WO2022239953A1 - 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도 - Google Patents

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신광수
심지현
이광우
장연재
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • a composition for producing pantoic acid, and a method for producing pantothenic acid and/or pantoic acid comprising culturing the microorganism are provided.
  • Pantothenic acid is a substance belonging to the vitamin B complex, also called vitamin B5, and is one of the commercially important substances that are variously applied to cosmetics, medicine, human nutrition, animal nutrition, and the like.
  • Pantothenic acid is a structure in which beta-alanine is connected to pantoic acid by an amide bond.
  • Pantothenic acid or pantoic acid can be produced synthetically or biotechnologically by fermentation of suitable microorganisms in suitable media.
  • An advantage of biotechnological production methods using microorganisms is that the desired stereo-isomeric D-form of pantothenic acid or pantoic acid is formed.
  • the polypeptide may include an amino acid sequence in which the amino acid corresponding to the 159th residue from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 is substituted with another amino acid.
  • the amino acid corresponding to the 159th residue from the N-terminus is substituted with another amino acid, and the amino acid corresponding to the 116th residue from the N-terminus is replaced with another amino acid. It may include an amino acid sequence substituted with an amino acid.
  • Counting amino acids from the N-terminus in the amino acid sequence as described above may mean counting methionine (Met, M) translated from the start codon as the first amino acid.
  • Another example provides a polynucleotide encoding the polypeptide.
  • the recombinant vector may be an expression vector.
  • Another example includes one or more (one, two, or both) selected from the group consisting of the polypeptide, a polynucleotide encoding the polypeptide, and a recombinant vector containing the polynucleotide, and 3-methyl-2- Provided is a microorganism that produces pantothenic acid or pantoic acid with enhanced activity of oxobutanoate hydroxymethyltransferase (3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase).
  • the microorganism is the microorganism
  • polypeptide in which the amino acid corresponding to the 159th residue from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 is substituted with another amino acid, a polynucleotide encoding the polypeptide, and a recombinant vector containing the polynucleotide at least one selected from the group (one, two, or both); or,
  • polypeptide in which the amino acid corresponding to the 116th residue from the N-terminus in the amino acid sequence of (1) and SEQ ID NO: 37 is substituted with another amino acid, a polynucleotide encoding the polypeptide, and the polynucleotide It may include one or more (one, two, or all) selected from the group consisting of recombinant vectors.
  • the microorganism may be a microorganism of the genus Corynebacterium or a microorganism of the genus Escherichia.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium may be Corynebacterium glutamicum.
  • Another example provides a composition for producing pantothenic acid or pantoic acid, including the microorganism.
  • Another example provides the use of the microorganism for the production of pantothenic acid and/or pantoic acid.
  • Another example provides a method for preparing pantothenic acid or pantoic acid, comprising culturing the microorganism in a medium.
  • the manufacturing method may further include, after the culturing, recovering pantothenic acid or pantoic acid from the cultured microorganism, medium, or both.
  • 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase or variants thereof capable of improving pantothenic acid and/or pantoic acid production ability are searched for, and by introducing them into microorganisms, pantothenic acid and/or pan It is intended to provide a recombinant strain with excellent native production ability.
  • the microorganism expressing 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase has excellent pantothenic acid production ability, and the 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase When an amino acid substitution mutation was introduced at a specific position, it was confirmed that the pantothenic acid production ability was further increased.
  • the polypeptide may include an amino acid sequence in which the amino acid corresponding to the 159th residue from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 is substituted with another amino acid.
  • the amino acid corresponding to the 159th residue from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 is substituted with another amino acid, and the amino acid corresponding to the 116th residue from the N-terminus is substituted with another amino acid. It may contain an amino acid sequence.
  • Counting amino acids from the N-terminus in the amino acid sequence as described above may mean counting methionine (Met, M) translated from the start codon as the first amino acid.
  • Another example provides a polynucleotide encoding the polypeptide.
  • Another example provides a recombinant vector comprising the polynucleotide.
  • the recombinant vector may be used as an expression vector for the polypeptide.
  • microorganism in which the activity of 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase is enhanced.
  • the microorganism may be a microorganism that produces pantothenic acid or pantoic acid.
  • the activity of the 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase is enhanced because the 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase in the microorganism is mutated or foreign It may be enhanced by introducing 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase or a variant thereof.
  • the activity-enhanced 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase is an amino acid corresponding to the 159th residue from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 is substituted with another amino acid It may contain an amino acid sequence.
  • the amino acid corresponding to the 159th residue from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 is substituted with another amino acid, and N -It may include an amino acid sequence in which the amino acid corresponding to the 116th residue from the end is substituted with another amino acid.
  • polypeptide in which the amino acid corresponding to the 159th residue from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 is substituted with another amino acid, a polynucleotide encoding the polypeptide, and a recombinant vector containing the polynucleotide at least one selected from the group; or
  • polypeptide in which the amino acid corresponding to the 116th residue from the N-terminus in the amino acid sequence of (1) and SEQ ID NO: 37 is substituted with another amino acid, a polynucleotide encoding the polypeptide, and the polynucleotide It may include one or more selected from the group consisting of recombinant vectors.
  • the microorganism with enhanced activity of the 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase is not enhanced with 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase (e.g., SEQ ID NO: Compared to the same microorganisms in which the amino acid corresponding to the 159th residue and/or the amino acid corresponding to the 116th residue from the N-terminus in the amino acid sequence of 37 are not substituted with other amino acids), high pantothenic acid and/or pantoic acid production ability can have
  • Another embodiment provides a composition for producing pantothenic acid and/or pantoic acid comprising a microorganism having enhanced activity of the 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase.
  • Another embodiment provides a method for producing pantothenic acid and/or pantoic acid comprising culturing a microorganism having enhanced activity of the 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase.
  • pantothenic acid e.g., D-pantothenic acid
  • D-pantothenic acid is a compound having the structure of Formula 1, a vitamin (vitamin B5) in which ⁇ -alanine is linked to pantoic acid by an amide bond, and coenzyme A It is a component of (coenzyme A, CoA) and acyl carrier protein (ACP), and is involved in various metabolic actions of organisms.
  • Pantoic acid e.g., D-pantoic acid
  • 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase (3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase) is 5,10-methylenetetrahydrofolate, 3-methyl-2-oxobutano It is an enzyme that catalyzes the biosynthesis of tetrahydrofolate and 2-dihydropantoate from water.
  • the 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase may be a mutant in which one or more amino acid residues are substituted, deleted, or inserted.
  • the variant of 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase has a different amino acid corresponding to the 159th residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, that is, arginine (R), histidine (H), lysine (K), aspartic acid (D), glutamic acid (E), serine (S), threonine (T), asparagine (N), glutamine (Q), cysteine (C), proline (P), It is selected from the group consisting of valine (V), isoleucine (I), leucine (L), methionine (M), tyrosine (Y), phenylaline (F), tryptophan (W), and glycine (G), and is originally It may be substituted with an amino acid different from the amino acid of
  • the 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase variant has a different amino acid corresponding to the 159th residue in the amino acid
  • the variant is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 , or a polypeptide in which the amino acid corresponding to the 159th residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 in an amino acid sequence having 99% or more homology or identity is substituted with another amino acid.
  • polypeptides having 99% or more and less than 100% sequence homology or identity and 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase activity may be included in the variants of the present application.
  • the 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase variant may include an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 110 to SEQ ID NO: 125, but is not limited thereto. Even if some amino acid sequences other than the amino acid corresponding to the 159th residue in the variant consisting of any one sequence selected from SEQ ID NO: 110 to SEQ ID NO: 125 are deleted, modified, substituted or added, 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy It is obvious that it can be included in the variant of the present application as long as it exhibits the activity of oxymethyltransferase.
  • the amino acid corresponding to the 159th residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 is fixed, and at least 80%, 85%, 90%, It may include polypeptides having at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homology or identity.
  • the amino acid corresponding to the amino acid residue corresponding to the 159th residue of 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase is a different amino acid, that is, arginine (R), Histidine (H), Lysine (K), Aspartic acid (D), Glutamic acid (E), Serine (S), Threonine (T), Asparagine (N), Glutamine (Q), Cysteine (C), Proline (P) , is selected from the group consisting of valine (V), isoleucine (I), leucine (L), methionine (M) and tyrosine (Y), and is substituted with an amino acid different from the original amino acid, and
  • an amino acid corresponding to the amino acid residue corresponding to the 116th residue of 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 is a different amino acid, that is, aspartic acid (D); Glutamic acid (E), serine (S), threonine (T), asparagine (N), glutamine (Q), cysteine (C), alanine (A), valine (V), isoleucine (I), leucine (L) and It is selected from the group consisting of methionine (M) and may be substituted with an amino acid different from the original amino acid.
  • the variant is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 , or in an amino acid sequence having 99% or more homology or identity, (1) an amino acid corresponding to the 159th residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 and (2) an amino acid corresponding to the 116th residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 It may include polypeptides substituted with other amino acids.
  • the 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase variant may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128, but is not limited thereto. In the variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128, even if some amino acid sequences other than (1) the amino acid corresponding to the 159th residue and (2) the amino acid corresponding to the 116th residue are deleted, modified, substituted or added, 3-methyl- It is obvious that it can be included in the variant of the present application as long as it shows the activity of 2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase.
  • the variant has (1) an amino acid corresponding to the 159th residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 and (2) an amino acid corresponding to the 116th residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 is fixed and SEQ ID NO: 128
  • a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more homology or identity to an amino acid sequence can include That is, (1) at a position corresponding to the 159th residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 and (2) at a position corresponding to the 116th residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, including substitution with another amino acid, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 128 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyl having at least 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or greater than 99%, but less than 100% sequence homology or identity to the sequence Polypeptide
  • polypeptide in which the amino acid corresponding to the 159th residue from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 is substituted with another amino acid, a polynucleotide encoding the polypeptide, and a recombinant vector containing the polynucleotide at least one selected from the group; or
  • polypeptide in which the amino acid corresponding to the 116th residue from the N-terminus in the amino acid sequence of (1) and SEQ ID NO: 37 is substituted with another amino acid, a polynucleotide encoding the polypeptide, and the polynucleotide Including one or more selected from the group consisting of recombinant vectors,
  • Pantothenic acid or a microorganism that produces pantoic acid is provided.
  • microorganism with enhanced activity of 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase refers to the activity of 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase described above.
  • a microorganism without pantothenic acid and/or pantoic acid-producing ability may have pantothenic acid and/or pantoic acid-producing ability, or pantothenic acid and/or pantoic acid-producing ability higher than the original pantothenic acid and/or pantoic acid-producing ability. Or it may have a pantosan production ability.
  • microorganism encompasses single-celled bacteria, and may be used interchangeably with “cell”.
  • a "parent microorganism or parent microorganism” strain in order to distinguish a microorganism before being mutated to express a polypeptide having the 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase activity from the mutated microorganism, a "parent microorganism or parent microorganism” strain) or host cell.
  • the microorganism may be at least one selected from the group consisting of a microorganism of the genus Corynebacterium and a microorganism of the genus Escherichia .
  • the microorganisms of the genus Corynebacterium are Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ), Corynebacterium ammoniagenes ( Corynebacterium ammoniagenes ), Brevibacterium lactofermentum ( Brevibacterium lactofermentum ), Brevibacterium plaum ( Brevibacterium flavum ), Corynebacterium thermoaminogenes ( Corynebacterium thermoaminogenes ), Corynebacterium efficiens ( Corynebacterium efficiens ), etc.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium may be Corynebacterium glutamicum .
