KR102096592B1 - 신규한 crispr 연관 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 CRISPR 연관 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 단백질은 가이드 RNA와 결합된 세포 내 핵산 서열을 인식하여 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 가진다. 따라서, 본 발명의 신규한 CRISPR 연관 단백질은 CRISPR-Cas 시스템에서 유전체를 교정하는 또 다른 뉴클레아제로서 사용될 수 있다.

Description

신규한 CRISPR 연관 단백질 및 이의 용도{NOVEL CRISPR ASSOCIATED PROTEIN AND USE THEREOF}

본 발명은 신규한 CRISPR 연관 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

유전체 교정(Genome Editing)이란 생명체의 유전정보를 자유롭게 교정하는 기술이다. 생명과학분야의 진보와 유전체 서열 분석 기술의 발전을 통해 우리는 다양한 유전정보에 대해 폭넓게 이해할 수 있게 되었다. 예를 들어 동식물의 번식, 질병과 성장, 다양한 인간 유전질병을 일으키는 유전자 변이, 바이오연료의 생산 등을 위한 유전자에 대한 이해는 이미 확보된 상황이지만 이를 직접적으로 활용하여 생명체를 개선하고, 인간 질병을 치료하는 수준에까지 이르기 위해서는 그 이상의 기술 진보가 필수적이다.

유전체 교정 기술은 인간을 포함하여 동물, 식물, 미생물의 유전정보를 변화시켜 그 활용범위를 획기적으로 확장시킬 수 있다. 유전자가위는 원하는 유전정보를 정확히 자를 수 있도록 설계되어 만들어지는 분자 도구로 유전체 교정 기술에서 핵심역할을 하고 있다. 유전자 서열분석 분야를 한 차원 발전시켰던 차세대시퀀싱(Next generation sequencing) 기술과 같이, 유전자가위는 유전정보 활용의 속도와 그 범위를 확장시키고 새로운 산업분야를 창출해 내는 핵심 기술이 되고 있다.

지금까지 개발된 유전자 가위는 그 순서에 따라 3세대로 나눌 수 있다. 1세대 유전자 가위는 ZFN(Zinc Finger Nuclease), 2세대 유전자 가위는 TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease), 가장 최근에 연구된 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas(CRISPR-associated)9은 3세대 유전자 가위다

CRISPRs는 유전자 서열이 밝혀진 박테리아의 대략 40% 및 유전자 서열이 밝혀진 고세균의 90%의 유전체에서 발견되는 여러 짧은 직접 반복을 포함하는 좌위이다. Cas 단백질은 CRISPR RNA(crRNA) 및 trans-activating crRNA(tracrRNA)로 명명된 두 개의 RNA와 복합체를 형성했을 때, 활성 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 형성하고, 그렇게 함으로써 파지 또는 플라스미드의 침입에서 외부 유전적 요소를 묵살하여 숙주 세포를 보호한다. crRNA는 전달에 외부 침입자로부터 점유되었던 숙주 유전체의 CRISPR 요소로부터 전사된다.

이러한 CRISPR-Cas 시스템 유래의 RNA-가이드 뉴클레아제(RNA-guided nuclease)는 유전체를 교정할 수 있는 수단을 제공해준다. 특히, 단일 가이드 RNA(sgRNA)와 Cas 단백질을 이용하여 세포 및 기관의 유전체를 편집할 수 있는 기술과 관련된 연구들이 활발히 진행되어왔다. 최근, Cpf1 단백질(Prevotella 및 Francisella 1 유래)이 CRISPR-Cas 시스템의 또 다른 뉴클레아제 단백질로서 보고되었고(B. Zetsche, et al., 2015), 이에 따라 유전체 교정에 있어서 선택의 폭이 넓어졌다.

B. Zetsche, et al., Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system, Cell, 2015, 163, 759-771.

본 발명자들은 유전체 교정에 있어서 기존에 알려진 뉴클레아제보다 더 효과적인 단백질을 개발하기 위하여 지속적으로 연구한 결과, 표적 핵산 서열을 인식하여 절단하는 신규한 CRISPR 연관 단백질을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 표적 핵산 서열을 인식하여 절단하는 신규한 CRISPR 연관 단백질을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Cas12a 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 925번째 위치의 라이신(Lys)이 다른 아미노산으로 치환된 Cas12a 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 Cas12a 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열 중 930번째 위치의 라이신(Lys)이 다른 아미노산으로 치환된 Cas12a 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 877번째 위치의 아스파르트산(Asp)이 다른 아미노산으로 치환된 Cas12a 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열 중 873번째 위치의 아스파르트산(Asp)이 다른 아미노산으로 치환된 Cas12a 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 mgCas12a; 및 암세포에 특이적으로 존재하는 핵산 서열을 타겟팅하는 crRNA를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 단백질은 가이드 RNA와 결합된 세포 내 핵산 서열을 인식하여 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 가진다. 따라서, 본 발명의 신규한 CRISPR 연관 단백질은 CRISPR-Cas 시스템에서 유전체를 교정하는 또 다른 뉴클레아제로서 사용될 수 있다.

도 1은 메타지놈으로부터 Cas12a를 발굴하는 과정을 도식화한 것이다.
도 2a는 발굴된 Cas12a의 계통수를 나타낸 것이다.
도 2b는 신규 Cas12a와 AsCas12a의 구조도를 나타낸 것이다.
도 3 내지 도 8은 ESPript 프로그램을 이용하여 정렬한 기존의 Cas12a 및 본 발명의 mgCas12a의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 9a 및 9b는 Cas12a 및 본 발명의 mgCas12a의 서열 정보를 비교 및 정리하여 표로 나타낸 것이다.
도 10 내지 도 12는 pH에 따른 본 발명에 따른 mgCas12a의 활성을 확인한 것이다. 한편, 도 10의 crRNA #1은 서열번호 25의 염기서열을 가지고, 도 11의 crRNA #2는 서열번호 26의 염기서열을 가진다.
도 13은 표적 핵산 서열 및 crRNA가 결합하는 위치를 표시하여 나타낸 것이다.
도 14는 CCR5 및 DNMT1 각 유전자의 crRNA를 이용한 유전자 편집 효율을 단백질별(mock, mgCas12a-1 및 mgCas12a-2)로 나타낸 것이다.
도 15는 FucT14-1 및 FucT14-2 각 유전자의 두 가지 crRNA를 이용한 유전자 편집 효율을 단백질별(FnCpf1, mgCas12a-1 및 mgCas12a-2)로 확인하여 나타낸 것이다.
도 16a 및 도 16b는 FnCas12a, WT mgCas12a-1 또는 WT mgCas12a-2 단백질의 DNA 절단 활성을 확인한 것이다.
도 17은 기존 Cas12a(AsCas12a, FnCas12a 또는 LbCas12a)와 신규 Cas12a(WT mgCas12a-1, d_mgCas12a-1, WTmgCas12a-2 또는 d_mgCas12a-2)의 비특이적인 DNase 기능을 확인한 것이다.
도 18a 및 도 18b는 crRNA 없이 FnCas12a, WT mgCas12a-1 또는 WT mgCas12a-2 단백질이 비특이적인 DNase 기능을 가지는지를 확인한 것이다.
도 19는 mgCas12a가 기존 Cas12a의 5' handle을 이용하여 DNA 절단이 가능한지를 확인한 것이다.
도 20a 및 도 20b는 이가이온들에서 FnCas12a, mgCas12a-1 또는 mgCas12a-2 단백질의 DNA 절단 활성을 나타낸 것이다.

본 발명은 일 측면으로, 메타지놈에서 수득한 신규한 Cas12a 단백질을 제공한다.

본 명세서에서 사용한 용어 “Cas12a”는 CRISPR 연관 단백질로서, Cpf1로도 지칭될 수 있다. 또한, Cpf1은 type V CRISPR 시스템 단백질이다. Cas12a는 단일 단백질로서, crRNA과 결합하여 표적 유전자를 절단한다는 점은 type II CRISPR 시스템 단백질인 Cas9와 유사하다. 다만, 그 작동 방식에서 차이가 있다. Cas12a 단백질은 하나의 crRNA로 작동한다. 따라서, Cas9의 경우와 같이 crRNA와 trans-activating crRNA(tracrRNA)를 동시에 사용하거나, 인위적으로 tracrRNA와 crRNA를 합친 single guide RNA(sgRNA)를 제작할 필요가 없다.

