CN110168091B

CN110168091B - 具有酰基转移酶活性的微生物及其用途

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Publication number: CN110168091B
Application number: CN201780057839.0A
Authority: CN
Inventors: 洪昭妍; 朴陈承; 朴惠姄; 崔秀真; 文准玉; 李成根; 全进祐
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2016-07-20
Filing date: 2017-07-19
Publication date: 2024-02-23
Anticipated expiration: 2037-07-19
Also published as: WO2018016873A1; BR112019001067B1; EP3489361A4; ES2946513T3; US20220042000A1; US12037610B2; KR101941745B1; CN110168091A; KR20180010382A; JP2019520845A; CA3031318A1; CA3031318C; NZ750131A; US20190264215A1; PL3489361T3; JP6959978B2; EP3489361B1; EP3489361A1; HUE063574T2; BR112019001067A2

Abstract

本公开涉及具有酰基转移酶活性的多肽或包括它的微生物；用于制备N‑乙酰基‑L‑甲硫氨酸的组合物，所述组合物包括所述多肽或微生物；以及利用所述多肽或微生物制备N‑乙酰基‑L‑甲硫氨酸的方法。此外，本公开涉及编码所述多肽的多核苷酸和包括所述多核苷酸的表达载体。因为包括本公开的新酰基转移酶的微生物具有增强的酰基转移酶活性，这种微生物可以高效地用于通过乙酰化L‑甲硫氨酸产生N‑乙酰基‑L‑甲硫氨酸。

Description

具有酰基转移酶活性的微生物及其用途

技术领域

本公开涉及具有酰基转移酶活性的多肽或包括它的微生物；用于制备N-乙酰基-L-甲硫氨酸的组合物，所述组合物包括所述多肽或微生物；以及利用所述多肽或微生物制备N-乙酰基-L-甲硫氨酸的方法。此外，本公开涉及编码所述多肽的多核苷酸和包括所述多核苷酸的表达载体。

背景技术

N-乙酰甲硫氨酸是甲硫氨酸的衍生物，其具有与甲硫氨酸相似的效力，但是其可以减少甲硫氨酸的特殊风味，并且在添加至食品时与甲硫氨酸相比可以大量添加。在具有瘤胃的动物的情况下，当甲硫氨酸用作饲料添加剂时，其首先被瘤胃微生物使用，因此不被动物吸收，而N-乙酰甲硫氨酸是瘤胃保护的氨基酸，其在通过瘤胃并到达肠时被吸收。N-乙酰基-DL-甲硫氨酸在瘤胃的降解抗性是已知的(Amos et al.,Journal of AnimalScience,1974,39(3),pp.612-617)。因此，生产N-乙酰甲硫氨酸具有工业价值，并且特别地，当用作饲料添加剂时优选提供具有高吸收率和高生物利用度的L-类型氨基酸，因此需要N-乙酰基-L-甲硫氨酸的研究和开发。在报道将甲硫氨酸转化为N-乙酰甲硫氨酸的酶中，大肠杆菌(Escherichia coli)的YncA是独特的(US 8,143,031 B2)。在这个文件中，通过测量YncA失活的DTNB分析方法发现间接使用乙酰基-CoA，并且未发现产生N-乙酰甲硫氨酸。此外，尚未发现通过YncA转化的转化子实际产生N-乙酰甲硫氨酸。

公开

技术问题

本发明人已不断努力通过微生物发酵或酶促反应产生N-乙酰基-L-甲硫氨酸，因此已寻找能够产生N-乙酰基-L-甲硫氨酸的微生物并发现6种新的酰基转移酶。此外，他们发现与已知的酰基转移酶相比，利用本公开的新酰基转移酶或表达新酰基转移酶的微生物可以以高浓度经济地生产N-乙酰基-L-甲硫氨酸。基于这个发现，完成本公开。

技术方案

本公开的目的是提供一种具有酰基转移酶活性的微生物，所述微生物包括SEQ IDNO.1-6中任一个的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有90％或更多同源性的氨基酸序列所示的多肽。

本公开的另一目的是提供一种具有乙酰转移酶活性的多肽，所述多肽通过SEQ IDNO.1-6中任一个的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有90％或更多同源性的氨基酸序列表示。

本公开的另一目的是提供一种编码所述多肽的多核苷酸。

本公开的另一目的是提供一种包括所述多核苷酸的表达载体。

本公开的另一目的是提供一种从L-甲硫氨酸制备N-乙酰基-L-甲硫氨酸的组合物，作为活性成分，所示组合物包括：(i)所述微生物或其培养物；(ii)所述多肽；或者它们的组合。

本公开的另一目的是提供一种制备N-乙酰基-L-甲硫氨酸的方法，包括：利用(i)所述微生物或其培养物；(ii)所述多肽；或者它们的组合乙酰化L-甲硫氨酸。

有利效果

因为包括本公开的新酰基转移酶的微生物具有增强的酰基转移酶活性，这种微生物可以高效地用于通过乙酰化L-甲硫氨酸产生N-乙酰基-L-甲硫氨酸。

发明的最佳模式

为了完成上述目的，本公开的一方面提供一种具有酰基转移酶活性的微生物，所述微生物包括SEQ ID NO.1-6中任一个的氨基酸序列或者与其具有90％或更多同源性的氨基酸序列所示的多肽。

本公开中使用的术语“酰基转移酶”是指具有从供体转移酰基至受体的活性的酶。在本公开中，供体不限，只要其可以向受体提供酰基，但是具体地可以是乙酰辅酶A(乙酰基-CoA)。此外，如本文所用，受体不限，只要其可以从供体接受酰基，但是具体地可以是L-甲硫氨酸。

具体地，酰基转移酶可以源自假单胞菌(Pseudomonas)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、肠杆菌属(Enterobacter)、Pseudovibrio属、耶氏酵母(Yarrowia)属或棒状杆菌(Corynebacterium)属。更具体地，酰基转移酶可以源自恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Enterobacter sp.638、Pseudovibriosp.FO-BEG1、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。

具体地，酰基转移酶可以是具有SEQ ID NO.1-6中任一个的氨基酸序列的多肽。此外，酰基转移酶可以是这样的多肽，其具有与SEQ ID NO.1-6中任一个的氨基酸序列具有70％或更多、80％或更多或者90％或更多同源性的氨基酸序列，并且具有与SEQ ID NO.1-6中任一个的氨基酸序列基本上相同或相应的酰基转移酶活性。此外，具有这样的同源性且具有与SEQ ID NO.1-6中任一个的氨基酸序列基本上相同或相应的酰基转移酶活性的氨基酸序列可以是其部分缺失、转化、取代或添加的氨基酸序列。很明显这种情况也可以包括在本公开的范围中。

本公开中使用的术语“同源性”是指在互相尽可能匹配的特定比较区域中比对两个氨基酸序列或编码多肽的基因的碱基序列之后，序列之间碱基或氨基酸残基的相同度。当同源性足够高时，相应基因的表达产物可以具有相同或相似活性。序列相同性的百分比可以利用已知的序列比较程序确定，例如，BLAST(NCBI)、CLC Main Workbench(CLC bio)、MegAlign(DNASTAR Inc)等。

本公开中使用的术语“具有酰基转移酶活性的微生物”是指在体内或体外产生酰基转移酶的微生物。具体地，因为本公开的微生物包括具有SEQ ID NO.1-6中任一个的氨基酸序列的多肽并因此具有酰基转移酶活性，所以其可以转移酰基至受体。更具体地，本公开的微生物对L-甲硫氨酸具有乙酰转移酶活性，因此可以产生N-乙酰基-L-甲硫氨酸。在本公开中，N-乙酰基-L-甲硫氨酸和N-乙酰甲硫氨酸可交换使用。

此外，本公开的微生物不仅包括本来包含具有SEQ ID NO.1-6中任一个的氨基酸序列的多肽的微生物，而且还包括其中与固有活性相比多肽的活性增强的微生物。即，可以通过天然或人为诱变或者物种修饰赋予或增强酰基转移酶的生产能力。如本文所用，术语多肽活性的“增强”是指提高微生物中包括的多肽的活性状态。多肽活性的增强不限，只要与多肽的天然状态或非变化状态相比，其可以增强每种多肽的活性，如靶多肽活性的增强。例如，多肽活性的增强可以通过源自以下的方法进行：i)增加编码每种多肽的多核苷酸的拷贝数，ii)修饰表达序列以增加多核苷酸的表达，iii)修饰染色体上的多核苷酸序列以增强每种多肽的活性，以及iv)它们的组合。具体地，多肽活性的增强可以通过选自以下的方法进行：将包括编码每种多肽的核苷酸序列的多核苷酸插入染色体的方法，通过载体系统将多核苷酸引入微生物的方法，在编码每种多肽的碱基序列上游引入表现出提高的活性的启动子或者将各突变的多肽引入启动子的方法，修饰5′-UTR区中的核苷酸序列的方法，以及引入编码每种多肽的碱基序列的突变体的方法，但是本公开不限于此。

