CN115943214A

CN115943214A - 用于获得car-nk细胞的方法

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Publication number: CN115943214A
Application number: CN202080094641.1A
Authority: CN
Inventors: 扬·斯潘霍尔茨; 尼娜·拉默斯-科克; 莫妮卡·拉伊莫; 露西娅·库切罗娃; 亨德里克斯·阿德里亚努斯·玛丽亚·海尔茨
Original assignee: Glycostem Therapeutics Bv
Current assignee: Glycostem Therapeutics Bv
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2020-11-29
Publication date: 2023-04-07
Also published as: US20230212515A1; EP4065137A1; JP2023504075A; KR20220107233A; WO2021107779A1; CA3159728A1

Abstract

本发明涉及制造用病毒载体遗传修饰的自然杀伤(NK)细胞的领域，这些病毒载体携带编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。本发明进一步涉及用方法获得的CAR‑NK细胞，和这些CAR‑NK细胞在医学中、特别是用于在治疗癌症的方法中的用途。

Description

用于获得CAR-NK细胞的方法

本发明涉及遗传修饰的自然杀伤(NK)细胞及其制造方法的领域。具体地，本发明涉及CAR-NK细胞、制造这些CAR-NK细胞的方法、和这些CAR-NK细胞在医学中、特别是用于治疗癌症中的用途。

自然杀伤细胞(NK细胞)是具有抗肿瘤、抗病毒和抗微生物活性的先天性免疫细胞。在报道了NK细胞在患有癌症的患者中的成功过继性转移和体内扩增后，将NK细胞用于治疗癌症引起了关注[Ruggeri等人(2005)CurrOpin Immunol[免疫学当前观点]17:211-7；Ren等人(2007)Cancer BiotherRadiopharm[癌症生物治疗和放射药物]22:223-34；Koehl等人(2004)Blood Cells Mol Dis[血细胞分子和疾病]33:261-6.176；Passweg等人(2004)Leukemia[白血病]18:1835-8]。通常，在这些研究中，供体NK细胞输注的耐受性良好且没有诱导GvHD的证据。然而，迄今为止，在患有癌症的患者中，只进行了少数研究过继性NK细胞输注的试验。主要障碍是仅相对少量NK细胞可以从常规白细胞去除术产物分离。这妨碍了患有癌症的人中NK细胞剂量依赖性抗肿瘤应答的临床试验[Klingemann等人(2004)Cytotherapy[细胞疗法]6:15-22；Passweg等人(2006)Best Pract Res Clin Haematol[临床血液学最佳实践和研究]19:811-824；McKenna等人(2007)Transfusion[输液]47:520-528；Koehl等人(2005)KlinPadiatr[小儿科杂志]217:345-350；Iyengar等人(2003)Cytotherapy[细胞疗法]5:479-484；Meyer-Monard等人(2009)Transfusion[输液]49:362-371]。因此，正在研究的用于扩增和激活NK细胞的离体方案，使得能够实现更高NK细胞剂量的临床试验，并且允许多次NK细胞输注[Carlens等人(2001)Hum Immunol[人类免疫学]62:1092-1098；Barkholt等人(2009)Immunotherapy[免疫疗法]1:753-764；Berg等人(2009)Cytotherapy[细胞疗法]11:341-355；Fujisaki等人(2009)Cancer Res[癌症研究]69:4010-4017；Siegler等人(2010)Cytotherapy[细胞疗法]12(6):750-63]。然而，大多数方案通过使用支持性饲养细胞系来面对技术缺点，这些支持性饲养细胞系对于大规模和多中心试验而言可能导致产生NK细胞产物的调控问题。先前，我们已经描述了具有以高细胞数目、高纯度和功能性从CD34+造血干细胞产生临床相关的NK细胞产物的能力的替代性基于细胞因子的培养方法[Spanholtz等人(2010)PLoS One[公共科学图书馆综合]5:e9221]。我们已经进一步优化了CD34+干细胞的富集，并且开发了导致高产率激活的CD34+干细胞来源的NK细胞的可扩展程序。

嵌合抗原受体(CAR)是包含三个基本单元的杂交分子：(1)细胞外抗原结合基序，(2)连接/跨膜基序，和(3)细胞内T细胞信号传导基序(Long等人(2013)Oncoimmunology 2[肿瘤免疫学2](4):e23621)。

通常，CAR的抗原结合基序与单链可变片段(scFv)，即免疫球蛋白(Ig)分子的最小结合域是可比的。替代性抗原结合基序，例如，受体配体、完整免疫受体、文库衍生肽、和先天性免疫系统效应分子(例如，NKG2D)也已被工程化。用于CAR表达的替代性细胞靶标(例如，NK或γ-δT细胞)也在开发中(Brown等人(2012)Clin Cancer Res[临床癌症研究]18(8):2199-209；Lehner等人(2012)PLoS One[公共科学图书馆综合]7(2):e31210)。

虽然CAR似乎可以以类似于CAR T细胞的方式触发NK细胞激活，但迄今为止，该技术临床应用的主要障碍已被CAR NK细胞在体内的扩增、输注后的细胞的快速消失和令人失望的临床活性所限制。因此，本领域长期迫切需要发现使用CAR-NK细胞治疗癌症的组合物和方法，这些组合物和方法可以表现出预期的治疗特性而没有上述缺点中的至少一个。

本发明通过提供一种用于制造CAR-NK细胞的方法来满足这些需求，该方法允许获得足够质量和数量的高活性CAR-NK细胞以供临床使用。本发明提供了一种用于医学治疗，特别是治疗患者肿瘤的高活性成品CAR-NK细胞的制造过程。

该制造过程包括以下步骤：

第一步骤，旨在用CAR转导CD34+干细胞的细胞群体。

第二步骤，旨在扩增转导的CD34+干细胞，并将扩增且转导的CD34+干细胞分化为CAR-NK祖细胞和CAR-NK细胞。本发明诸位发明人已出人意料地发现转导期间的特定培养条件对最终分化的CAR-NK细胞群体的性质和组成有影响。使用这种培养条件获得的细胞的质量优于使用其他培养条件获得的细胞的质量。更具体地，在所述第一步骤中，CD34+干细胞从生物样品(例如，脐带血、骨髓、或外周血)中获得，并且例如，通过病毒转导引入编码CAR的多核苷酸。所述引入多核苷酸是在包含细胞因子集合的培养基的存在下进行的。在所述第一步骤之后，培养物因此包含CAR-CD34+干细胞，这些CAR-CD34+干细胞在包含细胞因子的另一个集合的培养基中进一步扩增和/或分化。

在第二步骤中，将细胞群体(进一步)扩增和分化成含有CAR-NK细胞的细胞群体。优选地，将从所述第一步骤获得的CAR-CD34+干细胞首先在不同于所述第一培养基的、都具有细胞因子的集合的第二培养基和第三培养基中进行培养，由此获得含有多种CAR-NK细胞或CAR-NK祖细胞或两者的培养细胞的集合。

出人意料地发现，与使用具有不同细胞因子组成的培养基获得的群体相比，在所述第一步骤期间应用的条件允许获得具有更强治疗效果的CAR-NK群体。此外，当与使用相同的培养条件但没有引入CAR多核苷酸获得的非CAR NK细胞(天然NK细胞)群体或与使用包含CAR(其具有不相关的非靶向scFv蛋白)的CAR-NK细胞群体相比时，通过根据本发明的方法获得的NK-CAR群体在其对表达该CAR-配体的靶细胞的作用方面更优越。

由此，本发明提供了一种用于制造用嵌合抗原受体(CAR)遗传修饰的NK细胞群体的方法，该方法包括在具有特定细胞因子混合物的培养基中转导CD34+干细胞。本发明的方法允许获得细胞群体，其中所得的CAR-NK细胞优于迄今已知的那些。

在第一实施例中，本发明提供了用于制造用嵌合抗原受体(CAR)遗传修饰的细胞群体的方法，该方法包括：

(i)第一步骤，包括：

a)提供包含CD34+造血干细胞的样品，

b)纯化所述样品中的CD34+造血干细胞，

c)在培养基I的存在下，培养这些纯化的CD34+造血干细胞，

d)用编码CAR的多核苷酸转导这些纯化的CD34+造血干细胞，由此获得包含表达所述CAR的CD34+干细胞的细胞群体，以及

e)任选地，在培养基I中培养这些细胞群体至少10小时、优选至少16小时、更优选至少24小时、更优选至少36小时、更优选至少48小时、更优选至少60小时、最优选至少72小时，其中

培养基I是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含白介素-7，和干细胞因子(SCF)、flt-3配体(FLT-3L)、血小板生成素(TPO)中的一种或多种，以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和白介素-6(IL-6)中的两种或更多种。

在步骤e)中，这些细胞在培养基I中培养，不添加包含所述多核苷酸的载体，而在步骤d)中，载体以规则间隔添加，优选地每12-36小时一次、更优选地每16-32小时一次、更优选地每20-28小时一次、最优选地每22-26小时一次。优选地，在步骤d)和步骤e)之间将这些细胞洗涤至少一次以处理游离病毒载体。