또한, Cas12a 시스템은 Cas9와 달리 PAM이 표적 서열의 5' 위치에 존재한다. 또한, Cas12a 시스템은 표적을 결정하는 guide RNA의 길이도 Cas9에 비해 짧다. 또한, Cas12a는 표적 DNA가 절단된 위치에 blunt-end가 아닌 5' overhang(sticky end)을 발생시키므로, 보다 정확하고 다양한 유전자 교정이 가능하다는 이점을 갖는다.

종래에 Cas12a 단백질은 캔디다투스(Candidatus) 속, 라치노스피라(Lachnospira) 속, 뷰티리비브리오(Butyrivibrio) 속, 페레그리니박테리아(Peregrinibacteria), 액시도미노코쿠스(Acidominococcus) 속, 포르파이로모나스(Porphyromonas) 속, 프레보텔라(Prevotella) 속, 프란시셀라(Francisella) 속, 캔디다투스 메타노플라스마(Candidatus Methanoplasma), 또는 유박테리움(Eubacterium) 속 유래의 것일 수 있다. 구체적으로, PbCas12a는 Parcubacteria bacterium GWC2011_GWC2_44_17에서 유래한 단백질이며, PeCas12a는 Peregrinibacteria Bacterium GW2011_GWA_33_10에서 유래한 단백질이며, AsCas12a는 Acidaminococcus sp. BVBLG에서 유래한 단백질이며, PmCas12a는 Porphyromonas macacae에서 유래한 단백질이며, LbCas12a는 Lachnospiraceae bacterium ND2006에서 유래한 단백질이며, PcCas12a는 Porphyromonas crevioricanis에서 유래한 단백질이며, PdCas12a는 Prevotella disiens에서 유래한 단백질이며, FnCas12a는 Francisella novicida U112에서 유래한 단백질이다. 다만, Cas12a 단백질은 유래된 미생물에 따라 다른 활성을 가질 수 있다.

본 발명은 메타지놈의 유전자들을 분석하여 새로운 Cas12a를 규명한 것이다. 이하, 메타지놈에서 유래한 Cas12a를 mgCas12a로 지칭할 수 있다. 본 발명의 mgCas12a도 AsCas12a와 같이, WED, REC, PI, RuvC, BH 및 NUC 도메인을 포함한다(도 2). 또한, 본 발명의 mgCas12a 단백질은 종래에 알려진 Cas12a 단백질과 동일하게, crRNA 및 5’-handle을 포함한 gRNA로 유전자를 절단할 수 있음을 확인하였다. mgCas12a는 FnCas12a와 동일한 서열을 가지는 5’-handle RNA를 이용함을 확인하였다. 구체적으로, 5’-handle RNA의 서열은 AAUUUCUACUGUUGUAGAU(서열번호 12)일 수 있다. 다만, AsCas12a 및 LbCas12a의 5’-handle RNA에도 작동함을 확인하였다(도 19).

상기 mgCas12a는 분리 정제를 위해 Tag를 추가적으로 포함할 수 있다. Tag는 mgCas12a의 N 말단 또는 C 말단에 결합될 수 있다. 또한, Tag는 mgCas12a의 N 말단 및 C 말단에 동시에 결합될 수 있다. 상기 Tag의 일 구체예로는 6XHis Tag일 수 있다.

mgCas12a의 일 구체예로 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 제공한다. 또한, 상기 mgCas12a의 활성이 변하지 않는 한, 일부 아미노산을 결실, 치환 시킬 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 925번째 위치의 라이신(Lys)이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 일 수 있다. 이때, 다른 아미노산은 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 티로신(Tyr), 알라닌(Ala), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 발린(Val), 페닐알라닌(Phe), 메티오닌(Met), 트립토판(Trp), 글리신(Gly), 프롤린(Pro), 및 시스테인(Cys)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열의 925번째 위치의 라이신이 글루타민으로 치환된 것일 수 있으며, 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

또한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 mgCas12a는 pH 7.0 내지 pH 7.9에서 최적의 활성을 가질 수 있다.

mgCpf1의 또 다른 구체예로, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 제공한다. 또한, 상기 mgCpf1의 활성이 변하지 않는 한, 일부 아미노산을 결실, 치환 시킬 수 있다. 구체적으로, 서열번호 3의 아미노산 서열 중 930번째 위치의 라이신(Lys)이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 일 수 있다. 이때, 다른 아미노산은 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 티로신(Tyr), 알라닌(Ala), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 발린(Val), 페닐알라닌(Phe), 메티오닌(Met), 트립토판(Trp), 글리신(Gly), 프롤린(Pro), 및 시스테인(Cys)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열의 930번째 위치의 라이신이 글루타민으로 치환된 것일 수 있으며, 서열번호 6의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 mgCas12a는 pH 7.0 내지 pH 7.9에서 최적의 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면으로는, mgCas12a에서 엔도뉴클레아제 활성이 감소된 단백질을 제공한다. 일 구체예로, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 mgCas12a의 877번째 아스파르트산(Asp)이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 이때, 다른 아미노산은 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 글루탐산(Glu), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 티로신(Tyr), 알라닌(Ala), 라이신(Lys), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 발린(Val), 페닐알라닌(Phe), 메티오닌(Met), 트립토판(Trp), 글리신(Gly), 프롤린(Pro), 및 시스테인(Cys)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 아스파르트산(Asp)이 알라닌(Ala)으로 치환된 단백질일 수 있다.

또 다른 구체예로, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 mgCas12a의 873번째 아스파르트산(Asp)이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 이때, 다른 아미노산은 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 글루탐산(Glu), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 티로신(Tyr), 알라닌(Ala), 라이신(Lys), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 발린(Val), 페닐알라닌(Phe), 메티오닌(Met), 트립토판(Trp), 글리신(Gly), 프롤린(Pro), 및 시스테인(Cys)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 구체적으로, 상기 아스파르트산(Asp)이 알라닌(Ala)으로 치환된 단백질일 수 있다. 이때, 엔도뉴클레아제 활성이 감소된 mgCas12a를 dead mgCas12a 또는 d_mgCas12a로 지칭할 수 있다. 상기 d_mgCas12a는 서열번호 13 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면으로, mgCas12a; 및 암세포에 특이적으로 존재하는 핵산 서열을 타겟팅하는 crRNA를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 이때, 상기 mgCas12a는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, “암세포에 특이적으로 존재하는 핵산 서열”은 정상세포에는 존재하지 않으나 암세포에만 존재하는 핵산 서열을 의미한다. 즉, 정상 세포와 상이한 서열을 의미하며, 적어도 1개의 핵산이 상이할 수 있다. 또한, 유전자의 일부가 치환, 결실된 것일 수 있다. 일 구체예로 암세포에 특이적으로 존재하는 서열은 암세포에 존재하는 SNP일 수 있다. 상기 서열을 갖는 암세포 내에 존재하는 타겟 DNA와 타겟 RNA에 상보적인 서열을 갖는 가이드 RNA는 서로 특이적으로 결합한다.

특히, 암세포에 특이적으로 존재하는 핵산 서열은 여러 암조직의 유전체 서열분석으로부터 암세포에만 존재하는 특이적 SNP를 찾아서 이를 이용해서 crRNA를 제작할 수 있다. 따라서, 암세포 특이적 독성을 나타내는 방식이므로, 환자 맞춤형 항암치료제 개발이 가능할 수 있다. 뿐만 아니라, 암세포에 특이적으로 존재하는 핵산 서열은 정상세포와 달리 암세포에서 높은 CNV(copy number variation)를 가지는 유전자 일 수 있다.

상기 암의 일 구체예는 방광암, 골암, 혈액암, 유방암, 흑색종양, 갑상선암, 부갑상선암, 골수암, 직장암, 인후암, 후두암, 폐암, 식도암, 췌장암, 대장암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 두부 또는 경부암, 담낭암, 구강암, 결장암, 항문 부근암, 중추신경계 종양, 간암 및 대장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 특히, 우리나라 5대 암으로 알려진 위암, 대장암, 간암, 폐암, 유방암일 수 있다.

