KR20220107233A - Car-nk 세포의 수득 방법 - Google Patents

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KR20220107233A
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hours
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얀 스판홀츠
니나 라머스-코크
모니카 라이모
루치아 퀴세로바
헨드리쿠스 아드리아누스 마리아 헤이르츠
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글리코스템 떼라퓨틱스 비.브이.
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Abstract

본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 바이러스 벡터로 유전적으로 변형된 자연 살해(NK) 세포의 제조 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법으로 수득된 CAR-NK 세포 및 CAR-NK 세포의 특히 암 치료 방법에 사용하기 위한 약물에서의 용도에 관한 것이다.

Description

CAR-NK 세포의 수득 방법
본 발명은 유전적으로 변형된 자연 살해(NK) 세포 분야 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 CAR-NK 세포, CAR-NK 세포의 제조 방법 및 특히 암 치료를 위한 약물에 있어서 CAR-NK 세포의 용도에 관한 것이다.
자연 살해 세포(NK 세포)는 항종양, 항바이러스 및 항균 활성을 갖는 선천적 면역 세포이다. 암 치료를 위한 NK 세포의 사용은 암 환자에서 NK 세포의 성공적인 입양 전달 및　생체내　확장이 보고된 후 관심을 끌었다[Ruggeri et al (2005) Curr Opin Immunol 17: 211-7; Ren et al (2007) Cancer Biother Radiopharm 22: 223-34; Koehl et al (2004) Blood Cells Mol Dis 33: 261-6.176 Passweg et al (2004) Leukemia 18:1835-8]. 일반적으로, 공여자 NK 세포 주입은 이러한 연구에서 GvHD의 유도에 대한 증거없이 잘 용인되었다. 그러나, 현재까지 암 환자에서 입양 NK 세포 주입을 조사하는 시험은 단지 몇 건만 수행되었다. 주요 장애물은 일반 백혈구성분채집 제품으로부터 비교적 적은 수의 NK 세포만이 단리될 수 있다는 것이다. 이것은 암에 걸린 인간에서 NK-세포 용량-의존적 항종양 반응에 대한 임상 시험을 방해한다[Klingemann et al (2004) Cytotherapy 6: 15-22; Passweg et al (2006) Best Pract Res Clin Haematol 19: 811-824; McKenna et al (2007) Transfusion 47: 520-528; Koehl et al (2005) Klin Padiatr 217: 345-350; Iyengar et al (2003) Cytotherapy 5: 479-484; Meyer-Monard et al (2009) Transfusion 49: 362-371]. 따라서, 더 높은 NK 세포 투여량에서 임상 시험을 가능하게 하고 다중 NK 세포 주입을 허용하도록 하는, NK 세포의 확장 및 활성화를 위한 생체외 프로토콜이 연구 중에 있다[Carlens et al (2001) Hum Immunol 62: 1092-1098; Barkholt et al (2009) Immunotherapy 1: 753-764; Berg et al (2009) Cytotherapy 11: 341-355; Fujisaki et al (2009) Cancer Res 69: 4010-4017; Siegler et al. (2010) Cytotherapy 12(6):750-63]. 그러나, 대부분의 프로토콜은 규제 문제를 초래할 수 있는 지지적 피더(feeder) 세포주를 사용하여 대규모 및 다기관 시험을 위한 NK 세포 제품을 생산함으로써 기술적 단점에 직면한다. 이전에, 본 출원인은 CD34+ 조혈모세포로부터 많은 세포 수, 높은 순도 및 기능성을 가진 임상적으로 관련된 NK 세포 제품을 생성할 수 있는 대안적인 시토카인-기반 배양 방법을 기술하였다[Spanholtz et al (2010) PLoS One 5: e9221]. 또한, 본 출원인은 CD34+ 줄기 세포의 농축을 최적화하고, 활성화된 CD34+ 줄기 세포-유래 NK 세포의 높은 수율을 초래하는 확장가능한 절차를 개발하였다.
키메라 항원 수용체(CAR)는 3가지 필수 단위, 즉 (1) 세포외 항원-결합 모티프, (2) 연결/막횡단 모티프, 및 (3) 세포내 T-세포 신호 전달 모티프를 포함하는 혼성 분자이다(Long et al (2013) Oncoimmunology 2 (4):e23621).
