KR101587618B1 - 4-하이드록시부티릭산 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 4-하이드록시부티릭산의 제조방법 - Google Patents

4-하이드록시부티릭산 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 4-하이드록시부티릭산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 4-하이드록시부티릭산 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 4-하이드록시부티릭산의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 4-하이드록시부티릭산의 생성능을 증가시키기 위해 숙신산으로부터 4-하이드록시부티릭산을 합성하는 유전자가 증폭되어 있고, 보충 회로(anaplerotic pathway) 유전자가 증폭되어 있으며, 경쟁 유전자들이 결실되어 있는 4-하이드록시부티릭산 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 미 호기성(micro-aerobic) 조건하에서 배양하여 4-하이드록시부티릭산을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하고, 이를 이용함으로써, 4-하이드록시부티릭산을 고수율로 제조하는데 유용하다.

Description

4-하이드록시부티릭산 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 4-하이드록시부티릭산의 제조방법 {Mutants Having a High Producing Ability of 4-Hydroxybutyrate and Preparing Method for 4-Hydroxybutyrate Using the Same}
본 발명은 4-하이드록시부티릭산 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 4-하이드록시부티릭산의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 4-하이드록시부티릭산의 생성능을 증가시키기 위해 숙신산으로부터 4-하이드록시부티릭산을 합성하는 유전자가 증폭되어 있고, 보충 회로(anaplerotic pathway) 유전자가 증폭되어 있으며, 경쟁 유전자들이 결실되어 있는 4-하이드록시부티릭산 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 미 호기성(micro-aerobic) 조건하에서 배양하여 4-하이드록시부티릭산을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
4-하이드록시부티릭산은 생물학적으로 1,4-부탄디올 (1,4-butanediol) 또는 γ-부틸로락톤(gamma-butyrolactone)과 같은 중요한 C4 화합물의 전구체로 쓰일 수 있으며, 또한 다양한 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate)의 단량체로 이용되고 있다. 또한 Sodium 형태의 4-하이드록시부티릭산은 Xyrem이라는 약으로써, 기면증 환자에 쓰입니다. 현재 1g에 약 18 $에 판매되고 있다.
현재 미생물을 통한 4-하이드록시부티릭산 생산의 경우 고분자로써만 국한되어 있을 뿐, 4-하이드록시부티릭산을 단독적으로 생산하지는 못하고 있다. 고분자의 형태로 4-하이드록시부티릭산을 생성하게 되면, 상기에서 언급한 1,4-부탄디올 및 γ-부틸로락톤을 생물학적으로 생산할 때, 고분자를 단량체로 끊어야 하기 때문에 효율적이지 못한 문제점이 있다. 따라서, 4-하이드록시부티릭산을 고분자가 아닌 단독적으로 생산하는 균주를 개발하고, 이에 1,4-부탄디올이나 및 γ-부틸로락톤에 필요한 효소를 추가적으로 도입하면, 1,4-부탄디올 및 γ-부틸로락톤 단량체를 쉽게 생산할 수 있을 것으로 보고 이에 대한 연구가 진행중이다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 4-하이드록시부티릭산을 생산하는 미생물에서, 숙신산으로부터 4-하이드록시부티릭산의 합성에 관여하는 유전자를 증폭시키고, 추가적으로 4-하이드록시부티릭산의 전구체인 숙신산 생산에 관여하는 보충 회로(anaplerotic pathway) 유전자를 증폭시키고, 4-하이드록시부티릭산 생산의 경쟁 경로에 관여하는 유전자들을 약화 또는 결실시키고, 산화적 회로(oxidative pathway)에 관여하는 유전자들을 약화 또는 결실시키거나, 변이시켜 증폭시킬 경우, 4-하이드록시부티릭산 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제조할 수 있다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 4-하이드록시부티릭산의 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이 미생물의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이 미생물을 미 호기성(micro-aerobic) 조건에서 배양하여, 4-하이드록시부티릭산을 고수율로 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 코에이 트랜스퍼라아제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(cat1), 숙시닐-코에이 합성효소(succinyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자(sucCD), 코에이-의존적 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(sucD) 및 4-하이드록시부티릭산 디하이드로게나아제(4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(4 hbD 또는 yqhD)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 변이 미생물은 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 포스포엔올피루빅산 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase)를 코딩하는 유전자(pckA), 포스포엔올피루브산 카르복실라아제(phosphoenolpyrutave carboxylase)를 코딩하는 유전자(ppc) 및 피루빅산 카르복실라아제(pyruvate carboxylase)를 코딩하는 유전자(pyc)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 추가로 증폭되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 변이 미생물은 산화적 회로(oxidative pathway)에 관여하는 유전자 중 (ⅰ) NADH에 의한 저해가 제거되도록 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)를 코딩하는 유전자(gltA)가 추가로 증폭; (ⅱ) 유기호흡 조절 단백질(aerobic respiration control protein)을 코딩하는 유전자 (arcA)가 추가로 약화 또는 결실; 또는 (ⅲ) NADH에 의한 저해가 제거되도록 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)를 코딩하는 유전자(gltA)가 추가로 증폭되고, 동시에 유기호흡 조절 단백질(aerobic respiration control protein)을 코딩하는 유전자 (arcA)가 추가로 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 변이 미생물은 4-하이드록시부티릭산의 생산 경쟁 경로에 관여하는 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gabD 또는 yneI), 젖산 디하이드로게나아제 (lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(ldhA), 피루빅산-포름산 리아제(pyruvate formate lyase)를 코딩하는 유전자(pflB), 알코올 디하이드로게나아제(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adhE) 및 PTS 시스템의 PEP-단백질 포스포트랜스퍼라아제(PEP-protein phosphotransferase of PTS system)를 코딩하는 유전자(ptsI 또는 ptsG)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 추가로 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 변이 미생물은 4-하이드록시부티릭산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 코에이-의존적 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 (sucD)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 포스포엔올피루빅산 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase)를 코딩하는 유전자(pckA), 포스포엔올피루브산 카르복실라아제(phosphoenolpyrutave carboxylase)를 코딩하는 유전자(ppc) 및 피루빅산 카르복실라아제(pyruvate carboxylase)를 코딩하는 유전자(pyc)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, (A) 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 숙시닐-코에이 합성효소(succinyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자(sucCD)가 증폭되어 있고, (B) 4-하이드록시부티릭산의 생산 경쟁 경로에 관여하는 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gabD 및 yneI), 젖산 디하이드로게나아제 (lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(ldhA), 피루빅산-포름산 리아제(pyruvate formate lyase)를 코딩하는 유전자(pflB), 알코올 디하이드로게나아제(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adhE) 및 PTS 시스템의 PEP-단백질 포스포트랜스퍼라아제(PEP-protein phosphotransferase of PTS system)를 코딩하는 유전자(ptsI 또는 ptsG)가 약화 또는 결실되어 있으며, (C) 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 포스포엔올피루빅산 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase)를 코딩하는 유전자(pckA), 포스포엔올피루브산 카르복실라아제(phosphoenolpyrutave carboxylase)를 코딩하는 유전자(ppc) 및 피루빅산 카르복실라아제(pyruvate carboxylase)를 코딩하는 유전자(pyc)로 구성된 군에서 선택되는 유전자가 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (A) 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 숙시닐-코에이 합성효소(succinyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자(sucCD)가 증폭되어 있고, (B) 4-하이드록시부티릭산의 생산 경쟁 경로에 관여하는 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gabD 및 yneI), 젖산 디하이드로게나아제 (lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(ldhA), 피루빅산-포름산 리아제(pyruvate formate lyase)를 코딩하는 유전자(pflB), 알코올 디하이드로게나아제(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adhE) 및 PTS 시스템의 PEP-단백질 포스포트랜스퍼라아제(PEP-protein phosphotransferase of PTS system)를 코딩하는 유전자(ptsI 또는 ptsG)가 약화 또는 결실되어 있으며, (C) 산화적 회로(oxidative pathway)에 관여하는 유전자 중 (ⅰ) NADH에 의한 저해가 제거되도록 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)를 코딩하는 유전자(gltA)가 증폭; (ⅱ) 유기호흡 조절 단백질(aerobic respiration control protein)을 코딩하는 유전자 (arcA)가 약화 또는 결실; 또는 (ⅲ) NADH에 의한 저해가 제거되도록 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)를 코딩하는 유전자(gltA)가 증폭되고, 동시에 유기호흡 조절 단백질(aerobic respiration control protein)을 코딩하는 유전자 (arcA)가 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (A) 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 숙시닐-코에이 합성효소(succinyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자(sucCD)가 증폭되어 있고, (B) 4-하이드록시부티릭산의 생산 경쟁 경로에 관여하는 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gabD 및 yneI), 젖산 디하이드로게나아제 (lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(ldhA), 피루빅산-포름산 리아제(pyruvate formate lyase)를 코딩하는 유전자(pflB), 알코올 디하이드로게나아제(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adhE) 및 PTS 시스템의 PEP-단백질 포스포트랜스퍼라아제(PEP-protein phosphotransferase of PTS system)를 코딩하는 유전자(ptsI 또는 ptsG)가 약화 또는 결실되어 있고, (C) 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 포스포엔올피루빅산 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase)를 코딩하는 유전자(pckA), 포스포엔올피루브산 카르복실라아제(phosphoenolpyrutave carboxylase)를 코딩하는 유전자(ppc) 및 피루빅산 카르복실라아제(pyruvate carboxylase)를 코딩하는 유전자(pyc)로 구성된 군에서 선택되는 유전자가 증폭되어 있으며, (D) 산화적 회로(oxidative pathway)에 관여하는 유전자 중 (ⅰ) NADH에 의한 저해가 제거되도록 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)를 코딩하는 유전자(gltA)가 증폭; (ⅱ) 유기호흡 조절 단백질(aerobic respiration control protein)을 코딩하는 유전자 (arcA)가 약화 또는 결실; 또는 (ⅲ) NADH에 의한 저해가 제거되도록 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)를 코딩하는 유전자(gltA)가 증폭되고, 동시에 유기호흡 조절 단백질(aerobic respiration control protein)을 코딩하는 유전자 (arcA)가 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 미생물을 배양하여 4-하이드록시부티릭산을 생성시킨 다음, 4-하이드록시부티릭산을 회수하는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이 미생물은 4-하이드록시부티릭산을 고수율로 제조하는데 유용하다.
