WO2018016873A1 - 아실전이효소의 활성을 갖는 미생물 및 이의 용도 - Google Patents

아실전이효소의 활성을 갖는 미생물 및 이의 용도 Download PDF

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박진승
박혜민
최수진
문준옥
이성근
전진우
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Definitions

  • the present application is a polypeptide having acyltransferase activity or a microorganism comprising the same; A composition for producing N-acetyl-L-methionine comprising the polypeptide or microorganism; It relates to a method for producing N-acetyl-L-methionine using the polypeptide or microorganism.
  • the present invention also relates to a polynucleotide encoding the polypeptide and an expression vector comprising the polynucleotide.
  • N-acetylmethionine is a derivative of methionine, which is similar in efficacy to methionine, but can be added to foods in a large amount compared to methionine by reducing methionine-specific flavor.
  • methionine when methionine is used as a feed additive, the ruminant microorganisms are not used by the ruminant microorganisms and are not absorbed by the animal, whereas in the case of N-acetylmethionine, the protective amino acid absorbed after reaching the intestine through rumen- protected amino acid).
  • N-acetyl-DL-methionine The degradation resistance of the N-acetyl-DL-methionine in the rumen has been known (Amos et al., Journal of Animal Science, 1974, 39 (3), pp. 612-617). Therefore, the production of N-acetylmethionine has industrial value, and especially when used as feed additive, it is desirable to provide L-type amino acid with high absorption rate and high bioavailability, so that research and development on N-acetyl-L-methionine This is required.
  • E. coli YncA is unique (US 8,143,031 B2).
  • acetyl coenzyme (acetyl-coA) was used indirectly through DTNB analysis to measure the inactivation of YncA, but did not confirm the actual production of N-acetylmethionine.
  • actual N-acetylmethionine has not been confirmed by the transformants transformed with YncA.
  • N-acetyl-L-methionine In an ongoing effort to produce N-acetyl-L-methionine through microbial fermentation or enzymatic reaction, the present inventors searched for microorganisms having N-acetyl-L-methionine producing ability and discovered six new acyltransferases. The present invention was completed by confirming that N-acetyl-L-methionine can be produced in high concentration and economical compared to known acyltransferases using the novel acyltransferases or microorganisms expressing the same.
  • One object of the present application to provide a microorganism having the activity of acyl transferase, comprising a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence having at least 90% homology therewith. will be.
  • Another object of the present application is to provide a polypeptide having an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence having at least 90% homology with L-methionine.
  • Another object of the present application is to provide a polynucleotide encoding the polypeptide.
  • Another object of the present application is to provide an expression vector comprising the polynucleotide.
  • Another object of the present application is to (i) the microorganism or its culture; (ii) the polypeptide; Or it provides a composition for producing N-acetyl-L-methionine from L-methionine, including a combination thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present application is to (i) the microorganism or its culture; (ii) the polypeptide; Or it provides a method for producing N-acetyl-L-methionine comprising the step of acetylating L-methionine using a combination thereof.
  • Microorganisms including the novel acyltransferases of the present disclosure have enhanced activity of acyltransferases, and thus the microorganisms of the present disclosure can be efficiently used to acetylate L-methionine to produce N-acetyl-L-methionine.
  • an aspect of the present application comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 or a polypeptide represented by an amino acid sequence having 90% or more homology thereto, It provides a microorganism having.
  • acyltransferase refers to an enzyme having the activity of transferring an acyl group from a donor to a receptor.
  • the donor herein is not limited as long as it can provide an acyl group to the receptor, but may specifically be an acetyl coenzyme (acetyl-coA).
  • the receptor herein is not limited as long as it can receive an acyl group from a donor, but may specifically be L-methionine.
  • the acyltransferase may be derived from Pseudomonas genus, Bacillus genus, Enterobacter genus, Pseudovibrio genus, Yarrowia genus, or Corynebacterium genus, and more specifically, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Enterobacter sp. 638, pseudovibrio sp. FO-BEG1, Yarrowia lipolytica, or Corynebacterium glutamicum.
  • the acyltransferase may be a polypeptide having an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 70% or more, specifically 80% or more, more specifically 90% or more homology, substantially any of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: It may be a polypeptide having an amino acid sequence having the same or corresponding acyltransferase activity as one amino acid sequence.
  • amino acid in which some sequences are deleted, modified, substituted or added in an amino acid sequence having acyltransferase activity substantially identical to or corresponding to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 as such a homologous sequence It is apparent that the sequence may be included in the scope of the present application.
  • the term “homology” refers to the amino acid sequence or the nucleotide sequence of a gene encoding a polypeptide, wherein the sequence of bases or amino acid residues between the sequences is aligned after aligning both sequences as closely as possible in a specific comparison region. Means the same degree. If the homology is sufficiently high, the expression products of the gene of interest may have the same or similar activity.
  • the percent sequence identity can be determined using known sequence comparison programs, and examples include BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign TM (DNASTAR Inc), and the like.
  • the term "microorganism with acyltransferase activity” refers to a microorganism that produces acyltransferases in and / or out of an organism.
  • the microorganism of the present application includes a polypeptide having an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6, and has an acyl transferase activity, and thus may transfer an acyl group to a receptor.
  • the microorganism of the present application may have N-acetyl-L-methionine having acetyl transfer activity on L-methionine. N-acetyl-L-methionine and N-acetylmethionine are used interchangeably herein.
  • the microorganism of the present application includes not only a microorganism inherently including a polypeptide having an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6, but also microorganisms whose activity of the polypeptide is enhanced compared to the intrinsic activity. . That is, the ability to produce acyltransferases can be imparted or enhanced by natural or artificial mutations or species amelioration.
  • the term "strengthening" of polypeptide activity means improving the active state of the polypeptide possessed by the microorganism.
  • Enhancing the activity of a polypeptide is not limited as long as it can enhance the activity of each polypeptide over its natural state or the non-variable state of the polypeptide, such as enhancing the activity of the polypeptide of interest. For example, i) an increase in the number of copies of a polynucleotide encoding each polypeptide, ii) modification of an expression control sequence to increase expression of the polynucleotide, iii) the polynucleotide sequence on a chromosome to enhance the activity of each polypeptide. And iv) combinations thereof.
  • a method of inserting a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding each polypeptide into a chromosome a method of introducing the polynucleotide into a vector system into a microorganism, and improving upstream of a nucleotide sequence encoding each polypeptide
  • a method of introducing a promoter exhibiting the activated activity or introducing a mutated polypeptide into the promoter, a method of modifying the nucleotide sequence of the 5'-UTR region, and a method of introducing a variant of the nucleotide sequence encoding each polypeptide It may be performed by a method selected from the group, but is not limited thereto.
  • microorganisms having acyltransferase activity herein may be included regardless of the microorganism origin as long as they have acyltransferase activity.
  • Escherichia sp. Corynebacterium sp., Saccharomyces sp., Or Yarrowia sp. Escherichia coli coli
  • Corynebacterium glutamicum Saccharomyces cerevisiae
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • Yarrowia lipolytica but is not limited thereto.
  • the microorganism having acyltransferase activity herein may be a microorganism having enhanced cell membrane permeability of the donor and / or receptor.
  • the method of increasing the permeability of the cell membrane may use a conventionally known method, and specifically, the steps of freezing and thawing the microorganism may be repeated, but are not limited thereto.
  • the microorganism having an acyltransferase activity herein may be added to the medium in addition to a substrate associated with the biosynthetic pathway of the donor in the microorganism such as glucose instead of the acyl group donor to produce a product in which the acyl group is transferred.
  • the microorganism of the present invention can be cultured in a medium to which glucose is added instead of acetylzoenzyme A to produce N-acetyl-L-methionine. have.
  • the microorganism having acyltransferase activity herein may biosynthesize a receptor to which an acyl group is transferred from a donor, but is not limited thereto.
  • the microorganism of the present invention has the ability to produce L-methionine, which is an acyl group receptor, and thus can produce N-acetyl-L-methionine even when cultured in a medium without L-methionine. have.
  • microorganisms having acyltransferase activity herein are known in the art for related mechanisms such as biosynthesis-related pathways or substrate-releasing capacity to enhance N-acetyl-L-methionine production ability separately from the acyltransferases.
  • the mutation may be a mutant microorganism additionally introduced.
  • One aspect of the present disclosure provides a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence having 90% or more homology thereto.
  • the activity of the acyltransferase may be acetyl transfer activity against L-methionine.
  • the polypeptide is as described above.
  • One aspect of the present disclosure provides a polynucleotide encoding a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence having at least 90% homology thereto with the activity of acyltransferase. .
  • the polypeptide is as described above.
  • the polynucleotide may be any one of SEQ ID NO: 7 to SEQ ID NO: 12, but is not limited thereto. Also included herein are base sequences and variants thereof encoding the same amino acid sequence due to the genetic code degeneracy of the genetic code. For example, it may be modified to have an optimal codon depending on the microorganism used.
  • It may be a base sequence encoding.
  • a probe which can be prepared from a known gene sequence for example, a sequence encoding a polypeptide having an acyltransferase activity by hydration under strict conditions with a complementary sequence to all or part of the nucleotide sequence. .
  • “Strict conditions” refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and nonspecific hybrids are not formed.
  • genes with high homology are, for example, 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 97% or more, particularly specifically 99% or more Genes having homologous hybridization and hybridization with less homologous genes, or 60 ° C, 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically 60 ° C, 0.1 At a salt concentration and temperature corresponding to x SSC, 0.1% SDS, more specifically 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, and 0.1% SDS, the conditions for washing once, specifically, two to three times can be enumerated ( Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)).
  • the probe used for the hybridization may be part of the complementary sequence of the nucleotide sequence.
  • a probe can be constructed by PCR using an oligonucleotide constructed based on a known sequence as a primer as a template of a gene fragment containing such a nucleotide sequence.
  • a gene fragment of about 300 bp in length can be used as the probe. More specifically, when a gene fragment of about 300 bp in length is used as the probe, 50 ° C, 2 x SSC and 0.1% SDS are listed as washing conditions for hybridization.
  • genes, polypeptide sequences and promoter sequences they encode can be obtained from known databases, for example, but not limited to GenBank of NCBI.
  • One aspect of the present application provides an expression vector comprising the polynucleotide.
  • An expression vector comprising a polynucleotide of the present disclosure refers to a polynucleotide construct that is an expression vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell and that includes the necessary regulatory elements operably linked to express the polynucleotide insert.
  • Expression vectors comprising the polynucleotides provided herein are not particularly limited to, but are not limited to, E. coli-derived plasmids (pYG601BR322, pBR325, pUC118 and pUC119), Bacillus subtilis -derived plasmids (pUB110 and pTP5), yeast- Derived plasmids (YEp13, YEp24 and YCp50) and Ti-plasmid that can be used for Agrobacterium mediated transformation.
  • Specific examples of phage DNA include ⁇ -phage (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11 and ⁇ ZAP).
  • animal viruses such as retroviruses, adenoviruses or vaccinia viruses, insect viruses such as baculoviruses, double-stranded plant viruses (eg CaMV), single-stranded viruses Or viral vectors derived from gemini viruses can also be used.
  • a fusion plasmid (eg, pJG4-5) to which a nucleic acid expression activating protein (eg, B42) is linked may be used.
  • the plasmid vector may further comprise other sequences as necessary.
  • the fusion plasmid may include GST, GFP, His-tag, Myc-tag, etc. as a tag, but the fusion plasmid of the present invention is not limited by the above examples.