此外，在本公开中，具有酰基转移酶活性的微生物可以不考虑微生物的来源而使用，只要其具有酰基转移酶活性。例如，微生物可以是埃希氏菌属物种(Escherichia sp.)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium sp.)、酵母属物种(Saccharomyces sp.)或耶氏酵母属物种(Yarrowia sp.)。更具体地，微生物可以是大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或解脂耶氏酵母，但不限于此。

此外，在本公开中，具有酰基转移酶活性的微生物可以是具有增强的供体和/或受体细胞膜通透性的微生物。作为增加细胞膜通透性的方法，可以使用已知的方法。具体地，可以重复冻融微生物的过程，但是本公开不限于此。

此外，在本公开中，具有酰基转移酶活性的微生物可以生物合成受体，从供体向其转移酰基，但是本公开不限于此。具体地，即使在未添加L-甲硫氨酸的培养基中培养时，本公开的微生物可以产生N-乙酰基-L-甲硫氨酸，因为其具有产生L-甲硫氨酸的能力，L-甲硫氨酸是酰基的受体。

此外，在本公开中，具有酰基转移酶活性的微生物可以是突变的微生物，向其引入已知突变，关于相关机制如生物合成相同途径或底物释放能力相关机制，以便与酰基转移酶分别增强N-乙酰基-L-甲硫氨酸生产能力。

本公开的一方面提供一种具有乙酰转移酶活性的多肽，所述多肽通过SEQ IDNO.1-6中任一个的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有90％或更多同源性的氨基酸序列表示。具体地，乙酰转移酶活性可以是对L-甲硫氨酸的乙酰转移酶活性。

所述多肽如上文所述。

本公开的另一方面提供一种编码具有乙酰转移酶活性的多肽的多核苷酸，所述多肽通过SEQ ID NO.1-6中任一个的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有90％或更多同源性的氨基酸序列表示。所述多肽如上文所述。

例如，所述多核苷酸可以是SEQ ID NO.7-12中任一个的碱基序列，但不限于此。此外，所述多核苷酸可以包括由于遗传密码简并性编码相同氨基酸序列的碱基序列，及其突变体。例如，可以修饰所述多核苷酸以根据使用的微生物具有最佳密码子。

具体地，所述多核苷酸可以是这样的碱基序列，其编码与上述碱基序列具有70％或更多、80％或更多或者90％或更多相同性并且具有与上述碱基序列基本上相同或相应的酰基转移酶活性的氨基酸序列。此外，所述多核苷酸可以是探针，其可以制备自已知基因序列，例如，其可以是这样的序列，通过在严格条件下与全部或部分碱基序列的互补序列杂交编码具有酰基转移酶活性的多肽。这里，“严格条件”是指形成特异性杂交且不形成非特异性杂交的条件。例如，严格条件可以包括这样的条件，其中具有高同源性的基因，例如，具有80％或更多、特别地90％或更多、更特别地95％或更多、进一步特别地97％或更多或者特别地99％或更多同源性的基因杂交，并且具有较低同源性的基因不杂交，以及在对应于60℃、1×SSC、0.1％SDS，特别地60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，更特别地68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度和温度下进行一次洗涤，特别地两次或三次的条件，这是常规杂交的洗涤条件(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))。

杂交中使用的探针可以是碱基序列的互补序列的一部分。这种探针可以通过PCR制备，利用包括这样的碱基序列的基因片段作为模板，通过利用基于已知序列制备的寡核苷酸作为引物。例如，作为探针，可以使用具有约300bp长度的基因片段。更具体地，当使用具有约300bp长度的基因片段作为探针时，作为杂交的洗涤条件，示例50℃、2×SSC和0.1％SDS。

本公开中使用的基因、基因编码的多肽序列和启动子序列可以获得自已知数据库，例如，NCBI的GenBank。但是，本公开不限于此。

本公开的另一方面提供一种包括所述多核苷酸的表达载体。

包括本公开的多核苷酸的表达载体是能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白的表达载体，并且是指包括可操作地连接的必要控制元件以便表达多核苷酸插入物的多核苷酸产物。靶蛋白可以通过在宿主细胞中转化或转染制备的重组载体获得。

包括本公开的多核苷酸的表达载体没有特别限制，但是包括大肠杆菌衍生的质粒(pYG601BR322、pBR325、pUC118和pUC119)、枯草芽孢杆菌衍生的质粒(pUB110和pTP5)、酵母衍生的质粒(YEp13、YEp24和YCp50)以及可以用于农杆菌介导的转化的Ti-质粒。噬菌体DNA的具体实例包括λ-噬菌体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11和λZAP)。此外，还可以使用源自动物病毒如逆转录病毒、腺病毒和痘苗病毒，昆虫病毒如杆状病毒，双链植物病毒(例如，CaMV)，单链病毒或者双生病毒(Geminiviruses)的病毒载体。

此外，作为本公开的载体，可以使用连接核酸表达激活蛋白(例如，B42)的融合质粒(例如，pJG4-5)。此外，为了促进本公开中回收的靶蛋白的纯化，质粒载体必要时可以进一步包括其他序列。这样的融合质粒可以包括GST、GFP、His-标签或Myc-标签作为标签，但是本公开的融合质粒并不限于上述实例。

此外，在融合蛋白的生产中，可以使用色谱过程，并且特别地，可以通过亲和色谱纯化融合蛋白。例如，当融合谷胱甘肽-S-转移酶时，可以使用这种酶的底物谷胱甘肽。当使用六组氨酸时，可以利用Ni-NTA His缀合的树脂柱(Novagen,USA)容易地回收期望的靶蛋白。

为了插入本公开的多核苷酸作为载体，可以使用合适的限制性酶切割纯化的DNA并将切割的DNA插入适当载体DNA的限制性位点或克隆位点的方法。

可以将编码本公开的多肽的多核苷酸可操作地连接至载体。除了本公开的启动子和核酸，本公开的载体可以额外地包括顺式元件如增强子、剪接信号、poly A添加信号、选择标记和核糖体结合序列(SD序列)。选择标记的实例可以包括氯霉素抗性、氨苄西林抗性、二氢叶酸还原酶和新霉素，但是通过上述实例可操作地连接的额外组分没有限制。如本文所用的术语“转化”是指这样的现象，将DNA引入宿主细胞以允许DNA作为染色体的因子或通过染色体整合完成复制，以及将外部DNA引入细胞以引起人工遗传改变。

可以将包括编码本公开的多肽的多核苷酸的表达载体或表达载体的部分引入宿主细胞。这里，表达载体的部分是指表达载体的一部分，所述部分包括编码本公开的多肽的多核苷酸的一部分以便赋予宿主细胞酰基转移酶活性。例如，可以示例在农杆菌介导的转化中转移至宿主细胞中的Ti-质粒的T-DNA，但是本公开不限于此。

任何转化方法可以用于本公开的转化方法，并且可以根据本领域已知的方法容易地进行。一般来说，转化方法可以包括CaCl₂沉淀法，Hanahan法(其中二甲基亚砜(DMSO)在CaCl₂沉淀法中用作还原物质以增加效率)，电穿孔法，CaPO₄沉淀法，原生质融合法，利用碳化硅纤维的搅拌法，农杆菌介导的转化方法，利用PEG的转化方法，硫酸葡聚糖介导的转化方法，lipofectamine介导的转化方法以及干燥/抑制介导的转化方法。转化包括编码本公开的多肽的多核苷酸的载体的方法不限于上述实例，并且可以使用本领域中常用的转化或转染方法而没有限制。

本公开中用于制备转化子的宿主细胞种类没有特别限制，只要表达本公开的多核苷酸。本公开中使用的宿主细胞的具体实例可以包括埃希氏菌(Escherichia)属的细菌如大肠杆菌(E.coli)；芽孢杆菌属的细菌如枯草芽孢杆菌；假单胞菌属的细菌如恶臭假单胞菌；酵母如酿酒酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；动物细胞；植物细胞；以及昆虫细胞。可以用于本公开的大肠杆菌菌株的具体实例可以包括CL41(DE3)、BL21和HB101，而可以用于本公开的枯草芽孢杆菌的具体实例可以包括WB700和LKS87。

其中引入包括本公开的多核苷酸的表达载体的转化子可以是转化细胞或生物体的形式。

作为本公开中的启动子，可以使用任何启动子，只要其能够在宿主细胞中表达本公开的多核苷酸。例如，可以使用大肠杆菌或噬菌体衍生的启动子如trp启动子、lac启动子、PL启动子和PR启动子；大肠杆菌感染或噬菌体衍生的启动子如T7启动子；CaMV35S、MAS或组蛋白启动子；以及cj7启动子(韩国专利申请公开号10-2004-0107215)。此外，还可以使用人工修饰的启动子如tac启动子。

本公开的另一方面提供一种制备N-乙酰基-L-甲硫氨酸的方法，包括：利用(i)本公开的微生物或其培养物；(ii)本公开的多肽；或者它们的组合乙酰化L-甲硫氨酸。

具体地，所述方法包括：制备N-乙酰基-L-甲硫氨酸，包括：利用(i)本公开的微生物或其培养物；(ii)本公开的多肽；或者它们的组合乙酰化L-甲硫氨酸；以及回收N-乙酰基-L-甲硫氨酸，其是乙酰化的L-甲硫氨酸。

