CN108588105B - 大肠杆菌表达载体、构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了大肠杆菌表达载体pRTDuet‑1，所述表达载体由pETDuet‑1构建而来，其中pETDuet‑1的T7聚合酶启动子被沼泽红假单胞菌的磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子替代。还公开了表达载体pRTD‑G，其由pRTDuet‑1构建而来，还包括了目的基因，目的基因为6‑磷酸葡萄糖脱氢酶(g6pdh)基因。本发明还提供上述两种表达载体的构建方法。所构建出的表达载体可在不含T7聚合酶基因的大肠杆菌中表达目的基因，可以作为基因改造的可选质粒。
Description
技术领域
本发明涉及及基因工程领域，具体为大肠杆菌表达载体、构建方法及其应用。
背景技术
随着人类对原核生物的认知，越来越多的微生物种类被发现。为了改造这些微生物，穿梭表达载体的构建已得到相当多的关注。大肠杆菌是一种易于培养，生物量容易积累的比较常见的原核细菌，且容易对其进行基因改造和重组，因此常用的穿梭质粒都是基于特定菌株和大肠杆菌之间构建。现有的大肠杆菌表达质粒大多基于T7聚合酶进行外源基因高效表达，但是在其他宿主细菌上往往并不存在T7聚合酶，而往往只能挑选该细菌自带的质粒进行改造，从而限制了大肠杆菌表达系统的应用。
发明内容
本发明的目的是提供表达载体pRTDuet-1和表达载体pRTD-G及其构建方法，所述载体能够在不含T7聚合酶基因的大肠杆菌中表达。
为解决上述技术问题，本发明提供一种大肠杆菌表达载体pRTDuet-1，所述表达载体由pETDuet-1构建而来，其中所述pETDuet-1的T7聚合酶启动子被沼泽红假单胞菌的磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子替代。
优选的，表达载体pRTDuet-1具有序列号1所示的序列。
本发明还提供一种大肠杆菌表达载体pRTD-G，所述表达载体由权利要求2所述的pRTDuet-1构建而来，所述pRTD-G还包括目的基因，所述目的基因为6-磷酸葡萄糖脱氢酶(g6pdh)基因。
优选的，所述目的基因来自于沼泽红假单胞菌。
优选的，表达载体pRTD-G具有序列号2所示的序列。
本发明还提供表达载体pRTDuet-1以及表达载体pRTD-G的构建方法，包括步骤：
(1)获得重组载体1，所述重组载体1包括了将pETDuet-1质粒MCS II区T7启动子替换为沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子的含酶切位点的片段和pETDuet-1多克隆位点区域片段；所述重组载体1具有序列号3所示的序列；
(2)获得重组载体2，所述重组载体2包括了将pETDuet-1质粒MCS II区和MCS1区的两个T7启动子均替换为沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子的含酶切位点的片段和pETDuet-1多克隆位点区域片段，所述重组载体2具有序列号4所示的序列；
(3)重组载体2和pETDuet-1质粒分别酶切，将酶切后片段连接后获得pRTDuet-1质粒；
(4)获得重组载体3，所述重组载体3为含6-磷酸葡萄糖脱氢酶(g6pdh)基因的片段；所述重组载体3具有序列号5所示的序列；
(5)将重组载体3与pRTDuet-1质粒分别酶切，将酶切后片段连接后获得pRTD-G质粒。
优选的，所述步骤(1)具体为根据沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子序列和pETDuet-1质粒酶切位点设计两段式扩增引物1与扩增引物2；两段式扩增沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子，获得两段启动子片段，连接两段启动子片段，获得连接产物；将连接产物与克隆载体pBM20-T连接，获得重组载体1；所述引物1具有序列号6/7所示序列，所述引物2具有序列号8/9所示序列。
优选的，所述步骤(2)具体为根据沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子序列和pETDuet-1质粒MCS I区序列设计含酶切位点的长引物3；扩增长引物3和重组载体1的酶切片段，获得扩增产物，将扩增产物与克隆载体pBM20-T连接，获得重组载体2，所述长引物3具有序列号10所示序列。
优选的，长引物3前端含有的酶切位点为Cla I，Xba I。
优选的，所述重组载体1酶切片段使用限制性内切酶进行酶切，所述限制性内切酶为酶Xba I，Kpn I。
优选的，所述步骤(2)的扩增在TOUCH-DOWN PCR中进行，TOUCH-DOWN PCR的退火温度从65-56℃的10循环中每次循环退火温度降低1℃。
优选的，所述步骤(3)重组载体2和pETDuet-1质粒通过限制性内切酶分别酶切，酶切片段通过DNA连接酶连接，所述限制性内切酶为酶Cla I，Kpn I。
优选的，所述步骤(4)具体为根据pRTDuet-1质粒上的酶切位点设计引物4，利用引物4扩增6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(g6pdh)基因片段；获得的基因片段与克隆载体pBM20-T连接，获得重组载体3；所述引物4具有序列号11/12所示序列。
优选的，引物4含有的酶切位点为Nde I，Kpn I。
优选的，所述步骤(5)中重组载体3与pRTDuet-1质粒用限制性内切酶分别酶切，酶切后片段用DNA连接酶连接，所述限制性内切酶为Nde I，Kpn I。
本发明还提供表达载体pRTDuet-1以及表达载体pRTD-G在不含T7聚合酶基因的大肠杆菌中的应用。
本发明基于构建一种不依靠T7聚合酶表达体系的表达质粒，选择原核细菌沼泽红假单胞菌的磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子作为替代，利用基因工程中，可通过特定引物扩增出特定目标基因的PCR扩增技术，在特定限制性酶切位点使用特点限制性内切酶进行切割DNA的限制性内切酶酶切技术，以及通过DNA连接酶使不同基因片段连接在DNA连接酶连接技术等手段替换了pETDuet-1质粒中的T7聚合酶启动子，构建出了表达质粒pRTDuet-1，插入外源基因g6pdh构建出了表达载体pRTD-G，并在不同大肠杆菌中进行表达，实验验证表达质粒pRTDuet-1可在不含T7聚合酶基因的大肠杆菌中表达外源基因。
附图说明
图1、pRTDuet-1质粒构建图；
图2、pRTD-G质粒构建图；
图3、pRTD-G诱导表达SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
迄今为止，人们已经研究出多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白。与其他系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，操作简便，可以大规模发酵培养的优点，是现阶段最常用的表达系统。现有的大肠杆菌表达质粒大多基于T7聚合酶进行外源基因高效表达，但是在其他宿主细菌上往往并不存在T7聚合酶，进而导致只能挑选该细菌自带的质粒进行改造，从而在一定程度上限制了大肠杆菌表达系统的应用。
本发明提供一种大肠杆菌表达载体pRTDuet-1，表达载体由pETDuet-1构建而来，其中pETDuet-1的T7聚合酶启动子被沼泽红假单胞菌的磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子替代。
本发明还提供一种大肠杆菌表达载体pRTD-G，表达载体由pRTDuet-1构建而来，pRTD-G还包括目的基因，目的基因为6-磷酸葡萄糖脱氢酶(g6pdh)基因。目的基因来自于沼泽红假单胞菌。
本发明还提供了表达载体pRTDuet-1和pRTD-G的构建方法，如图1至图2所示，包括以下步骤：
(1)根据沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶的启动子序列和pETDuet-1质粒酶切位点设计一组沼泽红假单胞菌启动子的两段式扩增引物，并扩增沼泽红假单胞菌中启动子片段；
(2)回收启动子扩增的两端片段，进行测序验证扩增基因的完整性。
(3)将两段启动子片段并使用DNA连接酶进行连接，将使用克隆载体pBM20-T将连接产物连接起来，得到替换了pETDuet-1质粒MCS II区T7启动子的含酶切位点的沼泽红假单胞菌启动子和pETDuet-1多克隆位点区域片段的重组载体1；