在一个优选的实施例中，用于转导和表达CAR的多核苷酸不编码CAR，该CAR对在造血干细胞、NK祖细胞、或NK细胞的细胞表面上，特别是在此类细胞的细胞表面上表达的抗原具有特异性，此类细胞存在于通过进行根据本发明的方法获得的培养物中。此类细胞上存在的抗原的实例是：CD34、CD56、CD44v6、CD94、NKG2A、NKG2D、CD16、KIR、CD38、CD123、CD33等。

换言之，所述多核苷酸编码CAR，该CAR对不在造血干细胞、NK祖细胞、或NK细胞的细胞表面上表达的抗原具有特异性，特别地，此类抗原不在任何一个存在于根据本发明的方法期间的培养物中此类细胞的细胞表面上表达此类细胞。不存在于此类细胞上并因此优选的此类抗原的典型实例是：CD3、CD19、EGFR、HSP70、OGD2、CD20等。

总共使用了以下三种不同培养基进行培养和转导：

培养基I是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含白介素-7(IL-7)，和干细胞因子(SCF)、flt-3配体(FLT-3L)、血小板生成素(TPO)中的一种或多种，以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和白介素-6(IL-6)中的两种或更多种。优选地，该细胞因子的集合包含IL-7，和SCF、FLT-3L和TPO中的两种或更多种，更优选地，该细胞因子的集合包含SCF、FLT-3L、TPO和IL-7。在一个优选实施例中，该细胞因子的集合包含GM-CSF、G-CSF、和IL-6。特别优选的是，该培养基I包含SCF、FLT-3L、TPO、IL-7、GM-CSF、G-CSF、和IL-6。

培养基II是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含SCF、FLT-3L白介素-15(IL-15)和IL-7中的两种或更多种，以及GM-CSF、G-CSF、和IL-6中的两种或更多种。优选地，该细胞因子的集合包含SCF、FLT-3L、IL-15和IL-7中的三种或更多种，更优选地，该细胞因子的集合包含SCF、FLT-3L、IL-15和IL-7。在一个优选实施例中，该细胞因子的集合包含GM-CSF、G-CSF、和IL-6。特别优选的是，该培养基II包含SCF、FLT-3L、IL-15、IL-7、GM-CSF、G-CSF、和IL-6。

培养基III是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含SCF、IL-7、IL-15和白介素-2(IL-2)中的两种或更多种，以及GM-CSF、G-CSF、和IL-6中的两种或更多种。优选地，该细胞因子的集合包含SCF、IL-7、IL-15、和IL-2中的三种或更多种，更优选地，该细胞因子的集合包含SCF、IL-7、IL-15和IL-2。在一个优选实施例中，该细胞因子的集合包含GM-CSF、G-CSF、和IL-6。特别优选的是，该培养基III包含SCF、IL-7、IL-15、IL-2、GM-CSF、G-CSF、和IL-6。

第一，本发明的方法提供了产生含有CD34+干细胞的细胞群体的条件，这些干细胞携带至少一种编码CAR的多核苷酸。根据以下步骤产生该细胞群体：

本发明的方法中使用的起始材料是含有成体(即，胚后期)干细胞(也称为体干细胞)的生物样品。如本文所用，术语生物样品意指源自人类的样品。在一个优选实施例中，待使用的起始材料是脐带血。

根据本发明的方法，从生物样品分离CD34+干细胞。本领域已知用于CD34+分离的不同方案，包括基于免疫磁性选择或细胞分选的方法。如本文所用，免疫磁性选择是指将抗体偶联至磁性颗粒，从而使得能够通过使用磁体分离抗原结构。

在一个优选实施例中，首先使用梯度分离或离心技术使生物样品富集单核细胞，并且然后通过用缀合至磁珠的特异性抗CD34+抗体标记细胞和使用磁柱纯化CD34+细胞来进行免疫磁性选择。在一个另外的优选实施例中，使用MidiMACS^TM分离器、

Plus仪器或CliniMACS

装置进行免疫磁性分离。

在本发明的方法的第一阶段期间，首先培养分离的CD34+干细胞，并且然后在包含细胞因子和生长因子的混合物的基本培养基存在下进行转导。转导前的培养时间可以是从几秒到4天或更长的任何时间范围。优选地，起始培养和转导之间的时间为30分钟至48小时，更优选地为60分钟至36小时，更优选地为2小时至24小时，最优选地为6小时至16小时。许多基本培养基是已知的。以下给出了选择，但是还有许多可能是适合的。基本培养基包括但不限于BEM(基本伊格尔培养基)、DMEM(杜氏改良的伊格尔培养基)、格拉斯哥极限必需培养基、M199基础培养基、HAM F-10、HAM F-12、伊思考夫(Iscove)DMEM、RPMI、莱博维茨氏(Leibovitz)L15、MCDB、McCoy 5A、StemSpan

和

Stemline I^TM和Stemline II^TM、格雷克斯迪姆(Glycostem)基础生长培养基(GBGM^TM)；X-Vivo10^TM、X-Vivo15^TM和X-Vivo20^TM等。也可以使用这些基本培养基的组合。优选地，在添加或不添加人血清的培养开始的时间点，使用无血清配制品，例如Stemline I^TM和Stemline II^TM、StemSpan

StemSpan

或X-Vivo10^TM、GBGM、X-Vivo15^TM和X-Vivo20^TM。本文给出的量典型地适合培养。这些量可以适合于开始培养时与其一起的细胞的不同量。在根据本发明的不同培养步骤中使用的培养基的血清含量可以变化，优选地，与细胞因子的不同组合一起在根据本发明的限定时间点处提供扩增培养基或分化培养基，或可替代地，扩增+分化培养基。

在分离时，按从500至2x10⁶个细胞/ml的浓度范围，将CD34+干细胞接种在容器中，例如板、烧瓶、细胞工厂或袋中。在一个优选实施例中，在步骤(i)c)中按浓度1x10⁶个细胞/ml接种细胞。在另一个优选实施例中，步骤c)中的细胞培养以在500与10,000个CD34⁺细胞/ml之间、更优选地在1,000与8,000个CD34+细胞/ml之间、更优选地在2,000与6,000个CD34+细胞/ml之间的细胞密度开始。本发明诸位发明人已经观察到以比以前更低的细胞密度接种细胞不仅在培养12-15天后导致造血干细胞或祖细胞的绝对增加，而且令人惊讶地发现进一步扩增和分化培养方法(如实例中和先前在WO 2017077096中所述的)导致扩增的进一步增加并且导致与以更密浓度培养CD34⁺干细胞的方法相比等同或更佳质量的NK细胞。在纯化步骤(i)b)之后从低密度细胞培养开始的一个另外优点在于，它能够培养从自动细胞分选仪获得的CD34⁺造血干细胞，而无需预先人工操作(例如，像离心和悬浮)为更小体积。这是因为自动细胞分选之后的细胞浓度在约500-10,000个CD34⁺细胞/ml的范围内，而常规地初始培养约100,000个CD34⁺细胞/ml或更多(Veluchamy等人,Front Immunol[免疫学前沿]2017,8:87；Roeven等人,Stem Cells and Development[干细胞和发育]2015,24(24):2886-2898)。这使得能够进一步自动化选择和培养过程，从而有益于标准化和获得上市许可。

在一个实施例中，将细胞接种在容器中，这些容器预先涂覆有纤连蛋白的片段，例如片段CH-296

或功能衍生物。当涂覆在细胞容器的表面时，

显著增强了病毒载体介导的基因转导入哺乳动物细胞。在一个优选实施例中，细胞容器涂覆有

一旦接种，CD34+干细胞在培养基I中培养。在一个优选的实施例中，培养基I包含以下浓度范围的一种或多种细胞因子：2-100pg/ml(优选地，5-50pg/ml，最优选地约10pg/ml)的GM-CSF，100至1000pg/ml(优选地，150至500pg/ml，最优选地约250pg/ml)的G-CSF，4ng/ml至300ng/ml(优选地，10至100ng/ml，最优选地约25ng/ml)的SCF，4ng/ml至300ng/ml(优选地，10至100ng/ml，最优选地约25ng/ml)的Flt3-L，4ng/ml至100ng/ml(优选地，10至50ng/ml，最优选地约25ng/ml)的TPO，5-500pg/ml(优选地，25-100pg/ml，最优选地，约50pg/ml)的IL-6，和/或4ng/ml至100ng/ml(优选地，10至50ng/ml，最优选地约25ng/ml)的IL7。在本发明的一个更优选方面，培养基包含浓度为约25ng/ml SCF、约25ng/ml Flt3-L、约25ng/ml TPO、约250pg/ml G-CSF、约10pg/ml GM-CSF、约50pg/ml IL-6、和约25ng/mlIL7的细胞因子。在此背景下，“约”意指约20％，优选地10％、更优选地5％、最优选地2％的偏差。优选地，培养基I包含0.5％-10％血清、更优选地1％-5％血清、最优选地约2％血清。优选地，血清是人血清。

在开始培养和任选地培养这些细胞至少10分钟(优选地至少1小时、更优选地至少2小时、更优选地至少16小时或更长时间)的步骤之后，将CD34+干细胞遗传修饰为表达至少一种编码CAR的多核苷酸。用来进行干细胞的遗传工程化的技术是病毒转导。如本文所用，术语转导或病毒转导是指使用病毒载体将外源多核苷酸引入到细胞的基因组中。术语病毒载体用于指介导核酸转移的病毒颗粒。在本发明的一个优选方面，待用于转导的病毒载体选自逆转录病毒载体或仙台(Sendai)病毒载体。特别有用的逆转录病毒载体是慢病毒载体。仙台载体特别有用，因为它在细胞质中复制，不具有DNA形式，并且可以高效感染而没有基因组插入的风险。慢病毒载体特别适用于分裂和非分裂细胞的高效转导。