  • a chromatography process may be included, and the fusion protein may be purified, in particular, by affinity chromatography.
  • glutathione-S-transferase which is a substrate of this enzyme, can be used, and when hexahistidine is used, a desired protein of interest can be obtained by using a Ni-NTA His-binding resin column (Novagen, USA). Can be easily recovered.
  • a method of cutting the purified DNA with a suitable restriction enzyme and inserting it into a restriction site or a cloning site of the appropriate vector DNA can be used.
  • Polynucleotides encoding polypeptides of the present disclosure may be operably linked to a vector.
  • the vectors herein include cis elements such as enhancers, splicing signals, poly A addition signals, selection markers, Ribosome binding sequence (ribosome binding sequence, SD sequence) may be further included.
  • Ribosome binding sequence Ribosome binding sequence, SD sequence
  • chloramphenicol resistance nucleic acid, ampicillin resistance nucleic acid, dihydrofolate reductase, neomycin resistance nucleic acid, and the like may be used, but the additional components that are operably linked by the above examples are limited. No.
  • the term “transformation” refers to the introduction of DNA into a host so that the DNA can be reproduced as a factor of a chromosome or by completion of chromosomal integration, thereby introducing an external DNA into a cell to cause an artificial genetic change. It means a phenomenon.
  • the transformation may introduce an expression vector comprising a polynucleotide encoding a polypeptide of the present application or a portion of the expression vector into a host cell, wherein the portion of the expression vector is the activity of the acyltransferase in the host cell.
  • a portion of the expression vector comprising a polynucleotide portion encoding a polypeptide of the present application so as to impart. Examples include, but are not limited to, T-DNA of Ti plasmids delivered into host cells in Agrobacterial mediated transformation.
  • the transformation method of the present application can be used any transformation method, and can be easily performed according to the conventional methods in the art.
  • the Hanahan method, the electroporation method, the calcium phosphate precipitation method, the plasma fusion method, the silicon carbide which improved the efficiency by using a CaCl 2 precipitation method and a reducing material called DMSO (dimethyl sulfoxide) in the CaCl 2 method
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Methods for transforming a vector comprising a polynucleotide encoding a polypeptide of the present application are not limited to the examples above, and transformation or transfection methods commonly used in the art may be used without limitation.
  • the type of host cell that can be used for the preparation of the transformants herein is not particularly limited as long as it expresses the polynucleotides of the present application.
  • Specific examples of hosts that can be used in the present invention include bacteria of the genus Escherichia , such as E. coli ; Bacillus Bacillus (Bacillus) in bacteria, such as subtilis (Bacillus subtilis); Bacteria of the genus Pseudomonas , such as Pseudomonas putida ; Saccharomyces cerevisiae ), Schizosaccharomyces yeast such as pombe ); Animal cells, plant cells and insect cells.
  • E. coli strains that can be used in the present invention is CL41 (DE3), BL21 or HB101, specific examples of Bacillus subtilis strains are WB700 or LKS87.
  • the transformant into which the expression vector including the polynucleotide of the present disclosure is introduced may be in the form of a transformed cell or an organism.
  • a promoter may be used as long as it allows expression of a polynucleotide of the present disclosure in a host.
  • E. coli or phage-derived promoters such as, for example, trp promoter, lac promoter, PL promoter or PR promoter; E. coli infected phage-derived promoters such as the T7 promoter, CaMV35S, MAS or histone promoters, cj7 promoter (Korean Publication No. 10-2004-0107215) can be used.
  • Artificially modified promoters can also be used, such as the tac promoter.
  • One aspect of the present application is (i) a microorganism of the present disclosure or a culture thereof; (ii) a polypeptide herein; Or acetylation of L-methionine using a combination thereof provides a method for producing N-acetyl-L-methionine.
  • the preparation method is (i) a microorganism of the present application or a culture thereof; (ii) a polypeptide herein; Or acetylating L-methionine using a combination thereof; And recovering N-acetyl-L-methionine, which is the acetylated L-methionine.
  • culture is meant herein the growth of the microorganism in moderately controlled environmental conditions.
  • Cultivation process of the present application can be made according to the appropriate medium and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the strain selected.
  • the step of culturing the microorganism is not particularly limited thereto, and may be performed by a known batch culture method, continuous culture method, fed-batch culture method, or the like.
  • the medium and other culture conditions used for the cultivation of the microorganism of the present application may be any medium as long as it is a medium used for the cultivation of ordinary microorganisms.
  • the microorganism of the present invention may be a suitable carbon source, nitrogen source, personnel, inorganic compounds, It can be cultured in a conventional medium containing amino acids and / or vitamins under aerobic conditions while controlling the temperature, pH and the like.
  • the carbon source herein includes carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, maltose, mannitol, sorbitol and the like; Alcohols such as sugar alcohols, glycerol, pyruvic acid, lactic acid, citric acid and the like; Amino acids such as organic acids, glutamic acid, methionine, lysine, and the like, and the like, but are not limited thereto.
  • natural organic nutrients such as starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, rice winters, cassava, sugarcane residue and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pretreated molasses (ie, reducing sugars).
  • Carbohydrates, such as molasses), and other appropriate amounts of carbon sources can be used in various ways without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc., peptones, NZ-amines, meat extracts, yeast extracts, malt extracts, corn steep liquor, casein hydrolysates, fish or their degradation products, skim soy cakes or their degradation products Can be used. These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more kinds, but are not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc., peptones, NZ-amines
  • the personnel may include a first potassium phosphate, a second potassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • a first potassium phosphate sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate and the like may be used, and other amino acids, vitamins and / or suitable precursors may be used, but are not limited thereto.
  • These media or precursors may be added batchwise or continuously to the culture, but are not limited thereto.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid and the like can be added to the culture in an appropriate manner during the culturing of the microorganisms to adjust the pH of the culture.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to suppress bubble generation.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the culture, or nitrogen, hydrogen, or carbon dioxide gas may be injected without injecting gas to maintain anaerobic and unaerobic conditions.
  • the temperature of the culture depends on the microorganism of the present application, specifically, may be 20 °C to 50 °C, more specifically 25 °C to 40 °C, but is not limited thereto.
  • the incubation period may continue until the desired amount of useful substance is obtained, specifically, may be 10 hours to 100 hours, but is not limited thereto.
  • culture herein means the product obtained after culturing the microorganism of the present application.
  • the culture is a concept including both the form containing the microorganism and the form in which the microorganism is removed by centrifugation or the like in the culture medium containing the microorganism.
  • L-methionine herein may be produced by the microorganism of the present application or added to the medium.
  • recovering N-acetyl-L-methionine herein may be carried out from the culture medium using a suitable method known in the art according to the culture method of the microorganism of the present application, for example, batch, continuous or fed-batch culture method.
  • the desired N-acetyl-L-methionine can be recovered.
  • centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization and HPLC and the like can be used, and can also be used in combination with any suitable method known in the art.
  • the recovery step may include a separation process and / or a purification process.
  • One aspect of the present application is (i) a microorganism of the present disclosure or a culture thereof; (ii) a polypeptide herein; Or it provides a composition for the production of N-acetyl-L-methionine from L-methionine, including a combination thereof as an active ingredient.
  • the microorganism, culture, polypeptide and N-acetyl-L-methionine are as described above.
  • Example 1-1 Screening for N-acetyl L-methionine-producing microorganisms
  • Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Enterobacter sp. 638, Yarrowia lipolytica PO1f was inoculated into a 14 ml disposable culture tube containing 3 ml of YPD (1% yeast extract, 2% bacto-peptone, 2% glucose) liquid medium at 30 ° C. and 200 rpm.
  • YPD 1% yeast extract, 2% bacto-peptone, 2% glucose
  • the culture condition was secured by shaking culture for 24 hours.
  • 1 ml of the culture medium was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of YPD liquid medium containing 0.5% methionine (5 g / L), followed by shaking culture at 30 ° C. and 200 rpm for 24 hours.
  • pseudovibrio sp In the case of FO-BEG1, seed culture was obtained by inoculating a 14 ml disposable culture tube containing 3 ml of BACTO Marine broth (Difco 2216) liquid medium by shaking culture for 24 hours at 28 ° C and 200 rpm. 1 ml of the culture medium was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of BACTO Marine broth broth containing 0.5% (5 g / L) methionine, and incubated at 28 ° C. and 200 rpm for 24 hours.
  • BACTO Marine broth Difco 2216
  • the mixture was left overnight in an oven at 50 ° C. to concentrate the culture solution, and 1 ⁇ l of the concentrated culture solution was analyzed using thin layer chromatography. 1 ⁇ l of 10 mM N-acetyl-L-methionine reagent (Sigma Aldrich 01310) was used as a control. In the culture solution concentrate of the six microorganisms, the same spot as the control group was confirmed.
  • Methionine acyltransferase was selected from six microorganisms selected in Example 1-1.
  • the selected proteins were subjected to heterologous homology search by limiting the database to the species of the microorganism based on the amino acid sequence with YncA known as the existing methionine acyltransferase.
  • YncA known as the existing methionine acyltransferase.
  • all six enzymes found had a low homology with the YncA amino acid sequence, and the highest Enterobacter sp.
  • the homology of the acyltransferase sequence derived from 638 was 82%.
  • the homology with YncA of each enzyme is shown in Table 1.
  • the six polypeptides are polypeptides having novel acyltransferase activity with low homology with existing acyltransferases, and microorganisms including the same are also known as novel acyltransferase activities. It is to suggest that it is a microorganism having.
  • Example 2-1 Production of E. coli introduced with new acyl transferase gene
  • novel acyltransferase genes (SEQ ID NOs 7, 8, 9, 10) derived from Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter, and Pseudovirbrio are based on the amino acid sequence of each enzyme (SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4). It was synthesized with codons optimized for Escherichia coli.
  • GDNA of Yarrowia lipolytica PO1f was extracted to obtain new acyltransferase genes derived from Yarrowia.
  • the gDNA was used as a template and subjected to chain polymerization using primers 1 and 2 to obtain genes of a desired size (SEQ ID NO: 11) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 5).
  • Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 was plated in solid medium and cultured overnight to obtain colonies.
  • One colony was used as a template, and PCR (chain polymerization) using primers 3 and 4 was performed to obtain a gene having a size of about 0.5 Kb (SEQ ID NO: 12) and an amino acid sequence (SEQ ID NO: 6).
  • the PCR method was performed by denaturing at 94 ° C. for 5 minutes, then repeating 94 ° C./30 second denaturation, 56 ° C./30 second annealing, and 72 ° C./1 min polymerization, and polymerizing at 72 ° C. for 7 minutes. .
  • the six DNAs were treated with restriction enzymes NdeI, XbaI, and then ligated to the pUCtk vector treated with the same restriction enzyme.
  • the recombinant plasmid prepared above was transformed by applying a 40 ° C. and 90 second heat shock to E. coli DH5 ⁇ , which was then plated in kanamycin-containing LB solid medium and incubated at 37 ° C. overnight.
  • One colony obtained in the culture was inoculated in 3 ml of kanamycin-containing LB liquid medium and cultured overnight, and then recombinant plasmid was recovered using plasmid miniprep kit (Bioneer, Korea).
  • Sequence information of the recovered recombinant plasmid was confirmed by sequencing (Macrogen, Korea), respectively named pUCtk-ppmat, pUCtk-bsmat, pUCtk-entmat, pUCtk-pvmat, pUCtk-ylmat, pUCtk-cgmat.
