CN105176936B - 复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用，其亚克隆的序列为SEQ ID NO.31所示。复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的制备方法包括（1）制备依赖启动子但无需体外转录的高效复制子系统，（2）制备缺失病毒衣壳蛋白基因的亚克隆。利用该亚克隆制备出的复制耐受型的病毒样颗粒，可用于蛋白表达、基因治疗、神经细胞精细形态的描绘、神经环路的解析、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位分析、病毒抗体药物筛选、疫苗、诊断试剂、动物模型的建立或病毒复制与致病机制研究。

Description

复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用。

背景技术

西门利克森林病毒(Semliki forest virus，SFV)属于披膜病毒科甲病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为12kb。基因组编码的多聚蛋白可切割成5个结构蛋白(C、E3、E2、6K和E1)和4个非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)。非结构蛋白参与病毒的复制和包装等过程，而结构蛋白参与病毒粒子的组装。西门利克森林病毒具有广泛的宿主范围，且能够感染神经系统。病毒作为一种微生物，一方面对人类的健康和农业生产产生不利的影响，另一方面，病毒的感染特性使得其具有为人类所利用的能力，从而为人类的健康和农业生产服务。因此，必须充分了解病毒的生物学特性，才能够有得放矢去改造病毒。

随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本发明分别采用不同的技术途径获得了一种具有复制耐受型的西门利克森林病毒样颗粒。将在蛋白表达、基因治疗、疫苗和诊断试剂的研发、神经细胞和非神经细胞精细形态的描绘、灵长类和非灵长类解析脑神经环路、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值和前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆，其序列为SEQ ID NO.31所示，该亚克隆可用于西门利克森林病毒病毒样颗粒的制备。

本发明的另一个目的在于提供了一种复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的制备方法，方法简单。

本发明还有一个目的在乎提供了复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆在制备复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒中的应用，制备出的病毒样颗粒在蛋白表达、基因治疗、神经细胞精细形态的描绘、神经环路的解析、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆，其序列为SEQ ID NO.31所示。

复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的制备方法，包括：(1)制备依赖启动子的而无需体外转录的高效复制子系统，(2)制备缺失病毒衣壳蛋白基因的亚克隆。

SEQ ID NO.31所示的复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆，包括以下步骤：

1.构建Ubc启动子驱动的的西门利克森林病毒复制子：

使用PvuI和EcoRV酶切pSFV-replicon(Berglund,P et al.,(1993)Biotechnology11,916-920.)，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO:1，SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:7片段插入到pSFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon。

2.构建携带EGFP基因的西门利克森林病毒复制子：

使用BamHI和XhoI酶切Ubc-SFV-replicon，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQID NO:10片段插入到以SFV复制子质粒Ubc-SFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon-EGFP。

3.构建高效表达EGFP的西门利克森林病毒复制子

使用ApaI和NruI酶切Ubc-SFV-replicon-EGFP，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:18片段插入到Ubc-SFV-replicon-EGFP，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA。

4.制备缺失病毒衣壳蛋白基因且携带EGFP基因的西门利克森林病毒的亚克隆

使用ApaI和NruI酶切Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHp，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将片段SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:28插入到Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHp，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-FL-EGFP-△C，其序列为SEQ ID NO:31所示。

本发明提供的复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的制备方法也适合于与西门利克森林病毒同科的病毒的构建，例如委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equineencephalitis virus,VEEV)和辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)。

复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆在制备复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒中的应用，包括将Ubc-SFV-FL-EGFP-△C通过脂质体转染进BHK-21细胞制备复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒，制得的病毒样颗粒利用常规方法，可用于蛋白表达、基因治疗、神经细胞精细形态的描绘、神经环路的解析、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明提供了一种高效、便捷的制备复制耐受型的西门利克森林病毒样颗粒的方法，该平台制备的病毒具有可视化的特点，便于开展相关的研究。目前国内外还没有基于该系统的平台，本发明填补了该空白。

2.本发明对于开展SFV的应用性研究(如蛋白表达、基因治疗、细胞精细结构描绘、神经环路标记、药物筛选、抗原表位分析、新型疫苗和诊断试剂等)和基础性研究(如复制、包装盒致病机制等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值。

3.本发明制备出的复制耐受型的病毒样颗粒表明西门利克森林病毒的膜蛋白能够形成病毒样的颗粒，并且该颗粒具有包装病毒核酸的能力，这种包装是通过病毒样颗粒识别位于病毒nsP2基因中的包装序列。

4.野生病毒由于含有病毒衣壳蛋白，因此具有很强的核酸包装能力，病毒的产生的效率高，因此毒性较大。而本发明制备的病毒样颗粒包装核酸的效率低，具有完成病毒生命循环的能力，该病毒样颗粒的毒性小，有利于该系统的应用。

附图说明

图1为一种依赖于Ubc启动子的西门利克森林病毒的复制子的构建示意图。

pSFV-replicon的SP6启动子被真核启动子Ubc启动子取代。更具体而言，采用的EcoRV和PvuI作为酶切位点，将该Ubc启动子的序列引入到pSFV-replicon，而制备了Ubc-SFV-replicon。SP6启动子是用来进行复制子体外转录，而Ubc启动子则不需要进行体外转录为RNA，只需将该质粒DNA转染到细胞内，即可在Ubc的驱动下完成转录。该策略大大方便了实验流程。

图2为一种依赖于Ubc启动子的表达EGFP的西门利克森林病毒的复制子。

A：一种依赖于Ubc启动子的表达EGFP的西门利克森林病毒的复制子的构建示意图；

B：一种依赖于Ubc启动子的表达EGFP的西门利克森林病毒的复制子的DNA转染BHK-21细胞后的荧光表达情况；

图3为一种高效表达EGFP的西门利克森林病毒复制子。

A：一种依赖于Ubc启动子的高效表达EGFP的西门利克森林病毒的复制子的构建示意图；

B：表达EGFP的复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的DNA转染BHK-21细胞后的荧光表达情况。

图4为一种表达EGFP的复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒的制备。

A：一种缺失病毒衣壳蛋白基因的依赖于Ubc启动子的表达EGFP的西门利克森林病毒的亚克隆的构建示意图；

B：表达EGFP的复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的DNA转染BHK-21细胞后的荧光表达情况。

图5为一种复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒通过识别位于nsP2的包装序列而包装核酸。

