WO2020230718A1 - ３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法 - Google Patents

３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法 Download PDF

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河村　健司
山田　勝成
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Definitions

  • the present invention relates to a gene-modified microorganism in which a nucleic acid encoding a polypeptide involved in the production of a target substance is introduced or whose expression of the polypeptide is enhanced, and a method for producing a substance using the microorganism.
  • 3-Hydroxyadipic acid (IUPAC name: 3-hydroxyhexanedioic acid), ⁇ -hydromuconic acid (IUPAC name: (E) -hex-2-enedioic acid) and adipic acid (IUPAC name: hexanedioic acid) are dicarboxylic acids having 6 carbon atoms. It is an acid. These can be used as polyesters by polymerizing with polyhydric alcohols and as raw materials for polyamides by polymerizing with polyvalent amines. Further, by adding ammonia to these terminals to form lactam, it can be used alone as a raw material for polyamide.
  • Patent Document 1 describes a method for producing 1,3-butadiene using a microorganism having a modified metabolic pathway.
  • 1,3-butadiene is biosynthesized from acetyl-CoA and succinyl-CoA.
  • 3-Hydroxyadipic acid (3-hydroxyadipate) has been described as a metabolic intermediate in the metabolic pathways involved.
  • Patent Document 2 describes a method for producing muconic acid using a microorganism having a modified metabolic pathway.
  • trans and trans-muconic acid are biosynthesized from acetyl-CoA and succinyl-CoA.
  • ⁇ -hydromuconic acid (2,3-dehydroadipate) has been described as a metabolic intermediate in the metabolic pathway.
  • Patent Documents 3 and 4 describe methods for producing adipic acid and hexamethylenediamine (HMDA) using non-natural microorganisms, in which these substances are acetyl-CoA and succinyl-CoA. Although the reaction for synthesizing 3-oxoadipyl-CoA is included in the biosynthetic pathway, it is described that the biosynthetic pathways after 3-oxoadipyl-CoA are different. Further, in Patent Document 3, pyruvate kinase is described as an additional gene deletion of a metabolic pathway for improving the formation of HMDA coupled with proliferation in the production of HMDA, but the deficiency of pyruvate kinase is described. , There is no description that it is related to the improvement of productivity of adipic acid.
  • HMDA hexamethylenediamine
  • Patent Document 5 and Patent Document 6 describe methods for producing 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromucon acid using Serratia microorganisms, respectively.
  • the production efficiency of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid is particularly high by enhancing the activity of the acyltransferase that catalyzes the reaction that produces 3-oxoadipyl-CoA from acetyl-CoA and succinyl-CoA. It is disclosed that it is possible to improve the above, but there is no description about pyruvate kinase.
  • Patent Document 7 discloses a method for improving a microorganism based on insilico analysis, which deletes pykF, pykA, and ptsG, which are genes encoding pyruvate kinase and phosphotransferase system enzymes of Escherichia coli, and anaerobic conditions. It is disclosed that culturing underneath improves the productivity of succinic acid.
  • Patent Document 1 or 2 describes a metabolic pathway in which 3-hydroxyadipic acid or ⁇ -hydromuconic acid can be produced in a microorganism, but the metabolism is stopped with 3-hydroxyadipic acid or ⁇ -hydromuconic acid, and the culture medium is used. There is no description that it is secreted inside.
  • using a non-natural microorganism into which a nucleic acid encoding an enzyme that catalyzes the reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA described in Patent Documents 1 to 4 to 3-hydroxyadipyl-CoA has been introduced is actually used. It has not been verified whether 3-hydroxyadic acid, ⁇ -hydromuconic acid or adipic acid can be produced.
  • the enzymes that catalyze the reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to 3-hydroxyadipyl-CoA described in Patent Documents 1 to 4 also include 3-hydroxyadic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or adipic acid.
  • the presence of the enzyme, which exhibits excellent activity in the production of, has not yet been known.
  • a nucleic acid encoding an enzyme that exhibits excellent activity in a reduction reaction using 3-oxoadipyl-CoA as a substrate is introduced, or the metabolic pathway is further modified based on a gene-modified microorganism in which the expression of the enzyme is enhanced. It is an object of the present invention to provide a gene-modified microorganism for producing 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or adipic acid in a high yield, and a method for producing a substance using the modified microorganism.
  • the present inventors have introduced a nucleic acid encoding an enzyme showing excellent activity in a reduction reaction using 3-oxoadipyl-CoA as a substrate, or enhanced the expression of the enzyme. Furthermore, they have found that a genetically modified microorganism lacking the function of pyruvate kinase can produce 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or adipic acid in high yield, and to complete the present invention. I arrived.
  • the present invention provides the following.
  • B In any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 7, one or several amino acids consist of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and 3-oxoadipyl-CoA is reduced.
  • a polypeptide having enzymatic activity that catalyzes the reaction that produces 3-hydroxyadipyl-CoA (C) A reaction having 70% or more sequence identity with respect to any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 7 and reducing 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA. A polypeptide having enzymatic activity to catalyze.
  • the 13th amino acid residue from the N-terminal side is phenylalanine or leucine
  • the 15th amino acid residue of ami from the N-terminal side is leucine or glutamine, which is the N-terminal.
  • the 16th amino acid residue from the side is lysine or asparagine
  • the 17th amino acid residue from the N-terminal side is glycine or serine
  • the 19th amino acid residue from the N-terminal side is proline or arginine
  • N The genetically modified microorganism according to (2), wherein the 21st amino acid residue from the terminal side is leucine, methionine or valine.
  • the genetically modified microorganism according to any one of (1) to (3) which is a genetically modified form of a microorganism selected from the group consisting of the genus Escherichia, Serratia, Hafnia and Pseudomonas. (5) It has the ability to produce 3-oxoadipyl CoA and coenzyme A from acetyl-CoA and succinyl-CoA, and the ability to produce 3-hydroxyadipic acid from 3-hydroxyadipyl-CoA, (1) to (4). ) The genetically modified microorganism according to any one of.
  • a method for producing 3-hydroxyadipic acid which comprises culturing the genetically modified microorganism according to any one of (1) to (5) and (8) in a medium containing a carbon source as a fermentation raw material.
  • ⁇ -hydromuconic acid which comprises culturing the genetically modified microorganism according to any one of (1) to (4), (6) and (8) in a medium containing a carbon source as a fermentation raw material.
  • (11) A method for producing adipic acid, which comprises culturing the genetically modified microorganism according to any one of (1) to (4), (7) and (8) in a medium containing a carbon source as a fermentation raw material. ..
  • a method for producing one or more substances (13) The method according to (12), wherein the gene-modified microorganism is a microorganism in which the function of a phosphotransferase is further deleted.
  • the gene-modified microorganism according to the present invention expresses an enzyme showing excellent activity in the reduction reaction from 3-oxoadipyl-CoA to 3-hydroxyadipyl-CoA, and further lacks the function of pyruvate kinase.
  • 3-Hydroxyadiponic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or adipic acid can be produced in higher yields as compared to parent strain microorganisms that do not lack the function of pyruvate kinase.
  • the method for producing a substance according to the present invention uses a genetically modified microorganism having excellent productivity of 3-hydroxyadic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or adipic acid produced via 3-hydroxyadipyl-CoA, these are used.
  • the productivity of the substance can be greatly improved.
  • the microorganism of the present invention is a genetically modified microorganism in which a nucleic acid encoding the polypeptide described in (a) to (c) below is introduced, or the expression of the polypeptide is enhanced and the function of pyruvate kinase is deleted. is there.
  • A Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 7
  • B In the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 7, one or several amino acids are substituted or deleted.
  • Polypeptides (c) SEQ ID NOs: 1-7 consisting of the inserted and / or added amino acid sequence and having enzymatic activity to catalyze the reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • 3-oxoadipyl-CoA reductase the enzyme that catalyzes the reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA
  • 3-hydroxyadipic acid may be abbreviated as 3HA, ⁇ -hydromuconic acid as HMA, and adipic acid as ADA.
  • Introducing a nucleic acid in the present invention means introducing a nucleic acid from outside the cells of a microorganism into the cells and imparting the microorganism the ability to produce a polypeptide encoded by the nucleic acid.
  • the method of introduction is not particularly limited, and a method of incorporating the nucleic acid into an expression vector capable of autonomous replication in a microorganism and introducing the nucleic acid into a host microorganism, a method of incorporating the nucleic acid into the genome of a microorganism, and the like can be used.
  • enhancing the expression of a polypeptide means enhancing the expression of a polypeptide originally possessed by a microorganism.
  • the method for enhancing expression is not particularly limited, and examples thereof include a method for increasing the copy number of the nucleic acid encoding the polypeptide, a method for modifying the promoter region and the ribosome binding sequence upstream of the coding region of the polypeptide, and the like. These methods may be performed alone or in combination.
  • nucleic acid to be introduced may be one type or multiple types.
  • introduction of nucleic acid and enhancement of expression of polypeptide may be combined.
  • one or several amino acids consist of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and 3-oxoadipyl-CoA.
  • the range of "1 or several" is preferably 10 or less, more preferably 5 or less, particularly preferably 4 or less, and most preferably 1 or 2 or less. is there.
  • conservative substitution when an amino acid is substituted, it is highly possible that the activity of the polypeptide is maintained when the amino acid is substituted with an amino acid having similar properties (so-called conservative substitution).
  • the 20 kinds of amino acids constituting the natural protein are neutral amino acids having a low polar side chain (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro) and neutral amino acids having a hydrophilic side chain (Asn). , Grn, Thr, Ser, Tyr, Cys), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (Arg, Lys, His), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp).
  • the properties of the polypeptide do not change if they are substituted between them.
  • sequence identity is the same.
  • the preferred range is 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably 99% or more.
  • sequence identity refers to all amino acid sequences (translations) that overlap in the optimum alignment when a gap is introduced into or without a gap between two amino acid sequences or base sequences. It means the ratio (percentage) of the same amino acid or base to the starting point amino acid (including the starting amino acid) or the base sequence (including the starting codon), and is calculated by the formula (1).
  • the shorter sequence length to be compared is 400 amino acids or more, and if it is less than 400 amino acids, sequence identity is not defined.
  • the sequence identity can be easily examined by using BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), which is an algorithm widely used in this field.
  • BLAST can be used by anyone from websites such as NCBI (National Center for Biotechnology Information) and KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), and can be easily sequenced using default parameters. .. Sequence identity can also be examined using similar functions built into software such as Genetyx.
  • Sequence identity (%) number of matches (gaps are not counted) / shorter sequence length (length not including gaps at both ends) x 100 ... Equation (1).
  • sequence identity between the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 7 is calculated using the function of Genetyx (% Identity Matrix) according to the formula (1), the values of the sequence identity are the lowest, SEQ ID NOs: 2 and 4. The value of is 71.51%, and the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 7 have at least 70% or more sequence identity with each other.
  • Table 1 shows the calculation results of sequence identity using Genetyx. In Tables 1 to 5 below, the leftmost number indicates the sequence number.
  • the amino acid residue 15 to 38 from the N-terminal side (hereinafter, for convenience, the amino acid residue from the N-terminal side). , "A.a.”. Therefore, for example, the 15th to 38th amino acid residues from the N-terminal side may be simply expressed as "15 to 38a.a.”), SEQ ID NO: 173. It has a common sequence 1 consisting of 24 amino acid residues shown in. In common sequence 1, Xaa is an arbitrary amino acid residue, but 13a. a. Is preferably phenylalanine or leucine, 15a. a. Is preferably leucine or glutamine, 16a. a.
  • Common sequence 1 corresponds to NAD + binding residue and amino acid residues around it. The NAD + binding residue is described in Biochimie. 2012 Feb; 94 (2): 471-8. As shown in, the 24th amino acid residue of the common sequence 1 is aspartic acid, but the common sequence 1 is characterized by being asparagine.
  • the polypeptides set forth in SEQ ID NOs: 1 to 7 are considered to exhibit excellent enzymatic activity as 3-oxoadipyl-CoA reductase.
  • amino acid sequences of SEQ ID NOs: 8 to 86 have 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 7.
  • the calculation results of sequence identity using Genetyx are shown in Tables 2-1 to 2-3 and Tables 3-1 to 3-3.
  • the nucleic acid encoding the polypeptide according to (a) to (c) of the present invention may contain a sequence such that an additional peptide or protein is added to the N-terminal and / or C-terminal of the polypeptide. ..
  • Examples of such peptides or proteins include those containing a secretory signal sequence, a transport protein, a binding protein, a tag peptide for purification, a fluorescent protein and the like.
  • those skilled in the art can select peptides or proteins having a function to be added and add them to the polypeptides of the present invention, depending on the purpose.
  • the sequence identity of the amino acid sequence does not include such peptides or proteins.
  • the nucleic acid encoding the polypeptide set forth in SEQ ID NOs: 1 to 86 is not particularly limited as long as it has a base sequence that can be translated into the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 1 to 86, and the codon corresponding to each amino acid (standard). It can be decided with reference to (genetic code). At that time, the base sequence may be redesigned with codons commonly used for the host microorganism used in the present invention.
  • base sequence of the nucleic acid encoding the polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 1 to 86 include the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 87 to 172, respectively.
  • whether or not the polypeptide encoded by a certain nucleic acid has 3-oxoadipyl-CoA reductase activity is determined by preparing the following transformants A and B, and as a result of a culture test, a culture solution. If 3-hydroxyadipic acid or ⁇ -hydromuconic acid can be confirmed in the nucleic acid, it is determined that the nucleic acid encodes a polypeptide having 3-oxoadipyl-CoA reductase activity. The determination method will be described using the biosynthetic pathway shown in Scheme 1 below.
  • reaction A shows a reaction for producing 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A from acetyl-CoA and succinyl-CoA.
  • reaction B shows a reaction that produces 3-hydroxyadipyl-CoA from 3-oxoadipyl-CoA.
  • reaction C shows a reaction that produces 2,3-dehydroadipyl-CoA from 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • reaction D shows a reaction that produces adipyl-CoA from 2,3-dehydroadipyl-CoA.
  • Reaction E shows a reaction for producing 3-hydroxyadipic acid from 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • Reaction F shows a reaction that produces ⁇ -hydromuconic acid from 2,3-dehydroadipyl-CoA.
  • Reaction G shows a reaction for producing adipic acid from adipyl-CoA.
  • Transformant A has an enzyme that catalyzes Reaction A, Reaction E and Reaction F.
  • Transformant B has an enzyme that catalyzes Reaction A, Reaction C, Reaction E and Reaction F.
  • transformant A is prepared.
  • a plasmid expressing an enzyme that catalyzes Reaction A, Reaction E, and Reaction F is prepared.
  • the reactions E and F can be catalyzed by the same enzyme.
  • the plasmid is introduced into the Escherichia coli BL21 (DE3) strain, which is a microbial strain incapable of producing any of 3-hydroxyazipic acid, ⁇ -hydromuconic acid, and adipic acid.
  • An expression plasmid in which a nucleic acid encoding a polypeptide to be examined for enzyme activity is incorporated downstream of an appropriate promoter is introduced into the obtained transformant to obtain transformant A.
  • Transformant A is cultured, and it is confirmed whether or not 3-hydroxyadipic acid is contained in the culture solution after the culture. If 3-hydroxyadipic acid can be confirmed in the culture medium, then transformant B is prepared. Transformant B is obtained by preparing and introducing a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reaction C into transformant A. Transformant B is cultured, and it is confirmed whether or not ⁇ -hydromuconic acid is contained in the culture medium after the culture. If it can be confirmed that the culture solution after culturing contains ⁇ -hydromuconic acid, the 3-hydroxyadipic acid produced by transformant A and the ⁇ -hydromuconic acid produced by transformant B are 3-hydroxy. Since it can be seen that it was produced via adipyl-CoA, it is judged that the target polypeptide has 3-oxoadipyl-CoA reductase activity.
  • pcaF NCBI Gene ID: 1041755, SEQ ID NO: 174
  • pcaF NCBI Gene ID: 1041755, SEQ ID NO: 174
  • pcaI and pcaJ a continuous sequence including the full length of pcaI and pcaJ (NCBI Gene ID: 1046613, 1046612, SEQ ID NO: 175, 176) derived from Pseudomonas putida KT2440 strain is used.
  • the polypeptides encoded by pcaI and pcaJ catalyze Reaction E and Reaction F by forming a complex.
  • Pseudomonas putida KT2440 strain gene paaF (NCBI Gene ID: 1046932, SEQ ID NO: 177) is used.
  • the method for culturing the transformant A and the transformant B is as follows. At the time of culturing, an antibiotic for stably holding the plasmid and a substance for inducing the expression of the polypeptide encoded by the incorporated nucleic acid can be appropriately added.
  • Transformant A or B is added to 5 mL of medium I (Bacto tryptone (manufactured by Difco Laboratories) 10 g / L, Bacto yeast extract (manufactured by Difco Laboratories) 5 g / L, sodium chloride 5 g / L) adjusted to pH 7. Inoculate the ears and incubate with shaking at 30 ° C. and 120 min-1 for 18 hours to prepare a preculture solution.
  • the inclusion of 3-hydroxyadipic acid or ⁇ -hydromuconic acid in the culture solution can be confirmed by centrifuging the culture solution and analyzing the supernatant by LC-MS / MS.
  • the conditions of the analysis are as follows.
  • HPLC 1290 Infinity (manufactured by Agilent Technologies)
  • Ionization method ESI negative mode.
  • the activity value of 3-oxoadipyl-CoA reductase is 3-hydroxyadipyl produced using purified 3-oxoadipyl-CoA reductase using 3-oxoadipyl-CoA prepared by an enzymatic reaction from 3-oxoadipic acid as a substrate. It can be calculated by measuring CoA.
  • the specific method is as follows.
  • 3-oxoadipic acid can be prepared by a known method (for example, the method described in Reference Example 1 of WO2017 / 099209).
  • PCR was performed using the genomic DNA of Pseudomonas putida KT2440 strain as a template, and the total length of the nucleic acids encoding CoA transferase (pcaI and pcaJ, NCBI-GeneID: 1046613 and 1046612) was amplified. To do.
  • the base sequences of the primers used in this PCR are, for example, SEQ ID NOs: 194 and 195.
  • the amplified fragment is inserted into the KpnI site of pRSF-1b (manufactured by Novagen), which is an expression vector for Escherichia coli, in the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3), the expression of the enzyme was induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) according to a conventional method, and then purification was performed using a histidine tag from the culture solution, followed by CoA. Obtain a plasmid solution. Using the solution, prepare an enzyme reaction solution for preparing 3-oxoadipyl-CoA having the following composition, react at 25 ° C. for 3 minutes, and then use a UF membrane (Amicon Ultra-0.5 mL, 10 K, manufactured by Merck Millipore). The enzyme is removed by treatment, and the obtained permeate is used as a 3-oxoadipyl-CoA solution.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • PCR is performed using the genomic DNA of the target microbial strain as a template according to a conventional method, and the total length of the nucleic acid encoding 3-oxoadipyl-CoA reductase is amplified.
  • the base sequences of the primers used in this PCR are, for example, SEQ ID NOs: 196 and 197.
  • the amplified fragment is inserted into the BamHI site of the expression vector pACYCtuet-1 (manufactured by Novagen) for Escherichia coli so as to have the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3), the expression of the enzyme was induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) according to a conventional method, and then purification was performed using a histidine tag from the culture solution. Obtain a -oxoadipyl-CoA reductase solution.
  • the 3-oxoadipyl-CoA reductase activity can be confirmed by preparing an enzyme reaction solution having the following composition using this enzyme solution and measuring the amount of 3-hydroxyadipyl-CoA produced at 25 ° C.
  • the gene-modified microorganism in which the expression of the polypeptide described in (a) to (c) is enhanced is a microorganism originally possessing the nucleic acid encoding the polypeptide described in (a) to (c). Is a microorganism in which the expression of the polypeptides according to (a) to (c) possessed by the host microorganism is enhanced by genetic modification.
  • microorganisms that originally have the nucleic acid encoding the polypeptide according to (a) to (c) include the following Serratia microorganisms.
  • Serratia marcescens microorganisms having SEQ ID NOs: 1, 18-28, 30-33, 35-66, 69, 70, 72-78, 79
  • Serratia nematodiphila microorganisms having SEQ ID NOs: 2, 29, 67
  • Serratia lymutica Microorganisms having SEQ ID NOs: 3, 79-84, 86
  • Serratia proteamaculans microorganisms having SEQ ID NOs: 4, 85
  • Serratia ureillitica microorganisms having SEQ ID NO: 5
  • Serratia sp Serratia microorganisms.
  • BW106 (microorganism having SEQ ID NO: 6), Serratia liquefaciens (microorganism having SEQ ID NO: 7), Serratia sp. S119 (microorganism having SEQ ID NO: 8), Serratia sp. YD25 (microorganism having SEQ ID NO: 9), Serratia sp. FS14 (microorganism having SEQ ID NO: 10), Serratia sp. HMSC15F11 (microorganism having SEQ ID NO: 11), Serratia sp. JKS000199 (microorganism having SEQ ID NO: 12), Serratia sp. TEL (microorganism having SEQ ID NO: 13), Serratia sp.
  • ISTD04 microorganism having SEQ ID NO: 14
  • Serratia sp. SCBI microorganism having SEQ ID NO: 15
  • Serratia sp. S4 microorganism having SEQ ID NO: 16
  • Serratia sp. C-1 microorganism having SEQ ID NO: 17
  • Serratia sp. OMLW3 microorganism having SEQ ID NO: 34
  • Serratia sp. OLEL1 microorganism having SEQ ID NO: 68
  • Serratia sp. OLEL2 microorganism having SEQ ID NO: 71
  • polypeptides described in (a), (b), and (c) described above also have 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase activity, and the 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase is a Serratia genus microorganism. It is encoded by the 5-aminolevulinic acid synthase gene and the 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene that constitutes the gene cluster.
  • the "gene cluster” is in close proximity to a series of nucleic acid groups having related functions. It means an area that exists.
  • Specific components of a gene cluster include, for example, a group of nucleic acids that are transcriptionally regulated by a single transcriptional regulator, an operon that is transcribed under the control of a single transcriptional promoter, and the like. Whether or not a nucleic acid is a nucleic acid that constitutes a gene cluster can also be examined online using a gene cluster search program such as antiSMASH.
  • Whether or not a polypeptide is classified as 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase or 5-aminolevulinic acid synthase is determined by NCBI (National Center for Biotechnology Information), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes), and other websites.
  • BLAST National Center for Biotechnology Information
  • search is performed at, and an enzyme having high homology with the amino acid sequence of the polypeptide is examined.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is registered as Protein ID: ABV40935.1 on the NCBI database, and is presumed to be a protein having the activity of 3-hydroxybutyryl CoA dehydrogenase from the amino acid sequence. Is described.
  • the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is registered in the NCBI database as Gene ID: CP000826.1, and is stored in the genome of Serratia proteinaculans 568, and Gene ID: CP000826. It can be searched that it is stored in the positions 2015313 to 2016842 of .1. Furthermore, from the position information of this gene, the gene sequences before and after it can be confirmed, and it can also be confirmed that the 5-aminolevulinic acid synthase gene (Protein ID: ABV40933.1) constitutes the gene cluster shown in FIG.
  • Information on the amino acid sequences of 83 to 85 can be confirmed on NCBI by the protein ID and Gene ID shown in Tables 3-4 and 3-5.