  • the recombinant plasmid was introduced into E. coli BL21 (DE3) using a thermal shock method and plated in kanamycin-containing LB solid medium, and the surviving colonies were selected as transformants.
  • the transformants selected were BL21 (DE3) / pUCtk-ppmat (or E. coli CC03-9001), BL21 (DE3) / pUCtk-bsmat (or E. coli CC03-9002), BL21 (DE3) / pUCtk, respectively.
  • -entmat or E. coli CC03-9003
  • BL21 (DE3) / pUCtk-pvmat or E.
  • coli CC03-9004 BL21 (DE3) / pUCtk-ylmat (or E. coli CC03-9005) , BL21 (DE3) / pUCtk-cgmat (or E. coli CC03-9006).
  • the transformants were deposited in the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) on July 15, 2016 under the Budapest Treaty, and according to the order described above, accession numbers KCCM11863P, KCCM11864P, KCCM11865P, KCCM11866P, and KCCM11867P. Has been given, KCCM11868P.
  • N-acetylmethionine production capacity of selected E. coli one colony was inoculated in 3 ml of LB liquid medium containing kanamycin 25 mg / L and 0.2% (w / v) glucose, and incubated at 37 ° C. for 5 hours. Then, methionine was added to 2% (w / v) and incubated for 3 hours. 1 ⁇ l of the culture solution was used to pre-investigate N-acetylmethionine production by thin layer chromatography (TLC) analysis.
  • TLC thin layer chromatography
  • Example 2-1 One colony of the transformed Escherichia coli prepared in Example 2-1 was inoculated in 3 ml of LB liquid medium containing kanamycin 25 mg / L and glucose 0.2% (w / v) and incubated at 37 ° C. for 8 hours. Inoculate 50 ml of medium and incubate overnight. The culture medium was centrifuged to obtain pellets, suspended in 5 ml of 50 mM phosphate buffer at pH 7.0, and then cells were disrupted by sonication. Cell debris were removed by centrifugation at 14,000 rpm for 30 minutes to obtain supernatant.
  • the concentrate was packed in a HiTrap Q FF column filled with Q sepharose (GE, USA) and pure acryltransferase was isolated using NaCl concentration gradient (80, 100, 150, 200, 300, 500 mM sequence). .
  • Diluted enzyme was reconcentrated through Amicon Ultra 10-kDa cut-off membrane. The degree of overexpression and purification of the new acyltransferase was confirmed by SDS-PAGE.
  • the enzyme concentrate was added to 50 mM phosphate buffer 50 mM containing 20 mM acetylcoenzyme A and 20 mM methionine, and reacted for 10 minutes at 37 ° C. -Acetylmethionine amount was measured using HPLC (Shimadzu, system controller CBM-20A and other accessories).
  • concentration of the purified novel acyltransferase was measured by Bradford assay, and then the N-acetylmethionine value was divided by the concentration of the enzyme to compare the enzyme inactivity (Table 3).
  • Pseudomonas putida-derived enzyme showed the highest inactivation of 3.8 U / mg, which is compared with that of the inactive YncA in the literature of 0.745 U / mg (US 8143031 B2, Table 3), 5 The belly is highly active.
  • the 638-derived enzymes exhibited 1.6 U / mg and 1.7 U / mg of inactivation, respectively, which are more than twice as active as YncA. Pseudoviobrio sp.
  • Example 3-1 Pseudomonas Putida Derived new purified Acyl transferase N-acetylmethionine conversion using
  • Example 2 the methionine conversion reaction was performed using 1 mg of Pseudomonas putida, which had the highest specific activity.
  • a reaction solution 3 ml of a 50 mM phosphate buffer at pH 7.0 containing 20 mM methionine and 20 mM acetylcoenzyme A was used.
  • HPLC HPLC
  • 3.1 g / L of N-acetylmethionine was confirmed. This is a value obtained by converting at least 75% of methionine and acetylcoenzyme A in the reaction solution.
  • Example 3-2 Pseudomonas Putida origin Acyl transferase N-increased cell membrane permeability of introduced cells Acetylmethionine Conversion reaction
  • One colony of transformed Escherichia coli BL21 (DE3) / pUCtk-ppmat prepared by introducing a novel acyltransferase gene derived from Pseudomonas putida prepared in Example 2 contained 25 mg / L of kanamycin and 1% (w / v) of glucose. After inoculating 3 ml of LB liquid medium for 8 hours at 37 ° C., 500 ⁇ l of the culture solution was inoculated in 50 ml of LB liquid medium containing 25 mg / L of kanamycin and 0.2% (w / v) of glucose. The culture was centrifuged to obtain cell pellets and frozen in a freezing temperature of 20 °C.
  • the fully frozen cell pellet was re-dissolved at room temperature and the freezing process was repeated three times to add high permeability to the cell membrane.
  • the culture was concentrated by resuspending the total volume to 5 ml by adding 50 mM phosphate buffer at pH 7.0.
  • Example 4-1 new Acyl transferase Production of N-acetyl-L-methionine through E. coli
  • One colony of six transformants prepared in Example 2 was inoculated in 3 ml of LB liquid medium containing kanamycin 25 mg / L and glucose 1% (w / v) and incubated at 37 ° C. for 8 hours, followed by culture 500 ⁇ l was incubated overnight in 50 ml of LB liquid medium containing 25 mg / L kanamycin, 0.2% (w / v) glucose, 2% (w / v) methionine.
  • the pUCtk empty vector was transformed into BL21 (DE3) as a control.
  • N-acetylmethionine produced using HPLC (SHIMADZU, SYSTEM CONTROLLER CBM-20A and other accessories).
  • BL21 (DE3) / pUCtk-ppmat produced N-acetylmethionine at the highest concentration of 3.03 g / L
  • BL21 (DE3) / pUCtk-entmat produced the second highest N-acetylmethionine concentration at 2.23 g / L. Seemed. Trace amounts of N-acetylmethionine were also detected in the empty vector, which is presumed to be the role of the YncA enzyme possessed by E. coli (Table 5).
  • Example 4- new Acyl transferase Introduced Corynebacterium N-acetyl-L-methionine production via
  • the gene based on the nucleotide sequence 7 was polymerized by PCR using the vector pUCtk-ppmat of Example 1 as a template and primers 5 and 6.
  • the gene based on the nucleotide sequence 8 was polymerized by PCR using the vectors pUCtk-bsmat of Example 1 and primers 7 and 8.
  • the gene based on the nucleotide sequence 9 was polymerized by PCR using the vector pUCtk-entmat of Example 1 as a template and primers 9 and 10.
  • the gene based on the nucleotide sequence 10 was polymerized by PCR using the vectors pUCtk-pvmat of Example 1 as a template and primers 11 and 12.
  • the gene based on the nucleotide sequence 11 was polymerized by PCR using the vector pUCtk-ylmat of Example 1 as a template and primers 13 and 14.
  • the gene based on the nucleotide sequence 12 was polymerized by PCR using the vector pUCtk-cgmat of Example 1 as a template and primers 15 and 16.
  • a cj7 promoter As the promoter of the acyl transferase, a cj7 promoter (Korean Publication No. 10-2004-0107215) was used. In order to obtain a promoter cj7 DNA fragment, a primer in which a KpnI restriction enzyme was inserted at the 5 'end and an EcoRV site was inserted at the 3' end was synthesized, and the cj7 promoter was obtained through PCR using p117-cj1-gfp as a template. Amplified (Korean Patent Publication No. 10-2004-0107215). In this case, the PCR method was performed by denaturing at 94 ° C. for 5 minutes, repeating 94 ° C./30 second denaturation, 56 ° C./30 second annealing, and 72 ° C./1 min polymerization, and then polymerizing at 72 ° C. for 7 minutes. .
  • DNA fragments were obtained by treating the amplified 6 acyltransferase polynucleotides with restriction enzyme PstI, and promoter cj7 polynucleotides were treated with KpnI and EcoRV to obtain DNA fragments. After obtaining six DNA fragments, they were linked to the KpnI and PstI sites of pECCG117 vector, which are shuttle vectors of Escherichia and Corynebacterium, transformed to E. coli DH5 ⁇ , and then to LB solid medium containing kanamycin (25 mg / L). Smeared.
  • PstI restriction enzyme
  • promoter cj7 polynucleotides were treated with KpnI and EcoRV to obtain DNA fragments. After obtaining six DNA fragments, they were linked to the KpnI and PstI sites of pECCG117 vector, which are shuttle vectors of Escherichia and Corynebacterium, transformed to E. coli DH5 ⁇ , and
  • plasmids were obtained by using a plasmid extraction method known in the art, and pECCG117-Pcj7-ppmat, pECCG117-Pcj7-bsmat, pECCG117-Pcj7-entmat and pECCG117, respectively -Pcj7-pvmat, pECCG117-Pcj7-ylmat, and pECCG117-Pcj7-cgmat.
  • the obtained strains were 13032 / pECCG117-Pcj7-ppmat, 13032 / pECCG117-Pcj7-bsmat, 13032 / pECCG117-Pcj7-entmat, 13032 / pECCG117-Pcj7-pvmat, 13032 / pECCG117-Pcj7-ylmat, 13032 / pECCG117-Pcj7-Pcj7 cgmat, 13032 / pECCG117.
  • the strain was inoculated into a 14 ml disposable culture tube containing 3 ml of a complex liquid medium containing kanamycin (25 mg / L), and the temperature was 30 ° C and 200 ° C.
  • a culture medium was shaken for 24 hours under the condition of rpm to obtain a seed culture solution.
  • 1 ml of the culture medium was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of a complex liquid medium containing kanamycin (25 mg / L) and 2% (20 g / L) methionine. Shake incubation for hours. After incubation, N-acetylmethionine concentration was analyzed using HPLC (SHIMADZU, SYSTEM CONTROLLER CBM-20A and other accessories) (Table 6).
  • the transformant 13032 / pECCG117 produced as a control produced 1.07 g / L of N-acetylmethionine, which appears to be the ability of the acyltransferase possessed by the parent strain Corynebacterium glutamicum and 6 new acyls. Overexpression of the transferase was confirmed to produce more N-acetylmethionine than the original capacity.
  • Glucose 20 g (NH 4 ) 2 SO 4 50 g, peptone 10 g, yeast extract 5 g, urea 1.5 g, KH 2 PO 4 5 g, K 2 HPO 4 10 g, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g, biotin 100 ⁇ g, thiamine hydrochloride 1000 ⁇ g, calcium-pantothenic acid 2000 ⁇ g, nicotinamide 2000 ⁇ g, agar 20 g, kanamycin 25 mg (1L distilled water)
  • Example 4-3 new Acyl transferase Introduced Saccharomyces N-acetyl-L-methionine production via
  • N-acetyl-L-methionine production effect of the novel acyl transferase (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6) identified in Example 1 for overexpressing the gene to confirm in Saccharomyces Vectors were produced. Based on the nucleotide sequences 7, 8, 9, 10, 11, and 12, primers in which the SpeI restriction enzyme site was inserted at the 5 'end and XhoI sites in the 3' end were synthesized.
  • the gene based on the nucleotide sequence 7 was polymerized by PCR using the vector pUCtk-ppmat of Example 1 as a template and primers 17 and 18.
  • the gene based on the nucleotide sequence 8 was polymerized by PCR using the vector pUCtk-bsmat of Example 1 as a template and primers 19 and 20.
