CN117441008A

CN117441008A - 重组微生物和c6化合物的制造方法

Info

Publication number: CN117441008A
Application number: CN202280025115.9A
Authority: CN
Inventors: 山田祐太朗; 牛木章友; 宫武令; 井阪光二
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 2021-03-30
Filing date: 2022-03-29
Publication date: 2024-01-23

Abstract

本发明提供具有2,3‑脱氢己二酰‑CoA还原酶活性的重组微生物、以及C6化合物的制造方法，并且提供能够生产己二酸或己二酸衍生物的重组微生物、以及己二酸或己二酸衍生物的制造方法。一种重组微生物，其包含编码具有将2,3‑脱氢己二酰‑CoA还原而转换成己二酰CoA的酶活性的蛋白质的外源基因、以及编码3‑羟基己二酰CoA脱水酶的外源基因中的至少一者。

Description

重组微生物和C6化合物的制造方法

技术领域

本发明涉及重组微生物以及C6化合物的制造方法。本发明还涉及重组微生物以及己二酸或其衍生物的制造方法。

背景技术

己二酸、六亚甲基二胺、1,6-己二醇、6-氨基己酸、6-氨基-1-己醇和6-羟基己酸之类的C6化合物被用于聚酰胺、聚氨酯原料等，在化学产业中被定位为重要的化合物。例如，己二酸(CAS No.124-04-9)是作为以尼龙-66等为代表的聚酰胺原料、氨基甲酸酯、以及增塑剂原料使用的单体化合物。己二酸目前的常见制造方法为化学合成法，例如有将单独的环己醇、或者环己醇与环己酮的混合物(K/A油)利用硝酸氧化的方法。

近年来，化石燃料面临着枯竭的危险，并且被认为是地球温室化的原因之一，因此在化学品制造工艺中，希望由化石燃料来源的原料过渡到可再生的原料、例如过渡到生物物质来源的原料，提出了基于通过基因重组修饰了代谢的微生物的发酵生产的制造方法。

例如已报告了用于己二酸、6-氨基己酸或己内酰胺生物合成的微生物(专利文献1)。作为一例，公开了对包含下述酶的微生物进行培养的方法：将琥珀酰-CoA和乙酰-CoA转换成3-氧代己二酰-CoA的“琥珀酰-CoA:乙酰-CoA酰基转移酶”；将3-氧代己二酰-CoA转换成3-羟基己二酰-CoA的“3-羟基酰基-CoA脱氢酶”；将3-羟基己二酰-CoA转换成5-羧基-2-戊烯酰基-CoA的“3-羟基己二酰-CoA脱水酶”；将5-羧基-2-戊烯酰基-CoA转换成己二酰-CoA的“5-羧基-2-戊烯酰基-CoA还原酶”；以及将己二酰-CoA转换成己二酸酯的“磷酸己二酰转移酶”和“己二酸激酶”，作为各酶的例示，仅止步于给出有可能促进反应的基因，而针对这些酶的基因，对于其能够由生物物质来源的碳源有效地生产C6化合物的情况并未得到证实。

另外还提出了包括以酶方式将2,3-脱氢己二酸硫酯转换成己二酸硫酯的工序的己二酸硫酯的制备方法(专利文献2)，但限于热带念珠菌(Candida tropicalis)、细小裸藻(Euglena gracilis)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)和解脂亚罗酵母(Yarrowialipolytica)之类的生物种来源的烯酰CoA还原酶等一部分显示出酶活性，并未示出证实了C6化合物的发酵生产的示例。

此外还报告了，使用使大肠杆菌来源的酶PaaJ、PaaH和PaaF、以及贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)来源的酶DcaA和TesB共表达的基因重组大肠杆菌的培养，能够以葡萄糖作为碳源生产36mg/L的己二酸(非专利文献1)。

已证实了来源于多种生物种的反式烯酰CoA还原酶的酶活性，进而还提出了通过对表达出来源于热带念珠菌(Candida tropicalis)或Drosophila melanogaster的反式烯酰CoA还原酶或者这些酶的突变体的大肠杆菌进行培养而生产出己二酸和6-氨基己酸的示例(专利文献3)。

但是，基于上述现有技术的发酵生产的示例未必满足充分的生产率来贡献于工业利用，要求改善微生物的生产能力。

另外，关于己二酸，作为使用生物物质来源的原料的制造方法，还提出了使用基因重组微生物将生物物质来源的碳源转换成顺,顺-粘康酸，之后将所得到的顺,顺-粘康酸氢化来生产己二酸的方法(专利文献4)。另外还提出了使用基因重组体由α-酮戊二酸生产己二酸的方法(专利文献5)。

此外还提出了由生物物质来源的原料直接进行的己二酸的发酵生产方法(专利文献6)。该方法中，作为能够生产己二酸的非天然存在的微生物，举出了包含下述酶的非天然存在的微生物：将琥珀酰-CoA和乙酰-CoA转换成3-氧代己二酰-CoA的“琥珀酰-CoA:乙酰-CoA酰基转移酶”；将3-氧代己二酰-CoA转换成3-羟基己二酰-CoA的“3-羟基酰基-CoA脱氢酶”；将3-羟基己二酰-CoA转换成5-羧基-2-戊烯酰基-CoA的“3-羟基己二酰-CoA脱水酶”；将5-羧基-2-戊烯酰基-CoA转换成己二酰-CoA的“5-羧基-2-戊烯酰基-CoA还原酶”；以及将己二酰-CoA转换成己二酸酯的“磷酸己二酰转移酶”/“己二酸激酶”，但是关于各酶，仅止步于给出编码有可能促进反应的酶的基因，关于通过使用这些基因能够由生物物质来源的碳原料收率良好地生产己二酸的情况并未得到证实。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第5951990号说明书

专利文献2：日本特表2011-512868号公报

专利文献3：国际公开第2020/219859号

专利文献4：国际公开第1995/007996号

专利文献5：国际公开第2010/104391号

专利文献6：日本特开2011-515111号公报

非专利文献

非专利文献1：Kallscheuer,Nicolai,et al.“Improved production of adipatewith Escherichia coli by reversal ofβ-oxidation.”Applied microbiology andbiotechnology101.6(2017):2371-2382.

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供具有2,3-脱氢己二酰-CoA还原酶活性的重组微生物、以及C6化合物的有效的制造方法。

本发明进一步的目的在于提供能够生产己二酸或己二酸衍生物的重组微生物、以及己二酸或己二酸衍生物的制造方法。

用于解决课题的手段

本发明人为了解决上述现有技术的课题进行了深入研究，结果发现，通过在宿主微生物中表达外源性的特定的酶，能够取得2,3-脱氢己二酰-CoA还原酶活性良好的重组微生物，进而通过对该重组微生物进行培养，能够有效地生产C6化合物，从而实现了本发明。

即，本发明提供下述方案。

[1]一种重组微生物，其包含外源基因，该外源基因编码具有将2,3-脱氢己二酰-CoA还原而转换成己二酰CoA的酶活性的蛋白质，其中，

上述外源基因为：

(i)编码由与序列编号8、9、10、11、12、13、14、15或16所示的氨基酸序列具有80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA；

(ii)编码由在序列编号8、9、10、11、12、13、14、15或16所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而成的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA；

(iii)由与序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列具有80％以上的序列一致性的多核苷酸序列构成的DNA；

(iv)编码由在利用序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而成的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA；

(v)与由与序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列构成的DNA在严谨条件下杂交的DNA；或者

(vi)由序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列的简并异构体构成的DNA；

[2]如[1]中所述的重组微生物，其中，上述外源基因为：

(xi)编码由序列编号8、9、10、11、12、13、14、15或16所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA；或者

(xiii)由序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列构成的DNA；

[3]如[1]或[2]中所述的重组微生物，其中，上述外源基因来源于选自耳念珠菌(Candida auris)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、喜热梭孢壳(Thermothelomyces thermophilus)、太瑞斯梭孢壳霉(Thermothielavioides terrestris)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、丝状真菌柄孢霉(Podospora anserina)、淡紫拟青霉菌(Purpureocillium lilacinum)和圆核腔菌(Pyrenophora teres)中的至少一者；

[4]如[1]～[3]中任一项所述的重组微生物，其中，

上述重组微生物具有C6化合物的生产路径，

上述C6化合物为选自由己二酸、六亚甲基二胺、1,6-己二醇、6-氨基己酸、6-氨基-1-己醇和6-羟基己酸组成的组中的至少一者；

[5]如[1]～[4]中任一项所述的重组微生物，其中，上述重组微生物属于埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、节杆菌(Arthrobacter)属、短杆菌(Brevibacterium)属、梭菌(Clostridium)属、发酵单胞菌(Zymomonas)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、伯克霍尔德菌(Burkholderia)属、链霉菌(Streptomyces)属、红球菌(Rhodococcus)属、集胞藻(Synechocystis)属、嗜碱盐芽孢杆菌(Alkalihalobacillus)属、酵母菌(Saccharomyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、亚罗酵母(Yarrowia)属、念珠菌(Candida)属、毕赤酵母(Pichia)属、或曲霉(Aspergillus)属；

[6]如[1]～[5]中任一项所述的重组微生物，其中，上述重组微生物为大肠杆菌(Escherichia coli)；

[7]如[1]～[6]中任一项所述的重组微生物，其进一步包含选自由

·编码3-氧代己二酰CoA硫解酶的基因、

·编码3-羟基己二酰CoA脱氢酶的基因、

·编码3-羟基己二酰CoA脱水酶的基因、

·编码羧酸还原酶的基因、

·编码醇脱氢酶的基因、以及

·编码转氨酶(氨基转移酶)的基因

组成的组中的至少一者；

[8]一种C6化合物的制造方法，其包括对[1]～[7]中任一项所述的重组微生物进行培养的培养工序，其中，上述C6化合物为选自由己二酸、六亚甲基二胺、1,6-己二醇、6-氨基己酸、6-氨基-1-己醇和6-羟基己酸组成的组中的至少一者；

[9]一种重组蛋白，其中，

(a)具有将2,3-脱氢己二酰-CoA还原而转换成己二酰CoA的酶活性；

(b)为下述任一者：

(i)由与序列编号8、9、10、11、12、13、14、15或16所示的氨基酸序列具有80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成；

(ii)由在序列编号8、9、10、11、12、13、14、15或16所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而成的氨基酸序列构成；

(iii)利用由与序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列具有80％以上的序列一致性的多核苷酸序列构成的DNA进行编码；

(iv)由在利用序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而成的氨基酸序列构成；

(v)利用与由与序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列构成的DNA在严谨条件下杂交的DNA进行编码；以及

(vi)利用由序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列的简并异构体构成的DNA进行编码；

[10]一种重组蛋白，其中，

(xi)由序列编号8、9、10、11、12、13、14、15或16所示的氨基酸序列构成；或者

(xiii)利用由序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列构成的DNA进行编码；

[11]一种C6化合物的制造方法，其包括使用[9]或[10]中所述的重组蛋白的步骤。

此外，本发明人为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果发现，通过对于表达新近由自然界分离出的微生物伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株(保藏编号：NITE BP-03334)所具有的规定的酶的基因重组微生物进行培养，能够有效地生产己二酸类，从而完成了本发明。

即，本发明进一步提供下述方案：

[12]一种重组微生物，其包含编码3-羟基己二酰CoA脱水酶的外源基因和编码2,3-脱氢己二酰CoA还原酶的外源基因中的至少一者；

[13]如[12]中所述的重组微生物，其中，上述3-羟基己二酰CoA脱水酶和2,3-脱氢己二酰CoA还原酶中的至少一者来源于伯克霍尔德菌属(Burkholderiasp.)LEBP-3株(保藏编号：NITE BP-03334)；

[14]如[12]或[13]中所述的重组微生物，其中，

上述3-羟基己二酰CoA脱水酶被与下述PCR扩增物的序列一致性为80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的DNA所编码，

该DNA具有626～940bp，

该PCR扩增物是以伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株的染色体DNA作为模板，使用

(1a)由序列编号168所示的碱基序列构成的核苷酸以及由序列编号169所示的碱基序列构成的核苷酸；或者

(1b)包含序列编号168所示的碱基序列的核苷酸以及包含序列编号169所示的碱基序列的核苷酸

作为引物得到的；

[15]如[12]～[14]中任一项所述的重组微生物，其中，

上述2,3-脱氢己二酰CoA还原酶被与下述PCR扩增物的序列一致性为80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的DNA所编码，

该DNA具有924～1386bp，

(2a)由序列编号170所示的碱基序列构成的核苷酸以及由序列编号171所示的碱基序列构成的核苷酸；或者

(2b)包含序列编号170所示的碱基序列的核苷酸以及包含序列编号171所示的碱基序列的核苷酸

作为引物得到的；

[16]如[12]或[13]中所述的重组微生物，其中，

上述3-羟基己二酰CoA脱水酶被作为下述PCR扩增物的DNA所编码，

该DNA具有783或784bp，

作为引物得到的；

[17]如[12]～[14]中任一项所述的重组微生物，其中，

上述2,3-脱氢己二酰CoA还原酶被作为下述PCR扩增物的DNA所编码，

该DNA具有1155或1156bp，

作为引物得到的；

[18]如[12]～[17]中任一项所述的重组微生物，其中，上述重组微生物属于选自由埃希氏菌属、棒状杆菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、伯克霍尔德菌属、假单胞菌属、梭菌属、酵母菌属、裂殖酵母属、亚罗酵母属、念珠菌属、毕赤酵母属和曲霉属组成的组中的属；

[19]如[12]～[18]中任一项所述的重组微生物，其具有己二酸生产路径；

[20]如[12]～[19]中任一项所述的重组微生物，其具有六亚甲基二胺生产路径；

[21]如[12]～[19]中任一项所述的重组微生物，其具有1,6-己二醇生产路径；

[22]如[12]～[19]中任一项所述的重组微生物，其具有6-氨基-1-己醇生产路径；

[23]一种目标化合物的制造方法，其包括对[12]～[18]中任一项所述的重组微生物进行培养的培养工序，其中，

上述目标化合物选自由己二酸、己二酸衍生物、六亚甲基二胺、1,6-己二醇和6-氨基-1-己醇组成的组，

上述己二酸衍生物选自由氧代己二酸、乙酰丙酸、3-羟基己二酸和2,3-脱氢己二酸组成的组；

[24]一种己二酸的制造方法，其包括对[19]中所述的重组微生物进行培养的培养工序；

[25]一种六亚甲基二胺的制造方法，其包括对[20]中所述的重组微生物进行培养的培养工序；

[26]一种1,6-己二醇的制造方法，其包括对[21]中所述的重组微生物进行培养的培养工序；

[27]一种6-氨基-1-己醇的制造方法，其包括对[22]中所述的重组微生物进行培养的培养工序；

[28]一种重组多肽，其是下述(A-1)、(A-2)或(A-3)的重组多肽：

(A-1)被与下述PCR扩增物的序列一致性为80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的DNA所编码的重组多肽，

具有3-羟基己二酰CoA脱水酶活性，

上述DNA具有626～940bp，

(a1)由序列编号168所示的碱基序列构成的核苷酸以及由序列编号169所示的碱基序列构成的核苷酸；或者

(a2)包含序列编号168所示的碱基序列的核苷酸以及包含序列编号169所示的碱基序列的核苷酸

作为引物得到的；

(A-2)由在利用作为下述PCR扩增物的DNA所编码的多肽的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而成的氨基酸序列构成的重组多肽，

具有3-羟基己二酰CoA脱水酶活性，

上述DNA具有626～940bp，

作为引物得到的；

(A-3)被由下述PCR扩增物的简并异构体构成的DNA所编码的重组多肽，

具有3-羟基己二酰CoA脱水酶活性，

上述DNA具有626～940bp，

作为引物得到的；

[29]一种重组多肽，其是下述(B-1)、(B-2)或(B-3)的重组多肽：

(B-1)被与下述PCR扩增物的序列一致性为80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的DNA所编码的重组多肽，

具有2,3-脱氢己二酰CoA还原酶活性，

上述DNA具有924～1386bp，

(b1)由序列编号170所示的碱基序列构成的核苷酸以及由序列编号171所示的碱基序列构成的核苷酸；或者

(b2)包含序列编号170所示的碱基序列的核苷酸以及包含序列编号171所示的碱基序列的核苷酸

作为引物得到的；

(B-2)由在利用作为下述PCR扩增物的DNA所编码的多肽的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而成的氨基酸序列构成的重组多肽，

具有2,3-脱氢己二酰CoA还原酶活性，

上述DNA具有924～1386bp，

作为引物得到的；

(B-3)被由下述PCR扩增物的简并异构体构成的DNA所编码的重组多肽，

具有2,3-脱氢己二酰CoA还原酶活性，

上述DNA具有924～1386bp，

作为引物得到的。

发明的效果

根据本发明，可提供具有2,3-脱氢己二酰-CoA还原酶活性的重组微生物、以及C6化合物的制造方法。

另外，根据本发明，可提供能够生产己二酸或己二酸衍生物的重组微生物、以及己二酸或己二酸衍生物的制造方法。

附图说明

图1是示出由乙酰-CoA和琥珀酰-CoA合成C6化合物的生物合成路径的实例的图。

图2是示出各酶的氨基酸序列以及引物的碱基序列的图。

图3是示出各酶的氨基酸序列的图。

图4是示出各酶的氨基酸序列的图。

图5是示出各酶的氨基酸序列的图。

图6是示出编码各酶的碱基序列、以及引物的碱基序列的图。

图7是示出编码各酶的碱基序列、以及引物的碱基序列的图。

图8是示出编码各酶的碱基序列、以及引物的碱基序列的图。

图9是示出编码各酶的碱基序列的图。

图10是示出编码各酶的碱基序列的图。

图11是示出各引物的碱基序列的图。

图12是示出编码各酶的碱基序列、以及各引物的碱基序列的图。

图13是示出各引物的碱基序列的图。

图14是示出编码各酶的碱基序列、以及各引物的碱基序列的图。

图15是示出各酶的氨基酸序列、编码各酶的碱基序列、以及各引物的碱基序列的图。

图16示出本发明的重组微生物所具有的己二酸、己二酸衍生物、六亚甲基二胺、1,6-己二醇和6-氨基-1-己醇生产路径的实例。

图17示出PCR中的扩增对象的基因和所使用的引物。

图18示出各酶的氨基酸序列。

图19A示出编码各酶的碱基序列。

图19B示出编码各酶的碱基序列。

图20A示出PCR中的扩增对象和所使用的引物。

图20B示出PCR中的扩增对象和所使用的引物。

图21示出酶的氨基酸序列。

图22A示出酶的氨基酸序列。

图22B示出酶的氨基酸序列。

图22C示出酶的氨基酸序列。

图22D示出酶的氨基酸序列。

图22E示出酶的氨基酸序列。

图23A示出酶的氨基酸序列。

图23B示出酶的氨基酸序列。

图23C示出酶的氨基酸序列。

图23D示出酶的氨基酸序列。

图24A示出酶的氨基酸序列。

图24B示出酶的氨基酸序列。

图24C示出酶的氨基酸序列。

图24D示出酶的氨基酸序列。

图24E示出酶的氨基酸序列。

图25示出酶的氨基酸序列。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行详细说明。需要说明的是，本发明并不限定于以下的实施方式，可以在其要点的范围内进行各种变形来实施。另外，只要没有特别载明，本说明书中所述的DNA的取得、载体的制备和转化等基因操作可通过Molecular Cloning 4thEdition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012)、Current Protocols inMolecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)以及基因工程实验笔记(遺伝子工学実験ノート)(羊土社田村隆明)等公知的文献中记载的方法来进行。本说明书中，只要不特别声明，核苷酸序列以从5’方向朝向3’方向来记载。本说明书中，“多肽”和“蛋白质”的术语能够互换使用。

本说明书中，使用“～”表示的数值范围表示包含“～”的前后记载的数值分别作为最小值和最大值的范围。本说明书中阶段性地记载的数值范围中，某一阶段的数值范围的上限值或下限值可以与其他阶段的数值范围的上限值或下限值任意地组合。

本说明书中，“内源”或“内源性”这一术语用于表示下述含义：未进行所提及的基于基因重组的修饰的宿主微生物无论是否将所提及的基因或由其编码的蛋白质(代表性地为酶)以可在该宿主细胞内进行显性的生物化学反应的程度进行了功能性表达，均包含在宿主微生物中。

本说明书中，“外源”或“外源性”这一术语用于表示下述含义：在基因重组前的宿主微生物不具有要由本发明导入的基因的情况下；在实质上不表达基于该基因的酶的情况下；以及在该酶的氨基酸序列由该基因或者不同的基因编码、但在基因重组后不表达相匹配的内源性酶活性的情况下，向宿主中导入基于本发明的基因或核酸序列。

<1>发明A：重组微生物和C6化合物的制造方法

本发明中的重组微生物包含编码具有将2,3-脱氢己二酰-CoA还原而转换成己二酰CoA的酶活性的蛋白质的外源基因。将2,3-脱氢己二酰-CoA还原而转换成己二酰CoA的反应如图1的步骤D所示。“具有将2,3-脱氢己二酰-CoA还原而转换成己二酰CoA的酶活性的蛋白质”也被称为“2,3-脱氢己二酰CoA还原酶”。另外，将2,3-脱氢己二酰-CoA还原而转换成己二酰CoA的酶活性也被称为“2,3-脱氢己二酰CoA还原酶活性”或“2,3-脱氢己二酰CoA还原酶酶活性”，这些用语可互换使用。

本发明中的重组微生物中所包含的外源基因选自下述基因：

(i)编码由与序列编号8、9、10、11、12、13、14、15或16所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列一致性的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA；

(ii)编码由在序列编号8、9、10、11、12、13、14、15或16所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个、1～7个、1～5个或1～3个氨基酸而成的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA；

(iii)由与序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列具有80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列一致性的多核苷酸序列构成的DNA；

(iv)编码由在利用序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个、1～7个、1～5个或1～3个氨基酸而成的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA；

(v)与由与序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列构成的DNA在严谨条件下杂交的DNA；

(vi)由序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列的简并异构体构成的DNA。

本发明中的重组微生物中所包含的外源基因优选选自下述基因：

本发明中重组微生物中所包含的外源基因更优选为下述基因：

(xiii)由序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列构成的DNA。

上述外源基因例如来源于选自耳念珠菌(Candida auris)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、喜热梭孢壳(Thermothelomyces thermophilus)、太瑞斯梭孢壳霉(Thermothielavioidesterrestris)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、丝状真菌柄孢霉(Podosporaanserina)、淡紫拟青霉菌(Purpureocillium lilacinum)和圆核腔菌(Pyrenophorateres)中的至少一者。

通过包含上述外源基因，重组微生物具有良好的2,3-脱氢己二酰-CoA还原酶活性。通过使用具有该酶活性的重组微生物，能够制造出目标化合物。作为目标化合物，例如可以举出C6化合物。

本说明书中，“C6化合物”中包括：

·己二酸(CAS No.124-04-9)、

·六亚甲基二胺(CAS No.124-09-4)、

·1,6-己二醇(CAS No.629-11-8)、

·6-氨基己酸(CAS No.60-32-2)、

·6-氨基-1-己醇(CAS No.4048-33-3)、以及

·6-羟基己酸(CAS No.1191-25-9)，

“C6化合物”是指选自由这些化合物组成的组中的1种或2种以上的化合物。

如本领域技术人员所理解，本说明书中的“C6化合物”可采取包括任意的盐形态的中性或电离形态，并且该形态取决于pH。

如上所述，本发明的微生物是导入有外源性酶基因的基因重组微生物。“基因重组微生物”也被简称为“重组微生物”。

就本发明而言，导入目标外源基因的宿主微生物没有特别限定，可以为原核生物和真核生物中的任一者。可以从已经分离保存的微生物、新近从自然界分离出的微生物、以及进行了基因修饰的微生物中任意地选择。宿主微生物例如属于埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、节杆菌(Arthrobacter)属、短杆菌(Brevibacterium)属、梭菌(Clostridium)属、发酵单胞菌(Zymomonas)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、伯克霍尔德菌(Burkholderia)属、链霉菌(Streptomyces)属、红球菌(Rhodococcus)属、集胞藻(Synechocystis)属、嗜碱盐芽孢杆菌(Alkalihalobacillus)属、酵母菌(Saccharomyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、亚罗酵母(Yarrowia)属、念珠菌(Candida)属、毕赤酵母(Pichia)属、或曲霉(Aspergillus)属。宿主微生物优选属于埃希氏菌(Escherichia)属，更优选为大肠杆菌(Escherichia coli)。

因此，在上述宿主微生物在导入了外源基因的本发明中的重组微生物例如属于埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、节杆菌(Arthrobacter)属、短杆菌(Brevibacterium)属、梭菌(Clostridium)属、发酵单胞菌(Zymomonas)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、伯克霍尔德菌(Burkholderia)属、链霉菌(Streptomyces)属、红球菌(Rhodococcus)属、集胞藻(Synechocystis)属、嗜碱盐芽孢杆菌(Alkalihalobacillus)属、酵母菌(Saccharomyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、亚罗酵母(Yarrowia)属、念珠菌(Candida)属、毕赤酵母(Pichia)属、或曲霉(Aspergillus)属。本发明中的重组微生物优选属于埃希氏菌(Escherichia)属，更优选为大肠杆菌(Escherichia coli)。

本说明书中，关于某一化合物“具有生产路径”，是指本发明中的基因重组微生物可表达出足以进行该化合物的生产路径的各反应阶段的量的酶，能够生物合成该化合物。本发明的重组微生物可以使用本来具有该化合物的生产能力的宿主微生物，也可以对本来不具有该化合物的生产能力的宿主微生物进行修饰以使其具有该化合物的生产能力。

本说明书中，“来源于”是指所提及的特定生物种内源性地具有基因或由其编码的蛋白质(代表性地为酶)。

本发明的基因重组微生物包含编码具有将2,3-脱氢己二酰-CoA还原而转换成己二酰CoA的酶活性(即2,3-脱氢己二酰CoA还原酶活性)的蛋白质的外源基因，由此表达出足以进行反应的量的酶(即2,3-脱氢己二酰CoA还原酶)。该酶参与图1的步骤D的反应。

另外，通过进一步表达催化C6化合物生产路径的反应阶段的酶，可构成具有C6化合物生产路径的基因重组微生物。

在一个方式中，本发明中的重组微生物进一步包含选自由下述基因组成的组中的至少一者：

·编码3-氧代己二酰CoA硫解酶基因、

·编码3-羟基己二酰CoA脱氢酶的基因、

·编码3-羟基己二酰CoA脱水酶的基因、

·编码磷酸己二酰转移酶的基因与编码己二酸激酶的基因的组合、

·编码己二酰-CoA水解酶的基因、

·编码己二酸CoA转移酶的基因、

·编码脱氢酶的基因、

·编码羧酸还原酶的基因、

·编码转氨酶(氨基转移酶)的基因、

·编码醇脱氢酶的基因、以及

·编码CoA转移酶的基因、

·编码酸硫醇连接酶的基因。

·3-氧代己二酰CoA硫解酶催化图1的步骤A的反应、

·3-羟基己二酰CoA脱氢酶催化图1的步骤B的反应、

·3-羟基己二酰CoA脱水酶催化图1的步骤C的反应、

·磷酸己二酰转移酶己二酸激酶的组合、己二酰-CoA水解酶、己二酸CoA转移酶催化图1的步骤E的反应、

·脱氢酶催化图1的步骤F、U和V中的至少一者的反应、

·羧酸还原酶催化图1的步骤G、I、K和N中的至少一者的反应、

·转氨酶(氨基转移酶)催化图1的步骤J、M、P和R中的至少一者的反应、

·醇脱氢酶催化图1的步骤H、L、O和Q中的至少一者的反应、

·CoA转移酶或酸硫醇连接酶催化步骤S和T的至少一者的反应。

在优选的一个方式中，本发明中的重组微生物进一步包含选自由下述基因组成的组中的至少一者：

·编码3-氧代己二酰CoA硫解酶的基因、

·编码3-羟基己二酰CoA脱氢酶的基因、

·编码3-羟基己二酰CoA脱水酶的基因、

·编码羧酸还原酶的基因、

·编码醇脱氢酶的基因、以及

·编码转氨酶(氨基转移酶)的基因。

需要说明的是，本发明的基因重组微生物即使不通过外源基因的导入也可表达出足以催化C6化合物生产路径的反应阶段的量的酶的情况下，可通过由内源基因编码的酶进行反应。

将本发明中的基因重组微生物可以具有的C6化合物生产路径的一例示于图1。以下参照图1对催化各反应阶段的酶进行说明。

图1的步骤A中，琥珀酰-CoA与乙酰-CoA缩合，转换成3-氧代己二酰-CoA。作为可催化该转换的酶的示例，可以举出β-酮硫解酶。进而，还可例示出例如被分类在EC 2.3.1.9(乙酰基乙酰CoA硫解酶)、EC 2.3.1.16(3-酮酰-CoA硫解酶)和EC 2.3.1.174(3-氧代己二酰-CoA硫解酶)等组中的酶作为可对该转换具有活性的酶。作为可在该转换中使用的酶，只要对该转换具有活性就没有限定，例如可以举出琥珀酰CoA:乙酰CoA酰基转移酶和3-氧代己二酰CoA硫解酶。在一个方式中，使用由序列编号1中记载的氨基酸序列构成的大肠杆菌来源的PaaJ。

在图1的步骤B中，3-氧代己二酰-CoA转换成3-羟基己二酰-CoA。作为可催化该转换的酶的示例，可以举出被分类在EC 1.1.1组中的氧化还原酶。例如可例示出被分类在EC1.1.1.35(3-羟基酰基-CoA脱氢酶)、EC 1.1.1.36(乙酰基乙酰-CoA脱氢酶)、EC 1.1.1.157(3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶)、EC 1.1.1.211(长链3-羟基酰基-CoA脱氢酶)、EC 1.1.1.259(3-羟基庚二酰-CoA脱氢酶)之类的组中的酶作为可对该转换具有活性的酶。可在本发明中使用的酶只要具有对该转换的活性就没有限定，例如为3-羟基己二酰CoA脱氢酶。在一个方式中，使用由序列编号2中记载的氨基酸序列构成的大肠杆菌来源的PaaH。

在图1的步骤C中，3-羟基己二酰-CoA被转换成2,3-脱氢己二酰-CoA。作为可催化该转换的酶的示例，可以举出被分类在EC 4.2.1组中的氢化裂解酶。例如可例示出被分类在EC 4.2.1.17(烯酰基-CoA水合酶)、EC 4.2.1.55(3-羟基丁酰-CoA脱水酶)、EC 4.2.1.74(长链烯酰基-CoA水合酶)之类的组中的酶作为可对该转换具有活性的酶。可在本发明中使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定，例如为3-羟基己二酰CoA脱水酶。在一个方式中，使用由序列编号3中记载的氨基酸序列构成的大肠杆菌来源的PaaF。另外，作为其他方式，作为该酶，使用被下述PCR扩增物的碱基序列(783bp)所编码的3-羟基己二酰CoA脱水酶PaaF(L3)，该PCR扩增物是使用序列编号4所示的核苷酸和序列编号46所示的核苷酸作为引物、以伯克霍尔德菌属(Burkholderiasp.)LEBP-3株的染色体DNA作为模板得到的。伯克霍尔德菌属(Burkholderiasp.)LEBP-3株(下文中也简称为“L3株”)于2020年12月4日向独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(NPMD)(地址：千叶县木更津市かずさ镰足2-5-8 122号室)提交了保藏申请(受理号：NITE ABP-03334)，以“保藏号：NITE BP-03334”进行了国际保藏。

此处，作为PCR扩增物的制备中使用的DNA聚合酶，使用该领域中已知的酶，例如可以举出Taq DNA聚合酶、进行了热启动调整的DNA聚合酶、与聚合酶活性分开地具有3’-5’核酸外切酶活性的校对DNA聚合酶等，但并不限定于这些。在PCR扩增物的制备条件的一个优选方式中，使用各1μM的特定的核苷酸作为正向引物和反向引物，并且作为酶使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(产品名，Takara Bio制)，以25μL的液量在热处理98℃10秒、退火55℃15秒、延伸72℃5秒/kb的条件下实施30次循环的处理，由此制备该PCR扩增物。

在图1的步骤D中，2,3-脱氢己二酰-CoA被转换成己二酰-CoA。作为可催化该转换的酶的示例，可以举出被分类在EC 1.3.1组中的氧化还原酶。例如可例示出被分类在EC1.3.1.8(酰基-CoA脱氢酶(NADP⁺))、EC 1.3.1.9(烯酰基-ACP还原酶(NADH))、EC 1.3.1.38(反式-2-烯酰基-CoA还原酶(NADP⁺))、EC 1.3.1.44(反式-2-烯酰基-CoA还原酶(NAD⁺))、EC1.3.1.86(巴豆基-CoA还原酶)、EC 1.3.1.93(长链酰基-CoA还原酶)、EC 1.3.1.104(烯酰基-ACP还原酶(NADPH))之类的组中的酶作为可对该转换具有活性的酶。本发明中，步骤D的转换中使用上述2,3-脱氢己二酰CoA还原酶。

本发明中所使用的2,3-脱氢己二酰CoA还原酶例如为来源于下述生物种的酶：耳念珠菌(Candida auris)(序列编号8)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)(序列编号9)、库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)(序列编号10)、喜热梭孢壳(Thermothelomyces thermophilus)(序列编号11)、太瑞斯梭孢壳霉(Thermothielavioides terrestris)(序列编号12)、嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)(序列编号13)、丝状真菌柄孢霉(Podospora anserina)(序列编号14)、淡紫拟青霉菌(Purpureocillium lilacinum)(序列编号15)、圆核腔菌(Pyrenophora teres)(序列编号16)。优选使用由序列编号8～16中记载的氨基酸序列构成的酶中的至少一者，更优选使用由序列编号11、12、13、14和16中记载的氨基酸序列构成的酶中的至少一者(图3)。

图1的步骤E中，己二酰-CoA被转换成己二酸。作为可催化该转换的酶的示例，可以举出被分类在EC 3.1.2组中的硫酯水解酶。例如可例示出被分类在EC 3.1.2.1(乙酰-CoA水解酶)、EC 3.1.2.20(酰基-CoA水解酶)之类的组中的酶作为可对该转换具有活性的酶。可在本发明中使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定，例如为己二酰-CoA水解酶。

另外，作为可催化图1的步骤E的反应的其他酶的示例，还可以举出被分类在EC2.8.3组中的CoA-转移酶。例如可例示出被分类在EC 2.8.3.5(3-含氧酸CoA-转移酶)、EC2.8.3.6(3-氧代己二酸CoA-转移酶)、EC 2.8.3.18(琥珀酰-CoA:乙酰-CoA-转移酶)之类的组中的酶作为可对该转换具有活性的酶。可在本发明中使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定，例如为己二酸CoA转移酶。

此外，作为可催化图1的步骤E的反应的其他酶转换的示例，还可例示出下述路径：通过被分类在EC 2.3.1组中的酰基转移酶将己二酰-CoA的己二酰基转移至磷酸而生成己二酰磷酸后，利用被分类在EC 2.7.2组中的磷酸转移酶进行脱磷酸化。例如，作为酰基转移酶，可例示出被分类在EC 2.3.1.8(磷酸乙酰基转移酶)、EC 2.3.1.19(磷酸丁酰基转移酶)之类的组中的酶作为可对该转换具有活性的酶。作为磷酸转移酶，可例示出被分类在EC2.7.2.1(乙酸激酶)、EC 2.7.2.7(丁酸激酶)之类的组中的酶作为可对该转换具有活性的酶。可在本发明中使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定，例如为磷酸己二酰转移酶和己二酸激酶。

图1的步骤F、U和V中，酰基-CoA被转换成醛。作为可催化该转换的酶的示例，可以举出被分类在EC 1.2.1组中的酶。出于与该转换同样地催化CoA脱离而生成醛的转换反应的原因，例如可例示出被分类在EC 1.2.1.10(乙醛脱氢酶(乙酰化))、EC 1.2.1.17(乙醛酸脱氢酶(酰化))、EC 1.2.1.42(十六醛脱氢酶(酰化))、EC 1.2.1.44(肉桂酰-CoA还原酶(酰化))、EC 1.2.1.75(丙二酰-CoA还原酶(形成丙二酸半醛))、EC1.2.1.76(琥珀酸半醛脱氢酶(酰化))之类的组中的酶作为对该转换也可具有活性的酶。可在本发明中使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定，例如可使用由序列编号17中记载的氨基酸序列构成的克氏梭菌(Clostridium kluyveri)来源的sucD(图4)。

在图1的步骤G、I、K和N中，将羧基转换成醛。作为可催化该转换的酶，例如可以举出羧酸还原酶(Carboxylic Acid Reductase；CAR)。出于与该转换同样地可催化由羧酸生成醛的转换反应的原因，可例示出例如被分类在EC 1.2.1.30(羧酸还原酶(NADP⁺))、EC1.2.1.31(L-氨基己二酸半醛脱氢酶)、EC 1.2.1.95(L-2-氨基己二酸还原酶)、EC1.2.99.6(羧酸还原酶)之类的组中的酶作为对该转换也可具有活性的酶。关于作为酶的来源的生物种的代表示例，可以举出艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)、星形诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis)、皮疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)、褶皱慢反应脂肪酸菌(Segniliparus rugosus)、光滑脂肪酸慢出菌(Segniliparus rotundus)、酪酸冢村菌(Tsukamurella paurometabola)、海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)、免疫原分枝杆菌(Mycobacterium immunogenum)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、干朽菌(Serpula lacrymans)、多年异担子菌(Heterobasidion annosum)、灰拟鬼伞(Coprinopsis cinerea)、黄曲霉菌(Aspergillusflavus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，但并不限定于这些。可在本发明中使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定，例如可以使用由序列编号18～22的任一者中记载的氨基酸序列构成的酶的至少一种，优选使用由序列编号20中记载的氨基酸序列构成的脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)来源的酶MaCar、由序列编号22中记载的氨基酸序列构成的作为MaCar突变体的MaCar(m)中的至少一者，更优选使用由序列编号22中记载的氨基酸序列构成的MaCar(m)(图4)。

另外，羧酸还原酶可通过磷酸泛酰巯基乙胺基化而转换成活性型全酶(Venkitasubramanian et al.,Journal of Biological Chemistry,Vol.282,No.1,478-485(2007))。磷酸泛酰巯基乙胺基化通过磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Phosphopantetheinyl Transferase；PT)进行催化。作为可催化该反应的酶，例如可以举出被分类在EC 2.7.8.7中的酶。因此，本发明的微生物可以按照进一步增大磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的活性的方式进行修饰。作为增大磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的活性的方法，可以举出导入外源性磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因的方法、增强内源性磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因的表达的方法，但并不限定于这些。可在本发明中使用的酶只要具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移活性，并不限定于这些，作为代表性的酶，例如可以举出大肠杆菌的EntD、枯草杆菌(Bacillus subtilis)的Sfp、艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)的Npt(Venkitasubramanian et al.,Journal of Biological Chemistry,Vol.282,No.1,478-485(2007))、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Lys5(Ehmann et al.,Biochemistry 38.19(1999):6171-6177.)。可在本发明中使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定，例如可以使用由序列编号23～26中记载的氨基酸序列构成的酶中的至少任一种，优选使用由序列编号24中记载的氨基酸序列构成的艾阿华诺卡氏菌(Nocardiaiowensis)来源的艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)的Npt(图5)。

图1的步骤J、M、P和R的转换为氨基转移反应。作为可催化该转换的酶的示例，可以举出被分类在EC 2.6.1组中的转氨酶(氨基转移酶)。例如可例示出被分类在EC 2.6.1.19(4-氨基丁酸-2-氧代戊二酸转氨酶)、EC 2.6.1.29(二胺转氨酶)、EC 2.6.1.48(5-氨基戊酸转氨酶)之类的组中的酶作为对该转换也可具有活性的酶。可在本发明中使用的酶只要具有各步骤的转换活性就没有特别限定，例如可以使用已报告了对尸胺、亚精胺进行氨基转移的作为大肠杆菌的腐胺氨基转移酶的YgjG(Samsonova.,et al.,BMC microbiology3.1(2003):2.)、作为假单胞菌属的腐胺氨基转移酶的SpuC(Lu et al.,Journal ofbacteriology 184.14(2002):3765-3773.、Galman et al.,Green Chemistry 19.2(2017):361-366.)、大肠杆菌的GABA氨基转移酶GabT、PuuE。此外，帕氏鲁杰氏菌(Ruegeriapomeroyi)、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)、柠檬节杆菌(Arthrobactercitreus)、嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophilus)、费希尔曲霉(Aspergillusfischeri)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)等生物种来源的ω-转氨酶也被报告具有对1,8-二氨基辛烷、1,10-二氨基癸烷等二胺化合物的氨基转移活性，可在本发明中使用(Sung etal.,Green Chemistry 20.20(2018):4591-4595.、Sattler et al.,Angewandte Chemie124.36(2012):9290-9293.)。可在本发明中使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定，例如可以使用由序列编号27～31和158中记载的氨基酸序列构成的酶中的至少任一种(图5和图15)。作为代表性的氨基供体，可以举出L-谷氨酸、L-丙氨酸和甘氨酸，但并不限定于这些。

在图1的步骤H、L、O和Q中，醛转换成醇。作为可催化该转换的酶的示例，可以举出被分类在EC 1.1.1组中的氧化还原酶。出于与该转换同样地催化由醛向醇的转换反应的原因，例如可例示出被分类在EC 1.1.1.1(醇脱氢酶)、EC 1.1.1.2(醇脱氢酶(NADP⁺))、EC1.1.1.71(醇脱氢酶[NAD(P)⁺])之类的组中的酶作为对该转换也可具有活性的酶。可在本发明中使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定，例如为序列编号32中记载的大肠杆菌来源的Ahr(图5)。

在图1的步骤S和T的反应中，在羧基上加成CoA。作为可催化该转换的酶的示例，可以举出被分类在EC 2.8.3组中的CoA转移酶、被分类在EC 6.2.1组中的酸硫醇连接酶。本发明中所使用的酶只要具有对该转换的活性就没有限定。

编码可用于本发明的上述酶的基因可以来源于所例示的生物以外，并且也可以为人工合成的基因，只要在宿主微生物细胞内实质上可表达出酶活性即可。

本发明中的重组微生物中，宿主微生物中的任意基因可被适宜地破坏。靶基因的破坏可通过该领域中公知的方法来进行。

另外，在可用于本发明的上述酶的氨基酸序列、或者编码酶的基因的碱基序列中，只要可在上述宿主微生物细胞中实质上表达出酶活性，可具有在自然界中可能发生的全部的突变、人工导入的突变以及修饰，例如可以含有缺失、置换、插入、添加之类的突变。例如可以包含在上述酶的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1或2个以上、优选1～20个、更优选1～10个、进一步优选1～7个、进一步更优选1～5个、特别优选1～3个氨基酸而成的氨基酸序列。

此外，在编码可用于本发明的上述酶的基因的碱基序列中，只要可在上述宿主微生物细胞中实质上表达出酶活性，也可利用与具有互补的碱基序列的DNA在严谨条件下杂交的DNA。“严谨条件”例如为“1×SSC、0.1％SDS、60℃”的程度的条件，作为更严谨的条件，为“0.1×SSC、0.1％SDS、60℃”的程度的条件，作为进一步严谨的条件，为“0.1×SSC、0.1％SDS、68℃”的程度的条件。

此外已知在编码特定氨基酸的各种密码子中存在冗余密码子，因此在本发明中，也可利用最终被翻译成同一氨基酸的替代密码子。即，由于基因编码被简并，因此为了编码某一特定的氨基酸，可以使用多种密码子，因此氨基酸序列可利用任意的1组类似的DNA寡核苷酸进行编码。需要说明的是，已知大部分生物优先使用特定密码子(最佳密码子)的子集(Gene,Vol.105,pp.61-72,1991等)，因而根据宿主微生物进行“密码子最佳化”在本发明中也可以是有用的。

因此，对于本发明中的基因重组微生物，可以以能够表达出酶活性作为条件，包含与上述酶基因的碱基序列具有例如80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列一致性的碱基序列。或者可以包含编码包含与上述酶的氨基酸序列具有例如80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列一致性的氨基酸序列的蛋白质的基因。