(4)根据沼泽红假单胞菌启动子序列和pETDuet-1质粒MCS I区序列设计一条含另一组酶切位点的长引物，其中，作为优选，长引物前端含酶切位点为Cla I，Xba I；
(5)使用TOUCH-DOWN PCR将长引物和替换了pETDuet-1质粒MCS II区T7启动子的含酶切位点的沼泽红假单胞菌启动子和pETDuet-1多克隆位点区域片段的重组载体1双酶切片段进行扩增，将PCR扩增得到的基因片段连接到克隆载体pBM20-T上，得到替换了pETDuet-1质粒MCS区两个T7启动子的含酶切位点的沼泽红假单胞菌启动子和pETDuet-1多克隆位点区域片段的重组载体2，其中，作为优选，步骤中所述限制性内切酶为酶Xba I，KpnI，TOUCH-DOWN PCR的退火温度从65-56℃的10循环中每次循环退火温度降低1℃；
(6)将重组载体2和pETDuet-1质粒分别使用限制性内切作双酶切反应，然后用DNA连接酶将酶切后的启动子替换多克隆位点片段和pETDuet-1质粒片段连接得到pRTDuet-1质粒，其中，此步骤中所述限制性内切酶为酶Cla I，Kpn I；
(7)根据pRTDuet-1质粒上的酶切位点设计引物，PCR扩增6-磷酸葡萄糖脱氢酶g6pdh基因片段；
(8)切割回收扩增好的带有限制性酶切点的6-磷酸葡萄糖脱氢酶g6pdh基因片段，并用克隆载体pMD20-T将6-磷酸葡萄糖脱氢酶g6pdh基因片段连接起来，得到含6-磷酸葡萄糖脱氢酶g6pdh基因片段的重组载体3；
(9)将重组载体3中6-磷酸葡萄糖脱氢酶g6pdh基因和pRTDuet-1质粒分别用限制性内切酶作双酶切反应，然后用DNA连接酶将酶切后的pRTDuet-1质粒片段与6-磷酸葡萄糖脱氢酶g6pdh基因片段连接得到pRTD-G质粒；其中，此步骤中所述限制性内切酶为酶Nde I，Kpn I。
本发明还提供表达载体pRTDuet-1以及表达载体pRTD-G在不含T7聚合酶基因的大肠杆菌中的应用。
本发明通过Cla I，Xba I，Kpn I分步替换了pETDuet-1质粒的两个T7启动子，NdeI和Kpn I位点插入了6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因。本发明所获得的pRTDuet-1质粒有2个包含有沼泽红假单胞菌启动子的多克隆位点，每个多克隆位点各有一个抗体标签和12个内切酶位点。pRTDuet-1以及pRTD-G能够应用于不含T7聚合酶基因的大肠杆菌中，该质粒可以作为穿梭载体在不含T7聚合酶基因的大肠杆菌中发挥表达插入基因的作用，可以作为基因改造的可选质粒。
上述为本发明的详细阐述，下面为本发明实施例。
实施例
(1)在NCBI上查找沼泽红假单胞菌的磷酸烯醇式丙酮酸激酶的启动子序列，利用DNAman软件结合NCBI上查找的同源基因序列一同设计，分别设计MCS II区启动子修改前段引物1和后段引物2。引物合成的方法采用固相亚磷酰胺三酯法。
设计出来的引物1为：
片段1F：ATGCGTCCGGCGTAGAGGAT
片段1R：CTGCCGGCTCCGGTGGGGCGAATTTCGATTATGCGGCCGTGTACAA
引物2为
片段2F：GTATATACTGATGTGTACGGGGAATTGTGAGCGGATAA
片段2R：GCTAGTTATTGCTCAGCGG
(2)根据设计好的引物，利用PCR技术扩增沼泽红假单胞菌中启动子片段，即MCSII区前段和后端。PCR条件设置：95℃变性5分钟；95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸3分钟，20μL体系：2μL 10*Taq buffer，2μL MgCl2，1μL 10mmdNTP，12μLddH2O，1μL沼泽红假单胞菌总DAN，1μL上引物，1μL下引物，0.2μL Taq DNA酶。
(3)将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，并在凝胶成像仪下切割回收前段和后段，最后将切割片段用胶回收试剂盒(Omega Bio-Tek,USA)回收，各35μL的前，后段片段。
(4)将胶回收的片段送往基因测序公司测序，以验证扩增片段的完整性。
(5)将两段验证后的启动子片段使用DNA连接酶进行连接，连接条件：25℃，1小时；连接体系：2μL T4ligase Buffer，1μL T4ligase，3.5μL前段回收产物，3.5μL后段回收产物。将使用克隆载体pBM20-T将连接产物连接起来，得到了重组载体1：①连接体系：1μLpBM20-T Vector，3μL两段DNA连接产物，1μL dH2O,5μL Solution I；②16℃反应30分钟；③将连接好的质粒加入100μL的DH5α感受态中，冰中放置30分钟；④42℃加热45秒，再在冰中放置1分钟；⑤加入400μL LB培养基，37℃振荡培养40分钟；⑥将培养液倒入含有氨苄的固体LB培养基培养过夜；挑选单菌落放入100mL含有氨苄的液体LB培养基扩大培养，最后用质粒提取试剂盒(Omega Bio-Tek,USA)提取重组载体1。
(6)将提取得到的重组载体1用酶Xba I，Knp I作双酶切反应，得到含有Xba I，KnpI的粘性末端的替换了pETDuet-1质粒MCS II区T7启动子的含酶切位点的沼泽红假单胞菌启动子和pETDuet-1多克隆位点区域的基因片段，酶切步骤为：①反应温度37℃，5μL缓冲液5*NEB CutSmartBuffer，1μL酶Xba I，1μL酶Knp I，①20μL重组载体1，24μL无菌水，反应时间3h；最后酶切片段用胶回收试剂盒回收，回收后得到10μL用沼泽红假单胞菌启动子替换了pETDuet-1质粒MCS II区T7启动子的含酶切位点Xba I，Knp I的粘性末端的pETDuet-1多克隆位点区域的基因片段Q1。
(7)根据沼泽红假单胞菌启动子序列和pETDuet-1质粒MCS I区序列设计一条含另一组酶切位点的长引物3，其中，长引物3序列：ATCGAGATCGATCTCGATCCCGCGAAATCGCCCCACCGGAGCCGGCAGGTATATACTGATGTGTACGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTT，作为优选，长引物两端酶切位点为Cla I，Xba I。
(8)使用TOUCH-DOWN PCR将长引物3和(6)中得到的用沼泽红假单胞菌启动子替换了pETDuet-1质粒MCS II区T7启动子的含酶切位点Xba I，Knp I的粘性末端的pETDuet-1多克隆位点区域的基因片段Q1进行扩增，TOUCH-DOWN PCR反应条件：95℃，5分钟；TOUCH-DOWN循环10次：94℃，15秒；55℃-45℃，15秒；72℃，30秒；72℃，5分钟；4℃保存；20μL体系：2μL10*Taq buffer，2μL MgCl2，1μL 10mmdNTP，10μL Q1，10μLQ2，0.2μL Taq DNA酶。将TOUCH-DOWN PCR扩增得到的基因片段连接到克隆载体pBM20-T上，并转化到大肠杆菌Trans-110中，培养后提取质粒，得到包含用沼泽红假单胞菌启动子替换了pETDuet-1质粒MCS区T7启动子的多克隆位点区域片段的重组载体2。
(9)将重组载体2和pETDuet-1质粒分别使用Cla I和Kpn I限制性内切作双酶切反应，酶切步骤为：①反应温度37℃，5μL缓冲液5*NEB CutSmartBuffer，1μL酶Cla I，1μL酶Kpn I，①20μL质粒，24μL无菌水，反应时间3h；最后酶切片段用胶回收试剂盒回收，回收后得到10μL含有Cla I，Knp I的粘性末端的用沼泽红假单胞菌启动子替换了pETDuet-1质粒MCS区T7启动子的多克隆位点区域片段和10μL含有Cla I，Knp I粘性末端的pETDuet-1片段。
(10)将(9)中得到的两个片段使用DNA连接酶作连接反应，得到沼泽红假单胞菌启动子替换了T7启动子的pRTDuet-1质粒，并转化到大肠杆菌DH5α中，培养后提取质粒，酶连反应体系：1μL T4DNA连接酶，1μL 10*T4DNA连接酶反应缓冲液，3μL(9)中酶切好的多克隆区域片段，1μL(9)中酶切好的pETDuet-1质粒，4μL无菌水，反应温度16℃，反应时间15分钟。
(11)根据pRTDuet-1上的酶切位点设计引物，并使用PCR技术扩增6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因g6pdh基因片段。PCR条件设置：95℃变性5分钟；95℃变性30s，55℃复性30s，72摄氏度延伸1分30秒，35个循环；72℃延伸10分钟，20μL体系：2μL 10*Taq buffer，2μL MgCl2，1μL 10mmdNTP，12μL ddH2O，1μL沼泽红假单胞菌总DAN，1μL上引物，1μL下引物，0.2μL TaqDNA酶。此时得到的片段带有限制性酶切位点，用于与载体的连接；(6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因g6pdh酶切位点BamH I,Hind III)