CAR의 항원-결합 모티프는 일반적으로 면역글로불린(Ig) 분자의 최소 결합 도메인인 단일 사슬 단편 가변(scFv)에 필적한다. 교대 항원-결합 모티프, 예컨대 수용체 리간드, 손상되지 않은 면역 수용체, 라이브러리-유래 펩티드, 및 선천 면역 체계 이펙터 분자(예컨대, NKG2D)가 또한 조작되었다. CAR 발현에 대한 교대 세포 타겟(예컨대, NK 또는 감마-델타 T 세포)이 또한 개발 중에 있다(Brown et al (2012) Clin Cancer Res 18(8):2199-209; Lehner et al (2012) PLoS One 7 (2):e31210).
CAR이 CAR T 세포와 유사한 방식으로 NK-세포 활성화를 촉발시킬 수 있는 것으로 보이지만, 현재까지 이러한 기술의 임상 적용에 대한 주요 장애물은 CAR NK-세포의 생체내 확장, 주입 후 세포의 빠른 소멸, 및 실망스러운 임상 활성에 의해 제한되었다. 따라서, 상기한 단점들 중 적어도 하나 없이 의도된 치료 속성을 나타낼 수 있는 CAR-NK 세포를 사용한 암의 치료를 위한 조성물 및 방법을 발견하는 것에 대한 시급하고 오랫동안 느껴온 요구가 관련 기술분야에 존재한다.
본 발명은 임상 용도를 위한 충분한 품질 및 양으로 고 활성 CAR-NK 세포를 수득하게 하는 CAR-NK 세포의 제조 방법을 제공함으로써 이러한 요구를 다룬다. 본 발명은 의학적 치료, 특히 환자에서 종양 치료를 위해 사용되는 고 활성 기성품 CAR-NK 세포의 제조 방법을 제공한다.
제조 방법은 다음의 단계를 포함한다:
CD34+ 줄기 세포의 세포 집단에 CAR을 형질도입하는 것을 목적으로 하는 제1 단계.
형질도입된 CD34+ 줄기 세포의 확장, 및 확장 및 형질도입된 CD34+ 줄기 세포의 CAR-NK 전구 세포 및 CAR-NK 세포로의 분화를 목적으로 하는 제2 단계. 본 발명자들은 놀랍게도 형질도입 동안 특정 배양 조건이 최종 분화된 CAR-NK 세포 집단에 대한 성질 및 조성에 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 이러한 배양 조건이 사용될 때 수득된 세포는 다른 배양 조건을 사용하여 수득된 세포보다 우수한 품질을 갖는다. 보다 구체적으로, 상기 제1 단계에서, CD34+ 줄기 세포는 생물학적 샘플, 예컨대 제대혈, 골수 또는 말초 혈액으로부터 수득되고, CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 바이러스 형질도입에 의해 도입된다. 상기 폴리뉴클레오티드의 도입은 시토카인의 컬렉션(collection)을 포함하는 배양 배지의 존재 하에 수행된다. 상기 제1 단계 후, 배양물은 따라서 CAR-CD34+ 줄기 세포를 함유하고, 이것은 또 다른 시토카인의 컬렉션을 포함하는 배양 배지에서 추가로 확장 및/또는 분화된다.
제2 단계에서, 세포 집단은 CAR-NK 세포를 함유하는 세포 집단으로 (추가로) 확장 및 분화된다. 상기 제1 단계로부터 수득된 CAR-CD34+ 줄기 세포는 바람직하게는 먼저 제2 배지 및 제3 배지(둘 다 상기 제1 배양 배지와 상이한 시토카인의 컬렉션을 가짐)에서 배양되고, 이로써 복수의 CAR-NK 세포 또는 CAR-NK 전구 세포 또는 둘 다를 함유하는 배양된 세포의 컬렉션이 수득된다.
놀랍게도, 상기 제1 단계 동안 적용된 조건이 상이한 구성의 시토카인을 갖는 배양 배지를 사용하여 수득된 집단 보다 더 강력한 치료 효과를 갖는 CAR-NK 집단을 수득할 수 있게 한다는 것이 밝혀졌다. 또한, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 NK-CAR 집단은 동일한 배양 조건을 사용하지만 CAR 폴리뉴클레오티드의 도입 없이 수득된 비-CAR NK 세포(자연 NK 세포)의 집단 또는 관련없는 비표적화 scFv 단백질을 갖는 CAR을 함유하는 CAR-NK 세포의 집단과 비교할 때 CAR-리간드를 발현하는 타겟 세포에 대한 효과가 우수하다.
