WO2019231159A1 - 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법 - Google Patents

변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법 Download PDF

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seq
variant
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허란
임상조
김현아
김형준
서창일
이승빈
이지선
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    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01003—Homoserine dehydrogenase (1.1.1.3)

Definitions

  • the present application relates to variant homoserine dehydrogenase, specifically variant homoserine dehydrogena having a polypeptide comprising one or more amino acid substitutions in the amino acid sequence of a protein having homoserine dehydrogenase activity.
  • the amino acid substitution is a variant homoserine dehydrogenase comprising 285 amino acid substituted with isoleucine, 398 amino acid substituted with glutamine, or a combination thereof, and homoserine or homoserine using the same
  • a method for producing a derived L-amino acid a composition for producing homoserine or a homoserine-derived L-amino acid, a method for increasing the production capacity of a homoserine or a homoserine-derived L-amino acid, or a use of the above-described variant homoserine dehydrogenase will be.
  • L-Threonine, L-isoleucine and L-methionine in L-amino acids are homoserine dehydrogenase (Hose, EC: 1.1.1.3) in aspartate-semialdehyde (ASA). Homoserine produced by) is commonly used. Therefore, in order to produce the amino acids by fermentation, it is essential to maintain the activity of enzymes used in the biosynthetic pathway to a certain level or more, and intensive studies have been made.
  • homoserine dehydrogenase which acts at the branching point of L-lysine and L-threonine biosynthetic pathways, is known to regulate activity by L-threonine and L-isoleucine.
  • L-threonine and L-isoleucine There have been several reports in the past regarding the desensitized Hom and the method of producing L-threonine using L-threonine.
  • Eikmann et al Reported a desensitized Hom by conversion of glycine, the 378th amino acid residue of Hom, to glutamate (Eikmanns BJ et al ., Appl. Microbial Biotechnol.
  • the inventors of the present application isolate a novel gene encoding a variant Hom during the feedback inhibition desensitization study by threonine and confirm that L-amino acid production ability is improved in a microorganism transduced with the new gene. Completed.
  • One object of the present application is a variant homoserine dehydrogenase having a polypeptide comprising one or more amino acid substitutions in the amino acid sequence of a protein having homoserine dehydrogenase activity, wherein the amino acid substitution is at the 285th amino acid Or to a variant homoserine dehydrogenase comprising a 398th amino acid substituted with another amino acid or a combination thereof.
  • Another object of the present application is to provide a polynucleotide encoding said variant dehydrogenase.
  • Another object of the present application is to provide a microorganism of the genus Corynebacterium, comprising the above-described variant homoserine dehydrogenase.
  • Another object of the present application the step of culturing the microorganism in the medium; It provides a method for producing homoserine or homoserine-derived L-amino acid, comprising recovering homoserine or homoserine-derived L-amino acid from the microorganism or medium.
  • Still another object of the present application is to provide a composition for producing homoserine or homoserine-derived L-amino acid, comprising a microorganism comprising the mutant homoserine dehydrogenase of the present application or the mutant homoserine dehydrogenase.
  • Another object of the present application is to provide a method for increasing the production capacity of homoserine or homoserine-derived L-amino acid, comprising expressing a variant homoserine dehydrogenase of the present application in a microorganism of the genus Corynebacterium. It is.
  • Another object of the present application is to provide the use of said variant homoserine dehydrogenase for the production of homoserine or homoserine derived L-amino acids of the present application.
  • Another object of the present application is to provide the use of said polynucleotides for the production of homoserine or homoserine derived L-amino acids of the present application.
  • Another object of the present application is to provide a use of the microorganism of the genus Corynebacterium for the production of homoserine or homoserine-derived L-amino acid of the present application.
  • Another object of the present application is to provide the use of the composition for the production of homoserine or homoserine derived L-amino acids of the present application.
  • the variant homoserine dehydrogenase of the present application may be widely used for mass production of more efficient homoserine or homoserine-derived L-amino acids by desensitizing feedback inhibition by the final product as compared to the natural or wild type.
  • variant homoserine dehydrogenase having a polypeptide comprising one or more amino acid substitutions in the amino acid sequence of a protein having homoserine dehydrogenase activity, said amino acid Substitutions provide the variant homoserine dehydrogenase, wherein the 285th or 398th amino acid is substituted with another amino acid or a combination thereof.
  • a homoserine dehydrogenase variant comprising a 398th amino acid substituted with glutamine or a combination thereof. More specifically, a variant homoserine dehydrogenase is provided wherein the 285th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine, the 398th amino acid is substituted with glutamine, or a combination thereof.
  • homoserine dehydrogenase (EC: 1.1.1.3) refers to an enzyme that catalyzes the synthesis of homoserine, which is a common intermediate of methionine, threonine, and isoleucine biosynthesis in plants and microorganisms, Also called homoserine dehydrogenase.
  • homoserine dehydrogenase may be included as long as it is a protein having the above-described conversion activity, and enzymes derived from any organism (plant and microorganism, etc.) may be used.
  • the homoserine dehydrogenase may be derived from a microorganism of the genus Corynebacterium, and more specifically, may be derived from corynebacterium glutamicum .
  • it may be a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be used interchangeably with a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a method of securing homoserine dehydrogenase is applicable to various methods well known in the art. Examples of such methods include biosynthetic methods based on gene synthesis techniques including codon optimization and microbial mass genome information to secure proteins with high efficiency in microorganisms of Corynebacterium commonly used for protein expression. By this, it can be secured through the screening method of useful enzyme resources, but is not limited thereto.
  • the protein having the activity of homoserine dehydrogenase in the present application is the amino acid sequence of the protein having the activity of homoserine dehydrogenase, for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, meaningless addition of sequences before or after the amino acid sequence, or naturally It does not exclude mutations that may occur, or latent mutations thereof, and the homoserine dehydrogena of the present disclosure may have the same or corresponding activity as the protein including the amino acid sequence of SEQ ID NO. Corresponds to the protein of the agent activity.
  • a protein having the activity of homoserine dehydrogenase of the present application is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 80%, 90%, 95%, or 97% homology therewith. Can be.
  • a protein or polypeptide comprising an amino acid sequence described by a specific sequence number in the present application, if the amino acid sequence having such homology and exhibits the efficacy corresponding to the protein, some sequences are deleted, modified, It is obvious that a protein having a substituted or added amino acid sequence is also included within the scope of the present application.
  • a protein having homoserine dehydrogenase activity in the present application may be homoserine dehydrogenase derived from corynebacterium glutamicum .
  • amino acid sequence of homoserine dehydrogenase derived from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 SEQ ID NO: 1
  • amino acid sequence of homoserine dehydrogenase derived from Corynebacterium glutamicum ATCC14067 SEQ ID NO: 49
  • amino acid sequence of homoserine dehydrogenase from Corynebacterium glutamicum ATCC13869 SEQ ID NO: 50.
  • Homoserine dehydrogenases having the above sequence have at least 80%, 90%, 95%, or 97% homology with each other, and exhibit homologous efficacy as homoserine dehydrogenases, and thus, It is obvious that it is included in a protein having the activity of the genease.
  • homology refers to the percent identity between two polynucleotide or polypeptide moieties. It means the degree of coincidence with a given amino acid sequence or nucleotide sequence and can be expressed as a percentage. In this specification, homologous sequences thereof having the same or similar activity as a given amino acid sequence or base sequence are designated as "% homology”. Homology between sequences from one moiety to another can be determined by known art.
  • hybridization conditions which are defined within the scope of the art, are well known to those skilled in the art, and are well known to those skilled in the art (e.g., J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; FM Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York.
  • variant refers to a culture or individual that exhibits one stable phenotypic change, genetically or non-genetically. Specifically, one or more amino acids are mutated on an amino acid sequence corresponding to a protein having homoserine dehydrogenase activity, so that the activity is efficiently increased compared to wild type, natural type or unmodified type, or isoleucine, threonine, It may refer to a variant in which feedback inhibition to analogs or derivatives thereof is released or both activity increase and feedback inhibition cancellation are performed.
  • Variant homoserine dehydrogenase in the present application may be used interchangeably as “mutated homoserine dehydrogenase”, or “homoserine dehydrogenase variant”.
  • such variants may be non-naturally occurring.
  • the variant homoserine dehydrogenase of the present application is specifically a variant protein having a polypeptide comprising one or more amino acid substitutions in the amino acid sequence of a protein having homoserine dehydrogenase activity, wherein the amino acid substitution is 285 Variant homoserine dehydrogenase, including the first amino acid substituted with isoleucine, the 398th amino acid substituted with glutamine, or a combination thereof.
  • the amino acid sequence of the protein having the activity of homoserine dehydrogenase is as described above, for example, may be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the 285 th amino acid may be a threonine is substituted with isoleucine
  • the 398 th amino acid may be an arginine is substituted with glutamine.
  • variant homoserine dehydrogenase of the present application is a variant protein having a polypeptide including one or more amino acid substitutions in the amino acid sequence of a protein having homoserine dehydrogenase activity, wherein the amino acid substitution is the 378th amino acid It may be a variant homoserine dehydrogenase including one substituted with this tryptophan.
  • a variant protein having a polypeptide comprising at least one amino acid substitution in the amino acid sequence of a protein having homoserine dehydrogenase activity wherein the amino acid substitution is replaced with isoleucine at amino acid 285 or glutamine with amino acid 398
  • the 378th amino acid may be further substituted with tryptophan. More specifically, the 378th amino acid may be one in which glycine is substituted with tryptophan.
  • the variant homoserine dehydrogenase of the present application is a variant protein having a polypeptide comprising one or more amino acid substitutions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the amino acid substitution is the 285th amino acid to isoleucine. It may be a variant homoserine dehydrogenase, including substituted, 398th amino acid substituted with glutamine or a combination thereof.
  • the variant homoserine dehydrogenase of the present application can be a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, 11, 12 or 13.
  • the variant homoserine dehydrogenase of the present application is an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, 11, 12 or 13 or an amino acid sequence having at least 80%, 90%, 95%, or 97% homology therewith. It may be a protein composed.
  • variant homoserine dehydrogenase of the present application is a variant homoserine dehydrogenase having a polypeptide comprising one or more amino acid substitutions in the amino acid sequence of a protein having homoserine dehydrogenase activity. It is apparent that the amino acid or the 398th amino acid includes a substitution with another amino acid, and a protein showing a corresponding efficacy as a homoserine dehydrogenase is also included within the scope of the present application.
  • variant homoserine dehydrogenases of the present application unlike wild-type or natural protein, or unmodified protein, having the activity of homoserine dehydrogenase, are the final products isoleucine, threonine, methionine, homoserine Or feedback inhibition by a derivative or analog thereof may be released or desensitized.
  • feedback inhibition refers to the inhibition of a response in which the end product of metabolism is preliminary. Therefore, when releasing or desensitizing feedback inhibition of homoserine dehydrogenase, the productivity of homoserine and homoserine-derived L-amino acid of microorganisms can be improved.
  • the homoserine-derived L-amino acid refers to L-amino acid which can be biosynthesized using L-homoserine as a precursor, and is not limited as long as it is a material that can be biosynthesized from L-homoserine.
  • the homoserine-derived L-amino acid may include not only homoserine-derived L-amino acid but also derivatives thereof.
  • L-threonine, L-isoleucine, O-acetyl-L-homoserine, O-succinyl-L-homoserine, O-phospho-L-homoserine, L-methionine and / or L- It may be, but is not limited to, glycine. More specifically, it may be, but is not limited to, L-threonine, L-isoleucine, O-acetyl-L-homoserine, O-succinyl-L-homoserine and / or L-methionine.
  • Another aspect of the present application provides a polynucleotide encoding said variant homoserine dehydrogenase.
  • the homoserine dehydrogenase and the variant are as described above.
  • polynucleotide is a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are long chained by covalent bonds, and are DNA or RNA strands of a predetermined length or more, and more specifically, the homoserine is a variant.
  • polynucleotide fragments that encode dehydrogenase By polynucleotide fragments that encode dehydrogenase.
  • the polynucleotide encoding the variant protein of the present application may be included without limitation so long as it is a polynucleotide sequence encoding the variant protein having homoserine dehydrogenase activity of the present application.
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence of the homoserine dehydrogenase variant may specifically be derived from a microorganism of the genus Corynebacterium, and more specifically, may be derived from Corynebacterium glutamicum. However, it is not limited thereto.
  • the polynucleotide encoding the protein may be added to the coding region within a range that does not change the amino acid sequence of the protein due to degeneracy of the codon or in consideration of a codon preferred in an organism to express the protein.
