KR102421911B1 - 징크 바인딩 디하이드로게나제 신규 변이체 및 이를 이용한 l-방향족 아미노산 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 징크 바인딩 디하이드로게나제 신규 변이체 및 이를 이용한 L-방향족 아미노산 생산 방법에 관한 것으로, 상기 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체는 징크 바인딩 디하이드로게나제를 구성하는 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 치환됨으로써 효소 활성이 변화되어, 이를 포함하는 재조합 미생물은 L-방향족 아미노산을 효율적으로 생산할 수 있다.
Description
본 발명은 징크 바인딩 디하이드로게나제 신규 변이체 및 이를 이용한 L-방향족 아미노산 생산 방법에 관한 것이다.
아미노산은 곁사슬의 성질에 따라 소수성, 친수성, 염기성 및 산성 아미노산으로 구분되며, 이들 중 벤젠 고리를 갖는 아미노산을 방향족 아미노산이라 한다. 방향족 아미노산에는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이 있으며, 페닐알라닌과 트립토판은 생체 내에서 합성되지 않는 필수 아미노산으로 전세계적으로 연간 3000억 달러 규모의 시장을 형성하고 있는 고부가가치 산업에 해당한다.
방향족 아미노산의 생산은 자연상태에서 수득된 야생형 균주나 이의 아미노산 생산능이 향상되도록 변형된 변이주를 이용할 수 있다. 최근에는 방향족 아미노산의 생산 효율을 개선시키기 위해 L-아미노산과 같은 유용물질 생산에 많이 이용되는 대장균, 코리네박테리움 등의 미생물을 대상으로 유전자 재조합 기술을 적용하여 우수한 L-방향족 아미노산 생산능을 갖는 다양한 재조합 균주 또는 변이주 및 이를 이용한 L-방향족 아미노산 생산 방법이 개발되고 있다. 특히 L-방향족 아미노산의 생합성 경로에 관여하는 효소, 전사인자, 수송 단백질 등의 유전자를 대상으로 하거나, 또는 이들의 발현을 조절하는 프로모터에 변이를 유도하여 해당 아미노산의 생산량을 증대시키려는 시도가 있었다. 그러나 L-방향족 아미노산 생산에 직간접적으로 연관된 효소, 전사인자, 수송 단백질 등 단백질의 종류가 수십여 종에 이르기 때문에 이러한 단백질의 활성 변화에 따른 L-방향족 아미노산 생산능 증가 여부에 관해 여전히 많은 연구가 필요한 실정이다.
본 발명은 신규한 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이체 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용한 L-방향족 아미노산의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 서열번호 3의 아미노산 서열에서 102번째 글리신이 아르기닌으로 치환된, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체를 제공한다.
본 발명에서 사용된 “징크 바인딩 디하이드로게나제(zinc-binding dehydrogenase)”는 아연이 결합된 산화환원 효소의 일종으로, NAD 또는 NADP가 있는 조건에서 산화환원 활성을 가진다. 상기 징크 바인딩 디하이드로게나제는 징크 바인딩 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자 또는 이와 실질적 동일성을 가지는 서열일 수 있다. 여기서 “실질적 동일성”이란 각각의 유전자 서열, 즉 염기서열 또는 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 뉴클레오티드 서열을 최대한 대응되도록 정렬하여 분석하였을 때 상기 임의의 다른 뉴클레오티드 서열이 각각의 뉴클레오티드 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 의미한다.
본 발명에서의 징크 바인딩 디하이드로게나제는 yggP 유전자에 의해 암호화된 것으로, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 야생형 대장균에서 유래한 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 “변이체”는 특정 유전자의 아미노산 서열 중 N-말단, C-말단 및/또는 내부에서 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 의미한다. 여기서 “보존적 치환”이란 하나의 아미노산을 구조적 및/또는 화학적 성질이 유사한 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미하며, 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나, 또는 전혀 영향을 미치지 않을 수 있다. 또한, 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거되거나, 또는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 것을 포함한다. 이러한 변이체는 그 능력이 변이 전 폴리펩티드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 본 발명에서는 변이체가 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 등과 혼용될 수 있다.
본 발명에서의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열에서 102번째 위치한 아미노산인 글리신이 아르기닌으로 치환된 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체로, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에서 사용된 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 사용된 “벡터(vector)”는 숙주세포에 목적 유전자를 전달하여 발현시키기 위한 수단으로 사용되는 모든 유형의 핵산 서열 운반 구조체를 의미한다. 상기 벡터는 특별한 언급이 없는 한, 담지된 핵산 서열이 숙주세포 유전체 내 삽입되어 발현되도록 하는 것 및/또는 독자적으로 발현되도록 하는 것을 의미할 수 있다. 이러한 벡터는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하며, “작동가능하게 연결된(operably linked)”이란 목적 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결된 것을 의미하고, “조절요소”는 전사를 수행하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 상기 벡터의 일례로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들면, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로는 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, Charon21A 등이 있으며, 플라스미드 벡터로는 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 않는다.
상기 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 발현을 위한 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 유전자 또는 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있으며, 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
재조합 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예컨대, 메탈로 티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예컨대, 아데노 바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토 메갈로 바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 가진다.
상기 재조합 벡터는 선택 마커(selection marker)를 포함할 수 있는데, 상기 선택 마커는 벡터로 형질전환된 형질전환체 (숙주세포)를 선별하기 위한 것으로 상기 선택 마커가 처리된 배지에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존할 수 있기 때문에, 형질전환된 세포의 선별이 가능하다. 상기 선택 마커는 대표적인 예로 카나마이신, 스트렙토마이신, 클로람페니콜 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
재조합 벡터를 숙주세포에 삽입함으로써 형질전환체를 만들 수 있으며, 상기 형질전환체는 재조합 벡터를 적절한 숙주세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 숙주세포는 상기 발현벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있다.
재조합 미생물을 제작하기 위하여 원핵세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서 E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, E. coli XL1-Blue와 같은 대장균 속 균주, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 슈도모나스 종과 같은 다양한 장내균과 균주 등이 이용되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
재조합 미생물을 제작하기 위하여 진핵세포에 형질전환을 하는 경우에는 숙주세포로서 효모 (예컨대, 사카로마이세스 세레비지에), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 “형질전환(transformation)”은 외부 DNA를 숙주세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미하며, “형질전환체(transformat)”는 외부 DNA가 도입되어 목적 유전자의 발현을 안정적으로 유지하는 숙주세포를 의미한다.
