CN101649300B - 一种产l-苹果酸的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种产L-苹果酸的基因工程菌及其构建方法。本发明通过对L-苹果酸涉及的关键酶酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、苹果酸脱氢酶(MDH)和富马酸酶(FumC)进行改造，构建得到基因工程菌。本发明将fumC进行灭活性突变，致使代谢流在苹果酸向富马酸转化处中断，从而积累目的产物L-苹果酸；将在mdh前加上内源pepck基因的启动子使代谢流偏向苹果酸生成；此外，通过单氟乙酸钠诱导，使得PEPCK活性增强，并使产物反馈抑制大为减弱。将本发明菌株应用于L-苹果酸的发酵生产，能显著提高L-苹果酸产量，所用技术简单，效果明显，投入成本低，能够满足市场需求。

Description

一种产L-苹果酸的基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产L-苹果酸的基因工程菌，以及该基因工程菌的构建方法和用途，特别涉及利用基因工程技术对生产L-苹果酸涉及的关键酶进行改造，提高L-苹果酸发酵水平。

背景技术

L-苹果酸主要应用于食品工业，它是一种优良的酸味剂和保鲜剂。在各种果酒，乳酸菌发酵饮料，人造奶油中添加L-苹果酸可最大限度保持天然果汁的风味。L-苹果酸酸味刺激较为缓慢，且保留时间长，酸味比柠檬酸强20％，其与合成甜味剂一起使用还可消除后苦味，因而越来越为消费者所喜爱，L-苹果酸和柠檬酸按合适比例添加到果汁中，可以使果汁更加接近于天然风味。

L-苹果酸是三羧酸循环(TCA)的重要中间代谢物，可直接参与人体的代谢，可用于辅助治疗贫血，肝功能不全和肝衰竭等疾病，因此在医药工业上也有重要的应用价值。

L-苹果酸在细胞能量产生过程中发挥着重要的作用，L苹果酸能诱导皮肤细胞的分裂，改善皮肤组织的生长，因而还可以用于化妆品工业。

由于L-苹果酸的诸多优良特性，使其成为具有巨大应用前景的功能性食品添加剂，医药原料药。

现有的L-苹果酸生产技术主要有固定化细胞生物转化法，生物酶法，化学合成法，微生物发酵法等，其中微生物发酵法最具应用前景。固定化细胞(酶)法生产工艺转化率比较低，生产流程长，转化液中产物含量不高，后提取成本较高。且生物酶转化法使用的前体物质富马酸盐的用量大，原料来源窄。化学合成的苹果酸存在D-型和L-型两种旋光异构体，需要拆分，成本高，工艺复杂，技术难度大，设备昂贵，收率低，并且还存在废弃物污染问题。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种基因工程菌，其无富马酸酶(FumC)活性，从而使其L-苹果酸的产量得到提高。

本发明的另一个目的在于提供上述基因工程菌的构建方法，通过基因工程改造，使其代谢流在苹果酸向富马酸转化处中断，从而积累目的产物L-苹果酸。

本发明的再一个目的是通过微生物大规模发酵L-苹果酸，以降低L-苹果酸的生产成本。

为实现本发明的第一个目的，本发明提供一种产L-苹果酸的基因工程菌，其出发菌为产琥珀酸的菌，所述菌株的富马酸酶基因(fumC)突变，不具备富马酸酶活性。这种突变可以是移码突变、缺失突变、碱基替换或者插入突变等等，不论何种方法，其最终导致的结果是使该菌丧失富马酸酶活性。优选使fumC基因缺失。

为进一步提高L-苹果酸的产率，本发明利用苹果酸脱氢酶(MDH)表达盒替换富马酸酶基因。所述表达盒优选由该菌内源性启动子与苹果酸脱氢酶基因构成，更优选所述内源性启动子为磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(pepck)的启动子。

本发明产琥珀酸的菌可以是放线菌，也可以是产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)以及大肠杆菌(Escherichiacoli)，或上述的基因工程改造菌。

此外，还可以通过亚硝基胍(NTG)对出发菌进行诱变，经含单氟乙酸钠(SMF)的平板培养基(MB)筛选，获得SMF抗性菌株，这种抗性菌株的PEPCK酶活性得到了显著提高，以这种菌作为出发菌可以进一步提高L-苹果酸的产率。

为实现本发明的第二个目的，本发明提供一种构建上述菌株的方法，包括构建fumC打靶载体，导入出发菌，使fumC产生灭活性突变。如前所述，这种灭活性突变可以是移码突变、缺失突变、碱基替换或者插入突变等致使的FumC的活性丧失。

