WO2016068656A2 - 사이코스 에퍼머화 효소의 발현 시스템 및 이를 이용한 사이코스의 생산 - Google Patents

사이코스 에퍼머화 효소의 발현 시스템 및 이를 이용한 사이코스의 생산 Download PDF

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김혜정
김민정
최정윤
박종진
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)

Definitions

  • the present invention relates to an expression system capable of producing high expression and stability of a cosmos emulsifying enzyme, a GRAS (Generally Recognized as Safe) microorganism using the same, and a method of producing a cosmos comprising a microorganism and an enzyme using the expression system. It is about.
  • biosynthetic products are produced in cells by natural processes and are used in numerous industries, including the food, feed, cosmetic, food, food and pharmaceutical industries. They are produced on a large scale using bacterial strains or other microorganisms developed to produce and secrete large quantities of the specific substances required in each case.
  • Corynebacterium strains are the most microorganisms used industrially to produce Amanoic acid, and Corynebacterium glutamicum (Co y / 7e /> acter / t) efficiently produces glutamic acid in the mid-1950s. // 77 g / utamicum) has been discovered and industrialized, and the fermentation method using nutrient strains of Corynebacterium glutamicum produces industrially various amino acids.
  • Engineering cells needs to be sure to control the expression of various related genes, and such gene expression regulation requires a variety of efficient expression systems.
  • Various components of the regulatory sequence of the cell are known to those skilled in the art. These include binding sites for operators, binding sites for RNA polymerase enzymes referred to as -35 and -10 regions, and ribosomal 16S RNA referred to as ribosomal binding sites or Shine-Dalgamo sequences. It is divided into binding sites for.
  • Promoter selection is most important when developing expression systems. It is believed that the promoter is very involved in gene expression and expression control. Several promoters available for Corynebacterium glutamicum have been reported, mainly from Corynebacterium or Escherichia coli (J. Biotechnol., 104: 31 1-323, 2003).
  • E. coli-derived promoters exhibit relatively low activity compared to Corynebacterium due to the low permeability of expression inducers and the absence of gene expression inhibitors.
  • even the same promoter may have different expression efficiencies depending on the gene encoding the target protein, and the expression intensity of the promoters available in Corynebacterium also has a narrow selection, making it difficult to manufacture an expression system for the purpose. not.
  • the reality is that Corynebacterium cannot make various choices as in E. coli.
  • Korean Patent No. 10-1 106253 expresses Agrobacterium tumefaciens-derived Pycos-3-epimerase and prepares a transformed Escherichia coli in which a specific gene is activated, and inoculates these strains into a fructose-containing medium.
  • a technique is disclosed for converting fructose in medium into a psychose.
  • One example of the present invention is to provide a promoter capable of producing a cyclase epimerase with high stability while having high stability.
  • One embodiment of the present invention includes the promoter, and provides a regulatory sequence for controlling the expression of the Pseudomonas epimerase enzyme in the genus Corynebacterium strains.
  • Another example of the present invention is to provide a gene expression cassette comprising the promoter or regulatory sequence and the coding sequence of the cyclic epimerase.
  • Another embodiment of the present invention is to provide a vector comprising an expression cassette for the genus Corynebacterium, comprising the coding sequence of the promoter or regulatory sequence and the cyclic epimerase.
  • Another example of the present invention provides a Corynebacterium host cell transformed with the expression cassette or expressing a cosmos epimerizing enzyme comprising the expression cassette.
  • a cosmos epimerizing enzyme obtained by using the strain of the genus Corynebacterium, the cells of the strain, the culture of the strain, the lysate of the strain, and the extract or extract of the culture.
  • a composition for producing psychos comprising one or more selected.
  • a phycose epimerizing enzyme obtained using the strain of the genus Corynebacterium, the cells of the strain, the culture of the strain, the lysate of the strain, and Using at least one selected from the group consisting of extracts of the lysate or culture, there is provided a method of producing a psychocos from a fructose-containing raw material.
  • the present invention provides an expression system capable of producing cyclase afferase enzyme with high stability and expression rate, a generally recognized as safe (GRAS) microorganism using the same, a method for producing an enzyme using the generally recognized as safe (GRAS) microorganism, and the It relates to a method of producing a psychos comprising a microorganism and an enzyme using an expression system.
  • GRAS generally recognized as safe
  • E. coli-derived promoters exhibit relatively low activity in Corynebacterium strains due to the low permeability of the expression inducer and the absence of gene expression inhibitors, and also the cosmos epimerization to be produced in Corynebacterium strains. It is intended to provide an expression system suitable for the expression of an enzyme.
  • the present invention provides a promoter capable of stably expressing a cosmos epimerase enzyme at a high expression rate in a Corynebacterium strain, a regulatory sequence comprising the promoter, and a gene expression cassette comprising the regulatory sequence.
  • a promoter capable of stably expressing a cosmos epimerase enzyme at a high expression rate in a Corynebacterium strain
  • a regulatory sequence comprising the promoter
  • a gene expression cassette comprising the regulatory sequence.
  • the present inventors have combined with the above promoter to express a large amount of a cyclase epimerase having a stable and high enzyme production activity in a GRAS (Generally recognized as safe) strain for mass production of a cosmos applicable to food It is intended to provide a cosmos epimerase and its coding nucleotide sequence, which exhibits a better expression rate at the time of application.
  • GRAS Generally recognized as safe
  • promoter means a nucleic acid that is functionally linked to a target nucleotide sequence to regulate transcription or expression of the target nucleotide sequence, and a transcriptional promoter and expression Includes all promoters.
  • the nucleotide sequence to be transcribed does not necessarily require a direct linkage to the promoter in the chemical sense, but additional gene regulatory sequences and / or Linker nucleotide sequences and the like. Preference is given to an arrangement wherein the target nucleotide sequence for transcription is located below the promoter sequence (ie at the 3 'end of the promoter sequence).
  • the distance between the promoter sequence and the nucleotide sequence to be transcribed is preferably less than 200 bases, particularly preferably less than 100 bases.
  • ribosome binding site (RBS) or shine-dalgano sequence refers to an A / G-rich polynucleotide sequence, which is the site to which the ribosomes bind during translation.
  • regulatory sequence refers to a nucleic acid that includes a promoter and is functionally linked to the target nucleotide sequence or gene to be expressed and has the activity of regulating the expression of the target nucleic acid or the gene, ie transcription and / or translation.
  • the nucleotide sequence is also referred to as the "regulatory nucleotide sequence.”
  • an "expression cassette” includes a regulatory sequence that is functionally linked to the target nucleotide sequence to be expressed, eg, the coding nucleotide sequence of a cyclic epimerase.
  • expression cassettes can include nucleotide sequences that regulate transcription and translation, as well as nucleotide sequences that are expressed as proteins as a result of transcription and translation.
  • the nucleic acid molecule according to the present invention is preferably a form which is non-naturally occurring and is a nucleic acid molecule produced by the form of an isolated nucleic acid molecule or by synthetic or recombinant methods.
  • An “isolated” nucleic acid molecule is removed from other nucleic acid molecules present in the natural source of the nucleic acid, and further, when prepared by recombinant technology, essentially no other cellular material or culture medium is present, or chemically synthesized. In that case, no chemical precursors or other chemicals may be present.
  • One embodiment of the present invention relates to a nucleic acid molecule of the control sequence for the expression of the genus Corynebacterium strain, to enable the production of a high stability and activity of the cosmos epimerase enzyme, GRAS strain in a high yield with high stability .
  • the present invention will be described in more detail.
  • One embodiment of the present invention relates to a nucleic acid molecule of the control sequence for the expression of the genus Corynebacterium strain, to enable the production of a high stability and activity of the cosmos epimerase enzyme, GRAS strain in a high yield with high stability .
  • Another example of the invention is a nucleotide sequence that encodes a cosmos epimerase; And a regulatory sequence operably linked upstream thereof, the regulatory sequence controlling the expression of the Pseudomonas epimerase in Corynebacterium strains;
  • the regulatory sequence comprises a nucleic acid molecule comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, a nucleic acid molecule comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 63, a nucleic acid molecule comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 64, and a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 65 It provides a gene expression cassette (expression) of the cosmos epimerase enzyme in the genus Corynebacterium comprising a promoter selected from the group consisting of nucleic acid molecules.
  • the regulatory sequence according to the present invention includes a promoter expressing a nucleotide sequence encoding a cosmos epimerase or a regulatory sequence containing the same in a GRAS strain, eg, a strain of genus Corynebacterium.
  • the regulatory sequence may be an unmodified regulatory sequence or a modified regulatory sequence thereof that controls the expression of a nucleotide sequence encoding a cyclic epimerase enzyme in a Corynebacterium strain.
  • Promoters included in the regulatory sequence include polynucleotides selected from nucleic acid molecules and functional variants comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, and SEQ ID NO: 65.
  • the functional variant has a sequence identity of at least 90%, ie, 99%, 98%, 97%, 96%, 95 with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 63, 64, or 65 %, 94%, 93%, 92%, 91%, 90% or more.
  • the regulatory sequence according to the present invention may comprise one or more sequences selected from the group consisting of a ribosome binding region (RBS) sequence, a spacer sequence and a linker sequence.
  • RBS ribosome binding region
  • the ribosome binding region sequence is at least more than once, for example at least once to five times, or may contain two circuits: A.
  • the regulatory sequence comprises a first RBS sequence and a first spacer sequence, or a 2 ribosome binding region that is directly or via a linker linked to the 3 1 -terminus of the first RBS sequence and the first spacer sequence and the first spacer. Or a second RBS sequence and a second spacer sequence linked directly or via a linker to the 3′-terminus of the first spacer, and the first RBS sequence and the base 1 spacer sequence.
  • the promoter derived from the SOD promoter according to an embodiment of the present invention including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 will be described by way of example, the same applies to Tacl, Tac2, Trc promoter having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 63, 64 or 65 do.
  • the regulatory sequence may include a promoter comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a first RBS sequence comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: It may be a nucleic acid molecule comprising a spacer 1 comprising a nucleotide sequence of any one selected from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 (promoter-first RBS-first spacer).
  • a linker sequence consisting of 1 to 100 bases optionally linked to the 3 'end of the first spacer of the regulatory sequence It can be a nucleic acid molecule comprising (promoter-first RBS-first spacer-linker).
  • the regulatory sequence comprises two RBS sequences
  • the regulatory sequence includes (i) a promoter comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and further includes (ii) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 A spacer comprising (1) a nucleotide sequence selected from any one of the RBS sequences, (iii) the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3-6, (iv) a linker sequence of SEQ ID NO: 12, and (V) SEQ ID NO: 7 It may further include one or more selected from the group consisting of two spacers containing any one nucleotide sequence selected from 1 to 1 nucleotide sequence, it may be included one or more times the RBS sequence.
  • a second RBS sequence can be linked directly or via a linker to the 3′-end of the first spacer (promoter-first RBS-first spacer-second RBS or promoter first RBS-first spacer- Linker-second RBS).
  • the second spacer sequence may further include a second spacer sequence linked to the 3′-end of the second RBS.
  • the combination of the first RBS and the first spacer or the combination of the second RBS and the second spacer may be included one or more times, for example, 1-5 times, 2, 3, 4 or 5 times.
  • (1) comprising a RBS and spacer sequence linked directly or via a linker to the 3 ′ end of the promoter (eg, promoter-first linker-first RBS-first spacer, or promoter-first RBS-first spacer ),
  • ribosomal binding included in the control sequence may consist of 7 to 20 bases comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, for example the nucleic acid sequence of SEQ ID NO.
  • the linker sequence included in the regulatory sequence may be a nucleotide sequence having 1 to 100 bases, or 5 to 80 bases, and may be, for example, a nucleic acid molecule including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the linker sequence may include a linker positioned between the promoter and the CBS 1 RBS, a linker positioned between the first spacer and the second RBS, and may be used by appropriately selecting an optimal base sequence of the linker so as to be suitable for each promoter. have.
  • a SOD-derived promoter comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • it may be included in the regulatory sequence together with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 as a Ge 1 linker located between the first spacer and the Crab 2RBS.
  • a second linker located between the promoter and the Crab 1 RBS may include a Crab 1 linker consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 66.
  • a regulatory sequence comprising a Tacl, Tac2 promoter having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 63 or 64, in addition to a promoter sequence, includes a crab 2 linker (eg, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 66), a first RBS sequence (for example, it may comprise a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and a second spacer sequence (eg, a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7) (promoter- (one linker selected from the second linker to the giant linker) -first RBS-second Spacer).
  • a crab 2 linker eg, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 66
  • a first RBS sequence for example, it may comprise a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and a second spacer sequence (eg, a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7) (promoter- (one linker selected from the
  • Tacl promoter having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 63,
  • RBS sequence eg, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • a second spacer sequence comprising the second linker having the sequence of SEQ ID NO: 66 or additionally comprising a second spacer sequence (eg, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7) linked to the second linker;
  • it may be a regulatory sequence consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 70 or group.
  • a second spacer sequence comprising a Tacl promoter having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 64, a 1 RBS sequence (e.g., a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2), a nearly 13 linker having a sequence of SEQ ID NO: 67, or additionally linked to a 2 linker (e.g., , Nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7).
  • a 2 linker e.g., Nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7
  • it may be a regulatory sequence consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 73 or 74.
  • a second spacer sequence comprising a Tacl promoter having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 65, a 1 RBS sequence (eg, a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2), a third linker having a sequence of SEQ ID NO: 68, or additionally linked to a 4 linker 1, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7) may be included.
  • it may be a regulatory sequence consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 75.
  • the spacer sequence included in the regulatory sequence is a nucleic acid molecule having 3 to 15 bases and may be prepared in various kinds of bases and lengths, and a gene located below by including the spacer sequence in the regulatory sequence It can increase the expression efficiency of.
  • various nucleic acid compositions and sizes can be prepared and used in consideration of the coding nucleic acid sequence of the target protein to be expressed and the type of the target host cell.
  • the modified regulatory sequence according to the present invention may be a nucleotide sequence in which at least one base is substituted with a nucleotide sequence of at least one spacer selected from the group consisting of the first and second spacers of the unmodified regulatory sequence.
  • the modification control sequence when the modification control sequence includes one RBS sequence, the modification control sequence includes a promoter, a C 1 RBS, and a first spacer, and the first and second bases of the nucleotide sequence of the first spacer.
  • TT may be a modified regulatory sequence that is substituted with a GA, GT or GC base.
  • TT the first and second bases of the first spacer linked to the 3 'end of the RBS sequence, is substituted with GA, GT or GC, or the first and second bases of the second spacer linked to the 3' end of the second RBS sequence
  • a second spacer wherein TT is substituted with a GG, GA, GT, or GC base, or TT, with the first and second bases of the C 1 spacer, is linked to the 3 'end of the second RBS sequence TT, which is the first and second base of, may be a modification control sequence substituted with a GG, GA, GT or GC base.
  • the first spacer sequence according to the present invention may include the nucleotide sequence of any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 to 6
  • the second spacer sequence may include any one of the nucleotide sequences of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 to 1 1.
  • the promoter sequences, RBS sequences of the first and second spacers and their modified sequences, and linkers included in specific regulatory sequences according to the present invention are exemplarily described in Table 2 below.
  • the regulatory sequence includes a polynucleotide selected from the group consisting of nucleic acid molecules comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 32, when the promoter includes a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 derived from SOD promoter, In the Corynebacterium strain may be to express a psychos epimerizing agent.
  • gaaagga ggacaaa regulatory sequence is provided by the Tacl or Tac2 promoters SEQ ID NOs: 63 and 64.
  • a promoter comprising a nucleotide sequence it comprises a polynucleotide selected from the group consisting of nucleic acid molecules comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 67 to SEQ ID NO: 32, and the Pseudomonas epimerizing agent in the genus Corynebacterium It may be to express.
  • the regulatory sequence according to the present invention can be controlled to be expressed in Corynebacterium strains of the cosmos epimerase enzyme linked to the bottom.
  • the gene expression cassette according to the present invention can be used for the expression of the target protein in the genus Corynebacterium strain, an example of the target protein may be a psychos epimerization enzyme.
  • Said psychos epimerizing enzyme may be derived from C / ostridiun scidens, Troponema monia, Ensperfer a aerens, Agrobacterium Cycos epimerase derived from tumefaciens is not preferred because it has low enzyme activity and poor thermal stability.
  • E. coli-derived promoters exhibit relatively low activity in Corynebacterium due to the low permeability of expression inducers and the absence of gene expression inhibitors.
  • the expression efficiency is different depending on the gene encoding the protein of interest, and the promoters that can be used in Corynebacterium Intensity is also small choice is not easy to manufacture the expression system for the purpose.
  • the promoter for Corynebacterium strain expression the transcriptional control activity may be different according to a specific target protein, and thus the promoter, regulatory sequence or gene expression cassette according to the present invention in the Corynebacterium strain It is suitable to express cos epimerase.
  • the target protein may be directly linked to the 3 ′ end of the nucleic acid molecule for the expression of the genus Corynebacterium strain, or may be linked through a linker.
  • the psychic epimerase according to the present invention has excellent enzymatic activity and thermal stability. Therefore, in the embodiment of the present invention, the promoter or the regulatory sequence is important in combination with the gene encoding the cyclic epimerase, Promoter with the Pseudomonas epimerase enzyme used in the present invention can provide a protein expression more than appropriate, when the promoter is used, the folding (folding) of the protein can be obtained to obtain a high thermal stability results are more preferred. Do.
  • the physico epimerase is C. ostrid / un scidens, Troponema monia, Bis / fer adhaerens or lumino It may be derived from cocos torque (Ruminococcus torques), preferably may be a cosmos epimerizing enzyme comprising a tempide comprising any one of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 to 36.
  • the psychic epimerizing enzyme may be substituted, inserted and / or deleted from some amino acids of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 33 to 36.
  • the protein may include an amino acid sequence having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 99% homology with the amino acid sequence of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 33 to 36. Can be.
  • Nucleotide sequences encoding the cyclic epimerase are Clostridium San dance (C / ostric / iun scidens), Troponema monia, Ensperfer adhaerens or Luminococos Torque It may be a coding nucleotide sequence of a cosmos epimerase obtained from (Ruminococcus torques) or a nucleotide sequence modified to optimize expression in E. coli or Corynebacterium strains.
  • the nucleotide sequence encoding the cyclic epimerase may be a nucleotide sequence encoding any one amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 to 36.
  • the nucleotide sequence encoding the cyclic epimerase may be a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 37 to SEQ ID NO: 44. Or having a sequence having substantial identity to the nucleotide sequence.