需要说明的是，本说明书中，比较氨基酸序列相对于参照氨基酸序列的“序列一致性”的比例(％)如下定义：按照2个序列间的一致性最大的方式将序列排列整齐，必要时在2个序列中的一方或两方中插入间隙，将比较序列中的氨基酸残基与参照序列中的氨基酸残基相同的百分数定义为该比例。此时，保守置换不被视为序列一致性的一部分。序列一致性可以通过使用能够公知获得的计算机软件来确定，例如可以使用BLAST(注册商标。以下省略)(Basic Local Alignment Search Tool)等比对搜索工具来确定。本领域技术人员在比对中可以确定适当的参数以得到比较序列最大的比对。关于核苷酸序列的“序列一致性”，也可利用相同的方法来确定。

本发明中，通过将上述C6化合物生物合成酶基因作为“表达盒”导入至宿主微生物细胞内，能够更稳定地得到高水平的酶活性。本说明书中，“表达盒”是指包含与表达对象的核酸或表达对象的基因功能性结合的、对于转录和翻译进行调节的核酸序列的核苷酸。代表性地，本发明的表达盒以功能性结合的状态在编码序列的5’上游含有启动子序列、在3’下游含有终止子序列、根据情况进一步含有通常的调节元件，这种情况下，表达对象的核酸或表达对象的基因被导入至宿主微生物中。

关于启动子，不论是结构表达型启动子还是诱导表达型启动子，均被定义为使RNA聚合酶与DNA结合、引发RNA合成的DNA序列。强启动子是指以高频率引发mRNA合成的启动子，也适用于本发明中。在大肠杆菌中，能够利用lac系、trp系、tac或trc系、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的调节区域、针对糖酵解系酶(例如3-磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、谷氨酸脱羧酶A、丝氨酸羟甲基转移酶的启动子、T7噬菌体来源的RNA聚合酶的启动子区域等。在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中，可以利用HCE(高水平组成型表达)启动子、cspB启动子、sodA启动子、延伸因子(EF-Tu)启动子等。作为终止子，可以利用T7终止子、rrnBT1T2终止子、lac终止子等。除了启动子和终止子序列以外，可以作为其他调节元件的示例举出的序列为选择标记、扩增信号、复制起点等。适宜的调节序列例如记载于“Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185”,Academic Press(1990)。

上述说明的表达盒嵌入到例如由质粒、噬菌体、转座子、IS元件、噬粒、粘粒、或者线状或环状DNA等构成的载体中而被插入到宿主微生物中。优选质粒和噬菌体。这些载体在宿主微生物中可自体复制，也可通过染色体复制。适宜的质粒例如为：大肠杆菌的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI；杆菌的pUB110、pC194或pBD214；棒状杆菌属的pSA77或pAJ667等。在芽孢杆菌属等的杆菌中可以举出pUB110、pC194或pBD214等。除了这些以外还能够使用的质粒等记载于“Gene Cloning and DNA analysis 7thedition”,Wiley-Blackwell(2016)中。表达盒向载体中的导入可通过包括利用适当的限制酶切割、克隆化以及连接的惯用方法进行。各个表达盒可以配置在1个载体上，也可以配置在2个或其以上的载体上。

在如上所述构建出本发明的具有表达盒的载体后，作为将该载体导入至宿主微生物中时能够适用的方法，可以使用惯用的方法。例如可以举出氯化钙法、电穿孔法、接合传递法、原生质体融合法等，但并不限定于这些，可以选择适合于宿主微生物的方法。

本发明的第二方面涉及目标化合物的制造方法，其包括对上述重组微生物进行培养的培养工序。

此处，该化合物优选为C6化合物。C6化合物为选自由己二酸、六亚甲基二胺、1,6-己二醇、6-氨基己酸、6-氨基-1-己醇和6-羟基己酸组成的组中的至少一者。

C6化合物的制造方法包括对本发明中的基因重组微生物进行培养的培养工序。在培养工序中，通过利用含有碳源和氮源的培养基对重组微生物进行培养，可得到包含菌体的培养物。本发明的基因重组微生物在适于C6化合物生产、以及微生物的生长-维持的条件下进行培养，适宜的培养基组成、培养时间、培养条件可由本领域技术人员容易地设定。

作为碳源，可以举出D-葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、低聚糖、多糖、淀粉、纤维素、米糠、废糖蜜、油脂(例如大豆油、葵花籽油、花生油、椰子油等)、脂肪酸(例如棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸等)、醇(例如甘油、乙醇等)、有机酸(例如乙酸、乳酸、琥珀酸等)、玉米分解液、纤维素分解液。优选为D-葡萄糖、蔗糖或甘油。这些碳源可以单独使用或者以混合物的形式使用。

使用生物物质来源的原料制造的C6化合物可通过基于ISO16620-2或ASTM D6866中规定的碳-14(放射性碳)分析的生物基碳含量的测定，与例如来自石油、天然气、煤炭等的合成原料明确区分。

作为氮源，可以举出含氮有机化合物(例如蛋白胨、酪蛋白氨基酸、胰蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉、氨基酸和脲等)、或无机化合物(例如氨水溶液、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸钠、硝酸铵等)。这些氮源可以单独使用或者以混合物的形式使用。

另外，在重组微生物表达有用的附加特性的情况下、例如具有针对抗生素的抗性标记的情况下，培养基可以包含相对应的抗生素。由此，培养时的杂菌所致的污染风险降低。作为抗生素，可以举出氨苄青霉素等β-内酰胺系抗生素、卡那霉素等氨基糖苷系抗生素、红霉素等大环内酯系抗生素、四环素系抗生素、氯霉素等，但并不限定于这些。

培养可以为分批式、也可以为连续式。另外，在任一情况下，均可以为在培养的适当时刻追加补给上述碳源等的形式。进而，关于培养，可以一边控制合适的温度、氧浓度、pH等条件一边进行培养。来源于一般的微生物宿主细胞的转化体的合适的培养温度通常为15℃～55℃、优选为25℃～40℃的范围。宿主微生物为好氧性的情况下，为了确保发酵中的适当的氧浓度，可以进行振荡(烧瓶培养等)、搅拌/通气(发酵罐培养等)。这些培养条件可由本领域技术人员容易地设定。

培养工序中可以包括得到重组微生物的培养物和/或培养物的提取物的步骤。

本发明中的化合物的制造方法可以进一步包括将上述培养物和/或上述培养物的提取物与底物化合物混合而得到混合液的混合工序。底物化合物可以根据酶和目标化合物适宜地选择。

本发明中的化合物的制造方法可以包括对作为目标化合物的C6化合物进行分离和/或精制的工序。该分离和/或精制的工序中可以举出任意方法，例如离心分离、过滤、膜分离、析晶、提取、蒸馏、吸附、相分离、离子交换和各种色谱法等，但并不限定于这些。在分离和/或精制工序中，可以选择一种方法，并且也可以将多种方法组合。

本发明的又一方面涉及蛋白质。具体地说，该蛋白质为下述重组蛋白：

(b)为下述任一者：

(i)由与序列编号8、9、10、11、12、13、14、15或16所示的氨基酸序列具有80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列一致性的氨基酸序列构成；

(ii)由在序列编号8、9、10、11、12、13、14、15或16所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个、1～7个、1～5个或1～3个氨基酸而成的氨基酸序列构成；

(iii)利用由与序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列具有80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列一致性的多核苷酸序列构成的DNA进行编码；

(iv)由在利用序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个、1～7个、1～5个或1～3个氨基酸而成的氨基酸序列构成；

(vi)利用由序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列的简并异构体构成的DNA进行编码。

该蛋白质优选为下述重组蛋白：

(a)具有将2,3-脱氢己二酰-CoA还原而转换成己二酰CoA的酶活性，

(b)为下述任一者：

在优选的一个方式中，重组蛋白：

(xiii)利用由序列编号57、58、59、60、61、62、63、64或65所示的多核苷酸序列构成的DNA进行编码。

本发明的又一方面涉及C6化合物的制造方法，其包括使用上述蛋白质的步骤。

如以上所说明，根据本发明，通过在宿主微生物中导入编码上述具有2,3-脱氢己二酰CoA还原酶活性的蛋白质的基因，能够得到2,3-脱氢己二酰-CoA还原酶活性良好的重组微生物。另外还提供具有良好的2,3-脱氢己二酰CoA还原酶活性的蛋白质。

通过使用上述重组微生物或上述蛋白质，能够有效地制造出目标C6化合物。另外，通过根据所期望的C6化合物使用追加的酶进行转换，能够得到各种C6化合物。此外，本发明中的重组微生物由于具有良好的C6化合物生产能力，因此期待能够用于工业规模的目标化合物的生产。

<2>发明B：重组微生物以及己二酸或其衍生物的制造方法

本发明中的重组微生物是对宿主微生物进行了基因修饰以能够有效地生产己二酸(Adipic acid；ADA)(CAS No.124-04-9)或己二酸衍生物的微生物。

本说明书中，“己二酸衍生物”是具有碳原子数3～5的脂肪族烃基、以及1个或2个以上的羧基的脂肪族羧酸。己二酸衍生物所具有的脂肪族烃基为饱和或不饱和的。脂肪族烃基中，碳例如可以带有羟基、羧基、酮基、氨基等取代基的取代。“己二酸衍生物”所具有的脂肪族烃基的碳原子数优选为3或4。“己二酸衍生物”所具有的羧基优选为1或2。作为“己二酸衍生物”的具体例，可以举出具有碳原子数4的脂肪族烃基和2个羧酸的3-氧代己二酸(3-Oxoadipic acid；3-OA)、具有碳原子数3的脂肪族烃基和1个羧酸的乙酰丙酸(Levulinicacid；LEV)、具有碳原子数4的脂肪族烃基和2个羧酸的3-羟基己二酸(3-Hydroxyadipicacid；3HA)、以及具有碳原子数4的脂肪族烃基和2个羧酸的2,3-脱氢己二酸(2,3-Dehydroadipic acid；23DA)(参照图16)。

如本领域技术人员所理解，本说明书中的己二酸和己二酸衍生物可采取包括任意的盐形态的中性或电离形态，该形态取决于pH。因此，“己二酸”和“己二酸衍生物”中除了包含游离酸的形态以外，还包含任意的盐形态和电离形态。本说明书中，有时将己二酸和己二酸衍生物合起来总称为“己二酸类”或“己二酸类似物”。

也可以将由本发明中的重组微生物生产的己二酸作为原料来合成6-氨基己酸、六亚甲基二胺、1,6-己二醇和6-氨基-1-己醇。合成方法可以是化学合成法、利用酶或内含有酶的微生物的生物学合成法等。另外，只要为包含用于将己二酸转换成上述化合物的代谢路径的微生物，也可以在细胞内由使用己二酸作为中间体的原料进行代谢转换。

本发明中的基因重组微生物具体地说包含编码3-羟基己二酰CoA脱水酶的外源基因和编码2,3-脱氢己二酰CoA还原酶的外源基因中的至少一者。通过包含这样的外源基因中的至少一者，重组微生物具有己二酸生产路径，能够制造出己二酸或己二酸衍生物。本说明书中，“基因重组微生物”也简称为“重组微生物”。

3-羟基己二酰CoA脱水酶和2,3-脱氢己二酰CoA还原酶中的至少一者来源于伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株(保藏号：NITE BP-03334)。优选3-羟基己二酰CoA脱水酶和2,3-脱氢己二酰CoA还原酶这两者来源于伯克霍尔德菌属(Burkholderiasp.)LEBP-3株。

编码3-羟基己二酰CoA脱水酶的外源基因和编码2,3-脱氢己二酰CoA还原酶的外源基因中的至少一者来源于伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株(保藏号：NITEBP-03334)。优选编码3-羟基己二酰CoA脱水酶的外源基因和编码2,3-脱氢己二酰CoA还原酶的外源基因这两者来源于伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株(保藏号：NITEBP-03334)。

本发明的基因重组微生物被导入编码上述酶的外源基因中的至少一者即可。本发明的基因重组微生物优选被导入编码催化己二酸生产路径的各反应阶段的酶的外源基因中的至少一者，表达外源性酶。另外，本发明的基因重组微生物即使不通过外源基因的导入也可表达出足以催化己二酸生产路径的反应阶段的量的酶的情况下，可通过由内源基因编码的酶进行反应。

本发明中的重组微生物优选表达3-羟基己二酰CoA脱水酶和2,3-脱氢己二酰CoA还原酶中的至少一者。本发明中的重组微生物通过表达这些酶中的至少一者，可进行己二酸生产路径的反应阶段，生产出目标化合物。

更优选本发明中的重组微生物表达3-羟基己二酰CoA脱水酶和2,3-脱氢己二酰CoA还原酶这两者。本发明中的重组微生物通过表达这些酶，能够分别进行己二酸生产路径的反应阶段，生产出目标化合物。

进一步更优选本发明中的重组微生物除了表达3-羟基己二酰CoA脱水酶和2,3-脱氢己二酰CoA还原酶以外还表达氧化还原酶和/或β-酮硫解酶。本发明中的重组微生物通过表达出这些酶，能够分别进行己二酸生产路径的反应阶段，有效地生产出目标化合物(参照图16)。

以下对于本发明中的重组微生物所包含的基因编码的酶分别进行详细说明。

<3-羟基己二酰CoA脱水酶>

3-羟基己二酰CoA脱水酶是催化将3-羟基己二酰-CoA转换成2,3-脱氢己二酰-CoA的反应的酶(图16的步骤C)。

在一个方式中，3-羟基己二酰CoA脱水酶被与下述PCR扩增物的序列一致性为65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的DNA所编码，该PCR扩增物是以伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株的染色体DNA作为模板、使用规定的核苷酸作为引物得到的。此处，该DNA具有例如626～940bp、优选740～862bp、更优选743～823bp、进一步更优选767～799bp、特别更优选775～791bp、最优选778～788bp。关于PCR中使用的引物如下文所述。

在优选的一个方式中，3-羟基己二酰CoA脱水酶被作为PCR扩增物的DNA所编码，该PCR扩增物是以伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株的染色体DNA作为模板、使用规定的核苷酸作为引物得到的。该DNA具有例如626～940bp、优选740～862bp、更优选743～823bp、进一步更优选767～799bp、特别更优选775～791bp、最优选778～788bp。

在另外的方式中，3-羟基己二酰CoA脱水酶选自下述重组多肽：

(A-1)被与下述PCR扩增物的序列一致性为65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的DNA所编码的重组多肽，

具有3-羟基己二酰CoA脱水酶活性，

上述DNA具有上述碱基对数(bp)，

该PCR扩增物是以伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株的染色体DNA作为模板、使用规定的核苷酸作为引物得到的；

(A-2)由在利用作为下述PCR扩增物的DNA所编码的多肽的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加例如1～10个、优选1～7个、更优选1～5个、进一步优选1～3个氨基酸而成的氨基酸序列构成的重组多肽，

具有3-羟基己二酰CoA脱水酶活性，

上述DNA具有上述碱基对数(bp)，

以及

具有3-羟基己二酰CoA脱水酶活性，

上述DNA具有上述碱基对数(bp)，

该PCR扩增物是以伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株的染色体DNA作为模板、使用规定的核苷酸作为引物得到的。

在进一步优选的方式中，3-羟基己二酰CoA脱水酶是被以伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株的染色体DNA作为模板、使用规定的核苷酸作为引物得到的PCR扩增物所编码的重组多肽，该扩增物的碱基对数为783或784bp。

关于3-羟基己二酰CoA脱水酶，作为PCR中使用的引物(正向和反向)，可以举出下述引物(参照图17)。

(1a)由序列编号168所示的碱基序列构成的核苷酸以及由序列编号169所示的碱基序列构成的核苷酸；

(1b)包含序列编号168所示的碱基序列的核苷酸以及包含序列编号169所示的碱基序列的核苷酸；

(1c)由将序列编号168所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列构成的核苷酸以及由将序列编号169所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列构成的核苷酸；

(1d)包含将序列编号168所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列的核苷酸以及包含将序列编号169所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列的核苷酸。

上述(1b)的“包含序列编号168所示的碱基序列的核苷酸以及包含序列编号169所示的碱基序列的核苷酸”具有除了“序列编号168所示的碱基序列”和“序列编号169所示的碱基序列”以外还分别进一步追加了例如1～20bp、优选1～15bp、更优选5～15bp、进一步优选10～15bp之后的核苷酸长度。

上述(1d)的“包含将序列编号168所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列的核苷酸以及包含将序列编号169所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列的核苷酸”具有除了“将序列编号168所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列”和“将序列编号169所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列”以外还分别包含与载体末端相同的序列、例如分别进一步追加了1～20bp、优选1～15bp、更优选5～15bp、进一步优选10～15bp之后的核苷酸长度。作为上述(1d)的“包含将序列编号168所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列的核苷酸、以及包含将序列编号169所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列的核苷酸”的示例，可以举出(1d’)由序列编号198所示的碱基序列构成的核苷酸以及由序列编号199所示的碱基序列构成的核苷酸(图20A)。

关于3-羟基己二酰CoA脱水酶，优选的引物为：

(1a)由序列编号168所示的碱基序列构成的核苷酸以及由序列编号169所示的碱基序列构成的核苷酸；以及

(1b)包含序列编号168所示的碱基序列的核苷酸以及包含序列编号169所示的碱基序列的核苷酸。

作为PCR扩增物(其是使用上述核苷酸作为引物、以伯克霍尔德菌属(Burkholderiasp.)LEBP-3株的染色体DNA作为模板得到的)的DNA优选具有783或784bp。此处，作为PCR中使用的DNA聚合酶，使用该领域中已知的DNA聚合酶，例如可以举出Taq DNA聚合酶、进行了热启动调整的DNA聚合酶、与聚合酶活性分开地具有3’-5’核酸外切酶活性的校对DNA聚合酶等。

<2,3-脱氢己二酰CoA还原酶>

2,3-脱氢己二酰CoA还原酶是催化将2,3-脱氢己二酰-CoA转换成己二酰-CoA的反应的酶(参照图16的步骤D)。

在一个方式中，2,3-脱氢己二酰CoA还原酶被与下述PCR扩增物的序列一致性为65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的DNA所编码，该PCR扩增物是以伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株的染色体DNA作为模板、使用规定的核苷酸作为引物得到的。该DNA例如具有924～1386bp、优选1039～1249bp、更优选1097～1213bp、进一步更优选1131～1179bp、特别更优选1143～1167bp、进一步特别更优选1145～1165bp、最优选1150～1160bp。

在优选的一个方式中，2,3-脱氢己二酰CoA还原酶被作为PCR扩增物的DNA所编码，该PCR扩增物是以伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株的染色体DNA作为模板、使用规定的核苷酸作为引物得到的。该DNA例如具有924～1386bp、优选1039～1249bp、更优选1097～1213bp、进一步更优选1131～1179bp、特别更优选1143～1167bp、进一步特别更优选1145～1165bp、最优选1150～1160bp。

在另外的方式中，2,3-脱氢己二酰CoA还原酶选自下述重组多肽：

(B-1)被与下述PCR扩增物的序列一致性为65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的DNA所编码的重组多肽，

具有2,3-脱氢己二酰CoA还原酶活性，

上述DNA具有上述碱基对数(bp)，

(B-2)由在利用作为下述PCR扩增物的DNA所编码的多肽的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加例如1～10个、优选为1～7个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个氨基酸而成的氨基酸序列构成的重组多肽，

具有2,3-脱氢己二酰CoA还原酶活性，

上述DNA具有上述碱基对数(bp)，

以及

具有2,3-脱氢己二酰CoA还原酶活性，

上述DNA具有上述碱基对数(bp)，

在进一步优选的方式中，外源性的2,3-脱氢己二酰CoA还原酶是以伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株的染色体DNA作为模板、使用规定的核苷酸作为引物得到的PCR扩增物，该扩增物的碱基对数为1155或1156bp。

关于2,3-脱氢己二酰CoA还原酶，作为PCR中使用的引物(正向和反向)，可以举出下述引物(参照图17)。

(2a)由序列编号170所示的碱基序列构成的核苷酸以及由序列编号171所示的碱基序列构成的核苷酸；

(2b)包含序列编号170所示的碱基序列的核苷酸以及包含序列编号171所示的碱基序列的核苷酸；

(2c)由将序列编号170所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列构成的核苷酸以及由将序列编号171所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列构成的核苷酸；

(2d)包含将序列编号170所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列的核苷酸以及包含将序列编号171所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列的核苷酸。

上述(2b)的“包含序列编号170所示的碱基序列的核苷酸以及包含序列编号171所示的碱基序列的核苷酸”具有除了“序列编号170所示的碱基序列”和“序列编号171所示的碱基序列”以外还分别进一步追加了例如1～20bp、优选1～15bp、更优选5～15bp、进一步优选10～15bp之后的核苷酸长度。

上述(2d)的“包含将序列编号170所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列的核苷酸以及包含将序列编号171所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列的核苷酸”具有除了“将序列编号170所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列”和“将序列编号171所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列”以外还分别包含与载体末端相同的序列、例如分别进一步追加了1～20bp、优选1～15bp、更优选5～15bp、进一步优选10～15bp之后的核苷酸长度。作为上述(2d)的“包含将序列编号170所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列的核苷酸以及包含将序列编号171所示的碱基序列进行了密码子最佳化的碱基序列的核苷酸”的示例，可以举出(2d’)由序列编号210所示的碱基序列构成的核苷酸以及由序列编号211所示的碱基序列构成的核苷酸(图20A)。

关于2,3-脱氢己二酰CoA还原酶，优选的引物为：

(2a)由序列编号170所示的碱基序列构成的核苷酸以及由序列编号171所示的碱基序列构成的核苷酸；以及

(2b)包含序列编号170所示的碱基序列的核苷酸以及包含序列编号171所示的碱基序列的核苷酸。

作为PCR扩增物(其是使用上述核苷酸作为引物、以伯克霍尔德菌属(Burkholderiasp.)LEBP-3株的染色体DNA作为模板得到的)的DNA优选具有1155或1156bp。此处，作为PCR中使用的DNA聚合酶，使用该领域中已知的DNA聚合酶，例如可以举出Taq DNA聚合酶、进行了热启动调整的DNA聚合酶、与聚合酶活性分开地具有3’-5’核酸外切酶活性的校对DNA聚合酶等。

本说明书中，“PCR扩增物”是指以特定的核苷酸作为引物进行PCR从而得到的产物。需要说明的是，只要没有特别示出，本说明书中，在PCR扩增中，使用各1μM的特定的核苷酸作为正向引物和反向引物，并且作为酶使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(产品名、Takara Bio制)，以25μL的液量在热处理98℃10秒、退火55℃15秒、延伸72℃5秒/kb的条件下实施30次循环的处理。

就本发明而言，导入目标外源基因的宿主微生物没有特别限定，可以为原核生物和真核生物中的任一者。可以从已经分离保存的微生物、新近从自然界分离出的微生物、以及进行了基因修饰的微生物中任意地选择。宿主微生物例如属于选自由埃希氏菌属、棒状杆菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、伯克霍尔德菌属、假单胞菌属、梭菌属、酵母菌属、裂殖酵母属、亚罗酵母属、念珠菌属、毕赤酵母属、曲霉属、克雷伯氏菌属、葡糖杆菌属、发酵单胞菌属、乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属和链霉菌属组成的组中的属。本发明的宿主微生物优选属于选自由埃希氏菌属、棒状杆菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、伯克霍尔德菌属、假单胞菌属、梭菌属、酵母菌属、裂殖酵母属、亚罗酵母属、念珠菌属、毕赤酵母属和曲霉属组成的组中的属。宿主微生物更优选为大肠杆菌(Escherichia coli)。

因此，在上述宿主微生物中导入了外源基因的本发明中的重组微生物例如属于选自由埃希氏菌属、棒状杆菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、伯克霍尔德菌属、假单胞菌属、梭菌属、酵母菌属、裂殖酵母属、亚罗酵母属、念珠菌属、毕赤酵母属、曲霉属、克雷伯氏菌属、葡糖杆菌属、发酵单胞菌属、乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属和链霉菌属组成的组中的属，优选属于选自由埃希氏菌属、棒状杆菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、伯克霍尔德菌属、假单胞菌属、梭菌属、酵母菌属、裂殖酵母属、亚罗酵母属、念珠菌属、毕赤酵母属和曲霉属组成的组中的属。本发明中的重组微生物更优选为大肠杆菌(Escherichia coli)。

以下参照图16对于本发明中的基因重组微生物所具有的己二酸、己二酸衍生物、六亚甲基二胺、1,6-己二醇和6-氨基-1-己醇生产路径以及催化该路径的各反应阶段的酶进行说明。

图16的步骤A的转换中，例如琥珀酰CoA:乙酰CoA酰基转移酶、或者3-氧代己二酰CoA硫解酶参与其中，琥珀酰-CoA与乙酰-CoA发生缩合，转换成3-氧代己二酰-CoA。作为可催化该转换的酶的其他示例，可以举出β-酮硫解酶。进而，例如还可例示出被分类在EC2.3.1.9(乙酰基乙酰CoA硫解酶)、EC 2.3.1.16(3-酮酰-CoA硫解酶)和EC 2.3.1.174(3-氧代己二酰-CoA硫解酶)等组中的酶作为可对该转换具有活性的酶。本发明中所使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定，在一个方式中，使用由序列编号172所示的氨基酸序列构成的大肠杆菌来源的PaaJ。在优选的一个方式中，该酶是被作为下述PCR扩增物的DNA序列(1203bp)所编码的琥珀酰CoA:乙酰CoA酰基转移酶，该PCR扩增物是使用序列编号164所示的核苷酸和序列编号165所示的核苷酸作为引物、以伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株的染色体DNA作为模板得到的。

在图16的步骤B的转换中，3-羟基己二酰CoA脱氢酶参与其中，3-氧代己二酰-CoA被转换成3-羟基己二酰-CoA。作为可催化该转换的其他酶的示例，可以举出被分类在EC1.1.1组中的氧化还原酶。具体地说，例如可例示出被分类在EC 1.1.1.35(3-羟基酰基-CoA脱氢酶)、EC 1.1.1.36(乙酰基乙酰-CoA脱氢酶)、EC 1.1.1.157(3-羟基丁酰-CoA脱氢酶)、EC 1.1.1.211(长链3-羟基酰基-CoA脱氢酶)和EC 1.1.1.259(3-羟基庚二酰-CoA脱氢酶)等组中的酶作为可对该转换具有活性的酶。本发明中所使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定，例如使用由序列编号173所示的氨基酸序列构成的大肠杆菌来源的PaaH(图18)。在优选的一个方式中，该酶是被PCR扩增物的DNA序列(1521bp)所编码的3-羟基己二酰CoA脱氢酶，该PCR扩增物是使用序列编号166所示的核苷酸和序列编号167所示的核苷酸作为引物、以伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株的染色体DNA作为模板得到的。

在图16的步骤C的转换中，例如3-羟基己二酰CoA脱水酶参与其中，3-羟基己二酰-CoA被转换成2,3-脱氢己二酰-CoA。作为可催化该转换的其他酶的示例，可以举出被分类在EC 4.2.1组中的氢化裂解酶。具体地说，例如可例示出被分类在EC 4.2.1.17(烯酰基-CoA水合酶)、EC 4.2.1.55(3-羟基丁酰-CoA脱水酶)和EC 4.2.1.74(长链烯酰基-CoA水合酶)等组中的酶作为可对该转换具有活性的酶。在优选的一个方式中，该酶为上述3-羟基己二酰CoA脱水酶。

在图16的步骤D的转换中，例如2,3-脱氢己二酰CoA还原酶参与其中，2,3-脱氢己二酰-CoA被转换成己二酰-CoA。作为可催化该转换的酶的其他示例，可以举出被分类在EC1.3.1组中的氧化还原酶。具体地说，可例示出例如被分类在EC 1.3.1.8(酰基-CoA脱氢酶(NADP⁺))、EC 1.3.1.9(烯酰基-ACP还原酶(NADH))、EC 1.3.1.38(反式-2-烯酰基-CoA还原酶(NADP⁺))、EC 1.3.1.44(反式-2-烯酰基-CoA还原酶(NAD⁺))、EC 1.3.1.86(巴豆基-CoA还原酶)、EC 1.3.1.93(长链酰基-CoA还原酶)和EC 1.3.1.104(烯酰基-ACP还原酶(NADPH))等组中的酶作为可对该转换具有活性的酶。在优选的一个方式中，该酶为上述的2,3-脱氢己二酰CoA还原酶。

在图16的步骤E的转换中，己二酰-CoA被转换成己二酸。作为可催化该转换的酶的示例，可以举出被分类在EC 3.1.2组中的硫酯水合酶。例如可例示出被分类在EC 3.1.2.1(乙酰-CoA水合酶)和EC 3.1.2.20(酰基-CoA水合酶)等组中的酶作为可对该转换具有活性的酶。在优选的一个方式中，该酶只要对该转换具有活性就没有限定，可使用序列编号179所示的不动杆菌ADP1株来源的tesB(Ab)。根据所使用的酶的底物特异性，3-氧代己二酰-CoA、3-羟基己二酰CoA和2,3-脱氢己二酰CoA的CoA脱离，分别生成3-氧代己二酸、3-羟基己二酸、2,3-脱氢己二酸。

另外，作为可催化图16的步骤E的转换的其他酶的示例，还可例示出被分类在EC2.8.3组中的CoA-转移酶。例如可例示出被分类在EC 2.8.3.5(3-含氧酸CoA-转移酶)、EC2.8.3.6(3-氧代己二酸CoA-转移酶)、EC 2.8.3.18(琥珀酰-CoA:乙酸CoA-转移酶)之类的组中的酶作为可对该转换具有活性的酶。

此外，作为可催化图16的步骤E的转换的其他酶转换的示例，还可例示出下述路径：利用被分类在EC 2.3.1组中的酰基转移酶，将己二酰-CoA的己二酰基转移至磷酸而生成己二酰磷酸，之后利用被分类在EC 2.7.2组中的磷酸转移酶进行脱磷酸化。例如，作为酰基转移酶，可例示出被分类在EC 2.3.1.8(磷酸乙酰基转移酶)、EC 2.3.1.19(磷酸丁酰基转移酶)之类的组中的酶作为可对该转换具有活性的酶；对于磷酸转移酶，可例示出被分类在EC 2.7.2.1(乙酸激酶)、EC 2.7.2.7(丁酸激酶)之类的组中的酶作为可对该转换具有活性的酶。

图16的步骤T中，将3-氧代己二酸转换成乙酰丙酸。该转换被酶(3-氧代己二酸脱羧酶)催化、或者自发地产生。

图16的步骤F的转换中，由己二酰-CoA转换成己二酸半醛。作为可催化该转换的酶的示例，可以举出被分类在EC 1.2.1组中的酶。出于与该转换同样地催化CoA脱离而生成醛的转换反应的原因，例如可例示出被分类在EC 1.2.1.10(乙醛脱氢酶(乙酰化))、EC1.2.1.17(乙醛酸脱氢酶(酰化))、EC 1.2.1.42(十六醛脱氢酶(酰化))、EC 1.2.1.44(肉桂酰-CoA还原酶(酰化))、EC 1.2.1.75(丙二酰-CoA还原酶(形成丙二酸半醛))、EC 1.2.1.76(琥珀酸半醛脱氢酶(酰化))之类的组中的酶作为对该转换也可具有活性的酶。本发明所使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定，例如使用由序列编号236中记载的氨基酸序列构成的克氏梭菌(Clostridium kluyveri)来源的sucD(图21)。

在图16的步骤G、J、Q的转换中，羧基被转换成醛。作为可催化该转换的酶，例如可以举出羧酸还原酶(Carboxylic Acid Reductase；CAR)。出于与该转换同样地催化由羧酸生成醛的转换反应的原因，例如可例示出被分类在EC 1.2.1.30(羧酸还原酶(NADP+))、EC1.2.1.31(L-氨基己二酸半醛脱氢酶)、EC 1.2.1.95(L-2-氨基己二酸还原酶)、EC1.2.99.6(羧酸还原酶)之类的组中的酶作为对该转换也可具有活性的酶。关于作为酶的来源的生物种的代表示例，可以举出艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)、星形诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis)、皮疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)、褶皱慢反应脂肪酸菌(Segniliparus rugosus)、光滑脂肪酸慢出菌(Segniliparus rotundus)、酪酸冢村菌(Tsukamurella paurometabola)、海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)、免疫原分枝杆菌(Mycobacterium immunogenum)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、干朽菌(Serpula lacrymans)、多年异担子菌(Heterobasidion annosum)、灰拟鬼伞(Coprinopsis cinerea)、黄曲霉菌(Aspergillusflavus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，但并不限定于这些。本发明所使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定，例如可以使用由序列编号237～241的任一者中记载的氨基酸序列构成的酶中的至少一种(图22A～图22E)，优选使用由序列编号239中记载的氨基酸序列构成的脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)来源的酶MaCar、由序列编号241中记载的氨基酸序列构成的作为MaCar的突变体的MaCar(m)中的至少一者，更优选使用由序列编号241中记载的氨基酸序列构成的MaCar(m)。

另外，羧酸还原酶可通过磷酸泛酰巯基乙胺基化而转换成活性型的全酶(Venkitasubramanian et al.,Journal of Biological Chemistry,Vol.282,No.1,478-485(2007))。磷酸泛酰巯基乙胺基化通过磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Phosphopantetheinyl Transferase；PT)进行催化。作为可催化该反应的酶，例如可以举出被分类在EC 2.7.8.7中的酶。因此，本发明的微生物可以按照进一步增大磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的活性的方式进行修饰。作为增大磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的活性的方法，可以举出导入外源性磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因的方法、增强内源性磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因的表达的方法，但并不限定于这些。本发明所使用的酶只要具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移活性，就不限定于这些，作为代表性的酶，例如可以举出大肠杆菌的EntD、枯草杆菌(Bacillus subtilis)的Sfp、艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)的Npt(Venkitasubramanian et al.,Journal of Biological Chemistry,Vol.282,No.1,478-485(2007))、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Lys5(Ehmann et al.,Biochemistry 38.19(1999):6171-6177.)。本发明所使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定，例如可以使用由序列编号242～245所记载的氨基酸序列构成的酶中的至少任一种(图23A～图23D)，优选使用由序列编号243所记载的氨基酸序列构成的艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)来源的艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)的Npt。

图16的步骤M、N、S的转换为氨基转移反应。作为可催化该转换的酶的示例，可以举出被分类在EC 2.6.1组中的转氨酶(氨基转移酶)。例如可例示出被分类在EC 2.6.1.19(4-氨基丁酸-2-氧代戊二酸转氨酶)、EC 2.6.1.29(二胺转氨酶)、EC 2.6.1.48(5-氨基戊酸转氨酶)之类的组中的酶作为对该转换也可具有活性的酶。本发明所使用的酶只要具有各步骤的转换活性就没有特别限定，例如可以使用已报告了对尸胺、亚精胺进行氨基转移的作为大肠杆菌的腐胺氨基转移酶的YgjG(Samsonova.,et al.,BMC microbiology 3.1(2003):2.)、作为假单胞菌属的腐胺氨基转移酶的SpuC(Lu etal.,Journal ofbacteriology 184.14(2002):3765-3773.、Galman et al.,Green Chemistry 19.2(2017):361-366.)、大肠杆菌的GABA氨基转移酶GabT、PuuE。此外，帕氏鲁杰氏菌(Ruegeriapomeroyi)、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)、柠檬节杆菌(Arthrobactercitreus)、嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophilus)、费希尔曲霉(Aspergillusfischeri)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)等生物种来源的ω-转氨酶也被报告具有对1,8-二氨基辛烷、1,10-二氨基癸烷等二胺化合物的氨基转移活性，可在本发明中使用(Sung etal.,Green Chemistry 20.20(2018):4591-4595.、Sattler et al.,Angewandte Chemie124.36(2012):9290-9293.)。本发明所使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定，例如可以使用由序列编号246～250中记载的氨基酸序列构成的酶中的至少任一种(图24A～图24E)。作为代表性的氨基供体，可以举出L-谷氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸，但并不限定于这些。

图16的步骤H、L、R的转换中，醛被转换成醇。作为可催化该转换的酶的示例，可以举出被分类在EC 1.1.1组中的氧化还原酶。出于与该转换同样地催化由醛向醇的转换反应的原因，可例示出例如被分类在EC 1.1.1.1(醇脱氢酶)、EC 1.1.1.2(醇脱氢酶(NADP⁺))、EC 1.1.1.71(醇脱氢酶[NAD(P)⁺])之类的组中的酶作为对该转换也可具有活性的酶。本发明所使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定，例如使用序列编号251所记载的大肠杆菌来源的Ahr(图25)。

图16的步骤I、O的转换中，在羧基上加成CoA。作为可催化该转换的酶的示例，可以举出被分类在EC 2.8.3组中的CoA转移酶、被分类在EC 6.2.1组中的酸硫醇连接酶。本发明所使用的酶只要对该转换具有活性就没有限定。

本发明中的基因重组微生物中，优选除了上述的编码3-羟基己二酰CoA脱水酶和/或2,3-脱氢己二酰CoA还原酶的外源基因以外，还导入有编码选自由琥珀酰CoA:乙酰CoA酰基转移酶和3-羟基己二酰CoA脱氢酶组成的组中的至少一种酶的外源基因。

即，本发明中的重组微生物优选进一步包含编码琥珀酰CoA:乙酰CoA酰基转移酶的外源基因和编码3-羟基己二酰CoA脱氢酶的外源基因中的至少一者。

本发明中的重组微生物中，除了上述外源基因、即3-羟基己二酰CoA脱水酶、2,3-脱氢己二酰CoA还原酶、琥珀酰CoA:乙酰CoA酰基转移酶和3-羟基己二酰CoA脱氢酶以外，还可以导入另外的外源基因。

本发明中的重组微生物中，宿主微生物中的任意基因可被适宜地破坏。靶基因的破坏可依据该领域中公知的方法进行。

另外，可用于本发明的目的的上述酶基因只要在上述宿主微生物细胞内可实质上表达出酶活性，可具有在自然界中可能发生的全部的突变、人工导入的突变以及修饰。例如已知在编码特定氨基酸的各种密码子中存在冗余密码子。因此在本发明中也可利用最终被翻译成同一氨基酸的替代密码子。即，由于基因编码被简并，因此为了编码某一特定的氨基酸，可以使用多个密码子，因此氨基酸序列可利用任意的1组类似的DNA寡核苷酸进行编码。尽管仅该组唯一的成员与天然型酶的基因序列相同，但即使是不匹配的DNA寡核苷酸，在适当的严谨条件下(例如，3×SSC、68℃杂交、2×SSC、0.1％SDS以及68℃清洗)也能够与天然型序列杂交，能够对编码天然型序列的DNA进行鉴定、分离，进一步还能够将这样的基因用于本发明中。特别是已知大部分生物优先使用特定密码子(最佳密码子)的子集(Gene、Vol.105、pp.61-72、1991等)，因而根据宿主微生物进行“密码子最佳化”在本发明中也可以是有用的。

因此，对于本发明中的基因重组微生物，可以以实质上能够表达出酶活性作为条件，包含与上述酶基因的碱基序列具有例如65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列一致性的碱基序列。或者，本发明中的基因重组微生物可以包含与编码上述酶的氨基酸序列的碱基序列具有例如65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列一致性的碱基序列。

本发明中，通过将上述生物合成酶基因作为“表达盒”导入至宿主微生物细胞内，能够更稳定地得到高水平的酶活性。本说明书中，“表达盒”是指包含与表达对象的核酸或表达对象的基因功能性结合的、对于转录和翻译进行调节的核酸序列的核苷酸。代表性地，本发明的表达盒以功能性结合的状态在编码序列的5’上游含有启动子序列、在3’下游含有终止子序列、根据情况进一步含有通常的调节元件，这种情况下，表达对象的核酸或表达对象的基因被导入至宿主微生物中。

本说明书中，关于启动子，不论是结构表达型启动子还是诱导表达型启动子，均被定义为使RNA聚合酶与DNA结合、引发RNA合成的DNA序列。强启动子是指以高频率引发mRNA合成的启动子，也适用于本发明中。在大肠杆菌中，能够利用lac系、trp系、tac或trc系、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区域、针对糖酵解系酶(例如3-磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、谷氨酸脱羧酶A、丝氨酸羟甲基转移酶的启动子、T7噬菌体来源的RNA聚合酶的启动子区域等。在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中，可以利用HCE(高水平组成型表达)启动子、cspB启动子、sodA启动子和延伸因子(EF-Tu)启动子等。

作为终止子，可以利用T7终止子、rrnBT1T2终止子、lac终止子等。

除了启动子和终止子序列以外，作为其他调节元件，可以举出例如选择标记、扩增信号和复制起点等。关于适宜的调节元件，例如记载于”Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185”、Academic Press(1990)。

本发明中使用的宿主微生物可以是编码该微生物本来具有的酶的基因被破坏的微生物。作为编码该酶的基因，例如可以举出编码乳酸脱氢酶的ldh基因、编码乙酰CoA乙酰基转移酶的atoB基因、以及编码琥珀酰CoA合成酶α亚基的sucD基因。通过像这样使用宿主微生物本来具有的酶的基因中的一部分被破坏的宿主微生物，能够避免杂质的混入、抑制目标外反应的进行。具体地说，通过破坏编码乳酸脱氢酶的ldh基因，能够降低作为杂质的乳酸的生成。通过破坏编码乙酰CoA乙酰基转移酶的atoB基因、以及编码琥珀酰CoA合成酶α亚基的sucD基因，能够改善己二酸的收率。

上述说明的表达盒嵌入到例如由质粒、噬菌体、转座子、IS元件、噬粒、粘粒、或者线状或环状DNA等构成的载体中而被插入到宿主微生物中。优选质粒和噬菌体。这些载体在宿主微生物中可自体复制，也可以通过染色体复制。适宜的质粒例如为：大肠杆菌的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI；杆菌的pUB110、pC194或pBD214；棒状杆菌属的pSA77或pAJ667等。在芽孢杆菌属等的杆菌中可以举出pUB110、pC194或pBD214等。除了这些以外还能够使用的质粒等记载于“Gene Cloning and DNA nalysis6th edition”、Wiley-Blackwell(2016)中。表达盒向载体中的导入可通过包括利用适当的限制酶切割、克隆化以及连接的惯用方法进行。各个表达盒可以配置在1个载体上，也可以配置在2个或其以上的载体上。

本发明的另一方面涉及使用了上述重组微生物的目标化合物的制造方法。更具体地说，涉及包括对上述重组微生物进行培养的培养工序的目标化合物的制造方法。

此处，目标化合物选自由己二酸、己二酸衍生物、六亚甲基二胺、1,6-己二醇和6-氨基-1-己醇组成的组。作为己二酸衍生物，如上所述，例如可以举出3-氧代己二酸(3-OA)、乙酰丙酸(LEV)、3-羟基己二酸(3HA)和2,3-脱氢己二酸(23DA)。

在一个方式中，本发明中的重组微生物具有己二酸生产路径。这种情况下，本发明还涉及包括对该重组微生物进行培养的培养工序的己二酸的制造方法。

在一个方式中，本发明中的重组微生物具有六亚甲基二胺生产路径。这种情况下，本发明还涉及包括对该重组微生物进行培养的培养工序的六亚甲基二胺的制造方法。

在一个方式中，本发明中的重组微生物具有1,6-己二醇生产路径。这种情况下，本发明还涉及包括对该重组微生物进行培养的培养工序的1,6-己二醇的制造方法。

在一个方式中，本发明中的重组微生物具有6-氨基-1-己醇生产路径。这种情况下，本发明还涉及包括对该重组微生物进行培养的培养工序的6-氨基-1-己醇的制造方法。

在培养工序中，通过利用含有碳源和氮源的培养基对重组微生物进行培养，可得到包含菌体的培养物。本发明的基因重组微生物在适合于己二酸生产以及微生物的生长和维持的条件下进行培养，适宜的培养基组成、培养时间和培养条件可以由本领域技术人员容易地设定。

碳源可以举出D-葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、低聚糖、多糖、淀粉、纤维素、米糠、废糖蜜、油脂(例如大豆油、葵花籽油、花生油、椰子油等)、脂肪酸(例如棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸等)、醇(例如甘油、乙醇等)、有机酸(例如乙酸、乳酸、琥珀酸等)、玉米分解液、纤维素分解液、二氧化碳、一氧化碳等。优选为D-葡萄糖、蔗糖或甘油。这些碳源可以单独使用或者以混合物的形式使用。

使用生物物质来源的原料制造的己二酸可通过基于ISO16620-2或ASTM D6866中规定的碳-14(放射性碳)分析的生物基碳含量的测定，与例如来自石油、天然气体、煤炭等的合成原料明确区分。

氮源可以举出含氮有机化合物(例如蛋白胨、酪蛋白氨基酸、胰蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉、氨基酸和脲等)、或无机化合物(例如氨水溶液、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸钠、硝酸铵等)。这些氮源可以单独使用或者以混合物的形式使用。