此外，还可以利用打靶载体将富马酸酶基因fumC替换为苹果酸脱氢酶表达盒。这种表达盒优选采用该菌的内源性启动子，例如使用pepck基因的启动子。

使用本发明构建的基因工程菌进行L-苹果酸发酵表明，与出发菌相比其L-苹果酸的产量显著提高，这表明本发明菌株可广泛应用于L-苹果酸的生产。

本发明充分考察L-苹果酸涉及的关键酶，对其进行改造，构建得到基因工程菌，这些关键酶包括酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、苹果酸脱氢酶(MDH)和富马酸酶(Fumarase，FumC)。本发明将fumC进行灭活性突变，由于FumC的丧失，致使代谢流在苹果酸向富马酸转化处中断，从而积累目的产物L-苹果酸；将在mdh前加上内源pepck基因的启动子使代谢流偏向苹果酸生成；此外，通过单氟乙酸钠(Sodium Monofluroacetate，SMF)诱导，使得PEPCK活性增强，并使产物反馈抑制大为减弱。将本发明菌株应用于L-苹果酸的发酵生产，能显著提高L-苹果酸产量，所用技术简单，效果明显，投入成本低，能够满足市场需求。同时还能大量固定大气中的CO₂，在一定程度上减轻全球范围内的温室气体效应。

附图说明

图1显示的是细胞内琥珀酸代谢流程图；

图2显示的是重组载体FY-fmr-Kan-fmr构建过程；

图3显示的是FY-vfmr-proA-mdh-fmr载体构建过程；

图4显示的是PCR扩增的两端带fmr同源片段的卡那霉素片段的凝胶电泳图；

图5显示的是PCR法对重组子鉴定，其中1、2和3为3个不同的阳性克隆；

图6显示的是FY-fmr-Kan-fmr质粒的双酶切验证；

图7显示的是PCR扩增的proA-mdh片段的凝胶电泳图；

图8显示的是质粒FY-fmr-proA-mdh-fmr酶切验证；

图9显示的是AS-FY10菌株1L摇瓶发酵试验中，甲酸、乙酸、富马酸、丁二酸和苹果酸的含量情况；

图10显示的是AS-FY-Rec菌株1L摇瓶发酵试验中，乙酸、富马酸、丁二酸和苹果酸的含量情况；

图11显示的是AS-FY10菌株5L发酵罐试验中，甲酸、乙酸、丁二酸和苹果酸的含量情况；

图12显示的是AS-FY-Rec工程菌5L摇瓶发酵试验中，甲酸、乙酸、丁二酸和苹果酸的含量情况；

图13显示的是FY-SMF11在1L摇瓶中发酵实验中，甲酸、乙酸、富马酸、丁二酸和苹果酸的含量情况。

图14显示的是产丁二酸菌Mannheinia succinniciproducens摇瓶中发酵实验中，甲酸、乙酸、富马酸、丁二酸和苹果酸的含量情况。

图15显示的是产丁二酸菌Mannheinia succinniciproducens重组子MS11摇瓶中发酵实验中，甲酸、乙酸、富马酸、丁二酸和苹果酸的含量情况。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明对产琥珀酸的放线菌Actinobacillus succinogenes，Anaerobiospirillum succiniciproducens和Mannheimiasucciniciproducens等均作了基因工程改造，结果发现将fumC缺失后能够显著提高L-苹果酸的产量，特别是将在mdh前加上内源pepck基因的启动子替换fumC，L-苹果酸的产量得到了进一步提高。以下以放线菌(Actinobacillus succinogenes)为例具体说明本发明的内容。

在以下实施例中所涉及到的PCR引物如表1所示。

表1实施例中所涉及到的PCR引物

实施例1SMF抗性菌株的筛选

取新宰杀的牛瘤胃，厌氧培养法富集微生物，经进平板初筛，摇瓶复筛，获得一株产丁二酸菌。之后经形态学、生理生化及16S rRNA鉴定，确定该筛得的菌株属于产丁二酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)，该放线菌命名为AS-FY10。