상기 형질전환은 숙주세포에 따라 적합한 벡터 도입 기술이 선택되어 목적 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 벡터 도입은 전기천공법(electroporation), 열 충격(heat-shock), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 초산 리튬-DMSO법, 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함될 수 있다.
상기 형질전환체는 생체내 또는 시험관내에서 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질감염, 형질전환, 또는 감염된 세포를 포함하며, 재조합 숙주세포, 재조합 세포 또는 재조합 미생물과 동일한 용어로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 형질전환체는 에스케리치아(Escherichia) 속 균주인 것일 수 있다.
상기 에스케리치아 속 균주로는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리치아 헤르만니(Escherichia hermannii), 에스케리치아 불네리스(Escherichia vulneris) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서의 형질전환체는 전술한 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 균주, 상기 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체 또는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 균주, 또는 상기 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체에 대한 활성을 가지는 균주일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 형질전환체는 L-방향족 아미노산 생산능을 가지는 것일 수 있다.
상기 형질전환체는 자연적으로 L-방향족 아미노산 생산능을 가지고 있거나, 또는 인위적으로 L-방향족 아미노산 생산능이 부여된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 형질전환체는 징크 바인딩 디하이드로게나제의 활성이 변화되어 L-방향족 아미노산 생산능이 향상된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 “생산능이 향상된”은 모균주에 비해 L-방향족 아미노산의 생산성이 증가된 것을 의미한다. 상기 모균주는 변이의 대상이 되는 야생형 또는 변이주를 의미하며, 직접 변이의 대상이 되거나 재조합된 벡터 등으로 형질전환되는 대상을 포함한다. 본 발명에 있어서, 모균주는 야생형 에스케리치아 속 균주 또는 야생형으로부터 변이된 에스케리치아 속 균주일 수 있다.
본 발명에 따른 형질전환체는 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체가 도입됨으로써 징크 바인딩 디하이드로게나제의 활성이 변화하여 모균주에 비해 증가된 L-방향족 아미노산 생산능을 나타내며, 특히 모균주에 비해 L-방향족 아미노산 생산량이 5% 이상, 구체적으로는 5 내지 60% (바람직하게는 10 내지 50%) 증가되어 균주 배양액 1 ℓ 당 4 ~ 20 g의 L-방향족 아미노산을 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 형질전환체를 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체 또는 형질전환체가 배양된 배지로부터 L-방향족 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 L-방향족 아미노산의 생산 방법을 제공한다.
상기 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있으며, 통상의 기술자라면 배지 및 배양 조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 배지는 액체 배지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 방법은 예를 들면, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture), 유가식 배양(fed-batch culture) 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 변형될 수 있다. 에스케리치아 속 균주에 대한 배양 배지는 공지된 문헌 (Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981)을 참조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 배지에 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 인의 공급원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다. 또한 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양과정에서 배양액에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 추가적으로, 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 예를 들면 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 유용물질이 원하는 생산량으로 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 예를 들면 10 내지 160 시간일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양된 형질전환체 또는 형질전환체가 배양된 배지에서 L-방향족 아미노산을 회수하는 단계는 배양 방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 생산된 L-방향족 아미노산을 수집 또는 회수할 수 있다. 예를 들면 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해 (예를 들면, 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 L-방향족 아미노산을 회수하는 단계는 배양 배지를 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 L-방향족 아미노산을 회수하는 단계는 L-방향족 아미노산을 정제하는 공정을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 L-방향족 아미노산은 L-트립토판, L-페닐알라닌 및 L-티로신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체는 징크 바인딩 디하이드로게나제를 구성하는 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 치환됨으로써 효소 활성이 변화되어, 이를 포함하는 재조합 미생물은 L-방향족 아미노산을 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 플라스미드 pDSG의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 플라스미드 pDS9의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 플라스미드 pDS9의 구조를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체를 발현하는 균주 제작
징크 바인딩 디하이드로게나제의 아미노산 서열 (서열번호 3) 중 102번째 위치한 글리신이 아르기닌으로 치환된 변이체가 L-방향족 아미노산의 생산에 미치는 영향을 확인하기 위해 상기 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체를 발현하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 균주를 제작하였다. 균주 내 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체의 유전자 삽입을 위해 플라스미드 pDSG 및 pDS9를 사용하여 다음과 같이 제작하였다.
여기서 플라스미드 pDSG는 대장균에서만 작용하는 복제원점을 가지며, 암피실린 내성 유전자 및 가이드 RNA(gRNA) 발현 기전을 가진다. 플라스미드 pDS9는 대장균에서만 작용하는 복제원점을 가지며, 카나마이신 내성 유전자, λ Red 유전자 (exo, bet 및 gam) 및 Streptococcus pyogenes 유래 CAS9 발현 기전을 가진다.
1-1. 형질전환용 벡터 pDSG-yggP(Gly102Arg) 제작
대장균(Escherichia coli) MG1655 (KCTC14419BP) gDNA를 주형으로 프라이머 7 및 프라이머 9의 프라이머 쌍과 프라이머 8 및 프라이머 10의 프라이머 쌍을 이용하여 징크 바인딩 디하이드로게나제를 암호화하는 대장균 yggP 유전자의 102번 아미노산 변이의 upstream 단편과, 프라이머 11 및 프라이머 13의 프라이머 쌍과 프라이머 12 및 프라이머 14의 프라이머 쌍을 이용하여 대장균 yggP 유전자의 102번 아미노산 변이의 downstream 단편을 각각 PCR 수행을 통해 수득하였다. 이때 각 upstream과 downstream 단편에는 yggP 유전자의 102번째 아미노산 잔기인 글리신(Gly)을 아르기닌(Arg)으로 변경하는 서열을 포함시켰다. 여기서 중합효소는 Takara PrimeSTAR Max DNA polymerase를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 10초 변성, 57℃ 15초 어닐링 및 72℃ 10초 중합을 30회 반복하여 수행하였다.
플라스미드 pDSG를 주형으로 프라이머 3 및 프라이머 5의 프라이머 쌍, 프라이머 4 및 프라이머 6의 프라이머 쌍, 프라이머 15 및 프라이머 1, 및 프라이머 16 및 프라이머 2의 프라이머 쌍을 각각 이용하여 4개의 pDSG 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 이때 각 유전자 단편에는 yggP 유전자의 102번째 Gly을 타겟하는 gRNA 서열을 포함시켰다. gRNA는 변이를 유발하고자 하는 서열의 NGG 앞 20 mer로 선택하였다. 여기서 중합효소는 Takara PrimeSTAR Max DNA polymerase를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 10초 변성, 57℃ 15초 어닐링 및 72℃ 15초 중합을 30회 반복하여 수행하였다.