  • the gene based on the nucleotide sequence 9 was polymerized by PCR using the vector pUCtk-entmat of Example 1 as a template and primers 21 and 22.
  • the gene based on the nucleotide sequence 10 was polymerized by PCR using the vectors pUCtk-pvmat of Example 1 as the template and primers 23 and 24.
  • the gene based on the nucleotide sequence 11 was polymerized by PCR using the vector pUCtk-ylmat of Example 1 as a template and primers 25 and 26.
  • the gene based on the nucleotide sequence 12 was polymerized by PCR using the vector pUCtk-cgmat of Example 1 as a template and primers 27 and 28.
  • the PCR method was performed by denaturing at 94 ° C. for 5 minutes, then repeating 94 ° C./30 second denaturation, 56 ° C./30 second annealing, and 72 ° C./1 min polymerization, and polymerizing at 72 ° C. for 7 minutes. .
  • DNA fragments were obtained by treating the amplified 6 acyltransferase polynucleotides with restriction enzymes SpeI and XhoI. After 6 DNA fragments were obtained, the E. coli DH5 ⁇ was transformed by binding to the SpeI and XhoI sites of the Escherichia and Saccharomyces shuttle vectors p414ADH and smeared onto LB solid medium containing empicillin (100 mg / L). It was.
  • plasmids were obtained using plasmid miniprep kits (Bioneer, Korea) and p414ADH-ppmat, p414ADH-bsmat, p414ADH-entmat, and p414ADH-pvmat, respectively. , p414ADH-ylmat, and p414ADH-cgmat.
  • Colony was obtained by introducing Saccharomyces cerevisiae into CEN.PK2-1D, then spreading on YPD (1% yeast extract, 2% bacto-peptone, 2% glucose) plate medium and incubating at 30 ° C for 24 hours. It was.
  • the obtained strains were named ScCEN / p414ADH-ppmat, ScCEN / p414ADH-bsmat, ScCEN / p414ADH-entmat, ScCEN / p414ADH-pvmat, ScCEN / p414ADH-ylmat, ScCEN / p414ADH-cgmat, ScCEN / p414ADH.
  • the strain was inoculated into a 14 ml disposable culture tube containing 3 ml of YPD liquid medium containing empicillin (100 mg / L). A culture medium was shaken for 24 hours under the condition of rpm to obtain a seed culture solution. 1 ml of the culture medium was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of YPD liquid medium containing 0.5% methionine (5 g / L), followed by shaking culture at 30 ° C. and 200 rpm for 24 hours. After incubation, N-acetyl-L-methionine concentration was analyzed using HPLC (SHIMADZU, SYSTEM CONTROLLER CBM-20A and other accessories) (Table 7).
  • Saccharomyces cerevisiae does not appear to produce N-acetylmethionine on its own. It was confirmed to have.
  • Example 4-4 new Acyl transferase Introduced Yarrowia N-acetyl-L-methionine production via
  • Example 4-4-1 Construction of Acyltransferase Overexpression Vector for Yarrowia
  • the gene based on the nucleotide sequence 7 was polymerized by PCR using the vectors pUCtk-ppmat of Example 1 as a template and primers 29 and 30.
  • the gene based on the nucleotide sequence 8 was polymerized by PCR using the vector pUCtk-bsmat of Example 1 as a template and primers 31 and 32.
  • the gene based on SEQ ID NO: 9 was polymerized by PCR using the vector pUCtk-entmat of Example 1 as a template and primers 33 and 34.
  • the gene based on the nucleotide sequence 10 was polymerized by PCR using the vector pUCtk-pvmat of Example 1 as a template and primers 35 and 36.
  • the gene based on the nucleotide sequence 11 was polymerized by PCR using the vector pUCtk-ylmat of Example 1 as a template and primers 37 and 38.
  • the gene based on the nucleotide sequence 12 was polymerized by PCR using the vector pUCtk-cgmat of Example 1 as a template and primers 39 and 40.
  • the PCR method was performed by denaturing at 94 ° C. for 5 minutes, then repeating 94 ° C./30 second denaturation, 56 ° C./30 second annealing, and 72 ° C./1 min polymerization, and polymerizing at 72 ° C. for 7 minutes. .
  • Amplified six acyltransferase polynucleotides were treated with restriction enzyme KpnI to obtain DNA fragments.
  • the E. coli DH5 ⁇ was transformed by connecting to the KpnI site of the Escherichia and Yarrowia shuttle vectors pIMR53_AUX (FEMS Microbiology Letters Volume 199, Issue 1, pages 97-102, May 2001). 100 mg / L) were plated in LB solid medium. After screening the transformed colonies with the vector into which the gene was inserted by PCR, plasmids were obtained using plasmid miniprep kits (Bioneer, Korea), respectively. It was named pvmat, pIMR53U-ylmat, and pIMR53U-cgmat.
  • Each of the vectors pIMR53U-ppmat, pIMR53U-bsmat, pIMR53U-entmat, pIMR53U-pvmat, pIMR53U-ylmat, pIMR53U-cgmat, and the pIMR53_AUX vector of the experimental control group prepared in Example 4-4-1 were used in the American Bio Resource Center (American type).
  • Yarrowia lipolytica PO1f ATCC MYA-2613 TM ) purchased from Culture Collection was introduced using yeast transformation.
  • strains were named Yl / pIMR53U-ppmat, Yl / pIMR53U-bsmat, Yl / pIMR53U-entmat, Yl / pIMR53U-pvmat, Yl / pIMR53U-ylmat, Yl / pIMR53U-cgmat, Yl / pIMR53U.
  • the strain was inoculated into a 14 ml disposable culture tube containing 3 ml of YPD liquid medium, followed by shaking culture for 24 hours at 30 ° C. and 200 rpm. Seed culture was secured.
  • YPDm liquid medium containing 0.5% (5 g / L) methionine (glucose 10 g, Na 2 HPO 4 3.28 g, NaH 2 PO 4 1 ml of this culture medium was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 3.22 g, yeast extract 2 g, and 24 ml of Proteose-peptone 50 g / 1L) and incubated for 24 hours at 30 ° C. and 200 rpm. . After incubation, N-acetyl-L-methionine concentration was analyzed using HPLC (SHIMADZU, SYSTEM CONTROLLER CBM-20A and other accessories) (Table 8).
  • N-acetylmethionine was also produced in the transformant Yl / pIMR53U due to the effect of acyltransferase possessed by the wild type of Yarrowia lipolytica, but it was better for N overacetyl expression of six new acyltransferases. -Acetylmethionine production could be confirmed.

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Abstract

본원은 신규 아실전이효소의 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 미생물; 상기 폴리펩타이드 또는 미생물을 포함하는 N-아세틸-L-메티오닌의 제조용 조성물; 상기 폴리펩타이드 또는 미생물을 이용한 N-아세틸-L-메티오닌의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본원은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 본원의 신규 아실전이효소를 포함하는 미생물은 아실전이효소의 활성이 강화되는 바, 본원의 미생물은 L-메티오닌을 아세틸화시켜 N-아세틸-L-메티오닌을 생산하는 데 효율적으로 사용될 수 있다.

Description

아실전이효소의 활성을 갖는 미생물 및 이의 용도
본원은 아실전이효소 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 미생물; 상기 폴리펩타이드 또는 미생물을 포함하는 N-아세틸-L-메티오닌의 제조용 조성물; 상기 폴리펩타이드 또는 미생물을 이용한 N-아세틸-L-메티오닌의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본원은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
N-아세틸메티오닌은 메티오닌의 유도체로 메티오닌과 효능은 비슷하나, 메티오닌 특유의 향을 감소시켜 식품에 첨가시 메티오닌 대비 다량첨가가 가능하다. 또한, 반추위를 가지는 동물의 경우 메티오닌을 사료첨가제로 사용할 경우 반추위미생물에 의해 선이용되어 동물에게 흡수되지 않는데 반해, N-아세틸메티오닌의 경우 반추위를 통과하여 장에 도달 후 흡수되는 보호아미노산(rumen-protected amino acid)이다. N-아세틸-DL-메티오닌의 반추위에서의 분해 저항성은 공지된 바 있다(Amos et al., Journal of Animal Science, 1974, 39(3), pp. 612-617). 따라서 N-아세틸메티오닌의 생산은 산업적인 가치를 가지며, 특히 사료첨가제로 쓰이는 경우 흡수 속도가 빠르고 생체내 이용율이 높은 L형 아미노산을 제공하는 것이 바람직하므로, N-아세틸-L-메티오닌에 대한 연구개발이 요구되고 있다. 기존에 메티오닌을 N-아세틸메티오닌으로 전환한다고 보고된 효소의 경우 대장균의 YncA가 유일하다(US 8,143,031 B2). 상기 문헌의 경우, YncA의 비활성을 측정하기 위하여 DTNB 분석법을 통하여 간접적으로 아세틸 조효소에이(acetyl-coA)를 사용하는 것을 확인하였을 뿐, 실제 N-아세틸메티오닌의 생산을 확인하지 못했다. 또한, YncA에 의해 형질전환된 형질전환체에 의해 실제 N-아세틸메티오닌을 생성되는지도 확인된 바 없다.
본 발명자들은 미생물 발효나 효소반응을 통한 N-아세틸-L-메티오닌을 생산하고자 하는 지속적인 노력으로, N-아세틸-L-메티오닌 생산능이 있는 미생물을 탐색하여 신규 6종의 아실전이효소를 발굴하였고, 본 발명의 신규 아실전이효소 또는 이를 발현하는 미생물을 이용하여 공지된 아실전이효소에 비해 N-아세틸-L-메티오닌을 고농도 및 경제적으로 생산할 수 있음을 확인하여 본 발명은 완성하였다.
본원의 하나의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드를 포함하는, 아실전이효소의 활성을 갖는 미생물을 제공하는 것이다.
본원의 다른 목적은 L-메티오닌에 아세틸 전이 활성을 가지는, 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
본원의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본원의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본원의 또 다른 목적은 (i) 상기 미생물 또는 이의 배양물; (ii) 상기 폴리펩타이드; 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는, L-메티오닌으로부터 N-아세틸-L-메티오닌의 제조용 조성물을 제공하는 것이다.
본원의 또 다른 목적은 (i) 상기 미생물 또는 이의 배양물; (ii) 상기 폴리펩타이드; 또는 이들의 조합을 이용하여 L-메티오닌을 아세틸화하는 단계를 포함하는, N-아세틸-L-메티오닌의 제조방법을 제공하는 것이다.
본원의 신규 아실전이효소를 포함하는 미생물은 아실전이효소의 활성이 강화되는 바, 본원의 미생물은 L-메티오닌을 아세틸화시켜 N-아세틸-L-메티오닌을 생산하는 데 효율적으로 사용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한, 본원의 일 양태는 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드를 포함하는, 아실전이효소 활성을 갖는 미생물을 제공한다.
본원에서 사용되는 용어, "아실전이효소(acyltransferase)"는 공여자로부터 아실기(acyl group)를 수용체로 전달하는 활성을 지닌 효소를 의미한다. 본원에서 상기 공여자는 아실기를 수용체에 제공할 수 있는 한 제한되지 않으나, 구체적으로 아세틸 조효소에이(acetyl-coA)일 수 있다. 또한, 본원에서 상기 수용체는 공여자로부터 아실기를 받을 수 있는 한 제한되지 않으나, 구체적으로 L-메티오닌일 수 있다.
