WO2019107516A1 - ３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法 - Google Patents

３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法 Download PDF

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seq
acid
polypeptide
amino acid
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匡平 磯部
河村　健司
山田　勝成
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東レ株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a genetically modified microorganism in which a nucleic acid encoding a polypeptide involved in production of a target substance is introduced, or in which expression of the polypeptide is enhanced, and a method for producing a substance using the microorganism.
  • 3-hydroxyadipic acid (IUPAC name: 3-hydroxyhexanedioic acid), ⁇ -hydromuconic acid (IUPAC name: (E) -hex-2-enedioic acid) and adipic acid (IUPAC name: hexanedioic acid) are dicarbons having 6 carbon atoms It is an acid. These can be used as polyesters by polymerizing with polyhydric alcohols and as raw materials of polyamides by polymerizing with polyhydric amines. In addition, ammonia can be added to these ends to lactamize, which can be a raw material of polyamide alone.
  • 3-hydroxyadipate (3-hydroxyadipate) is described as a metabolic intermediate generated in microorganisms in the pathway for biosynthesis of butadiene.
  • Patent Document 2 As an example of literature related to biosynthesis of ⁇ -hydromuconic acid using microorganisms, trans, trans-muconic acid from succinyl-CoA is disclosed in Patent Document 2 relating to production of muconic acid using non-naturally occurring microorganisms.
  • ⁇ -hydromuconic acid (2,3-dehydroadipate) is described as a metabolic intermediate generated in microorganisms in the biosynthetic pathway.
  • Patent documents 1 and 2 describe the metabolic pathway which can produce 3-hydroxyadipic acid or ⁇ -hydromuconic acid in the microorganism, but stop the metabolism with 3-hydroxyadipic acid or ⁇ -hydromuconic acid, and the culture solution There is no mention of secretion inside. Also, using non-naturally occurring microorganisms into which a nucleic acid encoding an enzyme catalyzing the reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to 3-hydroxyadipyl-CoA described in Patent Documents 1 to 3 is actually used. It has not been tested whether 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid or adipic acid can be produced.
  • a genetically modified microorganism in which a nucleic acid encoding an enzyme exhibiting an excellent activity in a reduction reaction using 3-oxoadipyl-CoA as a substrate is introduced, or expression of the enzyme is enhanced, and production of a substance using the modified microorganism Intended to provide a method.
  • the inventors of the present invention conducted extensive studies to achieve the above object, and as a result, a group of polypeptides having similar amino acid sequences catalyzed a reaction of reducing 3-oxoadipyr-CoA to 3-hydroxyadipyr-CoA It has been found to show activity, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following.
  • the 13th amino acid residue from the N terminal side is phenylalanine or leucine
  • the 15th amino acid residue from the N terminal side is leucine or glutamine
  • the N terminal The 16th amino acid residue from the side is lysine or asparagine
  • the 17th N amino acid residue is glycine or serine
  • the 19th amino acid residue from the N terminal is proline or arginine
  • N The genetically modified microorganism according to (2), wherein the 21st amino acid residue from the terminal side is preferably leucine, methionine or valine.
  • the genetically modified microorganism according to any one of (1) to (3) which is a genetically modified version of a microorganism selected from the group consisting of Escherichia, Serratia, Hafnia and Pseudomonas.
  • (1) to (4) having the ability to form 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A from acetyl-CoA and succinyl-CoA, and the ability to form 3-hydroxyadipate from 3-hydroxyadipyl-CoA, The genetically modified microorganism according to any one of the above 1.).
  • a method for producing ⁇ -hydromuconic acid comprising culturing the genetically modified microorganism according to any one of (1) to (4) and (6) in a medium containing a carbon source as a fermentation raw material .
  • a method for producing adipic acid which comprises culturing the genetically modified microorganism according to any one of (1) to (4) and (7) in a medium containing a carbon source as a fermentation source.
  • a gene in which a nucleic acid encoding a polypeptide encoded by a 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene constituting a gene cluster and a 5-aminolevulinate synthase gene in a microorganism belonging to the genus Serratia, or a gene having enhanced expression of the polypeptide A method for producing one or more substances selected from the group consisting of 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and adipic acid, which comprises culturing a modified microorganism in a medium containing a carbon source as a fermentation source.
  • the genetically modified microorganism according to the present invention expresses an enzyme that exhibits excellent activity in the reduction reaction from 3-oxoadipyl-CoA to 3-hydroxyadipyl-CoA, so It excels in the productivity of the produced 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or adipic acid.
  • the method for producing a substance according to the present invention uses genetically modified microorganisms excellent in the productivity of 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or adipic acid produced via 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • the productivity of substances can be greatly improved.
  • the microorganism of the present invention is a genetically modified microorganism into which a nucleic acid encoding the polypeptide described in (a) to (c) below has been introduced or the expression of the polypeptide has been enhanced.
  • A The polypeptide consisting of the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 6 and 213
  • a polypeptide (c) sequence comprising an amino acid sequence which is deleted, inserted and / or added and which catalyzes a reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to form 3-hydroxyadipyl-CoA Having an identity of 70% or more to the amino acid sequence described in any of Nos. 1-6 and 213, and an activity of reducing 3-oxoadipyl-CoA to form 3-hydroxyadipyl-CoA Polypeptide having
  • 3-oxoadipyl-CoA reductase an enzyme that catalyzes a reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to form 3-hydroxyadipyl-CoA is referred to as "3-oxoadipyl-CoA reductase”.
  • 3-hydroxyadipic acid may be abbreviated as 3HA, ⁇ -hydromuconic acid as HMA, and adipic acid as ADA.
  • introducing nucleic acid refers to introducing a nucleic acid from the outside of the microorganism into the inside of the cell to give the microorganism the ability to produce the polypeptide encoded by the nucleic acid.
  • the method of introduction is not particularly limited, and a method of incorporating the nucleic acid into an expression vector capable of autonomous replication in the microorganism and introducing it into a host microorganism, a method of incorporating the nucleic acid into the genome of the microorganism, and the like can be used.
  • enhancing expression of a polypeptide refers to enhancing expression of a polypeptide originally possessed by a microorganism.
  • the method of enhancing expression is not particularly limited, a method of increasing the copy number of a nucleic acid encoding the polypeptide, a method of modifying a promoter region upstream of the coding region of the polypeptide and a ribosome binding sequence can be mentioned. These methods may be performed alone or in combination.
  • nucleic acids may be introduced. Also, introduction of nucleic acid may be combined with enhancement of expression of polypeptide.
  • the amino acid sequence comprises one or several amino acids substituted, deleted, inserted and / or added, and 3-oxoadipyl
  • the range of "one or several” is preferably 10 or less, more preferably 5 or less, particularly preferably 4 or less, and most preferably 1 or 2 for a polypeptide having an enzyme activity of -CoA reductase It is within.
  • conservative substitution when an amino acid is substituted, the activity of the polypeptide is likely to be maintained when it is substituted with an amino acid having similar properties (so-called conservative substitution).
  • the 20 kinds of amino acids constituting the natural protein are neutral amino acids (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro) having a low polarity side chain, and neutral amino acids (Asn) having a hydrophilic side chain. , Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (Arg, Lys, His), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp) such as those having similar properties And the substitution among them often does not change the properties of the polypeptide.
  • Sequence identity for a polypeptide having 70% or more sequence identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-6 and 213, and having the enzyme activity of 3-oxoadipyl-CoA reductase, used in the present invention 80% or more is preferable, More preferably, it is 85% or more, More preferably, it is 90% or more, More preferably, it is 95% or more, More preferably, it is 97% or more, More preferably, it is 99% or more.
  • sequence identity refers to all amino acid sequences that overlap in an optimal alignment when aligning two amino acid sequences or nucleotide sequences with or without introducing a gap (translation It means the ratio (percentage) of the same amino acid or base to the starting amino acid (including the starting amino acid) or the base sequence (including the start codon), which is calculated according to formula (1).
  • the shorter sequence length to be compared is 400 amino acids or more, and in the case of less than 400 amino acids, sequence identity is not defined. Sequence identity can be easily checked using BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), which is a commonly used algorithm in this field.
  • BLAST is available to anyone from websites such as the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), and can easily determine sequence identity using default parameters. .
  • sequence identity can also be determined using similar functions incorporated in software such as Genetyx.
  • Sequence identity (%) number of matches (gaps are not counted) / shorter sequence length (length not including gaps at both ends) ⁇ 100 (1)
  • SEQ ID NO: 2 when the sequence identity between the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 6 and 213 is calculated using Genetyx's function (% Identity Matrix), SEQ ID NO: 2 with the lowest sequence identity value The value of 4 is 71.51%, and the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 and 213 have at least 70% or more sequence identity with each other.
  • the calculation results of sequence identity using Genetyx are shown in Table 1. In Tables 1 to 5 below, the numbers on the leftmost side indicate the sequence numbers.
  • Each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 and 213 is used as Query, and the sequence identity with all amino acid sequences registered in NCBI's amino acid database (Non-redundant protein sequences) is checked using BLASTP. All the sequences having 70% or more of sequence identity were derived from Serratia bacteria.
  • amino acid residues 15 to 38 from the N terminal side may simply be represented as “15 to 38 a.a.”
  • Xaa is any amino acid residue, but 13a.a. is preferably phenylalanine or leucine, 15a.a. is preferably leucine or glutamine, 16a.a. is preferably lysine. Or asparagine, 17a.a.
  • Consensus sequence 1 corresponds to an NAD + binding residue and amino acid residues around it. NAD + binding residues are described in Biochimie. 2012 Feb; 94 (2): 471-8. As shown in the above, it is characterized in that the 24th amino acid residue of consensus sequence 1 is aspartic acid, but the consensus sequence 1 is asparagine.
  • consensus sequence 1 the polypeptides set forth in SEQ ID NOs: 1-6 and 213 are considered to exhibit excellent enzymatic activity as 3-oxoadipyl-CoA reductase.
  • polypeptides described in (b) and (c) above also preferably have a consensus sequence 1 consisting of 24 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 212 within 1 to 200 aa. More preferred consensus sequences are within 1 to 150 a.a., more preferably within 1 to 100 a.a. Specific examples thereof include the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 7-16 and 70-138. The amino acid sequences of SEQ ID NOs: 7-16 and 70-138 have a consensus sequence 1 consisting of 24 amino acid residues as shown in SEQ ID NO: 212 in 15-38 a.a.
  • amino acid sequences of SEQ ID NOS: 7 to 16 and 70 to 138 have sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 6 and 213.
  • sequence identity using Genetyx are shown in Tables 2-1 to 2-3 and Tables 3-1 to 3-3.
  • the nucleic acid encoding the polypeptide according to (a) to (c) of the present invention may contain a sequence such that an additional peptide or protein is added to the N-terminus and / or C-terminus of the polypeptide.
  • an additional peptide or protein is added to the N-terminus and / or C-terminus of the polypeptide.
  • peptides or proteins for example, those containing secretory signal sequences, transport proteins, binding proteins, tag peptides for purification, fluorescent proteins and the like can be exemplified.
  • those skilled in the art can select a peptide or protein having an addition function according to the purpose and add it to the polypeptide of the present invention.
  • the sequence identity of the amino acid sequence does not include such a peptide or protein.
  • the nucleic acid encoding the polypeptide set forth in SEQ ID NOs: 1-16, 70-138 or 213 is particularly limited as long as it is a base sequence that can be translated into the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 1-16 or 70-138. Alternatively, it can be determined with reference to the codon (standard genetic code) corresponding to each amino acid. At that time, the base sequence may be redesigned at codons frequently used for the host microorganism used in the present invention.
  • base sequence of the nucleic acid encoding the polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOS: 1-16, 70-138 and 213 include the base set forth in SEQ ID NOS: 54-69, 139-207 and 214, respectively. Sequence is mentioned.
  • a polypeptide encoded by a certain nucleic acid has 3-oxoadipyl-CoA reductase activity
  • transformant strain A and transformant strain B were prepared, and as a result of culture test, culture broth If 3-hydroxyadipic acid or ⁇ -hydromuconic acid can be identified therein, it is determined that the nucleic acid encodes a polypeptide having 3-oxoadipyl-CoA reductase activity.
  • the determination method is described using the biosynthetic pathway shown in the following scheme 1.
  • reaction A shows a reaction for producing 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A from acetyl-CoA and succinyl-CoA.
  • reaction B shows a reaction for producing 3-hydroxyadipyl-CoA from 3-oxoadipyl-CoA.
  • reaction C shows a reaction for producing 2,3-dehydroadipyr-CoA from 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • reaction D shows a reaction for producing adipyl-CoA from 2,3-dehydroadipyl-CoA.
  • Reaction E shows a reaction of producing 3-hydroxyadipic acid from 3-hydroxyadipyr-CoA.
  • Reaction F shows a reaction of producing ⁇ -hydromuconic acid from 2,3-dehydroadipyl-CoA.
  • Reaction G shows a reaction for producing adipic acid from adipyl-CoA.
  • Transformed strain A has an enzyme that catalyzes reaction A, reaction E and reaction F.
  • Transformed strain B has an enzyme that catalyzes reaction A, reaction C, reaction E and reaction F.
  • a transformed strain A is prepared.
  • a plasmid expressing an enzyme catalyzing reaction A, reaction E and reaction F, respectively, is prepared.
  • the reactions E and F can catalyze the reaction with the same enzyme.
  • the plasmid is introduced into a strain of Escherichia coli BL21 (DE3), which is a microbial strain not capable of producing any of 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and adipic acid.
  • An expression plasmid in which a nucleic acid encoding a polypeptide to be tested for the presence or absence of the enzyme activity is inserted downstream of a suitable promoter is introduced into the obtained transformant, to obtain a transformant A.
  • transformant strain A is cultured, and it is confirmed whether or not the culture solution after the culture contains 3-hydroxyadipic acid. If 3-hydroxyadipic acid can be confirmed in the culture solution, then transformant strain B is prepared. Transformed strain B is obtained by preparing and introducing a plasmid expressing an enzyme catalyzing reaction C into transformed strain A. The transformant strain B is cultured, and it is confirmed whether or not the culture solution after the culture contains ⁇ -hydromuconic acid. If it can be confirmed that the culture solution after culture contains ⁇ -hydromuconic acid, 3-hydroxyadipic acid produced by transformant A and ⁇ -hydromuconic acid produced by transformant B are 3-hydroxy adipate. It is determined that the polypeptide of interest has 3-oxoadipyl-CoA reductase activity, as it is known that it was produced via adipyl-CoA.
  • pcaF NCBI Gene ID: 1041755, SEQ ID NO: 20
  • pcaF NCBI Gene ID: 1041755, SEQ ID NO: 20
  • pcaI and pcaJ NCBI Gene ID: 1046613, 1046612, SEQ ID NO: 23, 24
  • the polypeptides encoded by pcaI and pcaJ catalyze reactions E and F by forming a complex.
  • Pseudomonas putida KT2440 strain gene paaF (NCBI Gene ID: 1046932, SEQ ID NO: 47) is used.
  • the culture method of the transformed strain A and the transformed strain B is as follows. At the time of culture, an antibiotic for stably holding a plasmid, and a substance which induces expression of a polypeptide encoded by the incorporated nucleic acid can be appropriately added.
  • One transformation platinum A or B was added to 5 mL of culture medium I (Bacto tryptone (Difco Laboratories) 10 g / L, Bacto yeast extract (Difco Laboratories) 5 g / L, sodium chloride 5 g / L) adjusted to pH 7 Inoculate the ear and shake culture at 30 ° C., 120 min-1 for 18 hours to obtain a pre-culture solution.
  • the medium II succinic acid 10 g / L, glucose 10 g / L, ammonium sulfate 1 g / L, potassium phosphate 50 mM, magnesium sulfate 0.025 g / L, iron sulfate
  • 0.25 mL of the preculture liquid was adjusted to pH 6.5 0.0625 mg / L, manganese sulfate 2.7 mg / L, calcium chloride 0.33 mg / L, sodium chloride 1.25 g / L, Bacto tryptone 2.5 g / L, Bacto yeast extract 1.25 g / L
  • the obtained culture broth contains 3-hydroxyadipic acid or ⁇ -hydromuconic acid.
  • the presence of 3-hydroxyadipic acid or ⁇ -hydromuconic acid in the culture can be confirmed by centrifuging the culture and analyzing the supernatant by LC-MS / MS.
  • the conditions of analysis are as follows.
  • LC detector DAD (210 nm) MS / MS: Triple-Quad LC / MS (manufactured by Agilent Technologies) Ionization method: ESI negative mode.
  • the value of the activity of 3-oxoadipyl-CoA reductase can be determined by using 3-oxoadipyl-CoA reductase, which is prepared from 3-oxoadipate by enzymatic reaction, using 3-oxoadipyl-CoA as a substrate and 3-hydroxyadipyl- It can be calculated by measuring CoA.
  • the specific method is as follows.
  • 3-oxoadipic acid can be prepared by known methods (for example, the method described in Reference Example 1 of WO 2017/099209).
  • PCR is performed using genomic DNA of Pseudomonas putida strain KT2440 as a template according to a conventional method to amplify the full length of a nucleic acid encoding CoA transferase (pcaI and pcaJ, NCBI-GeneID: 1046613 and 1046612) Do.
  • the nucleotide sequences of the primers used in this PCR are, for example, SEQ ID NOs: 25 and 26.
  • the amplified fragment is inserted into the KpnI site of pRSF-1b (manufactured by Novagen), an expression vector for E. coli, in the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid is introduced into E. coli BL21 (DE3), induction of expression of the enzyme by isopropyl-.beta.-thiogalactopyranoside (IPTG) is carried out according to a conventional method, followed by purification using a histidine tag from the culture solution, CoA Obtain a transferase solution.
  • the enzyme reaction solution for preparation of 3-oxoadipyl-CoA having the following composition is prepared using the solution, reacted for 3 minutes at 25 ° C., and then UF membrane (Amicon Ultra-0.5 mL 10 K, manufactured by Merck Millipore) is used. The enzyme is removed by treatment, and the resulting permeate is converted to a 3-oxoadipyl-CoA solution.
  • Enzyme reaction solution for preparation of 3-oxoadipyl-CoA 100 mM Tris-HCl (pH 8.2) 10 mM MgCl 2 0.5 mM succini-CoA 5mM 3-oxoadipic acid sodium salt 2 ⁇ M CoA transferase.
  • PCR is carried out according to a conventional method using genomic DNA of the target microorganism strain as a template to amplify the entire nucleic acid encoding 3-oxoadipyl-CoA reductase.
  • the nucleotide sequences of the primers used in this PCR are, for example, SEQ ID NOs: 31 and 32.
  • the amplified fragment is inserted into the BamHI site of an expression vector pACYCDuet-1 (manufactured by Novagen) for E. coli in the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid is introduced into E.
  • the genetically modified microorganism in which the expression of the polypeptide described in (a) to (c) is enhanced is a microorganism originally having a nucleic acid encoding the polypeptide described in (a) to (c).
  • the host microorganism is a microorganism having the expression of the polypeptide described in (a) to (c) possessed by the host microorganism enhanced by genetic modification.
  • microorganisms originally having a nucleic acid encoding the polypeptide described in (a) to (c) include the following Serratia microorganisms.
  • Serratia marcescens a microorganism having SEQ ID NO: 1, 70-80, 82-85, 87-118
  • Serratia nematodiphila a microorganism having SEQ ID NO: 2, 81, 119
  • Serratia plymuthica SEQ ID NO: 3, 131-136, 138
  • Serratia proteamaculans a microorganism having SEQ ID NO: 4, 137
  • Serratia urealitica a microorganism having SEQ ID NO: 5
  • Serratia sp Serratia sp.