수득된 yggP 유전자의 102번 아미노산의 upstream과 downstream, 그리고 4개의 pDSG 유전자 단편들을 self-assembly cloning 방법 (BioTechniques 51:55-56 (July 2011))을 이용하여 클로닝하여 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDSG-yggP(Gly102Arg)로 명명하였다.
1-2. 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체 yggP(Gly102Arg)가 도입된 L-트립토판 또는 L-페닐알라닌 생산 균주 제작
L-트립토판 생산 균주 및 L-페닐알라닌 생산 균주를 제작하기 위해 모균주로서 대장균 KFCC11660P 및 KCCM10016을 이용하였다.
KFCC11660P 균주 또는 KCCM10016 균주에 플라스미드 pDS9을 1차 형질전환하여 LB-Km (LB 액체배지 25 g/L 및 카나마이신 50 mg/L 함유) 고체배지에서 배양한 후 카나마이신 내성을 가지는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니에 pDSG-yggP(Gly102Arg) 플라스미드를 2차 형질전환하여 LB-Amp&Km (LB 액체배지 25 g/L, 암피실린 100 mg/L 및 카나마이신 50 mg/L 함유) 고체배지에서 배양하여 암피실린 및 카나마이신 내성을 가지는 콜로니를 선별한 후 프라이머 17 및 프라이머 18의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 수행을 통해 유전자 단편을 수득하였다. 중합효소는 Takara PrimeSTAR Max DNA polymerase를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 10초 변성, 57℃ 10초 어닐링 및 72℃ 15초 중합을 30회 반복하여 수행하였다. 마크로젠에 위탁하여 프라이머 17 및 프라이머 18의 프라이머 쌍을 이용하여 수득된 유전자 단편의 서열을 확인하였다.
선별된 2차 형질전환체는 LB 액체배지에서 7번 계대배양하여 LB 고체배지에서 콜로니를 선별하였다. 각 콜로니를 LB, LB-Amp 및 LB-Km 고체배지에서 각각 선별적으로 배양하였다. LB 고체배지에서 생장하면서 LB-Amp 및 LB-Km 고체배지에서 생육하지 않는 콜로니를 선별하였다. 이와 같은 방법으로 제작된 균주를 각각 KFCC11660P_yggP(Gly102Arg) 및 KCCM10016_yggP(Gly102Arg)로 명명하였다
실시예 1에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.
| 프라이머 명칭 | 서열번호 | 프라이머 서열 (5’-3’) |
| 프라이머 1 | 5 | CAATTTTATTATAGTAATTGACTATTATAC |
| 프라이머 2 | 6 | GCTTGGTAACCAATTTTATTATAGTAATTGACTATTATAC |
| 프라이머 3 | 7 | GTTACCAAGCGGATATTCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC |
| 프라이머 4 | 8 | GGATATTCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC |
| 프라이머 5 | 9 | GAGCCTGTCGGCCTACCTGCT |
| 프라이머 6 | 10 | CGGCCGGCATGAGCCTGTCG |
| 프라이머 7 | 11 | ATGCCGGCCGGCTGCTATTTATGGCAAGCG |
| 프라이머 8 | 12 | GCTGCTATTTATGGCAAGCG |
| 프라이머 9 | 13 | CCCATCGCCGGTTGCAATAC |
| 프라이머 10 | 14 | GCTTGGTAACCCCATCGCCG |
| 프라이머 11 | 15 | GTTACCAAGCAGATATTCAGCGGGCTACAG |
| 프라이머 12 | 16 | AGATATTCAGCGGGCTACAG |
| 프라이머 13 | 17 | TGCTCATAAACATATTGCGT |
| 프라이머 14 | 18 | GCCCATGCGATGCTCATAAA |
| 프라이머 15 | 19 | TCGCATGGGCGAGCTCCTGAAAATCTCGATAAC |
| 프라이머 16 | 20 | GAGCTCCTGAAAATCTCGATAAC |
| 프라이머 17 | 21 | ACGTGTGACGGATAAACCAC |
| 프라이머 18 | 22 | TTCACATACACCAGCTCAAT |
실험예 1. 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체가 도입된 변이주의 L-방향족 아미노산 생산능 평가
모균주 (KFCC11660P 및 KCCM10016)와 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체가 도입된 변이주 (KFCC11660P_yggP(Gly102Arg) 및 KCCM10016_yggP(Gly102Arg))의 L-트립토판 또는 L-페닐알라닌 생산능을 비교하였다.
하기 표 2의 트립토판 생산용 배지 또는 페닐알라닌 생산용 배지 10 mL가 담긴 100 mL 플라스크에 각 균주 (모균주 또는 변이주)를 부피 기준으로 1%씩 접종하여 37℃, 200 rpm의 조건으로 72시간 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC (Agilent)를 사용하여 배지 내 L-트립토판 또는 L-페닐알라닌의 농도를 측정하였고, 그 결과를 각각 하기 표 3 및 4에 나타내었다.