平板挑取AS-FY10单菌落，活化富集培养1-2次，在特定液体培养基(MA)中培养，37℃在充满CO₂条件下于250ml三角瓶(带橡皮塞)轻微摇晃培养1-4天至对数期，将处于对数生长期AS-FY10细胞离心(8000g，20min)，用0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤两次，然后将细胞振荡打散，将打散的细胞悬浮于0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，其中含有0.2mg/mL的NTG，在37℃，250rpm下振荡处理20min。取10mL处理后的菌悬液用0.16mol/L硫代硫酸钠溶液稀释10倍中止反应，离心收集细胞，用无菌生理盐水洗涤后将其接入含有下列成分的液体培养基中：TSB 20g/L，酵母膏5g/L，CSL 5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 8g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 3g/L，pH7.2，培养24h后稀释涂布于特定含SMF的MB平板，置于100％CO₂环境中37℃厌氧培养3～7d，挑取在SMF平板上生长的菌落并培养，然后分别测定PCEPCK酶比活性，共得到5株PCEPCK酶比活性提高的菌株，将其中一株PCEPCK酶比活性最高的菌株命名为FY-SMF11。每升特定MA液体培养基含有以下成分：葡萄糖10.0g，碳酸氢钠10.0g，酵母粉5.0g，NaH₂PO₄·H₂O 8.0g，K₂HPO₄ 16.0g，pH调6.5，灭菌，葡萄糖单灭；每升特定MB平板培养基含有以下成分：葡萄糖7.5g，碳酸氢钠7.0g，酵母粉5.5g，NaH₂PO₄·H₂O 6.5g，K₂HPO₄ 11.5g，琼脂11.0g，生物素0.3g，SMF 4.5g，pH 6.5，葡萄糖单灭。

实施例2重组质粒的转化、重组子筛选

1重组质粒FY-fmr-Kan-fmr的构建

以pCR2.1(invitrogen)为模板，用引物Kan F和Kan R(见表1)扩增卡那霉素抗性基因，pfu作聚合酶，PCR反应总体积为50μl反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火40sec，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min，添加普通Taq酶后继续保温10min。电泳分析条带大小1.0kb，与预期大小相符(图4)用上海生物工程有限公司试剂盒纯化PCR产物(具体方法参见说明书)，产物与pGEM-T vector(invitrogen)用T4DNA连接酶(Takara公司产品)4℃连接过夜。转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，通用引物PCR验证、酶切验证(图5，图6)，并测序。

2重组质粒FY-fmr-proA-mdh-fmr的构建

提取AS-FY10全基因组DNA，并以此为模板，扩增mdh片段，以扩增到的片段和GeneBank中已发表的mdh序列做比对，发现同源性为99.9％。用扩增片段做全基因组BLAST，找到mdh上游启动子序列，经软件分析，具有启动子的一般特性。分别用三轮PCR，得到-fmr-proA-mdh-fmr-片段：用引物proAF和proAR扩增pepck编码序列起始密码子ATG前300个碱基片段，再用引物pmdhA和pmdhR引物扩增mdh编码基因，大小1242bp。其中，proAR和pmdhA具有40bp相同序列的重叠区域，分别用试剂盒纯化两个PCR产物，按合适比例混合两纯化后的PCR产物，在50μl反应体系中进行如下反应：94℃预变性5min，进入循环，94℃30sec，56℃1min，72℃2min，5个循环，最后72℃保持5min。反应结束后电泳，并用胶回收试剂盒纯化，以得到的产物为模板，再用引物proAF和pmdhR进行扩增，得到proA-mdh片段，大小1.5Kb(图7)，其中proAF和pmdhR引物5’端分别含有富马酸酶编码基因5’端的前50碱基和3’端的后55个碱基，见表1。将得到的片段连到pGEM-T载体中，转化DH5α感受态细胞，通用引物T7 Promter和SP6 promoter PCR验证、酶切验证(图8)并测序，得到的重组载体命名为FY-fmr-proA-mdh-fmr。

3重组质粒的转化

用FY-SMF11做宿主菌，在含4.5g SMF的特定MA液体培养基中于37℃充满CO₂环境中静止或轻微摇晃培养16-30h，4℃下4000g离心10min收集菌体，按分子克隆(第三版)方法制备感受态细胞，或按以下方法制备：离心收集到的菌体用8ml冰冷的15％甘油溶液洗涤两次，再次离心，沉淀用0.2ml 15％冰冷甘油溶液重悬，置于冰上；取50μl菌悬液与1μl冰预冷的FY-fmr-Kan-fmr质粒混合，置于电击转化杯中(Bio-Rad公司产品)电击转化；迅速将电击过的菌液吸取转移到冰预冷1.5mlEP管中，加入900μl冰预冷冰预MA培养基，厌氧培养2h，然后取适量涂布到特定平板筛选培养基(MK)中，每升MK平板筛选培养基含有以下成分：葡萄糖7.5g，碳酸氢钠7.0g，酵母粉5.5g，富马酸钠6.0g，NaH₂PO₄·H₂O 6.5g，K₂HPO₄ 11.5g，琼脂11.0g，SMF 0.8g，卡那霉素35.0g，生物素0.3g/L。培养5天后，长出的菌落经培养、提取基因组DNA，PCR验证。重组子命名为AS-FY12。同样办法转化FY-fmr-proA-mdh-fmr质粒，卡那霉素负筛(影印法)，PCR验证，保存，最终重组子命名为AS-FY-Rec。