  • BW 106 (a microorganism having SEQ ID NO: 6), Serratia sp. S119 (a microorganism having SEQ ID NO: 7), Serratia sp. YD25 (a microorganism having SEQ ID NO: 8), Serratia sp. FS14 (a microorganism having SEQ ID NO: 9), Serratia sp. HMSC15F11 (a microorganism having SEQ ID NO: 10), Serratia sp. JKS 0001 99 (a microorganism having SEQ ID NO: 11), Serratia sp. TEL (a microorganism having SEQ ID NO: 12), Serratia sp.
  • ISTD04 (a microorganism having SEQ ID NO: 13), Serratia sp. SCBI (a microorganism having SEQ ID NO: 14), Serratia sp. S4 (a microorganism having SEQ ID NO: 15), Serratia sp. C-1 (a microorganism having SEQ ID NO: 16), Serratia sp. OMLW3 (a microorganism having SEQ ID NO: 86), Serratia sp. OLEL 1 (a microorganism having SEQ ID NO: 120), Serratia sp. OLEL2 (a microorganism having SEQ ID NO: 123), Serratia liquefaciens (a microorganism having SEQ ID NO: 213) and the like.
  • polypeptides described in (a), (b) and (c) above also have 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase activity, and this 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase is a microorganism of the genus Serratia. And a 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene which constitutes a 5-aminolevulinate synthase gene and a gene cluster.
  • the “gene cluster” refers to a series of nucleic acid groups having related functions in close proximity It means the area that exists. Specific components of the gene cluster include, for example, a nucleic acid group transcriptionally regulated by a single transcriptional regulator, an operon transcribed under the control of a single transcriptional promoter, and the like. Whether a certain nucleic acid is a nucleic acid that constitutes a gene cluster can also be examined online using a gene cluster search program such as antiSMASH.
  • the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is registered as Gene ID: CP000826.1 in the NCBI database, and is conserved on the genome of Serratia proteamaculans 568, and Gene ID: CP000826 It can be searched that it is stored in the positions 2015313 to 2016842 of .1. Furthermore, from the positional information of this gene, gene sequences before and after it can be confirmed, and it can also be confirmed that the gene cluster shown in FIG. 1 is formed with the 5-aminolevulinate synthase gene (Protein ID: ABV40933.1).
  • the amino acid sequences of 127 to 133, 135 to 137 and 213 can be confirmed on NCBI by the protein ID and gene ID shown in Table 13.
  • a “nucleic acid encoding a polypeptide encoded by a 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene constituting a 5-aminolevulinate synthase gene and a gene cluster in a microorganism of Serratia” is used in the present invention. Described as 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene, and the polypeptide encoded by the 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene is described as "3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase used in the present invention”.
  • the gene cluster containing the 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene used in the present invention includes other nucleic acids in the cluster as long as it contains at least the 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene and the 5-aminolevulinate synthase gene. It may be done.
  • FIG. 1 shows a specific example of a gene cluster including the 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene used in the present invention.
  • Serratia genus microorganism having the gene cluster is S. Marcescens, S. Nematodiphila, S. Plymuthica, S. Proteamaculans, S. Urealitica, S. Liquefaciens, Serratia sp. BW 106, Serratia sp. S119, Serratia sp. YD25, Serratia sp. FS 14, Serratia sp. HMSC15F11, Serratia sp. JKS 0001 99, Serratia sp. TEL, Serratia sp. ISTD04, Serratia sp. SCBI, Serratia sp. S4, Serratia sp. C-1, Serratia sp. OMLW3, Serratia sp. OLEL1, Serratia sp. OLEL2, S. Liquefaciens etc. are mentioned.
  • the 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase used in the present invention has excellent 3-oxoadipyl-CoA reductase activity. Whether a nucleic acid encoding 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase has 3-oxoadipyl-CoA reductase activity can be confirmed in the same manner as described above.
  • polypeptide encoded by the 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase gene used in the present invention is characterized by having a consensus sequence 1.
  • amino acid sequence of such polypeptide include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-16, 70-138 or 213.
  • one or more amino acids may be substituted, deleted, inserted and / or changed in the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 7 to 16 or 70 to 138, as long as they have the consensus sequence 1 above.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an added amino acid sequence and having an enzyme activity catalyzing a reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to form 3-hydroxyadipyl-CoA can also be preferably used.
  • the range of "one or several" is preferably 10 or less, more preferably 5 or less, particularly preferably 4 or less, and most preferably 1 or 2 or less.
  • sequence identity is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, more preferably with the amino acid sequence of any polypeptide of SEQ ID NO: 7-16 or 70-138.
  • the reaction has a sequence identity of preferably 95% or more, more preferably 97% or more, more preferably 99% or more, and catalyzing a reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to form 3-hydroxyadipyl-CoA
  • a nucleic acid encoding a polypeptide having an enzymatic activity can also be preferably used.
  • 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase used in the present invention
  • a polypeptide having the activity of 3-oxoadipyl-CoA reductase for example, PaaH derived from Pseudomonas putida strain KT2440 (SEQ ID NO: 208), Escherichia coli str. K-12 substr.
  • polypeptide examples include PaaH (SEQ ID NO: 209) derived from MG1655 strain, DcaH (SEQ ID NO: 210) derived from Acinetobacter baylyi ADP1 strain, PaaH (SEQ ID NO: 211) derived from Serratia plymuthica NBRC 102599 strain, etc. As shown in Table 4 and Table 5, it can be seen that Consensus Sequence 1 is not included.
  • these polypeptides consist of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of any one of (b) SEQ ID NO: 1-6 and 213, And a polypeptide having an enzyme activity catalyzing a reaction for reducing 3-oxoadipyl-CoA to form 3-hydroxyadipyl-CoA, or (c) against the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6 and 213 It does not correspond to a polypeptide having a sequence identity of 70% or more and having an enzyme activity that catalyzes a reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to form 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • the microorganism which can be used as a host for obtaining the genetically modified microorganism in the present invention is Escherichia coli, Serratia, Hafnia, Psuedomonas, Corynebacterium, Bacillus, Streptomyces, Cupriavidus, Acinetobacter, Alcaligenes, Brevibacterium.
  • Microorganisms belonging to the genera Delftia, Shimwellia, Aerobacter, Rhizobium, Thermobifida, Clostridium, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia and Candida are included. Among these, microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Hafnia, and Pseudomonas are preferable.
  • a method of producing 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or adipic acid using the genetically modified microorganism of the present invention is described.
  • the genetically modified microorganism of the present invention is capable of producing 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A from acetyl-CoA and succinyl-CoA (reaction A), and produces 3-hydroxyadipic acid from 3-hydroxyadipyl-CoA If it is capable of (reaction E), 3-hydroxyadipic acid can be produced.
  • reaction A 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A
  • 3-hydroxyadipic acid from 3-hydroxyadipyl-CoA
  • reaction E 3-hydroxyadipic acid
  • a microorganism having these generation capabilities as a host microorganism
  • genetically modified microorganisms capable of highly producing 3-hydroxyadipic acid can be obtained.
  • the following microorganisms are mentioned as microorganisms presumed to originally have these production ability.
  • Escherichia genus such as Escherichia fergusonii, Escherichia coli, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas putida, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas chlororaphis subsp.
  • Corinobacterium such as P.
  • aureofaciens such as Psuedomonas sp., Hafnia alvei, such as Hafnia, such as Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, such as Corynebacterium glutamicum, such as Bacillus subtilis C, such as Stre Cupellavidium, for example, to the genus Tomyces, Cupriavidus metallidurans, Cupriavidus necator, Cupriavidus, such as Cupriavidus, such as Acinetobacter baylyi, Acinetobacter, such as Acinetobacter radioresistens, such as the genus Alcaligenes, such as the genus Alcaligenes Shimwell such as Delftia spp., Shimwellia blattae a genus, Aerobacter genus such as Aerobacter cloacae, Rhizobium species such as Rhizob
  • reaction A 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A from acetyl-CoA and succinyl-CoA
  • reaction E 3-hydroxyadipate from 3-hydroxyadipyl-CoA
  • the ability to generate these reactions is imparted by introducing into the microorganism a nucleic acid encoding an enzyme catalyzing reactions A and E appropriately combined and introduced into a microorganism. be able to.
  • a microorganism having these generation capabilities as a host microorganism, a genetically modified microorganism capable of highly producing ⁇ -hydromuconic acid can be obtained.
  • Escherichia genus such as Escherichia fergusonii, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas chlororaphis subsp.
  • Aureofaciens such as Psuedomonas, Hafnia alvei, such as Hafnia, Bacillus badius, such as Bacillus, Cupriavidus metallidurans, Cupriavidus numazuensis, such as Cupriavidus, such as Cupriavidus, Acinetobacter baylyceli, Delftia genus such as Delftia acidovorans, Shimwellia such as Shimwellia blattae , Serratia grimesii, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia odorifera, Serratia plymuthica, Serratia spp., Such as Serratia entomophila or Serratia nematodiphila.
  • the ability of the genetically modified microorganism of the present invention to produce 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A from acetyl-CoA and succinyl-CoA (reaction A), dehydrating 3-hydroxyadipyl-CoA to give 2,3-dehydroazid Reactions A and C, if not originally possessing the ability to form pill-CoA (Reaction C) and 2,3-dehydroadipyl-CoA to generate ⁇ -hydromuconic acid (Reaction F).
  • the ability to generate these can be imparted by introducing into a microorganism a nucleic acid encoding an enzyme catalyzing F, in an appropriate combination.
  • the ability of the genetically modified microorganism of the present invention to produce 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A from succinyl-CoA (reaction A), dehydrating 3-hydroxyadipyl-CoA to give 2,3-dehydroadipyl-CoA
  • the ability to generate (reaction C), the ability to reduce 2,3-dehydroadipyl-CoA to form adipyl-CoA (reaction D), and the ability to form adipic acid from adipyl-CoA (reaction G) If it has, adipic acid can be produced.
  • microorganism having these producing ability as a host microorganism, a genetically modified microorganism capable of highly producing adipin can be obtained.
  • Microorganisms which are presumed to inherently have the ability to produce these include Thermobifida genera such as Thermobifida fusca.
  • the ability of the genetically modified microorganism of the present invention to produce 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A from succinyl-CoA (reaction A), dehydrating 3-hydroxyadipyl-CoA to give 2,3-dehydroadipyl-CoA
  • the ability to generate (reaction C), the ability to reduce 2,3-dehydroadipyl-CoA to form adipyl-CoA (reaction D), and the ability to form adipic acid from adipyl-CoA (reaction G)
  • the ability to generate these can be imparted by introducing into a microorganism a nucleic acid encoding an enzyme that catalyzes reactions A, C, D, and G appropriately combined and introduced into a microorganism.
  • acyltransferase As an enzyme catalyzing reaction A for producing 3-oxoadipyl-CoA, for example, acyltransferase ( ⁇ -ketothiolase) can be used.
  • the acyltransferase is not particularly limited in classification by EC number, but EC 2.3.1. Acyltransferases classified into-are preferred, and specifically, enzymes classified into EC 2.3. 1.174 as 3-oxoadipyl-CoA thiolase, EC 2.3. 1.9 as acetyl-CoA C-acetyltransferase
  • Enzymes classified, enzymes classified as EC2.3.1.16 as acetyl-CoA C-acyltransferase can be mentioned.
  • PaaJ NCBI-Protein ID: NP_415915
  • PcaF NCBI-Protein ID: NP_743536
  • Pseudomonas putida KT 2440 strain and the like can be preferably used.
  • acyltransferase can generate 3-oxoadipyl-CoA using succinyl-CoA and acetyl-CoA as a substrate depends on the reaction of 3-oxoadipyl-CoA with purified acyltransferase and 3-oxoadipyl-CoA as a substrate
  • the reduction reaction by the purified 3-oxoadipyl-CoA reductase can be combined and the reduction can be confirmed by measuring the amount of reduction of NADH accompanying the reduction of 3-oxoadipyl-CoA.
  • the specific measurement method is, for example, as follows.
  • PCR is carried out according to a conventional method using genomic DNA of the target microorganism strain as a template to amplify a full-length nucleic acid encoding acyltransferase.
  • the amplified fragment is inserted into the SacI site of an expression vector pACYCDuet-1 (manufactured by Novagen) for E. coli in the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid is introduced into E.
  • coli BL21 (DE3), induction of expression of the enzyme by isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) is carried out according to a conventional method, followed by purification using a histidine tag from a culture solution, Obtain a transferase solution.
  • the acyltransferase activity can be confirmed by preparing an enzyme reaction solution of the following composition using the enzyme solution and measuring the decrease in absorption at 340 nm associated with the oxidation of NADH at 30 ° C.
  • Whether or not the enzyme originally expressed in the host microorganism used in the present invention has an acyltransferase activity can be determined by performing the above-mentioned measurement using cell free extract (CFE) instead of the purified acyltransferase. It can confirm.
  • CFE cell free extract
  • the specific measuring method for E. coli is, for example, as follows.
  • E. coli MG1655 strain to be subjected to activity measurement was inoculated in 5 mL of culture medium adjusted to pH 7 (media composition: 10 g / L of tryptone, 5 g / L of yeast extract, 5 g / L of sodium chloride) Incubate with shaking for 18 hours.
  • the obtained culture solution was adjusted to pH 7 (medium composition: 10 g / L of tryptone, 5 g / L of yeast extract, 5 g / L of sodium chloride, 2.5 mM of ferulic acid, 2.5 mM of p-coumaric acid, benzoic acid 2.
  • a UF membrane (Amicon Ultra-0.5 mL 10 K, manufactured by Merck Millipore), the permeate is removed, and then 0.4 mL of Tris-HCl buffer is used. After removing low molecular weight contaminants by repeating the addition three times, resuspend with Tris-HCl buffer to make the volume 0.1 mL, which is called CFE. In place of the purified enzyme, 0.05 mL of the CFE is added to a total of 0.1 mL of the enzyme reaction solution to confirm the enzyme activity.
  • enoyl-CoA hydratase As an enzyme catalyzing the reaction C for producing 2,3-dehydroadipyl-CoA, for example, enoyl-CoA hydratase can be used.
  • the enoyl-CoA hydratase is not particularly limited in classification by EC number, but EC number 4.2.1. Enoyl-CoA hydratase classified into-is preferred, and specific examples thereof include enzymes classified into EC 4.2.1.17 as enoyl-CoA hydratase or 2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase.
  • PaaF (NCBI-ProteinID: NP_415911) derived from Escherichia coli MG1655 strain
  • PaaF (NCBI-ProteinID: NP_745427) derived from Pseudomonas putida KT 2440 strain, and the like can be preferably used.
  • enoyl-CoA hydratase catalyzes a reaction in which 2,3-dehydroadipyl-CoA is generated using 3-hydroxyadipyl-CoA as a substrate
  • the activity is detected by detecting 3-hydroxyadipyl-CoA generated using purified enoyl-CoA hydratase using 2,3-dehydroadipyl-CoA prepared by enzyme reaction from ⁇ -hydromuconic acid as a substrate It can confirm by that.
  • the specific measurement method is, for example, as follows.
  • the ⁇ -hydromuconic acid used here can be prepared by a known method (for example, the method described in Reference Example 1 of WO 2016/199858 A1).
  • PCR is performed using the genomic DNA of Pseudomonas putida strain KT2440 as a template according to a conventional method, and the nucleic acid encoding CoA transferase (pcaI and pcaJ, NCBI-GeneID: 1046613 and 1046612) Amplify the full length of The amplified fragment is inserted into the KpnI site of pRSF-1b (manufactured by Novagen), an expression vector for E. coli, in the same frame as the histidine tag sequence. The plasmid is introduced into E.
  • Enzyme reaction solution for preparing 2,3-dehydroadipyl-CoA 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM MgCl 2 0.4 mM succini-CoA 2 mM ⁇ -hydromuconic acid sodium salt 20 ⁇ g / mL CoA transferase.
  • PCR is carried out according to a conventional method using genomic DNA of the target microorganism strain as a template to amplify a full-length nucleic acid encoding enoyl-CoA hydratase.
  • the amplified fragment is inserted into the NdeI site of an expression vector pET-16b (manufactured by Novagen) for E. coli in the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid is introduced into E.
  • coli BL21 (DE3), induction of expression of the enzyme by isopropyl-.beta.-thiogalactopyranoside (IPTG) is carried out according to a conventional method, followed by purification from a culture solution using a histidine tag, and enoyl -Obtain a CoA hydratase solution.
  • the enoyl-CoA hydratase activity is prepared by preparing an enzyme reaction solution of the following composition using the solution, reacting at 30 ° C.
  • Whether the enzyme originally expressed in the host microorganism used in the present invention has enoyl-CoA hydratase activity can be determined by using 0.05 mL of a total of 0.1 mL of CFE instead of purified enoyl-CoA hydratase. It can confirm by adding and performing the above-mentioned measurement.
  • a specific example of the method for preparing CFE for E. coli is as described in the method for confirming acyltransferase activity.
  • enoyl-CoA reductase As an enzyme catalyzing the reaction D for producing adipyl-CoA, for example, enoyl-CoA reductase can be used.
  • the enoyl-CoA reductase is not particularly limited in classification by EC number, but EC number 1.3. -.
  • Enzymes classified into Specific examples thereof are described in, for example, JP-A-2011-515111, J Appl Microbiol. 2015 Oct; 119 (4): 1057-63.
  • Etc. among which TER (UniProtKB: Q5EU90) derived from Euglena gracilis Z strain, Tfu_1647 (NCBI-ProteinID: AAZ55682) derived from Thermobifida fusca YX strain, DcaA (NCBI-ProteinID: AAL09094) derived from Acinetobacter baylyi ADP1 strain. .1) can be preferably used.
  • enoyl-CoA reductase has 2,3-dehydroadipyl-CoA as a substrate
  • the activity to form adipyl-CoA is 2,3-dehydroadipyl prepared by enzymatic reaction from ⁇ -hydromuconic acid It can be confirmed by measuring the amount of reduction of NADH accompanying the reduction of 2,3-dehydroadipyl-CoA using purified enoyl-CoA reductase, using -CoA as a substrate.
  • PCR is performed according to a conventional method using genomic DNA of a target microorganism strain as a template to amplify a full-length nucleic acid encoding enoyl-CoA reductase.
  • the amplified fragment is inserted into the NdeI site of an expression vector pET-16b (manufactured by Novagen) for E. coli in the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid is introduced into E.
  • reaction E for producing 3-hydroxyadipic acid As the enzyme catalyzing reaction E for producing 3-hydroxyadipic acid, reaction F for producing ⁇ -hydromuconic acid, and reaction G for producing adipic acid, for example, CoA transferase or acyl-CoA hydrolase can be used. , CoA transferase is preferred.
  • the CoA transferase is not particularly limited in classification by EC number, but EC number 2.8.3. CoA transferase classified into-is preferable, and specifically, CoA transferase or an enzyme classified into EC 2.8.3.6 as acyl-CoA transferase and the like can be mentioned.
  • CoA transferase refers to an enzyme having a catalytic activity (CoA transferase activity) of a reaction for producing carboxylic acid and succinyl-CoA using acyl-CoA and succinic acid as a substrate.
  • PcaI and PcaJ (NCBI-Protein ID: NP — 746081 and NP — 746082) derived from Pseudomonas putida KT 2440 are preferably used as the enzyme catalyzing the reaction E for producing 3-hydroxyadipic acid and the reaction F for producing ⁇ -hydromuconic acid. be able to.
  • DcaI and DcaJ (NCBI-Protein ID: CAG68538 and CAG68539) derived from Acinetobacter baylyi ADP1 strain can preferably be used as an enzyme catalyzing the reaction G for producing adipic acid.
