KR20200145981A - 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주에서 듀얼 벡터 시스템과 조효소 특이성 조절을 이용한 글루타릭산 생산성 향상방법 - Google Patents
재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주에서 듀얼 벡터 시스템과 조효소 특이성 조절을 이용한 글루타릭산 생산성 향상방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT), 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD), 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB), 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA) 및 대장균 유래의 디하이드로디피콜리네이트 리덕테아제(dihydrodipicolinate reductase; DapB)를 코딩하는 각각의 뉴클레오티드가 선택적으로 포함된, pHM1519 복제 원점을 포함하는 제1벡터와 pBL1 복제 원점을 포함하는 제2벡터로 형질전환된 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주 및 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 배양하는 단계를 포함하는 글루타릭산 생산방법에 관한 것이다. 본 발명은 기존의 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주의 문제점을 파악하여, 듀얼벡터 시스템을 통해 글루타릭산 생산량을 늘리는 방법에 관한 것이다. 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 사용하여 글루타릭산을 생산하는 경우 생산량이 우수할 뿐만 아니라 부산물 없이 글루타릭산만 선택적으로 생산하는 것이 가능하다.
Description
본 발명은 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주에서 듀얼 벡터 시스템과 조효소 특이성 조절을 이용한 글루타릭산 생산성 향상방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT), 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD), 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB), 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA) 및 대장균 유래의 디하이드로디피콜리네이트 리덕테아제(dihydrodipicolinate reductase; DapB)를 코딩하는 각각의 뉴클레오티드가 선택적으로 포함된, pHM1519 복제 원점을 포함하는 제1벡터와 pBL1 복제 원점을 포함하는 제2벡터로 형질전환된 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주 및 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 배양하는 단계를 포함하는 글루타릭산 생산방법에 관한 것이다.
전 세계적인 석유수급 불안과 석유자원 고갈, 지구 온난화에 대한 위기의식으로 최근 산업 바이오 기술을 이용하여 바이오매스에서 유래한 대체 생산 방법이나 대체 화합물을 생산하기 위한 전 인류적인 노력이 바이오에너지, 바이오플라스틱, 바이오화합물 등의 다양한 분야에서 가시화되고 있다.
바이오매스를 활용하여 생산되는 바이오 플라스틱 시장의 경우 2002년 Natureworks사에 의해 상업화된 폴리유산 (Poly Lactic acid)이 연 14만 톤 규모로 생산되어 최근 시장이 급속히 확대되고 있다. PHA계 바이오플라스틱인 폴리-(3-하이드록시부틸레이트-코-3-하이드록시발레레이트 {poly-(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalarate) }(P(3HB-co-3HV))도 Metabolix와 ADM의 합작회사인 Telles에 의해 5만 톤 규모의 공장이 2010년 완공되어 제품이 시판되고 있다. 또한, 듀폰사가 생산하고 있는 바이오매스 기반의 1,3-프로판디올을 이용하여 PTT 고분자 제품이 현재 상용화되어 있다. 이외에도 숙신산 기반의 PBS 등도 활발히 개발되고 있다.
나일론 55와 나일론 45의 제조시 사용되는 C5의 글루타릭산(glutaric acid)은 주로 화학적 방법에 의해 생산하나, 바이오매스를 기반으로 제조하는 것도 가능하며, 미생물에서 자연적으로 생산되는 글루타릭산은 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 균주에서 L-라이신의 이화작용 경로 중 중간체로서 생성됨이 보고된 바 있다.
슈도모나스 푸티다 균주에서 L-라이신(L-lysine)은 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB) 효소에 의해 5-아미노발레르아미드(5-aminovaleramide)로 전환되며, 상기 5-아미노발레르아미드는 델타-아미노발레르아미다아제(delta-aminovaleramidase; DavA) 효소에 의해 5-아미노발레르산(5-aminovaleric acid, 5-AVA)으로 전환되고, 상기 5-아미노발레르산은 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT) 효소에 의해 글루타레이트 세미알데하이드(glutarate semialdehyde)로 전환되며, 상기 글루타레이트 세미알데하이드는 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD) 효소에 의해 글루타릭산(glutaric acid)으로 전환된다. 그러나 슈도모나스 푸티다 균주에서는 상기 과정에 의해 생산된 글루타릭산을 아세틸-CoA(acetyl-CoA)로 변환하는 과정을 더 포함한다.
재조합 균주를 이용하여 글루타릭산을 생산하는 종래 선행기술로서, 한국등록특허 제10-1271160호 및 선행논문 [Park, S. J. et al., Metab Eng., 42-47, 2013]에는 재조합 대장균 균주로부터 글루타릭산을 제조하는 방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제10-2014-0132093호 및 선행논문 [Shin, J. H. et al., Microb Cell Fact., 15(1), 174, 2016]에는 재조합 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주로부터 글루타릭산을 제조하는 방법이 개시된 바 있다. 마지막으로, 선행논문 [Kim, H. T. et al., Metab Eng., 99-109, 2019]에는 davT, davD, davB 및 davA 효소를 포함하는 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 사용하여 글루타릭산을 생산 하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 선행논문 [Kim, H. T. et al., Metab Eng., 99-109, 2019]는 글루타릭산 생산 과정에서 과량의 라이신이 전환되지 않고 축적되는 현상이 있었다. 이는 라이신으로부터 글루타릭산을 생합성하는 효소들의 반응이 원활하게 진행되지 않음을 의미한다. 원인은 단일 플라스미드를 사용하여 DavTDBA 효소를 발현했던 곳에서 기인한다고 볼 수 있다. 라이신에서 5-아미노발레르산을 생산하는 모듈이 뒤쪽에 위치하는 것을 근거로 원활한 효소 발현이 되지 않는 것을 파악 할 수 있다. 추가적으로 라이신 생합성 경로 분석결과 4mol의 NADPH가 요구되는 것을 확인하였고 글루타릭산의 전구체가 되는 라이신의 원활한 합성을 위해 조효소 특이성이 전환된 효소를 도입하였다.
