CN113817774A - 辛德毕斯病毒载体及其病毒颗粒和在神经环路中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种辛德毕斯病毒载体及其病毒颗粒和在神经环路中的应用。利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1的辛德毕斯病毒载体转染细胞成功制备出携带绿色荧光蛋白基因的辛德毕斯病毒颗粒。该病毒颗粒在体外可感染多种细胞，感染后可复制增殖，并且能在鼠脑神经环路进行顺向跨多级突触传播，在脑神经环路标记及示踪、非人灵长类神经细胞的标记、药物筛选平台的建立、药物抑制病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

Description

辛德毕斯病毒载体及其病毒颗粒和在神经环路中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种辛德毕斯病毒载体及其病毒颗粒和在神经环路中的应用。
背景技术
在中枢神经系统中拥有非常多不同类型的神经元，它们的树突及轴突共同组成了复杂的神经网络。这些复杂的神经网络，能够使机体进行正常的生理活动，如学习、认知、记忆、恐惧等。神经网络出现异常也会造成相应的神经疾病，如帕金森、老年痴呆和自闭症等。解析大脑神经环路是更加深入了解大脑功能及神经疾病的基础，而病毒示踪工具能够帮助解析大脑神经环路。因此，病毒示踪工具的开发为绘制大脑连接图谱提供了更多的选择。
辛德毕斯病毒(Sindbis virus，SINV)属于披膜病毒科、甲病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为12kb，共编码5个结构蛋白(capsid、E3、E2、6K和E1)和4个非结构蛋白(NSP1、NSP2、NSP3和NSP4)。辛德毕斯病毒在自然界中主要是通过蚊虫叮咬在脊椎动物，如鸟类、哺乳动物中进行传播，具有广泛的宿主范围，包括人、鼠、猴等，能够感染神经系统。这种感染特性可以使其成为介导外源基因到宿主体内的载体。另外，辛德毕斯病毒感染脑神经系统的特性使其具备解析神经环路的能力。但是因为存在一系列工艺和技术改造方面的问题，所以目前其还没有应用到解析大小鼠神经环路和灵长类神经环路的标记上。目前辛德毕斯病毒颗粒的获取方法多为先体外转录，然后用RNA转染细胞，利用细胞产生出辛德毕斯病毒颗粒，步骤繁琐，操作复杂，目前亟需一种可以快速简单获得辛德毕斯病毒颗粒的载体和方法。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种辛德毕斯病毒载体及其病毒颗粒和在神经环路中的应用。利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1的辛德毕斯病毒载体转染细胞成功制备出携带绿色荧光蛋白基因的辛德毕斯病毒颗粒。
本发明提供一种辛德毕斯病毒载体，所述辛德毕斯病毒载体以pSINV为骨架载体，在所述骨架载体上连接有荧光蛋白基因EGFP；所述辛德毕斯病毒载体上依次连接有启动子、5’UTR、NSP1基因的核苷酸序列、NSP2基因的核苷酸序列、NSP3基因的核苷酸序列、NSP4基因的核苷酸序列、C基因的核苷酸序列、E3基因的核苷酸序列、E2基因的核苷酸序列、6K基因的核苷酸序列、E1基因的核苷酸序列、EGFP基因的核苷酸序列、3’UTR；所述辛德毕斯病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，所述启动子为UBC启动子。
本发明还提供一种制备辛德毕斯病毒颗粒的方法，使用所述的辛德毕斯病毒载体转染细胞。
进一步的，所述细胞为BHK-21细胞或神经元细胞。
本发明还提供一种辛德毕斯病毒颗粒，由所述的辛德毕斯病毒载体转染细胞后制备得到。
本发明还提供所述的辛德毕斯病毒颗粒在顺向跨多级突触传播中的应用。
本发明还提供所述的辛德毕斯病毒颗粒在非人灵长类神经细胞的标记和神经环路示踪中的应用。
本发明还提供所述的辛德毕斯病毒颗粒在研究神经科学问题中的应用。
进一步的，所述神经科学问题包括但不限于以下：
药物抑制病毒作用机制、病毒复制和致病机制的分析。
本发明还提供所述的辛德毕斯病毒颗粒在制备标记神经元药物中的应用。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.本发明提供了一种高效、便捷的表达外源蛋白的辛德毕斯病毒系统，无需体外转录和RNA转染细胞的步骤，直接用本发明的辛德毕斯病毒载体转染细胞即可，节省时间和操作步骤。该系统制备的病毒具有可视化的特点，便于开展相关的研究。
2.本发明对于开展在体标记神经元、解析神经环路具有重要价值，同时对于其他应用性研究(如蛋白表达、基因治疗、非人灵长类神经细胞的标记、神经环路标记、药物筛选、抗原表位分析、新型疫苗和诊断试剂等)和基础性研究(如复制、包装和致病机制等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值。
3.本发明制备的辛德毕斯病毒颗粒能够在24小时内快速标记鼠神经细胞。
4.解析神经环路结构是开展脑科学研究的基础，良好的用于神经环路标记的工具对于解析神经环路的结构具有重要意义。辛德毕斯病毒能够感染人和鼠等动物的神经细胞，具有作为神经环路标记的潜力。本发明不仅能够用于非灵长类动物，而且还能用于非人灵长类动物的脑科学研究。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的辛德毕斯病毒载体的构建示意图。
图2为本发明的携带EGFP基因的辛德毕斯病毒载体转染后荧光表达示意图。
图3为本发明的携带EGFP基因的辛德毕斯病毒颗粒感染原代培养的神经元细胞及BHK-21细胞。
图4为本发明的携带EGFP基因的辛德毕斯病毒颗粒在小鼠视网膜进行注射后的标记情况。
图5为本发明的携带EGFP基因的辛德毕斯病毒颗粒在鼠脑内标记外侧膝状体后顺向跨突触传播。
图6为本发明的携带EGFP基因的辛德毕斯病毒颗粒在鼠脑上丘的神经环路标记。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。
实施例1
本发明的辛德毕斯病毒载体，通过下述步骤制备得到：
SINV-WT(结构如图1A和1D所示)和SINV-EGFP(结构如图1B和1C所示)均由UBC启动子启动病毒结构蛋白及非结构蛋白的转录和翻译，完成病毒的包装。使用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物扩增片段扩增UBC启动子SEQ ID NO.4，由SacI和PacI插入载体中。使用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物扩增EGFP基因片段SEQ ID NO.7，EGFP基因由SINV载体上第二个病毒亚基因组启动子(26S)启动，使用SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示引物扩增26S，并与EGFP基因融合在一段DNA片段中(即为SEQ ID NO.10)，经由ApaI和NotI插入载体中。
PCR的反应体系均为50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μMForward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃60s，72℃10min，16℃10min，30个循环；
使用SacI和PacI酶切pTE-3'2J载体(Hahn,C,S,et al.Infectious Sindbisvirus transient expression vectors for studying antigen processing andpresentation.Proceedings of the National Academy of Sciences,1992,89(7):2679-2683)，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO.4片段插入到pTE-3'2J，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSINV-WT。使用ApaI和NotI酶切pSINV-WT，采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ IDNO.10片段插入到pSINV-WT，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSINV-EGFP，其序列如SEQ ID NO.1所示。
图1为本实施例的辛德毕斯病毒载体的构建示意图。图1A为不携带EGFP基因的辛德毕斯病毒载体pSINV-WT的构建示意图；图1B为携带EGFP基因的辛德毕斯病毒载体pSINV-EGFP的构建示意图。图1C为pSINV-EGFP的载体结构图。图1D为pSINV-WT的载体结构图。图中可见pSINV-EGFP载体上依次连接有启动子、5’UTR、NSP1基因的核苷酸序列、NSP2基因的核苷酸序列、NSP3基因的核苷酸序列、NSP4基因的核苷酸序列、C基因的核苷酸序列、E3基因的核苷酸序列、E2基因的核苷酸序列、6K基因的核苷酸序列、E1基因的核苷酸序列、EGFP基因的核苷酸序列、3’UTR。构建完成的辛德毕斯病毒载体pSINV-EGFP的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。NSP1～4、C、E3、E2、6K和E1均为辛德毕斯病毒蛋白。
实施例2
本发明的携带EGFP基因的辛德毕斯病毒载体转染后荧光表达情况及一步生长曲线：
用质粒提取试剂盒提取实施例1的SINV-EGFP质粒后，利用lipofectamine 2000转染BHK-21细胞，37℃，5％(v/v)CO2培养箱中培养，使病毒感染BHK-21细胞，在不同的时间点通过倒置荧光显微镜观察细胞状态和荧光表达，结果如图2A所示，12小时后即可产生绿色的荧光信号，表明辛德毕斯病毒载体能成功包装出SINV病毒并高效快速表达外源蛋白。不同时间点收集的病毒上清的一部分分装后，取一部分采用双层蚀斑法检测不同时间点收集的上清病毒滴度，并绘制一步生长曲线，与不携带EGFP基因的野生型进行比较，结果如图2B所示。携带EGFP基因的辛德毕斯病毒载体表达出的辛德毕斯病毒颗粒与不携带EGFP基因的载体的生长曲线无显著差别，说明携带EGFP基因并不会对辛德毕斯病毒蛋白的表达产生影响。剩下的上清-80℃保存备用，用于后续实验。经过本实施例的感染，可以获得SINV-EGFP病毒载体制备的辛德毕斯病毒颗粒。
实施例3
实施例2制备的辛德毕斯病毒颗粒感染体外培养的多种细胞，并可在细胞中进行复制传播：
分别在BHK-21细胞和原代培养的神经元细胞中感染实施例2收集的病毒上清，取5μl转染后2天的上清感染原代培养的神经元细胞和BHK-21细胞，在感染后1天(24小时)观察绿色荧光的表达情况。结果如图3所示，图3A为原代培养的神经元细胞，图3B为BHK-21细胞。实施例2已经证明本发明的辛德毕斯病毒载体能够转染BHK-21细胞生产辛德毕斯病毒颗粒，因此图3B的结果可以作为阳性对照。图3B中BHK-21细胞均被辛德毕斯病毒感染并表达绿色荧光，进一步验证了上述辛德毕斯病毒可以感染BHK-21细胞，并在其中进行复制。图3A中原代神经元细胞也均被病毒感染，且表达大量绿色荧光蛋白，表明辛德毕斯病毒具有感染神经元的能力，可以运用于体内的神经环路标记，且本发明制备的辛德毕斯病毒颗粒能够在24小时内快速标记鼠神经细胞。