| 트립토판 생산용 배지 | 페닐알라닌 생산용 배지 | ||
| 조성 | 함량 | 조성 | 함량 |
| Glucose | 80.0 g/L | Glucose | 80.0 g/L |
| (NH4)2SO4 | 20.0 g/L | (NH4)2SO4 | 20.0 g/L |
| K2HPO4 | 0.8 g/L | K2HPO4 | 1.0 g/L |
| K2SO4 | 0.4 g/L | KH2PO4 | 1.0 g/L |
| MgCl2 | 0.8 g/L | K2SO4 | 0.4 g/L |
| Fumaric acid | 1.0 g/L | MgCl2 | 1.0 g/L |
| Yeast extract | 1.0 g/L | Fumaric acid | 0.5 g/L |
| (NH4)6Mo7O24 | 0.12 ppm | Yeast extract | 1.0 g/L |
| H3BO3 | 0.01 ppm | Glutamic acid | 0.5 g/L |
| CuSO4 | 0.01 ppm | CaCl2 | 5.00 ppm |
| MnCl2 | 2.00 ppm | MnCl2 | 2.00 ppm |
| ZnSO4 | 0.01 ppm | ZnSO4 | 1.00 ppm |
| CoCl2 | 0.10 ppm | CoCl2 | 0.10 ppm |
| FeCl2 | 10.00 ppm | FeCl2 | 10.00 ppm |
| Thiamine_HCl | 20.00 ppm | Thiamine_HCl | 20.00 ppm |
| L-Tyrosine | 200.00 ppm | L-Tyrosine | 200.00 ppm |
| L-phenylalanine | 300.00 ppm | CaCO3 | 3% |
| CaCO3 | 3% | - | - |
| pH 7.0 with NaOH (33%) | pH 7.0 with NaOH (33%) | ||
| 균주 | L-트립토판 농도 (g/L) |
L-트립토판 농도 증가율 (%) |
| KFCC11660P | 4.10 | - |
| KFCC11660P_yggP(Gly102Arg) | 4.87 | 18.7 |
| 균주 | L-페닐알라닌 농도 (g/L) |
L- 페닐알라닌 농도 증가율 (%) |
| KCCM10016 | 3.42 | - |
| KCCM10016_yggP(Gly102Arg) | 4.21 | 23.1 |
상기 표 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체가 도입된 변이주 KFCC11660P_yggP(Gly102Arg) 및 KCCM10016_yggP(Gly102Arg)는 모균주 KFCC11660P 및 KCCM10016에 비해 L-트립토판 및 L-페닐알라닌 생산량이 각각 약 19% 및 23% 향상된 것으로 확인되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> DAESANG CORPORATION
<120> Novel variant of zinc-binding dehydrogenase and method for
preparing L-aromatic amino acid using the same
<130> BPN221013
<160> 24
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 425
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yggP (G102R) variant
<400> 1
Met Lys Thr Lys Val Ala Ala Ile Tyr Gly Lys Arg Asp Val Arg Leu
1 5 10 15
Arg Val Phe Glu Leu Pro Glu Ile Thr Asp Asn Glu Leu Leu Val Ser
20 25 30
Val Ile Ser Asp Ser Val Cys Leu Ser Thr Trp Lys Ala Ala Leu Leu
35 40 45
Gly Ser Glu His Lys Arg Val Pro Asp Asp Leu Glu Asn His Pro Val
50 55 60
Ile Thr Gly His Glu Cys Ala Gly Val Ile Val Glu Val Gly Lys Asn
65 70 75 80
Leu Thr Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Gln Arg Phe Val Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Met Gly Leu Pro Ser Arg Tyr Ser Ala Gly Tyr Ser Tyr Glu Tyr Phe
100 105 110
Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Met Ile Ile Pro Glu Ile Ala Ile Asn Leu
115 120 125
Gly Cys Val Leu Pro Tyr His Gly Ser Tyr Phe Ala Ala Ala Ser Leu
130 135 140
Ala Glu Pro Met Cys Cys Ile Ile Gly Ala Tyr His Ala Asn Tyr His
145 150 155 160
Thr Thr Gln Tyr Val Tyr Glu His Arg Met Gly Val Lys Pro Gly Gly
165 170 175
Asn Ile Ala Leu Leu Ala Cys Ala Gly Pro Met Gly Ile Gly Ala Ile
180 185 190
Asp Tyr Ala Ile Asn Gly Gly Ile Gln Pro Ser Arg Val Val Val Val
195 200 205
Asp Ile Asp Asp Lys Arg Leu Ala Gln Val Gln Lys Leu Leu Pro Val
210 215 220
Glu Leu Ala Ala Ser Lys Gly Ile Glu Leu Val Tyr Val Asn Thr Lys
225 230 235 240
Gly Met Ser Asp Pro Val Gln Met Leu Arg Ala Leu Thr Gly Asp Ala
245 250 255
Gly Phe Asp Asp Ile Phe Val Tyr Ala Ala Val Pro Ala Val Val Glu
260 265 270
Met Ala Asp Glu Leu Leu Ala Glu Asp Gly Cys Leu Asn Phe Phe Ala
275 280 285
Gly Pro Thr Asp Lys Asn Phe Lys Val Pro Phe Asn Phe Tyr Asn Val
290 295 300
His Tyr Asn Ser Thr His Val Val Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asp
305 310 315 320
Asp Met Lys Glu Ala Ile Ala Leu Ser Ala Thr Gly Gln Leu Gln Pro
325 330 335
Ser Phe Met Val Thr His Ile Gly Gly Leu Asp Ala Val Pro Glu Thr
340 345 350
Val Leu Asn Leu Pro Asp Ile Pro Gly Gly Lys Lys Leu Ile Tyr Asn
355 360 365
Gly Val Thr Met Pro Leu Thr Ala Ile Ala Asp Phe Ala Glu Lys Gly
370 375 380
Lys Thr Asp Pro Leu Phe Lys Glu Leu Ala Arg Leu Val Glu Glu Thr
385 390 395 400
His Gly Ile Trp Asn Glu Gln Ala Glu Lys Tyr Leu Leu Ala Gln Phe
405 410 415
Gly Val Asp Ile Gly Glu Ala Ala Gln
420 425
<210> 2
<211> 1278
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yggP (G102R) variant
<400> 2
atgaaaacca aagttgctgc tatttatggc aagcgggatg tccgtctgcg cgtatttgaa 60
ctgccagaaa ttaccgataa tgaattactg gtgagtgtaa tttctgacag cgtctgttta 120
tcgacctgga aagcggcgtt actcggtagt gaacataaac gcgtacccga cgatttagaa 180
aatcatccgg tcattaccgg gcatgaatgt gccggggtta ttgtcgaagt gggtaaaaat 240
ctcactggca aatataaaaa aggccagcgt tttgtattgc aaccggcgat ggggttacca 300
agcagatatt cagcgggcta cagctacgaa tattttggcg gcaatgccac ttatatgatt 360
attcccgaaa tcgccattaa tttgggctgc gtattaccgt atcacggctc ttattttgct 420
gcggcgtcgc tggcagagcc tatgtgctgc attattggtg cttatcatgc caattatcac 480
accacgcaat atgtttatga gcatcgcatg ggcgtcaaac ctggcggcaa tattgcactg 540
ctggcgtgtg caggtccgat gggcattggc gctatcgatt acgccattaa cggcggcata 600
caaccgtcgc gggtggtggt ggtcgatatc gacgacaaac gtctggcgca ggtacagaag 660
ctgctgccgg tggaactggc ggccagtaaa ggcattgagc tggtgtatgt gaataccaaa 720
gggatgagcg atcctgtcca gatgctgcgg gcgctgacag gagatgccgg gttcgatgac 780
atttttgttt atgcggcggt gcctgctgtc gttgagatgg ctgatgaatt actggcggaa 840
gatggctgtc tgaacttctt tgccgggccg acggataaaa acttcaaagt gccgtttaat 900
ttctacaacg tccattacaa cagcacgcac gtcgtcggta catctggcgg ttcaacggac 960
gacatgaaag aggcgattgc ccttagcgcc actgggcagt tacagccgtc gtttatggtg 1020
acccatatcg gtggcctgga tgcggtgcca gaaaccgtgc tcaatctgcc ggatatccct 1080