在本公开中，“培养”是指在适当控制的环境条件下使微生物生长。

本公开的培养过程可以根据合适的培养基和培养条件进行，这是本领域已知的。这样的培养过程可以由本领域技术人员根据所选菌株容易地调整。在上述方法中，培养微生物的过程没有特别限制，但是可以通过分批培养方法、连续培养方法或补料分批培养方法进行，这是本领域已知的。用于培养本公开的微生物的培养基和其他培养条件可以没有任何特别限制地使用，只要其可以用于培养一般微生物。具体地，本公开的微生物可以在包括碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的一般培养基中培养，同时在好氧条件下控制温度、pH等。

在本公开中，碳源的实例可以包括但不限于碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇和山梨醇；醇如糖醇、甘油、丙酮酸、乳酸和柠檬酸；有机酸；以及氨基酸如谷氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸。此外，可以使用天然营养源如淀粉水解物、糖蜜、赤糖糊、米糠、木薯、甘蔗渣和玉米浸液。具体地，可以使用碳水化合物如葡萄糖和无菌预处理的糖蜜(即，转化为还原糖的糖蜜)，可以不同地使用适当量的其他碳源而没有限制。这些碳源可以单独使用或者两种或更多种组合使用。

氮源的实例可以包括无机氮源如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵；以及有机氮源，如氨基酸如谷氨酸、甲硫氨酸和谷氨酰胺，蛋白胨，NZ-胺，肉膏，酵母提取物，麦芽提取物，玉米浸液，酪蛋白水解物，鱼或其降解产物以及脱脂大豆饼或其降解产物。这些氮源可以单独使用或者两种或更多种组合使用。但是，本公开不限于此。

磷源的实例可以包括磷酸钾、亚磷酸钾及其含钠盐。无机化合物的实例可以包括氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰和碳酸钙，并且可以进一步包括但不限于氨基酸、维生素和/或合适的前体。可以将这些培养基或前体以分批或连续方式添加至培养物，但不限于此。

在本公开中，可以通过在培养微生物期间以适当方式向培养物添加化合物如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸或硫酸来调整培养物的pH。此外，在培养微生物期间，可以通过使用消泡剂如脂肪族聚乙二醇酯来抑制气泡的形成。此外，可以将氧气或含氧气体注入培养物以保持培养物的有氧状态，或者可以将氮气、氢气或二氧化碳气体注入培养物以保持没有注入气体的培养物的无氧或非有氧状态。

培养温度根据本公开的微生物变化。具体地，其温度可以是20℃-50℃，更具体地，25℃-40℃，但是不限于此。培养时间可以持续直至获得期望的可用材料的量。具体地，培养时间可以是10小时-100小时，但不限于此。

此外，如本文所用的术语“培养物”是指培养本公开的微生物之后获得的产物。培养物包括包含微生物的形式以及其中在包含微生物的培养液中通过离心等去除微生物的形式。

此外，在本公开中，L-甲硫氨酸可以通过本公开的微生物产生或者可以添加至培养基。

此外，在本公开中回收N-乙酰基-L-甲硫氨酸的步骤中，可以根据培养本公开的微生物的方法利用相关领域中已知的合适方法从培养液回收靶向N-乙酰基-L-甲硫氨酸，例如，分批培养方法、连续培养方法或补料分批培养方法。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的合适方法的组合。

回收步骤可以包括分离步骤和/或纯化步骤。

本公开的另一方面提供一种从L-甲硫氨酸制备N-乙酰基-L-甲硫氨酸的组合物，作为活性成分，所述组合物包括：(i)本公开的微生物或其培养物；(ii)本公开的多肽；或者它们的组合。所述微生物、培养物、多肽和N-乙酰基-L-甲硫氨酸如上文所述。

发明模式

此后，参考实施例更详细地描述本公开。但是，这些实施例仅说明本公开，并且本公开的范围不限于这些实施例。

实施例1：用于产生N-乙酰甲硫氨酸的新酶的选择

实施例1-1：用于产生N-乙酰基-L-甲硫氨酸的微生物的选择

因为微生物具有产生N-乙酰基-L-甲硫氨酸的能力，从6种随机选择的微生物培养液(恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌、Enterobacter sp.638、Pseudovibrio sp.FO-BEG1、解脂耶氏酵母PO1f(ATCC MYA-2613^TM)和谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032)证实N-乙酰甲硫氨酸斑点，这是产物。

具体地，将恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌、Enterobacter sp.638或解脂耶氏酵母PO1f接种于包含3mL液体YPD培养基(1％酵母提取物、2％细菌用蛋白胨、2％葡萄糖)的14mL培养管中，并且在30℃和200rpm的条件下振荡培养24小时以获得种子培养液。将1mL种子培养液接种于装有24mL包含0.5％(5g/L)甲硫氨酸的液体YPD培养基的250mL corner-baffle烧瓶中，并且在30℃和200rpm的条件下振荡培养24小时。

此外，将Pseudovibrio sp.FO-BEG1接种于包含3mL液体BACTO Marine肉汤(Difco2216)培养基的14mL一次性培养管中，并且在28℃和200rpm的条件下振荡培养24小时以获得种子培养液。将1mL种子培养液接种于装有24mL包含0.5％(5g/L)甲硫氨酸的液体BACTOMarine肉汤(Difco 2216)培养基的250mL corner-baffle烧瓶中，并且在28℃和200rpm的条件下振荡培养24小时。

此外，将谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032接种于包含3mL专用复合液体培养基(下文示出的成分)的14mL培养管中，并且在30℃和200rpm的条件下振荡培养24小时以获得种子培养液。将1mL种子培养液接种于装有24mL包含0.5％(5g/L)甲硫氨酸的专用复合液体培养基的250mL corner-baffle烧瓶中，并且在37℃和200rpm的条件下振荡培养24小时。

<复合液体培养基>

20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH₂PO₄、8g K₂HPO₄、0.5gMgSO₄7H₂O、100μg生物素、1000μg硫胺素HCl、2000μg泛酸钙、2000μg烟酰胺和25mg卡那霉素(基于1L蒸馏水)

培养完成之后，将培养液放在烤箱中在50℃下过夜以浓缩，并且利用薄层色谱分析1μL的浓缩培养液。10mM的N-乙酰基-L-甲硫氨酸试剂(Sigma Aldrich 01310)用作对照组。从上述6种微生物的培养液浓缩液证实了与对照组相同的斑点。

从上述结果，具有产生N-乙酰基-L-甲硫氨酸能力的6种微生物每种均包含酰基转移酶，包括L-甲硫氨酸作为底物。

实施例1-2：新酰基转移酶序列的确认

从实施例1-1中所选的6种微生物选择甲硫氨酸酰基转移酶。

基于已知为常规甲硫氨酸酰基转移酶的YncA的氨基酸序列通过将数据库限制为微生物的种类进行所选蛋白的异源同源性搜索。结果，发现全部6种搜索的酶均与YncA氨基酸序列具有低同源性，并且具有最高同源性的Enterobacter sp.638衍生的酰基转移酶序列的同源性是82％。各种酵母与YncA的同源性在表1中给出。

从上述结果，推断上述种类的多肽是具有新酰基转移酶活性的多肽，低于常规酰基转移酶的同源性，并且包括这些多肽的微生物也是具有以前未知的新酰基转移酶活性的微生物。

[表1]

实施例2：利用新酰基转移酶通过体外酶转化制备N-乙酰甲硫氨酸

实施例2-1：制备引入新酰基转移酶的大肠杆菌

基于各酶的氨基酸序列(SEQ ID NO.1、2、3和4)以大肠杆菌优化密码子合成假单胞菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)、肠杆菌(Enterobacter)和Pseudovibrio衍生的新酰基转移酶基因(SEQ ID NO.7、8、9和10)。

为了获得耶氏酵母衍生的新酰基转移酶基因，提取解脂耶氏酵母PO1f(ATCC MYA-2613^TM)的gDNA。通过利用引物1和2用gDNA作为模板进行聚合酶链反应获得期望大小的基因(SEQ ID NO.11)和期望大小的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)。

为了获得棒状杆菌(Corynebacterium)衍生的新酰基转移酶基因，将谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032条纹涂布在固体培养基上，然后培养过夜以获得菌落。通过利用引物3和4用一个菌落作为模板进行PCR(聚合酶链反应)获得具有约0.5kb大小的基因(SEQ IDNO.12)和氨基酸序列(SEQ ID NO.6)。在这种情况下，PCR这样进行，在94℃下进行变性5分钟，重复30次在94℃下变性30秒、在56℃下退火30秒和在72℃下聚合1分钟，然后在72℃下进行聚合反应7分钟。

将6种DNA用限制性酶NdeI和XbaI处理，然后连接至用相同限制性酶处理的pUCtk载体。通过在42℃对大肠杆菌DH5α应用热休克90秒转化制备的重组质粒，然后将这些涂布在包含卡那霉素的LB固体培养基中并在37℃下培养过夜。将培养中获得的一个菌落接种于3mL包含卡那霉素的LB液体培养基中并培养过夜，然后利用质粒miniprep试剂盒(Bioneer,Korea)回收重组质粒。通过测序(Macrogen,Korea)证实回收的重组质粒的序列信息，并且将质粒命名为pUCtk-ppmat、pUCtk-bsmat、pUCtk-entmat、pUCtk-pvmat、pUCtk-ylmat和pUCtk-cgmat。