实施例4
携带EGFP基因的辛德毕斯病毒颗粒在小鼠视网膜进行注射后的标记情况：
取2μl辛德毕斯病毒类病毒颗粒(病毒滴度是3×109PFU/ml)注射到C57BL/6鼠(20-25g)的视网膜，感染后72小时后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出小鼠眼球及脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，将眼球沿角膜缘后0.5mm剪开，分离出视网膜，沿四个方向剪开视网膜，并逐渐展平在载玻片上，自然干燥后，即可用于拍片。将脑组织置于30％(V/V)蔗糖溶液中2-3天后，将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻后切片，取脑片后使用荧光显微镜观察。结果如图4所示，图4A为视网膜(Retina)到外侧膝状体到视觉皮层1区的投射通路；图4B为视网膜铺片后辛德毕斯病毒的感染及表达情况；图4C为病毒由视网膜投射到外侧膝状体(LGN)，在LGN的病毒标记情况；图4D为病毒由外侧膝状体(LGN)投射到视觉皮层1区(V1)，在V1的病毒标记情况。图4B可观察到视网膜上的神经纤维被病毒感染后，表达绿色荧光。在外侧膝状体LGN可以观察到绿色荧光信号，同时，在LGN的下游，视觉皮层1区(V1)也可以观察到荧光信号。由于RGCs到LGN、V1是一个顺向的投射通路，表明本发明的辛德毕斯病毒颗粒在神经网络中可以跨突触进行传播，并且可以顺向跨多级进行传播，可以作为一种神经网络示踪工具进行神经环路的解析。
实施例5
本发明的携带EGFP基因的辛德毕斯病毒颗粒在鼠脑内标记外侧膝状体后顺向跨突触传播：
取150nl的辛德毕斯病毒颗粒(病毒滴度是3×109PFU/ml)定位注射到C57BL/6鼠(20-25g)的外侧膝状体，注射后96小时后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻后切片，取脑片后使用荧光显微镜观察。结果如图5所示，图5A为视网膜到外侧膝状体到视觉皮层的投射通路；图5B为注射后96小时，注射位点LGN的病毒标记情况；图5C为辛德毕斯病毒颗粒从LGN顺向跨突触传播到V1，病毒表达的荧光观察；图5D为辛德毕斯病毒颗粒从V1再顺向跨突触传播到V2(视觉皮层2区)，病毒表达的荧光观察；图5E为LGN的上游视网膜的荧光观察。在LGN注射位点可以观测到大量的绿色荧光信号(图5B)，LGN的下游V1也有绿色荧光(图5C)，并且下一级神经元V2也有少量的阳性细胞被标记上(图5D)，表明本发明的辛德毕斯病毒颗粒可以在神经环路中顺向跨多级进行复制传播。但是在LGN的上游神经元RGCs视网膜神经细胞并没有检测到绿色荧光信号(图5E)，表明本发明的辛德毕斯病毒颗粒在神经网络中是单向传播的，只能在神经元间跨突触传播给下级神经元，而不能逆向传播，因此可作为一种跨多级的神经环路示踪工具。
实施例6
本发明的携带EGFP基因的辛德毕斯病毒颗粒在鼠脑上丘的神经环路标记：
取150nl的辛德毕斯病毒颗粒(病毒滴度是3×109PFU/ml)定位注射到C57BL/6鼠(20-25g)的上丘，病毒注射后分别在24、48、96小时后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻后切片，取脑片后使用荧光显微镜观察。结果如图6所示，图6A为上丘到外侧后丘脑核到外侧杏仁核的投射通路；图6B为不同时间点取样，在注射位点上丘(SC)先观察到病毒绿色荧光信号，之后顺向跨突触传播至外侧后丘脑核，最后在外侧杏仁核观察到跨两级神经元的信号。在注射24小时后，注射位点SC即可观察到大量被标记的神经细胞，随着病毒感染时间的延长，48小时后，在SC的下游外侧后丘脑核(LP)也可以观察到绿色荧光信号，在外侧杏仁核(LA)暂未观察到，继续延长病毒在小鼠体内的传播时间，96小时观察，注射位点上丘(SC)信号增加，外侧后丘脑核(LP)的绿色荧光信号也有增加，并且在其的下一级神经元外侧杏仁核(LA)处也有少量细胞被标记上。由于上丘(SC)—外侧后丘脑核(LP)—外侧杏仁核(LA)这条通路是一条单向的神经环路，不存在互相投射，因此表明本发明的辛德毕斯病毒颗粒是一个只能通过顺向跨突触进行传播的示踪工具。
由于辛德毕斯病毒载体的高表达特性，可以应用在生物医学的多个领域。利用辛德毕斯载体作为疫苗载体传递抗原表位，以激活机体的免疫性应答；利用其高表达特性，携带一些特殊的细胞因子，如白细胞介素7、白细胞介素12、干扰素β等，可用于制备标记神经元的药物和发展基于辛德毕斯病毒的基因治疗。
综合以上实施例，本发明提供了一种辛德毕斯病毒载体及其病毒颗粒和在神经环路中的应用。利用SEQ ID NO.1所述的辛德毕斯病毒载体转染细胞成功制备出携带绿色荧光蛋白基因的辛德毕斯病毒颗粒。该病毒感染后可复制增殖，在体外可感染多种细胞，并且能在鼠脑神经环路进行顺向跨多级突触传播，在脑神经环路标记及示踪、非人灵长类神经细胞的标记、药物筛选平台的建立、药物抑制病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
SEQ ID NO.1
ATTGACGGCGTAGTACACACTATTGAATCAAACAGCCGACCAATTGCACTACCATCACAATGGAGAAGCCAGTAGTAAACGTAGACGTAGACCCCCAGAGTCCGTTTGTCGTGCAACTGCAAAAAAGCTTCCCGCAATTTGAGGTAGTAGCACAGCAGGTCACTCCAAATGACCATGCTAATGCCAGAGCATTTTCGCATCTGGCCAGTAAACTAATCGAGCTGGAGGTTCCTACCACAGCGACGATCTTGGACATAGGCAGCGCACCGGCTCGTAGAATGTTTTCCGAGCACCAGTATCATTGTGTCTGCCCCATGCGTAGTCCAGAAGACCCGGACCGCATGATGAAATATGCCAGTAAACTGGCGGAAAAAGCGTGCAAGATTACAAACAAGAACTTGCATGAGAAGATTAAGGATCTCCGGACCGTACTTGATACGCCGGATGCTGAAACACCATCGCTCTGCTTTCACAACGATGTTACCTGCAACATGCGTGCCGAATATTCCGTCATGCAGGACGTGTATATCAACGCTCCCGGAACTATCTATCATCAGGCTATGAAAGGCGTGCGGACCCTGTACTGGATTGGCTTCGACACCACCCAGTTCATGTTCTCGGCTATGGCAGGTTCGTACCCTGCGTACAACACCAACTGGGCCGACGAGAAAGTCCTTGAAGCGCGTAACATCGGACTTTGCAGCACAAAGCTGAGTGAAGGTAGGACAGGAAAATTGTCGATAATGAGGAAGAAGGAGTTGAAGCCCGGGTCGCGGGTTTATTTCTCCGTAGGATCGACACTTTATCCAGAACACAGAGCCAGCTTGCAGAGCTGGCATCTTCCATCGGTGTTCCACTTGAATGGAAAGCAGTCGTACACTTGCCGCTGTGATACAGTGGTGAGTTGCGAAGGCTACGTAGTGAAGAAAATCACCATCAGTCCCGGGATCACGGGAGAAACCGTGGGATACGCGGTTACACACAATAGCGAGGGCTTCTTGCTATGCAAAGTTACTGACACAGTAAAAGGAGAACGGGTATCGTTCCCTGTGTGCACGTACATCCCGGCCACCATATGCGATCAGATGACTGGTATAATGGCCACGGATATATCACCTGACGATGCACAAAAACTTCTGGTTGGGCTCAACCAGCGAATTGTCATTAACGGTAGGACTAACAGGAACACCAACACCATGCAAAATTACCTTCTGCCGATCATAGCACAAGGGTTCAGCAAATGGGCTAAGGAGCGCAAGGATGATCTTGATAACGAGAAAATGCTGGGTACTAGAGAACGCAAGCTTACGTATGGCTGCTTGTGGGCGTTTCGCACTAAGAAAGTACATTCGTTTTATCGCCCACCTGGAACGCAGACCTGCGTAAAAGTCCCAGCCTCTTTTAGCGCTTTTCCCATGTCGTCCGTATGGACGACCTCTTTGCCCATGTCGCTGAGGCAGAAATTGAAACTGGCATTGCAACCAAAGAAGGAGGAAAAACTGCTGCAGGTCTCGGAGGAATTAGTCATGGAGGCCAAGGCTGCTTTTGAGGATGCTCAGGAGGAAGCCAGAGCGGAGAAGCTCCGAGAAGCACTTCCACCATTAGTGGCAGACAAAGGCATCGAGGCAGCCGCAGAAGTTGTCTGCGAAGTGGAGGGGCTCCAGGCGGACATCGGAGCAGCATTAGTTGAAACCCCGCGCGGTCACGTAAGGATAATACCTCAAGCAAATGACCGTATGATCGGACAGTATATCGTTGTCTCGCCAAACTCTGTGCTGAAGAATGCCAAACTCGCACCAGCGCACCCGCTAGCAGATCAGGTTAAGATCATAACACACTCCGGAAGATCAGGAAGGTACGCGGTCGAACCATACGACGCTAAAGTACTGATGCCAGCAGGAGGTGCCGTACCATGGCCAGAATTCCTAGCACTGAGTGAGAGCGCCACGTTAGTGTACAACGAAAGAGAGTTTGTGAACCGCAAACTATACCACATTGCCATGCATGGCCCCGCCAAGAATACAGAAGAGGAGCAGTACAAGGTTACAAAGGCAGAGCTTGCAGAAACAGAGTACGTGTTTGACGTGGACAAGAAGCGTTGCGTTAAGAAGGAAGAAGCCTCAGGTCTGGTCCTCTCGGGAGAACTGACCAACCCTCCCTATCATGAGCTAGCTCTGGAGGGACTGAAGACCCGACCTGCGGTCCCGTACAAGGTCGAAACAATAGGAGTGATAGGCACACCGGGGTCGGGCAAGTCAGCTATTATCAAGTCAACTGTCACGGCACGAGATCTTGTTACCAGCGGAAAGAAAGAAAATTGTCGCGAAATTGAGGCCGACGTGCTAAGACTGAGGGGTATGCAGATTACGTCGAAGACAGTAGATTCGGTTATGCTCAACGGATGCCACAAAGCCGTAGAAGTGCTGTACGTTGACGAAGCGTTCGCGTGCCACGCAGGAGCACTACTTGCCTTGATTGCTATCGTCAGGCCCCGCAAGAAGGTAGTACTATGCGGAGACCCCATGCAATGCGGATTCTTCAACATGATGCAACTAAAGGTACATTTCAATCACCCTGAAAAAGACATATGCACCAAGACATTCTACAAGTATATCTCCCGGCGTTGCACACAGCCAGTTACAGCTATTGTATCGACACTGCATTACGATGGAAAGATGAAAACCACGAACCCGTGCAAGAAGAACATTGAAATCGATATTACAGGGGCCACAAAGCCGAAGCCAGGGGATATCATCCTGACATGTTTCCGCGGGTGGGTTAAGCAATTGCAAATCGACTATCCCGGACATGAAGTAATGACAGCCGCGGCCTCACAAGGGCTAACCAGAAAAGGAGTGTATGCCGTCCGGCAAAAAGTCAATGAAAACCCACTGTACGCGATCACATCAGAGCATGTGAACGTGTTGCTCACCCGCACTGAGGACAGGCTAGTGTGGAAAACCTTGCAGGGCGACCCATGGATTAAGCAGCCCACTAACATACCTAAAGGAAACTTTCAGGCTACTATAGAGGACTGGGAAGCTGAACACAAGGGAATAATTGCTGCAATAAACAGCCCCACTCCCCGTGCCAATCCGTTCAGCTGCAAGACCAACGTTTGCTGGGCGAAAGCATTGGAACCGATACTAGCCACGGCCGGTATCGTACTTACCGGTTGCCAGTGGAGCGAACTGTTCCCACAGTTTGCGGATGACAAACCACATTCGGCCATTTACGCCTTAGACGTAATTTGCATTAAGTTTTTCGGCATGGACTTGACAAGCGGACTGTTTTCTAAACAGAGCATCCCACTAACGTACCATCCCGCCGATTCAGCGAGGCCGGTAGCTCATTGGGACAACAGCCCAGGAACCCGCAAGTATGGGTACGATCACGCCATTGCCGCCGAACTCTCCCGTAGATTTCCGGTGTTCCAGCTAGCTGGGAAGGGCACACAACTTGATTTGCAGACGGGGAGAACCAGAGTTATCTCTGCACAGCATAACCTGGTCCCGGTGAACCGCAATCTTCCTCACGCCTTAGTCCCCGAGTACAAGGAGAAGCAACCCGGCCCGGTCGAAAAATTCTTGAACCAGTTCAAACACCACTCAGTACTTGTGGTATCAGAGGAAAAAATTGAAGCTCCCCGTAAGAGAATCGAATGGATCGCCCCGATTGGCATAGCCGGTGCAGATAAGAACTACAACCTGGCTTTCGGGTTTCCGCCGCAGGCACGGTACGACCTGGTGTTCATCAACATTGGAACTAAATACAGAAACCACCACTTTCAGCAGTGCGAAGACCATGCGGCGACCTTAAAAACCCTTTCGCGTTCGGCCCTGAATTGCCTTAACCCAGGAGGCACCCTCGTGGTGAAGTCCTATGGCTACGCCGACCGCAACAGTGAGGACGTAGTCACCGCTCTTGCCAGAAAGTTTGTCAGGGTGTCTGCAGCGAGACCAGATTGTGTCTCAAGCAATACAGAAATGTACCTGATTTTCCGACAACTAGACAACAGCCGTACACGGCAATTCACCCCGCACCATCTGAATTGCGTGATTTCGTCCGTGTATGAGGGTACAAGAGATGGAGTTGGAGCCGCGCCGTCATACCGCACCAAAAGGGAGAATATTGCTGACTGTCAAGAGGAAGCAGTTGTCAACGCAGCCAATCCGCTGGGTAGACCAGGCGAAGGAGTCTGCCGTGCCATCTATAAACGTTGGCCGACCAGTTTTACCGATTCAGCCACGGAGACAGGCACCGCAAGAATGACTGTGTGCCTAGGAAAGAAAGTGATCCACGCGGTCGGCCCTGATTTCCGGAAGCACCCAGAAGCAGAAGCCTTGAAATTGCTACAAAACGCCTACCATGCAGTGGCAGACTTAGTAAATGAACATAACATCAAGTCTGTCGCCATTCCACTGCTATCTACAGGCATTTACGCAGCCGGAAAAGACCGCCTTGAAGTATCACTTAACTGCTTGACAACCGCGCTAGACAGAACTGACGCGGACGTAACCATCTATTGCCTGGATAAGAAGTGGAAGGAAAGAATCGACGCGGCACTCCAACTTAAGGAGTCTGTAACAGAGCTGAAGGATGAAGATATGGAGATCGACGATGAGTTAGTATGGATCCATCCAGACAGTTGCTTGAAGGGAAGAAAGGGATTCAGTACTACAAAAGGAAAATTGTATTCGTACTTCGAAGGCACCAAATTCCATCAAGCAGCAAAAGACATGGCGGAGATAAAGGTCCTGTTCCCTAATGACCAGGAAAGTAATGAACAACTGTGTGCCTACATATTGGGTGAGACCATGGAAGCAATCCGCGAAAAGTGCCCGGTCGACCATAACCCGTCGTCTAGCCCGCCCAAAACGTTGCCGTGCCTTTGCATGTATGCCATGACGCCAGAAAGGGTCCACAGACTTAGAAGCAATAACGTCAAAGAAGTTACAGTATGCTCCTCCACCCCCCTTCCTAAGCACAAAATTAAGAATGTTCAGAAGGTTCAGTGCACGAAAGTAGTCCTGTTTAATCCGCACACTCCCGCATTCGTTCCCGCCCGTAAGTACATAGAAGTGCCAGAACAGCCTACCGCTCCTCCTGCACAGGCCGAGGAGGCCCCCGAAGTTGTAGCGACACCGTCACCATCTACAGCTGATAACACCTCGCTTGATGTCACAGACATCTCACTGGATATGGATGACAGTAGCGAAGGCTCACTTTTTTCGAGCTTTAGCGGATCGGACAACTCTATTACTAGTATGGACAGTTGGTCGTCAGGACCTAGTTCACTAGAGATAGTAGACCGAAGGCAGGTGGTGGTGGCTGACGTTCATGCCGTCCAAGAGCCTGCCCCTATTCCACCGCCAAGGCTAAAGAAGATGGCCCGCCTGGCAGCGGCAAGAAAAGAGCCCACTCCACCGGCAAGCAATAGCTCTGAGTCCCTCCACCTCTCTTTTGGTGGGGTATCCATGTCCCTCGGATCAATTTTCGACGGAGAGACGGCCCGCCAGGCAGCGGTACAACCCCTGGCAACAGGCCCCACGGATGTGCCTATGTCTTTCGGATCGTTTTCCGACGGAGAGATTGATGAGCTGAGCCGCAGAGTAACTGAGTCCGAACCCGTCCTGTTTGGATCATTTGAACCGGGCGAAGTGAACTCAATTATATCGTCCCGATCAGCCGTATCTTTTCCTCTACGCAAGCAGAGACGTAGACGCAGGAGCAGGAGGACTGAATACTGACTAACCGGGGTAGGTGGGTACATATTTTCGACGGACACAGGCCCTGGGCACTTGCAAAAGAAGTCCGTTCTGCAGAACCAGCTTACAGAACCGACCTTGGAGCGCAATGTCCTGGAAAGAATTCATGCCCCGGTGCTCGACACGTCGAAAGAGGAACAACTCAAACTCAGGTACCAGATGATGCCCACCGAAGCCAACAAAAGTAGGTACCAGTCTCGTAAAGTAGAAAATCAGAAAGCCATAACCACTGAGCGACTACTGTCAGGACTACGACTGTATAACTCTGCCACAGATCAGCCAGAATGCTATAAGATCACCTATCCGAAACCATTGTACTCCAGTAGCGTACCGGCGAACTACTCCGATCCACAGTTCGCTGTAGCTGTCTGTAACAACTATCTGCATGAGAACTATCCGACAGTAGCATCTTATCAGATTACTGACGAGTACGATGCTTACTTGGATATGGTAGACGGGACAGTCGCCTGCCTGGATACTGCAACCTTCTGCCCCGCTAAGCTTAGAAGTTACCCGAAAAAACATGAGTATAGAGCCCCGAATATCCGCAGTGCGGTTCCATCAGCGATGCAGAACACGCTACAAAATGTGCTCATTGCCGCAACTAAAAGAAATTGCAACGTCACGCAGATGCGTGAACTGCCAACACTGGACTCAGCGACATTCAATGTCGAATGCTTTCGAAAATATGCATGTAATGACGAGTATTGGGAGGAGTTCGCTCGGAAGCCAATTAGGATTACCACTGAGTTTGTCACCGCATATGTAGCTAGACTGAAAGGCCCTAAGGCCGCCGCACTATTTGCAAAGACGTATAATTTGGTCCCATTGCAAGAAGTGCCTATGGATAGATTCGTCATGGACATGAAAAGAGACGTGAAAGTTACACCAGGCACGAAACACACAGAAGAAAGACCGAAAGTACAAGTGATACAAGCCGCAGAACCCCTGGCGACTGCTTACTTATGCGGGATTCACCGGGAATTAGTGCGTAGGCTTACGGCCGTCTTGCTTCCAAACATTCACACGCTTTTTGACATGTCGGCGGAGGATTTTGATGCAATCATAGCAGAACACTTCAAGCAAGGCGACCCGGTACTGGAGACGGATATCGCATCATTCGACAAAAGCCAAGACGACGCTATGGCGTTAACCGGTCTGATGATCTTGGAGGACCTGGGTGTGGATCAACCACTACTCGACTTGATCGAGTGCGCCTTTGGAGAAATATCATCCACCCATCTACCTACGGGTACTCGTTTTAAATTCGGGGCGATGATGAAATCCGGAATGTTCCTCACACTTTTTGTCAACACAGTTTTGAATGTCGTTATCGCCAGCAGAGTACTAGAAGAGCGGCTTAAAACGTCCAGATGTGCAGCGTTCATTGGCGACGACAACATCATACATGGAGTAGTATCTGACAAAGAAATGGCTGAGAGGTGCGCCACCTGGCTCAACATGGAGGTTAAGATCATCGACGCAGTCATCGGTGAGAGACCACCTTACTTCTGCGGCGGATTTATCTTGCAAGATTCGGTTACTTCCACAGCGTGCCGCGTGGCGGATCCCCTGAAAAGGCTGTTTAAGTTGGGTAAACCGCTCCCAGCCGACGACGAGCAAGACGAAGACAGAAGACGCGCTCTGCTAGATGAAACAAAGGCGTGGTTTAGAGTAGGTATAACAGGCACTTTAGCAGTGGCCGTGACGACCCGGTATGAGGTAGACAATATTACACCTGTCCTACTGGCATTGAGAACTTTTGCCCAGAGCAAAAGAGCATTCCAAGCCATCAGAGGGGAAATAAAGCATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGTCAGCATAGTACATTTCATCTGACTAATACTACAACACCACCACCATGAATAGAGGATTCTTTAACATGCTCGGCCGCCGCCCCTTCCCGGCCCCCACTGCCATGTGGAGGCCGCGGAGAAGGAGGCAGGCGGCCCCGATGCCTGCCCGCAACGGGCTGGCTTCTCAAATCCAGCAACTGACCACAGCCGTCAGTGCCCTAGTCATTGGACAGGCAACTAGACCTCAACCCCCACGTCCACGCCCGCCACCGCGCCAGAAGAAGCAGGCGCCCAAGCAACCACCGAAGCCGAAGAAACCAAAAACGCAGGAGAAGAAGAAGAAGCAACCTGCAAAACCCAAACCCGGAAAGAGACAGCGCATGGCACTTAAGTTGGAGGCCGACAGATTGTTCGACGTCAAGAACGAGGACGGAGATGTCATCGGGCACGCACTGGCCATGGAAGGAAAGGTAATGAAACCTCTGCACGTGAAAGGAACCATCGACCACCCTGTGCTATCAAAGCTCAAATTTACCAAGTCGTCAGCATACGACATGGAGTTCGCACAGTTGCCAGTCAACATGAGAAGTGAGGCATTCACCTACACCAGTGAACACCCCGAAGGATTCTATAACTGGCACCACGGAGCGGTGCAGTATAGTGGAGGTAGATTTACCATCCCTCGCGGAGTAGGAGGCAGAGGAGACAGCGGTCGTCCGATCATGGATAACTCCGGTCGGGTTGTCGCGATAGTCCTCGGTGGAGCTGATGAAGGAACACGAACTGCCCTTTCGGTCGTCACCTGGAATAGTAAAGGGAAGACAATTAAGACGACCCCGGAAGGGACAGAAGAGTGGTCCGCAGCACCACTGGTCACGGCAATGTGTTTGCTCGGAAATGTGAGCTTCCCATGCGACCGCCCGCCCACATGCTATACCCGCGAACCTTCCAGAGCCCTCGACATCCTTGAAGAGAACGTGAACCATGAGGCCTACGATACCCTGCTCAATGCCATATTGCGGTGCGGATCGTCTGGCAGAAGCAAAAGAAGCGTCACTGACGACTTTACCCTGACCAGCCCCTACTTGGGCACATGCTCGTACTGCCACCATACTGAACCGTGCTTCAGCCCTGTTAAGATCGAGCAGGTCTGGGACGAAGCGGACGATAACACCATACGCATACAGACTTCCGCCCAGTTTGGATACGACCATAGCGGAGCAGCAAGCGCAAACAAGTACCGCTACATGTCGCTTAAGCAGGATCACACCGTTAAAGAAGGCACCATGGATGACATCAAGATTAGCACCTCAGGACCGTGTAGAAGGCTTAGCTACAAAGGATACTTTCTCCTCGCAAAATGCCCTCCAGGGGACAGCGTAACGGTTAGCATAGTGAGTAGCAACTCAGCAACGTCATGTACACTGGCCCGCAAGATAAAACCAAAATTCGTGGGACGGGAAAAATATGATCTACCTCCCGTTCACGGTAAAAAAATTCCTTGCACAGTGTACGACCGTCTGAAAGAAACAACTGCAGGCTACATCACTATGCACAGGCCGGGACCGCACGCTTATACATCCTACCTGGAAGAATCATCAGGGAAAGTTTACGCAAAGCCGCCATCTGGGAAGAACATTACGTATGAGTGCAAGTGCGGCGACTACAAGACCGGAACCGTTTCGACCCGCACCGAAATCACTGGTTGCACCGCCATCAAGCAGTGCGTCGCCTATAAGAGCGACCAAACGAAGTGGGTCTTCAACTCACCGGACTTGATCAGACATGACGACCACACGGCCCAAGGGAAATTGCATTTGCCTTTCAAGTTGATCCCGAGTACCTGCATGGTCCCTGTTGCCCACGCGCCGAATGTAATACATGGCTTTAAACACATCAGCCTCCAATTAGATACAGACCACTTGACATTGCTCACCACCAGGAGACTAGGGGCAAACCCGGAACCAACCACTGAATGGATCGTCGGAAAGACGGTCAGAAACTTCACCGTCGACCGAGATGGCCTGGAATACATATGGGGAAATCATGAGCCAGTGAGGGTCTATGCCCAAGAGTCAGCACCAGGAGACCCTCACGGATGGCCACACGAAATAGTACAGCATTACTACCATCGCCATCCTGTGTACACCATCTTAGCCGTCGCATCAGCTACCGTGGCGATGATGATTGGCGTAACTGTTGCAGTGTTATGTGCCTGTAAAGCGCGCCGTGAGTGCCTGACGCCATACGCCCTGGCCCCAAACGCCGTAATCCCAACTTCGCTGGCACTCTTGTGCTGCGTTAGGTCGGCCAATGCTGAAACGTTCACCGAGACCATGAGTTACTTGTGGTCGAACAGTCAGCCGTTCTTCTGGGTCCAGTTGTGCATACCTTTGGCCGCTTTCATCGTTCTAATGCGCTGCTGCTCCTGCTGCCTGCCTTTTTTAGTGGTTGCCGGCGCCTACCTGGCGAAGGTAGACGCCTACGAACATGCGACCACTGTTCCAAATGTGCCACAGATACCGTATAAGGCACTTGTTGAAAGGGCAGGGTATGCCCCGCTCAATTTGGAGATCACTGTCATGTCCTCGGAGGTTTTGCCTTCCACCAACCAAGAGTACATTACCTGCAAATTCACCACTGTGGTCCCCTCCCCAAAAATCAAATGCTGCGGCTCCTTGGAATGTCAGCCGGCCGCTCATGCAGACTATACCTGCAAGGTCTTCGGAGGGGTCTACCCCTTTATGTGGGGAGGAGCGCAATGTTTTTGCGACAGTGAGAACAGCCAGATGAGTGAGGCGTACGTCGAATTGTCAGCAGATTGCGCGTCTGACCACGCGCAGGCGATTAAGGTGCACACTGCCGCGATGAAAGTAGGACTGCGTATAGTGTACGGGAACACTACCAGTTTCCTAGATGTGTACGTGAACGGAGTCACACCAGGAACGTCTAAAGACTTGAAAGTCATAGCTGGACCAATTTCAGCATCATTTACGCCATTCGATCATAAGGTCGTTATCCATCGCGGCCTGGTGTACAACTATGACTTCCCGGAATATGGAGCGATGAAACCAGGAGCGTTTGGAGACATTCAAGCTACCTCCTTGACTAGCAAGGATCTCATCGCCAGCACAGACATTAGGCTACTCAAGCCTTCCGCCAAGAATGTGCATGTCCCGTACACGCAGGCCGCATCAGGATTTGAGATGTGGAAAAACAACTCAGGCCGCCCATTGCAGGAAACCGCACCTTTCGGGTGTAAGATTGCAGTAAATCCGCTCCGAGCGGTGGACTGTTCATACGGGAACATTCCCATTTCTATTGACATCCCGAACGCTGCCTTTATCAGGACATCAGATGCACCACTGGTCTCAACAGTCAAATGTGAAGTCAGTGAGTGCACTTATTCAGCAGACTTCGACGGGATGGCCACCCTGCAGTATGTATCCGACCGCGAAGGTCAATGCCCCGTACATTCGCATTCGAGCACAGCAACTCTCCAAGAGTCGACAGTACATGTCCTGGAGAAAGGAGCGGTGACAGTACACTTTAGCACCGCGAGTCCACAGGCGAACTTTATCGTATCGCTGTGTGGGAAGAAGACAACATGCAATGCAGAATGTAAACCACCAGCTGACCATATCGTGAGCACCCCGCACAAAAATGACCAAGAATTTCAAGCCGCCATCTCAAAAACATCATGGAGTTGGCTGTTTGCCCTTTTCGGCGGCGCCTCGTCGCTATTAATTATAGGACTTATGATTTTTGCTTGCAGCATGATGCTGACTAGCACACGAAGATGACGGGCCCAGGTAGACAATATTACACCTGTCCTACTGGCATTGAGAACTTTTGCCCAGAGCAAAAGAGCATTCCAAGCCATCAGAGGGGAAATAAAGCATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGTCAGCATAGTACATTTCATCTGACTAATACTACAACACCACCACCTCTAGAATCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCGCGACTCTAGACCATGGATCCTAGACGCTACGCCCCAATGATCCGACCAGCAAAACTCGATGTACTTCCGAGGAACTGATGTGCATAATGCATCAGGCTGGTACATTAGATCCCCGCTTACCGCGGGCAATATAGCAACACTAAAAACTCGATGTACTTCCGAGGAAGCGCAGTGCATAATGCTGCGCAGTGTTGCCACATAACCACTATATTAACCATTTATCTAGCGGACGCCAAAAACTCAATGTATTTCTGAGGAAGCGTGGTGCATAATGCCACGCAGCGTCTGCATAACTTTTATTATTTCTTTTATTAATCAACAAAATTTTGTTTTTAACATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGGAATTCCTCGAGGGGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGAGCTCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGTAGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCAGCAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATGGAAGACGCTTGTGAGGCGGGCTGTGAGGTCGTTGAAACAAGGTGGGGGGCATGGTGGGCGGCAAGAACCCAAGGTCTTGAGGCCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGACTTAATTAA
SEQ ID NO.2
AAACGCCAGCAACGCGAGCTCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCC
SEQ ID NO.3
GTGTGTACTACGCCGTCAATTTAATTAAGTCTAACAAAAAAGCCAAAAA
SEQ ID NO.4
AAACGCCAGCAACGCGAGCTCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGTAGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCAGCAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATGGAAGACGCTTGTGAGGCGGGCTGTGAGGTCGTTGAAACAAGGTGGGGGGCATGGTGGGCGGCAAGAACCCAAGGTCTTGAGGCCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGACTTAATTAAGTCTAACAAAAAAGCCAAAAA