A：一种包装序列缺失的制备西门利克森林病毒病毒样颗粒的构建示意图；

B：缺失包装序列的表达EGFP的复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆转染BHK-21细胞后的荧光表达情况。

图6为一种表达EGFP的复制耐受型西门利克森林病毒样颗粒的生物学特征的分析。

A：一种表达EGFP的复制耐受型西门利克森林病毒样颗粒的空斑形成特征(染色)；

B：一种表达EGFP的复制耐受型西门利克森林病毒样颗粒的空斑的荧光成像；

C：一种表达EGFP的复制耐受型西门利克森林病毒样颗粒的电镜特征；

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。

实施例1：

构建Ubc启动子驱动的的西门利克森林病毒复制子：

为了将Ubc启动子插入到复制子的3’UTR的上游，需要采用三片段同源重组的方法进行。(1)采用全基因序列合成的方法合成Ubc启动子，其序列为SEQ ID NO:1，为了大量获取Ubc启动子的产物，使用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物扩增片段SEQ ID NO:1；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段；(2)以pSFV-replicon为模板，扩增linker1，其序列为SEQ ID NO:4，采用引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；(3)以pSFV-replicon为模板，扩增linker2，其序列为SEQ ID NO:7，采用引物SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；

PCR的反应体系均为50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μMForward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃90s，72℃10min，16℃10min，30个循环；

使用PvuI和EcoRV酶切pSFV-replicon(Berglund,P et al.,(1993)Biotechnology11,916-920.)，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO:1，SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:7片段插入到pSFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon。

pSFV-replicon的SP6启动子被真核启动子Ubc启动子取代。更具体而言，采用的EcoRV和PvuI作为酶切位点，将该Ubc启动子的序列引入到pSFV-replicon，而制备了Ubc-SFV-replicon。SP6启动子是用来进行复制子体外转录，而Ubc启动子则不需要进行体外转录为RNA，只需将该质粒DNA转染到细胞内，即可在Ubc的驱动下完成转录。该策略大大方便了实验流程。构建示意图见图1。

实施例2：构建携带EGFP基因的西门利克森林病毒复制子，其构建方法如下：

以pEGFP-N2(Invitrogen公司)为模板扩增EGFP基因，其序列为SEQ ID NO:10，使用SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示引物扩增片段SEQ ID NO:10；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段。

PCR的反应体系均为50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μMForward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃60s，72℃10min，16℃10min，30个循环；

使用BamHI和XhoI酶切Ubc-SFV-replicon，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQID NO:10片段插入到以SFV复制子质粒Ubc-SFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon-EGFP。

使用Lipofectamine2000作为转染试剂将质粒DNA转入BHK-21细胞。具体而言，分为两个步骤：1)取2只1.5ml离心管，分别向其加入250μl的Opti-MEM,向其中一只加入2ug质粒Ubc-SFV-FL-EGFP-△C，向另一只加入5μl转染试剂，室温放置5min后，将两者混匀，置于室温放置20min；2)吸弃长满单次细胞的6孔板中的培养基，用PBS洗两次，吸弃PBS，然后加入1ml Opti-MEM，将步骤1中的混合液(500μl)立刻加入到孔中，混匀后置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中，4h后吸弃培养基，加入2ml含有2％FBS的DMEM培养基。

Ubc-SFV-replicon-EGFP质粒转染BHK2-21后1天可观察到绿色荧光蛋白(图2B),表明西门利克森林病毒复制子不需要通过体外转录为RNA后再转染BHK-21细胞，简化了实验的操作步骤。

实施例3：构建高效的携带EGFP基因的西门利克森林病毒复制子

将hdvr和BGHpA的序列插入到pUbc-SFV-replicon-EGFP的下游。采用基因合成的方法，合成hdvr-BGHpA的片段，其序列为SEQ ID NO:13。为了大量获取hdvr-BGHpA的产物，使用SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示引物扩增片段SEQ ID NO:13；以pSFV-replicon为模板，使用SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示引物扩增片段SEQ ID NO:18；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段。

PCR的反应体系均为50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μMForward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃60s，72℃10min，16℃10min，30个循环；

使用ApaI和NruI酶切Ubc-SFV-replicon-EGFP，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:18片段插入到Ubc-SFV-replicon-EGFP，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA。

按照实施例2中的转染方法将质粒Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA转染BHK-21细胞，1天后观察到绿色荧光蛋白(图3B),表达的荧光密度比(图2B)中的亮度高，表明hdvr和BGHpA的加入有利于西门利克森林病毒复制子高效表达外源蛋白。

实施例4：制备缺失病毒衣壳蛋白基因且携带EGFP基因的西门利克森林病毒的亚克隆

以pSFV-helper2(Berglund,P et al.,(1993)Biotechnology 11,916-920.)为模板分别扩增序列SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:28，使用SEQ IDNO:22和SEQ ID NO:23所示引物扩增片段SEQ ID NO:19；使用SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示引物扩增片段SEQ ID NO:20；使用SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示引物扩增片段SEQ ID NO:21；使用SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示引物扩增片段SEQ ID NO:28；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段。

PCR的反应体系均为50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μMForward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃20s，72℃10min，16℃10min，30个循环；

使用ApaI和NruI酶切Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将片段SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:28插入到Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-FL-EGFP-△C，其序列为SEQ ID NO:31所示。

实施例5：

复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆在制备复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒中的应用：

按照实施例2中的转染方法，将质粒Ubc-SFV-FL-EGFP-△C转染BHK-21细胞，1天后可观察到绿色荧光蛋白(图4B),可见到成团的绿色荧光蛋白，表明产生了具有感染性的亚病毒颗粒，收集上清加入到新鲜制备的BHK-21细胞，可以见到绿色荧光的表达，表达具有成簇的特点，再次收集上清感染新鲜制备的BHK-21细胞，可以见到绿色荧光的表达(图4B)，由此可见，该方法成功制备出了缺失衣壳后，仍可以包装病毒基因组的病毒样颗粒。

实施例6：

复制耐受型的西门利克森林病毒病的毒样颗粒的特征

为了分析复制耐受型病毒样颗粒的特征，一方面进行电镜分析其病毒的形状和大小，另一方面分析其在BHK-21细胞上产生的空斑的情况。

①吸取病毒液体10μl到干净的封口膜上，将铜网正面向下，置于样品表面孵育3-5min；用干净滤纸吸除多余液体，并将铜网浸入染色液染色3min；用干净滤纸吸除多余液体，将铜网铺在干净的滤纸片上，放入玻璃平皿待干燥后作透射电镜观察。可见到复制耐受型病毒样颗粒的直径较小(图6C)