  • the polynucleotide may include a polynucleotide sequence encoding the protein or a polynucleotide sequence having at least 80%, 90%, 95%, or 97% homology thereto.
  • polynucleotide sequence encoding a protein having such homology and exhibiting substantially the same or equivalent potency as the protein a polynucleotide sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted or added is also included within the scope of the present application.
  • the polynucleotide encoding a protein having homoserine dehydrogenase activity of the present application may be a polynucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 48 may be, but is not limited thereto.
  • polynucleotide encoding the variant homoserine dehydrogenase of the present application may be a polynucleotide sequence encoding a polypeptide comprising one or more amino acid substitutions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, specifically SEQ ID NO: 10 , Polynucleotide sequence encoding 11, 12 or 13.
  • stringent conditions are meant conditions that enable specific hybridization between polynucleotides. Such conditions are described specifically in the literature (eg, J. Sambrook et al., Homology).
  • genes with high homology 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 97% or more, particularly specifically 99% or more homologous genes 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically 60 ° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, which are hybridized with each other and do not hybridize with less homologous genes, or washing conditions of ordinary Southern hybridization. More specifically, it can enumerate the conditions which wash once, specifically 2 to 3 times at the salt concentration and temperature which are equivalent to 68 degreeC, 0.1xSSC, and 0.1% SDS.
  • Hybridization requires that two polynucleotides have complementary sequences, although mismatch between bases is possible depending on the stringency of the hybridization.
  • nucleotides having homology can be detected using hybridization conditions including hybridization steps at Tm values of 55 ° C. and using the conditions described above.
  • Tm value may be 60 ° C, 63 ° C or 65 ° C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
  • Another aspect of the present application provides a microorganism comprising the variant homoserine dehydrogenase.
  • the genus of Corynebacterium microorganisms producing the homoserine or homoserine-derived L-amino acid including the above-described variant homoserine dehydrogenase are provided. It is also to provide a microorganism of the genus of Corynebacterium producing L-alanine, including the mutant homoserine dehydrogenase. However, this is not limitative.
  • the homoserine dehydrogenase and the variants are as described above.
  • the microorganism comprising the mutant homoserine dehydrogenase of the present application is naturally a microorganism having the ability to produce homoserine or homoserine-derived L-amino acid, or a mother having no production capacity of homoserine or homoserine-derived L-amino acid. It means a microorganism to which the strain has been given the ability to produce homoserine or homoserine-derived L-amino acid.
  • the microorganism comprising the homoserine dehydrogenase is a variant homoserine di in which the 285th amino acid is substituted with isoleucine or the 398th amino acid is substituted with glutamine or a combination thereof in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 It may be a microorganism expressing hydrogenase, but is not limited thereto.
  • the microorganism may be transformed with a vector comprising a polynucleotide encoding the variant homoserine dehydrogenase, or transformed with a vector comprising a polynucleotide encoding a variant homoserine dehydrogenase to express a variant polypeptide.
  • the host cell or the microorganism may be any microorganism capable of producing homoserine or homoserine-derived L-amino acid including the variant polypeptide.
  • Microorganisms comprising a variant homoserine dehydrogenase of the present application are homoserine, homoserine-derived L-amino acid or L-alanine compared to a microorganism comprising a protein having a wild type or unmodified homoserine dehydrogenase activity. Since the production ability of is improved, homoserine, homoserine-derived L-amino acid or L-alanine can be obtained in high yield from these microorganisms.
  • the microorganism including the mutant homoserine dehydrogenase is not particularly limited in kind, but it is Enterobacter genus, Escherichia genus, Erwinia genus, Serratia ( Serratia) may be a microorganism belonging to the genus Pseudomonas (Pseudomonas) genus Providencia (Providencia) genus Corynebacterium (Corynebacterium) genus and Brevibacterium (Brevibacterium). More specifically, it may be a microorganism belonging to the genus Corynebacterium .
  • the "microorganism of the genus Corynebacterium” specifically refers to Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammonia genes, Brevibacterium lactofermentum , Brevibacterium flame ( or the like Brevibacterium flavu m), Corynebacterium thermo amino to Ness (Corynebacterium thermoaminogenes), Corynebacterium epi syeonseu (Corynebacterium efficiens), it is not limited thereto. More specifically, the microorganism of the genus Corynebacterium in the present application may be Corynebacterium glutamicum .
  • the microorganism including the mutant homoserine dehydrogenase may be a microorganism into which a vector including a polynucleotide encoding the homoserine dehydrogenase variant is introduced.
  • the introduction may be made by transformation, but is not limited thereto.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding said target protein operably linked to a suitable regulatory sequence such that the target protein can be expressed in a suitable host.
  • the regulatory sequence may comprise a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation. After being transformed into a suitable host cell, the vector can be replicated or function independent of the host genome and integrated into the genome itself.
  • the vector used in the present application is not particularly limited as long as it can replicate in a host cell, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc. can be used as a phage vector or cosmid vector
  • pBR-based, pUC-based, pBluescriptII-based , pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based and the like can be used.
  • pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vector, etc. may be used, but is not limited thereto.
  • the vector usable in the present application is not particularly limited and known expression vectors may be used.
  • a polynucleotide encoding a target protein may be inserted into a chromosome through a vector for intracellular chromosome insertion. Insertion of the polynucleotide into the chromosome can be made by any method known in the art, such as, but not limited to, homologous recombination.
  • the method may further include a selection marker for checking whether the chromosome is inserted. Selection markers are used to screen for cells transformed with a vector, i.e.
  • telomere length can be used to confirm the insertion of the desired polynucleotide molecule, and to select select phenotypes such as drug resistance, nutritional requirements, resistance to cytotoxic agents or expression of surface proteins. Marking markers can be used. In an environment in which a selective agent is treated, only cells expressing a selection marker survive or exhibit different expression traits, so that transformed cells can be selected.
  • transformation in the present application means introducing a vector comprising a polynucleotide encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the polynucleotide in the host cell can be expressed.
  • the transformed polynucleotides may include all of them, as long as they can be expressed in the host cell, either inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome.
  • the polynucleotide also includes DNA and RNA encoding the target protein.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be expressed by being introduced into a host cell.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all elements necessary for self expression.
  • the expression cassette may include a promoter, a transcription termination signal, a ribosomal binding site, and a translation termination signal, which are typically operably linked to the polynucleotide.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self replication.
  • the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operably linked with a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • the transformation method may include any method of introducing a polynucleotide into a cell, and may be performed by selecting a suitable standard technique as known in the art depending on the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate (Ca (H 2 PO 4 ) 2 , CaHPO 4 , or Ca 3 (PO 4 ) 2 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, Polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, lithium acetate-DMSO method and the like, but are not limited thereto.
  • electroporation calcium phosphate (Ca (H 2 PO 4 ) 2 , CaHPO 4 , or Ca 3 (PO 4 ) 2 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, Polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, lithium acetate-DMSO method and the like, but
  • operably linked means that the polynucleotide sequence is functionally linked with a promoter sequence for initiating and mediating the transcription of a polynucleotide encoding a target protein of the present application.
  • Operable linkages can be prepared using known genetic recombination techniques, and site-specific DNA cleavage and ligation can be made using, but are not limited to, cleavage and ligation enzymes in the art.
  • the microorganism containing the mutant homoserine dehydrogenase may be transformed to include the mutant homoserine dehydrogenase in a microorganism of the genus Corynebacterium.
  • Corynebacterium genus microorganisms are illustratively resistant to 2-amino-3-hydroxy-valerate (AHV) strain; L-Threo is substituted for lysine by replacing Leucine, amino acid 377 of lysC, to eliminate feedback inhibition of aspartate kinase (lysC), the first important enzyme in the threonine biosynthetic pathway.
  • O-acetylhomoserine (thiol) -lyase and the cystathionine gamma-synthase protein of O-acetyl-homoserine degradation pathway were inactivated and O-acetyl homo Strains producing serine; Or a strain that inactivates methionine cysteine transcriptional regulator protein to produce methionine, but is not limited thereto.
  • Another embodiment of the present application comprises culturing the described microorganisms in a medium and recovering homoserine or homoserine-derived L-amino acid from the microorganism or medium, homoserine or homoserine-derived L-amino acid To provide a production method.
  • the microorganism may be a microorganism of the genus Corynebacterium including the homoserine dehydrogenase variant of the present application as described above, and more specifically, may be corynebacterium glutamicum.
  • the Corynebacterium genus or Corynebacterium glutamicum may be a microorganism that produces homoserine or homoserine-derived L-amino acid.
  • the homoserine-derived L-amino acid may include not only homoserine-derived L-amino acid but also derivatives thereof.
  • L-threonine, L-isoleucine, O-acetyl-L-homoserine, O-succinyl-L-homoserine, O-phospho-L-homoserine, L-methionine and / or L- It may be, but is not limited to, glycine. More specifically, it may be, but is not limited to, L-threonine, L-isoleucine, O-acetyl-L-homoserine, O-succinyl-L-homoserine and / or L-methionine.
  • the Corynebacterium genus or Corynebacterium glutamicum may be a microorganism that produces L-alanine.
  • the homoserine or homoserine-derived L-amino acid may be a homoserine or homoserine-derived L-amino acid culture produced by the microorganisms described in the present application, a supernatant of the culture, a processed product thereof, or a purified form thereof. It is also apparent to those skilled in the art that not only forms themselves, but also their salt forms.
  • the method for producing homoserine or homoserine-derived L-amino acid can be readily determined by those skilled in the art under optimized culture conditions and enzyme activity conditions known in the art.
  • the step of culturing the microorganism in the method is not particularly limited, but may be performed by a known batch culture method, continuous culture method, fed-batch culture method and the like.
  • the culture conditions are not particularly limited thereto, but using a basic compound (eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia) or an acidic compound (eg, phosphoric acid or sulfuric acid), an appropriate pH (eg, pH 5 to 9, specifically, Can adjust pH 6 to 8, most specifically pH 6.8), and maintain an aerobic condition by introducing oxygen or oxygen-containing gas mixture into the culture.
  • a basic compound eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia
  • an acidic compound eg, phosphoric acid or sulfuric acid
  • an appropriate pH eg, pH 5 to 9, specifically, Can adjust pH 6 to 8, most specifically pH 6.8
  • the culture temperature may be maintained at 20 °C to 45 °C, specifically 25 °C to 40 °C, can be incubated for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • the threonine, isoleucine, or acetylhomoserine produced by the culture may be secreted into the medium or remain in the cell.
  • the culture medium used includes sugars and carbohydrates (e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose), fats and fats (e.g. soybean oil, sunflower seeds) as carbon sources.
  • sugars and carbohydrates e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose
  • fats and fats e.g. soybean oil, sunflower seeds
  • fatty acids e.g. palmitic acid, stearic acid and linoleic acid
  • alcohols e.g. glycerol and ethanol
  • organic acids e.g. acetic acid
  • Nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds (eg peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea), or inorganic compounds (eg ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate) and the like can be used individually or in combination, but is not limited thereto.
  • organic compounds eg peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea
  • inorganic compounds eg ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate
  • As a source of phosphorus, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, a corresponding sodium-containing salt, and the like may be used individually or in combination, but is not limited thereto.
  • the medium may also contain essential growth-promoting substances such as other metal salts (eg magnesium sul
  • the method for recovering homoserine or homoserine-derived L-amino acid produced in the culturing step of the present application may obtain a desired product from the culture solution using a suitable method known in the art depending on the culture method. For example, centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, and HPLC can be used, and suitable methods known in the art can be used to remove homoserine or homoserine-derived L-amino acids from media or microorganisms. It can be recovered.
  • the recovery step may include an additional purification process, can be carried out using a suitable method known in the art. Additional processes may be inserted to increase the recovery of the desired product before or after the incubation step or recovery step.
  • composition for producing homoserine or homoserine-derived L-amino acid comprising a microorganism comprising the variant homoserine dehydrogenase or the variant homoserine dehydrogenase to provide.
  • the composition for producing homoserine or homoserine-derived L-amino acid is a variant homoserine in which the 285th amino acid is substituted with isoleucine, the 398th amino acid is substituted with glutamine, or a combination thereof in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • a dehydrogenase a polynucleotide encoding the same, or a microorganism comprising the same, a composition capable of producing homoserine or homoserine-derived L-amino acid is meant.
  • the polynucleotide may further include, without limitation, a structure capable of operating the polynucleotide, for example, included in a vector to express a gene operably linked in an introduced host cell. It may be in the form.