따라서, 본 발명은 기존의 싱글벡터 시스템이 아닌 듀얼벡터 시스템으로 재조합 균주를 개발하였다. 이는 라이신에서 글루타릭산을 생산하는 모듈을 두 부분으로 나누어 원활한 효소발현을 토대로 기존의 문제점이었던 라이신의 축적이 일어나지 않도록 하였다. 추가적으로 라이신 생합성 효소의 조효소 특이성 정보를 얻어 조효소 특이성이 전환된 효소를 도입하였다.
Park, S. J. et al., Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of 5-aminovalerate and glutarate as C5 platform chemicals, Metab Eng., 42-47, 2013.
Shin, J. H. et al., Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for enhanced production of 5-aminovaleric acid, Microb Cell Fact., 15(1), 174, 2016.
본 발명의 주된 목적은 DavT 효소, DavD 효소, DavB 효소, DavA 효소 및 대장균 유래의 DapB 효소를 코딩하는 각각의 뉴클레오티드가 선택적으로 포함된, pHM1519 복제 원점을 포함하는 제1벡터와 pBL1 복제 원점을 포함하는 제2벡터로 형질전환된, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 배양하는 단계를 포함하는 글루타릭산 생산방법에 관한 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT) 효소, 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD) 효소, 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB) 효소, 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA) 효소 및 대장균 유래의 디하이드로디피콜리네이트 리덕테아제(dihydrodipicolinate reductase; DapB) 효소를 코딩하는 각각의 뉴클레오티드가 선택적으로 포함된, pHM1519 복제 원점을 포함하는 제1벡터와 pBL1 복제 원점을 포함하는 제2벡터로 형질전환된, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 제공한다.
상기 DavT 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davT)은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 표식되고, 상기 DavD 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davD)은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 표식되며, 상기 DavB 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davB)은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 표식되고, 상기 DavA 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davA)은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 표식되며, 상기 DapB 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(dapB)은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 표식된다.
또한, 상기 발현벡터는 히스티딘-태그(polyhistidine-tag, His-tag)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 상기 히스티딘-태그는 6개 이상의 히스티딘(histidine) 잔기(residue)로 구성된 아미노산 모티프로, 본 발명에서는 6개의 히스티딘-태그를 사용한다. 바람직하게는 상기 히스티딘-태그는 DavT 또는 DavB를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davT 또는 davB)의 N-말단에 위치하고, 보다 바람직하게는 상기 히스티딘-태그는 DavB를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davB)의 N-말단에 위치한다.
본 발명에서 듀얼벡터 시스템을 적용하기 위해 기존 싱글벡터 시스템(pCES208)과 동시 사용이 가능한 새로운 벡터를 개발하였다. 기존의 벡터시스템(pCES208)은 pHM1519 복제 원점을 사용하며 이와 동시 사용이 가능한 복제원점을 탐색한 결과, pBL1 복제 원점이 동시 사용이 가능함을 확인하였다. 이에 따라, 종래의 pKE112 벡터에 코리네박테리움 글루타미컴 복제원점인 pBL1을 도입하였고, 항생제 마커로써 스펙티노마이신(spectinomycin) 내성 유전자를 도입하여 pBL712 벡터를 제작하였다.
본 발명에서 제공하는 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주의 일 예로서, davT와 davD를 포함하는 pBL712 발현벡터; 및 davB와 davA를 포함하는 pCES208 발현벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주가 될 수 있다. 상기 각 발현벡터에 포함된 프로모터는 전사를 시작하는데 필요한 서열로, pL프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터, 합성 프로모터 등을 사용하는 것이 일반적이나, 최적의 발현세기를 나타내기 위해 바람직하게는 합성 프로모터인 H30 프로모터를 사용할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주의 다른 예로서, davT, davD, davB 및 davA를 포함하는 pCES208 발현벡터; 및 dapB가 포함된 pBL712 발현벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주가 될 수 있다.
상기 용어 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물(상기 폴리뉴클레오티드)이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 발현벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 삽입된 외래 DNA가 발현될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다.
상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
상기 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 형질전환에 사용될 수 있는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포 모두를 포함할 수 있으며, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 사용될 수 있다. 예를 들어, 에스케리키아, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10 등의 동물 세포 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
형질전환은 폴리뉴클레오티드를 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아-매개 형질전환, PEG(polyethylene glycol), 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 입자 충격법(particle bombardment) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 실시양태는, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 이용하여, 글루타릭산을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 글루타릭산 생산방법은 구체적으로, (a) 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 배양물로부터 글루타릭산을 회수하는 단계를 포함한다.
상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, davT와 davD를 포함하는 pBL712 발현벡터; 및 davB와 davA를 포함하는 pCES208 발현벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주가 될 수 있고, 다른 예로서, davT, davD, davB 및 davA를 포함하는 pCES208 발현벡터; 및 dapB가 포함된 pBL712 발현벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주가 될 수 있다.