引物4序列为：
GDP-BAMH:5-CGGATCCGCGCGTGACCACGCAAGCC-3
GDP-HIND:5-CCCAAGCTTGGG CTAGCCCAGTTTCCGCC-3
(12)将(11)扩增好的带有限制性酶切位点的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因用琼脂糖凝胶电泳分离，并凝胶成像仪下切割回收，最后用pBM20-T质粒将6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因连接起来，得到30μL含有6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因片段的重组载体3；①连接体系：1μLpBM20-T Vector，3μL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因片段，1μL dH2O,5μL Solution I；②16℃反应30分钟；③将连接好的质粒加入100μL的DH5α感受态中，冰中放置30分钟；④42℃加热45秒，再在冰中放置1分钟；⑤加入400μL LB培养基，37℃振荡培养40分钟；⑥将培养液倒入含有氨苄的固体LB培养基培养过夜；挑选单菌落放入100mL含有氨苄的液体LB培养基扩大培养，最后用质粒提取试剂盒(Omega Bio-Tek,USA)提取重组载体3。
(13)将(12)中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因重组质粒3用酶BamH I，Hind III作双酶切反应，得到含有BamH I，Hind III粘性末端的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因片段，酶切步骤为：①反应温度37℃，5μL缓冲液5*NEB CutSmartBuffer，1μL酶BamH I，1μL酶Hind III，20μL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因重组质粒3，24μL无菌水，反应时间3h；②利用胶回收试剂盒(Omega Bio-Tek,USA)回收①的酶切片段，回收后得到10μL含有BamH I，Hind III粘性末端的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因片段。
(14)分别将20μL pRTDuet-1质粒用酶BamH I，Hind III作双酶切反应，得到含有BamH I，Hind III的粘性末端的pRTDuet-1片段，酶切步骤及体系为：①反应温度37℃，缓冲液5μL5*NEB CutSmartBuffer，1μL酶BamH I，1μL酶Hind III，20μL pRTDuet-1质粒，24μL无菌水，反应时间3h；②利用胶回收试剂盒(Omega Bio-Tek,USA)回收①的酶切片段，回收后得到10μL含有BamH I，Hind III粘性末端的pRTDuet-1片段。
(15)将(14)中酶切好的pRTDuet-1质粒与(13)的酶切好的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因片段作酶连反应，得到含有6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因片段的pRTDuet-1质粒，即pRTD-G质粒，将连接好的质粒pRTD-G分别转入大肠杆菌BL21(DE3)，Trans100，DH5α中，并提取转入到DH5α中的质粒；酶连反应体系：1μL T4DNA连接酶，1μL 10*T4DNA连接酶反应缓冲液，3μL(13)中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因片段，1μL(14)中酶切好的pRTDuet-1质粒，4μL无菌水，反应温度16℃，反应时间15分钟。
(16)将(14)中的质粒提取后送往基因公司测序，以验证基因的完整性；
(17)将(14)中pRTD-G分别转化出的大肠杆菌BL21(DE3)，Trans100，DH5α菌株培养至OD600值约等于0.7时加入终浓度0.5mM的IPTG做诱导表达，再培养10小时，各取5mL菌液做SDS-PAGE，其中培养条件：温度37℃，转速160rpm，其中SDS-PAGE浓缩胶为5％，分离胶为12％，电泳条件，浓缩胶80V，分离胶120V，电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端为止，染色时间4小时，脱色至蛋白条带清洗为止。
在表达实验中，pRTD-G分别转化出的大肠杆菌BL21(DE3)，Trans100，DH5α菌株均表达出了转入的沼泽红假单胞菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶蛋白，实验结果如图3所示。本发明构建的表达载体pRTDuet-1能在不含T7聚合酶基因的大肠杆菌菌株中正常表达外源基因。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 成都理工大学
<120> 大肠杆菌表达载体、构建方法及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5464
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcaaccgca cctgtggcgc cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcga 60
gatcgatctc gatcccgcga aattcgcccc accggagccg gcaggtatat actgatgtgt 120
acggggaatt gtgagcggat aacaattccc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga 180
aggagatata ccatgggcag cagccatcac catcatcacc acagccagga tccgaattcg 240
agctcggcgc gcctgcaggt cgacaagctt gcggccgcat aatgcttaag tcgaacagaa 300
agtaatcgta ttgtacacgg ccgcataatc gaaattcgcc ccaccggagc cggcaggtat 360
atactgatgt gtacggggaa ttgtgagcgg ataacaattc cccatcttag tatattagtt 420
aagtataaga aggagatata catatggcag atctcaattg gatatcggcc ggccacgcga 480
tcgctgacgt cggtaccctc gagtctggta aagaaaccgc tgctgcgaaa tttgaacgcc 540
agcacatgga ctcgtctact agcgcagctt aattaaccta ggctgctgcc accgctgagc 600
aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag 660
gaggaactat atccggattg gcgaatggga cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc 720
gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc 780
tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa 840
tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact 900
tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt 960
gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa 1020
ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt 1080
aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac 1140