  • the nucleic acid encoding the polypeptide encoded by the 5-aminolevulinate synthase gene and the 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene constituting the gene cluster in the Serratia genus microorganism is referred to as "used in the present invention.” It is described as "3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene", and the polypeptide encoded by the 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene is described as "3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase used in the present invention".
  • the gene cluster containing the 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene used in the present invention contains at least the 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene and the 5-aminolevulinic acid synthase gene, the cluster contains other nucleic acids. It may be.
  • FIG. 1 shows a specific example of a gene cluster containing the 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene used in the present invention.
  • Serratia microorganisms having the gene cluster include S. cerevisiae. Marchescens, S.A. Nematodifila, S.A. Plymutica, S.A. Proteamalans, S.A. Ureillitica, S.A. Liquefaciens, Serratia sp. BW106, Serratia sp. S119, Serratia sp. YD25, Serratia sp. FS14, Serratia sp. HMSC15F11, Serratia sp. JKS000199, Serratia sp. TEL, Serratia sp. ISTD04, Serratia sp. SCBI, Serratia sp. S4, Serratia sp. C-1, Serratia sp. OMLW3, Serratia sp. OLEL1, Serratia sp. OLEL2, S.A. Examples include liquéfaciens.
  • the 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase used in the present invention has excellent 3-oxoadipyl-CoA reductase activity. Whether or not the nucleic acid encoding 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase has 3-oxoadipyl-CoA reductase activity can be confirmed by the same method as described above.
  • polypeptide encoded by the 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene used in the present invention is characterized by having a common sequence 1.
  • Specific examples of the amino acid sequence of such a polypeptide include the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 86.
  • the common sequence 1 if the common sequence 1 is possessed, one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of any of the polypeptides of SEQ ID NOs: 8 to 86.
  • Nucleic acids encoding polypeptides consisting of sequences and having enzymatic activity that catalyze the reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA can also be preferably used.
  • the range of "1 or several” is preferably 10 or less, more preferably 5 or less, particularly preferably 4 or less, and most preferably 1 or 2 or less.
  • sequence identity with the amino acid sequence of any of the polypeptides of SEQ ID NOs: 8 to 86 is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, still more preferably 95%.
  • the enzymatic activity that catalyzes the reaction that has a sequence identity of 97% or more, more preferably 99% or more, and reduces 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • a nucleic acid encoding the polypeptide having the peptide can also be preferably used.
  • PaaH SEQ ID NO:
  • Pseudomonas putida KT2440 strain. 178 Escherichia coli str. K-12 substr.
  • Examples include PaaH (SEQ ID NO: 179) derived from MG1655 strain, DcaH (SEQ ID NO: 180) derived from Acinetobacter baylyi ADP1 strain, PaaH (SEQ ID NO: 181) derived from Serratia pyrymutica NBRC102599 strain, and the like.
  • polypeptides consist of (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 7, and 3 70% or more of the polypeptide having enzymatic activity that catalyzes the reaction of reducing -oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA, or (c) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 7. It does not correspond to a polypeptide having the sequence identity of 3 and having enzymatic activity to catalyze the reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • deficient in the functions of pyruvate kinase and phosphotransferase-based enzymes means deficient in the activities of these enzymes.
  • the method for deleting the function is not particularly limited, but for example, the gene encoding the enzyme is subjected to gene mutation treatment by a gene mutagen, ultraviolet irradiation, etc., or partial or total deletion treatment of the base sequence by a site-specific mutation method or the like. , It can be performed by deleting by introducing a frame shift mutation into the base sequence, inserting a stop codon into the base sequence, or the like.
  • gene deletion can also be performed by removing all or part of the base sequence or replacing it with another base sequence using gene recombination technology. Among these, a method of deleting a part or the whole of the base sequence is preferable.
  • Pyruvate kinases are classified as EC 2.71.40 and catalyze the reaction of phosphoenolpyruvate (sometimes referred to herein as PEP) by dephosphorylation and conversion to pyruvate and ATP. It is an enzyme that Specifically, Escherichia coli str. K-12 substr. PykF (NCBI-ProteinID: NP_416191, SEQ ID NO: 182) from MG1655 strain, pykA (NCBI-ProteinID: NP_416368, SEQ ID NO: 183), and pykF (SEQ ID NO: 184) from Serratia grimesi NBRC13537 strain. And so on.
  • pyruvate kinase when the microorganism used in the present invention has two or more genes encoding pyruvate kinase, it is preferable to delete the functions of all pyruvate kinases. Whether or not the polypeptide encoded by the gene possessed by the microorganism used in the present invention is pyruvate kinase is determined on the websites such as NCBI (National Center for Biotechnology Information) and KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) websites such as KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). You can perform a Search (Alginment Search Tool) search. Or
  • the gene-modified microorganism of the present invention further deletes the function of the phosphotransferase system enzyme.
  • the phosphotransferase system enzyme refers to a phosphoenolpyruvate (PEP) -dependent phosphotransphase system (PTS) (in the present specification, it may be referred to as a PTS enzyme).
  • PTS is as shown in the metabolic pathway of the following scheme 2. In addition, it is the main mechanism for taking up carbohydrates such as hexose, hexitol, and disaccharide into cells.
  • carbohydrates are taken up into cells and converted to phosphate esters at the same time, while phosphate donor PEP is converted to pyruvate, so in microbial variants lacking the PTS enzyme gene, from PEP. The conversion reaction to pyruvate is inhibited.
  • the PTS enzyme is composed of two types of common enzymes, phosphoenolpyruvate sugar phosphotranphase enzyme I and phospho carrier protein HPr, which function regardless of the type of carbohydrate, and a membrane-cell membrane composed of a specific carbohydrate-specific membrane.
  • enzameII is further composed of sugar-specific IIA, IIB, and IIC component.
  • the enzyme II enzyme exists in a state of being linked as an individual or multiple domain protein depending on the species.
  • phosphoenolpyruvate sugar phosphotransphase enzameI is the ptsI gene
  • phosphocarrier protein HPr is the ptsH gene
  • glucose-specific IIA is the crr gene
  • glucose-specific IIB and IIC are also coded for glucose-specific IIB and IIC.
  • the enzyme encoded by the ptsG gene is classified into EC 2.7.1.199 and is called protein-Npi-phosphohistine-D-glucose phosphotransphase.
  • one of the above PTS enzyme genes may be deleted, or a plurality of them may be deleted. Any of the above PTS enzyme genes may be deleted, but it is preferable to delete the enzyme gene involved in glucose uptake, and it is particularly preferable to delete the ptsG gene.
  • Specific examples of the ptsG gene include Escherichia coli str. K-12 substr. Examples thereof include ptsG (NCBI-GeneID: 945651) derived from the MG1655 strain and ptsG (SEQ ID NO: 238) derived from the Serratia grimesi NBRC13537 strain.
  • polypeptide encoded by the gene of the microorganism used in the present invention is protein-Npi-phosphohisite-D-glucose phophotransphase can be determined by performing a BLAST search on a website such as NCBI or KEGG.
  • Escherichia coli is a microorganism capable of producing 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid, and in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-527991, pykF and pykA encoding the pyruvate kinase of Escherichia coli and the phosphotransferase system
  • a gene-modified strain lacking the ptsG gene encoding the enzyme was prepared, and when the gene-modified strain was cultured under anaerobic conditions, the yield of succinic acid increased and the yields of acetic acid and ethanol decreased. Is described.
  • acetic acid and ethanol are compounds metabolized from acetyl-CoA, as shown in the metabolic pathway of Scheme 2 above. That is, in Japanese Patent Publication No. 2008-527991, it is presumed that the supply amount of acetyl-CoA decreased and the yields of acetic acid and ethanol decreased due to the deletion of the ptsG, pkF, and pykA genes of Escherichia coli.
  • the 3-hydroxyadic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or adipic acid produced by the method of the present invention is a plurality of 3-oxoadipyl-CoA produced by reaction A from acetyl-CoA and succinyl-CoA as described above. It is a compound that is metabolized through a reaction. Therefore, from the description in JP-A-2008-527991, when the genes for pyruvate kinase and phosphotransferase are deleted, 3-hydroxyadic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or due to a decrease in the supply of acetyl-CoA. It is expected that the yield of adipic acid will also decrease.
  • pyruvate kinase and phospho are used in gene-modified microorganisms expressing an enzyme showing excellent activity in the reduction reaction from 3-oxoadipyl-CoA to 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • the yields of 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or adipic acid are improved, and the yields of acetic acid and ethanol are also improved.
  • Microorganisms that can be used as hosts for obtaining genetically modified microorganisms in the present invention include the genera Escherichia, Serratia, Hafnia, Psuedomonas, Corynebacterium, Bacillus, Streptomyces, Cupriavidius, Alicabic Genus, Delphitia, Simwellia, Aerobacter, Rhizobium, Thermobifida, Clostridium, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Kluyveromyces, Pichia and Canda.
  • microorganisms belonging to the genera Escherichia, Serratia, Hafnia, and Pseudomonas are preferable.
  • Microorganisms capable of producing 3-hydroxyadipic acid include the ability to produce 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A from acetyl-CoA and succinyl-CoA (reaction A), and from 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • a microorganism capable of producing 3-hydroxyadipic acid (reaction E) is used. By using a microorganism capable of producing these as a host microorganism, it is possible to obtain the genetically modified microorganism of the present invention capable of highly producing 3-hydroxyadipic acid.
  • microorganisms that are presumed to originally have the ability to catalyze the reactions A and E include microorganisms belonging to the following species.
  • Escherichia genus such as Escherichia fergusonii, Escherichia coli.
  • Pseudomonas chlororaphis Pseudomonas putida
  • Pseudomonas azotoformans Pseudomonas chlororaphis subsp.
  • the genus Psuedomonas, such as aureofaciens.
  • Hafnia genus such as Hafnia alvei.
  • Corynebacterium genus such as Corynebacterium glutamicium, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium glutamicenes, Corynebacterium glutamicum.
  • Bacillus genus such as Bacillus badius, Bacillus megaterium, Bacillus roseus.
  • the genus Streptomyces such as Streptomyces vinaceus, Streptomyces karnatakensis, Streptomyces olivaceus.
  • the genus Cupriavidus such as Cupriavidus metallicidurans, Cupriavidus necator, Cupriavidus oxalaticus.
  • Acinetobacter genus such as Acinetobacter baylyi, Acinetobacter radioretters.
  • Alcaligenes genus such as Alcaligenes faecalis.
  • the genus Nocardioides such as Nocardioides albus.
  • Brevibacterium genus such as Brevibacterium iodinum.
  • the genus Delftia such as Delftia acidovorans.
  • the genus Simwellia such as Simwellia blattae.
  • the genus Enterobacter such as Enterobacter cloacae.
  • Rhizobium genus such as Rhizobium radiobacter.
  • Serratia grimesii Serratia ficiaria, Serratia phonticola, Serratia odorifera, Serratia primutica, Serratia entomophila or Serratia genus Serratia genus Serratia.
  • the microorganism does not originally have the ability to catalyze the reactions A and / or E, the nucleic acids encoding the enzymes that catalyze these reactions A and E are appropriately combined and introduced into the microorganism to produce them. By imparting the ability, it can be used as the host microorganism.
  • Microorganisms capable of producing ⁇ -hydromuconic acid include the ability to produce 3-oxoadipyl CoA and coenzyme A from acetyl-CoA and succinyl-CoA (reaction A), and dehydration of 3-hydroxyadipyl-CoA. Utilize microorganisms capable of producing 2,3-dehydroadipyl-CoA (reaction C) and producing ⁇ -hydromuconic acid from 2,3-dehydroadipyl-CoA (reaction F). By using a microorganism capable of producing these as a host microorganism, it is possible to obtain the genetically modified microorganism of the present invention capable of producing high ⁇ -hydromucon acid.
  • Escherichia genus such as Escherichia fergusonii, Escherichia coli.
  • Pseudomonas fluororescens Pseudomonas putida
  • Pseudomonas azotoformans Pseudomonas chlororaphis subsp.
  • Hafnia genus such as Hafnia alvei.
  • Bacillus genus such as Bacillus.
  • the genus Cupriavidus such as Cupriavidus metallicidurans, Cupriavidus numazuensis, Cupriavidus oxalaticus.
  • Acinetobacter genus such as Acinetobacter baylyi, Acinetobacter radioretants.
  • Alcaligenes genus such as Alcaligenes faecalis.
  • the genus Delftia such as Delftia acidovorans.
  • the genus Simwellia such as Simwellia blattae.
  • Serratia grimesii Serratia ficiaria, Serratia phonticola, Serratia odorifera, Serratia primutica, Serratia entomophila or Serratia genus Serratia genus Serratia.
  • microorganisms that do not originally have the ability to catalyze the reactions A, C and / or F can be introduced into the microorganism by appropriately combining nucleic acids encoding enzymes that catalyze these reactions A, C and F. , These can be used as the host microorganism by imparting the ability to produce them.
  • Microorganisms capable of producing adipic acid include the ability to produce 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A (reaction A) from succinyl-CoA, and dehydration of 3-hydroxyadipyl-CoA to 2,3-dehydro.
  • reaction A 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A
  • reaction C The ability to produce adipyl-CoA
  • reaction D the ability to reduce 2,3-dehydroadipyl-CoA to produce adipyl-CoA
  • reaction G the ability to produce adipic acid from adipyl-CoA
  • microorganisms that do not originally have the ability to catalyze the reactions A, C, D and G can be combined into microorganisms by appropriately combining nucleic acids encoding enzymes that catalyze these reactions A, C, D and G. By introducing and imparting the ability to produce these, it can be used as the host microorganism.
  • acyltransferase As the enzyme that catalyzes the reaction A that produces 3-oxoadipyl-CoA, for example, acyltransferase ( ⁇ -ketothiolase) or the like can be used.
  • the acyltransferase is not particularly limited in terms of classification by EC number, but EC 23.1.
  • Examples of the classified enzyme, acetyl-CoA C-acyltransferase include an enzyme classified into EC2.3.1.16.
  • PaaJ NCBI-ProteinID: NP_415915
  • PcaF NCBI-ProteinID: NP_734536
  • Pseudomonas putida KT2440 strain and the like can be preferably used.
  • acyltransferase can produce 3-oxoadipyl-CoA using succinyl-CoA and acetyl-CoA as substrates depends on the 3-oxoadipyl-CoA production reaction by the purified acyltransferase and 3-oxoadipyl-CoA as substrates. It can be confirmed by combining the reduction reaction with the purified 3-oxoadipyl-CoA reductase and measuring the amount of decrease in NADH associated with the reduction of 3-oxoadipyl-CoA.
  • the specific measurement method is as follows, for example.
  • Confirmation of acyltransferase activity Perform PCR using the genomic DNA of the target microbial strain as a template according to a conventional method, and amplify the total length of the nucleic acid encoding the acyltransferase.
  • the amplified fragment is inserted into the SacI site of the expression vector pACYCtuet-1 for Escherichia coli (manufactured by Novagen) so as to have the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3), the expression of the enzyme was induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) according to a conventional method, and then purification was performed using a histidine tag from the culture solution to carry out acylation. Obtain a transferase solution.
  • the acyltransferase activity can be confirmed by preparing an enzyme reaction solution having the following composition using the enzyme solution and measuring the decrease in 340 nm absorption associated with the oxidation of NADH at 30 ° C.
  • Whether or not the enzyme originally expressed in the host microorganism used in the present invention has acyltransferase activity can be determined by performing the above-mentioned measurement using a cell disruption solution (cell free extract: CFE) instead of the purified acyltransferase. You can check.
  • CFE cell free extract
  • EFE Escherichia coli MG1655 strain to be measured for activity was inoculated into 5 mL of a medium adjusted to pH 7 (medium composition: tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, sodium chloride 5 g / L), and 30 Shake and incubate at ° C for 18 hours.
  • a medium prepared by adjusting the pH of the obtained culture solution to 7 (medium composition: trypton 10 g / L, yeast extract 5 g / L, sodium chloride 5 g / L, ferulic acid 2.5 mM, p-coumaric acid 2.5 mM, benzoic acid 2.
  • Tris-HCl buffer consisting of 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM dithiothreitol, glass beads ( ⁇ 0.1 mm) were added to the obtained suspension, and an ultrasonic crusher was used. Crush the cells at 4 ° C.
  • 0.5 mL of the supernatant obtained by centrifuging the cell disruption solution is passed through a UF membrane (Amicon Ultra-0.5 mL 10K, manufactured by Merck Millipore) to remove the permeate, and then 0.4 mL of Tris-HCl buffer is added. After removing low molecular weight impurities by repeating the addition three times, the CFE is resuspended in Tris-HCl buffer to a liquid volume of 0.1 mL. Instead of the purified enzyme, 0.05 mL of the CFE is added to a total volume of 0.1 mL of the enzyme reaction solution, and the enzyme activity is confirmed.
  • enoyl-CoA hydratase As the enzyme that catalyzes the reaction C that produces 2,3-dehydroadipyl-CoA, for example, enoyl-CoA hydratase or the like can be used.
  • the enoyl-CoA hydratase is not particularly limited in terms of classification by EC number, but EC number 4.2.1. Enoyl-CoA hydratase classified into-is preferable, and specific examples thereof include enzymes classified into EC 4.2.1.17 as enoyl-CoA hydratase or 2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase.
  • PaaF (NCBI-ProteinID: NP_415911) derived from Escherichia coli MG1655 strain
  • PaaF (NCBI-ProteinID: NP_745427) derived from Pseudomonas putida KT2440 strain, and the like can be preferably used.
  • enoyl-CoA hydratase catalyzes the reaction of 2,3-dehydroadipyl-CoA using 3-hydroxyadipyl-CoA as a substrate.
  • enoyl-CoA hydratase catalyzes the reaction of 2,3-dehydroadipyl-CoA using 3-hydroxyadipyl-CoA as a substrate.
  • the specific measurement method is as follows, for example.
  • the ⁇ -hydromucon acid used here can be prepared by a known method (for example, the method described in Reference Example 1 of WO2016 / 199858A1).
  • PCR was performed using the genomic DNA of Pseudomonas putida KT2440 strain as a template according to a conventional method, and nucleic acids encoding CoA transferase (pcaI and pcaJ, NCBI-GeneID: 1046613 and 1046612). Amplifies the total length of. The amplified fragment is inserted into the KpnI site of pRSF-1b (manufactured by Novagen), which is an expression vector for Escherichia coli, in the same frame as the histidine tag sequence.
  • pRSF-1b manufactured by Novagen
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3), the expression of the enzyme was induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) according to a conventional method, and then purification was performed using a histidine tag from the culture solution, followed by CoA. Obtain a plasmid solution.
  • An enzyme reaction solution for preparing 2,3-dehydroadipyl-CoA having the following composition is prepared using the solution, and after reacting at 30 ° C.
  • a UF membrane (Amicon Ultra-0.5 mL 10 K, Merck Millipore) The enzyme is removed by treatment with (manufactured by), and the obtained permeate is prepared as a 2,3-dehydroadipyl-CoA solution.
  • PCR is performed using the genomic DNA of the target microbial strain as a template according to a conventional method, and the total length of the nucleic acid encoding enoyl-CoA hydratase is amplified.
  • the amplified fragment is inserted into the NdeI site of the expression vector pET-16b for Escherichia coli (manufactured by Novagen) so as to have the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3), the expression of the enzyme was induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) according to a conventional method, and then purification was performed using a histidine tag from the culture solution to enoyl.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • purification was performed using a histidine tag from the culture solution to enoyl.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • Enzyme reaction solution 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM MgCl 2 300 ⁇ L / mL 2,3-dehydropyl-CoA solution 1 mM dithiothreitol 20 ⁇ g / mL enoyl-CoA hydrase.
  • Whether or not the enzyme originally expressed in the host microorganism used in the present invention has enoyl-CoA hydratase activity is determined by adding 0.05 mL of CFE instead of purified enoyl-CoA hydratase to a total amount of 0.1 mL of the enzyme reaction solution. It can be confirmed by adding and performing the above-mentioned measurement. Specific examples of the method for preparing CFE for Escherichia coli are as described in the method for confirming acyltransferase activity.
  • enoyl-CoA reductase As the enzyme that catalyzes the reaction D that produces adipyl-CoA, for example, enoyl-CoA reductase or the like can be used.
  • the enoyl-CoA reductase is not particularly limited in terms of classification by EC number, but EC number 1.3. -.
  • TER UniProtKB: Q5EU90
  • Tfu_1647 NCBI-ProteinID: AAZ55682
  • Acinetobacter AZ55682
  • the activity that adipyl-CoA produces is that 2,3-dehydroadipyl prepared by an enzymatic reaction from ⁇ -hydromuconic acid. It can be confirmed by measuring the amount of decrease in NADH associated with the reduction of 2,3-dehydroadipyl-CoA using purified enoyl-CoA reductase using -CoA as a substrate.
  • PCR is performed using the genomic DNA of the target microbial strain as a template according to a conventional method, and the total length of the nucleic acid encoding enoyl-CoA reductase is amplified.
  • the amplified fragment is inserted into the NdeI site of the expression vector pET-16b for Escherichia coli (manufactured by Novagen) so as to have the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3), the expression of the enzyme was induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) according to a conventional method, and then purification was performed using a histidine tag from the culture solution to enoyl. -Obtain a CoA reductase solution.
  • the enoyl-CoA reductase activity can be confirmed by preparing an enzyme reaction solution having the following composition using this enzyme solution and measuring the decrease in 340 nm absorption associated with the oxidation of NADH at 30 ° C.
  • Enzyme reaction solution 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM MgCl 2 300 ⁇ L / mL 2,3-dehydropyl-CoA solution 0.2 mM NADH 1 mM dithiothreitol 20 ⁇ g / mL enoyl-CoA reductase.
  • Whether or not the enzyme originally expressed in the host microorganism used in the present invention has enoyl-CoA reductase activity is determined by adding 0.05 mL of CFE instead of purified enoyl-CoA reductase to a total amount of 0.1 mL of the enzyme reaction solution. It can be confirmed by adding and performing the above-mentioned measurement. Specific examples of the method for preparing CFE for Escherichia coli are as described in the method for confirming acyltransferase activity.
  • the enzyme that catalyzes the reaction E that produces 3-hydroxyadipic acid the reaction F that produces ⁇ -hydromuconic acid, and the reaction G that produces adipic acid
  • CoA transferase or acyl-CoA hydrolase can be used as the enzyme that catalyzes the reaction E that produces 3-hydroxyadipic acid
  • the reaction F that produces ⁇ -hydromuconic acid for example, CoA transferase or acyl-CoA hydrolase can be used.
  • CoA transferase is preferred.
  • CoA transferase is not particularly limited in terms of classification by EC number, but EC number 2.8.3. CoA transferases classified into-are preferable, and specific examples thereof include enzymes classified into EC2.8.3.6 as CoA transferases or acyl-CoA transferases.
  • CoA transferase means an enzyme having catalytic activity (CoA transferase activity) of a reaction for producing carboxylic acid and succinyl-CoA using acyl-CoA and succinic acid as substrates.
  • PcaI and PcaJ (NCBI-Protein ID: NP_74681 and NP_746082) derived from Pseudomonas putida KT2440 strain are preferably used. be able to.
  • DcaI and DcaJ derived from Acinetobacter baylyi ADP1 strain can be preferably used.
  • the CoA transferase activity using 3-hydroxyadipyl-CoA, 2,3-dehydroadipyl-CoA or adipyl-CoA as a substrate is a reversible reaction of this enzyme reaction, so 3-hydroxyadipolic acid and succinyl-CoA , ⁇ -hydromuconic acid and succinyl-CoA, or 3-hydroxyadipyl-CoA, 2,3-dehydroadipyl-CoA or adipyl-CoA produced using purified CoA transferase using adipic acid and succinyl-CoA as substrates. Can be confirmed by detecting.