상기 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미하며 플라스크배양(flask culture), 회분배양(batch culture)등이 포함되나 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 탄산 칼슘을 사용하여 적정 pH 를 유지할 수 있고, 쉐이킹 속도를 조절하여 호기성 조건을 유지할 수 있다. 또한, 배양온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있으며, 10 내지 160시간 동안 배양함이 바람직하다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 코리네박테리움 글루타미컴 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당 원으로는 글루코스, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인의 원료로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다.
본 발명은 기존의 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주의 문제점을 파악하여, 듀얼벡터 시스템을 통해 글루타릭산 생산량을 늘리는 방법에 관한 것이다. 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 사용하여 글루타릭산을 생산하는 경우 생산량이 우수할 뿐만 아니라 부산물 없이 글루타릭산만 선택적으로 생산하는 것이 가능하다.
도 1은 본 발명의 핵심이 되는 듀얼벡터 시스템을 모식화 시켜놓은 도면이다.
도 2는 라이신 생합성 경로와 NADPH 조효소 사용에 연관된 유전자 후보군이다. 이 중 NADH 조효소의 선호도가 증진된 효소(DapBmut)를 도입하였다.
도 3은 듀얼벡터 시스템에 사용된 벡터에 관련된 도면이다. davB His A 유전자는 pCES208 벡터에 삽입되어 있으며 pCES208H30MCS 벡터로부터 제작되었다. davTD 유전자는 pBL712 벡터에 삽입되어 있으며 pBL712 벡터는 pKE112MCS 벡터를 backbone으로 하여 코리네박테리움 글루타미컴 균주에 사용가능하고 pCE208벡터와 동시 사용이 가능한 복제원점과 항생제 저항 유전자를 변형함으로써 제작되었다.
도 4는 신규 개발한 벡터(pBL712)가 제대로 작동하는지 확인하기 위해 두 가지 형광단백질인 mChemrry와 dsRed를 도입하였다. 또한 해당 벡터가 기존의 벡터(pCES208)와 동시 사용하는지 확인하기 위해 형광단백질을 통해 FACS 분석을 진행하였다.
도 5는 본 발명 실시예 1 의 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 듀얼벡터 시스템을 적용하여 플라스크에서 120 시간 배양하고, 이로부터 생산된 글루타릭산과 전구체들을 확인한 결과이다.
도 6은 도 5에서 배양된 결과를 토대로 콜로니를 선별하여 2차 배양 한 것이며, 실시예 1 및 비교예 1 내지 2의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 플라스크에서 120 시간 배양하고, 이로부터 생산된 글루타릭산과 전구체들을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명 실시예 1 및 비교예 1 의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 플라스크에서 120 시간 배양한 결과이며, 24 시간 간격으로 샘플을 얻어 생산된 글루타릭산과 전구체들을 시간에 따라 확인한 결과이다.
도 8는 본 발명 실시예 2 및 비교예 1 의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 플라스크에서 120 시간 배양하고, 이로부터 생산된 글루타릭산과 전구체들을 확인한 결과이다.
도 9는 도 8에서 배양된 결과를 토대로 2차 배양 한 것이며, 실시예 2 및 비교예 1의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 플라스크에서 120 시간 배양하고, 이로부터 생산된 글루타릭산과 전구체들을 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명 실시예 2 및 비교예 1의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 플라스크에서 120 시간 배양한 결과이며, 24 시간 간격으로 샘플을 얻어 생산된 글루타릭산과 전구체들을 시간에 따라 확인한 결과이다.
도 2는 라이신 생합성 경로와 NADPH 조효소 사용에 연관된 유전자 후보군이다. 이 중 NADH 조효소의 선호도가 증진된 효소(DapBmut)를 도입하였다.
도 3은 듀얼벡터 시스템에 사용된 벡터에 관련된 도면이다. davB His A 유전자는 pCES208 벡터에 삽입되어 있으며 pCES208H30MCS 벡터로부터 제작되었다. davTD 유전자는 pBL712 벡터에 삽입되어 있으며 pBL712 벡터는 pKE112MCS 벡터를 backbone으로 하여 코리네박테리움 글루타미컴 균주에 사용가능하고 pCE208벡터와 동시 사용이 가능한 복제원점과 항생제 저항 유전자를 변형함으로써 제작되었다.
도 4는 신규 개발한 벡터(pBL712)가 제대로 작동하는지 확인하기 위해 두 가지 형광단백질인 mChemrry와 dsRed를 도입하였다. 또한 해당 벡터가 기존의 벡터(pCES208)와 동시 사용하는지 확인하기 위해 형광단백질을 통해 FACS 분석을 진행하였다.
도 5는 본 발명 실시예 1 의 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 듀얼벡터 시스템을 적용하여 플라스크에서 120 시간 배양하고, 이로부터 생산된 글루타릭산과 전구체들을 확인한 결과이다.
도 6은 도 5에서 배양된 결과를 토대로 콜로니를 선별하여 2차 배양 한 것이며, 실시예 1 및 비교예 1 내지 2의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 플라스크에서 120 시간 배양하고, 이로부터 생산된 글루타릭산과 전구체들을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명 실시예 1 및 비교예 1 의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 플라스크에서 120 시간 배양한 결과이며, 24 시간 간격으로 샘플을 얻어 생산된 글루타릭산과 전구체들을 시간에 따라 확인한 결과이다.
도 8는 본 발명 실시예 2 및 비교예 1 의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 플라스크에서 120 시간 배양하고, 이로부터 생산된 글루타릭산과 전구체들을 확인한 결과이다.