根据本发明的方法，通过在培养基I存在下，将CD34+干细胞与携带至少一种编码CAR的多核苷酸的病毒载体一起孵育来进行转导。在一个实施例中，通过用含有携带编码CAR的多核苷酸的病毒载体的新鲜培养基I取代至少一半的培养基来进行孵育。

在另一个实施例中，通过将CD34+干细胞重新悬浮于含有携带编码CAR的多核苷酸的病毒载体的新鲜培养基I中，然后以500至10x10⁶个细胞/ml(优选地1,000至2x10⁶个细胞/ml、更优选地2000至1x10⁶个细胞、最优选地5000至5x10⁵个细胞/ml)的浓度范围将此重悬浮液接种到细胞容器中来进行孵育。

在本发明的另一个方面，细胞容器可以涂覆有

取决于载体的性质，病毒载体可以与不同浓度的CD34+干细胞一起孵育。优选地，通过孵育感染复数(MOI)范围为0.01至100的病毒载体来进行转导。MOI是病毒载体颗粒数量与限定的空间内存在的靶细胞数量的比率。在一个优选实施例中，这些病毒载体在0.1至50(更优选地1至10)的MOI范围内孵育。在转导运行期间，CD34+干细胞可以与病毒载体一起孵育5至48小时(优选地10-24小时、更优选地12-20小时)的时间段。根据本发明方法的转导阶段可以包括一个或多个转导运行。在一个优选实施例中，提供了根据本发明的方法，其中步骤(i)d)和(i)e)至少重复一次，导致至少两次转导运行，其中，CD34+干细胞与包含编码所述CAR的所述多核苷酸的病毒载体一起孵育。

转导导致产生含有CAR-CD34+干细胞的细胞群体，这些干细胞携带至少一种编码CAR的多核苷酸。

在具体实施例中，我们产生针对BCMA(用于治疗多发性骨髓瘤)和EGFR(用于治疗转移性结肠直肠癌、转移性非小细胞肺癌和头颈癌)的特异性CAR。

BCMA(来源：专利US 2016/0046724 A1)：

EGFR(来源：西妥昔单抗抗体序列)：

可以将如此获得的含有CAR-CD34+干细胞的细胞群体在新鲜培养基I存在下再培养至少一天，然后移至制造方法的第二阶段。

在另一个实施例中，可以在转导结束时冷冻含有CAR-CD34+干细胞的细胞群体。在另一个实施例中，可以将细胞群体在新鲜培养基I存在下再培养至少一天，并且然后可以冷冻。

可以在转导结束后或在培养一天或多天后，或在冷冻的含有CAR-CD34+干细胞的细胞群体解冻后，继续进行制造。优选地，在培养基I中，在总共至少7个培养日后，进行第二培养阶段。

本发明的一个实施例提供了通过本发明的方法的步骤i可获得的含有CAR-CD34+干细胞的细胞群体。

如此获得的CAR-CD34+干细胞可以通过对该表达的CAR进行阳性选择来纯化。阳性选择可以通过针对表达的CAR或针对与CAR共表达且通常不由CD34+细胞表达的可选择蛋白的抗体进行。由此，能够阳性地选择表达CAR的干细胞。

如前所述，优选地，其中发生转导的培养条件(即在培养基I中培养)继续持续总共至少7天，即包括在转导前培养、在转导运行1和2期间培养、和在转导后培养。此后，优选地开始第二阶段，该第二阶段包括扩增并且分化成NK细胞。

在一个优选实施例中，提供了一种根据本发明的方法，该方法进一步包括：

(ii)第二步骤，其中，来自步骤(i)的细胞群体被扩增并分化成含有CAR-NK细胞的细胞群体，该步骤包括在培养基III中培养来自步骤(i)的含有CAR-CD34+干细胞的细胞群体，由此获得含有CAR-NK细胞和祖CAR-NK细胞的细胞群体，其中该培养基III是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含SCF、IL-7、IL-15和白介素-2(IL-2)中的两种或更多种，以及GM-CSF、G-CSF、和IL-6中的两种或更多种。

替代性地，提供了一种根据本发明的方法，该方法进一步包括：

(ii)第二步骤，其中，来自步骤(i)的细胞群体被扩增并分化成含有CAR-NK细胞和祖CAR-NK细胞的细胞群体，该步骤包括在培养基II中培养来自步骤(i)的CAR-CD34+干细胞，由此获得含有CAR干细胞和CAR祖细胞的细胞群体，以及

(iii)第三步骤，其中，来自步骤(ii)的细胞群体被进一步扩增并分化成含有CAR-NK细胞和祖CAR-NK细胞的细胞群体，

其中培养基II是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含SCF、FLT-3L白介素-15(IL-15)和IL-7中的两种或更多种，以及GM-CSF、G-CSF、和IL6中的两种或更多种，并且

其中培养基III是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含SCF、IL-7、IL-15和白介素-2(IL-2)中的两种或更多种，以及GM-CSF、G-CSF、和IL-6中的两种或更多种

由此，从以上两段中可以推断出，使用培养基II的培养步骤是任选的，并且旨在获得更多CAR-干细胞或CAR-NK祖细胞，从而进入旨在分化的用培养基III的培养步骤。

在一个实施例中，本发明由此提供了一种用于制造NK细胞和祖NK细胞的群体的方法，该方法包括：

(i)第一步骤，包括：

a)提供包含CD34+造血干细胞的样品，

b)纯化所述样品中的CD34+造血干细胞，

c)在培养基I的存在下，培养这些纯化的CD34+造血干细胞，

d)引入编码CAR的多核苷酸，由此获得包含表达所述CAR的CD34+干细胞的细胞群体，以及

e)任选地，在培养基I中培养该细胞群体至少一天，其中

(ii)任选的第二步骤，其中来自步骤(i)的细胞群体被扩增并分化成含有CAR-NK细胞和祖CAR-NK细胞的细胞群体，该步骤包括在培养基II中培养来自步骤(i)的CAR-CD34+干细胞，由此获得含有CAR干细胞和CAR祖细胞的细胞群体，以及

(iii)第三步骤，其中来自步骤(i)或来自步骤(ii)的细胞群体被进一步扩增并分化成含有CAR-NK细胞和祖CAR-NK细胞的细胞群体，

其中培养基III是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含SCF、IL-7、IL-15和白介素-2(IL-2)中的两种或更多种，以及GM-CSF、G-CSF、和IL-6中的两种或更多种。

在该任选的步骤中，将收集自步骤(i)的细胞在培养基II中以在至少0.5x10⁶ml的细胞密度培养至少4天，由此获得含有定型为NK细胞谱系的多种CAR祖细胞的培养的CAR干细胞、CAR祖细胞或两者的集合。

在该第二培养阶段，使用培养基I进行的培养步骤后得到的含有CAR-CD34+干细胞的细胞群体、或使用培养基II进行的培养步骤后得到的含有CAR-干细胞或CAR-NK-祖细胞的细胞群体是在培养基III中以至少1×10⁶/ml的细胞密度培养至少7天，由此获得含有多个CAR-NK细胞或CAR-NK祖细胞或两者的培养细胞的集合。

在一个优选实施例中，培养基II包含以下浓度范围的细胞因子中的一种或多种：50pg/ml至1000ng/ml(优选地，150至400ng/ml)的G-CSF，2-100pg/ml(优选地，5-25ng/ml)的GM-CSF，4-300ng/ml(优选地，10-100ng/ml)的SCF，4ng/ml至300ng/ml(优选地，10ng/ml至100ng/ml)的Flt3-L，4ng/ml至300ng/ml(优选地，10ng/ml至100ng/ml)的IL15，2pg/ml至500pg/ml(优选地，20pg/ml至200pg/ml)的IL-6，和/或4ng/ml至100ng/ml(优选地，10ng/ml至50ng/ml)的IL7。在本发明的一个更优选方面，培养基II包含浓度为约10pg/ml GM-CSF、约250pg/ml G-CSF、约25ng/ml SCF、约25ng/ml Flt3-L、约20ng/ml IL-15、约50pg/ml IL-6、和约25ng/ml IL7的细胞因子。在此背景下，“约”意指约20％，优选地10％、更优选地5％、最优选地2％的偏差。优选地，培养基II包含4％-20％血清、更优选地6％-15％血清、最优选地约10％血清。优选地，血清是人血清。在一个优选实施例中，培养基III包含以下浓度范围的细胞因子中的一种或多种：50pg/ml至1000ng/ml(优选地，150至400ng/ml)的G-CSF，2-100pg/ml(优选地，5-25ng/ml)的GM-CSF，4-300ng/ml(优选地，10-100ng/ml)的SCF，200U/ml至5000U/ml(优选地，500至2000U/ml)的IL-2，4ng/ml至300ng/ml(优选地，10至100ng/ml)的IL15，2至500pg/ml(优选地，20至200pg/ml)的IL-6，和/或4ng/ml至100ng/ml(优选地，10至50ng/ml)的IL7。在本发明的一个更优选方面，培养基III包含浓度为约10pg/mlGM-CSF、约250pg/ml G-CSF、约20ng/ml SCF、约20ng/ml IL-15、约50pg/ml IL-6、约1000U/ml IL-2、和约20ng/ml IL7的细胞因子。在此背景下，“约”意指约20％，优选地10％、更优选地5％、最优选地2％的偏差。优选地，培养基II包含4-100μg/ml肝素、优选地10-40μg/ml肝素、更优选地约20μg/ml肝素。优选地，培养基III包含0.5％-10％血清、更优选地1％-5％血清、最优选地约2％血清。优选地，血清是人血清。