  • the specific measurement method is as follows, for example.
  • 3-Hydroxyadipic acid is prepared by the method described in Reference Example 1 of WO2016 / 199856A1.
  • PCR is performed using the genomic DNA of the target microbial strain as a template according to a conventional method, and the total length of the nucleic acid encoding the CoA transferase is amplified.
  • the amplified fragment is inserted into the KpnI site of pRSF-1b (manufactured by Novagen), which is an expression vector for Escherichia coli, in the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3), the expression of the enzyme was induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) according to a conventional method, and then purification was performed using a histidine tag from the culture solution, followed by CoA. Obtain a plasmid solution.
  • An enzyme reaction solution having the following composition is prepared using the solution, reacted at 30 ° C. for 10 minutes, and then treated with a UF membrane (Amicon Ultra-0.5 mL, 10 K, manufactured by Merck Millipore) to remove the enzyme.
  • a UF membrane Amicon Ultra-0.5 mL, 10 K, manufactured by Merck Millipore
  • ⁇ -hydromucon acid is prepared by the method described in Reference Example 1 of WO2016 / 199858A1.
  • PCR is performed using the genomic DNA of the target microbial strain as a template according to a conventional method, and the total length of the nucleic acid encoding the CoA transferase is amplified.
  • the amplified fragment is inserted into the KpnI site of pRSF-1b (manufactured by Novagen), which is an expression vector for Escherichia coli, in the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3), the expression of the enzyme was induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) according to a conventional method, and then purification was performed using a histidine tag from the culture solution, followed by CoA. Obtain a plasmid solution.
  • An enzyme reaction solution having the following composition is prepared using the solution, reacted at 30 ° C. for 10 minutes, and then treated with a UF membrane (Amicon Ultra-0.5 mL, 10 K, manufactured by Merck Millipore) to remove the enzyme.
  • 2-3-Dehydroadipyl-CoA in the permeate can be confirmed by detection with a high performance liquid chromatography tandem mass spectrometer (LC-MS / MS) (Agient).
  • PCR is performed using the genomic DNA of the target microbial strain as a template according to a conventional method, and the total length of the nucleic acid encoding the CoA transferase is amplified.
  • the amplified fragment is inserted into the KpnI site of pRSF-1b (manufactured by Novagen), which is an expression vector for Escherichia coli, in the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3), the expression of the enzyme was induced by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) according to a conventional method, and then purification was performed using a histidine tag from the culture solution, followed by CoA. Obtain a plasmid solution.
  • An enzyme reaction solution having the following composition is prepared using the solution, reacted at 30 ° C. for 10 minutes, and then treated with a UF membrane (Amicon Ultra-0.5 mL, 10 K, manufactured by Merck Millipore) to remove the enzyme. It can be confirmed by detecting adipyl-CoA in the permeate with a high performance liquid chromatography tandem mass spectrometer (LC-MS / MS) (Agient).
  • polypeptides (a) to (c) described in the present invention, or 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase are characterized by having superior activity to 3-oxoadipyl-CoA reductase used in the prior art.
  • excellent activity means that the same host microorganism, a genetically modified microorganism expressing the polypeptide or the conventional 3-oxoadipyl-CoA reductase under expression conditions, is cultured in a medium containing a carbon source as a fermentation raw material.
  • 3-hydroxyadiponic acid, ⁇ -hydromuconic acid, or adipic acid is produced in a higher yield than that of the conventional gene-modified microorganism expressing 3-oxoadipyl-CoA reductase.
  • the yield of 3-hydroxyadipic acid is calculated according to the formula (2).
  • the ⁇ -hydromucon acid yield or adipic acid yield is calculated by replacing 3-hydroxyadipic acid of the formula (2) with ⁇ -hydromucon acid or adipic acid, respectively.
  • PCR amplification of the upstream region 200b (SEQ ID NO: 186) of gapA (NCBI Gene ID: NC_000913.3) using the genomic DNA of Escherichia coli K-12 MG1655 as a template is performed according to a conventional method.
  • the primers used are, for example, SEQ ID NOs: 187 and 188), the obtained fragment and pBBR1MCS-2 / XhoI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Co., Ltd.), and the plasmid pBBR1MCS- 2 :: Obtain Pgap.
  • pBBR1MCS-2 Pgap is cleaved with ScaI to obtain pBBR1MCS-2 :: Pgap / ScaI.
  • the entire length of the nucleic acid encoding the acyltransferase was PCR-amplified according to a conventional method (primers used are, for example, SEQ ID NOs: 190 and 191), and the obtained fragment and pBBR1MCS-2 :: Pgap / ScaI were subjected to In-Fusion HD Cloning Kit.
  • pBBR1MCS-2 AT is cleaved with HpaI to obtain pBBR1MCS-2 :: AT / HpaI.
  • the entire length of the nucleic acid encoding the CoA transferase was PCR-amplified according to a conventional method (primers used are, for example, SEQ ID NOs: 194 and 195), and the obtained fragment and pBBR1MCS-2 :: AT / HpaI were obtained by "In-Fusion HD Cloning".
  • the plasmid is ligated using "Kit" to obtain pBBR1MCS-2 :: ATCT.
  • the expression vector pACYCtuet-1 (manufactured by Novagen) capable of autonomous replication in Escherichia coli is cleaved with BamHI to obtain pACYCtuet-1 / BamHI.
  • the polypeptides of SEQ ID NOs: 1 to 86 or the nucleic acids encoding 3-oxoadipyl-CoA reductase used in the prior art were PCR amplified according to a conventional method (the primers used are, for example, SEQ ID NOs: 196 and 197) and obtained.
  • the obtained plasmid and pBBR1MCS-2 are introduced into Escherichia coli strain BL21 (DE3) by electroporation (NM Calvin, PC Hanawalt. J. Bacteriol, 170 (1988), pp. 2996-2801).
  • Medium I Bacto yeast extract (manufactured by Difco Laboratories) 5 g / L, sodium chloride 5 g / L, canamycin 25 ⁇ g / mL and chloramphenicol were adjusted to pH 7 after the introduction.
  • Chloramphenicol 15 ⁇ g / mL is inoculated into 5 mL of loop loops and cultured at 30 ° C. for 120 min-1 with shaking for 18 hours.
  • Medium II succinic acid 10 g / L, glucose 10 g / L, ammonium sulfate 1 g / L, potassium phosphate 50 mM, magnesium sulfate 0.025 g / L, iron sulfate 0.0625 mg
  • the supernatant obtained by centrifuging the cells from the culture solution was membrane-treated with Millex-GV (0.22 ⁇ m, PVDF, manufactured by Merck & Co., Ltd.), and the permeate was analyzed to analyze 3-hydroxyazipine in the culture supernatant. Quantify the concentrations of acid and carbon sources. Quantitative analysis of 3-hydroxyadipic acid by LC-MS / MS is performed under the following conditions.
  • HPLC 1290 Infinity (manufactured by Agilent Technologies)
  • Ionization method ESI negative mode.
  • nucleic acid when a nucleic acid encoding any of acyltransferase, CoAtransferase, enoyl-CoA hydratase, and enoyl-CoA reductase is introduced into a host microorganism, the nucleic acid is artificially based on the amino acid sequence of the enzyme existing in the database. It may be synthetically synthesized or separated from nature. In the case of artificial synthesis, the frequency of use of codons corresponding to each amino acid may be changed according to the host microorganism to be introduced.
  • the method for introducing a nucleic acid encoding any of acyl transferase, CoA transferase, enoyl-CoA hydratase, and enoyl-CoA reductase into a host microorganism is not particularly limited, and an expression vector capable of autonomous replication in the host microorganism is used.
  • a method of introducing the nucleic acid into the integrated host microorganism, a method of incorporating the nucleic acid into the genome of the host microorganism, or the like can be used.
  • the organism that is the source of the gene is not particularly limited. Bacillus badius, Bacillus magaterium, Bacillus genus, such as Bacillus roseus, Brevibacterium genera such as Brevibacterium iodinum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium species such as Corynebacterium glutamicum, Cupriavidus metallidurans, Cupriavidus necator, Cupriavidus numazuensis, Cupriavidus such as Cupriavidus oxalaticus spp., Delftia genus such as Delftia acidovorans, Escherichia coli, Escherichia genus such as Escherichia fergusonii, Hafnia genus, such as Hafnia alvei, Microbacter
  • the expression vector or nucleic acid for genome integration is based on a promoter, a ribosome binding sequence, a nucleic acid encoding the polypeptide to be expressed, and a transcription termination sequence. It is preferably configured. It may also contain a gene that controls promoter activity.
  • the promoter used in the present invention is not particularly limited as long as it can express an enzyme in a host microorganism, and examples thereof include a gap promoter, a trp promoter, a lac promoter, a tac promoter, and a T7 promoter.
  • the present invention when introducing a nucleic acid or enhancing the expression of a polypeptide using an expression vector, is not particularly limited as long as it can autonomously replicate in the microorganism, but for example, pBBR1MCS vector, pBR322 vector, pMW vector, pET.
  • examples include vectors, pRSF vectors, pCDF vectors, pACYC vectors, and derivatives of the above-mentioned vectors.
  • the nucleic acid when introducing a nucleic acid or enhancing the expression of a polypeptide using a nucleic acid for genome integration, the nucleic acid is introduced using site-specific homologous recombination.
  • the method of partial homologous recombination is not particularly limited, but for example, a method using ⁇ Red recombinase and FLP recombinase (Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 6; 97 (12): 6640-6645.), ⁇ Red recombinase and sacB gene. (Biosci Biotechnol Biochem. 2007 Dec; 71 (12): 2905-11.) Can be mentioned.
  • the method for introducing the expression vector or the nucleic acid for genome integration is not particularly limited as long as it is a method for introducing the nucleic acid into the microorganism, and for example, the calcium ion method (Journal of Molecular Biology, 53,159 (1970)), the electroporation method ( NM Calvin, PC Hanawald.J. Vector, 170 (1988), pp. 2996-2801) and the like.
  • a medium containing a gene-modified microorganism having a nucleic acid encoding 3-oxoadipyl-CoA reductase or enhanced expression of the polypeptide as a fermentation raw material preferably a carbon source that can be used by ordinary microorganisms. Incubate in liquid medium.
  • a medium containing a nitrogen source, an inorganic salt, and if necessary, organic micronutrients such as amino acids and vitamins is used. As long as it contains the above nutrient source, it can be used in either a natural medium or a synthetic medium.
  • Fermentation raw material is a raw material that can be metabolized by the genetically modified microorganism.
  • “Metabolism” refers to the conversion of a chemical substance taken from outside the cell by a microorganism or generated from another chemical substance inside the cell into another chemical substance by an enzymatic reaction.
  • saccharides can be preferably used as the carbon source. Specific examples of saccharides include monosaccharides such as glucose, sucrose, fructose, galactose, mannose, xylose, and arabinose, disaccharides and polysaccharides to which these monosaccharides are bound, and starch saccharified liquid containing these, sugar syrup, and cellulose. Examples thereof include a contained biomass saccharified solution.
  • 3-hydroxyadic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or adipic acid can be efficiently produced by adding succinic acid, which is a substrate for CoA transferase.
  • the carbon sources listed above may be used alone or in combination.
  • the concentration of the carbon source in the medium is not particularly limited and can be appropriately set according to the type of the carbon source and the like, preferably the saccharide is 5 g / L to 300 g / L and succinic acid. Is 0.1 g / L to 100 g / L.
  • Examples of the nitrogen source used for culturing the genetically modified microorganism include ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salts, urea, nitrates, and other auxiliary organic nitrogen sources such as oil lees and soybean hydrolyzate. Casein decomposition products, other amino acids, vitamins, corn steep liquor, yeast or yeast extract, meat extract, peptides such as peptone, various fermented cells and their hydrolysates can be used.
  • the concentration of the nitrogen source in the medium is not particularly limited, but is preferably 0.1 g / L to 50 g / L.
  • inorganic salts used for culturing the genetically modified microorganism for example, phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts and the like can be appropriately added and used.
  • the culture conditions of the genetically modified microorganism for producing 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or adipic acid include the medium, culture temperature, stirring speed, pH, aeration amount, inoculation amount and the like of the component composition. , Appropriately adjusted or selected and set according to the type of the genetically modified microorganism, external conditions, and the like.
  • the pH range in the culture is not particularly limited as long as the genetically modified microorganism can grow, but is preferably pH 5 to 8, more preferably pH 5.5 to 6.8.
  • the range of aeration conditions in the culture is not particularly limited as long as it can produce 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or adipic acid, but at least at the start of the culture in order to grow the microbial mutant well. It is preferable that oxygen remains in the gas phase and / or the liquid phase in the culture vessel.
  • a defoaming agent such as mineral oil, silicone oil and a surfactant can be appropriately added to the medium.
  • the produced product can be recovered.
  • the recovery for example, isolation of the produced product can be carried out according to a general method in which the culture is stopped when the accumulated amount is appropriately increased and the fermentation product is collected from the culture. .. Specifically, after separating the cells by centrifugation, filtration, etc., the product is isolated from the culture by column chromatography, ion exchange chromatography, activated carbon treatment, crystallization, membrane separation, distillation, etc. be able to.
  • a method of adding an acid component to the salt of the product to recover the precipitate, and a concentration operation of the culture using a reverse osmosis membrane or an evaporator to remove water to remove the concentration of the product is precipitated by cooling crystallization or adiabatic crystallization, and the product and / or the salt crystal of the product is obtained by centrifugation or filtration.
  • examples thereof include a method for obtaining the product, a method in which alcohol is added to the culture to obtain the product as an ester, the ester of the product is recovered by a distillation operation, and then the product is obtained by hydrolysis. It is not limited. In addition, these recovery methods can be appropriately selected and optimized depending on the physical properties of the product and the like.
  • Reference example 1 An enzyme that catalyzes the reaction that produces 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A (reaction A), and a reaction that produces 3-hydroxyadipic acid from 3-hydroxyadipyl-CoA (reaction E) and 2,3-dehydro.
  • reaction A an enzyme that catalyzes the reaction that produces 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A
  • reaction E a reaction that produces 3-hydroxyadipic acid from 3-hydroxyadipyl-CoA
  • 2,3-dehydro Preparation of an enzyme that catalyzes the reaction (reaction F) that produces ⁇ -hydromuconic acid from adipyl-CoA, and a plasmid that expresses the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Escherichia coli.
  • the vector pBBR1MCS-2 (ME Kovach, (1995), Gene 166: 175-176) capable of autonomous replication in the plant was cleaved with XhoI to obtain pBBR1MCS-2 / XhoI.
  • Primers were designed (SEQ ID NO: 187, 188) and PCR reactions were performed according to conventional methods.
  • the obtained fragment and pBBR1MCS-2 / XhoI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) and introduced into Escherichia coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant Escherichia coli strain, and the plasmid whose nucleotide sequence was confirmed by a conventional method was designated as pBBR1MCS-2 :: Pgap.
  • pBBR1MCS-2 :: Pgap was cleaved with ScaI to obtain pBBR1MCS-2 :: Pgap / ScaI.
  • pBBR1MCS-2 AT was extracted from the obtained recombinant strain, and the plasmid whose nucleotide sequence was confirmed by a conventional method was designated as pBBR1MCS-2 :: AT. Subsequently, pBBR1MCS-2 :: AT was cleaved with HpaI to obtain pBBR1MCS-2 :: AT / HpaI.
  • CoA transferase genes pcaI and pcaJ (NCBI Gene ID: 1046613, 1046612, SEQ ID NOs: 192, 193) using the genomic DNA of the Pseudomonas putida KT2440 strain as a template to amplify the genes encoding the enzymes that catalyze Reactions D and E).
  • Primers for PCR amplification of contiguous sequences including the full length of the gene were designed (SEQ ID NO: 194, 195), and the PCR reaction was carried out according to a conventional method.
  • the obtained fragment and pBBR1MCS-2 :: AT / HpaI were ligated using an In-Fusion HD Cloning Kit and introduced into Escherichia coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the plasmid whose nucleotide sequence was confirmed by a conventional method was designated as pBBR1MCS-2 :: ATCT.
  • PBBR1MCS-2 ATCT was cleaved with ScaI to obtain pBBR1MCS-2 :: ATCT / ScaI.
  • a primer for amplifying the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 87 was designed using the genomic DNA of the Serratia marcescens ATCC13880 strain as a template (SEQ ID NO: 196, 197). , The PCR reaction was carried out according to a conventional method.
  • a primer for amplifying the nucleic acid shown in SEQ ID NO: 88 was designed using the genomic DNA of the Serratia nematodiphila DSM21420 strain as a template (SEQ ID NO: 198, 199). , The PCR reaction was carried out according to a conventional method.
  • a primer for amplifying the nucleic acid of SEQ ID NO: 89 was designed using the genomic DNA of the Serratia polymer NBRC102599 strain as a template (SEQ ID NOs: 200 and 201).
  • the PCR reaction was carried out according to a conventional method.
  • a primer for amplifying the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 90 was designed using the genomic DNA of Serratia polymerase 568 strain as a template (SEQ ID NOs: 202 and 203).
  • the PCR reaction was carried out according to a conventional method.
  • a primer for amplifying the nucleic acid of SEQ ID NO: 91 was designed using the genomic DNA of the Serratia ureilitica Lr5 / 4 strain as a template (SEQ ID NO: 204, 205), the PCR reaction was carried out according to a conventional method.
  • Serratia sp was designed using the genomic DNA of the Serratia ureilitica Lr5 / 4 strain as a template.
  • primers for amplifying the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 92 were designed (SEQ ID NOs: 206 and 207), and a PCR reaction was carried out according to a conventional method.
  • a primer for amplifying the nucleic acid shown in SEQ ID NO: 93 was designed using the genomic DNA of the Serratia liquefaciens FK01 strain as a template (SEQ ID NOs: 208, 209).
  • the PCR reaction was carried out according to a conventional method.
  • Each of the obtained fragments and pBBR1MCS-2 :: ATCT / ScaI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) and introduced into Escherichia coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the nucleotide sequence was confirmed by a conventional method.
  • the plasmid for expressing the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 1 is "pBBR1MCS-2 :: ATCTOR1”
  • the plasmid for expressing the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2 is “pBBR1MCS-2 :: ATCTOR2”
  • the plasmid for expressing the polypeptide shown in 3 is "pBBR1MCS-2 :: ATCTOR3”
  • the plasmid for expressing the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 4 is "pBBR1MCS-2 :: ATCTOR4", and SEQ ID NO: 5.
  • the plasmid for expressing the polypeptide described is described in "pBBR1MCS-2 :: ATCTOR5", the plasmid for expressing the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 6 is described in “pBBR1MCS-2 :: ATCTOR6", and SEQ ID NO: 7.
  • the plasmid for expressing the polypeptide is designated as “pBBR1MCS-2 :: ATCTL7", and these plasmids are shown in Table 6.
  • Reference example 2 Preparation of a plasmid for expressing an enzyme that catalyzes the reaction (Reaction C) that produces 2,3-dehydroadipyl-CoA from 3-hydroxyadipyl-CoA
  • An expression vector pMW119 (Nippon Gene) capable of autonomous replication in Escherichia coli was cut with SacI to obtain pMW119 / SacI.
  • PCR amplification of the upstream region 200b (SEQ ID NO: 186) of gapA NCBI Gene ID: NC_000913.3
  • Primers were designed (SEQ ID NOs: 210, 211) and PCR reactions were performed according to conventional methods.
  • the obtained fragment and pMW119 / SacI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) and introduced into Escherichia coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant Escherichia coli strain, and the plasmid whose nucleotide sequence was confirmed by a conventional method was designated as pMW119 :: Pgap.
  • pMW119 :: Pgap was cleaved with SphI to obtain pMW119 :: Pgap / SphI.
  • Reference example 3 An enzyme that catalyzes the reaction that produces 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A from acetyl-CoA and succinyl-CoA (reaction A), and an enzyme that catalyzes the reaction that produces adipic acid from adipyl-CoA (reaction G). And preparation of plasmids expressing the polypeptides set forth in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, Acetyl-Coabacter baylyi ADP1 strain genome to amplify the gene encoding the enzyme that catalyzes reaction G.
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the plasmids whose nucleotide sequences were confirmed by a conventional method were pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR1, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR2, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR3, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR4, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR5, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR6, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR7.
  • Reference example 4 Catalyze the reaction to produce 2,3-dehydroadipyl-CoA from 3-hydroxyadipyl-CoA (reaction C) and the reaction to produce adipyl-CoA from 2,3-dehydroadipyl-CoA (reaction D).
  • Preparation of plasmids for expressing the enzyme pMW119 :: EH was cleaved with HindIII to give pMW119 :: EH / HindIII.
  • Example 1 Preparation of Serratia microbial variant lacking pyruvate kinase function Produce Serratia microbial variant lacking pyruvate kinase function by deficient in pyruvate kinase-encoding genes pykF and pykA did.
  • 0.5 mL of the culture solution was inoculated into 50 mL of LB medium containing 500 ⁇ g / mL of ampicillin and 50 mM of arabinose, and cultivated in rotation at 30 ° C. for 2 hours. After ice-cooling the culture solution for 20 minutes, the cells were washed 3 times with 10% (w / w) glycerol. The washed pellet was suspended in 100 ⁇ L of 10% (w / w) glycerol, mixed with 5 ⁇ L of PCR fragments, and then ice-cooled in an electroporation cuvette for 10 minutes.
  • the kanamycin-resistant strain was inoculated into 5 mL of LB medium, and pKD46 was shed by subculturing twice at 37 ° C. to obtain an ampicillin-sensitive strain.
  • PCP20 was introduced into an ampicillin-sensitive strain, and an ampicillin-resistant strain was obtained again.
  • colony direct PCR was performed, and the loss of the kanamycin resistance gene was confirmed from the band length.
  • the primers used were oligo DNAs of SEQ ID NOs: 224 and 225.
  • the kanamycin-sensitive strain was inoculated into 5 mL of LB medium and subcultured twice at 37 ° C. to shed pCP20.
  • the obtained strain was designated as Serratia grimesi NBRC13537 ⁇ pykF.
  • the pykA of the Serratia grimesii NBRC13537 ⁇ pykF strain was deleted by the same method as in the preparation of the pykF-deficient strain. After introducing pKD46 into the strain, a PCR fragment for pykA deficiency was introduced. Colony direct PCR was performed using the obtained kanamycin-resistant strain, and deletion of the target gene and insertion of the kanamycin resistance gene were confirmed from the band length.
  • the primers used were oligo DNAs of SEQ ID NOs: 223 and 229.
  • PCP20 was introduced into an ampicillin-sensitive strain, and an ampicillin-resistant strain was obtained again. Colony direct PCR was performed using the obtained strain, and the loss of the kanamycin resistance gene was confirmed from the band length.
  • the primers used were oligo DNAs of SEQ ID NOs: 228 and 229. PCP20 was shed from the kanamycin-sensitive strain. The obtained strain was designated as Sg ⁇ PP.
  • Example 2 Preparation of Serratia microbial mutant in which the function of pyruvate kinase is deficient and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, E and F is introduced.
  • Each of the plasmids prepared in the above was introduced to prepare a microbial variant of the genus Serratia.
  • a Serratia microbial mutant in which the empty vector pBBR1MCS-2 was introduced into Sg ⁇ PP was prepared.
  • Sg ⁇ PP was inoculated into 5 mL of LB medium and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day.