  • the Escherichia genus strain may be Escherichia coli .
  • the microorganism with enhanced activity of 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase is a gene into which a gene encoding 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase is introduced. it could be
  • microorganisms with enhanced activity of 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase means that the parent strain has 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase activity. It may be a microorganism expressing a polypeptide having 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase activity into which a mutation (engineering) is introduced to express the polypeptide.
  • the microorganism is at least one selected from the group consisting of a polypeptide having 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase activity, a polynucleotide encoding the polypeptide, and a recombinant vector containing the polynucleotide It may contain.
  • the mutation to express the polypeptide having the 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase activity is the 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase described above It may be performed by introducing a polynucleotide encoding a polypeptide having an activity, or a recombinant vector containing the polynucleotide into a parent strain.
  • polynucleotide encoding the polypeptide having 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase activity introduced into the parent strain is 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy It may replace the methyltransferase encoding gene or be included in addition to it.
  • the microorganism expressing the polypeptide having the 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase activity may be accession number KCCM12973P (named as Corynebacterium glutamicum CV03-5002).
  • a polynucleotide which may be used interchangeably with “gene” or a polypeptide (which may be used interchangeably with “protein”) is “comprising, consisting of, or consisting of a specific nucleic acid sequence or amino acid sequence, Or expressed as a specific nucleic acid sequence or amino acid sequence” may mean that the polynucleotide or polypeptide essentially includes the specific nucleic acid sequence or amino acid sequence, and the original function and/or Or a "substantially equivalent sequence" in which a mutation (deletion, substitution, modification, and / or addition) is added to the specific nucleic acid sequence or amino acid sequence to the extent that the desired function is maintained (or that does not exclude the mutation ) can be interpreted as
  • nucleic acid sequences or amino acid sequences provided herein may be subjected to conventional mutagenesis, such as directed evolution and/or site-specific mutagenesis, to the extent that they retain their original or desired functions. It may include those modified by site-directed mutagenesis or the like.
  • a polynucleotide or polypeptide "comprises or consists of a particular nucleic acid sequence or amino acid sequence" means that the polynucleotide or polypeptide (i) comprises the particular nucleic acid sequence or amino acid sequence.
  • the desired function may mean a function that increases or imparts pantothenic acid and/or pantoic acid production ability of microorganisms.
  • nucleic acid sequence described herein is the amino acid sequence and / or function of the protein expressed from the coding region in consideration of the codon preferred in microorganisms to express the protein (lysine release protein) due to codon degeneracy.
  • Various modifications may be made to the coding region within a range that does not change .
  • identity refers to the degree of identity with a given nucleic acid sequence or amino acid sequence and can be expressed as a percentage (%).
  • algorithm BLAST according to literature (Kalin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993) or FASTA by Pearson (reference: Methods Enzymol ., 183, 63, 1990) can be used to determine Based on this algorithm BLAST, a program called BLASTN or BLASTX has been developed (see: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • a polynucleotide comprising a specific nucleic acid sequence provided herein includes a polynucleotide fragment comprising the specific nucleic acid sequence or a nucleic acid sequence substantially equivalent thereto, as well as a nucleic acid sequence complementary to the specific nucleic acid sequence.
  • the polynucleotide having the complementarity may be hybridized at a Tm value that can be appropriately adjusted by a person skilled in the art depending on the purpose, for example, a Tm value of 55 ° C, 60 ° C, 63 ° C or 65 ° C, and analyzed under the conditions described below. : These conditions are specifically described in known literature.
  • Hybridization requires two nucleotides to have complementary sequences, or mismatch between bases may be allowed depending on the stringency of hybridization.
  • the term "complementary" may be used to describe a relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other. For example, in DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine.
  • the appropriate stringency of hybridizing polynucleotides depends on the length of the polynucleotide and the degree of complementarity, which is well known in the art (see Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • transformation refers to a process of introducing a specific polynucleotide or a vector containing the same into a host cell, and the transformed polynucleotide may be inserted into a chromosome or located extrachromosomally in the host cell.
  • transformation may be to introduce a polynucleotide encoding a target protein (foreign protein) or a vector containing the polynucleotide into a host cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the polynucleotide may include DNA and/or RNA encoding a target protein.
  • the introduced form is not limited.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a genetic construct containing all elements required for self-expression.
  • the expression cassette may include expression control elements such as a promoter, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and/or a translation termination signal that are usually operably linked to the polynucleotide.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell.
  • operably linked means that an expression control element (eg, a promoter) and a polynucleotide so that the expression control element can perform transcriptional control (eg, transcription initiation) of a polynucleotide encoding a target protein (external protein). It may mean that nucleotides are functionally linked. Operable linking can be performed using genetic recombination techniques known in the art, for example, by conventional site-specific DNA cutting and linking, but is not limited thereto.
  • the method of transforming the polynucleotide into a host cell can be performed by any method of introducing nucleic acid into a cell (microorganism), and can be performed by appropriately selecting a transformation technique known in the art according to the host cell.
  • the known transformation methods include electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, and polyethylene glycol (PEG) precipitation (polyethylene glycol-mediated uptake). ), DEAE-dextran method, cationic liposome method, lipofection, lithium acetate-DMSO method, etc. may be exemplified, but are not limited thereto.
  • RNA-guided endonuclease system or CRISPR system
  • an RNA-guided endonuclease eg, Cas9 protein, etc.
  • its encoding gene or a vector containing the gene
  • a guide RNA eg, single guide RNA (sgRNA), etc.
  • a mixture comprising its encoding DNA or a vector containing the DNA (eg, a mixture of an RNA-guided endonuclease protein and a guide RNA, etc.), a complex (eg, ribonucleic acid fusion protein (RNP)), a recombinant vector (eg, , RNA-guided endonuclease encoding gene and a vector comprising a guide RNA encoding DNA, etc
  • RNP ribonucleic acid fusion protein
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing a base sequence of a polynucleotide encoding a protein of interest operably linked to suitable regulatory sequences so as to express the protein of interest in a suitable host.
  • the regulatory sequence may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and/or a sequence regulating termination of transcription and/or translation. have.
  • the vector After transformation into a suitable host cell, the vector can be expressed independently of the host cell's genome (genome) or integrated into the host cell's genome.
  • a vector usable herein is not particularly limited as long as it can be replicated in a host cell, and may be selected from all vectors commonly used.
  • commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages, and the like.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A can be used as phage vectors or cosmid vectors, and pBR-based, pUC as plasmid vectors system, pBluescriptII system, pGEM system, pTZ system, pCL system, pET system, etc.
  • pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, and pCC1BAC vectors may be exemplified, but are not limited thereto.
  • the vector usable herein may be a known expression vector and/or a vector for insertion of a polynucleotide into a host cell chromosome. Insertion of the polynucleotide into the host cell chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination or CRISPR system, but is not limited thereto.
  • the vector may further include a selection marker for determining whether the vector is inserted into the chromosome.
  • the selectable marker is used to select cells transformed with the vector, that is, to determine whether or not the polynucleotide is inserted, and selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or expression of surface proteins. It can be selected and used from among genes that give. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so transformed cells can be selected.
  • Another example provides a composition for producing pantothenic acid or pantoic acid, including the microorganism.
  • Another example provides a method for preparing pantothenic acid or pantoic acid, comprising culturing the microorganism in a medium.
  • Another example is a method for increasing pantothenic acid and/or pantoic acid production ability of a microorganism, including enhancing the activity of 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase of the microorganism, or the microorganism It provides a method for imparting pantothenic acid production ability to
  • the step of enhancing the activity of 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase of the microorganism is a polypeptide having 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase activity in the microorganism It may include the step of introducing a mutation to express.
  • the step of introducing the mutation is to introduce (transform) a polynucleotide encoding a polypeptide having 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase activity or a recombinant vector containing the polynucleotide into a microorganism It may include steps.
  • Another example provides a method for producing pantothenic acid and/or pantoic acid, comprising culturing the above-described microorganism having enhanced 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase activity in a medium.
  • the method may further include, after the culturing step, recovering pantothenic acid and/or pantoic acid from the cultured microorganism, medium, or both.
  • the step of culturing the microorganism is not particularly limited thereto, but may be performed by a known batch culture method, continuous culture method, fed-batch culture method, or the like.
  • the culture conditions are not particularly limited thereto, but a suitable pH (eg, pH 5 to 9, specifically, using a basic compound (eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide, or ammonia) or an acidic compound (eg, phosphoric acid or sulfuric acid) can be adjusted to pH 6-8, most specifically pH 6.8), and oxygen or an oxygen-containing gas mixture can be introduced into the culture to maintain aerobic conditions.
  • the incubation temperature may be maintained at 20 to 45° C., or 25 to 40° C., and may be cultured for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • Pantothenic acid and/or pantoic acid produced by the above culture may be secreted into the “medium” or remain in the cells.
  • Mediums usable for the culture include sugars and carbohydrates (eg glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose), oils and fats (eg soybean oil, sunflower seed oil, Peanut oil and coconut oil), fatty acids (eg palmitic acid, stearic acid and linoleic acid), alcohols (eg glycerol and ethanol), organic acids (eg acetic acid), etc. are individually used or Alternatively, two or more may be mixed and used, but is not limited thereto.
  • Nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds (e.g. peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor, soybean meal, and urea), inorganic compounds (e.g.
  • ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and nitric acid may be used individually or in combination of two or more selected from the group consisting of, etc., but is not limited thereto.
  • a phosphorus source one or more selected from the group consisting of potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, and sodium-containing salts corresponding thereto may be used individually or in combination of two or more, but is not limited thereto.
  • the medium may contain essential growth-promoting substances such as other metal salts (eg, magnesium sulfate or iron sulfate), amino acids, and/or vitamins.
  • the step of recovering pantothenic acid and/or pantoic acid may include collecting a desired amino acid from a culture medium, a culture medium, or a microorganism using an appropriate method known in the art according to a culture method.
  • the recovering may be performed by one or more methods selected from centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, and HPLC.
  • the method for recovering pantothenic acid and/or pantoic acid may additionally include a purification step before, simultaneously with, or after it.
  • a variant of 3-methyl-2ketobutanoate hydroxy methyltransferase is provided, and a technique for increasing pantothenic acid and/or pantoic acid production ability of microorganisms using the variant is provided.
  • the productivity of pantothenic acid and / or pantoic acid is improved or the ability to produce pantothenic acid and / or pantoic acid is imparted technology is provided.
  • PCR was performed using the primer sequences in Table 1 as a template, and DNA encoding 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase Fragments were amplified.
  • the PCR was performed using PfuUltraTM high-confidence DNA polymerase (Stratagene), denaturation 95° C., 30 seconds; Annealing 55° C., 30 seconds; And the polymerization reaction was carried out under the condition of repeating 30 times at 72°C for 1 minute. As a result, a DNA fragment (panB) encoding each 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase was obtained.
  • PCR was performed in the same manner as described above using the primers of SEQ ID NOs: 27 and 28 using Corynebacterium glutamicum (ATCC13032) genomic DNA as a template, , a promoter DNA fragment was obtained.