이때, 상기 암세포에 특이적으로 존재하는 핵산 서열을 타겟팅하는 crRNA는 하나 이상의 gRNA 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 난소암 또는 유방암에 존재하는 BRCA1의 엑손 10 또는 11을 동시에 타겟팅할 수 있는 gRNA를 사용할 수 있다. 또한, BRCA1의 엑손 11을 타겟팅 하는 두개 이상의 gRNA를 사용할 수 있다. 이와 같이 gRNA의 조합은 암 치료 목적 및 암의 종류에 따라 적합하게 선택될 수 있다. 즉, 서로 다른 gRNA를 선택하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 메타지놈 유래의 Cas12a 단백질 발굴

NCBI Genbank BLAST 데이터베이스에서 메타지놈 염기서열을 다운로드하고 로컬 BLASTp 데이터베이스로 구축하였다. 또한, 16개의 Cas12a과 다양한 CRISPR 관련 단백질(Cas1) 아미노산 서열을 Uniprot 데이터베이스에서 다운로드하였다. MetaCRT 프로그램을 이용하여 메타지놈에서 CRISPR 리피트(repeat)와 스페이서(spacer) 서열을 발견하였다. 그리고, CRISPR 서열을 갖는 메타지놈 서열만 추출하여 Prodigal 프로그램을 이용하여 유전자를 예측하였다.

상기 예측된 유전자 중, CRISPR 서열의 상하위 10 kb 범위 안에 있는 것을 추출하였고, Cas12a 아미노산 서열을 이용하여 해당 유전자 중 Cas12a의 호몰로그(homolog)를 예측하였다. Cas1 유전자를 이용하여 Cas12a 호몰로그의 상하위에 Cas1 호몰로그가 있는지 예측하였고, Cas1을 주위에 갖는 800 aa 내지 1,500 aa 범위의 Cas12a 유전자들을 선별하였다. 이들을 대상으로 NCBI Genbank non-redundant 데이터베이스에서 BLASTp를 이용하여, 이미 보고된 바 있는 유전자인지, 또한 전혀 CRISPR와 관계 없는 유전자는 아닌지 판별하였다.

메티오닌(Met)으로 시작하지 않는 조각난 Cas12a를 제외한 후, 이들을 MAFFT(multiple alignment using fast fourier transform) 프로그램을 이용하여 정렬하였다. 그 후, MEGA7을 이용하여 Neighbor-joining(100x부트스트랩(bootstrap))으로 계통수를 그렸다. 기존에 알려진 Cas12a 유전자와 단계통군을 이루는 유전자를 선별하여, 기존의 Cas12a 아미노산 서열과 함께 MEGA7, 최대공산(maximum-likelihood), 1000x 부트스트랩(bootstrap)으로 계통수를 그려 진화적 유연관계를 살폈다. 이때, 상기 메타지놈으로부터의 Cas12a 발굴과정을 도 1에 도식화하여 나타내다. 또한, Cas12a의 계통수를 도 2a에 나타내었다. 이때, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 신규한 단백질을 WT mgCas12a-1 이라고 명명하였다. 또한, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 신규한 단백질을 WT mgCas12a-2라고 명명하였다. 또한, 이때, AsCas12a와 mgCas12a-1 및 mgCas12a-2의 구조도를 도 2b에 나타내었다.

실시예 2. mgCas12a의 변이체 제작

ESPript 프로그램을 이용하여 Cas12a 후보군을 AsCas12a 및 LbCas12a의 구조를 기반으로 하여 정렬하였다. 상기 WT mgCas12a-1 및 WT mgCas12a-2에서 엔도뉴클레아제의 활성을 높이기 위해서 일부 아미노산을 치환하였다. WT mgCas12a-1의 925번째 아미노산인 Lys(K)를 Glu(Q)으로 치환한 것을 mgCas12a-1로 명명하였다. 또한, WT mgCas12a-2의 930번째 아미노산인 Lys(K)를 Glu(Q)으로 치환한 것을 mgCas12a-2로 명명하였다. 인간과 애기장대, 대장균의 코돈 사용빈도(codon usage)를 고려하여, 코돈 최적화(codon optimization)를 진행한 후 Bionics에 유전자 합성을 의뢰하였다. 이때, 인간 코돈 최적화된 mgCas12a-1 및 mgCas12a-2의 염기서열을 각각 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타내었다. 또한, 상기 ESPript 프로그램을 이용하여 정렬한 기존의 Cas12a(AsCas12a(서열번호 9), LbCas12a(서열번호 10), FnCas12a(서열번호 11)) 및 Cas12a 후보군(mgCas12a-1 및 mgCas12a-2)의 아미노산 서열을 도 3 내지 도 8에 나타내었으며, 이들의 서열 정보를 비교 정리하여 도 9a 및 도 9b에 나타내었다.

그리고, pUC57 벡터에 클로닝된 WT mgCas12a-1, WT mgCas12a-2, mgCas12a-1 및 mgCas12a-2 유전자를 다시 pET28a-KanR-6xHis-BPNLS 벡터에 삽입한 후 클로닝하였다. 클로닝된 벡터는 대장균 DH5a와 로제타(Rosetta) 균주에 각각 형질전환하였다. crRNA의 5'-핸들 서열을 메타지놈 CRISPR 반복 서열에서 추출하였다. 추출된 RNA를 DNA 올리고로 합성하였다. DNA 올리고머를 MEGAshortscript T7 RNA 전사효소 키트를 이용하여 전사하였고, 전사된 5'-핸들의 농도를 FLUOstar Omega로 확인하였다.

실시예 3. 단백질 발현과 정제

하룻밤 동안 배양한 로제타(DE3) 대장균 5 ml를 100 mg/ml의 카나마이신 항생제를 추가한 500 ml의 액체 TB 배지에 접종하였다. 배지는 37℃ 배양기에서 0.6 OD600이 될 때까지 배양하였다. 단백질 발현을 위해 0.4 uM의 IPTG(Isopropyl β- D-1-thiogalactopyranoside)를 처리한 뒤, 22℃에서 16 내지 18시간 더 배양하였다. 원심분리 후 수득한 세포를 10 ml의 용해 버퍼(20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 20 mM 이미다졸, 10% 글리세롤 및 EDTA-프리 프로테아제 인히비터 칵테일)와 혼합한 후, 초음파를 처리하여 세포를 분쇄하였다. 분쇄물을 6,000 rpm에서 20분간 세 번 원심분리한 후 0.22 마이크론 필터로 여과하였다.

이후, 니켈 컬럼(HisTrap FF 5 ml) 및 300 mM 이미다졸 버퍼를 이용하여 세척 및 용출하였고 친화-크로마토그래피로 단백질을 정제하였다. SDS-PAGE 전기영동으로 단백질의 크기를 확인하였고, 투석 버퍼(20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM DTT, 10% 글리세롤)로 하룻밤 동안 투석하였다. 이후, 단백질 크기에 맞춰 선택적으로 여과 및 농축(Amicon Ultra Centrifugal Filter 100,000 MWCO)하였다. 브래드포드 정량법으로 농도를 측정한 후, -80℃에 보관 및 사용하였다.

실시예 4. 클리비지 분석을 통한 mgCas12a에 적합한 pH 범위 확인

상추(Lactuca sativa)의 자일로실트랜스퍼레이즈(xylosyltransferase)를 PCR로 증폭하여 PAM(protospacer adjacent motif)을 예측하였고, 가이드 RNA(gRNA)를 디자인하였다. mgCas12a-1 및 mgCas12a-2의 RNP(ribonucleoprotein) 복합체를 mgCas12a 단백질 및 gRNA가 1:1.25의 분자비가 되도록 하여 상온에서 20분간 혼합하여, RNP 복합체를 제작하였다. 정제된 자일로실트랜스퍼레이즈 PCR 프로덕트를 다양한 농도로 RNP에 처리한 후, NEBuffer 1.1(1X Buffer Components, 10 mM Bis-Tris-Propane-HCl, 10 mM MgCl₂ 및 100 ㎍/ml BSA), NEBuffer 2.1(1X Buffer Components, 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂ 및 100 ㎍/ml BSA) 및 NEBuffer 3.1(1X Buffer Components, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂ 및 100 ㎍/ml BSA)로 농도를 맞추어 37℃에서 in vitro 클리비지(cleavage) 분석을 실시하였다. 이때, NEBuffer 1.1, NEBuffer 2.1 및 NEBuffer 3.1는 25℃에서 각각 pH 7.0, pH 7.9 및 pH 7.9 값을 갖는다. 각 반응이 완료된 후 65℃에서 10분간 인큐베이션하여 반응을 정지하였으며, 완료된 반응을 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 10 내지 도 12에 나타내었다. 도 10 내지 도 12에서 mgCas12a-1 및 mgCas12a-2를 hemgCas12a-1 및 hemgCas12a-2로 표기하였다. 또한, 상기 자일로실트랜스퍼레이즈에서 표적 핵산 서열 및 crRNA가 결합하는 위치를 표시하여 도 13에 나타내었다.