  • compositions may further comprise any suitable excipients conventionally used in compositions for producing homoserine or homoserine derived L-amino acids.
  • excipients may be, for example, but not limited to, preservatives, wetting agents, dispersants, suspending agents, buffers, stabilizers or isotonic agents.
  • the 285th amino acid is substituted with isoleucine
  • the 398th amino acid is substituted with glutamine, or a combination thereof
  • a method for increasing the production capacity of a microbial homoserine or homoserine-derived L-amino acid is provided.
  • homoserine dehydrogenase and "homoserine or homoserine derived L-amino acid” are as described above.
  • compositions for homoserine or homoserine-derived L-amino acid for production of homoserine or homoserine-derived L-amino acid.
  • L-Threo of homoserine dehydrogenase (hereinafter referred to as Hom, EC: 1.1.1.3), using Corynebacterium glutamicum KFCC10881 (Korean Patent No. 0159812) as a parent strain.
  • AHV 2-amino-3-hydroxy-valerate
  • NTG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
  • NTG treated strains were plated in minimal medium containing 3 g / l AHV, and 155 strains of AHV resistant KFCC10881 strains were obtained through the above procedure.
  • Glucose 20 g Peptone 10 g, Yeast extract 5 g, Urea 1.5 g, KH 2 PO 4 4 g, K 2 HPO 4 8 g, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g, Biotin 100 ⁇ g, Thiamine HCl 1000 ⁇ g, Calcium- 2000 ⁇ g pantothenic acid, 2000 ⁇ g nicotinamide (based on 1 liter of distilled water)
  • the 155 strains of AHV resistant strains obtained in Example 1 were subjected to L-threonine production capacity test.
  • a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of seed medium was inoculated with the 155 strains obtained in Example 1, followed by shaking culture at 200 ° C. at 200 rpm for 20 hours.
  • a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of L-threonine production medium was inoculated with 1 ml of the seed culture and shaken at 200 rpm for 48 hours at 30 ° C.
  • Glucose 30g KH 2 PO 4 2g, Urea 3g, (NH 4) 2 SO 4 40g, Peptone 2.5g, CSL (Sigma) 5g (10 ml), MgSO 4 .7H 2 O 0.5g, Leucine 400mg, CaCO 3 20g (1 liter of distilled water)
  • Table 1 shows the concentrations of the amino acids in the culture medium of the top 22 strains showing excellent L-threonine production among the 155 strains tested. 22 candidates identified through the above process were named as KFCC10881-1 to KFCC10881-22, respectively.
  • L-threonine, L-homoserine, L-glycine, L-alanine, and L-isoleucine produced by 22 strains with AHV resistance increased compared to the control, whereas L-lysine It showed a decreasing result.
  • the biosynthetic pathway of L-threonine and L-lysine is split from aspartate-semialdehyde (ASA).
  • ASA aspartate-semialdehyde
  • homoserine (Hse), L-glycine (Gly), and L-isoleucine (Ile) which may be by-products of the L-threonine biosynthetic pathway, may increase.
  • the sum of production (Thr + Hse + Gly + Ile) was also confirmed.
  • Example 3 Sequence analysis of strains having excellent threonine-producing ability derived from KFCC10881
  • nucleotide sequence of L-threonine biosynthetic enzymes of the strains selected in Example 1 was carried out as follows.
  • the nucleotide sequences of thrB encoding the kinase SEQ ID NO: 2, gene number NCgl1137) were obtained, respectively.
  • hom and thrB are known to have an operon structure (Peoples et al ., Mol. Biol. 2 (1): 63-72, 1988).
  • PCR was performed using primer combinations of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 using the cells of the strains as templates to obtain DNA fragments containing the hom - thrB operon of the selected strains.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase for PCR reaction, and PCR conditions were denaturation 96 ° C., 30 seconds; Annealing 52 ° C., 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 30 times at 72 °C, 3 minutes.
  • the nucleotide sequence was determined by ABI PRISM 3730XL Analyzer (96 capillary type, Applied Biosystems) using the prepared primer.
  • the hom sequence corresponding to hom is that the 854th base cytosine of SEQ ID NO: 1 is mutated to thiamin so that an ACT gene codon encoding a threonine residue is ATT gene codon encoding an isoleucine residue. (T285I mutation; SEQ ID NO: 6).
  • nucleotide sequence corresponding to the hom - thrB operon in KFCC10881-14 showed that the 1193th base guanine of SEQ ID NO: 1 was mutated to adenine, so that the CGA gene codon encoding an arginine residue was mutated to a CAA gene codon encoding a glutamine residue. It was found (hereinafter R398Q variant; SEQ ID NO: 7).
  • nucleotide sequence corresponding to the hom - thrB operon in KFCC10881-19 indicates that the guanine, which is the 1132th base of SEQ ID NO: 1, is mutated to cytosine so that the GGG gene codon encoding a glycine residue is mutated to a TGG gene codon encoding a tryptophan residue. It was found (hereinafter G378W variant; SEQ ID NO: 8).
  • nucleotide sequence corresponding to the hom - thrB operon in KFCC10881-22 is a GGG gene codon serine residue encoding a glycine residue by mutating 1132 base guanine to adenine and 1134 base guanine to cytosine. It was found that the mutation was transformed into AGC gene codon (hereinafter G378S mutation; SEQ ID NO: 9). On the other hand, no mutation was found in thrB corresponding to SEQ ID NO: 2.
  • the Hom (SEQ ID NO: 10) expressed in KFCC10881-1 is a Hom expressed in isoleucine (hereinafter referred to as T285I variant) and KFCC10881-14, which is the 285th amino acid residue.
  • SEQ ID NO: 11 is the 398th amino acid residue arginine glutamine (hereinafter referred to as R398Q variant)
  • Hom (SEQ ID NO: 12) expressed in KFCC10881-19 is glycine tryptophan (hereinafter referred to as G378W variant) 378 amino acid residue, KFCC10881-22 Hom (SEQ ID NO: 13) expressed in it was found that the 378 amino acid residue glycine is desensitized to the inhibition of feedback by L-threonine by changing to serine (hereinafter, G378S mutation).
  • the primers of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 were prepared to prepare strains in which the variants (T285I, R398Q, G378W, G378S) identified in Example 2 were introduced from the wild type strain.
  • PfuUltra TM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase for PCR reaction, and PCR conditions were denatured 95 ° C., 30 seconds; Annealing 55 ° C., 30 seconds; And the polymerization reaction 72 °C, 2 minutes was repeated 28 times.
  • Each of the prepared vectors was transformed into Corynebacterium glutamicum ATCC13032 by electroporation, and the strains were substituted with mutant bases on the chromosomes through a second crossover process. Appropriate substitutions were matched to each variant sequence using Mutant Allele Specific Amplification (MASA) PCR techniques (Takeda et al ., Hum. Mutation, 2, 112-117 (1993)) using the primer combinations listed below.
  • MASA Mutant Allele Specific Amplification
  • CTR-T285I SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17, CTR-R398Q: SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 18, CTR- G378W: SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 19, CTR-G378S: SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 20
  • CTR-T285I SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17
  • CTR-R398Q SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 18
  • CTR- G378W SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 19
  • CTR-G378S SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 20
  • CTR-T285I, CTR-R398Q, CTR-G378W, CTR-G378S prepared in Example 4 and wild-type strain were inoculated into 25 ml of the following seed medium with the control group, and then cultured to the second half of the log phase. The cells were collected by centrifugation, washed twice with 0.1 M potassium phosphatepH7.6) buffer, and finally suspended in 2 ml of the same buffer solution containing glycerol at a concentration of 30%.
  • Example 6 Preparation and Evaluation of Microorganism Strains of Corynebacterium Species with L-Threonine Production Capacity
  • L-threonine producing strains were developed from the wild species Corynebacterium glutamicum ATCC13032. Specifically, leucine, amino acid 377 of lysC, was replaced with lysine to resolve feedback inhibition of aspartate kinase (lysC), which acts as the first important enzyme in the threonine biosynthetic pathway. Number 22).
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 using the chromosome of ATCC13032 as a template to prepare strains into which the lysC (L377K) mutation was introduced.
  • PfuUltra TM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase for PCR reaction, and PCR conditions were denatured 95 ° C., 30 seconds; Annealing 55 ° C., 30 seconds; And repeating the polymerization reaction 72 DEG C for 1 minute 28 times.
  • a 515 bp DNA fragment at the top of 5 'and a 538 bp DNA fragment at the bottom of 3' were obtained based on the mutation of the lysC gene.
  • PCR amplification was carried out using primers of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 26 using two amplified DNA fragments as templates. PCR conditions were modified for 5 minutes at 95 °C, 95 °C 30 seconds denaturation, 55 °C 30 seconds annealing, 72 °C 2 minutes polymerization was repeated 28 times, and then the polymerization reaction was carried out at 72 °C 5 minutes.
  • a 1023 bp DNA fragment containing a mutation in the lysC gene encoding the aspartokinase variant in which the 377th leucine was substituted with lysine was amplified.
  • the amplified product was purified using QUIAGEN's PCR Purification kit and used as an insert DNA fragment for vector production.
  • the molarity (M) ratio of the pDZ vector heat-treated at 65 ° C. for 20 minutes and the inserted DNA fragment amplified by the PCR was 1: 2, thereby integrating the TaKaRa Infusion Cloning Kit.
  • Vector pDZ-L377K was introduced to introduce L377K mutations on the chromosome by cloning according to the manual provided using.
  • the produced vector was transformed into ATCC13032 by electroporation, and a second crossover process was carried out to obtain a strain in which each base variation was substituted with a mutant base on a chromosome, which was named CJP1.
  • Example 4 In order to clearly confirm the L-threonine production change of the strain, the mutations identified in Example 4 were introduced into the gene encoding homoserine dehydrogenase, respectively. Specifically, pDZ-T285I, pDZ-R398Q, pDZ-G378W pDZ-G378S vectors prepared in Example 4 were introduced into CJP1 to introduce T285I, R398Q, G378W, and G378S variants into the CTR-L377K strain, respectively. In the same manner as in Example 4, a second crossover was carried out to obtain a strain in which each base variation was substituted with a mutant base on a chromosome. Strains substituted with each variant base were named CJP1-T285I, CJP1-R398Q, CJP1-G378W, CJP1-G378S.
  • strains CJP1-T285I and CJP1-R398Q were deposited on September 26, 2017 at the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM), an international depository institution under the Budapest Treaty, and were given accession numbers as KCCM12119P and KCCM12120P, respectively.
  • KCCM Microorganism Conservation Center
  • pDZ-R398Q vector was transformed into CJP1-T285I strain to obtain strains containing both T285I and R398Q mutations, and strains were obtained in the same manner as above (CJP1-T285I, R398Q).
  • pDZ-R398Q vector was transformed into CJP1-G378W to obtain strains containing both G378W and R398Q mutations, and strains were obtained in the same manner as above (CJP1-G378W, R398Q).
  • Example 7 Preparation and Evaluation of Microorganism Strains of Corynebacterium Species with L-Isoleucine Production Capacity
  • a pair of primers (SEQ ID NOs: 27 and 28) for amplifying a 5 'top region around a mutation position and a pair of primers for amplifying a 3' bottom region to prepare a mutation introduction vector for an ilvA gene. Nos. 29 and 30) were devised.
  • the primers of SEQ ID NOs: 27 and 30 inserted a BamHI restriction enzyme site (underlined) at each end, and the primers of SEQ ID NOs: 28 and 29 were positioned so that nucleotide substitution mutations (underlined) were located at sites designed to cross each other. It was.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 using the wild type chromosome as a template. PCR conditions were modified for 5 minutes at 95 °C, 95 °C 30 seconds denaturation, 55 °C 30 seconds annealing, 72 °C 30 seconds polymerization was repeated 30 times, and then polymerization was carried out at 72 °C 7 minutes. As a result, a 627 bp DNA fragment at the top of 5 'and a 608 bp DNA fragment at the bottom of 3' were obtained based on the mutation of the ilvA gene.
  • PCR amplification was carried out using primers of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 30 using two amplified DNA fragments as templates. After 5 minutes of denaturation at 95 ° C., 95 ° C. 30 seconds of modification, 55 ° C. 30 seconds of annealing, and 72 ° C. 60 seconds of polymerization were repeated 30 times, followed by polymerization at 72 ° C. for 7 minutes. As a result, a 1217 bp DNA fragment containing a mutation in the ilvA gene encoding the IlvA variant in which the 323th valine was substituted with alanine was amplified. The plasmid was obtained by treating the pECCG117 (Korean Patent No.