  • pECCG117 (Korean Patent No. 10-0057684) vector heat-treated at 65 ° C for 20 minutes and the obtained DNA fragments (each panB and PLM1 promoter) were prepared at a molar concentration (M) of 2: 1: 1 (pECCG117 vector: panB: PLM1) was obtained by cloning using TaKaRa's Infusion Cloning Kit according to the provided manual, and the name of the obtained plasmid and introduced gene information are indicated in Table 1 above did
  • pantothenic acid productivity of the panB-expressing strains derived from various foreign microorganisms obtained in Example 2 the parent strain (non-transformed strain) was placed in a 250 ml corner-bubble flask containing 25 ml of production medium having the following composition. And after inoculating each of the above strains, pantothenic acid was prepared by shaking culture at 32 ° C. for 48 hours at 200 rpm.
  • Pantothenic acid concentration (g/L) L-valine concentration (g/L) ATCC13032 (wild type) 0.0 2.4 ATCC13032 pECCG117-panB(EC) 1.2 1.5 ATCC13032 pECCG117-panB (BS) 0.5 1.9 ATCC13032 pECCG117-panB (PA) 0.6 2.0 ATCC13032 pECCG117-panB(SR) 0.7 1.8 ATCC13032 pECCG117-panB(SP) 0.3 2.2 ATCC13032 pECCG117-panB (PR) 0.7 1.9 ATCC13032 pECCG117-panB(PT) 0.7 2.0 ATCC13032 pECCG117-panB (CB) 0.7 2.0 ATCC13032 pECCG117-panB (ECl) 0.6 2.1 ATCC13032 pECCG117-panB (AP) 0.6 1.9 ATCC13032 pECCG117-panB (SE) 0.5 2.0 ATCC13032 pECCG117-panB (SF)
  • the parent strain Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
  • panB-expressing Corynebacterium glutamicum strains derived from all foreign microorganisms tested average about 0.6 g /L of pantothenic acid was produced.
  • ATCC13032 pECCG117-panB(EC) which is an E. coli-derived panB expression strain, showed the highest pantothenic acid productivity (1.2 g/L) among strains expressing PanB derived from foreign microorganisms.
  • Example 1 The above results show that all of the 13 microorganism-derived enzymes (3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase) selected in Example 1 have the ability to produce pantothenic acid, and among them, the enzyme derived from Escherichia coli is particularly It shows that it has a high pantothenic acid production ability.
  • Example 4 Production of microorganisms of the genus Corynebacterium into which 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase gene derived from Escherichia coli was introduced
  • panB 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase encoding gene
  • a vector for deleting panB present in the parent strain was constructed.
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 29 and 30 and SEQ ID NOs: 31 and 32 using the genomic DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template.
  • PCR was denatured at 95° C. for 30 seconds; Annealing 55° C., 30 seconds; And the polymerization reaction was carried out under the conditions of repeating 25 times at 72 °C for 1 minute.
  • gene fragments of 1000 bp in the upper part of the panB gene and 1000 bp in the lower part of the panB gene were respectively obtained, and each amplification product was purified using QIAGEN's PCR Purification kit and used as an insert DNA fragment for vector construction.
  • the pDZ (Korean Registered Patent No. 0924065) vector and DNA fragments were treated with restriction enzyme smaI and then heat-treated at 65 ° C. for 20 minutes.
  • a vector pDZ_ ⁇ panB for deletion of the panB gene on the chromosome was constructed by cloning at a molar concentration (M) of 2:1:1 using an Infusion Cloning Kit from TaKaRa according to the provided manual.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 33 and 34 using the plasmid pECCG117-panB(EC) prepared in Example 2 as a template. PCR was denatured at 95° C. for 30 seconds; Annealing 55° C., 30 seconds; and polymerization reaction at 72° C. for 1 minute was repeated 25 times, and as a result, a DNA fragment of 1077 bp was obtained. After treatment with the restriction enzyme smaI, the pDZ_ ⁇ panB vector heat-treated at 65 ° C.
  • a vector pDZ_ ⁇ panB::PLM1-panB(EC) was constructed to introduce the panB gene derived from Escherichia coli into the chromosome.
  • the constructed vectors pDZ_ ⁇ panB and pDZ_ ⁇ panB::panB(EC) were transformed into Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 through electroporation, respectively, and a strain in which panB was deleted on the chromosome through a secondary crossing process ( ⁇ panB strain) and a strain into which E. coli-derived panB was introduced ( ⁇ panB::panB(EC)), respectively.
  • ⁇ panB strain a strain into which E. coli-derived panB was introduced
  • Proper substitution of E. coli-derived panB was confirmed using the MASA (Mutant Allele Specific Amplification) PCR technique (Takeda et al., Hum. Mutation, 2, 112-117 (1993)) using the following primer combination.
  • the primary determination was made by selecting the strain to be amplified, and the panB sequence of the selected strain was determined by the primers of SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36. Secondary confirmation was made by analyzing using the combination.
  • pantothenic acid productivity of the mutant strains obtained as described above the wild type strain of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, the ⁇ panB strain, and After inoculating the ⁇ panB::panB(EC) mutant strain, pantothenic acid was prepared by culturing at 32° C. for 48 hours with shaking at 200 rpm.
  • Pantothenic acid concentration g/L
  • L-valine concentration g/L
  • ATCC13032 wild type
  • panB wild-type and panB-deficient ( ⁇ panB) strains of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 produce little or no pantothenic acid, whereas mutants expressing foreign panB Corynebacterium Glutamicum ( ⁇ panB::panB(EC)) produced pantothenic acid at a concentration of 0.4 g/l.
  • Example 5 Creation of random mutant strains through artificial mutagenesis (NTG-based mutagenesis) and selection of panB producing strains
  • the mutant strain Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ⁇ panB::panB expressing E. coli-derived panB prepared according to Example 4 was prepared by using the following method to obtain a microbial mutant with improved pantothenic acid production ability.
  • (EC) Mutation of microorganisms was induced using the strain as a mother strain.
  • the Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ⁇ panB :: panB (EC) strain was activated by culturing in an activation medium for 16 hours, inoculated into a seed medium sterilized at 121 ° C. for 15 minutes and cultured for 14 hours, 5 ml of culture was recovered. After washing the recovered culture medium with 100 mM citric buffer, NTG (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) was added to a final concentration of 200 mg/l and treated for 20 minutes, Washed with 100 mM phosphate buffer. As a result of measuring the killing rate by smearing the NTG-treated strain on the minimum medium, the killing rate was found to be 85%.
  • Corynebacterium glutamicum CJVB5-01 Corynebacterium glutamicum, CJVB5-01
  • CJVB5-02 Corynebacterium glutamicum, CJVB5-02
  • composition of the medium used in this example is as follows.
  • Glucose 1.0%, Ammonium sulfate 0.4%, Magnesium sulfate 0.04%, Potassium phosphate 0.1%, Urea 0.1%, Thiamine 0.001%, Biotin 200 ⁇ g/l, Agar 2%, pH 7.2
  • Pantothenic acid concentration (g/L) L-valine concentration (g/L) ATCC13032 ⁇ panB 0.0 2.4 ATCC13032 ⁇ panB ::panB(EC) 0.3 1.4 CJVB5-01 1.2 1.0
  • Pantothenic acid concentration (g/L) L-valine concentration (g/L) ATCC13032 ⁇ panB ::panB(EC) 0.3 0.9 CJVB5-02 1.7 0.2
  • the Corynebacterium glutamicum ⁇ panB strain did not produce pantothenic acid, and the Corynebacterium glutamicum CJVB5-01 mutant and the CJVB5-02 mutant strain had foreign panB inserted.
  • the pantothenic acid production ability was superior.
  • the decrease in the concentration of valine, a substance that uses 3-methyl-2-oxobutanoate as a substrate confirmed that the pantothenic acid-producing ability of the CJVB5-1 mutant strain and the CJVB5-02 mutant strain was much stronger than that of the wild type.
  • the inserted E. coli panB gene showed a G116A mutation ( It was confirmed that G (Gly), which is the 116th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 was substituted with A (Ala)) to encode a mutant introduced therein.
  • G (Gly) which is the 116th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 was substituted with A (Ala)
  • a (Ala) A
  • amino acid mutations using amino acid positions such as 'G116A', is understood to mean amino acid mutations and/or genetic mutations that induce such amino acid mutations.
  • the amino acid sequence of the E. coli 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase mutant introduced with the G116A mutation is shown in SEQ ID NO: 62.
  • the inserted E. coli panB gene had an A159L mutation ( It was confirmed that A (Ala, alanine), an amino acid residue corresponding to the 159th residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, was mutated to encode a mutant in which L (Leu, leucine) was introduced.
  • an amino acid mutation indication using an amino acid position such as 'A159L', is understood to mean an amino acid mutation and/or a genetic mutation inducing such an amino acid mutation.
  • SEQ ID NO: 110 shows the amino acid sequence of the E. coli 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxy methyltransferase mutant introduced with the A159L mutation.
  • Example 2 Using pECCG117-panB(EC) prepared in Example 2 (see Table 1) as a template and using the primers shown in Table 6 below, G (Gly), the amino acid at position 116 of E. coli PanB (SEQ ID NO: 37) A mutant was prepared by introducing a random mutation (Saturated mutagenesis) in which a different amino acid was substituted (ie, a panB gene mutated to encode E. coli PanB into which the random mutation was introduced) was introduced. In addition, using the primers shown in Table 7 below, a random mutant was prepared in which A (Ala), an amino acid at position 159 of E. coli PanB (SEQ ID NO: 37), was substituted with another amino acid.
  • G Gly
  • a mutant was prepared by introducing a random mutation (Saturated mutagenesis) in which a different amino acid was substituted (ie, a panB gene mutated to encode E. coli PanB into which the random mutation was introduced) was introduced.
  • PCR was performed using pECCG117-panB(EC) prepared in Example 2 (see Table 1) as a template using the primers shown in Tables 6 and 7 above.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase SolGent co., Ltd.
  • PCR was denatured at 95 ° C for 10 minutes, denatured at 95 ° C for 30 seconds, annealed at 55 ° C for 30 seconds, and polymerized at 72 ° C for 1 minute. After repeating 25 times, the polymerization reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes.
  • the pECCG117 (Korean Registered Patent No. 10-0057684) vector, which was treated with the restriction enzyme BamHI and then heat-treated at 65 ° C. for 20 minutes, and each of the obtained DNA fragments (residue 116: 610 bp DNA fragment of the 5' upstream region and DNA fragment of 470 bp in the 3' downstream region, residue 159: a 477 bp DNA fragment in the 5' upstream region and a DNA fragment of 318 bp in the 3' downstream region) at a molar concentration (M) of 2: 1: 1
  • M molar concentration
  • a plasmid for introducing mutant panB was obtained by cloning according to the provided manual using an Infusion Cloning Kit from TaKaRa.
  • PCR was performed in the same manner as described above using primers of SEQ ID NOs: 108 and 109 using Corynebacterium glutamicum (ATCC13032) genomic DNA as a template, , a promoter DNA fragment was obtained.
  • Mutant plasmids prepared in Example 6 (Tables 8 and 9) and pECCG117-panB (WT-EC) (Table 1) were respectively introduced into the ATCC13032 ⁇ panB strain prepared in Example 4 by electric pulse method, followed by 25 mg of kanamycin.
  • a total of 19 transformed mutant strains introduced with each random mutation (Saturated Mutagenesis) were obtained by plating in a selection medium containing /l. Thereafter, the flask was evaluated in the same manner as in Example 3, and the resulting pantothenic acid producing ability was measured. The obtained results are shown in Tables 10 and 11:
  • the ATCC13032 ⁇ panB strain did not produce pantothenic acid, whereas E. coli PanB (wild type) or its variant strains were all capable of producing pantothenic acid.