实施例3PEPCE及MDH酶活测定

1粗酶液制备

在37℃下，AS-FY10和AS-FY-Rec在CO₂厌氧条件下培养24小时，取1mL菌悬液，离心获得菌体，用pH7.5，0.1mmol/L磷酸盐缓冲液稀释至10mL，冰浴超声破碎10min，然后在10000rpm下冷冻离心15min，所得上清即为粗酶液。

2PCEPCK酶活力测定

取两只比色皿，在其中一个中加入2.3mL pH 7.5，0.1mol/L磷酸盐缓冲液，之后依次加入50mmol/L MnCl₂，0.5mmol/L NaHCO₃，0.5mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸钠，50mmol/L ADP，5mmol/L NADH溶液各0.1ml，对照比色皿加入3mL磷酸盐缓冲液。将两只比色皿置于25℃保温2min，迅速加入0.1ml 500u/mL苹果酸脱氢酶纯酶液与适量粗酶液，启动反应；在3min内，在340nm处，每30s以对照比色皿调零，记录吸光度值，计算各时间段内吸光度降低值ΔA。并以下式计算酶活力。

本发明中PEPCK酶活力定义为：每分钟间接消耗1μmol NADH量所需的酶量，计算式如下：

$U=\frac{\mathrm{\ΔA}\×V}{\mathrm{\ϵ}\×b\×\mathrm{\Δt}}\×n\×{10}^3$

酶比活力为每毫克酶蛋白所具有的酶活力，单位为u/mg，计算如下：

式中，ΔA为340nm处吸光度的变化值；V为比色皿中酶促反应的体积，3mL；ε为NADH表观摩尔消光系数，6.22×10³；b为比色皿光程，1cm；Δt为时间间隔，3min；n为稀释倍数，n＝3000/x，x为向反应皿内加入的粗酶液体积，单位为μL；C为比色皿中酶蛋白质量浓度，单位为mg/mL。

3MDH活力测定

取两只比色皿，在其中一个中加入2.6mL pH 7.4，0.2mol/L磷酸盐缓冲液，之后依次加入0.2mol/L草酰乙酸，0.15mol/L NADH溶液各0.1ml，对照比色皿加入3mL磷酸盐缓冲液。将两只比色皿置于25℃保温2min，迅速加入0.1ml适当稀释的粗酶液，启动反应；在3min内，在340nm处，每30s以对照比色皿调零，记录吸光度值，计算各时间段内吸光度降低值ΔA。并以下式计算酶活力。

本发明中MDH酶活力定义为：每分钟直接消耗1μmol NADH量所需的酶量，计算式如下：

$U=\frac{\mathrm{\ΔA}\×V}{\mathrm{\ϵ}\×b\×\mathrm{\Δt}}\×n\×{10}^3$

酶比活力为每毫克酶蛋白所具有的酶活力，单位为u/mg，计算如下：

式中，ΔA为340nm处吸光度的变化值；V为比色皿中酶促反应的体积，3mL；ε为NADH表观摩尔消光系数，6.22×10³；b为比色皿光程，1cm；Δt为时间间隔，3min；n为稀释倍数，n＝3000/x，x为向反应皿内加入的粗酶液体积，单位为μL；C为比色皿中酶蛋白质量浓度，单位为mg/mL。

将出发菌AS-FY10和重组菌AS-FY-Rec在摇瓶中培养到对数期，按上述方法测定PEPCK和MDH的比活力，结果如表2所示。

表2 AS-FY10和AS-FY-Rec对数生长期PEPCK和MDH比活力比较

表2中数据说明，AS-FY-Rec比AS-FY-10其PEPCK酶比活升高，从1124u/mL升高到1524u/mL；而AS-FY-Rec比AS-FY-10的MDH酶比活也升高，从794u/mL升高到978u/mL。从后面结果来看，合成苹果酸两个关键酶比活力的增高是苹果酸合成增加的原因。

实施例41L摇瓶发酵及5L发酵罐发酵试验

11L摇瓶发酵验证

挑取AS-FY-Rec和AS-FY10单菌落，AS-FY10为对照菌，接种于种子培养基中(成分：葡萄糖9.5g/L，碳酸氢钠10.0g/L，富马酸钠6.0g/L，酵母粉5.5g/L，NaH₂PO₄·H₂O 8.0g/L，K₂HPO₄ 15.0g/L，生物素0.3g/L，pH调6.5，葡萄糖单灭)，接种量8％，装液量150ml。在充满CO₂环境下于37℃，150rpm摇床发酵100h，从第10小时开始，期间每隔10小时取样一次，液相测乙酸，甲酸，丁二酸和苹果酸含量。结果如图(9)和图(10)所示，说明经过SMF诱变和基因改造的工程菌株能够明显提高L-苹果酸的含量和降低其它杂酸的含量。