도 1은 글루코즈로부터 4-하이드록시부티릭산의 합성경로를 나타내는 모식도이다.
본 발명에서 "약화"란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나 일부 염기를 도입시켜 해당유전자에 의해 발현되는 효소의 활성을 감소시키는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로의 일부 또는 상당부분을 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서 '결실'이란 해당 유전자의 일부 또는 전체 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시켜 해당유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 효소활성을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로를 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서 "증폭"이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 동일한 효소를 코딩하는 다른 미생물 유래의 유전자를 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 증가시키는 것을 포괄하는 개념이다.
도 1은 글루코즈로부터 4-하이드록시부티릭산의 합성경로를 나타내는 모식도이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 4-하이드록시부티릭산의 합성에 관여하는 유전자(cat1, sucCD, sucD, yqhD 또는 4 hbD) 유전자를 증폭시키면 4-하이드록시부티릭산의 생성능을 높일 수 있음을 확인하고자 하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 먼저 대장균의 경우, 코에이-의존적 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제 (CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 (sucD)가 존재하지 않기 때문에 Clostridium kluyveri 유래의 sucD를 도입하였다. 그 결과, 본래 야생형 대장균은 4-하이드록시부티릭산을 생산하지 못하지만 sucD를 도입시킨 변이 미생물은 4-하이드록시부티릭산을 생산하는 것을 확인하였다.
그 다음, 4-하이드록시부티릭산 디하이드로게나아제 (4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자인 E. coli 유래의 yqhD와 C. kluyveri 유래의4hbD를 각각 sucD와 같이 증폭하였다. 그 결과 sucD만 증폭했을 때보다 두 경우 모두 4-하이드록시부티릭산의 생산이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 통해 yqhD 및 4hbD가 4-하이드록시부티릭산에 효과가 있음을 입증하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 C. kluyveri 유래의 코에이-트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자(cat1)과 E. coli 유래의 숙시닐-코에이 합성효소를 코딩하는 유전자 (sucCD)를 각각 sucD 및 4hbD와 같이 증폭하였다. 그 결과 sucD 와 4hbD만 증폭했을 때보다, 두 경우 모두 4-하이드록시부티릭산의 생산이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 통해 cat1 및 yqhD가 4-하이드록시부티릭산에 효과가 있음을 입증하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 코에이 트랜스퍼라아제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(cat1), 숙시닐-코에이 합성효소(succinyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자(sucCD), 코에이-의존적 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(sucD) 및 4-하이드록시부티릭산 디하이드로게나아제(4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(4 hbD 또는 yqhD)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서는 또한, 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 유전자가 증폭되어 있는 변이 미생물에 4-하이드록시부티릭산 생산의 경쟁 경로에 관여하는 유전자들을 약화 또는 결실시킬 경우 4-하이드록시부티릭산의 생성능을 증가시킬 수 있을 것으로 예측하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 앞서 언급한 4-하이드록시부티릭산의 합성에 관여하는 코에이-의존적 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(sucD), 숙시닐-코에이 합성효소 (succinyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자(sucCD) 및 4-하이드록시부티릭산 디하이드로게나아제 (4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(yqhD)를 함께 증폭시킨 균주에 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제 (succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gabD 또는 yneI )를 결실시킨 변이 미생물을 제조하였다. 그 결과 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제 (succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gabD 또는 yneI )를 결실시키지 않은 균주보다 4-하이드록시부티릭산 생성능이 향상되었음을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 gabD 및 yneI 유전자가 결실된 균주에 젖산 디하이드로게나아제(lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(ldhA)를 결실시키고, 4-하이드록시부티릭산의 합성에 관여하는 유전자(sucCD, sucD 또는 yqhD) 유전자를 증폭시킨 변이 미생물을 제조하였다. 그 결과 젖산 디하이드로게나아제(lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(ldhA)를 결실 시키지 않은 균주보다 4-하이드록시부티릭산 생성능이 향상되었음을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 gabD, yneI 및 ldhA 유전자가 결실된 균주에 알코올 디하이드로게나아제 (alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adhE)를 결실시키고, 4-하이드록시부티릭산의 합성에 관여하는 유전자(sucCD, sucD 또는 yqhD) 유전자를 증폭시킨 변이 미생물을 제조하였다. 그 결과 알코올 디하이드로게나아제 (alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adhE)를 결실 시키지 않은 균주보다 4-하이드록시부티릭산 생성능이 향상되었음을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 gabD, yneI, ldhA 및 adhE가 결실된 균주에 피루빅산-포름산 리아제 (pyruvate formate lyase)를 코딩하는 유전자(pflB)를 결실시키고, 4-하이드록시부티릭산의 합성에 관여하는 유전자(sucCD, sucD 또는 yqhD) 유전자를 증폭시킨 변이 미생물을 제조하였다. 그 결과 피루빅산-포름산 리아제 (pyruvate formate lyase)를 코딩하는 유전자(pflB )를 결실 시키지 않은 균주보다 4-하이드록시부티릭산 생성능이 향상되었음을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 gabD, yneI, ldhA ,adhE 및 pflB가 결실된 균주에 PTS 시스템의 PEP-단백질 포스포트랜스퍼라아제(PEP-protein phosphotransferase of PTS system)를 코딩하는 유전자(ptsI 또는 ptsG)를 결실시키고, 4-하이드록시부티릭산의 합성에 관여하는 유전자(sucCD, sucD 또는 yqhD) 유전자를 증폭시킨 변이 미생물을 제조하였다. PTS 시스템의 PEP-단백질 포스포트랜스퍼라아제(PEP-protein phosphotransferase of PTS system)를 코딩하는 유전자(ptsI 또는 ptsG)를 결실시킨 변이 미생물을 제조하였다. 그 결과 ptsI 또는 ptsG를 결실시키지 않은 균주보다 4-하이드록시부티릭산 생성능이 향상되었음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 상기 4-하이드록시부티릭산의 합성에 관여하는 유전자(cat1, sucCD, sucD, yqhD 또는 4 hbD)가 증폭되어 있는 변이 미생물 또는 상기 4-하이드록시부티릭산의 합성에 관여하는 유전자(cat1, sucCD, sucD, yqhD 또는 4hbD) 및 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 유전자(pckA, ppc 또는 pyc)가 증폭되어 있는 변이 미생물은 4-하이드록시부티릭산의 생산 경쟁 경로에 관여하는 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gabD 또는 yneI), 젖산 디하이드로게나아제 (lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(ldhA), 피루빅산-포름산 리아제(pyruvate formate lyase)를 코딩하는 유전자(pflB), 알코올 디하이드로게나아제(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adhE) 및 PTS 시스템의 PEP-단백질 포스포트랜스퍼라아제(PEP-protein phosphotransferase of PTS system)를 코딩하는 유전자(ptsI 또는 ptsG)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 추가로 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 또한, 4-하이드록시부티릭산의 생산을 강화하기 위해, 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 유전자가 증폭되어 있고, 4-하이드록시부티릭산 생산의 경쟁 경로에 관여하는 유전자들이 약화 또는 결실되어 있는 변이 미생물에 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 유전자(pckA , ppc 또는 pyc)를 추가로 증폭시킬 경우, 4-하이드록시부티릭산의 생성능을 증가시킬 수 있을 것으로 예측하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 앞서 언급한 4-하이드록시부티릭산의 합성에 관여하는 숙시닐-코에이 합성효소 (succinyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자(sucCD)를 증폭시키고, 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gabD, yneI), 젖산 디하이드로게나아제 (lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(ldhA), 피루빅산-포름산 리아제(pyruvate formate lyase)를 코딩하는 유전자(pflB), 알코올 디하이드로게나아제(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adhE) 및 PTS 시스템의 PEP-단백질 포스포트랜스퍼라아제(PEP-protein phosphotransferase of PTS system)를 코딩하는 유전자(ptsI 또는 ptsG)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 결실시킨 균주에 포스포엔올피루빅산 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase)를 코딩하는 유전자(pckA), 포스포엔올피루브산 카르복실라아제(phosphoenolpyrutave carboxylase)를 코딩하는 유전자(ppc) 및 피루빅산 카르복실라아제(pyruvate carboxylase)를 코딩하는 유전자(pyc)를 각각 증폭시킨 변이 미생물을 제조하였다. 그 결과 pckA , ppc 또는 pyc 유전자를 증폭시키지 않은 균주보다 4-하이드록시부티릭산 생성능이 향상되었음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 상기 4-하이드록시부티릭산의 합성에 관여하는 유전자(cat1, sucCD, sucD, yqhD 또는 4 hbD)가 증폭되어 있는 변이 미생물은 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 포스포엔올피루빅산 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase)를 코딩하는 유전자(pckA), 포스포엔올피루브산 카르복실라아제(phosphoenolpyrutave carboxylase)를 코딩하는 유전자(ppc) 및 피루빅산 카르복실라아제(pyruvate carboxylase)를 코딩하는 유전자(pyc)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 추가로 증폭되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 코에이-의존적 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 (sucD)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입되고, 상기 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 포스포엔올피루빅산 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase)를 코딩하는 유전자(pckA), 포스포엔올피루브산 카르복실라아제(phosphoenolpyrutave carboxylase)를 코딩하는 유전자(ppc) 및 피루빅산 카르복실라아제(pyruvate carboxylase)를 코딩하는 유전자(pyc)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입된 것을 특징으로 한다.