②取病毒液体15μl置于135μlDMEM(含有2％FBS)的稀释液中，依次10倍比西施。然后分别在每个稀释度取100μl加入到含有BHK-21细胞(汇合度95％)中，置于37℃，CO₂5％的培养箱中1小时，然后加入吸弃病毒液，加入浓度为0.6％的琼脂(含有2％FBS和1X的DMEM)，2天后加入含有中性红且浓度为0.6％的琼脂(含有2％FBS和1X的DMEM，)。24小时后可以看见斑点为针尖状(图6A和B)

最后，还需要注意的是，上述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，并且以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院武汉物理与数学研究所

<120> 复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用

<130> 复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用

<160> 31

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1205

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc acggcgagcg ctgccacgtc 60

agacgaaggg cgcagcgagc gtcctgatcc ttccgcccgg acgctcagga cagcggcccg 120

ctgctcataa gactcggcct tagaacccca gtatcagcag aaggacattt taggacggga 180

cttgggtgac tctagggcac tggttttctt tccagagagc ggaacaggcg aggaaaagta 240

gtcccttctc ggcgattctg cggagggatc tccgtggggc ggtgaacgcc gatgattata 300

taaggacgcg ccgggtgtgg cacagctagt tccgtcgcag ccgggatttg ggtcgcggtt 360

cttgtttgtg gatcgctgtg atcgtcactt ggtgagtagc gggctgctgg gctggccggg 420

gctttcgtgg ccgccgggcc gctcggtggg acggaagcgt gtggagagac cgccaagggc 480

tgtagtctgg gtccgcgagc aaggttgccc tgaactgggg gttgggggga gcgcagcaaa 540

atggcggctg ttcccgagtc ttgaatggaa gacgcttgtg aggcgggctg tgaggtcgtt 600

gaaacaaggt ggggggcatg gtgggcggca agaacccaag gtcttgaggc cttcgctaat 660

gcgggaaagc tcttattcgg gtgagatggg ctggggcacc atctggggac cctgacgtga 720

agtttgtcac tgactggaga actcggtttg tcgtctgttg cgggggcggc agttatggcg 780

gtgccgttgg gcagtgcacc cgtacctttg ggagcgcgcg ccctcgtcgt gtcgtgacgt 840

cacccgttct gttggcttat aatgcagggt ggggccacct gccggtaggt gtgcggtagg 900

cttttctccg tcgcaggacg cagggttcgg gcctagggta ggctctcctg aatcgacagg 960

cgccggacct ctggtgaggg gagggataag tgaggcgtca gtttctttgg tcggttttat 1020

gtacctatct tcttaagtag ctgaagctcc ggttttgaac tatgcgctcg gggttggcga 1080

gtgtgttttg tgaagttttt taggcacctt ttgaaatgta atcatttggg tcaatatgta 1140

attttcagtg ttagactagt aaattgtccg ctaaattctg gccgtttttg gcttttttgt 1200

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttaattaact atagtgagtc gtattagtct aacaaaaaag ccaaaaa 47

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<212> DNA

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gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 120

actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 180

tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 240

attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 300

tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 360

tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 420

aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 480

tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 540

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gactcactat agttaattaa gatggcggat gtgtgacata 40

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<212> DNA

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<212> DNA

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ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aatacacaga attctgattg gatccaccat ggtgagcaag ggcgagga 48

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggatcgacta gtgaactcga gttacttgta cagctcgtcc atgc 44

<210> 13

<211> 430

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gggtcggcat ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggctacttcg gtaggctaag 60

ggagaagaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 120

tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 180

tgtatcttat catgtctatt taaatctgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc 240

ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 300

aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg 360

gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg 420

ggctctatgg 430

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aaaaaactag aaatcggggt cggcatggca tctcca 36

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttaatgcaga ctagaaatcg cgaccataga gcccaccgca tcc 43

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cctaggcaag catgcgggcc 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

accccgattt ctagtttttt tt 22

<210> 18

<211> 364

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cctaggcaag catgcgggcc cagtgggtaa ttaattgaat tacatcccta cgcaaacgtt 60

ttacggccgc cggtggcgcc cgcgcccggc ggcccgtccc tggccgttgc aggccactcc 120

ggtggctccc gtcgtccccg acttccaggc ccagcagatg cagcaactca tcagcgccgt 180

aaatgcgctg acaatgagac agaacgcaat tgctcctgct aggagcttaa ttcgacgaat 240

aattggattt ttattttatt ttgcaattgg tttttaatat ttccaaaaaa aaaaaaaaaa 300

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaac tagaaatcgg 360

ggtc 364

<210> 19

<211> 125

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cctaggcaag catgcgggcc cagtgggtaa ttacctctac ggcggtccta gattggtgcg 60

ttaatacaca gaattctgat tatagcgcac tattatagca ccatgtccgc cccgctgatt 120

actgc 125

<210> 20

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tccgccccgc tgattactgc catgtgtgtc cttgccaatg ctaccttccc gtgcttccag 60

cccccgtgtg taccttgctg ctatgaaaac aacgcagagg ccacactacg gatgctcgag 120

gataacgtgg ataggccagg gtactacgac ctccttcagg cagccttgac gtgccgaaac 180

ggaacaagac accggcgcag cgtgtcgcaa cac 213

<210> 21

<211> 3107

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tgccgaaacg gaacaagaca ccggcgcagc gtgtcgcaac acttcaacgt gtataaggct 60