구체적으로, 상기 아실전이효소는 슈도모나스 속, 바실러스 속, 엔테로박터 속, 슈도비브리오 속, 야로위아 속, 또는 코리네박테리움 속 유래일 수 있으며, 더욱 구체적으로, 슈도모나스 푸티다, 바실러스 서브틸리스, 엔테로박터 sp. 638, 슈도비브리오 sp. FO-BEG1, 야로위아 리포라이티카, 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래일 수 있다.
구체적으로, 상기 아실전이효소는 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 또한, 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 아미노산 서열과 70 % 이상, 구체적으로는 80 % 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 가지며, 실질적으로 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하게 아실전이효소 활성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 또는 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하게 아실전이효소 활성을 갖는 아미노산 서열에서, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열일 수 있으며, 이의 경우도 본원의 범주에 포함됨은 자명하다.
본원에서 사용되는 용어, "상동성"이란, 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 아미노산 서열 또는 염기 서열에 있어서, 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬 (align)시킨 후 서열 간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 용어, "아실전이효소 활성을 갖는 미생물"은 생물체 내 및/또는 생물체 밖으로 아실전이효소를 생산하는 미생물을 의미한다. 구체적으로, 본원의 미생물은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하고 있어 아실전이효소의 활성을 가지는 바, 수용체에 아실기를 전달할 수 있다. 구체적으로, 본원의 미생물은 L-메티오닌에 아세틸 전이 활성을 가져 N-아세틸-L-메티오닌을 생산할 수 있다. 본원에서 N-아세틸-L-메티오닌과 N-아세틸메티오닌은 혼용된다.
또한, 본원의 미생물은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 내재적으로 포함하고 있는 미생물뿐만 아니라, 상기 폴리펩타이드의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된 미생물도 포함한다. 즉, 아실전이효소의 생산 능력은 천연 또는 인위적 돌연변이 또는 종 개량에 의해 부여되거나 증진될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 폴리펩타이드 활성의 "강화"는, 미생물이 보유하고 있는 폴리펩타이드의 활성 상태를 향상시키는 것을 의미한다. 폴리펩타이드의 활성의 강화는 목적 폴리펩타이드의 활성의 강화와 같이 각 폴리펩타이드의 활성을 천연의 자연상태 또는 당해 폴리펩타이드의 비변이 상태보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 그 예로, i) 각 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, ii) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절 서열의 변형, iii) 각 폴리펩타이드의 활성이 강화되도록 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 iv) 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행될 수 있다. 구체적으로는 각 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 염색체에 삽입하는 방법, 상기 폴리뉴클레오티드를 벡터 시스템에 도입하여 미생물에 도입하는 방법, 각 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열의 상류에 개량된 활성을 나타내는 프로모터를 도입하거나 프로모터에 변이를 준 각 폴리펩타이드를 도입하는 방법, 5'-UTR 지역의 염기 서열을 변형시키는 방법 및 각 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열의 변이체를 도입하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본원에서 아실전이효소 활성을 갖는 미생물은 아실전이효소 활성을 가지는 한 미생물 유래에 상관없이 모두 포함될 수 있다. 일 예로 에스체리치아 속(Escherichia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 또는 야로위아 속(Yarrowia sp.)일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 대장균(Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본원에서 아실전이효소 활성을 갖는 미생물은 공여자 및/또는 수용체의 세포막 투과성을 높인 미생물일 수 있다. 세포막의 투과성을 높이는 방법은 기존 공지 방법을 이용할 수 있으며, 구체적으로 미생물을 동결 및 해동시키는 단계를 반복 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본원에서 아실전이효소 활성을 갖는 미생물은 배지에 아실기의 공여자 대신 포도당 등 미생물에서 공여자의 생합성 경로에 관련된 기질을 첨가하여 아실기가 전이된 산물을 생산할 수 있다. 구체적으로, 본원의 미생물을 아세틸조효소 에이 대신 포도당이 첨가된 배지에서 배양하여 N-아세틸-L-메티오닌을 생산할 수 있다.
또한, 본원에서 아실전이효소 활성을 갖는 미생물은 공여자로부터 아실기가 전달되는 수용체를 생합성할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본원의 미생물은 아실기의 수용체인 L-메티오닌 생산능을 가져 L-메티오닌이 첨가되지 않은 배지에서 배양되더라도 N-아세틸-L-메티오닌을 생산할 수 있다.
또한, 본원에서 아실전이효소 활성을 갖는 미생물은 상기 아실전이효소와 별개로 N-아세틸-L-메티오닌 생산능을 증진시키기 위해 생합성 관련 경로나 기질 배출능력 관련 기작 등의 관련 기작에 대해 기존 공지의 변이가 추가적으로 도입된 변이 미생물일 수 있다.
본원의 일 양태는 아실전이효소의 활성을 가지는, 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드를 제공한다. 구체적으로, 상기 아실전이효소의 활성은 L-메티오닌에 대한 아세틸 전이 활성일 수 있다.
상기 폴리펩타이드는 전술한 바와 같다.
본원의 일 양태는 아실전이효소의 활성을 가지는, 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 전술한 바와 같다.
예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7 내지 서열번호 12 중 어느 하나의 염기 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열 및 이의 변이체 또한 본원에 포함된다. 예를 들어, 사용되는 미생물에 따라 최적인 코돈을 갖도록 개변되어 있는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 염기 서열과 70 % 이상, 구체적으로는 80 % 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 가지며, 실질적으로 상기 염기 서열과 동일하거나 상응하게 아실전이효소의 활성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열일 수 있다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건하에 하이드리드화하여, 아실전이효소의 활성을 갖는 폴리펩타이드을 암호화하는 서열이어도 좋다. 「엄격한 조건」이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 일례를 나타내면, 상동성이 높은 유전자끼리, 예를 들면, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)).
상기 하이브리드화에 사용된 프로브는, 염기 서열의 상보 서열의 일부이어도 좋다. 이러한 프로브는, 공지의 서열에 근거하여 작제된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여, 이러한 염기 서열을 포함하는 유전자 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 프로브로서는, 300bp 정도 길이의 유전자 단편을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 프로브로서, 300bp 정도 길이의 유전자 단편을 사용하는 경우에는, 하이브리드화의 세척 조건으로서는, 50℃, 2×SSC 및 0.1% SDS가 열거된다.
본원에서 사용되는 유전자, 이들이 코딩하는 폴리펩타이드 서열 및 프로모터 서열 등은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원의 일 양태는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 폴리뉴클레오티드 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 작제물을 말한다. 상기 제조된 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 목적하는 단백질들을 수득할 수 있게 된다.
본원에서 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 아그로박테리움 매개 형질전환에 사용할 수 있는 Ti-플라스미드를 포함한다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스, 이중 가닥 식물 바이러스(예, CaMV), 단일가닥 바이러스 또는 게미니 바이러스로부터 유래된 바이러스 벡터가 또한 사용될 수 있다.
아울러 본 발명의 벡터로서, 핵산 발현 활성화 단백질(예를 들어, B42같은)이 연결된 융합 플라스미드(fusion plasmid, 예를 들어, pJG4-5)가 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 회수되는 목적 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 플라스미드 벡터는 필요에 따라 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 융합 플라스미드에는 GST, GFP, His-tag, Myc-tag 등을 태그(tag)로 포함할 수 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 융합 플라스미드가 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 융합 단백질의 제조에 있어, 크로마토그래피 공정을 포함할 수 있으며, 상기 융합 단백질은 특히 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 헥사히스티딘이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼(Novagen, USA)을 이용하여 원하는 목적 단백질을 용이하게 회수할 수 있다.
본원의 폴리뉴클레오티드를 벡터로 삽입하기 위해, 정제된 DNA를 적당한 제한효소로 절단하여 적당한 벡터 DNA의 제한 부위 또는 클로닝 부위에 삽입하는 방법이 사용될 수 있다.
본원의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본원의 벡터는 프로모터 및 본원의 핵산 외에 인핸서(enhancer)와 같은 시스 요소(cis element), 스플라이싱 시그널(splicing signal), 폴리 A 추가 시그널(poly A addition signal), 선택 마커(selection marker), 라이보좀 결합 서열(ribosome binding sequence, SD sequence) 등을 추가로 포함할 수 있다. 선택 마커의 예로, 클로람페니콜 저항 핵산, 암피실린 저항 핵산, 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase), 네오마이신 저항 핵산 등이 사용될 수 있으나, 상기 예들에 의해 작동 가능하도록 연결되는 추가적 구성요소가 제한되는 것은 아니다.본 발명에서 용어, "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.
상기 형질전환으로 본원의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터의 일부를 숙주 세포 내에 도입할 수 있는데, 여기서 상기 발현 벡터의 일부란, 숙주 세포 내에 상기 아실전이효소의 활성을 부여할 수 있도록 본원의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 부분을 포함하는 발현 벡터의 부분을 의미한다. 예컨대, 아그로박테리아 매개 형질전환법에서 숙주 세포 내로 전달되는 Ti 플라스미드의 T-DNA를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 본원의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
본원에서 형질전환체 제조에 사용될 수 있는 숙주 세포의 종류는 본원의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 동물세포, 식물세포 및 곤충 세포가 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 대장균 균주의 구체적인 예로는 CL41(DE3), BL21 또는 HB101이, 바실러스 서브틸리스 균주의 구체적인 예로는 WB700 또는 LKS87이 있다.
본원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 형질전환세포 또는 생물체의 형태일 수 있다.
본원에서 프로모터는, 본원의 폴리뉴클레오티드를 숙주에서 발현하도록 하는 한 어떠한 프로모터도 사용될 수 있다. 예를 들어, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터 또는 PR 프로모터 같은 대장균 또는 파아지-유래 프로모터; T7 프로모터 같은 대장균 감염 파아지-유래 프로모터, CaMV35S, MAS 또는 히스톤 프로모터, cj7 프로모터(한국 공개 공보 제10-2004-0107215호)가 사용될 수 있다. 또한 tac 프로모터 같은 인공적으로 변형된 프로모터도 사용될 수 있다.
본원의 일 양태는 (i) 본원의 미생물 또는 이의 배양물; (ii) 본원의 폴리펩타이드; 또는 이들의 조합을 이용하여 L-메티오닌을 아세틸화하는 단계를 포함하는, N-아세틸-L-메티오닌의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 제조방법은 (i) 본원의 미생물 또는 이의 배양물; (ii) 본원의 폴리펩타이드; 또는 이들의 조합을 이용하여 L-메티오닌을 아세틸화하는 단계; 및 상기 아세틸화된 L-메티오닌인, N-아세틸-L-메티오닌을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 본원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 구체적으로는 본원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 만니톨, 소르비톨 등과 같은 탄수화물; 당 알코올, 글리세롤, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 알코올; 유기산, 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2종 이상이 조합되어 사용될 수 있다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본원에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 본원 미생물에 따라 다르며, 구체적으로, 20℃ 내지 50℃, 보다 구체적으로는 25℃ 내지 40℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본원에서 용어, "배양물"은 본원의 미생물을 배양한 다음 수득한 산물을 의미한다. 상기 배양물은 미생물을 포함하는 형태 및 상기 미생물을 포함하는 배양액에서 원심분리 등으로 미생물을 제거한 형태도 모두 포함하는 개념이다.
또한, 본원에서 L-메티오닌은 본원의 미생물이 생산하거나 또는 배지에 첨가된 것일 수 있다.
또한, 본원에서 N-아세틸-L-메티오닌을 회수하는 단계는 본원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 N-아세틸-L-메티오닌을 회수할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 또한 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 조합하여 사용될 수 있다.