ggcggtaaaa aactcattta taacggcgtg accatgccgc tcactgccat tgccgatttt 1140
gccgaaaaag gcaaaaccga tccgctgttt aaagagttgg cgcggctggt tgaggaaacg 1200
cacggcatct ggaatgaaca ggccgagaaa tatctgctgg cacaatttgg cgttgatatc 1260
ggggaggccg cgcaatga 1278
<210> 3
<211> 425
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yggP
<400> 3
Met Lys Thr Lys Val Ala Ala Ile Tyr Gly Lys Arg Asp Val Arg Leu
1 5 10 15
Arg Val Phe Glu Leu Pro Glu Ile Thr Asp Asn Glu Leu Leu Val Ser
20 25 30
Val Ile Ser Asp Ser Val Cys Leu Ser Thr Trp Lys Ala Ala Leu Leu
35 40 45
Gly Ser Glu His Lys Arg Val Pro Asp Asp Leu Glu Asn His Pro Val
50 55 60
Ile Thr Gly His Glu Cys Ala Gly Val Ile Val Glu Val Gly Lys Asn
65 70 75 80
Leu Thr Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Gln Arg Phe Val Leu Gln Pro Ala
85 90 95
Met Gly Leu Pro Ser Gly Tyr Ser Ala Gly Tyr Ser Tyr Glu Tyr Phe
100 105 110
Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Met Ile Ile Pro Glu Ile Ala Ile Asn Leu
115 120 125
Gly Cys Val Leu Pro Tyr His Gly Ser Tyr Phe Ala Ala Ala Ser Leu
130 135 140
Ala Glu Pro Met Cys Cys Ile Ile Gly Ala Tyr His Ala Asn Tyr His
145 150 155 160
Thr Thr Gln Tyr Val Tyr Glu His Arg Met Gly Val Lys Pro Gly Gly
165 170 175
Asn Ile Ala Leu Leu Ala Cys Ala Gly Pro Met Gly Ile Gly Ala Ile
180 185 190
Asp Tyr Ala Ile Asn Gly Gly Ile Gln Pro Ser Arg Val Val Val Val
195 200 205
Asp Ile Asp Asp Lys Arg Leu Ala Gln Val Gln Lys Leu Leu Pro Val
210 215 220
Glu Leu Ala Ala Ser Lys Gly Ile Glu Leu Val Tyr Val Asn Thr Lys
225 230 235 240
Gly Met Ser Asp Pro Val Gln Met Leu Arg Ala Leu Thr Gly Asp Ala
245 250 255
Gly Phe Asp Asp Ile Phe Val Tyr Ala Ala Val Pro Ala Val Val Glu
260 265 270
Met Ala Asp Glu Leu Leu Ala Glu Asp Gly Cys Leu Asn Phe Phe Ala
275 280 285
Gly Pro Thr Asp Lys Asn Phe Lys Val Pro Phe Asn Phe Tyr Asn Val
290 295 300
His Tyr Asn Ser Thr His Val Val Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asp
305 310 315 320
Asp Met Lys Glu Ala Ile Ala Leu Ser Ala Thr Gly Gln Leu Gln Pro
325 330 335
Ser Phe Met Val Thr His Ile Gly Gly Leu Asp Ala Val Pro Glu Thr
340 345 350
Val Leu Asn Leu Pro Asp Ile Pro Gly Gly Lys Lys Leu Ile Tyr Asn
355 360 365
Gly Val Thr Met Pro Leu Thr Ala Ile Ala Asp Phe Ala Glu Lys Gly
370 375 380
Lys Thr Asp Pro Leu Phe Lys Glu Leu Ala Arg Leu Val Glu Glu Thr
385 390 395 400
His Gly Ile Trp Asn Glu Gln Ala Glu Lys Tyr Leu Leu Ala Gln Phe
405 410 415
Gly Val Asp Ile Gly Glu Ala Ala Gln
420 425
<210> 4
<211> 1278
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yggP
<400> 4
atgaaaacca aagttgctgc tatttatggc aagcgggatg tccgtctgcg cgtatttgaa 60
ctgccagaaa ttaccgataa tgaattactg gtgagtgtaa tttctgacag cgtctgttta 120
tcgacctgga aagcggcgtt actcggtagt gaacataaac gcgtacccga cgatttagaa 180
aatcatccgg tcattaccgg gcatgaatgt gccggggtta ttgtcgaagt gggtaaaaat 240
ctcactggca aatataaaaa aggccagcgt tttgtattgc aaccggcgat ggggttacca 300
agcggatatt cagcgggcta cagctacgaa tattttggcg gcaatgccac ttatatgatt 360
attcccgaaa tcgccattaa tttgggctgc gtattaccgt atcacggctc ttattttgct 420
gcggcgtcgc tggcagagcc tatgtgctgc attattggtg cttatcatgc caattatcac 480
accacgcaat atgtttatga gcatcgcatg ggcgtcaaac ctggcggcaa tattgcactg 540
ctggcgtgtg caggtccgat gggcattggc gctatcgatt acgccattaa cggcggcata 600
caaccgtcgc gggtggtggt ggtcgatatc gacgacaaac gtctggcgca ggtacagaag 660
ctgctgccgg tggaactggc ggccagtaaa ggcattgagc tggtgtatgt gaataccaaa 720
gggatgagcg atcctgtcca gatgctgcgg gcgctgacag gagatgccgg gttcgatgac 780
atttttgttt atgcggcggt gcctgctgtc gttgagatgg ctgatgaatt actggcggaa 840
gatggctgtc tgaacttctt tgccgggccg acggataaaa acttcaaagt gccgtttaat 900
ttctacaacg tccattacaa cagcacgcac gtcgtcggta catctggcgg ttcaacggac 960
gacatgaaag aggcgattgc ccttagcgcc actgggcagt tacagccgtc gtttatggtg 1020
acccatatcg gtggcctgga tgcggtgcca gaaaccgtgc tcaatctgcc ggatatccct 1080
ggcggtaaaa aactcattta taacggcgtg accatgccgc tcactgccat tgccgatttt 1140
gccgaaaaag gcaaaaccga tccgctgttt aaagagttgg cgcggctggt tgaggaaacg 1200
cacggcatct ggaatgaaca ggccgagaaa tatctgctgg cacaatttgg cgttgatatc 1260
ggggaggccg cgcaatga 1278
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 1
<400> 5
caattttatt atagtaattg actattatac 30
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 2
<400> 6
gcttggtaac caattttatt atagtaattg actattatac 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 3
<400> 7
gttaccaagc ggatattcag gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 4
<400> 8
ggatattcag gttttagagc tagaaatagc 30
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 5
<400> 9
gagcctgtcg gcctacctgc t 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 6
<400> 10
cggccggcat gagcctgtcg 20
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 7
<400> 11
atgccggccg gctgctattt atggcaagcg 30
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 8
<400> 12
gctgctattt atggcaagcg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 9
<400> 13
cccatcgccg gttgcaatac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 10
<400> 14
gcttggtaac cccatcgccg 20
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 11
<400> 15
gttaccaagc agatattcag cgggctacag 30
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 12
<400> 16
agatattcag cgggctacag 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 13
<400> 17
tgctcataaa catattgcgt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 14