  • the activity of CoA transferase using 3-hydroxyadipyl-CoA, 2,3-dehydroadipyl-CoA or adipyl-CoA as a substrate is 3-hydroxyadipate and succinyl-CoA because this enzyme reaction is a reversible reaction.
  • 3-hydroxyadipyl-CoA, 2,3-dehydroadipyl-CoA or adipyl-CoA produced using purified CoA transferase with ⁇ -hydromuconic acid and succinyl-CoA, or adipic acid and succinyl-CoA as a substrate Can be confirmed by detecting
  • the specific measurement method is, for example, as follows.
  • 3-hydroxy adipic acid is prepared according to the method described in Reference Example 1 of WO 2016/199856 A1.
  • PCR is performed using genomic DNA of the target microorganism strain as a template according to a conventional method to amplify the entire nucleic acid encoding CoA transferase.
  • the amplified fragment is inserted into the KpnI site of pRSF-1b (manufactured by Novagen), an expression vector for E. coli, in the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid is introduced into E.
  • ⁇ -hydromuconic acid is prepared by the method described in Reference Example 1 of WO2016 / 199858A1.
  • PCR is performed using genomic DNA of the target microorganism strain as a template according to a conventional method to amplify the entire nucleic acid encoding CoA transferase.
  • the amplified fragment is inserted into the KpnI site of pRSF-1b (manufactured by Novagen), an expression vector for E. coli, in the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid is introduced into E.
  • PCR is performed using genomic DNA of the target microorganism strain as a template according to a conventional method to amplify a full-length nucleic acid encoding CoA transferase.
  • the amplified fragment is inserted into the KpnI site of pRSF-1b (manufactured by Novagen), an expression vector for E. coli, in the same frame as the histidine tag sequence.
  • the plasmid is introduced into E.
  • Whether the enzyme originally expressed in the host microorganism used in the present invention has CoA transferase activity can be determined by adding 0.05 mL of CFE to a total of 0.1 mL of the enzyme reaction solution instead of purified CoA transferase. This can be confirmed by measuring the A specific example of the method for preparing CFE for E. coli is as described in the method for confirming acyltransferase activity.
  • polypeptides described in (a) to (c) or 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase are characterized by having superior activity to 3-oxoadipyl-CoA reductase used in the prior art. I assume.
  • “superior activity” means culture in a medium containing a carbon source as a fermentation raw material, which is the same host microorganism, a genetically modified microorganism which expresses the polypeptide or conventional 3-oxoadipyl-CoA reductase under expression conditions
  • it means producing 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid, or adipic acid in high yield as compared to a genetically modified microorganism expressing conventional 3-oxoadipyl-CoA reductase.
  • the 3-hydroxyadipic acid yield is calculated according to the formula (3).
  • the ⁇ -hydromuconic acid yield or adipic acid yield is calculated by replacing 3-hydroxyadipic acid of the formula (3) with ⁇ -hydromuconic acid or adipic acid, respectively.
  • Yield (%) 3-hydroxy adipic acid production amount (mol) / consumption of carbon source (mol) x 100 ... Formula (3).
  • the polypeptide described in (a) to (c) or 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase has an activity superior to that of 3-oxoadipyl-CoA reductase used in the prior art.
  • the specific method to do this is as follows.
  • the vector pBBR1MCS-2 (ME Kovach, (1995), Gene 166: 175-176) capable of autonomous replication in E. coli is cleaved with XhoI to obtain pBBR1MCS-2 / XhoI.
  • PCR amplification of upstream region 200b of gapA is performed according to a conventional method using genomic DNA of Escherichia coli K-12 MG1655 as a template (the primer used is For example, the obtained fragment and pBBR1MCS-2 / XhoI are ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) to obtain plasmid pBBR1MCS-2 :: Pgap, for example.
  • pBBR1MCS-2 :: Pgap is cut with ScaI to obtain pBBR1MCS-2 :: Pgap / ScaI.
  • the full-length nucleic acid encoding acyltransferase is PCR-amplified according to a conventional method (the primers used are, for example, SEQ ID NOs: 21 and 22), and the obtained fragment and pBBR1MCS-2 :: Pgap / ScaI, In-Fusion HD Cloning Kit Ligated using to give the plasmid pBBR1MCS-2 :: AT.
  • Cleavage pBBR1 MCS-2 :: AT with HpaI to obtain pBBR1 MCS-2 :: AT / HpaI.
  • the full length nucleic acid encoding CoA transferase is PCR amplified according to a conventional method (the primers used are, for example, SEQ ID NOs: 25 and 26), and the obtained fragment and pBBR1MCS-2 :: AT / HpaI, In-Fusion HD Cloning Kit
  • the plasmid is ligated with pBBR1MCS-2 :: ATCT.
  • an expression vector pACYCDuet-1 capable of autonomous replication in E. coli is cleaved with BamHI to obtain pACYCDuet-1 / BamHI.
  • the nucleic acid encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1-16 or 70-138 or 3-oxoadipyl-CoA reductase used in the prior art is PCR-amplified according to a conventional method (for example, the primers used are SEQ ID NO: 31 and 32) ), The obtained fragment and pACYCDuet-1 / BamHI are ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech), and the polypeptide of SEQ ID NO: 1-16 or 70-138 or used in the prior art A plasmid is obtained which expresses the 3-oxoadipyl-CoA reductase.
  • the obtained plasmid and pBBR1 MCS-2 are introduced into E. coli strain BL21 (DE3) by electroporation (NM Calvin, PC Hanawalt. J. Bacteriol, 170 (1988), pp. 2796-2801).
  • the supernatant obtained by centrifuging the cells from the culture solution is subjected to membrane treatment using Millex-GV (0.22 ⁇ m, PVDF, manufactured by Merck), and the permeate is analyzed to analyze 3-hydroxyadipine in the culture supernatant. Determine the concentration of acid and carbon source. Quantitative analysis of 3-hydroxyadipic acid by LC-MS / MS is performed under the following conditions.
  • LC detector DAD (210 nm) MS / MS: Triple-Quad LC / MS (manufactured by Agilent Technoogies) Ionization method: ESI negative mode.
  • HPLC Shimazu Prominence (manufactured by Shimadzu Corporation)
  • nucleic acid when a nucleic acid encoding any of acyltransferase, CoA transferase, enoyl-CoA hydratase or enoyl-CoA reductase is introduced into a host microorganism, the nucleic acid is artificially prepared based on the amino acid sequence of the enzyme present in the database. And may be separated from nature. In the case of artificial synthesis, the frequency of use of codons corresponding to each amino acid may be changed according to the host microorganism to be introduced.
  • the method for introducing a nucleic acid encoding any of acyltransferase, CoA transferase, enoyl-CoA hydratase or enoyl-CoA reductase into a host microorganism is not particularly limited, and an expression vector capable of autonomous replication in the host microorganism can be used.
  • a method of incorporating the nucleic acid into a host microorganism, a method of incorporating the nucleic acid into the genome of the host microorganism, and the like can be used.
  • the organism serving as a gene source is not particularly limited.
  • Acinetobacter such as Acinetobacter baylyi, Acinetobacter radioresists, Aerobacter such as Aerobacter cloacae, Alcaligenes such as Alcaligenes faecalis, Bacillus genera such as Bacillus badius, Bacillus magertium, Bacillus roseus, Brevibacterium genus such as Brevibacterium iodoinum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebact Coribacillus such as rium acetoglutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum, and the like, and the Cupriavidus, such as Cupriavidus, such as Cupriavi s ich, such as Cui Hafnia, Microbacterium a Microbacterium genus such as moniaphilum, Nocardioides genus
  • Rhodospor such as toruloides such as the genus of the genus of Serratia, such as Sailtia, such as Sailtia, such as Sailtia, such as S. Strept, such as Streptomyces vinaceus
  • the genus Myces includes genus Yarrowia such as Yarrowia lipolytica, the genus Yersinia such as Yersinia ruckeri, the genus Euglena such as Euglena gracilis, and the genus Thermobifida such as Thermobifida fusca , Euglena, Thermobifida.
  • the expression vector or nucleic acid for integration into a genome is a promoter, a ribosome binding sequence, a nucleic acid encoding a polypeptide to be expressed, a transcription termination sequence It is preferable that it is comprised. In addition, a gene that controls promoter activity may be included.
  • the promoter used in the present invention is not particularly limited as long as it is capable of expressing an enzyme in a host microorganism, and examples include a gap promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter and the like.
  • a nucleic acid or enhancing expression of a polypeptide using an expression vector it is not particularly limited as long as it can be autonomously replicated in the microorganism, for example, pBBR1MCS vector, pBR322 vector, pMW vector, pET Vectors, pRSF vectors, pCDF vectors, pACYC vectors, and derivatives of the above-mentioned vectors, and the like can be mentioned.
  • the introduction is performed using site-specific homologous recombination.
  • site homologous recombination is not particularly limited, for example, a method using ⁇ Red recombinase and FLP recombinase (Proc Natl Acad Sci USA 2000. Jun 6; 97 (12): 6640-6645.), ⁇ Red recombinase and Methods using the sacB gene (Biosci Biotechnol Biochem. 2007 Dec; 71 (12): 2905-11) can be mentioned.
  • the method for introducing the expression vector or nucleic acid for integration into a genome is not particularly limited as long as it is a method for introducing a nucleic acid into a microorganism, for example, calcium ion method (Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)), electroporation method NM Calvin, PC Hanawalt. J. Bacteriol, 170 (1988), pp. 2796-2801) and the like.
  • a medium containing a carbon source that can be used by ordinary microorganisms, as a fermentation source is preferably a genetically modified microorganism into which a nucleic acid encoding 3-oxoadipyl-CoA reductase has been introduced or whose expression of the polypeptide has been enhanced.
  • Culture in liquid medium in addition to the carbon source that can be used by the genetically modified microorganism, a medium containing a nitrogen source, an inorganic salt, and, if necessary, an organic trace nutrient such as an amino acid or a vitamin, is suitably used. Any of a natural medium and a synthetic medium can be used as long as the nutrient source is contained.
  • the fermentation raw material is a raw material that can be metabolized by the genetically modified microorganism.
  • “Metabolism” refers to the conversion of one chemical substance, which is taken from the outside of a cell by a microbe from the outside of a cell or generated from another chemical substance in the cell, into another chemical substance by enzymatic reaction.
  • saccharides can be preferably used as a carbon source. Specific examples of saccharides include monosaccharides such as glucose, sucrose, fructose, galactose, mannose, xylose and arabinose, disaccharides to which these monosaccharides are bound, polysaccharides, starch saccharification solutions containing these, molasses, cellulose The biomass saccharified liquid etc. are mentioned.
  • 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or adipic acid can be efficiently produced by adding succinic acid which is a substrate of CoA transferase.
  • the carbon sources listed above may be used alone or in combination.
  • the concentration of the carbon source in the culture medium is not particularly limited, and can be appropriately set according to the type of the carbon source etc.
  • 5 g / L to 300 g / L of saccharides, succinic acid Is 0.1 g / L to 100 g / L.
  • nitrogen sources used for culturing the genetically modified microorganism include ammonia gas, ammonia water, ammonium salts, urea, nitrates, and other organic nitrogen sources that are additionally used, such as oil syrup, soybean hydrolysate, Casein decomposition products, other amino acids, vitamins, corn steep liquor, yeast or yeast extract, meat extract, peptides such as peptone, various fermented cells and hydrolysates thereof can be used.
  • the concentration of the nitrogen source in the culture medium is not particularly limited, but preferably 0.1 g / L to 50 g / L.
  • inorganic salts used for culturing the genetically modified microorganism for example, phosphate, magnesium salt, calcium salt, iron salt, manganese salt and the like can be appropriately added and used.
  • the culture conditions of the genetically modified microorganism for producing 3-hydroxyadipic acid, ⁇ -hydromuconic acid and / or adipic acid include the culture medium of the above-mentioned component composition, culture temperature, agitation speed, pH, aeration amount, inoculum size, etc. Depending on the type of the genetically modified microorganism and the external conditions, etc., it is appropriately adjusted or selected and set. When foaming occurs in liquid culture, antifoaming agents such as mineral oil, silicone oil and surfactants can be appropriately blended in the medium.
  • the produced products can be recovered.
  • Recovery, for example, isolation, of the produced product can be carried out according to a general method of stopping the culture when the accumulation amount is moderately increased and collecting the fermented product from the culture. .
  • the product is isolated from the culture by column chromatography, ion exchange chromatography, activated carbon treatment, crystallization, membrane separation, distillation and the like. be able to.
  • the acid component is added to the salt of the product to recover the precipitate, and the culture is concentrated by using a reverse osmosis membrane, an evaporator, etc.
  • the crystals of the product and / or the salt of the product are precipitated by cooling crystallization or adiabatic crystallization, and the crystals of the product and / or the salt of the product are separated by centrifugation or filtration.
  • the method of obtaining the product by hydrolysis after recovering the ester of the product by distillation after adding an alcohol to the culture to convert the product to an ester, and the like It is not limited.
  • these recovery methods can be appropriately selected and optimized depending on the physical properties of the product and the like.
  • Reference Example 1 An enzyme catalyzing a reaction for producing 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A from acetyl-CoA and succinyl-CoA (reaction A), and a reaction for producing 3-hydroxyadipic acid from 3-hydroxyadipyl-CoA (reaction E) Preparation of a plasmid expressing an enzyme catalyzing a reaction (reaction F) for producing ⁇ -hydromuconic acid from 2,3-dehydroadipyl-CoA
  • reaction F Preparation of a plasmid expressing an enzyme catalyzing a reaction (reaction F) for producing ⁇ -hydromuconic acid from 2,3-dehydroadipyl-CoA
  • the vector pBBR1MCS-2 autonomously replicable in E.
  • coli (ME Kovach, (1995), Gene 166: 175-176) was cleaved with XhoI to obtain pBBR1MCS-2 / XhoI.
  • the obtained fragment and pBBR1MCS-2 / XhoI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Clontech), and introduced into E. coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant E. coli strain, and the plasmid whose base sequence was confirmed by a conventional method was named pBBR1MCS-2 :: Pgap.
  • pBBR1MCS-2 :: Pgap was digested with ScaI to obtain pBBR1MCS-2 :: Pgap / ScaI.
  • a primer for PCR amplification of the full length of acyltransferase gene pcaF NCBI Gene ID: 1041755, SEQ ID NO: 20
  • genomic DNA of Pseudomonas putida strain KT2440 as a template Were designed SEQ ID NOs: 21 and 22
  • PCR was performed according to a conventional method.
  • the obtained fragment and pBBR1MCS-2 :: Pgap / ScaI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit and introduced into E. coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the plasmid whose base sequence was confirmed by a conventional method was named pBBR1MCS-2 :: AT. Subsequently, pBBR1MCS-2 :: AT was cleaved with HpaI to obtain pBBR1MCS-2 :: AT / HpaI.
  • Coa transferase genes PcaI and PcaJ NCBI Gene ID: 1046613, 1046612, SEQ ID NOs: 23, 24
  • Genomic DNA of Pseudomonas putida strain KT2440 as a template to amplify a gene encoding an enzyme catalyzing Reaction E and Reaction F.
  • the primers for PCR amplification of the continuous sequence containing the full length of (SEQ ID NOs: 25 and 26) were designed, and the PCR reaction was carried out according to a conventional method.
  • the obtained fragment and pBBR1MCS-2 :: AT / HpaI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit and introduced into E. coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the plasmid whose base sequence was confirmed by a conventional method was named pBBR1MCS-2 :: ATCT.
  • Reference Example 2 Preparation of a plasmid for expressing the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 213
  • the expression vector pACYCDuet-1 (Novagen) capable of autonomous replication in E. coli is digested with BamHI , PACYCDuet-1 / BamHI.
  • a primer for amplifying the nucleic acid described in SEQ ID NO: 54 was designed using genomic DNA of Serratia marcescens ATCC 13880 as a template (SEQ ID NOs: 31, 32) The PCR reaction was performed according to a conventional method.
  • a primer for amplifying the nucleic acid described in SEQ ID NO: 55 was designed using genomic DNA of Serratia nematodiphila strain DSM 21420 as a template (SEQ ID NO: 33, 34) The PCR reaction was performed according to a conventional method.
  • a primer for amplifying the nucleic acid described in SEQ ID NO: 56 was designed using the genomic DNA of Serratia plymuthica NBRC 102599 strain as a template (SEQ ID NO: 35, 36) The PCR reaction was performed according to a conventional method.
  • a primer for amplifying the nucleic acid described in SEQ ID NO: 57 was designed using genomic DNA of Serratia proteamaculans 568 strain as a template (SEQ ID NO: 37, 38) The PCR reaction was performed according to a conventional method.
  • a primer for amplifying a nucleic acid described in SEQ ID NO: 58 was designed using genomic DNA of Serratia urealytica Lr5 / 4 as a template (SEQ ID NO: 215, 216) The PCR reaction was performed according to a conventional method.
  • Serratia sp In order to amplify a nucleic acid encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 6, Serratia sp.
  • Primers for amplifying the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 59 were designed using the genomic DNA of strain BW106 as a template (SEQ ID NOs: 217 and 218), and PCR was performed according to a conventional method.
  • a primer for amplifying the nucleic acid described in SEQ ID NO: 214 was designed using genomic DNA of Serratia liquefaciens FK01 as a template (SEQ ID NO: 219, 220)
  • the PCR reaction was performed according to a conventional method.
  • the resulting fragments and pACYCDuet-1 / BamHI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) and introduced into E. coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the nucleotide sequence was confirmed by a conventional method.
  • the expression of 3-oxoadipyl-CoA reductase incorporated into the plasmid is induced with IPTG, and 14 amino acids including a histidine tag are added at the N-terminus.
  • a plasmid for expressing the polypeptide of SEQ ID NO: 1 is “pACYCDuet-1 :: Smr1”
  • a plasmid for expressing the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is “pACYCDuet-1 :: Snm1”
  • the plasmid for expressing the polypeptide described in 3 is “pACYCDuet-1 :: Spl1”
  • the plasmid for expressing the polypeptide described in SEQ ID NO: 4 is “pACYCDuet-1 :: Spe1”, in SEQ ID NO: 5
  • the plasmid for expressing the described polypeptide is “pACYCDuet-1 :: Sur1”
  • the plasmid for expressing the polypeptide described in SEQ ID NO: 6 is “pACYCDuet-1 :: Ssp1”, described in SEQ ID NO: 213
  • paaH SEQ ID NO: 28
  • dcaH SEQ ID NO: 29
  • paaH SEQ ID NO: 30
  • a plasmid for expressing a polypeptide encoded by the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 27 is “pACYCDuet-1 :: Ppu1”
  • a plasmid for expressing a polypeptide encoded by the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 28 is “pACYCDuet- 1: To express a polypeptide encoded by the nucleic acid described in "pACYCDuet-1 :: Aci1”
  • a plasmid for expressing a polypeptide encoded by the nucleic acid represented by SEQ ID NO: 29 The plasmid of (pACYCDuet-1 :: Spl2) is shown in Table 6 for these plasmids.
  • Example 1 Preparation of 3-hydroxyadipic acid-producing Escherichia coli into which a nucleic acid encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 213 was introduced
  • the plasmid pBBR1MCS-2 prepared in Reference Example 1 :: ATCT was introduced into E. coli strain BL21 (DE3) by electroporation (NM Calvin, PC Hanawalt. J. Bacteriol, 170 (1988), pp. 2796-2801).
  • the introduced strain was cultured at 37 ° C. on LB agar medium containing 25 ⁇ g / mL kanamycin.
  • the obtained recombinant strain was designated BL21 (DE3) / pBBR1MCS-2 :: ATCT.