  • the substantial identity may be such that the nucleotide sequence of the nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 37 to SEQ ID NO: 44 and any other sequence are aligned to the maximum, and the sequence thereof is analyzed to determine that the other sequence is SEQ ID NO: 37 to It means that the nucleotide sequence of the nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 44 has a sequence homology of at least 70%, at least 90%, or at least 98%.
  • the protein derived from Clostridiun sc / ctens (CPE) having the activity of producing psychoses from fructose (CDPE) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 33 A nucleotide sequence encoding a peptide comprising an amino acid sequence of, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 38.
  • the protein derived from Troponema pnm / (a), having the activity of producing a psychocos from fructose (TDPE) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 and of SEQ ID NO: 34 Nucleotide sequences encoding peptides comprising amino acid sequences, such as the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 40.
  • a protein derived from Ensperferharens (Ens / fer a? Aerer> s), which has the activity of producing a psychosis from fructose (EDPE)
  • EDPE fructose
  • a protein derived from luminococcus torques having the activity of producing psychoses from fructose (RDPE) has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36
  • a nucleotide sequence encoding a peptide comprising, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 43 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 44.
  • the expression cassette according to the present invention may further comprise one or more sequences selected from the group consisting of origins of replication, leader, selectable markers, cloning sites and restriction enzyme recognition sites.
  • Corynebacterium strain according to the present invention including a promoter for the expression, regulatory sequence comprising the same, or a polynucleotide encoding the regulatory sequence and the cyclic epimerase, Corynebacte Provided are gene expression cassettes for Leeum strains.
  • nucleic acid molecule for the expression of the genus Corynebacterium strain and the control sequence and the cyclic epimerase are as described above.
  • the expression cassette is a polynucleotide sequence for expression, and further comprises at least one sequence selected from the group consisting of origin of replication, leader, selectable marker, cloning site and restriction enzyme recognition site. can do.
  • the expression cassette according to the present invention may be used in the form of a recombinant vector comprising the polynucleotide, the polynucleotide itself naked, or the polynucleotide.
  • the recombinant vector refers to a recombinant nucleic acid molecule capable of delivering a target polynucleotide operably linked, wherein the target polynucleotide is operably linked to one or more transcriptional regulatory elements consisting of a promoter, a transcription terminator, and the like. It may be there.
  • the recombinant vector can be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression by methods well known in the art (Francois Baneyx, current Opinion Biotechnology 1999, 10:41 1-421).
  • the recombinant vector may be used as long as it is a vector that has been used for genetic recombination.
  • a plasmid expression vector, a virus expression vector (eg, a replication-defective retrovirus, adenovirus, and adeno-associated virus) and their related functions are performed.
  • Virus vectors may be selected from the group consisting of, but is not limited to these.
  • the recombinant vector may be one selected from the group consisting of pET, pKK223-3, pTrc99a, pKD, pXMJ19, pCES208 vector, and the like. Biotechn., 18: 639-647, 2008).
  • the vector comprising the expression cassette according to the present invention may include an expression vector or the like as a plasmid capable of propagating in a Corynebacterium strain and expressing a protein of interest.
  • the transcription terminator may be rrnB, rrnB_T1, rrnB_T2, T7 terminator, and the like, and preferably T7 transcription terminator PCR from the pET21 a vector.
  • Another embodiment of the present invention relates to a vector comprising a promoter comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 63, 64, or 65, and specifically, does not include a target protein or a target gene encoding the same, and includes only a regulatory sequence.
  • the vector is capable of propagating in E. coli, Corynebacterium strains, and the like, and includes a sherre vector, a replication vector or an expression vector.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 comprising a regulatory sequence that is located upstream of the target polynucleotide sequence to regulate the expression of the target polynucleotide sequence
  • the regulatory sequence Comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • a vector comprising a promoter, a first ribosome binding region (RBS) sequence and a base 1 spacer sequence, for example a plasmid.
  • the regulatory sequence comprises a promoter, a ribosome binding region (RBS) sequence and a crab spacer sequence, and a second ribosome binding region directly or via a linker to the 3′-terminus of the first spacer. It may be to include.
  • the regulatory sequence comprises a crab 1 ribosomal binding region (RBS) sequence and the first spacer sequence, and a second ribosome binding region directly or via a linker to the 3 '-end of the first spacer; May comprise two spacer sequences.
  • the first spacer sequence is SEQ ID NO: 4, comprising a base in which the first and second bases (TT) of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 are substituted with GA, GT, or GC. It may have a sequence of 5, or 6.
  • the modified base may be included in each of the first spacer or the second spacer, or the modified base may be included in both the first spacer or the second spacer.
  • the first spacer sequence has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3
  • the second spacer sequence comprises a base in which the first and second bases of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 are substituted with GA, GT, GC or GG.
  • the first spacer sequence may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3
  • the second spacer sequence may have a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 8 to 11.
  • the first spacer sequence is substituted with a base selected from the group consisting of GA, GT, and GC in the first and second bases (TT) of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and the second spacer sequence is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 medium
  • the first and second base may comprise a base selected from the group consisting of TT, GA, GT, GC and GG
  • the first spacer sequence may be a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 4 to 6, Crab 2 spacer
  • the sequence is SEQ ID NO: 7 to
  • Gene expression cassettes containing regulatory sequences and vectors comprising the same are the same as described above.
  • One example of the present invention may be a recombinant Corynebacterium host cell comprising the gene expression cassette or transformed with a vector comprising the expression cassette.
  • the method of transforming the host cell with the recombinant vector can be selected and used without any particular limitation of the transformation methods known in the art, such as fusion of bacterial protoplasts, electroporation, projectile bombardment, and viruses. It may be selected, such as infection with a vector.
  • the transformed Corynebacterium strain according to the present invention has a high stability, can overexpress the introduced cosmos epimerase, and thus can provide a high long-term stable high psychos conversion capacity. Therefore, the transformed Corynebacterium strain can be usefully applied to the production of psychose, it is possible to further improve the yield of the Pseudomonas.
  • Corybacterium strains are the Corynebacterium genus, in particular Corynebacterium glutamicum iglutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetoacedophyllum, corybacterium acetoacidophyllum Nebacterium thermoaminogenes (ermoam / nogenes), Corynebacterium melasecola (me / asseco! A) and Corynebacterium epiciens species bacteria.
  • the transformed recombinant Corynebacterium host cell is Recombinant Corynebacterium glutamicum (Co ynebacter / um sf / uiam / ' cm).
  • the culture of the genus Corynebacterium strain can be carried out by various culture methods known in the art in a suitable medium. Examples of the culturing method include batch, continuous and fed-batch cultivation.
  • the fed-batch culture includes, but is not limited to, injection batches and repeated injection batch cultures.
  • Medium that can be used according to the invention generally comprises one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and / or trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars such as monosaccharides, disaccharides or polysaccharides.
  • Chelating agents can be added to the medium to retain metal ions in solution. All components of the medium are sterilized by heating (20 minutes at 1.5 bar and 121 ° C.) or by sterile filtration.
  • Another embodiment of the present invention is a cyclic epimerization enzyme obtained using a transformed Corynebacterium strain, the cells of the strain, the culture of the strain, the lysate of the strain, and the crush or extract of the culture It provides a composition for the production of psychocos, comprising one or more selected from the group consisting of.
  • the present invention is a group consisting of a cosmos epimerizing enzyme obtained using a recombinant Corynebacterium host cell, the cells of the cells, the culture of the cells, the lysates of the cells, and the extracts or extracts of the cultures.
  • a method of producing a psychose by contacting a fructose-containing raw material with a composition for producing a psychose comprising at least one selected.
  • the culture includes an enzyme produced from the Corynebacterium strain, and may be in a cell-free form including or without the strain of the strain.
  • the lysate refers to a lysate obtained by crushing the genus Corynebacterium strain or a supernatant obtained by centrifugation of the lysate, and includes an enzyme produced from the genus Corynebacterium strain.
  • the Corynebacterium strain used for the production of psychose is one or more selected from the group consisting of the cells of the strain, the culture of the strain and the lysate of the strain. Used to mean.
  • the method of producing a psychos is fructose-containing strain of the genus Corynebacterium Reacting with the raw material.
  • the step of reacting the Corynebacterium strain with fructose may be performed by culturing the cells of the Corynebacterium strain in a culture medium containing fructose.
  • the step of reacting the genus Corynebacterium strain with fructose comprises contacting the strain (germ, culture of the strain, and / or lysate of the strain) with fructose, such as fructose with fructose.
  • the step of mixing or contacting the fructose with the carrier to which the strain is immobilized can be carried out. In this way, by reacting a strain of the genus Corynebacterium with fructose, the fructose can be converted to cyclose to produce cyclose from fructose. ⁇
  • the concentration of fructose used as a substrate may be 40 to 75% (w / v), such as 50 to 75% (w / v), based on the total reactant, for efficient production of psychos. have. If the concentration of fructose is lower than the range, the economical efficiency is lower. If the concentration of fructose is higher than the range, fructose is not dissolved well, so the concentration of fructose is preferably within the above range.
  • the fructose can be used in the form of a complete solution or a solution dissolved in water (such as distilled water).
  • the reaction may be performed under the conditions of pH 6 to 9.5, for example, pH 7 to 9, pH 7 to 8 or pH 8 to 9.
  • the reaction may be carried out under silver conditions of 30 ° C or more, such as 40 ° C or more. Since the browning phenomenon of fructose, which is a substrate, may occur when the temperature is 80 ° C. or higher, the reaction is performed under the conditions of 40 to 80 ° C., for example, 50 to 75 ° C., 60 to 75 ° C., or 68 to 75 ° C. Can be.
  • the reaction time increases the conversion of Gilsutok.
  • the reaction time is preferably 1 hour or more, for example, 2 hours or more, 3 hours or more, 4 hours or more, 5 hours or more, or 6 hours or more. If the reaction time exceeds 48 hours, the rate of increase in the rate of conversion of the psychos is insignificant or rather declining, so the reaction time should not exceed 48 hours. Therefore, the reaction time may be 1 to 48 hours, 2 to 48 hours, 3 to 48 hours, 4 to 48 hours, 5 to 48 hours, or 6 to 48 hours, in consideration of industrial and economic aspects, 48 hours, 2 to 36 hours, 3 to 24 hours, 3 to 12 hours ⁇ or 3 to 6 hours, but is not limited thereto. no. The above conditions were selected as conditions under which fructose-to-sycos conversion efficiency is maximized.
  • the cell concentration of the strain used is 5 mg (dcw: dry cell weight) / ml or more, for example, 5 to 100 mg (dcw) / ml, 10 to 90 mg (dcw) based on the total reactants ) / ml, 20 to 80 mg (dcw) / ml, 30 to 70 mg (dcw) / ml, 40 to 60 mg (dcw) / ml, or 45 to 55 mg (dcw) / ml. If the cell concentration is less than the above range, there is little or no Psychoconversion activity, and if the cell concentration exceeds the above range, the overall efficiency of the Pycose conversion reaction is lowered, so that the cell concentration is preferably within the above range.
  • the enzyme for converting the fructose to the psychos eg, epimerase
  • the enzyme for converting the fructose to the psychos can be activated by metal ions
  • the addition of metal ions the efficiency of conversion of fructose to psychos, that is, Psycho production rate can be increased.
  • the composition for producing psychos containing the Corynebacterium strain may be further comprising a metal ion.
  • the method for producing a psychos using the Corynebacterium strain may further comprise the step of adding a metal ion.
  • the metal ion may be added to the culture medium of the culture step, or the culture step may be performed in a culture medium to which the metal ion is added.
  • the metal ions may be added to fructose or to a combination of the Corynebacterium strain and fructose.
  • the Corynebacterium strain is added to an immobilized carrier (before fructose addition), the Corynebacterium strain is added to a mixture of immobilized carrier and fructose (after fructose addition) ), Or in the form of fructose and the combination at the time of fructose addition, or respectively.
  • the metal ions may be at least one selected from the group consisting of copper ions, manganese ions, calcium ions, magnesium silver, zinc ions, nickel silver, cobalt ions, iron ions, aluminum ions, and the like.
  • the metal ion may be at least one selected from the group consisting of manganese ions, magnesium ions, nickel ions, cobalt ions, and the like.
  • the metal ions may be manganese ions, cobalt ions, or It may be a combination thereof.
  • the amount of the metal ion added may be 0.5 mM or more.
  • the addition amount of the metal ion exceeds 5mM, the effect is insignificant compared to the excess amount, so that the addition amount of the metal ion can be 5mM or less.
  • the amount of the metal ion added may be in the range of 0.5 mM to 5 mM, for example, 0.5 mM to 2 mM.
  • the carrier may create an environment in which the activity of the immobilized strain or the enzyme produced from the strain can be maintained for a long time, and may be any known carrier that can be used for enzyme immobilization.
  • sodium alginate may be used as the carrier.
  • Sodium alginate is a natural colloidal polysaccharide that is abundant in the algae cell walls.
  • the strain or enzyme may be stably immobilized, which may be advantageous in achieving good psychocos yields.
  • sodium alginate solution e.g. aqueous sodium alginate solution
  • w / v sodium alginate at a concentration of 1.5 to 4.0%
  • sodium alginate at a concentration of (w / v) of about 2.5% in order to further enhance the yield of the psychos.
  • the solution can be used for immobilization of the strain.
  • Cultures containing enzymes produced, or lysate of the strain can be immobilized.
  • the enzyme may be purified from the strain, strain culture or lysate of the strain by conventional methods such as dialysis, precipitation, adsorption, electrophoresis, affinity chromatography, ion exchange chromatography and the like.
  • the step of reacting the enzyme protein with fructose may be performed by contacting the enzyme protein with fructose.
  • the step of contacting the enzyme protein or the like with fructose for example the The method may be performed by mixing an enzyme protein with fructose or contacting fructose with a carrier to which the enzyme protein is immobilized.
  • the step of reacting the enzyme protein with fructose may be performed by reacting the cells of the recombinant strain with fructose-containing raw material and contacting at a proper temperature. As such, by reacting the enzyme protein ' and the like with fructose, the fructose can be converted into the psychos to produce the psychos from the fructose.
  • the amount of the enzyme protein used is 0.001 mg / ml to 1.0 mg / ml, 0.005 mg / ml to 1.0 mg / ml, 0.01 mg / ml to 1.0 mg / ml, 0.01 based on the total reactants. mg / ml to 0.1 mg / ml, or 0.05 mg / ml to 0.1 mg / ml. If the amount of the enzyme is lower than the above concentration, the cycle conversion efficiency may be lowered, and if the amount is higher than the above concentration, the economic range in the industry is lowered, so the above range is appropriate.
  • the concentration of fructose used as a substrate may be 40 to 75% (w / v), such as 50 to 75% (w / v), based on the total counterungmul. If the concentration of fructose is lower than the above range, the economical efficiency is lowered. If the concentration of fructose is higher than the above range, fructose does not dissolve well, so the concentration of fructose is preferably within the above range.
  • the fructose can be used in the form of a complete solution or a solution dissolved in water (such as distilled water).
  • the reaction pH, reaction temperature and the concentration of the enzyme may be appropriately selected.
  • the reaction temperature is more than 80 ° C may occur browning phenomenon of fructose as a substrate, it may be carried out under temperature conditions of 30 ° C or more, such as 40 ° C or more.
  • the reaction time is preferably 1 hour or more. If the reaction time exceeds 8 hours, the increase rate of the psychocos conversion rate is insignificant or rather decreased, so the reaction time should not exceed 8 hours.
  • the cell concentration of the strain used is 0.1 mg (dcw: Dry cell weight) / ml or more.
  • the production method of the psycos may comprise the step of reacting a recombinant strain expressing a cosmos epimerase or an enzyme protein isolated from the recombinant strain with fructose.
  • the method of producing a cosmos may further comprise the step of culturing and recovering the recombinant strains expressing the psyche epimerase before the reaction step.
  • Cycos obtained from fructose by the method of the present invention can be purified by conventional methods and such crystals belong to those of ordinary skill in the art. For example, by one or more methods selected from the group consisting of centrifugation, filtration, crystallization, ion exchange chromatography, and combinations thereof.
  • the present invention is a gene expression system for expressing the cyclase epimerase enzyme in the GRAS strain Corynebacterium strain so that it can be used as a food material by mass production of fructose, recombinant vector and Corynebacterium genus comprising the same Strains may be provided, and psychocos may be produced using a fructose-containing raw material using a cosmos epimerase produced using the gene expression system.
  • FIG. 1 shows a cleavage map of a recombinant vector for expressing D-psicose 3-epimerase protein in corynebacterium glutamicum according to one embodiment of the invention.
  • FIG. 2 is a photograph comparing the expression level of protein through SDS-PAGE after lysing the corynebacterium cells cultured using a bead beater according to an embodiment of the present invention.
  • 3 to 5 are cleavage of a recombinant vector for expressing corynebacterium g hit ami cum ⁇ ⁇ D-psicose 3-epimerase protein of one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 shows a recombinant vector (pCES_taclCDPE)
  • FIG. 4 shows a recombinant vector ( P CES_tac2CDPE)
  • FIG. 5 shows a recombinant vector (pCES_trcCDPE).
  • Figure 6 is a photograph comparing the expression level of protein through SDS-PAGE after lysing the cells cultured using the bead beater of one embodiment.
  • Figure 7 is a graph comparing the cell initial reaction rate calculated in the interval between the straight line of the cycle conversion of one embodiment.
  • FIG. 8 is a graph comparing thermal stability at 50 ° C. during cell reaction of CDPE-expressing cells of one embodiment.
  • Polynucleotides modified by optimizing the DPE gene (Gene bank: EDS0641 1.1) derived from Clostridium sundance (C! Ostricfiuim scindens ATCC 35704) for E. coli was synthesized and named CDPE. Polynucleotides optimized for E.
  • the polynucleotide is a sod regulatory sequence of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: CDPE sequence that is optimized for E. coli of 36, and a T7-terminator.
  • a primer with a target site of -NN- was prepared.
  • the target site was defined as TT located at the rear 3 'of the first RBS (GAAGGA) located in front of the second RBS and sod promoter added at the time of cloning.
  • a primer was prepared (genotech commission). The sequence, saturation mutagenesis site and primer binding site of the primers are shown in Table 5 below.