<400> 18
gcccatgcga tgctcataaa 20
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 15
<400> 19
tcgcatgggc gagctcctga aaatctcgat aac 33
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 16
<400> 20
gagctcctga aaatctcgat aac 23
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 17
<400> 21
acgtgtgacg gataaaccac 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 18
<400> 22
ttcacataca ccagctcaat 20
<210> 23
<211> 3234
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pDSG
<400> 23
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 60
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 120
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 180
cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 240
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 300
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 360
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 420
taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 480
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 540
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 600
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 660
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 720
atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taaaagattg acagtataat 780
agtcaattac tataataaaa ttgatgcgca ggtgaaacac ctgctgcagt tttagagcta 840
gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 900
gtgctttttt tcgttttccg ggacgccctc gcggacgtgc tcatagtcca cgacgcccgt 960
gattttgtag ccctggccga cggccagcag gtaggccgac aggctcatgc cggccggagc 1020
tcctgaaaat ctcgataact caaaaaatac gcccggtagt gatcttattt cattatggtg 1080
aaagttggaa cctcttagga tcctctagat ttaagaagga gatatacata aaactccttc 1140
tgagctagtt ctctagcatt ctattatttt gattcgacac cttaataata gcagaaggag 1200
tttttacctg tcaaagaacc atcaaaccct tgatacacaa ggctttgacc taattttgaa 1260
aaatgatgtt gtttctatat agtatcaaga taagaaagaa aaggattttt cgctacgctc 1320
aaatcctttc ccgtcacggg cttctcaggg cgttttatgg cgggtctgct atgtggtgct 1380
atctgacttt ttgctgttca gcagttcctg ccctctgatt ttccagtctg accacttcgg 1440
attatcccgt gacaggtcat tcagactggc taatgcaccc agtaaggcag cggtatcatc 1500
aacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 1560
atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 1620
aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 1680
ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 1740
tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 1800
ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 1860
tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 1920
aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt 1980
gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 2040
tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 2100
cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 2160
tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 2220
ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 2280
cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 2340
actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 2400
ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 2460
aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 2520
ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 2580
atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 2640
aaaaaaacac aaaagaccac attttttaat gtggtcttta ttcttcaact aaagcaccca 2700
ttagttcaac aaacgaaaat tggataaagt gggatatttt taaaatatat atttatgtta 2760
cagtaagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc 2820
cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg 2880
cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg 2940
gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat 3000
gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc 3060
ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 3120
ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 3180
agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtt 3234
<210> 24
<211> 9656
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pDS9
<400> 24
aaagccatga caaaaacgcg taacaaaagt gtctataatc acggcagaaa agtccacatt 60
gattatttgc acggcgtcac actttgctat gccatagcat ttttatccat aagattagcg 120
gatcctacct gacgcttttt atcgcaactc tctactgttt ctccataccc gtttttttgg 180
gaattcgagc tctaaggagg ttataaaaaa tggatattaa tactgaaact gagatcaagc 240
aaaagcattc actaaccccc tttcctgttt tcctaatcag cccggcattt cgcgggcgat 300
attttcacag ctatttcagg agttcagcca tgaacgctta ttacattcag gatcgtcttg 360
aggctcagag ctgggcgcgt cactaccagc agctcgcccg tgaagagaaa gaggcagaac 420
tggcagacga catggaaaaa ggcctgcccc agcacctgtt tgaatcgcta tgcatcgatc 480
atttgcaacg ccacggggcc agcaaaaaat ccattacccg tgcgtttgat gacgatgttg 540
agtttcagga gcgcatggca gaacacatcc ggtacatggt tgaaaccatt gctcaccacc 600
aggttgatat tgattcagag gtataaaacg aatgagtact gcactcgcaa cgctggctgg 660
gaagctggct gaacgtgtcg gcatggattc tgtcgaccca caggaactga tcaccactct 720
tcgccagacg gcatttaaag gtgatgccag cgatgcgcag ttcatcgcat tactgatcgt 780
tgccaaccag tacggcctta atccgtggac gaaagaaatt tacgcctttc ctgataagca 840
gaatggcatc gttccggtgg tgggcgttga tggctggtcc cgcatcatca atgaaaacca 900
gcagtttgat ggcatggact ttgagcagga caatgaatcc tgtacatgcc ggatttaccg 960
caaggaccgt aatcatccga tctgcgttac cgaatggatg gatgaatgcc gccgcgaacc 1020