  • the seven types of plasmids prepared in Reference Example 2 were introduced into BL21 (DE3) / pBBR1MCS-2 :: ATCT by electroporation, respectively.
  • the introduced strain was cultured at 37 ° C. on an LB agar medium containing 25 ⁇ g / mL kanamycin and 15 ⁇ g / mL chloramphenicol.
  • the recombinant strain into which “pACYCDuet-1 :: Smr1” has been introduced is “Ec / Smr1_3HA”
  • the recombinant strain into which “pACYCDuet-1 :: Snm1” has been introduced is “Ec / Snm1_3HA”
  • the recombinant strain into which Ec / Sur1_3HA and pACYCDuet-1 :: Ssp1 have been introduced is referred to as "Ec / Ssp1_3HA” and the recombinant strain into which
  • Comparative Example 1 Preparation of E. coli capable of producing 3-hydroxyadipic acid into which a nucleic acid encoding 3-oxoadipyl-CoA reductase has been introduced
  • the plasmid pBBR1MCS-2 was electroporated into E. coli strain BL21 (DE3). (NM Calvin, PC Hanawalt. J. Bacteriol, 170 (1988), pp. 2796-2801).
  • the introduced strain was cultured at 37 ° C. on LB agar medium containing 25 ⁇ g / mL kanamycin.
  • the obtained recombinant strain was designated BL21 (DE3) / pBBR1MCS-2 :: ATCT.
  • the four types of plasmids prepared in Reference Example 3 were introduced into BL21 (DE3) / pBBR1MCS-2 :: ATCT by electroporation, respectively.
  • the introduced strain was cultured at 37 ° C. on an LB agar medium containing 25 ⁇ g / mL kanamycin and 15 ⁇ g / mL chloramphenicol.
  • the recombinant strain into which “pACYCDuet-1 :: Ppu1” has been introduced is “Ec / Ppu1_3HA”
  • the recombinant strain into which “pACYCDuet-1 :: Eco1” has been introduced is “Ec / Eco1_3HA”
  • the recombinant strain into which “Ec / Aci1_3HA” and “pACYCDuet-1 :: Spl2” have been introduced is referred to as “Ec / Spl2_3HA”
  • the recombinant strains obtained in this comparative example are shown in Table 7 .
  • Example 2 Production test of 3-hydroxyadipic acid using E. coli capable of producing 3-hydroxyadipic acid into which a nucleic acid encoding the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 213 has been introduced
  • the recombinant E. coli strain prepared in Example 1 was used to test production of 3-hydroxyadipic acid.
  • Comparative example 2 Production test of 3-hydroxyadipate using E. coli capable of producing 3-hydroxyadipate into which a nucleic acid encoding 3-oxoadipyl-CoA reductase has been introduced Production of Comparative Example 1 in the same manner as in Example 2 Table 7 shows the results of a production test of 3-hydroxyadipic acid using the resulting E. coli.
  • Example 2 From the results in Table 7, it was revealed that the recombinant strain used in Example 2 has an improved yield of 3-hydroxyadipic acid than the recombinant strain used in Comparative Example 2. That is, it was found that by introducing a nucleic acid encoding the polypeptide described in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 213 into a microorganism, the productivity of 3-hydroxyadipic acid is significantly improved. .
  • PCR amplification of the full length of the enoyl-CoA hydratase gene paaF (NCBI Gene ID: 1046932, SEQ ID NO: 47) using genomic DNA of Pseudomonas putida strain KT2440 as a template
  • the following primers were designed (SEQ ID NOS: 48, 49), and PCR was performed according to a conventional method.
  • the obtained fragment and pCDF-1b / KpnI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech), and introduced into E. coli strain DH5 ⁇ .
  • the said plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the base sequence was confirmed by a conventional method.
  • the expression of enoyl-CoA hydratase incorporated into the plasmid is induced by IPTG, and 11 amino acids including a histidine tag are added to the N-terminal.
  • the obtained plasmid was called "pCDF-1b :: EHa”.
  • Example 3 Preparation of ⁇ -hydromuconic acid-producing Escherichia coli into which a nucleic acid encoding the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 213 was introduced
  • Plasmid pCDF-1b prepared in Reference Example 4 EHa was electroporated into E. coli strain BL21 (DE3) / pBBR1 MCS-2 :: ATCT prepared in Example 1.
  • the introduced strain was cultured at 37 ° C. on LB agar medium containing 25 ⁇ g / mL kanamycin and 50 ⁇ g / mL streptomycin.
  • the obtained recombinant strain was designated BL21 (DE3) / pBBR1 MCS-2 :: ATCT / pCDF-1b :: EHa.
  • the plasmids “pACYCDuet-1 :: Ppu1”, “pACYCDuet-1 :: Eco1”, “pACYCDuet-1 :: Aci1”, and “pACYCDuet-1 :: Spl2” prepared in Reference Example 3 were respectively BL21 ( DE3) / pBBR1MCS-2 :: ATCT / pCDF-1b :: EHa was introduced by electroporation. The introduced strain was cultured at 37 ° C. on LB agar medium containing 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL streptomycin and 15 ⁇ g / mL chloramphenicol.
  • the recombinant strain into which "pACYCDuet-1 :: Ppu1” has been introduced is “Ec / Ppu1_HMA”
  • the recombinant strain into which "pACYCDuet-1 :: Eco1” is introduced is “Ec / Eco1_HMA”
  • "pACYCDuet-1 :: Aci1” The recombinant strains into which “Ec / Aci1_HMA” and “pACYCDuet-1 :: Spl2” have been introduced are referred to as “Ec / Spl2_HMA”, and the recombinant strains obtained in this comparative example are shown in Table 8 .
  • Example 4 Production test of ⁇ -hydromuconic acid using E. coli capable of producing ⁇ -hydromuconic acid into which a nucleic acid encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 213 was introduced
  • Example 3 The production test of ⁇ -hydromuconic acid was carried out using the E. coli prepared above. Medium I (Bacto tryptone (Difco Laboratories) 10 g / L adjusted to pH 7, Bacto yeast extract (Difco Laboratories) 5 g / L, sodium chloride 5 g / L, kanamycin 25 ⁇ g / mL, streptomycin 50 ⁇ g / mL and chloram The recombinant E.
  • coli strain prepared in Example 3 was inoculated into 5 mL of phenicol (15 ⁇ g / mL) and inoculated with one platinum loop, and cultured with shaking at 30 ° C., 120 min ⁇ 1 for 18 hours.
  • Medium II succinic acid 10 g / L, glucose 10 g / L, ammonium sulfate 1 g / L, potassium phosphate 50 mM, magnesium sulfate 0.025 g / L, iron sulfate 0.0625 mg
  • 0.25 mL of the culture solution was adjusted to pH 6.5 / L, manganese sulfate 2.7 mg / L, calcium chloride 0.33 mg / L, sodium chloride 1.25 g / L, Bacto tryptone 2.5 g / L, Bacto yeast extract 1.25 g / L, kanamycin 25 ⁇ g / mL, streptomycin 50 ⁇ g / mL, chloramphenicol 15 ⁇ g
  • Comparative example 4 Production test of ⁇ -hydromuconic acid using E. coli having ability to produce ⁇ -hydromuconic acid into which a nucleic acid encoding 3-oxoadipyl-CoA reductase has been introduced E. coli produced in Comparative Example 3 in the same manner as Example 4.
  • Table 8 shows the results of testing production of ⁇ -hydromuconic acid using
  • Example 4 has an improved yield of ⁇ -hydromuconic acid than the recombinant strain used in Comparative Example 4. That is, it was found that by introducing a nucleic acid encoding the polypeptide described in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 213 into a microorganism, the productivity of ⁇ -hydromuconic acid is remarkably improved.
  • a primer for amplifying the nucleic acid described in SEQ ID NO: 55 was designed using genomic DNA of Serratia nematodiphila strain DSM 21420 as a template (SEQ ID NO: 50, 51)
  • the PCR reaction was performed according to a conventional method.
  • a primer for amplifying the nucleic acid described in SEQ ID NO: 56 was designed using genomic DNA of Serratia plymuthica NBRC 102599 strain as a template (SEQ ID NO: 52, 53)
  • the PCR reaction was performed according to a conventional method.
  • the obtained fragment and pBBR1MCS-2 :: Pgap / ScaI prepared in Reference Example 1 were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit and introduced into E. coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the plasmids whose nucleotide sequences were confirmed by a conventional method were respectively designated as "pBBR1MCS-2 :: Snm1" and "pBBR1MCS-2 :: Spl1".
  • Example 5 Preparation of Serratia Microorganism Microorganisms Modified to Enhance the Expression of the Polypeptides Set forth in SEQ ID NOS: 2 and 3 Serratia nematodiphila Strain DSM 21420, a microorganism having a nucleic acid originally encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2 as a host microorganism And, using the Serratia plymuthica NBRC 102599 strain, which is a microorganism having a nucleic acid originally encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 3, a recombinant strain in which the expression of the polypeptide possessed by each was increased was produced.
  • the pBBR1MCS-2 Snm1 or pBBR1MCS-2 :: Spl prepared in Reference Example 5 was electroporated into each of the aforementioned Serratia microorganism strains (NM Calvin, PC Hanawalt. J. Bacteriol, 170 (1988), pp. 2796-2801). The strain after introduction was cultured at 30 ° C. in LB agar medium containing 25 ⁇ g / mL of kanamycin. The recombinant strains obtained in this example were named Sn / S nm1 and Sp / Spl1.
  • Example 6 Production test of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid using Serratia microorganism modified to enhance expression of the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2, 3 Expression of the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2, 3 In order to evaluate the enhanced effect, production tests of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid were performed using the recombinant Serratia microorganism strain prepared in Example 5.
  • Example 5 In 5 mL of medium I (Bacto tryptone (Difco Laboratories) 10 g / L, Bacto yeast extract (Difco Laboratories) 5 g / L, sodium chloride 5 g / L, kanamycin 25 ⁇ g / mL) adjusted to pH 7 in Example 5
  • the prepared recombinant strain was inoculated with one platinum ear and cultured with shaking at 30 ° C., 120 min ⁇ 1 for 18 hours.
  • Comparative example 6 Production Test of 3-Hydroxyadipic Acid and ⁇ -Hydromuconic Acid Using Serratia Microorganisms that Do Not Enhance Expression of the Polypeptides Set forth in SEQ ID NOS: 2 and 3
  • An Example Using Serratia Microorganisms Produced in Comparative Example 5 The production test of 3-hydroxyadipic acid and ⁇ -hydromuconic acid was conducted in the same manner as in 6. The results are shown in Table 9.
  • Comparative example 7 It is confirmed that the polypeptide described in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 213 has an activity to reduce 3-oxoadipyl-CoA to generate 3-hydroxyadipyl-CoA Control Test for Making Recombinant E. coli expressing enzymes catalyzing Reaction A, Reaction E, and Reaction F were produced.
  • pACYCDuet-1 was introduced into BL21 (DE3) / pBBR1MCS-2 :: ATCT.
  • the obtained recombinant strain was designated Ec / NC_3HA.
  • Example 3 coli strains (Ec / Smr1_HMA, Ec / Snm1_HMA, Ec / Spl1_HMA, Ec / Spe1_HMA, Ec / Sur1_HMA, Ec / Ssp1_HMA, Ec / Slq1_HMA) prepared in Example 3 The culture was performed under the same conditions as in Example 4 to measure 3-hydroxyadipic acid or ⁇ -hydromuconic acid in the culture solution. The results are shown in Table 10.
  • Ec / Smr1_3HA, Ec / Snm1_3HA, Ec / Spl1_3HA, Ec / Spe1_3HA, Ec / Sur1_3HA, Ec / Ssp1_3HA, and Ec / Slq1_3HA produced 3-hydroxyadipic acid
  • Ec / Sm1_Hm_HMA It was found that ⁇ -hydromuconic acid produced by Ec / Spl1_HMA, Ec / Spe1_HMA, Ec / Sur1_HMA, Ec / Ssp1_HMA, and Ec / Slq1_HMA were both produced via 3-hydroxyadipyr-CoA. Therefore, the polypeptide described in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 213 has an activity to reduce 3-oxoadipyl-CoA to form 3-hydroxyadipyl-CoA all right.
  • Reference Example 6 An enzyme that catalyzes a reaction that produces 3-oxoadipyl-CoA and coenzyme A from acetyl-CoA and succinyl-CoA (reaction A), and an enzyme that catalyzes a reaction that produces adipic acid from adipyl-CoA (reaction G) Preparation of Expressing Plasmid
  • the 6.6 kb fragment obtained by cleaving pBBR1MCS-2 :: AT prepared in Reference Example 1 with HpaI was named pBBR1MCS-2 :: AT / HpaI.
  • Reference Example 7 Preparation of a plasmid for expressing an enzyme catalyzing a reaction (reaction D) for producing adipyl-CoA from 2,3-dehydroadipyl-CoA
  • An expression vector pMW119 (made by Nippon Gene Co., Ltd.) capable of autonomous replication in E. coli is SacI And pMW119 / SacI was obtained.
  • Primers were designed (SEQ ID NOS: 225, 226), and PCR reaction was performed according to a conventional method.
  • the obtained fragment and pMW119 / SacI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Clontech), and introduced into E. coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant E.
  • pMW119 :: Pgap the plasmid whose base sequence was confirmed by a conventional method was designated as pMW119 :: Pgap. Subsequently, pMW119 :: Pgap was digested with SphI to obtain pMW119 :: Pgap / SphI.
  • a primer was designed to PCR amplify the full length of dcaA (NCBI-Protein ID: AAL 09094.1, SEQ ID NO: 227) from Acinetobacter baylyi ADP1 strain (sequence The PCR reaction was carried out according to a conventional method.
  • the obtained fragment and pMW119 :: Pgap / SphI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Clontech), and introduced into E. coli strain DH5 ⁇ .
  • the said plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the plasmid which confirmed the base sequence by the conventional method was made into pMW119 :: ER.
  • Example 7 Preparation of E. coli Having Adipic Acid-Producing Ability into which a Nucleic Acid Encoding the Polypeptide Represented in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 213 has been Introduced
  • Plasmid pBBR1MCS-2 prepared in Reference Example 6 :: ATCT2 was introduced into E. coli strain BL21 (DE3) by electroporation (NM Calvin, PC Hanawalt. J. Bacteriol, 170 (1988), pp. 2796-2801). The introduced strain was cultured at 37 ° C. on LB agar medium containing 25 ⁇ g / mL kanamycin. The obtained recombinant strain was designated BL21 (DE3) / pBBR1 MCS-2 :: ATCT2.
  • the plasmid pCDF-1b :: EHa prepared in Reference Example 4 was introduced into BL21 (DE3) / pBBR1 MCS-2 :: ATCT2 by electroporation.
  • the introduced strain was cultured at 37 ° C. on an LB agar medium containing 25 ⁇ g / mL kanamycin and 50 g / mL streptomycin.
  • the resulting recombinant strain was designated BL21 (DE3) / pBBR1 MCS-2 :: ATCT2 / pCDF-1b :: EHa.
  • the plasmid pMW119 :: ER prepared in Reference Example 7 was electroporated into BL21 (DE3) / pBBR1 MCS-2 :: ATCT2 / pCDF-1b :: EHa.
  • the introduced strain was cultured at 37 ° C. on an LB agar medium containing 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL streptomycin and 100 ⁇ g / mL ampicillin.
  • the obtained recombinant strain was designated BL21 (DE3) / pBBR1MCS-2 :: ATCT2 / pCDF-1b :: EHa / pMW119 :: ER.
  • the seven types of plasmids prepared in Reference Example 2 were electroporated into BL21 (DE3) / pBBR1 MCS-2 :: ATCT2 / pCDF-1b :: EHa / pMW119 :: ER, respectively.
  • the introduced strain was cultured at 37 ° C. on an LB agar medium containing 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL streptomycin, 100 ⁇ g / mL ampicillin and 15 ⁇ g / mL chloramphenicol.
  • the recombinant strain into which “pACYCDuet-1 :: Smr1” has been introduced is “Ec / Smr1_ADA”, and the recombinant strain into which “pACYCDuet-1 :: Snm1” has been introduced is “Ec / Snm1_ADA”, “pACYCDuet-1 :: Spl1” "Ec / Spl1_ADA”, the recombinant strain into which "pACYCDuet-1 :: Spe1” has been introduced “Ec / Spe1_ADA”, the recombinant strain into which "pACYCDuet-1 :: Sur1” has been introduced " The recombinant strains into which Ec / Sur1_ADA and pACYCDuet-1 :: Ssp1 have been introduced are referred to as "Ec / Ssp1_ADA” and the recombinant strains into which pACYCDuet-1 ::
  • the introduced strain was cultured at 37 ° C. on an LB agar medium containing 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL streptomycin, 100 ⁇ g / mL ampicillin and 15 ⁇ g / mL chloramphenicol.
  • the recombinant strain into which "pACYCDuet-1 :: Ppu1" has been introduced is “Ec / Ppu1_ADA”
  • the recombinant strain into which "pACYCDuet-1 :: Eco1” has been introduced is “Ec / Eco1_ADA”
  • Ec / Aci1_ADA” and the recombinant strain into which "pACYCDuet-1 :: Spl2” was introduced are referred to as "Ec / Spl2_ADA”
  • the recombinant strains obtained in this comparative example are shown in Table 11 .
  • Example 8 Production test of adipic acid using E. coli capable of producing adipic acid into which a nucleic acid encoding the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 213 has been introduced E. coli prepared in Example 7
  • the production test of adipic acid was conducted using Medium I (Bacto tryptone (Difco Laboratories) 10 g / L adjusted to pH 7, Bacto yeast extract (Difco Laboratories) 5 g / L, sodium chloride 5 g / L, kanamycin 25 ⁇ g / mL, streptomycin 50 ⁇ g / mL, ampicillin 100 ⁇ g
  • Example 3 coli strain prepared in Example 3 was inoculated into 5 mL of (mL / mL and chloramphenicol (15 ⁇ g / mL)) and cultured with shaking at 30 ° C. and 120 min ⁇ 1 for 18 hours.
  • Comparative Example 9 Production test of adipic acid using E. coli capable of producing adipic acid into which a nucleic acid encoding 3-oxoadipyl-CoA reductase has been introduced Adipine was prepared using E. coli prepared in Comparative Example 8 in the same manner as in Example 8. The results of the acid production test are shown in Table 11.
  • Example 8 has an improved adipic acid yield than the recombinant strain used in Comparative Example 9. That is, it was found that by introducing a nucleic acid encoding the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 213 into a microorganism, the productivity of adipic acid is remarkably improved.
  • Example 9 Confirmation that the polypeptides described in SEQ ID NOS: 2 and 4 have the activity of 3-oxoadipyl-CoA reductase
  • the strain BL21 (DE3) was introduced by electroporation. The introduced strain was cultured at 37 ° C. on LB agar medium containing 15 ⁇ g / mL of chloramphenicol. The resulting recombinant strains were designated BL21 (DE3) / pACYCDuet-1 :: Snm1 and BL21 (DE3) / pACYCDuet-1 :: Spe1.
  • IPTG was added to the culture solution to a concentration of 500 ⁇ M, and shaking culture was performed at 16 ° C. and 100 min ⁇ 1 for 18 hours.
  • the culture solution was centrifuged at 6,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed, and the cell pellet was suspended in Binding Buffer of His-Bind Buffer Kit (Merck).
  • the resulting cell suspension was sonicated with Digital Sonifier (manufactured by BRANSON) while cooling with ice.
  • the solution after disruption was centrifuged at 13000 rpm and 4 ° C. for 30 minutes, and the obtained supernatant was used as a cell disruption solution.