培养可以为分批式、也可以为连续式。另外，在任一情况下，均可以为在培养的适当时刻追加补给上述碳源等的形式。进而，关于培养，可以一边控制合适的温度、氧浓度、pH等条件一边进行培养。来源于一般的微生物宿主细胞的转化体的合适的培养温度通常为15℃～45℃、优选为25℃～37℃的范围。宿主微生物为好氧性的情况下，为了确保发酵中的适当的氧浓度，可以进行振荡(烧瓶培养等)、搅拌/通气(发酵罐培养等)。这些培养条件可由本领域技术人员容易地设定。

本发明中的目标化合物的制造方法可以包括由培养物中将生成化合物分离精制出来的分离精制工序。该工序中可以使用任意的方法，例如使用离心分离、膜过滤、膜分离、析晶、提取、蒸馏、吸附、相分离和各种色谱法之类的方法，但并不限定于这些。分离精制工序可由一种工序构成，并且也可以由多个工序的组合构成。

接受了上述说明的本领域技术人员能够充分实施本发明。以下为了进一步进行说明而举出实施例，因此本发明并不限定于该实施例。

实施例

<1>发明A

以下基于实施例对本发明A进行说明，但本发明A并不被这些实施例所限定。

将实施例中使用的试样的氨基酸序列和碱基序列示于图2～15。

<C6化合物生产路径酶基因表达质粒的构建>

在PCR片段的扩增中，使用PrimeSTAR Max DNAPolymerase(产品名、Takara Bio制)或者KOD FX Neo(产品名、东洋纺制)，在质粒的制备中使用大肠杆菌JM109株。碱基序列的最佳化使用GeneArt Gene Optimizer(软件名、Thermo Fisher Scientific公司)、或者Eurofins Genomics公司的人工基因合成服务。

由大肠杆菌(Eshcherichia coli)W3110株(NBRC12713)基因组DNA进行克隆，取得编码大肠杆菌(Eshcherichia coli)的PaaJ(Ec)(序列编号1)的多核苷酸。将序列编号34和35的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到包含paaJ(Ec)基因的编码区域(序列编号33)的PCR产物。接下来，将pRSFDuet-1(产品名、Merck公司制造)作为模板，以序列编号36和37的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到pRSFDuet-1片段。将包含paaJ(Ec)基因编码区域的DNA片段与pRSFDuet-1片段使用In-Fusion(注册商标。以下省略)HD cloning kit(产品名、Clontech公司制造)进行连接。转化到大肠杆菌JM109株中，由所得到的转化体提取质粒。得到作为PaaJ(Ec)表达质粒的“paaJ(Ec)-pRSFDuet”。

由大肠杆菌(Eshcherichia coli)W3110株(NBRC12713)的基因组DNA进行克隆，取得编码大肠杆菌(Eshcherichia coli)的PaaH(Ec)(序列编号2)的多核苷酸。将序列编号39和40的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到包含paaH(Ec)基因的编码区域(序列编号38)的PCR产物。接下来，将“paaJ(Ec)-pRSFDuet”作为模板，以序列编号41和42的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到“paaJ(Ec)-pRSFDuet”片段。将包含paaH(Ec)基因编码区域的DNA片段与“paaJ(Ec)-pRSFDuet”片段使用In-Fusion HD cloning kit(产品名、Clontech公司制造)进行连接。转化到大肠杆菌JM109株中，由所得到的转化体提取质粒。取得作为PaaJ(Ec)、PaaH(Ec)共表达质粒的“paaJ(Ec)-paaH(Ec)-pRSFDuet”。

由大肠杆菌(Eshcherichia coli)W3110株(NBRC12713)基因组DNA进行克隆，取得编码大肠杆菌(Eshcherichia coli)的PaaF(Ec)(序列编号3)的多核苷酸。以序列编号44和45的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到包含paaF(Ec)基因的编码区域(序列编号43)的PCR产物。对于编码被使用序列编号4所示的核苷酸和序列编号46所示的核苷酸作为引物、以L3株的染色体DNA作为模板的PCR扩增物的碱基序列所编码的L3株的PaaF(L3)的核苷酸，进行用于大肠杆菌表达的碱基序列的最佳化，利用Eurofins Genomics公司的人工基因合成服务来取得该核苷酸。以序列编号47和48的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到包含paaF(L3)基因的编码区域的最佳化序列的PCR产物。以pETDuet-1(产品名、Merck公司制造)作为模板、以序列编号49和50的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到pETDuet-1片段。将包含paaF(Ec)、paaF(L3)各自的编码区域的DNA片段和pETDuet-1片段使用In-Fusion HD cloning kit(产品名、Clontech公司制造)进行连接。转化到大肠杆菌JM109株中，由所得到的转化体提取质粒。作为PaaF(Ec)表达质粒得到“paaF(Ec)-pETDuet”、作为PaaF(L3)表达质粒得到“paaF(L3)-pETDuet”。

对于编码贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)的dcaA(Ab)(序列编号5)的多核苷酸，进行用于大肠杆菌表达的碱基序列的最佳化，利用Eurofins Genomics公司的人工基因合成服务来取得该核苷酸。以序列编号52和53的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到包含dcaA(Ab)基因的编码区域(序列编号51)的PCR产物。以“paaF(Ec)-pETDuet”作为模板、以序列编号84和85的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到“paaF(Ec)-pETDuet”片段。将包含dcaA(Ab)基因的编码区域的DNA片段与“paaF(Ec)-pETDuet”片段使用In-Fusion HD cloningkit(产品名、Clontech公司制造)进行连接。转化到大肠杆菌JM109株中，由所得到的转化体提取质粒。得到作为PaaF(Ec)、DcaA(Ab)共表达质粒的“paaF(Ec)-dcaA(Ab)-pETDuet”。

对于热带念珠菌(Candida tropicalis)的Ter(Ct)(序列编号6)，以将N末端区域除去22个残基的序列(序列编号7)的形式进行克隆。对于所编码的多核苷酸，进行用于大肠杆菌表达的碱基序列的最佳化，利用Eurofins Genomics公司的人工基因合成服务取得该核苷酸。以序列编号55和56的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到包含ter(Ct)基因的编码区域(序列编号54)的PCR产物。以“paaF(L3)-pETDuet”作为模板、以序列编号84和85的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到“paaF(L3)-pETDuet”片段。将包含ter(Ct)基因的编码区域的DNA片段与“paaF(L3)-pETDuet”片段利用In-FusionHD cloning kit(产品名、Clontech公司制造)进行连接。转化到大肠杆菌JM109株中，由所得到的转化体提取质粒。得到作为PaaF(L3)、Ter(Ct)共表达质粒的“paaF(L3)-ter(Ct)-pETDuet”。

使用BLAST Search(https://www.genome.jp/tools/blast/)BLASTP，由KEGGGENES数据库中选择推测具有2,3-脱氢己二酰-CoA还原酶的功能的蛋白质。将所选择的候选酶蛋白示于表A-1。

[表A-1]

表A候选2,3-脱氢己二酰CoA还原酶蛋白

对于所选择的编码2,3-脱氢己二酰-CoA还原酶候选蛋白的多核苷酸，进行用于大肠杆菌表达的碱基序列的最佳化，利用Eurofins Genomics公司的人工基因合成服务取得该核苷酸，通过PCR得到包含各酶基因的编码区域的DNA片段。将各酶基因的编码区域的碱基序列与PCR中使用的引物组的碱基序列的序列编号示于表2。以“paaF(L3)-pETDuet”作为模板、以序列编号84和85的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到“paaF(L3)-pETDuet”片段。将包含各基因的编码区域的DNA片段与“paaF(L3)-pETDuet”片段使用In-Fusion HD cloningkit(产品名、Clontech公司制造)进行连接。转化到大肠杆菌JM109株中，由所得到的转化体提取质粒。得到PaaF(L3)与各2,3-脱氢己二酰-CoA还原酶候选蛋白的共表达质粒。

[表A-2]

表A-2:候选2,3-脱氢己二酰

还原酶基因碱基序列和引物组

对于脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)的羧酸还原酶MaCar(序列编号20)，以将氨基酸序列的第283位色氨酸残基置换成精氨酸残基、将第303位丙氨酸残基置换成蛋氨酸残基的突变体MaCar(m)的形式使用(序列编号22)。对于编码MaCar(m)的多核苷酸，进行用于大肠杆菌表达的碱基序列的最佳化，利用Eurofins Genomics公司的人工基因合成服务取得该核苷酸。以序列编号87和88的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到包含Macar(m)基因的编码区域(序列编号86)的PCR产物。

接着，使用In-Fusion HD cloning kit(产品名、Clontech公司制造)，将该PCR产物插入到pACYCDuet-1(产品名、Merck公司制造)的限制酶NdeI和AvrII切断部位间。转化到大肠杆菌JM109株中，由所得到的转化体提取质粒。得到作为MaCar(m)表达质粒的“Macar(m)-pACYCDuet”。

由艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)JCM18299株(通过日本文部科学省国家生物资源项目由理研BRC提供)的基因组DNA进行克隆来取得编码艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)的Npt(序列编号24)的多核苷酸。以序列编号90和91的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到包含npt基因的编码区域(序列编号89)的PCR产物。接下来，以“MaCar(m)-pACYCDuet”作为模板、以序列编号92和93的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到“Macar(m)-pACYCDuet”片段。将PCR产物彼此使用In-Fusion HD cloning kit(产品名、Clontech公司制造)进行连接。转化到大肠杆菌JM109株中，由所得到的转化体提取质粒。取得作为MaCar(m)、Npt共表达质粒的“Macar(m)-npt-pACYCDuet”。

由大肠杆菌(Eshcherichia coli)W3110株(NBRC12713)基因组DNA进行克隆，取得编码大肠杆菌(Eshcherichia coli)的Ahr(序列编号32)的多核苷酸。以序列编号95和96的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到包含ahr基因(序列编号94)的编码区域的PCR产物。接着以“Macar(m)-npt-pACYCDuet”作为模板、以序列编号97和98的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到“macar(m)-npt-pACYCDuet”片段。将包含各基因的编码区域的PCR产物与“macar(m)-npt-pACYCDuet”片段使用In-Fusion HD cloning kit(产品名、Clontech公司制造)进行连接。转化到大肠杆菌JM109株中，由所得到的转化体提取质粒。分别得到作为Ahr、MaCar、Npt共表达质粒的“ahr-macar(m)-npt-pACYCDuet”。

<C6化合物生产菌株的构建>

将所构建的质粒转化到大肠杆菌BL2l(DE3)株感受态细胞(Nippon Gene公司制造)中，涂布至包含氨苄青霉素钠50mg/L、卡那霉素硫酸盐30mg/L、(菌株HDOl的构建中进一步包含氯霉素30mg/L)的LB琼脂培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、氯化钠5g/L、琼脂末15g/L)，在37℃培养24小时，得到转化体的单个菌落。将所取得的转化体示于表A-3。

[表A-3]

表A-3：转化体

转化体	质粒①	质粒②	质粒③
				ADA1	paaJ(Ec)-paaH(Ec)-pRSFDuet	paaF(Ec)-dcaA(Ab)-pETDuet	-
ADA2	paaJ(Ec)-paaH(Ec)-pRSFDuet	paaF(L3)-ter(Ct)-pETDuet	-
				ADA3	paaJ(Ec)-paaH(Ec)-pRSFDuet	paaF(L3)-ter(caur)-pETDuet	-
ADA4	paaJ(Ec)-paaH(Ec)-pRSFDuet	paaF(L3)-ter(kmx)-pETDuet	-
				ADA5	paaJ(Ec)-paaH(Ec)-pRSFDuet	paaF(L3)-ter(pkz)-pETDuet	-
ADA6	paaJ(Ec)-paaH(Ec)-pRSFDuet	paaF(L3)-ter(mtm)-pETDuet	-
				ADA7	paaJ(Ec)-paaH(Ec)-pRSFDuet	paaF(L3)-ter(ttt)-pETDuet
ADA8	paaJ(Ec)-paaH(Ec)-pRSFDuet	paaF(L3)-ter(cthr)-pETDuet
				ADA9	paaJ(Ec)*paaH(Ec)-pRSFDuet	paaF(L3)-ter(pan)-pETDuet	-
ADA10	paaJ(Ec)-paaH(Ec)-pRSFDuet	paaF(L3)-ter(plj)-pETDuet	-
				ADA11	paaJ(Ec)-paaH(Ec)-pRSFDuet	paaF(L3)-ter(pte)-pETDuet	-
HDO1	paaJ(Ec)-paaH(Ec)-pRSFDuet	paaF(L3)-ter(mtm)-pETDuet	ahr-macar(m)-npt-pACYCDuet

<基于重组大肠杆菌培养的己二酸生产试验>

将一白金环的转化体ADA1～11接种到包含氨苄青霉素钠50mg/L、卡那霉素硫酸盐30mg/L的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、氯化钠5g/L)2mL(14mL容量的圆底试管)中，在37℃进行24小时振荡培养，得到前培养液。将所得到的前培养液10μL接种到包含氨苄青霉素钠50mg/L、卡那霉素硫酸盐30mg/L的MM培养基1mL(96孔深孔板)中，在37℃进行48小时振荡培养。将MM培养基的组成示于表A-4。

[表A-4]

表A-4:MM培养基组成

培养结束后，对培养液中的己二酸浓度进行分析。分析通过使用了三甲基甲硅烷基衍生物化的GC/MS分析来进行。在培养液离心上清40μL(按照作为内标的癸二酸二钠成为最终浓度10mM的方式添加)中添加按照水：甲醇：氯仿＝5:2:2(v/v/v)的方式混合而成的提取液360μL，利用涡流混合器充分搅拌。离心分离(16,000×g、5分钟)后，将上清40μL采集到另一微量管中，利用离心蒸发器离心干固1小时。在所得到的干固物中添加甲氧基胺盐酸盐20mg/mL吡啶溶液100μL，在30℃振荡90分钟。添加N-甲基-N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺50μL，在37℃振荡30分钟。将反应溶液作为GC/MS测定试样，在下述条件下进行分析。

GC/MS分析条件

装置：GCMS-QP-2020NX(岛津制作所制)

柱：熔融二氧化硅毛细管惰性处理管(长度1m、外径0.35mm、内径0.25mm、GLScience公司制造)、InertCap 5MS/NP(长度30m、内径0.25mm、膜厚0.25μm、GL Science公司制造)

试样注入量：1μL

试样导入法：分流(分流比25:1)

气化室温度：230℃

载气：氦

载气线速度：39.0cm/秒

烘箱温度：80℃、保持2分钟→15℃/分钟升温→325℃、保持13分钟

离子化法：电子离子化法(EI)

离子化能量：70eV

离子源温度：230℃

扫描范围：m/z＝50～500

将结果示于表A-5。转化体ADA1～ADA11为导入有可进行图1的步骤A、B、C、D的反应的酶基因的表达质粒的转化体。步骤E的反应通过大肠杆菌的内源性酶来进行。

在表达有大肠杆菌来源的PaaJ(Ec)、PaaH(Ec)、PaaF(Ec)、以及贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)来源的dcaA(Ab)的转化体ADA1的培养(比较例1)中，生成了0.14g/L的己二酸。在表达有大肠杆菌来源的PaaJ(Ec)、PaaH(Ec)、L3株来源的PaaF(L3)、以及热带念珠菌(Candida tropicalis)的Ter(Ct)的转化体ADA2的培养(比较例2)中，生成了0.33g/L的己二酸。

在表达有大肠杆菌来源的PaaJ(Ec)、PaaH(Ec)、L3株来源的PaaF(L3)、作为催化图1的步骤D的反应的酶的Ter(caur)、Ter(kmx)、Ter(pkz)、Ter(mtm)、Ter(ttt)、Ter(cthr)、Ter(pan)、Ter(plj)、或Ter(pte)的转化体ADA3～ADA11的培养(实施例1～9)中，分别生成己二酸，显示出Ter(caur)、Ter(kmx)、Ter(pkz)、Ter(mtm)、Ter(ttt)、Ter(cthr)、Ter(pan)、Ter(plj)、或Ter(pte)具有进行己二酸生产路径反应的酶活性。

另外，在转化体ADA6(实施例4)、ADA7(实施例5)、ADA8(实施例6)、ADA9(实施例7)和ADA11(实施例9)的培养中，生成了高于比较例的己二酸，显示出通过表达酶Ter(mtm)、Ter(ttt)、Ter(cthr)、Ter(pan)、或Ter(pte)而提高了C6化合物生成量。另外，由这些结果可知，作为实施例示出的微生物中显示出了良好的2,3-脱氢己二酰-CoA还原酶活性。

[表A-5]

表A-5:己二酸生产试验结果

<基于重组大肠杆菌培养的1,6-己二醇和6-羟基己酸生产试验>

将一白金环的转化体HDO1接种到包含氨苄青霉素钠50mg/L、卡那霉素硫酸盐30mg/L、氯霉素30mg/L的LB液体培养基2mL(14mL容量的圆底试管)中，在37℃进行24小时振荡培养，得到前培养液。将所得到的前培养液10μL接种到包含氨苄青霉素钠50mg/L、卡那霉素硫酸盐30mg/L、氯霉素30mg/L的MM培养基1mL(96孔深孔板)中，在37℃进行48小时振荡培养。

培养结束后，对培养液中的1,6-己二醇浓度、6-羟基己酸浓度进行分析。使用GC/MS，在与己二酸浓度分析同样的条件下对6-羟基己酸浓度进行分析。使用高效液相色谱仪Prominence系统(岛津制作所制)在下述条件下进行1,6-己二醇浓度的分析。

高效液相色谱法(HPLC)分析条件

检测器：差示折射率检测器

柱：Shim-Pack Fast-OA(G)、Fast-OA(岛津制作所制)

烘箱温度：40℃

流动相：8mM甲磺酸水溶液

流速：0.6mL/min

注入量：10μL

将结果示于表A-6。转化体HDO1是除了可进行图1的步骤A、B、C、D的反应的酶基因的表达质粒以外还导入有羧酸还原酶、醇脱氢酶的表达质粒的转化体。在转化体HDO1的培养(实施例10)中，生成了6-羟基己酸和1，6-己二醇。

[表A-6]

表A-6：6-羟基己酸和1，6-己二醇的生产试验结果

<基因破坏用质粒的构建>

在大肠杆菌的基因的破坏·插入中，使用pHAK1(于2019年3月18日以受理号NITEP-02919保藏在独立行政法人制品评价技术基础机构生物技术中心专利微生物保藏中心(NPMD)(地址：千叶县木更津市かずさ镰足2-5-8122号室)。国际保藏号：NITE BP-02919)通过同源重组法来进行。pHAK1包含温度敏感性突变型repA基因、卡那霉素抗性基因、枯草杆菌(Bacillus subtilis)来源的左聚糖蔗糖酶基因sacB。左聚糖蔗糖酶基因在蔗糖存在下对宿主微生物产生致死作用。PCR片段的扩增使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(产品名、Takara Bio制)或KOD FX Neo(产品名、东洋纺制)进行，质粒制备使用大肠杆菌HST08株进行。

以大肠杆菌BL21(DE3)株的基因组DNA作为模板，得到包含破坏靶基因的5’同源区域、编码区域、以及3’同源区域的PCR产物。将靶基因与引物序列的组合示于下述表A-7。

[表A-7]

表A-7：用于质粒构建的引物组

基因名	序列编号
		atoB	99，100
sucD	101，102
		IdhA	103，104
adhE	105，106
		yqhD，dkgA	107，108
yahK	109，110
		ahr	111，112
pflB	113，114

接着，使用In-Fusion HD cloning kit(产品名、Clontech公司制造)，将该PCR产物插入到使用序列编号115和116的引物扩增得到的pHAK1质粒片段中，进行环状化。转化到大肠杆菌HST08株中，由所得到的转化体提取质粒。

将上述提取的插入有破坏靶基因的5’同源区域、编码区域、以及3’同源区域的DNA片段的pHAK1质粒作为模板，使用下述表A-8中记载的引物进行PCR，除去破坏靶基因的编码区域的部分区域或全部区域，得到内含有5’同源区域和3’同源区域的pHAK1质粒片段。

[表A-8]

表A-8：用于质粒构建的引物组

基因名	序列编号
		atoB	117，118
sucD	119，120
		IdhA	121，122
adhE	123，124
		yqhD，dkgA	125，126
yahK	127，128
		ahr	129，130
pflB	131，132

将所得到的质粒片段通过末端磷酸化、自连接而进行环状化。转化到大肠杆菌HST08株中，由所得到的转化体提取质粒，得到基因破坏用质粒。

<六亚甲基二胺生产路径酶基因插入用质粒的构建>

关于编码大肠杆菌(Eshcherichia coli)的PaaJ(Ec)(序列编号1)的多核苷酸(序列编号33)，由大肠杆菌(Eshcherichia coli)W3110株(NBRC12713)基因组DNA进行克隆。关于编码大肠杆菌(Eshcherichia coli)的PaaH(Ec)(序列编号2)的多核苷酸(序列编号38)，由大肠杆菌(Eshcherichia coli)W3110株(NBRC12713)的基因组DNA进行克隆来取得。

对于paaJ(Ec)和paaH(Ec)基因，按照作为表达盒插入到pflB基因区域中的方式来设计基因插入用质粒。在内含在先前构建的pflB基因破坏用质粒中的pflB基因编码区域的5’同源区域与3’同源区域之间，插入了以启动子区域(序列编号133)、paaJ(Ec)基因编码区域、连接子序列(序列编号134)、paaH基因编码区域、终止子区域(序列编号135)的顺序配置的表达盒。

对于编码被使用序列编号4所示的核苷酸和序列编号46所示的核苷酸作为引物、以L3株的染色体DNA作为模板的PCR扩增物的碱基序列所编码的L3株的PaaF(L3)的核苷酸，进行用于大肠杆菌表达的碱基序列的最佳化，利用Eurofins Genomics公司的人工基因合成服务取得该核苷酸。对于编码被使用序列编号162所示的核苷酸和序列编号163所示的核苷酸作为引物、以L3株的染色体DNA作为模板的PCR扩增物的碱基序列所编码的L3株的MmgC(L3)的多核苷酸(1155bp)，进行用于大肠杆菌表达的碱基序列的最佳化，利用EurofinsGenomics公司的人工基因合成服务取得该核苷酸。

对于paaF(L3)和mmgC(L3)基因的编码区域的最佳化序列，按照作为表达盒插入到yahK基因区域中的方式来设计基因插入用质粒。在内含在先前构建的yahK基因破坏用质粒中的yahK基因编码区域的5’同源区域与3’同源区域之间，插入了以启动子区域(序列编号136)、paaF(L3)基因编码区域、连接子序列(序列编号137)、mmgC(L3)基因编码区域、终止子区域(序列编号138)的顺序配置的表达盒。

对于脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)的羧酸还原酶MaCar(序列编号20)，以将氨基酸序列的第283位的色氨酸残基置换成精氨酸残基、将第303位的丙氨酸残基置换成蛋氨酸残基的突变体MaCar(m)的形式使用(序列编号22)。对于编码MaCar(m)的多核苷酸(序列编号86)，进行用于大肠杆菌表达的碱基序列的最佳化，利用Eurofins Genomics公司的人工基因合成服务取得该核苷酸。对于编码艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)的Npt(序列编号24)的多核苷酸(序列编号89)，由艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis)JCM18299株(通过日本文部科学省国家生物资源项目由理研BRC提供)的基因组DNA进行克隆来取得该核苷酸。

对于macar(m)和npt基因，按照作为表达盒插入到ldhA基因区域中的方式来设计基因插入用质粒。在内含在先前构建的ldhA基因破坏用质粒中的ldhA基因编码区域的5’同源区域与3’同源区域之间，插入了以启动子区域(序列编号139)、macar(m)基因编码区域、连接子序列(序列编号140)、npt基因编码区域、终止子区域(序列编号141)的顺序配置的表达盒。

<大肠杆菌修饰株的构建>

通过电穿孔法(参照羊土社基因工程实验笔记田村隆明著)在大肠杆菌BL21(DE3)株中转化用于破坏或插入所期望的基因的质粒后，涂布至含有卡那霉素硫酸盐100mg/L的LB琼脂培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、氯化钠5g/L、琼脂末15g/L)，在30℃培养一夜，取得单个菌落，得到转化体。将一白金环的本转化体接种到含有卡那霉素硫酸盐100mg/L的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、氯化钠5g/L)1mL中，在30℃进行振荡培养。将所得到的培养液涂布至含有卡那霉素硫酸盐100mg/L的LB琼脂培养基，在42℃培养一夜，取得菌落。将一白金环所得到的菌落接种到LB液体培养基1mL中，在30℃进行振荡培养。将所得到的培养液涂布至含有蔗糖20％的LB琼脂培养基，在30℃培养2天。对于所得到的菌落，使用表A-9所示的引物组通过菌落直接PCR来确认所期望的基因的破坏或插入。

重复以上的操作，构建出表A-10所示的包含复数个基因破坏和基因插入的大肠杆菌株“No.060”。表中，Δ表示该酶基因缺损，“基因名A：：基因名B”表示基因A区域被置换成包含基因B的区域。

[表A-9]

表A-9：破坏·插入目标确认用引物组

基因名	序列编号
		atoB	142，143
sucD	144，145
		IdhA	146，147
adhE	148，149
		yqhD，dkgA	150，151
yahK	152，153
		ahr	154，155
pflB	156，157

[表A-10]

表A-1O：大肠杆菌修饰株

/>

<六亚甲基二胺生产路径酶基因表达质粒的构建>

在PCR片段的扩增中使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(产品名、Takara Bio制)或者KOD FXNeo(产品名、东洋纺制)，在质粒的制备中使用大肠杆菌JM109株。

大肠杆菌(Eshcherichia coli)的YgjG(序列编号27)使用一部分氨基酸序列被置换的突变型YgjG(m)(序列编号158)。关于编码YgjG(m)的多核苷酸，以序列编号160和161的寡核苷酸作为引物进行PCR，得到包含ygjG(m)基因(序列编号159)的编码区域的PCR产物。接着使用In-Fusion HD cloning kit(产品名、Clontech公司制造)将该PCR产物插入到pACYCDuet-1(产品名、Merck公司制造)的限制酶NcoI和HindIII切断部位间。转化到大肠杆菌JM109株中，由所得到的转化体提取质粒。得到作为MaCar(m)表达质粒的“ygjG(m)-pACYCDuet”。

<基于重组大肠杆菌培养的六亚甲基二胺生产试验>

将“paaF(L3)-ter(mtm)-pETDuet”和“ygjG(m)-pACYCDuet”通过电穿孔法转化到大肠杆菌修饰株No.060中，在包含氨苄青霉素钠50mg/L、氯霉素30mg/L的LB琼脂培养基上在37℃培养一天，形成菌落，得到转化体HMD1。将一白金环的转化体HMD1的菌落接种到包含氨苄青霉素钠50mg/L、氯霉素30mg/L的LB液体培养基2mL(14mL容量的圆底试管)中，在37℃进行3～5小时振荡培养，得到前培养液。在250mL容量的罐状培养装置(机种名BioJr.8、Biott公司制造)中在包含羧苄西林钠50mg/L、氯霉素30mg/L、IPTG 0.02mM的合成培养基(下表)中添加前培养液0.5mL，进行主培养。培养条件如下：培养温度37℃；培养pH 7.0；pH调整10％(w/v)氨水；搅拌750rpm；通气1vvm。在前培养液接种后经过了22小时的时刻追加添加葡萄糖以使其最终浓度为35g/L，培养至经过41小时为止。

[表A-11]

表A-11:合成培养基组成

培养结束后，将培养液通过离心分离而分离成菌体和上清，对上清中的六亚甲基二胺浓度进行分析。六亚甲基二胺浓度的分析使用离子色谱在下述条件下进行。

离子色谱分析条件

装置：ICS-3000(Dionex公司制造)

检测器：电导率检测器

柱：IonPac CG19(2×50mm)/CS19(2×250mm)(Thermo Scientific公司制造)

烘箱温度：30℃

流动相：8mM甲磺酸水溶液(A)、70mM甲磺酸水溶液(B)

梯度条件：(A:100％、B:0％)-(10min)-(A:0％、B:100％)-(保持1min)

流速：0.28mL/min

注入量：20μL

将结果示于表A-12中。转化体HMD1是除了可进行图1的步骤A、B、C、D的反应的酶基因以外还导入有羧酸还原酶、氨基转移酶基因的转化体。转化体HMD1的培养(实施例11)中生成了六亚甲基二胺。

[表A-12]

表A--12:六亚甲基二胺生产菌株的培养结果

<2>发明B

以下基于实施例说明本发明B，但本发明B并不被这些实施例所限定。

<伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株的分离和鉴定>

使用以己二酸作为唯一碳源和能量源的培养基，由日本国内的活性污泥中分离出伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株。伯克霍尔德菌属(Burkholderiasp.)LEBP-3株于2020年12月4日(原保藏日)向独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心NPMD)(地址：千叶县木更津市かずさ镰足2-5-8122号室)提交了保藏申请(受理号：NITE ABP-03334)，以“保藏号：NITE BP-03334”进行了国际保藏。伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株的分类性状如下所示。

<LEBP-3株的细菌学的各性质>

培养温度：37℃、

细胞形态：杆菌(0.7×1.7-3.0μm)、

革兰氏染色性：－、

芽孢的有无：－、

运动性：+、

LB琼脂培养基48h培养时的菌落形态：直径1.9～2.5mm、淡黄色、圆形、透镜状、全缘、平滑、不透明、黄油样、

30℃生长：+、

45℃生长：+、

过氧化氢酶反应：+、

氧化酶反应：+、

葡萄糖中的酸/气体产生：+/－、

O/F检测(氧化/发酵)：+/－、

硝酸盐还原性：－、

吲哚产生性：－、

葡萄糖酸性化性：－、

脲酶：不具有、

七叶苷分解性：+、

葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、葡萄糖酸、正癸酸、己二酸、苹果酸、柠檬酸和乙酸苯酯：能够同化、

麦芽糖：不能同化。

<基于LEBP-3株的16SrRNA基因序列同源性的系统分析>

通过进行16SrDNA基因的碱基序列分析来进行鉴定。将16SrDNA基因的碱基序列利用PCR扩增，进行序列分析。BLAST同源性检索的数据库使用DB-BA11.0(Techno SurugaLaboratory公司)和国际碱基序列数据库。其结果，LEBP-3株包含在由Burkhlderia属构成的聚类中，但显示出与任一已知种均不同的分子系统学的位置，因此未能进行种名的鉴定。

<基于PCR扩增的酶基因的取得和同源性评价>

实施伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株的全基因组草图分析。将LEBP-3株在2mL的LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、氯化钠10g/L)中实施37℃振荡培养。培养结束后，由培养液回收菌体，使用Nucleo Spin Tissue(产品名、MACHEREY-NAGEL公司制造)提取基因组DNA。实施伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株的全基因组草图分析和注释，鉴定出7679个开放阅读框(Open reading frame；ORF)。根据该信息，作为琥珀酰CoA:乙酰CoA酰基转移酶鉴定出paaJ(L3)，作为3-羟基己二酰CoA脱氢酶鉴定出paaH(L3)，作为3-羟基己二酰CoA脱水酶鉴定出paaF(L3)，作为2,3-脱氢己二酰CoA还原酶鉴定出mmgC(L3)。

将PaaJ(L3)序列作为查询序列实施BLAST检索的结果示于表B-1，将PaaH(L3)序列作为查询序列实施BLAST检索的结果示于表B-2，将PaaF(L3)序列作为查询序列实施BLAST检索的结果示于表B-3，将MmgC(L3)序列作为查询序列实施BLAST检索的结果示于表B-4。需要说明的是，序列检索时的数据库指定了“Refseq__Protein”。

[表B-1]

[表B-2]

[表B-3]

[表B-4]

根据上述结果，伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)LEBP-3株所具有的上述酶被鉴定为新序列。paaJ(L3)基因可以以序列编号164所示的核苷酸和序列编号165所示的核苷酸作为引物进行PCR扩增。paaH(L3)基因可以以序列编号166所示的核苷酸和序列编号167所示的核苷酸作为引物进行PCR扩增。paaF(L3)基因可以以序列编号168所示的核苷酸和序列编号169所示的核苷酸作为引物进行PCR扩增。mmgC(L3)基因可以以序列编号170所示的核苷酸和序列编号171所示的核苷酸作为引物进行PCR扩增。将PCR中使用的引物、各酶和编码酶的碱基序列示于图17～20。

PCR扩增条件的一例如下所示。酶使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(产品名、Takara Bio制)。将热处理98℃10秒、退火55℃15秒、延伸72℃5秒/kb的循环实施30次。作为引物使用的寡核苷酸各添加1μM添加。以液量为25μL实施扩增。

<表达取得酶基因的重组大肠杆菌的构建>

在PCR片段的扩增中使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(产品名、Takara Bio制)，在质粒的制备中使用大肠杆菌JM109株。在碱基序列的密码子最佳化中使用GeneArtGeneOptinizer(软件名、Thermo Fisher Scientific公司)或Eurofins Genomics公司的人工基因合成服务。

对于编码大肠杆菌(Eshcherichia coli)的PaaJ(Ec)的多核苷酸，由大肠杆菌(Eshcherichia coli)W3110株(NBRC12713)基因组DNA进行克隆。以序列编号188和189的寡核苷酸(图20A)作为引物进行PCR，得到包含paaJ(Ec)基因的编码区域(序列编号180)(图19A)的PCR扩增物。接下来，以pRSFDuet-1(产品名、Merck公司制造)作为模板、以序列编号190和191所示的核苷酸(图20A)作为引物进行PCR，得到pRSFDuet-1片段。将包含基因编码区域的DNA片段和pRSFDuet-1片段使用In-Fusion HD cloning kit(产品名、Clontech公司制造)进行连接。转化到大肠杆菌JM109株中，由所得到的转化体提取质粒。得到作为PaaJ(Ec)表达质粒的“prm203”。

对于编码大肠杆菌(Eshcherichia coli)的PaaH(Ec)的多核苷酸，由大肠杆菌(Eshcherichia coli)W3110株(NBRC12713)的基因组DNA进行克隆。以序列编号192和193所示的核苷酸(图20A)作为引物进行PCR，得到包含paaH(Ec)基因的编码区域(序列编号181)(图19A)的PCR扩增物。接下来，以prm203作为模板、以序列编号194和195所示的核苷酸(图20A)作为引物进行PCR，得到prm203片段。将包含各基因编码区域的DNA片段与prm203片段使用In-Fusion HD cloning kit(产品名、Clontech公司制造)进行连接。转化到大肠杆菌JM109株中，由所得到的转化体提取质粒。得到作为PaaJ(Ec)-PaaH(Ec)表达质粒的“prm69”。

对于编码大肠杆菌(Eshcherichia coli)的PaaF(Ec)的多核苷酸，由大肠杆菌(Eshcherichia coli)W3110株(NBRC12713)基因组DNA进行克隆。以序列编号196和197所示的核苷酸(图20A)作为引物进行PCR，得到包含paaF(Ec)基因的编码区域(序列编号182)(图19A)的PCR扩增物。对于编码L3株的PaaF(L3)的多核苷酸，进行用于大肠杆菌表达的碱基序列的最佳化，利用Eurofins Genomics公司的人工基因合成服务取得该核苷酸。以序列编号198和199所示的核苷酸(图20A)作为引物进行PCR，得到包含paaF(L3)基因的编码区域的PCR扩增物。以pETDuet-1(产品名、Merck公司制造)作为模板、以序列编号204和205所示的核苷酸(图20A)作为引物进行PCR，得到pETDuet-1片段。将包含各基因的编码区域的DNA片段与pETDuet-1片段使用In-Fusion HD cloning kit(产品名、Clontech公司制造)进行连接。转化到大肠杆菌JM109株中，由所得到的转化体提取质粒。作为PaaF(Ec)表达质粒得到“prm74”、作为PaaF(L3)表达质粒得到“prm194”。

对于编码贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)的dcaA(Ab)、褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的Tfu1647、L3株的MmgC(L3)的多核苷酸，进行用于大肠杆菌表达的碱基序列的最佳化，利用Eurofins Genomics公司的人工基因合成服务取得该核苷酸。对于dcaA(Ab)基因(序列编号185)(图19B)，以序列编号206和207所示的核苷酸(图20A)作为引物进行PCR，对于褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的Tfu1647基因(序列编号186)(图19B)，以序列编号208和209所示的核苷酸(图20A)作为引物进行PCR，对于mmgC5(L3)基因，以序列编号210和211(图20A)所示的核苷酸作为引物进行PCR，分别得到包含dcaA(Ab)、Tfu1647、mmgC5(L3)各基因的编码区域的PCR扩增物。以prm74和prm194作为模板、以序列编号212和213所示的核苷酸(图20A)作为引物进行PCR，分别得到prm74片段和prm194片段。将包含各基因的编码区域的DNA片段与prm74片段和prm194片段使用In-Fusion HD cloningkit(产品名、Clontech公司制造)进行连接。转化到大肠杆菌JM109株中，由所得到的转化体提取质粒。分别得到作为PaaF(Ec)-dcaA(Ab)表达质粒的“prm127”、作为PaaF(Ec)-mmgC(L3)表达质粒的“prm234”、作为PaaF(L3)-mmgC(L3)表达质粒的“prm166”。

对于编码贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)的tesB(Ab)的多核苷酸，以序列编号214和215所示的核苷酸(图20A)作为引物由贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)的染色体DNA进行PCR，分别得到包含tesB(Ab)基因的编码区域的PCR扩增物。以pCDFDuet-1作为模板、以序列编号216和217所示的核苷酸(图20A)作为引物进行PCR，得到pCDFDuet-1片段。将包含各tesB(Ab)基因编码区域的DNA片段与pCDFDuet-1片段使用In-Fusion HDcloning kit(产品名、Clontech公司制造)进行连接。转化到大肠杆菌JM109株中，由所得到的转化体提取质粒。得到作为TesB(Ab)表达质粒的“prm92”。

如下所述制作大肠杆菌BL21(DE3)株的基因破坏株。编码乳酸脱氢酶的ldh基因、编码乙酰CoA乙酰基转移酶的atoB基因、以及编码琥珀酰CoA合成酶α亚基的sucD基因的破坏通过使用pHAK1(于2019年3月18日以受理号NITE P-02919保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构生物技术中心专利微生物保藏中心(NPMD)(地址：千叶县木更津市かずさ镰足2-5-8 122号室)。国际保藏号：NITE BP-02919)的同源重组法进行。pHAK1包含温度敏感性突变型repA基因、卡那霉素抗性基因、枯草杆菌(Bacillus subtilis)来源的左聚糖蔗糖酶基因SacB。左聚糖蔗糖酶基因在蔗糖存在下对宿主微生物产生致死作用。PCR片段的扩增使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(产品名、Takara Bio制)进行，质粒制备使用大肠杆菌HST08株进行。

以大肠杆菌BL21(DE3)株的基因组DNA作为模板，得到包含破坏靶基因的上游区域、编码区域、以及下游区域的PCR扩增物。对于ldh基因周边区域，以序列编号218和219所示的核苷酸(图20B)作为引物进行PCR，对于atoB基因周边区域，以序列编号220和221所示的核苷酸(图20B)作为引物进行PCR，对于sucD基因周边区域，以序列编号222和223所示的核苷酸(图20B)作为引物进行PCR，得到各片段。

接着，使用In-Fusion HD cloning kit(产品名、Clontech公司制造)，将该PCR扩增物插入到使用序列编号224和225所示的引物(图20B)扩增得到的pHAK1质粒片段中，进行环状化。

以所得到的插入有破坏靶基因的上游区域、编码区域、以及下游区域的DNA片段的pHAK1质粒作为模板，对于ldh基因周边区域，以序列编号226和227所示的核苷酸(图20B)作为引物进行PCR，对于atoB基因周边区域，以序列编号228和229所示的核苷酸(图20B)作为引物进行PCR，对于sucD基因周边区域，以序列编号230和231所示的核苷酸作为引物(图20B)进行PCR，得到除去了破坏靶基因的编码区域的一部分区域或全部区域的质粒片段。

对所得到的质粒片段通过末端磷酸化、自连接而进行环状化，得到基因破坏用质粒。

通过氯化钙法(参照羊土社基因工程实验笔记田村隆明著)在大肠杆菌BL21(DE3)株中转化用于破坏所期望的基因的质粒后，涂布至含有卡那霉素硫酸盐100mg/L的LB琼脂培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、氯化钠5g/L、琼脂末15g/L)，在30℃培养一夜，取得单个菌落，得到转化体。将一白金环的该转化体接种到含有卡那霉素硫酸盐100mg/L的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、氯化钠5g/L)1mL中，在30℃进行振荡培养。将所得到的培养液涂布至含有卡那霉素硫酸盐100mg/L的LB琼脂培养基，在42℃培养一夜。对于所得到的菌落，通过单交换将质粒插入到基因组中。将一白金环的菌落接种到LB液体培养基1mL中，在30℃进行振荡培养。将所得到的培养液涂布至含有蔗糖10％的LB琼脂培养基，培养一夜。对于所得到的菌落，通过菌落直接PCR来确认所期望的基因的破坏。首先构建ldh基因破坏株，以该ldh基因破坏株为基础构建atoB基因破坏株，进一步以ldh、atoB双重破坏株为基础构建sucD基因破坏株。将所制作的ldh、atoB、sucD基因的三重破坏株作为ASL000株。

将所构建的质粒转化到ASL000株中，涂布至包含氨苄青霉素钠50mg/L、卡那霉素硫酸盐30mg/L、链霉素硫酸盐50mg/L的LB琼脂培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、氯化钠5g/L、琼脂末15g/L)，在37℃培养24小时，得到转化体的单个菌落。将所取得的转化体示于表B-5。

[表B-5]

<基于表达取得酶基因的重组大肠杆菌的己二酸生产试验>

将一白金环的表B-5所示的菌株接种到包含氨苄青霉素钠50mg/L、卡那霉素硫酸盐30mg/L和链霉素硫酸盐50mg/L的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、氯化钠5g/L)2mL(14mL容量的圆底试管)中，在37℃进行24小时振荡培养，得到前培养液。将上述得到的前培养液10μL接种在包含氨苄青霉素钠50mg/L、卡那霉素硫酸盐30mg/L和链霉素硫酸盐50mg/L的MM培养基1mL(96孔深孔板)中，在37℃进行48小时振荡培养。

将MM培养基的组成示于表B-6。

[表B-6]

MM培养基

培养结束后，对培养液中的己二酸和己二酸类似物的浓度进行分析。分析通过使用了三甲基甲硅烷基衍生物化的GC/MS分析来进行。在培养液离心上清40μL(按照作为内标的癸二酸二钠成为最终浓度10mM的方式添加)中添加按照水：甲醇：氯仿＝5:2:2(v/v/v)进行混合而成的提取液360μL，充分混合。离心分离(16,000×g、5分钟)后，将上清100μL采集到另一微量管中，利用离心蒸发器进行1小时离心浓缩。在所得到的干固物中添加甲氧基胺盐酸盐20mg/mL吡啶溶液100μL，在30℃振荡90分钟。添加N-甲基-N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺50μL，在37℃振荡30分钟。将反应溶液作为GC/MS测定试样，在下述条件下进行分析。

GC/MS分析条件

装置：GCMS-QP-2020NX(岛津制作所制)

试样注入量：1μL

试样导入法：分流(分流比25:1)

气化室温度：230℃

载气：氦

载气线速度：39.0cm/秒

离子化法：电子离子化法(EI)

离子化能量：70eV

离子源温度：230℃

扫描范围：m/z＝50～500

注入量：1μL

将结果示于表B-7。表中，“3OA”表示3-氧代己二酸，“LEV”表示乙酰丙酸，“3HA”表示3-羟基己二酸，“23DA”表示2,3-脱氢己二酸，“ADA”表示己二酸。

[表B-7]

在表达了L3株来源的PaaF(L3)和mmgC(L3)这两者的发明株、即ADA500株和ADA496株中，3-氧代己二酸(3-OA)、乙酰丙酸(LEV)、3-羟基己二酸(3HA)、2,3-脱氢己二酸(23DA)和己二酸(ADA)生成得比对照株多，以它们的合计值计分别生成了355mg/L和613mg/L。根据以上的结果显示出，被这些基因所编码的酶具有进行己二酸路径反应的高活性，提高己二酸和己二酸衍生物的生成量。