  • 0.5 mL of the culture solution was inoculated into 5 mL of LB medium and cultured at 30 ° C. for 2 hours with shaking. After ice-cooling the culture solution for 20 minutes, the cells were washed 3 times with 10% (w / w) glycerol.
  • the washed pellet was suspended in 100 ⁇ L of 10% (w / w) glycerol and 1 ⁇ L of pBBR1MCS-2 (control), pBBR1MCS-2 :: ATCTOR1, pBBR1MCS-2 :: ATCTOR2, pBBR1MCS-2 :: ATCTOR3, pBBR1MCS. -2 :: ATCTOR4, pBBR1MCS-2 :: ATCTOR5, pBBR1MCS-2 :: ATCTOR6, or pBBR1MCS-2 :: ATCTOR7, and then ice-cooled in an electroporation cuvette for 10 minutes.
  • strains were designated as Sg ⁇ PP / pBBR (negative control), Sg ⁇ PP / 3HA1, Sg ⁇ PP / 3HA2, Sg ⁇ PP / 3HA3, Sg ⁇ PP / 3HA4, Sg ⁇ PP / 3HA5, Sg ⁇ PP / 3HA6, and Sg ⁇ PP / 3HA7, respectively.
  • pBBR1MCS-2 (control), pBBR1MCS-2 :: ACTTOR1, pBBR1MCS-2 :: ACTTOR2, pBBR1MCS-2 :: ACTTOR3, pBBR1MCS-2 :: ACTTOR4, pBBR1MCS-2: ATTTOR4, pBBR1MCS-2: ATTTOR1 ATCTOR6 or pBBR1MCS-2 :: ATCTL7 was introduced.
  • the obtained strains were designated as Sg / pBBR (negative control), Sg / 3HA1, Sg / 3HA2, Sg / 3HA3, Sg / 3HA4, Sg / 3HA5, Sg / 3HA6, and Sg / 3HA7, respectively.
  • Example 3 Production test of 3-hydroxyadic acid and ⁇ -hydromuconic acid using a Serratia microbial variant lacking the function of pyruvate kinase Using the Serratia microbial variant prepared in Example 2, 3-hydroxyadipic acid and A production test of ⁇ -hydromucon acid was carried out.
  • Medium II (glucose 50 g / L, ammonium sulfate 1 g / L, potassium phosphate 50 mM, magnesium sulfate 0.025 g / L, iron sulfate 0.0625 mg / L, manganese sulfate 2) in which 0.25 mL of the culture solution was adjusted to pH 6.5. .7 mg / L, calcium chloride 0.33 mg / L, sodium chloride 1.25 g / L, Bacto trypton 2.5 g / L, Bacto yeast extract 1.25 g / L, canamycin 25 ⁇ g / mL) 5 mL ( ⁇ 18 mm glass test tube, It was added to an aluminum stopper) and cultured with shaking at 30 ° C. and 120 min-1 for 24 hours.
  • HPLC Quantitative analysis of organic acids by HPLC ⁇
  • HPLC LC-10A (manufactured by Shimadzu Corporation)
  • Mobile phase 5 mM p-toluenesulfonic acid reaction solution: 5 mM p-toluenesulfonic acid, 0.1 mM EDTA, 20 mM Bis-Tris
  • Flow velocity 0.8 mL / min
  • HPLC Quantitative analysis of sugars and alcohols by HPLC ⁇
  • HPLC Shimadzu Prominence (manufactured by Shimadzu Corporation)
  • Comparative Example 1 Production test of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid using a Serratia microbial variant that does not lack the function of pyruvate kinase Serratia microbial microorganism prepared in Reference Example 5 by the same method as in Example 3. Variants were cultured. The concentrations of 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant, and the sugar remaining unused in the medium were quantified. Further, Table 7 shows the yields of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid calculated using the above formula (2) based on the results.
  • Example 4 Preparation of Escherichia coli mutant deficient in pyruvate kinase function
  • a mutant of Escherichia coli deficient in pyruvate kinase function was prepared by deleting pykF and pykA, which are genes encoding pyruvate kinase in Escherichia coli. Methods for deficiency of pykF and pykA are described in Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 6; 97 (12): 6640-6645. Followed the method described in.
  • An ampicillin-resistant strain was obtained by introducing pKD46, which is an FRT recombinase expression plasmid, into the Escherichia coli MG1655 strain.
  • the obtained strain was inoculated into 5 mL of LB medium containing 100 ⁇ g / mL of ampicillin, and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day.
  • 0.5 mL of the culture solution was inoculated into 50 mL of LB medium containing 100 ⁇ g / mL of ampicillin and 50 mM of arabinose, and cultivated in rotation at 30 ° C. for 2 hours.
  • the cells were washed 3 times with 10% (w / w) glycerol.
  • the washed pellet was suspended in 100 ⁇ L of 10% (w / w) glycerol, mixed with 5 ⁇ L of PCR fragments, and then ice-cooled in an electroporation cuvette for 10 minutes.
  • electroporation was performed using Gene pulper (manufactured by Bio-rad) (3 kV, 200 ⁇ , 25 ⁇ F), 1 mL of SOC medium was immediately added, and the cells were cultured with shaking at 30 ° C. for 2 hours.
  • the whole amount was applied to LB agar medium containing 25 ⁇ g / mL of kanamycin and incubated at 30 ° C. for 1 day. Colony direct PCR was performed using the obtained kanamycin-resistant strain, and deletion of the target gene and insertion of the kanamycin resistance gene were confirmed from the band length.
  • the primers used were oligo DNAs of SEQ ID NOs: 223 and 233.
  • the kanamycin-resistant strain was inoculated into 5 mL of LB medium, and pKD46 was shed by subculturing twice at 37 ° C. to obtain an ampicillin-sensitive strain.
  • PCP20 was introduced into an ampicillin-sensitive strain, and an ampicillin-resistant strain was obtained again.
  • colony direct PCR was performed, and the loss of the kanamycin resistance gene was confirmed from the band length.
  • the primers used were oligo DNAs of SEQ ID NOs: 232 and 233.
  • the kanamycin-sensitive strain was inoculated into 5 mL of LB medium and subcultured twice at 37 ° C. to shed pCP20.
  • the obtained strain was designated as Escherichia coli MG1655 ⁇ pykF.
  • the pykA of the Escherichia coli MG1655 ⁇ pykF strain was deleted by the same method as in the preparation of the pykF-deficient strain. After introducing pKD46 into the strain, a PCR fragment for pykA deficiency was introduced. Colony direct PCR was performed using the obtained kanamycin-resistant strain, and deletion of the target gene and insertion of the kanamycin resistance gene were confirmed from the band length.
  • the primers used were oligo DNAs of SEQ ID NOs: 223 and 224.
  • PCP20 was introduced into an ampicillin-sensitive strain, and an ampicillin-resistant strain was obtained again. Colony direct PCR was performed using the obtained strain, and the loss of the kanamycin resistance gene was confirmed from the band length.
  • the primers used were oligo DNAs of SEQ ID NOs: 236 and 237.
  • PCP20 was shed from the kanamycin-sensitive strain. The obtained strain was designated as Ec ⁇ PP.
  • Example 5 Preparation of Escherichia coli mutant in which the function of pyruvate kinase is deficient and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, E and F is introduced.
  • Ec ⁇ PP prepared in Example 4 was prepared in Reference Example 1. Each of these plasmids was introduced to prepare a mutant of Escherichia coli.
  • Ec ⁇ PP was inoculated into 5 mL of LB medium and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day.
  • 0.5 mL of the culture solution was inoculated into 5 mL of LB medium and cultured at 30 ° C. for 2 hours with shaking. After ice-cooling the culture solution for 20 minutes, the cells were washed 3 times with 10% (w / w) glycerol.
  • the washed pellet was suspended in 100 ⁇ L of 10% (w / w) glycerol and 1 ⁇ L of pBBR1MCS-2 (negative control), pBBR1MCS-2 :: ATCTOR1, pBBR1MCS-2 :: ATCTOR2, pBBR1MCS-2 :: ATCTOR3, After mixing with pBBR1MCS-2 :: ATTTOR4, pBBR1MCS-2 :: ATTTOR5, pBBR1MCS-2 :: ATTTOR6, or pBBR1MCS-2 :: ATTTOR7, it was ice-cooled in an electroporation cuvette for 10 minutes.
  • PBBBR1MCS-2 (control), pBBR1MCS-2 :: ATCTL1, pBBR1MCS-2 :: ATCTL2, pBBBR1MCS-2 :: ATCTL3, pBBBR1MCS-2 :: ATCTL4, pBBR1MCS-2 :: ATCTL5, pBBR1MCS-2 Alternatively, pBBR1MCS-2 :: ATCTL7 was introduced.
  • the obtained strains were designated as Ec / pBBR (negative control), Ec / 3HA1, Ec / 3HA2, Ec / 3HA3, Ec / 3HA4, Ec / 3HA5, Ec / 3HA6, and Ec / 3HA7, respectively.
  • Example 6 Production test of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid using a mutant of Escherichia coli lacking the function of pyruvate kinase
  • the mutant prepared in Example 5 was cultured in the same manner as in Example 3.
  • the concentrations of 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant, and the sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 8 shows the yields of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid calculated using the above formula (2) based on the values.
  • Comparative Example 2 Production test of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid using a mutant of Escherichia coli that does not lack the function of pyruvate kinase
  • the mutant prepared in Reference Example 6 is cultured in the same manner as in Example 6. did.
  • the concentrations of 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant, and the sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 8 shows the yields of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid calculated using the above formula (2) based on the values.
  • Example 7 Preparation of Serratia microbial mutants in which the function of pyruvate kinase is deficient and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, E and F is introduced.
  • Each of the Serratia microbial variants prepared in Example 2 In response, the plasmid pMW119 :: EH prepared in Reference Example 2 was introduced to prepare a Serratia microbial variant.
  • a Serratia microbial mutant in which the empty vector pMW119 was introduced into Sg ⁇ PP / pBBR prepared in Example 2 was prepared.
  • Sg ⁇ PP / pBBR, Sg ⁇ PP / 3HA1, Sg ⁇ PP / 3HA2, Sg ⁇ PP / 3HA3, Sg ⁇ PP / 3HA4, Sg ⁇ PP / 3HA5, Sg ⁇ PP / 3HA6, Sg ⁇ PP / 3HA7 were inoculated into 5 mL of LB medium containing 25 ⁇ g / mL of kanamycin at 30 ° C. Was shaken and cultured for 1 day. 0.5 mL of the culture solution was inoculated into 5 mL of LB medium containing 25 ⁇ g / mL of kanamycin, and cultured at 30 ° C. for 2 hours with shaking.
  • the cells were washed 3 times with 10% (w / w) glycerol.
  • the washed pellet was suspended in 100 ⁇ L of 10% (w / w) glycerol, mixed with 1 ⁇ L of pBBR1MCS-2 (control), or pMW119 :: EH and then ice-cooled in an electroporation cuvette for 10 minutes.
  • electroporation was performed using Gene pulper (manufactured by Bio-rad) (3 kV, 200 ⁇ , 25 ⁇ F), 1 mL of SOC medium was immediately added, and the cells were cultured with shaking at 30 ° C. for 1 hour.
  • Sg ⁇ PP / pBBRpMW negative control
  • Sg ⁇ PP / HMA1 Sg ⁇ PP / HMA2
  • Sg ⁇ PP / HMA3 Sg ⁇ PP / HMA4
  • Sg ⁇ PP / HMA5 Sg ⁇ PP / HMA6
  • Sg ⁇ PP / HMA7 Sg ⁇ PP / HMA7
  • Reference example 7 Preparation of Serratia microbial variant into which a plasmid that does not lack the function of pyruvate kinase and expresses an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, E and F is prepared by the same method as in Example 7. , Sg / pBBR, Sg / 3HA1, Sg / 3HA2, Sg / 3HA3, Sg / 3HA4, Sg / 3HA5, Sg / 3HA6, Sg / 3HA7 with pMW119 (control) or pMW119 :: EH.
  • strains were designated as Sg / pBBRpMW (negative control), Sg / HMA1, Sg / HMA2, Sg / HMA3, Sg / HMA4, Sg / HMA5, Sg / HMA6, and Sg / HMA7, respectively.
  • Example 8 Production test of ⁇ -hydromuconic acid using a mutant of a Serratia microorganism lacking the function of pyruvate kinase Performed in the same manner as in Example 3 except that ampicillin was added to a medium at a rate of 500 ⁇ g / mL.
  • the mutant prepared in Example 7 was cultured.
  • the concentrations of ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant and the sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 9 shows the yield of ⁇ -hydromuconic acid calculated using the above formula (2) based on the value.
  • Comparative Example 3 Production test of ⁇ -hydromuconic acid using a mutant of a Serratia microorganism that does not lack the function of pyruvate kinase
  • the mutant prepared in Reference Example 7 was cultured in the same manner as in Example 8.
  • the concentrations of ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant and the sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 9 shows the yield of ⁇ -hydromuconic acid calculated using the above formula (2) based on the value.
  • Example 9 Preparation of Escherichia coli mutant in which the function of pyruvate kinase is deficient and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, E and F is introduced.
  • the plasmid pMW119 :: EH prepared in Reference Example 2 was introduced to prepare an Escherichia coli mutant.
  • an Escherichia coli mutant in which the empty vector pMW119 was introduced into Ec ⁇ PP / pBBR prepared in Example 5 was prepared.
  • Ec ⁇ PP / pBBR, Ec ⁇ PP / 3HA1, Ec ⁇ PP / 3HA2, Ec ⁇ PP / 3HA3, Ec ⁇ PP / 3HA4, Ec ⁇ PP / 3HA5, Ec ⁇ PP / 3HA6, Ec ⁇ PP / 3HA7 were inoculated into 5 mL of LB medium containing 25 ⁇ g / mL of kanamycin at 30 ° C. Was shaken and cultured for 1 day. 0.5 mL of the culture solution was inoculated into 5 mL of LB medium containing 25 ⁇ g / mL of kanamycin, and cultured at 30 ° C. for 2 hours with shaking.
  • the cells were washed 3 times with 10% (w / w) glycerol.
  • the washed pellet was suspended in 100 ⁇ L of 10% (w / w) glycerol, mixed with 1 ⁇ L of pBBR1MCS-2 (control), or pMW119 :: EH and then ice-cooled in an electroporation cuvette for 10 minutes.
  • electroporation was performed using Gene pulper (manufactured by Bio-rad) (3 kV, 200 ⁇ , 25 ⁇ F), 1 mL of SOC medium was immediately added, and the cells were cultured with shaking at 30 ° C. for 1 hour.
  • Reference example 8 Preparation of Escherichia coli mutant in which the function of pyruvate kinase is not deleted and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, E and F is introduced.
  • Ec is prepared in the same manner as in Example 9.
  • the obtained strains were designated as Ec / pBBRpMW (negative control), Ec / HMA1, Ec / HMA2, Ec / HMA3, Ec / HMA4, Ec / HMA5, Ec / HMA6, and Ec / HMA7, respectively.
  • Example 10 Production test of ⁇ -hydromuconic acid using a mutant of Escherichia coli lacking the function of pyruvate kinase Example 9 in the same manner as in Example 6 except that ampicillin was added to the medium at a rate of 100 ⁇ g / mL.
  • the mutant prepared in 1 was cultured.
  • the concentrations of ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant and the sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 10 shows the yield of ⁇ -hydromuconic acid calculated using the above formula (2) based on the value.
  • Comparative Example 4 Production test of ⁇ -hydromuconic acid using a mutant of Escherichia coli in which the function of pyruvate kinase is not deficient
  • the mutant prepared in Reference Example 8 was cultured in the same manner as in Example 10.
  • the concentrations of ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant and the sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 10 shows the yield of ⁇ -hydromuconic acid calculated using the above formula (2) based on the value.
  • Example 11 Preparation of Serratia microbial mutant in which the function of pyruvate kinase is deficient and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, D, and G is introduced.
  • Sg ⁇ PP by the same method as in Example 2.
  • PBBR1MCS-2 :: ATCT2OR1, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR2, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR3, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR4, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR5, pBBR1MCS-2 , Or pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR7 was introduced.
  • the plasmid pMW119 EHER prepared in Reference Example 4 was introduced into each of the obtained mutants in the same manner as in Example 7 to prepare a Serratia microbial mutant.
  • the obtained strains were designated as Sg ⁇ PP / ADA1, Sg ⁇ PP / ADA2, Sg ⁇ PP / ADA3, Sg ⁇ PP / ADA4, Sg ⁇ PP / ADA5, Sg ⁇ PP / ADA6, and Sg ⁇ PP / ADA7, respectively.
  • PBBR1MCS-2 :: ATCT2OR1, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR2, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR3, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR3, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR4, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR1, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR3, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR3, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR3, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR4 -2 :: ATCT2OR6 or pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR7 was introduced.
  • the plasmid pMW119 :: EHER prepared in Reference Example 4 was introduced into each of the obtained mutants in the same manner as in Example 7 to prepare a Serratia microbial mutant.
  • the obtained strains were designated as Sg / ADA1, Sg / ADA2, Sg / ADA3, Sg / ADA4, Sg / ADA5, Sg / ADA6, and Sg / ADA7, respectively.
  • Example 12 Production test of adipic acid using a mutant of a Serratia microorganism lacking the function of pyruvate kinase
  • the mutant prepared in Example 11 and Sg ⁇ PP / pBBRpMW (negative control) were cultured in the same manner as in Example 8. did.
  • the concentrations of adipic acid and other products accumulated in the culture supernatant and sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • the quantification of adipic acid was carried out using LC-MS / MS under the same conditions as for 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid.
  • Table 11 shows the yield of adipic acid calculated using the above formula (2) based on the value.
  • Comparative Example 5 Production test of adipic acid using a mutant of a Serratia microorganism that does not lack the function of pyruvate kinase
  • the mutant prepared in Reference Example 9 and Sg / pBBRpMW were cultured in the same manner as in Example 8.
  • the concentrations of adipic acid and other products accumulated in the culture supernatant and sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 11 shows the yield of adipic acid calculated using the above formula (2) based on the value.
  • Example 13 Preparation of Escherichia coli mutant in which the function of pyruvate kinase is deficient and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, D, and G is introduced.
  • PBBR1MCS-2 ATCT2OR1, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR2, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR3, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR4, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR5, pBBR1MCS-2: pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR7 was introduced.
  • the plasmid pMW119 EHER prepared in Reference Example 4 was introduced into each of the obtained mutants in the same manner as in Example 9 to prepare an Escherichia coli mutant.
  • the obtained strains were designated as Ec ⁇ PP / ADA1, Ec ⁇ PP / ADA2, Ec ⁇ PP / ADA3, Ec ⁇ PP / ADA4, Ec ⁇ PP / ADA5, Ec ⁇ PP / ADA6, and Ec ⁇ PP / ADA7, respectively.
  • Reference example 10 Preparation of Escherichia coli mutant in which the function of pyruvate kinase is not deleted and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, C, D, and G is introduced.
  • PBBR1MCS-2 :: ATCT2OR1, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR2, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR3, pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR4, pBBR1MCS-2 created in Reference Example 3 for Escherichia coli MG1655 :: ATCT2OR6 or pBBR1MCS-2 :: ATCT2OR7 was introduced.
  • the plasmid pMW119 EHER prepared in Reference Example 4 was introduced into each of the obtained mutants in the same manner as in Example 9 to prepare an Escherichia coli mutant.
  • the obtained strains were designated as Ec / ADA1, Ec / ADA2, Ec / ADA3, Ec / ADA4, Ec / ADA5, Ec / ADA6, and Ec / ADA7, respectively.
  • Example 14 Production test of adipic acid using a mutant of Escherichia coli lacking the function of pyruvate kinase
  • the mutant prepared in Example 13 and Ec ⁇ PP / pBBRpMW were cultured in the same manner as in Example 10.
  • the concentrations of adipic acid and other products accumulated in the culture supernatant and sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • the quantification of adipic acid was carried out using LC-MS / MS under the same conditions as for 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid.
  • Table 12 shows the yield of adipic acid calculated using the above formula (2) based on the value.
  • Comparative Example 6 Production test of adipic acid using a mutant of Escherichia coli in which the function of pyruvate kinase is not deficient
  • the mutant prepared in Reference Example 10 and Ec / pBBRpMW were cultured in the same manner as in Example 10.
  • the concentrations of adipic acid and other products accumulated in the culture supernatant and sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 12 shows the yield of adipic acid calculated using the above formula (2) based on the value.
  • Example 15 Production test of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid using mutants of Serratia microorganisms lacking pyruvate kinase function 2 The production test of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid under anaerobic conditions was carried out using the Serratia microbial mutant prepared in Example 2.
  • the Serratia microbial mutant prepared in Example 2 was cultured in the same manner as in Example 3 except that the culture using Medium II was performed statically.
  • the concentrations of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant, and the sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 13 shows the yields of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid calculated using the above formula (2) based on the values.
  • Comparative Example 7 Production test of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid using mutants of Serratia microorganisms that do not lack the function of pyruvate kinase 2
  • the mutant prepared in Reference Example 5 was cultured in the same manner as in Example 15.
  • the concentrations of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant, and the sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 13 shows the yields of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid calculated using the above formula (2) based on the values.
  • Example 16 Production test of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid using a mutant of Escherichia coli lacking the function of pyruvate kinase 2 Using the Escherichia coli mutant prepared in Example 5, production tests of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromucon acid were carried out under anaerobic conditions.
  • the Escherichia coli mutant prepared in Example 5 was cultured in the same manner as in Example 6 except that the culture using Medium II was performed statically.
  • the concentrations of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant, and the sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 14 shows the yields of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid calculated using the above formula (2) based on the values.
  • Comparative Example 8 Production test of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid using a mutant of Escherichia coli that does not lack the function of pyruvate kinase 2
  • the mutant prepared in Reference Example 6 was cultured in the same manner as in Example 16.
  • the concentrations of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid and other products accumulated in the culture supernatant, and the sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 14 shows the yields of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid calculated using the above formula (2) based on the values.
  • Example 17 Production test of adipic acid using a mutant of a Serratia genus microorganism lacking the function of pyruvate kinase 2 The production test of adipic acid under anaerobic conditions was carried out using the Serratia microbial mutant prepared in Example 11.
  • the Serratia microbial mutant prepared in Example 11 was cultured in the same manner as in Example 12 except that the culture using Medium II was performed in a static state.
  • the concentrations of adipic acid and other products accumulated in the culture supernatant and sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 15 shows the yield of adipic acid calculated using the above formula (2) based on the value.
  • Comparative Example 9 Production test of adipic acid using a mutant of Serratia marcescens that does not lack the function of pyruvate kinase 2
  • the mutant prepared in Reference Example 9 was cultured in the same manner as in Example 17.
  • the concentrations of adipic acid and other products accumulated in the culture supernatant and sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 15 shows the yield of adipic acid calculated using the above formula (2) based on the value.
  • Example 18 Production test of adipic acid using a mutant of Escherichia coli lacking the function of pyruvate kinase 2 Using the Escherichia coli mutant prepared in Example 13, adipic acid production test was carried out under anaerobic conditions.
  • the Escherichia coli mutant prepared in Example 13 was cultured in the same manner as in Example 14 except that the culture using Medium II was performed statically.
  • the concentrations of adipic acid and other products accumulated in the culture supernatant and sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 16 shows the yield of adipic acid calculated using the above formula (2) based on the value.