选择在利用热休克将重组质粒引入大肠杆菌BL21(DE3)并将这个涂布于包含卡那霉素的LB固体培养基中之后存活的菌落作为转化子。将所选转化子命名为BL21(DE3)/pUCtk-ppmat(或大肠杆菌CC03-9001)、BL21(DE3)/pUCtk-bsmat(或大肠杆菌CC03-9002)、BL21(DE3)/pUCtk-entmat(或大肠杆菌CC03-9003)、BL21(DE3)/pUCtk-pvmat(或大肠杆菌CC03-9004)、和BL21(DE3)/pUCtk-ylmat(或大肠杆菌CC03-9005)、BL21(DE3)/pUCtk-cgmat(或大肠杆菌CC03-9006)。此外，在2016年7月15日于布达佩斯条约下将转化子储存至韩国微生物保藏中心(KCCM)，并且根据上述顺序分别收到储存号KCCM11863P、KCCM11864P、KCCM11865P、KCCM11866P、KCCM11867P和KCCM11868P。

为了检测所选转化的大肠杆菌的N-乙酰甲硫氨酸生成能力，将一个菌落接种于3mL包含25mg/L卡那霉素和0.2％(w/v)葡萄糖的LB液体培养基中，在37℃下培养5小时，然后添加多达2％(w/v)的甲硫氨酸进一步培养3小时，以便获得1μL的培养液。以前利用1μL培养液通过薄层色谱(TLC)分析检测N-乙酰甲硫氨酸的生成。在整个培养液中均发现推测为N-乙酰甲硫氨酸的斑点，斑点的浓度以BL21(DE3)/pUCtk-ppmat、BL21(DE3)/pUCtk-entmat、BL21(DE3)/pUCtk-bsmat、BL21(DE3)/pUCtk-cgmat、BL21(DE3)/pUCtk-pvmat和BL21(DE3)/pUCtk-ylmat的顺序增加。

[表2]

实施例2-2：证实利用新酰基转移酶的N-乙酰甲硫氨酸生产能力

将实施例2-1中制备的转化的大肠杆菌的一个菌落接种于3mL包含25mg/L卡那霉素和0.2％(w/v)葡萄糖的LB液体培养基中并在37℃下培养8小时，然后接种于50mL相同培养基中并培养过夜，以便获得培养液。将培养液离心以获得沉淀，将沉淀悬浮于5mL的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，然后利用超声破坏细胞以获得细胞碎片。通过14,000rpm离心30分钟去除细胞碎片以便获得上清液。考虑到新酰基转移酶的大小是约19kDa，使滤液通过Amicon Ultra(Milipore,Ireland)30kDa截留膜然后通过10kDa截留膜以获得留在滤器上的浓缩物。将浓缩物装入装有Q琼脂糖的HiTrap Q FF柱(GE,USA)，利用NaCl浓度梯度(按80、100、150、200、300、500mM的顺序)纯净分离新酰基转移酶。通过Amicon Ultra 10kDa截留膜重新浓缩稀释的酶。通过SDS-PAGE证实新酰基转移酶的过量表达和纯化的程度。

为了分析纯化的新酰基转移酶的活性，利用HPLC(Shimadzu，系统控制器CBM-20A和其他配件)测量将酶浓缩液引入包含20mM乙酰辅酶A和20mM甲硫氨酸的pH 7.0磷酸盐缓冲液并在37℃下进行反应10分钟之后产生的N-乙酰甲硫氨酸的量。此外，通过Bradford测定测量纯化的新酰基转移酶的浓度，然后产生的N-乙酰甲硫氨酸值除以酶浓度以比较酶的特异性活性(表3)。

在纯化的新酰基转移酶中，恶臭假单胞菌衍生的酶表现出3.8U/mg的最高活性，这是文件中公开的YncA的特异性活性(0.745U/mg)的5倍(US 8143031 B2，表3)。此外，枯草芽孢杆菌衍生的酶和Enterobacter sp.638衍生的酶分别表现出1.6U/mg和1.7U/mg的活性，每个都是YncA的特异性活性的2倍或更多倍。Pseudovibrio sp.FO-BEG1、解脂耶氏酵母和谷氨酸棒状杆菌衍生的新酰基转移酶各自具有少于1U/mg的低特异性活性，但是其在SDS-PAGE上的表达量不是那么小。因此，可以预期转化子的N-乙酰甲硫氨酸生产能力的提高取决于在宿主中的表达程度(表3)。

[表3]

酰基转移酶	特异性活性(U/mg)
		恶臭假单胞菌衍生的	3.8
枯草芽孢杆菌衍生的	1.6
		Enterobacter sp.638衍生的	1.7
Pseudovibrio sp.FO-BEG1衍生的	0.4
		解脂耶氏酵母PO1f衍生的	0.4
谷氨酸棒状杆菌衍生的	0.8

实施例3：利用恶臭假单胞菌衍生的新酰基转移酶的N-乙酰甲硫氨酸转化反应

实施例3-1：利用恶臭假单胞菌衍生的纯化的新酰基转移酶的N-乙酰甲硫氨酸转化反应

利用1mg恶臭假单胞菌衍生的纯化的酰基转移酶进行甲硫氨酸转化反应，其在实施例2中具有最高活性。将3ml包含20mM甲硫氨酸和20mM乙酰辅酶A的pH 7.0的50mM磷酸盐缓冲液用作底物溶液。在37℃和150rpm的条件下反应3小时之后通过HPLC(SHIMADZU,SYSTEM CONTROLLER CBM-20A和其他配件)分析反应溶液，证实生成3.1g/L的N-乙酰甲硫氨酸。这是通过将反应溶液中的甲硫氨酸和乙酰辅酶A转化75％或更多获得的值。

实施例3-2：其中提供恶臭假单胞菌衍生的酰基转移酶的细胞的N-乙酰甲硫氨酸转化反应取决于细胞膜通透性的增加

将通过引入实施例2中制备的恶臭假单胞菌衍生的新酰基转移酶基因制备的转化的大肠杆菌BL21(DE3)/pUCtk-ppmat的一个菌落接种于3ml包含25mg/L卡那霉素和1％(w/v)葡萄糖的LB液体培养基中并在37℃下培养8小时以获得培养液，然后将50μL培养液接种于50mL包含25mg/L卡那霉素和0.2％(w/v)葡萄糖的LB液体培养基中并培养过夜。将培养液离心以获得细胞沉淀，将细胞沉淀冷冻于-20℃的冰箱中。重复在室温下再融化完全冷冻的细胞沉淀和再冷冻这些细胞沉淀的过程3次以赋予细胞膜高通透性。通过添加50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)将培养液重悬至5mL的总体积以浓缩培养液。将1.8mL包含2％(w/v)甲硫氨酸的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)；1.8mL包含2％(w/v)甲硫氨酸和20mM乙酰辅酶A的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)；以及1.8mL包含2％(w/v)甲硫氨酸和2％(w/v)葡萄糖50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)分别放入15mL试管中，并且各自与200μL通过上述过程获得的具有提高的细胞膜通透性的酶细菌混合至2mL的总体积，然后在37℃和150rpm的条件下反应10小时。添加葡萄糖至反应溶液的目的是增加乙酰辅酶A的产生，这可能是反应中缺乏的，而不是为了大肠杆菌的存活。通过HPLC(SHIMADZU,SYSTEM CONTROLLER CBM-20A和其他配件)分析反应溶液，并且其结果在表4中给出。如表4中给出的，据发现当在发酵时添加乙酰辅酶A时，反应溶液的摩尔转化率与未添加乙酰辅酶A时相比增加。此外，因为发现甚至当添加蔗糖代替乙酰辅酶A时反应溶液的摩尔转化率增加，估计葡萄糖的添加产生一部分乙酰辅酶A。因为利用各自具有高通透性细胞膜的菌株，N-乙酰甲硫氨酸能够高浓度产生，并且甚至当仅添加葡萄糖至培养基代替乙酰辅酶A时还能够高浓度产生。

[表4]

反应溶液中添加	N-乙酰甲硫氨酸浓度(g/L)	摩尔转化率(％)
			未添加	13.1	51
乙酰辅酶A	20.0	78
			葡萄糖	18.7	73

实施例4：通过其中提供新酰基转移酶的转化子的发酵产生N-乙酰基-L-甲硫氨酸

实施例4-1：通过其中提供新酰基转移酶的大肠杆菌产生N-乙酰基-L-甲硫氨酸

将实施例2中制备的6种转化子的菌落之一接种于3mL包含25mg/L卡那霉素和1％(w/v)葡萄糖的LB液体培养基中并在37℃下培养8小时以获得培养液，然后将培养液接种于50mL包含25mg/L卡那霉素、0.2％(w/v)葡萄糖和2％(w/v)甲硫氨酸的LB液体培养基中并培养过夜。在这种情况下，作为对照组，将pUCtk空载体转化至BL21(DE3)中并使用。通过离心去除培养液中的细胞之后，利用HPLC(SHIMADZU,SYSTEM CONTROLLER CBM-20A和其他配件)分析产生的N-乙酰甲硫氨酸。在BL21(DE3)/pUCtk-ppmat的情况下，以3.03g/L的最高浓度产生N-乙酰甲硫氨酸。在BL21(DE3)/pUCtk-entmat的情况下，以2.23g/L的第二高浓度产生N-乙酰甲硫氨酸。甚至在空载体的情况下，检测到痕量N-乙酰甲硫氨酸，推测是大肠杆菌具有的YncA酶的作用(表5)。