acacgccctt acatcgcgta ctgcgccgac tgcggagcag ggcactcgtg tcatagcccc 120

gtagcaattg aagcggtcag gtccgaagct accgacggga tgctgaagat tcagttctcg 180

gcacaaattg gcatagataa gagtgacaat catgactaca cgaagataag gtacgcagac 240

gggcacgcca ttgagaatgc cgtccggtca tctttgaagg tagccacctc cggagactgt 300

ttcgtccatg gcacaatggg acatttcata ctggcaaagt gcccaccggg tgaattcctg 360

caggtctcga tccaggacac cagaaacgcg gtccgtgcct gcagaataca atatcatcat 420

gaccctcaac cggtgggtag agaaaaattt acaattagac cacactatgg aaaagagatc 480

ccttgcacca cttatcaaca gaccacagcg aagaccgtgg aggaaatcga catgcatatg 540

ccgccagata cgccggacag gacgttgcta tcacagcaat ctggcaatgt aaagatcaca 600

gtcggaggaa agaaggtgaa atacaactgc acctgtggaa ccggaaacgt tggcactact 660

aattcggaca tgacgatcaa cacgtgtcta atagagcagt gccacgtctc agtgacggac 720

cataagaaat ggcagttcaa ctcacctttc gtcccgagag ccgacgaacc ggctagaaaa 780

ggcaaagtcc atatcccatt cccgttggac aacatcacat gcagagttcc aatggcgcgc 840

gaaccaaccg tcatccacgg caaaagagaa gtgacactgc accttcaccc agatcatccc 900

acgctctttt cctaccgcac actgggtgag gacccgcagt atcacgagga atgggtgaca 960

gcggcggtgg aacggaccat acccgtacca gtggacggga tggagtacca ctggggaaac 1020

aacgacccag tgaggctttg gtctcaactc accactgaag ggaaaccgca cggctggccg 1080

catcagatcg tacagtacta ctatgggctt tacccggccg ctacagtatc cgcggtcgtc 1140

gggatgagct tactggcgtt gatatcgatc ttcgcgtcgt gctacatgct ggttgcggcc 1200

cgcagtaagt gcttgacccc ttatgcttta acaccaggag ctgcagttcc gtggacgctg 1260

gggatactct gctgcgcccc gcgggcgcac gcagctagtg tggcagagac tatggcctac 1320

ttgtgggacc aaaaccaagc gttgttctgg ttggagtttg cggcccctgt tgcctgcatc 1380

ctcatcatca cgtattgcct cagaaacgtg ctgtgttgct gtaagagcct ttctttttta 1440

gtgctactga gcctcggggc aaccgccaga gcttacgaac attcgacagt aatgccgaac 1500

gtggtggggt tcccgtataa ggctcacatt gaaaggccag gatatagccc cctcactttg 1560

cagatgcagg ttgttgaaac cagcctcgaa ccaaccctta atttggaata cataacctgt 1620

gagtacaaga cggtcgtccc gtcgccgtac gtgaagtgct gcggcgcctc agagtgctcc 1680

actaaagaga agcctgacta ccaatgcaag gtttacacag gcgtgtaccc gttcatgtgg 1740

ggaggggcat attgcttctg cgactcagaa aacacgcaac tcagcgaggc gtacgtcgat 1800

cgatcggacg tatgcaggca tgatcacgca tctgcttaca aagcccatac agcatcgctg 1860

aaggccaaag tgagggttat gtacggcaac gtaaaccaga ctgtggatgt ttacgtgaac 1920

ggagaccatg ccgtcacgat agggggtact cagttcatat tcgggccgct gtcatcggcc 1980

tggaccccgt tcgacaacaa gatagtcgtg tacaaagacg aagtgttcaa tcaggacttc 2040

ccgccgtacg gatctgggca accagggcgc ttcggcgaca tccaaagcag aacagtggag 2100

agtaacgacc tgtacgcgaa cacggcactg aagctggcac gcccttcacc cggcatggtc 2160

catgtaccgt acacacagac accttcaggg ttcaaatatt ggctaaagga aaaagggaca 2220

gccctaaata cgaaggctcc ttttggctgc caaatcaaaa cgaaccctgt cagggccatg 2280

aactgcgccg tgggaaacat ccctgtctcc atgaatttgc ctgacagcgc ctttacccgc 2340

attgtcgagg cgccgaccat cattgacctg acttgcacag tggctacctg tatttcggcg 2400

gcgtcttgac actgacgtac aagaccgaca agaacgggga ctgctctgta cactcgcact 2460

ctaacgtagc tactctacag gaggccacag caaaagtgaa gacagcaggt aaggtgacct 2520

tacacttctc cacggcaagc gcatcacctt cttttgtggt gtcgctatgc agtgctaggg 2580

ccacctgttc agcgtcgtgt gagcccccga aagaccacat agtcccatat gcggctagcc 2640

acagtaacgt agtgtttcca gacatgtcgg gcaccgcact atcatgggtg cagaaaatct 2700

cgggtggtct gggggccttc gcaatcggcg ctatcctggt gctggttgtg gtcacttgca 2760

ttgggctccg cagataagtt agggtaggca atggcattga tatagcaaga aaattgaaaa 2820

cagaaaaagt tagggtaagc aatggcatat aaccataact gtataacttg taacaaagcg 2880

caacaagacc tgcgcaattg gccccgtggt ccgcctcacg gaaactcggg gcaactcata 2940

ttgacacatt aattggcaat aattggaagc ttacataagc ttaattcgac gaataattgg 3000

atttttattt tattttgcaa ttggttttta atatttccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 3107

<210> 22

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cctaggcaag catgcgggcc cagtgggtaa ttacctctac ggcggtccta ga 52

<210> 23

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gcagtaatca gcggggcgga catggtgcta taatagtgcg ct 42

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tccgccccgc tgattactgc cat 23

<210> 25

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gtgttgcgac acgctgcgcc ggtgtcttgt tccgtttcgg ca 42

<210> 26

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tgccgaaacg gaacaagaca ccggcgcagc gtgtcgcaac ac 42

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

taatgcagac tagttttttt t 21

<210> 28

<211> 430

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gggtcggcat ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggctacttcg gtaggctaag 60

ggagaagaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 120

tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 180

tgtatcttat catgtctatt taaatctgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc 240

ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 300

aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg 360

gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg 420

ggctctatgg 430

<210> 29

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

aaaaaaacta gtctgcatta gggtcggcat ggcatctcca c 41

<210> 30

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ttaatgcaga ctagaaatcg cgaccataga gcccaccgca tcc 43