  • Example 2-1 E. coli transformation
  • the plasmid prepared in Example 1 was transformed into Ec () li DH10b strain by electroporation. Afterwards, screening was performed for the entire mutation in E.cc) li cells. Specifically, in a 1.5ml tube Dispense 1 ml LB (tryptone 10mg / L, NaCI 10mg / L, yeast extract 5mg / L) with kanamydn at a final concentration of 15 // g / ml, and inoculate randomly selected colonies from the plate at 37 ° C Incubated for about 16 hours.
  • LC analysis was then used to compare only the higher conversions to the pcos-sodCDPE and to select only those mutations with higher conversions. Specifically, the method proceeded by identifying the peaks of the substrate (fructose) and the product (psychose) and quantitative analysis through the area of the peaks.
  • R1-1 is substituted for GA at TT 1 and 2 nucleotide angles, and R1-4 is substituted for GG at TT. It is.
  • R2-5 and R2-1 1 are the first and second bases substituted with GG in TT.
  • Example 3 Determination of CDPE Expression at Co / vnebacter / t / m
  • the cells were cultured in 100ml LB to secure cells, and after lysis, His-tag purification was performed to confirm the expression rate of CDPE on SDS-PAGE. It was.
  • the expression (expression rate (%) (Purified protein (mg) / Total soluble protein (mg)) * 100) using the expression rate is shown in Table 7 below.
  • the total protein in the strain is the total protein contained in the strain expressing the cosmos epimerase, and the psyche epimerase is obtained by purifying only the cosmos epimerase. Therefore, the expression rate is a value calculated by the ratio of the target protein expressed in all proteins present in the strain.
  • the cells were cultured in 100 ml LB to obtain cells, which were not purified.
  • the coenzyme was used to analyze the production of psychos from raw materials containing 50 mM fructose.
  • the CDPE-expressing mutant cells obtained in Example 2 were crushed under high concentration substrate conditions in which 1 mM Mn 2+ was added to a raw material containing fructose at a concentration of 50 mM to obtain a supernatant containing protein.
  • the reaction was quantified to 0.007mg / ml, and the reaction was stopped for 5, 10, and 15 minutes at pH 7.0 PIPES 50mM and 60 ° C, and then boiled at 10C for 5 minutes.
  • LC liquid chromatography
  • the analysis was carried out through the area of identification and peaks.
  • the liquid chromatographic analysis was carried out using a Refractive Index Detector from HPLC (Agilent, USA) equipped with an Aminex HPX-87C column (BIO-RAD) (Agilent 1260 RID), the mobile phase solvent using water and a temperature of 80 ° C, The flow rate was performed at 0.6 ml / min. Then, the conversion rate was calculated through the following formula by measuring the amount of Psycho production and the amount of fructose remaining through the peak area of the LC. The results are shown in Table 8.
  • the CDPE expressing cells obtained in Example 2 were subjected to reaction at pH 7.0 PIPES 50 mM and 60 ° C. at a concentration of 0.5 to 2 mg / ml, followed by 5 minutes at 100 ° C. The reaction was stopped by boiling. Reaction of cells was carried out under the above conditions using the respective cells, and the cycle was determined through LC analysis. Conversion rates were compared. Specifically, liquid chromatography (LC) analysis was carried out through the identification of the peaks of the substrate (fructose) and the product (psychos) and the area of the peak (area).
  • LC liquid chromatography
  • the liquid chromatography analysis was performed using a Refractive Index Detector from HPLC (Agilent, USA) equipped with an Aminex HPX-87C column (BIO-RAD) (Agilent 1260 RID), the mobile phase solvent using water and a temperature of 80 ° C. , Flow rate was carried out at 0.6ml / min. Then, the conversion rate was calculated through the following formula by measuring the amount of Pseudomonas and the amount of fructose remaining through the peak area of the LC. The results are shown in Table 9.
  • the additional addition of 2 RBS and the sod promoter is defined as TT located at the back of the 3'-end of the 1 RBS (GAAGGA), which is referred to as GT, GC, or GG, respectively.
  • GAGGA 3'-end of the 1 RBS
  • One primer was prepared (genotech). The sequences of the promoters are shown in Table 1 1 below.
  • RBS1 GT_F GGTGCGGAAACCTACGAAAGGAGTTTTTACCCATGGCTGTA 49
  • CGCACC Secure the front and back fragments by PCR using -N- as the primer, and then construct one template through overlap PCR, and then ligation to XBl and Notl sites on pCES208 plasmid. Saturation mutagenesis prepared plasmid.
  • Example 7-2 CDPE Expression Rate Measurement
  • the cells were cultured in 100ml LB to secure cells, and the cells were lysed and His-tag purification was performed with Ni-NTA resin to obtain total protein.
  • the concentration of and the concentration of purified protein (CDPE) were measured by Bradford assay and the expression rate of the target protein was calculated. Specifically, after lysing the cells cultured using the Beadbeater, only the supernatant was obtained and mixed with the sample buffer in a 1: 1 ratio and heated at 100 ° C. for 5 minutes.
  • the prepared sample was prepared with 12% SDS-PAGE gel (composition: running gel-3.3 ml H 2 0, 4.0 ml 30% acrylamide, 2.5 ml 1.5M Tris buffer (pH 8.8), 100 ⁇ 10% SDS, 100!, 10% APS, 4 id TEMED I stacking gel-1.4 ml H 2 0, 0.33 ml 30% acrylamide, 0.25 ml 1.0M Tris buffer (pH 6.8), 20 fd 10% SDS, 20 fd 10% APS, 2 ⁇ TEMED) Electrophoresis was performed for about 50 minutes at 180V.
  • Figure 2 is a photograph comparing the expression level of protein through SDS-PAGE after lysing the corynebacterium cells cultured using a bead beater according to an embodiment of the present invention.
  • Example 13 In substantially the same manner as in Example 4, after transforming the corynebacterium, the cells were cultured in 100ml LB to secure the cells, and the cell reaction was performed to compare the psychocos conversion rate. The results are shown in Table 13 below.
  • the one-point mutation strains As shown in Table 13, the one-point mutation strains, the activity of the R1 GG to 100, the R1 GA 213, R1 GT 200, R1 GC 161, R1TT 147 all increased the activity I could confirm that.
  • the mutant (R1-1) obtained in Example 5 was used, and plasmids containing double mutants were prepared using the following primers.
  • the sequences of the promoters are shown in Table 15 below.
  • Table 16 below shows the total protein in the strain is a total protein contained within the strain expressing the cosmos epimerase, the physic epimerization enzyme is obtained by purifying only the cosmos epimerase. Therefore, the expression rate is calculated by calculating the ratio of the target protein in all the proteins present in the strain.
  • the cells were cultured in 100ml LB to obtain cells, and the cell reaction was performed to compare the psychocos conversion rate. It is shown in Table 13 below.
  • liquid chromatography (LC) analysis was performed to identify the peaks of the substrate (fructose) and the product (psychose) and quantitatively analyze the area of the peaks.
  • LC liquid chromatography
  • the liquid chromatography analysis was performed (Agilent 1260 RID) using a Refractive Index Detector from HPLC (Agilent, USA) equipped with an Aminex HPX-87C column (BIO-RAD). Water was used for the mobile phase solvent, and the temperature was 80 ° C. and the flow rate was 0.6 ml / min.
  • Table 17 As shown in Table 17, when the cycle conversion of R1 GG to 100, the double mutation strain R1 GA / R2GC was found to increase the activity to 217.
  • the decrease in activity of each cell was measured and the calculated decrease in activity was calculated based on the conversion rate and the 0 min.
  • DPE gene (Gene bank: EDS0641L 1) derived from crosstridium synthase (Clostr idiuim scindens ATCC 35704) was synthesized into a polynucleotide modified form optimized for E. coli. It was named CDPE.
  • Polynucleotides optimized for Escherichia coli (SEQ ID NO: 36), sod promoter (SEQ ID NO: 17) and T7 terminator obtained from the corynebacterium gDNA and pET21a vector were obtained as individual templates through PCAL, and overlapped with PD PCR) method was linked to one template and cloned into the pGEM T-easy vector through T-vector c loning to confirm the sequence of the polynucleotide.
  • the polynucleotide is a sod promoter of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 21 E. CD7 sequences and T7-terminators that are optimized for col i.
  • CDPE (SEQ ID NO: 36) was obtained by PCR from pET21a_CDPE, cloned with Xmal and Hindi II in the pKK223-3 vector to prepare pKK_CDPE. After securing the gene to be inserted, cloned into the pCES208 plasmid with Not l, Xbal site to prepare a recombinant vector (pCES ⁇ taclCDPE). A cleavage map of the prepared recombinant vector (pCES_taclCDPE) is shown in FIG. 3.
  • Example 9-3 Preparation of a Vector Using a tac2 Promoter
  • CDPE (SEQ ID NO: 36) was obtained by PCR from pET21a_CDPE, cloned into Ncol and Sai l in pKD vector to prepare pKILCDPE, and pKD_CDPE as a template to secure insert from PCR from tac2 promoter (SEQ ID NO: 72) to rrnB terminator. It was then cloned into PCS208 plasmid with Xbal si te to prepare pCES_t ac DPE. A cleavage map of the recombinant vector (pCES ′ tac2CDPE) prepared above is shown in FIG. 4.
  • Example 9-4 Preparation of Vector Using trc Promoter
  • CDPE (SEQ ID NO: 36) was obtained from pET21a_CDPE by PCR, cloned with Xmal and Hindi II in the pTrc99a vector, pTrc_CDPE was prepared, and pTrc_CDPE was used as a template.
  • PCES-trcCDPE was prepared by cloning with Xbal si te in the pCES208 plasmid.
  • a cleavage map of the recombinant vector (pCES ′ trcCDPE) prepared above is shown in FIG. 5.
  • Example 10 Host Cell Transformation
  • plasmids prepared in Example 9 were transformed into Corynebacterium glutaricum by electroporation. Pi inking colonies were inoculated into LB medium (Tryptone 10g / L, NaCl lOg / L, yeast extract 5g / L) 1 ⁇ 21 to which kanamycin was added at a final concentration of 15 ug / ml, followed by culturing at 30 o C and Incubated at 250 rpm for about 16 hours. Then, 1 ml of the culture solution was obtained and inoculated in 100 ml LB medium containing 15 ug / ml of kanamycin, and the culture was performed for 16 hours or longer.
  • LB medium Tryptone 10g / L, NaCl lOg / L, yeast extract 5g / L
  • the Korea Microorganism Conservation Center addressing the recombinant strain obtained by transforming Corynebacterium glutaricum with the recombinant vector (pCES_sodCDPE) of Example 9-1 at 25, 2ga-gil, Hongje, Seodaemun-gu, Seo-ri, Korea Culture Center of Microorganisms (KCCM) on October 29, 2014 and received the accession number KCCM11593P.
  • KCCM11593P accession number
  • expression rate (Pur ified protein (mg) I Total solubl e protein (mg)) * 100). Indicated.
  • the total protein in the strain is a total protein contained in the strain of Corynebacterium expressing the Pseudomonas epimerase, the Pseudomonas episomalase is obtained by purifying only the Pseudomonas epimerase enzyme . Therefore, the expression rate is calculated by calculating the ratio of the target protein in the total protein present in the Corynebacterium strain.
  • the CDPE expressing cells obtained in Example 2 were prepared at pH 7.0 PIPES 50 mM and 60 ° C. at a concentration of 0.5 to 2 mg / ml. After reaction was proceeded to boil at 100 0 C for 5 minutes to stop the reaction. Each cell was used for the cell reaction under the above conditions, and after sampling for each reaction time, the yield of each cycle and the initial reaction rate were calculated for each recombinant strain.
  • liquid chromatography (LC) analysis was performed to identify the peaks of the substrate (fructose) and the product (psychose) and to determine the area of the peak. Through ' quantitative analysis.
  • the initial reaction rate (Uni t / g-DCW) for the production of physicocytic cells for various emulsifier solutions are shown in Table 3 below.
  • the liquid chromatography analysis was performed using a Refract ive Index Detector of HPLC (Agi lent, USA) equipped with an Aminex HPX-87C column (BI0-RAD) (Agi lent 1260 RID). Water was used as the mobile phase solvent, the temperature was 80 ° C, the flow rate was 0.6ml / min.
  • the initial reaction rate is the value obtained by dividing the production amount of the product at the reaction point in the straight line by the amount of cells used in the reaction and the reaction time. In other words, the higher the initial reaction rate, the greater the amount of psychocos produced per cell and per hour.
  • t ac / CDPE showed the best cell activity, but sod / CDPE had the most stable half-life of 1800 minutes when thermal stability was observed at 50 ° C. Activity is also important when trying to produce cyclose through cell reaction in the process, but sod / CDPE is preferred because thermal stability acts more economically if only titration activity is secured.

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Abstract

본 발명은 사이코스 에퍼머화 효소를 높은 안정성과 발현율로 생산할 수 있는 유전자 발현 시스템, 이를 이용한 형질전환 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물, 상기 형질전환 GRAS 미생물 또는 형질전환 미생물로부터 얻어진 효소를 이용한 사이코스 생산방법에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
사이코스 에퍼머화 효소의 발현 시스템 및 이를 이용한 사이코스의 생산
【기술분야】
본 발명은 사이코스 에퍼머화 효소를 높은 발현을과 안정성으로 생산할 수 있는 발현 시스템, 이를 이용한 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물, 및 상기 발현 시스템을 이용한 미생물 및 효소를 포함하는 사이코스 생산방법에 관한 것이다.
【발명의 배경이 되는 기술】
다양한 생합성 산물이 자연 대상 과정에 의해 세포에서 생산되며， 식료품， 사료, 화장품, 먹이, 식품 및 제약 산업을 비롯한 수많은 산업 분야에서 사용되고 있다. 이들은 각각의 경우에 요구되는 특정 물질을 다량으로 생산 및 분비하도록 개발된 세균 균주 또는 다른 미생물을 이용하여 대규모로 생산된다. 예를 들면, 코리네박테리움 균주는 산업적으로 아마노산 생산에 가장 많이 이용되는 미생물로서, 1950년대 중반에 글루탐산을 효율적으로 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Co y/7e/>acter/t//77 g/utamicum)이 발견되어 산업화가 이루어졌고, 코리네박테리움 글루타미쿰의 영양 요구성 변이주를 이용한 발효법을 통해 산업적으로 다양한 아미노산올 생산하고 있다.
세포를 엔지니어링하는 데에는 다양한 관련 유전자의 발현 정도를 확실히 조절할 필요가 있고, 이러한 유전자 발현 조절은 다양한 효율적인 발현 시스템을 요구한다. 세포의 조절 서열의 다양한 구성 성분은 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 오퍼레이터 (operator)에 대한 결합 부위 , -35 및 -10 영역으로 지칭되는 RNA 폴리머라제 효소에 대한 결합 부위, 및 리보좀 결합 부위 또는 샤인-달가노 (Shine-Dalgamo) 서열로 지칭되는 리보좀 16S RNA에 대한 결합 부위로 구분되어 있다.
발현 시스템을 개발하는 데에는 프로모터의 선택이 가장 중요하게 여겨지는데 프로모터가 유전자의 발현 정도와 발현 조절에 상당히 크게 관여하기 때문이다. 코리네박테리움 글루타미쿰에서 이용 가능한 프로모터로는 몇 가지가 보고되어 있으며, 주로 코리네박테리움 유래 또는 대장균 유래의 프로모터들이다 (J. Biotechnol., 104:31 1 -323, 2003).
그러나, 대장균 유래의 프로모터는 발현유도인자의 낮은 투과성과 유전자 발현 억제 물질의 부재 등의 이유로 코리네박테리움에 비해 상대적으로 낮은 활성을 나타낸다. 또한 같은 프로모터라 하더라도 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 따라 발현 효율이 상이할 수 있으며 , 코리네박테리움에서 사용할 수 있는 프로모터들의 발현 세기 또한 선택의 폭이 좁아서 목적에 맞게 발현시스템을 제작하는 것이 용이하지 않다. 특히 대사경로의 구축과 같이 다양한 유전자들의 발현을 함께 조절해야 할 경우에 코리네박테리움에서는 대장균에서와 같이 다양한 선택을 할 수 있지 못한 것이 현실이다.
사이코스는 다이어트 감미료로서 각광을 받고 있지만， 자연계에 극히 드물게 존재하는 회소당에 속하기 때문에, 식품 산업에 적용하기 위해서는 사이코스를 효율적으로 대량 생산하는 기술의 개발이 필요하다. 종래의 사이코스 제조 방법은 주로 화학적 합성 과정을 거쳐 제조하는 방법이 대부분이었다. 효소적 방법에 의한 사이코스 제조에 관한 기술로는, 한국등록특허 10-0744479호에 형질전환 대장균을 이용하여 아그로박테리움 투메패시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 대량 생산하고, 생산된 효소를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 제조하는 방법을 기재하고 있다. 효소 정제의 과정을 생략하여 제조원가가 낮고 사이코스를 높은 효율로 생산할 수 있는 균주를 이용하여 사이코스를 생산하는 방법에 관한 개시가 있다. 또한, 한국등록특허 10-1 106253에는 아그로박테리움 투메파시엔스 유래 사이코스 -3- 에피머라제를 발현하며 특정 유전자가 블활성화된 형질전환 대장균을 제조하고， 이들 균주를 과당 포함배지에 접종하여 배지 내 과당을 사이코스로 전환하는 방법에 관한 기술을 개시하고 있다.
상기 한국등톡특허 10-1 106253에 기재된 기술은 대장균을 균주로 사용하기 때문에， 산업적으로 사용이 어려우며, 일반적으로 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 인정받은 균주가 아니기 때문에 식품 소재를 생산하는 균주로서 사용하기에 적합하지 않다는 문제점이 있으며, 아그로박테리움 투메패시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소는 효소의 활성이 ᅳ 낮고 열안정성이 좋지 않다는 단점이 있다.
따라서, 높은 활성을 가지는 사이코스 에피머화 효소를, GRAS 균주에서, 높은 안정성을 가지면서도 고수율로 생산하는 발현 시스템， 이를 이용한 사이코스 에피머화 효소의 생산방법， 및 상기 생산된 효소 또는 형질전환
GRAS 균주를 이용한 사이코스 생산방법이 여전히 필요한 실정이다.