[表5]

转化子	培养液中N-乙酰甲硫氨酸的浓度(g/L)
		BL21(DE3)/pUCtk	<0.1
BL21(DE3)/pUCtk-ppmat	3.03
		BL21(DE3)/pUCtk-bsmat	1.60
BL21(DE3)/pUCtk-entmat	2.23
		BL21(DE3)/pUCtk-pvmat	0.17
BL21(DE3)/pUCtk-ylmat	0.13
		BL21(DE3)/pUCtk-cgmat	0.58

实施例4-2：通过其中提供新酰基转移酶的棒状杆菌产生N-乙酰基-L-甲硫氨酸

实施例4-2-1：制备酰基转移酶过量表达载体用于引入棒状杆菌属的微生物

为了检测棒状杆菌属的微生物中从实施例1证实的新酰基转移酶(SEQ ID NO.1、2、3、4、5和6)的N-乙酰基-L-甲硫氨酸生成效果，制备用于过量表达相应基因的载体。基于碱基序列7、8、9、10、11和12合成其中在5′端插入EcoRV限制性酶位点的引物和其中在3′端插入PstI位点的引物。

利用实施例1的载体pUCtk-ppmat作为模板并利用引物5和6通过PCR聚合基于碱基序列7的基因。利用实施例1的载体pUCtk-bsmat作为模板并利用引物7和8通过PCR聚合基于碱基序列8的基因。利用实施例1的载体pUCtk-entmat作为模板并利用引物9和10通过PCR聚合基于碱基序列9的基因。利用实施例1的载体pUCtk-pvmat作为模板并利用引物11和12通过PCR聚合基于碱基序列10的基因。利用实施例1的载体pUCtk-ylmat作为模板并利用引物13和14通过PCR聚合基于碱基序列11的基因。利用实施例1的载体pUCtk-cgmat作为模板并利用引物15和16通过PCR聚合基于碱基序列12的基因。

作为酰基转移酶的启动子，使用启动子cj7(韩国未经审查的专利申请公开号10-2004-0107215)。为了获得cj7启动子的DNA片段，合成其中在5′端插入KpnI限制性酶的引物和其中在3′端插入EcoRV位点的引物，并且利用p117-cj1-gfp(韩国专利申请公开号10-2004-0107215)作为模板通过PCR扩增cj7启动子。在这种情况下，PCR这样进行，在94℃下进行变性5分钟，重复30次在94℃下变性30秒、在56℃下退火30秒和在72℃下聚合1分钟，然后在72℃下进行聚合反应7分钟。

将6种扩增的酰基转移酶多核苷酸用限制性酶PstI处理以获得DNA片段，并且将cj7启动子多核苷酸用KpnI和EcoRV处理以获得DNA片段。获得6种DNA片段之后，将它们连接至pECCG117载体的Kpnl和Pstl位点，其是埃希氏菌和棒状杆菌的穿梭载体，转化至大肠杆菌DH5α中，并且涂布在包含卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基中。通过PCR选择用其中插入基因的载体转化的菌落，然后利用公知的质粒提取方法获得质粒。将获得的质粒命名为pECCG117-Pcj7-ppmat、pECCG117-Pcj7-bsmat、pECCG117-Pcj7-entmat、pECCG117-Pcj7-pvmat、pECCG117-Pcj7-ylmat和pECCG117-Pcj7-cgmat。

实施例4-2-2：制备用于引入新酰基转移酶过量表达载体的菌株并证实N-乙酰基- L-甲硫氨酸生成能力

利用电脉冲法将实施例4-2-1中制备的载体pECCG117-Pcj7-ppmat、pECCG117-Pcj7-bsmat、pECCG117-Pcj7-entmat、pECCG117-Pcj7-pvmat、pECCG117-Pcj7-ylmat和pECCG117-Pcj7-cgmat以及实验对照组的载体pECCG117的每个引入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，涂布在包含卡那霉素(25mg/L)的复合平板培养基中，然后在30℃下培养24小时以获得菌株。将获得的菌株命名为13032/pECCG117-Pcj7-ppmat、13032/pECCG117-Pcj7-bsmat、13032/pECCG117-Pcj7-entmat、13032/pECCG117-Pcj7-pvmat、13032/pECCG117-Pcj7-ylmat、13032/pECCG117-Pcj7-cgmat和13032/pECCG117。为了证实转化子的N-乙酰甲硫氨酸生成能力，将菌株接种于包括3mL包含卡那霉素(25mg/L)的复合液体培养基的14mL培养管中，并且在30℃和200rpm的条件下振荡培养24小时以获得种子培养液。将1mL种子培养液接种于包括24mL包含卡那霉素(25mg/L)和甲硫氨酸(2％(20g/L))的复合液体培养基的250mL corner-baffle烧瓶中，并且在37℃和200rpm的条件下振荡培养24小时。完成培养之后，利用HPLC(SHIMADZU,SYSTEM CONTROLLER CBM-20A和其他配件)分析N-乙酰甲硫氨酸的浓度(表6)。

在作为对照组制备的转化子13032/pECCG117的情况下，产生1.07g/L的N-乙酰甲硫氨酸。推测这个结果是由亲本菌株谷氨酸棒状杆菌具有的酰基转移酶能力引起的。此外，可以确定因为过量表达6种新酰基转移酶，与原始能力相比产生大量的N-乙酰甲硫氨酸。

<复合平板培养基>

20g葡萄糖、50g(NH₄)₂SO₄、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、5g KH₂PO₄、10gK₂HPO₄、0.5g MgSO₄7H₂O、100μg生物素、1000μg硫胺素HCl、2000μg泛酸钙、2000μg烟酰胺、20g琼脂和25mg卡那霉素(基于1L蒸馏水)

<复合液体培养基>

[表6]

转化子	培养液中的N-乙酰甲硫氨酸浓度(g/L)
		13032/pECCG117	1.07
13032/pECCG117-Pcj7-ppmat	2.50
		13032/pECCG117-Pcj7-bsmat	1.79
13032/pECCG117-Pcj7-entmat	2.11
		13032/pECCG117-Pcj7-pvmat	1.23
13032/pECCG117-Pcj7-ylmat	1.31
		13032/pECCG117-Pcj7-cgmat	2.58

实施例4-3：通过其中提供新酰基转移酶的酵母(Saccharomyces)产生N-乙酰基- L-甲硫氨酸

实施例4-3-1：制备用于酵母的酰基转移酶过量表达载体

为了检测酵母中从实施例1证实的新酰基转移酶(SEQ ID NO.1、2、3、4、5和6)的N-乙酰基-L-甲硫氨酸生成效果，制备用于过量表达相应基因的载体。基于碱基序列7、8、9、10、11和12合成其中在5′端插入SpeI限制性酶位点的引物和其中在3′端插入XhoI位点的引物。

利用实施例1的载体pUCtk-ppmat作为模板并利用引物17和18通过PCR聚合基于碱基序列7的基因。利用实施例1的载体pUCtk-bsmat作为模板并利用引物19和20通过PCR聚合基于碱基序列8的基因。利用实施例1的载体pUCtk-entmat作为模板并利用引物21和22通过PCR聚合基于碱基序列9的基因。利用实施例1的载体pUCtk-pvmat作为模板并利用引物23和24通过PCR聚合基于碱基序列10的基因。利用实施例1的载体pUCtk-ylmat作为模板并利用引物25和26通过PCR聚合基于碱基序列11的基因。利用实施例1的载体pUCtk-cgmat作为模板并利用引物27和28通过PCR聚合基于碱基序列12的基因。在这种情况下，PCR这样进行，在94℃下进行变性5分钟，重复30次在94℃下变性30秒、在56℃下退火30秒和在72℃下聚合1分钟，然后在72℃下进行聚合反应7分钟。

将6种扩增的酰基转移酶多核苷酸用限制性酶SpeI和XhoI处理以获得DNA片段。获得6种DNA片段之后，将它们连接至p414ADH载体的SpeI和XhoI位点，其是埃希氏菌和酵母的穿梭载体，转化至大肠杆菌DH5α中，并且涂布在包含氨苄西林(100mg/L)的LB固体培养基中。通过PCR选择用其中插入基因的载体转化的菌落，然后利用质粒miniprep试剂盒(Bioneer,Korea)获得质粒。将获得的质粒命名为p414ADH-ppmat、p414ADH-bsmat、p414ADH-entmat、p414ADH-pvmat、p414ADH-ylmat和p414ADH-cgmat。