25L发酵罐发酵验证

挑取AS-FY-Rec和AS-FY10单菌落，AS-FY10为对照菌，接种于种子培养基，种子培养(同上述1L摇瓶发酵中的种子培养)16-30h后按8％接种量接种到5L发酵罐中，总发酵体积3.0L，发酵温度37℃，钢瓶通CO₂维持厌氧环境，发酵培养基成分：淀粉糖质原料75.0g/L，玉米浆50.0g/L，无机氮源30.0g/L，酵母膏15.0g/L，富马酸钠6.0g/L，NaH₂PO₄·H₂O 15.0g/L，K₂HPO₄ 20.0g/L，生物素4.5g/L。发酵过程中以Ca(OH)₂乳液维持pH在6.5。发酵24小时后开始补料，补料成分：淀粉糖质原料250.0g/L，玉米浆175.0g/L，无机氮源50.0g/L，酵母膏30.0g/L，富马酸钠6.0g/L，NaH₂PO₄·H₂O 45.0g/L，K₂HPO₄ 55.0g/L，生物素5.0g/L。发酵自第10小时开始取样，每10小时取样一次，发酵结果如图(11)和图(12)。重组菌株在第60小时左右产L-苹果酸的量达到最大。由于发酵液中检测到的丁二酸含量很低，所以在图中省略。可以看出，构建的工程菌株明显提高了L-苹果酸的产量和降低了丁二酸的含量，具备了工业化生产的能力。

实施例5FY-SMF11在1L摇瓶中发酵实验

挑取FY-SMF11单菌落，接种于种子培养基中(成分：葡萄糖9.5g/L，碳酸氢钠10.0g/L，富马酸钠6.0g/L，酵母粉5.5g/L，NaH₂PO₄·H₂O 8.0g/L，K₂HPO₄ 15.0g/L，生物素0.3g/L，pH调6.5，葡萄糖单灭)，接种量8％，装液量150ml。在充满CO₂环境下于37℃，100-180rpm摇床发酵100h，从第12小时开始，期间每隔10小时取样一次，液相测乙酸，甲酸，丁二酸和苹果酸含量。结果如图(13)所示，说明与野生型AS-FY10相比，经过SMF诱变菌株FY-SMF11合成L-苹果酸增加。

实施例6

用上述实施例1～5类似的方法，对琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)CGMCC 1593进行处理。结果，SMF抗性菌株的筛选获得4株PCEPCK酶比活性提高的菌株；转化重组质粒FY-fmr-proA-mdh-fmr，获得重组子，PEPCE及MDH酶活测定表明与出发菌相比，这两者的酶活均提高了约25％；摇瓶发酵表明其取得了与实施例4和5类似的结果。

实施例7产丁二酸菌(Mannheimia succiniciproducens)fumC基因缺失对L-苹果酸产量的影响

利用常规PCR技术和基因重组技术，具体方法参照实施例2，使用引物Kan F1 5’ATGACAGCGTTTCGTATTGAAAAAGATACTATGGGTGAAGTGCAGGTTCCTGCAGATAAAATCGATCTGACCCGCCAAAAACCT 3’(斜体碱基取自富马酸编码基因5’端的前60个碱基)和KanR1 5’TATTTCAAGCTACCAACCATATCGGCAGGTACCACCCATTTGTCGAAGTCTTCGGCTGAACTGTGCCTTTACAACTTATGAGTATG 3’(斜体碱基取自富马酸编码基因3’端的前60个碱基)扩增含有卡那霉素抗性基因片段。然后使用含有卡那霉素抗性基因片段转化产丁二酸菌Mannheimia succiniciproducens。转化方法参照实施例2中的重组质粒的转化。最终得到fumC基因缺失的重组子MS11。在1升摇瓶中进行发酵产丁二酸实验(发酵方法参照实施例4)，实验结果见图14和图15。实验结果表明：与野生产丁二酸菌Mannheimiasucciniciproducens相比，重组子MS11产苹果酸明显增加。

序列说明：

SEQ ID NO.1和2分别为编码苹果酸脱氢酶和编码富马酸酶的核苷酸序列，SEQ ID NO.3和4分别为苹果酸脱氢酶和编码富马酸酶的氨基酸序列，SEQ IDNO.5～12分别是引物Kan F、Kan R、T7promoter、primer(Promega)、SP6 promoterprimer(Promega)、proAF、proAR、pmdhA、pmdhR、Kan F1和Kan R1。