  • the mutants introduced with the G116S, G116C, G116L, G116I, G116T, G116V, G116D, G116E, G116N, G116A, G116M, or G116Q mutations are ATCC 13032 ⁇ panB pECCG117-panB (WT ) produced pantothenic acid at higher levels compared to As a result, both the wild-type and mutant types of E.
  • coli PanB have an effect of increasing pantothenic acid production, and in particular, the 116th amino acid residue of PanB (SEQ ID NO: 37) is an important position for pantothenic acid production, and the amino acid at this position can be converted into various amino acids different from the original. It was confirmed that the production ability of pantothenic acid was further increased when substituted with .
  • the ATCC 13032 ⁇ panB pECCG117-panB (G116A) strain (named Corynebacterium glutamicum CV03-5001), which was confirmed to have the best pantothenic acid production ability in this example, was published on June 8, 2020 at Korea Microorganism, located in Hongje-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea. It was deposited at the preservation center and given the accession number of KCCM12744P.
  • the wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 strain did not produce pantothenic acid, whereas all of the 19 mutant strains produced showed pantothenic acid-producing ability, among which wild-type panB
  • the amino acids corresponding to the 159th residue of (SEQ ID NO: 37) are arginine (R), serine (S), tyrosine (Y), cysteine (C), proline (P), histidine (H), leucine (L), isoleucine (I), threonine (T), lysine (K), valine (V), methionine (M), aspartic acid (D), glutamic acid (E), asparagine (N), or glutamine (Q) mutant strains , compared to the ATCC 13032 pECCG117-panB (WT) strain containing wild-type panB, and produced pantothenic acid at a high level.
  • panB As a result, it was confirmed that the amino acid residue corresponding to the 159th residue of panB (SEQ ID NO: 37) is an important position for pantothenic acid production, and when the amino acid at this position is substituted with various amino acids different from the original, the pantothenic acid production ability is further increased. was able to confirm
  • the ATCC 13032 ⁇ panB pECCG117-panB (A159L) strain which was confirmed to have the best pantothenic acid production ability in this example, was named CV03-5002 and was transferred to the Korea Microorganism Conservation Center located in Hongje-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea on April 13, 2021. It was deposited and given the accession number of KCCM12973P.
  • Example 8 Production and evaluation of mutant 3-methyl-2ketobutanoate hydroxymethyltransferase with improved pantothenic acid production ability
  • pECCG117-panB (A159L) prepared in Example 2 was used as a template and the primers of SEQ ID NOs: 74 and 126 and SEQ ID NOs: 77 and 127 were used as described in Example 2.
  • a vector containing both G116A and A159L was constructed.
  • the prepared mutant plasmid pECCG117-panB (G116A, A159L) was introduced into the wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain by electric pulse method and then plated on a selection medium containing 25 mg/L of kanamycin to obtain each transformant. Acquired. Thereafter, the flask was evaluated in the same manner as in Example 2, and the resulting pantothenic acid producing ability was measured. The obtained results are shown in Table 12 below.
  • Pantothenic acid production ability of mutant strains including G116A and A159L strain Pantothenic acid (g/L) batch 1 batch 2 batch 3 Average ATCC 13032 0.0 0.0 0.0 0 ATCC 13032 pECCG117-panB (WT) 0.7 0.7 0.6 0.67 ATCC 13032 pECCG117-panB (A159L) 2.9 2.8 3.1 2.93 ATCC 13032 pECCG117-panB (G116A) 2.2 2.4 2.1 2.23 ATCC 13032 pECCG117-panB (G116A, A159L) 3.9 3.7 3.7 3.77
  • the ATCC 13032 strain does not produce pantothenic acid, while the mutants containing both the amino acid mutation corresponding to the 116th residue and the amino acid mutation corresponding to the 159th residue of panB include wild-type panB. It produced pantothenic acid at a high level compared to the ATCC 13032 pECCG117-panB (WT) strain, and produced pantothenic acid at a higher level than mutant strains containing A159L or G116A mutations.
  • panB amino acid residues corresponding to the 116th and 159th residues of panB are important positions for pantothenic acid production, and when the amino acids at these positions are substituted with amino acids different from the original ones, it can be confirmed that the production ability of pantothenic acid is further increased. there was.

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Abstract

3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 변이체, 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성이 강화된 미생물, 상기 미생물을 포함하는 판토텐산 및/또는 판토산 생산용 조성물, 및 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 판토텐산 및/또는 판토산 제조 방법이 제공된다.

Description

3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도
관련 출원(들)과의 상호 인용
본 출원은 2021년 5월 10일자 대한민국 특허출원 제10-2021-0060009호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 대한민국 특허출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 변이체, 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 상기 미생물을 포함하는 판토텐산 및/또는 판토산 생산용 조성물, 및 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 판토텐산 및/또는 판토산 제조 방법이 제공된다.
판토텐산(pantothenic acid)은 비타민 B 복합체에 속하는 물질로 비타민 B5라고도 불리며, 화장품, 의약, 사람 영양물, 동물 영양물 등에 다양하게 응용되고 있는 상업적으로 중요한 물질 중 하나이다. 판토텐산은 판토산(pantonic acid)에 베타-알라닌이 아미드 결합으로 연결된 구조이다.
판토텐산 또는 판토산은 화학적으로 합성하여 제조하거나, 적합한 배지에서 적합한 미생물을 발효시킴으로써 생물공학적으로 제조할 수 있다. 미생물을 이용하는 생물공학적 제조 방법의 이점은 목적하는 입체-이성체성 D-형태의 판토텐산 또는 판토산이 형성된다는 것이다.
이에, 생물공학적으로 판토텐산 및/또는 판토산을 제조하는데 유리한 효과를 갖는 미생물 및 이를 이용하여 판토텐산 및/또는 판토산을 고효율로 제조하는 기술의 개발이 요구된다.
(선행기술문헌)
(특허문헌)
(선행문헌 1) 미국 등록특허 제7718205호
본 출원의 일 예는 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase) 활성을 가지는 폴리펩타이드를 제공한다. 일 구체예에서, (1) 상기 폴리펩타이드는 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 다른 구체예에서, (2) 상기 폴리펩타이드는 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, N-말단으로부터 116번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기와 같이 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 아미노산을 계수하는 것은, 개시코돈으로부터 번역된 메티오닌(Met, M)을 1번째 아미노산으로 하여 계수하는 것을 의미할 수 있다.
다른 예는, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 예는, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는, 발현 벡터일 수 있다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 (하나, 둘, 또는 모두)을 포함하고, 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase)의 활성이 강화된, 판토텐산 또는 판토산을 생산하는 미생물을 제공한다.
상기 미생물은,
(1) 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 (하나, 둘, 또는 모두); 또는,
(2) 상기 (1), 및 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 116번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 (하나, 둘, 또는 모두)을 포함하는 것일 수 있다.
상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물 또는 에세리키아 속 미생물일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
다른 예는, 상기 미생물을 포함하는, 판토텐산 또는 판토산 생산용 조성물을 제공한다.
다른 예는, 상기 미생물을 판토텐산 및/또는 판토산의 생산에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
다른 예는, 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 판토텐산 또는 판토산의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 상기 배양하는 단계 이후에, 배양된 미생물, 배지, 또는 이들 모두로부터 판토텐산 또는 판토산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서는 판토텐산 및/또는 판토산 생산능을 향상시킬 수 있는 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 또는 이의 변이체를 탐색하고, 이를 미생물에 도입함으로써, 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 우수한 재조합 균주를 제공하고자 한다.
본 명세서에서, 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물이 판토텐산 생산능이 우수함을 확인하고, 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 특정 위치에 아미노산 치환 변이가 도입되는 경우, 판토텐산 생산능이 보다 증가하는 것을 확인하였다.
일 예는 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, N-말단으로부터 116번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기와 같이 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 아미노산을 계수하는 것은, 개시코돈으로부터 번역된 메티오닌(Met, M)을 1번째 아미노산으로 하여 계수하는 것을 의미할 수 있다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 상기 폴리펩타이드의 발현 벡터로서 사용될 수 있다.
다른 예는 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물을 제공한다. 상기 미생물은 판토텐산 또는 판토산을 생산하는 미생물일 수 있다.
상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화되는 것은, 미생물 내재의 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제가 변이되거나, 또는 외래의 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 또는 이의 변이체가 도입됨으로써 강화되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 활성이 강화된 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제는 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는, 상기 활성이 강화된 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제는 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, N-말단으로부터 116번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물은,
(1) 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상; 또는
(2) 상기 (1), 및 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 116번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물은, 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제가 강화되지 않은 (예컨대, 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 159번째 잔기에 상응하는 아미노산 및/또는 116번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되지 않은) 동종 미생물과 비교하여, 높은 판토텐산 및/또는 판토산의 생산능을 가질 수 있다.
다른 예는 상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물을 포함하는 판토텐산 및/또는 판토산 생산용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 판토텐산 및/또는 판토산 생산 방법을 제공한다.
이하, 보다 상세히 설명한다.
폴리펩타이드
본 명세서에서, 판토텐산(pantothenic acid; e.g., D-판토텐산)은 화학식 1의 구조를 갖는 화합물로서, 판토산(pantoic acid)에 β-알라닌이 아미드 결합으로 연결된 비타민(비타민 B5)이고, 보조효소 A(coenzyme A, CoA)와 아실기 운반 단백질(acyl carrier protein, ACP)의 구성성분이며, 생물체의 각종 대사 작용에 관여한다.
Figure PCTKR2022003845-appb-img-000001
(화학식 1: 판토텐산)
판토산(pantoic acid; e.g., D-판토산)은 화학식 2의 구조를 갖는 화합물로서, 다양한 생물학적 활성 화합물의 구성성분이다:
Figure PCTKR2022003845-appb-img-000002
(화학식 2: 판토산)
본 명세서에서, 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase)는 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트, 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트, 및 물로부터 테트라하이드로폴레이트 및 2-디하이드로판토에이트를 생합성하는 과정을 촉매하는 효소이다.
일 구체예에서, 상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제는 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 또는 삽입된 변이가 도입된 변이체일 수 있다.
일 예에서, 상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 변이체는 서열번호 37의 아미노산 서열에서 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산, 즉, 아르기닌(R), 히스티딘(H), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 시스테인(C), 프롤린(P), 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 타이로신(Y), 페닐알라인(F), 트립토판(W), 및 글라이신(G)으로 이루어진 군에서 선택되고, 원래의 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 변이체는 서열번호 37의 아미노산 서열에서 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산, 즉, 아르기닌(R), 히스티딘(H), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 시스테인(C), 프롤린(P), 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M) 또는 타이로신(Y)으로 치환된 것일 수 있다. 상기 변이체 중 서열번호 37의 아미노산 서열에서 159째 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산을 제외한 일부 아미노산 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가되더라도 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성을 나타내는 한 본 출원의 변이체에 포함될 수 있음은 자명하다.
또한, 일 예에서 상기 변이체는 서열번호 37로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열에서 서열번호 37의 아미노산 서열의 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 즉 서열번호 37의 아미노산 서열의 159번째 잔기에 상응하는 위치에서 다른 아미노산으로의 치환을 포함하고 서열번호 37의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상, 100% 미만의 서열 상동성 또는 동일성을 가지며 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드는 본 출원의 변이체에 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 변이체는 서열번호 110 내지 서열번호 125 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열번호 110 내지 서열번호 125 중에서 선택된 어느 하나의 서열로 이루어진 변이체에서 159번째 잔기에 상응하는 아미노산을 제외한 일부 아미노산 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가되더라도 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성을 나타내는 한 본 출원의 변이체에 포함될 수 있음은 자명하다. 또한, 일 예에서 상기 변이체는 서열번호 37의 아미노산 서열의 159번째 잔기에 상응하는 아미노산은 고정되고 서열번호 110 내지 서열번호 125 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 즉 서열번호 37의 아미노산 서열의 159번째 잔기에 상응하는 위치에서 다른 아미노산으로의 치환을 포함하고 서열번호 110 내지 서열번호 125 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상, 100% 미만의 서열 상동성 또는 동일성을 가지는 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드는 본 출원의 변이체에 포함될 수 있다.