实施例4-3-2：制备用于引入新酰基转移酶过量表达载体的菌株并证实N-乙酰基- L-甲硫氨酸生成能力

利用酵母转化方法将实施例4-3-1中制备的载体p414ADH-ppmat、p414ADH-bsmat、p414ADH-entmat、p414ADH-pvmat、p414ADH-ylmat和p414ADH-cgmat以及实验对照组的载体pECCG117的每个引入酿酒酵母CEN.PK2-1D(韩国专利注册号10-1577134)，其是接收自EUROSCARF的典型野生酵母。将载体引入酿酒酵母CEN.PK2-1D，然后涂布于YPD平板培养基(1％酵母提取物、2％细菌用蛋白胨、2％葡萄糖)中，并且在30℃下培养24小时以获得菌株。将获得的菌株命名为ScCEN/p414ADH-ppmat、ScCEN/p414ADH-bsmat、ScCEN/p414ADH-entmat、ScCEN/p414ADH-pvmat、ScCEN/p414ADH-ylmat、ScCEN/p414ADH-cgmat和ScCEN/p414ADH。为了证实转化子的N-乙酰甲硫氨酸生成能力，将菌株接种于包括3mL包含氨苄西林(100mg/L)的YPD液体培养基的14mL培养管中，并且在30℃和200rpm的条件下振荡培养24小时以获得种子培养液。将1mL种子培养液接种于包括24mL包含甲硫氨酸(0.5％(5g/L))的YPD液体培养基的250mL corner-baffle烧瓶中，并且在30℃和200rpm的条件下振荡培养24小时。完成培养之后，利用HPLC(SHIMADZU,SYSTEM CONTROLLER CBM-20A和其他配件)分析N-乙酰基-L-甲硫氨酸的浓度(表7)。

如可以从转化子ScCEN/p414ADH看到的，所以推测酿酒酵母本身不产生N-乙酰甲硫氨酸，但是确定其中过量表达6种新酰基转移酶的菌株具有N-乙酰甲硫氨酸生成能力。

[表7]

转化子	培养液中的N-乙酰甲硫氨酸浓度(g/L)
		ScCEN/p414ADH	0
ScCEN/p414ADH-ppmat	1.64
		ScCEN/p414ADH-bsmat	1.44
ScCEN/p414ADH-entmat	1.65
		ScCEN/p414ADH-pvmat	0.42
ScCEN/p414ADH-ylmat	1.40
		ScCEN/p414ADH-cgmat	0.30

实施例4-4：通过其中提供新酰基转移酶的耶氏酵母产生N-乙酰基-L-甲硫氨酸

实施例4-4-1：制备用于耶氏酵母的酰基转移酶过量表达载体

为了检测耶氏酵母中从实施例1证实的新酰基转移酶(SEQ ID NO.1、2、3、4、5和6)的N-乙酰基-L-甲硫氨酸生成效果，制备用于过量表达相应基因的载体。基于碱基序列7、8、9、10、11和12合成其中在5′端插入KpnI限制性酶位点的引物和其中在3′端插入KpnI限制性酶位点的引物。

利用实施例1的载体pUCtk-ppmat作为模板并利用引物29和30通过PCR聚合基于碱基序列7的基因。利用实施例1的载体pUCtk-bsmat作为模板并利用引物31和32通过PCR聚合基于碱基序列8的基因。利用实施例1的载体pUCtk-entmat作为模板并利用引物33和34通过PCR聚合基于碱基序列9的基因。利用实施例1的载体pUCtk-pvmat作为模板并利用引物35和36通过PCR聚合基于碱基序列10的基因。利用实施例1的载体pUCtk-ylmat作为模板并利用引物37和38通过PCR聚合基于碱基序列11的基因。利用实施例1的载体pUCtk-cgmat作为模板并利用引物39和40通过PCR聚合基于碱基序列12的基因。在这种情况下，PCR这样进行，在94℃下进行变性5分钟，重复30次在94℃下变性30秒、在56℃下退火30秒和在72℃下聚合1分钟，然后在72℃下进行聚合反应7分钟。

将6种扩增的酰基转移酶多核苷酸用限制性酶KpnI处理以获得DNA片段。获得6种DNA片段之后，将它们连接至埃希氏菌和耶氏酵母的穿梭载体pIMR53_AUX(FEMSMicrobiology LettersVolume 199,Issue 1,pages 97-102,May 2001)的KpnI位点，转化至大肠杆菌DH5α中，并且涂布在包含氨苄西林(100mg/L)的LB固体培养基中。通过PCR选择用其中插入基因的载体转化的菌落，然后利用质粒miniprep试剂盒(Bioneer,Korea)获得质粒。将获得的质粒命名为pIMR53U-ppmat、pIMR53U-bsmat、pIMR53U-entmat、pIMR53U-pvmat、pIMR53U-ylmat和pIMR53U-cgmat。

实施例4-4-2：制备用于引入酰基转移酶过量表达载体的菌株并证实N-乙酰基-L- 甲硫氨酸生成能力

利用酵母转化方法将载体pIMR53U-ppmat、pIMR53U-bsmat、pIMR53U-entmat、pIMR53U-pvmat、pIMR53U-ylmat和pIMR53U-cgmat以及实验对照组的载体pIMR53_AUX的每个引入购自美国典型培养物保藏中心的解脂耶氏酵母PO1f(ATCC MYA-2613^TM)。将载体引入解脂耶氏酵母PO1f，然后涂布于YPD平板培养基(1％酵母提取物、2％细菌用蛋白胨、2％葡萄糖)中，并且在30℃下培养24小时以获得菌株。将获得的菌株命名为Yl/pIMR53U-ppmat、Yl/pIMR53U-bsmat、Yl/pIMR53U-entmat、Yl/pIMR53U-pvmat、Yl/pIMR53U-ylmat、Yl/pIMR53U-cgmat和Yl/pIMR53U。为了证实转化子的N-乙酰甲硫氨酸生成能力，将菌株接种于包括3mL的YPD液体培养基的14mL培养管中，并且在30℃和200rpm的条件下振荡培养24小时以获得种子培养液。将1mL种子培养液接种于包括24mL包含甲硫氨酸(0.5％(5g/L))的YPDm液体培养基(10g葡萄糖、3.28g Na₂HPO₄、3.22g NaH₂PO₄、2g酵母提取物和50g/L Proteose-蛋白胨)的250mL corner-baffle烧瓶中，并且在30℃和200rpm的条件下振荡培养24小时。完成培养之后，利用HPLC(SHIMADZU,SYSTEM CONTROLLER CBM-20A和其他配件)分析N-乙酰基-L-甲硫氨酸的浓度(表8)。

推测由于解脂耶氏酵母的野生型具有的酰基转移酶的影响，在转化子Yl/pIMR53U中也产生N-乙酰甲硫氨酸，但是确定其中过量表达6种新酰基转移酶的菌株具有N-乙酰甲硫氨酸生成能力。

[表8]

转化子	培养液中的N-乙酰基-L-甲硫氨酸浓度(g/L)
		YI/pIMR53U	1.02
YI/pIMR53U-ppmat	1.92
		YI/pIMR53U-bsmat	1.78
YI/pIMR53U-entmat	1.82
		YI/pIMR53U-pvmat	1.26
YI/pIMR53U-ylmat	2.01
		YI/pIMR53U-cgmat	1.38

从上述结果，表明与已知的酰基转移酶YncA相比，本公开中新开发的酰基转移酶和包括它们的微生物高效产生N-乙酰基-L-甲硫氨酸。

如上文所述，本领域技术人员能够理解本公开可以很容易地以其他详细形式执行而不改变其技术精神或基本特征。因此，应当理解上述实施方案在所有方面是说明性的而不是限制性的。本公开的范围通过下文描述的权利要求表示而不是详细描述，并且应当理解权利要求的含义和范围以及源自其等同物的所有改变或修改形式都在本公开的范围内。