  • Comparative Example 10 Production test of adipic acid using a mutant of Escherichia coli that does not lack the function of pyruvate kinase 2
  • the mutant prepared in Reference Example 10 was cultured in the same manner as in Example 18.
  • the concentrations of adipic acid and other products accumulated in the culture supernatant and sugar remaining unused in the medium were quantified.
  • Table 16 shows the yield of adipic acid calculated using the above formula (2) based on the value.
  • Example 19 Preparation of gene variants of Seratia microorganisms lacking pyruvate kinase gene and phosphotransferase gene
  • the pyruvate kinase and phospho by deleting ptsG which is a gene encoding phosphotransferase possessed by the Sg ⁇ PP strain prepared in Example 1.
  • a microbial variant of the genus Seratia which lacked the function of a transferase system enzyme, was prepared.
  • PCR was performed using pKD4 as a template and oligo DNAs of SEQ ID NOs: 239 and 240 as primers to obtain a PCR fragment having a sequence length of 1.6 kb for ptsG deficiency. After introducing pKD46 into the strain, a PCR fragment for ptsG deficiency was introduced. Colony direct PCR was performed using the obtained kanamycin-resistant strain, and deletion of the target gene and insertion of the kanamycin resistance gene were confirmed from the band length. The primers used were oligo DNAs of SEQ ID NOs: 223 and 242.
  • PCP20 was introduced into an ampicillin-sensitive strain, and an ampicillin-resistant strain was obtained again. Colony direct PCR was performed using the obtained strain, and the loss of the kanamycin resistance gene was confirmed from the band length.
  • the primers used were oligo DNAs of SEQ ID NOs: 241 and 242.
  • PCP20 was shed from the kanamycin-sensitive strain.
  • the obtained strain will be hereinafter referred to as Sg ⁇ PPG.
  • Example 20 Preparation of a gene variant of a Serratia genus microorganism lacking a pyruvate kinase gene and a phosphotransferase gene and introducing a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, E and F Sg ⁇ PPG prepared in Example 19
  • the plasmid pBBR1MCS-2 :: ATCTL1 prepared in Reference Example 1 was introduced into the strain by the same method as in Example 2, and the obtained Serratia microbial variant was designated as Sg ⁇ PPG / 3HA1.
  • Example 21 3-Hydroxyadipic acid and ⁇ - using Serratia microbial variants that lack the functions of pyruvate kinase and phosphotransferases and have introduced plasmids that express enzymes that catalyze reactions A, B, E and F.
  • Production test of hydromucon acid Using the Serratia microbial variant prepared in Example 20, the production test of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromucon acid was carried out in the same manner as in Example 15.
  • Comparative Example 11 3-Hydroxyadipic acid and ⁇ using Serratia microbial variants introduced with a plasmid that does not lack the functions of pyruvate kinase and phosphotransferase and expresses enzymes that catalyze reactions A, B, E and F.
  • -Hydromconic acid production test Using the Sg / 3HA1 strain prepared in Reference Example 5, a production test of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid was carried out in the same manner as in Comparative Example 7.
  • Example 21 Comparing the results of Example 21 with the results of Example 15, a reaction in which the pyruvate kinase and phosphotransferase system enzyme genes are deleted and 3-oxoadipyl-CoA is reduced to produce 3-hydroxyadipyl-CoA. It was found that the yields of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid were further improved in the Serratia microbial mutant with enhanced enzymatic activity to catalyze. Comparing the results of Example 21 and Comparative Example 11, the yields of acetic acid and ethanol produced by the conversion of acetyl-CoA are also improved in the mutant lacking the genes of pyruvate kinase and phosphotransferase system enzymes. I also found out.
  • Example 22 Preparation of mutants of Escherichia coli lacking pyruvate kinase gene and phosphotransferase gene
  • PCR was performed using pKD4 as a template and oligo DNAs of SEQ ID NOs: 243 and 244 as primers to obtain a PCR fragment having a sequence length of 1.6 kb for ptsG deficiency. After introducing pKD46 into the strain, a PCR fragment for ptsG deficiency was introduced. Colony direct PCR was performed using the obtained kanamycin-resistant strain, and deletion of the target gene and insertion of the kanamycin resistance gene were confirmed from the band length. The primers used were oligo DNAs of SEQ ID NOs: 223 and 246.
  • Example 23 Preparation of mutants of Escherichia coli in which a pyruvate kinase gene and a phosphotransferase gene are deficient and a plasmid expressing an enzyme that catalyzes reactions A, B, E, and F is introduced. Then, pBBR1MCS-2 :: ATCTL1 prepared in Reference Example 1 was introduced by the same method as in Example 5, and the obtained Escherichia coli mutant was designated as Ec ⁇ PPG / 3HA1.
  • Example 24 3-Hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid using Escherichia coli variants that lack the functions of pyruvate kinase and phosphotransferases and have introduced plasmids that express enzymes that catalyze reactions A, B, E and F.
  • Production test of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid were carried out in the same manner as in Example 16 using the Escherichia coli variant prepared in Example 23.
  • Comparative Example 12 3-Hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromucon using Escherichia coli variants introduced with a plasmid that does not lack the functions of pyruvate kinase and phosphotransferase and expresses enzymes that catalyze reactions A, B, E and F. Acid Production Test Using Ec / 3HA1 prepared in Reference Example 6, a production test of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid was carried out in the same manner as in Comparative Example 8.
  • Example 24 Comparing the results of Example 24 with the results of Example 16, a reaction in which the genes for pyruvate kinase and phosphotransferase are deleted and 3-oxoadipyl-CoA is reduced to produce 3-hydroxyadipyl-CoA. It was found that the yields of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid were further improved in the Escherichia coli mutant with enhanced enzymatic activity to catalyze. Comparing the results of Example 24 and Comparative Example 12, the yields of acetic acid and ethanol produced by the conversion of acetyl-CoA are also improved in the mutant lacking the genes of pyruvate kinase and phosphotransferase. I also found out.

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Abstract

要約 ３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸またはアジピン酸を高い収率で生産する遺伝子改変微生物が開示されている。遺伝子改変微生物は、以下（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードする核酸を導入、又は該ポリペプチドの発現を増強し、かつピルビン酸キナーゼの機能を欠損させたものである。（ａ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｂ）これらのいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（ｃ）これらのいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド

Description

３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
　本発明は、目的物質の生産に関与するポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物および当該微生物を用いた物質製造方法に関する。
　３－ヒドロキシアジピン酸（ＩＵＰＡＣ名：３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｅｄｉｏｉｃ　ａｃｉｄ）、α－ヒドロムコン酸（ＩＵＰＡＣ名：（Ｅ）－ｈｅｘ－２－ｅｎｅｄｉｏｉｃ　ａｃｉｄ）およびアジピン酸（ＩＵＰＡＣ名：ｈｅｘａｎｅｄｉｏｉｃ　ａｃｉｄ）は炭素数６のジカルボン酸である。これらは多価アルコールと重合することでポリエステルとして、また多価アミンと重合することでポリアミドの原料として用いることができる。また、これらの末端にアンモニアを付加してラクタム化することで、単独でもポリアミドの原料になり得る。
　微生物を利用した３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸の製造に関連して以下の文献が知られている。
　特許文献１には、代謝経路を改変した微生物を用いた１，３－ブタジエンの製造方法が記載されており、当該文献中では、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから１，３－ブタジエンが生合成される代謝経路における代謝中間体として３－ヒドロキシアジピン酸（３－ヒドロキシアジペート）が記載されている。
　特許文献２には、代謝経路を改変した微生物を用いたムコン酸の製造方法が記載されており、当該文献中では、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡからｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ－ムコン酸が生合成される代謝経路における代謝中間体としてα－ヒドロムコン酸（２，３－デヒドロアジペート）が記載されている。
　特許文献３、４には、非天然の微生物を用いたアジピン酸やヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）の製造方法が記載されており、当該文献中で、これらの物質は、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡが合成される反応が生合成経路に含まれる点で共通しているが、３－オキソアジピル－ＣｏＡ以降の生合成経路は別々であると記載されている。さらに、特許文献３では、ＨＭＤＡの製造において、増殖と共役したＨＭＤＡの形成を改善するための代謝経路の追加的な遺伝子欠失としてピルビン酸キナーゼが記載されているが、ピルビン酸キナーゼの欠損が、アジピン酸の生産性向上に関係するとの記載はない。
　また、特許文献１から４に記載された生合成経路では、いずれも３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへと還元する酵素反応を経由するとの記載がある。
　特許文献５および特許文献６には、セラチア属微生物を用いた３－ヒドロキシアジピン酸と、α－ヒドロムコン酸の製造方法がそれぞれ記載されている。当該文献中には、特に、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡより３－オキソアジピル－ＣｏＡを生じる反応を触媒するアシルトランスフェラーゼの活性を強化することにより、３－ヒドロキシアジピン酸とα－ヒドロムコン酸の生産効率を向上させることが可能であることが開示されているが、ピルビン酸キナーゼに関する記載はない。
　また、特許文献７には、インシリコ分析に基づく微生物の改良方法が開示されており、大腸菌のピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素をコードする遺伝子であるｐｙｋＦ、ｐｙｋＡ、ｐｔｓＧを欠失させ、嫌気条件下で培養することにより、コハク酸の生産性が向上することが開示されている。
特表２０１３－５３５２０３号公報 米国特許出願公開第２０１１／０１２４９１１Ａ１号明細書 特開２０１５－１４６８１０号公報 特表２０１１－５１５１１１号公報 国際公開第２０１７／２０９１０２号 国際公開第２０１７／２０９１０３号 特表２００８－５２７９９１号公報
　特許文献１または２には、微生物内で３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸が生成しうる代謝経路の記載はあるが、代謝を３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸で止め、培養液中に分泌させるという記載はない。また、特許文献１から４に記載された３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへと還元する反応を触媒する酵素をコードする核酸を導入した非天然の微生物を用いて、実際に３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸またはアジピン酸が製造できるかどうかの検証はなされていない。従って特許文献１から４に記載された３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへと還元する反応を触媒する酵素についても、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の製造において優れた活性を示す当該酵素の存在は未だ知られていなかった。
　そこで本発明では、３－オキソアジピル－ＣｏＡを基質とした還元反応において優れた活性を示す酵素をコードする核酸を導入、または当該酵素の発現を増強した遺伝子改変微生物を基にさらに代謝経路を改変して、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を高い収率で製造するための遺伝子改変微生物および当該改変微生物を用いた物質製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記目的を達成するため鋭意検討した結果、３－オキソアジピル－ＣｏＡを基質とした還元反応において優れた活性を示す酵素をコードする核酸を導入、または当該酵素の発現を増強し、さらに、ピルビン酸キナーゼの機能を欠損させた遺伝子改変微生物は、高い収率で３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を製造可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）以下（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強し、かつピルビン酸キナーゼの機能を欠損させた遺伝子改変微生物：
 （ａ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、
　（ｂ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド、
　（ｃ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド。
（２）前記（ｂ）および（ｃ）から選択されるポリペプチドが、配列番号１７３のアミノ酸配列からなる領域を含む、（１）記載の遺伝子改変微生物。
（３）前記配列番号１７３のアミノ酸配列において、Ｎ末端側から１３番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンまたはロイシンであり、Ｎ末端側から１５番目のアミの酸残基がロイシンまたはグルタミンであり、Ｎ末端側から１６番目のアミノ酸残基がリシンまたはアスパラギンであり、Ｎ末端側から１７番目のアミノ酸残基がグリシンまたはセリンであり、Ｎ末端側から１９番目のアミノ酸残基がプロリンまたはアルギニンであり、Ｎ末端側から２１番目のアミノ酸残基がロイシン、メチオニンまたはバリンである、（２）記載の遺伝子改変微生物。
（４）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属からなる群から選ばれる微生物の遺伝子改変体である、（１）～（３）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
（５）アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する能力並びに３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する能力を有する、（１）～（４）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
（６）アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する能力並びに２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成する能力を有する、（１）～（４）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
（７）アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する能力、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからアジピル－ＣｏＡを生成する能力並びにアジピル－ＣｏＡからアジピン酸を生成する能力を有する、（１）～（４）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
（８）さらにホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能を欠損させた、（１）～（７）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
（９）（１）～（５）および（８）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法。
（１０）（１）～（４）、（６）および（８）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、α－ヒドロムコン酸の製造方法。
（１１）（１）～（４）、（７）および（８）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、アジピン酸の製造方法。
（１２）Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子にコードされるポリペプチドをコードする核酸を導入または当該ポリペプチドの発現を増強し、かつピルビン酸キナーゼの機能を欠損させた遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸およびアジピン酸からなる群から選ばれる１つ以上の物質の製造方法。
（１３）前記遺伝子改変微生物がさらにホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能を欠損させた微生物である、（１２）に記載の方法。
　本発明に係る遺伝子改変微生物は、３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへの還元反応において優れた活性を示す酵素を発現し、さらにピルビン酸キナーゼの機能が欠損していることによって、ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない親株の微生物と比較して、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を高い収率で生産することができる。
　本発明に係る物質製造方法は、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを経由して生成する３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の生産性に優れる遺伝子改変微生物を用いるため、これらの物質の生産性を大幅に向上させることができる。
３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子と、５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子とが構成する遺伝子クラスターを示す図である。
　本発明の微生物は、以下（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強し、かつピルビン酸キナーゼの機能を欠損させた遺伝子改変微生物である。
（ａ）配列番号１～７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１～７のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１～７のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する活性を有するポリペプチド
　以下、本明細書中では３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素を「３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ」と記載する。また、本明細書では３－ヒドロキシアジピン酸を３ＨＡ、α－ヒドロムコン酸をＨＭＡ、アジピン酸をＡＤＡと略すことがある。
　本発明で核酸を導入するとは、微生物の菌体外から菌体内へと核酸を導入し、該微生物に該核酸がコードするポリペプチドの生産能を付与することを指す。導入する方法は特に限定されず、微生物内で自律複製可能な発現ベクターに当該核酸を組み込み宿主微生物に導入する方法や、微生物のゲノムに当該核酸を組み込む方法などを用いることができる。
　本発明でポリペプチドの発現を増強するとは、微生物が元来有しているポリペプチドの発現を増強することを指す。発現を増強する方法は特に限定されないが、当該ポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増加させる方法、当該ポリペプチドのコーディング領域上流のプロモーター領域やリボソーム結合配列を改変する方法などが挙げられる。これらの方法は単独で行ってもよいし、組み合わせてもよい。
　また、導入する核酸は１種類でも複数種類でもよい。また核酸の導入とポリペプチドの発現の増強を組み合わせてもよい。
　本発明で用いる、配列番号１～７のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの酵素活性を有するポリペプチドついて、「１もしくは数個」の範囲は、１０個以内が好ましく、さらに好ましくは５個以内、特に好ましくは４個以内、最も好ましくは１個または２個以内である。ここで、アミノ酸が置換される場合、性質が類似したアミノ酸に置換された場合（いわゆる保存的置換）にポリペプチドの活性が維持される可能性が高くなる。すなわち、アミノ酸が置換する場合、類似した性質のアミノ酸に置換しても生理活性が維持される場合が多いので、置換の場合は、類似した性質のアミノ酸に置換したものが好ましい。すなわち、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｙｒ，Ｃｙｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ，Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ）のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多い。
　本発明で用いる、配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの酵素活性を有するポリペプチドについて、配列同一性の好ましい範囲は、８０％以上が好ましく、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
　本発明で「配列同一性」とは、２つのアミノ酸配列または塩基配列にギャップを導入して、またはギャップを導入しないで整列させた場合の、最適なアライメントにおいて、オーバーラップする全アミノ酸配列（翻訳開始点となるアミノ酸を含む）または塩基配列（開始コドンを含む）に対する同一アミノ酸または塩基の割合（パーセンテージ）を意味し、式（１）によって算出する。式（１）において、比較する短い方の配列長は４００アミノ酸以上であり、４００アミノ酸未満の場合には配列同一性は定義されない。配列同一性は、この分野で汎用されているアルゴリズムであるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用いて容易に調べることができる。例えばＢＬＡＳＴは、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ）などのウェブサイトから誰でも利用可能であり、デフォルトのパラメーターを用いて容易に配列同一性を調べることができる。また、配列同一性はＧｅｎｅｔｙｘなどのソフトウェアに搭載されている同様の機能を用いても調べることができる。
　配列同一性（％）＝一致数（ギャップ同士はカウントしない）／短い方の配列長（両端のギャップを含まない長さ）×１００・・・式（１）。
　式（１）に従い、Ｇｅｎｅｔｙｘの機能（％Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　Ｍａｔｒｉｘ）を用いて配列番号１～７に記載のアミノ酸配列間の配列同一性を算出すると、最も配列同一性の値が低い配列番号２と４との値は７１．５１％となり、配列番号１～７に記載のアミノ酸配列は、お互いに少なくとも７０％以上の配列同一性を有している。Ｇｅｎｅｔｙｘを用いた配列同一性の算出結果を表１に示す。なお、下記表１～表５において、一番左側の数字は配列番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　配列番号１～７に記載の各アミノ酸配列をＱｕｅｒｙとして、ＮＣＢＩのアミノ酸データベース（Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に登録されている全アミノ酸配列との配列同一性を、ＢＬＡＳＴＰを用いて調べた結果、配列同一性が７０％以上の配列は全てＳｅｒｒａｔｉａ属細菌由来であった。
　前記（ａ）の配列番号１～７に記載のポリペプチドは、いずれもＮ末端側からのアミノ酸残基１５～３８番目（以下、便宜的に、Ｎ末端側から何番目のアミノ酸残基かを、「ａ．ａ．」で表すことがある。したがって、例えば、Ｎ末端側からのアミノ酸残基１５～３８番目は、単に「１５～３８ａ．ａ．」と表すことがある）において配列番号１７３に示す２４アミノ酸残基からなる共通配列１を有している。共通配列１において、Ｘａａは任意のアミノ酸残基であるが、１３ａ．ａ．は好ましくはフェニルアラニンまたはロイシンであり、１５ａ．ａ．は好ましくはロイシンまたはグルタミンであり、１６ａ．ａ．は好ましくはリシンまたはアスパラギンであり、１７ａ．ａ．はグリシンまたはセリン、より好ましくはグリシンであり、１９ａ．ａ．は好ましくはプロリンまたはアルギニンであり、２１ａ．ａ．は好ましくはロイシン、メチオニンまたはバリンである。共通配列１は、ＮＡＤ＋結合残基およびその周辺のアミノ酸残基にあたる。ＮＡＤ＋結合残基は、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．　２０１２　Ｆｅｂ；９４（２）：４７１－８．で示されているように、共通配列１の２４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であるが、共通配列１ではアスパラギンである点が特徴である。共通配列１を有することによって、配列番号１～７に記載のポリペプチドは、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼとしての優れた酵素活性を示すと考える。
　前記（ｂ）および（ｃ）に記載のポリペプチドについても、１～２００ａ．ａ．以内に配列番号１７３に示す２４アミノ酸残基からなる共通配列１を有していることが好ましい。より好ましい共通配列の位置は、１～１５０ａ．ａ．以内であり、さらに好ましくは、１～１００ａ．ａ．以内である。その具体例としては、配列番号８～８６のアミノ酸配列が挙げられる。配列番号８～８６のアミノ酸配列は、１５～３８ａ．ａ．において配列番号１７３に示す２４アミノ酸残基からなる共通配列１を有している。なお、配列番号８～８６のアミノ酸配列は、配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上である。Ｇｅｎｅｔｙｘを用いた配列同一性の算出結果を表２－１から表２－３および表３－１から表３－３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　本発明の（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸は、当該ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端にさらなるペプチドまたはタンパク質が付加されるような配列を含んでいてもよい。このようなペプチドまたはタンパク質としては、例えば、分泌シグナル配列、輸送タンパク質、結合タンパク質、精製用のタグペプチド、蛍光タンパク質等を含むものが例示できる。こうしたペプチドまたはタンパク質に関しては、当業者が目的に応じて、付加する機能を有するペプチドまたはタンパク質を選択して、本発明のポリペプチドに付加することができる。なお、アミノ酸配列の配列同一性には、このようなペプチドまたはタンパク質は含まれない。
　配列番号１～８６に記載のポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１～８６に記載のアミノ酸配列に翻訳されうるような塩基配列であれば特に限定されず、各アミノ酸に対応するコドン（標準遺伝暗号）を参考に決定することができる。その際、本発明に使用する宿主微生物にとってよく使用されているコドンで塩基配列を再設計してもよい。
　配列番号１～８６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸の塩基配列の具体例としては、それぞれ、配列番号８７～１７２に記載の塩基配列が挙げられる。
　本発明において、ある核酸がコードするポリペプチドが、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有しているかどうかは、以下の形質転換株Ａと形質転換株Ｂを作製し、培養試験の結果、培養液中に３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸を確認することができれば、当該核酸が３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードしていると判断する。判断方法を下記スキーム１に示す生合成経路を用いて説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　上記スキーム１は、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸、および／またはアジピン酸を生産するために必要な反応経路の例を示している。ここで、反応Ａは、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する反応を示す。反応Ｂは、３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｃは、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｄは、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからアジピル－ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｅは３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応を示す。反応Ｆは、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成する反応を示す。反応Ｇは、アジピル－ＣｏＡからアジピン酸を生成する反応を示す。
　形質転換株Ａは、反応Ａ，反応Ｅおよび反応Ｆを触媒する酵素を有する。形質転換株Ｂは、反応Ａ、反応Ｃ、反応Ｅおよび反応Ｆを触媒する酵素を有する。
　まず、形質転換株Ａを作製する。反応Ａ、反応Ｅおよび反応Ｆをそれぞれ触媒する酵素を発現するプラスミドを作製する。なお、反応ＥとＦは同一の酵素で反応を触媒することが可能である。当該プラスミドを、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸、およびアジピン酸のいずれも生産する能力のない微生物株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入する。得られた形質転換株に対し、酵素活性の有無を調べる対象となるポリペプチドをコードする核酸を適当なプロモーターの下流に組み込んだ発現プラスミドを導入し、形質転換株Ａを得る。形質転換株Ａを培養し、培養後の培養液に３－ヒドロキシアジピン酸が含まれているかどうかを確認する。３－ヒドロキシアジピン酸が培養液中に確認できた場合、次に形質転換株Ｂを作製する。形質転換株Ｂは、形質転換株Ａに対し、反応Ｃを触媒する酵素を発現するプラスミドを作製して導入することで得る。形質転換株Ｂを培養し、培養後の培養液にα－ヒドロムコン酸が含まれているかどうかを確認する。培養後の培養液にα－ヒドロムコン酸が含まれることを確認することができれば、形質転換株Ａが生産した３－ヒドロキシアジピン酸および形質転換株Ｂが生産したα－ヒドロムコン酸は、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを経由して生成されたことがわかるため、対象となるポリペプチドが３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有していると判断する。
　反応Ａを触媒する酵素をコードする遺伝子として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のｐｃａＦ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１０４１７５５、配列番号１７４）を用いる。
　反応ＥおよびＦを触媒する酵素をコードする遺伝子として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のｐｃａＩおよびｐｃａＪ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１０４６６１３、１０４６６１２、配列番号１７５、１７６）の全長を含む連続した配列を用いる。ｐｃａＩおよびｐｃａＪがコードするポリペプチドは、複合体を形成することによって反応Ｅと反応Ｆを触媒する。
　反応Ｃを触媒する酵素をコードする核酸として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株遺伝子ｐａａＦ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１０４６９３２、配列番号１７７）を用いる。
　形質転換株Ａ、形質転換株Ｂの培養方法は、以下のとおりである。なお培養の際には、プラスミドを安定に保持するための抗生物質や、組み込んだ核酸がコードするポリペプチドの発現を誘導する物質を適宜加えることができる。ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）５ｍＬに、形質転換株ＡまたはＢを一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で１８時間振とう培養し、前培養液とする。続いて当該前培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（コハク酸１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ）５ｍＬに添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養する。得られた培養液中に３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸が含まれているかを確認する。
　培養液中に３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸が含まれることは、培養液を遠心し、上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析することにより確認できる。分析の条件は以下のとおりである。
・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ　ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ－Ｑｕａｄ　ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ　ネガティブモード。
　３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの活性の値は、３－オキソアジピン酸から酵素反応で調製した３－オキソアジピル－ＣｏＡを基質として、精製３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼを用いて生成する３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを測定することで算出できる。具体的な方法は、以下の通りである。
　３－オキソアジピン酸は公知の方法（例えば、ＷＯ２０１７／０９９２０９の参考例１に記載された方法）により調製することができる。
　３－オキソアジピル－ＣｏＡ溶液の調製：常法に従いＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸（ｐｃａＩおよびｐｃａＪ、ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３および１０４６６１２）の全長を増幅する。なお、このＰＣＲで用いるプライマーの塩基配列は、例えば配列番号１９４および１９５である。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の３－オキソアジピル－ＣｏＡ調製用酵素反応溶液を調製し、２５℃で３分分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液を３－オキソアジピル－ＣｏＡ溶液とする。
　（酵素反応溶液）
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．５ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
５ｍＭ　３－ｏｘｏａｄｉｐｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ
２μＭ　ＣｏＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸全長を増幅する。なお、このＰＣＲで用いるプライマーの塩基配列は、例えば配列番号１９６および１９７である。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＢａｍＨＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ溶液を得る。３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性は、本酵素溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、２５℃における３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡの生成量を測定することで確認できる。
　（酵素反応溶液）
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
１５０μＬ／ｍＬ　３－ｏｘｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ
０．５ｍＭ　ＮＡＤＨ
１ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
１０μＭ　３－ｏｘｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ。
　本発明で、（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物は、（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸を元来有している微生物を宿主として、当該宿主微生物が有する（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドの発現を、遺伝子改変により増強した微生物である。
　（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸を元来有している微生物の具体例は、以下のＳｅｒｒａｔｉａ属微生物が挙げられる。Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（配列番号１、１８～２８、３０～３３、３５～６６、６９、７０、７２～７８、７９を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ（配列番号２、２９、６７を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ（配列番号３、７９～８４、８６を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ（配列番号４、８５を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ（配列番号５を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＢＷ１０６（配列番号６を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（配列番号７を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　Ｓ１１９（配列番号８を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＹＤ２５（配列番号９を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＦＳ１４（配列番号１０を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＨＭＳＣ１５Ｆ１１（配列番号１１を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＪＫＳ０００１９９（配列番号１２を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＴＥＬ（配列番号１３を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＩＳＴＤ０４（配列番号１４を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＳＣＢＩ（配列番号１５を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　Ｓ４（配列番号１６を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　Ｃ－１（配列番号１７を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＯＭＬＷ３（配列番号３４を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＯＬＥＬ１（配列番号６８を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＯＬＥＬ２（配列番号７１を有する微生物）などが挙げられる。
　上記した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に記載したポリペプチドは、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性をも兼備しており、この３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子によりコードされるものである。
　ここで、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子において、「遺伝子クラスター」とは、関連する機能を有する一連の核酸群が近接して存在する領域を意味する。遺伝子クラスターの具体的な構成要素としては、例えば単一の転写制御因子により転写調節される核酸群、単一の転写プロモーター制御下で転写されるオペロンなどが挙げられる。ある核酸が遺伝子クラスターを構成する核酸であるかどうかは、オンラインでａｎｔｉＳＭＡＳＨなどの遺伝子クラスター検索プログラムを用いて調べることもできる。また、あるポリペプチドが３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼあるいは５－アミノレブリン酸シンターゼに分類されるかどうかは、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ）などのウェブサイトでＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）検索を行い、当該ポリペプチドのアミノ酸配列との相同性が高い酵素を調べることでわかる。例えば配列番号４のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのデータベース上で、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ：ＡＢＶ４０９３５．１として登録されており、アミノ酸配列から、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質であると推定されることが記載されている。また、配列番号４のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ＮＣＢＩのデータベース上で、Ｇｅｎｅ　ＩＤ：ＣＰ０００８２６．１として登録されており、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ　５６８のゲノム上に保存されていること、またＧｅｎｅ　ＩＤ：ＣＰ０００８２６．１の位置２０１５３１３から２０１６８４２に保存されていることが検索できる。さらに、この遺伝子の位置情報から、その前後の遺伝子配列を確認することができ、５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ：ＡＢＶ４０９３３．１）と図１に示す遺伝子クラスターを構成することも確認できる。同様に、配列番号１～３、６～２０、２２～３０、３２～３５、３７、３８、４０、４２～４８、５１～５６、５９～６３、６５、６６、６８～７３、７５～８１、８３～８５のアミノ酸配列については、表３－４、表３－５に示すプロテインＩＤとＧｅｎｅ　ＩＤによって、ＮＣＢＩ上でその情報を確認することが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　以下、本明細書中では、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子にコードされるポリペプチドをコードする核酸を、「本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子」と記載し、当該３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子がコードするポリペプチドを、「本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」と記載する。
　本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる遺伝子クラスターは、少なくとも３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子および５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子を含んでいれば、他の核酸がクラスターに含まれていてもよい。図１に本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる遺伝子クラスターの具体例を示す。
　当該遺伝子クラスターを有するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物の具体例は、Ｓ．　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ、Ｓ．　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓ．　ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ、Ｓ．　ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ、Ｓ．　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＢＷ１０６、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　Ｓ１１９、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＹＤ２５、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＦＳ１４、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＨＭＳＣ１５Ｆ１１、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＪＫＳ０００１９９、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＴＥＬ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＩＳＴＤ０４、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＳＣＢＩ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　Ｓ４、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　Ｃ－１、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＯＭＬＷ３、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＯＬＥＬ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＯＬＥＬ２、Ｓ．　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓなどが挙げられる。
　本発明で用いる、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、優れた３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有している。３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする核酸が、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有しているかどうかは、上記と同様の方法で確認することができる。
　本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子がコードするポリペプチドは、共通配列１を有していることを特徴とする。このようなポリペプチドのアミノ酸配列の具体例としては、配列番号１～８６のアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明では、前記共通配列１を有していれば、配列番号８～８６のいずれのポリペプチドのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸も好ましく用いることができる。ここで、「１もしくは数個」の範囲は、１０個以内が好ましく、さらに好ましくは５個以内、特に好ましくは４個以内、最も好ましくは１個または２個以内である。ここで、アミノ酸が置換される場合、性質が類似したアミノ酸に置換された場合（すなわち、上記した保存的置換）にポリペプチドの活性が維持される可能性が高くなる。また、配列番号８～８６のいずれのポリペプチドのアミノ酸配列と、配列同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸も好ましく用いることができる。
　一方で、本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼには該当しないが、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの活性を有しているポリペプチドとして、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のＰａａＨ（配列番号１７８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株由来のＰａａＨ（配列番号１７９）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ　ＡＤＰ１株由来のＤｃａＨ（配列番号１８０）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ　ＮＢＲＣ１０２５９９株由来のＰａａＨ（配列番号１８１）などが挙げられるが、これらのポリペプチドには、表４および表５に示すように共通配列１が含まれていないことがわかる。なお、これらのポリペプチドは、（ｂ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド、または（ｃ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチドには該当しない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　本発明でピルビン酸キナーゼやホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能を欠損させるとは、これら酵素活性を欠損させることである。機能を欠損させる方法は特に限定されないが、例えば、当該酵素をコードする遺伝子を、遺伝子変異剤、紫外線照射などによる遺伝子変異処理、部位特異的変異法等による塩基配列の一部や全部の欠損処理、塩基配列へのフレームシフト変異の導入、塩基配列へのストップコドンの挿入等により、欠損させることにより行うことができる。また、遺伝子組換え技術を用いて、塩基配列の全部または一部を除去したり、他の塩基配列と置換したりすることでも遺伝子の欠損を行うことができる。これらの中で好ましくは塩基配列の一部もしくは全体を欠損させる方法が好ましい。
　ピルビン酸キナーゼはＥＣ２．７．１．４０に分類され、ホスホエノールピルビン酸（本明細書中ではＰＥＰと記載する場合がある。）を脱リン酸化し、ピルビン酸およびＡＴＰに変換する反応を触媒する酵素である。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株由来のｐｙｋＦ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１６１９１、配列番号１８２）、ｐｙｋＡ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１６３６８、配列番号１８３）、およびＳｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７株由来のｐｙｋＦ（配列番号１８４）、ｐｙｋＡ（配列番号１８５）などが挙げられる。
　下記スキーム２の代謝経路に示されるように、本発明で用いる微生物がピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子を２個以上有する場合は、全てのピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることが好ましい。本発明で用いる微生物が有する遺伝子がコードするポリペプチドがピルビン酸キナーゼであるかどうかは、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ）などのウェブサイトでＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）検索を行えばよい。または
　本発明の遺伝子改変微生物は、さらにホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損させることが好ましい。ホスホトランスフェラーゼ系酵素とは、ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ（ＰＥＰ）－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ（ＰＴＳ）を指す（本明細書中では、ＰＴＳ酵素と記載することがある。）ＰＴＳは、下記スキーム２の代謝経路に示されるように、ヘキソース、ヘキシトール、二糖などの炭水化物を細胞内に取り込むための主要な仕組みである。ＰＴＳにおいて、炭水化物は細胞内に取り込まれると同時にリン酸エステルへと変換され、一方リン酸供与体であるＰＥＰはピルビン酸へと変換するため、ＰＴＳ酵素遺伝子を欠損した微生物変異体では、ＰＥＰからピルビン酸への変換反応が阻害される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　ＰＴＳ酵素は、炭水化物の種類によらず機能するｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｓｕｇａｒ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｅｎｚｙｍｅＩおよびｐｈｏｓｐｈｏ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＨＰｒの２種類の共通酵素と、特定の炭水化物に特異的なｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ　ｓｕｇａｒ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅｓ（ｅｎｚｙｍｅＩＩ）で構成される。ｅｎｚｙｍｅＩＩはさらにｓｕｇａｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＩＩＡ、ＩＩＢ、およびＩＩＣ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔで構成される。ｅｎｚｙｍｅＩＩの酵素は生物種によって個別あるいは複数ドメインタンパクとしてつながった状態で存在する。微生物では、ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｓｕｇａｒ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｅｎｚｙｍｅＩはｐｔｓＩ遺伝子、ｐｈｏｓｐｈｏ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＨＰｒはｐｔｓＨ遺伝子、グルコース特異的ＩＩＡはｃｒｒ遺伝子、同じくグルコース特異的ＩＩＢおよびＩＩＣはｐｔｓＧ遺伝子にそれぞれコードされている。ｐｔｓＧ遺伝子がコードする酵素は、ＥＣ２．７．１．１９９に分類され、ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｎｐｉ－ｐｈｏｓｐｈｏｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅと呼ばれる。
　本発明では、上記のＰＴＳ酵素遺伝子のうち、１種類を欠損させてもよいし、複数を欠損させてもよい。上記のＰＴＳ酵素遺伝子のいずれを欠損させてもよいが、好ましくはグルコースの取り込みに関与する酵素遺伝子を欠損させることが好ましく、特にｐｔｓＧ遺伝子を欠損させることが好ましい。ｐｔｓＧ遺伝子の具体例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株由来のｐｔｓＧ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：９４５６５１）およびＳｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７株由来のｐｔｓＧ（配列番号２３８）などが挙げられる。
　本発明で用いる微生物が有する遺伝子がコードするポリペプチドがｐｒｏｔｅｉｎ－Ｎｐｉ－ｐｈｏｓｐｈｏｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅであるかどうかは、ＮＣＢＩやＫＥＧＧなどのウェブサイトでＢＬＡＳＴ検索を行えばよい。
　後述のとおり、大腸菌は３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物であり、特表２００８－５２７９９１号公報では、大腸菌のピルビン酸キナーゼをコードするｐｙｋＦおよびｐｙｋＡ並びにホスホトランスフェラーゼ系酵素をコードするｐｔｓＧ遺伝子を欠損させた遺伝子改変株を作製したこと、また当該遺伝子改変株を嫌気的条件で培養すると、コハク酸の収率が増加し、酢酸およびエタノールの収率が減少することが記載されている。ここで酢酸およびエタノールは、上記スキーム２の代謝経路に示すように、アセチル－ＣｏＡから代謝される化合物である。つまり、特表２００８－５２７９９１号公報では、大腸菌のｐｔｓＧ、ｐｋＦ、ｐｙｋＡ遺伝子を欠損させることにより、アセチル－ＣｏＡの供給量が低下し、酢酸およびエタノールの収率が低下したと推定される。
　本発明の方法で製造する３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸は、前述のとおり、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから反応Ａによって生産される３－オキソアジピル－ＣｏＡから複数の反応を介して代謝される化合物である。よって、特表２００８－５２７９９１号公報の記載から、ピルビン酸キナーゼとホスホトランスフェラーゼ系酵素の遺伝子を欠損させると、アセチル－ＣｏＡの供給量の低下により３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の収率も低下することが予想される。しかし、本発明では、上記の予想に反して、３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへの還元反応において優れた活性を示す酵素を発現した遺伝子改変微生物において、ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の遺伝子を欠損させることで、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の収率が向上し、かつ酢酸およびエタノールの収率も向上する。
　本発明で遺伝子改変微生物を得るための宿主として用いることができる微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属およびＣａｎｄｉｄａ属に属する微生物が挙げられる。これらの中でも、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物が好ましい。
　本発明の遺伝子改変微生物を用いて３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を製造する方法を説明する。
　３－ヒドロキシアジピン酸を製造する能力を有する微生物としては、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、および３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成（反応Ｅ）する能力を有する微生物を利用する。これらの生成能力を有する微生物を宿主微生物とすることで、３－ヒドロキシアジピン酸を高生産することができる本発明の遺伝子改変微生物を取得することができる。
　前記反応ＡおよびＥを触媒する能力を元来有すると推定される微生物としては、以下の種属に属する微生物が挙げられる。
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属。
　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓなどのＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属。
　Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属。
　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｏｓｅｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属。
　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖａｃｅｕｓなどのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属。
　Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属。
　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属。
　Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属。
　Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ　ａｌｂｕｓなどのＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属。
　Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｏｄｉｎｕｍなどのＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
　Ｄｅｌｆｔｉａ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属。
　Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ　ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属。
　Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅなどのＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ属。
　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒなどのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属。
　Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属。
　前記反応Ａおよび／またはＥを触媒する能力を元来有していない微生物であっても、これら反応Ａ、Ｅを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入し、これらの生成能を付与することで、前記宿主微生物として利用することができる。
　α－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物としては、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを脱水して２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成（反応Ｃ）する能力、および２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成（反応Ｆ）する能力を有する微生物を利用する。これらの生成能力を有する微生物を宿主微生物とすることで、α－ヒドロムコン酸を高生産することができる本発明の遺伝子改変微生物を取得することができる。
　前記反応Ａ、ＣおよびＦを触媒する能力を元来有すると推定される微生物としては、以下の種属に属する微生物が挙げられる。
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属。
　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓなどのＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属。
　Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属。
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属。
　Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｕｍａｚｕｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属。
　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属。
　Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属。
　Ｄｅｌｆｔｉａ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属。
　Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ　ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属。
　Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属。
　前記反応Ａ、Ｃおよび／またはＦを触媒する能力を元来有していない微生物であっても、これら反応Ａ、Ｃ、Ｆを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入し、これらの生成能を付与することで、前記宿主微生物として利用することができる。
　アジピン酸を製造する能力を有する微生物としては、スクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを脱水して２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成（反応Ｃ）する能力、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを還元してアジピル－ＣｏＡを生成（反応Ｄ）する能力、およびアジピル－ＣｏＡからアジピン酸を生成（反応Ｇ）する能力を有する微生物を利用する。これらの生成能力を有する微生物を宿主微生物とすれば、アジピン産を高生産することができる遺伝子改変微生物を取得することができる。
　前記反応Ａ、Ｃ、ＤおよびＧを触媒する能力を元来有すると推定される微生物としては、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａなどのＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属が挙げられる。
　前記反応Ａ、Ｃ、ＤおよびＧを触媒する能力を元来有していない微生物であっても、これら反応Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入し、これらの生成能を付与することで、前記宿主微生物として利用することができる。
　以下に反応Ａ、Ｃ～Ｇを触媒する酵素の具体例を示す。
　３－オキソアジピル－ＣｏＡを生成する反応Ａを触媒する酵素は、例えば、アシルトランスフェラーゼ（β－ケトチオラーゼ）などを用いることができる。アシルトランスフェラーゼとしてはＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ２．３．１．－に分類されるアシルトランスフェラーゼが好ましく、具体的には３－オキソアジピル－ＣｏＡチオラーゼとしてＥＣ２．３．１．１７４に分類される酵素、アセチル－ＣｏＡ　Ｃ－アセチルトランスフェラーゼとしてＥＣ２．３．１．９に分類される酵素、アセチル－ＣｏＡ　Ｃ－アシルトランスフェラーゼとしてＥＣ２．３．１．１６に分類される酵素が挙げられる。これらの中でもＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株由来のＰａａＪ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１５９１５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のＰｃａＦ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４３５３６）などを好ましく用いることができる。
　上記のアシルトランスフェラーゼが、スクシニル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡを基質として、３－オキソアジピル－ＣｏＡを生成できるかどうかは、精製アシルトランスフェラーゼによる３－オキソアジピル－ＣｏＡ生成反応と、３－オキソアジピル－ＣｏＡを基質とした精製３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼによる還元反応を組み合わせ、３－オキソアジピル－ＣｏＡの還元に伴うＮＡＤＨの減少量を測定することで確認できる。具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。
　アシルトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、アシルトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＳａｃＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、アシルトランスフェラーゼ溶液を得る。アシルトランスフェラーゼ活性は、当該酵素溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃におけるＮＡＤＨの酸化に伴う３４０ｎｍ吸収の減少を測定することで確認できる。
　（酵素反応溶液）
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．１ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
０．２ｍＭ　ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ
０．２ｍＭ　ＮＡＤＨ
１ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
１０μｇ／ｍＬ　３－ｏｘｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ
５μｇ／ｍＬ　ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がアシルトランスフェラーゼ活性を有しているかどうかは、精製アシルトランスフェラーゼの代わりに細胞破砕液（ｃｅｌｌ　ｆｒｅｅ　ｅｘｔｒａｃｔ：　ＣＦＥ）を用いて上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象とした具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。
　ＣＦＥの調製：ｐＨ７に調整した培地（培地組成：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）５ｍＬに活性測定の対象となる大腸菌ＭＧ１６５５株を一白金耳植菌し、３０℃で１８時間振とう培養する。得られた培養液をｐＨ７に調整した培地（培地組成：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、フェルラ酸２．５ｍＭ、ｐ－クマル酸２．５ｍＭ、安息香酸２．５ｍＭ、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸２．５ｍＭ、プロトカテク酸２．５ｍＭ、カテコール２．５ｍＭ、３ＯＡ２．５ｍＭ、３－ヒドロキシアジピン酸２．５ｍＭ、α－ヒドロムコン酸２．５ｍＭ、アジピン酸２．５ｍＭ、フェニルエチルアミン２．５ｍＭ）５ｍＬに添加し、３０℃で３時間振とう培養する。
　得られた培養液に１０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムを加え、菌体を遠心分離して上清を取り除く操作を３回行い、菌体を洗浄する。洗浄後の菌体をＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ１ｍＭからなるＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー１ｍＬに懸濁し、得られた懸濁液にガラスビーズ（φ０．１ｍｍ）を加え、超音波破砕機を用い４℃で菌体を破砕する。菌体破砕液を遠心して得られる上清のうち０．５ｍＬをＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に通し、透過液を除去したのちＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー０．４ｍＬを添加することを３回繰り返すことで低分子量の夾雑物を除去した後、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファーで再懸濁して液量を０．１ｍＬとしたものをＣＦＥとする。精製酵素の代わりに当該ＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加し、酵素活性の確認を行う。
　２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する反応Ｃを触媒する酵素は、例えば、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼなどを用いることができる。エノイル－ＣｏＡヒドラターゼとしては、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ番号４．２．１．－に分類されるエノイル－ＣｏＡヒドラターゼが好ましく、具体的にはエノイル－ＣｏＡヒドラターゼまたは２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡヒドラターゼとしてＥＣ４．２．１．１７に分類される酵素が挙げられる。これらの中でもＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株由来のＰａａＦ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１５９１１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のＰａａＦ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４５４２７）などを好ましく用いることができる。
　エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが触媒する反応は一般的に可逆反応であることから、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを基質として２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡが生成する反応を触媒する活性を有することは、α－ヒドロムコン酸から酵素反応で調製した２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを基質として、精製エノイル－ＣｏＡヒドラターゼを用いて生成する３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを検出することで確認することができる。具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。
　ここで用いるα－ヒドロムコン酸は、公知の方法（例えば、ＷＯ２０１６／１９９８５８Ａ１の参考例１に記載された方法）により調製することができる。
　２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ溶液の調製：常法に従いＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸（ｐｃａＩおよびｐｃａＪ、ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３および１０４６６１２）の全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ調製用酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液を２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ溶液とする。
　（酵素反応溶液）
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．４ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
２ｍＭ　α－ｈｙｄｒｏｍｕｃｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬ　ＣｏＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＥＴ－１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ溶液を得る。エノイル－ＣｏＡ　ヒドラターゼ活性は、当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液中の３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。
　（酵素反応溶液）
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
３００μＬ／ｍＬ　２，３－ｄｅｈｙｄｒｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ
１ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
２０μｇ／ｍＬ　ｅｎｏｙｌ－ＣｏＡ　ｈｙｄｒａｔａｓｅ。
　本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がエノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性を有しているかどうかは、精製エノイル－ＣｏＡヒドラターゼの代わりにＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加して上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象としたＣＦＥの調製方法の具体例はアシルトランスフェラーゼ活性の確認方法に記載した通りである。
　アジピル－ＣｏＡを生成する反応Ｄを触媒する酵素は、例えば、エノイル－ＣｏＡレダクターゼなどを用いることができる。エノイル－ＣｏＡレダクターゼとしては、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ番号１．３．－．－に分類されるエノイル－ＣｏＡレダクターゼが好ましく、具体的にはｔｒａｎｓ－２－エノイル－ＣｏＡレダクターゼとしてＥＣ１．３．１．４４に分類される酵素、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼとしてＥＣ１．３．８．７に分類される酵素が挙げられる。これらの具体例は、例えば特表２０１１－５１５１１１、Ｊ　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２０１５　Ｏｃｔ；１１９（４）：１０５７－６３．などに開示されているが、中でもＥｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ　Ｚ株由来のＴＥＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５ＥＵ９０）、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａ　ＹＸ株由来のＴｆｕ＿１６４７（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＡＺ５５６８２）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ　ＡＤＰ１株由来のＤｃａＡ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＡＬ０９０９４．１）などを好ましく用いることができる。
　エノイル－ＣｏＡレダクターゼが、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを基質とした場合、アジピル－ＣｏＡが生成する活性を有することは、α－ヒドロムコン酸から酵素反応で調製した２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを基質として、精製エノイル－ＣｏＡレダクターゼを用いて２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡの還元に伴うＮＡＤＨの減少量を測定することで確認できる。
　α－ヒドロムコン酸の調製と、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ溶液の調製は、上記と同様に行うことができる。
　エノイル－ＣｏＡレダクターゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、エノイル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＥＴ－１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、エノイル－ＣｏＡレダクターゼ溶液を得る。エノイル－ＣｏＡレダクターゼ活性は、本酵素溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃におけるＮＡＤＨの酸化に伴う３４０ｎｍ吸収の減少を測定することで確認できる。
　（酵素反応溶液）
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
３００μＬ／ｍＬ　２，３－ｄｅｈｙｄｒｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ０．２ｍＭ　ＮＡＤＨ
１ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
２０μｇ／ｍＬ　ｅｎｏｙｌ－ＣｏＡ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ。