<210> 31

<211> 15992

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gatggcggat gtgtgacata cacgacgcca aaagattttg ttccagctcc tgccacctcc 60

gctacgcgag agattaacca cccacgatgg ccgccaaagt gcatgttgat attgaggctg 120

acagcccatt catcaagtct ttgcagaagg catttccgtc gttcgaggtg gagtcattgc 180

aggtcacacc aaatgaccat gcaaatgcca gagcattttc gcacctggct accaaattga 240

tcgagcagga gactgacaaa gacacactca tcttggatat cggcagtgcg ccttccagga 300

gaatgatgtc tacgcacaaa taccactgcg tatgccctat gcgcagcgca gaagaccccg 360

aaaggctcgt atgctacgca aagaaactgg cagcggcctc cgggaaggtg ctggatagag 420

agatcgcagg aaaaatcacc gacctgcaga ccgtcatggc tacgccagac gctgaatctc 480

ctaccttttg cctgcataca gacgtcacgt gtcgtacggc agccgaagtg gccgtatacc 540

aggacgtgta tgctgtacat gcaccaacat cgctgtacca tcaggcgatg aaaggtgtca 600

gaacggcgta ttggattggg tttgacacca ccccgtttat gtttgacgcg ctagcaggcg 660

cgtatccaac ctacgccaca aactgggccg acgagcaggt gttacaggcc aggaacatag 720

gactgtgtgc agcatccttg actgagggaa gactcggcaa actgtccatt ctccgcaaga 780

agcaattgaa accttgcgac acagtcatgt tctcggtagg atctacattg tacactgaga 840

gcagaaagct actgaggagc tggcacttac cctccgtatt ccacctgaaa ggtaaacaat 900

cctttacctg taggtgcgat accatcgtat catgtgaagg gtacgtagtt aagaaaatca 960

ctatgtgccc cggcctgtac ggtaaaacgg tagggtacgc cgtgacgtat cacgcggagg 1020

gattcctagt gtgcaagacc acagacactg tcaaaggaga aagagtctca ttccctgtat 1080

gcacctacgt cccctcaacc atctgtgatc aaatgactgg catactagcg accgacgtca 1140

caccggagga cgcacagaag ttgttagtgg gattgaatca gaggatagtt gtgaacggaa 1200

gaacacagcg aaacactaac acgatgaaga actatctgct tccgattgtg gccgtcgcat 1260

ttagcaagtg ggcgagggaa tacaaggcag accttgatga tgaaaaacct ctgggtgtcc 1320

gagagaggtc acttacttgc tgctgcttgt gggcatttaa aacgaggaag atgcacacca 1380

tgtacaagaa accagacacc cagacaatag tgaaggtgcc ttcagagttt aactcgttcg 1440

tcatcccgag cctatggtct acaggcctcg caatcccagt cagatcacgc attaagatgc 1500

ttttggccaa gaagaccaag cgagagttaa tacctgttct cgacgcgtcg tcagccaggg 1560

atgctgaaca agaggagaag gagaggttgg aggccgagct gactagagaa gccttaccac 1620

ccctcgtccc catcgcgccg gcggagacgg gagtcgtcga cgtcgacgtt gaagaactag 1680

agtatcacgc aggtgcaggg gtcgtggaaa cacctcgcag cgcgttgaaa gtcaccgcac 1740

agccgaacga cgtactacta ggaaattacg tagttctgtc cccgcagacc gtgctcaaga 1800

gctccaagtt ggcccccgtg caccctctag cagagcaggt gaaaataata acacataacg 1860

ggagggccgg ccgttaccag gtcgacggat atgacggcag ggtcctacta ccatgtggat 1920

cggccattcc ggtccctgag tttcaggctt tgagcgagag cgccactatg gtgtacaacg 1980

aaagggagtt cgtcaacagg aaactatacc atattgccgt tcacggaccc tcgctgaaca 2040

ccgacgagga gaactacgag aaagtcagag ctgaaagaac tgacgccgag tacgtgttcg 2100

acgtagataa aaaatgctgc gtcaagagag aggaagcgtc gggtttggtg ttggtgggag 2160

agctaaccaa ccccccgttc catgaattcg cctacgaagg gctgaagatc aggccgtcgg 2220

caccatataa gactacagta gtaggagtct ttggggttcc gggatcaggc aagtctgcta 2280

ttattaagag cctcgtgacc aaacacgatc tggtcaccag cggcaagaag gagaactgcc 2340

aggaaatagt caacgacgtg aagaagcacc gcggactgga catccaggca aaaacagtgg 2400

actccatcct gctaaacggg tgtcgtcgtg ccgtggacat cctatatgtg gacgaggctt 2460

tcgcttgcca ttccggtact ctgctagccc taattgctct tgttaaacct cggagcaaag 2520

tggtgttatg cggagacccc aagcaatgcg gattcttcaa tatgatgcag cttaaggtga 2580

acttcaacca caacatctgc actgaagtat gtcataaaag tatatccaga cgttgcacgc 2640

gtccagtcac ggccatcgtg tctacgttgc actacggagg caagatgcgc acgaccaacc 2700

cgtgcaacaa acccataatc atagacacca caggacagac caagcccaag ccaggagaca 2760

tcgtgttaac atgcttccga ggctgggtaa agcagctgca gttggactac cgtggacacg 2820

aagtcatgac agcagcagca tctcagggcc tcacccgcaa aggggtatac gccgtaaggc 2880

agaaggtgaa tgaaaatccc ttgtatgccc ctgcgtcgga gcacgtgaat gtactgctga 2940

cgcgcactga ggataggctg gtgtggaaaa cgctggccgg cgatccctgg attaaggtcc 3000

tatcaaacat tccacagggt aactttacgg ccacattgga agaatggcaa gaagaacacg 3060

acaaaataat gaaggtgatt gaaggaccgg ctgcgcctgt ggacgcgttc cagaacaaag 3120

cgaacgtgtg ttgggcgaaa agcctggtgc ctgtcctgga cactgccgga atcagattga 3180

cagcagagga gtggagcacc ataattacag catttaagga ggacagagct tactctccag 3240

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tttctgcccc gaaggtgtcc ctgtattacg agaacaacca ctgggataac agacctggtg 3360