도 9는 도 8에서 배양된 결과를 토대로 2차 배양 한 것이며, 실시예 2 및 비교예 1의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 플라스크에서 120 시간 배양하고, 이로부터 생산된 글루타릭산과 전구체들을 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명 실시예 2 및 비교예 1의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 플라스크에서 120 시간 배양한 결과이며, 24 시간 간격으로 샘플을 얻어 생산된 글루타릭산과 전구체들을 시간에 따라 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 듀얼벡터 시스템 구축
듀얼벡터를 구축하기 위한 구체적인 방법으로서, 선행문헌 [Kim, H. T. et al., Metab Eng., 99-109, 2019]에서 사용된 벡터(pCES208)와 동시 사용가능한 새로운 벡터를 개발하였다. 기존의 벡터(pCES208)은 pHM1519 복제원점을 사용하며 이와 동시에 사용가능한 복제원점을 탐색한 결과 pBL1 복제원점이 동시 사용 가능함을 확인하였다.
이에 따라, 기존의 에스케리키아 콜리 벡터(pKE112)에 코리네박테리움 글루타미컴 복제원점(pBL1)을 도입하였고, H30프로모터 또는 H36프로모터를 삽입하였고 항생제 마커로써 스펙티노마이신(spectinomycin) 내성 유전자를 도입하여 pBL712 벡터를 제작하였다. 이후 기존벡터(pCES208)에 davB His A 유전자를 도입하였고, 새로 개발한 벡터(pBL712)에 davTD 유전자를 도입하여 듀얼벡터 시스템을 개발하였다. 이를 기존의 싱글벡터 시스템과 생산 효율을 비교하였다.
실시예 2: 조효소 특이성 조절을 위한 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 듀얼벡터 시스템 구축
글루타릭산의 전구체가 되는 라이신의 과량 생산을 위해 라이신 생합성 경로를 분석한 결과, 4 mol의 NADPH가 요구되는 것을 확인하였다. 이후 라이신 생합성 경로내 NADPH 요구 효소를 조사하여 대체 효소 후보군 정보를 수집하였다. 아스팔테이트 아미노트랜스퍼라제(aspartate aminotransferase ; AspC), 아스팔테이트-세미알데히드 디히드로제나제(aspartate-semialdehyde dehydrogenase ; Asd), 디히드로디피콜리네이트 리덕테아제(Dihydrodipicolinate reductase ; AapB), 디아미노피밀레이트 디히드로제나제(diaminopimelate dehydrogenase ; Adh)의 네 개의 후보군 중 디히드로디피콜리네이트 리덕테아제(DapB)를 변형시켜 NADH에 선호도가 증진된 효소(DapBmut)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도입하였다. 라이신으로부터 글루타릭산 생합성 경로에 사용되는 기존 벡터(pCES208H30davTDBHisA)는 유지하고 듀얼벡터 시스템에서 개발한 벡터(pBL712)에 효소(DapBmut)를 도입하였다. 이를 기존의 벡터 시스템과 생산 효율을 비교하였다.
| 서열번호 | 프라이머 서열 |
| 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 |
davB_F: 5'-GGATCCATGAACAAGAAGAATCGACACCCC-3' davB_R: 5'-GCGGCCGCTTAATCTGCCAGGGCGATCGGG-3' davA_F: 5'-GCGGCCGCAGGAGATATACATATGCGCATCGCACTGTACCAAG-3' davA_R: 5'-GCGGCCGCTTAGCCTTTACGCAGGTGCAGC-3' davT_F: 5'-AGATCTATGAGCAAAACCAACGAATC-3' davT_R: 5'-AGATCTTCAGGCGATTTCAGCGAAGC-3' davD_F: 5'-GGATCCAGGAGATATACATATGCAGCTCAAAGACGCTCAG-3' davD_R: 5'-AGATCTATGTATATCTCCTTCAGACGCTGATGCACAGGTA-3' davB His _F: 5'-GGATCCATGCACCATCATCACCATCACATGAACAAGAAGAACCGCCACCC-3' davB His _R: 5'-AGATCTATGCACCATCATCACCATCAC ATGAGCAAAACCAACGAAT-3' dapB mut _F: 5'-AAGCTTAGGAGATATACATATGCATGATGCAAACATCCGCG-3' dapB mut _R: 5'-AAGCTTTTACAAATTATTGAGATCAAGTACATCTC-3' |
발현벡터를 구축하기 위한 구체적인 방법으로서, 선행문헌 [Joo, J. C. et al., Bioresour Technol., 245(Pt B), 1692-1700, 2017]을 참고하여 만든 pCES208H30davBA 플라스미드를 BamHI과 BglII로 절단된 슈도모나스 푸티다 유래 davD 유전자를 삽입한 다음, BglII로 절단된 슈도모나스 푸티다 유래 davT 유전자를 삽입하여 pCES208H30davTDBHisA를 구축하였다.
또한, 서열번호 2, 4, 6 및 8에 기재한 코돈 최적화된 davT, davD, davB 및 davA 유전자(바이오니아, 합성 의뢰), davB 서열의 N-말단에 His6-tag 서열이 포함된 유전자를 상기와 동일한 방법으로 플라스미드에 삽입하여 하기 표 2의 발현벡터를 얻었다.