【발명의 내용】
【해결하고자 하는 과제】
본 발명의 일예는 높은 안정성을 가지면서도 고수율로 사이코스 에피머화 효소를 생산할 수 있는 프로모터를 제공하는 것이다. '
본 발명의 일예는 상기 프로모터를 포함하며, 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소의 발현을 조절하는 조절서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예는 상기 프로모터 또는 조절서열과 사이코스 에피머화 효소의.코딩 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 제공하는 것이다. 본 발명 다른 예는 상기 프로모터 또는 조절서열과 사이코스 에피머화 효소의 코딩 서열을 포함하는， 코리네박테리움속 균주용 발현 카세트를 포함하는 백터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예는 상기 발현 카세트로 형질전환되거나， 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 코리네박테리움속 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 다른 예는 상기 코리네박테리움속 균주를 이용하여 얻어진 사이코스 에피머화 효소, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물， 상기 균주의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 사이코스 생산용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 코리네박테리움속 균주를 이용하여 얻어진 사이코스 에피머화 효소, 상기 균주의 균체 , 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여， 과당 -함유 원료로부터 사이코스를 생산하는 방법을 제공한다. 【과제의 해결 수단】
본 발명은 높은 안정성과 발현율로 사이코스 에퍼머화 효소를 생산할 수 있는 발현 시스템， 이를 이용한 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물, 상기 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물을 이용한 효소의 제조방법, 및 상기 발현 시스템을 이용한 미생물 및 효소를 포함하는 사이코스 생산방법에 관한 것이다.
대장균 유래의 프로모터는 발현유도인자의 낮은 투과성과 유전자 발현 억제 물질의 부재 등의 이유로 코리네박테리움속 균주에서 상대적으로 낮은 활성을 나타내며, 또한 코리네박테리움속 균주에서 생산하고자 하는 사이코스 에피머화 효소의 발현에 적합한 발현 시스템을 제공하자 한다.
본 발명은 코리네박테리움속 균주에서 높은 발현율로 안정적으로 사이코스 에피머화 효소를 발현할 수 있는 프로모터， 상기 프로모터를 포함하는 조절서열， 상기 조절서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 제공하여， 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소를 높은 발현율로 안정적으로 대량으로 생산할 수 있다. 또한， 본 발명자들은 식품에 적용 가능한 사이코스를 대량 생산을 하기 위해, GRAS (Generally recognized as safe) 균주에서 안정적이고 높은 효소 생산활성을 갖는 사이코스 에피머화 효소를 다량 발현하기 위하여, 상기 프로모터와 조합시 더욱 우수한 발현율을 나타내는 사이코스 에피머화 효소 및 이의 코딩 뉴클레오타이드 서열을 제공하고자 한다.
본 명세서에서， "프로모터 "， "프로모터 활성을 갖는 핵산분자" 또는 "프로모터 서열"은 목적 뉴클레오타이드 서열에 기능적으로 연결되어 상기 목적 뉴클레오타이드 서열의 전사 또는 발현을 조절하는 핵산을 의미하며, 전사 프로모터 및 발현 프로모터를 모두 포함한다.
전사대상 뉴클레오타이드 서열은 화학적 의미에서 반드시 프로모터에 직접 연결을 필요로 하는 것은 아니며, 추가적인 유전자 조절 서열 및 /또는 링커 뉴클레오타이드 서열 등을 포함할 수 있다. 전사대상 목적 뉴클레오타이드 서열이 프로모터 서열의 하부에 (즉, 프로모터 서열의 3' 말단에) 위치하는 배열이 바람직하다. 프로모터 서열과 전사대상 뉴클레오타이드 서열 사이의 거리는 바람직하게는 200개 염기 미만， 특히 바람직하게는 100개 염기 미만이다.
본 명세서에서 "리보좀 결합 부위" (RBS)의 서열 또는 샤인-달가노 서열은 A/G 풍부 폴리뉴클레오티드 서열을 의미로서 번역시 리보좀이 결합하는 부위이다.
본 명세서에서 "조절 서열' '은 프로모터를 포함하고 발현대상 목적 뉴클레오타이드 서열 또는 유전자에 기능적으로 연결되어, 상기 목적 핵산 또는 상기 유전자의 발현, 즉 전사 및 /또는 번역을 조절하는 활성을 갖는 핵산을 의미한다. 따라서, 이와 관련하여 상기 뉴클레오타이드 서열은 "조절 뉴클레오타이드 서열"로도 불린다.
본 명세서에서 "발현 카세트 "는 발현대상 목적 뉴클레오타이드 서열， 예를 들면 사이코스 에피머화 효소의 코딩 뉴클레오타이드 서열에 기능적으로 연결된 조절 서열을 포함한다. 따라서, 발현 카세트는 전사 및 번역을 조절하는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 전사 및 번역의 결과로서 단백질로 발현되는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 바람직하게는 자연에 존재하지 않는 형태이며 (non-naturally occurring), 단리된 핵산 분자의 형태 또는 합성 또는 재조합 방법에 의해서 제조되는 핵산분자이다. "단리된" 핵산 분자는 상기 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 제거되고, 추가로, 재조합 기술에 의해 제조될 경우 본질적으로 다른 세포성 물질 또는 배양 배지가 존재하지 않거나, 화학적으로 합성될 경우에는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 존재하지 않을 수 있다.
본 발명의 일예는 코리네박테리움속 균주 발현용 조절서열의 핵산분자에 관한 것으로서, 높은 안정성과 활성을 가지는 사이코스 에피머화 효소를， GRAS 균주에서 높은 안정성을 가지면서도 고수율로 생산할 수 있도록 한다. 이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다
본 발명의 일예는 코리네박테리움속 균주 발현용 조절서열의 핵산분자에 관한 것으로서, 높은 안정성과 활성을 가지는 사이코스 에피머화 효소를, GRAS 균주에서 높은 안정성을 가지면서도 고수율로 생산할 수 있도록 한다. 본 발명의 또 다른 일예는 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 그 상류 (upstream)에 작동 가능하도록 연결되며， 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소의 발현을 조절하는 조절서열;을 포함하며，
상기 조절서열은， 서열번호 1의 핵산서열을 포함하는 핵산분자， 서열번호 63 의 핵산서열을 포함하는 핵산 분자, 서열번호 64의 핵산서열을 포함하는 핵산분자, 및 서열번호 65의 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 프로모터를 포함하는, 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소의 발현하는 유전자 발현 카세트 (gene expression cassette)를 제공한다.
본 발명에 따른 조절서열은, GRAS 균주, 예를 들면 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 발현하는 프로모터 또는 이를 함유하는 조절서열을 포함한다.
상기 조절서열은 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하는 비변형 조절서열 또는 이의 변형 조절서열일 수 있다.
상기 조절 서열에 포함된 프로모터는 서열번호 1， 서열번호 63, 서열번호 64， 및 서열번호 65의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자 및 기능적 변이체에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 다른 예에서, 상기 기능 변이체는， 서열번호 1 , 63， 64, 또는 65의 뉴클레오타이드 서열과의 서열 동일성이, 적어도 90%, 즉， 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91 %, 90% 이상이다.
상기 조절 서열에 포함된 프로모터 서열의 예는 하기 표 1에 나타냈다. 【표 1】
Figure imgf000009_0001
본 발명에 따른 조절 서열은, 프로모터 서열에 추가하여， 리보솜 결합 영역 (r ibosome binding region, RBS) 서열， 스페이서 서열 및 링커 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 포함할 수 있다. - 상기 리보솜 결합 영역 서열은 적어도 1회 이상, 예를 들면 적어도 1회 내지 5회， 또는 2회로 포함될 수 :있다.
상기 조절서열은 제 1 RBS 서열 및 제 1 스페이서 서열을 포함하거나， 제 1 RBS 서열 및 제 1 스페이서 서열과 제 1 스페이서의 31 -말단에 직접 또는 링커를 통해 연결되는 게 2 리보솜 결합 영역을 포함하거나， 제 1 RBS 서열 및 거 ] 1 스페이서 서열과, 게 1 스페이서의 3 ' -말단에 직접 또는 링커를 통해 연결되는 제 2 RBS 서열과 계 2 스페이서 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 SOD 프로모터 유래， 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터를 예로 들어 설명하고자 하며， 서열번호 63， 64 또는 65의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 Tacl , Tac2 , Trc 프로모터에 대해서 동일하게 적용된다.
구체적으로, 상기 조절서열이 하나의 RBS 서열을 포함하는 경우, 예를 들면 상기 조절서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터， 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제 1 RBS 서열 및 서열번호 3 내지 서열번호 6 의 뉴클레오타이드 서열중에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 게 1 스페이서를 포함하는 핵산분자일 수 있다 (프로모터 -제 1 RBS-제 1 스페이서). 또한， 선택적으로 상기 조절서열의 제 1 스페이서의 3'말단에 연결되는 1개 내지 100개 염기로 이루어지는 링커 서열을 포함하는 핵산분자일 수 있다 (프로모터-제 1 RBS-제 1 스페이서-링커).
상기 조절 서열이 두 개의 RBS 서열을 포함하는 경우, 예를 들면 상기 조절서열은 (i)서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터를 포함하며, 추가로 (ii)서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 게 1 RBS 서열, (iii)서열번호 3 내지 6의 뉴크레오타이드 서열중에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 게 1 스페이서, (iv) 서열번호 12의 링커서열， 및 (V) 서열번호 7 내지 1 1의 뉴크레오타이드 서열중에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 게 2 스페이서로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 추가로 포함할 수 있으며, 상기 RBS 서열을 1회 이상 포함될 수 있다.
예를 들면, 제 2 RBS서열을 상기 제 1 스페이서의 3'-말단에 직접 또는 링커를 통해 연결될 수 있다 (프로모터 -제 1 RBS-제 1 스페이서-제 2RBS 또는 프로모터 제 1 RBS-제 1 스페이서-링커-제 2RBS). 상기 두 개의 RBS 서열을 포함하는 조절서열에 있어서, 제 2 RBS의 3'-말단에 연결된 제 2 스페이서 서열을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 제 1 RBS와 제 1스페이서의 조합 또는 제 2RBS와 제 2스페이서의 조합은 1회 이상, 예를 들면 1-5회， 2, 3, 4 또는 5회 반복하여 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 비변형 조절서열의 구체적인 예는 다음과 같다.
(1 ) 프로모터의 3'말단에 직접 또는 링커를 통해 연결된 RBS와 스페이서 서열을 포함하는 것 (예， 프로모터 - 제 1링커 - 제 1 RBS - 제 1 스페이서, 또는 프로모터 - 제 1 RBS - 제 1 스페이서),
(2) 프로모터의 3'말단에 연결된 RBS과 스페이서 서열을 2회 이상 반복하여 포함하는 것 (예, 프로모터 - 제 1 RBS - 제 1 스페이서 - 제 2 RBS - 제 2 스페이서), 및
(3) 프로모터의 3'말단에 연결된 RBS과 스페이서 서열을 2회 이상 반복하여 포함하며, 제 1 스페이서 서열과 제 2 RBS 사이에 제 2링커를 추가로 포함하는 것 (예, 프로모터 - 제 1 RBS - 제 1 스페이서 - 제 2링커 서열 - 제 2 RBS - 제 2 스페이서).
본 발명의 일 예에서, 상기 조절서열에 포함되는 리보좀 결합 영역 (RBS)은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 7 내지 20 염기로 이루어지는 것일 수 있으며， 예를 들면 서열번호 2의 핵산서열이다.
상기 조절서열에 포함되는 링커 서열은 1개 내지 100개의 염기, 또는 5개 내지 80 염기를 가지는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들면 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자일 수 있다. 상기 링커서열은 프로모터와 게 1 RBS 사이에 위치하는 링커, 제 1스페이서와 제 2RBS에 사이에 위치하는 링커를 포함할 수 있으며, 각각의 프로모터에 적합하도록 링커의 최적 염기서열을 적절히 선택하여 사용될 수 있다. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 SOD 유래 프로모터의 경우, 제 1스페이서와 게 2RBS에 사이에 위치하는 게 1 링커로서 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열와 함께 조절서열에 포함될 수 있다. Tad 및 Tac2 유래 프로모터의 경우, 프로모터와 게 1 RBS 사이에 위치하는 제 2 링커로서, 서열번호 66의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 게 1 링커를 포함할 수 있다. 본 발명의 일예에서, 서열번호 63 또는 64의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 Tacl , Tac2 프로모터를 포함하는 조절서열은 프로모터 서열에 추가하여， 게 2링커 (예 서열번호 66의 뉴클레오타이드 서열)， 제 1 RBS 서열 (예， 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 및 제 2 스페이서 서열 (예, 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열)을 포함할 수 있다 (프로모터- (제 2링커 내지 거 링커중에서 선택된 하나의 링커) -제 1RBS-제 2스페이서) .
■ 구체적으로， 서열번호 63의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 Tacl 프로모터，
1 RBS 서열 (예 , 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열) , 서열번호 66의 서열을 갖는 제 2링커를 포함하거나 추가적으로 제 2링커에 연결된 제 2 스페이서 서열 (예， 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열)을 포함할 수 있다. 예로서， 서열번호 70 또는 기의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 조절서열일 수 있다.
서열번호 64의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 Tacl 프로모터， 1 RBS 서열 (예， 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열)， 서열번호 67의 서열을 갖는 거 13링커를 포함하거나 추가적으로 게 2링커에 연결된 제 2 스페이서 서열 (예， 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열)을 포함할 수 있다. 예로서 , 서열번호 73 또는 74의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 조절서열일 수 있다. 서열번호 65의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 Tacl 프로모터， 1 RBS 서열 (예， 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열)， 서열번호 68의 서열을 갖는 제 3링커를 포함하거나 추가적으로 게 4링커에 연결된 제 2 스페이서 서열 (여 1， 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열)을 포함할 수 있다. 예로서 , 서열번호 75의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 조절서열일 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 상기 조절서열에 포함되는 스페이서 서열은 3 내지 15 염기를 가지는 핵산분자이며 다양한 종류의 염기 및 길이로 제조될 수 있으며, 조절서열에 스페이서 서열을 포함시킴으로써 하부에 위치하는 유전자의 발현효율을 증가시킬 수 있다. 또한， 발현대상 목적 단백질의 코딩 핵산서열과 대상 숙주세포의 종류 등을 고려하여 다양한 종류의 핵산조성 및 크기로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 변형 조절서열은, 상기 비변형 조절서열의 계 1 스페이서 및 제 2 스페이서로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 스페이서의 뉴클레오타이드 서열이 하나 이상의 염기가 치환된 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. '
예들 들어， 상기 변형 조절서열이 하나의 RBS 서열을 포함하는 경우, 상기 변형 조절서열은 프로모터, 게 1 RBS 및 제 1 스페이서를 포함하며, 상기 제 1 스페이서의 뉴클레오타이드 서열의 첫 번째 및 두 번째 염기인 TT가, GA, GT 또는 GC 염기로 치환된 것인 변형 조절서열일 수 있다.
또한, 상기 변형 조절서열이 두 개의 RBS 서열을 포함하는 경우, 게 1
RBS 서열의 3'말단에 연결된 제 1 스페이서의 첫 번째 및 두 번째 염기인 TT가 GA, GT 또는 GC로 치환되거나, 제 2 RBS 서열의 3'말단에 연결된 제 2 스페이서의 첫 번째 및 두 번째 염기인 TT가 GG, GA, GT 또는 GC 염기로 치환되거나, 또는 게 1 스페이서의 첫 번째 및 두 번째 염기인 TT가 GA, GT 또는 GC로 치환되고 제 2 RBS 서열의 3'말단에 연결된 제 2 스페이서의 첫 번째 및 두 번째 염기인 TT가 GG, GA, GT 또는 GC 염기로 치환된 변형 조절서열일 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 제 1 스페이서 서열은 서열번호 3 내지 6의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있으며， 제 2스페이서 서열은 서열번호 7 내지 1 1의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 구체적인 조절서열에 포함되는 프로모터 서열, RBS서열 제 1스페이서 및 제 2스페이서와 이들의 변형 서열, 및 링커를 하기 표 2에 예시적으로 기재한다.
【표 2】
Figure imgf000013_0001
상기 조절서열은, SOD 프로모터 유래， 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터를 포함하는 경우， 서열번호 13 내지 서열번호 32의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화제를 발현하는 것일 수 있다.
【표 31
서열 서열 (5' -> 3') tri
ᄋ명 0 번호
13 (서열번호 1)+ gaaagga ttttttaccc RBSl/lst SPACER-TT
14 (서열번호 1)+ gaaagga gattttaccc RBSl/lst SPACER-GA ,
15 (서열번호 1 )+ gaaagga gtttttaccc RBSl/lst SPACER-GT (서열번호 1)+ gaaagga gcttttaccc RBSl/lst SPACER-GC
(서열번호 1)+ gaaagga ttttttaccc RBSl/lst SPACER-TT atggctgtatacgaactcccagaactcgactacgcatacgac 링커
(서열번호 1)+ gaaagga gattttaccc SOD一 R1GA/R2TT atggctgtatacgaactcccagaact cgactacgcatacgac
gaaagga ttacaaa
(서열번호 1)+ gaaagga gattttaccc S0D-R1GA/R2GA at gctgtatacgaactcccagaactcgactacgcatacgac
gaaagga gaacaaa
(서열번호 1)+ gaaagga gattttaccc S0D-R1GA/R2GT a ggctgtatacgaactcccagaactcgactacgcatacgac
gaaagga gtacaaa
(서열번호 1)+ gaaagga gattttaccc SOD— R1GA/R2GC atggctgt at acgaactcccagaactcgactacgcat acgac
gaaagga gcacaaa
(서열번호 1)+ gaaagga gattttaccc SOD-R1GA/R2GG atggctgt at acgaactcccagaactcgactacgcat acgac
gaaagga ggacaaa
(서열번호 1) + gaaagga gtttttaccc SOD一 R1GT/R2TT atggctgt at acgaactcccagaactcgactacgcat acgac
gaaagga ttacaaa
(서열번호 1) + gaaagga gtttttaccc SODᅳ R1GT/R2GA atggctgt at acgaactcccagaactcgactacgcat acgac
gaaagga gaacaaa
(서열번호 1) + gaaagga gtttttaccc SOD-R1GT/R2GT atggctgt at acgaactcccagaactcgactacgcat acgac
gaaagga gtacaaa
(서열번호 1) + gaaagga gtttttaccc SOD— R1GT/R2GC atggctgt atacgaactcccagaactcgactacgcat acgac
gaaagga gcacaaa
(서열번호 1) + gaaagga gtttttaccc SOD一 R1GT/R2GG atggctgt t acgaactcccagaactcgactacgcat acgac
gaaagga ggacaaa
(서열번호 1) + gaaagga gcttttaccc SOD-R1GC/R2TT atggctgt at acgaactcccagaactcgactacgcat acgac
gaaagga ttacaaa
(서열번호 1) + gaaagga gcttttaccc SOD— R1GC/R2GA atggctgt at acgaactcccagaactcgactacgcat acgac
gaaagga gaacaaa
(서열번호 1) + gaaagga gcttttaccc SOD-R1GC/R2GT atggctgt at acgaactcccagaactcgactacgcat acgac
gaaagga gtacaaa
(서열번호 1) + gaaagga gcttttaccc SOD—R1GC/R2GC atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac
gaaagga gcacaaa
(서열번호 1) + gaaagga gcttttaccc SOD-R1GC/R2GG atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac
gaaagga ggacaaa 조절서열은, Tacl 또는 Tac2 프로모터 서열번호 63 및 64의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터를 포함하는 경우， 서열번호 67 내지 서열번호 32의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화제를 발현하는 것일 수 있다.