도 10 내지 도 12에 나타난 바와 같이, mgCas12a-1 및 crRNA 복합체에 NEBuffer 1.1을 처리한 경우 표적 dsDNA가 절단되었다. 또한, mgCas12a-2 및 crRNA 복합체에 NEBuffer 1.1을 처리한 경우 표적 dsDNA가 절단되었다. 이를 통해, mgCas12a-1 및 mgCas12a-2는 pH 7.0에서 활성이 활발해짐을 알 수 있었다.

실시예 5. 동물세포에서 mgCas12a의 유전자 편집 효율 분석

실시예 5.1. CCR5 및 DNMT1의 유전자 편집을 위한 mgCas12a -1 및 mgCas12a -2를 포함한 RNP 제작

HEK 293T 세포를 10% 태아 소혈청인 FBS와 P/S(penicillin-streptomycin)가 함유된 DMEM 배지에서 37℃의 온도로 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 각각 100 pmole의 mgCas12a-1 단백질 및 mgCas12a-2 단백질과 200 pmole의 CCR5 및 DNMT1를 타겟팅하는 crRNA를 상온에서 20분간 배양하여 RNP를 제작하였다. 이때, 상기 CCR5 및 DNMT1의 crRNA 서열은 IDT(Integrated DNA Technologies)로부터 합성하였고, 이를 하기 표 1에 나타내었다.

Genes	crRNA sequence (5'-3')
CCR5	CACCGAAUUUCUACUGUUGUAGAUGGAGUGAAGGGAGAGUUUGUCAAUUUUUUG (서열번호 12)
DNMT1	GGUCAAUUUCUACUGUUGUAGAUGCUCAGCAGGCACCUGCCUCUUUU (서열번호 13)

상기 배양된 HEK293T 세포 2x10⁵개를 20 μl의 뉴클레오펙션(nucleofection) 시약과 혼합한 후, 이를 10 μl의 RNP 복합체와 혼합하였다. 이후, 형질감염을 위해 4D-Nucleofector 기기(Lonza)를 사용하였다. 형질감염한지 48시간 및 72시간이 지났을 때, PureLink^TM Genomic DNA Mini Kit(invitrogen)를 사용하여 상기 세포로부터 genomic DNA를 추출하였다.

실시예 5.2. 표적 부위에 대한 염기서열 분석

상기 실시예 5.1에서 추출한 genomic DNA를 하기 표 2에 나타낸 CCR5와 DNMT1의 어댑터 프라이머(primer)를 이용하여 증폭시켰다.

Genes	Adapter primer sequence (5'-3')
CCR5	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGGTATTTCTGTTCAGATCAC (서열번호 15)
	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGCCCATCAATTATAGAAAGCC (서열번호 16)
DNMT1	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCTGCACACAGCAGGCCTTTG (서열번호 17)
	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCCCAATAAGTGGCAGAGTGC (서열번호 18)

이후, 일루미나(Illumina)의 프로토콜대로 정제 과정 및 시퀀싱 라이브러리를 제조한 후, MiniSeq 장비를 이용하여 표적 부위에 대한 deep sequencing 분석을 진행하였다. mgCas12a-1와 mgCas12a-2 단백질에 의한 유전자 편집 효율을 도 14에 나타내었고, 표적 부위에 대한 시퀀싱 분석 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 도 14에 나타난 바와 같이, mock 단백질보다 mgCas12a-1와 mgCas12a-2 단백질에 의한 유전자 편집 효율이 더 높게 나타났다.

실시예 6. 식물세포에서 mgCas12a 의 유전자 편집 효율 분석

실시예 6.1. 식물 원형질체 분리

담배 종자를 50% Clorox로 1분간 처리하여 종자를 멸균하였다. 멸균된 종자를 종자파종 배지에 올려 일주일간 배양한 후, 배양에 사용되는 마젠타 박스(magenta box)에 옮겨 3주 동안 키웠다. 배양 빛 조건은 광배양 16시간 및 암배양 8시간이며, 25℃ 내지 28℃의 온도에서 키웠다. 식물은 4주 내지 6주 자란 잎을 사용하였고, 상기 잎을 유리판에 올려 잎병과 잎끝 부분을 자른 후 잎 안쪽부분만을 사용하였다. 이때, 0.5 mm 이하로 잘랐다. 자른 잎은 Enzyme 용액 10 mL에 올려 상온에서 암 상태로 3시간 내지 4시간 동안 orbital shaker(50 rpm) 위에서 배양하였다.

배양 후, W5 용액 10 mL을 첨가하고 조심스럽게 잘 섞어주었다. Cell strainer(70 μm)를 이용하여 Enzyme 용액 내에 존재하는 원형질체를 걸러주었다. 상기 걸러진 원형질체를 100 xg로 6분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 버리고 MMG 용액을 첨가하여 조심스럽게 원형질체 펠렛을 풀어준 후, 아이스에서 10분 내지 30분 정도 두었다. 이 중 일부를 계수판인 Hem cytometer와 현미경을 이용하여 원형질체의 수를 계수하였다. 이후, MMG 용액을 더 첨가하여 원형질체의 농도가 2 X 10⁶ 세포/mL가 되도록 희석하였다. 상기 enzyme 용액, MMG 용액 및 PEG 용액의 구성을 하기 표 4에 나타내었다.

Enzyme 용액	20 mL
1.0% Cellulase R10	200 mg
0.5% Macerozyme R10	100 mg
0.4 M Mannitol	10 mL (0.8 M Mannitol Stock solution)
20 mM MES, pH 5.7	4 mL (100 mM MES Stock solution, pH 5.7)
20 mM KCl	200 μL (2 M KCl Stock solution)
위 시약들 조합한 후 60도에서 10분간 배양한 후 아래 시약을 조합한다.
10 mM CaCl2·2H2O	200 μL (1 M CaCl2·2H2O Stock solution)
0.1 % BSA	200 μL (10% BSA Stock solution)
MMG 용액	10 mL
0.4 M Mannitol	5 mL (0.8 M Mannitol Stock solution)
4 mM MES, pH 5.7	400 μL (0.1 M MES Stock solution, pH5.7)
15 mM MgCl2	150 μL (1 M MgCl2 Stock solution)
Nuclease-free water	4.45 mL
PEG 용액	5 mL
0.2 M Mannitol	1.25 mL (0.8 M Mannitol Stock solution)
40%W/V PEG-4000	2 g (Polyethylene glycol 4000)
100 mM CaCl2·2H2O	500 μL (1 M CaCl2·2H2O Stock solution)
Nuclease-free water	1.5 mL
W5 용액	50 mL
154 mM NaCl	3.85 mL (2 M NaCl Stock solution)
125 mM CaCl2·2H2O	6.25 mL (1 M CaCl2·2H2O Stock solution)
5 mM KCI	125 μL (2 M KCl Stock solution)
2 mM MES, pH 5.7	500 μL (0.1 M MES Stock solution)
Nuclease-free water	39.275 mL

실시예 6.2. 표적 부위에 대한 염기서열 분석 및 편집 효율 확인

2 mL e-tube에 crRNA, mgCas12a 단백질 및 NEB buffer 1.1을 최종 volume 20 μL가 되게한 후 상온에서 10분 동안 반응시켰다. 상기 실시예 6.1에서 수득한 원형질체 200 μL(5 X 10⁵ 세포)와 반응시킨 crRNA 및 mgCas12 단백질(볼륨 20 μL)을 E-tube(2 mL)에 넣고 잘 섞은 후, 클린 벤치(Clean bench)에서 10분간 배양하였다. 이후, 상기 배양한 볼륨과 동일한 PEG 용액 220 μL를 넣고 조심스럽게 섞어주었다. 상온에서 15분간 배양한 후, W5 용액 840 μL을 첨가하여 잘 섞어주었다. 100 xg에서 2분간 원심 분리한 후, 상등액을 제거하였다. 그리고, W5 용액에서 이틀간 배양한 후 세포를 수거하여 DNA를 추출하였다.