이후, 상기 발현벡터를 코리네박테리움 글루타미컴 균주에 형질전환하여 하기 표 2의 실험군 1 내지 2 및 비교군 1 내지 2의 균주를 확보하였다.
| 실험군 | 플라스미드 | |
| 실험군 1 | pBL712H30DavTD + pCES208H30DavBHisA | pBL712H30RED derivative-H30 promoter, P. putida KT2440 davTD genes, SpmR pCES208H30GFP derivative-H30 promoter, P. putida KT2440 davB His A genes, KmR |
| 실험군 2 | pCES208H30DavTDBHisA + pBL712H30DapBmut | pBL712H30RED derivative-H30 promoter, E. coli mutant R13A dapB gene, SpmR pCES208H30GFP derivative-H30 promoter, P. putida KT2440 davTD genes, P. putida KT2440 davB His A genes, KmR |
| 비교군 1 | pCES208H30DavTDBHisA | pCES208H30GFP derivative-H30 promoter, P. putida KT2440 davTD genes, P. putida KT2440 davB His A genes, KmR |
| 비교군 2 | pCES208H30DavBHisA | pCES208H30GFP derivative-H30 promoter, P. putida KT2440 davB His A genes, KmR |
실시예 3: 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 듀얼벡터 균주로부터 글루타릭산의 생산 확인
상기 실험군 1의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 듀얼벡터 균주를 2㎖의 RG 배지(10g/L 글루코스, 40g/L 뇌심장침출액(brain heart infusion), 10g/L 육추출물(beef extract), and 30g/L of D-솔비톨)가 포함된 14㎖의 둥근튜브(round bottom tube)에 접종하고, 30℃ 및 250rpm의 조건에서 오버나이트(overnight)로 배양하였다.
다음으로, 250㎖ 플라스크(baffled flask)에 20㎖의 CG50 배지 및 상기 오버나이트로 배양한 배양액을 넣고, 30℃ 및 250rpm의 조건에서 120시간 동안 배양하였다. 이때 상기 CG50 배지는 1리터 기준 50g 글루코스, 30g 효모추출물(yeast extract), 30g (NH4)2SO4·7H2O, 0.5g KH2PO4, 0.5g MgSO4·7H2O, 0.01g MnSO4·H2O, 0.01g FeSO4·7H2O, 0.5㎎ 비오틴(biotin) 및 0.3㎎ 티아민-염산염(thiamine-HCl)이 포함되며, 추가로 20㎎/L의 카나마이신(kanamycin)과 200㎎/L의 스펙티노마이신(spectinomycin)을 더하였다. 마지막으로 급격한 pH 변화를 막기위해 0.03g/L의 탄산칼슘을 더하였다.
실험군 1, 비교군 1 및 비교군 2를 대상으로 2차 배양을 실시하였다. 2차 배양은 앞선 배양 결과를 토대로 실험군을 선정하여 2차 배양을 동일한 조건에서 진행하였다. 또한, 실험군 1 및 비교군 1의 경우 24시간 간격으로 샘플분석을 하여 생성물 농도를 확인하였다.
상기 250㎖ 플라스크에서 첫 번째 배양한 실험군 1의 배양액을 이용하여 남아있는 글루코스 및 재조합 코리네박테리움 글루타미컴으로부터 생산된 글루타릭산을 측정하기 위해, 하기 표 3의 조건으로 HPLC를 수행하였으며 이의 결과를 도 5에 나타내었다.
상기 도 5에서 보듯이, 실험군 1의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 듀얼벡터 균주를 이용한 경우 글루타릭산이 5.5~7.5g/L로 생산되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 표 3의 HPLC 조건으로 실험군 1의 두 번째 120시간 배양과 시간별 120시간 배양 결과를 확인하여 도 6 및 7에 나타내었다.
상기 도 6에서 보듯이, 글루타릭산이 싱글벡터에 비해 6.6~6.9g/L증가된 7.6~7.9g/L인 것을 확인할 수 있다.
마지막으로 시간별 배양결과인 도 7을 살펴보면, 글루타릭산이 대조군은 0.8g/L 이고 실험군은 8.3g/L인 것을 확인할 수 있다.
반면, 2차배양에서 중간 생성물인 5-AVA의 축적은 싱글벡터에 비해 듀얼벡터에서 현저히 감소된 것을 확인할 수 있다.
실시예 4: 조효소 특이성이 변형된 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 듀얼벡터 균주로부터 글루타릭산의 생산 확인
상기 실험군 2 및 비교군 1의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 듀얼벡터 균주를 2㎖의 RG 배지(10g/L 글루코스, 40g/L 뇌심장침출액(brain heart infusion), 10g/L 육추출물(beef extract), and 30g/L of D-솔비톨)가 포함된 14㎖의 둥근튜브(round bottom tube)에 접종하고, 30℃ 및 250rpm의 조건에서 오버나이트(overnight)로 배양하였다.
다음으로, 250㎖ 플라스크(baffled flask)에 20㎖의 CG50 배지 및 상기 오버나이트로 배양한 배양액을 넣고, 30℃ 및 250rpm의 조건에서 120시간 동안 배양하였다. 이때 상기 CG50 배지는 1리터 기준 50g 글루코스, 30g 효모추출물(yeast extract), 30g (NH4)2SO4·7H2O, 0.5g KH2PO4, 0.5g MgSO4·7H2O, 0.01g MnSO4·H2O, 0.01g FeSO4·7H2O, 0.5㎎ 비오틴(biotin) 및 0.3㎎ 티아민-염산염(thiamine-HCl)이 포함되며, 추가로 20㎎/L의 카나마이신(kanamycin)과 200㎎/L의 스펙티노마이신(spectinomycin)을 더하였다. 마지막으로 급격한 pH 변화를 막기위해 0.03g/L의 탄산칼슘을 더하였다.
상기 실험군 2 및 비교군 1을 대상으로 2차 배양을 실시하였다. 2차 배양은 앞선 배양 결과를 토대로 실험군을 선정하여 2차 배양을 동일한 조건에서 진행하였다.