상기 회수 단계는 분리 공정 및/또는 정제 공정을 포함할 수 있다.
본원의 일 양태는 (i) 본원의 미생물 또는 이의 배양물; (ii) 본원의 폴리펩타이드; 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는, L-메티오닌으로부터 N-아세틸-L-메티오닌의 제조용 조성물을 제공한다. 상기 미생물, 배양물, 폴리펩타이드 및 N-아세틸-L-메티오닌은 전술한 바와 같다.
이하 본원을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본원을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본원의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. N-아세틸메티오닌 생산 신규효소 선별
실시예 1-1. N-아세틸 L-메티오닌 생산 미생물 선별
N-아세틸-L-메티오닌 생산능을 갖는 미생물로, 무작위적으로 선별된 6종의 미생물 배양액 (슈도모나스 푸티다, 바실러스 서브틸리스, 엔테로박터 sp. 638, 슈도비브리오 sp. FO-BEG1, 야로위아 리포라이티카 PO1f (ATCC MYA-2613TM), 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032)에서 생성물인, N-아세틸메티오닌 스팟(spot)을 확인하였다.
구체적으로, 슈도모나스 푸티다, 바실러스 서브틸리스, 엔테로박터 sp. 638, 야로위아 리포라이티카 PO1f의 경우 YPD (1% yeast extract, 2% bacto-peptone, 2% glucose) 액체배지 3 ml을 함유하는 14 ml의 1 회용 배양 튜브에 접종하여 30 ℃, 200 rpm의 조건으로 24시간 동안 진탕 배양하여 종배양액을 확보하였다. 메티오닌 0.5% (5g/L)가 포함된 YPD 액체배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 상기 종배양액 1 ml을 접종하고, 30 ℃, 200 rpm에서 24시간 동안 진탕 배양하였다.
또한, 슈도비브리오 sp. FO-BEG1의 경우, BACTO Marine broth (Difco 2216) 액체배지 3 ml을 함유하는 14 ml의 1회용 배양 튜브에 접종하여 28 ℃, 200 rpm의 조건으로 24시간 동안 진탕 배양하여 종배양액을 확보하였다. 메티오닌 0.5% (5g/L)가 포함된 BACTO Marine broth 액체배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 상기 종배양액 1 ml을 접종하고, 28 ℃, 200 rpm에서 24시간 동안 진탕 배양하였다.
또한, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 경우, 전용 복합 액체배지 (성분 하기 표시) 3 ml을 함유하는 14 ml의 1회용 배양 튜브에 접종하여 30 ℃, 200 rpm의 조건으로 24시간 동안 진탕 배양하여 종배양액을 확보하였다. 메티오닌 0.5% (5g/L)가 포함된 복합 액체배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 상기 종배양액 1 ml을 접종하고, 37 ℃, 200 rpm에서 24시간 동안 진탕 배양하였다.
<복합 액체배지>
포도당 20g, 펩톤 10g, 효모추출물 5g, 요소 1.5g, KH2PO4 4g, K2HPO4 8g, MgSO47H2O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니코틴아미드 2000㎍, 카나마이신 25 mg (증류수 1 리터 기준)
배양을 종료한 후, 50 ℃ 오븐에서 밤새 정치하여 배양액을 농축하고, 농축된 배양액 1 μl를 박층크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. 대조군으로 10 mM N-아세틸-L-메티오닌 시약(Sigma Aldrich 01310)의 1 μl을 사용하였다. 상기 6종의 미생물의 배양액 농축액에서 대조군과 같은 스팟을 확인하였다.
상기 결과로부터 N-아세틸-L-메티오닌 생산능을 가지는 6종의 미생물은 L-메티오닌을 기질로 하는 아실전이효소가 있을 것으로 예측되었다.
실시예 1-2. 신규 아실전이효소 서열 확인
실시예 1-1에서 선별된 미생물 6종에서 메티오닌 아실전이효소를 선별하였다. 선별된 단백질은 기존 메티오닌 아실전이효소로 공지된 YncA와의 아미노산 서열을 기준으로 상기 미생물의 종으로 데이터베이스를 제한하여 각각 이종 상동성 검색을 수행하였다. 그 결과, 탐색된 6종의 효소 모두 YncA 아미노산 서열과의 상동성이 낮은 편으로, 가장 높은 엔테로박터 sp. 638 유래의 아실전이효소 서열의 상동성이 82 %였다. 각 효소의 YncA와의 상동성을 표 1에 기재하였다.
이와 같은 결과는, 상기 6종의 폴리펩타이드는 기존 아실전이효소와 상동성이 낮은 신규한 아실전이효소 활성을 갖는 폴리펩타이드이며, 이를 포함하는 미생물 역시, 기존에 알려져 있지 않은 신규한 아실전이효소 활성을 갖는 미생물임을 시사하는 것이다.
Figure PCTKR2017007770-appb-T000001
실시예 2. 신규한 아실전이효소 이용 in vitro 효소 전환 방법을 통한 N- 아세틸메티오닌 생산
실시예 2-1. 신규 아실전이효소 유전자 도입 대장균 제작
슈도모나스 유래, 바실러스 유래, 엔테로박터 유래, 슈도비브리오 유래의 신규 아실전이효소 유전자(서열번호 7, 8, 9, 10)는 각 효소의 아미노산 서열 (서열번호 1, 2, 3, 4)에 근거해 대장균에 최적화된 코돈으로 합성되었다.
야로위아 유래의 신규 아실전이효소 유전자 획득을 위하여 야로위아 리포라이티카 PO1f (ATCC MYA-2613TM)의 gDNA를 추출하였다. 상기 gDNA를 주형으로 하고 프라이머 1과 2를 이용한 연쇄중합반응을 시행하여 원하는 크기의 유전자(서열번호 11) 및 아미노산 서열(서열번호 5)를 수득하였다.
코리네박테리움 유래의 신규 아실전이효소 유전자 획득을 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032를 고체 배지에 획선으로 도말한 후 밤새 배양하여 콜로니를 얻었다. 한 콜로니를 주형으로 하고 프라이머 3과 4를 이용한 PCR (연쇄중합반응)법을 시행하여 0.5 Kb 정도 크기의 유전자(서열번호 12) 및 아미노산 서열(서열번호 6)을 수득하였다. 이때, PCR법은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃/30초 변성, 56℃/30초 어닐링, 72℃/1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응시켜서 수행되었다.
상기 6종의 DNA를 제한효소 NdeI, XbaI으로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pUCtk 벡터에 라이게이션하였다. 상기 제작된 재조합 플라스미드를 대장균 DH5α에 42 ℃, 90초 열충격을 가해 형질전환시킨 후, 이를 카나마이신 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양에서 얻어진 콜로니 하나를 카나마이신 함유 LB 액체 배지 3 ml에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프렙키트 (Bioneer, Korea)를 이용하여 재조합 플라스미드를 회수하였다. 회수한 재조합 플라스미드의 서열정보를 시퀀싱 (Macrogen, Korea)을 통하여 확인하였고, 각각 pUCtk-ppmat, pUCtk-bsmat, pUCtk-entmat, pUCtk-pvmat, pUCtk-ylmat, pUCtk-cgmat로 명명하였다.
상기 재조합 플라스미드를 대장균 BL21(DE3)에 열충격법을 이용해 도입하여 카나마이신 함유 LB 고체 배지에 도말한 후 살아남은 콜로니를 형질전환체로 선택하였다. 선택된 형질전환체를 각각 BL21(DE3)/pUCtk-ppmat(또는, E. coli CC03-9001), BL21(DE3)/pUCtk-bsmat(또는, E. coli CC03-9002), BL21(DE3)/pUCtk-entmat(또는, E. coli CC03-9003), BL21(DE3)/pUCtk-pvmat(또는, E. coli CC03-9004), BL21(DE3)/pUCtk-ylmat(또는, E. coli CC03-9005), BL21(DE3)/pUCtk-cgmat(또는, E. coli CC03-9006)로 명명하였다. 또한, 상기 형질전환체를 부다페스트 조약하에 2016년 7월 15일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 상기 기재 순서에 따라 각각 기탁번호 KCCM11863P, KCCM11864P, KCCM11865P, KCCM11866P, KCCM11867P, KCCM11868P를 부여 받았다.
선택된 형질전환 대장균의 N-아세틸메티오닌 생산 능력을 사전 조사하기 위해 콜로니 하나를 카나마이신 25mg/L, 포도당 0.2% (w/v)이 함유된 LB 액체 배지 3 ml에 접종하여, 37 ℃에서 5시간 배양 후, 메티오닌을 2% (w/v) 되도록 첨가하여 3시간 더 배양하였다. 상기 배양액 1 μl를 시용하여 박층 크로마토그래피(TLC) 분석을 통해 N-아세틸메티오닌 생산 여부를 사전조사하였다. 상기 배양액 모두에서 N-아세틸메티오닌으로 추정되는 스팟이 발견되었고, 스팟의 진하기는 BL21(DE3)/pUCtk-ppmat, BL21(DE3)/pUCtk-entmat, BL21(DE3)/pUCtk-bsmat, BL21(DE3)/pUCtk-cgmat, BL21(DE3)/pUCtk- pvmat, BL21(DE3)/pUCtk-ylmat 순이었다.
Figure PCTKR2017007770-appb-T000002
Figure PCTKR2017007770-appb-I000001
실시예 2-2. 신규 아실전이효소를 이용한 N-아세틸메티오닌 생산능 확인
상기 실시예 2-1에서 제작한 형질전환 대장균의 콜로니 하나를 카나마이신 25mg/L, 포도당 0.2% (w/v)이 함유된 LB 액체 배지 3 ml에 접종하여 37 ℃에서 8시간 배양한 후, 동일배지 50 ml에 접종하여 밤새 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리하여 펠렛을 얻고 pH 7.0의 50 mM 인산버퍼 5 ml에 현탁한 후 sonication을 이용해 세포를 파쇄하였다. 세포 debris는 14,000 rpm에서 30분 원심분리하여 제거하고 상등액을 수득하였다. 신규 아실전이효소의 크기가 모두 19 kDa 근처임을 감안해 Amicon Ultra (Milipore, Ireland) 30-kDa cut-off membrane을 통과한 여과액을 10-kDa cut-off membrane에 통과시켜 필터 위에 남은 농축액을 얻었다. 상기 농축액을 Q sepharose가 충진된 HiTrap Q FF 칼럼(GE, USA)에 충진하고 NaCl 농도 gradient(80, 100, 150, 200, 300, 500 mM 순서)를 이용하여 신규 아실전이효소를 순수하게 분리하였다. 희석된 효소는 Amicon Ultra 10-kDa cut-off membrane을 통하여 재농축하였다. 신규 아실전이효소의 과발현 정도와 정제 정도는 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다.
상기 정제된 신규 아실전이효소의 활성 정도를 분석하기 위해, 20 mM 아세틸조효소 에이, 20 mM 메티오닌을 함유한 pH 7.0 인산버퍼 50 mM에 효소 농축액을 넣고, 37 ℃에서 10분간 반응한 후 생성된 N-아세틸메티오닌 양을 HPLC(Shimadzu, system controller CBM-20A 및 기타 악세서리)를 이용하여 측정하였다. 또한, 상기 정제된 신규 아실전이효소의 농도를 Bradford 분석법을 통하여 측정한 후, 생성된 N-아세틸메티오닌 값을 효소의 농도로 나누어 효소의 비활성을 비교하였다(표 3).