  • His-Bind Resin solution was added to 30 mL of the cell lysate and incubated at 4 ° C. for 1 hour. The solution was centrifuged at 4000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and 20 mL of the supernatant was removed, and then the His-Bind Resin solution was loaded onto the column. After washing twice with 10 mL of Binding Buffer, it was washed twice with 10 mL of Wash Buffer 1 (imidazole 25 mM) and twice with 10 mL of Wash Buffer 2 (imidazole 60 mM). Finally, it was eluted four times with 2 mL of Elution Buffer (imidazole 1 mM), and the fractions were collected.
  • the fraction whose band could be confirmed around 55 kDa which is the molecular weight of the target enzyme was centrifuged at 8000 rpm and 4 ° C. for 15 minutes, the supernatant was removed, and 5 mL of Strage Buffer was added and washed. After further centrifuging at 8000 rpm and 4 ° C. for 15 minutes and removing the supernatant, adding 3 mL of Strage Buffer was repeated twice. The obtained solutions were named enzyme solutions Snm1 and Spe1.
  • 3-oxoadipic acid was prepared by the method described in Reference Example 1 of WO 2017/099209.
  • PCR is performed on the full length of CoA transferase pcaI and pcaJ (NCBI-GeneID: 1046613 and 1046612, SEQ ID NOS: 23 and 24) using genomic DNA of Pseudomonas putida strain KT2440 as a template Primers for amplification were designed (SEQ ID NOS: 230, 231), and PCR was performed according to a conventional method.
  • the obtained fragment and pRSF-1b / KpnI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Clontech), and introduced into E. coli strain DH5 ⁇ .
  • the said plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the base sequence was confirmed by a conventional method.
  • the obtained plasmid was called "pRSF-1b :: CT".
  • pRSF-1b CT was introduced into E. coli BL21 (DE3) and induction of expression of the enzyme by isopropyl-.beta.-thiogalactopyranoside (IPTG) in a conventional manner, followed by purification using a histidine tag from the culture broth To obtain a CoA transferase solution.
  • the enzyme reaction solution for preparation of 3-oxoadipyl-CoA having the following composition is prepared using the solution, reacted at 25 ° C. for 3 minutes, and treated with UF membrane (Amicon Ultra-0.5 mL 10 K, manufactured by Merck Millipore) The resulting permeate was used as a solution of 3-oxoadipyl-CoA.
  • Enzyme reaction solution for preparation of 3-oxoadipyl-CoA 100 mM Tris-HCl (pH 8.2) 10 mM MgCl 2 0.5 mM succini-CoA 5mM 3-oxoadipic acid sodium salt 2 ⁇ M CoA transferase.
  • 3-oxoadipyl-CoA reductase activity was confirmed by measuring the amount of 3-hydroxyadipyl-CoA produced.
  • An enzyme reaction solution of the following composition is prepared using enzyme solutions Snm1 and Spe1, and the enzyme reaction solution after reaction at 25 ° C. for 1 hour is subjected to membrane treatment using Millex-GV (0.22 ⁇ m, PVDF, manufactured by Merck) The permeate was analyzed by LC-MS / MS under the same conditions as in Example 2.
  • the 3-oxoadipyl-CoA concentration was quantified using the method of Kaschabek et al. (J Bacteriol. 2002 Jan; 184 (1): 207-215), and the concentration in the enzyme reaction solution was adjusted to 15 ⁇ M.
  • the results of similar reactions by adding Tris-HCl instead of the enzyme solution as a control are also shown in Table 12.

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Abstract

３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへと還元する反応を触媒する酵素をコードする核酸を導入した遺伝子改変微生物が開示されている。遺伝子改変微生物は、以下（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸を導入、又は当該ポリペプチドの発現を増強したものである。（ａ）配列番号１～６、２１３のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）これらのいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（ｃ）これらのいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する活性を有するポリペプチド。

Description

３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
 本発明は、目的物質の生産に関与するポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物及び当該微生物を用いた物質製造方法に関する。
　３－ヒドロキシアジピン酸（ＩＵＰＡＣ名：３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｅｄｉｏｉｃ　ａｃｉｄ）、α－ヒドロムコン酸（ＩＵＰＡＣ名：（Ｅ）－ｈｅｘ－２－ｅｎｅｄｉｏｉｃ　ａｃｉｄ）およびアジピン酸（ＩＵＰＡＣ名：ｈｅｘａｎｅｄｉｏｉｃ　ａｃｉｄ）は炭素数６のジカルボン酸である。これらは多価アルコールと重合することでポリエステルとして、また多価アミンと重合することでポリアミドの原料として用いることができる。また、これらの末端にアンモニアを付加してラクタム化することで、単独でもポリアミドの原料になり得る。
　微生物を利用した３－ヒドロキシアジピン酸の生合成に関連する文献の例としては、非天然の微生物を用いた１，３－ブタジエンの製造に関する特許文献１の中で、スクシニル－ＣｏＡから１，３－ブタジエンを生合成する経路において微生物内で生成する代謝中間体として３－ヒドロキシアジピン酸（３－ヒドロキシアジペート）が記載されている。
　微生物を利用したα－ヒドロムコン酸の生合成に関連する文献の例としては、非天然の微生物を用いたムコン酸の製造に関する特許文献２の中で、スクシニル－ＣｏＡからｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ－ムコン酸を生合成する経路において微生物内で生成する代謝中間体としてα－ヒドロムコン酸（２，３－デヒドロアジペート）が記載されている。
　微生物を利用したアジピン酸の生合成に関連する文献の例としては、非天然の微生物を用いたアジピン酸の製造に関する特許文献３の中で、スクシニル－ＣｏＡからアジピン酸を生合成する逆アジペート分解経路が記載されている。
　特許文献１から３に記載された生合成経路では、いずれも３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへと還元する酵素反応を経由するとの記載がある。
特表２０１３－５３５２０３号公報 米国特許出願公開第２０１１／０１２４９１１Ａ１号明細書 特表２０１１－５１５１１１号公報
　特許文献１または２には、微生物内で３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸が生成しうる代謝経路の記載はあるが、代謝を３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸で止め、培養液中に分泌させるという記載はない。また、特許文献１から３に記載された３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへと還元する反応を触媒する酵素をコードする核酸を導入した非天然の微生物を用いて、実際に３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸またはアジピン酸が製造できるかどうかの検証はなされていない。従って特許文献１から３に記載された３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへと還元する反応を触媒する酵素についても、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の製造において優れた活性を示す当該酵素の存在は未だ知られていなかった。
　そこで本発明では、３－オキソアジピル－ＣｏＡを基質とした還元反応において優れた活性を示す酵素をコードする核酸を導入、または当該酵素の発現を増強した遺伝子改変微生物及び当該改変微生物を用いた物質製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記目的を達成するため鋭意検討した結果、アミノ酸配列が類似する一群のポリペプチドが、３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへと還元する反応を触媒する優れた活性を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）　以下（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物：
 （ａ）配列番号１～６及び２１３のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、
 （ｂ）配列番号１～６及び２１３のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド、
 （ｃ）配列番号１～６及び２１３のいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド。
（２）　前記（ｂ）及び（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドが、配列番号２１２のアミノ酸配列からなる領域を含む、（１）記載の遺伝子改変微生物。
（３）　前記配列番号２１２のアミノ酸配列において、Ｎ末端側から１３番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンまたはロイシンであり、Ｎ末端側から１５番目のアミの酸残基がロイシンまたはグルタミンであり、Ｎ末端側から１６番目のアミノ酸残基がリシンまたはアスパラギンであり、Ｎ末端側から１７番目のアミノ酸残基がグリシンまたはセリンであり、Ｎ末端側から１９番目のアミノ酸残基がプロリンまたはアルギニンであり、Ｎ末端側から２１番目のアミノ酸残基が好ましくはロイシン、メチオニンまたはバリンである、（２）記載の遺伝子改変微生物。
（４）　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属からなる群から選ばれる微生物の遺伝子改変体である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
（５）　アセチル－ＣｏＡ及びスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡ及び補酵素Ａを生成する能力及び３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する能力を有する、（１）～（４）のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
（６）　アセチル－ＣｏＡ及びスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡ及び補酵素Ａを生成する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する能力及び２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成する能力を有する、（１）～（４）のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
（７）　アセチル－ＣｏＡ及びスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡ及び補酵素Ａを生成する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する能力、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからアジピル－ＣｏＡを生成する能力及びアジピル－ＣｏＡからアジピン酸を生成する能力を有する、（１）～（４）のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
（８）　（１）～（５）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法。
（９）　（１）～（４）及び（６）のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、α－ヒドロムコン酸の製造方法。
（１０）　（１）～（４）及び（７）のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、アジピン酸の製造方法。
（１１）　Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子にコードされるポリペプチドをコードする核酸を導入または当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸及びアジピン酸からなる群から選ばれる１つ以上の物質の製造方法。
　本発明に係る遺伝子改変微生物は、３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへの還元反応において優れた活性を示す酵素を発現することから、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを経由して生成する３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の生産性に優れる。
　本発明に係る物質製造方法は、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを経由して生成する３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の生産性に優れる遺伝子改変微生物を用いるため、これらの物質の生産性を大幅に向上させることができる。
３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子と、５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子とが構成する遺伝子クラスターを示す図である。
　本発明の微生物は、以下（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物である。
（ａ）配列番号１～６および２１３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１～６および２１３のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１～６および２１３のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する活性を有するポリペプチド
　以下、本明細書中では３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素を「３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ」と記載する。また、本明細書では３－ヒドロキシアジピン酸を３ＨＡ、α－ヒドロムコン酸をＨＭＡ、アジピン酸をＡＤＡと略すことがある。
　本発明で核酸を導入するとは、微生物の菌体外から菌体内へと核酸を導入し、該微生物に該核酸がコードするポリペプチドの生産能を付与することを指す。導入する方法は特に限定されず、微生物内で自律複製可能な発現ベクターに当該核酸を組み込み宿主微生物に導入する方法や、微生物のゲノムに当該核酸を組み込む方法などを用いることができる。
　本発明でポリペプチドの発現を増強するとは、微生物が元来有しているポリペプチドの発現を増強することを指す。発現を増強する方法は特に限定されないが、当該ポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増加させる方法、当該ポリペプチドのコーディング領域上流のプロモーター領域やリボソーム結合配列を改変する方法などが挙げられる。これらの方法は単独で行ってもよいし、組み合わせてもよい。
　また、導入する核酸は１種類でも複数種類でもよい。また核酸の導入とポリペプチドの発現の増強を組み合わせてもよい。
　本発明で用いる、配列番号１～６および２１３のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの酵素活性を有するポリペプチドついて、「１もしくは数個」の範囲は、１０個以内が好ましく、さらに好ましくは５個以内、特に好ましくは４個以内、最も好ましくは１個又は２個以内である。ここで、アミノ酸が置換される場合、性質が類似したアミノ酸に置換された場合（いわゆる保存的置換）にポリペプチドの活性が維持される可能性が高くなる。すなわち、アミノ酸が置換する場合、類似した性質のアミノ酸に置換しても生理活性が維持される場合が多いので、置換の場合は、類似した性質のアミノ酸に置換したものが好ましい。すなわち、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多い。
　本発明で用いる、配列番号１～６および２１３のいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの酵素活性を有するポリペプチドについて、配列同一性の好ましい範囲は、８０％以上が好ましく、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
　本発明で「配列同一性」とは、２つのアミノ酸配列または塩基配列にギャップを導入して、またはギャップを導入しないで整列させた場合の、最適なアライメントにおいて、オーバーラップする全アミノ酸配列（翻訳開始点となるアミノ酸を含む）または塩基配列（開始コドンを含む）に対する同一アミノ酸または塩基の割合（パーセンテージ）を意味し、式（１）によって算出する。式（１）において、比較する短い方の配列長は４００アミノ酸以上であり、４００アミノ酸未満の場合には配列同一性は定義されない。配列同一性は、この分野で汎用されているアルゴリズムであるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）を用いて容易に調べることができる。例えばＢＬＡＳＴは、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ）などのウェブサイトから誰でも利用可能であり、デフォルトのパラメーターを用いて容易に配列同一性を調べることができる。また、配列同一性はＧｅｎｅｔｙｘなどのソフトウェアに搭載されている同様の機能を用いても調べることができる。
　配列同一性（％）＝一致数（ギャップ同士はカウントしない）／短い方の配列長（両端のギャップを含まない長さ）×１００・・・式（１）
式（１）に従い、Ｇｅｎｅｔｙｘの機能（％Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　Ｍａｔｒｉｘ）を用いて配列番号１～６および２１３に記載のアミノ酸配列間の配列同一性を算出すると、最も配列同一性の値が低い配列番号２と４との値は７１．５１％となり、配列番号１～６および２１３に記載のアミノ酸配列は、お互いに少なくとも７０％以上の配列同一性を有している。Ｇｅｎｅｔｙｘを用いた配列同一性の算出結果を表１に示す。なお、下記表１～表５において、一番左側の数字は配列番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　配列番号１～６および２１３に記載の各アミノ酸配列をＱｕｅｒｙとして、ＮＣＢＩのアミノ酸データベース（Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に登録されている全アミノ酸配列との配列同一性を、ＢＬＡＳＴＰを用いて調べた結果、配列同一性が７０％以上の配列は全てＳｅｒｒａｔｉａ属細菌由来であった。
　前記（ａ）の配列番号１～６および２１３に記載のポリペプチドは、いずれもＮ末端側からのアミノ酸残基１５～３８番目（以下、便宜的に、Ｎ末端側から何番目のアミノ酸残基かを、「a.a.」で表すことがある。したがって、例えば、Ｎ末端側からのアミノ酸残基１５～３８番目は、単に「１５～３８a.a.」と表すことがある）において配列番号２１２に示す２４アミノ酸残基からなる共通配列１を有している。共通配列１において、Ｘａａは任意のアミノ酸残基であるが、１３a.a.は好ましくはフェニルアラニンまたはロイシンであり、１５a.a.は好ましくはロイシンまたはグルタミンであり、１６a.a.は好ましくはリシンまたはアスパラギンであり、１７a.a.はグリシンまたはセリン、より好ましくはグリシンであり、１９a.a.は好ましくはプロリンまたはアルギニンであり、２１a.a.は好ましくはロイシン、メチオニンまたはバリンである。共通配列１は、ＮＡＤ＋結合残基およびその周辺のアミノ酸残基にあたる。ＮＡＤ＋結合残基は、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．　２０１２　Ｆｅｂ；９４（２）：４７１－８．で示されているように、共通配列１の２４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であるが、共通配列１ではアスパラギンである点が特徴である。共通配列１を有することによって、配列番号１～６および２１３に記載のポリペプチドは、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼとしての優れた酵素活性を示すと考える。
　前記（ｂ）および（ｃ）に記載のポリペプチドについても、１～２００a.a.以内に配列番号２１２に示す２４アミノ酸残基からなる共通配列１を有していることが好ましい。より好ましい共通配列の位置は、１～１５０a.a.以内であり、さらに好ましくは、１～１００a.a.以内である。その具体例としては、配列番号７～１６および７０～１３８のアミノ酸配列が挙げられる。配列番号７～１６および７０～１３８のアミノ酸配列は、１５～３８a.a.において配列番号２１２に示す２４アミノ酸残基からなる共通配列１を有している。なお、配列番号７～１６および７０～１３８のアミノ酸配列は、配列番号１～６および２１３のいずれかのアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上である。Ｇｅｎｅｔｙｘを用いた配列同一性の算出結果を表２－１から表２－３および表３－１から表３－３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　本発明の（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸は、当該ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端にさらなるペプチド又はタンパク質が付加されるような配列を含んでいてもよい。このようなペプチド又はタンパク質としては、例えば、分泌シグナル配列、輸送タンパク質、結合タンパク質、精製用のタグペプチド、蛍光タンパク質等を含むものが例示できる。こうしたペプチド又はタンパク質に関しては、当業者が目的に応じて、付加する機能を有するペプチド又はタンパク質を選択して、本発明のポリペプチドに付加することができる。なお、アミノ酸配列の配列同一性には、このようなペプチド又はタンパク質は含まれない。
　配列番号１～１６、７０～１３８または２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１～１６または７０～１３８に記載のアミノ酸配列に翻訳されうるような塩基配列であれば特に限定されず、各アミノ酸に対応するコドン（標準遺伝暗号）を参考に決定することができる。その際、本発明に使用する宿主微生物にとってよく使用されているコドンで塩基配列を再設計してもよい。
　配列番号１～１６、７０～１３８および２１３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸の塩基配列の具体例としては、それぞれ、配列番号５４～６９、１３９～２０７および２１４に記載の塩基配列が挙げられる。
　本発明において、ある核酸がコードするポリペプチドが、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有しているかどうかは、以下の形質転換株Ａと形質転換株Ｂを作製し、培養試験の結果、培養液中に３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸を確認することができれば、当該核酸が３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードしていると判断する。判断方法を下記スキーム１に示す生合成経路を用いて説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　上記スキーム１は、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸、および／またはアジピン酸を生産するために必要な反応経路の例を示している。ここで、反応Ａは、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する反応を示す。反応Ｂは、３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｃは、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｄは、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからアジピル－ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｅは３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応を示す。反応Ｆは、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成する反応を示す。反応Ｇは、アジピル－ＣｏＡからアジピン酸を生成する反応を示す。
　形質転換株Ａは、反応Ａ，反応Ｅおよび反応Ｆを触媒する酵素を有する。形質転換株Ｂは、反応Ａ、反応Ｃ、反応Ｅおよび反応Ｆを触媒する酵素を有する。
　まず、形質転換株Ａを作製する。反応Ａ、反応Ｅおよび反応Ｆをそれぞれ触媒する酵素を発現するプラスミドを作製する。なお、反応ＥとＦは同一の酵素で反応を触媒することが可能である。当該プラスミドを、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸、及びアジピン酸のいずれも生産する能力のない微生物株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入する。得られた形質転換株に対し、酵素活性の有無を調べる対象となるポリペプチドをコードする核酸を適当なプロモーターの下流に組み込んだ発現プラスミドを導入し、形質転換株Ａを得る。形質転換株Ａを培養し、培養後の培養液に３－ヒドロキシアジピン酸が含まれているかどうかを確認する。３－ヒドロキシアジピン酸が培養液中に確認できた場合、次に形質転換株Ｂを作製する。形質転換株Ｂは、形質転換株Ａに対し、反応Ｃを触媒する酵素を発現するプラスミドを作製して導入することで得る。形質転換株Ｂを培養し、培養後の培養液にα－ヒドロムコン酸が含まれているかどうかを確認する。培養後の培養液にα－ヒドロムコン酸が含まれることを確認することができれば、形質転換株Ａが生産した３－ヒドロキシアジピン酸および形質転換株Ｂが生産したα－ヒドロムコン酸は、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを経由して生成されたことがわかるため、対象となるポリペプチドが３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有していると判断する。
　反応Ａを触媒する酵素をコードする遺伝子として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のｐｃａＦ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　１０４１７５５、配列番号２０）を用いる。
　反応ＥおよびＦを触媒する酵素をコードする遺伝子として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のｐｃａＩおよびｐｃａＪ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　１０４６６１３、１０４６６１２、配列番号２３、２４）の全長を含む連続した配列を用いる。ｐｃａＩおよびｐｃａＪがコードするポリペプチドは、複合体を形成することによって反応Ｅと反応Ｆを触媒する。
　反応Ｃを触媒する酵素をコードする核酸として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株遺伝子ｐａａＦ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　１０４６９３２、配列番号４７）を用いる。
　形質転換株Ａ、形質転換株Ｂの培養方法は、以下のとおりである。なお培養の際には、プラスミドを安定に保持するための抗生物質や、組み込んだ核酸がコードするポリペプチドの発現を誘導する物質を適宜加えることができる。ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）５ｍＬに、形質転換株ＡまたはＢを一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で１８時間振とう培養し、前培養液とする。続いて当該前培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（コハク酸１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ）５ｍＬに添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養する。得られた培養液中に３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸が含まれているかを確認する。
　培養液中に３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸が含まれることは、培養液を遠心し、上清をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析することにより確認できる。分析の条件は以下のとおりである。
・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ　ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ－Ｑｕａｄ　ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ　ネガティブモード。
　３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの活性の値は、３－オキソアジピン酸から酵素反応で調製した３－オキソアジピル－ＣｏＡを基質として、精製３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼを用いて生成する３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを測定することで算出できる。具体的な方法は、以下の通りである。
　３－オキソアジピン酸は公知の方法（例えば、ＷＯ２０１７／０９９２０９の参考例１に記載された方法）により調製することができる。
　３－オキソアジピル－ＣｏＡ溶液の調製：常法に従いＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸（ｐｃａＩおよびｐｃａＪ、ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３および１０４６６１２）の全長を増幅する。なお、このＰＣＲで用いるプライマーの塩基配列は、例えば配列番号２５および２６である。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の３－オキソアジピル－ＣｏＡ調製用酵素反応溶液を調製し、２５℃で３分分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液を３－オキソアジピル－ＣｏＡ溶液とする。
３－オキソアジピル－ＣｏＡ調製用酵素反応溶液：
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．５ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｉｙ－ＣｏＡ
５ｍＭ　３－ｏｘｏａｄｉｐｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ
２μＭ　ＣｏＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸全長を増幅する。なお、このＰＣＲで用いるプライマーの塩基配列は、例えば配列番号３１および３２である。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＢａｍＨＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ溶液を得る。３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性は、本酵素溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、２５℃における３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡの生成量を測定することで確認できる。
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
１５０μＬ／ｍＬ　３－ｏｘｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ
０．５ｍＭ　ＮＡＤＨ
１ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
１０μＭ　３－ｏｘｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ。
　本発明で、（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物は、（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸を元来有している微生物を宿主として、当該宿主微生物が有する（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドの発現を、遺伝子改変により増強した微生物である。
　（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸を元来有している微生物の具体例は、以下のＳｅｒｒａｔｉａ属微生物が挙げられる。Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（配列番号１、７０～８０、８２～８５、８７～１１８を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ（配列番号２、８１、１１９を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ（配列番号３、１３１～１３６、１３８を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ（配列番号４、１３７を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ（配列番号５を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＢＷ１０６（配列番号６を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　Ｓ１１９（配列番号７を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＹＤ２５（配列番号８を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＦＳ１４（配列番号９を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＨＭＳＣ１５Ｆ１１（配列番号１０を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＪＫＳ０００１９９（配列番号１１を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＴＥＬ（配列番号１２を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＩＳＴＤ０４（配列番号１３を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＳＣＢＩ（配列番号１４を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　Ｓ４（配列番号１５を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　Ｃ－１（配列番号１６を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＯＭＬＷ３（配列番号８６を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＯＬＥＬ１（配列番号１２０を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＯＬＥＬ２（配列番号１２３を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（配列番号２１３を有する微生物）などが挙げられる。