嵌合抗原受体

用于本发明的方法的病毒载体携带至少一种编码CAR的多核苷酸。用于本发明的方法的CAR是重组嵌合受体，这些重组嵌合受体包含：

(i)细胞外部分：这部分由负责将CAR分泌到细胞膜外部的信号肽组成。紧接着该信号序列的是靶向性或抗原特异性结合域。该域由以高特异性结合抗原的多肽序列组成。该域可以由具有高特异性的任何类型的抗体(单克隆、多克隆、单链、或多链抗体)组成。最常见的是，单链可变片段(scFvs)用于传递CAR特异性。靶向结构域之后是铰链区以及间隔子结构域，铰链区赋予CAR柔性，间隔子结构域通常是IgG1重链的恒定区。

(ii)跨膜部分：这部分将CAR固定到NK细胞膜中

(iii)细胞质部分：这部分包含各种激活和共刺激域。这些域在scFv与其靶标结合后将信号传递到细胞内信号传导途径。

术语肿瘤抗原包括在肿瘤细胞(例如，但不限于生物标记，或肿瘤细胞上发现的且基本上不存在于正常组织上或其表达限制在非重要正常组织中的细胞表面标记)上表达的抗原。“基本上不存在”是指至少在重要的正常细胞上的表达水平如此之低，以至于CAR-NK细胞显示出与所述正常细胞的结合相对少，因此毒性低。

本发明进一步提供了包含通过本发明的方法可获得的CAR-NK细胞的组合物。出人意料地发现，适用于用携带嵌合抗原受体的病毒载体转导干细胞的条件对含有CAR-CD34+干细胞的细胞群体的性质和组成具有影响，并且对源自扩增阶段和分化阶段的含有CAR-NK细胞的最终细胞群体具有影响。根据本发明的方法可获得的CAR-NK细胞呈现了NK细胞和CAR之间的协同治疗效果。此类效果导致强于用不同制造方法获得的效果。因此，本发明进一步提供了含有通过本发明的方法可获得的CAR-NK细胞的组合物，用于在医学中使用、更优选地用于在免疫疗法中使用、特别是用于治疗肿瘤和血液恶性肿瘤。

术语“免疫疗法”表示使用人的免疫系统的某些部分来对抗疾病(例如癌症)的治疗。免疫系统的部分可以来自患有疾病的人，但还可以来自另一个人，称为“供体”，例如本发明中的情况。用于根据本发明使用的组合物优选地用于基于细胞的免疫疗法，其中将源自自体的、非单倍体相同的供体的免疫效应细胞施用至有需要的接受者。

本发明优选使用由GMP顺应性培养系统产生的细胞用于例如从脐带血(UCB)来源的CD34+祖细胞(优选地没有T细胞污染)产生大批的免疫效应细胞。使用此类细胞是有利地，因为它们具有更高的一致性，使得例如调控过程容易得多。同时，本发明使得能够使用此类大批的免疫效应细胞，这是因为先前出于安全方面的考虑，必须基于与设想的接受者至少部分匹配而产生单个批次。然而本发明显示，如本发明定义的免疫效应细胞(超出单倍体相同的错配)可安全用于免疫疗法并且它们显示出功效。

优选地，用于根据本发明使用的组合物进一步包含至少一种赋形剂，例如像用于输注的水、生理盐溶液(0.9％NaCl)、或细胞缓冲液，优选地由经蛋白组分(例如人血清白蛋白(HAS))取代的生理盐溶液组成。

为了使用本发明的组合物，例如，在非单倍体相同的错配的情况下，优选的是用于根据本发明使用的组合物中B细胞或T细胞数目低，从而避免移植物抗宿主病。在一个优选实施例中，用于根据本发明使用的组合物并不导致移植物抗宿主病。优选地，该组合物包含不多于5％T细胞和不多于5％B细胞，更优选地不多于2％T细胞和不多于2％B细胞，最优选地少于1％T细胞和少于1％B细胞。

在一个优选实施例中，提供了用于根据本发明使用的组合物，其中免疫效应细胞除了对CAR呈阳性外，还对神经细胞黏附分子(NCAM)呈阳性。

神经细胞黏附分子(NCAM)是在神经元、神经胶质、骨骼肌和自然杀伤细胞的表面上表达的免疫球蛋白(Ig)超家族的糖蛋白。NCAM(也称为CD56)已经被认为在细胞-细胞黏附、神经突增生、突触可塑性、以及学习和记忆方面具有作用。优选地，NCAM用于定义用于根据本发明使用的分化的免疫效应细胞的群体，并且可以用于将输注的效应细胞与患者外周血中的自然杀伤细胞区分。优选地，用于根据本发明使用的组合物包含多于90％CD56+细胞，更优选地多于95％CD56+细胞，最优选地多于98％CD56+细胞。

典型地，本发明的组合物包含多种细胞。组合物中的所有细胞不是必须具有本发明定义的特征和效果。然而，优选的是在用于根据本发明使用的组合物中具有如本发明中定义的至少某一百分比的免疫效应细胞，从而在效率(在生产期间)和功效(在临床中)之间达到正确的平衡。在一个优选实施例中，提供了用于根据本发明使用的组合物，其中该组合物包含多种细胞，其特征在于，该多种细胞中30％-100％、优选地30％-90％、更优选地30％-80％、更优选地30％-70％、更优选地30％-60％、更优选地30％-50％、最优选地30％-40％是如本发明定义的CAR-NK细胞。优选地，包含多种细胞的组合物的特征在于该多种细胞中40％-100％、更优选地50％-100％、更优选地60％-100％、更优选地70％-100％、更优选地80％-100％、最优选地90％-100％是如本发明定义的CAR-NK细胞。在用于根据本发明使用的组合物内，如本发明定义的CAR-NK细胞的其他优选范围是：40％-90％、50％-90％、60％-90％、70％-90％、80％-90％、40％-80％、50％-80％、60％-80％、40％-70％、40％-60％、50％-60％或40％-50％。出于生产效率，如本发明定义的更低百分比的CAR-NK细胞是希望的，而另一方面，出于临床功效和调控原因，如本发明定义的更高百分比的CAR-NK细胞是希望的。

从调控角度而不是从效率角度来看，优选的是从单个供体获得用于根据本发明使用的组合物。甚至更优选的是，单一供体提供了多于一个治疗剂量，使得大规模批次可以生产、批准或认证，并且在必须用根据本发明使用的组合物治疗随机个体的情况下可以成品使用。优选地，CAR-NK细胞的产生足以用于根据本发明使用的至少10个、更优选地至少20个、更优选地至少50个、更优选地至少100个、最优选地至少200个或更多个单次治疗剂量。如果例如，约5x10⁸-1x10¹⁰个细胞将用于单次治疗，则优选的是，用于治疗，例如10个个体，至少10¹¹个免疫效应细胞从一个单一供体的CD34阳性干细胞或祖细胞产生。由此产生的大批量细胞可以很容易地转移到小瓶或袋中，每个小瓶或袋中具有正确数量的细胞(例如，约5x10⁸-1x10¹⁰个细胞)，然后小瓶或袋被冷冻并且储存。当需要用于根据本发明使用的组合物时，可以将此类小瓶中的一个或此类袋中的一个解冻并制备以施用于需要免疫疗法的个体。在一个优选实施例中，提供了用于根据本发明使用的组合物，其中多种细胞源自从单个供体获得的细胞。优选地，该多种细胞源自脐带血和骨髓(因为这些是CD34阳性干细胞和/或祖细胞的丰富来源)中的至少一种。

由于可能使用包含CAR-NK细胞的成品组合物，用于根据本发明使用的组合物将细胞过继性疗法从个性化医学向更通用的药物进一步推进，因为不再需要寻找单个供体来匹配单个接受者。这还有益地影响了治疗的成本。

如本文所用的“成品(off-the-shelf)”意指制备并且储存以在需要时直接使用这种组合物。具体地，可用于“成品”的组合物不是针对一个特定接受者产生，而是通常可以在不同时间点用于不同接受者。例如，如本发明定义的组合物可以冷冻，并且当需要时，如本发明定义的解冻和使用。如本发明定义的组合物使得能够实现大规模生产GMP产生的免疫效应细胞，这些免疫效应细胞理论上可以在任何随机接受者需要时的几分钟内提供。