상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter, trp promoter 등을 예시할 수 있다.
본 발명에서는 또한, 4-하이드록시부티릭산의 생산을 강화하기 위해, 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 유전자가 증폭되어 있고, 4-하이드록시부티릭산 생산의 경쟁 경로에 관여하는 유전자들이 약화 또는 결실되어 있는 변이 미생물 또는 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 유전자가 증폭되어 있고, 4-하이드록시부티릭산 생산의 경쟁 경로에 관여하는 유전자들이 약화 또는 결실되어 있고, 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 유전자(pckA , ppc 또는 pyc)가 증폭되어 있는 변이 미생물에 산화적 회로(oxidative pathway)에 관여하는 유전자 중 NADH에 의한 저해가 제거되도록 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)를 코딩하는 유전자(gltA)를 추가로 증폭하거나 유기호흡 조절 단백질(aerobic respiration control protein)을 코딩하는 유전자 (arcA)를 추가로 약화 또는 결실시킬 경우, 4-하이드록시부티릭산의 생성능을 증가시킬 수 있을 것으로 예측하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 앞서 설명한 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 유전자가 증폭되어 있고, 4-하이드록시부티릭산 생산의 경쟁 경로에 관여하는 유전자들이 약화 또는 결실되어 있는 변이 미생물 또는 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 유전자가 증폭되어 있고, 4-하이드록시부티릭산 생산의 경쟁 경로에 관여하는 유전자들이 약화 또는 결실되어 있고, 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 유전자(pckA , ppc 또는 pyc)가 증폭되어 있는 변이 미생물에 산화적 회로(oxidative pathway)에 관여하는 유전자 중 NADH에 의한 저해가 제거되도록 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)를 코딩하는 유전자(gltA)를 추가로 증폭시켜 CS16/p99SC4CD/p15PpcGltAR163L를 제조하였고, 여기에 추가로 4-하이드록시부티릭산 생산의 경쟁 경로에 관여하는 유전자(arcA)가 결실된 CS28/p99SC4CD/p15PpcGltAR163L를 제조하고, 이들의 4-하이드록시부티릭산의 생성능을 증가되었음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 유전자가 증폭되어 있고, 4-하이드록시부티릭산 생산의 경쟁 경로에 관여하는 유전자들이 약화 또는 결실되어 있는 변이 미생물 또는 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 유전자가 증폭되어 있고, 4-하이드록시부티릭산 생산의 경쟁 경로에 관여하는 유전자들이 약화 또는 결실되어 있고, 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 유전자(pckA , ppc 또는 pyc)가 증폭되어 있는 변이 미생물은 산화적 회로(oxidative pathway)에 관여하는 유전자 중 (ⅰ) NADH에 의한 저해가 제거되도록 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)를 코딩하는 유전자(gltA)가 추가로 증폭; (ⅱ) 유기호흡 조절 단백질(aerobic respiration control protein)을 코딩하는 유전자 (arcA)가 추가로 약화 또는 결실; 또는 (ⅲ) NADH에 의한 저해가 제거되도록 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)를 코딩하는 유전자(gltA)가 추가로 증폭되고, 동시에 유기호흡 조절 단백질(aerobic respiration control protein)을 코딩하는 유전자 (arcA)가 추가로 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)는 4-하이드록시부티릭산의 생성능을 향상시키기 위한 것으로서, NADH에 의한 저해가 제거된 것이라면 돌연변이의 위치나 종류는 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 글루코즈로부터 4-하이드록시부티릭산을 생성하는 미생물이면 제한없이 사용할 수 있으며, 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 사카로마이세스 속( Saccharomyces sp.) 등을 예시할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에 있어서, 상기 변이 미생물을 배양하여 4-하이드록시부티릭산을 생성시킨 다음, 4-하이드록시부티릭산을 회수하는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 변이 미생물의 배양 및 4-하이드록시부티릭산의 수득 과정은 종래 발효공정에서 통상적으로 알려진 배양방법(회분식 배양, 유가식 배양) 및 4-하이드록시부티릭산의 분리 및 정제방법을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 4-하이드록시부티릭산의 생물공학적 생산은 세포 내 혹은 세포 외(in vivo or in vitro)에서 수행될 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 유전자를 제거하기 위하여 특정 벡터와 숙주세포로 4-하이드록시부티릭산 생성 미생물인 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 미생물만을 예시하였으나, 다른 종류의 벡터와 4-하이드록시부티릭산 생성 미생물들을 사용하는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예 1: 4-하이드록시부티릭산 생산에 관여하는 유전자들의 증폭과 증폭된 변이 미생물의 제조
1-1: 플라스미드 p99SucD의 제작
항시적, 생합성적 Clostridium kluyver i(DSM 555)의 CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자 sucD를 trc promoter의 강한 유전자 발현을 진행하는 pTrc99a (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 발현벡터에 클로닝하였다. C. kluyveri의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 1과 2의 프라이머를 이용하여, PCR을 수행함으로써, sucD 절편을 제조하였다.
이때, PCR 조건은 다음과 같다. step 1 : 95℃, 2 min; step 2 : 95℃, 20 sec; step 3 : 55℃, 30 sec; step 4 : 72℃, 1 min; step 2 ~ step 4 28회 반복; step 5 : 72℃, 7 min; step 6 : 4℃ 유지.
[서열번호 1]: 5'-GCGATAGAATTCATGAGTAATGAAGTATCTATAAAAGAATT AATTG-3'
[서열번호 2]: 5'-GCATATGAGCTCTTATCCCCATATTTCCTCATAGCTA-3'
다음으로 제조된 sucD 절편 및 pTrc99a 플라스미드에 제한효소(EcoRI 와 SacI)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 sucD 절편 및 pTrc99a 플라스미드를 중합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 벡터 p99SucD를 제작하였다.
1-2: 플라스미드 p99SYn의 제작
항시적, 생합성적 E. coli W3110(ATCC 39936) (derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic)의 NAD(P) dependent alcohol dehydrogenase를 코딩하는 유전자 yqhD를 상기 1-1에서 제조된 p99SucD에 클로닝 하였다. 발현은 yqhD 유전자 앞의 RBS(ribosome binding site)에 의해 sucD유전자 앞에 있는 trc promoter의 영향을 받는다. E. coli W3110(ATCC 39936) (derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 3과 4의 프라이머를 이용하여, 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, yqhD 절편을 제조하였다.
[서열번호 3]: 5'-ATTGATGAGCTCGGAGCAAGTAATGAACAACTTTAAT-3'
[서열번호 4]: 5'-CTTGTCTCTAGATTAGCGGGCGGCTTCGTATA-3'
다음으로 제조된 yqhD 절편 및 p99SucD 플라스미드에 제한효소(SacI 과 XbaI)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 yqhD 절편 및 p99SucD 플라스미드를 중합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 벡터 p99SYn을 제작하였다.
1-3: 플라스미드 p99SC4의 제작
항시적, 생합성적 Clostridium kluyveri(DSM 555)의 4-hydroxybutyrate dehydrogenase를 코딩하는 유전자 4hbD를 상기 1-1에서 제작된 p99SucD에 클로닝 하였다. 발현은 4hbD 유전자 앞의 RBS(ribosome binding site)에 의해 sucD 유전자 앞에 있는 trc promoter의 영향을 받는다. C. kluyveri의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 5과 6의 프라이머를 이용하여, 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, 4hbD 절편을 제조하였다.
[서열번호 5]: 5'-GATATAGAGCTCACAGGAAACAATGAAGTTATTAAAATTGG CACCTG-3'
[서열번호 6]: 5'-GCCAGCTCTAGATTAATATAACTTTTTATATGTGTTTACTA TGTCTTC-3'
다음으로 제조된 4hbD 절편 및 p99SucD 플라스미드에 제한효소(SacI 과 XbaI)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 4hbD 절편 및 p99SucD 플라스미드를 중합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 벡터 p99SC4를 제작하였다.