序列表

<110>安徽丰原发酵技术工程研究有限公司

<120>一种产L-苹果酸的基因工程菌及其构建方法和应用

<130>KHP09112565.9

<160>14

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1242

<212>DNA

<213>放线菌

<400>1

atgaaagtaa ccttattagg cgccagcggc ggtatcggtc aacctctttc attgttgtta    60

aaattacatc ttccggcaga aagcgattta agcttatacg atgttgcgcc ggtcaccccc    120

ggtgtggcga aagacatcag ccatattccg acttcggttg aagtggaagg tttcggcggc    180

gatgatccgt ccgaggcatt aaaaggggcg gatatcgttt taatctgtgc gggtgtggcg    240

cgtaagccgg gtatgactcg tgcggatttg tttaatgtta acgccggtat tatccagaat    300

ttagtggaaa aagttgcgca agtttgcccg caggcttgtg tttgcattat cactaatccg    360

gtgaactcga ttattccgat tgcggcggaa gtgctgaaaa aagcgggcgt atacgataaa    420

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acgattttac ctttgttgtc acaaattccg catgtggaat ttaccgagca ggaattaaaa    600

gatttaactc accgcatcca aaatgccggc accgaagtgg tagaagctaa agccggtgcg    660

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ggtacattaa gcgcatttga gcaacaagcg cttgaagcga tgttaccgac cttgcaaact    900

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<210>2

<211>1395

<212>DNA

<213>放线菌

<400>2

atgacatttc gtattgaaaa agacactatg ggcgaggttc aagttcctgc ggataaatat    60

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caatccaata tgaatctgaa cgaagttatc gctaaccgcg cacatgtgat taacggtggt    360