【표 4】
Figure imgf000015_0001
본 발명에 따른 조절서열은 그 하부에 연결된 사이코스 에피머화 효소를 코리네박테리움속 균주에서 발현할 수 있도록 조절할 수 있다. 이에, 본 발명에 따른 유전자 발현 카세트는 코리네박테리움속 균주에서 목적 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있으며, 상기 목적 단백질의 예는 사이코스 에피머화 효소일 수 있다. 상기 사이코스 에피머화 효소는 클로스트리디움 신댄스 (C/ostridiun scidens), 트로포네마 프리미샤 (rreponema primitia), 엔시퍼 아드해렌스 (Ens/fer a aerens)에서 유래된 것일 수 있으며， 아그로박테리움 투메패시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소는 효소의 활성이 낮고 열안정성이 좋지 않다는 단점이 있어 바람직하지 않다.
대장균 유래의 프로모터는 발현유도인자의 낮은 투과성과 유전자 발현 억제 물질의 부재 등의 이유로 코리네박테리움에서 상대적으로 낮은 활성을 나타낸다. 또한 같은 프로모터라 하더라도 목적단백질을 코딩하는 유전자에 따라 발현 효율이 상이하며 , 코리네박테리움에서 사용할 수 있는 프로모터들의 세기 또한 선택의 폭이 작아서 목적에 맞게 발현시스템을 제작하는 것이 용이하지 않다. 또한, 코리네박테리움속 균주 발현용 프로모터일 지라도 특정 목적 단백질에 따라 그 전사조절 활성이 상이할 수 있으며， 이에 본 발명에 따른 프로모터, 조절서열 또는 유전자 발현 카세트는 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 것이 적합하다.
상기 목적 단백질은 코리네박테리움속 균주 발현용 핵산분자의 3'말단에 직접 연결되거나， 링커를 통해 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 사이코스 에피머화 효소는 효소활성 및 열안정성이 우수한 것이 바람직하고, 이에 본 발명의 구체예에서 , 프로모터 또는 조절서열은 사이코스 에피머화 효소를 코딩하는 유전자와의 조합이 중요하며, 본 발명에 사용된 사이코스 에피머화 효소와는 프로모터는 적정 이상의 단백질 발현을 제공할 수 있으며, 프로모터를 사용한 경우에는 단백질의 폴딩 (folding)이 견고하여 열안정성이 높게 나타나는 결과를 얻을 수 있어 더욱 바람직하다.
본 발명의 일예에서 , 상기 사이코스 에피머라제는 클로스트리디움 신댄스 (C/ostrid/un scidens), 트로포네마 프리미샤 (Treponema primitia), 엔시퍼 아드해렌스 (Bis/fer adhaerens) 또는 루미노코코스 토르크 (Ruminococcus torques)에서 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 33 내지 36의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 템타이드를 포함하는 사이코스 에피머화 효소일 수 있다.
상기 사이코스 에피머화 효소는 과당을 사이코스로 전환하는 활성이 유지되는 한, 서열번호 33 내지 36의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 중 일부 아미노산이 치환， 삽입 및 /또는 결실된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 단백질은 서열번호 33 내지 36의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열올 포함하는 것일 수 있다.
상기 사이코스 에피머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 클로스트리디움 산댄스 (C/ostric/iun scidens), 트로포네마 프리미샤 (rreponema primitia), 엔시퍼 아드해렌스 (Ens/fer adhaerens) 또는 루미노코코스 토르크 (Ruminococcus torques)에서 얻어진 사이코스 에피머화 효소의 암호화 뉴클레오타이드 서열이거나, 대장균 또는 코리네박테리움속 균주에서 발현에 최적화할 수 있도록 변형된 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
예를 들면, 상기 사이코스 에피머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은， 서열번호 33 내지 36의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 구체적으로, 상기 사이코스 에피머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은ᅵ 서열번호 37 내지 서열번호 44로 이루어지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자일 수 있다. 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기의 실질적인 동일성은 서열번호 37 내지 서열번호 44로 이루어지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대웅되도록 정렬하고， 그 서열을 분석하여， 상기 임의의 다른 서열이 서열번호 37 내지 서열번호 44로 이루어지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.
본 발명의 일 예에서, 클로스트리디움 신댄스 (Clostridiun sc/ctens)에서 유래한 것으로， 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질 (CDPE)는 서열번호 33의 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열， 예를 들어 서열번호 37의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 38의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에서， 트로포네마 프리미샤 (Treponema pnm/ /a)에서 유래한 것으로， 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질 (TDPE)는 서열번호 34의 아미노산 서열올 가지며 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 서열번호 39의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 40의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 엔시퍼 아드해렌스 (Ens/fer a ?aerer>s)에서 유래한 것으로, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질 (EDPE)는 서열번호 35의 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 서열번호 41의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 42의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 루미노코코스 토르크 ( uminococcus torques)에서 유래한 것으로, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질 (RDPE)은 서열번호 36의 아미노산 서열을 가지며 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 서열번호 43의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 44의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 발현 카세트는 복제 기점, 리더 (leader), 선택 가능한 마커， 클로닝 부위 및 제한효소 인식부위로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 예는， 본 발명에 따른 코리네박테리움속 균주 발현용 프로모터, 이를 포함하는 조절서열， 또는 상기 조절서열과 및 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 코리네박테리움속 균주용 유전자 발현 카세트를 제공한다.
상기 코리네박테리움속 균주 발현용 핵산분자, 및 조절 서열과 사이코스 에피머화 효소는 상술한 바와 같다.
본 발명의 일예에서, 상기 발현 카세트는 발현을 위한 폴리뉴클레오티드 서열로서, 복제 기점, 리더 (leader), 선택 가능한 마커， 클로닝 부위 및 제한효소 인식부위로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 발현 카세트는 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체로 naked nucleic acid construct), 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 백터의 형태로 사용될 수 있다. 상기 재조합 백터란 작동 가능하도록 연결된 목적 폴리뉴클레오타이드를 전달할 수 있는 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 목적 폴리뉴클레오타이드는 프로모터 및 전사 종결인자 등으로 이루어지는 하나 이상의 전사 조절 요소와 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다.
상기 재조합 백터는 당업계에 널리 알려진 방법을 통해 클로닝을 위한 백터 또는 발현을 위한 백터로서 구축될 수 있다 (Francois Baneyx, current Opinion Biotechnology 1999, 10:41 1 -421 ). 상기 재조합 백터는 유전자 재조합에 이용되어온 백터라면 모두 사용이 무방하며 , 예컨대， 플라스미드 발현백터, 바이러스 발현백터 (예, 복제결함 레트로바이러스， 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동둥한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 백터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 상기 재조합 백터는 pET, pKK223-3, pTrc99a, pKD, pXMJ19, pCES208 백터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것으로부터 제작된 것일 수 있으며, 람직하게는 E.coli-corynebacterium shuttle vector (pCES208, J. Microbiol. Biotechn이., 18:639-647， 2008)일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 백터는 특히 코리네박테리움속 균주에서 증식 가능하고 목적 단백질을 발현 가능한 플라스미드로서 발현백터 등을 포함할 수 있다.
상기 전사 종결인자는 rrnB, rrnB_T1 , rrnB_T2, T7 terminator 등 일수 있으며， 바람직하게는 pET21 a vector로부터 PCR된 T7 전사 종결인자일 수 있다. 본 발명의 또 다른 일예에는, 서열번호 1 , 63， 64 또는 65의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터를 포함하는 백터에 관한 것으로서, 특별히 목적 단백질 또는 이를 암호화하는 목적 유전자를 포함하지 않고 조절서열만을 포함할 수 있다. 상기 백터는 대장균, 코리넥박테리움속 균주 등에서 증식가능하며， 셔를백터， 복제 백터 또는 발현 백터 등을 포함한다. 구체적으로 , S0D 프로모터 유래 , 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터를 포함하는 경우， 목적 폴리뉴클레오타이드 서열의 상류에 위치하여 상기 목적 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하는 조절서열을 포함하며， 상기 조절 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터， 제 1리보솜 결합 영역 (r ibosome binding regi on , RBS) 서열 및 거] 1 스페이서 서열을 포함하는 것인 백터， 예를 들면 플라스미드에 관한 것이다. 상기 조절서열은 프로모터， 게 1리보솜 결합 영역 (r i bosome bi nding regi on , RBS) 서열 및 게 1 스페이서 서열과， 제 1 스페이서의 3 ' -말단에 직접 또는 링커를 통해 연결되는 제 2 리보솜 결합 영역을 포함하는 것일 수 있다. 또한， 상기 조절서열은 게 1리보솜 결합 영역 (r ibosome binding regi on , RBS) 서열 및 제 1 스페이서 서열과， 제 1 스페이서의 3 ' -말단에 직접 또는 링커를 통해 연결되는 제 2 리보솜 결합 영역과 게 2 스페이서 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 프로모터를 포함하는 백터에서， 바람직하게는 상기 제 1스페이서 서열은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열중 첫번째 및 두번째 염기 (TT)가 GA , GT 또는 GC 로 치환된 염기를 포함하는 서열로서 서열번호 4， 5， 또는 6의 서열올 가지는 것일 수 있다.
상기 백터가 제 1 스페이서와 제 2 스페이서를 포함하는 경우， 제 1 스페이서 또는 제 2 스페이서 각각에만 변형염기를 포함하거나， 또는 제 1 스페이서 또는 계 2 스페이서 모두에서 변형된 염기를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 제 1스페이서 서열은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 가지고， 제 2 스페이서 서열은 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열중 첫번째 및 두번째 염기가 GA , GT , GC 또는 GG로 치환된 염기를 포함하는 것일 수 있으며, 제 1 스페이서 서열은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 가지고， 제 2 스페이서 서열은 서열번호 8 내지 11중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다.
혹은， 상기 계 1스페이서 서열은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열중 첫번째 및 두번째 염기 (TT)가 GA , GT 및 GC로 이루어지는 군에서 선택되는 염기로 치환되고， 제 2 스페이서 서열은 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열중 첫번째 및 두번째 염기가 TT , GA , GT , GC 및 GG로 이루어지는 군에서 선택되는 염기를 포함할 수 있으며， 제 1 스페이서 서열은 서열번호 4 내지 6중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열일 수 있고， 게 2 스페이서 서열은 서열번호 7 내지
11중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
본 발명에 따라 목적 단백질 또는 이를 암호화하는 목적 유전자를 포함하지 않고 조절서열만을 포함하는 백터에서, RBS , 링커, 게 1스페이서 및 제 2 스페이서 등 기타 구성요소에 대해서는 상기 사이코스 에피머라제 코딩 서열과 조절 서열을 함유하는 유전자 발현 카세트 및 이를 포함하는 백터에 상술한 내용과 동일하다. 본 발명의 일예는 상기 유전자 발현 카세트를 포함하거나， 상기 발현 카세트를 포함하는 백터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움속 숙주세포일 수 있다.
상기 재조합 백터로 숙주 세포를 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지된 모든 형질전환 방법 특별한 제한 없이 선택하여 사용할 수 있으며， 예컨대, 세균 원형질체의 융합, 전기 천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러스 백터를 사용한 감염 등 선택된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 형질전환 코리네박테리움속 균주는 높은 안정성을 가지며, 도입된 사이코스 에피머화 효소를 과발현할 수 있으며, 따라서 장기간 안정적으로 높은 사이코스 전환능을 제공할 수 있다. 따라서， 상기 형질전환 코리네박테리움속 균주는 사이코스 제조에 유용하게 적용될 수 있으며, 사이코스 생산 수율을 보다 증진시킬 수 있다.
바람직한 코리박테리움속 균주는 코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 iglutamicum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (acetoacidophik f), 코리네박테리움 써모아미노제네스 ( ermoam/nogenes), 코리네박테리움 멜라쎄콜라 (me/asseco!a) 및 코리네박테리움 에피시엔스 (efficiens) 종 세균이다.
본 발명에 따른 형질전환된 재조합 코리네박테리움속 숙주세포는 재조합 코리네박테리움 글투타미쿰 (Co ynebacter/um sf/uiam/'c m)일 수 있다. 상기 코리네박테리움속 균주의 배양은 적당한 배지에서 당업계에서 알려진 다양한 배양 방법으로 수행될 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함된다. 상기 유가식 배양에는 주입 배치 및 반복 주입 배치 배양이 포함되나， 여기에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 배지는 일반적으로 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염, 비타민 및 (또는) 미량 원소를 포함한다. 바람직한 탄소 공급원은 단당류， 이당류 또는 다당류와 같은 당류이다. 용액 중 금속 이온을 유지시키기 위해 배지에 킬레이팅제를 첨가할 수 있다. 배지의 모든 성분은 가열 (1 .5 bar 및 121 °C에서 20분) 또는 멸균 여과에 의해 멸균시킨다.
본 발명의 또 다른 일예는, 형질전환 코리네박테리움속 균주를 이용하여 얻어진 사이코스 에피머화 효소, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는， 사이코스 생산용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 재조합 코리네박테리움속 숙주세포를 이용하여 얻어진 사이코스 에피머화 효소, 상기 세포의 균체, 상기 세포의 배양물， 상기 세포의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 사이코스 생산용 조성물을 과당 -함유 원료와 접촉하여 사이코스를 생산하는 방법올 제공한다.
상기 배양물은 상기 코리네박테리움속 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 균주의 상기 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 무세포 (cell-free) 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 상기 코리네박테리움속 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 코리네박테리움속 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것이다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 사이코스의 제조에 사용되는 코리네박테리움속 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.
상기 사이코스 생산 방법은 상기 코리네박테리움속 균주를 과당 -함유 원료와 반웅시키는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 코리네박테리움속 균주를 과당과 반웅시키는 단계는 상기 코리네박테리움속 균주의 균체를 과당이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 코리네박테리움속 균주를 과당과 반웅시키는 단계는 상기 균주 (균체 , 균주의 배양물, 및 /또는 균주의 파쇄물)를 과당과 접촉시키는 단계 , 예컨대, 상기 균주를 과당과 흔합하는 단계 또는 상기 균주가 고정화된 담체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 코리네박테리움속 균주를 과당과 반응시킴으로써 과당을 사이코스로 전환하여 과당으로부터 사이코스를 생산할 수 있다. Λ
상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여， 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반응물 기준으로 40 내지 75%(w/v), 예컨대, 50 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고ᅵ 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완층용액 또는 물 (예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.
상기 사이코스 생산방법에 있어서， 상기 반응은 pH 6 내지 9.5， 예컨대, pH 7 내지 9, pH 7 내지 8 또는 pH 8 내지 9의 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 반웅은 30 °C 이상, 예컨대 40°C 이상의 은도 조건 하에서 수행될 수 있다. 온도가 80°C 이상이 되면 기질인 과당의 갈변 현상이 일어날 수 있으므로, 상기 반응은 40 내지 80°C , 예컨대， 50 내지 75°C , 60 내지 75Ό , 또는 68 내지 75 °C의 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한 상기 반웅 시간이 길수톡 사이코스 전환를이 높아진다. 예컨대, 상기 반응 시간은 1시간 이상， 예컨대 2시간 이상, 3시간 이상， 4시간 이상, 5시간 이상 또는 6시간 이상으로 하는 것이 좋다. 반웅시간이 48 시간을 넘어가면 사이코스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로, 반웅시간은 48 시간올 넘기지 않는 것이 좋다. 따라서 상기 반웅 시간은 1 내지 48시간， 2 내지 48시간， 3 내지 48시간, 4 내지 48시간, 5 내지 48시간, 또는 6 내지 48시간으로 할 수 있으며, 산업적 및 경제적 측면을 고려하여, 1 내지 48시간, 2 내지 36 시간, 3 내지 24 시간, 3 내지 12시간ᅵ 또는 3 내지 6시간 정도로 할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조건은 과당에서 사이코스로의 전환 효율이 최대화되는 조건으로서 선정된 것이다.
또한， 상기 사이코스 생산 방법에 있어서， 사용되는 균주의 균체 농도는 전체 반응물 기준으로 5 mg(dcw: 건조세포중량 )/ml 이상, 예컨대， 5 내지 100mg(dcw)/ml, 10 내지 90mg(dcw)/ml, 20 내지 80mg(dcw)/ml, 30 내지 70 mg(dcw)/ml, 40 내지 60 mg(dcw)/ml, 또는 45 내지 55 mg(dcw)/ml일 수 있다. 균체 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 사이코스 전환 활성이 낮거나 거의 없고, 상기 범위를 초과하면 균체가 너무 많아져서 사이코스 전환 반웅의 전체적인 효율이 낮아지므로， 균체 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다.
상기 과당을 사이코스로 전환시키는 효소 (예컨대, 에피머레이즈)는 금속 이온에 의하여 활성화가 조절될 수 있으므로， 상기 사이코스 생산에 있어서， 금속 이온을 첨가하면 과당에서 사이코스로의 전환 효율, 즉 사이코스 생산률이 증가될 수 있다.
따라서, 상기 코리네박테리움속 균주를 포함하는 사이코스 생산용 조성물은 금속 이온을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 코리네박테리움속 균주를 이용한 사이코스 생산 방법은 금속 이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서， 상기 금속 이온은 상기 배양 단계의 배양 배지에 첨가되거나, 상기 배양 단계가 상기 금속 이온이 첨가된 배양 배지에서 수행되는 것일 수 있다. 다른 구현예에서， 상기 금속 이온은 과당에 첨가되거나, 상기 코리네박테리움속 균주와 과당과의 흔합물에 첨가될 수 있다. 또 다른 구현예에서 , 상기 코리네박테리움속 균주가 고정화된 담체에 첨가되거나 (과당 첨가 전), 상기 코리네박테리움속 균주가 고정화된 담체와 과당과의 흔합물에 첨가되거나 (과당 첨가 후), 또는 과당 첨가시에 과당과 흔합물의 형태로 또는 각각 첨가될 수 있다.