工业实用性

本发明能够提供例如C6化合物的有效的制造工艺，期待其在工业规模的生产中的应用。

本发明还适合用于由生物物质原料直接进行己二酸类的发酵生产。

序列表

<110> 旭化成株式会社

<120> 重组微生物和C6化合物的制造方法

<130> 210089WO01

<150> JP2021-069632

<151> 2021-04-16

<150> JP2021-057325

<151> 2021-03-30

<160> 251

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 401

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 1

Met Arg Glu Ala Phe Ile Cys Asp Gly Ile Arg Thr Pro Ile Gly Arg

1 5 10 15

Tyr Gly Gly Ala Leu Ser Ser Val Arg Ala Asp Asp Leu Ala Ala Ile

20 25 30

Pro Leu Arg Glu Leu Leu Val Arg Asn Pro Arg Leu Asp Ala Glu Cys

35 40 45

Ile Asp Asp Val Ile Leu Gly Cys Ala Asn Gln Ala Gly Glu Asp Asn

50 55 60

Arg Asn Val Ala Arg Met Ala Thr Leu Leu Ala Gly Leu Pro Gln Ser

65 70 75 80

Val Ser Gly Thr Thr Ile Asn Arg Leu Cys Gly Ser Gly Leu Asp Ala

85 90 95

Leu Gly Phe Ala Ala Arg Ala Ile Lys Ala Gly Asp Gly Asp Leu Leu

100 105 110

Ile Ala Gly Gly Val Glu Ser Met Ser Arg Ala Pro Phe Val Met Gly

115 120 125

Lys Ala Ala Ser Ala Phe Ser Arg Gln Ala Glu Met Phe Asp Thr Thr

130 135 140

Ile Gly Trp Arg Phe Val Asn Pro Leu Met Ala Gln Gln Phe Gly Thr

145 150 155 160

Asp Ser Met Pro Glu Thr Ala Glu Asn Val Ala Glu Leu Leu Lys Ile

165 170 175

Ser Arg Glu Asp Gln Asp Ser Phe Ala Leu Arg Ser Gln Gln Arg Thr

180 185 190

Ala Lys Ala Gln Ser Ser Gly Ile Leu Ala Glu Glu Ile Val Pro Val

195 200 205

Val Leu Lys Asn Lys Lys Gly Val Val Thr Glu Ile Gln His Asp Glu

210 215 220

His Leu Arg Pro Glu Thr Thr Leu Glu Gln Leu Arg Gly Leu Lys Ala

225 230 235 240

Pro Phe Arg Ala Asn Gly Val Ile Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Val

245 250 255

Asn Asp Gly Ala Ala Ala Leu Ile Ile Ala Ser Glu Gln Met Ala Ala

260 265 270

Ala Gln Gly Leu Thr Pro Arg Ala Arg Ile Val Ala Met Ala Thr Ala

275 280 285

Gly Val Glu Pro Arg Leu Met Gly Leu Gly Pro Val Pro Ala Thr Arg

290 295 300

Arg Val Leu Glu Arg Ala Gly Leu Ser Ile His Asp Met Asp Val Ile

305 310 315 320

Glu Leu Asn Glu Ala Phe Ala Ala Gln Ala Leu Gly Val Leu Arg Glu

325 330 335

Leu Gly Leu Pro Asp Asp Ala Pro His Val Asn Pro Asn Gly Gly Ala

340 345 350

Ile Ala Leu Gly His Pro Leu Gly Met Ser Gly Ala Arg Leu Ala Leu

355 360 365

Ala Ala Ser His Glu Leu His Arg Arg Asn Gly Arg Tyr Ala Leu Cys

370 375 380

Thr Met Cys Ile Gly Val Gly Gln Gly Ile Ala Met Ile Leu Glu Arg

385 390 395 400

Val

<210> 2

<211> 475

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 2

Met Met Ile Asn Val Gln Thr Val Ala Val Ile Gly Ser Gly Thr Met

1 5 10 15

Gly Ala Gly Ile Ala Glu Val Ala Ala Ser His Gly His Gln Val Leu

20 25 30

Leu Tyr Asp Ile Ser Ala Glu Ala Leu Thr Arg Ala Ile Asp Gly Ile

35 40 45

His Ala Arg Leu Asn Ser Arg Val Thr Arg Gly Lys Leu Thr Ala Glu

50 55 60

Thr Cys Glu Arg Thr Leu Lys Arg Leu Ile Pro Val Thr Asp Ile His

65 70 75 80

Ala Leu Ala Ala Ala Asp Leu Val Ile Glu Ala Ala Ser Glu Arg Leu

85 90 95

Glu Val Lys Lys Ala Leu Phe Ala Gln Leu Ala Glu Val Cys Pro Pro

100 105 110

Gln Thr Leu Leu Thr Thr Asn Thr Ser Ser Ile Ser Ile Thr Ala Ile

115 120 125

Ala Ala Glu Ile Lys Asn Pro Glu Arg Val Ala Gly Leu His Phe Phe

130 135 140

Asn Pro Ala Pro Val Met Lys Leu Val Glu Val Val Ser Gly Leu Ala

145 150 155 160

Thr Ala Ala Glu Val Val Glu Gln Leu Cys Glu Leu Thr Leu Ser Trp

165 170 175

Gly Lys Gln Pro Val Arg Cys His Ser Thr Pro Gly Phe Ile Val Asn

180 185 190

Arg Val Ala Arg Pro Tyr Tyr Ser Glu Ala Trp Arg Ala Leu Glu Glu

195 200 205

Gln Val Ala Ala Pro Glu Val Ile Asp Ala Ala Leu Arg Asp Gly Ala

210 215 220

Gly Phe Pro Met Gly Pro Leu Glu Leu Thr Asp Leu Ile Gly Gln Asp

225 230 235 240

Val Asn Phe Ala Val Thr Cys Ser Val Phe Asn Ala Phe Trp Gln Glu

245 250 255

Arg Arg Phe Leu Pro Ser Leu Val Gln Gln Glu Leu Val Ile Gly Gly

260 265 270

Arg Leu Gly Lys Lys Ser Gly Leu Gly Val Tyr Asp Trp Arg Ala Glu

275 280 285

Arg Glu Ala Val Val Gly Leu Glu Ala Val Ser Asp Ser Phe Ser Pro

290 295 300

Met Lys Val Glu Lys Lys Ser Asp Gly Val Thr Glu Ile Asp Asp Val

305 310 315 320

Leu Leu Ile Glu Thr Gln Gly Glu Thr Ala Gln Ala Leu Ala Ile Arg

325 330 335

Leu Ala Arg Pro Val Val Val Ile Asp Lys Met Ala Gly Lys Val Val

340 345 350

Thr Ile Ala Ala Ala Ala Val Asn Pro Asp Ser Ala Thr Arg Lys Ala

355 360 365

Ile Tyr Tyr Leu Gln Gln Gln Gly Lys Thr Val Leu Gln Ile Ala Asp

370 375 380

Tyr Pro Gly Met Leu Ile Trp Arg Thr Val Ala Met Ile Ile Asn Glu

385 390 395 400

Ala Leu Asp Ala Leu Gln Lys Gly Val Ala Ser Glu Gln Asp Ile Asp

405 410 415

Thr Ala Met Arg Leu Gly Val Asn Tyr Pro Tyr Gly Pro Leu Ala Trp

420 425 430

Gly Ala Gln Leu Gly Trp Gln Arg Ile Leu Arg Leu Leu Glu Asn Leu

435 440 445

Gln His His Tyr Gly Glu Glu Arg Tyr Arg Pro Cys Ser Leu Leu Arg

450 455 460

Gln Arg Ala Leu Leu Glu Ser Gly Tyr Glu Ser

465 470 475

<210> 3

<211> 255

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 3

Met Ser Glu Leu Ile Val Ser Arg Gln Gln Arg Val Leu Leu Leu Thr

1 5 10 15

Leu Asn Arg Pro Ala Ala Arg Asn Ala Leu Asn Asn Ala Leu Leu Met

20 25 30

Gln Leu Val Asn Glu Leu Glu Ala Ala Ala Thr Asp Thr Ser Ile Ser

35 40 45

Val Cys Val Ile Thr Gly Asn Ala Arg Phe Phe Ala Ala Gly Ala Asp

50 55 60

Leu Asn Glu Met Ala Glu Lys Asp Leu Ala Ala Thr Leu Asn Asp Thr

65 70 75 80

Arg Pro Gln Leu Trp Ala Arg Leu Gln Ala Phe Asn Lys Pro Leu Ile

85 90 95

Ala Ala Val Asn Gly Tyr Ala Leu Gly Ala Gly Cys Glu Leu Ala Leu

100 105 110

Leu Cys Asp Val Val Val Ala Gly Glu Asn Ala Arg Phe Gly Leu Pro

115 120 125

Glu Ile Thr Leu Gly Ile Met Pro Gly Ala Gly Gly Thr Gln Arg Leu

130 135 140

Ile Arg Ser Val Gly Lys Ser Leu Ala Ser Lys Met Val Leu Ser Gly

145 150 155 160

Glu Ser Ile Thr Ala Gln Gln Ala Gln Gln Ala Gly Leu Val Ser Asp

165 170 175

Val Phe Pro Ser Asp Leu Thr Leu Glu Tyr Ala Leu Gln Leu Ala Ser

180 185 190

Lys Met Ala Arg His Ser Pro Leu Ala Leu Gln Ala Ala Lys Gln Ala

195 200 205

Leu Arg Gln Ser Gln Glu Val Ala Leu Gln Ala Gly Leu Ala Gln Glu

210 215 220

Arg Gln Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Thr Glu Asp Arg His Glu Gly

225 230 235 240

Ile Ser Ala Phe Leu Gln Lys Arg Thr Pro Asp Phe Lys Gly Arg

245 250 255

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

atgcaaacca tcgaaaacga ag 22

<210> 5

<211> 384

<212> PRT

<213> 贝氏不动杆菌

<400> 5

Met Ile Arg Asp Glu Gly Met Leu Gln Gln Leu Leu Ser Thr Ile Arg

1 5 10 15

Asp Phe Val Lys Asn Glu Leu Ile Pro Arg Glu His Glu Val Ala Glu

20 25 30

Lys Asp Cys Ile Pro Glu Asp Ile Ile Gln Gln Met Arg Glu Leu Gly

35 40 45

Leu Phe Gly Leu Thr Ile Pro Glu Glu Tyr Gly Gly Leu Gly Ile Thr

50 55 60

Met Glu Glu Glu Val Asn Val Ala Phe Glu Leu Gly Gln Thr Ser Pro

65 70 75 80

Ala Phe Arg Ser Leu Ile Gly Thr Asn Asn Gly Ile Gly Ser Ser Gly

85 90 95

Leu Ile Ile Asp Gly Thr Glu Glu Gln Lys Gln Lys Tyr Leu Pro Arg

100 105 110

Tyr Ala Ser Gly Glu Ile Ile Gly Ser Phe Cys Leu Thr Glu Pro Glu

115 120 125

Ala Gly Ser Asp Ala Ala Ser Leu Lys Thr Thr Ala Val Lys Asp Gly

130 135 140

Asp Phe Tyr Ile Leu Asn Gly Thr Lys Arg Phe Ile Thr Asn Ala Pro

145 150 155 160

His Ala Ala Thr Phe Thr Val Met Ala Arg Thr Asn Pro Ala Ile Lys

165 170 175

Gly Ala Gly Gly Ile Ser Ala Phe Leu Val Glu Ala Asn Thr Pro Gly

180 185 190

Ile Thr Leu Gly Lys Ile Asp Gln Lys Met Gly Gln Lys Gly Ser His

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Thr Cys Asp Val Ile Phe Glu Asn Cys Arg Val Pro Ala Ser Ala Leu

210 215 220

Ile Gly Gly Val Glu Gly Val Gly Phe Lys Thr Ala Met Lys Val Leu

225 230 235 240

Asp Lys Gly Arg Leu His Ile Gly Ala Tyr Ser Val Gly Val Ala Glu

245 250 255

Arg Met Leu Asn Asp Ala Leu His Tyr Ala Val Glu Arg Lys Gln Phe

260 265 270

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Ser Lys Ala Glu Ile Tyr Ala Ala Lys Cys Met Val Leu Asp Ala Ala

290 295 300

Arg Arg Arg Asp Glu Gly Gln Asn Ile Ser Thr Glu Ala Ser Cys Ala

305 310 315 320

Lys Met Phe Ala Thr Glu Met Cys Gly Arg Val Ala Asp Arg Cys Val

325 330 335

Gln Ile His Gly Gly Ala Gly Tyr Ile Ser Glu Tyr Ser Ile Glu Arg

340 345 350

Phe Tyr Arg Asp Val Arg Leu Phe Arg Leu Tyr Glu Gly Thr Thr Gln

355 360 365

Val Gln Gln Ile Ile Ile Ala Lys Asn Met Ile Lys Glu Val Thr Ser

370 375 380

<210> 6

<211> 386

<212> PRT

<213> 热带念珠菌

<400> 6

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1 5 10 15

His Asn Gln Phe Arg Thr Met Ile Thr Ala Gln Ala Val Leu Tyr Thr

20 25 30

Gln His Gly Glu Pro Lys Asp Val Leu Phe Thr Gln Ser Phe Glu Ile

35 40 45

Asp Asp Asp Asn Leu Ala Pro Asn Glu Val Ile Val Lys Thr Leu Gly

50 55 60

Ser Pro Val Asn Pro Ser Asp Ile Asn Gln Ile Gln Gly Val Tyr Pro

65 70 75 80

Ser Lys Pro Ala Lys Thr Thr Gly Phe Gly Thr Thr Glu Pro Ala Ala

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Pro Cys Gly Asn Glu Gly Leu Phe Glu Val Ile Lys Val Gly Ser Asn

100 105 110

Val Ser Ser Leu Glu Ala Gly Asp Trp Val Ile Pro Ser His Val Asn

115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

Leu Thr Ile Asn Gln Gly Ala Thr Ile Ser Val Asn Pro Leu Thr Ala

165 170 175

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Phe Ile Gln Asn Gly Gly Thr Ser Ala Val Gly Lys Tyr Ala Ser Gln

195 200 205

Ile Gly Lys Leu Leu Asn Phe Asn Ser Ile Ser Val Ile Arg Asp Arg

210 215 220

Pro Asn Leu Asp Glu Val Val Ala Ser Leu Lys Glu Leu Gly Ala Thr

225 230 235 240

Gln Val Ile Thr Glu Asp Gln Asn Asn Ser Arg Glu Phe Gly Pro Thr

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Asn Asn Gly Leu Met Leu Thr Tyr Gly Gly Met Ser Phe Gln Pro Val

290 295 300

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305 310 315 320

Phe Trp Val Thr Glu Leu Leu Lys Asn Asn Lys Glu Leu Lys Thr Ser

325 330 335

Thr Leu Asn Gln Ile Ile Ala Trp Tyr Glu Glu Gly Lys Leu Thr Asp

340 345 350

Ala Lys Ser Ile Glu Thr Leu Tyr Asp Gly Thr Lys Pro Leu His Glu

355 360 365

Leu Tyr Gln Asp Gly Val Ala Asn Ser Lys Asp Gly Lys Gln Leu Ile

370 375 380

Thr Tyr

385

<210> 7

<211> 364

<212> PRT

<213> 热带念珠菌

<400> 7

Met Ile Thr Ala Gln Ala Val Leu Tyr Thr Gln His Gly Glu Pro Lys

1 5 10 15

Asp Val Leu Phe Thr Gln Ser Phe Glu Ile Asp Asp Asp Asn Leu Ala

20 25 30

Pro Asn Glu Val Ile Val Lys Thr Leu Gly Ser Pro Val Asn Pro Ser

35 40 45

Asp Ile Asn Gln Ile Gln Gly Val Tyr Pro Ser Lys Pro Ala Lys Thr

50 55 60

Thr Gly Phe Gly Thr Thr Glu Pro Ala Ala Pro Cys Gly Asn Glu Gly

65 70 75 80

Leu Phe Glu Val Ile Lys Val Gly Ser Asn Val Ser Ser Leu Glu Ala

85 90 95

Gly Asp Trp Val Ile Pro Ser His Val Asn Phe Gly Thr Trp Arg Thr

100 105 110

His Ala Leu Gly Asn Asp Asp Asp Phe Ile Lys Leu Pro Asn Pro Ala

115 120 125

Gln Ser Lys Ala Asn Gly Lys Pro Asn Gly Leu Thr Ile Asn Gln Gly

130 135 140

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145 150 155 160

Tyr Val Lys Leu Thr Pro Gly Lys Asp Trp Phe Ile Gln Asn Gly Gly

165 170 175

Thr Ser Ala Val Gly Lys Tyr Ala Ser Gln Ile Gly Lys Leu Leu Asn

180 185 190

Phe Asn Ser Ile Ser Val Ile Arg Asp Arg Pro Asn Leu Asp Glu Val

195 200 205

Val Ala Ser Leu Lys Glu Leu Gly Ala Thr Gln Val Ile Thr Glu Asp

210 215 220

Gln Asn Asn Ser Arg Glu Phe Gly Pro Thr Ile Lys Glu Trp Ile Lys

225 230 235 240

Gln Ser Gly Gly Glu Ala Lys Leu Ala Leu Asn Cys Val Gly Gly Lys

245 250 255

Ser Ser Thr Gly Ile Ala Arg Lys Leu Asn Asn Asn Gly Leu Met Leu

260 265 270

Thr Tyr Gly Gly Met Ser Phe Gln Pro Val Thr Ile Pro Thr Ser Leu

275 280 285

Tyr Ile Phe Lys Asn Phe Thr Ser Ala Gly Phe Trp Val Thr Glu Leu

290 295 300

Leu Lys Asn Asn Lys Glu Leu Lys Thr Ser Thr Leu Asn Gln Ile Ile

305 310 315 320

Ala Trp Tyr Glu Glu Gly Lys Leu Thr Asp Ala Lys Ser Ile Glu Thr

325 330 335

Leu Tyr Asp Gly Thr Lys Pro Leu His Glu Leu Tyr Gln Asp Gly Val

340 345 350

Ala Asn Ser Lys Asp Gly Lys Gln Leu Ile Thr Tyr

355 360

<210> 8

<211> 388

<212> PRT

<213> 耳念珠菌

<400> 8

Met Phe Val Pro Thr Val Ala Gly Lys Arg Phe Leu Thr Asn Gln Leu

1 5 10 15

Arg Lys Ser Pro Gln Phe Thr Arg Met Leu Thr Ser His Ala Val Ile

20 25 30

Phe Ser Ser His Gly Glu Pro Lys Asp Val Leu Lys Thr His Thr Tyr

35 40 45

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50 55 60

Leu Gly Ala Pro Val Asn Pro Ser Asp Ile Asn Gln Val Gln Gly Val

65 70 75 80

Tyr Pro Ser Gln Pro Glu Lys Thr Thr Gln Leu Gly Thr Ser Glu Pro

85 90 95

Ser Ala Val Gly Gly Asn Glu Gly Leu Phe Glu Ile Ile Lys Ile Gly

100 105 110

Ser Asp Val Lys Gly Phe Gln Val Gly Asp Trp Ala Ile Pro Thr Ser

115 120 125

Val Asn Phe Gly Thr Trp Arg Ser His Ala Leu Cys Glu Glu Gly Lys

130 135 140

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Thr Ala Tyr Leu Met Leu Thr His Tyr Val Lys Leu Thr Pro Gly Lys

180 185 190

Asp Trp Phe Ile Gln Asn Gly Gly Asn Ser Ala Val Gly Lys Phe Ala

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Ser Gln Ile Gly Lys Leu Leu Gly Ile His Ser Ile Ser Val Val Arg

210 215 220

Asp Arg Pro Glu Ile Glu Glu Leu Lys Lys Glu Leu Lys Glu Val Cys

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245 250 255

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260 265 270

Leu Ala Leu Asn Cys Val Gly Gly Lys Ser Ser Ala Gly Val Ala Arg

275 280 285

Lys Leu Ala Pro Asn Gly Leu Met Leu Thr Tyr Gly Gly Met Ser Phe

290 295 300

Gln Pro Val Thr Leu Pro Thr Ser Leu His Ile Phe Lys Asn Val Thr

305 310 315 320

Ser Ala Gly Phe Trp Val Thr Glu Leu Leu Lys Ser Asp Pro Asn Leu

325 330 335

Lys Arg Glu Thr Val Asp Lys Ile Val Glu Trp Tyr Thr Ser Gly Glu

340 345 350

Leu Leu Asp Ala Pro Ser Lys Glu Asn Gln Trp Gly Asp Gln Asp Leu

355 360 365

Ala Gln Val Phe Ile Asp Ala Val Ala Asn Ser Lys Ser Gly Lys Gln

370 375 380

Leu Val Lys Phe

385

<210> 9

<211> 380

<212> PRT

<213> 马克斯克鲁维酵母

<400> 9

Met Ser Ser Phe Leu Ser Lys Arg Phe Ile Ser Thr Thr Gln Arg Ala

1 5 10 15

Met Ser Gln Leu Pro Lys Ala Lys Ser Leu Ile Tyr Ser Ser His Asp

20 25 30

Gln Asp Val Ser Lys Ile Leu Lys Val His Thr Tyr Gln Pro Lys Gly

35 40 45

Ser Ala Glu Ser Ser Ile Leu Leu Lys Thr Leu Ala Phe Pro Ile Asn

50 55 60

Pro Ser Asp Ile Asn Gln Leu Glu Gly Val Tyr Pro Ser Lys Pro Glu

65 70 75 80

Lys Val Leu Asp Tyr Ser Thr Glu Glu Pro Ser Ala Ile Ala Gly Asn

85 90 95

Glu Gly Leu Phe Glu Val Val Ser Val Pro Ser Gly Val Lys Asn Leu

100 105 110

Lys Ala Gly Asp Arg Val Ile Pro Leu Gln Ala Asn Phe Gly Thr Trp

115 120 125

Ser Thr Tyr Arg Thr Cys Glu Ser Glu Asn Asp Leu Ile Lys Ile Glu

130 135 140

Gly Val Asp Leu Tyr Thr Ala Ala Thr Ile Ala Val Asn Gly Cys Thr

145 150 155 160

Ala Tyr Gln Met Val Asn Asp Tyr Ile Glu Trp Asp Pro Ser Gly Asn

165 170 175

Asp Trp Leu Val Gln Asn Ala Gly Thr Ser Ser Val Ser Lys Ile Val

180 185 190

Thr Gln Ile Ala Lys Asp Lys Gly Ile Lys Thr Leu Ser Val Val Arg

195 200 205

Asp Arg Asp Asn Phe Asp Glu Val Ala Glu Lys Leu Glu Lys Lys Tyr

210 215 220

Gly Ala Thr Lys Val Ile Ser Glu Ser Gln Asn Gly Glu Arg Glu Phe

225 230 235 240

Gly Asn Glu Val Leu Pro Lys Ile Leu Gly Pro Asn Ala Gln Val Lys

245 250 255

Leu Ala Leu Asn Ser Val Gly Gly Lys Ser Cys Thr Asn Ile Ala Arg

260 265 270

Lys Leu Ser Pro Asn Gly Leu Met Leu Thr Tyr Gly Gly Met Ser Lys

275 280 285

Gln Pro Val Thr Leu Pro Thr Gly Leu Phe Ile Phe Asn Ser Ile Arg

290 295 300

Ser His Gly Phe Trp Val Thr Ala Asn Ser Lys Arg Asp Pro Glu Asn

305 310 315 320

Lys Arg Lys Thr Val Asp Ala Val Val Lys Leu Tyr Arg Asp Gly Lys

325 330 335

Ile Ile Ser Pro Lys Glu Asp Ile Arg Thr Leu Glu Trp Asp Val Asn

340 345 350

Asn Leu Ser Asp Glu Gly Val Leu Asp Leu Val Asn Arg Gly Ile Ala

355 360 365

Thr Lys Gly Ala Lys Asn Met Val Val Leu Lys Trp

370 375 380

<210> 10

<211> 373

<212> PRT

<213> 库德里阿兹威毕赤酵母

<400> 10

Met Ser Leu Arg Ser Val Phe Ser Val Ser Ser Ile Arg Arg Met Ser

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ala Arg Ala Ile Val Tyr Asn Ala His Gly Glu Pro Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Lys Cys His Ser Tyr Lys Ile Asp Leu Gln Asn Leu Gln

35 40 45

Pro Asn Glu Val Val Val Gln Thr Leu Ala Ala Pro Leu Asn Pro Ser

50 55 60

Asp Ile Asn Gln Ile Gln Gly Val Tyr Pro Ser Lys Pro Pro Leu Ser

65 70 75 80

Ile Asp Ser Leu Pro Glu Leu Lys Glu Pro Ala Ala Val Thr Gly Asn

85 90 95

Glu Gly Val Phe Lys Val Ile Ala Lys Gly Ser Asn Val Gly Glu Leu

100 105 110

Glu Thr Gly Asp Trp Cys Ile Pro Ser Gly Val Asn Phe Gly Thr Trp

115 120 125

Cys Thr His Arg Leu Thr Thr Asp Lys Asn Leu Leu Lys Met Pro Lys

130 135 140

Thr Ile Ser Leu Asn Gln Ala Ala Thr Ile Ala Val Asn Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ala Tyr Gln Met Leu Thr His Phe Val Lys Leu Gln Pro Gly Asp Trp

165 170 175

Phe Ile Gln Asn Gly Ala Asn Ser Gln Val Gly Arg Ala Ala Ile Gln

180 185 190

Ile Gly His Lys Leu Gly Tyr Lys Ser Leu Asn Ile Val Arg Asn Arg

195 200 205

Asp Asn Leu Asp Glu Leu Val Lys Asp Leu Glu Ser Ile Gly Ala Thr

210 215 220

Lys Val Ile Thr Glu Asp Glu Ser Ala Ser Lys Glu Phe Gly Ala Thr

225 230 235 240

Val Lys Glu Trp Leu Glu Gly Lys Glu Ile Lys Leu Gly Leu Asn Cys

245 250 255

Ile Gly Gly Pro Ser Ala Ser Asn Leu Ala Arg Lys Leu Gly His Asp

260 265 270

Ala Thr Ile Leu Thr Tyr Gly Ala Met Ser Lys Lys Pro Leu Ser Leu

275 280 285

Pro Thr Gly Asn Phe Ile Phe Lys Asn Leu Thr Ala Lys Gly Phe Trp

290 295 300

Ile Thr Gly Asn Ile Lys Arg His Pro Glu Leu Arg Ile Glu Thr Ile

305 310 315 320

Asn Ala Val Leu Lys Phe Met Glu Asp Gly Thr Leu Lys Glu Pro Lys

325 330 335

Val Asn Glu Pro Lys Val Lys Leu Ser Thr Thr Thr Asn Glu Ser Phe

340 345 350

Leu Glu Thr Val Leu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gln Lys Gly Lys Gln

355 360 365

Leu Leu Lys Phe Glu

370

<210> 11

<211> 448

<212> PRT

<213> 喜热梭孢壳

<400> 11

Met Ala Ser Val Leu Ser Pro Asn Ala Ala Ala Arg His Leu Leu Arg

1 5 10 15

Pro Ala Thr Arg Ser Thr Pro Pro Arg Leu Leu Pro Ser Ala Ile Leu

20 25 30

His Gln Ser Gly Asn Asn Ser Thr Arg Asn Pro Arg Ile Ser Asp Pro

35 40 45

Gln Ser Ile Ala Gln Arg Leu Gly Arg Arg Tyr Lys Ser Gly Pro Tyr

50 55 60

Gly Tyr Thr Gln Ala Lys Thr Leu Val Phe Ser Arg Phe Gly Glu Pro

65 70 75 80

Ser Asp Val Leu Arg Leu His Thr His Ser Ile Ser Pro Thr Leu Pro

85 90 95

Asp Gly Ala Val Leu Val Arg Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Pro Ala

100 105 110

Asp Val Asn Thr Ile Gln Gly Thr Tyr Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ser

115 120 125

Pro Leu Leu Gly Thr Pro Glu Pro Ser Ala Val Pro Gly Asn Glu Gly

130 135 140

Cys Phe Glu Val Val Ala Val Gly Pro Arg Val Gly Gly Gly Leu Arg

145 150 155 160

Lys Gly Asp Trp Val Ile Pro Ala Thr Thr Gly Phe Gly Thr Phe Arg

165 170 175

Thr His Ala Leu Val Glu Asn Ala Asp Arg Ala Leu Leu Arg Val Gly

180 185 190

Gly Asp Lys Gly Thr Ala Gly Leu Thr Ala Lys Gln Val Ala Thr Val

195 200 205

Ser Val Asn Pro Cys Ser Ala Tyr Arg Met Leu Lys Asp Tyr Val Asp

210 215 220

Leu Val Asp Leu Ser Val Lys Ser Phe Ala Arg Gly Asp Gly Ala Thr

225 230 235 240

Gly Gly Ala Trp Phe Leu Gln Asn Gly Ala Asn Ser Gly Val Gly Arg

245 250 255

Ala Ala Ile Gln Leu Gly Arg Leu Trp Gly Leu Arg Ser Ile Asn Val

260 265 270

Val Arg Glu Arg Ala Thr Ala Glu Glu Thr Glu Ala Leu Lys Ser Glu

275 280 285

Leu Arg Glu Leu Gly Ala Thr Val Val Val Thr Glu Ala Glu Phe Leu

290 295 300

Asp Arg Ser Phe Ser Ala Arg Leu Lys Glu Glu Trp Thr Arg Gly Asp

305 310 315 320

Arg Glu Pro Val Met Leu Gly Leu Asn Cys Val Gly Gly Lys Ser Ala

325 330 335

Ser Ala Met Ile Lys Ala Leu Ser Pro Lys Gly Cys Met Val Thr Tyr

340 345 350

Gly Gly Met Ser Arg Gln Ser Phe Pro Phe Pro Thr Gly Pro Gln Ile

355 360 365

Phe Lys Arg Leu Arg Phe Glu Gly Phe Trp Leu Ser Glu Trp Ala Lys

370 375 380

Glu Asn Pro Ala Glu Lys Arg Asn Thr Ile Asn Glu Ile Leu Glu Leu

385 390 395 400

Met Arg Glu Gly Lys Phe Lys Glu Ser Pro Phe Lys Glu Val Glu Trp

405 410 415

Asn Trp Asp Thr Glu Glu Lys Val Leu Lys Asp Ala Ile Gln Gly Thr

420 425 430

Leu Glu Gly Phe Lys Ser Gly Lys Gly Leu Phe Val Phe Gly Asp Thr

435 440 445

<210> 12

<211> 443

<212> PRT

<213> 太瑞斯梭孢壳霉

<400> 12

Met Ala Ser Ala Leu Asn Pro Arg His Leu Pro Leu Arg Leu Ala Leu

1 5 10 15

Arg Pro Arg Leu Pro Leu Leu Pro Ser Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr

20 25 30

Thr Thr Pro Pro Ser Cys Leu Pro Ile Pro Thr Ser Ile Arg Leu Pro

35 40 45

Pro Arg Arg His Lys Ser Gly Pro Tyr Gly Tyr Thr Leu Ala Lys Thr

50 55 60

Leu Val Phe Ser Arg Phe Gly Glu Pro Arg Asp Val Leu Ser Leu His

65 70 75 80

Thr His Ser Ile Ser Pro Ala Leu Pro Asp Gly Ala Ala Leu Leu Arg

85 90 95

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Pro Ala Asp Val Asn Thr Val Gln Gly

100 105 110

Thr Tyr Gly Ala Lys Pro Ala Phe Glu Arg Leu Leu Gly Thr Pro Glu

115 120 125

Pro Ala Ala Val Pro Gly Asn Glu Gly Cys Phe Glu Val Val Ala Ile

130 135 140

Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Leu Lys Lys Gly Asp Trp Val

145 150 155 160

Ile Pro Ala Gln Ser Gly Phe Gly Thr Phe Arg Thr His Ala Leu Val

165 170 175

Glu Gly Ala Glu Arg Lys Leu Ile Arg Val Gly Gly Ala Lys Gly Arg

180 185 190

Glu Gly Leu Arg Ala Ala Gln Val Ala Thr Val Ser Val Asn Pro Cys

195 200 205

Ser Ala Tyr Arg Met Leu Arg Asp Tyr Val Asp Leu Val Asp Leu Ser

210 215 220

Val Gln Ser Phe Ala Arg Gly Asp Gly Ala Thr Gly Gly Ala Trp Phe

225 230 235 240

Val Gln Asn Gly Ala Asn Ser Gly Val Gly Arg Ala Ala Ile Gln Leu

245 250 255

Gly Arg Leu Trp Gly Leu Arg Ser Ile Asn Val Val Arg Glu Arg Ala

260 265 270

Thr Pro Glu Glu Thr Ala Ala Leu Lys Arg Glu Leu Ala Glu Leu Gly

275 280 285

Ala Thr Val Val Val Thr Glu Ser Glu Phe Leu Asp Arg Ser Phe Ala

290 295 300

Asp Arg Leu Arg Asp Glu Trp Thr Arg Gly Gly Arg Glu Pro Val Met

305 310 315 320

Leu Gly Leu Asn Cys Val Gly Gly Lys Ser Ala Ala Ala Met Val Lys

325 330 335

Ala Leu Ser Pro Arg Gly Cys Met Val Thr Tyr Gly Gly Met Ser Arg

340 345 350

Gln Ser Phe Pro Phe Pro Thr Gly Gln Gln Ile Phe Lys Arg Leu Arg

355 360 365

Phe Glu Gly Phe Trp Leu Ser Glu Trp Ala Lys Glu Asn Pro Ala Ala

370 375 380

Lys Arg Asp Thr Ile Asn Glu Ile Leu Glu Leu Met Arg Glu Gly Lys

385 390 395 400

Phe Lys Glu Ala Pro Leu Gln Glu Val Glu Trp Asn Trp Asp Thr Glu

405 410 415

Glu Ser Val Leu Lys Asp Thr Ile Gln Gly Thr Leu Glu Gly Phe Arg

420 425 430

Pro Gly Lys Ser Ile Phe Val Phe Lys Asp Thr

435 440

<210> 13

<211> 439

<212> PRT

<213> 嗜热毛壳菌

<400> 13

Met Ala Ser Ile Leu Ser Pro His Ser Ala Leu Arg Leu Gly Gly Ile

1 5 10 15

Ser Thr Leu Ser Arg Gln Thr Leu Leu Arg Thr Ser Arg Val Thr Leu

20 25 30

Thr Gln Leu Pro Lys Thr Ala Pro Gln Leu Pro Gln Arg Arg His Lys

35 40 45

Ser Ala Pro Tyr Gly Tyr Thr Gln Ser Lys Thr Leu Val Phe Pro Arg

50 55 60

Phe Gly Glu Pro Ile Asp Val Leu Ser Leu His Thr His Ser Ile Ser

65 70 75 80

Pro Thr Leu Pro Asp Thr Ala Val Leu Leu Arg Thr Leu Ala Ala Pro

85 90 95

Ile Asn Pro Ala Asp Val Asn Thr Ile Gln Gly Thr Tyr Gly Ala Lys

100 105 110

Pro Thr Phe Ser Asn Leu Leu Gly Thr Ala Glu Pro Ala Ala Val Pro

115 120 125

Gly Asn Glu Gly Val Phe Glu Val Val Ser Val Gly Ser Glu Ile Ala

130 135 140

Lys Arg Gly Val Phe Lys Lys Gly Asp Trp Val Ile Pro Ser Ser Ser

145 150 155 160

Gly Phe Gly Thr Phe Arg Thr His Val Leu Val Glu Glu Ala Glu Gln

165 170 175

Lys Leu Trp Arg Ile Gly Gly Glu Lys Gly Thr Glu Gly Leu Thr Pro

180 185 190

Val Gln Val Ala Thr Val Ser Val Asn Pro Cys Ser Ala Tyr Arg Met

195 200 205

Leu Arg Asp Tyr Val Asp Leu Val Gly Val Ser Val Arg Met Tyr Gln

210 215 220

Glu Gly Gly Ser Asp Val Arg Gly Gly Ala Trp Phe Leu Gln Asn Gly

225 230 235 240

Ala Asn Ser Gly Val Gly Arg Ala Ala Ile Gln Leu Gly Arg Leu Trp

245 250 255

Gly Leu Arg Ser Ile Asn Val Val Arg Glu Arg Ala Thr Ala Glu Glu

260 265 270

Thr Glu Ala Leu Lys Lys Glu Leu Tyr Asp Leu Gly Ala Thr Val Val

275 280 285

Val Thr Glu Ser Glu Phe Leu Asp Arg Ser Phe Thr Gln Arg Leu Asn

290 295 300

Glu Glu Trp Thr Arg Gly Gly Lys Glu Pro Leu Leu Leu Ala Leu Asn

305 310 315 320

Cys Val Gly Gly Lys Ser Ala Gln Gln Ile Val Arg Ala Leu Ser Pro

325 330 335

Lys Gly Thr Met Val Thr Tyr Gly Gly Met Ser Arg Gln Ser Phe Pro

340 345 350

Phe Pro Thr Gly Pro Gln Ile Phe Lys Arg Leu Arg Phe Glu Gly Phe

355 360 365

Trp Leu Ser Glu Trp Ala Lys Glu Asn Pro Ala Glu Lys Lys Lys Cys

370 375 380

Val Asp Glu Ile Ile Glu Leu Met Arg Glu Gly Lys Phe Lys Glu Ala

385 390 395 400

Pro Val Gln Glu Ile Arg Trp Asp Trp Glu Thr Glu Glu Lys Val Leu

405 410 415

Lys Glu Ala Val Gln Gly Thr Leu Glu Gly Phe Arg Ser Gly Lys Gly

420 425 430

Val Phe Ile Phe Gly Asp Thr

435

<210> 14

<211> 422

<212> PRT

<213> 丝状真菌柄孢霉

<400> 14

Met Ala Ala Pro Arg Leu Thr Ser Lys Ala Leu Arg Leu Pro Thr Ser

1 5 10 15

Lys Leu Leu Arg Pro Ala Leu Thr Thr Ala Thr Pro Arg Ala Ala Pro

20 25 30

Thr Leu Thr Gln Lys Arg His Leu Thr Gly Pro Tyr Gly Tyr His Gln

35 40 45

Ser Lys Ala Leu Thr Phe Ser Ser Phe Gly Glu Pro Ile Asp Val Leu

50 55 60

Ser Leu His Thr His Ser Ile Ser Pro Thr Leu Pro Ser Gly Ser Val

65 70 75 80

Leu Val Arg Thr Leu Ala Ala Pro Val Asn Pro Ala Asp Val Asn Thr

85 90 95

Ile Gln Gly Thr Tyr Gly Ser Lys Pro Pro Phe Thr Thr Leu Leu Gly

100 105 110

Thr Ala Gln Pro Ser Ala Val Pro Gly Asn Glu Ala Cys Phe Glu Val

115 120 125

Leu Ser Val Gly Gln Gly Val Lys Gly Leu Glu Lys Gly Asp Trp Val

130 135 140

Ile Pro Ala Lys Thr Gly Phe Gly Thr Phe Arg Thr His Ala Leu Val

145 150 155 160

Glu Glu Ala Glu Gly Lys Leu Met Arg Val Glu Arg Glu Gly Leu Thr

165 170 175

Pro Val Gln Val Ala Thr Val Ser Val Asn Pro Cys Ser Ala Tyr Arg

180 185 190

Met Leu Lys Asp Tyr Val Asp Leu Val Gly Leu Ser Met Arg Trp Tyr

195 200 205

Arg Glu Gly Lys Asp Val Ser Gly Gly Ala Trp Phe Leu Gln Asn Gly

210 215 220

Ala Asn Ser Gly Val Gly Arg Ala Ala Val Gln Phe Gly Arg Leu Trp

225 230 235 240

Gly Leu Arg Ser Ile Asn Val Val Arg Glu Arg Glu Thr Pro Glu Glu

245 250 255

Thr Glu Lys Leu Lys Glu Glu Leu Thr Gly Leu Gly Ala Asn Val Val

260 265 270

Leu Thr Glu Gln Glu Phe Leu Asp Arg Ser Phe Arg Asp Arg Leu Gly

275 280 285

Glu Leu Thr Lys Arg Gly Lys Glu Pro Leu Leu Leu Gly Met Asn Cys

290 295 300

Val Gly Gly Lys Ser Ala Ser Ala Val Val Lys Ala Leu Ser Pro Lys

305 310 315 320

Gly Cys Met Val Thr Tyr Gly Gly Met Ser Arg Gln Ser Phe Pro Phe

325 330 335

Pro Thr Gly Pro Gln Ile Phe Lys Arg Leu Arg Phe Glu Gly Phe Trp

340 345 350

Leu Ser Glu Trp Gly Lys Glu Asn Pro Glu Gly Lys Lys Lys Met Ile

355 360 365

Glu Asp Ile Leu Asn Leu Met Arg Glu Gly Lys Phe Lys Glu Ser Pro

370 375 380

Val Gln Glu Val Glu Trp Asn Trp Glu Thr Glu Glu Lys Thr Leu Lys

385 390 395 400

Glu Ala Val Gln Gly Thr Leu Gly Gly Phe Arg Ser Gly Lys Gly Val

405 410 415

Phe Val Phe Gly Glu Thr

420

<210> 15

<211> 424

<212> PRT

<213> 淡紫拟青霉菌

<400> 15

Met Ala Ser Ser Arg Leu Leu Gly Pro Pro Leu Arg Leu Pro Ser Ser

1 5 10 15

Gly Phe Ser Arg Pro Val Ala Ala Leu Asn Cys Arg Ala Ala Ala Leu

20 25 30

Pro Leu His Leu Pro Arg Thr Ala Val Arg Tyr Arg Ser Gly Pro Tyr

35 40 45

Gly Tyr Thr Gln Ala Lys Ala Leu Val Tyr Ser Lys Asn Gly Glu Pro

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Ala Asp Val Leu Lys Leu His Thr His Ser Ile Ser Pro Ser Ile Pro

65 70 75 80

Ser Thr Ser Val Leu Val Arg Cys Leu Ala Ala Pro Ile Asn Pro Ala

85 90 95

Asp Val Asn Thr Ile Gln Gly Thr Tyr Gly Ser Lys Gln Pro Leu Thr

100 105 110

Ser Leu Ile Gly Thr Ser Glu Pro Ser Ala Val Pro Gly Asn Glu Gly

115 120 125

Val Phe Glu Val Leu Ser Ala Gly Ser Pro Ser Ser Glu Leu Lys Lys

130 135 140

Gly Asp Trp Val Ile Pro Ala Ala Ser Gln Ile Gly Thr Trp Arg Thr

145 150 155 160

His Ala Val Phe Gly Ala Asp Glu Leu Leu Lys Val Asp Lys Glu Gly

165 170 175

Leu Thr Pro Thr Gln Val Ser Leu Val Ser Val Asn Pro Cys Thr Ala

180 185 190

Tyr Arg Ile Leu Arg Ser Tyr Gly Pro Ser Ala Gly Val Lys Ala Ala

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Leu Gly Met Arg Pro Leu Glu Val Gly Ser Gly Gln Trp Phe Ile Gln