  • pECCG117- ilvA (V323A) vector was introduced into the CJP1-T285I, R398Q, CJP1-G378W, R398Q, CJP1-T285I, G378W strains prepared in Example 6, and then contained 25 mg / L of kanamycin. Transformants were obtained by plating on one selection medium. Cultured in the same manner as in the flask culture method shown in Example 2, the concentration of L-isoleucine in the culture was analyzed and shown in Table 6.
  • strain containing the hom (G378W) mutation was confirmed that the L-isoleucine production capacity 0.2g / L compared to the control strain.
  • strains containing hom mutations in which both mutations were introduced at the same time improved L-isoleucine production ability by 0.3-0.5 g / L compared to the control strain, among which CJP1-T285I, R398Q / pECCG117 containing both variants of T285I and R398Q.
  • 1.1 g / l L-isoleucine was produced in the ilvA (V323A) strain.
  • the metB gene encoding cystathionine gamma-synthase of O-acetyl-homoserine degradation pathway was obtained by PCR using chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template. Secured. Obtains base sequence information of the metB gene (NCBI accession number Ncgl2360, SEQ ID NO: 31) based on NIH GenBank of the National Institutes of Health, and based on this, contains the N-terminal portion and linker sequence of the metB gene. Primers (SEQ ID NOs: 32, 33), primers containing the C-terminal and linker moieties (SEQ ID NOs: 34, 35) were synthesized.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template and the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 32, 33, 34, and 35 as primers.
  • the polymerase was PfuUltra TM high-trust DNA polymerase (Stratagene), and PCR conditions were denatured 96 ° C., 30 seconds; Annealing 53 ° C., 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 30 times at 72 °C, 1 minute.
  • 500bp amplified gene containing the N-terminal portion and linker of metB gene and 500bp amplified gene containing the C-terminal portion and linker of metB gene were obtained.
  • PCR was performed using the two amplified genes obtained as templates, and the PCR conditions were denatured at 96 ° C. for 60 seconds; Annealing 50 ° C., 60 seconds; And repeating the polymerization reaction 72 ° C. for 1 minute 10 times and then repeating the sequence 20 times after addition of SEQ ID NOs: 32 and 35.
  • an amplified ⁇ metB gene of 1000bps which is a metB inactivation cassette containing N-terminal-linker-C-terminal of the metB gene, was obtained.
  • the produced pDZ- ⁇ metB vector was transformed into Corynebacterium glutamicum ATCC13032, ATCC13032 :: Hom FBR , and the second cross-over process was performed to corynebacterium glutamicum ATCC13032 ⁇ metB , which metB gene was inactivated on the chromosome.
  • ATCC13032 :: Hom FBR ⁇ metB was obtained.
  • the inactivated metB gene was finally identified by PCR using primers of SEQ ID NOs: 32 and 35 and compared with ATCC13032, in which the metB gene was not inactivated.
  • O-acetylhomoserine (thiol) -lyase of O-acetyl-homoserine degradation pathway through PCR using chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template.
  • MetY gene coding for was obtained. Based on the NIH GenBank of the US National Institutes of Health, the nucleotide sequence information of the metY gene (NCBI accession number Ncgl0625, SEQ ID NO: 36) was obtained, and based on this, the N-terminal portion and linker sequence of the metY gene were included.
  • Primers SEQ ID NOs: 37, 38
  • primers containing the C-terminal and linker moieties SEQ ID NOs: 39, 40 were synthesized.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template and oligonucleotides of SEQ ID NOs: 37 and 38 and SEQ ID NOs: 39 and 40 as primers.
  • the polymerase was PfuUltra TM high-trust DNA polymerase (Stratagene), and PCR conditions were denatured 96 ° C., 30 seconds; Annealing 53 ° C., 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 30 times at 72 °C, 1 minute.
  • 500bp amplified gene containing the N-terminal portion and linker of metY gene and 500bp amplified gene containing the C-terminal portion and linker of metY gene were obtained.
  • PCR was performed using the two amplified genes obtained as templates, and the PCR conditions were denatured at 96 ° C. for 60 seconds; Annealing 50 ° C., 60 seconds; And repeating the polymerization reaction 72 ° C. for 1 minute 10 times and then repeating the sequence 20 times after addition of SEQ ID NOs: 37 and 40.
  • an amplified ⁇ metY gene of 1000bps which is a metB inactivation cassette containing N-terminal-linker-C-terminal of the metY gene, was obtained.
  • the metY gene obtained through the PCR was treated with restriction enzymes XbaI and SalI contained at the ends, cloned into the pDZ (KR2008-0025355) vector treated with restriction enzymes XbaI and SalI through ligation and finally met Y.
  • a pDZ- ⁇ metY recombinant vector was constructed in which the inactivation cassette was cloned.
  • the produced pDZ- ⁇ metY vector was transformed into Corynebacterium glutamicum ATCC13032, ATCC13032 :: Hom FBR , ATCC13032 ⁇ metB , ATCC13032 :: Hom FBR ⁇ metB strains, and the second crossover process inactivates the metY gene on the chromosome.
  • Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ⁇ metY , ATCC13032 :: Hom FBR ⁇ metY , ATCC13032 ⁇ metB ⁇ metY , ATCC13032 :: Hom FBR ⁇ metB ⁇ metY were obtained.
  • the inactivated metY gene was confirmed by PCR using primers of SEQ ID NOs: 37 and 40, and then compared with ATCC13032 in which the metY gene was not inactivated.
  • O-acetyl-L-homoserine did not accumulate when culturing the control strain Corynebacteria glutamicum ATCC13032 as shown in Table 7, whereas ATB13032 ⁇ metB , ATCC13032 ⁇ metY , ATCC13032 ⁇ in which metB, metY, and metBY were inactivated. It was confirmed that 0.3, 0.3, and 0.5 g / L of O-acetyl-L-homoserine accumulated in metB ⁇ metY strains, respectively.
  • ATCC13032 Hom FBR strain substituted with the hom gene in a mutant form
  • ATCC13032 Hom FBR ⁇ metB
  • ATCC13032 Hom FBR ⁇ metY
  • ATCC13032 Hom in which metB, metY, and metBY are inactivated in the strain, respectively
  • FBR ⁇ metB ⁇ metY strain 1.2, 1.4 and 3.5 g / L of O-acetyl-L-homoserine were confirmed to be accumulated.
  • mcbR J. Biotechnol. 103: 51-65, 2003
  • mcbR J. Biotechnol. 103: 51-65, 2003
  • encoding a known methionine cysteine transcriptional regulator protein in the strains prepared in Example 6 to prepare a methionine producing strain Vectors were prepared for inactivation of.
  • a recombinant plasmid vector was constructed by the following method. Based on the nucleotide sequence reported to the National Institutes of Health (NIH Genbank), the mcbR gene and peripheral sequence (SEQ ID NO: 41) of Corynebacterium glutamicum were obtained.
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, and SEQ ID NO: 45 with the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 as a template for the purpose of obtaining the deleted mcbR gene. It was. PCR conditions were modified for 5 minutes at 95 °C, 95 °C 30 seconds denaturation, 53 °C 30 seconds annealing, 72 °C 30 seconds polymerization was repeated 30 times, and then polymerization was carried out at 72 °C 7 minutes. As a result, 700 bp DNA fragments were obtained, respectively.
  • the non-replicable pDZ vector (Korean Patent Registration No. 10-0924065) and the amplified mcbR gene fragments in Corynebacterium glutamicum were treated with restriction enzyme smaI for chromosome introduction, followed by DNA conjugated enzyme. After ligation, E. coli DH5 ⁇ was transformed and plated in LB solid medium containing kanamycin (25 mg / L). The colonies transformed with the vector into which the defective fragments of the desired genes were inserted by PCR were selected, and then plasmids were obtained by plasmid extraction and named pDZ- ⁇ mcbR.
  • the strains of the mcbR gene were identified by PCR using primers 46 and 47. Each are the recombinant strains of Corynebacterium glutamicum CJP1-G378W / ⁇ mcbR, CJP1 -T285I, R398Q / ⁇ mcbR, CJP1-G378W, R398Q / ⁇ mcbR, CJP1-T285I, G378W / ⁇ mcbR, CJP1 / ⁇ mcbR Named this.
  • Corynebacterium glutamicum CJP1 / ⁇ mcbR the invention Corynebacterium glutamicum CJP1-G378W / ⁇ mcbR, CJP1 -T285I, R398Q / ⁇ mcbR , CJP1-G378W, R398Q / ⁇ mcbR, CJP1-T285I, G378W / ⁇ mcbR were inoculated and shaken at 200 rpm for 20 hours at 30 ° C.
  • a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of production medium was then inoculated with 1 ml of seed culture and shaken at 200 rpm for 48 hours at 30 ° C.
  • the composition of the seed medium and the production medium is as follows.
  • Glucose 20 g Peptone 10 g, Yeast extract 5 g, Urea 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, Biotin 100 ⁇ g, Thiamine HCl 1000 ⁇ g, Calcium-pantothenic acid 2000 ⁇ g, Nicotinamide 2000 ⁇ g ( 1 liter of distilled water)
  • Glucose 50 g (NH4) 2S2O3 12 g, Yeast extract 5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 ⁇ 7H2O 1.2 g, biotin 100 ⁇ g, thiamine hydrochloride 1000 ⁇ g, calcium-pantothenic acid 2000 ⁇ g, nicotinamide 3000 ⁇ g, CaCO3 30 g ( Based on 1 liter of distilled water).

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Abstract

본 출원은 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산 방법
본 출원은 변이형 호모세린 디하이드로게나제에 관한 것으로, 구체적으로 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드를 갖는 변이형 호모세린 디하이드로게나제로서, 상기 아미노산 치환은 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환된 것, 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환된 것 또는 이들의 조합을 포함하는 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용하여 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 생산하는 방법, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산 생산용 조성물, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산능 증가 방법 또는 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제의 용도에 관한 것이다.
L-아미노산 중 L-쓰레오닌, L-이소류신 및 L-메티오닌은 아스파테이트-세미알데하이드(aspartate-semialdehyde, 이하 ASA)에서 호모세린 디하이드로게나제(homoserine dehydrogenase, 이하 Hom, EC:1.1.1.3)에 의해 생성된 호모세린을 공통적으로 이용한다. 따라서 상기 아미노산들을 발효법으로 생산하기 위해서는 생합성 경로에서 이용되는 효소들의 활성을 일정 수준 이상으로 유지하는 것이 필수적이며, 이에 대한 집중적인 연구가 이루어져 왔다.
특히, L-라이신과 L-쓰레오닌 생합성 경로의 분지점에서 작용하는 호모세린 디하이드로게나제는 L-쓰레오닌 및 L-이소류신에 의해 활성이 조절되는 것으로 알려져 있다. L-쓰레오닌에 의한 피드백 억제에 탈감작화된 Hom 및 이를 이용한 L-쓰레오닌의 생산방법에 관해서는 종래에 몇몇 보고가 있어 왔다. 1991년 독일의 Eikmann 등은 Hom의 378번째 아미노산 잔기인 글라이신이 글루타메이트로 전환되어 탈감작화된 Hom를 보고하였으며(Eikmanns BJ et al., Appl. Microbial Biotechnol. 34: 617-622, 1991), 1991년 미국의 Archer 등은 프레임쉬프트 돌연변이로 인해 Hom의 C-말단이 손상될 경우, 탈감작화 특성을 나타낸다는 것을 보고하였다(Archer JA et al., Gene 107: 53-59, 1991).
본 발명자들은 쓰레오닌에 의한 피드백 저해 탈감작화 연구를 수행하던 중 변이형 Hom을 코딩하는 신규 유전자를 분리하고, 상기 신규 유전자가 형질도입된 미생물에서 L-아미노산 생산능이 향상됨을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은, 호모세린 디히드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 갖는 변이형 호모세린 디하이드로게나제로서, 상기 아미노산 치환은 285번째 아미노산 또는 398번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된 것을 포함하는, 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은, 상기 변이형 디하이드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은, 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는, 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은, 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 상기 미생물 또는 배지로부터 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은, 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제 또는 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물을 포함하는, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은, 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 코리네박테리움 속 미생물에서 발현시키는 단계를 포함하는, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산능 증가 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산을 위한, 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제의 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산을 위한, 상기 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산을위한, 상기 코리네박테리움 속 미생물의 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산을 위한, 상기 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제는 천연형 또는 야생형에 비하여 최종 산물에 의한 피드백 억제가 탈감작화되어 보다 효율적인 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 대량 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 갖는 변이형 호모세린 디하이드로게나제로서, 상기 아미노산 치환은 285번째 아미노산 또는 398번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된 것을 포함하는, 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 제공한다.