SEQ ID NO.5
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
SEQ ID NO.6
TAGGATCCATGGTCTAGAGTCGCGGCCGCTTTACTTGTACAGCTCGTCCAT
SEQ ID NO.7
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCGCGACTCTAGACCATGGATCCTA
SEQ ID NO.8
CTAGCACACGAAGATGACGGGCCCAGGTAGACAATATTACACCT
SEQ ID NO.9
TCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGATTCTAGAGGTGGTGGTGTTGTAGTATTA
SEQ ID NO.10
CTAGCACACGAAGATGACGGGCCCAGGTAGACAATATTACACCTGTCCTACTGGCATTGAGAACTTTTGCCCAGAGCAAAAGAGCATTCCAAGCCATCAGAGGGGAAATAAAGCATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGTCAGCATAGTACATTTCATCTGACTAATACTACAACACCACCACCTCTAGAATCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCGCGACTCTAGACCATGGATCCT。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院深圳理工大学（筹）
<120> 辛德毕斯病毒载体及其病毒颗粒和在神经环路中的应用
<130> 20210906
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15693
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
attgacggcg tagtacacac tattgaatca aacagccgac caattgcact accatcacaa 60
tggagaagcc agtagtaaac gtagacgtag acccccagag tccgtttgtc gtgcaactgc 120
aaaaaagctt cccgcaattt gaggtagtag cacagcaggt cactccaaat gaccatgcta 180
atgccagagc attttcgcat ctggccagta aactaatcga gctggaggtt cctaccacag 240
cgacgatctt ggacataggc agcgcaccgg ctcgtagaat gttttccgag caccagtatc 300
attgtgtctg ccccatgcgt agtccagaag acccggaccg catgatgaaa tatgccagta 360
aactggcgga aaaagcgtgc aagattacaa acaagaactt gcatgagaag attaaggatc 420
tccggaccgt acttgatacg ccggatgctg aaacaccatc gctctgcttt cacaacgatg 480
ttacctgcaa catgcgtgcc gaatattccg tcatgcagga cgtgtatatc aacgctcccg 540
gaactatcta tcatcaggct atgaaaggcg tgcggaccct gtactggatt ggcttcgaca 600
ccacccagtt catgttctcg gctatggcag gttcgtaccc tgcgtacaac accaactggg 660
ccgacgagaa agtccttgaa gcgcgtaaca tcggactttg cagcacaaag ctgagtgaag 720
gtaggacagg aaaattgtcg ataatgagga agaaggagtt gaagcccggg tcgcgggttt 780
atttctccgt aggatcgaca ctttatccag aacacagagc cagcttgcag agctggcatc 840
ttccatcggt gttccacttg aatggaaagc agtcgtacac ttgccgctgt gatacagtgg 900
tgagttgcga aggctacgta gtgaagaaaa tcaccatcag tcccgggatc acgggagaaa 960
ccgtgggata cgcggttaca cacaatagcg agggcttctt gctatgcaaa gttactgaca 1020
cagtaaaagg agaacgggta tcgttccctg tgtgcacgta catcccggcc accatatgcg 1080
atcagatgac tggtataatg gccacggata tatcacctga cgatgcacaa aaacttctgg 1140
ttgggctcaa ccagcgaatt gtcattaacg gtaggactaa caggaacacc aacaccatgc 1200
aaaattacct tctgccgatc atagcacaag ggttcagcaa atgggctaag gagcgcaagg 1260
atgatcttga taacgagaaa atgctgggta ctagagaacg caagcttacg tatggctgct 1320
tgtgggcgtt tcgcactaag aaagtacatt cgttttatcg cccacctgga acgcagacct 1380
gcgtaaaagt cccagcctct tttagcgctt ttcccatgtc gtccgtatgg acgacctctt 1440
tgcccatgtc gctgaggcag aaattgaaac tggcattgca accaaagaag gaggaaaaac 1500
tgctgcaggt ctcggaggaa ttagtcatgg aggccaaggc tgcttttgag gatgctcagg 1560
aggaagccag agcggagaag ctccgagaag cacttccacc attagtggca gacaaaggca 1620
tcgaggcagc cgcagaagtt gtctgcgaag tggaggggct ccaggcggac atcggagcag 1680
cattagttga aaccccgcgc ggtcacgtaa ggataatacc tcaagcaaat gaccgtatga 1740
tcggacagta tatcgttgtc tcgccaaact ctgtgctgaa gaatgccaaa ctcgcaccag 1800
cgcacccgct agcagatcag gttaagatca taacacactc cggaagatca ggaaggtacg 1860
cggtcgaacc atacgacgct aaagtactga tgccagcagg aggtgccgta ccatggccag 1920
aattcctagc actgagtgag agcgccacgt tagtgtacaa cgaaagagag tttgtgaacc 1980
gcaaactata ccacattgcc atgcatggcc ccgccaagaa tacagaagag gagcagtaca 2040
aggttacaaa ggcagagctt gcagaaacag agtacgtgtt tgacgtggac aagaagcgtt 2100
gcgttaagaa ggaagaagcc tcaggtctgg tcctctcggg agaactgacc aaccctccct 2160
atcatgagct agctctggag ggactgaaga cccgacctgc ggtcccgtac aaggtcgaaa 2220
caataggagt gataggcaca ccggggtcgg gcaagtcagc tattatcaag tcaactgtca 2280
cggcacgaga tcttgttacc agcggaaaga aagaaaattg tcgcgaaatt gaggccgacg 2340
tgctaagact gaggggtatg cagattacgt cgaagacagt agattcggtt atgctcaacg 2400
gatgccacaa agccgtagaa gtgctgtacg ttgacgaagc gttcgcgtgc cacgcaggag 2460
cactacttgc cttgattgct atcgtcaggc cccgcaagaa ggtagtacta tgcggagacc 2520
ccatgcaatg cggattcttc aacatgatgc aactaaaggt acatttcaat caccctgaaa 2580
aagacatatg caccaagaca ttctacaagt atatctcccg gcgttgcaca cagccagtta 2640
cagctattgt atcgacactg cattacgatg gaaagatgaa aaccacgaac ccgtgcaaga 2700
agaacattga aatcgatatt acaggggcca caaagccgaa gccaggggat atcatcctga 2760
catgtttccg cgggtgggtt aagcaattgc aaatcgacta tcccggacat gaagtaatga 2820
cagccgcggc ctcacaaggg ctaaccagaa aaggagtgta tgccgtccgg caaaaagtca 2880
atgaaaaccc actgtacgcg atcacatcag agcatgtgaa cgtgttgctc acccgcactg 2940
aggacaggct agtgtggaaa accttgcagg gcgacccatg gattaagcag cccactaaca 3000
tacctaaagg aaactttcag gctactatag aggactggga agctgaacac aagggaataa 3060
ttgctgcaat aaacagcccc actccccgtg ccaatccgtt cagctgcaag accaacgttt 3120
gctgggcgaa agcattggaa ccgatactag ccacggccgg tatcgtactt accggttgcc 3180
agtggagcga actgttccca cagtttgcgg atgacaaacc acattcggcc atttacgcct 3240
tagacgtaat ttgcattaag tttttcggca tggacttgac aagcggactg ttttctaaac 3300
agagcatccc actaacgtac catcccgccg attcagcgag gccggtagct cattgggaca 3360