序列表

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 具有酰基转移酶活性的微生物及其用途

<130> OPA17107

<150> KR10-2016-0092228

<151> 2016-07-20

<160> 52

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 171

<212> PRT

<213> Pseudomonas putida

<400> 1

Met Ser His Glu Ile Arg Asp Ala Leu Pro Ala Asp Val Pro Gly Ile

1 5 10 15

Leu Asp Ile Tyr Asn Asp Ala Val Arg Asn Thr Thr Ala Ile Trp Asn

20 25 30

Glu Thr Pro Val Asp Leu Gly Asn Arg Gln Ala Trp Phe Glu Ala Arg

35 40 45

Ala Gln Gln Gly Tyr Pro Ile Leu Val Ala Val Asp His Ser Gly Val

50 55 60

Leu Gly Tyr Ala Ser Phe Gly Asp Trp Arg Pro Phe Glu Gly Phe Arg

65 70 75 80

Asn Thr Val Glu His Ser Val Tyr Ile Arg Gly Asp Gln Arg Gly Lys

85 90 95

Gly Leu Gly Pro Gln Leu Met Thr Ala Leu Ile Ala Arg Ala Arg Gly

100 105 110

Cys Gly Lys His Val Met Val Ala Ala Ile Glu Ser Gly Asn Ala Ala

115 120 125

Ser Val Arg Leu His Glu Arg Leu Gly Phe Val Val Thr Gly Gln Met

130 135 140

Pro Gln Val Gly Val Lys Phe Gly Arg Trp Leu Asp Leu Thr Phe Met

145 150 155 160

Gln Leu Val Leu Asp Pro Gly Ala Glu Pro Ala

165 170

<210> 2

<211> 163

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 2

Met Thr Leu Arg Leu Ala Glu His Arg Asp Leu Glu Ala Val Val Ala

1 5 10 15

Ile Tyr Asn Ser Thr Ile Ala Ser Arg Met Val Thr Ala Asp Thr Glu

20 25 30

Pro Val Thr Pro Glu Asp Arg Met Glu Trp Phe Ser Gly His Thr Glu

35 40 45

Ser Arg Pro Leu Tyr Val Ala Glu Asp Glu Asn Gly Asn Val Ala Ala

50 55 60

Trp Ile Ser Phe Glu Thr Phe Tyr Gly Arg Pro Ala Tyr Asn Lys Thr

65 70 75 80

Ala Glu Val Ser Ile Tyr Ile Asp Glu Ala Cys Arg Gly Lys Gly Val

85 90 95

Gly Ser Tyr Leu Leu Gln Glu Ala Leu Arg Ile Ala Pro Asn Leu Gly

100 105 110

Ile Arg Ser Leu Met Ala Phe Ile Phe Gly His Asn Lys Pro Ser Leu

115 120 125

Lys Leu Phe Glu Lys His Gly Phe Ala Glu Trp Gly Leu Phe Pro Gly

130 135 140

Ile Ala Glu Met Asp Gly Lys Arg Tyr Asp Leu Lys Ile Leu Gly Arg

145 150 155 160

Glu Leu Ser

<210> 3

<211> 171

<212> PRT

<213> Enterobacter sp. 638

<400> 3

Met Ile Ile Arg His Ala Ser Lys Glu Asp Cys Ala Ala Ile Gly Glu

1 5 10 15

Ile Tyr Asn His Ala Val Val His Thr Ala Ala Ile Trp Asn Asp Thr

20 25 30

Thr Val Asp Thr Glu Asn Arg Ile Ala Trp Phe Glu Ala Arg Thr Leu

35 40 45

Met Gly Tyr Pro Val Leu Val Ser Glu Glu Asn Gly Val Val Thr Gly

50 55 60

Tyr Ala Ser Phe Gly Asp Trp Arg Ala Phe Asp Gly Phe Arg His Thr

65 70 75 80

Val Glu His Ser Val Tyr Val His Pro Asp His Gln Gly Lys Gly Ile

85 90 95

Gly Arg Glu Leu Met Lys Ala Leu Ile Gly Glu Ala Arg Asn Ile Gly

100 105 110

Lys His Val Met Val Ala Gly Ile Glu Ala Gln Asn His Gly Ser Ile

115 120 125

His Leu His Lys Thr Leu Gly Phe Val Ile Thr Gly Gln Met Pro Gln

130 135 140

Val Gly Thr Lys Phe Gly Arg Trp Leu Asp Leu Thr Phe Met Gln Leu

145 150 155 160

Gln Leu Asp Glu Arg Ile Asp Pro Asp Ala Ile

165 170

<210> 4

<211> 175

<212> PRT

<213> Pseudovibrio sp. FO-BEG1

<400> 4

Met Lys Leu Arg Gln Ala Thr Lys Ser Asp Leu Pro Thr Leu Leu Glu

1 5 10 15

Ile His Asn Asp Ala Val Lys Thr Leu Ala Ala Ile Trp Thr Asp Thr

20 25 30

Leu Glu Thr Leu Glu Asp Arg Val Ser Trp Phe Glu Lys Arg Ile Ala

35 40 45

Gly Gly Phe Pro Ile Ile Val Ala Glu Asp Glu Asn Gly Asp Val Leu

50 55 60

Gly Tyr Gly Ser Tyr Gly Ser Phe Arg Glu Lys Ser Gly Tyr Asp Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu His Ser Val Tyr Val Thr Pro Gln Ser Arg Gly Asn Gly

85 90 95

Ala Gly Ser Val Leu Leu Glu Lys Leu Ile Glu Leu Ala Lys Gln Asp

100 105 110

Asp Arg His Val Leu Ile Gly Ala Ile Asp Ser Glu Asn Lys Gly Ser

115 120 125

Ile Arg Leu His Glu Arg Tyr Gly Phe Arg Ile Thr Gly Glu Leu Pro

130 135 140

Gln Val Gly Phe Lys Phe Gly Arg Trp Leu Asp Leu Thr Leu Met Thr

145 150 155 160

Leu Ile Leu Asn Asp Asp Glu Ala Pro Thr Ala Leu Ala His Glu

165 170 175

<210> 5

<211> 154

<212> PRT

<213> Yarrowia lipolytica PO1f

<400> 5

Met Lys Ile Ser Pro Glu Pro Tyr Thr Ala Asp Leu Tyr Lys Leu Val

1 5 10 15

Arg Lys Asn Met Lys Gly Met Tyr Glu Gly Ser Gly Met Gly Trp Asn

20 25 30

Arg Val Asp Lys Ile Asp Glu Met Glu Asp Glu Glu Leu Ala Tyr His

35 40 45

Val Ala Arg Glu Asn Gly Glu Met Leu Gly Phe Val Ser Phe Met His

50 55 60

Thr Val Glu Asp Asp Val Glu Val Val Tyr Leu Tyr Glu Leu Gln Val

65 70 75 80

Ala Lys Gly Arg Gln Gly His Gly Val Gly Lys Glu Leu Met Arg Val

85 90 95

Val Ile Asp Glu Ala Arg Ala Cys Gly Arg Pro Ile Met Leu Thr Val

100 105 110

Phe Leu Met Asn Glu Arg Ala Ile Gly Phe Tyr Arg Arg Tyr Gly Phe

115 120 125

Glu Arg Val Gly Arg Gly Pro Gln Glu Gly Lys Arg Val Arg Gly Trp

130 135 140

Met Gln Met Arg Arg Asp Thr Arg Ser Asp

145 150

<210> 6

<211> 179

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

<400> 6

Met Val Glu Arg Asp Phe Thr Ile Arg Pro Ile Arg Glu Gly Asp Phe

1 5 10 15

Pro Gln Val Arg Asp Ile Tyr Glu Leu Gly Leu Glu Thr Gly His Ala

20 25 30

Thr Tyr Glu Thr Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Phe Ser Gln Ser Lys

35 40 45

Ile Met Asp Thr Val Met Val Ala Val Glu Asn Asn Asp Pro Asp Phe

50 55 60

Ile Leu Gly Trp Val Ser Ala Ala Pro Ile Ser Ser Arg Gln Val Phe

65 70 75 80

His Gly Val Val Glu Asp Ser Ile Tyr Ile His Pro Gln Gly Gln Gly

85 90 95

Arg Gly Ile Gly Gly Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ile Thr Tyr Cys Glu