在一个实施例中，本发明提供了一种包含CAR-NK细胞的组合物，其中该组合物在包含以下步骤的过程中离体产生：

(i)第一步骤，包括：

a)提供包含CD34+造血干细胞的样品，

b)纯化所述样品中的CD34+造血干细胞，

c)在培养基I的存在下，培养这些纯化的CD34+造血干细胞，

e)任选地，在培养基I中培养该细胞群体至少一天，其中

可以按任何可能的方式获得包含造血干细胞和/或祖细胞的样品组合物，该方式例如，像获得或收集含有干细胞和/或祖细胞的细胞来源，例如骨髓、脐带血、胎盘材料、外周血、用干细胞动员剂治疗的人的外周血、使用细胞培养步骤从胚胎干细胞或其任何衍生物离体产生的外周血、或使用细胞培养步骤从诱导性多能干细胞及其任何衍生物离体产生的外周血。可以使用亲和纯化方法，从含有此类干细胞和/或祖细胞的细胞来源进一步纯化造血干细胞和/或祖细胞。

术语“离体”意指过程或方法并不是在活的个体内进行的，而是例如在能够培养细胞的装置内、优选地是开放或者封闭的细胞培养装置(例如培养瓶、一次性袋或生物反应器)中进行。

术语“CD34+干细胞”意指在细胞表面上表达CD34抗原的多能干细胞，优选地是能够发育成所有特定类型的血液细胞的干细胞，并且更优选地是可以产生血统的谱系特异性祖细胞的细胞。

术语“CD34+祖细胞”意指在细胞表面上表达CD34抗原的多能祖细胞，优选地是能够发育成各种类型的血液细胞的祖细胞，并且更优选地是可以产生某些血统的谱系特异性祖细胞的细胞。

如本文所用的术语“亲和纯化”意指通过以下方法标记待纯化的细胞：例如出于分离目的靶向特定目的表位，例如用与适合由分离方法检测的药剂偶联的抗体靶向抗原，使用例如与用于纯化方法(例如荧光激活细胞分选(FACS))的荧光染料偶联的抗体，和/或使用例如与用于磁性选择程序的磁性颗粒偶联的抗体。亲和纯化方法是本领域已知的，并且例如可以是基于(例如抗原和抗体之间的、酶和底物之间的、或受体和配体之间的)高特异性相互作用分离生物化学混合物的任何方法。

如本文所用的术语“扩增”意指由于由细胞培养步骤引起的细胞分裂事件造成的细胞扩增，优选地基本上不改变细胞的表型(这通常称为分化)。短语“基本上不改变细胞的表型”意指细胞优选地并不改变其功能、其细胞表面标记和/或其形态学。

如本文所用的术语“分化”意指改变细胞的表型，这意味着在细胞培养过程期间改变某些细胞表面分子的表达、改变细胞功能和/或改变细胞的形态学，其中优选地，细胞由于添加了细胞培养基而仍然可以扩增。如先前所示，发明人已经表明，用于如本发明定义的免疫疗法的组合物对于治疗肿瘤而言是特别有用的。根据一个优选实施例，用于根据本发明使用的组合物被用于治疗肿瘤。在本发明的意义内，肿瘤包括造血系统肿瘤或实体肿瘤。肿瘤可以是恶性的或良性的。

用于在根据本发明的免疫疗法中使用的组合物可以用于治疗肿瘤的不同阶段，特别是在治疗造血系统肿瘤(例如像急性骨髓性白血病(AML))中。例如，如本发明例示的，组合物优选地可以在无法进行骨髓移植的那些(老年)患者中用作巩固疗法。另外，如使用另一种治疗的其他实例所示，根据本发明的免疫效应细胞疗法优选地可以用于诱导疗法未完全缓解的患者(难治性患者)或在诱导疗法后很短时间复发的那些患者(复发性患者)。将免疫效应细胞疗法并入其他巩固疗法也是可行并且优选的，例如在同种异体HSTC方案中，另外使用如本发明定义的免疫效应细胞。

在一个优选实施例中，提供了用于根据本发明使用的组合物，其中待在一次治疗中施用的组合物包含至少5x10⁵个细胞，并且不多于5x10¹¹个细胞。

可以通过任何可接受的方法施用本发明的组合物，条件是免疫效应细胞能够达到其在个体中的靶标。例如，可以经由静脉内途径或经由局部途径(包括但不限于眼部、皮肤、肺部、经颊和鼻内途径)施用本发明的组合物。如本文所用的局部途径还意指任何直接局部施用(例如像在骨髓中)，但也指直接注射入例如实体肿瘤中。在特定情况下，例如，如果免疫疗法旨在影响胃肠道的粘膜层，则可以使用口服途径。

优选地，提供了用于根据本发明使用的组合物，其中通过静脉内途径或通过局部途径或通过口服途径或通过这些途径的任何组合来施用组合物。如本文使用的术语“局部”意指局部地、优选地在肿瘤部位(可以位于任何解剖学部位中，更具体地，肿瘤可以位于骨髓或任何其他器官中)施用免疫效应细胞。可以施用一次用于根据本发明使用的组合物，但是如果认为有必要，则可以多次施用组合物。这些可以是一天多次、一周多次或甚至一月多次。还可能的是，首先等待第一次施用(例如输注)的临床结果，并且如果认为有必要，在组合物无效的情况下进行第二次施用，并且甚至进行第三次施用、第四次施用等等。

在一个优选实施例中，提供了用于根据本发明使用的组合物用于治疗肿瘤，其中肿瘤是造血肿瘤或淋巴肿瘤，或者其中肿瘤是实体肿瘤。

术语“血液肿瘤”、“造血肿瘤”或“淋巴肿瘤”意指这些是造血组织或淋巴组织的肿瘤。造血恶性肿瘤和淋巴恶性肿瘤是影响血液、骨髓、淋巴、和淋巴系统的肿瘤。

在肿瘤是造血系统肿瘤或淋巴肿瘤的那些情况下，提供了用于根据本发明使用的组合物，其中肿瘤是以下中的一种或多种：白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征或骨髓瘤，优选地选自以下的白血病、淋巴瘤或骨髓瘤：急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性T细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性单核细胞白血病(AMoL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、组织细胞性淋巴瘤或多发性骨髓瘤，优选地AML。

在肿瘤是实体肿瘤的那些情况下，提供了用于根据本发明使用的组合物，其中肿瘤是以下中的一种：腺癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌、未分化癌、大细胞癌或小细胞癌、肝细胞癌、肝母细胞瘤、结肠腺癌、肾细胞癌、肾细胞腺癌、结肠直肠癌、结肠直肠腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌、肺癌、乳腺癌、默克尔细胞癌、横纹肌肉瘤、恶性黑色素瘤、表皮样癌、肺癌、肾癌、肾腺癌、乳房癌、乳房腺癌、乳腺导管癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、口腔癌、肛门癌、皮肤癌、尤因肉瘤、胃癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、维尔姆斯瘤(Wilmstumour)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、胰腺癌、胰腺腺癌、子宫颈癌、鳞状细胞癌、髓母细胞瘤、前列腺癌、结肠癌、结肠腺癌、移行细胞癌、骨肉瘤、导管癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、卵巢腺癌、卵巢畸胎瘤、膀胱乳头状瘤、成神经细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、上皮样癌、黑色素瘤或视网膜母细胞瘤的恶性赘生物或转移性诱导性继发性肿瘤。

在一个优选实施例中，提供了用于根据本发明使用的组合物，其中实体肿瘤选自宫颈癌的恶性赘生物或转移性诱导性继发性肿瘤，这些宫颈癌选自：腺癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌、子宫颈癌、小细胞癌、和黑色素瘤。在另一个优选实施例中，提供了用于根据本发明使用的组合物，其中实体肿瘤选自结肠直肠癌症的恶性赘生物或转移性诱导性继发性肿瘤，这些结肠直肠癌症选自：腺癌、鳞状细胞癌、结肠腺癌、结肠直肠癌、结肠直肠腺癌、结肠癌、和黑色素瘤。

相对于迄今为止已知的治疗选择，本发明的组合物具有若干优点。本发明的组合物是有利地，不依赖于HPV类型、肿瘤病史、肿瘤EGFR表达和KRAS状态。除此之外，本发明的免疫效应细胞还克服了HLA-E、HLA-G和(IDO)抑制，由此导致针对肿瘤(尤其是针对宫颈癌和结肠直肠癌症)的增强的抗肿瘤效果。

如通常所述，术语“表皮生长因子受体”或EGFR是指在几乎所有健康组织中广泛表达的细胞表面蛋白。EGFR蛋白由跨膜糖蛋白编码，并且是蛋白激酶家族的成员。EGFR的过表达及其下游信号传导途径中的突变与若干实体肿瘤(像结肠、肺和子宫颈)中的不良预后相关联。

术语柯尔斯顿(Kirsten)大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)是指主动参与调控正常组织信号传导(EGFR下游信号传导途径的一部分)的基因。然而，已报道了KRAS基因在结肠、直肠和肺的实体肿瘤的肿瘤细胞中的突变。发生在超过50％的结肠直肠癌症患者中的这些激活突变帮助肿瘤细胞逃避EGFR靶向药物，像西妥昔单抗和帕尼单抗。

如本文使用的术语“人乳头状瘤病毒(HPV)”是指在女性中引起宫颈癌的病毒组。HPV病毒影响嘴、喉、外阴、子宫颈和阴道周围的皮肤和湿膜。HPV感染引起会导致子宫颈中癌症的异常细胞变化。

如本文使用的术语吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)是指在将氨基酸L-色氨酸降解为N-甲酰犬尿氨酸中充当催化剂的酶。报道了IDO通常在前列腺、胃、卵巢、子宫颈和结肠的实体肿瘤中过表达，使得肿瘤细胞能够逃避被细胞毒性T细胞和NK细胞杀伤。