또한, 실험군 2 및 비교군 1의 경우 24시간 간격으로 샘플분석을 하여 생성물 농도를 확인하였다.
상기 250㎖ 플라스크에서 첫 번째 배양한 실험군 2의 배양액을 이용하여 남아있는 글루코스 및 재조합 코리네박테리움 글루타미컴으로부터 생산된 글루타릭산을 측정하기 위해, 상기 표 3의 조건으로 HPLC를 수행하였으며 이의 결과를 도 8에 나타내었다.
상기 도 8에서 보듯이, 실험군 2의 조효소 특이성이 변형된 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 이용한 경우 글루타릭산이 0.5~1.4g/L로 생산되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 표 3의 HPLC 조건으로 실시예 1의 120시간 배양과 시간별 120시간 배양 결과를 확인하여 도 9 및 10에 나타내었다.
상기 두 번째 배양결과인 도 9에서 보듯이, 글루타릭산이 싱글벡터에 비해 0.3~0.6g/L증가된 0.9~1.2g/L인 것을 확인할 수 있었다.
마지막으로 시간별 배양결과인 도 10을 살펴보면, 글루타릭산이 대조군은 0.8g/L 이고 실험군은 1.0g/L인 것을 확인할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY
<120> Method for improvement of glutaric acid production by applying
dual vector system and modulating cofactor specificity of lysin
biosynthesis enzyme in recombinant Corynebacterium glutamicum
strain
<130> KPA190799-KR
<160> 17
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1278
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant davT
<400> 1
atgagcaaaa ccaacgaatc cttgatgcaa cgtcgtgtag ctgccgtccc acgtggcgtc 60
ggccagatcc acccgatctt cgtcgacacc gcgaagaact cgaccgtgat cgacgttgaa 120
ggccgcgaac tgatcgactt cgccggcggc atcgcagtac tgaacaccgg ccacctgcac 180
ccgaaagtag ttgcagccgt gcaagagcag ctgaccaagg tcagccacac ctgcttccag 240
gtgctggctt acgagcccta tgtagagctg tgcgaaaaga tcaacaagct ggtcccaggc 300
gacttcgaca agaagaccct gctggtcacc accggctccg aagccgttga aaacgccgtc 360
aagatcgccc gtgctgccac tggccgcgct ggcgtcatcg ccttcaccgg cggttatcac 420
ggccgtacca tgatgaccct gggcctgacc ggcaaggtcg tgccgtactc cgctggcatg 480
ggcctgatgc caggcggcat cttccgcgcc ctgttcccga gcgaactgca cggtatcagc 540
gttgacgacg ccatcgcctc ggtcgagcgc atcttcaaga acgacgccga gccgcgcgac 600
atcgccgcaa tcatcctcga gccagtacaa ggcgaaggcg gcttcctgcc agcgccgaaa 660
gagctgatga agcgcctgcg cgccctgtgc gaccagcacg gcatcctgct gatcgccgac 720
gaagtacaaa ctggcgctgg ccgtaccggc accttcttcg ccatggaaca gatgggcgtt 780
gcgcctgacc tgaccacctt cgccaaatcc atcgctggcg gcttcccgct ggccggtgtg 840
tgcggcaagg ccgaatacat ggacgccatc gcgcctggcg gcctgggcgg tacctacgcc 900
ggttcgccga tcgcttgcgc cgcggccctg gccgtgatcg aagtgttcga agaagaaaaa 960
ctgctggacc gcagcaaggc tgtgggtgag cgcctgaccg ccggcctgcg cgaaatccag 1020
aagaagtacc cgatcatcgg cgacgtccgt ggtctgggct cgatgattgc cgtcgaagtc 1080
ttcgagaagg gcactcacac cccgaacgct gctgctgttg gccaggttgt cgccaaggct 1140
cgtgaaaagg gtctgatcct gctgtcttgc ggcacctacg gcaacgtcct gcgtatcctg 1200
gttccgctga ccgccgaaga cgcgctgctg gacaaaggcc tggccatcat cgaagagtgc 1260
ttcgctgaaa tcgcctga 1278
<210> 2
<211> 1443
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant davD
<400> 2
atgcagctca aagacgctca gttgttccgc cagcaagcct atatcaatgg tgagtggctg 60
gatgcggaca acggccagac catcaaggtg accaacccgg ccaccggcga agtcatcggt 120
accgtgccga agatgggtac cgcggaaacc cgccgcgcca tcgaagccgc cgacaaggcc 180
ctgccggcct ggcgtgccct gactgcgaaa gagcgctcgg ccaagctgcg tcgctggttc 240
gaactgatga tcgagaacca ggacgacctg gctcgcctga tgaccaccga acagggcaag 300
ccgctggccg aagccaaggg cgaaatcgcc tacgctgcct cgttcatcga gtggttcgcc 360
gaagaagcca agcgcatcta cggtgacacc atcccgggcc accagccaga caagcgcctg 420
attgtcatca agcagccaat cggcgttacc gcggccatca ctccgtggaa cttcccggcc 480
gccatgatca cccgtaaagc cggcccggcc ctggccgctg gctgcaccat ggtcctcaag 540
ccggcttcgc aaaccccata ctccgctctg gccctggtcg agctggccca ccgtgccggc 600
atcccggctg gcgtgctgag tgtggttacc ggcagcgccg gcgaagttgg cggcgaactg 660
accggcaact ccctggtacg caagctgtcc ttcaccggct cgaccgaaat cggtcgccag 720
ctgatggaag aatgcgccaa ggacatcaag aaggtttccc tggagctggg tggcaacgcc 780
ccgttcatcg tgttcgacga cgccgacctg gacaaggcgg tcgagggcgc gatcatctcc 840
aagtaccgta acaacggcca gacctgcgtc tgcgccaacc gtatctacgt gcaggacggc 900
gtctacgacg cgttcgccga gaagctggcc gctgcagttg ccaagctgaa gatcggtaac 960
ggcctggaag aaggcaccac cactggcccg ctgatcgatg gcaaggctgt cgccaaggtc 1020
caggaacaca tcgaggacgc cgtcagcaaa ggcgccaaag tgctgtccgg tggcaagctg 1080
atcgaaggca acttcttcga gccgaccatc ctggttgacg taccgaagac cgctgctgtc 1140
gccaaggaag agacgttcgg cccactggcg ccgctgttcc gcttcaaaga cgaagccgaa 1200
gtcatcgcca tgtccaacga caccgagttc gggctggcct cgtacttcta cgcccgcgac 1260