aatttctggc ggcacgatgg catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 1200
aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 1260
taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 1320
gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 1380
agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 1440
cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 1500
tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 1560
gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 1620
agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 1680
gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 1740
atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 1800
gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 1860
tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 1920
atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 1980
agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 2040
gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 2100
cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatcat gattgaagca tttatcaggg 2160
ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggtca 2220
tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 2280
tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 2340
aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 2400
aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt 2460
taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 2520
taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 2580
agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 2640
tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 2700
cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 2760
agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 2820
gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 2880
aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 2940
tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 3000
ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 3060
aagagcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat 3120
atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt atacactccg 3180
ctatcgctac gtgactgggt catggctgcg ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 3240
ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 3300
agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgaggca gctgcggtaa 3360
agctcatcag cgtggtcgtg aagcgattca cagatgtctg cctgttcatc cgcgtccagc 3420
tcgttgagtt tctccagaag cgttaatgtc tggcttctga taaagcgggc catgttaagg 3480
gcggtttttt cctgtttggt cactgatgcc tccgtgtaag ggggatttct gttcatgggg 3540
gtaatgatac cgatgaaacg agagaggatg ctcacgatac gggttactga tgatgaacat 3600
gcccggttac tggaacgttg tgagggtaaa caactggcgg tatggatgcg gcgggaccag 3660
agaaaaatca ctcagggtca atgccagcgc ttcgttaata cagatgtagg tgttccacag 3720
ggtagccagc agcatcctgc gatgcagatc cggaacataa tggtgcaggg cgctgacttc 3780
cgcgtttcca gactttacga aacacggaaa ccgaagacca ttcatgttgt tgctcaggtc 3840
gcagacgttt tgcagcagca gtcgcttcac gttcgctcgc gtatcggtga ttcattctgc 3900
taaccagtaa ggcaaccccg ccagcctagc cgggtcctca acgacaggag cacgatcatg 3960
ctagtcatgc cccgcgccca ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc 4020
ggtcgagatc ccggtgccta atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg 4080
cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 4140
gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg 4200
caacagctga ttgcccttca ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct 4260
ggtttgcccc agcaggcgaa aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga 4320
gctgtcttcg gtatcgtcgt atcccactac cgagatgtcc gcaccaacgc gcagcccgga 4380
ctcggtaatg gcgcgcattg cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt 4440
gggaacgatg ccctcattca gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca 4500