在以下非限制性实例中更详细地描述了本发明。

附图说明

图1：我们设计了模块化CAR分子，该分子允许通过单克隆程序轻松掺入新的scFv蛋白。FseI-SbfI侧翼填充片段允许轻松地将靶向分子无缝克隆到空的CAR骨架中。如图1b和图1c所示，我们将scFv蛋白插入该空间，这些scFv蛋白将转导的NK细胞分别靶向BCMA+或EGFR+肿瘤细胞。图1d展示了对照载体，该对照载体包含对任何人类蛋白都没有结合亲和力的不相关的scFv。IgD铰链区赋予CAR柔性，而优化的IgG1重链序列充当间隔区。CAR通过deCD28跨膜序列固定到膜中。该第三代CAR包含CD28和OX-40的共刺激结构域以及CD3ζ的激活结构域。图1e示出了每个结构域相对于细胞膜的位置。箭头指示独特的限制性位点，该限制性位点可用于掺入scFv(经由FseI和SbfI)、将CAR转移到慢病毒转移质粒(CAR两侧的箭头)或改变共刺激或激活结构域(每个结构域两侧的箭头)。

图2：来自使用两个供体的两种不同培养条件的流式细胞术数据的代表性实例。对在CD45+淋巴细胞上的活细胞进行门控。该图展示了如果根据本发明中描述的技术扩增和分化造血干细胞和祖细胞，CD44v6在NK细胞(A)和祖细胞(B)上的表达。A.第29天oNKord细胞的CD44v6表达(％CD56：92％)，B.第14天oNKord祖细胞的CD44v6表达(％CD56：1.2％)

图3：CD34+细胞中的转导效率。以MOI 20将CD34+HSC细胞用包含EGFP的VSV-G假型慢病毒颗粒转导。随后在扩增/分化培养基中扩增细胞29天，并通过流式细胞术确定EGFP阳性细胞的百分比。三个不同的供体用于转导，测量以一式三份进行，示出平均值±SD。

图4：源自CD34+HSC的前体的转导。在扩增/分化培养基中培养21、28、和34天后，以MOI 20用包含EGFP的VSV-G假型慢病毒颗粒转导源自CD34+HSC(NK)的前体细胞。转导后，随后在分化培养基中保持这些细胞6天，并通过流式细胞术确定EGFP阳性细胞的百分比。三个不同的供体用于转导，测量以一式两份进行，示出三个不同供体的平均值±SD。

实例

实例1：产生第三代CAR构建体

这些实例中使用的CAR构建体是通过ID&T DNA技术合成产生的，作为具有侧翼限制性位点的单个多核苷酸，可以轻松转移到合适的表达载体中。CAR表达盒是完全人类密码子，其经优化用于在人类细胞中有效表达。该载体由CD8a信号肽、FseI-SbfI侧翼填充片段、IgD铰链区、IgG1重链恒定片段、CD28跨膜结构域、CD28共激活结构域、OX40共激活结构域和CD3ζ激活结构域组成，其中该IgG1重链恒定片段被优化以避免与IgG Fcγ受体结合，从而抑制先天性免疫细胞的无意激活(Hombach等人,Gene Therapy[基因治疗],2010)。每个(共)激活结构域的两侧都有独特的限制性位点，允许测试每个单独的域。

在图1中示出了该CAR盒的示意性版本。

该CAR盒的蛋白质序列如下所示：

CD8a前导序列：

FseI-SbfI侧翼填充片段：

IgD铰链区：

优化的IgG1重链Fc部分，优化为：

CD28跨膜结构域：

CD28共激活结构域：

OX40共激活结构域：

CD3ζ激活结构域：

为了产生针对BCMA(用于治疗多发性骨髓瘤)和EGFR(用于治疗转移性结肠直肠癌、转移性非小细胞肺癌和头颈癌)的特异性CAR，我们通过无缝克隆用填充片段替换针对BCMA和EGFR的单链可变片段蛋白质序列。

BCMA(来源：专利US 2016/0046724 A1)：

EGFR(来源：西妥昔单抗抗体序列)：

整个CAR盒(包括相关的ScFv序列)通过CAR盒两侧的独特限制性位点插入到第三代慢病毒骨架质粒中。在该载体中，EF1α启动子驱动该CAR多核苷酸的组成型表达。

在HEK293T细胞中通过转染第3代辅助质粒并结合该选择的包含编码该CAR的多核苷酸的慢病毒转移质粒产生病毒载体。转染后24小时，用补充有10％FBS的基础培养基补充细胞，并在5％CO₂和37摄氏度下孵育。48小时后，进行第一次病毒载体收获，并用上述培养基补充生产细胞。再过24小时后，进行第二次也是最后一次收获。

接下来，将两种收获物合并，通过0.22um或0.45um PES过滤器过滤，并用苯佐纳酶(50U/ml)处理以去除任何剩余的质粒DNA。接下来，通过PEG6000沉淀浓缩病毒上清液。简而言之，将病毒上清液与4x沉淀缓冲液(由0.5M NaCl和7.5％PEG6000组成)混合并在4摄氏度下以7000x g离心20分钟。接下来，去除上清液，混合物重新悬浮于适当的培养基中，并且立即用于下游转导或储存在-80摄氏度以供以后使用。

本文中，我们区分了4种不同的生长培养基：

实例2：通过慢病毒载体转导CD34⁺造血干细胞

在本发明方法的第一阶段，CD34+干细胞通过免疫磁性分离技术从起始材料中分离出来，并且随后被包含一个或多个编码CAR的多核苷酸的慢病毒载体转导，产生CAR-NK细胞。目标是获得在本发明方法的第二阶段扩增的稳定的CAR-NK细胞群体。

起始材料

本发明的方法中使用的起始材料是含有成体(胚后期)干细胞(也称为体干细胞)的生物样品。如本文所用，术语生物样品意指源自人类的样品。在一个优选实施例中，待使用的起始材料是脐带血。

CD34+干细胞群体的分离

CD34+干细胞通过Miltenyi

封闭系统细胞制造平台从脐带血中分离出来。简而言之，经由CD34-缀合的磁珠通过磁分离纯化细胞。最终产物是纯CD34+群体，该纯CD34+群体收集在培养基I中，并用于扩增和/或分化、转导或在冰箱中按照受控温度分布曲线冷冻。

转导CD34+细胞以获得CAR-NK群体

分离或解冻后，立即计数CD34+干细胞，之后立即以1-50的MOI重新悬浮于实例1中制备的病毒原液中，并铺板在重组人纤维连接片断(Retronectin)涂覆的板上。任选地，转导效率可以通过添加10ug/ml聚凝胺或10ug/ml硫酸鱼精蛋白来提高。

包括对照细胞，我们区分：

任选地，转导后24小时，将这些细胞用选定的培养基洗涤并以相同的MOI重新转导。孵育24小时后，用培养基II补充这些细胞。

实例3：CAR-CD34+细胞的扩增和分化

细胞培养

直接培养条件A-D的转导细胞，或者如果冷冻保存的转导CAR和条件A-D的模拟物祖细胞在由补充有2.5mM MgCl2和0.13mg/ml DNA酶的人血清白蛋白组成的解冻缓冲液中解冻。将CD34+UCB细胞在A-D条件下以0.02-2x10^6个细胞/ml的细胞浓度铺板在新鲜培养基I中的经组织培养处理的6孔板中。

扩增阶段

在扩增阶段中测量细胞活力、CD34含量和CAR表达的流式细胞术数据，以监测和提供最佳细胞培养条件。在新鲜的培养基I(由以下组成：补充有10％人血清的GBGM、低剂量细胞因子混合物(含有10pg/ml GM-CSF，250pg/ml G-CSF和50pg/ml IL-6)、25ng/ml SCF、Flt-3L、TPO、IL-7)中培养CD34+UCB细胞。条件A-D的细胞在培养基I中培养至第9天。每周每2-3天更换培养基I。在第10天，通过添加培养基II(在此用25mg/ml TPO替换20ng/ml IL-15)培养祖细胞。

分化阶段

在分化期间，测量作为NK细胞的标记的CD56含量，而不是CD34含量以及细胞活力和CAR表达。分化培养基(aka培养基III)由以下组成：补充有2％人血清的GBGM、低剂量细胞因子混合物(含有10pg/ml GM-CSF，250pg/ml G-CSF和50pg/ml IL-6)、20ng/ml SCF、IL-15、IL-7和1000U/ml IL-2(阿地白介素(Proleukin))。每周两次更换分化培养基，直至培养结束。

在BCMA和EGFR转导的UCB-NK细胞中的CAR表达显示在条件A-C转导的NK细胞中的相对高的CAR表达，并且介导条件D转导的NK细胞中的表达。

实例4：CAR-NK-BCMA和CAR-NK-EGFR细胞与对照CAR-NK-IRR和模拟物细胞的抗肿瘤潜力

针对一系列多发性骨髓瘤和结肠直肠癌细胞系(参见下表)(对于NK细胞的细胞毒性，分别是敏感的、中等的和具有抗性的)，在用来自条件A-D的模拟物和CAR转导的UCB-NK细胞的培养结束时进行体外功能性测定。