1-4: 플라스미드 p99SC4C1의 제작
항시적, 생합성적 Clostridium kluyveri(DSM 555)의 CoA transferase 를 코딩하는 유전자 cat1을 상기 1-3에서 제작된 p99SC4에 클로닝 하였다. 발현은 cat1 유전자 앞의 RBS(ribosome binding site)에 의해 SucD 유전자 앞에 있는 trc promoter의 영향을 받는다. C. kluyveri의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 7과 8의 프라이머를 이용하여, 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, cat1 절편을 제조하였다.
[서열번호 7]: 5'-GTTATATCTAGAACAGGAAACAATGAGTAAAGGGATAAAGA ATTCACAA-3'
[서열번호 8]: 5'-ATAATCTCTAGAACAGGAAACAATGAACTTACATGAATATCA GGCA-3'
다음으로 제조된 cat1 절편 및 p99SC4 플라스미드에 제한효소(XbaI 과 SbfI)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 cat1 절편 및 p99SC4 플라스미드를 중합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 벡터 p99SC4C1을 제작하였다.
1-5: 플라스미드 p99SC4CD의 제작
항시적, 생합성적 E. coli W3110(ATCC 39936) (derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic)의 succinyl-CoA synthase beta subunit를 코딩하는 유전자(sucC)와 succinyl-CoA synthase alpha subunit를 코딩하는 유전자(sucD)를 상기 1-3에서 제작된 p99SC4에 클로닝 하였다. sucC와 sucD의 경우 오페론으로써 게놈상에서 한 promoter에 의해 조절되며 같이 붙어있다. 또한 두 유전자는 각각 succinyl-CoA synthase의 한 부분을 코딩하고 발현된 단백질이 합쳐져 succinyl-CoA synthase의 기능을 한다. 이하 두 유전자를 합쳐서 sucCD라 하고 succinyl-CoA synthase beta subunit과 succinyl-CoA synthase alpha subunit를 합쳐서 succinyl-CoA synthase라 한다. 발현은 sucCD 유전자 앞의 RBS(ribosome binding site)에 의해 sucD 유전자 앞에 있는 trc promoter의 영향을 받는다. E. coli W3110(ATCC 39936) (derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 9과 10의 프라이머를 이용하여, 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, sucCD 절편을 제조하였다.
[서열번호 9]: 5'-ATAATCTCTAGAACAGGAAACAATGAACTTACATGAATATCA GGCA-3'
[서열번호 10]: 5'-ATACTTCCTGCAGGTTATTTCAGAACAGTTTTCAGTGCT-3'
다음으로 제조된 sucCD 절편 및 p99SC4 플라스미드에 제한효소(XbaI 과 SbfI)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 sucCD 절편 및 p99SC4 플라스미드를 중합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 벡터 p99SC4CD을 제작하였다.
1-6: 플라스미드 p99SYnCD의 제작
항시적, 생합성적 E. coli W3110(ATCC 39936) (derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic)의 succinyl-CoA synthase를 코딩하는 유전자(sucCD)를 상기 1-2에서 제작된 p99SYn에 클로닝 하였다. 발현은 sucCD 유전자 앞의 RBS(ribosome binding site)에 의해 suc D유전자 앞에 있는 trc promoter의 영향을 받는다. E. coli W3110(ATCC 39936) (derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 1-5에서 제조한 합성된 서열번호 9과 10의 프라이머를 이용하여, 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, sucCD 절편을 제조하였다.
다음으로 제조된 sucCD 절편 및 p99SYn 플라스미드에 제한효소(XbaI 과 SbfI)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 sucCD 절편 및 p99SYn 플라스미드를 중합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 벡터 p99SYnCD를 제작하였다.
1-7: WL3110/p99SucD 균주의 제조
본 발명자가 한국공개특허 제2009-0018781호에서 개시한 방법으로 제조한 WL3110 균주(W3110 ΔlacI)에 상기 1-1에서 제조된 p99SucD 벡터를 도입시켜 WL3110/p99SucD 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar) 고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
참고로, WL3110 균주(W3110 ΔlacI)는 다음의 방법으로 제조할 수 있다.
서열번호 11과 12의 프라이머, 주형으로써 플라스미드인 pECmulox를 사용하여 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, lacI 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하였다.
다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, λ recombinase를 함유하는 전기충격용 대장균(W3110)에 electroporation하여 WL3110(W3110 ΔlacI)를 제조하였다.
[서열번호 11] : 5'-GTGAAACCAGTAACGTTATACGATRTCGCAGAGTATGCCG GTGTCTCTTAGATTGGCAGCATTACACGTCTTG-3'
[서열번호 12] : 5'-TCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGC TGCATTAATGCACTTAACGGCTGACATGGG-3'
1-8: WL3110 / p99SYn 균주의 제조
WL3110 균주(W3110 ΔlacI)에 상기 1-2에서 제조된 p99SYn 벡터를 도입시켜 WL3110/p99SucD 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
1-9: WL3110/p99SC4 균주의 제조
WL3110 균주(W3110 ΔlacI)에 상기 1-3에서 제조된 p99SC4 벡터를 도입시켜 WL3110/p99SC4 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
1-10: WL3110/p99SC4C1 균주의 제조
WL3110 균주(W3110 ΔlacI)에 상기 1-4에서 제조된 p99SC4C1 벡터를 도입시켜 WL3110/p99SC4C1 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
1-11: WL3110/p99SC4CD 균주의 제조
WL3110 균주(W3110 ΔlacI)에 상기 1-5에서 제조된 p99SC4CD 벡터를 도입시켜 WL3110/p99SC4CD균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
1-12: WL3110/p99SYnCD 균주의 제조
WL3110 균주(W3110 ΔlacI)에 상기 1-6에서 제조된 p99SYnCD 벡터를 도입시켜 WL3110/p99SYnCD균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
실시예 2: 4-하이드록시부티릭산 생산 유전자들이 증폭된 변이 미생물을 이용한 4-하이드록시부티릭산의 제조
실시예 1에서 제조된 하기 표 1의 변이 미생물들을 4g/L (NH4)2HPO4, 6.67g/L KH2PO4, 0.8g/L citric acid, 0.8g/L MgSO4·7H2O, 0.5% (v/v) trace metal solution으로 구성되는 최소 MR배지(Jung, Y.K., Kim, T.Y., Park, S.J., and Lee, S.Y., Biotechnol . Bioeng., 105(1): 161- 171, 2010)에서 플라스크 컬쳐하였다. Trace metal solution은 1리터당 5M HCl: 10g FeSO4·7H2O, 2.25g ZnSO4·7H2O, 1g CuSO4·5H2O, 0.5g MnSO4·5H2O, 0.23g Na2B4O7·10H2O, 2g CaCl2·2H2O, 및 0.1g (NH4)6Mo7O24을 포함한다. 포도당(100g/l) 저장 용액 및 NaHCO3(60g/l)는 별도로 멸균시켰고, 각각 최종 농도 10g/l 및 6g/l까지 멸균된 배지에 추가 하였다.
4-하이드록시부티릭산 생산을 위해 먼저 엠피실린(ampicillin)(50㎍/㎖)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 형질전환 균주를 10㎖ LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 배양액중 3mL을 동일한 배지 100mL을 포함하는 anaerobic flask에 첨가한 후, 5시간 동안 세포의 농도를 높이기 위해 37℃, 220 rpm으로 배양하였다. 다음으로 micro-aerobic 조건으로 전환하기 위해 질소가스를 10분정도 charging 하였으며, 동시에 클로닝된 유전자들의 발현 유도를 위해 IPTG(Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside) 1M용액 100㎕와 포도당 용액 (500g/L) 1mL를 추가 하였다. 그 후 microaerobic 조건을 유지시켜 주기 위해 flask 가지에 주사바늘을 꽂아 공기가 들어갈 수 있도록 하였다. micro-aerobic 조건으로 전환한 후 24시간 동안 37℃, 220 rpm으로 배양하였다. 그 후 배양액을 원심분리를 이용하여 세포를 분리한 후에, 해리된 상등액을 4-하이드록시부티릭산 분석을 위해 packed column(Supelco CarbopackTM B AW/6.6% PEG 20M, 2m × 2mm ID, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography(Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA)로 측정하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
Strain/plasmid 4-hydroxybutyrate yield(g/g)
WL3110 0
WL3110/pTrc99a 0
WL3110/p99SucD 0.0027 ± 0.00087
WL3110/p99SYn 0.0063 ± 0.00004
WL3110/p99SC4 0.0064 ± 0.00045
WL3110/p99SC4C1 0.0145 ± 0.00344
WL3110/p99SC4CD 0.0192 ± 0.00371
WL3110/p99SYnCD 0.0179 ± 0.00160
표 1로부터, sucD, yqhD, 4hbD, cat1 및 sucCD 유전자들이 증폭된 변이 미생물들 모두 글루코즈를 기질로 한 4-하이드록시부티릭산 생성능이 향상되었음을 알 수 있었다.
실시예 3: 4-하이드록시부티릭산 생산의 증가를 위해 경쟁 회로들의 유전자가 결실된 변이 미생물의 제조
염색체 상의 경쟁회로 유전자들의 결실은 이중교차상동 재조합(double-crossover homologous recombination)에 의해서 수행되었다(Datsenko, K. A., & Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci., 97:6640-6645, 2000). 결실을 위한 절편은 (1) 결실을 원하는 유전자의 상동서열, (2) lox71-chloramphenicol marker (CmR)-lox66 및 (3) 결실을 원하는 유전자의 상동서열을 포함한다.