상기 금속 이온은 구리 이온, 망간 이온， 칼슘 이온, 마그네슘 이은, 아연 이온， 니켈 이은， 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대， 상기 금속 이온은 망간 이온, 마그네슘 이온, 니켈 이온, 코발트 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 일 예에서 상기 금속 이온은 망간 이온， 코발트 이온, 또는 이들의 흔합물일 수 있다. 사이코스 생산 수율 증진 효과를 고려하여， 상기 금속 이온의 첨가량은 o.5mM 이상으로 할 수 있다. 한편， 상기 금속 이온의 첨가량이 5mM을 초과하면 그 초과량에 비하여 효과가 미미하기 때문에， 상기 금속 이온의 첨가량은 5mM 이하로 할 수 있다. 예컨대, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.5mM 내지 5mM, 예컨대 , 0.5 mM 내지 2mM 범위로 할 수 있다. 상기 담체는 고정된 균주， 또는 상기 균주로부터 생산되는 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성할 수 있는 것으로, 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 공지된 모든 담체일 수 있다. 예컨대, 상기 담체로서 알긴산나트륨 (soduim alginate)을 사용할 수 있다. 알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누로닉산 (β-D- mannuronic acid)과 글루로닉산 (α-L-gluronic acid)이 조성되어 있고, 함량면에서는 무작위로 베타 -1 ,4 결합을 이루어 형성되어, 균주 또는 효소가 안정적으로 고정되어 우수한 사이코스 수율을 나타내는 데 유리할 수 있다. 일 구체예에서, 사이코스의 수율을 보다 증진시키기 위하여 1.5 내지 4.0%(w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액 (예컨대, 알긴산나트륨 수용액), 예컨대 약 2.5%의 (w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액을 균주의 고정화에 사용할 수 있다. 예컨대, 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양액, 또는 상기 균주의 파쇄물의 1 내지 2 부피배의 알긴산나트륨 수용액에 상기 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양물, 또는 상기 균주의 파쇄물을 첨가하여 흔합한 후, 상기 얻어진 흔합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 약 0.2M 칼슘 이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 함으로써， 알긴산나트륨 담체에 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양물， 또는 상기 균주의 파쇄물이 고정화시킬 수 있다. 상기 효소는 상기 균주, 균주 배양물 또는 상기 균주의 파쇄물로부터 통상의 방법, 예컨대 투석， 침전, 흡착, 전기영동, 친화 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 등의 방법에 의하여 정제된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 효소 단백질 등을 과당과 반웅시키는 단계는 상기 효소 단백질을 과당과 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 효소 단백질 등을 과당과 접촉시키는 단계는 예컨대, 상기 효소 단백질 등을 과당과 흔합하는 단계 또는 상기 효소 단백질 등이 고정화된 담 체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 또 다른 예에서 상기 효소 단백질 등을 과당과 반웅시키는 단계는 상기 재조합 균주의 균체를 과당 -함유 원료화 접촉하여 적정온도에서 반웅을 시켜 수행할 수 있다. 이와 같이 상기 효소 단백질 '등을 과당과 반응시킴으로써 과당을 사이코스로 전환하여 과당으로부터 사이코스를 생산할 수 있다.
상기 효율적인 사이코스 생산을 위하여 , 사용되는 효소 단백질의 양은 전체 반응물 기준으로 0.001 mg/ml 내지 1.0mg/ml, 0.005mg/ml 내지 1 .0mg/ml, 0.01 mg/ml 내지 1.0mg/ml, 0.01 mg/ml 내지 0.1 mg/ml, 또는 0.05mg/ml 내지 0.1 mg/ml일 수 있다. 효소의 사용량이 상기 농도보다 낮으면 사이코스 전환 효율이 낮아 질 수 있고, 상기 농도보다 높으면 산업에서의 경제성이 낮아지므로 상기 범위가 적당하다.
상기 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반웅물 기준으로 40 내지 75%(w/v), 예컨대, 50 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완층용액 또는 물 (예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.
상기 효소 단백질의 최적 조건올 고려할하여 반응 pH, 반웅온도 및 효소의 농도 등을 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 예컨대, 상기 반응 pH는 pH 6 내지 9, 반응온도는 온도가 80 °C을 넘으면 기질인 과당의 갈변 현상이 일어날 수 있으므로, 30 °C 이상, 예컨대 40°C 이상의 온도 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한, 효소 농도에 따라서 달라지지만, 대체적으로 반웅시간이 길수록 사이코스 전환률이 높아진다. 예컨대, 효소의 열안정성 (예컨대, 50°C에서의 열안정성)을 고려하여, 상기 반응 시간은 1시간 이상으로 하는 것이 좋다. 반응시간이 8 시간을 넘어가면 사이코스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로, 반웅시간은 8시간을 넘기지 않는 것이 좋다.
또한， 상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 재조합 균주를 사용하는 경우, 사용되는 균주의 균체 농도는 전체 반웅물을 기준으로 0.1 mg(dcw: 건조세포중량 )/ml 이상일 수 있다.
다른 일 구현 예에 있어서, 상기 사이코스의 생산 방법은 사이코스 에피머화효소를 발현하는 재조합 균주 또는 상기 재조합 균주로부터 분리된 효소 단백질을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 사이코스 생산 방법은 상기 반웅 단계 이전에 사이코스 에피머화효소를 발현하는 재조합 .균주를 배양 및 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 의하여 과당으로부터 수득된 사이코스는 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있으며, 이러한 결정은 당업자에게 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 이루어질 수 있다,
【발명의 -효과】
본 발명은 과당으로부터 사이코스를 대량 제조하여 식품소재로 사용할 수 있도록 GRAS 균주인 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 유전자 발현 시스템, 이를 포함하는 재조합 백터 및 코리네박테리움속 균주를 제공하며, 상기 유전자 발현 시스템를 이용하여 생산된 사이코스 에피머화 효소를 이용하여 과당 -함유 원료를 이용하여 사이코스를 생산할 수 있다.
.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 D-사이코스 3-에피머화 효소 단백질을 corynebacterium glutamicum에서 발현하기 위한 재조합 백터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따라 Bead beater를 이용하여 배양한 corynebacterium 세포를 용해시킨 후 SDS-PAGE를 통해 단백질의 발현량을 비교한 사진이다 . 도 3 내지 도 5는 본 발명의 일실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소 단백질을 corynebacterium g hit ami cum쒜 ^ 발현하기 위한 재조합 백터의 개열 지도로서 , 도 3은 재조합 백터 (pCES_taclCDPE) , 도 4는 재조합 백터 (PCES_tac2CDPE) , 도 5는 재조합 백터 (pCES_trcCDPE)를 각각 나타낸 것이다. 도 6은 일 실시예의 Bead beater를 이용하여 배양한 세포를 용해시킨 후 SDS-PAGE를 통해 단백질의 발현량을 비교한 사진이다. 도 7은 일 실시예의 사이코스 전환율이 직선인 구간에서 세포 초기반웅 속도 계산하여 비교한 그래프이다. 도 8은 일 실시예의 CDPE를 발현시킨 세포의 세포 반웅 진행 시 50°C에 서의 열 안정성을 비교한 그래프이다. '【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 l . sod 플라스미드의 제조
실시예 1 -1 : sod 프로모터를 이용한 백터제조
클로스트리디움 산댄스 (C!ostricfiuim scindens ATCC 35704)로부터 유래된 사이코스 에피머화 효소의 암호화 유전자 (DPE gene; Gene bank: EDS0641 1 .1 )를, 대장균에 최적화하여 변형한 형태의 폴리뉴클리오티드로 합성하고 CDPE라 명명하였다. 대장균에 최적화된 폴리뉴클리오티드 (서열번호 36), 코리네박테리움의 gDNA에서 확보한 sod 조절서열 (서열번호 17: sod promoter-RBS-SPACER R1 TT-니 NKER), 및 pET21 a 백터로부터 확보한 T7 터미네이터를 포함한 서열을 PCR올 통해 각각의 주형으로 확보하였고, 이를 오버랩 PCR 법으로 하나의 주형으로 연결하여， T-vector cloning을 통해 pGEM T-easy vector에 클로닝하여 폴리뉴클레오티드의 서열을 확인하였으며， 구체적으로 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 17의 sod 조절서열, 서열번호 36의 E.coli에 최적화 서열인 CDPE 서열, 및 T7-터미네이터를 포함한다.
상기 확인된 전체 폴리뉴클레오티드를 제한효소 Notl과 Xbal(NEB)을 사용하여 발현백터인 pCES208(vJ. Microbiol. Biotechnol., 18:639-647, 2008)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 백터 pCES208/사이코스 에피머화 효소 (pCES_sodCDPE)를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 백터 (pCES_sodCDPE)의 개열지도를 도 1에 개시하였다. 실시예 1-2: Saturation mutaqenesis를 이용한 백터제조
Saturation mutagenesis을 이용한 백터 제조를 진행하기 위해서 target site를 -NN-으로 한 프라이머를 제작하였다. 구체적으로, Target site는 클로닝할 때 추가로 첨가한 제 2 RBS와 sod promoter에 앞쪽에 위치한 제 1 RBS(GAAGGA)의 3'쪽 뒷부분에 위치하는 TT로 정하였고, 이 부분을 -NN-으로 한 프라이머를 제작하였다 (제노텍 의뢰). 프라이머의 서열 및 saturation mutagenesis site, primer binding site는 하기 표 5에 나타내었다 .
【표 5】
Figure imgf000029_0001
상기 프라이머로 -NN-을 기점으로 앞부분과 뒷부분 fragment를 PCR을 통해 확보한 후， 오버랩 (overlap) PCR을 통해 하나의 주형 (template)으로 제작하고, 그 다음 pCES208 플라스미드에 Xbal, Notl site로 ligation하여 Saturation mutagenesis된 플라스미드를 제작하였다. 실시예 2. 대장균의 형질전환 및 스크리닝
실시예 2-1 : 대장균의 형질전환
실시예 1에서 제작한 플라스미드를 전기천공법 (electroporation)을 사용하여 E.c()li DH10b strain을 형질전환시켰다. 이 후 E.cc)li cell에서 전체 돌연변이를 대상으로 스크리닝을 진행하였다. 구체적으로, 1.5ml 튜브에 kanamydn을 최종농도 15//g/ml로 넣은 1 ml LB(tryptone 10mg/L, NaCI 10mg/L, yeast extract 5mg/L)를 분주한 후 플레이트에서 무작위로 선별한 콜로니를 접종하고, 37°C에서 약 16시간 동안 배양하였다. 그 다음 cell harvest를 통해 배지를 제거하고 50mM PIPES 버퍼 (pH 7.0)에 녹인 50% 과당 (기질), 1 mM Mn2+를 첨가하여 60°C에서 30분간 전환반응 후， 100°C에서 5분간 끊여서 반웅 중지시켰다. 실시예 2-2: 사이코스 전환율을 이용한 스크리닝
그 다음 LC분석을 통해 pCES_sodCDPE와의 사이코스 전환율을 비교하여 전환율이 더 높은 돌연변이들만 선정하였다. 구체적으로， 기질 (과당)과 생산물질 (사이코스)의 피크 확인 및 피크의 에어리어 (area)를 통한 정량분석하는 방법으로 진행하였다.
LC 분석 후 피크의 에어리어를 비교함으로써 사이코스 생산량과 기질의 감소되는 정도를 확인할 수 있었는데, 이러한 계산을 위해서 과당 농도별 샘플 (10, 20, 50, 100, 120, 150mM)과 사이코스의 농도별 샘플 (1， 2, 5, 10, 20,
50mM)을 준비하여 R제곱값이 0.99 이상이 되도록 standard curve를 각각 그렸고, 그에 따른 수식을 도출하여 피크의 에어리어에 따른 과당 및 사이코스의 농도를 계산하였다. .
최종 결과값은 사이코스 전환율로 나타내어 서로 비교하였으며, 사이코스 전환율과 CDPE의 발현량은 서로 비례하므로 사이코스 생산량이 많을수록 CDPE의 발현량이 증가하였다는 것을 의미한다.
그 결과, R1 site 3종, R2 site에서 3종, 총 6가지의 돌연변이를 선정하였다. 각각의 돌연변이를 R1-1 , R1-4, R1-8, R2-1 , R2-5, 및 R2-1 1로 명명하였다. 이후 재확인을 위해 다시 한번 LC분석을 통해 돌연변이를 일으키지 않은 대조군인 pCES_sod CDPE와의 사이코스 전환율을 비교하는 재확인 실험을 수행하여 전환율이 더 높은 돌연변이들 4종만 선정하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.
【표 6]
Figure imgf000030_0001
R1 -1 8.59
R1 -4 8.94
R2-5 5.66
R2-1 1 6.07 상기 표 6에서 확인할 수 있듯이, 최종적으로 R1 site에서 R1-1 및 R1- 4의 2개， R2 site에서 R2-5 및 R2-1 1의 2개, 총 4개의 돌연변이에서 사이코스 전환율이 향상된 것을 확인할 수 있었고, 이러한 결과를 통해서 CDPE의 발현이 증가된 것이라고 예상할 수 있다. 실시예 2-3: 변이서열의 확인 .
돌연변이를 일으키지 않은 pCES— sodCDPE의 플라스미드에 포함된 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 기준으로， R1-1은 1번 및 2번째 염기각 TT에서 GA로 치환된 것이고, R1 -4는 TT에서 GG로 치환된 것이다.
또한， 돌연변이를 일으키지 않은 pCES_sodCDPE의 플라스미드에 포함된 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 기준으로， R2-5 및 R2-1 1는 1번째 및 2번째 염기가 TT에서 GG로 치환된 것이다. 실시예 3. Co/vnebacter/t/m에서의 CDPE 발현율 측정
실시예 2에서 선정한 4가지 돌연변이들로 coAynejbacter/um에 형질전환 진행 후， 100ml LB에 배양하여 세포를 확보하고, 세포를 용해시킨 후 His-tag 정제를 진행하여 SDS-PAGE상에서 CDPE의 발현율을 확인하였다.
구체적으로, Beadbeater를 이용하여 배양한 세포를 용해 (lysis)시킨 후 상등액만 취득하여 샘플버퍼와 1 :1로 흔합 후 100 °C에서 5분간 가열하였다. 준비한 샘플은 12% SDS-PAGE gel (조성: running gel - 3.3 ml H20, 4.0 ml 30% acrylamide, 2.5 ml 1.5M Tris buffer(pH 8.8), 100 μΐ 10% SDS, 100 ≠, 10% APS, 4 μί TEMED I stacking gel - 1.4 ml H20, 0.33 ml 30% acrylamide, 0.25 ml 1.0M Tris buffer(pH 6.8), 20 μί 10% SDS, 20 ≠ 10% APS, 2 μΐ TEMED)에 180V로 50분 가량 전기영동하여 단백질 발현을 확인하였다.
CDPE의 발현을 SDS-PAGE gel상에서 확인 후 정확한 발현량의 측정을 위해 Ni-NTA resin을 이용한 His-tag정제 진행하여, 계산식 (발현율 (%) = (Purified protein(mg) / Total soluble protein(mg)) * 100)을 이용하여 발현율 계산하여 하기 표 7에 나타내었다.
하기 표 7에서, 균주 내 전체 단백질은 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 균주 내부에 포함된 전체 단백질이고, 사이코스 에피머화 효소는 그 중 사이코스 에피머화 효소만을 정제하여 확보한 것이다. 따라서 발현율은 균주에 존재하는 전체 단백질에서 목적단백질이 어느 정도 비율로 발현되는지 계산한 값이다.
【표 7】
Figure imgf000032_0001
상기 표 7에서 확인 할 수 있듯이, 재조합 백터 (pCES_sodCDPE)의 형질전환체와 비교하였을 때, R1-1의 정제한 CDPE의 농도가 약 1.5배 높은 것을 확인할 수 있었다. 반면에， 나머지 샘플들은 낮은 발현율을 보임을 확인하였다. 실시예 4. 효소 반응을 통한 사이코스 생산
실시예 2에 따른 4가지 돌연변이들인 R1-1 , R1-4, R2-5, 및 R2-1 1로 co yneibacter/ivm에 형질전환 진행 후， 100ml LB에 배양하여 세포를 확보하고, 정제하지 않은 조효소를 이용하여, 50mM 과당을 함유하는 원원료부터 사이코스 생산량을 분석하였다.
구체적으로， 50mM 농도의 과당을 함유하는 원료에 1 mM Mn2+ 첨가한 고농도 기질 조건에, 실시예 2에서 얻어진, CDPE 발현 돌연변이 세포를 파쇄하여 단백질을 포함하고 있는 상등액을 확보한 후 전체 단백질의 농도가 0.007mg/ml이 되도록 정량하여 pH 7.0 PIPES 50mM 및 60°C 조건에서 5， 10, 15분 동안 반응을 진행한 후에 10C C에서 5분간 끓여서 반응 중지하였다.
그 다음， LC분석을 통해 사이코스 전환율을 비교하였다. 구체적으로, 액체 크로마토그래피 (LC) 분석을 기질 (과당)과 생산물질 (사이코스)의 피크 확인 및 피크의 에어리어 (area)를 통해 분석을 진행하였다. 상기 액체 크로마토그래피 분석 Aminex HPX-87C 컬럼 (BIO-RAD)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector를 이용하고 (Agilent 1260 RID), 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80 °C ,유속은 0.6ml/min로 하여 수행하였다. 그 다음, 전환율을 LC의 peak area를 통해 사이코스 생산량과 남아있는 과당의 양을 측정하여 하기의 계산식을 통해 계산하였다. 그 결과를 표 8에 나타냈다.
[계산식]
전환율 (%) = 사이코스 생산량 (g/l) /(사이코스 생산량 + 남아있는 과당) (g/l) * 100
【표 8】
Figure imgf000033_0001
]상기 표 8에서 확인할 수 있듯이， sod-CDPEII과 비교하여 R1 -1의 전환율이 높은 결과를 얻을 수 있았다. 그 외에 다른 돌연변이들은 sod- CDPE와 비교하여 약간 감소된 전환율을 보임을 확인하였다. 실시예 5. 코리네박테리움의 세포 반웅을 통한 사이코스 생산
실시예 2에 따른 4가지 돌연변이들인 R1 -1 , R1 -4, R2-5 및 R2-1 1로 corynebacterium 에 형질전환 진행 후， 100ml LB에 배양하여 세포를 확보하고， 세포반응을 이용하여 고형분 함량기준으로 50 중량0 /。 과당을 함유하는 원료로부터 사이코스를 생산하여 사이코스 전환율을 비교하였다.