attcaaaact cgcgaaggca gagaaatcac ggggccgtgg cagtcgcatc ccaaacggat 1080
gttacgtcat aaagccatga ttcagtgtgc ccgtctggcc ttcggatttg ctggtatcta 1140
tgacaaggat gaagccgagc gcattgtcga aaatactgca tacactgcag aacgtcagcc 1200
ggaacgcgac atcactccgg ttaacgatga aaccatgcag gagattaaca ctctgctgat 1260
cgccctggat aaaacatggg atgacgactt attgccgctc tgttcccaga tatttcgccg 1320
cgacattcgt gcatcgtcag aactgacaca ggccgaagca gtaaaagctc ttggattcct 1380
gaaacagaaa gccgcagagc agaaggtggc agcatgacac cggacattat cctgcagcgt 1440
accgggatcg atgtgagagc tgtcgaacag ggggatgatg cgtggcacaa attacggctc 1500
ggcgtcatca ccgcttcaga agttcacaac gtgatagcaa aaccccgctc cggaaagaag 1560
tggcctgaca tgaaaatgtc ctacttccac accctgcttg ctgaggtttg caccggtgtg 1620
gctccggaag ttaacgctaa agcactggcc tggggaaaac agtacgagaa cgacgccaga 1680
accctgtttg aattcacttc cggcgtgaat gttactgaat ccccgatcat ctatcgcgac 1740
gaaagtatgc gtaccgcctg ctctcccgat ggtttatgca gtgacggcaa cggccttgaa 1800
ctgaaatgcc cgtttacctc ccgggatttc atgaagttcc ggctcggtgg tttcgaggcc 1860
ataaagtcag cttacatggc ccaggtgcag tacagcatgt gggtgacgcg aaaaaatgcc 1920
tggtactttg ccaactatga cccgcgtatg aagcgtgaag gcctgcatta tgtcgtgatt 1980
gagcgggatg aaaagtacat ggcgagtttt gacgagatcg tgccggagtt catcgaaaaa 2040
atggacgagg cactggctga aattggtttt gtatttgggg agcaatggcg atgagatcta 2100
aagaggagaa aggatctatg gataagaaat actcaatagg cttagatatc ggcacaaata 2160
gcgtcggatg ggcggtgatc actgatgaat ataaggttcc gtctaaaaag ttcaaggttc 2220
tgggaaatac agaccgccac agtatcaaaa aaaatcttat aggggctctt ttatttgaca 2280
gtggagagac agcggaagcg actcgtctca aacggacagc tcgtagaagg tatacacgtc 2340
ggaagaatcg tatttgttat ctacaggaga ttttttcaaa tgagatggcg aaagtagatg 2400
atagtttctt tcatcgactt gaagagtctt ttttggtgga agaagacaag aagcatgaac 2460
gtcatcctat ttttggaaat atagtagatg aagttgctta tcatgagaaa tatccaacta 2520
tctatcatct gcgaaaaaaa ttggtagatt ctactgataa agcggatttg cgcttaatct 2580
atttggcctt agcgcatatg attaagtttc gtggtcattt tttgattgag ggagatttaa 2640
atcctgataa tagtgatgtg gacaaactat ttatccagtt ggtacaaacc tacaatcaat 2700
tatttgaaga aaaccctatt aacgcaagtg gagtagatgc taaagcgatt ctttctgcac 2760
gattgagtaa atcaagacga ttagaaaatc tcattgctca gctccccggt gagaagaaaa 2820
atggcttatt tgggaatctc attgctttgt cattgggttt gacccctaat tttaaatcaa 2880
attttgattt ggcagaagat gctaaattac agctttcaaa agatacttac gatgatgatt 2940
tagataattt attggcgcaa attggagatc aatatgctga tttgtttttg gcagctaaga 3000
atttatcaga tgctatttta ctttcagata tcctaagagt aaatactgaa ataactaagg 3060
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taaaagcttt agttcgacaa caacttccag aaaagtataa agaaatcttt tttgatcaat 3180
caaaaaacgg atatgcaggt tatattgatg ggggagctag ccaagaagaa ttttataaat 3240
ttatcaaacc aattttagaa aaaatggatg gtactgagga attattggtg aaactaaatc 3300
gtgaagattt gctgcgcaag caacggacct ttgacaacgg ctctattccc catcaaattc 3360
acttgggtga gctgcatgct attttgagaa gacaagaaga cttttatcca tttttaaaag 3420
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catggaattt tgaagaagtt gtcgataaag gtgcttcagc tcaatcattt attgaacgca 3600
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atgatttgct aaaaattatt aaagataaag attttttgga taatgaagaa aatgaagata 3960
tcttagagga tattgtttta acattgacct tatttgaaga tagggagatg attgaggaaa 4020
gacttaaaac atatgctcac ctctttgatg ataaggtgat gaaacagctt aaacgtcgcc 4080
gttatactgg ttggggacgt ttgtctcgaa aattgattaa tggtattagg gataagcaat 4140
ctggcaaaac aatattagat tttttgaaat cagatggttt tgccaatcgc aattttatgc 4200
agctgatcca tgatgatagt ttgacattta aagaagacat tcaaaaagca caagtgtctg 4260
gacaaggcga tagtttacat gaacatattg caaatttagc tggtagccct gctattaaaa 4320
aaggtatttt acagactgta aaagttgttg atgaattggt caaagtaatg gggcggcata 4380
agccagaaaa tatcgttatt gaaatggcac gtgaaaatca gacaactcaa aagggccaga 4440
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ttcttaaaga gcatcctgtt gaaaatactc aattgcaaaa tgaaaagctc tatctctatt 4560
atctccaaaa tggaagagac atgtatgtgg accaagaatt agatattaat cgtttaagtg 4620
attatgatgt cgatcacatt gttccacaaa gtttccttaa agacgattca atagacaata 4680
aggtcttaac gcgttctgat aaaaatcgtg gtaaatcgga taacgttcca agtgaagaag 4740
tagtcaaaaa gatgaaaaac tattggagac aacttctaaa cgccaagtta atcactcaac 4800
gtaagtttga taatttaacg aaagctgaac gtggaggttt gagtgaactt gataaagctg 4860
gttttatcaa acgccaattg gttgaaactc gccaaatcac taagcatgtg gcacaaattt 4920
tggatagtcg catgaatact aaatacgatg aaaatgataa acttattcga gaggttaaag 4980
tgattacctt aaaatctaaa ttagtttctg acttccgaaa agatttccaa ttctataaag 5040
tacgtgagat taacaattac catcatgccc atgatgcgta tctaaatgcc gtcgttggaa 5100
ctgctttgat taagaaatat ccaaaacttg aatcggagtt tgtctatggt gattataaag 5160
tttatgatgt tcgtaaaatg attgctaagt ctgagcaaga aataggcaaa gcaaccgcaa 5220
aatatttctt ttactctaat atcatgaact tcttcaaaac agaaattaca cttgcaaatg 5280
gagagattcg caaacgccct ctaatcgaaa ctaatgggga aactggagaa attgtctggg 5340
ataaagggcg agattttgcc acagtgcgca aagtattgtc catgccccaa gtcaatattg 5400
tcaagaaaac agaagtacag acaggcggat tctccaagga gtcaatttta ccaaaaagaa 5460
attcggacaa gcttattgct cgtaaaaaag actgggatcc aaaaaaatat ggtggttttg 5520
atagtccaac ggtagcttat tcagtcctag tggttgctaa ggtggaaaaa gggaaatcga 5580
agaagttaaa atccgttaaa gagttactag ggatcacaat tatggaaaga agttcctttg 5640
aaaaaaatcc gattgacttt ttagaagcta aaggatataa ggaagttaaa aaagacttaa 5700
tcattaaact acctaaatat agtctttttg agttagaaaa cggtcgtaaa cggatgctgg 5760
ctagtgccgg agaattacaa aaaggaaatg agctggctct gccaagcaaa tatgtgaatt 5820