gtcgccttcc cgttccgcta tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc 4560
agccagacgc agacgcgccg agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg 4620
gtgacccaat gcgaccagat gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat 4680
aatactgttg atgggtgtct ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca 4740
ggcagcttcc acagcaatgg catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact 4800
gacgcgttgc gcgagaagat tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc 4860
taccatcgac accaccacgc tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac 4920
aatttgcgac ggcgcgtgca gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg 4980
tttgcccgcc agttgttgtg ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc 5040
ttccactttt tcccgcgttt tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac 5100
ggtctgataa gagacaccgg catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt 5160
caccaccctg aattgactct cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg 5220
ccattcgatg gtgtccggga tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc 5280
agcccagtag taggttgagg ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg 5340
agatggcgcc caacagtccc ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag 5400
cgctcatgag cccgaagtgg cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg 5460
cgcc 5464
<210> 2
<211> 6955
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcaaccgca cctgtggcgc cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcga 60
gatcgatctc gatcccgcga aattcgcccc accggagccg gcaggtatat actgatgtgt 120
acggggaatt gtgagcggat aacaattccc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga 180
aggagatata ccatgggcag cagccatcac catcatcacc acagccagga tccgcgcgtg 240
accacgcaag ccaacagcaa tcaggttccc gacggctgcg cgttcgtcat cttcggtgtc 300
accggcgatc tcacccaccg tctggtgatc ccggcgctgt acaatctcgc cgaagccggg 360
ctgctgccgg agaaattctg cgtcgtcgga gtcacccgca aggagatggc gagcgacgat 420
ctgagagaaa gcctgttgca gggcttgcgc aaatacgcca cccgcccggt cgacgacaag 480
gtcgccgatc agcttctgta ctgcgtcacc gcaatcagcg ccgatccgag cgaaccggac 540
tcgttcgacc ggctgcgcga gcgcctggaa aagctcgagg ccaaccgcaa caccggtggc 600
aaccggctgt tctacctcgc caccccgccg gacgcgttcg caccgatcgc gaccgagctc 660
ggccgcgcca agctgctcga agagaccagc ggcgcgtggc gtcggctggt ggtggagaag 720
ccgttcggca ccgacctcgc ctcggccaag gcgctgaacg atcatctgct cggcatcatc 780
tccgagcacg agctgtaccg gatcgatcac tacctcggca aagagacggt gcagaacatc 840
ctggtgctgc ggttctccaa cggcatgttc gagccgatct ggaaccgcga gcacatcgrc 900
cacatccaga tcaccgtcga ggaaaagctc ggcgtcggcc atcgcggcag sttctacgac 960
aagaccggcg cgctgcgcga catggtgccg aaccatctgt tccaactgct gtcgctggtg 1020
gcgatggagc cgccggcgca tttcaacgcc catgcggtgc gatccgccaa ggctgatgtg 1080
ttggcggcaa tccagatcca gagcgaagac gaggcgctgc gcaattcggt gcgcggccaa 1140
tacacctccg gcaggatcgg cgacaacgag attcccgact atcgcagcgc caaggacgtc 1200
gaaccggaca gtaccaccga gaccttcgcg gcactgaagc tgtcgatcga caattggcgc 1260
tgggccggcg tgccgttcta tctgcgcacc ggcaaggcgc tgtcgggcaa gcgcaccgag 1320
gtcgcgatca agttcaaaca ggcgccgttc tcgatgttcc gctgcacccc ggtgcgggaa 1380
ttgtcgcaga actatctggt gatcgggatc gagccggtcg aaggcatctc gctgcagttc 1440
aacaccaagg tgccgggccc ggtgatcgcg atcgacggcg tcgagatgac gttcaagtac 1500
gaggactact tcaaggtggc gccgagcaac ggctacgaaa cgctgctgca cgactgcatg 1560
atcggcgaca acatcctgtt ccagcgcgcc gacggcgtcg aggcgggatg gcgggtggtg 1620
cagccctttc tcgacgcctg gaagaaagcc ggcgcccacg gcctgcagat ctatcgcgcc 1680
ggcagcgaag gccccgaaga cgccgacgag ttgctgacgc gcgatggccg ctgttggcgg 1740
aaactgggct agcccaagct tgcggccgca taatgcttaa gtcgaacaga aagtaatcgt 1800
attgtacacg gccgcataat cgaaattcgc cccaccggag ccggcaggta tatactgatg 1860
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tcggtaccct cgagtctggt aaagaaaccg ctgctgcgaa atttgaacgc cagcacatgg 2040
actcgtctac tagcgcagct taattaacct aggctgctgc caccgctgag caataactag 2100
cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta 2160
tatccggatt ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 2220
ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 2280
cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 2340
ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 2400
tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 2460
gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 2520
ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 2580
gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caatttctgg 2640
cggcacgatg gcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa 2700
tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc 2760
ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga 2820
ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca 2880
atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc 2940
ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat 3000
tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc 3060
attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt 3120
tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc 3180
ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg 3240
gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt 3300
gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg 3360
gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga 3420
aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg 3480
taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg 3540
tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt 3600
tgaatactca tactcttcct ttttcaatca tgattgaagc atttatcagg gttattgtct 3660
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaataggtc atgaccaaaa 3720
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 3780
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 3840
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 3900
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 3960
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 4020
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 4080
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 4140
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 4200
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 4260
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 4320
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 4380
gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc 4440
ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg 4500
ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc 4560
tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tatggtgcac 4620
tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc gctatcgcta 4680
cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg 4740
gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg 4800
tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca 4860
gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt 4920
ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt 4980
tcctgtttgg tcactgatgc ctccgtgtaa gggggatttc tgttcatggg ggtaatgata 5040
ccgatgaaac gagagaggat gctcacgata cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta 5100
ctggaacgtt gtgagggtaa acaactggcg gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc 5160
actcagggtc aatgccagcg cttcgttaat acagatgtag gtgttccaca gggtagccag 5220
cagcatcctg cgatgcagat ccggaacata atggtgcagg gcgctgactt ccgcgtttcc 5280
agactttacg aaacacggaa accgaagacc attcatgttg ttgctcaggt cgcagacgtt 5340
ttgcagcagc agtcgcttca cgttcgctcg cgtatcggtg attcattctg ctaaccagta 5400
aggcaacccc gccagcctag ccgggtcctc aacgacagga gcacgatcat gctagtcatg 5460
ccccgcgccc accggaagga gctgactggg ttgaaggctc tcaagggcat cggtcgagat 5520
cccggtgcct aatgagtgag ctaacttaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 5580
cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 5640