　本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がエノイル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有しているかどうかは、精製エノイル－ＣｏＡレダクターゼの代わりにＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加して上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象としたＣＦＥの調製方法の具体例はアシルトランスフェラーゼ活性の確認方法に記載した通りである。
　３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応Ｅ、α－ヒドロムコン酸を生成する反応Ｆ、アジピン酸を生成する反応Ｇを触媒する酵素は、例えば、ＣｏＡトランスフェラーゼあるいはアシル－ＣｏＡヒドロラーゼなどを用いることができるが、ＣｏＡトランスフェラーゼが好ましい。
　ＣｏＡトランスフェラーゼとしては、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ番号２．８．３．－に分類されるＣｏＡトランスフェラーゼが好ましく、具体的にはＣｏＡトランスフェラーゼまたはアシル－ＣｏＡトランスフェラーゼとしてＥＣ２．８．３．６に分類される酵素などが挙げられる。
　本発明において、「ＣｏＡトランスフェラーゼ」とは、アシル－ＣｏＡおよびコハク酸を基質としてカルボン酸およびスクシニル－ＣｏＡを生成する反応の触媒活性（ＣｏＡトランスフェラーゼ活性）を有する酵素を意味する。
　３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応Ｅ、α－ヒドロムコン酸を生成する反応Ｆを触媒する酵素には、中でもＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のＰｃａＩおよびＰｃａＪ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４６０８１およびＮＰ＿７４６０８２）等を好ましく用いることができる。
　また、アジピン酸を生成する反応Ｇを触媒する酵素には、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ　ＡＤＰ１株由来のＤｃａＩおよびＤｃａＪ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＣＡＧ６８５３８およびＣＡＧ６８５３９）などを好ましく用いることができる。
　３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡ、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡまたはアジピル－ＣｏＡを基質とするＣｏＡトランスフェラーゼ活性は、本酵素反応が可逆反応であることから、３－ヒドロキシアジピン酸およびスクシニル－ＣｏＡ、α－ヒドロムコン酸およびスクシニル－ＣｏＡ、またはアジピン酸およびスクシニル－ＣｏＡを基質として、精製ＣｏＡトランスフェラーゼを用いて生成する３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡ、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡまたはアジピル－ＣｏＡを検出することで確認することができる。具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。
　３－ヒドロキシアジピン酸の調製：３－ヒドロキシアジピン酸はＷＯ２０１６／１９９８５６Ａ１の参考例１に記載された方法により調製する。
　３－ヒドロキシアジピン酸を基質としたＣｏＡトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、透過液中の３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。
　（酵素反応溶液）
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．４ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
２ｍＭ　３－ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬ　ＣｏＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　α－ヒドロムコン酸の調製：α－ヒドロムコン酸はＷＯ２０１６／１９９８５８Ａ１の参考例１に記載された方法により調製する。
　α－ヒドロムコン酸を基質としたＣｏＡトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、透過液中の２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。
　（酵素反応溶液）
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．４ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
２ｍＭ　α－ｈｙｄｒｏｍｕｃｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬ　ＣｏＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　アジピン酸を基質としたＣｏＡトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、透過液中のアジピル－ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。
　（酵素反応溶液）
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．４ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
２ｍＭ　ａｄｉｐｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬ　ＣｏＡ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有しているかどうかは、精製ＣｏＡトランスフェラーゼの代わりにＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加して上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象としたＣＦＥの調製方法の具体例はアシルトランスフェラーゼ活性の確認方法に記載した通りである。
　本発明で（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチド、または３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、従来技術で用いられている３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼよりも優れた活性を有することを特徴とする。ここで、「優れた活性」とは、同一の宿主微生物、発現条件下で当該ポリペプチドまたは従来の３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼを発現した遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地で培養した場合、従来の３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼを発現した遺伝子改変微生物に比べて高い収率で３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸、またはアジピン酸を生産することを意味する。ここで、３－ヒドロキシアジピン酸収率は式（２）に従って算出する。α－ヒドロムコン酸収率またはアジピン酸収率は、式（２）の３－ヒドロキシアジピン酸をそれぞれα－ヒドロムコン酸またはアジピン酸に置き換えることで算出する。
　収率（％）＝３－ヒドロキシアジピン酸生成量（ｍｏｌ）／炭素源の消費量（ｍｏｌ）×１００・・・式（２）。
　本発明で（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチド、または３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼが、従来技術で用いられている３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼよりも優れた活性を有することを確認する具体的な方法は以下の通りである。大腸菌内で自立複製可能なベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（ＭＥ　Ｋｏｖａｃｈ，　（１９９５），　Ｇｅｎｅ　１６６：　１７５－１７６）をＸｈｏＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩを得る。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２　ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号１８６）を常法に従ってＰＣＲ増幅し（用いるプライマーは、例えば配列番号１８７および１８８である）、得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩ　を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐを得る。ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＰｇａｐをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを得る。アシルトランスフェラーゼをコードする核酸全長を常法に従ってＰＣＲ増幅し（用いるプライマーは、例えば配列番号１９０および１９１である）、得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結しプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴを得る。ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴをＨｐａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを得る。ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を常法に従ってＰＣＲ増幅し（用いるプライマーは、例えば配列番号１９４および１９５である）、得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ”を用いて連結しプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴを得る。
　一方、大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をＢａｍＨＩで切断し、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１／ＢａｍＨＩを得る。配列番号１～８６のポリペプチドあるいは従来技術で用いられている３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸を常法に従ってＰＣＲ増幅し（用いるプライマーは、例えば配列番号１９６および１９７である）、得られた断片およびｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１／ＢａｍＨＩ　を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、配列番号１～８６のポリペプチドあるいは従来技術で用いられている３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼを発現するプラスミドを得る。
　得られたプラスミドおよびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴを、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にエレクトロポレーション（ＮＭ　Ｃａｌｖｉｎ，ＰＣ　Ｈａｎａｗａｌｔ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７０　（１９８８），ｐｐ．２７９６－２８０１）で導入する。導入後の当該株をｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬ）５ｍＬに一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で１８時間振とう培養する。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（コハク酸１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬおよびＩＰＴＧ０．０１ｍＭ）５ｍＬに添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養する。当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を分析することで培養上清中の３－ヒドロキシアジピン酸および炭素源の濃度を定量する。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる３－ヒドロキシアジピン酸の定量分析は以下の条件で行う。
・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ　ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ－Ｑｕａｄ　ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ　ネガティブモード。
　ＨＰＬＣによる糖、コハク酸などの炭素源の定量分析は以下の条件で行う。
・ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｚｕ　Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　Ｓｕｇａｒ　ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）、長さ３００　ｍｍ、内径８　ｍｍ、粒径６μｍ
移動相：０．０５Ｍ　硫酸水溶液
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：６５℃
検出器：ＲＩ。
　本発明においてアシルトランスフェラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ、エノイル－ＣｏＡレダクターゼのいずれかをコードする核酸を宿主微生物に導入する場合、当該核酸はデータベース上に存在する当該酵素のアミノ酸配列を元に人工的に合成してもよいし、天然から分離してもよい。人工的に合成する場合、導入する宿主微生物に合わせて各アミノ酸に対応するコドンの使用頻度を変更してもよい。
　本発明で、アシルトランスフェラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ、エノイル－ＣｏＡレダクターゼのいずれかをコードする核酸を宿主微生物に導入する方法は特に限定されず、宿主微生物内で自律複製可能な発現ベクターに当該核酸を組み込み宿主微生物に導入する方法や、宿主微生物のゲノムに当該核酸を組み込む方法などを用いることができる。
　当該酵素をコードする核酸を天然から分離する場合、遺伝子源となる生物は特に限定されないが、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅなどのＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｏｓｅｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｏｄｉｎｕｍなどのＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｕｍａｚｕｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｄｅｌｆｔｉａ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍなどのＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ　ａｌｂｕｓなどのＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属、Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ　ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓなどのＰｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒなどのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓなどのＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ　ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ｓｔｅｒｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｎａｃｅｕｓなどのＳｔｅｒｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｒｕｃｋｅｒｉなどのＹｅｒｓｉｎｉａ属、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ　などのＥｕｇｌｅｎａ　属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａなどのＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属が挙げられ、好ましくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｅｕｇｌｅｎａ　属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属である。
　本発明で発現させるポリペプチドをコードする核酸を発現ベクターまたは宿主微生物ゲノムに組み込む場合、当該発現ベクターまたはゲノム組み込み用核酸はプロモーター、リボソーム結合配列、発現させるポリペプチドをコードする核酸、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーター活性を制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　本発明で用いるプロモーターは、宿主微生物内で酵素を発現させられるものであれば特に限定されないが、例えばｇａｐプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが挙げられる。
　本発明で発現ベクターを用いて核酸の導入や、ポリペプチドの発現の増強を行う場合は、当該微生物中で自律複製可能であれば特に限定されないが、例えばｐＢＢＲ１ＭＣＳベクター、ｐＢＲ３２２ベクター、ｐＭＷベクター、ｐＥＴベクター、ｐＲＳＦベクター、ｐＣＤＦベクター、ｐＡＣＹＣベクター、および上述のベクターの派生型などが挙げられる。
　本発明でゲノム組み込み用核酸を用いて核酸の導入や、ポリペプチドの発現の増強を行う場合は、部位特異的相同組換えを用いて導入する。部位相同組換えの方法は特に限定されないが、例えばλ　Ｒｅｄ　レコンビナーゼおよびＦＬＰレコンビナーゼを用いる方法（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．２０００　Ｊｕｎ　６；９７（１２）：　６６４０－６６４５．）、λ　Ｒｅｄ　レコンビナーゼおよびｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００７　Ｄｅｃ；７１（１２）：２９０５－１１．）が挙げられる。
　発現ベクターまたはゲノム組み込み用核酸の導入方法は、微生物に核酸を導入する方法であれば特に限定されないが、例えばカルシウムイオン法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９　（１９７０））、エレクトロポレーション法（ＮＭ　Ｃａｌｖｉｎ，ＰＣ　Ｈａｎａｗａｌｔ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７０　（１９８８），ｐｐ．２７９６－２８０１）などが挙げられる。
　本発明では、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸を導入、もしくは当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物を、通常の微生物が利用し得る炭素源を発酵原料として含有する培地、好ましくは液体培地中において培養する。当該遺伝子改変微生物が利用し得る炭素源の他には、窒素源、無機塩および必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの有機微量栄養素を程よく含有した培地を用いる。上記栄養源を含有していれば天然培地、合成培地のいずれでも利用できる。
　発酵原料とは、当該遺伝子改変微生物が代謝し得る原料である。「代謝」とは、微生物が細胞外から取り入れた、あるいは細胞内で別の化学物質より生じたある化学物質が、酵素反応により別の化学物質へと変換されることを指す。炭素源としては、糖類を好ましく用いることができる。糖類の具体例としては、グルコース、シュクロース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース等の単糖類、これら単糖類が結合した二糖類、多糖類、およびこれらを含有する澱粉糖化液、糖蜜、セルロース含有バイオマス糖化液などが挙げられる。
　また、上記に挙げた糖以外にも、ＣｏＡトランスフェラーゼの基質であるコハク酸を添加することで３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を効率よく生産することができる。
　上記に挙げた炭素源は、一種類のみ用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。炭素源の添加において、培地中の炭素源の濃度は、特に限定されず、炭素源の種類などに応じて適宜設定することができ、好ましくは、糖類は５ｇ／Ｌ～３００ｇ／Ｌ、コハク酸は０．１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌである。
　当該遺伝子改変微生物の培養に用いる窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用できる。培地中の窒素源の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．１ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌである。
　当該遺伝子改変微生物の培養に用いる無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
　３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物の培養条件は、前記成分組成の培地、培養温度、撹拌速度、ｐＨ、通気量、植菌量などを、当該遺伝子改変微生物の種類および外部条件などに応じて、適宜調節あるいは選択して設定する。
　培養におけるｐＨの範囲は当該遺伝子改変微生物が生育することができれば特に制限はないが、好ましくはｐＨ５～８、より好ましくはｐＨ５．５～６．８である。
　培養における通気条件の範囲は３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産することができれば特に制限はないが、当該微生物変異体を良好に生育させるために、少なくとも培養開始時において培養容器内の気相および／または液相に酸素が残存していることが好ましい。
液体培養において発泡がある場合には、鉱油、シリコーン油および界面活性剤などの消泡剤を適宜培地に配合することができる。
　前記微生物の培養物中に、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸が回収可能な量まで生産された後、生産された当該生産物を回収することができる。生産された当該生産物の回収、例えば単離は、蓄積量が適度に高まった時点で培養を停止し、その培養物から、発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行うことができる。具体的には、遠心分離、ろ過などにより菌体を分離したのち、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭処理、結晶化、膜分離、蒸留などにより、当該生産物を培養物から単離することができる。より具体的には、当該生産物の塩に酸成分を添加して析出物を回収する方法、培養物を逆浸透膜やエバポレーターなどを用いた濃縮操作により水を除去して当該生産物の濃度を高めた後、冷却結晶化や断熱結晶化により当該生産物および／または当該生産物の塩の結晶を析出させ、遠心分離やろ過などにより当該生産物および／または当該生産物の塩の結晶を得る方法、培養物にアルコールを添加して当該生産物をエステルとした後、蒸留操作により当該生産物のエステルを回収後、加水分解により当該生産物を得る方法等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、これらの回収方法は生成物の物性などにより適当に選択して最適化することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
参考例１
３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する反応（反応Ａ）を触媒する酵素、および３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応（反応Ｅ）かつ２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成する反応（反応Ｆ）を触媒する酵素、および配列番号１、２、３、４、５、６、７に記載のポリペプチドを発現するプラスミドの作製
　大腸菌内で自律複製可能なベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（ＭＥ　Ｋｏｖａｃｈ，　（１９９５），　Ｇｅｎｅ　１６６：　１７５－１７６）をＸｈｏＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２　ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号１８６）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１８７、１８８）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩ　を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え大腸菌株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＰｇａｐをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩ　を得た。反応Ａを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてアシルトランスフェラーゼ遺伝子ｐｃａＦ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　１０４１７５５、配列番号１８９）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１９０、１９１）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴをＨｐａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを得た。反応Ｄおよび反応Ｅを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子ｐｃａＩおよびｐｃａＪ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　１０４６６１３、１０４６６１２、配列番号１９２、１９３）の全長を含む連続した配列をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１９４、１９５）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴとした。
　ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ／ＳｃａＩを得た。配列番号１のポリペプチドをコードする核酸を増幅するために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　ＡＴＣＣ１３８８０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号８７に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１９６、１９７）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号２のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ　ＤＳＭ２１４２０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号８８に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１９８、１９９）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号３のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ　ＮＢＲＣ１０２５９９株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号８９に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２００、２０１）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号４のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ　５６８株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号９０に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２０２、２０３）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号５のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ　Ｌｒ５／４株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号９１に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２０４、２０５）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号６のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＢＷ１０６株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号９２に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２０６、２０７）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号７のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　ＦＫ０１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号９３に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２０８、２０９）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られたそれぞれの断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ／ＳｃａＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認した。
　配列番号１に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ１」、配列番号２に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ２」、配列番号３に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ３」、配列番号４に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ４」、配列番号５に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ５」、配列番号６に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ６」、配列番号７に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ７」とし、これらのプラスミドについて表６に示す。
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参考例２
３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する反応（反応Ｃ）を触媒する酵素を発現するためのプラスミドの作製
　大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＭＷ１１９（ニッポンジーン社製）をＳａｃＩで切断し、ｐＭＷ１１９／ＳａｃＩを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２　ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号１８６）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１０、２１１）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＭＷ１１９／ＳａｃＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え大腸菌株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＭＷ１１９：：Ｐｇａｐとした。続いてｐＭＷ１１９：：ＰｇａｐをＳｐｈＩで切断し、ｐＭＷ１１９：：Ｐｇａｐ／ＳｐｈＩを得た。反応Ｃを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてエノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子ｐａａＦ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　１０４６９３２、配列番号１７６）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１２、２１３）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＭＷ１１９：：Ｐｇａｐ／ＳｐｈＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認した。得られたプラスミドを「ｐＭＷ１１９：：ＥＨ」とした。
参考例３
アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する反応（反応Ａ）を触媒する酵素、およびアジピル－ＣｏＡからアジピン酸を生成する反応（反応Ｇ）を触媒する酵素、および配列番号１、２、３、４、５、６、７、に記載のポリペプチドを発現するプラスミドの作製
　反応Ｇを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ　ＡＤＰ１株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子ｄｃａＩおよびｄｃａＪ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：ＣＲ５４３８６１．１、配列番号２１４、２１５）の全長を含む連続した配列をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１６、２１７）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片および参考例１で作製したｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ６、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ７をそれぞれＨｐａＩで切断して得られる断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをそれぞれｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ６、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ７とした。
参考例４
３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する反応（反応Ｃ）および２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからアジピル－ＣｏＡを生成する反応（反応Ｄ）を触媒する酵素を発現するためのプラスミドの作製
　ｐＭＷ１１９：：ＥＨをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＭＷ１１９：：ＥＨ／ＨｉｎｄＩＩＩを得た。反応Ｄを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ　ＡＤＰ１株由来のｄｃａＡ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＡＬ０９０９４．１、配列番号２１８）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１９、２２０）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＭＷ１１９：：ＥＨ／ＨｉｎｄＩＩＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＭＷ１１９：：ＥＨＥＲとした。
実施例１
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物変異体の作製
　セラチア属微生物のピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子であるｐｙｋＦおよびｐｙｋＡを欠損させ、ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物変異体を作製した。
　ｐｙｋＦおよびｐｙｋＡの欠損方法は、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　２０００　Ｊｕｎ　６；　９７（１２）：　６６４０-６６４５．に記載の方法に従った。
ｐｙｋＦを欠損したセラチア属微生物変異体の作製
　ｐＫＤ４を鋳型として、プライマーとして配列番号２２１および２２２のオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ｐｙｋＦ欠損のための配列長１．６ｋｂのＰＣＲ断片を得た。ＦＲＴ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ発現プラスミドであるｐＫＤ４６を、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７株に導入し、アンピシリン耐性株を取得した。得られた株をアンピシリン５００μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬをアンピシリン５００μｇ／ｍＬおよびアラビノース５０ｍＭを含む５０ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、回旋培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、５μＬのＰＣＲ断片と混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。Ｇｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で２時間振とう培養した。全量をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られたカナマイシン耐性株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長より目的遺伝子の欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。プライマーは配列番号２２３および２２５のオリゴＤＮＡを使用した。
　続いて当該カナマイシン耐性株を５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃にて２回継代培養することでｐＫＤ４６を脱落させ、アンピシリン感受性株を得た。アンピシリン感受性株にｐＣＰ２０を導入し、再びアンピシリン耐性株を取得した。得られた株を４０℃で培養した後にコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長よりカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認した。プライマーは配列番号２２４および２２５のオリゴＤＮＡを使用した。カナマイシン感受性株を５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃にて２回継代培養することでｐＣＰ２０を脱落させた。得られた株をＳｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７ΔｐｙｋＦとした。
ｐｙｋＡを欠損したセラチア属微生物変異体の作製
　ｐＫＤ４を鋳型として、プライマーとして配列番号２２６および２２７のオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、配列長１．６ｋｂのｐｙｋＡ欠損用ＰＣＲ断片を得た。
　ｐｙｋＦ欠損株の作製と同様の方法にて、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７ΔｐｙｋＦ株のｐｙｋＡを欠損させた。当該株にｐＫＤ４６を導入したのち、ｐｙｋＡ欠損用ＰＣＲ断片を導入した。得られたカナマイシン耐性株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長より目的遺伝子の欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。プライマーは配列番号２２３および２２９のオリゴＤＮＡを使用した。
　続いてｐＫＤ４６を脱落させ、アンピシリン感受性株を得た。アンピシリン感受性株にｐＣＰ２０を導入し、再びアンピシリン耐性株を取得した。得られた株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長よりカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認した。プライマーは配列番号２２８および２２９のオリゴＤＮＡを使用した。カナマイシン感受性株よりｐＣＰ２０を脱落させた。得られた株をＳｇΔＰＰとした。
実施例２
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
　実施例１で作製したＳｇΔＰＰに対して、参考例１で作製したプラスミドをそれぞれ導入し、セラチア属微生物変異体を作製した。また、コントロールとして、ＳｇΔＰＰに、空ベクターであるｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２を導入したセラチア属微生物変異体を作製した。
　ＳｇΔＰＰを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１μＬのｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（コントロール）、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ６、またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ７と混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。Ｇｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で１時間振とう培養した。５０μＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られた株をそれぞれＳｇΔＰＰ／ｐＢＢＲ（ネガティブコントロール）、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ１、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ２、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ３、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ４、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ５、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ６、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ７とした。
参考例５
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
　実施例２と同様の方法にて、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７にｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（コントロール）、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ６、またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ７を導入した。得られた株をそれぞれＳｇ／ｐＢＢＲ（ネガティブコントロール）、Ｓｇ／３ＨＡ１、Ｓｇ／３ＨＡ２、Ｓｇ／３ＨＡ３、Ｓｇ／３ＨＡ４、Ｓｇ／３ＨＡ５、Ｓｇ／３ＨＡ６、Ｓｇ／３ＨＡ７とした。