정제된 신규 아실전이효소 중 슈도모나스 푸티다 유래 효소가 3.8 U/mg으로 가장 높은 비활성을 나타내었는데, 이는 문헌상의 YncA의 비활성이 0.745 U/mg인 것을 비교할 때(US 8143031 B2, Table 3), 5배가 높은 활성이다. 이 밖에 바실러스 서브틸리스 유래 효소와 엔테로박터 sp. 638 유래 효소는 각각 1.6 U/mg, 1.7 U/mg의 비활성을 나타내었으며, 이 역시 YncA 대비 2배 이상의 활성이다. 슈도비브리오 sp. FO-BEG1, 야로위아 리포라이티카, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 신규 아실전이효소의 비활성은 1 U/mg에 미치지 못하게 낮았으나, SDS-PAGE 상 발현량이 적지 않아 숙주 내에서의 발현량 정도에 따라 형질전환체의 N-아세틸메티오닌 생산능 향상을 기대할 수 있다(표 3).
Figure PCTKR2017007770-appb-T000003
실시예 3. 슈도모나스 푸티다 유래 신규 아실전이효소를 이용한 N- 아세틸메 티오닌 전환반응
실시예 3-1. 슈도모나스 푸티다 유래 정제된 신규 아실전이효소를 이용한 N-아세틸메티오닌 전환반응
상기 실시예 2에서 비활성이 가장 높았던 슈도모나스 푸티다의 정제 효소 1 mg을 이용하여 메티오닌 전환반응을 수행하였다. 반응액으로 20 mM 메티오닌과 20 mM 아세틸조효소 에이를 함유한 pH 7.0의 50 mM 인산버퍼 3 ml을 사용하였다. 37 ℃, 150 rpm 조건에서 3시간 반응 후 반응액을 HPLC(SHIMADZU, SYSTEM CONTROLLER CBM-20A 및 기타 악세서리)로 분석하였을 때, 3.1 g/L의 N-아세틸메티오닌의 생성을 확인할 수 있었다. 이는 반응액 중의 메티오닌과 아세틸조효소 에이를 75% 이상 전환한 값이다.
실시예 3-2. 슈도모나스 푸티다 유래 아실전이효소를 도입한 세포의 세포막 투과성 증가에 따른 N- 아세틸메티오닌 전환반응
실시예 2에서 제조된 슈도모나스 푸티다 유래 신규 아실전이효소 유전자를 도입하여 만든 형질전환 대장균 BL21(DE3)/pUCtk-ppmat의 콜로니 하나를 카나마이신 25mg/L, 포도당 1% (w/v)이 함유된 LB 액체 배지 3 ml에 접종하여 37 ℃에서 8시간 배양한 후, 배양액 500 μl를 카나마이신 25mg/L, 포도당 0.2 % (w/v)가 함유된 LB 액체 배지 50 ml에 접종하여 밤새 배양하였다. 배양액을 원심분리를 이용하여 세포 펠렛을 얻어 영하 20 ℃ 냉동고에서 얼렸다. 완전히 얼은 세포 펠렛을 상온에서 다시 녹이고 얼리는 과정을 3회 반복하여 세포막에 고투과성을 부가하였다. pH 7.0의 50 mM 인산버퍼를 더하여 총 부피가 5 ml이 되게 재현탁하여 배양액을 농축하였다. 15 ml 시험관에 메티오닌 2% (w/v)이 함유된 50 mM 인산버퍼 (pH 7.0) 1.8 ml; 메티오닌 2 % (w/v), 아세틸조효소 에이 20 mM이 함유된 50 mM 인산버퍼 (pH 7.0) 1.8 ml; 및 메티오닌 2 % (w/v), 포도당 2 % (w/v)이 함유된 50 mM 인산버퍼 (pH 7.0) 1.8 ml을 각각 넣고, 상기 과정을 통하여 얻어진 세포막 투과성이 증가된 효소균 200 μL씩을 혼합하여 각각 총 2 ml가 되게 조제한 후 37 ℃, 150 rpm에서 10시간 반응하였다. 상기 반응액에 포도당을 첨가하는 목적은 반응과정에서 부족해질 수 있는 아세틸조효소 에이의 생성량을 증가시키기 위한 것으로, 대장균의 생존을 위한 것은 아니다. 반응액을 HPLC(SHIMADZU, SYSTEM CONTROLLER CBM-20A 및 기타 악세서리)로 분석한 결과를 표 4에 기재하였다. 발효 때보다 아세틸조효소 에이를 첨가했을 때, 미첨가시보다 몰전환율이 증가하는 결과를 보였다. 또한 아세틸조효소 에이 대신 포도당만을 첨가해도 몰전환율이 증가되는 것을 보아, 포도당 첨가가 아세틸조효소 에이의 증가분을 만드는 것으로 추정되었다. 고투과성 세포막을 가진 균주를 이용한 결과 N-아세틸메티오닌의 고농도 생산이 가능하였으며, 아세틸조효소 에이 대신 포도당만을 배지에 첨가해도 N-아세틸메티오닌을 고농도로 생산하였다.
Figure PCTKR2017007770-appb-T000004
실시예 4. 신규 아실전이효소를 도입한 형질전환체의 발효를 통한 N-아세틸-L-메티오닌 생산
실시예 4-1. 신규 아실전이효소를 도입한 대장균을 통한 N-아세틸-L-메티오닌 생산
실시예 2에서 제작한 형질전환체 6종의 각 콜로니 하나를 카나마이신 25mg/L, 포도당 1 % (w/v) 함유된 LB 액체 배지 3 ml에 접종하여 37 ℃에서 8시간 배양한 후, 배양액 500 μl를 카나마이신 25mg/L, 포도당 0.2 % (w/v), 메티오닌 2 % (w/v) 함유된 LB 액체 배지 50 ml에 접종하여 밤새 배양하였다. 이때 대조군으로 pUCtk 공벡터를 BL21 (DE3)에 형질전환하여 사용하였다. 배양액 내 세포를 원심분리로 제거하고 HPLC(SHIMADZU, SYSTEM CONTROLLER CBM-20A 및 기타 악세서리)를 이용해 생성된 N-아세틸메티오닌을 분석하였다. BL21(DE3)/pUCtk-ppmat의 경우 가장 높은 3.03 g/L의 농도로 N-아세틸메티오닌을 생산하였고, BL21(DE3)/pUCtk-entmat가 2.23 g/L로 두번째로 높은 N-아세틸메티오닌 농도를 보였다. 공벡터의 경우도 미량의 N-아세틸메티오닌이 검출되었는데 이는 대장균이 보유하고 있는 YncA 효소의 역할인 것으로 추정된다(표 5).
Figure PCTKR2017007770-appb-T000005
실시예 4-2. 신규 아실전이효소를 도입한 코리네박테리움을 통한 N-아세틸-L-메티오닌 생산
4-2-1. 코리네박테리움속 미생물 도입용 아실전이효소 과발현 벡터 제작
상기 실시예 1로부터 확인된 신규 아실전이효소(서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6)의 N-아세틸-L-메티오닌 생산 효과를 코리네박테리움속 미생물에서 확인하고자 해당 유전자를 과발현하기 위한 벡터를 제작하였다. 염기 서열 7, 8, 9, 10, 11, 12에 근거하여 5' 말단에 EcoRV 제한효소 부위를 삽입한 프라이머와 3' 말단에 PstI 부위를 삽입한 프라이머를 합성하였다.
염기 서열 7 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-ppmat를 주형으로 하고 프라이머 5와 6을 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 염기 서열 8 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-bsmat를 주형으로 하고 프라이머 7과 8을 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 염기 서열 9 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-entmat를 주형으로 하고 프라이머 9와 10을 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 염기 서열 10 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-pvmat를 주형으로 하고 프라이머 11과 12을 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 염기 서열 11 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-ylmat를 주형으로 하고 프라이머 13과 14를 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 염기 서열 12 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-cgmat를 주형으로 하고 프라이머 15와 16 을 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다.
아실전이효소의 프로모터는 cj7 프로모터(한국 공개 공보 제10-2004-0107215호)를 사용하였다. 프로모터 cj7 DNA 단편을 획득하기 위해서 5' 말단에 KpnI 제한효소를 삽입한 프라이머와 3' 말단에 EcoRV 부위를 삽입한 프라이머를 합성하고, p117-cj1-gfp를 주형으로 한 PCR법을 통하여 cj7 프로모터를 증폭하였다(한국 공개 특허 제10-2004-0107215호). 이때, PCR법은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃/30초 변성, 56℃/30초 어닐링, 72℃/1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합 반응시켜서 수행되었다.
증폭된 6종의 아실전이효소 폴리뉴클레오티드를 제한효소 PstI으로 처리하여 DNA 절편을 획득하고, 프로모터 cj7 폴리뉴클레오티드는 KpnI과 EcoRV로 처리하여 DNA 절편을 획득하였다. 6개의 DNA 절편을 획득한 후, 에세리키아와 코리네박테리움의 셔틀 벡터인 pECCG117벡터의 KpnI, PstI 부위에 연결하여 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/L)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, 통상에 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하여 각각 pECCG117-Pcj7-ppmat, pECCG117-Pcj7-bsmat, pECCG117-Pcj7-entmat, pECCG117-Pcj7-pvmat, pECCG117-Pcj7-ylmat, pECCG117-Pcj7-cgmat라고 명명하였다.
4-2-2. 신규 아실전이효소 과발현 벡터 도입 균주 제작 및 N-아세틸-L-메티오닌 생산능 확인
상기 실시예 4-2-1에서 제조한 벡터 pECCG117-Pcj7-ppmat, pECCG117-Pcj7-bsmat, pECCG117-Pcj7-entmat, pECCG117-Pcj7-pvmat, pECCG117-Pcj7-ylmat, pECCG117-Pcj7-cgmat와 실험 대조군의 pECCG117 벡터를 각각 전기펄스법을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 도입한 후, 카나마이신 (25 mg/L) 이 포함된 복합평판 배지에 도말하고 30 ℃에서 24시간 동안 배양하여 콜로니를 획득하였다. 획득한 균주는 13032/pECCG117-Pcj7-ppmat, 13032/pECCG117-Pcj7-bsmat, 13032/pECCG117-Pcj7-entmat, 13032/pECCG117-Pcj7-pvmat, 13032/pECCG117-Pcj7-ylmat, 13032/pECCG117-Pcj7-cgmat, 13032/pECCG117로 명명하였다. 형질전환체의 N-아세틸메티오닌 생산능을 확인하기 위해 카나마이신(25 mg/L)이 포함된 복합액체배지 3 ㎖을 함유하는 14 ㎖의 1회용 배양 튜브에 상기 균주를 접종하고, 30 ℃, 200 rpm의 조건으로 24시간 동안 진탕 배양하여 종배양액을 확보하였다. 카나마이신(25 mg/L)과 메티오닌 2% (20g/L)가 포함된 복합액체배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 상기 종배양액 1 ml을 접종하고, 37 ℃, 200 rpm에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 배양을 종료한 후, HPLC(SHIMADZU, SYSTEM CONTROLLER CBM-20A 및 기타 악세서리)를 이용하여 N-아세틸메티오닌 농도를 분석하였다(표 6).
대조군으로 제작한 형질전환체 13032/pECCG117의 경우 1.07 g/L의 N-아세틸메티오닌을 생산했는데 이는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰이 보유한 아실전이효소의 능력으로 보이고, 6종의 신규아실전이효소를 과발현시킨 결과 원래 능력보다 더 많은 N-아세틸메티오닌을 생산함을 확인할 수 있었다.