일 예에서, 상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 변이체는,
(1) 서열번호 37의 아미노산 서열에서 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 159번째 잔기에 상응하는 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산, 즉, 아르기닌(R), 히스티딘(H), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 시스테인(C), 프롤린(P), 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M) 및 타이로신(Y)으로 이루어진 군에서 선택되고, 원래의 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환되고, 및
(2) 서열번호 37의 아미노산 서열에서 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 116번째 잔기에 상응하는 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산, 즉 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 시스테인(C), 알라닌(A), 발린(V), 이소류신(I), 류신(L) 및 메티오닌(M)으로 이루어지는 군에서 선택되고, 원래의 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
상기 변이체 중 서열번호 37의 아미노산 서열에서 159번째 잔기에 상응하는 아미노산 잔기 및 116번째 잔기에 상응하는 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산을 제외한 일부 아미노산 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가되더라도 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성을 나타내는 한 본 출원의 변이체에 포함될 수 있음은 자명하다.
또한, 일 예에서 상기 변이체는 서열번호 37로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열에서, (1) 서열번호 37의 아미노산 서열의 159번째 잔기에 상응하는 아미노산 및 (2) 서열번호 37의 아미노산 서열의 116번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 즉 (1) 서열번호 37의 아미노산 서열의 159번째 잔기에 상응하는 위치 및 (2) 서열번호 37의 아미노산 서열의 116번째 잔기에 상응하는 위치에서 다른 아미노산으로의 치환을 포함하고 서열번호 37의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상, 100% 미만의 서열 상동성 또는 동일성을 가지며 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드는 본 출원의 변이체에 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 변이체는 서열번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열번호 128의 아미노산 서열로 이루어진 변이체에서 (1) 159번째 잔기에 상응하는 아미노산 및 (2) 116번째 잔기에 상응하는 아미노산을 제외한 일부 아미노산 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가되더라도 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성을 나타내는 한 본 출원의 변이체에 포함될 수 있음은 자명하다. 또한, 일 예에서 상기 변이체는 (1) 서열번호 37의 아미노산 서열의 159번째 잔기에 상응하는 아미노산 및 (2) 서열번호 37의 아미노산 서열의 116번째 잔기에 상응하는 아미노산은 고정되고 서열번호 128의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 즉 (1) 서열번호 37의 아미노산 서열의 159번째 잔기에 상응하는 위치 및 (2) 서열번호 37의 아미노산 서열의 116번째 잔기에 상응하는 위치에서 다른 아미노산으로의 치환을 포함하고 서열번호 128의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상, 100% 미만의 서열 상동성 또는 동일성을 가지는 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드는 본 출원의 변이체에 포함될 수 있다.
미생물
본 명세서에서,
(1) 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상; 또는
(2) 상기 (1), 및 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 116번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는,
판토텐산 또는 판토산을 생산하는 미생물을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물"은 앞서 설명한 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 발현하도록 조작(변이)됨으로써, 판토텐산 및/또는 판토산 생산능이 없던 미생물이 판토텐산 및/또는 판토산 생산능을 갖게 되거나, 본래의 판토텐산 및/또는 판토산 생산능보다 높은 판토텐산 및/또는 판토산 생산능을 갖게된 것일 수 있다. 본 명세서에서 "미생물"은 단세포 박테리아를 포괄하는 것으로, "세포"와 혼용될 수 있다. 본 명세서에서, 상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드 발현하도록 변이되기 전의 미생물을 상기 변이된 미생물과 구별하기 위하여, "모균주 (parent microorganism or parent strain) 또는 숙주 세포 (host cell)"로 표현될 수 있다.
일 예에서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 (the genus　Corynebacterium) 미생물, 에세리키아 속 (Escherichia) 미생물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium　glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium　thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium　efficiens) 등을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 더욱 구체적으로는, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium　glutamicum)일 수 있다. 상기 에세리키아 속 균주는 대장균 (Escherichia coli)일 수 있다.
본 명세서에서, 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물은 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제를 암호화하는 유전자가 도입된 것일 수 있다.
본 명세서에서, "3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물"은 모균주가 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 발현하도록 하는 변이(조작)가 도입된, 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 발현하는 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 발현하도록 하는 변이는 앞서 설명한 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 모균주에 도입하는 것에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 이와 같이 모균주에 도입되는 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 모균주 내재의 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 암호화 유전자를 대체하거나 이에 더하여 추가로 포함되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 발현하는 미생물은 기탁번호 KCCM12973P (Corynebacterium glutamicum CV03-5002로 명명)인 것일 수 있다.
본 명세서에서, 폴리뉴클레오타이드("유전자"와 혼용될 수 있음) 또는 폴리펩타이드("단백질"과 혼용될 수 있음)가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다, 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다, 또는 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 표현된다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것(또는 상기 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다.
일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 이들의 본래의 기능 또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 통상적인 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법(direct evolution) 및/또는 부위특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis) 등에 의하여 변형된 것을 포함할 수 있다. 일 예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다 또는 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 (i) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하거나, 또는 (ii) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 목적하는 기능은 미생물의 판토텐산 및/또는 판토산 생산능을 증가시키거나 부여하는 기능을 의미할 수 있다.
본 명세서에 기재된 핵산 서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질(라이신 배출 단백질)을 발현시키고자 하는 미생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열 및/또는 기능을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "상동성(identity)"은 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율(%)로 표시될 수 있다. 핵산 서열에 대한 상동성의 경우, 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST(참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993)나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
일 예에서, 본 명세서에 제공되는 특정 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 특정 핵산 서열 또는 이와 실질적으로 동등한 핵산 서열뿐만 아니라, 상기 특정 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 구체적으로, 상기 상보성을 가지는 폴리뉴클레오타이드는 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절 가능한 Tm 값, 예컨대, 55℃, 60℃, 63℃ 또는 65℃의 Tm 값에서 혼성화하고, 후술하는 조건에서 분석할 수 있다: 이러한 조건은 공지의 문헌에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 높은 상보성을 갖는 유전자끼리 혼성화하고, 그보다 낮은 상보성을 갖는 유전자끼리는 혼성화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1x SSC(saline-sodium citrate buffer), 및 0.1%(w/v) SDS (Sodium Dodecyl Sulfate); 60℃, 0.1x SSC, 및 0.1% SDS; 또는 68℃, 0.1x SSC, 및 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세척하는 조건을 등을 열거할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 혼성화에는 두 개의 뉴클레오타이드가 상보적 서열을 가질 것을 요구되거나, 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 허용될 수 있다. 상기 용어 "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오타이드 염기 간의 관계를 기술하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, DNA의 경우, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 폴리뉴클레오타이드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오타이드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고, 이는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다 (Sambrook et al., supra,9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
상기 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "형질전환"은 특정 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 과정으로 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내에서 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다. 일 예로 형질전환은 표적 단백질(외래 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드나 이를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 그 도입되는 형태는 제한이 없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및/또는 번역 종결신호 등의 발현 조절 요소를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다. 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 발현조절 요소가 목적 단백질(외래 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 전사 조절 (예, 전사 개시)를 수행할 수 있도록 발현조절 요소 (예, 프로모터)와 폴리뉴클레오타이드가 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미할 수 있다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 수행할 수 있으며, 예컨대, 통상적인 부위-특이적 DNA 절단 및 연결에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포(미생물) 내로 도입하는 어떠한 방법으로도 수행 가능하며, 숙주 세포에 따라 당 분야에서 공지된 형질전환 기술을 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 상기 공지된 형질전환 방법으로 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전법, 염화칼슘 (CaCl2) 침전법, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 리포펙션(lipofection), 초산 리튬-DMSO법 등이 예시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 유전체 (염색체) 내 도입 (삽입)은 공지된 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템 (RNA-guided endonuclease system 또는 CRISPR system; 예컨대, (a) RNA-가이드 엔도뉴클레아제(예, Cas9 단백질 등), 이의 암호화 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터; 및 (b) 가이드 RNA (예, single guide RNA (sgRNA) 등), 이의 암호화 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는 혼합물(예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA의 혼합물 등), 복합체 (예컨대, 리보핵산 융합단백질 (RNP), 재조합 벡터 (예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 암호화 유전자 및 가이드 RNA 암호화 DNA를 포함하는 함께 포함하는 벡터 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및/또는 전사 및/또는 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 세포 내로 형질전환된 후, 숙주 세포의 게놈(유전체)과 무관하게 발현되거나, 숙주 세포의 게놈 내에 통합될 수 있다.
본 명세서에서 사용가능한 벡터는 숙주 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 통상 사용되는 모든 벡터들 중에서 선택될 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 등을 들 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터로서, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는　pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용 가능한 벡터는 공지된 발현 벡터 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 염색체 내 삽입용 벡터일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 염색체 내 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합 또는 CRISPR 시스템에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 벡터는 상기 염색체 내 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 상기 폴리뉴클레오타이드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 유전자들 중에서 선택되어 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
다른 예는, 상기 미생물을 포함하는, 판토텐산 또는 판토산 생산용 조성물을 제공한다.
다른 예는, 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 판토텐산 또는 판토산의 제조 방법을 제공한다.
다른 예는 미생물의 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성을 강화시키는 단계를 포함하는, 상기 미생물의 판토텐산 및/또는 판토산 생산능을 증가시키는 방법, 또는 상기 미생물에 판토텐산 생산능을 부여하는 방법을 제공한다.