gaaggatgta tggattcaat gccgcaacag ctgccaggct ggaagctaga cataccttcc 3420

tgaaggggca gtggcatacg ggcaagcagg cagttatcgc agaaagaaaa atccaaccgc 3480

tttctgtgct ggacaatgta attcctatca accgcaggct gccgcacgcc ctggtggctg 3540

agtacaagac ggttaaaggc agtagggttg agtggctggt caataaagta agagggtacc 3600

acgtcctgct ggtgagtgag tacaacctgg ctttgcctcg acgcagggtc acttggttgt 3660

caccgctgaa tgtcacaggc gccgataggt gctacgacct aagtttagga ctgccggctg 3720

acgccggcag gttcgacttg gtctttgtga acattcacac ggaattcaga atccaccact 3780

accagcagtg tgtcgaccac gccatgaagc tgcagatgct tgggggagat gcgctacgac 3840

tgctaaaacc cggcggcagc ctcttgatga gagcttacgg atacgccgat aaaatcagcg 3900

aagccgttgt ttcctcctta agcagaaagt tctcgtctgc aagagtgttg cgcccggatt 3960

gtgtcaccag caatacagaa gtgttcttgc tgttctccaa ctttgacaac ggaaagagac 4020

cctctacgct acaccagatg aataccaagc tgagtgccgt gtatgccgga gaagccatgc 4080

acacggccgg gtgtgcacca tcctacagag ttaagagagc agacatagcc acgtgcacag 4140

aagcggctgt ggttaacgca gctaacgccc gtggaactgt aggggatggc gtatgcaggg 4200

ccgtggcgaa gaaatggccg tcagccttta agggagaagc aacaccagtg ggcacaatta 4260

aaacagtcat gtgcggctcg taccccgtca tccacgctgt agcgcctaat ttctctgcca 4320

cgactgaagc ggaaggggac cgcgaattgg ccgctgtcta ccgggcagtg gccgccgaag 4380

taaacagact gtcactgagc agcgtagcca tcccgctgct gtccacagga gtgttcagcg 4440

gcggaagaga taggctgcag caatccctca accatctatt cacagcaatg gacgccacgg 4500

acgctgacgt gaccatctac tgcagagaca aaagttggga gaagaaaatc caggaagcca 4560

tagacatgag gacggctgtg gagttgctca atgatgacgt ggagctgacc acagacttgg 4620

tgagagtgca cccggacagc agcctggtgg gtcgtaaggg ctacagtacc actgacgggt 4680

cgctgtactc gtactttgaa ggtacgaaat tcaaccaggc tgctattgat atggcagaga 4740

tactgacgtt gtggcccaga ctgcaagagg caaacgaaca gatatgccta tacgcgctgg 4800

gcgaaacaat ggacaacatc agatccaaat gtccggtgaa cgattccgat tcatcaacac 4860

ctcccaggac agtgccctgc ctgtgccgct acgcaatgac agcagaacgg atcgcccgcc 4920

ttaggtcaca ccaagttaaa agcatggtgg tttgctcatc ttttcccctc ccgaaatacc 4980

atgtagatgg ggtgcagaag gtaaagtgcg agaaggttct cctgttcgac ccgacggtac 5040

cttcagtggt tagtccgcgg aagtatgccg catctacgac ggaccactca gatcggtcgt 5100

tacgagggtt tgacttggac tggaccaccg actcgtcttc cactgccagc gataccatgt 5160

cgctacccag tttgcagtcg tgtgacatcg actcgatcta cgagccaatg gctcccatag 5220

tagtgacggc tgacgtacac cctgaacccg caggcatcgc ggacctggcg gcagatgtgc 5280

atcctgaacc cgcagaccat gtggacctgg agaacccgat tcctccaccg cgcccgaaga 5340

gagctgcata ccttgcctcc cgcgcggcgg agcgaccggt gccggcgccg agaaagccga 5400

cgcctgcccc aaggactgcg tttaggaaca agctgccttt gacgttcggc gactttgacg 5460

agcacgaggt cgatgcgttg gcctccggga ttactttcgg agacttcgac gacgtcctgc 5520

gactaggccg cgcgggtgca tatattttct cctcggacac tggcagcgga catttacaac 5580

aaaaatccgt taggcagcac aatctccagt gcgcacaact ggatgcggtc gaggaggaga 5640

aaatgtaccc gccaaaattg gatactgaga gggagaagct gttgctgctg aaaatgcaga 5700

tgcacccatc ggaggctaat aagagtcgat accagtctcg caaagtggag aacatgaaag 5760

ccacggtggt ggacaggctc acatcggggg ccagattgta cacgggagcg gacgtaggcc 5820

gcataccaac atacgcggtt cggtaccccc gccccgtgta ctcccctacc gtgatcgaaa 5880

gattctcaag ccccgatgta gcaatcgcag cgtgcaacga atacctatcc agaaattacc 5940

caacagtggc gtcgtaccag ataacagatg aatacgacgc atacttggac atggttgacg 6000

ggtcggatag ttgcttggac agagcgacat tctgcccggc gaagctccgg tgctacccga 6060

aacatcatgc gtaccaccag ccgactgtac gcagtgccgt cccgtcaccc tttcagaaca 6120

cactacagaa cgtgctagcg gctgccacca agagaaactg caacgtcacg caaatgcgag 6180

aactacccac catggactcg gcagtgttca acgtggagtg cttcaagcgc tatgcctgct 6240

ccggagaata ttgggaagaa tatgctaaac aacctatccg gataaccact gagaacatca 6300

ctacctatgt gaccaaattg aaaggcccga aagctgctgc cttgttcgct aagacccaca 6360

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acgcgatcat cgcctctcac ttccacccag gagacccggt tctagagacg gacattgcat 6660

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taggggtgga tcagtacctg ctggacttga tcgaggcagc ctttggggaa atatccagct 6780

gtcacctacc aactggcacg cgcttcaagt tcggagctat gatgaaatcg ggcatgtttc 6840

tgactttgtt tattaacact gttttgaaca tcaccatagc aagcagggta ctggagcaga 6900

gactcactga ctccgcctgt gcggccttca tcggcgacga caacatcgtt cacggagtga 6960

tctccgacaa gctgatggcg gagaggtgcg cgtcgtgggt caacatggag gtgaagatca 7020

ttgacgctgt catgggcgaa aaacccccat atttttgtgg gggattcata gtttttgaca 7080

gcgtcacaca gaccgcctgc cgtgtttcag acccacttaa gcgcctgttc aagttgggta 7140

agccgctaac agctgaagac aagcaggacg aagacaggcg acgagcactg agtgacgagg 7200

ttagcaagtg gttccggaca ggcttggggg ccgaactgga ggtggcacta acatctaggt 7260

atgaggtaga gggctgcaaa agtatcctca tagccatggc caccttggcg agggacatta 7320

aggcgtttaa gaaattgaga ggacctgtta tacacctcta cggcggtcct agattggtgc 7380

gttaatacac agaattctga ttggatccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg 7440

ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc 7500

cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac 7560

cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg 7620

cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga 7680

aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc 7740

cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt 7800

caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt 7860

ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa 7920

catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga 7980

cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga 8040

ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac 8100

tctcggcatg gacgagctgt acaagtaact cgagttcact agtcgatccc gcggccgctt 8160

tcgaacctag gcaagcatgc gggcccagtg ggtaattacc tctacggcgg tcctagattg 8220

gtgcgttaat acacagaatt ctgattatag cgcactatta tagcaccatg tccgccccgc 8280

tgattactgc catgtgtgtc cttgccaatg ctaccttccc gtgcttccag cccccgtgtg 8340

taccttgctg ctatgaaaac aacgcagagg ccacactacg gatgctcgag gataacgtgg 8400

ataggccagg gtactacgac ctccttcagg cagccttgac gtgccgaaac ggaacaagac 8460

accggcgcag cgtgtcgcaa cacttcaacg tgtataaggc tacacgccct tacatcgcgt 8520

actgcgccga ctgcggagca gggcactcgt gtcatagccc cgtagcaatt gaagcggtca 8580

ggtccgaagc taccgacggg atgctgaaga ttcagttctc ggcacaaatt ggcatagata 8640

agagtgacaa tcatgactac acgaagataa ggtacgcaga cgggcacgcc attgagaatg 8700

ccgtccggtc atctttgaag gtagccacct ccggagactg tttcgtccat ggcacaatgg 8760

gacatttcat actggcaaag tgcccaccgg gtgaattcct gcaggtctcg atccaggaca 8820

ccagaaacgc ggtccgtgcc tgcagaatac aatatcatca tgaccctcaa ccggtgggta 8880

gagaaaaatt tacaattaga ccacactatg gaaaagagat cccttgcacc acttatcaac 8940

agaccacagc gaagaccgtg gaggaaatcg acatgcatat gccgccagat acgccggaca 9000

ggacgttgct atcacagcaa tctggcaatg taaagatcac agtcggagga aagaaggtga 9060

aatacaactg cacctgtgga accggaaacg ttggcactac taattcggac atgacgatca 9120

acacgtgtct aatagagcag tgccacgtct cagtgacgga ccataagaaa tggcagttca 9180

actcaccttt cgtcccgaga gccgacgaac cggctagaaa aggcaaagtc catatcccat 9240

tcccgttgga caacatcaca tgcagagttc caatggcgcg cgaaccaacc gtcatccacg 9300

gcaaaagaga agtgacactg caccttcacc cagatcatcc cacgctcttt tcctaccgca 9360

cactgggtga ggacccgcag tatcacgagg aatgggtgac agcggcggtg gaacggacca 9420

tacccgtacc agtggacggg atggagtacc actggggaaa caacgaccca gtgaggcttt 9480

ggtctcaact caccactgaa gggaaaccgc acggctggcc gcatcagatc gtacagtact 9540

actatgggct ttacccggcc gctacagtat ccgcggtcgt cgggatgagc ttactggcgt 9600

tgatatcgat cttcgcgtcg tgctacatgc tggttgcggc ccgcagtaag tgcttgaccc 9660

cttatgcttt aacaccagga gctgcagttc cgtggacgct ggggatactc tgctgcgccc 9720

cgcgggcgca cgcagctagt gtggcagaga ctatggccta cttgtgggac caaaaccaag 9780

cgttgttctg gttggagttt gcggcccctg ttgcctgcat cctcatcatc acgtattgcc 9840

tcagaaacgt gctgtgttgc tgtaagagcc tttctttttt agtgctactg agcctcgggg 9900

caaccgccag agcttacgaa cattcgacag taatgccgaa cgtggtgggg ttcccgtata 9960

aggctcacat tgaaaggcca ggatatagcc ccctcacttt gcagatgcag gttgttgaaa 10020

ccagcctcga accaaccctt aatttggaat acataacctg tgagtacaag acggtcgtcc 10080

cgtcgccgta cgtgaagtgc tgcggcgcct cagagtgctc cactaaagag aagcctgact 10140

accaatgcaa ggtttacaca ggcgtgtacc cgttcatgtg gggaggggca tattgcttct 10200

gcgactcaga aaacacgcaa ctcagcgagg cgtacgtcga tcgatcggac gtatgcaggc 10260

atgatcacgc atctgcttac aaagcccata cagcatcgct gaaggccaaa gtgagggtta 10320

tgtacggcaa cgtaaaccag actgtggatg tttacgtgaa cggagaccat gccgtcacga 10380

tagggggtac tcagttcata ttcgggccgc tgtcatcggc ctggaccccg ttcgacaaca 10440

agatagtcgt gtacaaagac gaagtgttca atcaggactt cccgccgtac ggatctgggc 10500

aaccagggcg cttcggcgac atccaaagca gaacagtgga gagtaacgac ctgtacgcga 10560

acacggcact gaagctggca cgcccttcac ccggcatggt ccatgtaccg tacacacaga 10620

caccttcagg gttcaaatat tggctaaagg aaaaagggac agccctaaat acgaaggctc 10680

cttttggctg ccaaatcaaa acgaaccctg tcagggccat gaactgcgcc gtgggaaaca 10740

tccctgtctc catgaatttg cctgacagcg cctttacccg cattgtcgag gcgccgacca 10800

tcattgacct gacttgcaca gtggctacct gtatttcggc ggcgtcttga cactgacgta 10860

caagaccgac aagaacgggg actgctctgt acactcgcac tctaacgtag ctactctaca 10920

ggaggccaca gcaaaagtga agacagcagg taaggtgacc ttacacttct ccacggcaag 10980

cgcatcacct tcttttgtgg tgtcgctatg cagtgctagg gccacctgtt cagcgtcgtg 11040

tgagcccccg aaagaccaca tagtcccata tgcggctagc cacagtaacg tagtgtttcc 11100

agacatgtcg ggcaccgcac tatcatgggt gcagaaaatc tcgggtggtc tgggggcctt 11160

cgcaatcggc gctatcctgg tgctggttgt ggtcacttgc attgggctcc gcagataagt 11220

tagggtaggc aatggcattg atatagcaag aaaattgaaa acagaaaaag ttagggtaag 11280

caatggcata taaccataac tgtataactt gtaacaaagc gcaacaagac ctgcgcaatt 11340

ggccccgtgg tccgcctcac ggaaactcgg ggcaactcat attgacacat taattggcaa 11400

taattggaag cttacataag cttaattcga cgaataattg gatttttatt ttattttgca 11460

attggttttt aatatttcca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 11520

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaact agtctgcatt agggtcggca tggcatctcc 11580