<복합평판배지>
포도당 20g, (NH4)2SO4 50g, 펩톤 10g, 효모추출물 5g, 요소 1.5g, KH2PO4 5g, K2HPO4 10g, MgSO4·7H2O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 염산염 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니코틴아미드 2000㎍, 한천 20g, 카나마이신 25 mg (증류수 1L 기준)
<복합액체배지>
포도당 20g, 펩톤 10g, 효모추출물 5g, 요소 1.5g, KH2PO4 4g, K2HPO4 8g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니코틴아미드 2000㎍, 카나마이신 25 mg (증류수 1L 기준)
Figure PCTKR2017007770-appb-T000006
실시예 4-3. 신규 아실전이효소가 도입된 사카로마이세스를 통한 N-아세틸-L-메티오닌 생산
4-3-1. 사카로마이세스용 아실전이효소 과발현 벡터 제작
상기 실시예 1로부터 확인된 신규 아실전이효소(서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6)의 N-아세틸-L-메티오닌 생산 효과를 사카로마이세스에서 확인하고자 해당 유전자를 과발현하기 위한 벡터를 제작하였다. 염기 서열 7, 8, 9, 10, 11, 12에 근거하여 5' 말단에 SpeI 제한효소 부위를 삽입한 프라이머와 3' 말단에 XhoI 부위를 삽입한 프라이머를 합성하였다.
염기 서열 7 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-ppmat를 주형으로 하고 프라이머 17과 18을 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 염기 서열 8 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-bsmat를 주형으로 하고 프라이머 19와 20을 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 염기 서열 9 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-entmat를 주형으로 하고 프라이머 21과 22을 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 염기 서열 10 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-pvmat를 주형으로 하고 프라이머 23과 24을 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 염기 서열 11 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-ylmat를 주형으로 하고 프라이머 25와 26을 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 염기 서열 12 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-cgmat를 주형으로 하고 프라이머 27과 28을 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 이때, PCR법은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃/30초 변성, 56℃/30초 어닐링, 72℃/1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응시켜서 수행되었다.
증폭된 6종의 아실전이효소 폴리뉴클레오티드를 제한효소 SpeI과 XhoI으로 처리하여 DNA 절편을 획득하였다. 6개의 DNA 절편을 획득한 후, 에세리키아와 사카로마이세스 셔틀 벡터인 p414ADH의 SpeI, XhoI 부위에 연결하여 대장균 DH5α에 형질전환하고 엠피실린(100mg/L)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, 플라스미드 미니프렙키트 (Bioneer, Korea)를 이용하여 플라스미드를 획득하여 각각 p414ADH-ppmat, p414ADH-bsmat, p414ADH-entmat, p414ADH-pvmat, p414ADH-ylmat, p414ADH-cgmat라고 명명하였다.
4-3-2. 아실전이효소 과발현 벡터 도입 균주 제작 및 N-아세틸-L-메티오닌 생산능 확인
상기 실시예 4-3-1에서 제조한 벡터 p414ADH-ppmat, p414ADH-bsmat, p414ADH-entmat, p414ADH-pvmat, p414ADH-ylmat, p414ADH-cgmat와 실험대조군의 p414ADH 벡터 각각을 EUROSCARF에서 분양받은 야생형 효모 중 대표적인 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) CEN.PK2-1D(한국 등록 특허 제10-1577134)에 효모형질전환법을 이용하여 도입하였다. 사카로마이세스 세레비지에 CEN.PK2-1D에 도입한 후, YPD (1% yeast extract, 2% bacto-peptone, 2% glucose) 평판배지에 도말하여 30 ℃에서 24시간 동안 배양하여 콜로니를 획득하였다. 획득한 균주는 ScCEN/p414ADH-ppmat, ScCEN/p414ADH-bsmat, ScCEN/p414ADH-entmat, ScCEN/p414ADH-pvmat, ScCEN/p414ADH-ylmat, ScCEN/p414ADH-cgmat, ScCEN/p414ADH로 명명하였다. 형질전환체의 N-아세틸메티오닌 생산능을 확인하기 위해 엠피실린 (100 mg/L)이 포함된 YPD 액체배지 3㎖을 함유하는 14 ㎖ 1회용 배양 튜브에 상기 균주를 접종하고, 30 ℃, 200 rpm의 조건으로 24시간 동안 진탕 배양하여 종배양액을 확보하였다. 메티오닌 0.5% (5g/L)가 포함된 YPD액체배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 상기 종배양액 1 ml을 접종하고, 30 ℃, 200 rpm에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 배양을 종료한 후, HPLC(SHIMADZU, SYSTEM CONTROLLER CBM-20A 및 기타 악세서리)를 이용하여 N-아세틸-L-메티오닌 농도를 분석하였다 (표 7)
형질전환체 ScCEN/p414ADH에서 알 수 있듯이, 사카로마이세스 세레비지에는 자체적으로 N-아세틸메티오닌을 생산하지 않는 것으로 보이나, 6종의 신규 아실전이효소가 과발현된 균주의 경우 N-아세틸메티오닌 생산능을 가지는 것으로 확인되었다.
Figure PCTKR2017007770-appb-T000007
실시예 4-4. 신규 아실전이효소가 도입된 야로위아를 통한 N-아세틸-L-메티오닌 생산
실시예 4-4-1. 야로위아용 아실전이효소 과발현 벡터 제작
상기 실시예 1 로부터 확인된 신규 아실전이효소(서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6)의 N-아세틸-L-메티오닌 생산 효과를 야로위아에서 확인하고자 해당 유전자를 과발현하기 위한 벡터를 제작하였다. 염기 서열 7, 8, 9, 10, 11, 12에 근거하여 5' 말단과 3' 말단에 KpnI 제한효소 부위를 삽입한 프라이머를 합성하였다.
염기 서열 7 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-ppmat를 주형으로 하고 프라이머 29와 30을 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 염기 서열 8 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-bsmat를 주형으로 하고 프라이머 31과 32을 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 염기 서열 9 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-entmat를 주형으로 하고 프라이머 33과 34를 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 염기 서열 10 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-pvmat를 주형으로 하고 프라이머 35와 36을 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 염기 서열 11 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-ylmat를 주형으로 하고 프라이머 37과 38을 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 염기 서열 12 기반의 유전자는 상기 실시예 1의 벡터 pUCtk-cgmat를 주형으로 하고 프라이머 39와 40을 이용한 PCR법을 통하여 중합되었다. 이때, PCR법은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃/30초 변성, 56℃/30초 어닐링, 72℃/1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응시켜서 수행되었다.
증폭된 6종의 아실전이효소 폴리뉴클레오티드를 제한효소 KpnI으로 처리하여 DNA 절편을 획득하였다. 6개의 DNA 절편을 획득한 후, 에세리키아와 야로위아 셔틀 벡터 pIMR53_AUX (FEMS Microbiology LettersVolume 199, Issue 1, pages 97-102, May 2001)의 KpnI 부위에 연결하여 대장균 DH5α에 형질전환하고 엠피실린 (100mg/L)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR법을 통해 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, 플라스미드 미니프렙키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 플라스미드를 획득하여 각각 pIMR53U-ppmat, pIMR53U-bsmat, pIMR53U-entmat, pIMR53U-pvmat, pIMR53U-ylmat, pIMR53U-cgmat라고 명명하였다.
4-4-2. 아실전이효소 과발현 벡터 도입 균주 제작 및 N-아세틸-L-메티오닌 생산능 확인
상기 실시예 4-4-1에서 제조한 벡터 pIMR53U-ppmat, pIMR53U-bsmat, pIMR53U-entmat, pIMR53U-pvmat, pIMR53U-ylmat, pIMR53U-cgmat와 실험대조군의 pIMR53_AUX 벡터 각각을 미국생물자원센터(American type Culture Collection)로부터 구매한 야로위아 리포라이티카 PO1f (ATCC MYA-2613TM)에 효모 형질전환법을 이용하여 도입되었다. 야로위아 리포라이티카 PO1f에 도입한 후, YPD (1% yeast extract, 2% bacto-peptone, 2% glucose) 평판배지에 도말하여 30 ℃에서 24시간 동안 배양하여 콜로니를 획득하였다. 획득한 균주는 Yl/pIMR53U-ppmat, Yl/pIMR53U-bsmat, Yl/pIMR53U-entmat, Yl/pIMR53U-pvmat, Yl/pIMR53U-ylmat, Yl/pIMR53U-cgmat, Yl/pIMR53U로 명명하였다. 형질전환체의 N-아세틸메티오닌 생산능을 확인하기 위해, YPD액체배지 3 ㎖을 함유하는 14 ㎖ 1회용 배양 튜브에 상기 균주를 접종하고, 30 ℃, 200 rpm의 조건으로 24시간 동안 진탕 배양하여 종배양액을 확보하였다. 메티오닌 0.5 % (5g/L)이 포함된 YPDm 액체배지 (포도당 10 g, Na2HPO4 3.28 g, NaH2PO4 3.22 g, yeast extract 2 g, Proteose-peptone 50 g / 1L 기준) 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 상기 종배양액 1 ml을 접종하고, 30 ℃, 200 rpm에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 배양을 종료한 후, HPLC(SHIMADZU, SYSTEM CONTROLLER CBM-20A 및 기타 악세서리)를 이용하여 N-아세틸-L-메티오닌 농도를 분석하였다(표 8)
야로위아 리포라이티카의 야생형이 보유하고 있는 아실전이효소의 효과로 형질전환체 Yl/pIMR53U에서도 N-아세틸메티오닌이 생산된 것으로 보이나, 6종의 신규아실전이효소가 과발현된 균주의 경우 더 나은 N-아세틸메티오닌 생산을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2017007770-appb-T000008
상기와 같은 결과들은 본 발명에서 새롭게 개발한 아실전이효소 및 이를 포함하는 미생물이 기존에 알려진 아실전이효소인 YncA보다 우수하게 N-아세틸-L-메티오닌을 생산하는 것을 시사한다.
이상의 설명으로부터, 본원이 속하는 기술분야의 당업자는 본원이 그기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2017007770-appb-I000002
Figure PCTKR2017007770-appb-I000003
Figure PCTKR2017007770-appb-I000004
Figure PCTKR2017007770-appb-I000005
Figure PCTKR2017007770-appb-I000006
Figure PCTKR2017007770-appb-I000007

Claims (9)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드를 포함하는, 아실전이효소의 활성을 갖는 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 에스체리치아 속(Escherichia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 사카로마이세스 속( Saccharomyces sp.) 및 야로위아 속(Yarrowia sp.)로 이루어진 군에서 선택되는 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 L-메티오닌에 아세틸 전이 활성을 가져 N-아세틸-L-메티오닌을 생산하는 미생물.
  4. L-메티오닌에 아세틸 전이 활성을 가지는, 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드.
  5. 제4항의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  7. (i) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 미생물 또는 이의 배양물; (ii) 제4항의 폴리펩타이드; 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는, L-메티오닌으로부터 N-아세틸-L-메티오닌의 제조용 조성물.
  8. (i) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 미생물 또는 이의 배양물; (ii) 제4항의 폴리펩타이드; 또는 이들의 조합을 이용하여 L-메티오닌을 아세틸화하는 단계를 포함하는, N-아세틸-L-메티오닌의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 아세틸화된 L-메티오닌인, N-아세틸-L-메티오닌을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 제조방법.
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