(1) ~ (3)은 5' -> 3' 방향이며, (1)과 (3)은 다른 서열이어야 되고, (1)의 서열이 (3)의 서열보다 왼쪽 즉 5' 방향이다. (2)는 lox71-CmR-lox66 카세트를 포함하는 pECmulox(Kim, J.M., Lee, K.H. & Lee, S.Y., FEMS Microbiol. Lett., 278: 78-85, 2008)를 PCR을 수행하여 제조할 수 있다. 즉, pACYC184 (NEW England Biolabs)를 주형으로 하여, 서열번호 13 및 14의 프라이머로 PCR을 수행하여 얻은 PCR 산물을 제한 효소 HindIII와 SmaI으로 자르고 pUG6(Guldener U, Heck S, Fielder T, Beinhauer J & Hegemann JH, Nucleic Acids Res, 24: 2519-2524, 1996; NCBI GenBank: AF298793.1)을 제한 효소 HindIII와 EcoRV로 자른 DNA 산물과 Ligation함으로써, pECmulox를 제조할 수 있다.
[서열번호 13] : 5'-ATATAAGCTTTACCGTTCGTATAGCATACATTATAC GAAGTTATTGCCCTGAACCGACGACCG-3'
[서열번호 14] : 5'-AATTCCCGGGTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACG AAGTTATCATCACCCGACGCACTTTGC-3'
상기 서열번호 13 및 14의 프라이머에 각각 (1)과 (3)의 서열을 포함시켜 PCR을 수행하면 결실을 위한 절편을 완성할 수 있다. 또한 유전자와의 이중교차상동 재조합을 강화하기 위해, 즉 결실하고 싶은 유전자의 상동서열 개수를 늘리기 위해 한번 완성된 결실을 위한 절편을 주형으로 하여 프라이머에 추가적으로 상동서열을 더 붙여 PCR을 통해 상동서열이 늘어난 PCR 절편을 얻을 수 있다.
또 다른 방법으로는 (1), (2), (3)을 각각 별도의 프라미어를 이용해서 PCR을 수행한 후 (1)의 Sense 프라이머와 (3)의 Antisense 프라이머를 이용하여 Overlapping PCR을 통해 PCR 산물을 얻을 수 있다. 이 방법의 장점은 (1)과 (3)을 별도로 PCR을 수행하기 때문에 유전자의 상동서열 개수를 원하는 만큼 늘릴 수 있다.
상기 PCR 산물들은 λ recombinase를 포함하는 전기충격용 대장균 세포(electrocompetent cells)에 트랜스포메이션시켰다. 콜로니들은 클로로암페니콜(Cm; 34μg/ml)을 포함하는 Luria-Bertani (LB) agar (Sambrook, J., Fritsch E. F., & Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000) 플레이트에서 선택되었다. CmR 의 성공적인 유전자 대체는 direct colony PCR에 의해서 확인되었다. 상기 항생제 마커는 차후에 temperature-sensitive replication origin과 IPTG-inducible cre recombinase를 포함하는 helper plasmid pJW168 (Lucigen, USA)에 의해 제거되었다.
3-1: CS01 균주의 제조
서열번호 15 및 16의 프라이머로, 주형으로써 플라스미드 pECmulox(Kim, J.M., Lee, K.H. & Lee, S.Y., FEMS Microbiol. Lett., 278: 78-85, 2008)를 사용하여 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, NAD(P)-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase를 코딩하는 gabD가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 1-7에서 제조한 WL3110 균주(W3110 ΔlacI)에 electroporation하여 CS01 균주(W3110 ΔlacI ΔgabD )를 제조하였다.
[서열번호 15]:5'-CCATTCTGCGCAACTGGTTCAATTTGATGATGGAGCATCAG GACGATTT AGACACTATAGAACGCGGCCG-3'
[서열번호 16]:5'-GGTCATACACGCCGTCCTGCACATACAGGCGGTTGGCGCAG ACGCAGGTTCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3'
3-2: CS03균주의 제조
서열번호 17 및 18의 프라이머로, 주형으로써 플라스미드 pECmulox(Kim, J.M., Lee, K.H. & Lee, S.Y., FEMS Microbiol. Lett., 278: 78-85, 2008)를 사용하여 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, aldehyde dehydrogenase(특히 succinate semialdehyde dehydrogenase 라고 알려짐)를 코딩하는 yneI 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 3-1에서 제조된 CS01 균주에 electroporation하여 CS03 균주(W3110 ΔlacI ΔgabD ΔyneI) 를 제조하였다.
[서열번호 17]: 5'-GTCCGGCAATGCTGAAGGCGGAACCTACGCTGGTGGAAAA TCAGCAGGCGGACACTATAGAACGCGGCCG-3'
[서열번호 18]: 5'-AGGGTTTTCTCCACCTGATGATGCAGCTCATCACGTAAATC AAAACGAGCCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3'
3-3: CS05 균주의 제조
서열번호 19 및 20의 프라이머, 주형으로써 플라스미드 pECmulox(Kim, J.M., Lee, K.H. & Lee, S.Y., FEMS Microbiol. Lett., 278: 78-85, 2008)를 사용하여 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, 젖산 디하이드로게나아제 (lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(ldhA) 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 3-2에서 제조된 CS03 균주에 electroporation하여 CS05 균주(W3110 ΔlacI ΔgabD ΔyneI ΔldhA)를 제조하였다.
[서열번호 19]: 5'-CACAAAACAGTACGACAAGAAGTACCTGCAACAGGTGAAC GAGTCCTTTGGACACTATAGAACGCGGCCG-3'
[서열번호 20]: 5'-AGGTTTCGCCTTTTTCCAGATTGCTTAAGTTTTGCAGCGT AGTCTGAGAACCGCATAGGCCACTAGTGGA-3'
3-4: CS06 균주의 제조
서열번호 21 및 22의 프라이머, 주형으로써 플라스미드 pECmulox(Kim, J.M., Lee, K.H. & Lee, S.Y., FEMS Microbiol. Lett., 278: 78-85, 2008)를 사용하여 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, 알코올 디하이드로게나아제(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adhE)가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 3-3에서 제조된 CS05 균주에 electroporation하여 CS06 균주(W3110 ΔlacI ΔgabD ΔyneI ΔldhA ΔadhE)를 제조하였다.
[서열번호 21]: 5'-TGAACTTAACGCACTCGTAGAGCGTGTAAAAAAAGCCCAG CGTGAATATGGACACTATAGAACGCGGCCG-3'
[서열번호 22]: 5'-GCTTTTTTCTCAGCTTTAGCCGGAGCAGCTTCTTTCTTCG CTGCAGTTTCCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3'
3-5: CS07 균주의 제조
서열번호 23 및 24의 프라이머, 주형으로써 플라스미드 pECmulox(Kim, J.M., Lee, K.H. & Lee, S.Y., FEMS Microbiol. Lett., 278: 78-85, 2008)를 사용하여 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, 피루빅산-포름산 리아제(pyruvate formate lyase)를 코딩하는 유전자(pflB)가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 그 후, 이중교차상동 재조합을 강화하기 위해 상기 PCR 산물을 주형으로 하여, 서열번호 25 및 26의 프라이머를 이용하여 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, pflB 유전자와 상동서열 개수가 증가된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 3-4에서 제조된 CS06 균주에 electroporation하여 CS07 균주(W3110 ΔlacI ΔgabD ΔyneI ΔldhA ΔadhE ΔpflB)를 제조하였다.
[서열번호 23]: 5'-TCCGAGCTTAATGAAAAGTTAGCCACAGCCTGGGAAGGTT TTACCAAAGGGACACTATAGAACGCGGCCG-3'
[서열번호 24]: 5'-CGATACCACACGCCATGGTGCGGATAACGTCACGGTCGTG CAGCGCCATCCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3'
[서열번호 25]: 5'-TGTCGAAGTACGCAGTAAATAAAAAATCCACTTAAGAAGG TAGGTGTTACATGTCCGAGCTTAATGAAAAGTT-3'
[서열번호 26]: 5'-CACGGTCGTGCAGCGCCATCAGAGAGGCTTCGTAGCTGTAC TTGTCGTGCATGTAGTGGATGATGTTCAGTGC-3'
3-6: CS10 균주의 제조
서열번호 27과 28, 서열번호 29과 30, 서열번호 31과 32의 프라이머를 이용하고, 주형으로써 각각 E. coli W3110(ATCC 39936) (derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic)의 게놈 DNA, 플라스미드인 pECmulox(Kim, J.M., Lee, K.H. & Lee, S.Y., FEMS Microbiol. Lett., 278: 78-85, 2008), E. coli W3110(ATCC 39936) (derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic)의 게놈 DNA를 사용하여 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, 각각 PCR 절편을 얻고, 세 개의 PCR 절편을 주형으로 하고 서열번호 27 및 32의 프라이머를 이용하여 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, PEP-protein phosphotransferase of PTS system을 코딩하는 유전자 (ptsI) 가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 3-5에서 제조된 CS07 균주에 electroporation하여 CS10 균주(W3110 ΔlacI ΔgabD ΔyneI ΔldhA ΔadhE ΔpflB ΔptsI )를 제조하였다.