acagcccagg aacccgcaag tatgggtacg atcacgccat tgccgccgaa ctctcccgta 3420
gatttccggt gttccagcta gctgggaagg gcacacaact tgatttgcag acggggagaa 3480
ccagagttat ctctgcacag cataacctgg tcccggtgaa ccgcaatctt cctcacgcct 3540
tagtccccga gtacaaggag aagcaacccg gcccggtcga aaaattcttg aaccagttca 3600
aacaccactc agtacttgtg gtatcagagg aaaaaattga agctccccgt aagagaatcg 3660
aatggatcgc cccgattggc atagccggtg cagataagaa ctacaacctg gctttcgggt 3720
ttccgccgca ggcacggtac gacctggtgt tcatcaacat tggaactaaa tacagaaacc 3780
accactttca gcagtgcgaa gaccatgcgg cgaccttaaa aaccctttcg cgttcggccc 3840
tgaattgcct taacccagga ggcaccctcg tggtgaagtc ctatggctac gccgaccgca 3900
acagtgagga cgtagtcacc gctcttgcca gaaagtttgt cagggtgtct gcagcgagac 3960
cagattgtgt ctcaagcaat acagaaatgt acctgatttt ccgacaacta gacaacagcc 4020
gtacacggca attcaccccg caccatctga attgcgtgat ttcgtccgtg tatgagggta 4080
caagagatgg agttggagcc gcgccgtcat accgcaccaa aagggagaat attgctgact 4140
gtcaagagga agcagttgtc aacgcagcca atccgctggg tagaccaggc gaaggagtct 4200
gccgtgccat ctataaacgt tggccgacca gttttaccga ttcagccacg gagacaggca 4260
ccgcaagaat gactgtgtgc ctaggaaaga aagtgatcca cgcggtcggc cctgatttcc 4320
ggaagcaccc agaagcagaa gccttgaaat tgctacaaaa cgcctaccat gcagtggcag 4380
acttagtaaa tgaacataac atcaagtctg tcgccattcc actgctatct acaggcattt 4440
acgcagccgg aaaagaccgc cttgaagtat cacttaactg cttgacaacc gcgctagaca 4500
gaactgacgc ggacgtaacc atctattgcc tggataagaa gtggaaggaa agaatcgacg 4560
cggcactcca acttaaggag tctgtaacag agctgaagga tgaagatatg gagatcgacg 4620
atgagttagt atggatccat ccagacagtt gcttgaaggg aagaaaggga ttcagtacta 4680
caaaaggaaa attgtattcg tacttcgaag gcaccaaatt ccatcaagca gcaaaagaca 4740
tggcggagat aaaggtcctg ttccctaatg accaggaaag taatgaacaa ctgtgtgcct 4800
acatattggg tgagaccatg gaagcaatcc gcgaaaagtg cccggtcgac cataacccgt 4860
cgtctagccc gcccaaaacg ttgccgtgcc tttgcatgta tgccatgacg ccagaaaggg 4920
tccacagact tagaagcaat aacgtcaaag aagttacagt atgctcctcc accccccttc 4980
ctaagcacaa aattaagaat gttcagaagg ttcagtgcac gaaagtagtc ctgtttaatc 5040
cgcacactcc cgcattcgtt cccgcccgta agtacataga agtgccagaa cagcctaccg 5100
ctcctcctgc acaggccgag gaggcccccg aagttgtagc gacaccgtca ccatctacag 5160
ctgataacac ctcgcttgat gtcacagaca tctcactgga tatggatgac agtagcgaag 5220
gctcactttt ttcgagcttt agcggatcgg acaactctat tactagtatg gacagttggt 5280
cgtcaggacc tagttcacta gagatagtag accgaaggca ggtggtggtg gctgacgttc 5340
atgccgtcca agagcctgcc cctattccac cgccaaggct aaagaagatg gcccgcctgg 5400
cagcggcaag aaaagagccc actccaccgg caagcaatag ctctgagtcc ctccacctct 5460
cttttggtgg ggtatccatg tccctcggat caattttcga cggagagacg gcccgccagg 5520
cagcggtaca acccctggca acaggcccca cggatgtgcc tatgtctttc ggatcgtttt 5580
ccgacggaga gattgatgag ctgagccgca gagtaactga gtccgaaccc gtcctgtttg 5640
gatcatttga accgggcgaa gtgaactcaa ttatatcgtc ccgatcagcc gtatcttttc 5700
ctctacgcaa gcagagacgt agacgcagga gcaggaggac tgaatactga ctaaccgggg 5760
taggtgggta catattttcg acggacacag gccctgggca cttgcaaaag aagtccgttc 5820
tgcagaacca gcttacagaa ccgaccttgg agcgcaatgt cctggaaaga attcatgccc 5880
cggtgctcga cacgtcgaaa gaggaacaac tcaaactcag gtaccagatg atgcccaccg 5940
aagccaacaa aagtaggtac cagtctcgta aagtagaaaa tcagaaagcc ataaccactg 6000
agcgactact gtcaggacta cgactgtata actctgccac agatcagcca gaatgctata 6060
agatcaccta tccgaaacca ttgtactcca gtagcgtacc ggcgaactac tccgatccac 6120
agttcgctgt agctgtctgt aacaactatc tgcatgagaa ctatccgaca gtagcatctt 6180
atcagattac tgacgagtac gatgcttact tggatatggt agacgggaca gtcgcctgcc 6240
tggatactgc aaccttctgc cccgctaagc ttagaagtta cccgaaaaaa catgagtata 6300
gagccccgaa tatccgcagt gcggttccat cagcgatgca gaacacgcta caaaatgtgc 6360
tcattgccgc aactaaaaga aattgcaacg tcacgcagat gcgtgaactg ccaacactgg 6420
actcagcgac attcaatgtc gaatgctttc gaaaatatgc atgtaatgac gagtattggg 6480
aggagttcgc tcggaagcca attaggatta ccactgagtt tgtcaccgca tatgtagcta 6540
gactgaaagg ccctaaggcc gccgcactat ttgcaaagac gtataatttg gtcccattgc 6600
aagaagtgcc tatggataga ttcgtcatgg acatgaaaag agacgtgaaa gttacaccag 6660
gcacgaaaca cacagaagaa agaccgaaag tacaagtgat acaagccgca gaacccctgg 6720
cgactgctta cttatgcggg attcaccggg aattagtgcg taggcttacg gccgtcttgc 6780
ttccaaacat tcacacgctt tttgacatgt cggcggagga ttttgatgca atcatagcag 6840
aacacttcaa gcaaggcgac ccggtactgg agacggatat cgcatcattc gacaaaagcc 6900
aagacgacgc tatggcgtta accggtctga tgatcttgga ggacctgggt gtggatcaac 6960
cactactcga cttgatcgag tgcgcctttg gagaaatatc atccacccat ctacctacgg 7020
gtactcgttt taaattcggg gcgatgatga aatccggaat gttcctcaca ctttttgtca 7080
acacagtttt gaatgtcgtt atcgccagca gagtactaga agagcggctt aaaacgtcca 7140
gatgtgcagc gttcattggc gacgacaaca tcatacatgg agtagtatct gacaaagaaa 7200
tggctgagag gtgcgccacc tggctcaaca tggaggttaa gatcatcgac gcagtcatcg 7260
gtgagagacc accttacttc tgcggcggat ttatcttgca agattcggtt acttccacag 7320
cgtgccgcgt ggcggatccc ctgaaaaggc tgtttaagtt gggtaaaccg ctcccagccg 7380
acgacgagca agacgaagac agaagacgcg ctctgctaga tgaaacaaag gcgtggttta 7440
gagtaggtat aacaggcact ttagcagtgg ccgtgacgac ccggtatgag gtagacaata 7500
ttacacctgt cctactggca ttgagaactt ttgcccagag caaaagagca ttccaagcca 7560
tcagagggga aataaagcat ctctacggtg gtcctaaata gtcagcatag tacatttcat 7620