210 215 220

Asn Gly Ala Asn Ser Gly Val Gly Arg Ala Ala Ile Gln Phe Gly Lys

225 230 235 240

Leu Trp Gly Leu Arg Ser Ile Asn Val Ile Arg Asp Arg Asp Thr Val

245 250 255

Glu Ala Thr Asp Ala Leu Lys Gln Glu Leu Arg Asp Leu Gly Ala Asp

260 265 270

Val Val Val Ala Glu Ser Glu Phe Leu Ser Arg Gly Trp Lys Asp Gln

275 280 285

Leu Ala Glu Ile Thr Arg Lys Gly Arg Glu Gln Val Gly Leu Gly Leu

290 295 300

Asn Cys Val Gly Gly Lys Ser Ala Thr Ala Leu Ala Arg Ser Leu Gly

305 310 315 320

Glu Gly Ala Thr Leu Val Ser Tyr Gly Gly Met Ala Lys Gln Pro Val

325 330 335

Ala Leu Pro Val Gly Leu Leu Ile Phe Lys Asp Ile Arg Phe Val Gly

340 345 350

Phe Trp Leu Ser Lys Trp Asn Gln Gln Asp Val Val Gly Arg Arg His

355 360 365

Met Val Ala Asp Ile Leu Gly Leu Met Arg Asp Gly Lys Phe Arg Asp

370 375 380

Ala Pro Val Asp Glu Val Lys Trp Asp Trp Asp Thr Asp Glu Ala Thr

385 390 395 400

Leu Arg Gly Ala Ala Gln Arg Gly Leu Glu Gly Phe Arg Gln Gly Lys

405 410 415

Gly Val Tyr Val Phe Gly Asp Thr

420

<210> 16

<211> 405

<212> PRT

<213> 圆核腔菌

<400> 16

Met Ala Ser Lys Leu Ile Ser Pro Ser Pro Arg Leu Ala Gln Ser Cys

1 5 10 15

Leu Arg Arg Thr Arg Asn Leu Ala Pro Val Thr Ala Arg Phe Pro Gln

20 25 30

Arg Arg Tyr Ile Ser Ala Tyr Gly Tyr Glu Gln Ala Lys Ala Leu Thr

35 40 45

Phe Thr Glu Tyr Gly Asp Pro Ser Ala Val Leu Ser Leu His Ser His

50 55 60

Ser Ile Ser Pro Pro His Ser Asn Tyr Met Thr Leu Arg Phe Leu Ala

65 70 75 80

Ser Pro Ile Asn Pro Ala Asp Ile Asn Gln Ile Gln Gly Val Tyr Pro

85 90 95

Ser Lys Pro Thr Phe Thr Thr Ser Leu Gly Thr Pro Asn Pro Ile Ala

100 105 110

Val Ala Gly Asn Glu Gly Val Ala Glu Ile Ile Ala Leu Gly Glu Gly

115 120 125

Val Lys Lys Glu Gly Phe Lys Lys Gly Asp Trp Val Phe Met Lys Gly

130 135 140

Pro Gly Phe Gly Thr Trp Arg Thr His Ala Ser Ala Thr Thr Asn Asp

145 150 155 160

Val Val Lys Leu Asn Asp Gln Met Arg Glu Gly Ile Thr Ala Ile Gln

165 170 175

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180 185 190

Asp Phe Thr Thr Leu Ser Glu Gly Asp Trp Phe Ile Gln Asn Gly Ala

195 200 205

Asn Ser Gly Val Gly Arg Ala Ala Ile Gln Leu Gly Arg Lys Trp Gly

210 215 220

Tyr Lys Ser Ile Asn Ile Ile Arg Ser Arg Glu Asp Lys Asn Lys Glu

225 230 235 240

Glu Ala Met Lys Lys Glu Leu His Asn Leu Gly Ala Asp Val Val Ile

245 250 255

Thr Asp Ala Glu Leu Gln Ala Gln Gly Ile Lys Asp Gln Ala Lys Glu

260 265 270

Trp Thr Asn Gly Gly Arg Ser Pro Ile Arg Leu Ala Leu Asn Cys Val

275 280 285

Asn Gly Lys Ala Ala Thr Ala Met Ala Lys Leu Leu Ser Ser Ser Ala

290 295 300

His Phe Val Thr Tyr Gly Ala Met Ser Lys Gln Pro Leu Thr Ile Pro

305 310 315 320

Ala Ser Met Leu Ile Phe Lys Asp Ile His Phe His Gly Phe Trp Val

325 330 335

Ser Arg Trp Ala Glu Glu His Pro Glu Glu Lys Gln Lys Thr Val Ala

340 345 350

Asp Val Leu Asp Met Thr Arg Lys Gly Glu Phe Lys Asp Met Pro Val

355 360 365

Asp Glu Ile Lys Trp Glu Trp Glu Thr Lys Gly Glu Glu Leu Val Ala

370 375 380

Lys Val Lys Asp Thr Leu Glu Gly Tyr Arg Asp Gly Lys Gly Ile Phe

385 390 395 400

Val Phe Gly Lys Thr

405

<210> 17

<211> 453

<212> PRT

<213> 克氏梭菌

<400> 17

Met Ser Asn Glu Val Ser Ile Lys Glu Leu Ile Glu Lys Ala Lys Val

1 5 10 15

Ala Gln Lys Lys Leu Glu Ala Tyr Ser Gln Glu Gln Val Asp Val Leu

20 25 30

Val Lys Ala Leu Gly Lys Val Val Tyr Asp Asn Ala Glu Met Phe Ala

35 40 45

Lys Glu Ala Val Glu Glu Thr Glu Met Gly Val Tyr Glu Asp Lys Val

50 55 60

Ala Lys Cys His Leu Lys Ser Gly Ala Ile Trp Asn His Ile Lys Asp

65 70 75 80

Lys Lys Thr Val Gly Ile Ile Lys Glu Glu Pro Glu Arg Ala Leu Val

85 90 95

Tyr Val Ala Lys Pro Lys Gly Val Val Ala Ala Thr Thr Pro Ile Thr

100 105 110

Asn Pro Val Val Thr Pro Met Cys Asn Ala Met Ala Ala Ile Lys Gly

115 120 125

Arg Asn Thr Ile Ile Val Ala Pro His Pro Lys Ala Lys Lys Val Ser

130 135 140

Ala His Thr Val Glu Leu Met Asn Ala Glu Leu Lys Lys Leu Gly Ala

145 150 155 160

Pro Glu Asn Ile Ile Gln Ile Val Glu Ala Pro Ser Arg Glu Ala Ala

165 170 175

Lys Glu Leu Met Glu Ser Ala Asp Val Val Ile Ala Thr Gly Gly Ala

180 185 190

Gly Arg Val Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Arg Pro Ala Tyr Gly Val

195 200 205

Gly Pro Gly Asn Ser Gln Val Ile Val Asp Lys Gly Tyr Asp Tyr Asn

210 215 220

Lys Ala Ala Gln Asp Ile Ile Thr Gly Arg Lys Tyr Asp Asn Gly Ile

225 230 235 240

Ile Cys Ser Ser Glu Gln Ser Val Ile Ala Pro Ala Glu Asp Tyr Asp

245 250 255

Lys Val Ile Ala Ala Phe Val Glu Asn Gly Ala Phe Tyr Val Glu Asp

260 265 270

Glu Glu Thr Val Glu Lys Phe Arg Ser Thr Leu Phe Lys Asp Gly Lys

275 280 285

Ile Asn Ser Lys Ile Ile Gly Lys Ser Val Gln Ile Ile Ala Asp Leu

290 295 300

Ala Gly Val Lys Val Pro Glu Gly Thr Lys Val Ile Val Leu Lys Gly

305 310 315 320

Lys Gly Ala Gly Glu Lys Asp Val Leu Cys Lys Glu Lys Met Cys Pro

325 330 335

Val Leu Val Ala Leu Lys Tyr Asp Thr Phe Glu Glu Ala Val Glu Ile

340 345 350

Ala Met Ala Asn Tyr Met Tyr Glu Gly Ala Gly His Thr Ala Gly Ile

355 360 365

His Ser Asp Asn Asp Glu Asn Ile Arg Tyr Ala Gly Thr Val Leu Pro

370 375 380

Ile Ser Arg Leu Val Val Asn Gln Pro Ala Thr Thr Ala Gly Gly Ser

385 390 395 400

Phe Asn Asn Gly Phe Asn Pro Thr Thr Thr Leu Gly Cys Gly Ser Trp

405 410 415

Gly Arg Asn Ser Ile Ser Glu Asn Leu Thr Tyr Glu His Leu Ile Asn

420 425 430

Val Ser Arg Ile Gly Tyr Phe Asn Lys Glu Ala Lys Val Pro Ser Tyr

435 440 445

Glu Glu Ile Trp Gly

450

<210> 18

<211> 1174

<212> PRT

<213> 艾阿华诺卡氏菌

<400> 18

Met Ala Val Asp Ser Pro Asp Glu Arg Leu Gln Arg Arg Ile Ala Gln

1 5 10 15

Leu Phe Ala Glu Asp Glu Gln Val Lys Ala Ala Arg Pro Leu Glu Ala

20 25 30

Val Ser Ala Ala Val Ser Ala Pro Gly Met Arg Leu Ala Gln Ile Ala

35 40 45

Ala Thr Val Met Ala Gly Tyr Ala Asp Arg Pro Ala Ala Gly Gln Arg

50 55 60

Ala Phe Glu Leu Asn Thr Asp Asp Ala Thr Gly Arg Thr Ser Leu Arg

65 70 75 80

Leu Leu Pro Arg Phe Glu Thr Ile Thr Tyr Arg Glu Leu Trp Gln Arg

85 90 95

Val Gly Glu Val Ala Ala Ala Trp His His Asp Pro Glu Asn Pro Leu

100 105 110

Arg Ala Gly Asp Phe Val Ala Leu Leu Gly Phe Thr Ser Ile Asp Tyr

115 120 125

Ala Thr Leu Asp Leu Ala Asp Ile His Leu Gly Ala Val Thr Val Pro

130 135 140

Leu Gln Ala Ser Ala Ala Val Ser Gln Leu Ile Ala Ile Leu Thr Glu

145 150 155 160

Thr Ser Pro Arg Leu Leu Ala Ser Thr Pro Glu His Leu Asp Ala Ala

165 170 175

Val Glu Cys Leu Leu Ala Gly Thr Thr Pro Glu Arg Leu Val Val Phe

180 185 190

Asp Tyr His Pro Glu Asp Asp Asp Gln Arg Ala Ala Phe Glu Ser Ala

195 200 205

Arg Arg Arg Leu Ala Asp Ala Gly Ser Ser Val Ile Val Glu Thr Leu

210 215 220

Asp Ala Val Arg Ala Arg Gly Arg Asp Leu Pro Ala Ala Pro Leu Phe

225 230 235 240

Val Pro Asp Thr Asp Asp Asp Pro Leu Ala Leu Leu Ile Tyr Thr Ser

245 250 255

Gly Ser Thr Gly Thr Pro Lys Gly Ala Met Tyr Thr Asn Arg Leu Ala

260 265 270

Ala Thr Met Trp Gln Gly Asn Ser Met Leu Gln Gly Asn Ser Gln Arg

275 280 285

Val Gly Ile Asn Leu Asn Tyr Met Pro Met Ser His Ile Ala Gly Arg

290 295 300

Ile Ser Leu Phe Gly Val Leu Ala Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Phe Ala

305 310 315 320

Ala Lys Ser Asp Met Ser Thr Leu Phe Glu Asp Ile Gly Leu Val Arg

325 330 335

Pro Thr Glu Ile Phe Phe Val Pro Arg Val Cys Asp Met Val Phe Gln

340 345 350

Arg Tyr Gln Ser Glu Leu Asp Arg Arg Ser Val Ala Gly Ala Asp Leu

355 360 365

Asp Thr Leu Asp Arg Glu Val Lys Ala Asp Leu Arg Gln Asn Tyr Leu

370 375 380

Gly Gly Arg Phe Leu Val Ala Val Val Gly Ser Ala Pro Leu Ala Ala

385 390 395 400

Glu Met Lys Thr Phe Met Glu Ser Val Leu Asp Leu Pro Leu His Asp

405 410 415

Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ser Val Leu Leu Asp Asn Gln

420 425 430

Ile Gln Arg Pro Pro Val Leu Asp Tyr Lys Leu Val Asp Val Pro Glu

435 440 445

Leu Gly Tyr Phe Arg Thr Asp Arg Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Leu

450 455 460

Leu Lys Ala Glu Thr Thr Ile Pro Gly Tyr Tyr Lys Arg Pro Glu Val

465 470 475 480

Thr Ala Glu Ile Phe Asp Glu Asp Gly Phe Tyr Lys Thr Gly Asp Ile

485 490 495

Val Ala Glu Leu Glu His Asp Arg Leu Val Tyr Val Asp Arg Arg Asn

500 505 510

Asn Val Leu Lys Leu Ser Gln Gly Glu Phe Val Thr Val Ala His Leu

515 520 525

Glu Ala Val Phe Ala Ser Ser Pro Leu Ile Arg Gln Ile Phe Ile Tyr

530 535 540

Gly Ser Ser Glu Arg Ser Tyr Leu Leu Ala Val Ile Val Pro Thr Asp

545 550 555 560

Asp Ala Leu Arg Gly Arg Asp Thr Ala Thr Leu Lys Ser Ala Leu Ala

565 570 575

Glu Ser Ile Gln Arg Ile Ala Lys Asp Ala Asn Leu Gln Pro Tyr Glu

580 585 590

Ile Pro Arg Asp Phe Leu Ile Glu Thr Glu Pro Phe Thr Ile Ala Asn

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Ser Ala Asp Met Arg Pro Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp

675 680 685

Ser Leu Ser Ala Leu Ser Phe Ser Asn Leu Leu His Glu Ile Phe Gly

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Val Glu Val Pro Val Gly Val Val Val Ser Pro Ala Asn Glu Leu Arg

705 710 715 720

Asp Leu Ala Asn Tyr Ile Glu Ala Glu Arg Asn Ser Gly Ala Lys Arg

725 730 735

Pro Thr Phe Thr Ser Val His Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg Ala Ala

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Asp Leu Thr Leu Asp Lys Phe Ile Asp Ala Arg Thr Leu Ala Ala Ala

755 760 765

Asp Ser Ile Pro His Ala Pro Val Pro Ala Gln Thr Val Leu Leu Thr

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Gly Ala Asn Gly Tyr Leu Gly Arg Phe Leu Cys Leu Glu Trp Leu Glu

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Arg Leu Asp Lys Thr Gly Gly Thr Leu Ile Cys Val Val Arg Gly Ser

805 810 815

Asp Ala Ala Ala Ala Arg Lys Arg Leu Asp Ser Ala Phe Asp Ser Gly

820 825 830

Asp Pro Gly Leu Leu Glu His Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Arg Thr Leu

835 840 845

Glu Val Leu Ala Gly Asp Ile Gly Asp Pro Asn Leu Gly Leu Asp Asp

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865 870 875 880

Ala Ala Leu Val Asn His Val Leu Pro Tyr Thr Gln Leu Phe Gly Pro

885 890 895

Asn Val Val Gly Thr Ala Glu Ile Val Arg Leu Ala Ile Thr Ala Arg

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915 920 925

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1025 1030 1035

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Glu Thr Ala Ile Arg Ala Leu Pro Glu Lys Gln Arg Gln Ala Ser

1100 1105 1110

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1130 1135 1140

Thr Ala Lys Ile Gly Pro Glu Gln Asp Ile Pro His Leu Ser Ala

1145 1150 1155

Pro Leu Ile Asp Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Leu Leu Gln Leu

1160 1165 1170

Leu

<210> 19

<211> 1174

<212> PRT

<213> 海洋分枝杆菌

<400> 19

Met Ser Pro Ile Thr Arg Glu Glu Arg Leu Glu Arg Arg Ile Gln Asp

1 5 10 15

Leu Tyr Ala Asn Asp Pro Gln Phe Ala Ala Ala Lys Pro Ala Thr Ala

20 25 30

Ile Thr Ala Ala Ile Glu Arg Pro Gly Leu Pro Leu Pro Gln Ile Ile

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Glu Thr Val Met Thr Gly Tyr Ala Asp Arg Pro Ala Leu Ala Gln Arg

50 55 60

Ser Val Glu Phe Val Thr Asp Ala Gly Thr Gly His Thr Thr Leu Arg

65 70 75 80

Leu Leu Pro His Phe Glu Thr Ile Ser Tyr Gly Glu Leu Trp Asp Arg

85 90 95

Ile Ser Ala Leu Ala Asp Val Leu Ser Thr Glu Gln Thr Val Lys Pro

100 105 110

Gly Asp Arg Val Cys Leu Leu Gly Phe Asn Ser Val Asp Tyr Ala Thr

115 120 125

Ile Asp Met Thr Leu Ala Arg Leu Gly Ala Val Ala Val Pro Leu Gln

130 135 140

Thr Ser Ala Ala Ile Thr Gln Leu Gln Pro Ile Val Ala Glu Thr Gln

145 150 155 160

Pro Thr Met Ile Ala Ala Ser Val Asp Ala Leu Ala Asp Ala Thr Glu

165 170 175

Leu Ala Leu Ser Gly Gln Thr Ala Thr Arg Val Leu Val Phe Asp His

180 185 190

His Arg Gln Val Asp Ala His Arg Ala Ala Val Glu Ser Ala Arg Glu

195 200 205

Arg Leu Ala Gly Ser Ala Val Val Glu Thr Leu Ala Glu Ala Ile Ala

210 215 220

Arg Gly Asp Val Pro Arg Gly Ala Ser Ala Gly Ser Ala Pro Gly Thr

225 230 235 240

Asp Val Ser Asp Asp Ser Leu Ala Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Ser

245 250 255

Thr Gly Ala Pro Lys Gly Ala Met Tyr Pro Arg Arg Asn Val Ala Thr

260 265 270

Phe Trp Arg Lys Arg Thr Trp Phe Glu Gly Gly Tyr Glu Pro Ser Ile

275 280 285

Thr Leu Asn Phe Met Pro Met Ser His Val Met Gly Arg Gln Ile Leu

290 295 300

Tyr Gly Thr Leu Cys Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Phe Val Ala Lys Ser

305 310 315 320

Asp Leu Ser Thr Leu Phe Glu Asp Leu Ala Leu Val Arg Pro Thr Glu

325 330 335

Leu Thr Phe Val Pro Arg Val Trp Asp Met Val Phe Asp Glu Phe Gln

340 345 350

Ser Glu Val Asp Arg Arg Leu Val Asp Gly Ala Asp Arg Val Ala Leu

355 360 365

Glu Ala Gln Val Lys Ala Glu Ile Arg Asn Asp Val Leu Gly Gly Arg

370 375 380

Tyr Thr Ser Ala Leu Thr Gly Ser Ala Pro Ile Ser Asp Glu Met Lys

385 390 395 400

Ala Trp Val Glu Glu Leu Leu Asp Met His Leu Val Glu Gly Tyr Gly

405 410 415

Ser Thr Glu Ala Gly Met Ile Leu Ile Asp Gly Ala Ile Arg Arg Pro

420 425 430

Ala Val Leu Asp Tyr Lys Leu Val Asp Val Pro Asp Leu Gly Tyr Phe

435 440 445

Leu Thr Asp Arg Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Leu Val Lys Thr Asp

450 455 460

Ser Leu Phe Pro Gly Tyr Tyr Gln Arg Ala Glu Val Thr Ala Asp Val

465 470 475 480

Phe Asp Ala Asp Gly Phe Tyr Arg Thr Gly Asp Ile Met Ala Glu Val

485 490 495

Gly Pro Glu Gln Phe Val Tyr Leu Asp Arg Arg Asn Asn Val Leu Lys

500 505 510

Leu Ser Gln Gly Glu Phe Val Thr Val Ser Lys Leu Glu Ala Val Phe

515 520 525

Gly Asp Ser Pro Leu Val Arg Gln Ile Tyr Ile Tyr Gly Asn Ser Ala

530 535 540

Arg Ala Tyr Leu Leu Ala Val Ile Val Pro Thr Gln Glu Ala Leu Asp

545 550 555 560

Ala Val Pro Val Glu Glu Leu Lys Ala Arg Leu Gly Asp Ser Leu Gln

565 570 575

Glu Val Ala Lys Ala Ala Gly Leu Gln Ser Tyr Glu Ile Pro Arg Asp

580 585 590

Phe Ile Ile Glu Thr Thr Pro Trp Thr Leu Glu Asn Gly Leu Leu Thr

595 600 605

Gly Ile Arg Lys Leu Ala Arg Pro Gln Leu Lys Lys His Tyr Gly Glu

610 615 620

Leu Leu Glu Gln Ile Tyr Thr Asp Leu Ala His Gly Gln Ala Asp Glu

625 630 635 640

Leu Arg Ser Leu Arg Gln Ser Gly Ala Asp Ala Pro Val Leu Val Thr

645 650 655

Val Cys Arg Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Ser Ala Ser Asp Val

660 665 670

Gln Pro Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala

675 680 685

Leu Ser Phe Thr Asn Leu Leu His Glu Ile Phe Asp Ile Glu Val Pro

690 695 700

Val Gly Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Asp Leu Gln Ala Leu Ala Asp

705 710 715 720

Tyr Val Glu Ala Ala Arg Lys Pro Gly Ser Ser Arg Pro Thr Phe Ala

725 730 735

Ser Val His Gly Ala Ser Asn Gly Gln Val Thr Glu Val His Ala Gly

740 745 750

Asp Leu Ser Leu Asp Lys Phe Ile Asp Ala Ala Thr Leu Ala Glu Ala

755 760 765

Pro Arg Leu Pro Ala Ala Asn Thr Gln Val Arg Thr Val Leu Leu Thr

770 775 780

Gly Ala Thr Gly Phe Leu Gly Arg Tyr Leu Ala Leu Glu Trp Leu Glu

785 790 795 800

Arg Met Asp Leu Val Asp Gly Lys Leu Ile Cys Leu Val Arg Ala Lys

805 810 815

Ser Asp Thr Glu Ala Arg Ala Arg Leu Asp Lys Thr Phe Asp Ser Gly

820 825 830

Asp Pro Glu Leu Leu Ala His Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Asp His Leu

835 840 845

Glu Val Leu Ala Gly Asp Lys Gly Glu Ala Asp Leu Gly Leu Asp Arg

850 855 860

Gln Thr Trp Gln Arg Leu Ala Asp Thr Val Asp Leu Ile Val Asp Pro

865 870 875 880

Ala Ala Leu Val Asn His Val Leu Pro Tyr Ser Gln Leu Phe Gly Pro

885 890 895

Asn Ala Leu Gly Thr Ala Glu Leu Leu Arg Leu Ala Leu Thr Ser Lys

900 905 910

Ile Lys Pro Tyr Ser Tyr Thr Ser Thr Ile Gly Val Ala Asp Gln Ile

915 920 925

Pro Pro Ser Ala Phe Thr Glu Asp Ala Asp Ile Arg Val Ile Ser Ala

930 935 940

Thr Arg Ala Val Asp Asp Ser Tyr Ala Asn Gly Tyr Ser Asn Ser Lys

945 950 955 960

Trp Ala Gly Glu Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Leu Cys Gly Leu

965 970 975

Pro Val Ala Val Phe Arg Cys Asp Met Ile Leu Ala Asp Thr Thr Trp

980 985 990

Ala Gly Gln Leu Asn Val Pro Asp Met Phe Thr Arg Met Ile Leu Ser

995 1000 1005

Leu Ala Ala Thr Gly Ile Ala Pro Gly Ser Phe Tyr Glu Leu Ala

1010 1015 1020

Ala Asp Gly Ala Arg Gln Arg Ala His Tyr Asp Gly Leu Pro Val

1025 1030 1035

Glu Phe Ile Ala Glu Ala Ile Ser Thr Leu Gly Ala Gln Ser Gln

1040 1045 1050

Asp Gly Phe His Thr Tyr His Val Met Asn Pro Tyr Asp Asp Gly

1055 1060 1065

Ile Gly Leu Asp Glu Phe Val Asp Trp Leu Asn Glu Ser Gly Cys

1070 1075 1080

Pro Ile Gln Arg Ile Ala Asp Tyr Gly Asp Trp Leu Gln Arg Phe

1085 1090 1095

Glu Thr Ala Leu Arg Ala Leu Pro Asp Arg Gln Arg His Ser Ser

1100 1105 1110

Leu Leu Pro Leu Leu His Asn Tyr Arg Gln Pro Glu Arg Pro Val

1115 1120 1125

Arg Gly Ser Ile Ala Pro Thr Asp Arg Phe Arg Ala Ala Val Gln

1130 1135 1140

Glu Ala Lys Ile Gly Pro Asp Lys Asp Ile Pro His Val Gly Ala

1145 1150 1155

Pro Ile Ile Val Lys Tyr Val Ser Asp Leu Arg Leu Leu Gly Leu

1160 1165 1170

Leu

<210> 20

<211> 1178

<212> PRT

<213> 脓肿分枝杆菌

<400> 20

Met Thr Glu Thr Ile Ser Thr Ala Ala Val Pro Thr Thr Asp Leu Glu

1 5 10 15

Glu Gln Val Lys Arg Arg Ile Glu Gln Val Val Ser Asn Asp Pro Gln

20 25 30

Leu Ala Ala Leu Leu Pro Glu Asp Ser Val Thr Glu Ala Val Asn Glu

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Glu Ser Gly Asp Pro Lys Leu Ser Ala His Tyr Arg Gln Leu Ala Gln

835 840 845

Gln Ser Leu Glu Val Ile Ala Gly Asp Phe Gly Asp Gln Asp Leu Gly

850 855 860

Leu Ser Gln Glu Val Trp Gln Lys Leu Ala Lys Asp Val Asp Leu Ile

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Val His Ser Gly Ala Leu Val Asn His Val Leu Pro Tyr Ser Gln Leu

885 890 895

Phe Gly Pro Asn Val Ala Gly Thr Ala Glu Ile Ile Lys Leu Ala Ile

900 905 910

Ser Glu Arg Leu Lys Pro Val Thr Tyr Leu Ser Thr Val Gly Ile Ala

915 920 925

Asp Gln Ile Pro Val Thr Glu Phe Glu Glu Asp Ser Asp Val Arg Val

930 935 940

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980 985 990

Ser Asp Tyr His Gly Gln Leu Asn Val Thr Asp Val Phe Thr Arg Ser

995 1000 1005

Ile Gln Ser Leu Leu Leu Thr Gly Val Ala Pro Ala Ser Phe Tyr

1010 1015 1020

Glu Leu Asp Ala Asp Gly Asn Arg Gln Arg Ala His Tyr Asp Gly

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Val Pro Gly Asp Phe Thr Ala Ala Ser Ile Thr Ala Ile Gly Gly

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Val Asn Val Val Asp Gly Tyr Arg Ser Phe Asp Val Phe Asn Pro

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Asp Ala Gly Tyr Lys Ile Ala Arg Ile Asp Asp Tyr Asp Gln Trp

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Leu Ala Arg Phe Glu Leu Ala Leu Lys Gly Leu Pro Glu Gln Gln

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Arg Gln Gln Ser Val Leu Pro Leu Leu Lys Met Tyr Glu Lys Pro

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Gln Pro Ala Ile Asp Gly Ser Ala Leu Pro Thr Ala Glu Phe Ser

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<212> PRT

<213> 枯草杆菌

<400> 23

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<400> 24

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Ala Lys Glu Ala Thr Tyr Lys Ala Trp Trp Pro Leu Thr Ala Arg Trp

145 150 155 160

Leu Gly Phe Glu Glu Ala His Ile Thr Phe Glu Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Ala Asp Ser Gly Asn Gly Thr Phe His Ser Glu Leu Leu Val Pro Gly

180 185 190

Gln Thr Asn Asp Gly Gly Thr Pro Leu Leu Ser Phe Asp Gly Arg Trp

195 200 205

Leu Ile Ala Asp Gly Phe Ile Leu Thr Ala Ile Ala Tyr Ala

210 215 220

<210> 25

<211> 272

<212> PRT

<213> 酿酒酵母

<400> 25

Met Val Lys Thr Thr Glu Val Val Ser Glu Val Ser Lys Val Ala Gly

1 5 10 15

Val Arg Pro Trp Ala Gly Ile Phe Val Val Glu Ile Gln Glu Asp Ile

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Leu Ala Asp Glu Phe Thr Phe Glu Ala Leu Met Arg Thr Leu Pro Leu

35 40 45

Ala Ser Gln Ala Arg Ile Leu Asn Lys Lys Ser Phe His Asp Arg Cys

50 55 60

Ser Asn Leu Cys Ser Gln Leu Leu Gln Leu Phe Gly Cys Ser Ile Val

65 70 75 80

Thr Gly Leu Asn Phe Gln Glu Leu Lys Phe Asp Lys Gly Ser Phe Gly

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Lys Pro Phe Leu Asp Asn Asn Arg Phe Leu Pro Phe Ser Met Thr Ile

100 105 110

Gly Glu Gln Tyr Val Ala Met Phe Leu Val Lys Cys Val Ser Thr Asp

115 120 125

Glu Tyr Gln Asp Val Gly Ile Asp Ile Ala Ser Pro Cys Asn Tyr Gly

130 135 140

Gly Arg Glu Glu Leu Glu Leu Phe Lys Glu Val Phe Ser Glu Arg Glu

145 150 155 160

Phe Asn Gly Leu Leu Lys Ala Ser Asp Pro Cys Thr Ile Phe Thr Tyr

165 170 175

Leu Trp Ser Leu Lys Glu Ser Tyr Thr Lys Phe Thr Gly Thr Gly Leu

180 185 190

Asn Thr Asp Leu Ser Leu Ile Asp Phe Gly Ala Ile Ser Phe Phe Pro

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Lys Ser Ile Ser Asp Lys Ile Asn Thr Asn Arg Pro Lys Leu Tyr Asn

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<210> 26

<211> 209

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 26

Met Val Asp Met Lys Thr Thr His Thr Ser Leu Pro Phe Ala Gly His

1 5 10 15

Thr Leu His Phe Val Glu Phe Asp Pro Ala Asn Phe Cys Glu Gln Asp

20 25 30

Leu Leu Trp Leu Pro His Tyr Ala Gln Leu Gln His Ala Gly Arg Lys

35 40 45

Arg Lys Thr Glu His Leu Ala Gly Arg Ile Ala Ala Val Tyr Ala Leu

50 55 60

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65 70 75 80

Pro Val Trp Pro Ala Glu Val Tyr Gly Ser Ile Ser His Cys Gly Thr

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Thr Ala Leu Ala Val Val Ser Arg Gln Pro Ile Gly Ile Asp Ile Glu

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Glu Ile Phe Ser Val Gln Thr Ala Arg Glu Leu Thr Asp Asn Ile Ile

115 120 125

Thr Pro Ala Glu His Glu Arg Leu Ala Asp Cys Gly Leu Ala Phe Ser

130 135 140

Leu Ala Leu Thr Leu Ala Phe Ser Ala Lys Glu Ser Ala Phe Lys Ala

145 150 155 160

Ser Glu Ile Gln Thr Asp Ala Gly Phe Leu Asp Tyr Gln Ile Ile Ser

165 170 175

Trp Asn Lys Gln Gln Val Ile Ile His Arg Glu Asn Glu Met Phe Ala

180 185 190

Val His Trp Gln Ile Lys Glu Lys Ile Val Ile Thr Leu Cys Gln His

195 200 205

Asp

<210> 27

<211> 468

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 27

Met Ile Arg Glu Pro Pro Glu His Ile Leu Asn Arg Leu Pro Ser Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Leu Ala Cys Ser Ala His Ala Leu Asn Leu Ile Glu Lys

20 25 30

Arg Thr Leu Asp His Glu Glu Met Lys Ala Leu Asn Arg Glu Val Ile

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Glu Tyr Phe Lys Glu His Val Asn Pro Gly Phe Leu Glu Tyr Arg Lys

50 55 60

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65 70 75 80

Ser Leu Asn Thr Leu Val Asp Thr Gln Gly Gln Glu Phe Ile Asp Cys

85 90 95

Leu Gly Gly Phe Gly Ile Phe Asn Val Gly His Arg Asn Pro Val Val

100 105 110

Val Ser Ala Val Gln Asn Gln Leu Ala Lys Gln Pro Leu His Ser Gln

115 120 125

Glu Leu Leu Asp Pro Leu Arg Ala Met Leu Ala Lys Thr Leu Ala Ala

130 135 140

Leu Thr Pro Gly Lys Leu Lys Tyr Ser Phe Phe Cys Asn Ser Gly Thr

145 150 155 160

Glu Ser Val Glu Ala Ala Leu Lys Leu Ala Lys Ala Tyr Gln Ser Pro

165 170 175

Arg Gly Lys Phe Thr Phe Ile Ala Thr Ser Gly Ala Phe His Gly Lys

180 185 190

Ser Leu Gly Ala Leu Ser Ala Thr Ala Lys Ser Thr Phe Arg Lys Pro

195 200 205

Phe Met Pro Leu Leu Pro Gly Phe Arg His Val Pro Phe Gly Asn Ile

210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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275 280 285

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Leu Cys Leu Ala Lys Ala Leu Gly Gly Gly Val Met Pro Ile Gly Ala

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Thr Ile Ala Thr Glu Glu Val Phe Ser Val Leu Phe Asp Asn Pro Phe

325 330 335

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420 425 430

Thr Ile Arg Ile Glu Pro Pro Leu Thr Leu Thr Ile Glu Gln Cys Glu

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Leu Val Ile Lys Ala Ala Arg Lys Ala Leu Ala Ala Met Arg Val Ser

450 455 460

Val Glu Glu Ala

465

<210> 28

<211> 456

<212> PRT

<213> 绿脓杆菌

<400> 28

Met Asn Ser Gln Ile Thr Asn Ala Lys Thr Arg Glu Trp Gln Ala Leu

1 5 10 15

Ser Arg Asp His His Leu Pro Pro Phe Thr Asp Tyr Lys Gln Leu Asn

20 25 30

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35 40 45

Asp Ser Glu Gly Asn Lys Ile Leu Asp Ala Met Ala Gly Leu Trp Cys

50 55 60

Val Asn Val Gly Tyr Gly Arg Glu Glu Leu Val Gln Ala Ala Thr Arg

65 70 75 80

Gln Met Arg Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Leu Phe Phe Gln Thr Ala His

85 90 95

Pro Pro Val Val Glu Leu Ala Lys Ala Ile Ala Asp Val Ala Pro Glu

100 105 110

Gly Met Asn His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp

115 120 125

Thr Val Leu Arg Met Val Arg His Tyr Trp Ala Thr Lys Gly Gln Pro

130 135 140

Gln Lys Lys Val Val Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr

145 150 155 160

Val Ala Gly Val Ser Leu Gly Gly Met Lys Ala Leu His Glu Gln Gly

165 170 175

Asp Phe Pro Ile Pro Gly Ile Val His Ile Ala Gln Pro Tyr Trp Tyr

180 185 190

Gly Glu Gly Gly Asp Met Ser Pro Asp Glu Phe Gly Val Trp Ala Ala

195 200 205

Glu Gln Leu Glu Lys Lys Ile Leu Glu Val Gly Glu Glu Asn Val Ala

210 215 220

Ala Phe Ile Ala Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro

225 230 235 240

Pro Asp Thr Tyr Trp Pro Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ala Lys Tyr Asp

245 250 255

Ile Leu Phe Ile Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly

260 265 270

Glu Trp Phe Gly Ser Gln Tyr Tyr Gly Asn Ala Pro Asp Leu Met Pro

275 280 285

Ile Ala Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Met Gly Gly Val Val

290 295 300

Val Arg Asp Glu Ile Val Glu Val Leu Asn Gln Gly Gly Glu Phe Tyr

305 310 315 320

His Gly Phe Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu

325 330 335

Glu Asn Ile Arg Ile Leu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Glu Lys Val Lys

340 345 350

Ala Glu Thr Ala Pro Tyr Leu Gln Lys Arg Trp Gln Glu Leu Ala Asp

355 360 365

His Pro Leu Val Gly Glu Ala Arg Gly Val Gly Met Val Ala Ala Leu

370 375 380

Glu Leu Val Lys Asn Lys Lys Thr Arg Glu Arg Phe Thr Asp Lys Gly

385 390 395 400

Val Gly Met Leu Cys Arg Glu His Cys Phe Arg Asn Gly Leu Ile Met

405 410 415

Arg Ala Val Gly Asp Thr Met Ile Ile Ser Pro Pro Leu Val Ile Asp

420 425 430

Pro Ser Gln Ile Asp Glu Leu Ile Thr Leu Ala Arg Lys Cys Leu Asp

435 440 445

Gln Thr Ala Ala Ala Val Leu Ala

450 455

<210> 29

<211> 426

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 29

Met Asn Ser Asn Lys Glu Leu Met Gln Arg Arg Ser Gln Ala Ile Pro

1 5 10 15

Arg Gly Val Gly Gln Ile His Pro Ile Phe Ala Asp Arg Ala Glu Asn

20 25 30

Cys Arg Val Trp Asp Val Glu Gly Arg Glu Tyr Leu Asp Phe Ala Gly

35 40 45

Gly Ile Ala Val Leu Asn Thr Gly His Leu His Pro Lys Val Val Ala

50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

Glu Ala Val Glu Asn Ala Val Lys Ile Ala Arg Ala Ala Thr Lys Arg

115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

Leu Met Pro Gly His Val Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Cys Pro Leu His

165 170 175

Gly Ile Ser Glu Asp Asp Ala Ile Ala Ser Ile His Arg Ile Phe Lys

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Leu Arg Ala Leu Cys Asp Glu His Gly Ile Met Leu Ile Ala Asp Glu

225 230 235 240

Val Gln Ser Gly Ala Gly Arg Thr Gly Thr Leu Phe Ala Met Glu Gln

245 250 255

Met Gly Val Ala Pro Asp Leu Thr Thr Phe Ala Lys Ser Ile Ala Gly

260 265 270

Gly Phe Pro Leu Ala Gly Val Thr Gly Arg Ala Glu Val Met Asp Ala

275 280 285

Val Ala Pro Gly Gly Leu Gly Gly Thr Tyr Ala Gly Asn Pro Ile Ala

290 295 300

Cys Val Ala Ala Leu Glu Val Leu Lys Val Phe Glu Gln Glu Asn Leu

305 310 315 320

Leu Gln Lys Ala Asn Asp Leu Gly Gln Lys Leu Lys Asp Gly Leu Leu

325 330 335

Ala Ile Ala Glu Lys His Pro Glu Ile Gly Asp Val Arg Gly Leu Gly

340 345 350

Ala Met Ile Ala Ile Glu Leu Phe Glu Asp Gly Asp His Asn Lys Pro

355 360 365

Asp Ala Lys Leu Thr Ala Glu Ile Val Ala Arg Ala Arg Asp Lys Gly

370 375 380

Leu Ile Leu Leu Ser Cys Gly Pro Tyr Tyr Asn Val Leu Arg Ile Leu

385 390 395 400

Val Pro Leu Thr Ile Glu Asp Ala Gln Ile Arg Gln Gly Leu Glu Ile

405 410 415

Ile Ser Gln Cys Phe Asp Glu Ala Lys Gln

420 425

<210> 30

<211> 421

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 30

Met Ser Asn Asn Glu Phe His Gln Arg Arg Leu Ser Ala Thr Pro Arg

1 5 10 15

Gly Val Gly Val Met Cys Asn Phe Phe Ala Gln Ser Ala Glu Asn Ala

20 25 30

Thr Leu Lys Asp Val Glu Gly Asn Glu Tyr Ile Asp Phe Ala Ala Gly

35 40 45

Ile Ala Val Leu Asn Thr Gly His Arg His Pro Asp Leu Val Ala Ala

50 55 60

Val Glu Gln Gln Leu Gln Gln Phe Thr His Thr Ala Tyr Gln Ile Val

65 70 75 80

Pro Tyr Glu Ser Tyr Val Thr Leu Ala Glu Lys Ile Asn Ala Leu Ala

85 90 95

Pro Val Ser Gly Gln Ala Lys Thr Ala Phe Phe Thr Thr Gly Ala Glu

100 105 110

Ala Val Glu Asn Ala Val Lys Ile Ala Arg Ala His Thr Gly Arg Pro

115 120 125

Gly Val Ile Ala Phe Ser Gly Gly Phe His Gly Arg Thr Tyr Met Thr

130 135 140

Met Ala Leu Thr Gly Lys Val Ala Pro Tyr Lys Ile Gly Phe Gly Pro

145 150 155 160

Phe Pro Gly Ser Val Tyr His Val Pro Tyr Pro Ser Asp Leu His Gly

165 170 175

Ile Ser Thr Gln Asp Ser Leu Asp Ala Ile Glu Arg Leu Phe Lys Ser

180 185 190

Asp Ile Glu Ala Lys Gln Val Ala Ala Ile Ile Phe Glu Pro Val Gln

195 200 205

Gly Glu Gly Gly Phe Asn Val Ala Pro Lys Glu Leu Val Ala Ala Ile

210 215 220

Arg Arg Leu Cys Asp Glu His Gly Ile Val Met Ile Ala Asp Glu Val

225 230 235 240

Gln Ser Gly Phe Ala Arg Thr Gly Lys Leu Phe Ala Met Asp His Tyr

245 250 255

Ala Asp Lys Pro Asp Leu Met Thr Met Ala Lys Ser Leu Ala Gly Gly

260 265 270

Met Pro Leu Ser Gly Val Val Gly Asn Ala Asn Ile Met Asp Ala Pro

275 280 285

Ala Pro Gly Gly Leu Gly Gly Thr Tyr Ala Gly Asn Pro Leu Ala Val

290 295 300

Ala Ala Ala His Ala Val Leu Asn Ile Ile Asp Lys Glu Ser Leu Cys

305 310 315 320

Glu Arg Ala Asn Gln Leu Gly Gln Arg Leu Lys Asn Thr Leu Ile Asp

325 330 335

Ala Lys Glu Ser Val Pro Ala Ile Ala Ala Val Arg Gly Leu Gly Ser

340 345 350

Met Ile Ala Val Glu Phe Asn Asp Pro Gln Thr Gly Glu Pro Ser Ala

355 360 365

Ala Ile Ala Gln Lys Ile Gln Gln Arg Ala Leu Ala Gln Gly Leu Leu

370 375 380

Leu Leu Thr Cys Gly Ala Tyr Gly Asn Val Ile Arg Phe Leu Tyr Pro

385 390 395 400

Leu Thr Ile Pro Asp Ala Gln Phe Asp Ala Ala Met Lys Ile Leu Gln

405 410 415

Asp Ala Leu Ser Asp

420

<210> 31

<211> 464

<212> PRT

<213> 帕氏鲁杰氏菌

<400> 31

Met Ala Thr Ile Thr Asn His Met Pro Thr Ala Glu Leu Gln Ala Leu

1 5 10 15

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Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Leu Asp Ala Met Ala Gly Leu Trp Cys

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85 90 95

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Asp Leu Asn His Val Phe Phe Ala Gly Gly Gly Ser Glu Ala Asn Asp

115 120 125

Thr Asn Ile Arg Met Val Arg Thr Tyr Trp Gln Asn Lys Gly Gln Pro

130 135 140

Glu Lys Thr Val Ile Ile Ser Arg Lys Asn Ala Tyr His Gly Ser Thr

145 150 155 160

Val Ala Ser Ser Ala Leu Gly Gly Met Ala Gly Met His Ala Gln Ser

165 170 175

Gly Leu Ile Pro Asp Val His His Ile Asn Gln Pro Asn Trp Trp Ala

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Glu Gly Gly Asp Met Asp Pro Glu Glu Phe Gly Leu Ala Arg Ala Arg

195 200 205

Glu Leu Glu Glu Ala Ile Leu Glu Leu Gly Glu Asn Arg Val Ala Ala

210 215 220

Phe Ile Ala Glu Pro Val Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Ala Pro

225 230 235 240

Asp Ser Tyr Trp Pro Glu Ile Gln Arg Ile Cys Asp Lys Tyr Asp Ile

245 250 255

Leu Leu Ile Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn

260 265 270

Trp Phe Gly Thr Gln Thr Met Gly Ile Arg Pro His Ile Met Thr Ile

275 280 285

Ala Lys Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Ala Pro Ile Gly Gly Ser Ile Val

290 295 300

Cys Asp Glu Val Ala His Val Ile Gly Lys Asp Glu Phe Asn His Gly

305 310 315 320

Tyr Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu Glu Asn

325 330 335

Leu Arg Ile Leu Glu Glu Glu Asn Ile Leu Asp His Val Arg Asn Val

340 345 350

Ala Ala Pro Tyr Leu Lys Glu Lys Trp Glu Ala Leu Thr Asp His Pro

355 360 365

Leu Val Gly Glu Ala Lys Ile Val Gly Met Met Ala Ser Ile Ala Leu

370 375 380

Thr Pro Asn Lys Ala Ser Arg Ala Lys Phe Ala Ser Glu Pro Gly Thr

385 390 395 400

Ile Gly Tyr Ile Cys Arg Glu Arg Cys Phe Ala Asn Asn Leu Ile Met

405 410 415

Arg His Val Gly Asp Arg Met Ile Ile Ser Pro Pro Leu Val Ile Thr

420 425 430

Pro Ala Glu Ile Asp Glu Met Phe Val Arg Ile Arg Lys Ser Leu Asp

435 440 445

Glu Ala Gln Ala Glu Ile Glu Lys Gln Gly Leu Met Lys Ser Ala Ala

450 455 460

<210> 32

<211> 339

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 32

Met Ser Met Ile Lys Ser Tyr Ala Ala Lys Glu Ala Gly Gly Glu Leu

1 5 10 15

Glu Val Tyr Glu Tyr Asp Pro Gly Glu Leu Arg Pro Gln Asp Val Glu

20 25 30

Val Gln Val Asp Tyr Cys Gly Ile Cys His Ser Asp Leu Ser Met Ile

35 40 45

Asp Asn Glu Trp Gly Phe Ser Gln Tyr Pro Leu Val Ala Gly His Glu

50 55 60

Val Ile Gly Arg Val Val Ala Leu Gly Ser Ala Ala Gln Asp Lys Gly

65 70 75 80

Leu Gln Val Gly Gln Arg Val Gly Ile Gly Trp Thr Ala Arg Ser Cys

85 90 95

Gly His Cys Asp Ala Cys Ile Ser Gly Asn Gln Ile Asn Cys Glu Gln

100 105 110

Gly Ala Val Pro Thr Ile Met Asn Arg Gly Gly Phe Ala Glu Lys Leu

115 120 125

Arg Ala Asp Trp Gln Trp Val Ile Pro Leu Pro Glu Asn Ile Asp Ile

130 135 140

Glu Ser Ala Gly Pro Leu Leu Cys Gly Gly Ile Thr Val Phe Lys Pro

145 150 155 160

Leu Leu Met His His Ile Thr Ala Thr Ser Arg Val Gly Val Ile Gly

165 170 175

Ile Gly Gly Leu Gly His Ile Ala Ile Lys Leu Leu His Ala Met Gly

180 185 190

Cys Glu Val Thr Ala Phe Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Gln Glu Val