[서열번호 27] : 5'- CGCAACAATTGCACGTCATTT-3'
[서열번호 28] : 5'-CTATAGTGTCACCtaCAGCAACAGAAGTGTAGCACG-3'
[서열번호 29] : 5'-ACACTTCTGTTGCTGTAGGTGACACTATAGAACGCGG-3'
[서열번호 30] : 5'-GCATCTCGTGGATTACCGCATAGGCCACTAGTGGA-3'
[서열번호 31] : 5'-TGGCCTATGCGGTAATCCACGAGATGCGGCCC-3'
[서열번호 32] : 5'-AGATTTTACCAATGGTGCCGTC-3'
3-7: CS16 균주의 제조
서열번호 33 및 34의 프라이머, 주형으로써 플라스미드 pECmulox(Kim, J.M., Lee, K.H. & Lee, S.Y., FEMS Microbiol. Lett., 278: 78-85, 2008)를 사용하여 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, PEP-protein phosphotransferase of PTS system을 코딩하는 유전자 (ptsG) 가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 그 후, 이중교차상동 재조합을 강화하기 위해 상기 PCR 산물을 주형으로 하여, 서열번호 35 및 36의 프라이머를 이용하여 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, ptsG 유전자와 상동서열 개수가 증가된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 3-5에서 제조된 CS07 균주에 electroporation하여 CS16 균주(W3110 ΔlacI ΔgabD ΔyneI ΔldhA ΔadhE ΔpflB ΔptsG)를 제조하였다.
[서열번호 33]: 5'-CCTGTACACGGCGAGGCTCTCCCCCCTTGCCACGCGTGAGAACGTAAAAAGACACTATAGAACGCGGCCG-3'
[서열번호 34]: 5'-GAGAGAAGGTCTGGATTGCAGAACCAATCGGCGGCCAAATGAAGGACAGCCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3'
[서열번호 35]: 5'-TGGCACTGAATTATTTTACTCTGTGTAATAAATAAAGGGCGCTTAGATGCCCTGTACACGGCGAGGCTCT-3'
[서열번호 36]: 5'-GAAACCGTAAATGCCAAACGCAACTACCGGGTTCTGGTAAGCAGCCCACTGAGAGAAGGTCTGGATTGCAGA-3'
3-8: CS03 / p99SC4CD 균주의 제조
실시예 3-2에서 제조된 CS03 균주에 상기 1-5에서 제조된 p99SC4CD 벡터를 도입시켜 CS03/p99SC4CD 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
3-9: CS05 / p99SC4CD 균주의 제조
실시예 3-3에서 제조된 CS05 균주에 상기 1-5에서 제조된 p99SC4CD 벡터를 도입시켜 CS05/p99SC4CD 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
3-10: CS06 / p99SC4CD 균주의 제조
실시예 3-4에서 제조된 CS06 균주에 상기 1-5에서 제조된 p99SC4CD 벡터를 도입시켜 CS06/p99SC4CD 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
3-11: CS07/p99SC4CD 균주의 제조
실시예 3-5에서 제조된 CS07 균주에 상기 1-5에서 제조된 p99SC4CD 벡터를 도입시켜 CS07/p99SC4CD 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
3-12: CS10/p99SC4CD 균주의 제조
실시예 3-6에서 제조된 CS10 균주에 상기 1-5에서 제조된 p99SC4CD 벡터를 도입시켜 CS10/p99SC4CD 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
3-13: CS16 / p99SC4CD 균주의 제조
실시예 3-6에서 제조된 CS16 균주에 상기 1-5에서 제조된 p99SC4CD 벡터를 도입시켜 CS16/p99SC4CD 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
실시예 4: 4- 하이드록시부티릭산 생산의 증가를 위해 경쟁 회로들의 유전자가 결실된 변이 미생물을 이용한 4- 하이드록시부티릭산의 제조
실시예 3에서 제조된 표 2의 변이 균주들을 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하였다. 그 후 배양액을 실시예 2와 동일한 방법으로 처리하고, GC 분석을 통해 4-하이드록시부티릭산의 농도를 측정하고, 표 2에 나타내었다.
Strain/plasmid 4-hydroxybutyrate yield(g/g)
WL3110/p99SC4CD 0.0192 ± 0.00371
CS03/p99SC4CD 0.1317 ± 0.02084
CS05/p99SC4CD 0.1762 ± 0.01886
CS06/p99SC4CD 0.1936 ± 0.00024
CS07/p99SC4CD 0.2227 ± 0.05879
CS10/p99SC4CD 0.2456 ± 0.03234
CS16/p99SC4CD 0.3261 ± 0.0066
표 2로부터, gabD, yneI, ldhA, adhE, pflB, ptsI 및 ptsG 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 결실된 변이 미생물들 모두 4-하이드록시부티릭산 생성능이 향상되었음을 알 수 있었다.
실시예 5: 보충회로(anaplerotic pathway) 유전자가 증폭된 변이 미생물의 제조
5-1: 플라스미드 p15PckA의 제작
항시적, 생합성적 Mannheimia succiniciproducens(KCTC 0769BP)의 phosphoenolpyruvate carboxykinase를 코딩하는 유전자 pckA를 tac promoter로 강한 유전자 발현을 진행하는 pTac15K(p15A origin, low copies, KmR; KAISTMBELstock) 발현벡터에 클로닝하였다.
참고로, pTac15k의 제조방법은 다음과 같다. pHCE IIB(NcoI) ((주)바이오리더스)를 AatII와 NheI으로 자르고 pACYC177(New England Biolabs)도 AaII와 NheI으로 자른 후, pHCE IIB(NcoI)의 pHCD promoter를 포함하는 절편이랑 pACYC177의 p15A origin과 암피실린 항생제를 포함하는 절편과 중합시켜, pHNC15라는 벡터를 만들었다. 암피실린을 카나마이신으로 만들기 위해 pHNC15를 FspI으로 자르고 pUC4K (GE Healthcare Life Sciences)를 pstI으로 자른 후, Fill-in 하고, 중합시켜 pHNC15에서 암피실린 대신 카나마이신이 들어간 pHNC15K 벡터를 완성하였다. 다음으로 pHNC15K에서 promoter를 pHCE 대신 pTac으로 바꾸기 위해 pHNC15K를 NheI으로 자른 후 filling in 한 후, EcoRI으로 잘랐다, 이 때 생긴 절편은 pHNC15K에서 pHCE부분이 제거된 절편이다. tac promoter를 얻기 위해 pKK223-3 (Pharmacia Biotech)를 sphI으로 자르고 filling in 한 후 EcoRI으로 잘랐다. 이 때 생긴 절편 중 tac promoter를 포함한 절편과 위에서 언급한 절편을 중합하여 pTac15K을 완성하였다.
M. succiniciproducens(KCTC 0769BP)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 37과 38의 프라이머를 이용하여, 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, pckA 절편을 제조하였다.
[서열번호 37]: 5'-ATATTAGAATTCATGACAGATCTTAATCAATT-3'
[서열번호 38]: 5'-TGCTACGAGCTCTTATGCTTTAGGACCGGCAGC-3'
다음으로 제조된 pckA 절편 및 pTac15k 플라스미드에 제한효소(EcoRI와 SacI)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 pckA 절편 및 pTac15k 플라스미드를 중합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 벡터 p15PckA를 제작하였다.
5-2: 플라스미드 p15Pyc의 제작
항시적, 생합성적 Corynebacterium glutamicum(ATCC 13032)의 phosphoenolpyruvate carboxykinase를 코딩하는 유전자 pyc를 tac promoter로 강한 유전자 발현을 진행하는 pTac15K(p15A origin, low copies, KmR; KAISTMBELstock) 발현벡터에 클로닝하였다. C. glutamicum(ATCC 13032)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 39와 40의 프라이머를 이용하여, PCR을 수행함으로써, pyc 절편을 제조하였다. PCR 조건은 step 4의 시간이 1min 45 sec인 점을 제외하고는 실시예 1-1과 동일하다.
[서열번호 39]: 5'-ATCGGAGCTCGTGTCGACTCACACATCTTC-3'
[서열번호 40]: 5'-GCTGTCTAGATTAGGAAACGACGACGATCA-3'
다음으로 제조된 pyc 절편 및 pTac15k 플라스미드에 제한효소(SacI와 XbaI)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 pckA 절편 및 pTac15k 플라스미드를 중합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 벡터 p15Pyc를 제작하였다.
5-3: 플라스미드 p15CY의 제작
항시적, 생합성적 Corynebacterium glutamicum(ATCC 13032)의 phosphoenolpyruvate carboxykinase를 코딩하는 유전자 pyc를 상기 5-1에서 제작된 p15PckA에 클로닝 하였다. 발현은 pyc 유전자 앞의 RBS(ribosome binding site)에 의해 pckA 유전자 앞에 있는 tac promoter의 영향을 받는다. C. glutamicum의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 41과 40의 프라이머를 이용하여, 상기 5-2와 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, pyc 절편을 제조하였다.
[서열번호 41]: 5'-ATTAGAGAGCTCACAGGAAACAGTGTCGACTCACACATCTT CAAC-3'
다음으로 제조된 pyc 절편 및 실시예 5-1에서 제작된 p15PckA 플라스미드에 제한효소(SacI 와 XbaI)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 pyc 절편 및 p15PckA 플라스미드를 중합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 벡터 p15CY를 제작하였다.