　上記した(ａ）、（ｂ）、（ｃ）に記載したポリペプチドは、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性をも兼備しており、この３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子によりコードされるものである。
　ここで、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子において、「遺伝子クラスター」とは、関連する機能を有する一連の核酸群が近接して存在する領域を意味する。遺伝子クラスターの具体的な構成要素としては、例えば単一の転写制御因子により転写調節される核酸群、単一の転写プロモーター制御下で転写されるオペロンなどが挙げられる。ある核酸が遺伝子クラスターを構成する核酸であるかどうかは、オンラインでａｎｔｉＳＭＡＳＨなどの遺伝子クラスター検索プログラムを用いて調べることもできる。また、あるポリペプチドが３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼあるいは５－アミノレブリン酸シンターゼに分類されるかどうかは、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ）などのウェブサイトでＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）検索を行い、当該ポリペプチドのアミノ酸配列との相同性が高い酵素を調べることでわかる。例えば配列番号４のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのデータベース上で、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ：ＡＢＶ４０９３５．１として登録されており、アミノ酸配列から、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質であると推定されることが記載されている。また、配列番号４のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ＮＣＢＩのデータベース上で、Ｇｅｎｅ　ＩＤ：ＣＰ０００８２６．１として登録されており、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ　５６８のゲノム上に保存されていること、またＧｅｎｅ　ＩＤ：ＣＰ０００８２６．１の位置２０１５３１３から２０１６８４２に保存されていることが検索できる。さらに、この遺伝子の位置情報から、その前後の遺伝子配列を確認することができ、５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ：ＡＢＶ４０９３３．１）と図１に示す遺伝子クラスターを構成することも確認できる。同様に、配列番号１～３、６～１６、７０～７２、７４～８２、８４～８７、８９、９０、９２、９４～１００、１０３～１０８、１１１～１１５、１１７、１１８、１２０～１２５、１２７～１３３、１３５～１３７、２１３のアミノ酸配列については、表１３に示すプロテインＩＤとＧｅｎｅ　ＩＤによって、ＮＣＢＩ上でその情報を確認することが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　以下、本明細書中では、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子にコードされるポリペプチドをコードする核酸を、「本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子」と記載し、当該３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子がコードするポリペプチドを、「本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」と記載する。
　本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる遺伝子クラスターは、少なくとも３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子および５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子を含んでいれば、他の核酸がクラスターに含まれていてもよい。図１に本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる遺伝子クラスターの具体例を示す。
　当該遺伝子クラスターを有するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物の具体例は、Ｓ．　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ、Ｓ．　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓ．　ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ、Ｓ．　ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ、Ｓ．　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＢＷ１０６、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　Ｓ１１９、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＹＤ２５、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＦＳ１４、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＨＭＳＣ１５Ｆ１１、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＪＫＳ０００１９９、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＴＥＬ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＩＳＴＤ０４、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＳＣＢＩ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　Ｓ４、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　Ｃ－１、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＯＭＬＷ３、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＯＬＥＬ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＯＬＥＬ２、Ｓ．　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓなどが挙げられる。
　本発明で用いる、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、優れた３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有している。３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする核酸が、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有しているかどうかは、上記と同様の方法で確認することができる。
　本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子がコードするポリペプチドは、共通配列１を有していることを特徴とする。このようなポリペプチドのアミノ酸配列の具体例としては、配列番号１～１６、７０～１３８または２１３のアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明では、前記共通配列１を有していれば、配列番号７～１６または７０～１３８のいずれのポリペプチドのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸も好ましく用いることができる。ここで、「１もしくは数個」の範囲は、１０個以内が好ましく、さらに好ましくは５個以内、特に好ましくは４個以内、最も好ましくは１個又は２個以内である。ここで、アミノ酸が置換される場合、性質が類似したアミノ酸に置換された場合（すなわち、上記した保存的置換）にポリペプチドの活性が維持される可能性が高くなる。また、配列番号７～１６または７０～１３８のいずれのポリペプチドのアミノ酸配列と、配列同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸も好ましく用いることができる。
　一方で、本発明で用いる３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼには該当しないが、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの活性を有しているポリペプチドとして、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のＰａａＨ（配列番号２０８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株由来のＰａａＨ（配列番号２０９）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ　ＡＤＰ１株由来のＤｃａＨ（配列番号２１０）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ　ＮＢＲＣ１０２５９９株由来のＰａａＨ（配列番号２１１）などが挙げられるが、これらのポリペプチドには、表４および表５に示すように共通配列１が含まれていないことがわかる。なお、これらのポリペプチドは、（ｂ）配列番号１～６及び２１３のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド、または（ｃ）配列番号１～６及び２１３のいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチドには該当しない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　本発明で遺伝子改変微生物を得るための宿主として用いることができる微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属およびＣａｎｄｉｄａ属に属する微生物が挙げられる。これらの中でも、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物が好ましい。
　本発明の遺伝子改変微生物を用いて３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を製造する方法を説明する。
　本発明の遺伝子改変微生物が、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、および３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成（反応Ｅ）する能力を有していれば、３－ヒドロキシアジピン酸を製造することができる。これらの生成能力を有する微生物を宿主微生物とすれば、３－ヒドロキシアジピン酸を高生産することができる遺伝子改変微生物を取得することができる。これらの生成能力を元来有すると推定される微生物としては、以下の微生物が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓなどのＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｏｓｅｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖａｃｅｕｓなどのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ　ａｌｂｕｓなどのＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｏｄｉｎｕｍなどのＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｌｆｔｉａ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ　ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅなどのＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒなどのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属。これらの微生物を宿主微生物として本発明の遺伝子改変微生物を取得することで、３－ヒドロキシアジピン酸を高生産する遺伝子改変微生物を取得することができる。
　本発明の遺伝子改変微生物が、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、および／または３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成（反応Ｅ）する能力を元来有していない場合には、反応Ａ、Ｅを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入することで、これらの生成能を付与することができる。
　本発明の遺伝子改変微生物が、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを脱水して２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成（反応Ｃ）する能力、および２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成（反応Ｆ）する能力を有していれば、α－ヒドロムコン酸を製造することができる。これらの生成能力を有する微生物を宿主微生物とすれば、α－ヒドロムコン酸を高生産することができる遺伝子改変微生物を取得することができる。これらの生成能力を元来有すると推定される微生物としては、以下の微生物が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓなどのＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｕｍａｚｕｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｄｅｌｆｔｉａ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ　ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属。
　本発明の遺伝子改変微生物が、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを脱水して２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成（反応Ｃ）する能力、および２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成（反応Ｆ）する能力を元来有していない場合には、反応Ａ、Ｃ、Ｆを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入することで、これらの生成能を付与することができる。
　本発明の遺伝子改変微生物が、スクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを脱水して２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成（反応Ｃ）する能力、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを還元してアジピル－ＣｏＡを生成（反応Ｄ）する能力、およびアジピル－ＣｏＡからアジピン酸を生成（反応Ｇ）する能力を有していれば、アジピン酸を製造することができる。これらの生成能力を有する微生物を宿主微生物とすれば、アジピン産を高生産することができる遺伝子改変微生物を取得することができる。これらの生成能力を元来有すると推定される微生物としては、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａなどのＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属が挙げられる。
　本発明の遺伝子改変微生物が、スクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを脱水して２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成（反応Ｃ）する能力、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを還元してアジピル－ＣｏＡを生成（反応Ｄ）する能力、およびアジピル－ＣｏＡからアジピン酸を生成（反応Ｇ）する能力を元来有していない場合には、反応Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入することで、これらの生成能を付与することができる。
　以下に反応Ａ、Ｃ～Ｇを触媒する酵素の具体例を示す。
　３－オキソアジピル－ＣｏＡを生成する反応Ａを触媒する酵素は、例えば、アシルトランスフェラーゼ（β－ケトチオラーゼ）などを用いることができる。アシルトランスフェラーゼとしてはＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ２．３．１．－に分類されるアシルトランスフェラーゼが好ましく、具体的には３－オキソアジピル－ＣｏＡチオラーゼとしてＥＣ２．３．１．１７４に分類される酵素、アセチル－ＣｏＡ　Ｃ－アセチルトランスフェラーゼとしてＥＣ２．３．１．９に分類される酵素、アセチル－ＣｏＡ　Ｃ－アシルトランスフェラーゼとしてＥＣ２．３．１．１６に分類される酵素が挙げられる。これらの中でもＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株由来のＰａａＪ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１５９１５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のＰｃａＦ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４３５３６）などを好ましく用いることができる。
　上記のアシルトランスフェラーゼが、スクシニル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡを基質として、３－オキソアジピル－ＣｏＡを生成できるかどうかは、精製アシルトランスフェラーゼによる３－オキソアジピル－ＣｏＡ生成反応と、３－オキソアジピル－ＣｏＡを基質とした精製３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼによる還元反応を組み合わせ、３－オキソアジピル－ＣｏＡの還元に伴うＮＡＤＨの減少量を測定することで確認できる。具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。
　アシルトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、アシルトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＳａｃＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、アシルトランスフェラーゼ溶液を得る。アシルトランスフェラーゼ活性は、当該酵素溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃におけるＮＡＤＨの酸化に伴う３４０ｎｍ吸収の減少を測定することで確認できる。
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．１ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ＣｏＡ
０．２ｍＭ　ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ
０．２ｍＭ　ＮＡＤＨ
１ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
１０μｇ／ｍＬ　３－ｏｘｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ
５μｇ／ｍＬ　ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がアシルトランスフェラーゼ活性を有しているかどうかは、精製アシルトランスフェラーゼの代わりに細胞破砕液（ｃｅｌｌ　ｆｒｅｅ　ｅｘｔｒａｃｔ：　ＣＦＥ）を用いて上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象とした具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。
　ＣＦＥの調製：ｐＨ７に調整した培地（培地組成：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）５ｍＬに活性測定の対象となる大腸菌ＭＧ１６５５株を一白金耳植菌し、３０℃で１８時間振とう培養する。得られた培養液をｐＨ７に調整した培地（培地組成：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、フェルラ酸２．５ｍＭ、ｐ－クマル酸２．５ｍＭ、安息香酸２．５ｍＭ、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸２．５ｍＭ、プロトカテク酸２．５ｍＭ、カテコール２．５ｍＭ、３ＯＡ２．５ｍＭ、３－ヒドロキシアジピン酸２．５ｍＭ、α－ヒドロムコン酸２．５ｍＭ、アジピン酸２．５ｍＭ、フェニルエチルアミン２．５ｍＭ）５ｍＬに添加し、３０℃で３時間振とう培養する。
　得られた培養液に１０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムを加え、菌体を遠心分離して上清を取り除く操作を３回行い、菌体を洗浄する。洗浄後の菌体をＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ１ｍＭからなるＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー１ｍＬに懸濁し、得られた懸濁液にガラスビーズ（φ０．１ｍｍ）を加え、超音波破砕機を用い４℃で菌体を破砕する。菌体破砕液を遠心して得られる上清のうち０．５ｍＬをＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に通し、透過液を除去したのちＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー０．４ｍＬを添加することを３回繰り返すことで低分子量の夾雑物を除去した後、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファーで再懸濁して液量を０．１ｍＬとしたものをＣＦＥとする。精製酵素の代わりに当該ＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加し、酵素活性の確認を行う。
　２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する反応Ｃを触媒する酵素は、例えば、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼなどを用いることができる。エノイル－ＣｏＡヒドラターゼとしては、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ番号４．２．１．－に分類されるエノイル－ＣｏＡヒドラターゼが好ましく、具体的にはエノイル－ＣｏＡヒドラターゼまたは２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡヒドラターゼとしてＥＣ４．２．１．１７に分類される酵素が挙げられる。これらの中でもＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株由来のＰａａＦ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１５９１１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のＰａａＦ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４５４２７）などを好ましく用いることができる。
　エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが触媒する反応は一般的に可逆反応であることから、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼが、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを基質として２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡが生成する反応を触媒する活性を有することは、α－ヒドロムコン酸から酵素反応で調製した２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを基質として、精製エノイル－ＣｏＡヒドラターゼを用いて生成する３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを検出することで確認することができる。具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。
　ここで用いるα－ヒドロムコン酸は、公知の方法（例えば、ＷＯ２０１６／１９９８５８Ａ１の参考例１に記載された方法）により調製することができる。
　２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ溶液の調製：常法に従いＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸（ｐｃａＩおよびｐｃａＪ、ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３および１０４６６１２）の全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ調製用酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液を２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ溶液とする。
２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ調製用酵素反応溶液
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．４ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｉｙ－ＣｏＡ
２ｍＭ　α－ｈｙｄｒｏｍｕｃｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬ　ＣｏＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＥＴ－１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ溶液を得る。エノイル－ＣｏＡ　ヒドラターゼ活性は、当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液中の３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
３００μＬ／ｍＬ　２，３－ｄｅｈｙｄｒｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ
１ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
２０μｇ／ｍＬ　ｅｎｏｙｌ－ＣｏＡ　ｈｙｄｒａｔａｓｅ。
　本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がエノイル－ＣｏＡヒドラターゼ活性を有しているかどうかは、精製エノイル－ＣｏＡヒドラターゼの代わりにＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加して上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象としたＣＦＥの調製方法の具体例はアシルトランスフェラーゼ活性の確認方法に記載した通りである。
　アジピル－ＣｏＡを生成する反応Ｄを触媒する酵素は、例えば、エノイル－ＣｏＡレダクターゼなどを用いることができる。エノイル－ＣｏＡレダクターゼとしては、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ番号１．３．－．－に分類されるエノイル－ＣｏＡレダクターゼが好ましく、具体的にはｔｒａｎｓ－２－エノイル－ＣｏＡレダクターゼとしてＥＣ１．３．１．４４に分類される酵素、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼとしてＥＣ１．３．８．７に分類される酵素が挙げられる。これらの具体例は、例えば特表２０１１－５１５１１１、Ｊ　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２０１５　Ｏｃｔ；１１９（４）：１０５７－６３．などに開示されているが、中でもＥｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ　Ｚ株由来のＴＥＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５ＥＵ９０）、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａ　ＹＸ株由来のＴｆｕ＿１６４７（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＡＺ５５６８２）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ　ＡＤＰ１株由来のＤｃａＡ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＡＬ０９０９４．１）などを好ましく用いることができる。
　エノイル－ＣｏＡレダクターゼが、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを基質とした場合、アジピル－ＣｏＡが生成する活性を有することは、α－ヒドロムコン酸から酵素反応で調製した２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを基質として、精製エノイル－ＣｏＡレダクターゼを用いて２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡの還元に伴うＮＡＤＨの減少量を測定することで確認できる。
　α－ヒドロムコン酸の調製と、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ溶液の調製は、上記と同様に行うことができる。
　エノイル－ＣｏＡレダクターゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、エノイル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＥＴ－１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、エノイル－ＣｏＡレダクターゼ溶液を得る。エノイル－ＣｏＡレダクターゼ活性は、本酵素溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃におけるＮＡＤＨの酸化に伴う３４０ｎｍ吸収の減少を測定することで確認できる。
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
３００μＬ／ｍＬ　２，３－ｄｅｈｙｄｒｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ０．２ｍＭ　ＮＡＤＨ
１ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
２０μｇ／ｍＬ　ｅｎｏｙｌ－ＣｏＡ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ。
　本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がエノイル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有しているかどうかは、精製エノイル－ＣｏＡレダクターゼの代わりにＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加して上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象としたＣＦＥの調製方法の具体例はアシルトランスフェラーゼ活性の確認方法に記載した通りである。
　３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応Ｅ、α－ヒドロムコン酸を生成する反応Ｆ、アジピン酸を生成する反応Ｇを触媒する酵素は、例えば、ＣｏＡトランスフェラーゼあるいはアシル－ＣｏＡヒドロラーゼなどを用いることができるが、ＣｏＡトランスフェラーゼが好ましい。
　ＣｏＡトランスフェラーゼとしては、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ番号２．８．３．－に分類されるＣｏＡトランスフェラーゼが好ましく、具体的にはＣｏＡトランスフェラーゼまたはアシル－ＣｏＡトランスフェラーゼとしてＥＣ２．８．３．６に分類される酵素などが挙げられる。
　本発明において、「ＣｏＡトランスフェラーゼ」とは、アシル－ＣｏＡおよびコハク酸を基質としてカルボン酸およびスクシニル－ＣｏＡを生成する反応の触媒活性（ＣｏＡトランスフェラーゼ活性）を有する酵素を意味する。
　３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応Ｅ、α－ヒドロムコン酸を生成する反応Ｆを触媒する酵素には、中でもＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のＰｃａＩおよびＰｃａＪ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４６０８１およびＮＰ＿７４６０８２）等を好ましく用いることができる。
　また、アジピン酸を生成する反応Ｇを触媒する酵素には、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ　ＡＤＰ１株由来のＤｃａＩおよびＤｃａＪ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＣＡＧ６８５３８およびＣＡＧ６８５３９）などを好ましく用いることができる。
　３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡ、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡまたはアジピル－ＣｏＡを基質とするＣｏＡトランスフェラーゼ活性は、本酵素反応が可逆反応であることから、３－ヒドロキシアジピン酸およびスクシニル－ＣｏＡ、α－ヒドロムコン酸およびスクシニル－ＣｏＡ、またはアジピン酸およびスクシニル－ＣｏＡを基質として、精製ＣｏＡトランスフェラーゼを用いて生成する３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡ、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡまたはアジピル－ＣｏＡを検出することで確認することができる。具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。
　３－ヒドロキシアジピン酸の調製：３－ヒドロキシアジピン酸はＷＯ２０１６／１９９８５６Ａ１の参考例１に記載された方法により調製する。
　３－ヒドロキシアジピン酸を基質としたＣｏＡトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、透過液中の３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．４ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｉｙ－ＣｏＡ
２ｍＭ　３－ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬ　ＣｏＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　α－ヒドロムコン酸の調製：α－ヒドロムコン酸はＷＯ２０１６／１９９８５８Ａ１の参考例１に記載された方法により調製する。
　α－ヒドロムコン酸を基質としたＣｏＡトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、透過液中の２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．４ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｉｙ－ＣｏＡ
２ｍＭ　α－ｈｙｄｒｏｍｕｃｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬ　ＣｏＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　アジピン酸を基質としたＣｏＡトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、透過液中のアジピル－ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．４ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｉｙ－ＣｏＡ
２ｍＭ　ａｄｉｐｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬ　ＣｏＡ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有しているかどうかは、精製ＣｏＡトランスフェラーゼの代わりにＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加して上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象としたＣＦＥの調製方法の具体例はアシルトランスフェラーゼ活性の確認方法に記載した通りである。
　本発明で（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチド、または３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、従来技術で用いられている３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼよりも優れた活性を有することを特徴とする。ここで、「優れた活性」とは、同一の宿主微生物、発現条件下で当該ポリペプチドまたは従来の３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼを発現した遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地で培養した場合、従来の３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼを発現した遺伝子改変微生物に比べて高い収率で３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸、またはアジピン酸を生産することを意味する。ここで、３－ヒドロキシアジピン酸収率は式（３）に従って算出する。α－ヒドロムコン酸収率またはアジピン酸収率は、式（３）の３－ヒドロキシアジピン酸をそれぞれα－ヒドロムコン酸またはアジピン酸に置き換えることで算出する。