195 200 205

Leu Ala Met Gly Ala Asp Lys Val Val Asn Ser Arg Asp Pro Gln Ala

210 215 220

Leu Lys Ala Leu Ala Gly Gln Phe Asp Leu Ile Ile Asn Thr Val Asn

225 230 235 240

Val Ser Leu Asp Trp Gln Pro Tyr Phe Glu Ala Leu Thr Tyr Gly Gly

245 250 255

Asn Phe His Thr Val Gly Ala Val Leu Thr Pro Leu Ser Val Pro Ala

260 265 270

Phe Thr Leu Ile Ala Gly Asp Arg Ser Val Ser Gly Ser Ala Thr Gly

275 280 285

Thr Pro Tyr Glu Leu Arg Lys Leu Met Arg Phe Ala Ala Arg Ser Lys

290 295 300

Val Ala Pro Thr Thr Glu Leu Phe Pro Met Ser Lys Ile Asn Asp Ala

305 310 315 320

Ile Gln His Val Arg Asp Gly Lys Ala Arg Tyr Arg Val Val Leu Lys

325 330 335

Ala Asp Phe

<210> 33

<211> 1206

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 33

atgcgtgaag cctttatttg tgacggaatt cgtacgccaa ttggtcgcta cggcggggca 60

ttatcaagtg ttcgggctga tgatctggct gctatccctt tgcgggaact gctggtgcga 120

aacccgcgtc tcgatgcgga gtgtatcgat gatgtgatcc tcggctgtgc taatcaggcg 180

ggagaagata accgtaacgt agcccggatg gcgactttac tggcggggct gccgcagagt 240

gtttccggca caaccattaa ccgcttgtgt ggttccgggc tggacgcact ggggtttgcc 300

gcacgggcga ttaaagcggg cgatggcgat ttgctgatcg ccggtggcgt ggagtcaatg 360

tcacgggcac cgtttgttat gggcaaggca gccagtgcat tttctcgtca ggctgagatg 420

ttcgatacca ctattggctg gcgatttgtg aacccgctca tggctcagca atttggaact 480

gacagcatgc cggaaacggc agagaatgta gctgaactgt taaaaatctc acgagaagat 540

caagatagtt ttgcgctacg cagtcagcaa cgtacggcaa aagcgcaatc ctcaggcatt 600

ctggctgagg agattgttcc ggttgtgttg aaaaacaaga aaggtgttgt aacagaaata 660

caacatgatg agcatctgcg cccggaaacg acgctggaac agttacgtgg gttaaaagca 720

ccatttcgtg ccaatggggt gattaccgca ggcaatgctt ccggggtgaa tgacggagcc 780

gctgcgttga ttattgccag tgaacagatg gcagcagcgc aaggactgac accgcgggcg 840

cgtatcgtag ccatggcaac cgccggggtg gaaccgcgcc tgatggggct tggtccggtg 900

cctgcaactc gccgggtgct ggaacgcgca gggctgagta ttcacgatat ggacgtgatt 960

gaactgaacg aagcgttcgc ggcccaggcg ttgggtgtac tacgcgaatt ggggctgcct 1020

gatgatgccc cacatgttaa ccccaacgga ggcgctatcg ccttaggcca tccgttggga 1080

atgagtggtg cccgcctggc actggctgcc agccatgagc tgcatcggcg taacggtcgt 1140

tacgcattgt gcaccatgtg catcggtgtc ggtcagggca tcgccatgat tctggagcgt 1200

gtttga 1206

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> paaJ(Ec) pRSFDuet cloning fw

<400> 34

ataaggagat ataccatgcg tgaagccttt atttg 35

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> paaJ(Ec) pRSFDuet cloning rv

<400> 35

tgcggccgca agctttcaaa cacgctccag aatca 35

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pRSFDuet MCS1 Backbone Fw

<400> 36

aagcttgcgg ccgcataatg cttaa 25

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pRSFDuet MCS1 Backbone Rv

<400> 37

catggtatat ctccttatta 20

<210> 38

<211> 1428

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 38

atgatgataa atgtgcaaac tgtggcagtg attgggagcg gcaccatggg ggcaggcatt 60

gctgaagttg ctgccagtca tggacaccag gttttactgt atgacatttc tgctgaagcg 120

ctgacccgcg caatcgacgg gatacacgcg cggctaaatt cacgcgtgac gcggggaaaa 180

ctgactgctg aaacctgtga acgcacattg aaacgcctga tcccggtgac cgatattcac 240

gcgctggcag ctgcggacct ggtcattgaa gcggcgtctg aacgtctgga agtcaaaaaa 300

gcgctctttg cacagctggc ggaagtttgc ccgccacaaa cgctattgac cactaacact 360

tcgtcaatct ctataaccgc gattgctgcg gagataaaaa atcctgaacg tgttgcgggg 420

ctgcattttt ttaacccggc accggtgatg aagttggtgg aggtggtcag tgggctggca 480

acggcggcgg aagttgttga gcagttgtgt gaactaacgt tgagttgggg taagcagcct 540

gtgcgctgtc attcgactcc tggatttatc gttaaccgtg ttgcgcgtcc ttattattcc 600

gaggcctggc gggcactgga agagcaggtt gctgcaccag aagtgattga cgctgcactt 660

cgcgatggcg ctggtttccc gatggggccg ctggaattaa ccgatctgat tggtcaggac 720

gtcaattttg ctgtcacctg ttcggtgttt aacgctttct ggcaggagcg tcgtttttta 780

ccttcgctgg tgcaacagga actggtgatt ggtggacggt tgggcaagaa aagtgggctg 840

ggcgtgtacg actggcgcgc ggaacgtgag gcagttgttg gcctggaagc ggtaagcgac 900

agttttagcc caatgaaagt agaaaagaaa agtgacggtg tcacggaaat tgacgatgtt 960

ttattgattg agacacaagg cgagacggca caggcgctgg caatacgact ggcacgcccg 1020

gtggtagtga tcgataaaat ggcgggcaag gtggtgacca ttgctgctgc agcggtgaac 1080

ccggactcag cgacccgcaa ggccatttat tacctgcaac agcagggcaa aacagtgctg 1140

caaattgcag attacccagg aatgctgatt tggcgaacgg tagcaatgat catcaatgaa 1200

gcccttgatg cgcttcaaaa aggcgtggcc tctgaacagg atatcgatac cgccatgcgt 1260

cttggggtga attatccata tggcccactt gcctggggag cgcaacttgg ctggcagcga 1320

atattaaggc tccttgaaaa tctacagcat cactatggcg aagaacgcta tcgcccatgt 1380

tcattgctgc gccaacgggc gcttctggag agcggttatg agtcataa 1428

<210> 39

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> paaH(Ec) pRSFDuet cloning fw

<400> 39

ggagatatac atatgatgat aaatgtgcaa actgt 35

<210> 40

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> paaH(Ec) pRSFDuet cloning rv

<400> 40

agactcgagg gtaccttatg actcataacc gctct 35

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pRSFDuet MCS2 Backbone Fw

<400> 41

ggtaccctcg agtctggtaa agaaa 25

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pRSFDuet MCS2 Backbone Rv

<400> 42

catatgtata tctccttctt 20

<210> 43

<211> 768

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 43

atgagcgaac tgatcgtcag ccgtcagcaa cgagtattgt tgctgaccct taaccgtccc 60

gccgcacgta atgcgctaaa taatgccctg ctgatgcaac tggtaaatga actggaagct 120

gcggctaccg ataccagcat ttcggtctgt gtgattaccg gtaatgcacg cttttttgcc 180

gctggggccg atctcaacga aatggcagaa aaagatctcg cggccacctt aaacgataca 240

cgtccgcagc tatgggcgcg attgcaggcc tttaataaac cacttatcgc agccgtcaat 300

ggttacgcgc ttggggcggg ttgcgaactg gcattgttgt gcgatgtggt ggttgccgga 360

gagaacgcgc gttttgggtt gccggaaatc actctcggca tcatgcctgg cgcaggcgga 420

acgcaacgtt taatccgtag tgtcggtaaa tcgttagcca gcaaaatggt gctgagcgga 480

gaaagtatca ccgctcagca agcacagcag gccgggctgg ttagcgacgt cttccccagc 540

gatttaaccc tcgaatacgc cttacagctg gcatcgaaaa tggcacgtca ctcgccgctg 600

gccttacaag cggcaaagca agcgctgcgc cagtcgcagg aagtggcttt gcaagccgga 660

cttgcccagg agcgacagtt attcaccttg ctggcggcaa cagaagatcg tcatgaaggc 720

atctccgctt tcttacaaaa acgcacgccc gactttaaag gacgctaa 768

<210> 44

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> paaF(Ec) pETDuet cloning fw

<400> 44

aggagatata ccatgagcga actgatcgtc agccg 35

<210> 45

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> paaF(Ec) pETDuet cloning rv

<400> 45

tgcggccgca agcttttagc gtcctttaaa gtcgg 35

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

ttaacgtcct gcataggtgg gttt 24

<210> 47

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> paaF(L3)opt pETDuet cloning fw

<400> 47

agaaggagat ataccatgca gaccattgaa aatga 35

<210> 48

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> paaF(L3)opt pETDuet cloning rv

<400> 48

tgcggccgca agcttttaac gaccggcata ggtcg 35

<210> 49

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pETDuet MCS1 Backbone fw

<400> 49

aagcttgcgg ccgcataatg cttaa 25

<210> 50

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pETDuet MCS1 Backbone rv

<400> 50

catggtatat ctccttctta aagtt 25

<210> 51

<211> 1155

<212> DNA

<213> 贝氏不动杆菌

<400> 51

atgattcgtg atgaaggtat gctgcaacag ctgctgagca ccattcgtga ttttgttaaa 60

aatgaactga ttccgcgtga acatgaagtg gcagaaaaag attgtattcc cgaagatatt 120

attcagcaga tgcgtgaact gggtctgttt ggtctgacca ttccggaaga atatggtggt 180

ctgggtatta ccatggaaga agaagttaac gttgcatttg aactgggcca gaccagtccg 240

gcatttcgta gcctgattgg caccaataat ggtattggta gcagcggtct gattattgat 300

ggcaccgaag aacagaaaca gaaatatctg cctcgttatg caagcggtga aattattggt 360

agtttttgtc tgaccgaacc ggaagcaggt agtgatgcag caagcctgaa aaccaccgca 420

gttaaagatg gtgatttcta tattctgaac ggcaccaaac gctttattac caatgcaccg 480

catgcagcaa cctttaccgt tatggcacgt accaatccgg caattaaagg tgccggtggt 540

attagcgcat ttctggttga agcaaataca ccgggtatta cgctgggtaa aattgatcag 600

aaaatgggtc agaaaggtag ccatacctgt gatgtgattt ttgaaaattg tcgtgttccg 660

gcaagcgcac tgattggtgg tgttgaaggt gttggcttta aaaccgcaat gaaagttctg 720

gataaaggtc gtctgcatat tggtgcatat agcgttggtg ttgcagaacg tatgctgaat 780

gatgcactgc attatgccgt tgaacgtaaa cagtttggtc agccgattgc aaattttcag 840

ctgattcagg caatgctggc agatagcaaa gcagaaattt atgcagccaa atgcatggtt 900

ctggatgcag cacgtcgtcg tgatgagggt cagaatatta gcaccgaagc aagctgtgca 960

aaaatgtttg caaccgaaat gtgtggtcgt gttgccgatc gttgtgttca gattcatggt 1020

ggtgcaggtt atattagcga atacagcatt gaacgcttct atcgtgatgt gcgtctgttt 1080

cgcctgtatg aaggtacaac ccaggtgcag cagattatta tcgccaaaaa catgatcaaa 1140

gaggtgacca gctaa 1155

<210> 52

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dcaA(Ab)opt pETDuet cloning fw

<400> 52

gaaggagata tacatatgat tcgtgatgaa ggtat 35

<210> 53

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dcaA(Ab)opt pETDuet cloning rv

<400> 53

tggcagcagc ctaggttagc tggtcacctc tttga 35

<210> 54

<211> 1095

<212> DNA

<213> 热带念珠菌

<400> 54

atgattaccg cacaggcagt tctgtatacc cagcatggtg aaccgaaaga tgtgctgttt 60

acccagagct ttgaaatcga tgatgataat ctggcaccga acgaagttat tgttaaaacc 120

ctgggtagtc cggttaatcc gagcgatatt aatcagattc agggtgttta tccgagcaaa 180

ccggcaaaaa ccaccggttt tggcaccacc gaaccggcag caccgtgtgg taatgaaggt 240

ctgtttgaag ttattaaagt gggcagcaat gttagcagcc tggaagccgg tgattgggtt 300

attccgagcc atgtgaattt tggtacatgg cgtacccatg cactgggcaa tgatgatgat 360

tttatcaaac tgccgaatcc ggcacagagc aaagcaaatg gtaaaccgaa tggcctgacc 420

attaatcagg gtgcaaccat tagcgttaat ccgctgaccg catatctgat gctgacccat 480

tatgttaaac tgacaccggg taaagattgg tttattcaga atggtggcac cagcgcagtt 540

ggtaaatatg caagccagat tggtaaactg ctgaacttta atagcattag cgtgattcgt 600

gatcgtccga atctggatga agttgttgca agcctgaaag aactgggtgc gacccaggtt 660

attaccgaag atcagaataa tagccgtgaa tttggtccga ccattaaaga atggattaaa 720

cagagcggtg gtgaagcaaa actggcactg aattgtgttg gtggtaaaag cagcaccggt 780

attgcacgta aactgaataa taacggtctg atgttaacct atggtggcat gagctttcag 840

ccggttacca ttccgaccag cctgtatatc tttaaaaact ttaccagtgc cggtttttgg 900

gttaccgagc tgctgaaaaa taacaaagaa ctgaaaacca gcacgctgaa ccagattatt 960

gcatggtatg aagagggtaa actgaccgat gcaaaaagca ttgaaaccct gtatgatggc 1020

accaaaccgc tgcatgaact gtatcaggat ggtgttgcaa atagcaaaga tggcaaacag 1080

ctgatcacct actaa 1095

<210> 55

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(Ct)opt N22AAcut pETDuet cloning fw

<400> 55

gaaggagata tacatatgat taccgcacag gcagt 35

<210> 56

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(Ct)opt N22AAcut pETDuet cloning rv

<400> 56

tggcagcagc ctaggttagt aggtgatcag ctgtt 35

<210> 57

<211> 1167

<212> DNA

<213> 耳念珠菌

<400> 57

atgtttgttc caaccgttgc tgggaaacgc tttctgacca atcagctgcg caaaagtccg 60

cagttcaccc gtatgctgac ttcacacgcg gtgattttca gctctcatgg ggaacccaaa 120

gacgttctga aaacgcatac gtacgaaatc gatgagaaca acatcaaacc caacgagatt 180

gtcctgaaaa ccttgggtgc tccggtcaat ccatcggaca ttaaccaggt gcagggtgta 240

tatcctagcc aaccggagaa aacgacccaa ctgggaactt cggaaccgtc agccgttggt 300

ggcaatgaag ggctctttga gatcatcaaa attggcagtg atgtgaaagg ctttcaagtt 360

ggtgattggg ccattccgac ctcggtcaac tttggtacgt ggcgtagtca tgcgctgtgc 420

gaagaaggca aaatgatgaa agtcccgaac ccggaacagt ctaaacaggc cggtaagaaa 480

cagggcttaa ccatcaatca aggtgcgacc ttaagcgtga atccgcttac agcctacctt 540

atgctcacac actacgtgaa actcacaccg ggtaaggact ggtttatcca gaacggtggc 600

aatagcgcag tcggaaaatt tgcgagccaa attgggaaat tactggggat tcatagcatt 660

tccgtggttc gcgatcgtcc tgaaattgaa gaactgaaga aagagctgaa ggaagtatgt 720

ggtgcgactc aggtaatcac cgaagagcag aacaactcca aggacttcgg ccctcaggtg 780

aagcagtggg tgaaagaaac tggcggcgag atcaaactgg cgctgaattg cgtaggtggc 840

aaaagcagtg caggcgttgc acggaaactc gctcccaacg gactgatgct gacatatggc 900

ggcatgtcat ttcaaccggt aaccttgcca acgagcttgc acattttcaa gaatgtgacg 960

tctgcgggct tctgggtgac ggaactgctg aaatctgatc cgaacctgaa acgcgaaacc 1020

gttgacaaaa ttgtcgagtg gtatacctca ggcgaattac ttgatgcgcc atcgaaagaa 1080

aatcagtggg gtgatcaaga tctggcacaa gtgttcattg atgccgtcgc caactccaaa 1140

tccggaaaac agttggtgaa gttttaa 1167

<210> 58

<211> 1143

<212> DNA

<213> 马克斯克鲁维酵母

<400> 58

atgagttcat ttctcagcaa acgcttcatt agcacgacgc aacgtgccat gagccaattg 60

ccgaaagcca aatcgctgat ctactcatcc catgatcagg acgtgagtaa aatcctgaaa 120

gtgcatactt accagccgaa agggtcagcg gaaagctcga tcctgctcaa aacgttagcc 180

tttccgatca atccttccga catcaaccaa ctggaagggg tatatccgag taagccggaa 240

aaggtgttgg attactcaac ggaagaaccg agcgctattg ctggcaatga gggtctgttt 300

gaggttgtat cggtacctag cggtgtcaag aatctgaaag ctggtgaccg tgtcattcca 360

cttcaggcga actttggcac ctggtctacg tatcgcacat gcgaaagcga gaatgacttg 420

atcaaaatcg aaggcgtaga tctctatacc gcagcaacca ttgcggtgaa tggctgtacc 480

gcgtaccaaa tggtgaatga ctacattgag tgggatccta gtggcaacga ttggctggtt 540

cagaacgcgg gtacaagttc tgtatccaaa attgtgaccc agatcgctaa agacaagggc 600

atcaaaaccc tgtcggtggt tcgtgatcgc gataactttg acgaagttgc ggagaaactg 660

gaaaagaaat atggtgcgac caaagtgatt tctgaaagcc agaacggaga acgtgagttc 720

gggaatgaag tcttaccgaa gattcttggt cccaatgccc aggttaaact cgcgttaaac 780

tctgtgggcg gtaaaagctg cactaacatt gcccgcaaac tgagtccaaa cggattaatg 840

ctgacctatg gcggcatgtc caaacagccg gttacactgc caactggcct gtttatcttc 900

aatagcattc ggtcgcacgg tttctgggtt accgcaaatt cgaaacgcga tcccgaaaac 960

aaacggaaaa ctgtggatgc cgtggtcaaa ctgtatcgcg atggcaagat tatttccccg 1020

aaagaggaca ttcgtaccct ggaatgggat gtcaacaatc tgtctgatga aggtgtcctt 1080

gatttggtca accgcggaat tgcaacgaaa ggggcaaaga acatggttgt gctgaaatgg 1140

taa 1143

<210> 59

<211> 1122

<212> DNA

<213> 库德里阿兹威毕赤酵母

<400> 59

atgagtctgc gttccgtgtt tagcgtgagt tccattcgtc ggatgtcctc tatcacggct 60

cgcgcaatcg tctataacgc gcatggcgaa ccgaaagata ccctgaaatg ccacagctac 120

aagatcgacc ttcagaattt acagcctaac gaggttgtcg tacaaactct cgcagcgcca 180

ctgaacccga gtgatatcaa ccagattcag ggtgtttacc cgtctaagcc tccgctgagc 240

attgactcac tgccagaact gaaagaaccg gccgctgtta ctggcaatga gggtgtgttc 300

aaagtgattg ccaaagggtc gaatgtagga gaactggaaa cgggagactg gtgtattccg 360

tctggcgtaa actttggtac ctggtgtacg caccgcttaa ccacggataa gaatctgctg 420

aaaatgccga aaaccatctc gttaaaccag gcagcaacca ttgccgtcaa cccctcatcg 480

gcatatcaga tgctgacgca ctttgtgaaa ctgcaaccag gtgattggtt tatccagaat 540

ggcgccaatt cccaagttgg tcgtgcagcg attcagattg gccataaact ggggtacaaa 600

tcgttgaaca ttgttcgcaa ccgtgacaac ttggatgagc tggtgaagga cctggaatcg 660

attggggcga ctaaagtgat tacagaagat gaaagcgcga gcaaagagtt tggcgctacg 720

gttaaagagt ggcttgaggg caaagagatc aaactcggtc tgaattgcat tggtggtccg 780

tctgcgtcaa acttagcccg caaattgggc catgatgcta ccatcctgac gtatggcgcg 840

atgagcaaga aaccgctctc attgccgact gggaatttca tctttaagaa tctcaccgcc 900

aaaggatttt ggattacagg taacatcaaa cgccatccag aactgcgcat cgaaaccatt 960

aatgcggtcc tgaaattcat ggaagatggc acccttaagg aacctaaagt gaacgaaccc 1020

aaagtcaaac tgagtaccac aacaaatgaa agcttccttg aaaccgtgct ggccgcgttg 1080

gaagatagcc aaaagggcaa acaactgtta aaattcgaat aa 1122

<210> 60

<211> 1347

<212> DNA

<213> 喜热梭孢壳

<400> 60

atggcgtcag tcttatcacc aaacgcagca gcacgtcatc tgctgcgtcc tgctacccgg 60

tctacaccgc ctcgtttact gccgtccgca atcttacacc aaagcggcaa taactccacg 120

cgcaatccgc gcattagcga tccgcagtca attgctcaac ggttaggtcg tcgctacaaa 180

tcgggcccgt acggctatac gcaggccaaa acgctggtgt tttcgcgttt cggagaaccc 240

tccgatgttc tgcgcctgca tacgcatagc atcagtccga cactgccgga tggtgcggtt 300

ctggtgcggg cactggcagc tccagtaaac ccggcggatg tcaacactat ccaaggcacc 360

tatggtgcgc gtccagcttt cagcccctta ctcggcactc ccgaacctag tgcggttcca 420

ggcaacgaag gttgctttga agttgtcgca gttggtccac gtgtcggcgg cggtctgcgt 480

aaaggggatt gggtgattcc ggccaccacc ggctttggca cctttcgcac acacgcgttg 540

gtggagaatg ccgatcgcgc tctgcttcgc gtaggaggtg acaaaggtac cgcgggtctg 600

accgccaaac aggtggccac ggtaagcgtc aatccgtgtt cggcctatcg tatgctcaag 660

gactacgtcg atctggtgga cttgagtgtg aagtcctttg ctcgcggtga tggggccact 720

ggcggggcgt ggtttctcca gaatggcgcg aatagcggag ttggtcgcgc ggcgattcag 780

ctgggccgcc tctggggtct gcgctcgatt aacgtggttc gtgaacgcgc taccgccgaa 840

gaaaccgaag cattgaaaag cgaactgcgt gagcttggtg cgacggttgt tgtgaccgaa 900

gcggaattcc ttgatcgctc tttctcggcc cgcttgaaag aagagtggac acgcggcgat 960

cgcgaaccgg tgatgctggg tttgaactgt gtaggcggga aaagcgcgag cgccatgatc 1020

aaggccctgt ctccgaaagg ttgcatggtg acttatggcg ggatgagtcg tcagtcattc 1080

ccctttccga ctggtcctca gatctttaaa cgcctgcgtt ttgagggatt ctggctgagt 1140

gaatgggcca aagagaatcc ggcggagaaa cgcaacacca ttaatgagat tctggagctg 1200

atgcgggaag gcaaattcaa agagtctccg ttcaaagaag tggaatggaa ctgggacacg 1260

gaagaaaagg tactgaaaga cgcaattcaa ggcacccttg aagggttcaa gtccgggaaa 1320

ggattatttg tctttggcga cacgtaa 1347

<210> 61

<211> 1332

<212> DNA

<213> 太瑞斯梭孢壳霉

<400> 61

atggccagcg ccttgaatcc tcgccatctg ccgctgcgct tagccttacg tcctcgcttg 60

ccactgctgc catccacgag ctctaccacc acaaccacaa ccccaccctc gtgtctgccg 120

attccgacct ctattcgtct gcctccccgt cgtcacaaat cagggccgta tggttacacg 180

cttgcgaaaa ccttagtgtt tagtcgcttt ggtgaacccc gcgatgtact gtcgcttcat 240

acccacagca ttagccccgc actgccggat ggggcggctc tgttacgcgc tcttgcagcg 300

ccggtcaatc cggcggacgt aaacaccgtc caagggacct atggcgccaa accggcgttt 360

gagcgtctgc tgggtactcc ggaaccggct gcagtaccgg gcaatgaggg ttgcttcgaa 420

gtcgttgcca ttggtggagg tgccggtggt ggcggtggtc ttaagaaagg tgactgggtt 480

attcctgcac agagtggctt cggcaccttc cgcacacatg cgttggtgga aggcgcagaa 540

cgcaaactga ttcgtgtggg aggcgccaaa gggcgtgaag gtctgcgtgc tgcgcaagtt 600

gcgacggtgt ctgtgaatcc atgtagcgca tatcggatgc tccgtgatta cgtagactta 660

gtggacctga gcgtgcagtc atttgctcgc ggtgatggcg caaccggcgg cgcgtggttc 720

gtgcagaacg gagccaacag tggcgttggt cgtgcggcta ttcaactggg acgtctgtgg 780

ggcttgcgtt cgatcaacgt ggttcgggaa cgtgcgactc cggaagaaac cgcggcctta 840

aaacgcgaac tcgccgagtt gggtgcaacg gtagtcgtta cggaatccga attcctcgat 900

cgctcgtttg ctgaccggct gcgcgatgag tggactcgcg gcggccgcga accggtgatg 960

ctcggtctga actgcgttgg cgggaaatct gccgcagcca tggtcaaagc gctgagtcca 1020

cgcggatgca tggtcacata cggcggtatg agccgccagt ccttcccgtt tccgactggc 1080

cagcagatct ttaagcgcct gcgctttgag ggcttttggc tgtcagagtg ggcgaaagag 1140

aatcctgcgg cgaaacggga taccatcaac gagattctgg aattgatgcg tgaaggcaaa 1200

ttcaaggaag caccgctcca agaagttgaa tggaactggg atacggaaga atccgtgctg 1260

aaagacacga tccaggggac tctggagggg tttcgcccag gcaaaagcat cttcgtcttt 1320

aaggatacgt aa 1332

<210> 62

<211> 1320

<212> DNA

<213> 嗜热毛壳菌

<400> 62

atggctagca tcctgtcccc tcattctgct ctccgtttgg gaggaatctc cacgctgtca 60

cgtcagaccc tgctgcgtac ctctcgtgtg accttaaccc agttaccgaa aaccgctccg 120

cagttaccgc aacgtcggca taaaagtgcg ccttacggct atacccagtc caaaacgctg 180

gtgtttccgc gtttcgggga gccgattgac gttctgtcgt tacacactca ctcgattagc 240

ccgacccttc ccgatactgc ggtgctgctt cgcacgctgg cggcgcccat taatcctgcg 300

gacgtcaaca cgattcaggg gacctatggc gcaaagccga cgttcagcaa cttactgggc 360

accgcagagc ctgcagcagt tccggggaat gaaggtgtat ttgaggtcgt ttcggttggc 420

tcggaaattg caaaacgtgg cgtgttcaag aaaggtgatt gggtcattcc gagcagtagc 480

ggctttggca cttttcgcac ccatgtactg gttgaagaag cggagcagaa actgtggcgc 540

attggcggcg agaaaggcac cgaaggttta acgccagtac aggtcgcaac ggtttcggtg 600

aatccgtgtt ctgcgtatcg catgctgcgt gactatgtgg atctggtggg cgtgagcgta 660

cgcatgtacc aggaaggtgg gtcagatgtc cgtggtggag cgtggttcct gcaaaatggc 720

gccaactcag gtgttggacg cgctgccatt caactcgggc gtttgtgggg tttgcgctca 780

atcaacgtgg tacgggagcg cgcgactgcc gaagaaacag aagccctgaa gaaagagctg 840

tacgatcttg gggccactgt ggtggtgacc gaatccgaat tcctggatcg cagttttaca 900

cagcgcctga atgaggaatg gacacgggga ggtaaagagc cattgctgct tgccctgaac 960

tgcgtgggtg gcaaaagtgc ccaacagatt gttcgcgctc tgtctccgaa aggcactatg 1020

gtcacgtatg gcggtatgag ccgccaaagc tttccgtttc cgacgggtcc acagatcttt 1080

aaacgtctgc gctttgaagg tttctggctc tccgaatggg ccaaagaaaa ccccgcagaa 1140

aagaagaaat gcgtagatga gatcatcgaa ctgatgcgcg aaggcaaatt caaagaagcg 1200

ccagtccagg aaattcgctg ggattgggaa accgaagaaa aggtcttgaa agaggcggtt 1260

caaggcacac tcgaaggctt tcgcagtggt aaaggtgtgt ttatcttcgg tgacacctaa 1320

<210> 63

<211> 1269

<212> DNA

<213> 丝状真菌柄孢霉

<400> 63

atggcagctc cgcgtctgac ctctaaagcc ttacgcttac cgacgagcaa actcttgcgt 60

ccagcgctga caactgctac gcctcgcgca gccccaacct tgacccagaa acgtcatctg 120

actggtccat atggctacca ccagagcaaa gcgctgacct tctccagctt tggcgaaccg 180

attgacgtgc tctcactgca tacgcactcg attagtccga cattaccctc aggtagtgtc 240

ttagtgcgta ctctcgcggc accggtaaac ccggcagacg ttaacaccat tcaagggacc 300

tacggatcca agccgccctt tacgacgctg ttgggtacgg cccaaccgtc ggcggttccg 360

ggcaatgaag cgtgctttga ggtgctgtct gtgggccaag gggtgaaagg gctcgaaaag 420

ggcgattggg tcattccagc caagactggg ttcggcacct ttcggactca tgcccttgtg 480

gaagaagctg aggggaaact gatgcgtgta gaacgcgaag gcttgacgcc ggttcaggta 540

gccaccgtta gcgtcaaccc ttgttcggcg tatcgcatgc tgaaagacta cgtggatctg 600

gttggcctgt ccatgcgctg gtatcgcgaa ggtaaagatg tgagcggtgg cgcctggttc 660

ctgcagaatg gcgcgaactc tggagttggc cgtgcggccg tgcaatttgg ccgtttgtgg 720

ggtttacgca gcatcaacgt tgtacgcgaa cgtgaaacac ctgaagaaac cgaaaagtta 780

aaagaagaac tgacgggttt gggtgcgaac gtcgtcctga ccgagcagga atttcttgat 840

cgctcttttc gcgatcggct gggtgagctg acgaaacgcg gtaaagaacc cctgctgctt 900

ggtatgaatt gtgtgggcgg aaaatccgca tcagcggtag tcaaagctct ctcgccaaaa 960

ggctgcatgg tcacctatgg cggtatgagt cgtcagagct tcccgtttcc tactggtccg 1020

cagatcttca agcgtctgcg cttcgaaggc ttctggcttt cagagtgggg taaagagaat 1080

ccggaaggga agaagaaaat gatcgaagat attctgaacc tgatgcgcga agggaaattc 1140

aaagaaagcc cggttcaaga ggtggagtgg aattgggaaa ccgaggagaa aaccctgaaa 1200

gaggcagttc agggaacact gggtggcttt cgcagtggca aaggcgtgtt tgtgtttgga 1260

gaaacctaa 1269

<210> 64

<211> 1275

<212> DNA

<213> 淡紫拟青霉菌

<400> 64

atggcgagta gtcgcctgct cggaccacca ctgcgcctcc caagctcggg attcagccgc 60

ccggttgctg ccctgaattg tcgtgcggca gcactgccct tgcatctgcc acgtacagcg 120

gtccggtatc gttcggggcc ttacggttac actcaggcga aggcccttgt gtacagcaag 180

aacggcgaac cggcagatgt gctgaagtta cacacgcaca gtatttcccc ttcaattccg 240

tccacctccg ttctggtacg ctgcctggcc gctccgatta acccggctga tgtcaacacg 300

attcagggga cctatggcag caaacaaccg ctcacgagct taattgggac cagtgaaccc 360

tccgcagttc cgggcaatga aggcgtcttt gaagttctct cagccggttc cccgagcagc 420

gagctgaaga agggagattg ggtgatccct gccgcatctc agattggcac atggcgcacc 480

catgcggtgt ttggggctga cgagctcttg aaagtcgaca aagagggtct gacgccgact 540

caagtttctc ttgtgtcggt taacccgtgt acggcgtatc gcatcctgcg gagctatggt 600

ccctcagctg gcgtgaaagc ggcgttaggc atgcgcccgt tagaggtggg tagtggacag 660

tggtttatcc agaatggcgc gaattctggc gttggccgtg cagccattca gtttggcaaa 720

ctgtggggct tgcgctcgat caacgtcatt cgcgaccgtg acaccgtcga agccacagac 780

gcactgaaac aggagttgcg ggatttgggc gcggatgtcg tagttgctga atctgagttc 840

ctgtctcgtg gttggaaaga ccaactggcg gaaattaccc gcaaagggcg tgaacaggta 900

gggcttggcc tgaattgcgt gggtggcaaa tcagccacgg cacttgcgcg tagcctgggt 960

gaaggtgcca ctctggtaag ctatggtggt atggcgaaac aaccggtggc gttacctgtc 1020

ggtctgttga tcttcaaaga tatccgcttc gttggctttt ggctgtcgaa atggaaccag 1080

caggatgtgg tgggtcgtcg ccatatggta gcagacatcc tgggactgat gcgtgacggt 1140

aaattccgcg atgccccggt ggatgaagtg aaatgggatt gggataccga tgaagcgacc 1200

ctgcgtgggg ctgcccaacg cggcttagaa ggttttcgcc aaggtaaagg cgtatacgtg 1260

tttggcgata cctaa 1275

<210> 65

<211> 1218

<212> DNA

<213> 圆核腔菌

<400> 65

atggcgtcta aactgatctc gcctagtccg cgcctcgcac agagctgttt acgccgcact 60

cgtaatttgg ccccggtgac tgcgcgcttt ccccaacgcc gctacatctc tgcctatggg 120

tatgaacagg caaaagctct gacgtttacc gaatacgggg atccatctgc ggtgctgagc 180

ttgcacagcc actccatctc gccgcctcat agcaactata tgaccctgcg cttcctggcg 240

agcccgatca atccagcaga cattaaccaa attcagggcg tttatccgtc caaacccact 300

tttacgacgt cgctgggtac tccgaaccca attgccgtcg ctggcaatga aggcgtggcg 360

gaaattattg cgctgggtga aggtgttaag aaagaaggct tcaagaaagg cgattgggtc 420

tttatgaaag gcccgggctt tggcacatgg cgtacccatg ccagtgcaac taccaacgat 480

gtcgtcaagc tgaatgacca gatgcgggaa ggtatcacgg ccattcaagc gggcaccgtt 540

tcaattaatc cgtgcaccgc ttatcgtatg cttcgggatt ttaccaccct gagcgaagga 600

gattggttta tccagaatgg cgccaattca ggcgtgggtc gtgcagcaat tcagctgggt 660

cgcaaatggg gatacaaatc cattaacatt attcgcagtc gtgaggataa gaacaaagaa 720

gaggcgatga agaaagagct gcataacctc ggggccgatg tggtaattac ggatgcagag 780

ttacaagcgc aagggatcaa agaccaggcc aaagagtgga caaacggtgg acgtagccct 840

attcgccttg cgttaaactg cgtgaatggc aaagctgcta ccgcgatggc gaaactgctg 900

tcgagttcag cccatttcgt aacctatggt gcgatgtcca agcagccgtt gaccatccca 960

gccagcatgc ttattttcaa agatatccac tttcatggtt tctgggtgtc tcgctgggca 1020

gaagaacacc cggaagagaa acagaaaacg gttgcggatg tcctcgacat gacacgtaag 1080

ggagagttca aagacatgcc ggttgatgaa atcaaatggg aatgggaaac aaaaggggag 1140

gaactggttg ctaaagtgaa agacacgtta gaaggttacc gtgacggtaa aggcatcttc 1200

gtatttggca aaacctaa 1218

<210> 66

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(caur) pETDuet cloning fw

<400> 66

gaaggagata tacatatgtt tgttccaacc gttgc 35

<210> 67

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(caur) pETDuet cloning rv

<400> 67

tggcagcagc ctaggttaaa acttcaccaa ctgtt 35

<210> 68

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(kmx) pETDuet cloning fw

<400> 68

gaaggagata tacatatgag ttcatttctc agcaa 35

<210> 69

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(kmx) pETDuet rv

<400> 69

tggcagcagc ctaggttacc atttcagcac aacca 35

<210> 70

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(pkz) pETDuet cloning fw

<400> 70

gaaggagata tacatatgag tctgcgttcc gtgtt 35

<210> 71

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(pkz) pETDuet cloning rv

<400> 71

tggcagcagc ctaggttatt cgaattttaa cagtt 35

<210> 72

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(mtm) pETDuet cloning fw

<400> 72

gaaggagata tacatatggc gtcagtctta tcacc 35

<210> 73

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(mtm) pETDuet cloning rv

<400> 73

tggcagcagc ctaggttacg tgtcgccaaa gacaa 35

<210> 74

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(ttt) pETDuet cloning fw

<400> 74

gaaggagata tacatatggc cagcgccttg aatcc 35

<210> 75

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(ttt) pETDuet Ecloning rv

<400> 75

tggcagcagc ctaggttacg tatccttaaa gacga 35

<210> 76

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(cthr) pETDuet cloning fw

<400> 76

gaaggagata tacatatggc tagcatcctg tcccc 35

<210> 77

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(cthr) pETDuet cloning rv

<400> 77

tggcagcagc ctaggttagg tgtcaccgaa gataa 35

<210> 78

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(pan) pETDuet cloning fw

<400> 78

gaaggagata tacatatggc agctccgcgt ctgac 35

<210> 79

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(pan) pETDuet cloning rv

<400> 79

tggcagcagc ctaggttagg tttctccaaa cacaa 35

<210> 80

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(plj) pETDuet cloning fw

<400> 80

gaaggagata tacatatggc gagtagtcgc ctgct 35

<210> 81

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(plj) pETDuet cloning rv

<400> 81

tggcagcagc ctaggttagg tatcgccaaa cacgt 35

<210> 82

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(pte) pETDuet Ecloning fw

<400> 82

gaaggagata tacatatggc gtctaaactg atctc 35

<210> 83

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ter(pte) pETDuet cloning rv

<400> 83

tggcagcagc ctaggttagg ttttgccaaa tacga 35

<210> 84

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pETDuet MCS2 Backbone Fw

<400> 84

cctaggctgc tgccaccgct gagca 25

<210> 85

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pETDuet MCS2 Backbone Rv

<400> 85

catatgtata tctccttctt atact 25

<210> 86

<211> 3537

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mab4714opt W283RA303A

<400> 86

atgaccgaaa ccattagcac cgcagcagtt ccgaccaccg atctggaaga acaggttaaa 60

cgtcgtattg aacaggttgt tagcaatgat ccgcagctgg cagccctgct gccggaagat 120

agcgttaccg aagcagttaa tgaaccggat ctgccgctgg ttgaagttat tcgtcgtctg 180

ctggaaggtt atggtgatcg tccggcactg ggtcagcgtg catttgaatt tgttaccggt 240

gatgatggtg caaccgttat tgcactgaaa ccggaataca ccaccgttag ctatcgtgaa 300

ctgtgggaac gtgccgaagc aattgcagca gcatggcatg aacagggtat tcgtgatggt 360

gattttgttg cacagctggg ttttaccagc accgattttg caagcctgga tgttgcaggt 420

ctgcgtctgg gtacagttag cgttccgctg cagaccggtg ccagcctgca gcagcgtaat 480

gcaatcctgg aagaaacccg tccggcagtt tttgcagcaa gcattgaata tctggatgca 540

gcagttgata gcgttctggc aaccccgagc gtgcgtctgc tgagcgtttt tgattatcat 600

gccgaagtgg atagccagcg tgaagcactg gaagcagttc gtgcacgtct ggaaagcgca 660

ggtcgtacca ttgttgttga agccctggcc gaagcgctgg cacgtggtcg tgatctgcca 720

gcagcaccgc tgccgagtgc cgatccggat gcactgcgcc tgctgattta taccagcggt 780

agcaccggta caccgaaagg tgccatgtat ccgcagtggc tggttgcaaa tctgtggcag 840

aaaaaaaggc tgaccgatga tgttattccg agcattggtg tgaattttat gccgatgagc 900

catctgatgg gtcgtctgac cctgatgggc accctgagcg gtggtggcac cgcctattat 960

atcgcaagca gcgatctgag cacctttttt gaagatattg ccctgattcg tccgagcgaa 1020

gttctgtttg ttccgcgtgt tgtggaaatg gtttttcagc gttttcaggc agaactggat 1080

cgtagcctgg ctccgggtga aagcaatagc gaaattgcag aacgtattaa agtgcgtatt 1140

cgcgaacagg attttggtgg tcgtgtgctg agcgcaggta gcggtagtgc accgctgagt 1200

ccggaaatga ccgaatttat ggaaagcctg ctgcaagtgc cgctgcgtga tggttatggt 1260

agtaccgaag ccggtggtgt ttggcgtgat ggcgttctgc agcgtccgcc tgttaccgat 1320

tataaactgg ttgatgtgcc ggaactgggt tattttacca ccgatagtcc gcatccgcgt 1380

ggtgaactgc gtctgaaaag cgaaaccatg tttccgggtt attacaaacg tccggaaacc 1440

accgcagatg tttttgatga tgaaggctat tacaaaacgg gtgatgtggt tgctgaactg 1500

ggtcctgatc atctgaaata cctggatcgt gttaaaaacg ttctgaaact ggcacagggt 1560

gaatttgtgg cagttagcaa actggaagcc gcatataccg gtagtccgct ggttcgtcag 1620

atttttgttt atggtaatag cgaacgtagc tttctgctgg ccgttgttgt tccgacaccg 1680

gaagttctgg aacgttatgc agatagtccg gatgcgctga aaccgctgat tcaggatagt 1740

ctgcagcagg ttgcaaaaga tgcagaactg cagagctatg aaattccgcg tgattttatt 1800

gttgaaaccg ttccgtttac cgttgaaagc ggactgctga gtgatgcacg taaactgtta 1860

cgtccgaaac tgaaagatca ttatggtgaa cgcctggaag ccctgtatgc cgaactggca 1920

gaaagccaga atgaacgtct gcgtcagctg gcacgcgaag cagcaacacg tccggttctg 1980

gaaaccgtta ccgatgccgc agccgcactg ctgggtgcaa gcagctccga tctggcacca 2040

gatgttcgtt ttattgattt aggtggtgat agcctgagcg cactgagcta tagcgagctg 2100

ctgcgcgata tttttgaagt tgatgttccg gttggtgtga ttaatagcgt tgcaaatgat 2160

ctggcagcaa ttgcccgtca tattgaagca cagcgtacag gtgcagcaac ccagccgacc 2220

tttgcaagcg ttcatggtaa agatgccacc gttattaccg caggcgaact gaccctggat 2280

aaatttctgg atgaaagtct gctgaaagca gccaaagatg ttcagcctgc gacagcagat 2340

gttaaaaccg tgctggtgac cggtggtaat ggctggttag gtcgttggct ggttctggat 2400

tggctggaac gtctggcacc gaatggtggt aaagtttatg cactgattcg tggtgcagat 2460

gcggaagcag cacgcgcacg cctggatgcc gtttatgaaa gcggtgatcc taaactgagt 2520

gcacattatc gtcaactggc ccagcagagc ctggaagtta ttgcaggcga ttttggcgat 2580

caggatctgg gtctgagcca agaagtttgg cagaaactgg cgaaagatgt tgatctgatt 2640

gttcatagcg gtgccctggt taatcatgtt ctgccgtata gccagctgtt tggtccgaat 2700

gttgccggta cagcagaaat tatcaaactg gcaattagcg aacgcctgaa acctgttacc 2760

tatctgagta ccgttggtat tgcagatcag attccggtta ccgaatttga agaggatagt 2820

gatgttcgcg ttatgagcgc agaacgtcag attaatgatg gctatgcaaa tggctatggc 2880

aatagcaaat gggctggtga agttctgctg cgtgaagccc atgatttagc cggtctgccg 2940

gttcgtgttt ttcgtagcga tatgattctg gcacatagcg attatcacgg tcagctgaat 3000

gtgaccgatg tttttacccg tagcattcag agtctgctgc tgacaggtgt tgcaccggca 3060

agcttttatg aactggatgc ggatggtaat cgccagcgtg cccattatga tggtgttcca 3120

ggtgatttta ccgcagccag cattaccgca attggtggtg ttaatgttgt ggatggttat 3180

cgcagctttg atgtgtttaa tccgcatcac gatggtgtta gcatggatac ctttgttgat 3240

tggctgattg atgccggtta caaaattgca cgcatcgatg attatgatca gtggttagca 3300

cgttttgaac tggccctgaa aggcctgcct gaacagcagc gtcagcagag cgttctgcca 3360

ctgctgaaaa tgtatgaaaa accgcagcct gcaattgatg gtagcgcact gccgaccgca 3420

gaatttagcc gtgcagttca tgaagcaaaa gtgggtgata gtggtgaaat cccgcatgtt 3480

accaaagaac tgattctgaa atatgccagc gatattcagc tgctgggttt agtttaa 3537

<210> 87

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACYCDuet Mab4714opt cloning fw