ctgactaata ctacaacacc accaccatga atagaggatt ctttaacatg ctcggccgcc 7680
gccccttccc ggcccccact gccatgtgga ggccgcggag aaggaggcag gcggccccga 7740
tgcctgcccg caacgggctg gcttctcaaa tccagcaact gaccacagcc gtcagtgccc 7800
tagtcattgg acaggcaact agacctcaac ccccacgtcc acgcccgcca ccgcgccaga 7860
agaagcaggc gcccaagcaa ccaccgaagc cgaagaaacc aaaaacgcag gagaagaaga 7920
agaagcaacc tgcaaaaccc aaacccggaa agagacagcg catggcactt aagttggagg 7980
ccgacagatt gttcgacgtc aagaacgagg acggagatgt catcgggcac gcactggcca 8040
tggaaggaaa ggtaatgaaa cctctgcacg tgaaaggaac catcgaccac cctgtgctat 8100
caaagctcaa atttaccaag tcgtcagcat acgacatgga gttcgcacag ttgccagtca 8160
acatgagaag tgaggcattc acctacacca gtgaacaccc cgaaggattc tataactggc 8220
accacggagc ggtgcagtat agtggaggta gatttaccat ccctcgcgga gtaggaggca 8280
gaggagacag cggtcgtccg atcatggata actccggtcg ggttgtcgcg atagtcctcg 8340
gtggagctga tgaaggaaca cgaactgccc tttcggtcgt cacctggaat agtaaaggga 8400
agacaattaa gacgaccccg gaagggacag aagagtggtc cgcagcacca ctggtcacgg 8460
caatgtgttt gctcggaaat gtgagcttcc catgcgaccg cccgcccaca tgctataccc 8520
gcgaaccttc cagagccctc gacatccttg aagagaacgt gaaccatgag gcctacgata 8580
ccctgctcaa tgccatattg cggtgcggat cgtctggcag aagcaaaaga agcgtcactg 8640
acgactttac cctgaccagc ccctacttgg gcacatgctc gtactgccac catactgaac 8700
cgtgcttcag ccctgttaag atcgagcagg tctgggacga agcggacgat aacaccatac 8760
gcatacagac ttccgcccag tttggatacg accatagcgg agcagcaagc gcaaacaagt 8820
accgctacat gtcgcttaag caggatcaca ccgttaaaga aggcaccatg gatgacatca 8880
agattagcac ctcaggaccg tgtagaaggc ttagctacaa aggatacttt ctcctcgcaa 8940
aatgccctcc aggggacagc gtaacggtta gcatagtgag tagcaactca gcaacgtcat 9000
gtacactggc ccgcaagata aaaccaaaat tcgtgggacg ggaaaaatat gatctacctc 9060
ccgttcacgg taaaaaaatt ccttgcacag tgtacgaccg tctgaaagaa acaactgcag 9120
gctacatcac tatgcacagg ccgggaccgc acgcttatac atcctacctg gaagaatcat 9180
cagggaaagt ttacgcaaag ccgccatctg ggaagaacat tacgtatgag tgcaagtgcg 9240
gcgactacaa gaccggaacc gtttcgaccc gcaccgaaat cactggttgc accgccatca 9300
agcagtgcgt cgcctataag agcgaccaaa cgaagtgggt cttcaactca ccggacttga 9360
tcagacatga cgaccacacg gcccaaggga aattgcattt gcctttcaag ttgatcccga 9420
gtacctgcat ggtccctgtt gcccacgcgc cgaatgtaat acatggcttt aaacacatca 9480
gcctccaatt agatacagac cacttgacat tgctcaccac caggagacta ggggcaaacc 9540
cggaaccaac cactgaatgg atcgtcggaa agacggtcag aaacttcacc gtcgaccgag 9600
atggcctgga atacatatgg ggaaatcatg agccagtgag ggtctatgcc caagagtcag 9660
caccaggaga ccctcacgga tggccacacg aaatagtaca gcattactac catcgccatc 9720
ctgtgtacac catcttagcc gtcgcatcag ctaccgtggc gatgatgatt ggcgtaactg 9780
ttgcagtgtt atgtgcctgt aaagcgcgcc gtgagtgcct gacgccatac gccctggccc 9840
caaacgccgt aatcccaact tcgctggcac tcttgtgctg cgttaggtcg gccaatgctg 9900
aaacgttcac cgagaccatg agttacttgt ggtcgaacag tcagccgttc ttctgggtcc 9960
agttgtgcat acctttggcc gctttcatcg ttctaatgcg ctgctgctcc tgctgcctgc 10020
cttttttagt ggttgccggc gcctacctgg cgaaggtaga cgcctacgaa catgcgacca 10080
ctgttccaaa tgtgccacag ataccgtata aggcacttgt tgaaagggca gggtatgccc 10140
cgctcaattt ggagatcact gtcatgtcct cggaggtttt gccttccacc aaccaagagt 10200
acattacctg caaattcacc actgtggtcc cctccccaaa aatcaaatgc tgcggctcct 10260
tggaatgtca gccggccgct catgcagact atacctgcaa ggtcttcgga ggggtctacc 10320
cctttatgtg gggaggagcg caatgttttt gcgacagtga gaacagccag atgagtgagg 10380
cgtacgtcga attgtcagca gattgcgcgt ctgaccacgc gcaggcgatt aaggtgcaca 10440
ctgccgcgat gaaagtagga ctgcgtatag tgtacgggaa cactaccagt ttcctagatg 10500
tgtacgtgaa cggagtcaca ccaggaacgt ctaaagactt gaaagtcata gctggaccaa 10560
tttcagcatc atttacgcca ttcgatcata aggtcgttat ccatcgcggc ctggtgtaca 10620
actatgactt cccggaatat ggagcgatga aaccaggagc gtttggagac attcaagcta 10680
cctccttgac tagcaaggat ctcatcgcca gcacagacat taggctactc aagccttccg 10740
ccaagaatgt gcatgtcccg tacacgcagg ccgcatcagg atttgagatg tggaaaaaca 10800
actcaggccg cccattgcag gaaaccgcac ctttcgggtg taagattgca gtaaatccgc 10860
tccgagcggt ggactgttca tacgggaaca ttcccatttc tattgacatc ccgaacgctg 10920
cctttatcag gacatcagat gcaccactgg tctcaacagt caaatgtgaa gtcagtgagt 10980
gcacttattc agcagacttc gacgggatgg ccaccctgca gtatgtatcc gaccgcgaag 11040
gtcaatgccc cgtacattcg cattcgagca cagcaactct ccaagagtcg acagtacatg 11100
tcctggagaa aggagcggtg acagtacact ttagcaccgc gagtccacag gcgaacttta 11160
tcgtatcgct gtgtgggaag aagacaacat gcaatgcaga atgtaaacca ccagctgacc 11220
atatcgtgag caccccgcac aaaaatgacc aagaatttca agccgccatc tcaaaaacat 11280
catggagttg gctgtttgcc cttttcggcg gcgcctcgtc gctattaatt ataggactta 11340
tgatttttgc ttgcagcatg atgctgacta gcacacgaag atgacgggcc caggtagaca 11400
atattacacc tgtcctactg gcattgagaa cttttgccca gagcaaaaga gcattccaag 11460
ccatcagagg ggaaataaag catctctacg gtggtcctaa atagtcagca tagtacattt 11520
catctgacta atactacaac accaccacct ctagaatcgc caccatggtg agcaagggcg 11580
aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc 11640
acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga 11700
agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga 11760
cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca 11820
agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca 11880
actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc 11940
tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact 12000
acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact 12060
tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga 12120
acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt 12180
ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga 12240
ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaaagcggc cgcgactcta 12300
gaccatggat cctagacgct acgccccaat gatccgacca gcaaaactcg atgtacttcc 12360
gaggaactga tgtgcataat gcatcaggct ggtacattag atccccgctt accgcgggca 12420
atatagcaac actaaaaact cgatgtactt ccgaggaagc gcagtgcata atgctgcgca 12480
gtgttgccac ataaccacta tattaaccat ttatctagcg gacgccaaaa actcaatgta 12540
tttctgagga agcgtggtgc ataatgccac gcagcgtctg cataactttt attatttctt 12600
ttattaatca acaaaatttt gtttttaaca tttcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 12660
aaaaaagggg aattcctcga ggggaattaa ttcttgaaga cgaaagggcc aggtggcact 12720
tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 12780
tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt 12840
atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 12900
gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 12960
cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 13020
gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 13080
cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 13140
gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 13200
tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 13260
ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 13320
gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 13380
cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 13440
tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 13500
tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 13560
cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 13620
acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 13680
tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat 13740
ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg 13800
accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc 13860
aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 13920
ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 13980
gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta 14040
ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta 14100
ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag 14160
ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 14220
gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 14280
cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 14340
cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 14400
cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 14460
aacgccagca acgcgagctc gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc 14520
acggcgagcg ctgccacgtc agacgaaggg cgcagcgagc gtcctgatcc ttccgcccgg 14580
acgctcagga cagcggcccg ctgctcataa gactcggcct tagaacccca gtatcagcag 14640
aaggacattt taggacggga cttgggtgac tctagggcac tggttttctt tccagagagc 14700
ggaacaggcg aggaaaagta gtcccttctc ggcgattctg cggagggatc tccgtggggc 14760
ggtgaacgcc gatgattata taaggacgcg ccgggtgtgg cacagctagt tccgtcgcag 14820
ccgggatttg ggtcgcggtt cttgtttgtg gatcgctgtg atcgtcactt ggtgagtagc 14880
gggctgctgg gctggccggg gctttcgtgg ccgccgggcc gctcggtggg acggaagcgt 14940
gtggagagac cgccaagggc tgtagtctgg gtccgcgagc aaggttgccc tgaactgggg 15000
gttgggggga gcgcagcaaa atggcggctg ttcccgagtc ttgaatggaa gacgcttgtg 15060
aggcgggctg tgaggtcgtt gaaacaaggt ggggggcatg gtgggcggca agaacccaag 15120
gtcttgaggc cttcgctaat gcgggaaagc tcttattcgg gtgagatggg ctggggcacc 15180
atctggggac cctgacgtga agtttgtcac tgactggaga actcggtttg tcgtctgttg 15240
cgggggcggc agttatggcg gtgccgttgg gcagtgcacc cgtacctttg ggagcgcgcg 15300
ccctcgtcgt gtcgtgacgt cacccgttct gttggcttat aatgcagggt ggggccacct 15360
gccggtaggt gtgcggtagg cttttctccg tcgcaggacg cagggttcgg gcctagggta 15420
ggctctcctg aatcgacagg cgccggacct ctggtgaggg gagggataag tgaggcgtca 15480
gtttctttgg tcggttttat gtacctatct tcttaagtag ctgaagctcc ggttttgaac 15540
tatgcgctcg gggttggcga gtgtgttttg tgaagttttt taggcacctt ttgaaatgta 15600
atcatttggg tcaatatgta attttcagtg ttagactagt aaattgtccg ctaaattctg 15660
gccgtttttg gcttttttgt tagacttaat taa 15693

Claims (10)

1.一种辛德毕斯病毒载体，其特征在于，所述辛德毕斯病毒载体以pSINV为骨架载体，在所述骨架载体上连接有荧光蛋白基因EGFP；
所述辛德毕斯病毒载体上依次连接有启动子、5’UTR、NSP1基因的核苷酸序列、NSP2基因的核苷酸序列、NSP3基因的核苷酸序列、NSP4基因的核苷酸序列、C基因的核苷酸序列、E3基因的核苷酸序列、E2基因的核苷酸序列、6K基因的核苷酸序列、E1基因的核苷酸序列、EGFP基因的核苷酸序列、3’UTR；所述辛德毕斯病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的辛德毕斯病毒载体，其特征在于，所述启动子为UBC启动子。
3.一种制备辛德毕斯病毒颗粒的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的辛德毕斯病毒载体转染细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞为BHK-21细胞或神经元细胞。
5.一种辛德毕斯病毒颗粒，其特征在于，由权利要求1所述的辛德毕斯载体转染细胞后制备得到。
6.权利要求5所述的辛德毕斯病毒颗粒在顺向跨多级突触传播中的应用。
7.权利要求5所述的辛德毕斯病毒颗粒在非人灵长类神经细胞的标记和神经环路示踪中的应用。
8.权利要求5所述的辛德毕斯病毒颗粒在研究神经科学问题中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述神经科学问题包括但不限于以下：
药物抑制病毒作用机制、病毒复制和致病机制的分析。
10.权利要求5所述的辛德毕斯病毒颗粒在制备标记神经元药物中的应用。
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