구체적으로는 호모세린 디히드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 갖는 변이형 호모세린 디하이드로게나제로서, 상기 아미노산 치환은 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환되거나 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된 것을 포함하는, 호모세린 디히드로게나제 변이체를 제공한다. 보다 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환되거나, 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된, 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 제공한다.
본 출원에서 호모세린 디하이드로게나제(homoserine dehydrogenase, EC:1.1.1.3)는 식물, 미생물에 있어 메티오닌, 쓰레오닌, 이소류신 생합성의 공통 중간물질인 호모세린의 합성을 촉매하는 효소를 의미하며, 호모세린 탈수소효소로도 불린다. 본 출원에서 호모세린 디하이드로게나제는 상기 전환 활성을 가지는 단백질이라면 유래에 상관없이 포함될 수 있으며, 임의의 유기체(식물 및 미생물 등)로부터 유래하는 효소를 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 호모세린 디하이드로게나제는 코리네박테리움 속 미생물 유래일 수 있고, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 (corynebacterium glutamicum) 유래일 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에 있어서, 호모세린 디하이드로게나제를 확보하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법이 적용 가능하다. 그 방법의 예로는 단백질 발현에 통상적으로 널리 이용되는 코리네박테리움 속 미생물에서 단백질을 고효율로 확보할 수 있도록 코돈 최적화가 포함된 유전자 합성 기술 그리고 미생물의 대량 유전체 정보를 기반으로 생물정보학적 방법에 의해 유용 효소자원의 스크리닝 방법을 통해 확보할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서의 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질은 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열, 예를 들어 서열번호 1의 아미노산 서열, 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본원의 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질에 해당된다. 구체적인 예를 들어, 본원의 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다.
또한, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 예를 들어, 본 출원에서의 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질은 코리네박테리움 글루타미쿰(corynebacterium glutamicum) 유래의 호모세린 디하이드로게나제일 수 있다. 보다 구체적으로는, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 호모세린 디하이드로게나제의 아미노산 서열(서열번호 1), 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 유래의 호모세린 디하이드로게나제의 아미노산 서열(서열번호 49), 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 호모세린 디하이드로게나제의 아미노산 서열(서열번호 50)일 수 있다. 상기 서열을 갖는 호모세린 디하이드로게나제는 서로 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성을 보이며, 호모세린 디하이드로게나제로서 상응하는 효능을 나타내므로 본 출원의 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질에 포함됨은 자명하다.
상기 "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원에서 용어 "변이", "변이형" 또는 "변이체"는 유전적 또는 비유전적으로 하나의 안정적인 표현형적 변화를 나타내는 배양물이나 개체를 뜻한다. 구체적으로는 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질에 상응하는 아미노산 서열상에서 하나 이상의 아미노산이 변이되어 그 활성이 야생형, 천연형 또는 비변이형과 비교하여 효율적으로 증가되거나, 이소류신, 쓰레오닌, 이들의 유사체 또는 유도체에 대한 피드백 저해가 해제되거나 활성 증가와 피드백 저해 해제가 모두 이루어진 변이체를 의미할 수 있다.
본 출원에서 변이형 호모세린 디하이드로게나제는, "변이된 호모세린 디하이드로게나제", 또는 " 호모세린 디하이드로게나제 변이체"로 혼용될 수 있다. 한편, 이러한 변이체는 비자연적인 (non-naturally occurring) 것일 수 있다.
본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제는 구체적으로, 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 갖는 변이형 단백질로서, 상기 아미노산 치환은 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환된 것, 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환된 것 또는 이들의 조합을 포함하는 변이형 호모세린 디하이드로게나제일 수 있다. 상기 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열은 앞서 설명한 바와 같고, 예를 들어 서열번호 1의 아미노산 서열일 수 있다. 또한 상기 285번째 아미노산은 쓰레오닌이 이소류신으로 치환된 것일 수 있으며, 상기 398번째 아미노산은 아르기닌이 글루타민으로 치환된 것일 수 있다.
또한 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제는 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 갖는 변이형 단백질로서, 상기 아미노산 치환은 378번째 아미노산이 트립토판으로 치환된 것을 포함하는 변이형 호모세린 디하이드로게나제일 수 있다. 또한, 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드를 갖는 변이형 단백질로서, 상기 아미노산 치환은 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환되거나 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된 변이형 호모세린 디하이드로게나제에, 378번째 아미노산이 트립토판으로 추가적으로 치환된 것일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 378번째 아미노산은 글리신이 트립토판으로 치환된 것일 수 있다.
보다 더욱 구체적으로, 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드를 갖는 변이형 단백질로서, 상기 아미노산 치환은 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환된 것, 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환된 것 또는 이들의 조합을 포함하는, 변이형 호모세린 디하이드로게나제일 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제는 서열번호 10, 11, 12 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 또한 상기 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제와 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질에 해당된다. 구체적인 예를 들어, 본원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제는 서열번호 10, 11, 12 또는 13의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다
또한 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제는 호모세린 디하이드로게나제 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드를 갖는 변이형 호모세린 디하이드로게나제로서, 285번째 아미노산 또는 398번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이를 포함하고, 호모세린 디하이드로게나제로서 상응하는 효능을 나타내는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다
또한, 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제는 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 야생형 또는 천연형 단백질, 또는 비변형 단백질과 달리, 최종 산물인 이소류신, 쓰레오닌, 메티오닌, 호모세린 또는 이들의 유도체 또는 유사체에 의한 피드백 저해가 해제되거나 탈감작된 특징을 가지는 것일 수 있다. 본 출원에서 용어, "피드백 저해 (feedback inhibition)"는 대사의 최종산물이 그보다 전단계 있는 반응을 저해하는 것을 말한다. 따라서, 호모세린 디하이드로게나제의 피드백 저해를 해제하거나 탈감작하는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 미생물의 호모세린 및 호모세린 유래 L-아미노산의 생산성을 높일 수 있다.
상기 호모세린 유래 L-아미노산은 L-호모세린을 전구체로하여 생합성할 수 있는 L-아미노산을 의미하며, L-호모세린으로부터 생합성 될 수 있는 물질이라면 제한되지 않는다. 상기 호모세린 유래 L-아미노산은 호모세린 유래 L-아미노산뿐만 아니라 이의 유도체도 포함할 수 있다. 예를 들어 L-쓰레오닌, L-이소류신, O-아세틸-L-호모세린, O-석시닐-L-호모세린, O-포스포-L-호모세린, L-메티오닌 및/또는 L-글리신일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로는 L-쓰레오닌, L-이소류신, O-아세틸-L-호모세린, O-석시닐-L-호모세린 및/또는 L-메티오닌 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 호모세린 디하이드로게나제, 변이형에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 변이형 상기 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다. 본 출원의 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 본 출원의 호모세린 디하이드로게나제 활성을 갖는 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원에서 호모세린 디하이드로게나제 변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 구체적으로 코리네박테리움 속 미생물 유래일 수 있으며, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 유래일 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로는, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 실질적으로 상기 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 폴리뉴클레오티드 서열도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 본 출원의 호모세린 디하이드로게나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 48의 폴리뉴클레오티드 서열 일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 또한 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 10, 11, 12 또는 13을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 6, 7, 8, 9의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1xSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1xSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1xSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드의 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물을 제공한다. 구체적으로는 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속(the genus of Corynebacterium) 미생물을 제공하는 것이다. 또한 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는, L-알라닌을 생산하는 코리네박테리움 속(the genus of Corynebacterium) 미생물을 제공하는 것이다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
상기 호모세린 디하이드로게나제, 변이체에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
구체적으로 본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물은 자연적으로 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산능이 없는 모균주에 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 구체적으로 상기 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환되거나 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된, 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 발현하는 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 미생물은, 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어 변이형 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 상기 숙주세포 또는 미생물은 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하여 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다.
본 출원의 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물은 야생형 또는 비변형 호모세린 디하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질을 포함하는 미생물에 비하여 호모세린, 호모세린 유래 L-아미노산 또는 L-알라닌의 생산능이 향상되므로, 이들 미생물로부터 호모세린, 호모세린 유래 L-아미노산 또는 L-알라닌을 고수율로 수득할 수 있다.
본 출원에서 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물은 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있다. 보다 구체적으로는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속하는 미생물일 수 있다.
본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 암모니아게네스, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens) 등이나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로는, 본 출원에서 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.
한편, 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물은 호모세린 디하이드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입된 미생물일 수 있다. 구체적으로 상기 도입은 형질전환에 의해 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 폴리뉴클레오티드 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 형질전환 하는 방법은 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (Ca(H2PO4)2, CaHPO4, 또는 Ca3(PO4)2) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물은, 코리네박테리움 속 미생물에 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하도록 형질전환된 것일 수 있다. 상기 코리네박테리움속 미생물은 예시적으로 2-amino-3-hydroxy-valerate(AHV)에 내성을 갖는 균주; 쓰레오닌 생합성 경로에서 첫번째 중요한 효소로 작용하는 aspartate kinase(lysC)의 피드백 저해(feedback inhibition) 해소를 위해 lysC의 377번 아미노산인 루신(Leucine)을 라이신(Lysine)으로 치환하여, L-쓰레오닌을 생산하는 균주; 상기 L-쓰레오닌을 생산하는 균주에서 L-쓰레오닌 디하이드라타제(L-threonine dehydratase, isoleucine 생합성 경로의 첫 번째 효소)를 코딩하는 유전자 ilvA의 323번째 아미노산을 알라닌으로 치환하여 L-이소류신을 생산하는 균주 (Appl. Enviro. Microbiol., Dec. 1996, p.4345-4351); O-아세틸-호모세린 분해경로의 O-아세틸-호모세린 티올 리아제(O-acetylhomoserine (thiol)-lyase) 및, 시스타치오닌 감마 신타제(cystathionine gamma-synthase) 단백질이 불활성화되어 O-아세틸 호모세린을 생산하는 균주; 또는 메티오닌 시스테인 전사 조절인자 단백질이 불활성화되어 메티오닌을 생산하는 균주가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 기술된 미생물을 배지에서 배양하는 단계 및 상기 미생물 또는 배지로부터 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산 의 생산 방법을 제공한다.
상기 미생물은 상기 설명한 바와 같이 본 출원의 호모세린 디하이드로게나제 변이체를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물일 수 있으며, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 또한, 상기 코리네박테리움 속 미생물 또는 코리네박테리움 글루타미쿰은 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 생산하는 미생물일 수 있다. 상기 호모세린 유래 L-아미노산은 호모세린 유래 L-아미노산뿐만 아니라 이의 유도체도 포함할 수 있다. 예를 들어 L-쓰레오닌, L-이소류신, O-아세틸-L-호모세린, O-석시닐-L-호모세린, O-포스포-L-호모세린, L-메티오닌 및/또는 L-글리신일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로는 L-쓰레오닌, L-이소류신, O-아세틸-L-호모세린, O-석시닐-L-호모세린 및/또는 L-메티오닌 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 코리네박테리움 속 미생물 또는 코리네박테리움 글루타미쿰은 L-알라닌을 생산하는 미생물일 수 있다.
상기 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산은, 본 출원의 기술된 미생물이 생산한 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산 배양액이거나, 배양의 상등액이거나, 이의 가공물이거나 또는 이의 정제된 형태일 수 있다. 또한 그 자체 형태뿐 아니라, 이의 염 형태도 모두 포함함은 당업자에게 자명하다.
상기 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 생산하는 방법은 당업계에 공지된 최적화된 배양 조건 및 효소 활성 조건에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다
상기 방법에 있어서 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 쓰레오닌, 이소류신, 또는 아세틸호모세린은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 산물을 수득할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적 물질인 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 회수 할 수 있다. 또한, 상기 회수 단계는 추가적인 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 배양 단계 또는 회수 단계 전 후에 목적하는 산물의 회수율을 증가시키기 위한 추가적인 공정이 삽입될 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태로서, 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제 또는 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물을 포함하는, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산 생산용 조성물을 제공한다.