5-4: 플라스미드 p15Ppc의 제작
항시적, 생합성적 E. coli(W3110)의 phosphoenolpyruvate carboxylase를 코딩하는 유전자 ppc를 tac promoter로 강한 유전자 발현을 진행하는 pTac15K(p15A origin, low copies, KmR; KAISTMBELstock) 발현벡터에 클로닝하였다. E. coli(W3110)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 42와 43의 프라이머를 이용하여, PCR을 수행함으로써, ppc 절편을 제조하였다. PCR 조건은 step 4의 시간이 1min 45 sec인 점을 제외하고는 실시예 1-1과 동일하다.
[서열번호 42]: 5'-ATTGTAGAATTCATGAACGAACAATATTCCGCATT-3'
[서열번호 43]: 5'-ATAGTGGAGCTCTTAGCCGGTATTACGCATACCT-3'
다음으로 제조된 ppc 절편 및 pTac15k 플라스미드에 제한효소(EcoRI와 SacI)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 ppc 절편 및 pTac15k 플라스미드를 중합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 벡터 p15Ppc를 제작하였다.
5-5: CS10/p99SC4CD/p15PckA 균주의 제조
실시예 3-12에서 제조된 CS10/p99SC4CD 균주에 상기 5-1에서 제작된 p15PckA 벡터를 도입시켜 CS10/p99SC4CD/p15PckA 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin) 및 카나마이신(kanamycin)을 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
5-6: CS10/p99SC4CD/p15Pyc 균주의 제조
실시예 3-12에서 제조된 CS10/p99SC4CD 균주에 상기 5-2에서 제작된 p15Pyc 벡터를 도입시켜 CS10/p99SC4CD/p15Pyc 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin) 및 카나마이신(kanamycin)을 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
5-7: CS10/p99SC4CD/p15CY 균주의 제조
실시예 3-12에서 제조된 CS10/p99SC4CD 균주에 상기 5-3에서 제작된 p15CY 벡터를 도입시켜 CS10/p99SC4CD/p15CY 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin) 및 카나마이신(kanamycin)을 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
5-8: CS10/p99SC4CD/pTac15K 균주의 제조
실시예 3-12에서 제조된 CS10/p99SC4CD 균주에 pTac15K 벡터를 도입시켜 CS10/p99SC4CD/pTac15K 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin) 및 카나마이신(kanamycin)을 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
5-9: CS16/p99SC4CD/p15PckA 균주의 제조
실시예 3-13에서 제조된 CS16/p99SC4CD 균주에 상기 5-1에서 제작된 p15PckA 벡터를 도입시켜 CS16/p99SC4CD/p15PckA 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin) 및 카나마이신(kanamycin)을 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
5-10: CS16/p99SC4CD/p15Ppc 균주의 제조
실시예 3-13에서 제조된 CS16/p99SC4CD 균주에 상기 5-4에서 제작된 p15Ppc 벡터를 도입시켜 CS16/p99SC4CD/p15Ppc 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin) 및 카나마이신(kanamycin)을 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
5-11: CS16/p99SC4CD/p15Pyc 균주의 제조
실시예 3-13에서 제조된 CS16/p99SC4CD 균주에 상기 5-2에서 제작된 p15Pyc 벡터를 도입시켜 CS16/p99SC4CD/p15Pyc 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin) 및 카나마이신(kanamycin)을 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
5-12: CS16/p99SC4CD/pTac15K 균주의 제조
실시예 3-13에서 제조된 CS16/p99SC4CD 균주에 pTac15K 벡터를 도입시켜 CS16/p99SC4CD/pTac15K 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin) 및 카나마이신(kanamycin)을 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
실시예 6: 보충회로(anaplerotic pathway) 유전자가 증폭된 변이 미생물을 이용한 4-하이드록시부티릭산의 제조
실시예 5에서 제조된 표 3의 변이 균주들을 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하였다. 다른 점은 생산균주에 따라 엠피실린(ampicilin)만 들어간 LB 평판배지나 엠피실린(ampicilin)과 카나마이신(kanamycin)이 같이 들어간 LB 평판배지에서 선별하였다. 그 후 배양액을 실시예 2와 마찬가지 방법으로 처리하고 GC 분석을 통해 4-하이드록시부티릭산의 농도를 측정하고, 표 3에 기재하였다.
Strain/plasmid 4-hydroxybutyrate yield (g/g)
CS10/p99SC4CD/pTac15K 0.2217 ± 0.00586
CS10/p99SC4CD/p15PckA 0.2818 ± 0.02270
CS10/p99SC4CD/p15Pyc 0.2869 ± 0.01191
CS10/p99SC4CD/p15CY 0.2934 ± 0.01778
CS16/p99SC4CD/pTac15K 0.3399 ± 0.00792
CS16/p99SC4CD/p15PckA 0.3801 ± 0.00731
CS16/p99SC4CD/p15Ppc 0.4848 ± 0.02618
CS16/p99SC4CD/p15Pyc 0.2792 ± 0.01045
표 3으로부터, 단순히 strong promoter를 이용한 미생물보다는 보충회로 유전자인 pckA, pyc 및 ppc 유전자들이 증폭된 변이 미생물들 모두 4-하이드록시부티릭산 생성능이 향상되었음을 알 수 있었다.
실시예 7: 산화적 회로(oxidative pathway) 유전자가 증폭되거나 강화된 변이 미생물의 제조
7-1: 플라스미드 p15PpcGltAR163L의 제작
항시적, 생합성적 E. coli(W3110)의 citrate synthase를 코딩하는 유전자 gltA를 tac promoter로 강한 유전자 발현을 진행하는 pTac15K(p15A origin, low copies, KmR; KAISTMBELstock) 발현벡터에 클로닝하였다. 여기서 gltA는 NADH에 의해 저해를 받는 기작을 제거하기 위해 돌연변이가 일어난 것을 사용하였다 (Pereira, D.S., Donald, I.J., Hosfield, D.J. & Duckworth, H.W. J. Biol. Chem. 269: 412-417, 1994).
즉, 163번째 아미노산인 arginine(R)이 leucine(L)으로 치환된 돌연변이를 만들기 위해 E. coli(W3110)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 44과 45 및 46와 47의 프라이머를 이용하여, 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, 각각의 대해서 PCR 절편을 제조하였다.
[서열번호 44]: 5'-GCTGTCGGTACCAGGAGACCTTAAATGGCTGATACA-3'
[서열번호 45]: 5'-GGAACGCGGCAATTTCACGGTGACGAGGATTGTTAACATCCA-3'
[서열번호 46]: 5'-AAATTGCCGCGTTCCTCCTGCTGTCGAAAAT-3'
[서열번호 47]: 5'-TGCTACGAGCTCTTATGCTTTAGGACCGGCAGC-3'
다음으로 제조된 각각의 PCR 절편들을 주형으로 하여 서열번호 44와 47의 프라이머를 이용하여 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, 돌연변이가 일어난 gltA 절편을 제조할 수 있었다. 다음으로 제조된 gltA 절편 및 p15Ppc 플라스미드에 제한효소(KpnI와 XbaI)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 돌열변이 gltA 절편 및 p15Ppc 플라스미드를 중합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 벡터 p15PpcGltAR163L를 제작하였다.
7-2: CS28 균주의 제조
서열번호 48과 49, 서열번호 50과 51, 서열번호 52와 53의 프라이머를 이용하고, 주형으로써 각각 E. coli W3110(ATCC 39936) (derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic)의 게놈 DNA, 플라스미드인 pECmulox(Kim, J.M., Lee, K.H. & Lee, S.Y., FEMS Microbiol. Lett., 278: 78-85, 2008), E. coli W3110(ATCC 39936) (derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic)의 게놈 DNA를 사용하여 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, 각각 PCR 절편을 얻고, 세 개의 PCR 절편을 주형으로 하고 서열번호 48 및 53의 프라이머를 이용하여 상기 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행함으로써, aerobic respiration control protein ArcA를 코딩하는 유전자 (arcA) 가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 3-7에서 제조된 CS16 균주에 electroporation하여 CS28 균주(W3110 ΔlacI ΔgabD ΔyneI ΔldhA ΔadhE ΔpflB ΔptsGΔarcA )를 제조하였다.
[서열번호 48] : 5'- TTTTGACACTGTCGGGTCCT-3'
[서열번호 49] : 5'-GCGTTCTATAGTGTCTTTCAACGTGTTGCGTGTTA-3'
[서열번호 50] : 5'-CGCAACACGTTGAAAGACACTATAGAACGCGGCCG-3'
[서열번호 51] : 5'-GATTCGAAATGTTTACCGCATAGGCCACTAGTGGA-3'
[서열번호 52] : 5'-TAGTGGCCTATGCGGCATTTCGAATCTACGCCGGA-3'
[서열번호 53] : 5'-CGGCATGATGTTTGTGACCC-3'
7-3: CS16/p99SC4CD/p15PpcGltAR163L 균주의 제조
실시예 3-13에서 제조된 CS16/p99SC4CD 균주에 상기 7-1에서 제작된 p15PpcGltAR163L 벡터를 도입시켜 CS16/p99SC4CD/p15PpcGltAR163L 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin) 및 카나마이신(kanamycin)을 포함된 아가(agar) 고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
7-4: CS28 / p99SC4CD 균주의 제조
실시예 7-2에서 제조된 CS28 균주에 상기 1-5에서 제조된 p99SC4CD 벡터를 도입시켜 CS28/p99SC4CD 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin)이 포함된 아가(agar) 고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
7-5: CS28/p99SC4CD/p15PpcGltAR163L 균주의 제조
실시예 7-4에서 제조된 CS28/p99SC4CD 균주에 상기 7-1에서 제작된 p15PpcGltAR163L 벡터를 도입시켜 CS28/p99SC4CD/p15PpcGltAR163L 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 암피실린(ampicillin) 및 카나마이신(kanamycin)을 포함된 아가(agar) 고체 배지에서 배양하면서 재조합된 변이 미생물들을 선별하였다.