aaattaggtg aaaaatctat tattcatcca aacgacgatg taaacaaatc tcaatcttca    420

aacgatactt atccgacagc aatgcacatt gccacatata agaaagtggt tgaagcaacg    480

attccggcca tcgaacgttt acaaaaaacc ttagcggcga aatccgaaga attcaaagat    540

gtggtgaaaa tcggccgtac gcacttaatg gatgccaccc cgttgacatt gggtcaggaa    600

ttcagcggtt atgctgcaca attaagtttc ggtttagcgg caatcaaaaa taccttaccg    660

catttacgcc aactggcatt aggcggtacg gcagtgggta ccggtttaaa tacacctaaa    720

ggctatgatg taaaagtagc ggaatatatc gccaaattca ccggcttgcc gtttattacc    780

gccgaaaaca aatttgaagc attagcaaca catgacgcta tcgttgaaac tcacggcgca    840

ttaaaacaag ttgcgatgtc cttattcaaa attgcaaatg atatccgttt attggcttca    900

ggtcctcgtt ctggtatcgg tgaaatttta attcctgaaa acgaaccggg ttcatccatc    960

atgccgggta aagttaatcc gacccaatgc gaagcgatga caatggttgc cgcacaagta    1020

ttaggtaacg ataccactat ttcatttgcc ggttcgcaag gtcatttcga attgaacgta    1080

ttcaaaccgg ttatggcggc aaatttcctg caatccgctc aattaatcgc agatgtttgc    1140

atttctttcg acgagcactg tgcaagcggc attaaaccaa atacgccgcg cattcaacac    1200

ttacttgaaa gttcattaat gttagtgacc gcattaaata ctcatatcgg ttatgaaaat    1260

gcggcgaaaa ttgcgaaaac tgcgcacaaa aacggtacaa cattacgtga agaggctatc    1320

aacttaggtt tagtgtccgc cgaagatttc gataaatggg ttcgtccgga agatatggtt    1380

ggcagcttaa aataa                                                     1395

<210>3

<211>464

<212>PRT

<213>放线菌

<400>3

Met Thr Phe Arg Ile Glu Lys Asp Thr Met Gly Glu Val Gln Val Pro

1               5                   10                  15

Ala Asp Lys Tyr Trp Ala Ala Gln Thr Glu Arg Ser Arg Asn Asn Phe

            20                  25                  30

Lys Ile Gly Pro Ala Ala Ser Met Pro His Glu Ile Ile Glu Ala Phe

        35                  40                  45

Gly Tyr Leu Lys Lys Ala Ala Ala Tyr Ala Asn Ala Asp Leu Gly Val

    50                  55                  60

Leu Pro Ala Glu Lys Arg Asp Leu Ile Ala Gln Ala Cys Asp Glu Ile

65                  70                  75                  80

Leu Ala Arg Lys Leu Asp Asp Gln Phe Pro Leu Val Ile Trp Gln Thr

                85                  90                  95

Gly Ser Gly Thr Gln Ser Asn Met Asn Leu Asn Glu Val Ile Ala Asn

            100                 105                 110

Arg Ala His Val Ile Asn Gly Gly Lys Leu Gly Glu Lys Ser Ile Ile

        115                 120                 125

His Pro Asn Asp Asp Val Asn Lys Ser Gln Ser Ser Asn Asp Thr Tyr

    130                 135                 140

Pro Thr Ala Met His Ile Ala Thr Tyr Lys Lys Val Val Glu Ala Thr

145                 150                 155                 160

Ile Pro Ala Ile Glu Arg Leu Gln Lys Thr Leu Ala Ala Lys Ser Glu

                165                 170                 175

Glu Phe Lys Asp Val Val Lys Ile Gly Arg Thr His Leu Met Asp Ala

            180                 185                 190

Thr Pro Leu Thr Leu Gly Gln Glu Phe Ser Gly Tyr Ala Ala Gln Leu

        195                 200                 205

Ser Phe Gly Leu Ala Ala Ile Lys Asn Thr Leu Pro His Leu Arg Gln

    210                 215                 220

Leu Ala Leu Gly Gly Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Thr Pro Lys

225                 230                 235                 240

Gly Tyr Asp Val Lys Val Ala Glu Tyr Ile Ala Lys Phe Thr Gly Leu

                245                 250                 255

Pro Phe Ile Thr Ala Glu Asn Lys Phe Glu Ala Leu Ala Thr His Asp

            260                 265                 270

Ala Ile Val Glu Thr His Gly Ala Leu Lys Gln Val Ala Met Ser Leu

        275                 280                 285

Phe Lys Ile Ala Asn Asp Ile Arg Leu Leu Ala Ser Gly Pro Arg Ser

    290                 295                 300

Gly Ile Gly Glu Ile Leu Ile Pro Glu Asn Glu Pro Gly Ser Ser Ile

305                 310                 315                 320

Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Thr Gln Cys Glu Ala Met Thr Met Val