　収率（％）＝３－ヒドロキシアジピン酸生成量（ｍｏｌ）／炭素源の消費量（ｍｏｌ）×１００・・・式（３）。
　本発明で（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチド、または３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼが、従来技術で用いられている３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼよりも優れた活性を有することを確認する具体的な方法は以下の通りである。大腸菌内で自立複製可能なベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（ＭＥ　Ｋｏｖａｃｈ，　（１９９５），　Ｇｅｎｅ　１６６：　１７５－１７６）をＸｈｏＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩを得る。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２　ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂを常法に従ってＰＣＲ増幅し（用いるプライマーは、例えば配列番号１８および１９である）、得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩ　を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐを得る。ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＰｇａｐをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを得る。アシルトランスフェラーゼをコードする核酸全長を常法に従ってＰＣＲ増幅し（用いるプライマーは、例えば配列番号２１および２２である）、得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結しプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴを得る。ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴをＨｐａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを得る。ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を常法に従ってＰＣＲ増幅し（用いるプライマーは、例えば配列番号２５および２６である）、得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結しプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴを得る。
　一方、大腸菌内で自立複製可能な発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をＢａｍＨＩで切断し、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１／ＢａｍＨＩを得る。配列番号１～１６または７０～１３８のポリペプチドあるいは従来技術で用いられている３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸を常法に従ってＰＣＲ増幅し（用いるプライマーは、例えば配列番号３１および３２である）、得られた断片およびｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１／ＢａｍＨＩ　を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、配列番号１～１６または７０～１３８のポリペプチドあるいは従来技術で用いられている３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼを発現するプラスミドを得る。
　得られたプラスミドおよびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴを、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にエレクトロポレーション（ＮＭ　Ｃａｌｖｉｎ，　ＰＣ　Ｈａｎａｗａｌｔ．　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，　１７０　（１９８８），　ｐｐ．　２７９６-２８０１）で導入する。導入後の当該株をｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬ）５ｍＬに一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で１８時間振とう培養する。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（コハク酸１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬおよびＩＰＴＧ０．０１ｍＭ）５ｍＬに添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養する。当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を分析することで培養上清中の３－ヒドロキシアジピン酸および炭素源の濃度を定量する。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる３－ヒドロキシアジピン酸の定量分析は以下の条件で行う。
　・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ　ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ－Ｑｕａｄ　ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ　ネガティブモード。
　ＨＰＬＣによる糖、コハク酸などの炭素源の定量分析は以下の条件で行う。
・ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｚｕ　Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　Ｓｕｇａｒ　ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）、長さ３００　ｍｍ、内径８　ｍｍ、粒径６μｍ
移動相：０．０５Ｍ　硫酸水溶液
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：６５℃
検出器：ＲＩ。
　本発明においてアシルトランスフェラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ、エノイル－ＣｏＡレダクターゼのいずれかをコードする核酸を宿主微生物に導入する場合、当該核酸はデータベース上に存在する当該酵素のアミノ酸配列を元に人工的に合成してもよいし、天然から分離してもよい。人工的に合成する場合、導入する宿主微生物に合わせて各アミノ酸に対応するコドンの使用頻度を変更してもよい。
　本発明で、アシルトランスフェラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ、エノイル－ＣｏＡレダクターゼのいずれかをコードする核酸を宿主微生物に導入する方法は特に限定されず、宿主微生物内で自律複製可能な発現ベクターに当該核酸を組み込み宿主微生物に導入する方法や、宿主微生物のゲノムに当該核酸を組み込む方法などを用いることができる。
　当該酵素をコードする核酸を天然から分離する場合、遺伝子源となる生物は特に限定されないが、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅなどのＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｏｓｅｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｏｄｉｎｕｍなどのＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｕｍａｚｕｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｄｅｌｆｔｉａ　　　　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍなどのＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ　ａｌｂｕｓなどのＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属、Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ　ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓなどのＰｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒなどのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓなどのＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ　ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ｓｔｅｒｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｎａｃｅｕｓなどのＳｔｅｒｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｒｕｃｋｅｒｉなどのＹｅｒｓｉｎｉａ属、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ　などのＥｕｇｌｅｎａ　属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａなどのＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属が挙げられ、好ましくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｅｕｇｌｅｎａ　属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属である。
　本発明で発現させるポリペプチドをコードする核酸を発現ベクターまたは宿主微生物ゲノムに組み込む場合、当該発現ベクターまたはゲノム組み込み用核酸はプロモーター、リボソーム結合配列、発現させるポリペプチドをコードする核酸、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーター活性を制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　本発明で用いるプロモーターは、宿主微生物内で酵素を発現させられるものであれば特に限定されないが、例えばｇａｐプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが挙げられる。
　本発明で発現ベクターを用いて核酸の導入や、ポリペプチドの発現の増強を行う場合は、当該微生物中で自律複製可能であれば特に限定されないが、例えばｐＢＢＲ１ＭＣＳベクター、ｐＢＲ３２２ベクター、ｐＭＷベクター、ｐＥＴベクター、ｐＲＳＦベクター、ｐＣＤＦベクター、ｐＡＣＹＣベクター、および上述のベクターの派生型などが挙げられる。
　本発明でゲノム組み込み用核酸を用いて核酸の導入や、ポリペプチドの発現の増強を行う場合は、部位特異的相同組換えを用いて導入する。部位相同組換えの方法は特に限定されないが、例えばλ　Ｒｅｄ　レコンビナーゼおよびＦＬＰレコンビナーゼを用いる方法（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　２０００　Ｊｕｎ　６；　９７（１２）：　６６４０-６６４５．）、λ　Ｒｅｄ　レコンビナーゼおよびｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２００７　Ｄｅｃ；７１（１２）：２９０５－１１．）が挙げられる。
　発現ベクターまたはゲノム組み込み用核酸の導入方法は、微生物に核酸を導入する方法であれば特に限定されないが、例えばカルシウムイオン法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　５３，　１５９　（１９７０））、エレクトロポレーション法（ＮＭ　Ｃａｌｖｉｎ，　ＰＣ　Ｈａｎａｗａｌｔ．　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，　１７０　（１９８８），　ｐｐ．　２７９６-２８０１）などが挙げられる。
　本発明では、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸を導入、もしくは当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物を、通常の微生物が利用し得る炭素源を発酵原料として含有する培地、好ましくは液体培地中において培養する。当該遺伝子改変微生物が利用し得る炭素源の他には、窒素源、無機塩および必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの有機微量栄養素を程よく含有した培地を用いる。上記栄養源を含有していれば天然培地、合成培地のいずれでも利用できる。
　発酵原料とは、当該遺伝子改変微生物が代謝し得る原料である。「代謝」とは、微生物が細胞外から取り入れた、あるいは細胞内で別の化学物質より生じたある化学物質が、酵素反応により別の化学物質へと変換されることを指す。炭素源としては、糖類を好ましく用いることができる。糖類の具体例としては、グルコース、シュクロース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース等の単糖類、これら単糖類が結合した二糖類、多糖類、およびこれらを含有する澱粉糖化液、糖蜜、セルロース含有バイオマス糖化液などが挙げられる。
　また、上記に挙げた糖以外にも、ＣｏＡトランスフェラーゼの基質であるコハク酸を添加することで３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を効率よく生産することができる。
　上記に挙げた炭素源は、一種類のみ用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。炭素源の添加において、培地中の炭素源の濃度は、特に限定されず、炭素源の種類などに応じて適宜設定することができ、好ましくは、糖類は５ｇ／Ｌ～３００ｇ／Ｌ、コハク酸は０．１ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌである。
　当該遺伝子改変微生物の培養に用いる窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用できる。培地中の窒素源の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．１ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌである。
　当該遺伝子改変微生物の培養に用いる無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
　３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物の培養条件は、前記成分組成の培地、培養温度、撹拌速度、ｐＨ、通気量、植菌量などを、当該遺伝子改変微生物の種類および外部条件などに応じて、適宜調節あるいは選択して設定する。液体培養において発泡がある場合には、鉱油、シリコーン油および界面活性剤などの消泡剤を適宜培地に配合することができる。
　前記微生物の培養物中に、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸が回収可能な量まで生産された後、生産された当該生産物を回収することができる。生産された当該生産物の回収、例えば単離は、蓄積量が適度に高まった時点で培養を停止し、その培養物から、発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行うことができる。具体的には、遠心分離、ろ過などにより菌体を分離したのち、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭処理、結晶化、膜分離、蒸留などにより、当該生産物を培養物から単離することができる。より具体的には、当該生産物の塩に酸成分を添加して析出物を回収する方法、培養物を逆浸透膜やエバポレーターなどを用いた濃縮操作により水を除去して当該生産物の濃度を高めた後、冷却結晶化や断熱結晶化により当該生産物および／または当該生産物の塩の結晶を析出させ、遠心分離やろ過などにより当該生産物および／または当該生産物の塩の結晶を得る方法、培養物にアルコールを添加して当該生産物をエステルとした後、蒸留操作により当該生産物のエステルを回収後、加水分解により当該生産物を得る方法等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、これらの回収方法は生成物の物性などにより適当に選択して最適化することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
参考例１
アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する反応（反応Ａ）を触媒する酵素、及び３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応（反応Ｅ）かつ２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成する反応（反応Ｆ）を触媒する酵素を発現するプラスミドの作製
　大腸菌内で自律複製可能なベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（ＭＥ　Ｋｏｖａｃｈ，　（１９９５），　Ｇｅｎｅ　１６６：　１７５－１７６）をＸｈｏＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２　ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号１７）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１８、１９）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩ　を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え大腸菌株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＰｇａｐをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩ　を得た。　反応Ａを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてアシルトランスフェラーゼ遺伝子ｐｃａＦ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　１０４１７５５、配列番号２０）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１、２２）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴをＨｐａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを得た。反応Ｅおよび反応Ｆを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子ＰｃａＩおよびＰｃａＪ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　１０４６６１３、１０４６６１２、配列番号２３、２４）の全長を含む連続した配列をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２５、２６）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴとした。
参考例２
配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドの作製
　大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をＢａｍＨＩで切断し、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１／ＢａｍＨＩを得た。配列番号１のポリペプチドをコードする核酸を増幅するために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　ＡＴＣＣ１３８８０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５４に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号３１、３２）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号２のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ　ＤＳＭ２１４２０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５５に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号３３，３４）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号３のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ　ＮＢＲＣ１０２５９９株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５６に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号３５，３６）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号４のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ　５６８株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５７に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号３７，３８）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号５のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ　Ｌｒ５／４株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５８に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１５，２１６）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号６のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｓｐ．　ＢＷ１０６株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５９に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１７，２１８）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号２１３のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　ＦＫ０１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２１４に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１９，２２０）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られたそれぞれの断片およびｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１／ＢａｍＨＩ　を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認した。なお当該プラスミドに組み込まれた３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの発現はＩＰＴＧで誘導され、Ｎ末端にヒスチジンタグを含む１４個のアミノ酸が付加されている。
　配列番号１に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｍｒ１」、配列番号２に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｎｍ１」、配列番号３に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｌ１」、配列番号４に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｅ１」、配列番号５に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｕｒ１」、配列番号６に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｓｐ１」、配列番号２１３に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｌｑ１」とし、これらのプラスミドについて表６に示す。
参考例３
３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼを発現するためプラスミドの作製
　本発明の（ａ）～（ｃ）に記載のポリペプチド以外で、３－オキソアシル－ＣｏＡを基質として３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡを生成する還元反応を触媒する４種類の酵素を発現するためのプラスミドを作製した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のｐａａＨ（配列番号２７）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株由来のｐａａＨ（配列番号２８）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ　ＡＤＰ１株由来のｄｃａＨ（配列番号２９）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ　ＮＢＲＣ１０２５９９株由来のｐａａＨ（配列番号３０）の４種類を用いた。配列番号２７に記載の核酸を増幅するためのプライマーとして（配列番号３９，４０）、配列番号２８に記載の核酸を増幅するためのプライマーとして（配列番号４１，４２）、
配列番号２９に記載の核酸を増幅するためのプライマーとして（配列番号４３，４４）、配列番号３０に記載の核酸を増幅するためのプライマーとして（配列番号４５，４６）を用いた以外は、参考例２と同様の方法でプラスミドを作製した。
　配列番号２７に記載の核酸がコードするポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｐｐｕ１」、配列番号２８に記載の核酸がコードするポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｅｃｏ１」、配列番号２９に記載の核酸がコードするポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ａｃｉ１」、配列番号３０に記載の核酸がコードするポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｌ２」とし、これらのプラスミドについて表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
実施例１
配列番号１，２，３，４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸が導入された３－ヒドロキシアジピン酸生産能を有する大腸菌の作製
　参考例１で作製したプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴを、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にエレクトロポレーション（ＮＭ　Ｃａｌｖｉｎ，　ＰＣ　Ｈａｎａｗａｌｔ．　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，　１７０　（１９８８），　ｐｐ．　２７９６-２８０１）で導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて３７℃で培養した。得られた組み換え株をＢＬ２１（ＤＥ３）／　ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴとした。
　続いて、参考例２で作製した７種類のプラスミドをそれぞれＢＬ２１（ＤＥ３）／　ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて、３７℃で培養した。「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｍｒ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｍｒ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｎｍ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｌ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｅ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｕｒ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｓｐ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｌｑ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｌｑ１＿３ＨＡ」とし、本実施例で得られた組換え株を表７に示す。
比較例１
３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸が導入された３－ヒドロキシアジピン酸生産能を有する大腸菌の作製
　参考例１で作製したプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴを、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にエレクトロポレーション（ＮＭ　Ｃａｌｖｉｎ，　ＰＣ　Ｈａｎａｗａｌｔ．　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，　１７０　（１９８８），　ｐｐ．　２７９６-２８０１）で導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて３７℃で培養した。得られた組み換え株をＢＬ２１（ＤＥ３）／　ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴとした。
　続いて、参考例３で作製した４種類のプラスミドをそれぞれＢＬ２１（ＤＥ３）／　ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて、３７℃で培養した。
　「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｐｐｕ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｐｐｕ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｅｃｏ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｅｃｏ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ａｃｉ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ａｃｉ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｌ２」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｌ２＿３ＨＡ」とし、本比較例で得られた組換え株を表７に示す。
実施例２
配列番号１，２，３，４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸が導入された３－ヒドロキシアジピン酸生産能を有する大腸菌を用いた３－ヒドロキシアジピン酸の生産試験
　実施例１で作製した組換え大腸菌株を用いて、３－ヒドロキシアジピン酸の生産試験を行った。
　ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬ）５ｍＬに、実施例１で作製した組換え株を一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で１８時間振とう培養した。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（コハク酸１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬおよびＩＰＴＧ０．０１ｍＭ）５ｍＬに添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養した。
３－ヒドロキシアジピン酸および炭素源の定量分析
　当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を以下の方法で分析することで培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸および炭素源の濃度を定量した。その結果を表７に示す。また式（３）用いて算出した３－ヒドロキシアジピン酸の収率を表７に示す。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる３－ヒドロキシアジピン酸の定量分析
・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ　ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ－Ｑｕａｄ　ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ　ネガティブモード。
ＨＰＬＣによる糖およびコハク酸の定量分析
・ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｚｕ　Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　Ｓｕｇａｒ　ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）、長さ３００　ｍｍ、内径８　ｍｍ、粒径６μｍ
移動相：０．０５Ｍ　硫酸水溶液
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：６５℃
検出器：ＲＩ
・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ　ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ－Ｑｕａｄ　ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ　ネガティブモード。
比較例２
３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸が導入された３－ヒドロキシアジピン酸生産能を有する大腸菌を用いた３－ヒドロキシアジピン酸の生産試験
　実施例２と同様の方法にて、比較例１で作製した大腸菌を用いて３－ヒドロキシアジピン酸の生産試験を行った結果を表７に示す。
　表７の結果から、実施例２で用いた組換え株は、本比較例２で用いた組換え株よりも３－ヒドロキシアジピン酸収率が向上することが明らかとなった。すなわち、配列番号１、２，３，４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸を微生物に導入することによって、３－ヒドロキシアジピン酸の生産性が著しく向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
参考例４
３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する反応（反応Ｃ）を触媒する酵素を発現するためのプラスミドの作製
　大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＣＤＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をＫｐｎＩで切断し、ｐＣＤＦ－１ｂ／ＫｐｎＩを得た。反応Ｃを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてエノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子ｐａａＦ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　１０４６９３２、配列番号４７）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号４８、４９）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＣＤＦ－１ｂ／ＫｐｎＩ　を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認した。なお当該プラスミドに組み込まれたエノイル－ＣｏＡヒドラターゼの発現はＩＰＴＧで誘導され、Ｎ末端にヒスチジンタグを含む１１個のアミノ酸が付加されている。得られたプラスミドを「ｐＣＤＦ－１ｂ：：ＥＨａ」とした。
実施例３
配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸が導入されたα－ヒドロムコン酸生産能を有する大腸菌の作製
　参考例４で作製したプラスミドｐＣＤＦ－１ｂ：：ＥＨａを、実施例１で作製した大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて３７℃で培養した。得られた組み換え株をＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ／　ｐＣＤＦ－１ｂ：：ＥＨａとした。
　続いて、参考例２で作製したプラスミド「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｍｒ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｎｍ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｌ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｅ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｕｒ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｓｐ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｌｑ１」それぞれを、ＢＬ２１（ＤＥ３）／　ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ／　ｐＣＤＦ－１ｂ：：ＥＨａにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて、３７℃で培養した。「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｍｒ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｍｒ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｎｍ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｌ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｅ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｕｒ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｓｐ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｌｑ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｌｑ１＿ＨＭＡ」とし、本実施例で得られた組換え株を表８に示す。