ttttatattt agctagtcat tatgaaaagt tgaagggtag tccagaagat aacgaacaaa 5880
aacaattgtt tgtggagcag cataagcatt atttagatga gattattgag caaatcagtg 5940
aattttctaa gcgtgttatt ttagcagatg ccaatttaga taaagttctt agtgcatata 6000
acaaacatag agacaaacca atacgtgaac aagcagaaaa tattattcat ttatttacgt 6060
tgacgaatct tggagctccc gctgctttta aatattttga tacaacaatt gatcgtaaac 6120
gatatacgtc tacaaaagaa gttttagatg ccactcttat ccatcaatcc atcactggtc 6180
tttatgaaac acgcattgat ttgagtcagc taggaggtga ctaacgcatc ctcacgataa 6240
tatccgggta ggcgcaatca ctttcgtcta ctccgttaca aagcgaggct gggtatttcc 6300
cggcctttct gttatccgaa atccactgaa agcacagcgg ctggctgagg agataaataa 6360
taaacgaggg gctgtatgca caaagcatct tctgttgagt taagaacgag tatcgagatg 6420
gcacatagcc ttgctcaaat tggaatcagg tttgtgccaa taccagtaga aacagacgaa 6480
gaatccatgg gtatggacag ttttcccttt gatatgtaac ggtgaacagt tgttctactt 6540
ttgtttgtta gtcttgatgc ttcactgata gatacaagag ccaaatctag taatatttta 6600
tctgattaat aagatgatct tcttgagatc gttttggtct gcgcgtaatc tcttgctctg 6660
aaaacgaaaa aaccgccttg cagggcggtt tttcgaaggt tctctgagct accaactctt 6720
tgaaccgagg taactggctt ggaggagcgc agtcaccaaa acttgtcctt tcagtttagc 6780
cttaaccggc gcatgacttc aagactaact cctctaaatc aattaccagt ggctgctgcc 6840
agtggtgctt ttgcatgtct ttccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 6900
cagcggtcgg actgaacggg gggttcgtgc atacagtcca gcttggagcg aactgcctac 6960
ccggaactga gtgtcaggcg tggaatgaga caaacgcggc cataacagcg gaatgacacc 7020
ggtaaaccga aaggcaggaa caggagagcg cacgagggag ccgccagggg gaaacgcctg 7080
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca ccactgattt gagcgtcaga tttcgtgatg 7140
cttgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cggctttgcc gcggccccgc tgaatattcc 7200
ttttgtctcc gaccatcagg cacctgagtc gctgtctttt tcgtgacatt cagttcgctg 7260
cgctcacggc tctggcagtg aatgggggta aatggcacta caggcgcctt ttatggattc 7320
atgcaaggaa actacccata atacaagaaa agatgtggtc tttattcttc aactaaagca 7380
cccattagtt caacaaacga aaattggata aagtgggata tttttaaaat atatatttat 7440
gttacctggc agagcctgta ctttttacag tcggttttct aatgtcacta acctgccccg 7500
ttagtcgcca tttgcatcga tttattatga caacttgacg gctacatcat tcactttttc 7560
ttcacaaccg gcacggaact cgctcgggct ggccccggtg cattttttaa atacccgcga 7620
gaaatagagt tgatcgtcaa aaccaacatt gcgaccgacg gtggcgatag gcatccgggt 7680
ggtgctcaaa agcagcttcg cctggctgat acgttggtcc tcgcgccagc ttaagacgct 7740
aatccctaac tgctggcgga aaagatgtga cagacgcgac ggcgacaagc aaacatgctg 7800
tgcgacgctg gcgatatcaa aattgctgtc tgccaggtga tcgctgatgt actgacaagc 7860
ctcgcgtacc cgattatcca tcggtggatg gagcgactcg ttaatcgctt ccatgcgccg 7920
cagtaacaat tgctcaagca gatttatcgc cagcagctcc gaatagcgcc cttccccttg 7980
cccggcgtta atgatttgcc caaacaggtc gctgaaatgc ggctggtgcg cttcatccgg 8040
gcgaaagaac cccgtattgg caaatattga cggccagtta agccattcat gccagtaggc 8100
gcgcggacga aagtaaaccc actggtgata ccattcgcga gcctccggat gacgaccgta 8160
gtgatgaatc tctcctggcg ggaacagcaa aatatcaccc ggtcggcaaa caaattctcg 8220
tccctgattt ttcaccaccc cctgaccgcg aatggtgaga ttgagaatat aacctttcat 8280
tcccagcggt cggtcgataa aaaaatcgag ataaccgttg gcctcaatcg gcgttaaacc 8340
cgccaccaga tgggcattaa acgagtatcc cggcagcagg ggatcatttt gcgcttcagc 8400
catacttttc atactcccgc cattcagaga agaaaccaat tgtccatatt gcatcagaca 8460
ttgccgtcac tgcgtctttt actggctctt ctcgctaacc aaaccggtaa ccccgcttat 8520
taaaagcatt ctgtaacaaa gcgggaccag taatagaaag tgagggagcc acggttgatg 8580
agagctttgt tgtaggtgga ccagttggtg attttgaact tttgctttgc cacggaacgg 8640
tctgcgttgt cgggaagatg cgtgatctga tccttcaact cagcaaaagt tcgatttatt 8700
caacaaagcc acgttgtgtc tcaaaatctc tgatgttaca ttgcacaaga taaaaatata 8760
tcatcatgaa caataaaact gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgttatgagc 8820
catattcaac gggaaacgtc ttgctcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat 8880
ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga 8940
ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc 9000
aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg 9060
accatcaagc attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc 9120
gggaaaacag cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat 9180
gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac 9240
agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat 9300
gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg 9360
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ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag 9600
tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa tcagaattgg ttaattggtt gtaaca 9656
Claims (7)
- 서열번호 3의 아미노산 서열에서 102번째 글리신이 아르기닌으로 치환된, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 징크 바인딩 디하이드로게나제 변이체.
- 청구항 1의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 1의 변이체 또는 청구항 2의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환체.
- 청구항 3에 있어서,
상기 형질전환체는 에스케리치아(Escherichia) 속 균주인 것인 형질전환체. - 청구항 3에 있어서,
상기 형질전환체는 L-방향족 아미노산 생산능을 가지는 것인 형질전환체. - 청구항 3의 형질전환체를 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 형질전환체 또는 형질전환체가 배양된 배지로부터 L-방향족 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 L-방향족 아미노산의 생산 방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 L-방향족 아미노산은 L-트립토판, L-페닐알라닌 및 L-티로신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 방법.
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