상기 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산 생산용 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환되거나, 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된, 변이형 호모세린 디하이드로게나제, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, , 또는 이를 포함하는 미생물을 포함하여, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 생산할 수 있는 조성물을 의미한다. 그 예로, 상기 폴리뉴클레오티드는, 추가로 상기 폴리뉴클레오티드를 작동시킬 수 있는 구성을 제한없이 포함할 수 있으며, 예를 들어, 도입된 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있게 벡터 내에 포함된 형태일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태로서, 호모세린 디하이드로게나제 활성을 갖는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 285번째 아미노산을 이소류신으로 치환하거나, 398번째 아미노산을 글루타민으로 치환하거나 또는 이들의 조합으로 치환하는 단계를 포함하는,미생물의 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산능 증가 방법을 제공한다.
상기 용어, " 호모세린 디하이드로게나제", 및 “호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산”은 전술한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태로서, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산을 위한, 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제의 용도를 제공한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태로서, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산을 위한, 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태로서, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산을 위한, 상기 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는, 코리네박테리움 속 미생물의 용도를 제공한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태로서, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산을 위한, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산용 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인공변이법을 통한 AHV 내성 미생물 스크리닝
본 실시예에서는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881(대한민국 등록특허 제0159812호)을 모균주로 하여 호모세린 디하이드로게나제(homoserine dehydrogenase, 이하, Hom, EC:1.1.1.3)의 L-쓰레오닌에 의한 피드백 억제를 해제하기 위하여 L-쓰레오닌 유사체인 2-amino-3-hydroxy-valerate(이하, AHV)에 대한 내성을 부여하는 실험을 실시하였다.
N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine: 이하, NTG)을 사용한 인공변이법으로 변이를 유도하였다. 종배지에서 18시간 동안 배양한 KFCC10881 균주를 종배지 4 ml에 접종한 후, OD660이 약 1.0이 될 때까지 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균체를 회수한 후, 50 mM Tris-malate 완충용액(pH6.5)으로 2회 세척하여 최종 4 ml의 동일한 완충용액으로 현탁하였다. 균체 현탁액에 최종농도 150 mg/l이 되도록 NTG 용액 (2 mg/ml in 0.05M Tris-malate 완충용액(pH6.5))을 첨가하여 실온에서 20분 간 정치한 후, 원심분리를 통해 균체를 수거하였으며, NTG 제거를 위하여 동일한 완충용액으로 2회 세척하였다. 최종적으로 세척한 균체를 20% 글리세롤 용액 4 ml에 현탁 한 후, 사용 전까지 -70℃에 보관하였다. NTG 처리 균주를 3g/l의 AHV를 포함하는 최소배지에 도말하였으며, 상기 과정을 통하여 155주의 AHV 내성 KFCC10881 균주를 획득하였다.
종배지 (pH 7.0)
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
최소배지 (pH 7.2)
포도당 5 g, KH2PO4 1 g, (NH4)2SO4 5 g, MgSO4 7H2O 0.4 g, NaCl 0.5 g 바이오틴 200 ㎍, 티아민 HCl 100 ㎍, 칼슘-판토텐산 100 ㎍, 니코틴아마이드 0.03 g, 요소 2 g, Na2B4O710H2O 0.09 mg, (NH4)6Mo7O274H2O 0.04 mg, ZnSO47H2O 0.01 mg, CuSO45H2O, MnCl24H2O 0.01 mg, FeCl36H2O 1 mg, CaCl2 0.01 mg (증류수 1 리터 기준)
실시예 2: AHV 내성 KFCC10881 균주에 대한 L-쓰레오닌 생산 테스트
실시예 1에서 획득한 155주의 AHV 내성 균주에 대하여 L-쓰레오닌 생산능 테스트를 진행하였다. 종배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 실시예 1에서 획득한 155주의 균주를 접종한 후, 30℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 L-쓰레오닌 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 48 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
L-쓰레오닌 생산배지 (pH 7.2)
포도당 30g, KH2PO4 2g, Urea 3g, (NH4)2SO4 40g, Peptone 2.5g, CSL(Sigma) 5g(10 ml), MgSO4.7H2O 0.5g, Leucine 400mg, CaCO3 20g(증류수 1 리터 기준)
배양 종료 후 HPLC를 이용하여 생산된 여러 아미노산의 생산량을 측정하였다. 실험한 155주의 균주 중 L-쓰레오닌 생산능이 우수한 것으로 나타난 상위 22주에 대한 아미노산의 배양액 내 농도를 표 1에 나타내었다. 상기 과정을 통하여 확인된 22주의 후보를 각각 KFCC10881-1 내지 KFCC10881-22로 명명하였다.
우수 AHV 내성 균주 L-쓰레오닌 생산 실험
OD Thr Hse Gly Ala Ile Lys Thr+Hse +Gly+Ile
KFCC10881 58.5 0.0 0.1 0.3 0.1 0.0 13.3 0.4
KFCC10881-1 60.1 2.0 1.5 2.8 1.6 2.7 5.7 7.7
KFCC10881-2 57.1 3.0 2.2 0.8 3.1 1.3 12.5 7.3
KFCC10881-3 47.3 2.8 2.3 0.8 3.4 1.4 10.5 7.3
KFCC10881-4 51.7 3.2 2.1 0.8 3.2 1.3 13.4 7.4
KFCC10881-5 58.4 3.1 2.2 0.8 3.3 1.3 12.4 7.4
KFCC10881-6 52.6 3.4 2.5 0.7 3.4 1.0 12.8 7.6
KFCC10881-7 14.2 0.4 0.2 0.3 0.2 0.6 11.1 1.5
KFCC10881-8 55.8 3.0 2.0 0.8 3.3 1.3 13.0 7.1
KFCC10881-9 44.3 3.2 2.8 0.6 3.1 0.9 12.6 7.5
KFCC10881-10 47.5 3.7 3.0 0.7 3.4 0.8 12.6 8.2
KFCC10881-11 57.0 2.7 1.8 0.7 3.4 1.2 11.6 6.4
KFCC10881-12 51.8 3.3 3.5 0.6 3.2 0.9 12.4 8.3
KFCC10881-13 49.8 3.0 2.3 0.7 3.4 1.3 12.8 7.3
KFCC10881-14 62.7 2.4 2.1 2.5 3.2 3.0 3.3 10.0
KFCC10881-15 62.4 2.9 2.7 0.7 3.2 1.1 12.3 7.4
KFCC10881-16 59.6 2.8 2.5 0.8 3.3 1.3 11.4 7.4
KFCC10881-17 24.1 0.1 0.2 0.2 1.6 0.2 10.4 0.7
KFCC10881-18 60.5 2.6 2.5 0.7 3.2 1.0 12.3 6.8
KFCC10881-19 60.0 3.0 1.9 2.8 2.7 3.0 5.4 9.3
KFCC10881-20 65.8 2.7 2.0 0.8 3.4 1.4 13.0 6.9
KFCC10881-21 17.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.6 11.1 1.5
KFCC10881-22 60.1 3.5 1.9 2.0 2.5 2.8 2.7 10.2
표 1의 결과와 같이, AHV 내성을 갖는 22종의 균주가 생산하는 L-쓰레오닌, L-호모세린, L-글리신, L-알라닌, L-이소류신은 대조군 대비 증가한 반면, L-라이신은 감소하는 결과를 보였다.
L-쓰레오닌과 L-라이신의 생합성 경로는 아스파르테이트 세미알데히드(aspartate-semialdehyde, 이하, ASA)를 기점으로 갈라지게 된다. 즉, L-쓰레오닌의 생산량이 늘어날수록 L-라이신의 생산량은 감소하게 된다. 이에 따라 L-쓰레오닌 생산량이 증가할수록 L-쓰레오닌 생합성 경로상 부산물이 될 수 있는 호모세린(Hse), L-글라이신(Gly), L-이소류신(Ile)도 늘어날 수 있으므로, 이들의 생산량의 총합(Thr + Hse + Gly + Ile)도 확인하였다.
따라서, 상기 AHV 내성 균주들 중 L-라이신의 생산량이 감소하고, L-쓰레오닌 생산량이 높고, Thr + Hse + Gly + Ile 전체 생산량이 높은 4종 균주들 (KFCC10881-1, KFCC10881-14, KFCC10881-19, 및 KFCC10881-22)을 가장 우수한 AHV 내성 균주로 선별하였다.
실시예 3: KFCC10881 유래 쓰레오닌 생산능이 우수한 균주들의 염기서열 분석
상기 실시예 1에서 선별한 균주들의 L-쓰레오닌 생합성 효소들의 염기서열을 분석하기 위하여 다음과 같이 진행하였다. KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에서 제공하는 유전자 정보에 근거하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하고 있는 hom의 염기서열(서열번호 1, NCgl1136), 호모세린키나제를 코딩하고 있는 thrB의 염기서열(서열번호 2, 유전자 번호 NCgl1137)을 각각 확보하였다. hom와 thrB는 오페론 구조를 이루고 있는 것으로 알려져 있다 (Peoples et al., Mol. Biol. 2(1):63-72, 1988).
선별된 균주들의 hom-thrB 오페론을 포함한 DNA 단편을 확보하기 위하여 균주들의 균체를 주형으로 사용하여, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 조합으로 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 52℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 3분을 30회 반복하였다. 그 결과, 서열번호 1의 개시코돈 상단으로 프로모터 부위를 포함한 300bp의 염기서열을 포함하여 서열번호 2의 종결코돈 하단 200 bp를 포함한 2778bp의 유전자 단편을 증폭할 수 있었다(서열번호 5).
상기 제작된 프라이머를 이용하여 ABI PRISM 3730XL Analyzer(96 capillary type, Applied Biosystems)로 염기서열을 결정하였다. KFCC10881-1 내의 hom-thrB 오페론 중 hom에 해당하는 염기서열은 서열번호 1의 854번째 염기 시토신이 티아민으로 변이되어 쓰레오닌 잔기를 코딩하는 ACT 유전자 코돈이 이소류신 잔기를 코딩하는 ATT 유전자 코돈으로 변이되었음을 알 수 있었다 (이하 T285I변이; 서열번호 6). 또한, KFCC10881-14 내의 hom-thrB 오페론에 해당하는 염기서열은 서열번호 1의 1193번째 염기 구아닌이 아데닌으로 변이되어 알지닌 잔기를 코딩하는 CGA 유전자 코돈이 글루타민 잔기를 코딩하는 CAA 유전자 코돈으로 변이되었음을 알 수 있었다(이하 R398Q 변이; 서열번호 7). 또한, KFCC10881-19 내의 hom-thrB 오페론에 해당하는 염기서열은 서열번호 1의 1132번째 염기인 구아닌이 시토신으로 변이되어 글리신 잔기를 코딩하는 GGG 유전자 코돈이 트립토판 잔기를 코딩하는 TGG 유전자 코돈으로 변이되었음을 알 수 있었다(이하 G378W변이; 서열번호 8). 또한, KFCC10881-22 내의 hom-thrB 오페론에 해당하는 염기서열은 서열번호 1의 1132번째 염기 구아닌이 아데닌으로, 1134번째 염기 구아닌이 시토신으로 변이되어 글리신 잔기를 코딩하는 GGG 유전자 코돈이 세린 잔기를 코딩하는 AGC 유전자 코돈으로 변이되었음을 알 수 있었다(이하 G378S변이; 서열번호 9). 한편 서열번호 2에 해당하는 thrB에서는 변이가 발견되지 않았다.
상기 염기서열 분석 결과를 종합해 볼 때, 결과적으로 KFCC10881-1내에서 발현되는 Hom(서열번호 10)은 285번째 아미노산 잔기인 쓰레오닌이 이소류신(이하 T285I 변이), KFCC10881-14내에 발현되는 Hom(서열번호 11)은 398번째 아미노산 잔기인 아르기닌이 글루타민(이하 R398Q 변이), KFCC10881-19내에 발현되는 Hom(서열번호 12)은 378번째 아미노산 잔기인 글리신이 트립토판(이하 G378W 변이), KFCC10881-22내에 발현되는 Hom(서열번호 13)은 378번째 아미노산 잔기인 글리신이 세린(이하 G378S 변이)으로 변이됨으로써 L-쓰레오닌에 의한 피드백 억제에 탈감작화 되었음을 알 수 있었다.
실시예 4: 신규 호모세린 디하이드로게나제 도입 균주 제작
상기 실시예 2에서 확인한 변이체들(T285I, R398Q, G378W, G378S)이 야생형 균주 유래로 도입된 균주를 제작하기 위하여 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머를 제작하였다.