구체적으로, 고형분 함량기준으로 50 중량0 /。 과당을 함유하는 원료에
1 mM Mn2+ 첨가한 고농도 기질 조건에, 실시예 2에서 얻어진 CDPE 발현 세포를 0.5 내지 2mg/ml의 농도로 pH 7.0 PIPES 50mM 및 60°C 조건에서 반웅을 진행한 후에 100 °C에서 5분간 끓여서 반응 중지하였다. 각각의 세포를 이용하여 상기 조건에서 세포 반웅을 진행하고, LC분석을 통해 사이코스 전환율을 비교하였다. 구체적으로， 액체 크로마토그래피 (LC) 분석을 기질 (과당)과 생산물질 (사이코스)의 피크 확인 및 피크의 에어리어 (area)를 통해 분석을 진행하였다. 상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼 (BIO-RAD)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector를 이용하고 (Agilent 1260 RID), 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80 °C , 유속은 0.6ml/min로 하여 수행하였다. 그 다음， 전환율을 LC의 peak area를 통해 사이코스 생산량과 남아있는 과당의 양을 측정하여 하기의 계산식을 통해 계산하였다. 그 결과를 표 9에 나타냈다.
[계산식]
전환율 (%) = 사이코스 생산량 (g/l) /(사이코스 생산량 + 남아있는 과당)
(g/i) * i oo
【표 9】
Figure imgf000034_0001
상기 표 9에 나타난 것과 같이， sod-CDPEN과 비교하여 R1 -1의 전환율이 높은 결과를 얻을 수 있었다. 그 외에 다른 돌연변이들은 sod- CDPE와 비교하여 약간 감소된 전환율을 보임을 확인하였다. 실시예 6: 코리네박테리움의 세포반응 열안정성 비교
사이코스 에피머화 효소를 고발현율로 생산하는 균주도 중요하지만， 안정적으로 생산하는 균주가 산업적으로 유용하므로, 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 균주 자체의 열안정성을 확인하고자 본 실험을 수행하였다. 세포 반웅 진행 시 50 °C에서의 열안정성 확인하기 위하여, 유화제 전처리 과정까지 완료한 세포 1 .0mg/ml를 50mM PIPES buffer(pH 7.0)에 재현탁 시킨 후， 50 °C의 물에 중탕하여 열을 가하였다. 이 후 시간별로 세포을 sampling하여 기질로 50% fructose 사용하고 Mn2+를 1 mM 첨가한 상태에서 50 °C에서 60분동안 전환반웅을 실시하였다. 시간별로 샘플링한 세포에 대한 사이코스 전환율 및 각 세포의 활성 감소 정도를， 각 샘플에 대한 데이터를 전환율과 0분을 기준으로 하였을 때 활성의 감소 정도를 계산한 값을 표 10에 나타내었다.
【표 10]
Figure imgf000035_0001
상기 표 10에서 볼 수 있듯이, 기존의 pCES_sodCDPE와 R1-1의 열안정성을 비교한 결과, 큰 차이 없는 것으로 확인되어 R1 -1 역시 열안정성이 매우 우수함을 확인하였다. R1-1의 반감기는 약 1800분 정도로 예상된다. 실시예 7: 변이 조절서열의 제조 및 CDPE 발현
실시예 7-1 : 변이 조절 서열을 포함하는 백터 제조
Target site를 클로닝할 때 추가로 첨가한 게 2 RBS와 sod promoter에 앞쪽에 위치한 게 1 RBS(GAAGGA)의 3'-쪽 뒷부분에 위치하는 TT로 정하고, 이 부분을 각각 GT, GC, 또는 GG로 한 프라이머를 제작하였다 (제노텍 의뢰). 프로모터의 서열은 하기 표 1 1에 나타내었다.
【표 1 1 ]
Primer 서열목록 (5'->3') 서열번호
RBS1 GT_F GGTGCGGAAACCTACGAAAGGAGTTTTTACCCATGGCTGTA 49
TACGAAC BS1 GT_R GTTCGTATACAGCCATGGGTAAAAACTCCTTTCGTAGGTTTC 50
CGCACC
RBS1 GC_F GGTGCGGAAACCTACGAAAGGAGCTTTTACCCATGGCTGTA 51
TACGAAC
RBS1 GC_R GTTCGTATACAGCCATGGGTAAAAGCTCCTTTCGTAGGTTTC 52
CGCACC RBS1 GG_F GGTGCGGAAACCTACGAAAGGAGGTTTTACCCATGGCTGTA 53
TACGAAC
RBS1 GG_R GTTCGTATACAGCCATGGGTAAAACCTCCTTTCGTAGGTTTC 54
CGCACC 상기 프라이머로 -NN-을 기점으로 앞부분과 뒷부분 fragment를 PCR을 통해 확보한 후, 오버랩 (overlap) PCR을 통해 하나의 주형 (template)으로 제작하고, 그 다음 pCES208 플라스미드에 Xbal, Notl site로 ligation하여 Saturation mutagenesis된 플라스미드를 제작하였다. 실시예 7-2: CDPE 발현율 측정
상기 변이 조절서열을 포함하는 플라스미드로 co ^ebacte V m에 형질전환 진행 후， 100ml LB에 배양하여 세포를 확보하고， 세포를 용해시킨 후 Ni-NTA resin으로 His-tag 정제를 진행하여, 총 단백질의 농도와 정제 단백질 (CDPE)의 농도를 Bradford assay법으로 측정한 후 목적단백질의 발현율 계산하였다. 구체적으로, Beadbeater를 이용하여 배양한 세포를 용해 (lysis)시킨 후 상둥액만 취득하여 샘플버퍼와 1 :1로 흔합 후 100°C에서 5분간 가열하였다. 준비한 샘플은 12% SDS-PAGE gel (조성 : running gel - 3.3 ml H20, 4.0 ml 30% acrylamide, 2.5 ml 1 .5M Tris buffer(pH 8.8), 100 ≠ 10% SDS, 100 ! , 10% APS, 4 id TEMED I stacking gel - 1 .4 ml H20, 0.33 ml 30% acrylamide, 0.25 ml 1.0M Tris buffer(pH 6.8), 20 fd 10% SDS, 20 fd 10% APS, 2 ≠ TEMED)에 180V로 50분 가량 전기영동하였다. 도 2은 본 발명의 일 실시예에 따라 Bead beater를 이용하여 배양한 corynebacterium 세포를 용해시킨 후 SDS-PAGE를 통해 단백질의 발현량을 비교한 사진이다.
그 다음 정확한 발현량의 측정을 위해 Ni-NTA resin을 이용한 His- tag정제 진행하여, 계산식 (발현율 (%) = (Purified protein(mg) I Total soluble protein(mg)) * 100)을 이용하여 발현율 계산하여 하기 표 12에 나타내었다.
【표 12】
균주내 전체 사이코스 발현율 (%)
단백질 (mg) 에피머화효소 (mg)
pCES sodCII 10.7 1.1 10.3
RI GA 1 1.5 1.7 14.8
R1 GT 10.9 1.6 14.7
R1 GC 8.2 0.8 9.8 R1 GG 10.8 0.7 6.5 상기 표 12에서 확인 할 수 있듯이, pCES_sodCDPE와 비교하였을 때, CDPE의 발현율에 따라 one point mutation 균주 중에서는 RI GA, R1 GT가 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었고， R1 GC는 거의 비슷한 활성을 가지며， R1 GG는 활성이 감소하였음을 확인할 수 있었다. 실시예 7-3: 세포반응을 이용한 사이코스 생산
실시예 4와 실질적으로 동일한 방법으로, corynebacterium 에 형질전환 진행 후, 100ml LB에 배양하여 세포를 확보하고, 세포반웅을 진행하여 사이코스 전환율을 비교하였다. 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.
【표 13】
Figure imgf000037_0001
상기 표 13에 나타난 것과 같이, one point mutation 균주들은, R1 GG의 사이코스 전환율을 100으로 하였을 때, R1 GA는 213, R1 GT는 200, R1 GC는 161 , R1TT는 147로 모두 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
7-4: 세포 반응 시 열안정성 비교
사이코스 에피머화 효소를 고발현율로 생산하는 균주도 중요하지만, 안정적으로 생산하는 균주가 산업적으로 유용하므로， 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 균주 자체의 열안정성을 확인하고자 본 실험을 수행하였다. 세포 반응 진행 시 50 °C에서의 열안정성 확인하기 위하여, 유화제 전처리 과정까지 완료한 세포 1 .0mg/ml를 50mM PIPES buffer(pH 7.0)에 재현탁 시킨 후, 50 °C의 물에 중탕하여 열을 가하였다. 이 후 시간별로 세포을 sampling하여 기질로 50% fructose 사용하고 Mn2+를 1 mM 첨가한 상태에서 50 °C에서 60분동안 전환반웅을 실시하였다.
각 세포의 활성 감소 정도를, 각 샘플에 대한 데이터를 전환율과 0분을 활성의 감소 정도를 계산한 값으로 측정하여 표 14에
【표 14】
Figure imgf000038_0001
실시예 8: 변이 조절서열의 제조 및 CDPE 발현
8-1 : 변이 조절 서열을 포함하는 백터 제조
제 1 RBS와 제 2 RBS의 site를 지정하여 Saturation mutagenesis 실험을 진행한 결과 제 1 RBS의 TT가 CDPE의 발현에 영향을 미치는 site라는 것을 확인하였고, 이를 토대로 제 1 RBS의 TT가 GT, GC, 또는 GG로 돌연변이, 및 기능이 향상된 돌연변이인 R1 -1 (제 1 RBS의 TT의 GA 돌연변이)를 template로 하여 제 2 RBS의 TT를 GA, GT, GC, 또는 GG로 돌연변이시켜 비교실험을 진행하였다.
주형으로는 상기 실시예 5에서 확보한 돌연변이 (R1-1)를 사용하였고， 아래의 primer를 이용하여 각각의 double mutant를 포함하는 플라스미드를 제작하였다. 프로모터의 서열은 하기 표 15에 나타내었다.
【표 15】
Primer 서열목록 (5'->3') 서열
번호
RBS1 GA/RBS2GA_F GACTACGCATACGACGAAAGGAGAACAAAATGAA 55
ACACGGTATCTACTAC
RBS1 GA/RBS2GA_R GTAGTAGATACCGTGTTTCATTTTGTTCTCCTTTC 56
GTCGTATGCGTAGTC
RBS1 GA RBS2GT_F GACTACGCATACGACGAAAGGAGTACAAAATGAA 57
ACACGGTATCTACTAC
RBS1 GA/RBS2GT_R GTAGTAGATACCGTGTTTCATTTTGTACTCCTTTC 58
GTCGTATGCGTAGTC
RBS1 GA/RBS2GC_F GACTACGCATACGACGAAAGGAGCACAAAATGAA 59
ACACGGTATCTACTAC
RBS1 GA/RBS2GC_R GTAGTAGATACCGTGTTTCATTTTGTGCTCCTTTC 60
GTCGTATGCGTAGTC
RBS1 GA/RBS2GG F GACTACGCATACGACGAAAGGAGGACAAAATGAA 61 ACACGGTATCTACTAC
RBS1 GA/RBS2GG_R GTAGTAGATACCGTGTTTCATTTTGTCCTCCTTTC 62
GTCGTATGCGTAGTC
8-2: CDPE 발현율 측정
실시예 7-2와 실질적으로 동일한 방법으로, 상기 변이 조절서열을 포함하는 플라스미드로 co ynebacter/wm에 형질전환하고, CDPE 발현율을 측정하였으며 그 결과를 하기 표 13에 나타냈다.
하기 표 16에세 균주 내 전체 단백질은 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 균주 내부에 포함된 전체 단백질이고, 사이코스 에피머화 효소는 그 중 사이코스 에피머화 효소만을 정제하여 확보한 것이다. 따라서 발현율은 균주에 존재하는 전체 단백질에서 목적단백질이 어느 정도 비을로 발현되는지 계산한 값이다.
【표 16]
Figure imgf000039_0001
상기 표 16에서 확인 할 수 있듯이， Double mutation 균주들은 pCES_sodCDPE와 CDPE의 발현율을 비교하였을 때, R1 GA/R2GA, R1 GA/R2GT, R1 GA/R2GC, R1 GA/R2GG 모두 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
8-3: 세포 반응을 통한 사이코스 생산
실시예 8-2에 따른 double mutant를 corynebacterium 에 형질전환 진행 후, 100ml LB에 배양하여 세포를 확보하고, 세포반웅을 진행하여 사이코스 전환율을 비교하였다. 다음의 표 13에 나타내었다.
상기 얻어진 생산물을 확인하고자, 액체 크로마토그래피 (LC) 분석을 기질 (과당)과 생산물질 (사이코스)의 피크 확인 및 피크의 에어리어 (area)를 통한 정량분석 진행하였다. 그 결과 다양한 유화제 용액에 대한 세포의 사이코스 생산에 관한 초기반응속도 (Unit/g-DCW)를 하기 표 17에 나타냈다. 상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼 (BIO-RAD)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector를 이용하여 (Agilent 1260 RID) 수행하였다. 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80°C , 유속은 0.6ml/min로 하였다.
【표 17]
Figure imgf000040_0001
상기 표 17에 나타난 것과 같이, R1 GG의 사이코스 전환율을 100으로 하였을 때， Double mutation 균주인 R1 GA/R2GC는 217로 활성이 증가함을 확인할 수 있었다.
8-4: 세포 반응 시 열안정성 비교
사이코스 에피머화 효소를 고발현율로 생산하는 균주도 중요하지만， 안정적으로 생산하는 균주가 산업적으로 유용하므로， 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 균주 자체의 열안정성을 확인하고자 본 실험을 수행하였다. 세포 반웅 진행 시 5(rc에서의 열안정성 확인하기 위하여, 유화제 전처리 과정까지 완료한 세포 1.0mg/ml를 50mM PIPES buffer(pH 7.0)에 재현탁 시킨 후, 5(rc의 물에 중탕하여 열을 가하였다. 이 후 시간별로 세포을 sampling하여 ^질로 50% fructose 사용하고 Mn2+를 1 mM 첨가한 상태에서 50 °C에서 60분동안 전환반응을 '실시하였다.
각 세포의 활성 감소 정도를， 각 샘플에 대한 데이터를 전환율과 0분을 기준으로 하였을 때 활성의 감소 정도를 계산한 값으로 측정하여 표 18에 나타내었다.
【표 18]
pCES一 sodCII R1 GA/R2GA R1 GA/R2GT R1 GA/R2GC R1 GA/R2GG
0분 100 100 100 100 100
240분 86.6 86.9 90.8 90.4 88.5
360분 83.5 90 81.5 92.2 83.6
840분 77.9 80.9 68.4 77.4 82.4
1200분 73.2 77.3 64.6 73.6 72.2 1560분 70.4 74.1 62.7 70.8 75.4
1680분 67.9 70.5 59.6 67.4 71.8
1740분 62.3 66.4 56.9 61.7 63.2 상기 표 18에서 볼 수 있듯이, pCES_sodCDPE와 Double mutation 균주들 간의 열안정성을 비교한 결과, 큰 차이 없는 것으로 확인되었으며, RBS의 sequence 변화에 따라 CDPE의 발현에는 영향을 주었지만, 발현 단백질의 열안정성에는 크게 영향을 미치지 않는다는 것을 열안정성 실험을 통해 알 수 있었다. 실시예 9. 플라스미드의 제조
실시예 9-1 : sod 프로모터를 이용한 백터제조
크로스트리디움 신댄스 (Clostr idiuim scindens ATCC 35704)로부터 유래된 사이코스 에피머화 효소의 암호화 유전자 (DPE gene ; Gene bank : EDS0641L 1)를, 대장균에 최적화하여 변형한 형태의 폴리뉴클리오티드로 합성하고 CDPE라 명명하였다. 대장균에 최적화된 폴리뉴클리오티드 (서열번호 36)와 corynebacter ium gDNA와 pET21a 백터로부터 확보한 sod 프로모터 (서열번호 17)와 T7 터미네이터를 피씨알을 통해 각각의 주형으로 확보하였고， 이를 오버랩 피씨알 (PCR) 법으로 하나의 주형으로 연결하여 T- vector c loning을 통해 pGEM T-easy vector에 클로닝하여 폴리뉴클레오티드의 서열을 확인하였으며, 구체적으로 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6의 sod 프로모터, 서열번호 21의 E . col i에 최적화 서열인 CDPE 서열 및 T7- 터미네이터를 포함한다.