100 105 110

Ser Asn Gly Ile Trp Ser Ile His Ser Trp Ile Phe Pro Glu Asn Leu

115 120 125

Gly Ser Ala Lys Leu His Glu Ser Lys Gly Phe Val Lys Val Gly Thr

130 135 140

Met His Gln Met Ala Arg Met Pro Tyr Gly Glu Met Glu Gly Gln Trp

145 150 155 160

Arg Asp Cys Asp Leu Trp Glu Cys Leu Leu Ser Val Pro Glu Gln Ala

165 170 175

Gln Ser Ser

<210> 7

<211> 516

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida

<400> 7

atgagccatg aaattcgcga tgcgctgccg gcggatgtgc cgggcattct ggatatttat 60

aacgatgcgg tgcgcaacac cacggcgatt tggaacgaaa ccccggtgga tctgggcaac 120

cgccaggcgt ggtttgaagc gcgcgcgcag cagggctatc cgattctggt ggcggtggat 180

catagcggcg tgctgggcta tgcgagcttt ggcgattggc gcccgtttga aggctttcgc 240

aacaccgtgg aacatagcgt gtatattcgc ggcgatcagc gcggcaaagg cctgggcccg 300

cagctgatga ccgcgctgat tgcgcgcgcg cgcggctgcg gcaaacatgt gatggtggcg 360

gccattgaaa gcggcaacgc ggcgagcgtg cgcctgcatg aacgcctggg ctttgtggtg 420

accggccaga tgccgcaggt gggcgtgaaa tttggccgct ggctggatct gacctttatg 480

cagctggtgc tggatccggg cgcggaaccg gcgtga 516

<210> 8

<211> 492

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 8

atgaccctgc gcctggcgga acatcgcgat ctggaagcgg tggtggcgat ttataacagc 60

accattgcga gccgcatggt gaccgcggat accgaaccgg tgaccccgga agatcgcatg 120

gaatggttta gcggccatac cgaaagccgc ccgctgtatg tggcggaaga tgaaaacggc 180

aacgtggcgg cgtggattag ctttgaaacc ttttatggcc gcccggcgta taacaaaacc 240

gcggaagtga gcatttatat tgatgaagcg tgccgcggca aaggcgtggg cagctatctg 300

ctgcaggaag cgctgcgcat tgcgccgaac ctgggcattc gcagcctgat ggcgtttatt 360

tttggccata acaaaccgag cctgaaactg tttgaaaaac atggctttgc ggaatggggc 420

ctgtttccgg gcattgcgga aatggatggc aaacgctatg atctgaaaat tctgggccgc 480

gaactgagct ga 492

<210> 9

<211> 516

<212> DNA

<213> Enterobacter sp. 638

<400> 9

atgatcatcc gccatgccag taaagaagat tgcgccgcta tcggcgagat ttataaccac 60

gccgttgtgc acactgccgc tatctggaat gacaccaccg ttgataccga gaaccgcatt 120

gcgtggtttg aagctcgcac gttgatgggg tatccggtgc tggtcagtga agaaaatggc 180

gtggtcacgg gctatgcgtc atttggcgac tggcgtgcat ttgacggatt tcgccatacg 240

gtcgaacatt cggtctacgt tcaccccgac catcagggca aaggaattgg ccgtgagctg 300

atgaaagcgc tgattggtga agcgcgaaac atcggcaaac acgttatggt ggcgggaatt 360

gaggcacaaa atcacggctc aattcacctg cataagacgc tcggatttgt gattaccggg 420

caaatgccgc aggtcgggac caaatttggc cgctggctgg atctcacctt tatgcagctc 480

cagcttgacg agcgcatcga cccggacgct atctga 516

<210> 10

<211> 528

<212> DNA

<213> Pseudovibrio sp. FO-BEG1

<400> 10

atgaaactgc gtcaggcaac caaatctgat cttccgacac ttctggaaat tcacaatgat 60

gccgttaaga cactagctgc gatttggacg gatactttag agacgctgga agatcgagtg 120

agttggttcg aaaagcggat cgcaggcggg tttccgatca ttgtagctga agatgagaac 180

ggcgatgtac ttggctacgg cagttacgga tcttttcgtg aaaaatctgg ttacgataag 240

acggtggagc attctgtcta cgtaaccccg caatcacgcg gtaacggtgc tggctccgtt 300

ttgctggaaa agctgatcga actggcaaaa caggatgatc gccatgtcct tattggcgca 360

atcgacagtg aaaacaaagg ctcaatccgc ctccatgaac gctatggctt caggatcacc 420

ggagaactcc cacaagtcgg cttcaaattc ggccgctggc tggatctcac cctgatgacg 480

cttatcttaa acgatgatga agcaccaaca gcactcgcgc atgaataa 528

<210> 11

<211> 465

<212> DNA

<213> Yarrowia lipolytica PO1f

<400> 11

atgaagatat ctccagaacc ctacaccgcc gatttgtaca aattggtgcg caaaaacatg 60

aagggaatgt acgagggttc ggggatgggg tggaataggg ttgacaagat tgacgagatg 120

gaggacgagg agctggcgta tcacgtggct cgcgaaaatg gagagatgct aggattcgtc 180

tcgttcatgc atacggttga agacgacgtg gaggtggtat atctgtatga gcttcaggtg 240

gccaagggtc gccagggtca cggtgtgggt aaggagctca tgagggttgt gatagacgag 300

gctagggctt gtggtcgtcc gatcatgttg actgtttttc tcatgaatga gcgggccatt 360

ggtttctaca ggcggtatgg ttttgagcgg gtggggcggg gtcctcagga gggcaagcgg 420

gtgaggggat ggatgcagat gaggcgagac acgaggagtg actag 465

<210> 12

<211> 540

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

<400> 12

atggttgaaa gagacttcac tatccgacca atccgcgagg gtgatttccc tcaggtgagg 60

gacatctacg aattgggcct ggagacggga catgcgactt atgagacttc tggtcccacg 120

tgggaccagt tctcccaatc taaaatcatg gataccgtca tggtggcggt agaaaacaac 180

gacccggact tcatcctcgg atgggtgtct gctgctccaa tttcaagccg acaggttttc 240

catggagtgg tggaagattc catctatatc cacccccagg gccaaggccg aggaatcggc 300

ggcgctttgc tcgacgccct tatcacctac tgcgaaagca acggcatctg gtcgatccac 360

tcctggatct tcccggaaaa cctcggttct gcgaaactgc atgaatcgaa gggcttcgtg 420

aaggtgggca ccatgcacca aatggcaagg atgccctacg gcgagatgga aggacaatgg 480

cgcgattgtg atctgtggga gtgcctctta tccgttccag agcaagctca aagttcctaa 540

540

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 1

<400> 13

atccatatga agatatctcc agaaccc 27

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 2

<400> 14

tactctagac tagtcactcc tcgtgtc 27

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 3

<400> 15

atccatatgg ttgaaagaga cttcac 26

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 4

<400> 16

tactctagat taggaacttt gagcttg 27

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 5

<400> 17

atcatgagcc atgaaatt 18

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 6

<400> 18

gcactgcagt cacgccggtt ccgc 24

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 7

<400> 19

atcatgaccc tgcgcctg 18

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 8

<400> 20

gcactgcagt cagctcagtt cgcg 24

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 9

<400> 21

atcatgatca tccgccat 18

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 10

<400> 22

gcactgcagt cagatagcgt ccgg 24

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 11

<400> 23

atcatgaaac tgcgtcag 18

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 12

<400> 24

gcactgcagt tattcatgcg cgag 24

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 13

<400> 25

atcatgaaga tatctcca 18

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 14

<400> 26

gcactgcagc tagtcactcc tcgt 24

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 15

<400> 27

atcatggttg aaagagac 18

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 16

<400> 28

gcactgcagt taggaacttt gagc 24

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 17

<400> 29

tgcactagta tgagccatga aatt 24

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 18

<400> 30

tgcctcgagt cacgccggtt ccgc 24

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 19

<400> 31

tgcactagta tgaccctgcg cctg 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 20

<400> 32

tgcctcgagt cagctcagtt cgcg 24

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 21

<400> 33

tgcactagta tgatcatccg ccat 24

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 22

<400> 34

gcactgcagt cagatagcgt ccgg 24

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 23

<400> 35

tgcactagta tgaaactgcg tcag 24

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 24

<400> 36

tgcctcgagt tattcatgcg cgag 24

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 25

<400> 37

tgcactagta tgaagatatc tcca 24

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 26

<400> 38

tgcctcgagc tagtcactcc tcgt 24

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 27

<400> 39

tgcactagta tggttgaaag agac 24

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 28

<400> 40

tgcctcgagt taggaacttt gagc 24

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 29

<400> 41

tgcggtacca tgagccatga aatt 24

<210> 42

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 30

<400> 42

ctaggtacct cacgccggtt ccgc 24

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 31

<400> 43

tgcggtacca tgaccctgcg cctg 24

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 32

<400> 44

ctaggtacct cagctcagtt cgcg 24

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 33

<400> 45

tgcggtacca tgatcatccg ccat 24

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 34

<400> 46

ctaggtacct cagatagcgt ccgg 24

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 35

<400> 47

tgcggtacca tgaaactgcg tcag 24

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 36

<400> 48

ctaggtacct tattcatgcg cgag 24

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 37

<400> 49

tgcggtacca tgaagatatc tcca 24

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 38

<400> 50

ctaggtaccc tagtcactcc tcgt 24

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 39

<400> 51

tgcggtacca tggttgaaag agac 24

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 40

<400> 52

ctaggtacct taggaacttt gagc 24

Claims

1.具有酰基转移酶活性的微生物用于制备N-乙酰-L甲硫氨酸的用途，所述微生物包含SEQ ID NO.1-3中任一个的氨基酸序列所示的多肽，其中所述微生物选自埃希氏菌属物种(Escherichia sp.)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium sp.)、酵母属物种(Saccharomyces sp.)和耶氏酵母属物种(Yarrowia sp.)。

2.具有乙酰转移酶活性的多肽用于制备N-乙酰-L甲硫氨酸的用途，所述多肽由SEQ IDNO.1-3中任一个的氨基酸序列表示，其中所述多肽来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或Enterobacter sp.638。

3.一种编码权利要求2所定义的多肽的多核苷酸用于制备N-乙酰-L甲硫氨酸的用途。

4.包含权利要求3所定义的多核苷酸的表达载体用于制备N-乙酰-L甲硫氨酸的用途。

5.组合物用于从L-甲硫氨酸制备N-乙酰基-L-甲硫氨酸的用途，所述组合物包含以下作为活性成分：(i)权利要求1所定义的微生物或其包含权利要求2所定义的多肽的培养物；

(ii)权利要求2所定义的多肽；或者

(iii)它们的组合。

6.一种制备N-乙酰基-L-甲硫氨酸的方法，所述方法包括：

(i)培养具有酰基转移酶活性的用于制备N-乙酰基-L-甲硫氨酸的经修饰的微生物使L-甲硫氨酸乙酰化，所述经修饰的微生物包含SEQ ID NO.1-3中任一个的氨基酸序列所示的多肽；和

(ii)从所培养的微生物或其培养物回收N-乙酰基-L-甲硫氨酸，

其中所述经修饰的微生物选自埃希氏菌属物种、棒状杆菌属物种、酵母属物种和耶氏酵母属物种。

7.权利要求6的方法，其中所述N-乙酰基-L-甲硫氨酸是乙酰化的L-甲硫氨酸。