상기 미생물의 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성을 강화시키는 단계는 상기 미생물에 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 발현하도록 하는 변이를 도입하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 변이를 도입하는 단계는 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드의 암호화 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 도입(형질전환)시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 상기한 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성이 강화된 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 판토텐산 및/또는 판토산의 생산 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 배양하는 단계 이후에, 상기 배양된 미생물, 배지, 또는 이들 모두로부터 판토텐산 및/또는 판토산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
　상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45℃, 또는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 판토텐산 및/또는 판토산은　배지　중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
상기 배양에 사용 가능한 배지는 탄소 공급원으로 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올), 유기산 (예: 아세트산) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한,　상기 배지는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산, 및/또는 비타민 등과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
상기 판토텐산 및/또는 판토산을 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지, 배양액, 또는 미생물로부터 목적하는 아미노산을 수집하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 회수하는 단계는 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화, HPLC 등에서 선택된 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있다. 상기 판토텐산 및/또는 판토산을 회수하는 방법은, 그 이전, 동시, 또는 그 이후에, 정제단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서는 3-메틸-2케토뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 변이체를 제공하며, 이를 이용하여 미생물의 판토텐산 및/또는 판토산의 생산능을 증가시키는 기술이 제공된다. 상기 3-메틸-2케토뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 변이체를 발현하도록 하는 변이를 미생물에 도입함으로써, 판토텐산 및/또는 판토산의 생산성을 향상시키거나 판토텐산 및/또는 판토산 생상능을 부여할 수 있는 기술이 제공된다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1. 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 유전자 탐색 및 선별
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 암호화 유전자(panB)를 query로 설정하여 NCBI BLAST 탐색 결과, 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 암호화 유전자 활성을 가질 것으로 추정되는 후보 유전자들과 이들을 보유한 미생물들을 선별하였다. 그 중 생물안전도(biosafety level)가 1 등급인 미생물 유래의 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 암호화 유전자들을 선별하고, 이를 표 1에 정리하였다:
3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 암호화 유전자를 보유하고 있을 것으로 추정되는 미생물 및 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 유전자 선별에 사용된 프라이머/플라스미드
미생물명 KCTC
Accession No.		 프라이머 플라스미드
1 Escherichia coli ATCC47076 서열번호 1, 2 pECCG117-panB(EC)
2 Bacillus subtilis KCTC3135(ATCC 6051) 서열번호 3, 4 pECCG117-panB(BS)
3 Pantoea agglomerans KCTC2564(ATCC27155) 서열번호 5, 6 pECCG117-panB(PA)
4 Serratia rubidaea KCTC2927(ATCC27593) 서열번호 7, 8 pECCG117-panB(SR)
5 Serratia proteamaculans KCTC2936(ATCC19323) 서열번호 9, 10 pECCG117-panB(SP)
6 Pseudomonas resinovorans KCTC12498(ATCC14235) 서열번호 11, 12 pECCG117-panB(PR)
7 Pedobacter terrae KCTC12762(DSM17933) 서열번호 13, 14 pECCG117-panB(PT)
8 Citrobacter bitternis KCTC42139(JCM30009) 서열번호 15, 16 pECCG117-panB(CB)
9 Enterobacter cloacae KCTC2519(ATCC23355) 서열번호 17, 18 pECCG117-panB(ECl)
10 Achromobacter piechaudii KCTC22890(ATCC43552) 서열번호 19, 20 pECCG117-panB(AP)
11 Staphylococcus epidermidis KCTC1917(ATCC12228) 서열번호 21, 22 pECCG117-panB(SE)
12 Shigella flexneri KCTC12073 서열번호 23, 24 pECCG117-panB(SF)
13 Corynebacterium glutamicum KCTC9097(ATCC13032) 서열번호 25, 26 pECCG117-panB(CG)
실시예 2. 외래 미생물 유래 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제가 도입된 코리네박테리움 속 미생물 제작
상기 실시예 1에서 확보된 미생물들의 게놈을 추출한 후, 이를 주형으로 표 1의 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 수행하여, 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제를 암호화하는 DNA 단편을 증폭하였다. 상기 PCR은 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하여 수행하였으며, 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 30회 반복하는 조건으로 수행하였다. 그 결과 각각의 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제를 암호화하는 DNA 단편(panB)을 획득하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 PLM1 프로모터를 확보하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC13032) 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 27와 28의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 바와 동일하게 PCR을 수행하여, 프로모터 DNA 단편을 획득하였다.
제한효소 BamHI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pECCG117 (대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 얻어진 DNA단편들 (각 panB, PLM1 프로모터)을 몰농도 (M) 2:1:1 (pECCG117 벡터:panB:PLM1)이 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고, 상기 획득된 플라스미드의 이름과 도입된 유전자 정보를 상기 표 1에 표기하였다.
제작된 13종의 벡터들을 전기천공법에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 형질전환하여, 외래 PanB(3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제)를 발현하는 균주들을 제작하였다
실시예 3. 외래 미생물 유래 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제가 발현되는 코리네박테리움 속 미생물의 판토텐산 생산능 조사
상기 실시예 2에서 얻어진 다양한 외래 미생물 유래의 panB 발현 균주들의 판토텐산 생산성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 조성으로 이루어진 생산배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바풀 플라스크에 모균주(비형질전환 균주) 및 상기 균주들을 각각 접종한 후, 32 ℃에서 48시간동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 판토텐산을 제조하였다.
<생산배지>
포도당 10%, 베타-알라닌 0.5%, 효모추출물 0.4%, 황산암모늄 1.5%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.05%, 황산철7수염 10 mg/l, 황산망간1수염 6.7 mg/l, 비오틴 50 μg/l, 티아민·HCl 100 μg/l, pH 7.2
상기 얻어진 배양액을 20,000 rcf에서 10분동안 원심분리 후 상등액을 TDW(triple distilled water)로 1/10 희석한 후 HPLC 분석을 수행하여 판토텐산 및 L-발린의 농도를 측정하고, 그 결과를 하기의 표 2에 나타내었다.
판토텐산 농도 (g/L) L-valine 농도 (g/L)
ATCC13032 (야생형) 0.0 2.4
ATCC13032 pECCG117-panB(EC) 1.2 1.5
ATCC13032 pECCG117-panB(BS) 0.5 1.9
ATCC13032 pECCG117-panB(PA) 0.6 2.0
ATCC13032 pECCG117-panB(SR) 0.7 1.8
ATCC13032 pECCG117-panB(SP) 0.3 2.2
ATCC13032 pECCG117-panB(PR) 0.7 1.9
ATCC13032 pECCG117-panB(PT) 0.7 2.0
ATCC13032 pECCG117-panB(CB) 0.7 2.0
ATCC13032 pECCG117-panB(ECl) 0.6 2.1
ATCC13032 pECCG117-panB(AP) 0.6 1.9
ATCC13032 pECCG117-panB(SE) 0.5 2.0
ATCC13032 pECCG117-panB(SF) 0.7 1.9
ATCC13032 pECCG117-panB(CG) 0.6 2.0
표 2에 나타난 바와 같이, 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032는 판토텐산을 생산하지 않는 반면, 시험된 모든 외래 미생물 유래의 panB 발현 코리네박테리움 글루타미쿰 균주들은 평균적으로 약 0.6 g/L의 판토텐산을 생산하였다. 특히, 외래 미생물 유래의 PanB의 발현 균주들 중에서 대장균 유래의 panB 발현 균주인 ATCC13032 pECCG117-panB(EC)가 가장 높은 판토텐산 생산성(1.2 g/L)을 보였다.
상기의 결과는 실시예 1에서 선별된 13종의 미생물 유래 효소(3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제)들이 모두 판토텐산 생산능을 보이며, 이 중에서도 대장균 유래의 효소가 특히 높은 판토텐산 생산능을 가짐을 보여준다.
실시예 4. 대장균 유래 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 미생물 제작
상기 실시예 3에서 특히 우수한 판토텐산 생산능을 가지는 것으로 확인된 대장균 유래의 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 암호화 유전자(panB)를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 도입하기 위한 플라스미드를 제작하였다.
먼저, 모균주에 존재하는 panB를 결손시키기 위한 벡터를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 29와 30 및 서열번호 31와 32의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55 ℃, 30초; 및 중합반응 72 ℃, 1분을 25회 반복하는 조건으로 수행하였다. 그 결과, panB 유전자 상단부위 1000 bp와 panB 유전자 하단부위 1000 bp의 유전자 단편을 각각 획득하였고, QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 각 증폭산물을 정제하여, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다.
제한효소 smaI으로 처리한 후 65 ℃에서 20분간 열처리한 pDZ(대한민국 등록 특허 번호 제0924065호) 벡터와 DNA 단편(panB 유전자 상단부위 1000 bp의 유전자 단편 및 panB 유전자 하단부위 1000 bp의 유전자 단편)을 몰농도 (M) 2:1:1이 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 panB 유전자를 염색체상에 결손하기 위한 벡터 pDZ_ΔpanB를 제작하였다.
대장균 유래 panB 유전자를 준비하기 위하여, 실시예 2에서 제작된 플라스미드 pECCG117-panB(EC)를 주형으로 하여 서열번호 33와 34의 프라이머를 이용하여 PCR하였다. PCR은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55 ℃, 30초; 및 중합반응 72 ℃, 1분을 25회 반복하여 수행하고, 그 결과 1077 bp의 DNA단편을 획득하였다. 제한효소 smaI으로 처리한 후 65 ℃에서 20분간 열처리한 pDZ_ΔpanB 벡터와 상기 얻어진 DNA 단편을 몰농도 (M) 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써, 대장균 유래의 panB 유전자를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDZ_ΔpanB::PLM1-panB(EC)를 제작하였다.
제작된 벡터 pDZ_ΔpanB와 pDZ_ΔpanB::panB(EC)를 전기천공법을 통해 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 panB가 결손된 균주(ΔpanB 균주)와 대장균 유래 panB가 도입된 균주(ΔpanB::panB(EC))를 각각 얻었다. 대장균 유래 panB의 적절한 치환 여부는 하기의 프라이머 조합을 사용하여 MASA(Mutant Allele Specific Amplification) PCR 기법(Takeda et al., Hum. Mutation, 2, 112-117 (1993))을 사용하여 확인하였다. 즉, 대장균 panB에 부합하는 프라이머 조합(서열번호 35와 28 및 서열번호 36와 1)에서는 증폭되는 균주를 선별함으로써 1차 결정하였으며, 선별된 균주의 panB 서열은 서열번호 35 및 서열번호 36의 프라이머 조합을 이용하여 분석함으로써 2차 확인하였다.
상기와 같이 얻어진 변이주들의 판토텐산 생산성을 확인하기 위하여, 생산배지 (실시예 3 참조) 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바풀 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 야생형 균주, ΔpanB 균주, 및 ΔpanB::panB(EC) 변이주를 접종한 후, 32 ℃에서 48시간동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 판토텐산을 제조하였다.
상기 얻어진 배양액을 20,000 rcf에서 10분동안 원심분리 후 상등액을 TDW(triple distilled water)로 1/10 희석한 후 HPLC 분석을 수행하여 판토텐산 및 L-발린의 농도를 측정하고, 그 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.
판토텐산 농도 (g/L) L-valine 농도(g/L)
ATCC13032 (야생형) 0.1 1.9
ATCC13032 ΔpanB 0.0 2.7
ATCC13032 ΔpanB ::panB(EC) 0.4 1.3
표 3에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 야생형 및 panB 결손 (ΔpanB) 균주는 판토텐산을 전혀 생산하지 못하거나 거의 생산하지 못하는 반면, 외래의 panB를 발현하는 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰(ΔpanB::panB(EC))은 0.4g/l의 농도로 판토텐산을 생산하였다.
실시예 5. 인공변이법(NTG 기반 변이)을 통한 무작위 돌연변이주 제작 및 panB 생산 균주 선별
본 실시예에서는 판토텐산의 생산능이 보다 더 향상된 미생물 변이주를 얻기 위해 하기와 같은 방법을 사용하여, 실시예 4에 따라 제작한 대장균 유래 panB를 발현하는 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ΔpanB::panB(EC) 균주를 모균주로 하여 미생물의 변이를 유도하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ΔpanB::panB(EC) 균주를 활성화 배지에서 16시간 동안 배양하여 활성화시키고, 121 ℃에서 15분간 멸균한 종배지에 접종하여 14시간 동안 배양한 후, 배양액 5 ml을 회수하였다. 회수한 배양액을 100 mM 시트르산 완충용액 (citric buffer)으로 세척한 후, NTG (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 최종농도 200 mg/l가 되도록 첨가하여 20분 동안 처리하고, 100 mM 인산 완충용액 (phosphate buffer)으로 세척하였다. NTG가 처리된 균주를 최소배지에 도말하여 사멸율을 측정한 결과, 사멸율은 85%로 나타났다. 생존한 세포들을 생산배지에 접종 및 배양하고, 최종적으로 우수한 판토텐산 생산능을 나타내는 변이주를 2종 선별하여 코리네박테리움 글루타미쿰 CJVB5-01 (Corynebacterium glutamicum, CJVB5-01) 및 CJVB5-02 (Corynebacterium glutamicum, CJVB5-02)로 명명하였다.