<400> 87

gaaggagata tacatatgac cgaaaccatt agcac 35

<210> 88

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACYCDuet Mab4714opt cloning rv

<400> 88

gtggcagcag cctagttaaa ctaaacccag cagct 35

<210> 89

<211> 669

<212> DNA

<213> 艾阿华诺卡氏菌

<400> 89

atgatcgaga caattttgcc tgctggtgtc gagtcggctg agctgctgga gtatccggag 60

gacctgaagg cgcatccggc ggaggagcat ctcatcgcga agtcggtgga gaagcggcgc 120

cgggacttca tcggggccag gcattgtgcc cggctggcgc tggctgagct cggcgagccg 180

ccggtggcga tcggcaaagg ggagcggggt gcgccgatct ggccgcgcgg cgtcgtcggc 240

agcctcaccc attgcgacgg atatcgggcc gcggcggtgg cgcacaagat gcgcttccgt 300

tcgatcggca tcgatgccga gccgcacgcg acgctgcccg aaggcgtgct ggattcggtc 360

agcctgccgc cggagcggga gtggttgaag accaccgatt ccgcactgca cctggaccgt 420

ttactgttct gcgccaagga agccacctac aaggcgtggt ggccgctgac cgcgcgctgg 480

ctcggcttcg aggaagcgca catcaccttc gagatcgaag acggctccgc cgattccggc 540

aacggcacct ttcacagcga gctgctggtg ccgggacaga cgaatgacgg tgggacgccg 600

ctgctttcgt tcgacggccg gtggctgatc gccgacgggt tcatcctcac cgcgatcgcg 660

tacgcctga 669

<210> 90

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Npt cloning fw

<400> 90

tttaaggagt tcgatatgat cgagacaatt ttgcc 35

<210> 91

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Npt rv

<400> 91

ggtggcagca gcctagtcag gcgtacgcga tcgcg 35

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mab4714opt_pACYCDuet Npt insertion backbone Fw

<400> 92

ctaggctgct gccaccgctg 20

<210> 93

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mab4714opt_pACYCDuet Npt insertion backbone Rv

<400> 93

atcgaactcc ttaaatttat ttaaactaaa cccagcagct gaata 45

<210> 94

<211> 1020

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 94

atgtcgatga taaaaagcta tgccgcaaaa gaagcgggcg gcgaactgga agtttatgag 60

tacgatcccg gtgagctgag gccacaagat gttgaagtgc aggtggatta ctgcgggatc 120

tgccattccg atctgtcgat gatcgataac gaatggggat tttcacaata tccgctggtt 180

gccgggcatg aggtgattgg gcgcgtggtg gcactcggga gcgccgcgca ggataaaggt 240

ttgcaggtcg gtcagcgtgt cgggattggc tggacggcgc gtagctgtgg tcactgcgac 300

gcctgtatta gcggtaatca gatcaactgc gagcaaggtg cggtgccgac gattatgaat 360

cgcggtggct ttgccgagaa gttgcgtgcg gactggcaat gggtgattcc actgccagaa 420

aatattgata tcgagtccgc cgggccgctg ttgtgcggcg gtatcacggt ctttaaacca 480

ctgttgatgc accatatcac tgctaccagc cgcgttgggg taattggtat tggcgggctg 540

gggcatatcg ctataaaact tctgcacgca atgggatgcg aggtgacagc ctttagttct 600

aatccggcga aagagcagga agtgctggcg atgggtgccg ataaagtggt gaatagccgc 660

gatccgcagg cactgaaagc actggcgggg cagtttgatc tcattatcaa caccgtcaac 720

gtcagcctcg actggcagcc ctattttgag gcgctgacct atggcggtaa tttccatacg 780

gtcggtgcgg ttctcacgcc gctgtctgtt ccggccttta cgttaattgc gggcgatcgc 840

agcgtctctg gttctgctac cggcacgcct tatgagctgc gtaagctgat gcgttttgcc 900

gcccgcagca aggttgcgcc gaccaccgaa ctgttcccga tgtcgaaaat taacgacgcc 960

atccagcatg tgcgcgacgg taaggcgcgt taccgcgtgg tgttgaaagc cgatttttga 1020

<210> 95

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ahr cloning fw

<400> 95

ataaggagat ataccatgtc gatgataaaa agcta 35

<210> 96

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ahr cloning rv

<400> 96

atgcggccgc aagcttcaaa aatcggcttt caaca 35

<210> 97

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACYCDuet MCS1 Backbone Fw

<400> 97

catggtatat ctccttatta aagttaaaca aaatt 35

<210> 98

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pACYCDuet MCS1 Backbone Rv

<400> 98

agcttgcggc cgcataatgc ttaagtcgaa 30

<210> 99

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> atoB-del-f1

<400> 99

ttgttgaata aatcggcact cggtatcgct tacct 35

<210> 100

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> atoB-del-r1

<400> 100

tatcgcatgc agatcggctg gtggtcaacg gtgcc 35

<210> 101

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sucD-del-f1

<400> 101

ttgttgaata aatcggagcg cgacctggcg ttgat 35

<210> 102

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sucD-del-r1

<400> 102

tatcgcatgc agatcacgat atttttcagt taacc 35

<210> 103

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ldhA-del-f1

<400> 103

ttgttgaata aatcgtttat cgatattgat ccagg 35

<210> 104

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ldhA-del-r1

<400> 104

tatcgcatgc agatctgtgt gcattaccca acggc 35

<210> 105

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> adhE-del-f1

<400> 105

ttgttgaata aatcgctgcc gctgtctgat aactg 35

<210> 106

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> adhE-del-r1

<400> 106

tatcgcatgc agatctcgat atacccgtac tttgt 35

<210> 107

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dkgA-HA-flag-f

<400> 107

ttgttgaata aatcgtctgt ttgccgagaa tacgc 35

<210> 108

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dkgA-HA-flag-r

<400> 108

tatcgcatgc agatccgacc attttccgcc accat 35

<210> 109

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yahK-del-f1

<400> 109

ttgttgaata aatcgatatt cgtcctaacg aacag 35

<210> 110

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yahK-del-r1

<400> 110

tatcgcatgc agatcttttt gattttcaag tatgt 35

<210> 111

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ahr-del-f1

<400> 111

ttgttgaata aatcgctcat aacggtactg caaac 35

<210> 112

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ahr-del-r1

<400> 112

tatcgcatgc agatctcgca gcaggtaaga tgatt 35

<210> 113

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pflB-del-f1

<400> 113

ttgttgaata aatcgatcac ctggggtcag ttggc 35

<210> 114

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pflB-del-r1

<400> 114

tatcgcatgc agatccgtcg ttcatctgtt tgaga 35

<210> 115

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pHAK-v-fw

<400> 115

gatctgcatg cgatatctct agaacgcgta agc 33

<210> 116

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pHAK-v-rev3

<400> 116

cgatttattc aacaaagccg ccgtcccg 28

<210> 117

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> atoB-del-f2-2

<400> 117

cgatggtgat tgaacggttg 20

<210> 118

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> atoB-del-r2-2

<400> 118

gcactgacga tgacacaatt 20

<210> 119

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sucD-del-f2-2

<400> 119

gaaattcgct gctctggaag 20

<210> 120

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sucD-del-r2-2

<400> 120

cctggcagat aaccttggtg ttt 23

<210> 121

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ldhA-del-f2-2

<400> 121

tggtttaatc ttgccgctcc 20

<210> 122

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ldhA-del-r2-2

<400> 122

gtgctataaa cggcgagttt ca 22

<210> 123

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> adhE-del-f2

<400> 123

tcagtagcgc tgtctggcaa tataaa 26

<210> 124

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> adhE-del-r2

<400> 124

aatgctctcc tgataatgtt aaactttttt 30

<210> 125

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yqhD-del-f2

<400> 125

catgcaaatt ctcccggtgg cggta 25

<210> 126

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yqhD-del-r2

<400> 126

ccaatatgag ggcagagaac gatc 24

<210> 127

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yahK-del-f2-2

<400> 127

tcgcacacta acagactgaa 20

<210> 128

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yahK-del-r2

<400> 128

tgtgtttact cctgattagc 20

<210> 129

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ahr-del-f2-2

<400> 129

cgtggtgttg aaagccgatt attg 24

<210> 130

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ahr-del-r2-2

<400> 130

cataaacttc cagttctccg ccc 23

<210> 131

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pflB-del-f2

<400> 131

ttagatttga ctgaaatcgt acagtaaaaa gc 32

<210> 132

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pflB-del-r2

<400> 132

gtaacaccta ccttcttaag tggattt 27

<210> 133

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子区域

<400> 133

gcagctgctg cagctcgaga gatctctcaa gcccaaagga agagtgaggc gagtcagtcg 60

cgtaatgctt aggcacagga ttgatttgtc gcaatgattg acacgattcc gcttgacgct 120

gcgtaaggtt tgtgtataat tacaggcaac cttttattca ctaacaaata gctggtggaa 180

gatatc 186

<210> 134

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子区域

<400> 134

agaaggagat atacat 16

<210> 135

<211> 162

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 终止子区域

<400> 135

ggtaccctcg agtctggtaa agaaaccgct gctgcgaaat ttgaacgcca gcacatggac 60

tcgtctacta gcgcagctta attaacctag gctgctgcca ccgctgagca ataactagca 120

taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tg 162

<210> 136

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子区域

<400> 136

gcagctgctg cagctcgaga gatctctcaa gcccaaagga agagtgaggc gagtcagtcg 60

cgtaatgctt aggcacagga ttgatttgtc gcaatgattg acacgattcc gcttgacgct 120

gcgtaaggtt tgtgtataat tacaggcaac cttttattca ctaacaaata gctggtggaa 180

gatatc 186

<210> 137

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子区域

<400> 137

aagcttgcgg ccgcagaagg agatatacat 30

<210> 138

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 终止子区域

<400> 138

ctaggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt 60

cttgaggggt tttttg 76

<210> 139

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 启动子区域

<400> 139

gcagctgctg cagctcgaga gatctctcaa gcccaaagga agagtgaggc gagtcagtcg 60

cgtaatgctt aggcacagga ttgatttgtc gcaatgattg acacgattcc gcttgacgct 120

gcgtaaggtt tgtgtataat tacaggcaac cttttattca ctaacaaata gctggtggaa 180

gatatc 186

<210> 140

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子区域

<400> 140

ataaatttaa ggagttcgat 20

<210> 141

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 终止子区域

<400> 141

ctaggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt 60

cttgaggggt tttttg 76

<210> 142

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> atoB check Fw2

<400> 142

aagcagctac cgaaagatgc ccc 23

<210> 143

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> atoB check Rv2

<400> 143

ggcagatgat caaaatatct cagcgcagat 30

<210> 144

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sucD-check-f

<400> 144

gggtctggaa ggtaaactgg 20

<210> 145

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sucD-check-r

<400> 145

cgtcaaagaa gagcgggtca att 23

<210> 146

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ldhA-check-f

<400> 146

agaggttaat gcgagagaga g 21

<210> 147

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ldhA-check-r

<400> 147

ctggatggta cggcgattgg 20

<210> 148

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> adhE-check-f

<400> 148

tcgacatcgc tatcgtcacc accagg 26

<210> 149

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> adhE-check-r

<400> 149

cgcgtatagg tttgtcatcg cctgca 26

<210> 150

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dkgA-check-Fw

<400> 150

tattctcaat ccgtttcagc acgcg 25

<210> 151

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dkgA-check-Rv

<400> 151

ggattattgg ccgtcttgaa ggtg 24

<210> 152

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yahK-check-f2

<400> 152

agctgaccat cagtcacgcc tttgc 25

<210> 153

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yahK-check-r2

<400> 153

cgtccagaac agagagcaat aacatcac 28

<210> 154

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ahr-check-f

<400> 154

tccgctagtg tgatttcagg 20

<210> 155

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ahr-check-r

<400> 155

gaaattatta tgccgccagg cgt 23

<210> 156

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pflB-check-f

<400> 156

ctgattcttt gtgttgtctg cggag 25

<210> 157

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pflB-check-r

<400> 157

cagatattta gcgaactcca gcgtg 25

<210> 158

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> YgjG(m)

<400> 158

Met Ile Arg Glu Pro Pro Glu His Ile Leu Asn Arg Leu Pro Ser Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Leu Ala Cys Ser Ala His Ala Leu Asn Leu Ile Glu Lys

20 25 30

Arg Thr Leu Asp His Lys Glu Met Lys Ala Leu Asn Arg Glu Val Ile

35 40 45

Glu Tyr Tyr Lys Glu His Val Asn Pro Gly Phe Leu Glu Tyr Arg Lys

50 55 60

Ser Val Thr Ala Gly Gly Asp Tyr Gly Ala Val Glu Trp Gln Ala Gly

65 70 75 80

Ser Leu Asn Thr Leu Val Asp Thr Gln Gly Gln Glu Phe Ile Asp Cys

85 90 95

Leu Gly Gly Phe Gly Ile Phe Asn Val Gly His Arg Asn Pro Val Val

100 105 110

Val Ser Ala Val Gln Asn Gln Leu Ala Lys Gln Pro Leu His Ser Gln

115 120 125

Glu Leu Leu Asp Pro Leu Arg Ala Met Leu Ala Lys Thr Leu Ala Ala

130 135 140

Leu Thr Pro Gly Lys Leu Lys Tyr Ser Phe Phe Cys Asn Ser Gly Thr

145 150 155 160

Glu Ser Val Glu Ala Ala Leu Lys Leu Ala Lys Ala Tyr Gln Ser Pro

165 170 175

Arg Gly Lys Phe Thr Phe Ile Ala Thr Ser Gly Ala Phe His Gly Lys

180 185 190

Ser Leu Gly Ala Leu Ser Ala Thr Ala Lys Ser Thr Phe Arg Lys Pro

195 200 205

Phe Met Pro Leu Leu Pro Gly Phe Arg His Val Pro Phe Gly Asn Ile

210 215 220

Glu Ala Met Arg Arg Ala Leu Asn Glu Cys Lys Lys Thr Gly Asp Asp

225 230 235 240

Val Ala Ala Val Ile Leu Glu Pro Ile Gln Gly Glu Gly Gly Val Ile

245 250 255

Leu Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Thr Ala Val Arg Lys Leu Cys Asp Glu

260 265 270

Phe Gly Ala Leu Met Ile Leu Asp Glu Val Gln Thr Gly Met Gly Arg

275 280 285

Thr Gly Lys Met Phe Ala Cys Glu His Glu Asn Val Gln Pro Asp Ile

290 295 300

Leu Cys Leu Ala Lys Ala Leu Gly Gly Gly Val Met Pro Ile Gly Ala

305 310 315 320

Thr Ile Ala Thr Glu Glu Val Phe Ser Val Leu Phe Asp Asn Pro Phe

325 330 335

Leu His Thr Thr Thr Phe Gly Gly Asn Pro Leu Ala Cys Ala Ala Ala

340 345 350

Leu Ala Thr Ile Asn Val Leu Leu Glu Gln Asn Leu Pro Ala Gln Ala

355 360 365

Glu Gln Lys Gly Asp Met Leu Leu Asp Gly Phe Arg Gln Leu Ala Arg

370 375 380

Glu Tyr Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Arg Gly Lys Gly Met Leu Met

385 390 395 400

Ala Ile Glu Phe Val Asp Asn Glu Ile Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Glu

405 410 415

Met Phe Arg Gln Arg Val Leu Val Ala Gly Thr Leu Asn Asn Ala Lys

420 425 430

Thr Ile Arg Ile Glu Pro Pro Leu Thr Leu Thr Ile Glu Gln Cys Glu

435 440 445

Leu Val Ile Lys Ala Ala Arg Lys Ala Leu Ala Ala Met Arg Val Ser

450 455 460

Val Glu Glu Ala

465

<210> 159

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ygjG (m)

<400> 159

atgatacgcg agcctccgga gcatattttg aacaggttac cttcgagcgc atcggcttta 60

gcgtgcagcg cccacgccct gaatctcatt gagaagcgaa cgctggatca taaggagatg 120

aaagcactta accgagaggt gattgaatac tacaaagagc atgtcaatcc ggggttttta 180

gagtatcgca aatctgttac cgccggcggg gattacggag ccgtagagtg gcaagcggga 240

agtttaaata cgcttgtcga cacccagggc caggagttta tcgactgcct gggaggtttt 300

ggaattttca acgtggggca ccgtaatcca gttgtggttt ccgccgtaca gaatcaactt 360

gcgaaacaac cgctgcacag ccaggaactg ctcgatccgt tacgggcgat gttggcgaaa 420

acccttgctg cgctaacgcc cggtaaactg aaatacagct tcttctgtaa tagcggcacc 480

gagtccgttg aagcagcgct gaagctggcg aaagcttacc agtcaccgcg cggcaagttt 540

acttttattg ccaccagcgg cgcgttccac ggtaaatcac ttggcgcgct gtcggccacg 600

gcgaaatcga ccttccgcaa accgtttatg ccgttactgc cgggcttccg tcatgtgccg 660

tttggcaata tcgaagccat gcgcagggct cttaacgagt gcaaaaaaac cggtgatgat 720

gtggctgcgg tgatcctcga accgattcag ggtgaaggtg gcgtaattct gccgccgccg 780

ggctatctca ccgccgtacg taagctatgc gatgagttcg gcgcactgat gatcctcgat 840

gaagtacaaa cgggcatggg gcgcacgggc aagatgttcg cctgcgagca tgagaacgta 900

cagccggata tcctctgcct tgccaaagcg ctcggcggcg gcgtgatgcc gattggcgcg 960

accatcgcca ctgaagaggt gttttcagtt ctgttcgaca acccattcct gcataccacc 1020

acctttggcg gcaacccgct ggcctgtgcg gcggcgctgg cgaccatcaa tgtgttgctg 1080

gagcagaact taccggctca ggctgagcaa aaaggcgata tgttgctgga cggtttccgt 1140

caactggcgc gggaatatcc cgatctggta caggaagcgc gtggtaaagg gatgttgatg 1200

gcgattgagt ttgttgataa cgaaatcggc tataactttg ccagcgagat gttccgccag 1260

cgcgtactgg tggccggaac gctcaataac gccaaaacga tccgcattga accgccactg 1320

acactgacca ttgaacagtg tgaactggtg atcaaagcgg cgcgtaaggc gctggcggcc 1380

atgcgagtaa gtgtcgaaga agcgtaa 1407

<210> 160

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 160

ataaggagat ataccatgat acgcgagcct ccgga 35

<210> 161

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 161

atgcggccgc aagctttacg cttcttcgac actta 35

<210> 162

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 162

atgattcgcg accaggaaac 20

<210> 163

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 163

tcaaacttgg acgtcccgaa t 21

<210> 164

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 for paaJ

<400> 164

atgcttgacg cctatctcta tgctg 25

<210> 165

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 for paaJ

<400> 165

ttacatgcgt tcgatgacta cgg 23

<210> 166

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 for paaH

<400> 166

atgaacactg acatccagac cc 22

<210> 167

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 for paaH

<400> 167

tcagttgtca ggggtcagc 19

<210> 168

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 for paaF

<400> 168

atgcaaacca tcgaaaacga ag 22

<210> 169

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 for paaF

<400> 169

ttaacgtcct gcataggtgg gttt 24

<210> 170

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 for mmgC

<400> 170

atgattcgcg accaggaaac 20

<210> 171

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mmgC的引物

<400> 171

tcaaacttgg acgtcccgaa t 21

<210> 172

<211> 401

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 172

Met Arg Glu Ala Phe Ile Cys Asp Gly Ile Arg Thr Pro Ile Gly Arg

1 5 10 15

Tyr Gly Gly Ala Leu Ser Ser Val Arg Ala Asp Asp Leu Ala Ala Ile

20 25 30

Pro Leu Arg Glu Leu Leu Val Arg Asn Pro Arg Leu Asp Ala Glu Cys

35 40 45

Ile Asp Asp Val Ile Leu Gly Cys Ala Asn Gln Ala Gly Glu Asp Asn

50 55 60

Arg Asn Val Ala Arg Met Ala Thr Leu Leu Ala Gly Leu Pro Gln Ser

65 70 75 80

Val Ser Gly Thr Thr Ile Asn Arg Leu Cys Gly Ser Gly Leu Asp Ala

85 90 95

Leu Gly Phe Ala Ala Arg Ala Ile Lys Ala Gly Asp Gly Asp Leu Leu

100 105 110

Ile Ala Gly Gly Val Glu Ser Met Ser Arg Ala Pro Phe Val Met Gly

115 120 125

Lys Ala Ala Ser Ala Phe Ser Arg Gln Ala Glu Met Phe Asp Thr Thr

130 135 140

Ile Gly Trp Arg Phe Val Asn Pro Leu Met Ala Gln Gln Phe Gly Thr

145 150 155 160

Asp Ser Met Pro Glu Thr Ala Glu Asn Val Ala Glu Leu Leu Lys Ile

165 170 175

Ser Arg Glu Asp Gln Asp Ser Phe Ala Leu Arg Ser Gln Gln Arg Thr

180 185 190

Ala Lys Ala Gln Ser Ser Gly Ile Leu Ala Glu Glu Ile Val Pro Val

195 200 205

Val Leu Lys Asn Lys Lys Gly Val Val Thr Glu Ile Gln His Asp Glu

210 215 220

His Leu Arg Pro Glu Thr Thr Leu Glu Gln Leu Arg Gly Leu Lys Ala

225 230 235 240

Pro Phe Arg Ala Asn Gly Val Ile Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Val

245 250 255

Asn Asp Gly Ala Ala Ala Leu Ile Ile Ala Ser Glu Gln Met Ala Ala

260 265 270

Ala Gln Gly Leu Thr Pro Arg Ala Arg Ile Val Ala Met Ala Thr Ala

275 280 285

Gly Val Glu Pro Arg Leu Met Gly Leu Gly Pro Val Pro Ala Thr Arg

290 295 300

Arg Val Leu Glu Arg Ala Gly Leu Ser Ile His Asp Met Asp Val Ile

305 310 315 320

Glu Leu Asn Glu Ala Phe Ala Ala Gln Ala Leu Gly Val Leu Arg Glu

325 330 335

Leu Gly Leu Pro Asp Asp Ala Pro His Val Asn Pro Asn Gly Gly Ala

340 345 350

Ile Ala Leu Gly His Pro Leu Gly Met Ser Gly Ala Arg Leu Ala Leu

355 360 365

Ala Ala Ser His Glu Leu His Arg Arg Asn Gly Arg Tyr Ala Leu Cys

370 375 380

Thr Met Cys Ile Gly Val Gly Gln Gly Ile Ala Met Ile Leu Glu Arg

385 390 395 400

Val

<210> 173

<211> 475

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 173

Met Met Ile Asn Val Gln Thr Val Ala Val Ile Gly Ser Gly Thr Met

1 5 10 15

Gly Ala Gly Ile Ala Glu Val Ala Ala Ser His Gly His Gln Val Leu

20 25 30

Leu Tyr Asp Ile Ser Ala Glu Ala Leu Thr Arg Ala Ile Asp Gly Ile

35 40 45

His Ala Arg Leu Asn Ser Arg Val Thr Arg Gly Lys Leu Thr Ala Glu

50 55 60

Thr Cys Glu Arg Thr Leu Lys Arg Leu Ile Pro Val Thr Asp Ile His

65 70 75 80

Ala Leu Ala Ala Ala Asp Leu Val Ile Glu Ala Ala Ser Glu Arg Leu

85 90 95

Glu Val Lys Lys Ala Leu Phe Ala Gln Leu Ala Glu Val Cys Pro Pro

100 105 110

Gln Thr Leu Leu Thr Thr Asn Thr Ser Ser Ile Ser Ile Thr Ala Ile

115 120 125

Ala Ala Glu Ile Lys Asn Pro Glu Arg Val Ala Gly Leu His Phe Phe

130 135 140

Asn Pro Ala Pro Val Met Lys Leu Val Glu Val Val Ser Gly Leu Ala

145 150 155 160

Thr Ala Ala Glu Val Val Glu Gln Leu Cys Glu Leu Thr Leu Ser Trp

165 170 175

Gly Lys Gln Pro Val Arg Cys His Ser Thr Pro Gly Phe Ile Val Asn

180 185 190

Arg Val Ala Arg Pro Tyr Tyr Ser Glu Ala Trp Arg Ala Leu Glu Glu

195 200 205

Gln Val Ala Ala Pro Glu Val Ile Asp Ala Ala Leu Arg Asp Gly Ala

210 215 220

Gly Phe Pro Met Gly Pro Leu Glu Leu Thr Asp Leu Ile Gly Gln Asp

225 230 235 240

Val Asn Phe Ala Val Thr Cys Ser Val Phe Asn Ala Phe Trp Gln Glu

245 250 255

Arg Arg Phe Leu Pro Ser Leu Val Gln Gln Glu Leu Val Ile Gly Gly

260 265 270

Arg Leu Gly Lys Lys Ser Gly Leu Gly Val Tyr Asp Trp Arg Ala Glu

275 280 285

Arg Glu Ala Val Val Gly Leu Glu Ala Val Ser Asp Ser Phe Ser Pro

290 295 300

Met Lys Val Glu Lys Lys Ser Asp Gly Val Thr Glu Ile Asp Asp Val

305 310 315 320

Leu Leu Ile Glu Thr Gln Gly Glu Thr Ala Gln Ala Leu Ala Ile Arg

325 330 335

Leu Ala Arg Pro Val Val Val Ile Asp Lys Met Ala Gly Lys Val Val

340 345 350

Thr Ile Ala Ala Ala Ala Val Asn Pro Asp Ser Ala Thr Arg Lys Ala

355 360 365

Ile Tyr Tyr Leu Gln Gln Gln Gly Lys Thr Val Leu Gln Ile Ala Asp

370 375 380

Tyr Pro Gly Met Leu Ile Trp Arg Thr Val Ala Met Ile Ile Asn Glu

385 390 395 400

Ala Leu Asp Ala Leu Gln Lys Gly Val Ala Ser Glu Gln Asp Ile Asp

405 410 415

Thr Ala Met Arg Leu Gly Val Asn Tyr Pro Tyr Gly Pro Leu Val Trp

420 425 430

Gly Ala Gln Leu Gly Trp Gln Arg Ile Leu Arg Leu Leu Glu Asn Leu

435 440 445

Gln His His Tyr Gly Glu Glu Arg Tyr Arg Pro Cys Ser Leu Leu Arg

450 455 460

Gln Arg Ala Leu Leu Glu Ser Gly Tyr Glu Ser

465 470 475

<210> 174

<211> 255

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 174

Met Ser Glu Leu Ile Val Ser Arg Gln Gln Arg Val Leu Leu Leu Thr

1 5 10 15

Leu Asn Arg Pro Ala Ala Arg Asn Ala Leu Asn Asn Ala Leu Leu Met

20 25 30

Gln Leu Val Asn Glu Leu Glu Ala Ala Ala Thr Asp Thr Ser Ile Ser

35 40 45

Val Cys Val Ile Thr Gly Asn Ala Arg Phe Phe Ala Ala Gly Ala Asp

50 55 60

Leu Asn Glu Met Ala Glu Lys Asp Leu Ala Ala Thr Leu Asn Asp Thr

65 70 75 80

Arg Pro Gln Leu Trp Ala Arg Leu Gln Ala Phe Asn Lys Pro Leu Ile

85 90 95

Ala Ala Val Asn Gly Tyr Ala Leu Gly Ala Gly Cys Glu Leu Ala Leu

100 105 110

Leu Cys Asp Val Val Val Ala Gly Glu Asn Ala Arg Phe Gly Leu Pro

115 120 125

Glu Ile Thr Leu Gly Ile Met Pro Gly Ala Gly Gly Thr Gln Arg Leu

130 135 140

Ile Arg Ser Val Gly Lys Ser Leu Ala Ser Lys Met Val Leu Ser Gly

145 150 155 160

Glu Ser Ile Thr Ala Gln Gln Ala Gln Gln Ala Gly Leu Val Ser Asp

165 170 175

Val Phe Pro Ser Asp Leu Thr Leu Glu Tyr Ala Leu Gln Leu Ala Ser

180 185 190

Lys Met Ala Arg His Ser Pro Leu Ala Leu Gln Ala Ala Lys Gln Ala

195 200 205

Leu Arg Gln Ser Gln Glu Val Ala Leu Gln Ala Gly Leu Ala Gln Glu

210 215 220

Arg Gln Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Thr Glu Asp Arg His Glu Gly

225 230 235 240

Ile Ser Ala Phe Leu Gln Lys Arg Thr Pro Asp Phe Lys Gly Arg

245 250 255

<210> 175

<211> 259

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> crt(Ck)

<400> 175

Met Glu Phe Lys Asn Ile Ile Leu Glu Lys Asp Gly Asn Val Ala Ser

1 5 10 15

Ile Thr Leu Asn Arg Pro Lys Ala Leu Asn Ala Leu Asn Ala Ala Thr

20 25 30

Leu Lys Glu Ile Asp Ala Ala Ile Asn Asp Ile Ala Glu Asp Asp Asn

35 40 45

Val Tyr Ala Val Ile Ile Thr Gly Ser Gly Lys Ala Phe Val Ala Gly

50 55 60

Ala Asp Ile Ala Glu Met Lys Asp Leu Thr Ala Val Glu Gly Arg Lys

65 70 75 80

Phe Ser Val Leu Gly Asn Lys Ile Phe Arg Lys Leu Glu Asn Leu Glu

85 90 95

Lys Pro Val Ile Ala Ala Ile Asn Gly Phe Ala Leu Gly Gly Gly Cys

100 105 110

Glu Leu Ser Leu Ser Cys Asp Ile Arg Ile Ala Ser Ser Lys Ala Lys

115 120 125

Phe Gly Gln Pro Glu Val Gly Leu Gly Ile Thr Pro Gly Phe Gly Gly

130 135 140

Thr Gln Arg Leu Ala Arg Ala Ile Gly Val Gly Met Ala Lys Glu Leu

145 150 155 160

Ile Tyr Thr Gly Lys Val Ile Asn Ala Glu Glu Ala Leu Arg Ile Gly

165 170 175

Leu Val Asn Lys Val Val Glu Pro Asp Lys Leu Leu Glu Glu Ala Lys

180 185 190

Ala Leu Val Asp Ala Ile Ile Val Asn Ala Pro Ile Ala Val Arg Met

195 200 205

Cys Lys Ala Ala Ile Asn Gln Gly Leu Gln Cys Asp Ile Asp Thr Gly

210 215 220

Val Ala Tyr Glu Ala Glu Val Phe Gly Glu Cys Phe Ala Thr Glu Asp

225 230 235 240

Arg Val Glu Gly Met Thr Ala Phe Val Glu Lys Arg Asp Lys Ala Phe

245 250 255

Lys Asn Lys

<210> 176

<211> 276

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> ch(Pp)

<400> 176

Met Ser Lys Tyr Glu Gly Arg Trp Thr Thr Val Lys Val Glu Leu Glu

1 5 10 15

Ala Gly Ile Ala Trp Val Thr Leu Asn Arg Pro Glu Lys Arg Asn Ala

20 25 30

Met Ser Pro Thr Leu Asn Arg Glu Met Val Asp Val Leu Glu Thr Leu

35 40 45

Glu Gln Asp Ala Asp Ala Gly Val Leu Val Leu Thr Gly Ala Gly Glu

50 55 60

Ser Trp Thr Ala Gly Met Asp Leu Lys Glu Tyr Phe Arg Glu Val Asp

65 70 75 80

Ala Gly Pro Glu Ile Leu Gln Glu Lys Ile Arg Arg Glu Ala Ser Gln

85 90 95

Trp Gln Trp Lys Leu Leu Arg Leu Tyr Ala Lys Pro Thr Ile Ala Met

100 105 110

Val Asn Gly Trp Cys Phe Gly Gly Gly Phe Ser Pro Leu Val Ala Cys

115 120 125

Asp Leu Ala Ile Cys Ala Asn Glu Ala Thr Phe Gly Leu Ser Glu Ile

130 135 140

Asn Trp Gly Ile Pro Pro Gly Asn Leu Val Ser Lys Ala Met Ala Asp

145 150 155 160

Thr Val Gly His Arg Gln Ser Leu Tyr Tyr Ile Met Thr Gly Lys Thr

165 170 175

Phe Asp Gly Arg Lys Ala Ala Glu Met Gly Leu Val Asn Asp Ser Val

180 185 190

Pro Leu Ala Glu Leu Arg Glu Thr Thr Arg Glu Leu Ala Leu Asn Leu

195 200 205

Leu Glu Lys Asn Pro Val Val Leu Arg Ala Ala Lys Asn Gly Phe Lys

210 215 220

Arg Cys Arg Glu Leu Thr Trp Glu Gln Asn Glu Asp Tyr Leu Tyr Ala

225 230 235 240

Lys Leu Asp Gln Ser Arg Leu Leu Asp Thr Thr Gly Gly Arg Glu Gln

245 250 255

Gly Met Lys Gln Phe Leu Asp Asp Lys Ser Ile Lys Pro Gly Leu Gln

260 265 270

Ala Tyr Lys Arg

275

<210> 177

<211> 384

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> dcaA(Ab)

<400> 177

Met Ile Arg Asp Glu Gly Met Leu Gln Gln Leu Leu Ser Thr Ile Arg

1 5 10 15

Asp Phe Val Lys Asn Glu Leu Ile Pro Arg Glu His Glu Val Ala Glu

20 25 30

Lys Asp Cys Ile Pro Glu Asp Ile Ile Gln Gln Met Arg Glu Leu Gly

35 40 45

Leu Phe Gly Leu Thr Ile Pro Glu Glu Tyr Gly Gly Leu Gly Ile Thr

50 55 60

Met Glu Glu Glu Val Asn Val Ala Phe Glu Leu Gly Gln Thr Ser Pro

65 70 75 80

Ala Phe Arg Ser Leu Ile Gly Thr Asn Asn Gly Ile Gly Ser Ser Gly

85 90 95

Leu Ile Ile Asp Gly Thr Glu Glu Gln Lys Gln Lys Tyr Leu Pro Arg

100 105 110

Tyr Ala Ser Gly Glu Ile Ile Gly Ser Phe Cys Leu Thr Glu Pro Glu

115 120 125

Ala Gly Ser Asp Ala Ala Ser Leu Lys Thr Thr Ala Val Lys Asp Gly

130 135 140

Asp Phe Tyr Ile Leu Asn Gly Thr Lys Arg Phe Ile Thr Asn Ala Pro

145 150 155 160

His Ala Ala Thr Phe Thr Val Met Ala Arg Thr Asn Pro Ala Ile Lys

165 170 175

Gly Ala Gly Gly Ile Ser Ala Phe Leu Val Glu Ala Asn Thr Pro Gly

180 185 190

Ile Thr Leu Gly Lys Ile Asp Gln Lys Met Gly Gln Lys Gly Ser His

195 200 205

Thr Cys Asp Val Ile Phe Glu Asn Cys Arg Val Pro Ala Ser Ala Leu

210 215 220

Ile Gly Gly Val Glu Gly Val Gly Phe Lys Thr Ala Met Lys Val Leu

225 230 235 240

Asp Lys Gly Arg Leu His Ile Gly Ala Tyr Ser Val Gly Val Ala Glu

245 250 255

Arg Met Leu Asn Asp Ala Leu His Tyr Ala Val Glu Arg Lys Gln Phe

260 265 270

Gly Gln Pro Ile Ala Asn Phe Gln Leu Ile Gln Ala Met Leu Ala Asp

275 280 285

Ser Lys Ala Glu Ile Tyr Ala Ala Lys Cys Met Val Leu Asp Ala Ala

290 295 300

Arg Arg Arg Asp Glu Gly Gln Asn Ile Ser Thr Glu Ala Ser Cys Ala

305 310 315 320

Lys Met Phe Ala Thr Glu Met Cys Gly Arg Val Ala Asp Arg Cys Val

325 330 335

Gln Ile His Gly Gly Ala Gly Tyr Ile Ser Glu Tyr Ser Ile Glu Arg

340 345 350

Phe Tyr Arg Asp Val Arg Leu Phe Arg Leu Tyr Glu Gly Thr Thr Gln

355 360 365

Val Gln Gln Ile Ile Ile Ala Lys Asn Met Ile Lys Glu Val Thr Ser

370 375 380

<210> 178

<211> 385

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> Tfu1647

<400> 178

Met Ser Asp Phe Asp Leu Tyr Arg Pro Thr Glu Glu His Glu Ala Leu

1 5 10 15

Arg Glu Ala Ile Arg Ser Val Ala Glu Asp Lys Ile Ala Pro His Ala

20 25 30

Ala Asp Val Asp Glu Gln Ser Arg Phe Pro Gln Glu Ala Tyr Glu Ala

35 40 45

Leu Arg Ala Ser Asp Phe His Ala Pro His Val Ala Glu Glu Tyr Gly

50 55 60

Gly Val Gly Ala Asp Ala Leu Ala Thr Cys Ile Val Ile Glu Glu Ile

65 70 75 80

Ala Arg Val Cys Ala Ser Ser Ser Leu Ile Pro Ala Val Asn Lys Leu

85 90 95

Gly Ser Met Pro Leu Ile Leu Ser Gly Ser Asp Glu Val Lys Gln Arg

100 105 110

Tyr Leu Pro Glu Leu Ala Ser Gly Glu Ala Met Phe Ser Tyr Gly Leu

115 120 125

Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Asp Thr Ala Ser Met Arg Thr Arg Ala

130 135 140

Val Arg Asp Gly Asp Asp Trp Ile Leu Asn Gly Gln Lys Ser Trp Ile

145 150 155 160

Thr Asn Ala Gly Ile Ser Lys Tyr Tyr Thr Val Met Ala Val Thr Asp

165 170 175

Pro Asp Gly Pro Arg Gly Arg Asn Ile Ser Ala Phe Val Val His Ile

180 185 190

Asp Asp Pro Gly Phe Ser Phe Gly Glu Pro Glu Arg Lys Leu Gly Ile

195 200 205

Lys Gly Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ile Phe Asp Asn Val Arg Ile Pro

210 215 220

Gly Asp Arg Leu Val Gly Lys Val Gly Glu Gly Leu Arg Thr Ala Leu

225 230 235 240

Arg Thr Leu Asp His Thr Arg Val Thr Ile Gly Ala Gln Ala Val Gly

245 250 255

Ile Ala Gln Gly Ala Leu Asp Tyr Ala Leu Gly Tyr Val Lys Glu Arg

260 265 270

Lys Gln Phe Gly Lys Ala Ile Ala Asp Phe Gln Gly Ile Gln Phe Met

275 280 285

Leu Ala Asp Met Ala Met Lys Leu Glu Ala Ala Arg Gln Met Val Tyr

290 295 300

Val Ala Ala Ala Lys Ser Glu Arg Asp Asp Ala Asp Leu Ser Phe Tyr

305 310 315 320

Gly Ala Ala Ala Lys Cys Phe Ala Ser Asp Val Ala Met Glu Ile Thr

325 330 335

Thr Asp Ala Val Gln Leu Leu Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Arg Asp Tyr

340 345 350

Pro Val Glu Arg Met Met Arg Asp Ala Lys Ile Thr Gln Ile Tyr Glu

355 360 365

Gly Thr Asn Gln Ile Gln Arg Val Val Met Ala Arg Gln Leu Leu Lys

370 375 380

Lys

385

<210> 179

<211> 290

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> tesB(Ab)

<400> 179

Met Asn Thr Leu Thr Gln Glu Leu Val Glu Leu Leu Ser Leu Glu Lys

1 5 10 15

Leu Glu Glu Asn Leu Tyr Arg Gly Met Ser Arg Asn Leu Val Gly Lys

20 25 30

Arg Val Phe Gly Gly Gln Val Leu Gly Gln Ala Leu Arg Ala Ala Ser

35 40 45

Tyr Thr Thr Asp Arg Pro Ala His Ser Leu His Ala Tyr Phe Leu Tyr

50 55 60

Gly Gly Asp Val Asn Ala Pro Ile Ile Tyr Glu Val Asp Pro Leu Arg

65 70 75 80

Asp Gly Lys Ser Phe Val Ser Arg Gln Val Arg Ala Ile Gln His Gly

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Ser Ala Met Val Ser Phe Ala Ser Pro Glu Glu Gly

100 105 110

Leu Asn Tyr Gln Asn Asp Met Pro Asp Tyr Pro Ala Pro Glu Gln Leu

115 120 125

Lys Ser Glu Ala Glu Leu Lys Leu Gly Leu Ile Asp Phe Val Pro Glu

130 135 140

Asn Val Arg Ala Ser Phe Met Arg Glu Arg His Ile Glu Ile Arg Pro

145 150 155 160

Val Glu Pro Val Asn Pro Phe Gln Pro Gln Pro Gln Ala Pro Thr Asn

165 170 175

Ala His Tyr Ile Arg Thr His Asp Lys Ile Gly Lys Ala Phe Asp Gln

180 185 190

Ile Ala Leu His Gln Ser Ile Val Ala Phe Tyr Ser Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Met Thr Thr Ala Leu Lys Pro His Gly Leu Ser Tyr Leu Ser Pro Ser