骨髓瘤细胞系	结肠直肠癌细胞系

RPMI-8226	HT-29
		U-266	TC71
OPM-2	HCT-15
		LP-1	SW480
SK-MM2	COLO320
		NCI-H929	RKO

在37℃下，按1x10^7个细胞/ml的浓度，用5μM太平洋蓝琥珀酰亚胺基酯(PBSE)标记靶细胞(参见上表)10分钟。将靶细胞在靶培养基中洗涤并且浓缩至5x10^5个细胞/ml。将NK细胞也浓缩至5x10^5个细胞/ml，并且在过夜测定中与靶细胞(100μl效应细胞+100μl靶标)共培养。对于脱粒测量，在孵育开始时添加抗CD107a，并且在孵育结束时添加用于NK细胞鉴别的抗CD56。在1:1的效应细胞:靶细胞(E:T)比率下，基于凋亡7AAD活力标记的流式细胞术读出来计算细胞毒性。

与条件D相比，针对敏感性肿瘤细胞系(参见上表)，观察到来自条件A-C的BCMA和EGFR转导的UCB-NK细胞的更低细胞毒性。

实例5：CD34+细胞的扩增和分化

细胞培养

将CD34+UCB细胞在A-D条件下以0.02-2x10^6个细胞/ml的细胞浓度铺板在新鲜培养基I中经组织培养液处理的6孔板中。

扩增阶段

在扩增阶段中测量CD45和CD56以及CD44v6的流式细胞术数据，以监测和提供最佳细胞培养条件。在新鲜的培养基I(由以下组成：补充有10％人血清的GBGM、低剂量细胞因子混合物(含有10pg/ml GM-CSF，250pg/ml G-CSF和50pg/ml IL-6)、25ng/ml SCF、Flt-3L、TPO、IL-7)中培养CD34+UCB细胞。细胞在培养基I中培养至第9天。每周每2-3天更换培养基I。在第10天，通过添加培养基II(在此用25mg/ml TPO替换20ng/ml IL-15)培养祖细胞。在第14天，分析细胞培养物的CD56 NK细胞含量和CD44v6表达，如图2所示。

分化阶段

在分化期间，测量作为NK细胞的标记的CD56含量，以及CD45和CD44v6表达。分化培养基(aka培养基III)由以下组成：补充有2％人血清的GBGM、低剂量细胞因子混合物(含有10pg/ml GM-CSF，250pg/ml G-CSF和50pg/ml IL-6)、20ng/ml SCF、IL-15、IL-7和1000U/mlIL-2(阿地白介素(Proleukin))。每周两次更换分化培养基，直至培养结束。在第29天，分析细胞培养物的CD56 NK细胞含量和CD44v6表达，如图2所示。

实例6：通过慢病毒载体转导CD34⁺造血干细胞和源自CD34+造血干细胞的前体细胞

通过免疫磁性分离技术从起始材料中分离CD34+干细胞，随后用慢病毒载体转导，由VSVG包膜假型化，其包含一个或多个编码EGFP的多核苷酸，产生EGFP-NK细胞(pLentiCMV GFP Puro(658-5)；Addgene质粒#17448；n2t.net/addgene:17448；RRID:Addgene_17448；Campeau E,Ruhl VE,Rodier F,Smith CL,Rahmberg BL,Fuss JO,Campisi J,Yaswen P,Cooper PK,Kaufman PD..PLoS One.[公共科学图书馆综合]2009年8月6日；4(8):e6529)。替代性地，如前所述培养CD34+干细胞(Spanholtz J,Tordoir M,Eissens D,Preijers F,van der Meer A,Joosten I等人，方法III，PLoS ONE[公共科学图书馆综合]2010 5(2):e9221)以获得前体细胞；并且这些前体细胞在第21、28或34天用上述慢病毒载体转导，然后进一步扩增和分化。

起始材料

在此，我们区分了2种不同的生长培养基：

CD34+干细胞群体的分离

CD34+干细胞通过Miltenyi

封闭系统细胞制造平台(美天旎生物科技公司(Miltenyi Biotec B.V.&Co KG)，德国贝吉施格拉德巴赫(Bergisch Gladbach))从脐带血中分离出来。简而言之，经由CD34-缀合的磁珠通过磁分离纯化细胞。最终产物是纯CD34+群体，该纯CD34+群体收集在培养基I中，并用于扩增和/或分化、或在冰箱中按照受控温度分布曲线冷冻。

转导CD34+细胞或其衍生的前体以获得EGFP-NK群体

解冻后立即将CD34+干细胞重新悬浮于培养基A中。24小时后对细胞进行计数，在96孔板中以每孔5,000个细胞/100μl新鲜培养基A的浓度重新悬浮。将实例1中制备的病毒原液以MOI 20/100μl稀释在重组人纤维连接片断涂覆的板(Takara Bio Europe SAS公司，法国圣日耳曼昂莱)的培养基A中。随后将细胞添加到板中。任选地，可以通过向病毒原液中添加以下转导增强剂来提高转导效率，以在培养基A中达到这些最终浓度：8μg/ml聚凝胺(西格玛奥德里奇化学公司(Sigma-Aldrich Chemie N.V.)，荷兰兹韦恩德雷赫特)，4μg/ml硫酸鱼精蛋白(西格玛奥德里奇化学公司)、1μg/ml

(美天旎生物科技公司)、4μg/ml硫酸鱼精蛋白加1μg/ml

1mg/ml LentiBOOST^TM(Sirion BiotechGmbH公司，德国马丁斯里德市)，或1μl/100μl LentiBlast Premium培养基(OZBiosciencesSAS公司，法国马赛)。

替代性地，将CD34+细胞在扩增和分化培养基中培养，并如上所述转导所得前体细胞。用在24孔板中以200,000个细胞/250μl新鲜培养基B/孔的浓度重新悬浮的细胞进行转导。将实例1中制备的病毒原液在培养基B中以MOI 20/250μl稀释。以与上述相同的最终浓度使用转导增强剂。

包括对照细胞，我们区分：

细胞	培养基	MOI	条件
				CD34+	培养基A	20	EGFP载体
CD34+	培养基A	N/A	模拟物
				第21天源自CD34+细胞的前体	培养基B	20	EGFP载体
第21天源自CD34+细胞的前体	培养基B	N/A	模拟物
				第28天源自CD34+细胞的前体	培养基B	20	EGFP载体
第28天源自CD34+细胞的前体	培养基B	N/A	模拟物
				第35天源自CD34+细胞的前体	培养基B	20	EGFP载体
第35天源自CD34+细胞的前体	培养基B	N/A	模拟物

孵育24小时后，用培养基II补充这些CD34+细胞。孵育24小时后，用培养基III补充源自CD34+细胞的前体。

序列表

<110> 格雷克斯迪姆医疗私人有限公司（Glycostem Therapeutics B .V .）

<120> 用于获得CAR-NK细胞的方法

<130> IP-10

<150> N2024334

<151> 2019-11-28

<160> 11

<170> 专利3.5版

<210> 1

<211> 239

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ala Leu Ser Asn His

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Val Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser

85 90 95

Ala His Gly Gly Glu Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ala Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

130 135 140

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser

145 150 155 160

Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

165 170 175

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

180 185 190

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

195 200 205

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr

210 215 220

Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235

<210> 2

<211> 242

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile

130 135 140

Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser

145 150 155 160

Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly

165 170 175

Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile

180 185 190

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser

195 200 205

Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln

210 215 220

Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

225 230 235 240

Lys Arg

<210> 3

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CAR盒的一部分-CD8a前导序列

<400> 3

Met Asp Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Leu His Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser

20 25

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CAR盒的一部分-FseI-SbfI侧翼填充片段

<400> 4

Gly Arg Pro Ser Leu Ser Glu Ser Cys Arg Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CAR盒的一部分-IgD铰链区

<400> 5

Ala Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro

1 5 10 15

Thr Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu

20 25

<210> 6

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CAR盒的一部分-优化的IgG1重链Fc部分，

优化的

<400> 6

Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Gly Arg

1 5 10 15

Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu

20 25 30

Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Ala Ala Ala Val Glu Pro Lys Ser Cys

35 40 45

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ala Ala Pro Pro Val Ala Gly

50 55 60

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

65 70 75 80

Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

85 90 95

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

100 105 110

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

115 120 125

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

130 135 140

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

145 150 155 160

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

165 170 175

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

180 185 190

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

195 200 205

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

210 215 220

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

225 230 235 240

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

245 250 255

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

260 265 270

Gly Lys

<210> 7

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CAR盒的一部分-CD28跨膜结构域

<400> 7

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 8

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CAR盒的一部分-CD28共激活结构域

<400> 8

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 9

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CAR盒的一部分-OX40共激活结构域

<400> 9

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser

20 25 30

Thr Leu Ala Lys Ile

35

<210> 10

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CAR盒的一部分-CD3ζ激活结构域

<400> 10

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 11

<211> 8619

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLenti CMV GFP Puro (658-5)