atgagccgtg tgttccgtgt cgccgaagcc ctggaatacg gcatggtggg tatcaacacc 1320
ggcctgatct ccaacgaagt ggcgccgttc ggtggtatca aggcttcggg cctgggccgc 1380
gaaggttcca agtacggtat cgaggactac ctcgaaatca aatacctgtg catcagcgtc 1440
tga 1443
<210> 3
<211> 1683
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant davB
<400> 3
atgaacaaga agaaccgcca ccccgccgac ggcaagaagc cgatcaccat tttcggcccg 60
gacttccctt ttgctttcga cgactggctg gaacacccgg caggcctggg cagcattccg 120
gctgagcgcc atggggaaga ggtggccatt gtcggtgccg gtatcgccgg cctggtagcg 180
gcctacgagc tgatgaagct gggcctcaag ccggtggtgt acgaggcttc caagctgggc 240
ggccggctgc gctcgcaagc cttcaatggc actgacggga tcgttgccga actgggtggc 300
atgcgcttcc cggtgtcgtc caccgccttc taccactacg tcgacaagct gggcctggaa 360
accaagccct tccccaaccc gctgaccccg gcttcgggca gcacggtgat cgacctggaa 420
ggccagacct actacgccga gaagcccacc gacctgccac aactgtttca tgaggtagcc 480
gacgcctggg ccgatgcgct ggagagcggt gcgcagttcg ccgatatcca gcaggccatc 540
cgcgaccgtg atgtaccgcg cctgaaggaa ctttggaaca agctggtgcc gctgtgggac 600
gaccgcacct tctacgactt cgtcgccacc tcgcgctctt ttgccaagct gagcttccag 660
caccgcgaag tgttcggcca ggtcggtttc ggcaccggcg gttgggactc ggacttcccc 720
aactcgatgc tggaaatctt ccgcgtggtg atgaccaact gcgacgacca ccagcacctg 780
gtggtcgggg gcgtggaaca agtgccacaa ggcatctggc gccacgtacc ggaacgctgc 840
gtgcattggc cagagggcac cagcctgagc acgctgcatg gcggcgcacc gcgtaccggt 900
gtcaagcgca ttgcccgcgc ctccgatggc cgcctggcgg tcaccgacaa ctggggcgat 960
acccgccact acagcgcagt actcgccacc tgccagacct ggttgctgac cacccagatc 1020
gactgcgaag aatcgctgtt ctcgcaaaag atgtggatgg ccctggaccg tacccgctac 1080
atgcagtcgt cgaaaacctt cgtcatggtc gaccgcccgt tctggaagga caaggacccg 1140
gaaaccggcc gtgacctgct gagcatgacc ctcaccgatc gcctcacccg cggcacttac 1200
ctgttcgaca acggcaacga caagcccggg gtgatctgcc tgtcatactc gtggatgagc 1260
gacgcgctga agatgctgcc gcacccggtg gagaagcgcg tacaactggc cctggatgcg 1320
ctgaagaaga tctacccgaa gaccgatatc gccggccaca tcatcggcga cccgatcacg 1380
gtttcctggg aggccgaccc gtacttcctc ggcgccttca aaggcgcgct tccgggccat 1440
taccgctaca accagcgcat gtacgcgcac ttcatgcagc aggacatgcc ggcagagcag 1500
cgcggtatct tcattgctgg tgacgacgtg tcatggaccc ccgcctgggt tgaaggcgcg 1560
gtgcagacgt cgctgaatgc agtgtggggt atcatgaacc actttggtgg ccacacccac 1620
cccgacaacc cgggcccggg cgatgtgttc aacgaaatcg gcccgatcgc cctggcggat 1680
tga 1683
<210> 4
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant davA
<400> 4
atgcgcatcg ctctgtacca gggcgcaccc aagccactgg atgtgcccgg caacctgcaa 60
cggctgcgcc accaggcgca gctggcagcc gaacgcggcg cacagttgct ggtgtgcccg 120
gagatgttcc tgaccggcta caacatcggc ctggcccagg tcgagcgcct ggccgaggcc 180
gccgatggcc cggcagccat gaccgtggta gagatcgccc aggcgcaccg catcgccatt 240
gtctatggct acccggagcg cggtgacgac ggggcgatct acaacagcgt gcagttgatc 300
gatgcgcatg gccgcagcct gagcaattac cgcaagacgc acctgttcgg tgaactggac 360
cgctcgatgt tcagccctgg tgcggaccac ttcccggtgg tggaactgga aggctggaag 420
gttggcctgc tgatctgcta cgacatcgag ttcccggaga acgcccgacg cctagcgctg 480
gacggcgccg agctgatcct ggtgccgacg gcgaacatga cgccgtacga ctttacctgc 540
caggtgaccg tgagagcgag ggcacaggaa aaccagtgct acctggtata tgccaactac 600
tgcggtgcgg aagacgagat tgagtattgc gggcagagca gcatcatcgg cccggatggc 660
agcttgctgg ccatggccgg gcgggatgag tgccagttgt tggcagagct tgaacatgag 720
cgggtggtgc aggggcgcac ggcgtttccc tacctgaccg atttgcgcca ggagctgcac 780
ctgcgtaaag gctga 795
<210> 5
<211> 920
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant dapB
<400> 5
gcggccgcaa agtaactttt cggttaaggt agcgcattcg tggtgttgcc cgtggcccgg 60
ttggttgggc aggagtatat tgatgcatga tgcaaacatc cgcgttgcca tcgcgggagc 120
cggggggcgt atgggccgcc agttgattca ggcggcgctg gcattagagg gcgtgcagtt 180
gggcgctgcg ctggaggctg aaggatcttc tttactgggc agcgacgccg gtgagctggc 240
cggagccggg aaaacaggcg ttaccgtgca aagcagcctc gatgcggtaa aagatgattt 300
tgatgtgttt atcgatttta cccgtccgga aggtacgctg aaccatctcg ctttttgtcg 360
ccagcatggc aaagggatgg tgatcggcac tacggggttt gacgaagccg gtaaacaagc 420
aattcgtgac gccgctgccg atattgcgat tgtctttgct gccaatttta gcgttggcgt 480
taacgtcatg cttaagctgc tggagaaagc agccaaagtg atgggtgact acaccgatat 540
cgaaattatt gaagcacatc atagacataa agttgatgcg ccgtcaggca ccgcactggc 600