T285I, R398Q, G378W, G378S hom변이가 각각 도입된 균주들을 제작하기 위해 KFCC10811-1, KFCC10811-14, KFCC10811-19, KFCC10811-22 균주로부터 각각 추출한 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머를 사용하여 각각 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복하였다. 그 결과, 1338bp의 hom 유전자의 약 300bp 프로모터 부위를 포함한 1668bp의 유전자 단편을 각각 수득하였다. 증폭산물을 QUIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 한편 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 T285I, R398Q, G378W, G378S 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDZ-T285I, pDZ-R398Q, pDZ-G378W, pDZ-G378S를 제작하였다.
각각 제작된 벡터를 전기천공법에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 각각 변이형 염기로 치환되어 있는 균주를 얻었다. 적절한 치환 여부는 아래에 열거된 프라이머 조합을 사용하여 MASA(Mutant Allele Specific Amplification) PCR 기법(Takeda et al., Hum. Mutation, 2, 112-117 (1993))을 사용하여 각 변이형 서열에 부합하는 프라이머 조합(CTR-T285I : 서열번호 16 및 서열번호 17, CTR-R398Q : 서열번호 16 및 서열번호 18, CTR- G378W : 서열번호 16 및 서열번호 19, CTR-G378S : 서열번호 16 및 서열번호 20)에서는 증폭되는 균주를 선별함으로써 1차 결정하였으며, 선별된 균주의 hom 서열분석은 서열번호 16 및 서열번호 21을 이용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 변이형 서열 분석함으로써 2차 확인하였다. 각각의 변이형 염기로 치환된 균주는 CTR-T285I, CTR-R398Q, CTR-G378W, CTR-G378S로 명명하였다.
실시예 5: 호모세린 디하이드로게나제 효소활성의 측정
상기 제작한 균주들를 대상으로 Hom 효소활성을 측정하였다. 실시예 4에서 제작된 CTR-T285I, CTR-R398Q, CTR-G378W, CTR-G378S 및 대조군으로 야생형 균주(ATCC13032)를 하기 종배지 25 ml에 접종한 후, 대수기 후반부까지 배양하였다. 원심분리를 통하여 균체를 회수하여, 0.1 M potassium phosphatepH7.6) 완충용액으로 2회 세척한 후, 30%의 농도로 글리세롤을 함유하고 있는 동일 완충용액 2 ml로 최종 현탁하였다. 균체 현탁액을 일반적인 글래스비드 볼텍싱법으로 10분간 물리적으로 파쇄한 후, 2회의 원심분리(13,000 rpm, 4℃, 30분)를 통하여 상층액을 회수, Hom 효소활성 측정을 위한 조효소액(crude extract)으로 사용하였다. Hom 효소활성 측정을 위하여 효소 활성 측정용 반응액 (potassium phosphate (pH7.0) 완충용액, 25 mM NADPH, 5 mM aspartate semi-aldehyde) 0.9 ml에 0.1 ml 조효소액을 첨가한 후, 30℃에서 반응하였다. Hom 효소활성 U는 L-쓰레오닌 유무(0mM, 10mM)에 따라 분당 소모한 NADPH umol 수로 정의하였으며, 효소 활성 측정 결과는 하기 표 2와 같다.
Hom 효소활성(U) 및 L-쓰레오닌에 의한 탈감작화 측정
균주 L-쓰레오닌 첨가량 (mM)에 따른 효소활성(U)
0 mM 10 mM
ATCC13032 0.92 0.02
CTR-T285I 1.11 0.82
CTR-R398Q 1.31 1.12
CTR-G378W 1.39 1.21
CTR-G378S 1.38 1.22
실험 결과, T285I, R398Q, G378W, G378S 변이를 각각 포함하고 있는 Hom의 경우, 10 mM L-쓰레오닌이 포함되어 있는 조건에서 야생형 Hom와 달리 활성억제 정도가 감소하여, L-쓰레오닌에 대해 탈감작화 되어 있음을 알 수 있었다.
실시예 6: L-쓰레오닌 생산능을 가진 코리네박테리움 속 미생물 균주 제작 및 평가
야생종 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 로부터 L-쓰레오닌 생산 균주를 개발하였다. 구체적으로, 쓰레오닌 생합성 경로에서 첫번째 중요한 효소로 작용하는 aspartate kinase(lysC)의 피드백 저해(feedback inhibition) 해소를 위해 lysC의 377번 아미노산인 루신(Leucine)을 라이신(Lysine)으로 치환하였다 (서열번호 22).
더 구체적으로, lysC(L377K) 변이가 도입된 균주들을 제작하기 위해 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 23 및 서열번호 24 혹은 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복하였다. 그 결과 lysC 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 515 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 538bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다. 증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 23 및 서열번호 26의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 중합을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 377번째 루신이 라이신으로 치환된 아스파토키나제 변이체를 코딩하는 lysC 유전자의 변이를 포함하는 1023bp의 DNA 단편이 증폭되었다. 증폭산물을 QUIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다. 한편 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 L377K 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDZ-L377K를 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 ATCC13032에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 각 염기변이가 변이형 염기로 치환되어 있는 균주를 얻었으며, 이를 CJP1로 명명하였다.
상기 균주의 L-쓰레오닌 생산 변화를 명확히 확인하기 위하여, 호모세린 디하이드로게나제(homoserin dehydrogenase)를 코딩하는 유전자에 상기 실시예 4에서 확인한 변이들을 각각 도입하였다. 구체적으로, T285I, R398Q, G378W, G378S 변이를 CTR-L377K 균주에 각각 도입하기 위해서 실시예 4에서 제작된 pDZ-T285I, pDZ-R398Q, pDZ-G378W pDZ-G378S 벡터를 전기천공법으로 CJP1에 형질전환하고, 실시예 4와 동일한 방법으로 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 각 염기변이가 변이형 염기로 치환되어 있는 균주를 얻었다. 각각의 변이형 염기로 치환된 균주는 CJP1-T285I, CJP1-R398Q, CJP1-G378W, CJP1-G378S로 명명하였다.
상기 균주 CJP1-T285I, CJP1-R398Q는 2017년 9월 26일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 각각 KCCM12119P, KCCM12120P로 기탁번호를 부여받았다.
제작 균주 4종의 L-쓰레오닌 생산능 확인
균주 Amino acid (g/l)
Thr Lys
CJP1 0.40 3.60
CJP1-T285I 1.10 3.00
CJP1-R398Q 1.21 2.75
CJP1-G378W 1.30 2.68
CJP1-G378S 1.25 2.78
그 결과, 각각의 변이를 도입한 균주들은 대조군인 CJP1 균주 대비 L-라이신의 생산량이 감소하고 L-쓰레오닌 생산량이 0.7 ~ 0.9g/L씩 증가하였다.
한편, T285I, R398Q 변이를 동시에 포함하는 균주를 얻기 위해 pDZ-R398Q 벡터를 CJP1-T285I 균주에 형질전환하고, 상기와 동일한 방법으로 균주를 수득하였다(CJP1-T285I,R398Q). 또한, G378W, R398Q 변이를 동시에 포함하는 균주를 얻기 위해 pDZ-R398Q 벡터를 CJP1-G378W에 형질전환하고, 상기와 동일한 방법으로 균주를 수득하였다(CJP1-G378W,R398Q). 또한, T285I, G378W 변이를 동시에 포함하는 균주를 얻기 위해 pDZ-G378W 벡터를 CJP1-T285I에 형질전환하고, 상기와 동일한 방법으로 균주를 수득하였다(CJP1-T285I,G378W). 실시예 2의 방법으로 L-쓰레오닌 생산능 테스트를 진행하였으며 하기 표 4에 나타내었다.
제작 균주 3종의 L-쓰레오닌 생산능 확인
균주 Amino acid (g/l)
Thr Lys
CJP1 0.41 3.55
CJP1-G378W 1.30 2.68
CJP1-T285I,R398Q 1.41 2.65
CJP1-G378W,R398Q 2.12 1.92
CJP1-T285I,G378W 1.92 2.15
그 결과, 앞의 실시예에서 가장 높은 Thr 생산능을 보이는 CJP1-G378W 대비 본 발명의 변이를 2 종 도입한 경우 보다 높은 Thr 생산능을 확인하였다. 두 변이를 도입한 균주들은 대조군인 CJP1 균주 대비 쓰레오닌 생산량이 1.1 ~ 1.7g/L씩 증가하였고, 따라서 Hom의 탈감작화 효과가 크게 향상된 것을 확인 할 수 있었다.
실시예 7: L-이소류신 생산능을 가진 코리네박테리움 속 미생물 균주 제작 및 평가
이소류신 생산 균주를 제작하기 위해, 실시예 6에서 제작된 균주들에서 기 공지된 L-쓰레오닌 디하이드라타제(L-threonine dehydratase, isoleucine 생합성 경로의 첫 번째 효소)를 코딩하는 변이 유전자 ilvA(V323A) (Appl. Enviro. Microbiol., Dec. 1996, p.4345-4351)의 발현을 강화하기 위한 벡터를 제작하였다.
구체적으로, ilvA 유전자를 대상으로 변이 도입 벡터를 제작하기 위하여 변이 위치를 중심으로 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 27 및 28)과 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 29 및 30)을 고안하였다. 서열번호 27 및 30의 프라이머는 각 말단에 BamHⅠ 제한 효소 부위(밑줄로 표시)를 삽입하였고, 서열번호 28 및 29의 프라이머는 서로 교차되도록 고안한 부위에 뉴클레오티드 치환 변이(밑줄로 표시)가 위치하도록 하였다.
서열번호 염기서열
27 ACGGATCCCAGACTCCAAAGCAAAAGCG
28 ACACCACGGCAGAACCAGGTGCAAAGGACA
29 CTGGTTCTGCCGTGGTGTGCATCATCTCTG
30 ACGGATCCAACCAAACTTGCTCACACTC
야생형의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 27 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 ilvA 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 627 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 608 bp의 DNA 단편을 수득하였다. 증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 27 및 서열번호 30의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 323번째 발린이 알라닌으로 치환된 IlvA 변이체를 코딩하는 ilvA 유전자의 변이를 포함하는 1217 bp의 DNA 단편이 증폭되었다. pECCG117 (대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 1011 bp의 DNA 단편을 제한 효소 BamHⅠ으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pECCG117-ilvA(V323A)라 명명하였다.
pECCG117-ilvA(V323A)벡터를 실시예 6에서 제작된 CJP1-T285I,R398Q, CJP1-G378W,R398Q, CJP1-T285I,G378W 균주들에 전기천공법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에 도말하여 형질전환주를 획득하였다. 실시예 2에 나타낸 플라스크 배양법과 동일한 방법으로 배양하여 배양액 중의 L-이소류신 농도를 분석하여 표 6에 나타내었다.
제작된 균주 평가
균주 L-이소류신(g/L)
CJP1/pECCG117-ilvA(V323A) 0.7
CJP1-G378W/pECCG117-ilvA(V323A) 0.9
CJP1-T285I,R398Q/pECCG117-ilvA(V323A) 1.1
CJP1-G378W,R398Q/pECCG117-ilvA(V323A) 1.2
CJP1-T285I,G378W/pECCG117-ilvA(V323A) 1.0
그 결과, hom(G378W)변이를 포함하는 균주에서 대조군 균주 대비 L-이소류신 생산능이 0.2g/L 향상되었음을 확인할 후 있었다. 또한, 두 변이가 동시에 도입된 hom 변이를 포함하는 균주는 대조군 균주 대비 L-이소류신 생산능이 0.3~0.5g/L 향상되었고, 그 중 T285I, R398Q 두 변이를 모두 포함하는 CJP1-T285I, R398Q/pECCG117-ilvA(V323A) 균주에서 1.1g/l L-이소류신이 생산되었다.
실시예 8: 변이형 Hom으로 치환된 O-아세틸-호모세린(OAH) 생산 균주 제작 및 평가
8-1: 변이형 Hom으로 치환된 ATCC13032 균주 제작
상기 실시예 7과 동일한 방법으로, ATCC13032 균주에 T285I 및 R398Q의 2종의 변이를 도입하였고, 이 균주를 ATCC13032::HomFBR 이라 명명하였다.
8-2: metB 유전자의 결손
본 실시예에서는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, O-아세틸-호모세린 분해경로의 시스타치오닌 감마 신타제(cystathionine gamma-synthase)를 코딩하는 metB 유전자를 확보하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)을 근거로 하여 metB 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 Ncgl2360, 서열번호 31)를 확보하고, 이에 근거하여 metB 유전자의 N-terminal 부분과 linker sequence를 함유하는 프라이머(서열번호 32, 33), C-terminal 부분과 linker부분을 함유하는 프라이머(서열번호 34, 35) 를 합성하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 32과 33 및 34과 35의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 30회 반복하였다. 그 결과, metB 유전자의 N-terminal 부분과 linker를 함유한 500bp의 증폭된 유전자와 metB 유전자의 C-terminal 부분과 linker를 함유한 500bp 증폭된 유전자를 획득하였다.