ggtttgcgta ttgggcgcca gggtggtttt tcttttcacc agtgagacgg gcaacagctg 5700
attgcccttc accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag cggtccacgc tggtttgccc 5760
cagcaggcga aaatcctgtt tgatggtggt taacggcggg atataacatg agctgtcttc 5820
ggtatcgtcg tatcccacta ccgagatgtc cgcaccaacg cgcagcccgg actcggtaat 5880
ggcgcgcatt gcgcccagcg ccatctgatc gttggcaacc agcatcgcag tgggaacgat 5940
gccctcattc agcatttgca tggtttgttg aaaaccggac atggcactcc agtcgccttc 6000
ccgttccgct atcggctgaa tttgattgcg agtgagatat ttatgccagc cagccagacg 6060
cagacgcgcc gagacagaac ttaatgggcc cgctaacagc gcgatttgct ggtgacccaa 6120
tgcgaccaga tgctccacgc ccagtcgcgt accgtcttca tgggagaaaa taatactgtt 6180
gatgggtgtc tggtcagaga catcaagaaa taacgccgga acattagtgc aggcagcttc 6240
cacagcaatg gcatcctggt catccagcgg atagttaatg atcagcccac tgacgcgttg 6300
cgcgagaaga ttgtgcaccg ccgctttaca ggcttcgacg ccgcttcgtt ctaccatcga 6360
caccaccacg ctggcaccca gttgatcggc gcgagattta atcgccgcga caatttgcga 6420
cggcgcgtgc agggccagac tggaggtggc aacgccaatc agcaacgact gtttgcccgc 6480
cagttgttgt gccacgcggt tgggaatgta attcagctcc gccatcgccg cttccacttt 6540
ttcccgcgtt ttcgcagaaa cgtggctggc ctggttcacc acgcgggaaa cggtctgata 6600
agagacaccg gcatactctg cgacatcgta taacgttact ggtttcacat tcaccaccct 6660
gaattgactc tcttccgggc gctatcatgc cataccgcga aaggttttgc gccattcgat 6720
ggtgtccggg atctcgacgc tctcccttat gcgactcctg cattaggaag cagcccagta 6780
gtaggttgag gccgttgagc accgccgccg caaggaatgg tgcatgcaag gagatggcgc 6840
ccaacagtcc cccggccacg gggcctgcca ccatacccac gccgaaacaa gcgctcatga 6900
gcccgaagtg gcgagcccga tcttccccat cggtgatgtc ggcgatatag gcgcc 6955
<210> 3
<211> 513
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcgagatcg atctcgatcc cgcgaaatta atacgactca ctatagggga attgtgagcg 60
gataacaatt cccctctaga aataattttg tttaacttta agaaggagat ataccatggg 120
cagcagccat caccatcatc accacagcca ggatccgaat tcgagctcgg cgcgcctgca 180
ggtcgacaag cttgcggccg cataatgctt aagtcgaaca gaaagtaatc gtattgtaca 240
cggccgcata atcgaaattc gccccaccgg agccggcagg tatatactga tgtgtacggg 300
gaattgtgag cggataacaa ttccccatct tagtatatta gttaagtata agaaggagat 360
atacatatgg cagatctcaa ttggatatcg gccggccacg cgatcgctga cgtcggtacc 420
ctcgagtctg gtaaagaaac cgctgctgcg aaatttgaac gccagcacat ggactcgtct 480
actagcgcag cttaattaac ctaggctgct gcc 513
<210> 4
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgatctcga tcccgcgaaa ttcgccccac cggagccggc aggtatatac tgatgtgtac 60
ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag 120
gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattcgag 180
ctcggcgcgc ctgcaggtcg acaagcttgc ggccgcataa tgcttaagtc gaacagaaag 240
taatcgtatt gtacacggcc gcataatcga aattcgcccc accggagccg gcaggtatat 300
actgatgtgt acggggaatt gtgagcggat aacaattccc catcttagta tattagttaa 360
gtataagaag gagatataca tatggcagat ctcaattgga tatcggccgg ccacgcgatc 420
gctgacgtcg gtaccctcga gtctggtaaa gaaaccgctg ctgcgaaatt tgaacgccag 480
cacatggact cgtctactag cgcagcttaa ttaacctagg ctgctgcc 528
<210> 5
<211> 1745
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcgagatcg atctcgatcc cgcgaaattc gccccaccgg agccggcagg tatatactga 60
tgtgtacggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt 120
taagaaggag atataccatg ggcagcagcc atcaccatca tcaccacagc caggatccgc 180
gcgtgaccac gcaagccaac agcaatcagg ttcccgacgg ctgcgcgttc gtcatcttcg 240
gtgtcaccgg cgatctcacc caccgtctgg tgatcccggc gctgtacaat ctcgccgaag 300
ccgggctgct gccggagaaa ttctgcgtcg tcggagtcac ccgcaaggag atggcgagcg 360
acgatctgag agaaagcctg ttgcagggct tgcgcaaata cgccacccgc ccggtcgacg 420
acaaggtcgc cgatcagctt ctgtactgcg tcaccgcaat cagcgccgat ccgagcgaac 480
cggactcgtt cgaccggctg cgcgagcgcc tggaaaagct cgaggccaac cgcaacaccg 540
gtggcaaccg gctgttctac ctcgccaccc cgccggacgc gttcgcaccg atcgcgaccg 600
agctcggccg cgccaagctg ctcgaagaga ccagcggcgc gtggcgtcgg ctggtggtgg 660
agaagccgtt cggcaccgac ctcgcctcgg ccaaggcgct gaacgatcat ctgctcggca 720