상기 추출한 DNA를 이용하여 타겟 부분에 PCR을 수행한 후, NGS(Next-Generation Sequencing)로 타겟 유전자 편집 효율을 확인하였다. 이를 하기 표 5에 나타내었다. 표 5에 나타난 바와 같이, FnCpf1에 비해 mgCas12a-1 단백질에 의한 유전자 편집 효율이 1.8배 높게 나타났다.

Target gene	crRNA	Nuclease	Total Sequences	With both indicator sequences	More than minimum frequency	Insertions	Deletions	Indel frequency
FucT14 -1	2	none	161551	161421	160896	4	180	184 (0.1%)
		mgCas12a-1	124361	124255	123844	3	168	171 (0.1%)
		mgCas12a-2	99154	99053	98734	0	131	131 (0.1%)
		FnCpf1	50060	50022	49808	0	63	63 (0.1%)
	4	none	161551	161411	160899	4	178	182 (0.1%)
		mgCas12a-1	106782	106706	106330	0	1877	1877 (1.8%)
		mgCas12a-2	126665	126544	126057	79	885	964 (0.8%)
		FnCpf1	64554	64501	64272	15	470	485 (0.8%)
FucT14 -2	2	none	49459	49422	49192	2	49	51 (0.1%)
		mgCas12a-1	81191	81101	80738	0	90	90 (0.1%)
		mgCas12a-2	83694	83614	83286	0	99	99 (0.1%)
		FnCpf1	108803	108682	108260	0	112	112 (0.1%)
	4	none	49459	49427	49199	2	49	51 (0.1%)
		mgCas12a-1	54918	54854	54532	6	689	695 (1.3%)
		mgCas12a-2	127825	127691	127213	2	143	145 (0.1%)
		FnCpf1	64265	64168	63882	0	162	162 (0.3%)

또한, 담배 FucT14 유전자의 두 가지 crRNA를 이용한 유전자 편집 효율을 단백질별로 확인하여 도 15에 나타내었다. 도 15에 나타난 바와 같이, FnCpf1보다 mgCas12a-1 단백질에 의한 유전자 편집이 두 배 높게 나타났다. 이때, 상기 타겟 유전자 NbFucT14 _1 및 NbFucT14 _2의 crRNA 및 프라이머 서열을 하기 표 6 및 표 7에 나타내었다.

Target Gene	crRNA (primer name)	crRNA sequence(PAM site)
NbFucT14_1 NbFucT14_2	NbFTa14_1/2-2	TTTGGATAATTTGTACTCTTGTCGATGT (서열번호 19)
	NbFTa14_1/2-4	TTTAGTCCACAAACAGCTAAGCCCACAT (서열번호 20)

Target gene	Primer name	Sequence	Size (bp)
NbFucT14_1	NGS NbFTa14_1_F	TGAGCTGAAGATGGATTATG (서열번호 21)	216
	NGS NbFTa14_1_R	TCATGCTTAAGATAAAAGAG (서열번호 22)
NbFucT14_2	NGS NbFTa14_2_F	TCATGAGCTTAAGATGGATC (서열번호 23)	217
	NGS NbFTa14_2_R	GTTTAAGCTAAAAGAACTAC (서열번호 24)

실시예 7. FnCas12a와 mgCas12a의 유전자 편집 효율 비교

FnCas12a, WT mgCas12a-1 또는 WT mgCas12a-2 단백질, 및 crRNA로 구성된 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성하기 위해, FnCas12a, WT mgCas12a-1 또는 WT mgCas12a-2 단백질 6 pmol과 crRNA 7.5 pmol을 NEB1.1 버퍼 및 1X 증류수와 함께 상온에서 30분간 혼합하였다. crRNA 의존적인 Cas12a(FnCas12a, WT mgCas12a-1 또는 WT mgCas12a-2)를 이용하여 dsDNA 절단 활성을 확인하기 위하여, 0.3 pmol의 타겟 dsDNA(선형, 원형)를 첨가한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이때, DNA로는 HsCCR5, HsDNMT1 및 HsEMX1를 사용하였다. 또한, 실험에 사용된 선형 DNA(서열번호 27 내지 서열번호 29)는 PCR 정제산물이고, 원형 DNA(서열번호 30 내지 서열번호 32)는 정제된 플라스미드이다. SDS와 EDTA(Gel loading dye, NEB)를 첨가한 후 -20℃에서 10분간 보관하여 상기 반응을 멈추었다. 각각의 DNA를 1% 아가로즈 겔에 로딩한 후 전기영동하여 FnCas12a, WT mgCas12a-1 또는 WT mgCas12a-2에 의한 DNA 절단 활성을 확인하였다. 그 결과를 도 16a(선형 DNA) 및 도 16b(원형 DNA)에 나타내었다. 상기 도 16a 및 도 16b에서 S는 기질(substrate)를 의미하고, 겔 아래 기재된 각 숫자들은 기질 DNA 밴드의 짙은 정도를 의미한다.

실시예 8. mgCas12a의 비특이적인 DNase 활성 확인

Cas12a(AsCas12a, FnCas12a 또는 LbCas12a)와 mgCas12a(WT mgCas12a-1, d_mgCas12a-1, WTmgCas12a-2 또는 d_mgCas12a-2)의 무작위한 DNase 기능을 확인하기 위하여, 상기 실시에 7과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 이때, 상기 d-mgCas12a-1 및 d_mgCas12a-2는 WT mgCas12a-1 및 WT mgCas12a-2의 877번 및 873번의 Asp를 Ala으로 치환시킨 단백질을 의미한다.

구체적으로, 상기 7 종류의 Cas12a와 crRNA로 구성된 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성하기 위해, 각각의 Cas12a 단백질 6 pmol과 crRNA 7.5 pmol을 NEB1.1 버퍼 및 1X 증류수와 함께 상온에서 30분간 작용시켰다. 이후, 0.3 pmol의 타겟 dsDNA를 첨가한 후 37℃에서 12시간 및 24시간 동안 반응시켰다. 이때, DNA로는 HsCCR5, HsDNMT1 및 HsEMX1를 사용하였다. SDS와 EDTA(Gel loading dye, NEB)를 첨가한 후 -20℃에서 10분간 보관하여 상기 반응을 멈추었다. 각각의 DNA를 1% 아가로즈 겔에 로딩한 후 전기영동하여 상기 7 종류의 Cas12a에 의한 DNA 절단 활성을 확인하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다. 상기 도 17에서 S는 기질(substrate)를 의미하고, 겔 아래 기재된 각 숫자들은 기질 DNA 밴드의 짙은 정도를 의미한다.

도 17에 나타난 바와 같이, 기존 Cas12a인 AsCas12a, FnCas12a 또는 LbCas12a와 crRNA로 구성된 리보핵단백질 복합체보다 신규 Cas12a인 WT mgCas12a-1, d_mgCas12a-1, WTmgCas12a-2 또는 d_mgCas12a-2와 crRNA로 구성된 리보핵단백질 복합체가 약한 비특이적인 DNase 기능을 나타내었다. 또한, 전반적으로 Cas12a RNP와 DNA를 반응시킬 경우 비특이적인 DNase 기능이 발생하는 것을 추측할 수 있었다.

실시예 9. crRNA 없는 조건에서 Cas12a의 비특이적인 DNase 기능 확인

crRNA 없이도 Cas12a가 무작위한 DNase 기능을 갖는지를 확인하기 위하여, FnCas12a, WT mgCas12a-1 또는 WT mgCas12a-2 단백질을 crRNA 없는 조건에서 시간을 달리하여 상기 실시예 7과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 18a 및 도 18b에 나타내었다. 도 18a 및 도 18b에 나타난 바와 같이, crRNA 없이도 FnCas12a, WT mgCas12a-1 또는 WT mgCas12a-2 단백질이 무작위한 DNase 기능을 가졌고, FnCas12a 단백질의 무작위한 DNase 기능이 가장 먼저 발생되었다.