aatgggagag gcgatcgccc acgcccttga taaagatctg aaagattgcg cggtctacag 660
tcgtgaaggc cacaccggtg aacgtgtgcc tggcaccatt ggttttgcca ccgtgcgtgc 720
aggtgacatc gttggtgaac ataccgcgat gtttgccgat attggcgagc gtctggagat 780
cacccataag gcgtccagcc gtatgacatt tgctaacggc gcggtaagat cggctttgtg 840
gttgagtggt aaggaaagcg gtctttttga tatgcgagat gtacttgatc tcaataattt 900
gtaacctgca gggcggccgc 920
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
ggatccatga acaagaagaa tcgacacccc 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
gcggccgctt aatctgccag ggcgatcggg 30
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
gcggccgcag gagatataca tatgcgcatc gcactgtacc aag 43
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
gcggccgctt agcctttacg caggtgcagc 30
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
agatctatga gcaaaaccaa cgaatc 26
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
agatcttcag gcgatttcag cgaagc 26
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
ggatccagga gatatacata tgcagctcaa agacgctcag 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
agatctatgt atatctcctt cagacgctga tgcacaggta 40
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
ggatccatgc accatcatca ccatcacatg aacaagaaga accgccaccc 50
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
agatctatgc accatcatca ccatcacatg agcaaaacca acgaat 46
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
aagcttagga gatatacata tgcatgatgc aaacatccgc g 41
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 17
aagcttttac aaattattga gatcaagtac atctc 35
Claims (11)
- 5-아미노발레이트 아미노트랜스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT), 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD), 라이신-2-모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase; DavB), 델타-아미노발레르아미다아제(deltaaminovaleramidase; DavA) 및 대장균 유래의 디하이드로디피콜리네이트 리덕테아제(dihydrodipicolinate reductase; DapB)를 코딩하는 각각의 뉴클레오티드가 선택적으로 포함된, pHM1519 복제 원점을 포함하는 제1벡터와 pBL1 복제 원점을 포함하는 제2벡터로 형질전환된, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 DavT 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davT)은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 DavD 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davD)은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 포함하는 것을 특징으로 하는, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 DavB 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davB)은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 포함하는 것을 특징으로 하는, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 DavA 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(davA)은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 포함하는 것을 특징으로 하는, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 DapB 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(dapB)은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 포함하는 것을 특징으로 하는, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주는 davT와 davD를 포함하는 pBL712 발현벡터; 및 davB와 davA를 포함하는 pCES208 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주는 davT, davD, davB 및 davA를 포함하는 pCES208 발현벡터; 및 dapB가 포함된 pBL712 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는, 글루타릭산 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주.
- (a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 수득한 배양물로부터 글루타릭산을 회수하는 단계를 포함하는, 글루타릭산 생산방법.
- 제9항에 있어서,
상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주는 davT와 davD를 포함하는 pBL712 발현벡터; 및 davB와 davA를 포함하는 pCES208 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는, 글루타릭산 생산방법.
- 제9항에 있어서,
상기 재조합 코리네박테리움 글루타미컴 균주는 davT, davD, davB 및 davA를 포함하는 pCES208 발현벡터; 및 dapB가 포함된 pBL712 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는, 글루타릭산 생산방법.
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Citations (3)
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| KR101271160B1 (ko) | 2011-11-24 | 2013-06-04 | 한국화학연구원 | 재조합 미생물을 이용한 글루타릭산의 제조 방법 |
| KR20140132093A (ko) | 2013-05-07 | 2014-11-17 | 한국과학기술원 | 코리네박테리움 속 균주를 이용한 글루코스로부터 글루타릭산의 제조방법 |
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-
2019
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