실시예 8: 산화적 회로(oxidative pathway) 유전자가 증폭되거나 강화된 변이 미생물을 이용한 4-하이드록시부티릭산의 제조
실시예 7 에서 제조된 표 4의 변이 균주들을 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하였다. 다른 점은 생산균주에 따라 엠피실린(ampicilin)만 들어간 LB 평판배지나 엠피실린(ampicilin)과 카나마이신(kanamycin)이 같이 들어간 LB 평판배지에서 선별하였다. 그 후 배양액을 실시예 2와 동일한 방법으로 처리하고 GC 분석을 통해 4-하이드록시부티릭산의 농도를 측정하고, 표 4에 기재하였다.
Strain/plasmid 4-hydroxybutyrate yield (g/g)
CS16/p99SC4CD/p15Ppc 0.4848 ± 0.02618
CS16/p99SC4CD/p15PpcGltAR163L 0.5001 ± 0.01413
CS28/p99SC4CD/p15PpcGltAR163L 0.5439 ± 0.01912
표 4로부터, 산화적 회로 유전자인 gltA가 증폭되거나 및 산화적 회로 유전자들을 저해하는 조절 단백질을 코딩하는 arcA 유전자가 제거된 변이 미생물들 모두 4-하이드록시부티릭산 생성능이 향상되었음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Mutants Having a High Producing Ability of 4-hydroxybutyrate and Preparing Method for 4-hydroxybutyrate Using Thereof <130> P12-B279 <150> KR 2011-0130183 <151> 2011-12-07 <160> 53 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gcgatagaat tcatgagtaa tgaagtatct ataaaagaat taattg 46 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcatatgagc tcttatcccc atatttcctc atagcta 37 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 attgatgagc tcggagcaag taatgaacaa ctttaat 37 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cttgtctcta gattagcggg cggcttcgta ta 32 <210> 5 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gatatagagc tcacaggaaa caatgaagtt attaaaattg gcacctg 47 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gccagctcta 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Claims (25)

  1. 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 숙시닐-코에이 합성효소(succinyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있고, 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 포스포엔올피루빅산 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase)를 코딩하는 유전자, 포스포엔올피루브산 카르복실라아제(phosphoenolpyrutave carboxylase)를 코딩하는 유전자 및 피루빅산 카르복실라아제(pyruvate carboxylase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이미생물.
  2. 제1항에 있어서, 코에이 트랜스퍼라아제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 코에이-의존적 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 4-하이드록시부티릭산 디하이드로게나아제(4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 추가로 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이미생물.
  3. 제1항에 있어서, 4-하이드록시부티릭산의 생산 경쟁 경로에 관여하는 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 젖산 디하이드로게나아제 (lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 피루빅산-포름산 리아제(pyruvate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 알코올 디하이드로게나아제(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 PTS 시스템의 PEP-단백질 포스포트랜스퍼라아제(PEP-protein phosphotransferase of PTS system)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이미생물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 산화적 회로(oxidative pathway)에 관여하는 유전자 중 (ⅰ) NADH에 의한 저해가 제거되도록 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)를 코딩하는 유전자가 추가로 증폭; (ⅱ) 유기호흡 조절 단백질(aerobic respiration control protein)을 코딩하는 유전자가 추가로 결실; 또는 (ⅲ) NADH에 의한 저해가 제거되도록 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)를 코딩하는 유전자가 추가로 증폭되고, 동시에 유기호흡 조절 단백질(aerobic respiration control protein)을 코딩하는 유전자가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이미생물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 코에이-의존적 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입된 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이미생물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 포스포엔올피루빅산 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase)를 코딩하는 유전자, 포스포엔올피루브산 카르복실라아제(phosphoenolpyrutave carboxylase)를 코딩하는 유전자 및 피루빅산 카르복실라아제(pyruvate carboxylase)를 코딩하는 유전자는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입된 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이미생물.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속( Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이미생물.
  10. (A) 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 숙시닐-코에이 합성효소(succinyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있고,
    (B) 4-하이드록시부티릭산의 생산 경쟁 경로에 관여하는 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 젖산 디하이드로게나아제 (lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 피루빅산-포름산 리아제(pyruvate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 알코올 디하이드로게나아제(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자및 PTS 시스템의 PEP-단백질 포스포트랜스퍼라아제(PEP-protein phosphotransferase of PTS system)를 코딩하는 유전자가 결실되어 있으며,
    (C) 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 포스포엔올피루빅산 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase)를 코딩하는 유전자, 포스포엔올피루브산 카르복실라아제(phosphoenolpyrutave carboxylase)를 코딩하는 유전자 및 피루빅산 카르복실라아제(pyruvate carboxylase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 유전자가 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이미생물.
  11. 삭제
  12. (A) 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 숙시닐-코에이 합성효소(succinyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자가 증폭되어 있고,
    (B) 4-하이드록시부티릭산의 생산 경쟁 경로에 관여하는 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 젖산 디하이드로게나아제 (lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 피루빅산-포름산 리아제(pyruvate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 알코올 디하이드로게나아제(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 PTS 시스템의 PEP-단백질 포스포트랜스퍼라아제(PEP-protein phosphotransferase of PTS system)를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고,
    (C) 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 포스포엔올피루빅산 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase)를 코딩하는 유전자, 포스포엔올피루브산 카르복실라아제(phosphoenolpyrutave carboxylase)를 코딩하는 유전자 및 피루빅산 카르복실라아제(pyruvate carboxylase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 유전자가 증폭되어 있으며,
    (D) 산화적 회로(oxidative pathway)에 관여하는 유전자 중 (ⅰ) NADH에 의한 저해가 제거되도록 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)를 코딩하는 유전자가 증폭; (ⅱ) 유기호흡 조절 단백질(aerobic respiration control protein)을 코딩하는 유전자가 결실; 또는 (ⅲ) NADH에 의한 저해가 제거되도록 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)를 코딩하는 유전자가 증폭되고, 동시에 유기호흡 조절 단백질(aerobic respiration control protein)을 코딩하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이미생물.
  13. 4-하이드록시부티릭산의 생합성에 관여하는 숙시닐-코에이 합성효소(succinyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자를 증폭시키고, 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 포스포엔올피루빅산 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase)를 코딩하는 유전자, 포스포엔올피루브산 카르복실라아제(phosphoenolpyrutave carboxylase)를 코딩하는 유전자 및 피루빅산 카르복실라아제(pyruvate carboxylase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이미생물의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 코에이 트랜스퍼라아제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자, 코에이-의존적 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 4-하이드록시부티릭산 디하이드로게나아제(4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 증폭시키는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이미생물의 제조방법.
  15. 제13항에 있어서, 4-하이드록시부티릭산의 생산 경쟁 경로에 관여하는 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 젖산 디하이드로게나아제 (lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 피루빅산-포름산 리아제(pyruvate formate lyase)를 코딩하는 유전자, 알코올 디하이드로게나아제(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 PTS 시스템의 PEP-단백질 포스포트랜스퍼라아제(PEP-protein phosphotransferase of PTS system)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이미생물의 제조방법.
  16. 삭제
  17. 제13항에 있어서, 산화적 회로(oxidative pathway)에 관여하는 유전자 중 (ⅰ) NADH에 의한 저해가 제거되도록 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)를 코딩하는 유전자가 추가로 증폭; (ⅱ) 유기호흡 조절 단백질(aerobic respiration control protein)을 코딩하는 유전자가 추가로 결실; 또는 (ⅲ) NADH에 의한 저해가 제거되도록 돌연변이된 시트레이트 합성효소(citrate synthase)를 코딩하는 유전자가 추가로 증폭되고, 동시에 유기호흡 조절 단백질(aerobic respiration control protein)을 코딩하는 유전자가 추가로 결실시키는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이미생물의 제조방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 코에이-의존적 숙신산 세미알데히드 디하이드로게나아제(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입시키는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이미생물의 제조방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 보충 회로(anaplerotic pathway)에 관여하는 포스포엔올피루빅산 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase)를 코딩하는 유전자, 포스포엔올피루브산 카르복실라아제(phosphoenolpyrutave carboxylase)를 코딩하는 유전자 및 피루빅산 카르복실라아제(pyruvate carboxylase)를 코딩하는 유전자는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입시키는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이미생물의 제조방법.
  20. 삭제
  21. 제13항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속( Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산 생성능을 가지는 변이미생물의 제조방법.
  22. 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제7항, 제9항, 제10항 및 제12항 중 어느 한 항의 변이미생물을 배양하여 4-하이드록시부티릭산을 생성시킨 다음, 4-하이드록시부티릭산을 회수하는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시부티릭산의 제조방법.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
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