실시예 10. 기존 Cas12a의 handle을 사용한 mgCas12a의 DNA 절단 기능 확인

신규 Cas12a(d_mgCas12a 또는 WT mgCas12a)가 기존 Cas12a(AsCas12a, FnCas12a 또는 LbCas12a) 서열의 5' 말단에 존재하는 handle을 이용하여 DNA 절단이 가능한지를 확인하기 위해, AsCas12a, FnCas12a 또는 LbCas12a 각각의 handle과 반응시간을 달리하여 상기 실시예 7과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다.

도 19에 나타난 바와 같이, AsCas12a, FnCas12a 또는 LbCas12a의 handle을 이용하여 d_mgCas12a 또는 WT mgCas12a 단백질로 DNA를 절단한 결과, 상기 각 handle에 따라 DNA 절단 효율이 조금씩 달랐지만 세 종류의 handle을 이용한 d_mgCas12a 또는 WT mgCas12a 단백질에서 모두 DNA를 절단 기능이 있었다. 이를 통해, DNA 절단을 위해 mgCas12a가 AsCas12a, FnCas12a 또는 LbCas12a의 handle을 이용할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 11. 이가이온에 의한 FnCas12a 또는 mgCas12a의 활성 확인

또한, 이가이온들(CaCl₂, CoCl₂, CuSO₄, FeCl₂, MnSO₄, NiSO₄ 또는 ZnSO₄)에 의한 FnCas12a, mgCas12a-1 또는 mgCas12a-2 단백질의 DNA 절단 활성을 확인하기 위하여, NEBuffer 1.1 대신 정해진 양의 이가이온들을 대신 사용하여 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 20a 및 도 20b에 나타내었다. 도 20a 및 도 20b에 나타난 바와 같이, FnCas12a, mgCas12a-1 또는 mgCas12a-2 단백질이 같은 이가이온에서 비슷한 DNA 절단 활성을 나타내었다.