상기 확인된 전체 폴리뉴클레오티드를 제한효소 Not l과 XbaKNEB)을 사용하여 발현백터인 pCES208(J . Mi crobiol . Biotechnol . , 18 : 639-647， 2008)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 백터 pCES208/사이코스 에피머화 효소 (pCES_sodCDPE)를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 백터 (pCES_sodCDPE)의 개열지도를 도 1에 개시하였다. 실시예 9-2 : tacl 프로모터를 이용한 백터제조
pCES_sodCDPEI I 이외 목적단백질의 발현 및 활성 비교를 위해 클로닝을 진행하기 위해 다음과 같은 플라스미드 역시 제조하였다:
pET21a_CDPE로부터 CDPE (서열번호 36)를 PCR하여 확보하고, pKK223-3 백터에 Xmal , Hindi I I로 클로닝하여 pKK_CDPE를 제조하고， pKK_CDPE를 주형으로 하여 tac 프로모터 (서열번호 69)부터 rrn 터미네이터까지 PCR 방법으로 삽입할 유전자를 확보한 후 pCES208 플라스미드에 Not l , Xbal si te로 클로닝하여 재조합 백터 (pCESᅳ taclCDPE)를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 백터 (pCES_taclCDPE)의 개열지도를 도 3에 개시하였다. 실시예 9-3 : tac2 프로모터를 이용한 백터제조
pET21a_CDPE로부터 CDPE (서열번호 36)를 PCR하여 확보하고， pKD 백터에 Ncol , Sai l으로 클로닝하여 pKILCDPE를 제조하고, pKD_CDPE를 주형으로로 하여 tac2 프로모터 (서열번호 72)부터 rrnB 터미네이터까지 PCR로 insert 확보한 후 PCES208 플라스미드에 Xbal si te로 클로닝하여 pCES_t ac DPE를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 백터 (pCESᅳ tac2CDPE)의 개열지도를 도 4에 개시하였다. 실시예 9-4 : trc 프로모터를 이용한 백터제조
pET21a_CDPE로부터 CDPE (서열번호 36)를 PCR하여 확보하고, pTrc99a 백터에 Xmal , Hindi I I로 클로닝하여 pTrc_CDPE를 제조하고， pTrc_CDPE를 주형으로 하여 trc 프로모터 (서열번호 73)부터 rrnB 터미네이터까지 PCR로 insert 확보한 후 pCES208 플라스미드에 Xbal si te로 클로닝하여 pCES— trcCDPE를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 백터 (pCESᅳ trcCDPE)의 개열지도를 도 5에 개시하였다. 실시예 10. 숙주세포 형질전환
실시예 9에서 제작한 4 종류의 플라스미드를 전기천공법 (electroporation)을 사용하여 코리네박테리움 글루타리쿰을 형질전환시켰다 . 콜로니를 pi eking하여 카나마이신 (Kanamycin)을 최종농도 15ug/ml로 첨가한 LB 배지 (트립톤 10g/L, NaCl lOg/L, 효모 추출물 5g/L) ½1에 접종한 후， 배양조건 30oC 및 250rpm에서 약 16시간 동안 배양하였다. 그리고 나서 상기 배양액 중 1ml을 수득하여 15ug/ml의 카나마이신을 포함하고 있는 100ml LB 배지에 접종하여 본 배양을 16시간 이상 진행하였다. 구체적으로， 상기 실시예 9-1의 재조합 백터 (pCES_sodCDPE)로 코리네박테리움 글루타리쿰을 형질전환하여 얻어진 재조합 균주를 대한민국 서을시 서대문구 홍제내 2가길 25에 주소를 둔 한국미생물보존센터 (Korea Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2014년 10월 29일 기탁하여 기탁번호 KCCM11593P 받았다. 실시예 11. 목적단백질 발현 확인
Beadbeater를 이용하여 배양한 세포를 용해 (lysis)시킨 후 상등액만 취득하여 샘플버퍼와 1 ： 1로 흔합 후 100 °C에서 5분간 가열한다. 준비한 샘플은 12% SDS-PAGE gel (조성 ： running gel - 3.3 ml ¾0， 4.0 ml 30% aery 1 amide, 2.5 ml 1.5M Tris buffer(pH 8.8), 100 βί 10% SDS, 100 μί, 10% APS, 4 f TEMED I stacking gel - 1.4 ml H20, 0.33 ml 30% aery 1 amide, 0.25 ml 1.0M Tris buffer(pH 6.8), 20 ≠ 10% SDS, 20 ≠ 10% APS, 2 ≠ TEMED)에 180V로 50분 가량 전기영동하여 단백질 발현을 확인한다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
CDPE의 발현을 SDS-PAGE gel상에서 확인 후 정확한 발현량의 측정을 위해 Ni -NTA res in을 이용한 Hi s-tag정제 진행하여 , 계산식 (발현율 = (Pur i f i ed protein(mg) I Total solubl e protein(mg) ) * 100)을 이용하여 발현율 계산하여 다음 표 2에 나타내었다. 상기 표 19에서， 균주내 전체 단백질은 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 코리네박테리움 균주 내부에 포함된 전체 단백질이고， 사이코스 에피머화 효소는 그 중 사이코스 에피머화 효소만을 정제하여 확보한 것이다. 따라서 발현율은 코리네박테리움 균주에 존재하는 전체 단백질에서 목적단백질이 어느 정도 비율로 발현되는지 계산한 값이다.
【표 19】
Figure imgf000044_0001
실시예 12. 세포 반응을 통한 사이코스 생산
고형분 함량기준으로 50 중량 % 과당을 함유하는 원료에 ImM Mn2+ 첨가한 고농도 기질 조건에， 실시예 2에서 얻어진 CDPE 발현 세포를 0.5 내지 2mg/ml의 농도로 pH 7.0 PIPES 50mM 및 60oC 조건에서 반웅을 진행한 후에 100 0C에서 5분간 끓여서 반응 중지하였다. 각각의 세포를 이용하여 상기 조건에서 세포 반응을 진행하고， 반웅시간 별로 샘플링한 후에 각 재조합 균주별 사이코스 생산량과 세포 초기반웅속도를 계산하였다. 사이코스 전환율이 직선인 구간에서 단위 세포당 초기반응속도를 계산 (계산식 ： 단위 세포당 초기반웅속도 = 사이코스 생산량 (g/ 1 ) I 시간 (min) I 반웅에 사용한 세포의 양 (g) )하여 다음의 표 3 및 도 7에 나타내었다.
상기 얻어진 생산물을 확인하고자， 액체 크로마토그래피 (LC) 분석을 기질 (과당)과 생산물질 (사이코스)의 피크 확인 및 피크의 에어리어 (area)를 통한 '정량분석 진행하였다. 그 결과 다양한 유화제 용액에 대한 세포의 사이코스 생산에 관한 초기반응속도 (Uni t/g-DCW)를 하기 표 3에 나타냈다. 상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼 (BI0-RAD)이 장착된 HPLC( Agi lent , USA)의 Refract ive Index Detector를 이용하여 (Agi lent 1260 RID) 수행하였다. 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80 °C , 유속은 0.6ml /min로 하였다.
최종 결과값은 초기반웅속도로 나타내어 서로 비교하였으며， 이때 초기반응속도란 일직선속도구간의 반응지점에서의 생산물질의 생산량을 반응에 사용한 세포의 양과 반응 시간으로 나누어준 값을 말한다. 즉， 초기반웅속도의 값이 클수록 같은 세포당， 시간당 생산되는 사이코스의 양이 많다는 것을 의미한다.
【표 20】
Figure imgf000045_0001
상기 표 20에 나타난 것과 같이， 발현율이 가장 좋았던 tacCDPE가 가장 높은 활성을 나타냈고， 그 다음으로 tac2 , sod , trc 순으로 나타났다. 따라서, 세포 초기반웅속도와 CDPE 발현량은 비례한다는 것을 확인할 수 있었다. 실시예 13 : 세포 반응시 열안정성 비교
사이코스 에피머화 효소를 고발현율로 생산하는 균주도 중요하지만， 안정적으로 생산하는 균주가 산업적으로 유용하므로， 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 균주 자체의 열안정성을 확인하고자 본 실험을 수행하였다. 세포 반웅 진행시 50oC에서의 열안정성 확인하기 위하여， 실시예 2에서 얻어진 CDPE를 발현시킨 재조합 균주세포를 50 0C에서 배양하여 열을 가한 후， 세포 반응 진행하였다. 각 세포의 반감기 (시간， min)를 측정하여 표 21 및 도 8에 나타내었다.
【표 21】
Figure imgf000046_0001
상기 표 21에서 볼 수 있듯이， t ac /CDPE가 가장 뛰어난 세포 활성을 보였지만 50oC에서의 열안정성을 봤을 때 sod/CDPE가 반감기가 1800분으로 가장 안정했다. 공정상에서 세포반웅올 통해 사이코스를 생산하고자 할 때 활성도 중요하지만, 적정선의 활성만 확보된다면 그 이후에는 열안정성이 경제성에 더 크게 작용하므로 sod/CDPE가 바람직하다.
특허절차상 미생물 기탁의
승인에 관한부다페스트 조약 국제용 양식
이건 문서의 아랫부분에 기재된
국제기탁기관에 의해
조약 7. 1에 따라 발행된
원기탁에 관한 접수
Figure imgf000047_0001
1 조약 6.4(d)는, 국제기탁기관의 지위를 획득한 날; 국제기탁기관의 지위를 획득한 이후에 부다페스트 조약국 이외에서 행해진 기탁을 부다페스트 조약에 의한 기탁으로 전환한 경우에는 국제기탁기관이 접수한 날로 적용한다.
FORM BP/4 단일 대체용지 (규칙 제 26조)

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및 그 상류 (upstream)에 작동 가능하도록 연결되며， 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소의 발현을 조절하는 조절서열;을 포함하며 ,
상기 조절서열은， 서열번호 1 , 63， 64 또는 65의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터를 포함하는 것인， 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 유전자 발현 카세트.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서 , 상기 조절서열은， 리보솜 결합 영역 ( r ibosome binding region , RBS) 서열， 스페이서 서열 및 링커 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 추가 서열을 포함하는 것인 유전자 발현 카세트.
【청구항 3】
제 2 항에 있어서， 상기 리보솜 결합 영역 서열은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 7 내지 20개의 염기로 이루어지는 것인 유전자 발현 카세트.
【청구항 4】
제 2 항에 있어서, 상기 조절 서열은 추가로 리보솜 결합 영역 서열을 적어도 1회 내지 5회 포함하는 것인 유전자 발현 카세트.
【청구항 5]
제 2 항에 있어서， 상기 링커 서열은 5개 내지 100개 염기로 이루어진 뉴클레오타이드 서열인, 유전자 발현 카세트.
【청구항 6】
제 2 항에 있어서, 상기 제 1 스페이서 서열은 서열번호 3 내지 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 유전자 발현 카세트.
【청구항 7]
제 2 항에 있어서， 상기 제 2 스페이서 서열은, 서열번호 7 내지 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 유전자 발현 카세트.
【청구항 8】
제 2 항에 있어서， 상기 조절서열은 프로모터， 제 1리보솜 결합 영역 (r ibosome binding regi on, RBS) 서열 및 게 1 스페이서 서열을 포함하는 것인 유전자 발현 카세트.
【청구항 9]
제 2 항에 있어서， 상기 조절서열은 프로모터， 계 1리보솜 결합 영역 (r i bosome binding regi on , RBS) 서열 및 거 U 스페이서 서열과，
저 U 스페이서의 31 -말단에 직접 또는 링커를 통해 연결되는 제 2 리보솜 결합 영역을 포함하는 것인 유전자 발현 카세트.
【청구항 10]
제 2 항에 있어서， 상기 조절서열은 제 1리보솜 결합 영역 (r ibosome binding region, RBS) 서열 및 제 1 스페이서 서열과，
제 1 스페이서의 3 ' -말단에 직접 또는 링커를 통해 연결되는 제 2 리보솜 결합 영역과 제 2 스페이서 서열을 포함하는 것인 유전자 발현 카세트.
【청구항 11】
제 8 항에 있어서， 상기 조절서열은
서열번호 1의 프로모터 뉴클레오타이드 서열，
서열번호 2의 RBS 뉴클레오타이드 서열， 및
서열번호 3 내지 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 계 1스페이서 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트. (promoter-RBSl-Spacerl : TT , GA, GT, GC-RBS)
【청구항 12】
제 11 항에 있어서， 상기 조절서열은 서열번호 13 내지 서열번호 16로 이루어진 서열에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 유전자 발현 카세트. (promoter-RBSl-Spacerl： TTᅳ GA, GT, GC)
【청구항 13】
제 9 항에 있어서， 상기 조절서열은 서열번호 13 내지 서열번호 16로 이루어진 서열에서 선택된 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 12의 링커서열을 포함하는 유전자 발현 카세트. (promoter-RBSl-Spacerl- TT, GA, GT, GC- 1 inkerl)
【청구항 14】
제 10 항에 있어서， 상기 조절서열은 서열번호 1의 프로모터 뉴클레오타이드 서열,
서열번호 2의 RBS 뉴클레오타이드 서열，
서열번호 3 내지 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 게 1스페이서 서열，
서열번호 2의 RBS 뉴클레오타이드 서열， 및
서열번호 7 내지 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 제 2스페이서 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트 . (promoter- RBSl-Spacer 1： TT , GA , GT， GC-RBS2-spacer 2-ΊΤ , GA， GT , GC , GG)
【청구항 15】
제 2 항에 있어서, 상기 조절서열은 서열번호 63， 64. 또는 65의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프로모터, 및 상기 프로모터의 3 ' -말단에 직접 또는 링커를 통해 연결되는 제 1리보솜 결합 영역 (r ibosome binding region , RBS) 서열 및 제 2 스페이서 서열을 포함하는 것인， 유전자 발현 카세트.
【청구항 16】
제 15 항에 있어서， 상기 링커 서열은 서열번호 66 , 67 또는 68의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 서열이고， 제 2 스페이서 서열은 서열번호 7 내지 11로 이루어지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열인 유전자 발현 카세트.
【청구항 17】
거 U항에 있어서， 상기 코리네박테리움속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 i Corynebacterii glut ami cum) , 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 {acetoglutamicum) , 코리네박테리움 아세토아시도필룸 cetoacidophi lum) , 코리네박테리움 써모아미노제네스 (thermoaminogenes), 코리네박테리움 멜라쎄콜라 melassecola) 및 코리네박테리움 에피시엔스 efficient — 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 유전자 발현 카세트.
【청구항 18]
제 1항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소는 클로스트리디움 신댄스 (C7os r/o i scidens) , 트로포네마 프리미샤 (7 ¾σο72«773 primitia), 엔시퍼 아드해렌스 ( //er adhaerens) 또는 루미노코코스 토르크 {Ruminococcus or wes)에서 유래된 것인， 유전자 발현 카세트.
【청구항 19】
제 18 항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 33 내지 서열번호 36의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것인， 유전자 발현 카세트.
【청구항 20】
제 19항에 있어서， 상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 37의 내지 서열번호 44의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열인 것인, 유전자 발현 카세트.
【청구항 21]
.제 1항에 따른 발현 카세트를 포함하는 백터
【청구항 22]
목적 폴리뉴클레오타이드 서열의 상류에 위치하여 상기 목적 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하는 조절서열올 포함하며，
상기 조절 서열은 서열번호 1, 63， 64 또는 65의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터， 게 1리보솜 결합 영역 (ribosome binding region, RBS) 서열 및 제 1 스페이서 서열을 포함하는 것인 백터.
【청구항 23]
제 22 항에 있어서， 상기 리보솜 결합 영역 서열은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 7 내지 20개의 염기로 이루어지며， 리보솜 결합 영역 서열을 적어도 1회 내지 5회 포함하는 것인 백터.
【청구항 24]
제 22 항에 있어서， 상기 조절서열은 프로모터， 제 1리보솜 결합 영역 (ribosome binding region, RBS) 서열 및 제 1 스페이서 서열과， 제 1 스페이서의 3'-말단에 직접 또는 링커를 통해 연결되는 제 2 리보솜 결합 영역을 포함하는 것인 백터.
【청구항 25】
제 22 항에 있어서, 상기 조절서열은 제 1리보솜 결합 영역 (ribosome binding region, RBS) 서열 및 제 1 스페이서 서열과，
제 1 스페이서의 3'-말단에 직접 또는 링커를 통해 연결되는 제 2 리보솜 결합 영역과 제 2 스페이서 서열을 포함하는 것인 백터.
【청구항 26】 제 22항 내지 24항중 어느 한 항에 있어서， 상기 게 1스페이서 서열은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열중 첫번째 및 두번째 염기가 GA , GT 또는 GC 로 치환된 염기를 포함하는 것인 백터.
【청구항 27】
제 25 항에 있어서， 상기 제 1스페이서 서열은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열중 첫번째 및 두번째 염기가 TT이고， 게 2 스페이서 서열은 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열중 첫번째 및 두번째 염기가 GA , GT , GC 또는 GG로 치환된 염기를 포함하는 것인 백터.
【청구항 28】
제 25 항에 있어서， 상기 게 1스페이서 서열은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열중 첫번째 및 두번째 염기가 GA , GT 및 GC로 이루어지는 군에서 선택되는 염기로 치환되고， 계 2 스페이서 서열은 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열중 첫번째 및 두번째 염기가 TT , GA , GT , GC 및 GG로 이루어지는 군에서 선택되는 염기로 치환된 것인 백터.
【청구항 29】
제 26 항에 있어서, 상기 조절서열은 서열번호 14 , 15 또는 16의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것인 백터.
【청구항 30]
제 28 항에 있어서， 상기 조절서열은 서열번호 18 내지 32로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 백터.
【청구항 31 ]
제 24항 또는 제 25항에 있어서, 상기 링커 서열은 5개 내지 100개 염기로 이루어진 뉴클레오타이드 서열인 유전자 발현 카세트.
【청구항 32】
제 22 항에 있어서， 상기 백터는 복제 기점, 리더 ( l eader ) , 선택 가능한 마커， 클로닝 부위 및 제한효소 인식부위로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 추가로 포함하는 것인， 백터.
【청구항 33】
제 1항에 따른 유전자 발현 카세트 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 백터로 형질전환된 것인 재조합 코리네박테리움속 숙주세포.
【청구항 34】
제 33 항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 숙주세포는 코리네박테리움 글투타미쿰 iglutamicum) , 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 i acetoglutamicum) , 코리네박테리움 아세토아시도필룸 i acetoacidophi lum) , 코리네박테리움 써모아미노제네스 thennoaininogenes) , 코리네박테리움 멜라쎄콜라 nelassecola) 및 코리네박테리움 에피시엔스 efficiens) — 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 재조합 코리네박테리움속 숙주세포.
【청구항 35]
제 1항에 따른 유전자 발현 카세트 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 백터로 형질전환된 것인 재조합 코리네박테리움속 숙주세포를 이용하여 얻어진 사이코스 에피머화 효소， 상기 세포의 균체， 상기 세포의 배양물， 상기 세포의 파쇄물， 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 사이코스 생산용 조성물.
【청구항 36】
제 1항에 따른 유전자 발현 카세트를 포함하는 백터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움속 숙주세포를 배양하고，
상기 세포의 배양물에서 얻어진 사이코스 에피머화 효소， 상기 세포의 균체， 상기 세포의 배양물, 상기 세포의 파쇄물， 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 과당 -함유 원료와 반웅하여 사이코스를 생산하는 방법 .
【청구항 37】
제 36 항에 있어서， 상기 사이코스 에피머화 효소 또는 상기 세포의 균체가 고정화된 담체에， 과당 -함유 원료를 접촉시켜 사이코스를 생산하는 것인, 방법.
【청구항 38】
제 36 항에 있어서， 상기 방법은 구리， 망간， 칼슘， 마그네슘， 아연， 니켈, 코발트， 철 및 알루미늄으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것인， 사이코스를 생산하는 방법.
【청구항 39]
제 36 항에 있어서， 상기 과당 -함유 원료는 과당을 40 내지 75%(w/w)의 농도로 포함하는 것인， 사이코스를 생산하는 방법. 【청구항 40]
제 36 항에 있어서, 상기 방법은 pH 6 내지 9 및 40 내지 80 °C의 조건 하에서 수행되는 것인， 사이코스를 생산하는 방법.
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