比較例３
３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸が導入されたα－ヒドロムコン酸生産能を有する大腸菌の作成
　参考例４で作製したプラスミドｐＣＤＦ－１ｂ：：ＥＨａを、参考例２で作製した大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）／　ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて３７℃で培養した。得られた組み換え株をＢＬ２１（ＤＥ３）／　ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ／　ｐＣＤＦ－１ｂ：：ＥＨａとした。
　続いて、参考例３で作製したプラスミド「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｐｐｕ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｅｃｏ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ａｃｉ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｌ２」それぞれを、ＢＬ２１（ＤＥ３）／　ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ／　ｐＣＤＦ－１ｂ：：ＥＨａにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて、３７℃で培養した。
　「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｐｐｕ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｐｐｕ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｅｃｏ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｅｃｏ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ａｃｉ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ａｃｉ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｌ２」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｌ２＿ＨＭＡ」とし、本比較例で得られた組換え株を表８に示す。
実施例４
配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸が導入されたα－ヒドロムコン酸生産能を有する大腸菌を用いたα－ヒドロムコン酸の生産試験
　実施例３で作製した大腸菌を用いてα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬ）５ｍＬに、実施例３で作製した組換え大腸菌株を一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で１８時間振とう培養した。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（コハク酸１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬおよびＩＰＴＧ０．０１ｍＭ）５ｍＬに添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養した。
α－ヒドロムコン酸および炭素源の定量分析
　当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を実施例２と同様の条件でＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて分析した。培養上清中に蓄積したα－ヒドロムコン酸の定量分析を行った結果、および式（３）を用いて算出したα－ヒドロムコン酸の収率を表８に示す。
比較例４
３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸が導入されたα－ヒドロムコン酸生産能を有する大腸菌を用いたα－ヒドロムコン酸の生産試験
　実施例４と同様の方法にて、比較例３で作製した大腸菌を用いてα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った結果を表８に示す。
　表８の結果から、実施例４で用いた組換え株は、本比較例４で用いた組換え株よりもα－ヒドロムコン酸収率が向上することが明らかとなった。すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸を微生物に導入することによって、α－ヒドロムコン酸の生産性が著しく向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
参考例５
配列番号２、３に記載のポリペプチドの発現を増強するためのプラスミドの作製
　配列番号２、３に記載のポリペプチドを構成的に発現するための様々なプラスミドを作製した。
　配列番号２のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ　ＤＳＭ２１４２０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５５に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号５０，５１）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。また、配列番号３のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ　ＮＢＲＣ１０２５９９株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５６に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号５２，５３）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片および参考例１で作製したｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをそれぞれ「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｓｎｍ１」および「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｓｐｌ１」とした。
実施例５
配列番号２、３に記載のポリペプチドの発現を増強するように改変したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物の作製
　宿主微生物として、元来配列番号２のポリペプチドをコードする核酸を有する微生物であるＳｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ　ＤＳＭ２１４２０株、および元来配列番号３のポリペプチドをコードする核酸を有する微生物であるＳｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ　ＮＢＲＣ１０２５９９株を用いて、それぞれが有するポリペプチドの発現を増大させた組換え株を作製した。参考例５で作製したｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｓｎｍ１あるいはｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｓｐｌ１を、上述のＳｅｒｒａｔｉａ属微生物株それぞれにエレクトロポレーション（ＮＭ　Ｃａｌｖｉｎ，　ＰＣ　Ｈａｎａｗａｌｔ．　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，　１７０　（１９８８），　ｐｐ．　２７９６-２８０１）で導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて、３０℃で培養した。本実施例で得られた組換え株をＳｎ／Ｓｎｍ１、Ｓｐ／Ｓｐｌ１とした。
実施例６
配列番号２、３に記載のポリペプチドの発現を増強するように改変したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸生産試験
　配列番号２、３に記載のポリペプチドの発現を増強した効果を評価するために、実施例５で作製した組換えＳｅｒｒａｔｉａ属微生物株を用いて、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。
　ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ）５ｍＬに、実施例５で作製した組換え株を一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で１８時間振とう培養した。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（コハク酸１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ）５ｍＬに添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養した。
３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸、および炭素源の定量分析
　当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を実施例２と同様の条件でＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて分析した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の定量分析を行った結果およびそれぞれの収率を表９に示す。
比較例５
配列番号２、３に記載のポリペプチドの発現を増強していないＳｅｒｒａｔｉａ属微生物の作製
　実施例５と同様の方法にて、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ｇａｐをＳｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ　ＤＳＭ２１４２０株およびＳｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ　ＮＢＲＣ１０２５９９株それぞれに導入した。得られた組換え株をＳｎ／ＮＣ、およびＳｐ／ＮＣとした。
比較例６
配列番号２、３に記載のポリペプチドの発現を増強していないＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
　比較例５で作製したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を用いて実施例６と同様の方法にて３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験を行った。結果を表９に示す。
　表９の結果から、実施例６で用いた配列番号２、３に記載のポリペプチドの発現を増大させた組換え株は、本比較例６で用いた、配列番号２、３に記載のポリペプチドの発現を増大させていない組換え株よりも３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸収率が向上することが明らかとなった。すなわち、配列番号２，３に記載のポリペプチドの発現を増強することによって、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産性が著しく向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
比較例７
配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドが、３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する活性を有していることを確認するためのコントロール試験
　反応Ａと反応Ｅ、反応Ｆを触媒する酵素を発現させた組換え大腸菌を作製した。実施例１と同様の方法にて、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１をＢＬ２１（ＤＥ３）／　ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴに導入した。得られた組換え株をＥｃ／ＮＣ＿３ＨＡとした。
　反応Ａ、反応Ｅ、反応Ｆ、反応Ｃを触媒する酵素を発現させた組換え大腸菌を作製した。実施例３と同様の方法にて、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１をＢＬ２１（ＤＥ３）／　ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ／　ｐＣＤＦ－１ｂ：：ＥＨａに導入した。得られた組換え株をＥｃ／ＮＣ＿ＨＭＡとした。
　Ｅｃ／ＮＣ＿３ＨＡ、Ｅｃ／ＮＣ＿ＨＭＡ、実施例１で作製した、組換え大腸菌７株（Ｅｃ／Ｓｍｒ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｌｑ１＿３ＨＡ）、および実施例３で作製した組換え大腸菌７株（Ｅｃ／Ｓｍｒ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｌｑ１＿ＨＭＡ）を用いて、実施例２および実施例４と同様の条件で培養を行い、培養液中の３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸を測定した。結果を表１０に示す。
表１０の結果から、Ｅｃ／ＮＣ＿３ＨＡおよびＥｃ／ＮＣ＿ＨＭＡでは、３－ヒドロキシアジピン酸またはα－ヒドロムコン酸が検出されず、実施例２および４で生産された３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸は、配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドを発現させたことにより生産可能になったことが確認できた。また、Ｅｃ／Ｓｍｒ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿３ＨＡ、およびＥｃ／Ｓｌｑ１＿３ＨＡではα－ヒドロムコン酸が検出されず、反応Ｃを触媒する酵素を発現させたＥｃ／Ｓｍｒ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿ＨＭＡ、およびＥｃ／Ｓｌｑ１＿ＨＭＡではα―ヒドロムコン酸の生産が確認された。このことから、Ｅｃ／Ｓｍｒ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿３ＨＡ、およびＥｃ／Ｓｌｑ１＿３ＨＡが生産した３－ヒドロキシアジピン酸、およびＥｃ／Ｓｍｒ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿ＨＭＡ、およびＥｃ／Ｓｌｑ１＿ＨＭＡが生産したα－ヒドロムコン酸は、共に３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを経由して生成されたことがわかった。従って、配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドは３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する活性を有していることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
参考例６
アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する反応（反応Ａ）を触媒する酵素、及びアジピル－ＣｏＡからアジピン酸を生成する反応（反応Ｇ）を触媒する酵素を発現するプラスミドの作製
　参考例１で作製したｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴをＨｐａＩで切断して得られる６．６ｋｂの断片をｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩとした。反応Ｇを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ　ＡＤＰ１株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子ｄｃａＩおよびｄｃａＪ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：ＣＲ５４３８６１．１、配列番号２２１、２２２）の全長を含む連続した配列をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２２３、２２４）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２とした。
参考例７
２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからアジピル－ＣｏＡを生成する反応（反応Ｄ）を触媒する酵素を発現するためのプラスミドの作製
　大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＭＷ１１９（ニッポンジーン社製）をＳａｃＩで切断し、ｐＭＷ１１９／ＳａｃＩを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２　ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号１７）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２２５、２２６）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＭＷ１１９／ＳａｃＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え大腸菌株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＭＷ１１９：：Ｐｇａｐとした。続いてｐＭＷ１１９：：ＰｇａｐをＳｐｈＩで切断し、ｐＭＷ１１９：：Ｐｇａｐ／ＳｐｈＩを得た。反応Ｄを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ　ＡＤＰ１株由来のｄｃａＡ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＡＬ０９０９４．１、配列番号２２７）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２２８、２２９）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＭＷ１１９：：Ｐｇａｐ／ＳｐｈＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＭＷ１１９：：ＥＲとした。
実施例７
配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸が導入されたアジピン酸生産能を有する大腸菌の作製
　参考例６で作製したプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２を、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にエレクトロポレーション（ＮＭ　Ｃａｌｖｉｎ，　ＰＣ　Ｈａｎａｗａｌｔ．　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，　１７０　（１９８８），　ｐｐ．　２７９６-２８０１）で導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて３７℃で培養した。得られた組み換え株をＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２とした。
　参考例４で作製したプラスミドｐＣＤＦ－１ｂ：：ＥＨａをＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２にエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびストレプトマイシン５０ｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて３７℃で培養した。得られた組み換え株をＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２／ｐＣＤＦ－１ｂ：：ＥＨａとした。
　参考例７で作製したプラスミドｐＭＷ１１９：：ＥＲをＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２／ｐＣＤＦ－１ｂ：：ＥＨａにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬおよびアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて３７℃で培養した。得られた組み換え株をＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２／ｐＣＤＦ－１ｂ：：ＥＨａ／ｐＭＷ１１９：：ＥＲとした。
参考例２で作製した７種類のプラスミドをそれぞれＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２／ｐＣＤＦ－１ｂ：：ＥＨａ／ｐＭＷ１１９：：ＥＲにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて、３７℃で培養した。「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｍｒ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｍｒ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｎｍ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｌ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｅ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｕｒ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｓｐ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｌｑ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｌｑ１＿ＡＤＡ」とし、本実施例で得られた組換え株を表１１に示す。
比較例８
３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸が導入されたアジピン酸生産能を有する大腸菌の作成
　参考例３で作製したプラスミド「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｐｐｕ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｅｃｏ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ａｃｉ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｌ２」それぞれを、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ２／ｐＣＤＦ－１ｂ：：ＥＨａ／ｐＭＷ１１９：：ＥＲにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて、３７℃で培養した。
　「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｐｐｕ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｐｐｕ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｅｃｏ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｅｃｏ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ａｃｉ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ａｃｉ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｌ２」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｌ２＿ＡＤＡ」とし、本比較例で得られた組換え株を表１１に示す。
実施例８
配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸が導入されたアジピン酸生産能を有する大腸菌を用いたアジピン酸の生産試験
　実施例７で作製した大腸菌を用いてアジピン酸の生産試験を行った。ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬ）５ｍＬに、実施例３で作製した組換え大腸菌株を一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で１８時間振とう培養した。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（コハク酸１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬおよびＩＰＴＧ０．０１ｍＭ）５ｍＬに添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養した。
アジピン酸および炭素源の定量分析
　当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を実施例２と同様の条件でＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて分析した。培養上清中に蓄積したアジピン酸の定量分析を行った結果、および式（３）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１１に示す。
比較例９
３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸が導入されたアジピン酸生産能を有する大腸菌を用いたアジピン酸の生産試験
　実施例８と同様の方法にて、比較例８で作製した大腸菌を用いてアジピン酸の生産試験を行った結果を表１１に示す。
　表１１の結果から、実施例８で用いた組換え株は、本比較例９で用いた組換え株よりもアジピン酸収率が向上することが明らかとなった。すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸を微生物に導入することによって、アジピン酸の生産性が著しく向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
実施例９
配列番号２および４に記載のポリペプチドが３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの活性を有していることの確認
　参考例２で作製したプラスミドｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｎｍ１およびｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｅ１を、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて３７℃で培養した。得られた組み換え株をＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｎｍ１およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｅ１とした。
　ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬ）２０ｍＬに、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｎｍ１およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１：：Ｓｐｅ１を一白金耳植菌し、３７℃、１２０ｒｐｍで１７時間回旋培養した。当該培養液１０ｍＬを２Ｌの培地Ｉに添加し、３７℃、１００ｍｉｎ－１で２時間振とう培養した。当該培養液にＩＰＴＧを５００μＭとなるように添加し、１６℃、１００ｍｉｎ－１で１８時間振とう培養した。培養液を６０００ｒｐｍ、４℃で１５分遠心し上清を除去後の細胞ペレットをＨｉｓ－Ｂｉｎｄ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ社製）のＢｉｎｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒで懸濁した。得られた細胞懸濁液を氷冷しながらＤｉｇｉｔａｌ　Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）にて細胞を超音波破砕した。破砕後の溶液を１３０００ｒｐｍ、４℃で３０分遠心し、得られた上清を細胞破砕液とした。
　細胞破砕液３０ｍＬに適量のＨｉｓ－Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ溶液を加え、４℃で１時間インキュベーションした。当該溶液を４０００ｒｐｍ、４℃で５分遠心し、上清を２０ｍＬ除去後のＨｉｓ－Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ溶液をカラムにロードした。１０ｍＬのＢｉｎｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した後、１０ｍＬのＷａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ１（イミダゾール２５ｍＭ）で２回、１０ｍＬのＷａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ２（イミダゾール６０ｍＭ）で２回洗浄した。最後に２ｍＬのＥｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（イミダゾール１ｍＭ）で４回溶出し、フラクションを回収した。
　目的酵素の分子量である５５ｋＤａ付近にバンドが確認できたフラクションを８０００ｒｐｍ、４℃で１５分遠心し、上清を除去後５ｍＬのＳｔｒａｇｅ　Ｂｕｆｆｅｒを添加し、洗浄した。さらに８０００ｒｐｍ、４℃で１５分遠心し、上清を除去後３ｍＬのＳｔｒａｇｅ　Ｂｕｆｆｅｒを添加することを２回繰り返した。得られた溶液を酵素溶液Ｓｎｍ１およびＳｐｅ１とした。
　３－オキソアジピン酸の調製：３－オキソアジピン酸はＷＯ２０１７／０９９２０９の参考例１に記載された方法により調製した。
　３－オキソアジピル－ＣｏＡ溶液の調製：大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＲＳＦ－１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をＫｐｎＩで切断し、ｐＲＳＦ－１ｂ／ＫｐｎＩを得た。反応Ｅを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＣｏＡトランスフェラーゼｐｃａＩおよびｐｃａＪ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３および１０４６６１２、配列番号２３および２４）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２３０、２３１）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＲＳＦ－１ｂ／ＫｐｎＩ　を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認した。得られたプラスミドを「ｐＲＳＦ－１ｂ：：ＣＴ」とした。
　ｐＲＳＦ－１ｂ：：ＣＴを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得た。当該溶液を用いて以下組成の３－オキソアジピル－ＣｏＡ調製用酵素反応溶液を調製し、２５℃で３分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ　１０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液を３－オキソアジピル－ＣｏＡ溶液とした。
３－オキソアジピル－ＣｏＡ調製用酵素反応溶液：
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．５ｍＭ　ｓｕｃｃｉｎｉｙ－ＣｏＡ
５ｍＭ　３－ｏｘｏａｄｉｐｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ
２μＭ　ＣｏＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
　３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性の確認：３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性は、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡの生成量を測定することで確認した。酵素溶液Ｓｎｍ１およびＳｐｅ１を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、２５℃で1時間反応後の酵素反応溶液をＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を実施例２と同様の条件でＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて分析した。なお３－オキソアジピル－ＣｏＡ濃度はＫａｓｃｈａｂｅｋらの方法（Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　２００２　Ｊａｎ；　１８４（１）：　２０７-２１５）を用いて定量し、酵素反応溶液中の濃度が１５μＭとなるよう調整した。コントロールとして酵素溶液の代わりにＴｒｉｓ－ＨＣｌを添加して同様に反応させた結果も併せて表１２に示す。
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
１５０μＬ／ｍＬ　３－ｏｘｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ
０．５ｍＭ　ＮＡＤＨ
１ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
１０μＭ　３－ｏｘｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ。
　表１２の結果から、酵素溶液Ｓｎｍ１およびＳｐｅ１を用いた反応では３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡの生成が確認できた。一方コントロールでは３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡは検出されなかった。従って、酵素溶液Ｓｎｍ１およびＳｐｅ１は３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの活性を有していることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019

Claims (11)

  1. 　以下（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物：
    　（ａ）配列番号１～６及び２１３のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    　（ｂ）配列番号１～６及び２１３のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド、
    　（ｃ）配列番号１～６及び２１３のいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド。
  2. 　前記（ｂ）及び（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドが、配列番号２１２のアミノ酸配列からなる領域を含む、請求項１記載の遺伝子改変微生物。
  3. 　前記配列番号２１２のアミノ酸配列において、Ｎ末端側から１３番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンまたはロイシンであり、Ｎ末端側から１５番目のアミの酸残基がロイシンまたはグルタミンであり、Ｎ末端側から１６番目のアミノ酸残基がリシンまたはアスパラギンであり、Ｎ末端側から１７番目のアミノ酸残基がグリシンまたはセリンであり、Ｎ末端側から１９番目のアミノ酸残基がプロリンまたはアルギニンであり、Ｎ末端側から２１番目のアミノ酸残基が好ましくはロイシン、メチオニンまたはバリンである、請求項２記載の遺伝子改変微生物。
  4. 　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属からなる群から選ばれる微生物の遺伝子改変体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
  5. 　アセチル－ＣｏＡ及びスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡ及び補酵素Ａを生成する能力及び３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する能力を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
  6. 　アセチル－ＣｏＡ及びスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡ及び補酵素Ａを生成する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する能力及び２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成する能力を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
  7. 　アセチル－ＣｏＡ及びスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡ及び補酵素Ａを生成する能力、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する能力、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからアジピル－ＣｏＡを生成する能力及びアジピル－ＣｏＡからアジピン酸を生成する能力を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
  8. 　請求項１～５のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法。
  9. 　請求項１～４及び６のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、α－ヒドロムコン酸の製造方法。
  10. 　請求項１～４及び７のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、アジピン酸の製造方法。
  11. 　Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５－アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子にコードされるポリペプチドをコードする核酸を導入または当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸及びアジピン酸からなる群から選ばれる１つ以上の物質の製造方法。
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