<110> g+flas life sciences Seoul National University R&DB Foundation <120> NOVEL CRISPR ASSOCIATED PROTEIN AND USE THEREOF <130> FPD/201907-0124 <150> KR 10-2018-0093336 <151> 2018-08-09 <160> 32 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mgCas12a-1 <400> 1 Met Asn Asn Gly Thr Asn Asn Phe Gln Asn Phe Ile Gly Ile Ser Ser 1 5 10 15 Leu Gln Lys Thr Leu Arg Asn Ala Leu Ile Pro Thr Glu Thr Thr Gln 20 25 30 Gln Phe Ile Val Lys Asn Gly Ile Ile Lys Glu Asp Glu Leu Arg Gly 35 40 45 Glu Asn Arg Gln Ile Leu Lys Asp Ile Met Asp Asp Tyr Tyr Arg Gly 50 55 60 Phe Ile Ser Glu Thr Leu Ser Ser Ile Asp Asp Ile Asp Trp Thr Ser 65 70 75 80 Leu Phe Glu Lys Met Glu Ile Gln Leu Lys Asn Gly Asp Asn Lys Asp 85 90 95 Thr Leu Ile Lys Glu Gln Ala Glu Lys Arg Lys Ala Ile Tyr Lys Lys 100 105 110 Phe Ala Asp Asp Asp Arg Phe Lys Asn Met Phe Ser Ala Lys Leu Ile 115 120 125 Ser Asp Ile Leu Pro Glu Phe Val Ile His Asn Asn Asn Tyr Ser Ala 130 135 140 Ser Glu Lys Glu Glu Lys Thr Gln Val Ile Lys Leu Phe Ser Arg Phe 145 150 155 160 Ala Thr Ser Phe Lys Asp Tyr Phe Lys Asn Arg Ala Asn Cys Phe Ser 165 170 175 Ala Asp Asp Ile Ser Ser Ser Ser Cys His Arg Ile Val Asn Asp Asn 180 185 190 Ala Glu Ile Phe Phe Ser Asn Ala Leu Val Tyr Arg Arg Ile Val Lys 195 200 205 Asn Leu Ser Asn Asp Asp Ile Asn Lys Ile Ser Gly Asp Ile Lys Asp 210 215 220 Ser Leu Lys Glu Met Ser Leu Glu Glu Ile Tyr Ser Tyr Glu Lys Tyr 225 230 235 240 Gly Glu Phe Ile Thr Gln Glu Gly Ile Ser Phe Tyr Asn Asp Ile Cys 245 250 255 Gly Lys Val Asn Ser Phe Met Asn Leu Tyr Cys Gln Lys Asn Lys Glu 260 265 270 Asn Lys Asn Leu Tyr Lys Leu Arg Lys Leu His Lys Gln Ile Leu Cys 275 280 285 Ile Ala Asp Thr Ser Tyr Glu Val Pro Tyr Lys Phe Glu Ser Asp Glu 290 295 300 Glu Val Tyr Gln Ser Val Asn Gly Phe Leu Asp Asn Ile Ser Ser Lys 305 310 315 320 His Ile Val Glu Arg Leu Arg Lys Ile Gly Asp Asn Tyr Asn Gly Tyr 325 330 335 Asn Leu Asp Lys Ile Tyr Ile Val Ser Lys Phe Tyr Glu Ser Val Ser 340 345 350 Gln Lys Thr Tyr Arg Asp Trp Glu Thr Ile Asn Thr Ala Leu Glu Ile 355 360 365 His Tyr Asn Asn Ile Leu Pro Gly Asn Gly Lys Ser Lys Ala Asp Lys 370 375 380 Val Lys Lys Ala Val Lys Asn Asp Leu Gln Lys Ser Ile Thr Glu Ile 385 390 395 400 Asn Glu Leu Val Ser Asn Tyr Lys Leu Cys Pro Asp Asp Asn Ile Lys 405 410 415 Ala Glu Thr Tyr Ile His Glu Ile Ser His Ile Leu Asn Asn Phe Glu 420 425 430 Ala Gln Glu Leu Lys Tyr Asn Pro Glu Ile His Leu Val Glu Ser Glu 435 440 445 Leu Lys Ala Ser Glu Leu Lys Asn Val Leu Asp Val Ile Met Asn Ala 450 455 460 Phe His Trp Cys Ser Val Phe Met Thr Glu Glu Leu Val Asp Lys Asp 465 470 475 480 Asn Asn Phe Tyr Ala Glu Leu Glu Glu Ile Tyr Asp Glu Ile Tyr Thr 485 490 495 Val Ile Ser Leu Tyr Asn Leu Val Arg Asn Tyr Val Thr Gln Lys Pro 500 505 510 Tyr Ser Thr Lys Lys Ile Lys Leu Asn Phe Gly Ile Pro Thr Leu Ala 515 520 525 Asp Gly Trp Ser Lys Ser Lys Glu Tyr Ser Asn Asn Ala Ile Ile Leu 530 535 540 Met Arg Asp Asn Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Phe Asn Ala Lys Asn Lys 545 550 555 560 Pro Asp Lys Lys Ile Ile Glu Gly Asn Thr Ser Glu Asn Lys Gly Asp 565 570 575 Tyr Lys Lys Met Ile Tyr Asn Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met Ile 580 585 590 Pro Lys Val Phe Leu Ser Ser Lys Thr Gly Val Glu Thr Tyr Lys Pro 595 600 605 Ser Ala Tyr Ile Leu Glu Gly Tyr Lys Gln Asn Lys His Leu Lys Ser 610 615 620 Ser Lys Asp Phe Asp Ile Thr Phe Cys His Asp Leu Ile Asp Tyr Phe 625 630 635 640 Lys Asn Cys Ile Ala Ile His Pro Glu Trp Lys Asn Phe Gly Phe Asp 645 650 655 Phe Ser Asp Thr Ser Thr Tyr Glu Asp Ile Ser Gly Phe Tyr Arg Glu 660 665 670 Val Glu Leu Gln Gly Tyr Lys Ile Asp Trp Thr Tyr Ile Ser Glu Lys 675 680 685 Asp Ile Asp Leu Leu Gln Glu Lys Gly Gln Leu Tyr Leu Phe Gln Ile 690 695 700 Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Lys Lys Ser Thr Gly Asn Asp Asn Leu His 705 710 715 720 Thr Met Tyr Leu Lys Asn Leu Phe Ser Glu Glu Asn Leu Lys Asp Ile 725 730 735 Val Leu Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Ile Phe Phe Arg Lys Ser Ser 740 745 750 Ile Lys Asn Pro Ile Ile His Lys Lys Gly Ser Ile Leu Val Asn Arg 755 760 765 Thr Tyr Glu Ala Glu Glu Lys Asp 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1440 ttcgatgaaa ccttttattc ggagatggat gagatctatc aggatatgca ggaaatcgtt 1500 ccattataca atcatgttcg aaactatgtt acacagaaac catataagca ggagaaatat 1560 cgtttatatt tccacactcc aacattggca aatggctggt ccaagagtaa ggaatatgac 1620 aacaacgcaa ttatattggt gcgagaagat aaatattatt taggtattct gaatgcgaaa 1680 aagaaaccat cgaaagaaat tatggcgggc aaagaggatt gttcagaaca tgcatatgca 1740 aagatgaatt attatttgtt gccgggcgcg aacaagatgc ttccaaaagt atttttatct 1800 aagaaaggaa tacaggacta tcacccatca tcatatattg ttgaaggata taatgaaaag 1860 aaacatatta aaggttccaa gaattttgat atccggtttt gtagggattt gattgactac 1920 ttcaaggaat gcattaaaaa acatccggat tggaataagt ttaactttga attttctgcg 1980 acagaaacat atgaggatat cagtgtcttt tatcgcgaag ttgaaaagca aggatatcgc 2040 gtagagtgga cgtatatcaa tagtgaagat attcagaaac tggaagaaga tggacagttg 2100 tttttatttc agatatataa caaagatttt gctgtgggaa gtacaggtaa accaaatctt 2160 catacattgt atctgaaaaa tctgttcagc gaagaaaatt tgcgggacat tgtattaaaa 2220 ctaaatgggg aagcagaaat attcttccgt aaatcaagtg ttcaaaaacc ggtgattcat 2280 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gcatatacct ccaagattga tccgacaacc ggatttatca atgcatttaa gcgggatgtg 3180 gtatcaacaa atgatgcaaa agagaatttc ctgatgaagt ttgattctat tcagtacgat 3240 atagaaaaag gcttatttaa gttttcattt gattacaaaa attttgccac acataaactt 3300 acacttgcga agacaaaatg ggacgtatat acaaatggaa ctcgaataca aaacatgaaa 3360 gttgaaggac attggctttc aatggaagtt gaacttacaa cgaaaatgaa agagttgctg 3420 gatgactcgc atattccata tgaagaagga cagaatatat tggatgattt gcgggagatg 3480 aaagatataa caaccattgt gaatggtata ttggaaatct tctggttgac agtccagctt 3540 cggaatagca ggatagataa tccggattac gatagaatta tctcaccggt attgaataaa 3600 aatggagaat tttttgattc tgatgaatat aattcatata ttgatgcgca aaaggcaccg 3660 ttaccgatag atgccgatgc aaatggcgca ttttgcattg cattaaaagg aatgtatact 3720 gccaatcaga tcaaagaaaa ctgggttgaa ggggagaaac ttccggcgga ttgcttgaag 3780 atcgaacatg cgagttggtt agcatttatg caaggagaaa ggggatag 3828 <210> 5 <211> 1263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered mgCas12a-1(K925Q) <400> 5 Met Asn Asn Gly Thr Asn Asn Phe Gln Asn Phe Ile Gly Ile 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aagtggtggc 600 ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 660 ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 720 gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 780 tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 840 tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 900 aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 960 aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctgg ctccccgtcg 1020 tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 1080 gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 1140 agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 1200 aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 1260 gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 1320 caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 1380 cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 1440 ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 1500 ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 1560 gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 1620 cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 1680 gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 1740 caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 1800 tactcttcct ttttcaattc agaagaactc gtcaagaagg cgatagaagg cgatgcgctg 1860 cgaatcggga gcggcgatac cgtaaagcac gaggaagcgg tcagcccatt cgccgccaag 1920 ctcttcagca atatcacggg tagccaacgc tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag 1980 ccggccacag tcgatgaatc cagaaaagcg gccattttcc accatgatat tcggcaagca 2040 ggcatcgcca tgggtcacga cgagatcctc gccgtcgggc atgctcgcct tgagcctggc 2100 gaacagttcg gctggcgcga gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag 2160 accggcttcc atccgagtac gtgctcgctc gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg 2220 gcaggtagcc ggatcaagcg tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga tggatacttt 2280 ctcggcagga gcaaggtgag atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag 2340 ccagtccctt cccgcttcag tgacaacgtc gagcacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt 2400 ggccagccac gatagccgcg ctgcctcgtc ttgcagttca ttcagggcac cggacaggtc 2460 ggtcttgaca aaaagaaccg ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga 2520 gcagccgatt gtctgttgtg cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg 2580 agaacctgcg tgcaatccat cttgttcaat catgcgaaac gatcctcatc ctgtctcttg 2640 atcagagctt gatcccctgc gccatcagat ccttggcggc aagaaagcca tccagtttac 2700 tttgcagggc ttcccaacct taccagaggg cgccccagct ggcaattccg gttcgcttgc 2760 tgtccataaa accgcccagt ctagctatcg ccatgtaagc ccactgcaag ctacctgctt 2820 tctctttgcg cttgcgtttt cccttgtcca gatagcccag tagctgacat tcatccgggg 2880 tcagcaccgt ttctgcggac tggctttcta cgtgaaaagg atctaggtga agatcctttt 2940 tgataatctc atgcctgaca tttatattcc ccagaacatc aggttaatgg cgtttttgat 3000 gtcattttcg cggtggctga gatcagccac ttcttccccg ataacggaga ccggcacact 3060 ggccatatcg gtggtcatca tgcgccagct ttcatccccg atatgcacca ccgggtaaag 3120 ttcacgggag actttatctg acagcagacg tgcactggcc agggggatca ccatccgtcg 3180 ccccggcgtg tcaataatat cactctgtac atccacaaac agacgataac ggctctctct 3240 tttataggtg taaaccttaa actgccgtac gtataggctg cgcaactgtt gggaagggcg 3300 atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg 3360 attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga 3420 attgtaatac gattcactat agggcgaatt gggccctcta gatgcatgct cgagcggccg 3480 ccagtgtgat ggatatctgc agaattcgcc cttgctgctc tcgaactcct ggcctcaact 3540 aatccacctg ccttggcctc ccaaagtgct gggattacag gcgtgagcca ctgctcccag 3600 ccccacgtgt ctttgtctca agtctttctg aagctcttca aaggcccagt gacttgtggc 3660 tgtggggcgg gatgatgggc cagttggagg gtccaaggat cttgtgctgg aagggttttg 3720 ggcccatgtg agcaggacca gaacccttcc ccaaggggtg caatgcccag gttgtcctcc 3780 atctgagcag gggctggcag tacacctgcc cccgggcctt gggcctgggt gtccacatca 3840 ggcattgccc ttctcccctc ctgcaggtgg gcaatgccgt gccaccgccc ctggccaaag 3900 ccattggctt ggagatcaag ctttgtatgt tggccaaagc ccgagagagt gcctcaggta 3960 tggtggggtg ggccaggctt cctctggggc ctgactgccc tctgggggta catgtggggg 4020 cagttgctgg ccaccgtttt gggctctggg actcaggcgg gtcacctacc cacgttcgtg 4080 gccccatctt tctcaagggg ctgctgtgag gattgagtga gttgcacgtg tcaagtgctt 4140 agagcaggcg tgctgcacac agcaggcctt tggtcaggtt ggctgctggg ctggccctgg 4200 ggccgtttcc ctcactcctg ctcggtgaat ttggctcagc aggcacctgc ctcagctgct 4260 cacttgagcc tctgggtcta gaaccctctg gggaccgttt gaggagtgtt cagtctccgt 4320 gaacgttccc ttagcactct gccacttatt gggtcagctg ttaacatcag tacgttaatg 4380 tttcctgatg gtccatgtct gttactcgcc tgtcaagtgg cgtgacaccg ggcgtgttcc 4440 ccagagtgac ttttcctttt atttcccttc agctaaaata aaggaggagg aagctgctaa 4500 ggactagttc tgccctcccg tcacccctgt ttctggcacc aggaatcccc aacatgcact 4560 gatgttgtgt ttttaacatg tcaatctgtc cgttcacatg tgtggtacat ggtgtttgtg 4620 gccttggctg acaagggcga attccagcac actggcggcc gttactagtg gatccgagct 4680 cggtaccaag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc 4740 tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat 4800 gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 4860 tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 4920 ggcgct 4926 <210> 32 <211> 5267 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> All-in-one vector(HsEMX1) <400> 32 cttccgcttc ctcgctcact gattcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 60 cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 120 acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 180 ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 240 ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 300 gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 360 gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 420 ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 480 actatcgtct tgaatccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 540 gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 600 ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 660 ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 720 gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 780 tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 840 tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 900 aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 960 aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctgg ctccccgtcg 1020 tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 1080 gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 1140 agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 1200 aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 1260 gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 1320 caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 1380 cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 1440 ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 1500 ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 1560 gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 1620 cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 1680 gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 1740 caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 1800 tactcttcct ttttcaattc agaagaactc gtcaagaagg cgatagaagg cgatgcgctg 1860 cgaatcggga gcggcgatac cgtaaagcac gaggaagcgg tcagcccatt cgccgccaag 1920 ctcttcagca atatcacggg tagccaacgc tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag 1980 ccggccacag tcgatgaatc cagaaaagcg gccattttcc accatgatat tcggcaagca 2040 ggcatcgcca tgggtcacga cgagatcctc gccgtcgggc atgctcgcct tgagcctggc 2100 gaacagttcg gctggcgcga gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag 2160 accggcttcc atccgagtac gtgctcgctc gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg 2220 gcaggtagcc ggatcaagcg tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga tggatacttt 2280 ctcggcagga gcaaggtgag atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag 2340 ccagtccctt cccgcttcag tgacaacgtc gagcacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt 2400 ggccagccac gatagccgcg ctgcctcgtc ttgcagttca ttcagggcac cggacaggtc 2460 ggtcttgaca aaaagaaccg ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga 2520 gcagccgatt gtctgttgtg cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg 2580 agaacctgcg tgcaatccat cttgttcaat catgcgaaac gatcctcatc ctgtctcttg 2640 atcagagctt gatcccctgc gccatcagat ccttggcggc aagaaagcca tccagtttac 2700 tttgcagggc ttcccaacct taccagaggg cgccccagct ggcaattccg gttcgcttgc 2760 tgtccataaa accgcccagt ctagctatcg ccatgtaagc ccactgcaag ctacctgctt 2820 tctctttgcg cttgcgtttt cccttgtcca gatagcccag tagctgacat tcatccgggg 2880 tcagcaccgt ttctgcggac tggctttcta cgtgaaaagg atctaggtga agatcctttt 2940 tgataatctc atgcctgaca tttatattcc ccagaacatc aggttaatgg cgtttttgat 3000 gtcattttcg cggtggctga gatcagccac ttcttccccg ataacggaga ccggcacact 3060 ggccatatcg gtggtcatca tgcgccagct ttcatccccg atatgcacca ccgggtaaag 3120 ttcacgggag actttatctg acagcagacg tgcactggcc agggggatca ccatccgtcg 3180 ccccggcgtg tcaataatat cactctgtac atccacaaac agacgataac ggctctctct 3240 tttataggtg taaaccttaa actgccgtac gtataggctg cgcaactgtt gggaagggcg 3300 atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg 3360 attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga 3420 attgtaatac gattcactat agggcgaatt gggccctcta gatgcatgct cgagcggccg 3480 ccagtgtgat ggatatctgc agaattcgcc cttgtgggga cagaaggtct ggagctgccc 3540 gtgaagggca gaatgctgcc ctcagacccg cttcctccct gtccttgtct gtccaaggag 3600 aatgaggtct cactggtgga tttcggacta ccctgaggag ctggcacctg agggacaagg 3660 ccccccacct gcccagctcc agcctctgat gaggggtggg agagagctac atgaggttgc 3720 taagaaagcc tcccctgaag gagaccacac agtgtgtgag gttggagtct ctagcagcgg 3780 gttctgtgcc cccagggata gtctggctgt ccaggcactg ctcttgatat aaacaccacc 3840 tcctagttat gaaaccatgc ccattctgcc tctctgtatg gaaaagagca tggggctggc 3900 ccgtggggtg gtgtccactt taggccctgt gggagatcat gggaacccac gcagtgggtc 3960 ataggctctc tcatttacta ctcacatcca ctctgtgaag aagcgattat gatctctcct 4020 ctagaaactc gtagagtccc atgtctgccg gcttccagag cctgcactcc tccaccttgg 4080 cttggctttg ctggggctag aggagctagg atgcacagca gctctgtgac cctttgtttg 4140 agaggaacag gaaaaccacc cttctctctg gcccactgtg tcctcttcct gccctgccat 4200 ccccttctgt gaatgttaga cccatgggag cagctggtca gaggggaccc cggcctgggg 4260 cccctaaccc tatgtagcct cagtcttccc atcaggctct cagctcagcc tgagtgttga 4320 ggccccagtg gctgctctgg gggcctcctg agtttctcat ctgtgcccct ccctccctgg 4380 cccaggtgaa ggtgtggttc cagaaccgga ggacaaagta caaacggcag aagctggagg 4440 aggaagggcc tgagtccgag cagaagaaga agggctccca tcacatcaac cggtggcgca 4500 ttgccacgaa gcaggccaat ggggaggaca tcgatgtcac ctccaatgac tagggtgggc 4560 aaccacaaac ccacgagggc agagtgctgc ttgctgctgg ccaggcccct gcgtgggccc 4620 aagctggact ctggccactc cctggccagg ctttggggag gcctggagtc atggccccac 4680 agggcttgaa gcccggggcc gccattgaca gagggacaag caatgggctg gctgaggcct 4740 gggaccactt ggccttctcc tcggagagcc tgcctgcctg ggcgggcccg cccgccaccg 4800 cagcctccca gctgctctcc gtgtctccaa tctccctttt gttttgatgc atttctgttt 4860 taatttattt tccaggcacc actgtagttt agtgatcccc agtgtccccc ttccctatgg 4920 gaataataaa agtctctctc ttaatgacac gggcatccag ctccagcccc agaaagggcg 4980 aattccagca cactggcggc cgttactagt ggatccgagc tcggtaccaa gcttggcgta 5040 atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat 5100 acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt 5160 aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta 5220 atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgct 5267