                325                 330                 335

Ala Ala Gln Val Leu Gly Asn Asp Thr Thr Ile Ser Phe Ala Gly Ser

            340                 345                 350

Gln Gly His Phe Glu Leu Asn Val Phe Lys Pro Val Met Ala Ala Asn

        355                 360                 365

Phe Leu Gln Ser Ala Gln Leu Ile Ala Asp Val Cys Ile Ser Phe Asp

    370                 375                 380

Glu His Cys Ala Ser Gly Ile Lys Pro Asn Thr Pro Arg Ile Gln His

385                 390                 395                 400

Leu Leu Glu Ser Ser Leu Met Leu Val Thr Ala Leu Asn Thr His Ile

                405                 410                 415

Gly Tyr Glu Asn Ala Ala Lys Ile Ala Lys Thr Ala His Lys Asn Gly

            420                 425                 430

Thr Thr Leu Arg Glu Glu Ala Ile Asn Leu Gly Leu Val Ser Ala Glu

        435                 440                 445

Asp Phe Asp Lys Trp Val Arg Pro Glu Asp Met Val Gly Ser Leu Lys

    450                 455                 460

<210>4

<211>312

<212>PRT

<213>放线菌

<400>4

Met Lys Val Thr Leu Leu Gly Ala Ser Gly Gly Ile Gly Gln Pro Leu

1               5                   10                  15

Ser Leu Leu Leu Lys Leu His Leu Pro Ala Glu Ser Asp Leu Ser Leu

            20                  25                  30

Tyr Asp Val Ala Pro Val Thr Pro Gly Val Ala Lys Asp Ile Ser His

        35                  40                  45

Ile Pro Thr Ser Val Glu Val Glu Gly Phe Gly Gly Asp Asp Pro Ser

    50                  55                  60

Glu Ala Leu Lys Gly Ala Asp Ile Val Leu Ile Cys Ala Gly Val Ala

65                  70                  75                  80

Arg Lys Pro Gly Met Thr Arg Ala Asp Leu Phe Asn Val Asn Ala Gly

                85                  90                  95

Ile Ile Gln Asn Leu Val Glu Lys Val Ala Gln Val Cys Pro Gln Ala

            100                 105                 110

Cys Val Cys Ile Ile Thr Asn Pro Val Asn Ser Ile Ile Pro Ile Ala

        115                 120                 125

Ala Glu Val Leu Lys Lys Ala Gly Val Tyr Asp Lys Arg Lys Leu Phe

    130                 135                 140

Gly Ile Thr Thr Leu Asp Thr Ile Arg Ser Glu Lys Phe Ile Val Gln

145                 150                 155                 160

Ala Lys Asn Ile Glu Ile Asn Arg Asn Asp Ile Ser Val Ile Gly Gly

                165                 170                 175

His Ser Gly Val Thr Ile Leu Pro Leu Leu Ser Gln Ile Pro His Val

            180                 185                 190

Glu Phe Thr Glu Gln Glu Leu Lys Asp Leu Thr His Arg Ile Gln Asn

        195                 200                 205

Ala Gly Thr Glu Val Val Glu Ala Lys Ala Gly Ala Gly Ser Ala Thr

    210                 215                 220

Leu Ser Met Ala Tyr Ala Ala Met Arg Phe Val Val Ser Met Ala Arg

225                 230                 235                 240

Ala Leu Asn Gly Glu Val Ile Thr Glu Cys Ala Tyr Ile Glu Gly Asp

                245                 250                 255

Gly Lys Phe Ala Arg Phe Phe Ala Gln Pro Val Arg Leu Gly Lys Asn

            260                 265                 270

Gly Val Glu Glu Ile Leu Pro Leu Gly Thr Leu Ser Ala Phe Glu Gln

        275                 280                 285

Gln Ala Leu Glu Ala Met Leu Pro Thr Leu Gln Thr Asp Ile Asp Asn

    290                 295                 300

Gly Val Lys Phe Val Thr Gly Glu

305                 310

<210>5

<211>74

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ttattttaag ctgccaacca tatcttccgg acgaacccat ttatcgaaat atcgatctga    60

cccgccaaaa acct                                                      74

<210>6

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

atgacatttc gtattgaaaa agacactatg ggcgaggttc aagttcctgc ggatactgtg    60

cctttacaac ttatgagtat g                                              81

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

taatacgact cactataggg                                                20

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

tatttaggtg acactatag                                                 19

<210>9

<211>72

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ttattttaag ctgccaacca tatcttccgg acgaacccat ttatcgaaat aattaaagaa    60

attagccctg cg                                                        72

<210>10

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

tactttcatt ggaataatcc gcggtcgccg ccatagccag taagtcatta agttctttta    60

acg                                                                  63

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

atgaaagtaa ccttattagg cgcc                                           24

<210>12

<211>79

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

atgacatttc gtattgaaaa agacactatg ggcgaggttc aagttcctgc ggataagcaa    60

caccgccgaa catgttatc                                                 79

<210>13

<211>84

<212>DNA

<213>aa

<400>13

atgacagcgt ttcgtattga aaaagatact atgggtgaag tgcaggttcc tgcagataaa    60

atcgatctga cccgccaaaa acct                                           84

<210>14

<211>86

<212>DNA

<213>aa

<400>14

tatttcaagc taccaaccat atcggcaggt accacccatt tgtcgaagtc ttcggctgaa    60

ctgtgccttt acaacttatg agtatg                                         86

Claims (10)

1.一种产L-苹果酸的基因工程菌，其出发菌为产琥珀酸的菌，其特征在于，所述菌株的富马酸酶基因突变，不具备富马酸酶活性，该突变是富马酸酶基因替换为苹果酸脱氢酶表达盒。

2.如权利要求1所述的产L-苹果酸的基因工程菌，其特征在于，所述苹果酸脱氢酶表达盒是由该菌内源性启动子与苹果酸脱氢酶基因构成。

3.如权利要求2所述的产L-苹果酸的基因工程菌，其特征在于，所述内源性启动子为磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的启动子。

4.如权利要求1～3任一项所述的产L-苹果酸的基因工程菌，其特征在于，所述出发菌为产琥珀酸的放线菌。

5.如权利要求4所述的产L-苹果酸的基因工程菌，其特征在于所述出发菌为抗单氟乙酸钠产琥珀酸的放线菌。

6.一种构建权利要求1～5任一所述产L-苹果酸的基因工程菌的方法，其包括构建富马酸酶基因打靶载体，导入出发菌，使富马酸酶基因产生灭活性突变，所述灭活性突变是将富马酸酶基因替换为苹果酸脱氢酶表达盒。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述苹果酸脱氢酶表达盒是由该菌内源性启动子与苹果酸脱氢酶基因构成。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述内源性启动子为磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的启动子。

9.权利要求1～5任一项所述基因工程菌在制备L-苹果酸中的应用。

10.一种制备L-苹果酸的方法，其以权利要求1～5任一项所述基因工程菌进行发酵生产L-苹果酸。

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