본 실시예에서 사용한 배지의 조성은 하기와 같다.
<활성화배지>
소고기 추출물 1%, 폴리펩톤 1%, 소듐클로라이드 0.5%, 효모추출물 1%, 한천 2%, pH 7.2
<생산배지>
포도당 10%, 베타-알라닌 0.5%, 효모추출물 0.4%, 황산암모늄 1.5%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.05%, 황산철7수염 10 mg/l, 황산망간1수염 6.7 mg/l, 비오틴 50 μg/l, 티아민·HCl 100 μg/l, pH 7.2
<최소배지>
포도당 1.0%, 황산암모늄 0.4%, 황산마그네슘 0.04%, 인산제1칼륨 0.1%, 요소 0.1%, 티아민 0.001%, 비오틴 200 μg/l, 한천 2%, pH 7.2
상기 얻어진 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 CJVB5-01 및 CJVB5-02의 판토텐산 생산능을 확인하기 위하여, 생산배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바풀 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ΔpanB::panB(EC) 균주, CJVB5-01 변이주 및 CJVB5-02 변이주를 각각 접종한 후, 32℃에서 48시간동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 판토텐산을 제조하였다.
상기 얻어진 배양액을 20,000 rcf에서 10분동안 원심분리 후 상등액을 TDW(triple distilled water)로 1/10 희석한 후 HPLC 분석을 수행하여 판토텐산 및 L-발린의 농도를 측정하고, 그 결과를 하기의 표 4 및 표 5에 나타내었다.
판토텐산 농도 (g/L) L-valine 농도(g/L)
ATCC13032 ΔpanB 0.0 2.4
ATCC13032 ΔpanB ::panB(EC) 0.3 1.4
CJVB5-01 1.2 1.0
판토텐산 농도 (g/L) L-valine 농도 (g/L)
ATCC13032ΔpanB ::panB(EC) 0.3 0.9
CJVB5-02 1.7 0.2
상기 표 4 및 표 5에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpanB 균주는 판토텐산을 생산하지 않았고, 코리네박테리움 글루타미쿰 CJVB5-01 변이주 및 CJVB5-02 변이주는 외래 panB가 삽입된 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpanB::panB(EC)과 비교하여, 보다 우수한 판토텐산 생산능을 보이는 것을 확인하였다. 또한 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트를 기질로 하는 물질인 발린의 농도가 감소한 것을 보아 CJVB5-1 변이주 및 CJVB5-02 변이주의 판토텐산 생산능이 야생형보다 훨씬 강해진 것을 확인할 수 있었다.
코리네박테리움 글루타미쿰 CJVB5-01 변이주의 게놈 시퀀싱 결과, 삽입된 대장균 panB 유전자가, 야생형 대장균 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 (서열번호 37)에 G116A 변이 (서열번호 37의 아미노산 서열 중 116번째 아미노산 잔기인 G(Gly)가 A(Ala)로 치환)가 도입된 변이체를 암호화하도록 변이되었음을 확인하였다. 이하, 'G116A'와 같이 아미노산 위치를 이용한 아미노산 변이 표시는 아미노산 변이 및/또는 이러한 아미노산 변이를 유도하는 유전자 변이를 의미하는 것으로 이해된다. 상기 G116A 변이가 도입된 대장균 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 변이체의 아미노산 서열을 서열번호 62에 나타내었다.
코리네박테리움 글루타미쿰 CJVB5-02 변이주의 게놈 시퀀싱 결과, 삽입된 대장균 panB 유전자가, 야생형 대장균 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 (서열번호 37)에 A159L 변이 (서열번호 37의 아미노산 서열 중 159번째 잔기에 상응하는 아미노산 잔기인 A(Ala, 알라닌)가 L(Leu, 류신)로 치환)가 도입된 변이체를 암호화하도록 변이되었음을 확인하였다. 이하, 'A159L'와 같이 아미노산 위치를 이용한 아미노산 변이 표시는 아미노산 변이 및/또는 이러한 아미노산 변이를 유도하는 유전자 변이를 의미하는 것으로 이해된다. 상기 A159L 변이가 도입된 대장균 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 변이체의 아미노산 서열을 서열번호 110에 나타내었다.
상기의 결과로 무작위 돌연변이법을 통해 얻어진 CJVB5-01 변이주 및 CJVB5-02 변이주가 피루브산으로부터 판토텐산이 합성되는 경로를 저해받지 않고, 판토텐산을 고효율 및 고수율로 생산할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 3-메틸-2케토뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 활성을 갖는 변이형 panB 플라스미드 제작
상기 실시예 5을 통해 판토텐산 생산능에 영향을 미치는 것으로 확인된 대장균 PanB (3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제)의 변이 위치인 116번째 및/또는 159번째 잔기에 상응하는 아미노산 잔기가 판토텐산 생산능 증가에 중요한 위치임을 확인하기 위하여, 이 위치의 아미노산 잔기를 다른 아미노산으로 치환한 변이형을 제작하여 그 효과를 확인하였다.
실시예 2에서 제작된 pECCG117-panB(EC) (표 1 참조)를 주형으로 하고 하기의 표 6에 기재된 프라이머를 사용하여, 대장균 PanB (서열번호 37)의 116번째 위치의 아미노산인 G(Gly)가 다른 아미노산이 치환된 무작위 돌연변이 (Saturated mutagenesis)가 도입된 (즉, 상기 무작위 돌연변이가 도입된 대장균 PanB를 암호화하도록 변이된 panB 유전자가 도입된) 변이체를 제작하였다. 또한 하기의 표 7에 기재된 프라이머를 사용하여, 대장균 PanB (서열번호 37)의 159번째 위치의 아미노산인 A(Ala)이 다른 아미노산으로 치환된 무작위 돌연변이가 도입된 변이체를 제작하였다. 실시예 1에서 제작된 pECCG117-panB(EC)를 주형으로 사용하였다. 각각의 Saturated mutagenesis가 도입된 변이주의 변이형에 따른 치환된 아미노산 및 각 변이형에 사용된 프라이머를 다음의 표 6 및 표 7에 정리하였다:
Template 아미노산 치환 사용된 프라이머
pECCG117-panB(EC) G116S 서열번호 27, 38 / 39, 28
G116C 서열번호 27, 40 / 41, 28
G116L 서열번호 27, 42 / 43, 28
G116I 서열번호 27, 44 / 45, 28
G116T 서열번호 27, 46 / 47, 28
G116V 서열번호 27, 48 / 49, 28
G116M 서열번호 27, 50 / 51, 28
G116D 서열번호 27, 52 / 53, 28
G116E 서열번호 27, 54 / 55, 28
G116N 서열번호 27, 56 / 57, 28
G116Q 서열번호 27, 58 / 59, 28
G116A 서열번호 27, 60 / 61, 28
Template 치환 아미노산 사용된 프라이머
pECCG117-panB(EC) A159R 서열번호 74, 75 / 76, 77
A159S 서열번호 74, 78 / 79, 77
A159Y 서열번호 74, 80 / 81, 77
A159C 서열번호 74, 82 / 83, 77
A159P 서열번호 74, 84 / 85, 77
A159H 서열번호 74, 86 / 87, 77
A159L 서열번호 74, 88 / 89, 77
A159I 서열번호 74, 90 / 91, 77
A159T 서열번호 74, 92 / 93, 77
A159K 서열번호 74, 94 / 95, 77
A159V 서열번호 74, 96 / 97, 77
A159M 서열번호 74, 98 / 99, 77
A159D 서열번호 74, 100 / 101, 77
A159E 서열번호 74, 102 / 103, 77
A159N 서열번호 74, 104 / 105, 77
A159Q 서열번호 74, 106 / 107, 77
WT (서열번호 37) 서열번호 74, 77
구체적으로, 상기 표 6 및 표 7에서 제시한 프라이머를 이용하여 실시예 2에서 제작된 pECCG117-panB(EC)(표 1 참조)를 주형으로 PCR을 수행하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제 (SolGent co.,Ltd.)를 사용하였으며, PCR은 95 ℃에서 10분간 변성 후, 95 ℃ 30초 변성, 55 ℃ 30초 어닐링, 72 ℃ 1분 중합을 25회 반복한 후, 72 ℃에서 5분간 중합반응을 수행하여 진행하였다. 그 결과 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 유전자의 변이(116번 잔기)를 중심으로 5' 상류 부위의 610 bp DNA 단편과 3' 하류 부위의 470 bp의 DNA 단편을 수득하였고, 159번 잔기를 중심으로 5' 상류 부위의 477 bp DNA 단편과 3' 하류 부위의 318 bp의 DNA 단편을 수득하였고,
제한효소 BamHI으로 처리한 후 65 ℃에서 20분간 열처리한 pECCG117 (대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 상기 수득된 각각의 DNA 단편들(116번 잔기: 5' 상류 부위의 610 bp DNA 단편 및 3' 하류 부위의 470 bp의 DNA 단편, 159번 잔기: 5' 상류 부위의 477 bp DNA 단편 및 3' 하류 부위의 318 bp의 DNA 단편)을 몰농도 (M) 2:1:1이 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써, 변이 panB 도입을 위한 플라스미드를 획득하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 PLM1 프로모터를 확보하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC13032) 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 108와 109의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 바와 동일하게 PCR을 수행하여, 프로모터 DNA 단편을 획득하였다.