<400> 11

aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 60

ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 120

aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt 180

ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca 240

gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag 300

ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc 360

ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca 420

gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt 480

aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct 540

gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt 600

aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga 660

caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact 720

tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc 780

acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga 840

gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt 900

agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga 960

gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact 1020

ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 1080

taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 1140

agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 1200

aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 1260

ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta 1320

gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 1380

aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 1440

aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 1500

gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 1560

aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 1620

aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 1680

cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 1740

cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 1800

tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt 1860

tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga 1920

ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta 1980

atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa 2040

tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat 2100

gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta 2160

cgccaagcgc gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag ctggagctgc aagcttaatg 2220

tagtcttatg caatactctt gtagtcttgc aacatggtaa cgatgagtta gcaacatgcc 2280

ttacaaggag agaaaaagca ccgtgcatgc cgattggtgg aagtaaggtg gtacgatcgt 2340

gccttattag gaaggcaaca gacgggtctg acatggattg gacgaaccac tgaattgccg 2400

cattgcagag atattgtatt taagtgccta gctcgataca taaacgggtc tctctggtta 2460

gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa 2520

taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac 2580

tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtgg cgcccgaaca 2640

gggacttgaa agcgaaaggg aaaccagagg agctctctcg acgcaggact cggcttgctg 2700

aagcgcgcac ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa attttgacta 2760

gcggaggcta gaaggagaga gatgggtgcg agagcgtcag tattaagcgg gggagaatta 2820

gatcgcgatg ggaaaaaatt cggttaaggc cagggggaaa gaaaaaatat aaattaaaac 2880

atatagtatg ggcaagcagg gagctagaac gattcgcagt taatcctggc ctgttagaaa 2940

catcagaagg ctgtagacaa atactgggac agctacaacc atcccttcag acaggatcag 3000

aagaacttag atcattatat aatacagtag caaccctcta ttgtgtgcat caaaggatag 3060

agataaaaga caccaaggaa gctttagaca agatagagga agagcaaaac aaaagtaaga 3120

ccaccgcaca gcaagcggcc gctgatcttc agacctggag gaggagatat gagggacaat 3180

tggagaagtg aattatataa atataaagta gtaaaaattg aaccattagg agtagcaccc 3240

accaaggcaa agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg 3300

ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg 3360

gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct 3420

attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca 3480

agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc 3540

tctggaaaac tcatttgcac cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag taataaatct 3600

ctggaacaga tttggaatca cacgacctgg atggagtggg acagagaaat taacaattac 3660

acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa 3720

gaattattgg aattagataa atgggcaagt ttgtggaatt ggtttaacat aacaaattgg 3780

ctgtggtata taaaattatt cataatgata gtaggaggct tggtaggttt aagaatagtt 3840

tttgctgtac tttctatagt gaatagagtt aggcagggat attcaccatt atcgtttcag 3900

acccacctcc caaccccgag gggacccgac aggcccgaag gaatagaaga agaaggtgga 3960

gagagagaca gagacagatc cattcgatta gtgaacggat ctcgacggta tcggttaact 4020

tttaaaagaa aaggggggat tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata 4080

gcaacagaca tacaaactaa agaattacaa aaacaaatta caaaattcaa aattttatcg 4140

ataagcttgg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 4200

caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 4260

gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 4320

tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 4380

ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 4440

attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata 4500

gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt 4560

ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca 4620

aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg 4680

tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgactcta 4740

gaggatccac cggtcgccac catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 4800

cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag 4860

ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 4920

ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc 4980

cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac 5040

gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg 5100

aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 5160

gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 5220

atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 5280

gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 5340

gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 5400

gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 5460

atggacgagc tgtacaagta aagcggccgc gtcgacaatc aacctctgga ttacaaaatt 5520

tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct 5580

gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg 5640

tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc 5700

gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt 5760

cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc 5820

gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg 5880

ttgtcgggga agctgacgtc ctttccatgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg 5940

cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc 6000

ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg 6060

atctcccttt gggccgcctc cccgcctgga attctaccgg gtaggggagg cgcttttccc 6120

aaggcagtct ggagcatgcg ctttagcagc cccgctgggc acttggcgct acacaagtgg 6180

cctctggcct cgcacacatt ccacatccac cggtaggcgc caaccggctc cgttctttgg 6240

tggccccttc gcgccacctt ctactcctcc cctagtcagg aagttccccc ccgccccgca 6300

gctcgcgtcg tgcaggacgt gacaaatgga agtagcacgt ctcactagtc tcgtgcagat 6360

ggacagcacc gctgagcaat ggaagcgggt aggcctttgg ggcagcggcc aatagcagct 6420

ttgctccttc gctttctggg ctcagaggct gggaaggggt gggtccgggg gcgggctcag 6480

gggcgggctc aggggcgggg cgggcgcccg aaggtcctcc ggaggcccgg cattctgcac 6540

gcttcaaaag cgcacgtctg ccgcgctgtt ctcctcttcc tcatctccgg gcctttcgac 6600

ctgcagccca agcttaccat gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac 6660

gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc 6720

cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc 6780

acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg 6840

gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc 6900

atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg 6960

ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg tcggcgtctc gcccgaccac 7020

cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc 7080

ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc 7140

ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc 7200

cgcaagcccg gtgcctgacg cccgccccac gacccgcagc gcccgaccga aaggagcgca 7260

cgaccccatg catctcgagg gcccggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt 7320

agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctagctc actcccaacg 7380

aagacaagat ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg 7440

ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt 7500

gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc 7560

cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tagtagttca tgtcatctta ttattcagta 7620

tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga gagtgagagg aacttgttta ttgcagctta 7680

taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact 7740

gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct ggctctagct 7800

atcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg 7860

ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag 7920

ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag ggacgtaccc aattcgccct 7980

atagtgagtc gtattacgcg cgctcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 8040

accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 8100

atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 8160

gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 8220

ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 8280

ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 8340

ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 8400

ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 8460

gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 8520

tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 8580

ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattt 8619

Claims

1.一种用于制造用嵌合抗原受体(CAR)遗传修饰的细胞的群体的方法，该方法包括：

(i)第一步骤，包括：

a)提供包含CD34+造血干细胞的样品，

b)纯化所述样品中的CD34+造血干细胞，

c)在培养基I的存在下，培养这些纯化的CD34+造血干细胞，

d)通过在培养基I中在包含所述多核苷酸的载体存在下培养这些细胞群体至少10小时，优选地至少16小时、更优选地至少24小时、更优选地至少36小时、更优选地至少48小时、更优选地至少60小时、最优选地至少72小时，用编码CAR的多核苷酸转导这些纯化的CD34+造血干细胞，由此获得包含表达所述CAR的CD34+干细胞的细胞群体，并且

e)在培养基I中培养这些细胞群体至少10小时、优选至少16小时、更优选至少24小时、更优选至少36小时、更优选至少48小时、更优选至少60小时、最优选至少72小时，其中

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)中的细胞培养以在500与10,000个CD34⁺细胞/ml之间、更优选地在1,000与8,000个CD34+细胞/ml之间、更优选地在2,000与6,000个CD34+细胞/ml之间的细胞密度开始。

3.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该多核苷酸不编码对造血干细胞、自然杀伤(NK)祖细胞或NK细胞上表达的抗原特异的CAR。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，该方法进一步包括:

(ii)第二步骤，其中，来自步骤(i)的细胞群体被扩增并分化成含有CAR-NK祖细胞和/或CAR-NK细胞的细胞群体，该步骤包括在培养基III中培养来自步骤(i)的含有CAR-CD34+干细胞的细胞群体，由此获得含有CAR-NK祖细胞和/或CAR-NK细胞的细胞群体，其中该培养基III是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含SCF、IL-7、IL-15和白介素-2(IL-2)中的两种或更多种，以及GM-CSF、G-CSF、和IL-6中的两种或更多种。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，该方法进一步包括:

(ii)第二步骤，其中，来自步骤(i)的细胞群体被扩增并分化成含有CAR干细胞和/或CAR祖细胞的细胞群体，该步骤包括在培养基II中培养来自步骤(i)的CAR-CD34+干细胞，由此获得含有CAR干细胞和CAR祖细胞的细胞群体，以及

(iii)第三步骤，其中，来自步骤(ii)的细胞群体被进一步扩增并分化成含有CAR-NK祖细胞和/或CAR-NK细胞的细胞群体，

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该样品已从脐带血获得。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中使用CD34+免疫磁性选择方法纯化干细胞。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中培养基I包含：浓度为4ng/ml至300ng/ml的SCF、或浓度为4ng/ml至300ng/ml的Flt3-L、或浓度为4ng/ml至100ng/ml的TPO、或浓度为4ng/ml至50ng/ml的IL7、或优选地指定浓度的这些细胞因子的任何组合。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤d)和e)至少重复一次，导致至少两次转导运行，其中，CD34+干细胞与包含编码所述CAR的所述多核苷酸的病毒载体一起孵育。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中CD34+干细胞与包含编码所述CAR的所述多核苷酸的病毒载体一起孵育，感染复数(MOI)在0.01和100之间，优选地在1和10之间。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中该病毒载体是逆转录病毒载体。

12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中该病毒载体是仙台病毒载体。

13.根据任一前述权利要求所述的方法，其中该CAR针对肿瘤抗原。

14.一种组合物，该组合物包含通过根据权利要求1-13中任一项所述的方法可获得的NK-CAR细胞。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中该NK-CAR细胞对神经细胞黏附分子(NCAM)和CAR呈阳性。

16.根据权利要求14或15所述的组合物，用于在医学中使用、优选地用于在免疫疗法中使用、更优选地用于在治疗肿瘤和血液恶性肿瘤中使用。