acctcctcgc ggtccgacct gggctacttc ggtaggctaa gggagaagaa cttgtttatt 11640

gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt 11700

ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctat 11760

ttaaatctgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 11820

tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc 11880

attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg 11940

aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gtcgcgattt 12000

ctagtctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct 12060

cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 12120

cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 12180

acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 12240

ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgaccctca agtcaaaggg 12300

ggcgaaaccc gacaggacta taaaaatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgggc 12360

gctctcctgt tccaaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cccctttctc ccttcgggaa 12420

gcggggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 12480

ccaagctggg ctgtgtgcac aaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 12540

actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 12600

gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 12660

ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 12720

ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 12780

gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 12840

tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 12900

tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 12960

aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 13020

aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 13080

tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 13140

gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 13200

agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 13260

aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 13320

gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 13380

caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 13440

cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 13500

ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 13560

ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 13620

gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 13680

cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 13740

gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 13800

caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 13860

tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 13920

acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 13980

aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc 14040

gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca 14100

tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc 14160

gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag 14220

agcagattgt actgagagtg caccattcga cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg 14280

aagcagccca gtagtaggtt gaggccgttg agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc 14340

aaggagatgg cgcccaacag tcccccggcc acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa 14400

caagcgctca tgagcccgaa gtggcgagcc cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata 14460

taggcgccag caaccgcacc tgtggcgccg gtgatgccgg ccacgatgcg tccggcgtag 14520

aggatctggc tagcgatgac cctgctgatt ggttcgctga ccatttccgg gtgcgggacg 14580

gcgttaccag aaactcagaa ggttcgtcca accaaaccga ctctgacggc agtttacgag 14640

agagatgata gggtctgctt cagtaagcca gatgctacac aattaggctt gtacatattg 14700

tcgttagaac gcggctacaa ttaatacata accttatgta tcatacacat acgggcgcgc 14760

cgcgccgggt tttggcgcct cccgcgggcg cccccctcct cacggcgagc gctgccacgt 14820

cagacgaagg gcgcagcgag cgtcctgatc cttccgcccg gacgctcagg acagcggccc 14880

gctgctcata agactcggcc ttagaacccc agtatcagca gaaggacatt ttaggacggg 14940

acttgggtga ctctagggca ctggttttct ttccagagag cggaacaggc gaggaaaagt 15000

agtcccttct cggcgattct gcggagggat ctccgtgggg cggtgaacgc cgatgattat 15060

ataaggacgc gccgggtgtg gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt 15120

tcttgtttgt ggatcgctgt gatcgtcact tggtgagtag cgggctgctg ggctggccgg 15180

ggctttcgtg gccgccgggc cgctcggtgg gacggaagcg tgtggagaga ccgccaaggg 15240

ctgtagtctg ggtccgcgag caaggttgcc ctgaactggg ggttgggggg agcgcagcaa 15300

aatggcggct gttcccgagt cttgaatgga agacgcttgt gaggcgggct gtgaggtcgt 15360

tgaaacaagg tggggggcat ggtgggcggc aagaacccaa ggtcttgagg ccttcgctaa 15420

tgcgggaaag ctcttattcg ggtgagatgg gctggggcac catctgggga ccctgacgtg 15480

aagtttgtca ctgactggag aactcggttt gtcgtctgtt gcgggggcgg cagttatggc 15540

ggtgccgttg ggcagtgcac ccgtaccttt gggagcgcgc gccctcgtcg tgtcgtgacg 15600

tcacccgttc tgttggctta taatgcaggg tggggccacc tgccggtagg tgtgcggtag 15660

gcttttctcc gtcgcaggac gcagggttcg ggcctagggt aggctctcct gaatcgacag 15720

gcgccggacc tctggtgagg ggagggataa gtgaggcgtc agtttctttg gtcggtttta 15780

tgtacctatc ttcttaagta gctgaagctc cggttttgaa ctatgcgctc ggggttggcg 15840

agtgtgtttt gtgaagtttt ttaggcacct tttgaaatgt aatcatttgg gtcaatatgt 15900

aattttcagt gttagactag taaattgtcc gctaaattct ggccgttttt ggcttttttg 15960

ttagactaat acgactcact atagttaatt aa 15992

Claims (6)

1.复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆，其序列为SEQ ID NO:31。

2.权利要求1所述亚克隆的制备方法，包括：

1)构建Ubc启动子驱动的西门利克森林病毒复制子：

使用PvuI和EcoRV酶切pSFV-replicon，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7片段插入到pSFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon；

2)构建携带EGFP基因的西门利克森林病毒复制子：

使用BamHI和XhoI酶切Ubc-SFV-replicon，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ IDNO:10片段插入到以SFV复制子质粒Ubc-SFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon-EGFP；

3)构建高效表达EGFP的西门利克森林病毒复制子

使用ApaI和NruI酶切Ubc-SFV-replicon-EGFP，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQID NO:13和SEQ ID NO:18片段插入到Ubc-SFV-replicon-EGFP，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA；

4)制备缺失病毒衣壳蛋白基因且携带EGFP基因的西门利克森林病毒的亚克隆

使用ApaI和NruI酶切Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将片段SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:28插入到Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-FL-EGFP-△C，其序列为SEQID NO:31所示。

3.权利要求1所述的的亚克隆在制备复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒中的应用。

4.利用权利要求1所述的亚克隆制备的复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒。

5.权利要求4所述的病毒样颗粒的应用；

所述的应用为制备神经细胞精细形态的描绘的制剂、制备神经环路的解析的制剂、制备神经环路稀疏标记的制剂、制备病毒抗原表位分析的制剂、病毒抗体药物筛选、制备疫苗、制备诊断试剂、动物模型的建立或病毒复制中的应用。

6.权利要求4所述的病毒样颗粒的应用；所述的应用为在制备基因治疗药物或是制备致病机制研究药物中的应用。