상기 얻어진 변이 플라스미드의 정보를 하기의 표 8 및 표 9에 정리하였다:
변이 위치 아미노산 치환 아미노산 치환을 유도하도록 제작된 변이 플라스미드
야생형 panB (서열번호 37)의 116번째 잔기에 상응하는 아미노산 잔기 G116S pECCG117-panB(G116S)
G116C pECCG117-panB(G116C)
G116L pECCG117-panB(G116L)
G116I pECCG117-panB(G116I)
G116T pECCG117-panB(G116T)
G116V pECCG117-panB(G116V)
G116M pECCG117-panB(G116M)
G116D pECCG117-panB(G116D)
G116E pECCG117-panB(G116E)
G116N pECCG117-panB(G116N)
G116Q pECCG117-panB(G116Q)
G116A pECCG117-panB(G116A)
변이 위치 아미노산 치환 아미노산 치환을 유도하도록 제작된 변이 플라스미드
야생형 panB (서열번호 37)의 159번째 잔기에 상응하는 아미노산 잔기 A159R pECCG117-panB(A159R)
A159S pECCG117-panB(A159S)
A159Y pECCG117-panB(A159Y)
A159C pECCG117-panB(A159C)
A159P pECCG117-panB(A159P)
A159H pECCG117-panB(A159H)
A159L pECCG117-panB(A159L)
A159I pECCG117-panB(A159I)
A159T pECCG117-panB(A159T)
A159K pECCG117-panB(A159K)
A159V pECCG117-panB(A159V)
A159M pECCG117-panB(A159M)
A159D pECCG117-panB(A159D)
A159E pECCG117-panB(A159E)
A159N pECCG117-panB(A159N)
A159Q pECCG117-panB(A159Q)
WT pECCG117-panB(WT)
실시예 7. 변이형 3-메틸-2케토뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 판토텐산 생산능 평가
실시예 6에서 제작된 변이 플라스미드(표 8 및 표 9)와 pECCG117-panB(WT-EC)(표 1)을 각각 실시예 4에서 제작된 ATCC13032 ΔpanB 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신 25 mg/l를 함유하는 선별배지에서 도말하여 각각의 무작위 돌연변이(Saturated mutagenesis)가 도입된 총 19종의 형질전환 변이주를 획득하였다. 그 후, 실시예 3과 동일한 방법으로 플라스크 평가를 진행하여, 얻어진 판토텐산 생산능을 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 표 10 및 표 11에 나타내었다:
균주 판토텐산 (g/L)
배치1 배치2 배치3 평균
ATCC 13032 ΔpanB (대조군) 0.0 0.0 0.0 0.0
ATCC 13032 ΔpanB pECCG117-panB(G116S) 1.5 1.9 1.6 1.7
ATCC 13032 ΔpanB pECCG117-panB(G116C) 1.2 1.3 1.2 1.2
ATCC 13032 ΔpanB pECCG117-panB(G116L) 1.6 1.5 1.4 1.5
ATCC 13032 ΔpanB pECCG117-panB(G116I) 1.5 1.7 1.6 1.6
ATCC 13032 ΔpanB pECCG117-panB(G116T) 2.4 2.5 2.3 2.4
ATCC 13032 ΔpanB pECCG117-panB(G116V) 1.6 1.7 1.4 1.6
ATCC 13032 ΔpanB pECCG117-panB(G116M) 0.9 0.9 1.1 1.0
ATCC 13032 ΔpanB pECCG117-panB(G116D) 1.3 1.1 1.2 1.2
ATCC 13032 ΔpanB pECCG117-panB(G116E) 1.9 1.2 2.1 1.7
ATCC 13032 ΔpanB pECCG117-panB(G116N) 2.5 2.5 2.6 2.5
ATCC 13032 ΔpanB pECCG117-panB(G116Q) 1.0 1.1 1.0 1.0
ATCC 13032 ΔpanB pECCG117-panB(G116A) 2.6 2.9 2.9 2.8
ATCC 13032 ΔpanB pECCG117-panB(WT) 0.9 0.8 1.0 0.9
상기의 표 10에서 볼 수 있듯이, ATCC13032 ΔpanB 균주는 판토텐산을 생산하지 않는 반면, 대장균 PanB (야생형) 또는 이의 변이형이 도입된 변이주는 모두 판토텐산 생산능을 보였다. 또한, G116S, G116C, G116L, G116I, G116T, G116V, G116D, G116E, G116N, G116A, G116M, 또는 G116Q 변이가 도입된 변이주는 대장균 PanB (야생형)을 포함하는 변이주인 ATCC 13032 ΔpanB pECCG117-panB(WT)와 비교하여 보다 높은 수준으로 판토텐산을 생산하였다. 이와 같은 결과로, 대장균 PanB의 야생형 및 변이형 모두 판토텐산 생산 증가 효과를 가지고, 특히 PanB(서열번호 37)의 116번째 아미노산 잔기가 판토텐산 생산에 중요한 위치이며, 이 위치의 아미노산을 원래와 다른 다양한 아미노산으로 치환할 경우 판토텐산의 생산능이 보다 증가됨을 확인할 수 있었다.
본 실시예에서 판토텐산의 생산능이 가장 우수한 것으로 확인된 ATCC 13032 ΔpanB pECCG117-panB(G116A) 균주(Corynebacterium glutamicum CV03-5001으로 명명)를 2020년 6월 8일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제동에 소재하는 한국미생물보존센터에 기탁하여 KCCM12744P의 기탁번호를 부여받았다.
Saturated mutagenesis가 도입된 균주의 판토텐산 생산능
균주 판토텐산 (g/L)
배치1 배치2 배치3 평균
ATCC 13032 0.0 0.0 0.0 0
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159R) 0.7 0.8 0.8 0.77
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159S) 2.5 2.9 2.6 2.67
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159Y) 0.8 0.7 0.8 0.77
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159C) 2.2 2.3 2.2 2.23
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159P) 1.2 1.3 1.3 1.27
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159H) 0.7 0.8 0.7 0.73
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159L) 2.8 3.1 2.9 2.93
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159I) 2.5 2.7 2.6 2.6
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159T) 2.1 2.1 2.3 2.17
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159K) 0.9 0.6 0.7 0.73
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159V) 2.6 2.7 2.4 2.57
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159M) 1.9 1.9 2.2 2
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159D) 1.3 1.1 1.2 1.2
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159E) 0.8 0.8 0.7 0.77
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159N) 1.2 1.5 1.6 1.43
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159Q) 1.2 1.1 1.2 1.17
ATCC 13032 pECCG117-panB(WT) 0.7 0.7 0.7 0.7
또한 상기 표 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주는 판토텐산을 생산하지 않는 반면, 상기 제작된 19종의 변이주는 모두 판토텐산 생산능을 보였으며, 이 중에서 야생형 panB (서열번호 37)의 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 아르기닌(R), 세린(S), 타이로신(Y), 시스테인(C), 프롤린(P), 히스티딘(H), 류신(L), 이소류신(I), 트레오닌(T), 라이신(K), 발린(V), 메티오닌(M), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 또는 글루타민(Q)으로 변이된 변이주는, 야생형 panB를 포함하는 ATCC 13032 pECCG117-panB(WT) 균주와 비교하여, 높은 수준으로 판토텐산을 생산하였다. 이와 같은 결과로 panB (서열번호 37)의 159번째 잔기에 상응하는 아미노산 잔기가 판토텐산 생산에 중요한 위치임을 확인할 수 있었으며, 이 위치의 아미노산을 원래와 다른 다양한 아미노산으로 치환할 경우 판토텐산의 생산능이 보다 증가됨을 확인할 수 있었다.
본 실시예에서 판토텐산의 생산능이 가장 우수한 것으로 확인된 ATCC 13032 ΔpanB pECCG117-panB(A159L) 균주를 CV03-5002로 명명하고 2021년 4월 13일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제동에 소재하는 한국미생물보존센터에 기탁하여 KCCM12973P의 기탁번호를 부여받았다.
실시예 8. 판토텐산 생산능이 향상된 변이형 3-메틸-2케토뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 제작 및 평가
실시예 7에서 효과를 확인한 3-메틸-2케토뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 G116A 변이체와, 3-메틸-2케토뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제 A159L 변이체를 조합하여 추가적인 활성 향상이 있는지 여부를 확인하였다.
G116A와 A159L 변이체를 포함하는 벡터를 제작하기 위하여 실시예 2에서 제작된 pECCG117-panB(A159L)을 주형으로 서열번호 74, 126 및 서열번호 77, 127의 프라이머를 이용하여 실시예 2에 기재된 바와 동일하게 G116A와 A159L이 모두 포함된 벡터를 제작하였다. 제작된 변이 플라스미드 pECCG117-panB(G116A, A159L)을 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신 25 mg/L를 함유하는 선별배지에서 도말하여 각각의 형질전환주를 획득하였다. 그 후, 실시예 2과 동일한 방법으로 플라스크 평가를 진행하여, 얻어진 판토텐산 생산능을 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 아래 표 12에 나타내었다.
G116A와 A159L을 포함하는 변이 균주의 판토텐산 생산능
균주 판토텐산 (g/L)
배치1 배치2 배치3 평균
ATCC 13032 0.0 0.0 0.0 0
ATCC 13032 pECCG117-panB(WT) 0.7 0.7 0.6 0.67
ATCC 13032 pECCG117-panB(A159L) 2.9 2.8 3.1 2.93
ATCC 13032 pECCG117-panB(G116A) 2.2 2.4 2.1 2.23
ATCC 13032 pECCG117-panB(G116A, A159L) 3.9 3.7 3.7 3.77
상기 표 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, ATCC 13032 균주는 판토텐산을 생산하지 않는 반면, panB의 116번째 잔기에 상응하는 아미노산 변이와 159번째 잔기에 상응하는 아미노산 변이를 모두 포함하는 변이주는 야생형 panB를 포함하는 ATCC 13032 pECCG117-panB(WT) 균주와 비교하여 높은 수준으로 판토텐산을 생산하였고, A159L 또는 G116A 변이를 포함하는 변이주들보다도 높은 수준으로 판토텐산을 생산하였다. 이와 같은 결과로 panB의 116번째와 159번째 잔기에 상응하는 아미노산 잔기가 판토텐산 생산에 중요한 위치임을 확인할 수 있었으며, 이 위치들의 아미노산을 원래와 다른 아미노산으로 치환할 경우 판토텐산의 생산능이 보다 증가됨을 확인할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
(수탁번호)
기탁기관명 : 한국미생물보존센터
수탁번호 : KCCM12744P
수탁일자 : 20200608
기탁기관명 : 한국미생물보존센터
수탁번호 : KCCM12973P
수탁일자 : 20210413
Figure PCTKR2022003845-appb-img-000003
Figure PCTKR2022003845-appb-img-000004

Claims (18)

  1. 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 아르기닌(R), 세린(S), 타이로신(Y), 시스테인(C), 프롤린(P), 히스티딘(H), 류신(L), 이소류신(I), 트레오닌(T), 라이신(K), 발린(V), 메티오닌(M), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 또는 글루타민(Q)으로 치환된, 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 110 내지 서열번호 125의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 폴리펩타이드.
  4. 서열번호 37의 아미노산 서열에서,
    (1) N-말단으로부터 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고; 및
    (2) N-말단으로부터 116번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 폴리펩타이드.
  5. 제4항에 있어서,
    (1) 상기 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 아르기닌(R), 세린(S), 타이로신(Y), 시스테인(C), 프롤린(P), 히스티딘(H), 류신(L), 이소류신(I), 트레오닌(T), 라이신(K), 발린(V), 메티오닌(M), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 또는 글루타민(Q)으로 치환되고; 및
    (2) 상기 116번째 잔기에 상응하는 아미노산이 알라닌(A), 아스파라긴(N), 트레오닌(T), 글루탐산(E), 세린(S), 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 아스파르트산(D), 시스테인(C), 글루타민(Q), 또는 메티오닌(M)으로 치환된, 폴리펩타이드.
  6. 제4항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 128의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제7항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
  9. (1) 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상; 또는
    (2) 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, N-말단으로부터 116번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는,
    판토텐산 또는 판토산을 생산하는 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 아르기닌(R), 세린(S), 타이로신(Y), 시스테인(C), 프롤린(P), 히스티딘(H), 류신(L), 이소류신(I), 트레오닌(T), 라이신(K), 발린(V), 메티오닌(M), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 또는 글루타민(Q)으로 치환된, 미생물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드는,
    서열번호 110 내지 서열번호 125의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 미생물.
  12. 제9항에 있어서,
    (1) 상기 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 아르기닌(R), 세린(S), 타이로신(Y), 시스테인(C), 프롤린(P), 히스티딘(H), 류신(L), 이소류신(I), 트레오닌(T), 라이신(K), 발린(V), 메티오닌(M), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 또는 글루타민(Q)으로 치환되고; 및
    (2) 상기 116번째 잔기에 상응하는 아미노산이 알라닌(A), 아스파라긴(N), 트레오닌(T), 글루탐산(E), 세린(S), 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 아스파르트산(D), 시스테인(C), 글루타민(Q), 또는 메티오닌(M)으로 치환된, 미생물.
  13. 제9항에 있어서, 상기 서열번호 37의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 159번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, N-말단으로부터 116번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩타이드는,
    서열번호 128의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 미생물.
  14. 제9항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물 또는 에세리키아 속 미생물인, 미생물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, 미생물.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항의 미생물을 포함하는, 판토텐산 또는 판토산 생산용 조성물.
  17. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 판토텐산 또는 판토산의 제조 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 배양하는 단계 이후에, 배양된 미생물, 배지, 또는 이들 모두로부터 판토텐산 또는 판토산을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 판토텐산 또는 판토산의 제조 방법.
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