상기에 획득한 증폭된 두 유전자를 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 60초; 어닐링 50℃, 60초; 및 중합반응 72℃, 1분을 10회 반복 후 서열번호 32 및 35를 첨가 후 20회 반복하였다. 그 결과 metB 유전자의 N-terminal-linker-C-terminal을 함유한 metB 불활성화 카세트인 1000bps의 증폭된 Δ metB 유전자를 획득하였다. 상기 PCR을 통하여 획득한 metB 유전자에 말단에 포함된 제한효소 XbaI, SalI을 처리하고, 제한효소 XbaI, SalI가 처리된 pDZ(KR 0924065) 벡터에 접합(ligation)을 통하여 클로닝하였고 최종적으로 metB 불활성화 카세트가 클로닝된 pDZ-ΔmetB 재조합 벡터를 제작하였다.
제작된 pDZ-ΔmetB 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, ATCC13032::HomFBR 에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 metB 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ΔmetB, ATCC13032::HomFBR ΔmetB 을 얻었다. 불활성화된 metB 유전자는 서열번호 32 과 35의 프라이머를 이용한 PCR을 후 metB 유전자가 불활성화 되지 않은 ATCC13032와 비교를 통하여 최종 확인하였다.
8-3: metY 유전자의 결손
본 실시예에서는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, O-아세틸-호모세린 분해경로의 O-아세틸-호모세린 티올 리아제(O-acetylhomoserine (thiol)-lyase)를 코딩하는 metY 유전자를 확보하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)을 근거로 하여 metY 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 Ncgl0625, 서열번호 36)를 확보하고, 이에 근거하여 metY 유전자의 N-terminal 부분과 linker sequence를 함유하는 프라이머(서열번호 37, 38), C-terminal 부분과 linker부분을 함유하는 프라이머(서열번호 39, 40)를 합성하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 37과 38 및 서열번호 39과 40의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 30회 반복하였다. 그 결과, metY 유전자의 N-terminal 부분과 linker를 함유한 500bp의 증폭된 유전자와 metY 유전자의 C-terminal 부분과 linker를 함유한 500bp 증폭된 유전자를 획득하였다. 상기에 획득한 증폭된 두 유전자를 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 60초; 어닐링 50℃, 60초; 및 중합반응 72℃, 1분을 10회 반복 후 서열번호 37 및 40를 첨가 후 20회 반복하였다. 그 결과 metY 유전자의 N-terminal-linker-C-terminal을 함유한 metB 불활성화 카세트인 1000bps의 증폭된 Δ metY 유전자를 획득하였다.
상기 PCR을 통하여 획득한 metY 유전자에 말단에 포함된 제한효소 XbaI, SalI을 처리하고, 제한효소 XbaI, SalI가 처리된 pDZ(KR2008-0025355) 벡터에 접합(ligation)을 통하여 클로닝하였고 최종적으로 met Y 불활성화 카세트가 클로닝된 pDZ-ΔmetY 재조합 벡터를 제작하였다.
제작된 pDZ-ΔmetY 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, ATCC13032::HomFBR, ATCC13032 ΔmetB, ATCC13032::HomFBR ΔmetB 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 metY 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ΔmetY, ATCC13032::HomFBR ΔmetY, ATCC13032 ΔmetB ΔmetY, ATCC13032::HomFBR ΔmetB ΔmetY 을 얻었다. 불활성화된 metY 유전자는 서열번호 37 과 40의 프라이머를 이용한 PCR을 후 metY유전자가 불활성화 되지 않은 ATCC13032와 비교를 통하여 최종 확인하였다.
8-4: O-아세틸-호모세린 생산 균주 제작 및 평가
실시예 8-1 내지 8-3에서 제작된, metB, metY, metBY 유전자가 결손되고 변이형 hom 유전자로 치환된 ATCC13032, ATCC13032ΔmetB, ATCC13032 ΔmetY, ATCC13032 Δ metB Δ metY, ATCC13032::HomFBR, ATCC13032::HomFBR Δ metB, ATCC13032::HomFBR Δ metY, ATCC13032::HomFBR Δ metB Δ metY 균주의 O-아세틸-호모세린 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 32℃의 배양기에서 LB 고체배지에서 밤새 배양한 단일 콜로니를 25 ml의 O-아세틸-호모세린 역가 배지에 1 백금이씩 접종하여 32℃에서 250 rpm으로 42-64시간 동안 배양하였다. 배양물로부터 O-아세틸-호모세린을 HPLC에 의하여 분석하였다. 분석 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
L-O-아세틸호모세린 생산배지 (pH 7.2)
포도당 30 g, KH2PO4 2 g, Urea 3 g, (NH4)2SO4 40 g, Peptone 2.5 g, CSL(Sigma) 5 g(10 ml), MgSO4.7H2O 0.5 g, Methionine 400 mg, Leucine 400 mg, CaCO3 20 g (증류수 1 리터 기준)
O-아세틸-호모세린 생산 평가
Strains O-AH production(g/L)
ATCC13032 - 0.0
metB 0.3
metY 0.3
metBY 0.5
ATCC13032::HomFBR(T285I + R398Q) - 0.0
metB 1.2
metY 1.4
metBY 3.5
그 결과, 상기 표 7과 같이 대조군 균주인 Corynebacteria glutamicum ATCC13032를 배양시 O-아세틸-L-호모세린이 축적되지 않는 반면, metB, metY, metBY가 불활성화된 ATCC13032 Δ metB, ATCC13032 Δ metY, ATCC13032 Δ metB Δ metY 균주에서는 각각 0.3, 0.3, 0.5 g/L의 O-아세틸-L-호모세린이 축적되었음을 확인하였다.
또한, hom 유전자를 mutant 형태로 치환한 ATCC13032::HomFBR 균주, 상기 균주에서 metB, metY, metBY가 각각 불활성화된 ATCC13032::HomFBR Δ metB, ATCC13032::HomFBR Δ metY, ATCC13032::HomFBR Δ metB Δ metY 균주의 경우 각각 1.2, 1.4, 3.5g/L의 O-아세틸-L-호모세린이 축적된 것을 확인 할 수 있었다.
따라서, 상기 결과로부터 본 발명의 변이형 hom을 사용하여 호모세린을 전구체로 사용하는 목적 아미노산의 생산량을 크게 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 9: 메티오닌(Met) 생산 균주 제작 및 평가
9-1: mcbR 유전자 결손을 위한 재조합 벡터 제작
본 실시예에서는 메티오닌 생산 균주를 제작하기 위해, 실시예 6에서 제작된 균주들에서 기 공지된 메티오닌 시스테인 전사 조절인자 단백질를 코딩하는 mcbR (J. Biotechnol. 103:51-65, 2003) 의 불활성화를 위해 벡터를 제작하였다.
구체적으로, mcbR 유전자를 코리네박테리움 ATCC13032 염색체 상에서 결손시키기 위하여 하기의 방법으로 재조합 플라스미드 벡터를 제작하였다. 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 mcbR 유전자 및 주변서열(서열번호 41)을 확보하였다.
결손된 mcbR 유전자를 획득하기 위한 목적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 42 및 서열번호 43, 서열번호 44 및 서열번호 45의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 53℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 각각 700bp DNA 단편들을 수득하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(대한민국 특허 등록번호 제10-0924065호)와 상기 증폭한 mcbR 유전자 단편들을 염색체 도입용 제한효소 smaI 으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자들의 결손된 단편이 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 pDZ-△mcbR 이라 명명하였다.
9-2: L-메티오닌 생산능을 가진 코리네박테리움 속 미생물 균주 제작 및 평가
상기 실시예 9에서 제작된 pDZ-△mcbR 벡터를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 실시예 6에서 제작된 CJP1-G378W, CJP1-T285I,R398Q, CJP1-G378W,R398Q, CJP1-T285I,G378W와 CJP1 균주들에 전기천공법으로 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 그 후, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에서 2차 재조합을 하였다. 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환주를 대상으로 프라이머 46와 프라이머 47을 이용하여 PCR법을 통하여 mcbR 유전자가 결손된 균주를 확인하였다. 본 재조합 균주들은 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 CJP1-G378W/ΔmcbR, CJP1-T285I,R398Q/ΔmcbR, CJP1-G378W,R398Q/ΔmcbR, CJP1-T285I,G378W/ΔmcbR, CJP1/ΔmcbR 이라 명명하였다.
상기 제작된 CJP1-G378W/ΔmcbR, CJP1-T285I,R398Q/ΔmcbR, CJP1-G378W,R398Q/ΔmcbR, CJP1-T285I,G378W/ΔmcbR 균주의 L-메티오닌 생산능을 분석하기 위해 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJP1/ΔmcbR 균주와 함께 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 CJP1/ΔmcbR 과 발명 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 CJP1-G378W/ΔmcbR, CJP1-T285I,R398Q/ΔmcbR, CJP1-G378W,R398Q/ΔmcbR, CJP1-T285I,G378W/ΔmcbR 를 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
상기 배양 방법으로 배양하여 배양액의 중의 L-메티오닌 농도를 분석하여 표 3에 나타내었다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 8.0)>
포도당 50 g, (NH4)2S2O3 12 g, Yeast extract 5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 1.2 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
상기 배양 방법으로 배양하여 배양액의 중의 L-메티오닌 농도를 분석하여 표 8에 나타내었다.
제작된 균주 평가
균주 L-메티오닌(g/L)
CJP1/ΔmcbR 0.01
CJP1-G378W/ΔmcbR 0.13
CJP1-T285I,R398Q/ΔmcbR 0.18
CJP1-G378W,R398Q/ΔmcbR 0.20
CJP1-T285I,G378W/ΔmcbR 0.17
그 결과, G378W hom변이를 포함하는 균주에서 대조군 균주 대비 L-메티오닌 생산능이 0.12g/L 향상되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 두 변이가 동시에 도입된 hom 변이를 포함하는 균주들은 대조균 균주 대비 L-메티오닌 생산능이 0.16 ~ 0.19 g/l 향상되었음을 확인 할 수 있었다.
상기 결과로부터 본 발명의 변이형 hom을 사용하여 L-메티오닌의 생산량을 크게 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2019006083-appb-I000001
Figure PCTKR2019006083-appb-I000002

Claims (17)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환되거나, 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된, 변이형 호모세린 디하이드로게나제.
  2. 제1항에 있어서, 추가로 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 378번째 아미노산이 트립토판으로 치환된, 변이형 호모세린 디하이드로게나제.
  3. 제1항 내지 제2항에서 선택되는 어느 한 항의 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환되거나, 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된, 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는, 코리네박테리움속 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 미생물은 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 호모세린 유래 L-아미노산은 L-쓰레오닌, L-이소류신, O-아세틸호모세린 및 L-메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 코리네박테리움속 미생물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 미생물은 L-알라닌을 생산하는 코리네박테리움속 미생물.
  8. 제4항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 미생물.
  9. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 285번째 아미노산이 이소류신으로 치환되거나, 398번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나 또는 이들의 조합으로 치환된, 변이형 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 상기 미생물 또는 배지로부터 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 호모세린 유래 L-아미노산은 L-쓰레오닌, L-이소류신, O-아세틸-L-호모세린 및 L-메티오닌 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산 방법.
  11. 제1항의 변이형 호모세린 디하이드로게나제 또는 4항의 코리네박테리움속 미생물을 포함하는, 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산 생산용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 호모세린 유래 L-아미노산은 L-쓰레오닌, L-이소류신, O-아세틸-L-호모세린 및 L-메티오닌 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산 생산용 조성물.
  13. 호모세린 디하이드로게나제 활성을 갖는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 285번째 아미노산을 이소류신으로 치환하거나, 398번째 아미노산을 글루타민으로 치환하거나 또는 이들의 조합으로 치환하는 단계를 포함하는, 미생물의 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산능 증가 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 호모세린 유래 L-아미노산은 L-쓰레오닌, L-이소류신, O-아세틸-L-호모세린 및 L-메티오닌 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산 방법.
  15. 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산을 위한, 제1항의 변이형 호모세린 디하이드로게나제의 용도.
  16. 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산을 위한, 제3항의 폴리뉴클레오티드의 용도.
  17. 호모세린 또는 호모세린 유래 L-아미노산의 생산을 위한, 제4항의 코리네박테리움 속 미생물의 용도.
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