tcatctccga gcacgagctg taccggatcg atcactacct cggcaaagag acggtgcaga 780
acatcctggt gctgcggttc tccaacggca tgttcgagcc gatctggaac cgcgagcaca 840
tcgrccacat ccagatcacc gtcgaggaaa agctcggcgt cggccatcgc ggcagsttct 900
acgacaagac cggcgcgctg cgcgacatgg tgccgaacca tctgttccaa ctgctgtcgc 960
tggtggcgat ggagccgccg gcgcatttca acgcccatgc ggtgcgatcc gccaaggctg 1020
atgtgttggc ggcaatccag atccagagcg aagacgaggc gctgcgcaat tcggtgcgcg 1080
gccaatacac ctccggcagg atcggcgaca acgagattcc cgactatcgc agcgccaagg 1140
acgtcgaacc ggacagtacc accgagacct tcgcggcact gaagctgtcg atcgacaatt 1200
ggcgctgggc cggcgtgccg ttctatctgc gcaccggcaa ggcgctgtcg ggcaagcgca 1260
ccgaggtcgc gatcaagttc aaacaggcgc cgttctcgat gttccgctgc accccggtgc 1320
gggaattgtc gcagaactat ctggtgatcg ggatcgagcc ggtcgaaggc atctcgctgc 1380
agttcaacac caaggtgccg ggcccggtga tcgcgatcga cggcgtcgag atgacgttca 1440
agtacgagga ctacttcaag gtggcgccga gcaacggcta cgaaacgctg ctgcacgact 1500
gcatgatcgg cgacaacatc ctgttccagc gcgccgacgg cgtcgaggcg ggatggcggg 1560
tggtgcagcc ctttctcgac gcctggaaga aagccggcgc ccacggcctg cagatctatc 1620
gcgccggcag cgaaggcccc gaagacgccg acgagttgct gacgcgcgat ggccgctgtt 1680
ggcggaaact gggctagccc aagcttgcgg ccgcataatg cttaagtcga acagaaagta 1740
atcgt 1745
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgcgtccgg cgtagaggat 20
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgccggctc cggtggggcg aatttcgatt atgcggccgt gtacaa 46
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtatatactg atgtgtacgg ggaattgtga gcggataa 38
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctagttatt gctcagcgg 19
<210> 10
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atcgagatcg atctcgtccc gcgaaatcgc cccaccggag ccggcaggta tatactgatg 60
tgtacgggga attgtgagcg gataacaatt cccctctaga aataatttt 109
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cggatccgcg cgtgaccacg caagcc 26
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cccaagcttg ggctagccca gtttccgcc 29
Claims (10)
1.一种大肠杆菌表达载体pRTDuet-1，其特征在于，所述表达载体由pETDuet-1构建而来，其中所述pETDuet-1的T7聚合酶启动子被沼泽红假单胞菌的磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子替代。
2.根据权利要求1所述的表达载体pRTDuet-1，其特征在于，所述表达载体pRTDuet-1的核苷酸序列为序列号1所示的序列。
3.一种大肠杆菌表达载体pRTD-G，其特征在于，所述表达载体由权利要求2所述的pRTDuet-1构建而来，所述pRTD-G还包括目的基因，所述目的基因为6-磷酸葡萄糖脱氢酶(g6pdh)基因。
4.根据权利要求3所述的表达载体pRTD-G，其特征在于，所述目的基因来自于沼泽红假单胞菌。
5.根据权利要求4所述的表达载体pRTD-G，其特征在于，所述表达载体pRTD-G的核苷酸序列为序列号2所示的序列。
6.权利要求2所述表达载体pRTDuet-1以及权利要求5所述表达载体pRTD-G的构建方法，其特征在于，包括步骤：
(1)获得重组载体1，所述重组载体1包括了将pETDuet-1质粒MCSII区T7启动子替换为沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子的含酶切位点的片段和pETDuet-1多克隆位点区域片段；所述重组载体1具有序列号3所示的序列；
(2)获得重组载体2，所述重组载体2包括了将pETDuet-1质粒MCSII区和MCS1区的两个T7启动子均替换为沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子的含酶切位点的片段和pETDuet-1多克隆位点区域片段，所述重组载体2具有序列号4所示的序列；
(3)重组载体2和pETDuet-1质粒分别酶切，将酶切后片段连接后获得pRTDuet-1质粒；
(4)获得重组载体3，所述重组载体3为含6-磷酸葡萄糖脱氢酶(g6pdh)基因的片段；所述重组载体3具有序列号5所示的序列；
(5)将重组载体3与pRTDuet-1质粒分别酶切，将酶切后片段连接后获得pRTD-G质粒。
7.根据权利要求 6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为根据沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子序列和pETDuet-1质粒酶切位点设计两段式扩增引物对1与扩增引物对2；两段式扩增沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子，获得两段启动子片段，连接两段启动子片段，获得连接产物；将连接产物与克隆载体pBM20-T连接，获得重组载体1；所述引物对1的核苷酸序列分别如序列号6和序列号7所示序列，所述引物对2的核苷酸序列分别如序列号8和序列号9所示序列。
8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为根据沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子序列和pETDuet-1质粒MCSI区序列设计含酶切位点的长引物3；扩增长引物3和重组载体1的酶切片段，获得扩增产物，将扩增产物与克隆载体pBM20-T连接，获得重组载体2；所述长引物3的核苷酸序列为序列号10所示序列。
9.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)具体为根据pRTDuet-1质粒上的酶切位点设计引物对4，利用引物对4扩增6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(g6pdh)基因片段；获得的基因片段与克隆载体pBM20-T连接，获得重组载体3；所述引物对4的核苷酸序列分别如序列号11和序列号12所示序列。
10.权利要求2所述表达载体pRTDuet-1以及权利要求5所述表达载体pRTD-G在不含T7聚合酶基因的大肠杆菌中的应用。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20220201 |