210 215 220

Leu Gln Cys Ala Ser Ile Asp His Thr Ile Tyr Phe His Arg Pro Leu

225 230 235 240

Arg Ala Asp Glu Trp Met Leu Tyr Asp Met Asp Ala Thr Val Ser Ala

245 250 255

Gly Ser Arg Gly Leu Asn Phe Gly Arg Met Trp Gln Asn Gly Leu Leu

260 265 270

Val Cys Ser Thr Val Gln Glu Gly Leu Met Arg Leu Arg Glu Ile Glu

275 280 285

Thr Gln

290

<210> 180

<211> 1206

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 180

atgcgtgaag cctttatttg tgacggaatt cgtacgccaa ttggtcgcta cggcggggca 60

ttatcaagtg ttcgggctga tgatctggct gctatccctt tgcgggaact gctggtgcga 120

aacccgcgtc tcgatgcgga gtgtatcgat gatgtgatcc tcggctgtgc taatcaggcg 180

ggagaagata accgtaacgt agcccggatg gcgactttac tggcggggct gccgcagagt 240

gtttccggca caaccattaa ccgcttgtgt ggttccgggc tggacgcact ggggtttgcc 300

gcacgggcga ttaaagcggg cgatggcgat ttgctgatcg ccggtggcgt ggagtcaatg 360

tcacgggcac cgtttgttat gggcaaggca gccagtgcat tttctcgtca ggctgagatg 420

ttcgatacca ctattggctg gcgatttgtg aacccgctca tggctcagca atttggaact 480

gacagcatgc cggaaacggc agagaatgta gctgaactgt taaaaatctc acgagaagat 540

caagatagtt ttgcgctacg cagtcagcaa cgtacggcaa aagcgcaatc ctcaggcatt 600

ctggctgagg agattgttcc ggttgtgttg aaaaacaaga aaggtgttgt aacagaaata 660

caacatgatg agcatctgcg cccggaaacg acgctggaac agttacgtgg gttaaaagca 720

ccatttcgtg ccaatggggt gattaccgca ggcaatgctt ccggggtgaa tgacggagcc 780

gctgcgttga ttattgccag tgaacagatg gcagcagcgc aaggactgac accgcgggcg 840

cgtatcgtag ccatggcaac cgccggggtg gaaccgcgcc tgatggggct tggtccggtg 900

cctgcaactc gccgggtgct ggaacgcgca gggctgagta ttcacgatat ggacgtgatt 960

gaactgaacg aagcgttcgc ggcccaggcg ttgggtgtac tacgcgaatt ggggctgcct 1020

gatgatgccc cacatgttaa ccccaacgga ggcgctatcg ccttaggcca tccgttggga 1080

atgagtggtg cccgcctggc actggctgcc agccatgagc tgcatcggcg taacggtcgt 1140

tacgcattgt gcaccatgtg catcggtgtc ggtcagggca tcgccatgat tctggagcgt 1200

gtttga 1206

<210> 181

<211> 1428

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 181

atgatgataa atgtgcaaac tgtggcagtg attgggagcg gcaccatggg ggcaggcatt 60

gctgaagttg ctgccagtca tggacaccag gttttactgt atgacatttc tgctgaagcg 120

ctgacccgcg caatcgacgg gatacacgcg cggctaaatt cacgcgtgac gcggggaaaa 180

ctgactgctg aaacctgtga acgcacattg aaacgcctga tcccggtgac cgatattcac 240

gcgctggcag ctgcggacct ggtcattgaa gcggcgtctg aacgtctgga agtcaaaaaa 300

gcgctctttg cacagctggc ggaagtttgc ccgccacaaa cgctattgac cactaacact 360

tcgtcaatct ctataaccgc gattgctgcg gagataaaaa atcctgaacg tgttgcgggg 420

ctgcattttt ttaacccggc accggtgatg aagttggtgg aggtggtcag tgggctggca 480

acggcggcgg aagttgttga gcagttgtgt gaactaacgt tgagttgggg taagcagcct 540

gtgcgctgtc attcgactcc tggatttatc gttaaccgtg ttgcgcgtcc ttattattcc 600

gaggcctggc gggcactgga agagcaggtt gctgcaccag aagtgattga cgctgcactt 660

cgcgatggcg ctggtttccc gatggggccg ctggaattaa ccgatctgat tggtcaggac 720

gtcaattttg ctgtcacctg ttcggtgttt aacgctttct ggcaggagcg tcgtttttta 780

ccttcgctgg tgcaacagga actggtgatt ggtggacggt tgggcaagaa aagtgggctg 840

ggcgtgtacg actggcgcgc ggaacgtgag gcagttgttg gcctggaagc ggtaagcgac 900

agttttagcc caatgaaagt agaaaagaaa agtgacggtg tcacggaaat tgacgatgtt 960

ttattgattg agacacaagg cgagacggca caggcgctgg caatacgact ggcacgcccg 1020

gtggtagtga tcgataaaat ggcgggcaag gtggtgacca ttgctgctgc agcggtgaac 1080

ccggactcag cgacccgcaa ggccatttat tacctgcaac agcagggcaa aacagtgctg 1140

caaattgcag attacccagg aatgctgatt tggcgaacgg tagcaatgat catcaatgaa 1200

gcccttgatg cgcttcaaaa aggcgtggcc tctgaacagg atatcgatac cgccatgcgt 1260

cttggggtga attatccata tggcccactt gtctggggag cgcaacttgg ctggcagcga 1320

atattaaggc tccttgaaaa tctacagcat cactatggcg aagaacgcta tcgcccatgt 1380

tcattgctgc gccaacgggc gcttctggag agcggttatg agtcataa 1428

<210> 182

<211> 768

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 182

atgagcgaac tgatcgtcag ccgtcagcaa cgagtattgt tgctgaccct taaccgtccc 60

gccgcacgta atgcgctaaa taatgccctg ctgatgcaac tggtaaatga actggaagct 120

gcggctaccg ataccagcat ttcggtctgt gtgattaccg gtaatgcacg cttttttgcc 180

gctggggccg atctcaacga aatggcagaa aaagatctcg cggccacctt aaacgataca 240

cgtccgcagc tatgggcgcg attgcaggcc tttaataaac cacttatcgc agccgtcaat 300

ggttacgcgc ttggggcggg ttgcgaactg gcattgttgt gcgatgtggt ggttgccgga 360

gagaacgcgc gttttgggtt gccggaaatc actctcggca tcatgcctgg cgcaggcgga 420

acgcaacgtt taatccgtag tgtcggtaaa tcgttagcca gcaaaatggt gctgagcgga 480

gaaagtatca ccgctcagca agcacagcag gccgggctgg ttagcgacgt cttccccagc 540

gatttaaccc tcgaatacgc cttacagctg gcatcgaaaa tggcacgtca ctcgccgctg 600

gccttacaag cggcaaagca agcgctgcgc cagtcgcagg aagtggcttt gcaagccgga 660

cttgcccagg agcgacagtt attcaccttg ctggcggcaa cagaagatcg tcatgaaggc 720

atctccgctt tcttacaaaa acgcacgccc gactttaaag gacgctaa 768

<210> 183

<211> 780

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> crt(Ck)

<400> 183

atggaattca agaacatcat cctggaaaaa gatggtaatg ttgccagcat taccctgaat 60

cgtccgaaag cactgaatgc cctgaatgca gcaaccctga aagaaattga tgcagccatt 120

aatgatatcg ccgaagatga taatgtgtac gccgtgatta ttaccggtag cggtaaagca 180

tttgttgccg gtgcagatat tgcagaaatg aaagatctga ccgcagttga aggtcgcaaa 240

tttagcgttc tgggcaataa aatctttcgc aaactggaaa atctggaaaa accggttatt 300

gccgcaatta atggttttgc attaggtggt ggttgtgaac tgagcctgag ctgtgatatt 360

cgtattgcaa gcagcaaagc aaaatttggt cagccggaag ttggtctggg tattacccct 420

ggttttggtg gcacccagcg tctggcacgt gcaattggtg ttggtatggc aaaagaactg 480

atttataccg gcaaagtgat taatgcagaa gaagcactgc gtattggtct ggttaataaa 540

gttgttgaac cggacaaact gctggaagaa gcaaaagcac tggttgatgc cattattgtt 600

aatgcaccga ttgcagttcg tatgtgtaaa gcagcaatta atcagggtct gcagtgtgat 660

attgataccg gtgttgcata tgaagccgaa gtttttggtg aatgttttgc aaccgaagat 720

cgtgttgaag gtatgaccgc ctttgttgaa aaacgtgata aagcctttaa aaacaaataa 780

<210> 184

<211> 831

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> ech(Pp)

<400> 184

atgagcaaat atgaaggtcg ttggaccacc gttaaagttg aactggaagc aggtattgca 60

tgggttaccc tgaatcgtcc ggaaaaacgt aatgcaatga gcccgacact gaatcgtgaa 120

atggttgatg ttctggaaac cctggaacag gatgcagatg ccggtgttct ggttctgacc 180

ggtgccggtg aaagctggac cgcaggtatg gatctgaaag aatattttcg tgaagttgat 240

gccggtccgg aaattctgca agaaaaaatt cgtcgtgaag caagccagtg gcagtggaaa 300

ctgctgcgtc tgtatgcaaa accgaccatt gccatggtta atggttggtg ttttggtggt 360

ggttttagtc cgctggttgc atgtgatctg gcaatttgtg caaatgaagc aacctttggt 420

ctgagcgaaa tcaattgggg tattccgcct ggtaatctgg ttagcaaagc aatggcagat 480

accgttggtc atcgtcagag cctgtattat atcatgaccg gtaaaacctt tgatggtcgt 540

aaagcagcag aaatgggttt agttaatgat agcgttccgc tggcagaact gcgtgaaacc 600

acacgtgaac tggcactgaa tctgctggaa aaaaatccgg ttgttctgcg tgcagcaaaa 660

aatggtttta aacgttgtcg tgaactgacc tgggaacaga atgaagatta tctgtacgcc 720

aaactggatc agagccgtct gctggatacc acaggtggtc gtgaacaggg tatgaaacag 780

tttctggatg acaaaagcat taaaccgggt ctgcaggcat ataaacgtta a 831

<210> 185

<211> 1155

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> dcaA(Ab)

<400> 185

atgattcgtg atgaaggtat gctgcaacag ctgctgagca ccattcgtga ttttgttaaa 60

aatgaactga ttccgcgtga acatgaagtg gcagaaaaag attgtattcc cgaagatatt 120

attcagcaga tgcgtgaact gggtctgttt ggtctgacca ttccggaaga atatggtggt 180

ctgggtatta ccatggaaga agaagttaac gttgcatttg aactgggcca gaccagtccg 240

gcatttcgta gcctgattgg caccaataat ggtattggta gcagcggtct gattattgat 300

ggcaccgaag aacagaaaca gaaatatctg cctcgttatg caagcggtga aattattggt 360

agtttttgtc tgaccgaacc ggaagcaggt agtgatgcag caagcctgaa aaccaccgca 420

gttaaagatg gtgatttcta tattctgaac ggcaccaaac gctttattac caatgcaccg 480

catgcagcaa cctttaccgt tatggcacgt accaatccgg caattaaagg tgccggtggt 540

attagcgcat ttctggttga agcaaataca ccgggtatta cgctgggtaa aattgatcag 600

aaaatgggtc agaaaggtag ccatacctgt gatgtgattt ttgaaaattg tcgtgttccg 660

gcaagcgcac tgattggtgg tgttgaaggt gttggcttta aaaccgcaat gaaagttctg 720

gataaaggtc gtctgcatat tggtgcatat agcgttggtg ttgcagaacg tatgctgaat 780

gatgcactgc attatgccgt tgaacgtaaa cagtttggtc agccgattgc aaattttcag 840

ctgattcagg caatgctggc agatagcaaa gcagaaattt atgcagccaa atgcatggtt 900

ctggatgcag cacgtcgtcg tgatgagggt cagaatatta gcaccgaagc aagctgtgca 960

aaaatgtttg caaccgaaat gtgtggtcgt gttgccgatc gttgtgttca gattcatggt 1020

ggtgcaggtt atattagcga atacagcatt gaacgcttct atcgtgatgt gcgtctgttt 1080

cgcctgtatg aaggtacaac ccaggtgcag cagattatta tcgccaaaaa catgatcaaa 1140

gaggtgacca gctaa 1155

<210> 186

<211> 1158

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> Tfu1647

<400> 186

atgagtgact tcgacctcta ccggcccacc gaggagcacg aagccctccg cgaagccatc 60

cgctccgtcg ctgaagacaa gatcgccccg cacgcggccg acgtcgacga gcagtcccgc 120

ttcccgcagg aggcctacga ggcgctgcgc gccagcgact tccacgctcc ccacgtcgcg 180

gaggagtacg gcggtgttgg cgcagacgcg ctggcgacct gcatcgtcat tgaggagatc 240

gcccgggtgt gcgcctcctc ttccctcatc cccgcggtca acaagctcgg ctcgatgccg 300

ctgatcctct ccggatctga cgaggtgaag cagcgctacc tgcccgaact ggcatctggc 360

gaggcgatgt tctcctacgg gctctccgag cgcgaggcgg gatccgacac cgcgagcatg 420

cgcacccgtg ccgtccgcga cggcgacgac tggatcctca acggccagaa gtcgtggatc 480

acgaacgccg gaatctccaa gtactacacg gtgatggcgg tcaccgaccc ggacgggccg 540

cgcggacgca acatcagcgc tttcgtcgtc cacatcgacg atcccgggtt ctcttttgga 600

gaaccggaac gcaagctcgg catcaaaggt tcgcccacgc gcgaactgat cttcgacaat 660

gtccgtatcc ccggcgaccg cctggtgggc aaggtcgggg aaggactgcg taccgcgctg 720

cgcaccctcg accacacccg cgtcaccatt ggcgcccagg ctgtgggcat cgcccagggg 780

gcgctcgact acgccctggg ctatgtcaag gagcgcaagc agttcggcaa ggccatcgcc 840

gacttccaag gcatccagtt catgctcgcc gacatggcca tgaagctgga agcggcccgc 900

cagatggttt acgtcgctgc cgccaagtcc gagcgcgacg acgccgacct ctccttctac 960

ggtgccgccg ctaaatgctt cgcctcggat gtggcaatgg agatcaccac tgacgcggtg 1020

caactactcg gcggctacgg ctacacccgg gactacccgg tcgagcggat gatgcgcgac 1080

gccaagatca cccagatcta cgagggcacc aaccagatcc agcgggtggt catggcccgg 1140

cagctcttga agaagtga 1158

<210> 187

<211> 873

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> tesB(Ab)

<400> 187

atgaatacac taacccaaga actggttgaa cttttatctc tagaaaagct ggaagagaac 60

ctctatcgcg ggatgagccg aaatctggtg gggaagcgcg tattcggtgg tcaggttctt 120

ggacaagcat taagagctgc gtcatatacg acagatcgtc ctgcacattc attacatgct 180

tactttctct atggtggcga tgttaacgcc cctattattt atgaagtaga tcctttacgt 240

gatggtaaaa gttttgtgag tcgtcaggtt cgcgctattc agcatggacg tactattttt 300

tctgcgatgg tttcttttgc atcaccagaa gaagggctta actatcaaaa tgatatgcct 360

gattatcctg cacctgagca gcttaaatct gaagcggagt taaaactggg gctgattgat 420

tttgtacctg aaaatgtacg tgccagtttt atgcgtgaac gccacataga gattcgtcca 480

gttgagccag ttaatccctt tcagcctcaa cctcaagcac cgactaacgc ccactatatc 540

cgtacccatg acaagatcgg aaaagcgttt gaccagattg cgctacacca gtctattgtt 600

gctttttatt cagactttac tttaatgaca acagcactta aaccgcatgg tttaagctat 660

ctttcaccga gtttgcagtg tgccagtata gatcacacca tttattttca tcgtccgtta 720

cgtgcagatg aatggatgct ctacgacatg gatgccacgg tcagtgctgg ctcaagaggt 780

ttgaactttg ggcgaatgtg gcaaaatgga ttattggttt gtagcaccgt acaagaaggt 840

ttaatgcgcc ttcgtgaaat tgaaacacag taa 873

<210> 188

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ paaJ(Ec) IF

<400> 188

ataaggagat ataccatgcg tgaagccttt atttg 35

<210> 189

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ paaJ(Ec) IF

<400> 189

tgcggccgca agctttcaaa cacgctccag aatca 35

<210> 190

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ pRSFDuet-P1

<400> 190

aagcttgcgg ccgcataatg cttaa 25

<210> 191

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ pRSFDuet-P1

<400> 191

catggtatat ctccttatta 20

<210> 192

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ paaH(Ec) IF

<400> 192

ggagatatac atatgatgat aaatgtgcaa actgt 35

<210> 193

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ paaH(Ec) IF

<400> 193

agactcgagg gtaccttatg actcataacc gctct 35

<210> 194

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ pRSFDuet-P2

<400> 194

ggtaccctcg agtctggtaa agaaa 25

<210> 195

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ pRSFDuet-P2

<400> 195

catatgtata tctccttctt 20

<210> 196

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ paaF(Ec) IF

<400> 196

aggagatata ccatgagcga actgatcgtc agccg 35

<210> 197

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ paaF(Ec) IF

<400> 197

tgcggccgca agcttttagc gtcctttaaa gtcgg 35

<210> 198

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ paaF(L3)opt

<400> 198

agaaggagat ataccatgca gaccattgaa aatga 35

<210> 199

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ paaF(L3)opt

<400> 199

tgcggccgca agcttttaac gaccggcata ggtcg 35

<210> 200

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ crt1(Ck)opt

<400> 200

agaaggagat ataccatgga attcaagaac atcat 35

<210> 201

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ crt1(Ck)opt

<400> 201

tgcggccgca agcttttatt tgtttttaaa ggctt 35

<210> 202

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ ech(Pp)opt

<400> 202

agaaggagat ataccatgag caaatatgaa ggtcg 35

<210> 203

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ ech(Pp)opt

<400> 203

tgcggccgca agcttttaac gtttatatgc ctgca 35

<210> 204

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ pETDuet-P1

<400> 204

aagcttgcgg ccgcataatg cttaa 25

<210> 205

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ pETDuet-P1

<400> 205

catggtatat ctccttctta aagtt 25

<210> 206

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ dcaA(Ab)

<400> 206

gaaggagata tacatatgat tcgtgatgaa ggtat 35

<210> 207

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ dcaA(Ab)

<400> 207

tggcagcagc ctaggttagc tggtcacctc tttga 35

<210> 208

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ Tfu1647

<400> 208

gaaggagata tacatatgag tgacttcgac ctcta 35

<210> 209

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ Tfu1647

<400> 209

tggcagcagc ctaggtcact tcttcaagag ctgcc 35

<210> 210

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ mmgC(L3)opt

<400> 210

gaaggagata tacatatgat ccgtgatcaa gaaac 35

<210> 211

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ mmgC(L3)opt

<400> 211

tggcagcagc ctaggttaca cctggacatc acgaa 35

<210> 212

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ pETDuet-P2

<400> 212

cctaggctgc tgccaccgct gagca 25

<210> 213

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ pETDuet-P2

<400> 213

catatgtata tctccttctt atact 25

<210> 214

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ tesB(Ab)

<400> 214

ataaggagat ataccatgaa tacactaacc caaga 35

<210> 215

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ tesB(Ab)

<400> 215

tgcggccgca agcttttact gtgtttcaat ttcac 35

<210> 216

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ pCDFDuet

<400> 216

aagcttgcgg ccgcataatg cttaa 25

<210> 217

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ pCDFDuet

<400> 217

catggtatat ctccttatta 20

<210> 218

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ ldh

<400> 218

ttgttgaata aatcgtttat cgatattgat ccagg 35

<210> 219

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ ldh

<400> 219

tatcgcatgc agatctgtgt gcattaccca acggc 35

<210> 220

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ atoB

<400> 220

ttgttgaata aatcggcact cggtatcgct tacct 35

<210> 221

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ atoB

<400> 221

tatcgcatgc agatcggctg gtggtcaacg gtgcc 35

<210> 222

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ sucD

<400> 222

ttgttgaata aatcggagcg cgacctggcg ttgat 35

<210> 223

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ sucD

<400> 223

tatcgcatgc agatcacgat atttttcagt taacc 35

<210> 224

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ pHAK1

<400> 224

gatctgcatg cgatatctct agaacgcgta agctt 35

<210> 225

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ pHAK1

<400> 225

tctcgagccg atttattcaa caaagccgc 29

<210> 226

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ del-ldh

<400> 226

tggtttaatc ttgccgctcc 20

<210> 227

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ del-ldh

<400> 227

gtgctataaa cggcgagttt ca 22

<210> 228

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ del-atoB

<400> 228

cgatggtgat tgaacggttg 20

<210> 229

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ del-atoB

<400> 229

gcactgacga tgacacaatt 20

<210> 230

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ del-sucD

<400> 230

gaaattcgct gctctggaag 20

<210> 231

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ del-sucD

<400> 231

cctggcagat aaccttggtg ttt 23

<210> 232

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ paaJ(L3)opt

<400> 232

ataaggagat ataccatgct ggatgcatat ctgta 35

<210> 233

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ paaJ(L3)opt

<400> 233

tgcggccgca agcttttaca tacgttcaat aacaa 35

<210> 234

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ paaH(L3)opt

<400> 234

gaaggagata tacatatgaa caccgatatt cagac 35

<210> 235

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/ paaH(L3)opt

<400> 235

agactcgagg gtaccttaat tatccggtgt cagca 35

<210> 236

<211> 453

<212> PRT

<213> 克氏梭菌

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<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> CAR

<400> 237

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<210> 238

<211> 1174

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> CAR

<400> 238

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Leu

<210> 239

<211> 1178

<212> PRT

<213> 脓肿分枝杆菌

<400> 239

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Leu Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Thr Ala Val Arg Lys Leu Cys Asp Glu

260 265 270

Phe Gly Ala Leu Met Ile Leu Asp Glu Val Gln Thr Gly Met Gly Arg

275 280 285

Thr Gly Lys Met Phe Ala Cys Glu His Glu Asn Val Gln Pro Asp Ile

290 295 300

Leu Cys Leu Ala Lys Ala Leu Gly Gly Gly Val Met Pro Ile Gly Ala

305 310 315 320

Thr Ile Ala Thr Glu Glu Val Phe Ser Val Leu Phe Asp Asn Pro Phe

325 330 335

Leu His Thr Thr Thr Phe Gly Gly Asn Pro Leu Ala Cys Ala Ala Ala

340 345 350

Leu Ala Thr Ile Asn Val Leu Leu Glu Gln Asn Leu Pro Ala Gln Ala

355 360 365

Glu Gln Lys Gly Asp Met Leu Leu Asp Gly Phe Arg Gln Leu Ala Arg

370 375 380

Glu Tyr Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Arg Gly Lys Gly Met Leu Met

385 390 395 400

Ala Ile Glu Phe Val Asp Asn Glu Ile Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Glu

405 410 415

Met Phe Arg Gln Arg Val Leu Val Ala Gly Thr Leu Asn Asn Ala Lys

420 425 430

Thr Ile Arg Ile Glu Pro Pro Leu Thr Leu Thr Ile Glu Gln Cys Glu

435 440 445

Leu Val Ile Lys Ala Ala Arg Lys Ala Leu Ala Ala Met Arg Val Ser

450 455 460

Val Glu Glu Ala

465

<210> 247

<211> 456

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> AT

<400> 247

Met Asn Ser Gln Ile Thr Asn Ala Lys Thr Arg Glu Trp Gln Ala Leu

1 5 10 15

Ser Arg Asp His His Leu Pro Pro Phe Thr Asp Tyr Lys Gln Leu Asn

20 25 30

Glu Lys Gly Ala Arg Ile Ile Thr Lys Ala Glu Gly Val Tyr Ile Trp

35 40 45

Asp Ser Glu Gly Asn Lys Ile Leu Asp Ala Met Ala Gly Leu Trp Cys

50 55 60

Val Asn Val Gly Tyr Gly Arg Glu Glu Leu Val Gln Ala Ala Thr Arg

65 70 75 80

Gln Met Arg Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Leu Phe Phe Gln Thr Ala His

85 90 95

Pro Pro Val Val Glu Leu Ala Lys Ala Ile Ala Asp Val Ala Pro Glu

100 105 110

Gly Met Asn His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp

115 120 125

Thr Val Leu Arg Met Val Arg His Tyr Trp Ala Thr Lys Gly Gln Pro

130 135 140

Gln Lys Lys Val Val Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr

145 150 155 160

Val Ala Gly Val Ser Leu Gly Gly Met Lys Ala Leu His Glu Gln Gly

165 170 175

Asp Phe Pro Ile Pro Gly Ile Val His Ile Ala Gln Pro Tyr Trp Tyr

180 185 190

Gly Glu Gly Gly Asp Met Ser Pro Asp Glu Phe Gly Val Trp Ala Ala

195 200 205

Glu Gln Leu Glu Lys Lys Ile Leu Glu Val Gly Glu Glu Asn Val Ala

210 215 220

Ala Phe Ile Ala Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro

225 230 235 240

Pro Asp Thr Tyr Trp Pro Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ala Lys Tyr Asp

245 250 255

Ile Leu Phe Ile Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly

260 265 270

Glu Trp Phe Gly Ser Gln Tyr Tyr Gly Asn Ala Pro Asp Leu Met Pro

275 280 285

Ile Ala Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Met Gly Gly Val Val

290 295 300

Val Arg Asp Glu Ile Val Glu Val Leu Asn Gln Gly Gly Glu Phe Tyr

305 310 315 320

His Gly Phe Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu

325 330 335

Glu Asn Ile Arg Ile Leu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Glu Lys Val Lys

340 345 350

Ala Glu Thr Ala Pro Tyr Leu Gln Lys Arg Trp Gln Glu Leu Ala Asp

355 360 365

His Pro Leu Val Gly Glu Ala Arg Gly Val Gly Met Val Ala Ala Leu

370 375 380

Glu Leu Val Lys Asn Lys Lys Thr Arg Glu Arg Phe Thr Asp Lys Gly

385 390 395 400

Val Gly Met Leu Cys Arg Glu His Cys Phe Arg Asn Gly Leu Ile Met

405 410 415

Arg Ala Val Gly Asp Thr Met Ile Ile Ser Pro Pro Leu Val Ile Asp

420 425 430

Pro Ser Gln Ile Asp Glu Leu Ile Thr Leu Ala Arg Lys Cys Leu Asp

435 440 445

Gln Thr Ala Ala Ala Val Leu Ala

450 455

<210> 248

<211> 426

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> AT

<400> 248

Met Asn Ser Asn Lys Glu Leu Met Gln Arg Arg Ser Gln Ala Ile Pro

1 5 10 15

Arg Gly Val Gly Gln Ile His Pro Ile Phe Ala Asp Arg Ala Glu Asn

20 25 30

Cys Arg Val Trp Asp Val Glu Gly Arg Glu Tyr Leu Asp Phe Ala Gly

35 40 45

Gly Ile Ala Val Leu Asn Thr Gly His Leu His Pro Lys Val Val Ala

50 55 60

Ala Val Glu Ala Gln Leu Lys Lys Leu Ser His Thr Cys Phe Gln Val

65 70 75 80

Leu Ala Tyr Glu Pro Tyr Leu Glu Leu Cys Glu Ile Met Asn Gln Lys

85 90 95

Val Pro Gly Asp Phe Ala Lys Lys Thr Leu Leu Val Thr Thr Gly Ser

100 105 110

Glu Ala Val Glu Asn Ala Val Lys Ile Ala Arg Ala Ala Thr Lys Arg

115 120 125

Ser Gly Thr Ile Ala Phe Ser Gly Ala Tyr His Gly Arg Thr His Tyr

130 135 140

Thr Leu Ala Leu Thr Gly Lys Val Asn Pro Tyr Ser Ala Gly Met Gly

145 150 155 160

Leu Met Pro Gly His Val Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Cys Pro Leu His

165 170 175

Gly Ile Ser Glu Asp Asp Ala Ile Ala Ser Ile His Arg Ile Phe Lys

180 185 190

Asn Asp Ala Ala Pro Glu Asp Ile Ala Ala Ile Val Ile Glu Pro Val

195 200 205

Gln Gly Glu Gly Gly Phe Tyr Ala Ser Ser Pro Ala Phe Met Gln Arg

210 215 220

Leu Arg Ala Leu Cys Asp Glu His Gly Ile Met Leu Ile Ala Asp Glu

225 230 235 240

Val Gln Ser Gly Ala Gly Arg Thr Gly Thr Leu Phe Ala Met Glu Gln

245 250 255

Met Gly Val Ala Pro Asp Leu Thr Thr Phe Ala Lys Ser Ile Ala Gly

260 265 270

Gly Phe Pro Leu Ala Gly Val Thr Gly Arg Ala Glu Val Met Asp Ala

275 280 285

Val Ala Pro Gly Gly Leu Gly Gly Thr Tyr Ala Gly Asn Pro Ile Ala

290 295 300

Cys Val Ala Ala Leu Glu Val Leu Lys Val Phe Glu Gln Glu Asn Leu

305 310 315 320

Leu Gln Lys Ala Asn Asp Leu Gly Gln Lys Leu Lys Asp Gly Leu Leu

325 330 335

Ala Ile Ala Glu Lys His Pro Glu Ile Gly Asp Val Arg Gly Leu Gly

340 345 350

Ala Met Ile Ala Ile Glu Leu Phe Glu Asp Gly Asp His Asn Lys Pro

355 360 365

Asp Ala Lys Leu Thr Ala Glu Ile Val Ala Arg Ala Arg Asp Lys Gly

370 375 380

Leu Ile Leu Leu Ser Cys Gly Pro Tyr Tyr Asn Val Leu Arg Ile Leu

385 390 395 400

Val Pro Leu Thr Ile Glu Asp Ala Gln Ile Arg Gln Gly Leu Glu Ile

405 410 415

Ile Ser Gln Cys Phe Asp Glu Ala Lys Gln

420 425

<210> 249

<211> 421

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> AT

<400> 249

Met Ser Asn Asn Glu Phe His Gln Arg Arg Leu Ser Ala Thr Pro Arg

1 5 10 15

Gly Val Gly Val Met Cys Asn Phe Phe Ala Gln Ser Ala Glu Asn Ala

20 25 30

Thr Leu Lys Asp Val Glu Gly Asn Glu Tyr Ile Asp Phe Ala Ala Gly

35 40 45

Ile Ala Val Leu Asn Thr Gly His Arg His Pro Asp Leu Val Ala Ala

50 55 60

Val Glu Gln Gln Leu Gln Gln Phe Thr His Thr Ala Tyr Gln Ile Val

65 70 75 80

Pro Tyr Glu Ser Tyr Val Thr Leu Ala Glu Lys Ile Asn Ala Leu Ala

85 90 95

Pro Val Ser Gly Gln Ala Lys Thr Ala Phe Phe Thr Thr Gly Ala Glu

100 105 110

Ala Val Glu Asn Ala Val Lys Ile Ala Arg Ala His Thr Gly Arg Pro

115 120 125

Gly Val Ile Ala Phe Ser Gly Gly Phe His Gly Arg Thr Tyr Met Thr

130 135 140

Met Ala Leu Thr Gly Lys Val Ala Pro Tyr Lys Ile Gly Phe Gly Pro

145 150 155 160

Phe Pro Gly Ser Val Tyr His Val Pro Tyr Pro Ser Asp Leu His Gly

165 170 175

Ile Ser Thr Gln Asp Ser Leu Asp Ala Ile Glu Arg Leu Phe Lys Ser

180 185 190

Asp Ile Glu Ala Lys Gln Val Ala Ala Ile Ile Phe Glu Pro Val Gln

195 200 205

Gly Glu Gly Gly Phe Asn Val Ala Pro Lys Glu Leu Val Ala Ala Ile

210 215 220

Arg Arg Leu Cys Asp Glu His Gly Ile Val Met Ile Ala Asp Glu Val

225 230 235 240

Gln Ser Gly Phe Ala Arg Thr Gly Lys Leu Phe Ala Met Asp His Tyr

245 250 255

Ala Asp Lys Pro Asp Leu Met Thr Met Ala Lys Ser Leu Ala Gly Gly

260 265 270

Met Pro Leu Ser Gly Val Val Gly Asn Ala Asn Ile Met Asp Ala Pro

275 280 285

Ala Pro Gly Gly Leu Gly Gly Thr Tyr Ala Gly Asn Pro Leu Ala Val

290 295 300

Ala Ala Ala His Ala Val Leu Asn Ile Ile Asp Lys Glu Ser Leu Cys

305 310 315 320

Glu Arg Ala Asn Gln Leu Gly Gln Arg Leu Lys Asn Thr Leu Ile Asp

325 330 335

Ala Lys Glu Ser Val Pro Ala Ile Ala Ala Val Arg Gly Leu Gly Ser

340 345 350

Met Ile Ala Val Glu Phe Asn Asp Pro Gln Thr Gly Glu Pro Ser Ala

355 360 365

Ala Ile Ala Gln Lys Ile Gln Gln Arg Ala Leu Ala Gln Gly Leu Leu

370 375 380

Leu Leu Thr Cys Gly Ala Tyr Gly Asn Val Ile Arg Phe Leu Tyr Pro

385 390 395 400

Leu Thr Ile Pro Asp Ala Gln Phe Asp Ala Ala Met Lys Ile Leu Gln

405 410 415

Asp Ala Leu Ser Asp

420

<210> 250

<211> 464

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> AT

<400> 250

Met Ala Thr Ile Thr Asn His Met Pro Thr Ala Glu Leu Gln Ala Leu

1 5 10 15

Asp Ala Ala His His Leu His Pro Phe Ser Ala Asn Asn Ala Leu Gly

20 25 30

Glu Glu Gly Thr Arg Val Ile Thr Arg Ala Arg Gly Val Trp Leu Asn

35 40 45

Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Leu Asp Ala Met Ala Gly Leu Trp Cys

50 55 60

Val Asn Ile Gly Tyr Gly Arg Asp Glu Leu Ala Glu Val Ala Ala Arg

65 70 75 80

Gln Met Arg Glu Leu Pro Tyr Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr Thr His

85 90 95

Val Pro Ala Ile Ala Leu Ala Gln Lys Leu Ala Glu Leu Ala Pro Gly

100 105 110

Asp Leu Asn His Val Phe Phe Ala Gly Gly Gly Ser Glu Ala Asn Asp

115 120 125

Thr Asn Ile Arg Met Val Arg Thr Tyr Trp Gln Asn Lys Gly Gln Pro

130 135 140

Glu Lys Thr Val Ile Ile Ser Arg Lys Asn Ala Tyr His Gly Ser Thr

145 150 155 160

Val Ala Ser Ser Ala Leu Gly Gly Met Ala Gly Met His Ala Gln Ser

165 170 175

Gly Leu Ile Pro Asp Val His His Ile Asn Gln Pro Asn Trp Trp Ala

180 185 190

Glu Gly Gly Asp Met Asp Pro Glu Glu Phe Gly Leu Ala Arg Ala Arg

195 200 205

Glu Leu Glu Glu Ala Ile Leu Glu Leu Gly Glu Asn Arg Val Ala Ala

210 215 220

Phe Ile Ala Glu Pro Val Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Ala Pro

225 230 235 240

Asp Ser Tyr Trp Pro Glu Ile Gln Arg Ile Cys Asp Lys Tyr Asp Ile

245 250 255

Leu Leu Ile Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn

260 265 270

Trp Phe Gly Thr Gln Thr Met Gly Ile Arg Pro His Ile Met Thr Ile

275 280 285

Ala Lys Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Ala Pro Ile Gly Gly Ser Ile Val

290 295 300

Cys Asp Glu Val Ala His Val Ile Gly Lys Asp Glu Phe Asn His Gly

305 310 315 320

Tyr Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu Glu Asn

325 330 335

Leu Arg Ile Leu Glu Glu Glu Asn Ile Leu Asp His Val Arg Asn Val

340 345 350

Ala Ala Pro Tyr Leu Lys Glu Lys Trp Glu Ala Leu Thr Asp His Pro

355 360 365

Leu Val Gly Glu Ala Lys Ile Val Gly Met Met Ala Ser Ile Ala Leu

370 375 380

Thr Pro Asn Lys Ala Ser Arg Ala Lys Phe Ala Ser Glu Pro Gly Thr

385 390 395 400

Ile Gly Tyr Ile Cys Arg Glu Arg Cys Phe Ala Asn Asn Leu Ile Met

405 410 415

Arg His Val Gly Asp Arg Met Ile Ile Ser Pro Pro Leu Val Ile Thr

420 425 430

Pro Ala Glu Ile Asp Glu Met Phe Val Arg Ile Arg Lys Ser Leu Asp

435 440 445

Glu Ala Gln Ala Glu Ile Glu Lys Gln Gly Leu Met Lys Ser Ala Ala

450 455 460

<210> 251

<211> 339

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 251

Met Ser Met Ile Lys Ser Tyr Ala Ala Lys Glu Ala Gly Gly Glu Leu

1 5 10 15

Glu Val Tyr Glu Tyr Asp Pro Gly Glu Leu Arg Pro Gln Asp Val Glu

20 25 30

Val Gln Val Asp Tyr Cys Gly Ile Cys His Ser Asp Leu Ser Met Ile

35 40 45

Asp Asn Glu Trp Gly Phe Ser Gln Tyr Pro Leu Val Ala Gly His Glu

50 55 60

Val Ile Gly Arg Val Val Ala Leu Gly Ser Ala Ala Gln Asp Lys Gly

65 70 75 80

Leu Gln Val Gly Gln Arg Val Gly Ile Gly Trp Thr Ala Arg Ser Cys

85 90 95

Gly His Cys Asp Ala Cys Ile Ser Gly Asn Gln Ile Asn Cys Glu Gln

100 105 110

Gly Ala Val Pro Thr Ile Met Asn Arg Gly Gly Phe Ala Glu Lys Leu

115 120 125

Arg Ala Asp Trp Gln Trp Val Ile Pro Leu Pro Glu Asn Ile Asp Ile

130 135 140

Glu Ser Ala Gly Pro Leu Leu Cys Gly Gly Ile Thr Val Phe Lys Pro

145 150 155 160

Leu Leu Met His His Ile Thr Ala Thr Ser Arg Val Gly Val Ile Gly

165 170 175

Ile Gly Gly Leu Gly His Ile Ala Ile Lys Leu Leu His Ala Met Gly

180 185 190

Cys Glu Val Thr Ala Phe Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Gln Glu Val

195 200 205

Leu Ala Met Gly Ala Asp Lys Val Val Asn Ser Arg Asp Pro Gln Ala

210 215 220

Leu Lys Ala Leu Ala Gly Gln Phe Asp Leu Ile Ile Asn Thr Val Asn

225 230 235 240

Val Ser Leu Asp Trp Gln Pro Tyr Phe Glu Ala Leu Thr Tyr Gly Gly

245 250 255

Asn Phe His Thr Val Gly Ala Val Leu Thr Pro Leu Ser Val Pro Ala

260 265 270

Phe Thr Leu Ile Ala Gly Asp Arg Ser Val Ser Gly Ser Ala Thr Gly

275 280 285

Thr Pro Tyr Glu Leu Arg Lys Leu Met Arg Phe Ala Ala Arg Ser Lys

290 295 300

Val Ala Pro Thr Thr Glu Leu Phe Pro Met Ser Lys Ile Asn Asp Ala

305 310 315 320

Ile Gln His Val Arg Asp Gly Lys Ala Arg Tyr Arg Val Val Leu Lys

325 330 335

Ala Asp Phe

Claims

1.一种重组微生物，其包含外源基因，该外源基因编码具有将2,3-脱氢己二酰-CoA还原而转换成己二酰CoA的酶活性的蛋白质，其中，

所述外源基因为：

2.如权利要求1所述的重组微生物，其中，所述外源基因为：

3.如权利要求1或2所述的重组微生物，其中，所述外源基因来源于选自耳念珠菌(Candida auris)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、喜热梭孢壳(Thermothelomyces thermophilus)、太瑞斯梭孢壳霉(Thermothielavioides terrestris)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、丝状真菌柄孢霉(Podospora anserina)、淡紫拟青霉菌(Purpureocillium lilacinum)和圆核腔菌(Pyrenophora teres)中的至少一者。

4.如权利要求1～3中任一项所述的重组微生物，其中，

所述重组微生物具有C6化合物的生产路径，

所述C6化合物为选自由己二酸、六亚甲基二胺、1,6-己二醇、6-氨基己酸、6-氨基-1-己醇和6-羟基己酸组成的组中的至少一者。

5.如权利要求1～4中任一项所述的重组微生物，其中，所述重组微生物属于埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、节杆菌(Arthrobacter)属、短杆菌(Brevibacterium)属、梭菌(Clostridium)属、发酵单胞菌(Zymomonas)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、伯克霍尔德菌(Burkholderia)属、链霉菌(Streptomyces)属、红球菌(Rhodococcus)属、集胞藻(Synechocystis)属、嗜碱盐芽孢杆菌(Alkalihalobacillus)属、酵母菌(Saccharomyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、亚罗酵母(Yarrowia)属、念珠菌(Candida)属、毕赤酵母(Pichia)属、或曲霉(Aspergillus)属。

6.如权利要求1～5中任一项所述的重组微生物，其中，所述重组微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)。

7.如权利要求1～6中任一项所述的重组微生物，其进一步包含选自由

·编码3-氧代己二酰CoA硫解酶的基因、

·编码3-羟基己二酰CoA脱氢酶的基因、

·编码3-羟基己二酰CoA脱水酶的基因、

·编码羧酸还原酶的基因、

·编码醇脱氢酶的基因、以及

·编码转氨酶(氨基转移酶)的基因

组成的组中的至少一者。

8.一种C6化合物的制造方法，其包括对权利要求1～7中任一项所述的重组微生物进行培养的培养工序，其中，所述C6化合物为选自由己二酸、六亚甲基二胺、1,6-己二醇、6-氨基己酸、6-氨基-1-己醇和6-羟基己酸组成的组中的至少一者。

9.一种重组蛋白，其中，

(b)为下述任一者：

10.一种重组蛋白，其中，

(xi)由序列编号8、9、10、11、12、13、14、15或16所示的氨基酸序列构成，或者

11.一种C6化合物的制造方法，其包括使用权利要求9或10所述的重组蛋白的步骤。

12.一种重组微生物，其包含编码3-羟基己二酰CoA脱水酶的外源基因和编码2,3-脱氢己二酰CoA还原酶的外源基因中的至少一者。

13.如权利要求12所述的重组微生物，其中，所述3-羟基己二酰CoA脱水酶和2,3-脱氢己二酰CoA还原酶中的至少一者来源于伯克霍尔德菌属(Burkholderiasp.)LEBP-3株(保藏编号：NITE BP-03334)。

14.如权利要求12或13所述的重组微生物，其中，

所述3-羟基己二酰CoA脱水酶被与下述PCR扩增物的序列一致性为80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的DNA所编码，

该DNA具有626bp～940bp，

作为引物得到的。

15.如权利要求12～14中任一项所述的重组微生物，其中，

所述2,3-脱氢己二酰CoA还原酶被与下述PCR扩增物的序列一致性为80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的DNA所编码，

该DNA具有924bp～1386bp，

作为引物得到的。

16.如权利要求12或13所述的重组微生物，其中，

所述3-羟基己二酰CoA脱水酶被作为下述PCR扩增物的DNA所编码，

该DNA具有783bp或784bp，

作为引物得到的。

17.如权利要求12～14中任一项所述的重组微生物，其中，

所述2,3-脱氢己二酰CoA还原酶被作为下述PCR扩增物的DNA所编码，

该DNA具有1155bp或1156bp，

作为引物得到的。

18.如权利要求12～17中任一项所述的重组微生物，其中，所述重组微生物属于选自由埃希氏菌属、棒状杆菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、伯克霍尔德菌属、假单胞菌属、梭菌属、酵母菌属、裂殖酵母属、亚罗酵母属、念珠菌属、毕赤酵母属和曲霉属组成的组中的属。

19.如权利要求12～18中任一项所述的重组微生物，其具有己二酸生产路径。

20.如权利要求12～19中任一项所述的重组微生物，其具有六亚甲基二胺生产路径。

21.如权利要求12～19中任一项所述的重组微生物，其具有1,6-己二醇生产路径。

22.如权利要求12～19中任一项所述的重组微生物，其具有6-氨基-1-己醇生产路径。

23.一种目标化合物的制造方法，其包括对权利要求12～18中任一项所述的重组微生物进行培养的培养工序，其中，

所述目标化合物选自由己二酸、己二酸衍生物、六亚甲基二胺、1,6-己二醇和6-氨基-1-己醇组成的组，

所述己二酸衍生物选自由氧代己二酸、乙酰丙酸、3-羟基己二酸和2,3-脱氢己二酸组成的组。

24.一种己二酸的制造方法，其包括对权利要求19所述的重组微生物进行培养的培养工序。

25.一种六亚甲基二胺的制造方法，其包括对权利要求20所述的重组微生物进行培养的培养工序。

26.一种1,6-己二醇的制造方法，其包括对权利要求21所述的重组微生物进行培养的培养工序。

27.一种6-氨基-1-己醇的制造方法，其包括对权利要求22所述的重组微生物进行培养的培养工序。

28.一种重组多肽，其是下述(A-1)、(A-2)或(A-3)的重组多肽：

具有3-羟基己二酰CoA脱水酶活性，

所述DNA具有626bp～940bp，

作为引物得到的；

具有3-羟基己二酰CoA脱水酶活性，

所述DNA具有626bp～940bp，

作为引物得到的；

具有3-羟基己二酰CoA脱水酶活性，

所述DNA具有626bp～940bp，

作为引物得到的。

29.一种重组多肽，其是下述(B-1)、(B-2)或(B-3)的重组多肽：

具有2,3-脱氢己二酰CoA还原酶活性，

所述DNA具有924bp～1386bp，

作为引物得到的；

具有2,3-脱氢己二酰CoA还原酶活性，

所述DNA具有924bp～1386bp，

作为引物得到的；

具有2,3-脱氢己二酰CoA还原酶活性，

所述DNA具有924bp～1386bp，

作为引物得到的。