実施例３
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　実施例２で作製したセラチア属微生物変異体を用いて、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。
　ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ）５ｍＬ（φ１８ｍｍガラス試験管、アルミ栓）に、実施例２で作製した変異体を一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養した。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（グルコース５０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ）５ｍＬ（φ１８ｍｍガラス試験管、アルミ栓）に添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養した。
基質および生成物の定量分析
　当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を以下の方法で分析することで培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。さらに、その結果を元に上記の式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率を表７に示す。ただし、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる定量分析において０．１ｍｇ／Ｌ以下であった場合は検出限界以下とし、表中には以下Ｎ．Ｄ．と表す。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の定量分析
・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ　ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：１２６０ＤＡＤ　ＶＬ＋（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ－Ｑｕａｄ　ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ　ネガティブモード。
ＨＰＬＣによる有機酸の定量分析
・ＨＰＬＣ：ＬＣ－１０Ａ（島津製作所製）
カラム：　Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＳＰＲ－Ｈ（島津ジーエルシー社製）、長さ２５０ｍｍ、内径７．８ｍｍ、粒径８μｍ
Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＳＣＲ－１０１Ｈ（島津ジーエルシー社製）長さ２５０ｍｍ、内径７．８ｍｍ、粒径１０μｍ
移動相：　５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸
反応液：５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２０ｍＭ　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４５℃
検出器：ＣＤＤ－１０Ａｖｐ（島津製作所製）
ＨＰＬＣによる糖およびアルコールの定量分析
・ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｚｕ　Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　Ｓｕｇａｒ　ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）、長さ３００　ｍｍ、内径８　ｍｍ、粒径６μｍ
移動相：０．０５Ｍ　硫酸水溶液
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：６５℃
検出器：ＲＩＤ－１０Ａ（島津製作所製）。
比較例１
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していないセラチア属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　実施例３と同様の方法にて、参考例５で作製したセラチア属微生物変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。さらに、その結果を元に上記式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率を表７に示す。
　本比較例１の結果と実施例３の結果を比較すると、セラチア属微生物のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
実施例４
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌変異体の作製
　大腸菌のピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子であるｐｙｋＦおよびｐｙｋＡを欠損させ、ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を作製した。ｐｙｋＦおよびｐｙｋＡの欠損方法は、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．２０００　Ｊｕｎ　６；９７（１２）：６６４０－６６４５．に記載の方法に従った。
ｐｙｋＦを欠損した大腸菌の変異体の作製
　ｐＫＤ４を鋳型として、プライマーとして配列番号２３０および２３１のオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ｐｙｋＦ欠損のための配列長１．６ｋｂのＰＣＲ断片を得た。
　ＦＲＴ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ　発現プラスミドであるｐＫＤ４６を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株に導入し、アンピシリン耐性株を取得した。得られた株をアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬをアンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびアラビノース５０ｍＭを含む５０ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、回旋培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、５μＬのＰＣＲ断片と混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。Ｇｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で２時間振とう培養した。全量をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られたカナマイシン耐性株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長より目的遺伝子の欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。プライマーは配列番号２２３および２３３のオリゴＤＮＡを使用した。
　続いて当該カナマイシン耐性株を５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃にて２回継代培養することでｐＫＤ４６を脱落させ、アンピシリン感受性株を得た。アンピシリン感受性株にｐＣＰ２０を導入し、再びアンピシリン耐性株を取得した。得られた株を４０℃で培養した後にコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長よりカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認した。プライマーは配列番号２３２および２３３のオリゴＤＮＡを使用した。カナマイシン感受性株を５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃にて２回継代培養することでｐＣＰ２０を脱落させた。得られた株をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５ΔｐｙｋＦとした。
ｐｙｋＡを欠損した大腸菌の変異体の作製
　ｐＫＤ４を鋳型として、プライマーとして配列番号２３４および２３５のオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、配列長１．６ｋｂのｐｙｋＡ欠損用ＰＣＲ断片を得た。
　ｐｙｋＦ欠損株の作製と同様の方法にて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５ΔｐｙｋＦ株のｐｙｋＡを欠損させた。当該株にｐＫＤ４６を導入したのち、ｐｙｋＡ欠損用ＰＣＲ断片を導入した。得られたカナマイシン耐性株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長より目的遺伝子の欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。プライマーは配列番号２２３および２２４のオリゴＤＮＡを使用した。
　続いてｐＫＤ４６を脱落させ、アンピシリン感受性株を得た。アンピシリン感受性株にｐＣＰ２０を導入し、再びアンピシリン耐性株を取得した。得られた株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長よりカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認した。プライマーは配列番号２３６および２３７のオリゴＤＮＡを使用した。カナマイシン感受性株よりｐＣＰ２０を脱落させた。得られた株をＥｃΔＰＰとした。
実施例５
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
　実施例４で作製したＥｃΔＰＰに対して、参考例１で作製したプラスミドをそれぞれ導入し、大腸菌の変異体を作製した。
　ＥｃΔＰＰを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１μＬのｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（ネガティブコントロール）、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ６、またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ７と混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。Ｇｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で１時間振とう培養した。５０μＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られた株をそれぞれＥｃΔＰＰ／ｐＢＢＲ（ネガティブコントロール）、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ１、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ２、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ３、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ４、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ５、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ６、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ７とした。
参考例６
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
　実施例５と同様の方法にて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５にｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（コントロール）、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ６、またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ７を導入した。得られた株をそれぞれＥｃ／ｐＢＢＲ（ネガティブコントロール）、Ｅｃ／３ＨＡ１、Ｅｃ／３ＨＡ２、Ｅｃ／３ＨＡ３、Ｅｃ／３ＨＡ４、Ｅｃ／３ＨＡ５、Ｅｃ／３ＨＡ６、Ｅｃ／３ＨＡ７とした。
実施例６
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　実施例３と同様の方法にて、実施例５で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率を表８に示す。
比較例２
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない大腸菌の変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　実施例６と同様の方法にて、参考例６で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率を表８に示す。
　本比較例２の結果と実施例６の結果を比較すると、大腸菌のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
実施例７
　ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
　実施例２で作製したセラチア属微生物変異体それぞれに対して、参考例２で作製したプラスミドｐＭＷ１１９：：ＥＨを導入し、セラチア属微生物変異体を作製した。また、コントロールとして、実施例２で作成したＳｇΔＰＰ／ｐＢＢＲに、空ベクターであるｐＭＷ１１９を導入したセラチア属微生物変異体を作製した。
　ＳｇΔＰＰ／ｐＢＢＲ、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ１、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ２、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ３、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ４、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ５、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ６、ＳｇΔＰＰ／３ＨＡ７を、カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１μＬのｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（コントロール）、またはｐＭＷ１１９：：ＥＨと混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。Ｇｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で１時間振とう培養した。５０μＬをアンピシリン５００μｇ／ｍＬおよびカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られた株をそれぞれＳｇΔＰＰ／ｐＢＢＲｐＭＷ（ネガティブコントロール）、ＳｇΔＰＰ／ＨＭＡ１、ＳｇΔＰＰ／ＨＭＡ２、ＳｇΔＰＰ／ＨＭＡ３、ＳｇΔＰＰ／ＨＭＡ４、ＳｇΔＰＰ／ＨＭＡ５、ＳｇΔＰＰ／ＨＭＡ６、ＳｇΔＰＰ／ＨＭＡ７とした。
参考例７
　ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
　実施例７と同様の方法にて、Ｓｇ／ｐＢＢＲ、Ｓｇ／３ＨＡ１、Ｓｇ／３ＨＡ２、Ｓｇ／３ＨＡ３、Ｓｇ／３ＨＡ４、Ｓｇ／３ＨＡ５、Ｓｇ／３ＨＡ６、Ｓｇ／３ＨＡ７にｐＭＷ１１９（コントロール）、またはｐＭＷ１１９：：ＥＨを導入した。得られた株をそれぞれＳｇ／ｐＢＢＲｐＭＷ（ネガティブコントロール）、Ｓｇ／ＨＭＡ１、Ｓｇ／ＨＭＡ２、Ｓｇ／ＨＭＡ３、Ｓｇ／ＨＭＡ４、Ｓｇ／ＨＭＡ５、Ｓｇ／ＨＭＡ６、Ｓｇ／ＨＭＡ７とした。
実施例８
　ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物の変異体を用いたα－ヒドロムコン酸の生産試験
　培地にアンピシリンを５００μｇ／ｍＬとなるように添加した以外は実施例３と同様の方法にて、実施例７で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したα－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したα－ヒドロムコン酸の収率を表９に示す。
比較例３
　ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していないセラチア属微生物の変異体を用いたα－ヒドロムコン酸の生産試験
　実施例８と同様の方法にて、参考例７で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したα－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したα－ヒドロムコン酸の収率を表９に示す。
　本比較例３の結果と実施例８の結果を比較すると、セラチア属微生物のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、α－ヒドロムコン酸の収率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
実施例９
　ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
　実施例５で作製した大腸菌変異体それぞれに対して、参考例２で作製したプラスミドｐＭＷ１１９：：ＥＨを導入し、大腸菌変異体を作製した。また、コントロールとして、実施例５で作成したＥｃΔＰＰ／ｐＢＢＲに、空ベクターであるｐＭＷ１１９を導入した大腸菌変異体を作製した。
　ＥｃΔＰＰ／ｐＢＢＲ、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ１、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ２、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ３、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ４、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ５、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ６、ＥｃΔＰＰ／３ＨＡ７を、カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１μＬのｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（コントロール）、またはｐＭＷ１１９：：ＥＨと混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。Ｇｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で１時間振とう培養した。５０μＬをアンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られた株をそれぞれＥｃΔＰＰ／ｐＢＢＲｐＭＷ（ネガティブコントロール）、ＥｃΔＰＰ／ＨＭＡ１、ＥｃΔＰＰ／ＨＭＡ２、ＥｃΔＰＰ／ＨＭＡ３、ＥｃΔＰＰ／ＨＭＡ４、ＥｃΔＰＰ／ＨＭＡ５、ＥｃΔＰＰ／ＨＭＡ６、ＥｃΔＰＰ／ＨＭＡ７とした。
参考例８
　ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
　実施例９と同様の方法にて、Ｅｃ／ｐＢＢＲ、Ｅｃ／３ＨＡ１、Ｅｃ／３ＨＡ２、Ｅｃ／３ＨＡ３、Ｅｃ／３ＨＡ４、Ｅｃ／３ＨＡ５、Ｅｃ／３ＨＡ６、Ｅｃ／３ＨＡ７にｐＭＷ１１９（コントロール）、またはｐＭＷ１１９：：ＥＨを導入した。得られた株をそれぞれＥｃ／ｐＢＢＲｐＭＷ（ネガティブコントロール）、Ｅｃ／ＨＭＡ１、Ｅｃ／ＨＭＡ２、Ｅｃ／ＨＭＡ３、Ｅｃ／ＨＭＡ４、Ｅｃ／ＨＭＡ５、Ｅｃ／ＨＭＡ６、Ｅｃ／ＨＭＡ７とした。
実施例１０
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を用いたα－ヒドロムコン酸の生産試験
　培地にアンピシリンを１００μｇ／ｍＬとなるように添加した以外は実施例６と同様の方法にて、実施例９で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したα－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したα－ヒドロムコン酸の収率を表１０に示す。
比較例４
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない大腸菌の変異体を用いたα－ヒドロムコン酸の生産試験
　実施例１０と同様の方法にて、参考例８で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したα－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したα－ヒドロムコン酸の収率を表１０に示す。
　本比較例４の結果と実施例１０の結果を比較すると、大腸菌のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、α－ヒドロムコン酸の収率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
実施例１１
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＧを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
　実施例２と同様の方法にて、ＳｇΔＰＰに対して参考例３で作成したｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ６、またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ７を導入した。得られた変異体それぞれに対して、実施例７と同様の方法にて、参考例４で作製したプラスミドｐＭＷ１１９：：ＥＨＥＲを導入し、セラチア属微生物変異体を作製した。得られた株をそれぞれＳｇΔＰＰ／ＡＤＡ１、ＳｇΔＰＰ／ＡＤＡ２、ＳｇΔＰＰ／ＡＤＡ３、ＳｇΔＰＰ／ＡＤＡ４、ＳｇΔＰＰ／ＡＤＡ５、ＳｇΔＰＰ／ＡＤＡ６、ＳｇΔＰＰ／ＡＤＡ７とした。
参考例９
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＧを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体の作製
　実施例１１と同様の方法にて、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７に対して参考例３で作成したｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ６、またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ７を導入した。得られた変異体それぞれに対して、実施例７と同様の方法にて、参考例４で作製したプラスミドｐＭＷ１１９：：ＥＨＥＲを導入し、セラチア属微生物変異体を作製した。得られた株をそれぞれＳｇ／ＡＤＡ１、Ｓｇ／ＡＤＡ２、Ｓｇ／ＡＤＡ３、Ｓｇ／ＡＤＡ４、Ｓｇ／ＡＤＡ５、Ｓｇ／ＡＤＡ６、Ｓｇ／ＡＤＡ７とした。
実施例１２
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物の変異体を用いたアジピン酸の生産試験
　実施例８と同様の方法にて、実施例１１で作製した変異体およびＳｇΔＰＰ／ｐＢＢＲｐＭＷ（ネガティブコントロール）を培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。なおアジピン酸の定量はＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸と同様の条件にて行った。その値を元に上記式（２）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１１に示す。
比較例５
　ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していないセラチア属微生物の変異体を用いたアジピン酸の生産試験
　実施例８と同様の方法にて、参考例９で作製した変異体およびＳｇ／ｐＢＢＲｐＭＷを培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１１に示す。
　本比較例５の結果と実施例１２の結果を比較すると、セラチア属微生物のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、アジピン酸の収率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
実施例１３
　ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＧを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
　実施例５と同様の方法にて、ＥｃΔＰＰに対して参考例３で作成したｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ６、またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ７を導入した。得られた変異体それぞれに対して、実施例９と同様の方法にて、参考例４で作製したプラスミドｐＭＷ１１９：：ＥＨＥＲを導入し、大腸菌変異体を作製した。得られた株をそれぞれＥｃΔＰＰ／ＡＤＡ１、ＥｃΔＰＰ／ＡＤＡ２、ＥｃΔＰＰ／ＡＤＡ３、ＥｃΔＰＰ／ＡＤＡ４、ＥｃΔＰＰ／ＡＤＡ５、ＥｃΔＰＰ／ＡＤＡ６、ＥｃΔＰＰ／ＡＤＡ７とした。
参考例１０
　ピルビン酸キナーゼの機能が欠損しておらず、かつ反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＧを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体の作製
　実施例１３と同様の方法にて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５に対して参考例３で作成したｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ４、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ５、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ６、またはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２ＯＲ７を導入した。得られた変異体それぞれに対して、実施例９と同様の方法にて、参考例４で作製したプラスミドｐＭＷ１１９：：ＥＨＥＲを導入し、大腸菌変異体を作製した。得られた株をそれぞれＥｃ／ＡＤＡ１、Ｅｃ／ＡＤＡ２、Ｅｃ／ＡＤＡ３、Ｅｃ／ＡＤＡ４、Ｅｃ／ＡＤＡ５、Ｅｃ／ＡＤＡ６、Ｅｃ／ＡＤＡ７とした。
実施例１４
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を用いたアジピン酸の生産試験
　実施例１０と同様の方法にて、実施例１３で作製した変異体およびＥｃΔＰＰ／ｐＢＢＲｐＭＷを培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。なおアジピン酸の定量はＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸と同様の条件にて行った。その値を元に上記式（２）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１２に示す。
比較例６
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない大腸菌の変異体を用いたアジピン酸の生産試験
　実施例１０と同様の方法にて、参考例１０で作製した変異体およびＥｃ／ｐＢＢＲｐＭＷを培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１２に示す。
　本比較例６の結果と実施例１４の結果を比較すると、大腸菌のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、アジピン酸の収率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
実施例１５
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物の変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験２
　実施例２で作製したセラチア属微生物変異体を用いて、嫌気条件下での３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。
　培地ＩＩを用いた培養を静置にて行った以外は実施例３と同様の方法にて、実施例２で作製したセラチア属微生物変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率を表１３に示す。
比較例７
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していないセラチア属微生物の変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験２
　実施例１５と同様の方法にて、参考例５で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率を表１３に示す。
　本比較例７の結果と実施例１５の結果を比較すると、セラチア属微生物のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、嫌気条件下でも３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
実施例１６
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験２
　実施例５で作製した大腸菌変異体を用いて、嫌気条件下での３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。
　培地ＩＩを用いた培養を静置にて行った以外は実施例６と同様の方法にて、実施例５で作製した大腸菌変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率を表１４に示す。
比較例８
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない大腸菌の変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験２
　実施例１６と同様の方法にて、参考例６で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率を表１４に示す。
　本比較例８の結果と実施例１６の結果を比較すると、大腸菌のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、嫌気条件下でも３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
実施例１７
　ピルビン酸キナーゼの機能が欠損したセラチア属微生物の変異体を用いたアジピン酸の生産試験２
　実施例１１で作製したセラチア属微生物変異体を用いて、嫌気条件下でのアジピン酸の生産試験を行った。
　培地ＩＩを用いた培養を静置にて行った以外は実施例１２と同様の方法にて、実施例１１で作製したセラチア属微生物変異体を培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１５に示す。
比較例９
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していないセラチア属微生物の変異体を用いたアジピン酸の生産試験２
　実施例１７と同様の方法にて、参考例９で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１５に示す。
　本比較例９の結果と実施例１７の結果を比較すると、セラチア属微生物のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、嫌気条件下でもアジピン酸の収率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
実施例１８
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損した大腸菌の変異体を用いたアジピン酸の生産試験２
　実施例１３で作製した大腸菌変異体を用いて、嫌気条件下でのアジピン酸の生産試験を行った。
　培地ＩＩを用いた培養を静置にて行った以外は実施例１４と同様の方法にて、実施例１３で作製した大腸菌変異体を培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１６に示す。
比較例１０
ピルビン酸キナーゼの機能が欠損していない大腸菌の変異体を用いたアジピン酸の生産試験２
　実施例１８と同様の方法にて、参考例１０で作製した変異体を培養した。培養上清中に蓄積したアジピン酸および他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。その値を元に上記式（２）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１６に示す。
　本比較例１０の結果と実施例１８の結果を比較すると、大腸菌のピルビン酸キナーゼの機能を欠損させることにより、嫌気条件下でもアジピン酸の収率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
実施例１９
ピルビン酸キナーゼ遺伝子およびホスホトランスフェラーゼ系酵素遺伝子が欠損したセラチア属微生物の遺伝子変異体の作製
　実施例１で作製したＳｇΔＰＰ株の有するホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるｐｔｓＧを欠損させ、ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損したセラチア属微生物変異体を作製した。
　ｐＫＤ４を鋳型として、プライマーとして配列番号２３９および２４０のオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ｐｔｓＧ欠損のための配列長１．６ｋｂのＰＣＲ断片を得た。当該株にｐＫＤ４６を導入したのち、ｐｔｓＧ欠損用ＰＣＲ断片を導入した。得られたカナマイシン耐性株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長より目的遺伝子の欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。プライマーは配列番号２２３および２４２のオリゴＤＮＡを使用した。
　続いてｐＫＤ４６を脱落させ、アンピシリン感受性株を得た。アンピシリン感受性株にｐＣＰ２０を導入し、再びアンピシリン耐性株を取得した。得られた株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長よりカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認した。プライマーは配列番号２４１および２４２のオリゴＤＮＡを使用した。カナマイシン感受性株よりｐＣＰ２０を脱落させた。得られた株を以降ＳｇΔＰＰＧと記載する。
実施例２０
ピルビン酸キナーゼ遺伝子およびホスホトランスフェラーゼ系酵素遺伝子が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物の遺伝子変異体の作製
　実施例１９で作製したＳｇΔＰＰＧ株に対して、実施例２と同様の方法にて参考例１で作製したプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ１を導入し、得られたセラチア属微生物変異体をＳｇΔＰＰＧ／３ＨＡ１とした。
実施例２１
ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　実施例２０で作製したセラチア属微生物変異体を用いて、実施例１５と同様の方法にて３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。
比較例１１
ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損せず、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したセラチア属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　参考例５で作製したＳｇ／３ＨＡ１株を用いて、比較例７と同様の方法にて３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。
　実施例２１の結果と実施例１５の結果を比較すると、ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の遺伝子が欠損し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を強化したセラチア属微生物変異体では、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率がさらに向上することがわかった。また、実施例２１と比較例１１の結果を比較すると、ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の遺伝子が欠損した変異体では、アセチル－ＣｏＡが変換されて生成する酢酸およびエタノールの収率も向上することもわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
実施例２２
ピルビン酸キナーゼ遺伝子およびホスホトランスフェラーゼ系酵素遺伝子が欠損した大腸菌の変異体の作製
　実施例４で作製したＥｃΔＰＰ株の有するホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるｐｔｓＧを欠損させ、ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損した大腸菌の変異体を作製した。
　ｐＫＤ４を鋳型として、プライマーとして配列番号２４３および２４４のオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ｐｔｓＧ欠損のための配列長１．６ｋｂのＰＣＲ断片を得た。当該株にｐＫＤ４６を導入したのち、ｐｔｓＧ欠損用ＰＣＲ断片を導入した。得られたカナマイシン耐性株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長より目的遺伝子の欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。プライマーは配列番号２２３および２４６のオリゴＤＮＡを使用した。
　続いてｐＫＤ４６を脱落させ、アンピシリン感受性株を得た。アンピシリン感受性株にｐＣＰ２０を導入し、再びアンピシリン耐性株を取得した。得られた株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長よりカナマイシン耐性遺伝子の脱落を確認した。プライマーは配列番号２４５および２４６のオリゴＤＮＡを使用した。カナマイシン感受性株よりｐＣＰ２０を脱落させた。得られた株を得られた株を以降ＥｃΔＰＰＧと記載する。
実施例２３
ピルビン酸キナーゼ遺伝子およびホスホトランスフェラーゼ系酵素遺伝子が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌の変異体の作製
　実施例２２で作製したＥｃΔＰＰＧ株に対して、実施例５と同様の方法にて参考例１で作製したｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲ１を導入し、得られた大腸菌変異体をＥｃΔＰＰＧ／３ＨＡ１とした。
実施例２４
ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　実施例２３で作製した大腸菌変異体を用いて、実施例１６と同様の方法にて３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。
比較例１２
ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能が欠損せず、かつ反応Ａ、Ｂ、ＥおよびＦを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入した大腸菌変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　参考例６で作製したＥｃ／３ＨＡ１を用いて、比較例８と同様の方法にて３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。
　実施例２４の結果と実施例１６の結果を比較すると、ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の遺伝子が欠損し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を強化した大腸菌変異体では、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率がさらに向上することがわかった。また、実施例２４と比較例１２の結果を比較すると、ピルビン酸キナーゼおよびホスホトランスフェラーゼ系酵素の遺伝子が欠損した変異体では、アセチル－ＣｏＡが変換されて生成する酢酸およびエタノールの収率も向上することもわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026

Claims (13)

  1. 　以下（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強し、かつピルビン酸キナーゼの機能を欠損させた遺伝子改変微生物：
    　（ａ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    　（ｂ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド、
    　（ｃ）配列番号１～７のいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド。
  2. 　前記（ｂ）および（ｃ）から選択されるポリペプチドが、配列番号１７３のアミノ酸配列からなる領域を含む、請求項１記載の遺伝子改変微生物。
  3. 　前記配列番号１７３のアミノ酸配列において、Ｎ末端側から１３番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンまたはロイシンであり、Ｎ末端側から１５番目のアミの酸残基がロイシンまたはグルタミンであり、Ｎ末端側から１６番目のアミノ酸残基がリシンまたはアスパラギンであり、Ｎ末端側から１７番目のアミノ酸残基がグリシンまたはセリンであり、Ｎ末端側から１９番目のアミノ酸残基がプロリンまたはアルギニンであり、Ｎ末端側から２１番目のアミノ酸残基がロイシン、メチオニンまたはバリンである、請求項２記載の遺伝子改変微生物。
  4. 　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属からなる群から選ばれる微生物の遺伝子改変体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
  5. 　アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する能力並びに３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する能力を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
  6. 　アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する能力並びに２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成する能力を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
  7. 　アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する能力、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからアジピル－ＣｏＡを生成する能力並びにアジピル－ＣｏＡからアジピン酸を生成する能力を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
  8. 　さらにホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能を欠損させた、請求項１～７のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
  9. 　請求項１～５および８のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法。
  10. 　請求項１～４、６および８のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、α－ヒドロムコン酸の製造方法。
  11. 　請求項１～４、７および８のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、アジピン酸の製造方法。
  12. 　Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子にコードされるポリペプチドをコードする核酸を導入または当該ポリペプチドの発現を増強し、かつピルビン酸キナーゼの機能を欠損させた遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸およびアジピン酸からなる群から選ばれる１つ以上の物質の製造方法。
  13. 　前記遺伝子改変微生物がさらにホスホトランスフェラーゼ系酵素の機能を欠損させた微生物である、請求項１２に記載の方法。
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