Claims (20)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Cas12a 단백질.
2. 제1항에 있어서,
   상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Cas12a 단백질은 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩되는 것인, Cas12a 단백질.
3. 제1항에 있어서,
   상기 단백질이 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, Cas12a 단백질.
4. 제1항에 있어서,
   상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Cas12a 단백질은 pH 7.0 내지 pH 7.9에서 최적의 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, Cas12a 단백질.
5. 서열번호 1의 아미노산 서열 중 925번째 위치의 라이신(Lys)이 다른 아미노산으로 치환된 Cas12a 단백질.
6. 제5항에 있어서,
   상기 다른 아미노산은 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 티로신(Tyr), 알라닌(Ala), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 발린(Val), 페닐알라닌(Phe), 메티오닌(Met), 트립토판(Trp), 글리신(Gly), 프롤린(Pro), 및 시스테인(Cys)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, Cas12a 단백질.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 서열번호 1의 아미노산 서열 중 877번째 위치의 아스파르트산(Asp)이 다른 아미노산으로 치환된 Cas12a 단백질.
14. 제13항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 글루탐산(Glu), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 티로신(Tyr), 알라닌(Ala), 라이신(Lys), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 발린(Val), 페닐알라닌(Phe), 메티오닌(Met), 트립토판(Trp), 글리신(Gly), 프롤린(Pro), 및 시스테인(Cys)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, Cas12a 단백질.
15. 제13항에 있어서,
    상기 단백질이 엔도뉴클레아제 활성이 감소된 것인, Cas12a 단백질.
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 제1항 또는 제5항에 기재된 Cas12a 단백질; 및 암세포에 특이적으로 존재하는 핵산 서열을 타겟팅하는 crRNA를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
20. 제19항에 있어서,
    상기 Cas12a 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 약학적 조성물.

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