따라서, 본 발명은 CD34+ 줄기 세포를 시토카인의 특정 혼합물을 갖는 배양 배지에서 형질도입하는 것을 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR)로 유전적으로 변형된 NK-세포의 집단의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 생성된 CAR-NK 세포가 지금까지 공지된 것보다 우수한 세포 집단을 수득할 수 있게 한다.
제1 구현예에서, 본 발명은
(i) a) CD34+ 조혈모세포를 포함하는 샘플을 제공하고,
b) 상기 샘플 중 CD34+ 조혈모세포를 정제하고,
c) 배양 배지 I의 존재 하에 정제된 CD34+ 조혈모세포를 배양하고,
d) 정제된 CD34+ 조혈모세포에 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 형질도입하여 상기 CAR을 발현하는 CD34+ 줄기 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하고,
e) 선택적으로 세포 집단을 배양 배지 I에서 적어도 10시간, 바람직하게는 적어도 16시간, 더 바람직하게는 적어도 24시간, 더 바람직하게는 적어도 36시간, 더 바람직하게는 적어도 48시간, 더 바람직하게는 적어도 60시간, 가장 바람직하게는 적어도 72시간 동안 배양하는 것을 포함하고,
여기서, 배양 배지 I는 시토카인의 컬렉션을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 인터루킨-7, 및 줄기 세포 인자(SCF), flt-3리간드(FLT-3L), 트롬보포이에틴(TPO) 중 1종 이상, 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 및 인터루킨-6 IL-6) 중 2종 이상을 포함하는 것인 제1 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체 CAR)로 유전적으로 변형된 세포 집단의 제조 방법을 제공한다.
단계 e)에서, 세포는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 첨가 없이 배지 I에서 배양되는 반면, 단계 d)에서 벡터는 일정한 간격으로, 바람직하게는 12 내지 36시간 마다, 더 바람직하게는 16 내지 32시간 마다, 더 바람직하게는 20 내지 28시간 마다, 가장 바람직하게는 22 내지 26시간 마다 첨가된다. 바람직하게는, 세포를 단계 d)와 단계 e) 사이에 적어도 한번 세척하여 유리 바이러스 벡터를 제거한다.
바람직한 일 구현예에서, CAR의 형질도입 및 발현에 사용되는 폴리뉴클레오티드는 조혈모세포, NK 전구 세포 또는 NK 세포의 세포 표면, 특히 본 발명에 따른 방법을 수행함으로써 수득되는 배양물에 존재하는 이러한 세포의 세포 표면에서 발현되는 항원에 특이적인 CAR을 코딩하지 않는다. 이러한 세포에 존재하는 항원의 예는 CD34, CD56, CD44v6, CD94, NKG2A, NKG2D, CD16, KIRs, CD38, CD123, CD33 등이다.
다시 말해서, 상기 폴리뉴클레오티드는 조혈모세포, NK 전구 세포 또는 NK 세포의 세포 표면에서 발현되지 않는 항원에 특이적인 CAR을 코딩하며, 특히 이러한 항원은 본 발명에 따른 방법 동안 배양물에 존재하는 임의의 이러한 세포의 세포 표면에서 발현되지 않는다. 이러한 세포에 존재하지 않으며 따라서 바람직한 이러한 항원의 통상적인 예는 CD3, CD19, EGFR, HSP70, OGD2, CD20 등이다.
배양 및 형질도입을 위하여, 총 3가지의 상이한 배지가 사용된다:
배양 배지 I는 시토카인의 컬렉션을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 인터루킨-7(IL-7), 및 줄기 세포 인자(SCF), flt-3리간드(FLT-3L), 트롬보포이에틴(TPO) 중 1종 이상, 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 및 인터루킨-6(IL-6) 중 2종 이상을 포함한다. 바람직하게는, 시토카인의 컬렉션은 IL-7, 및 SCF, FLT-3L 및 TPO 중 2종 이상을 포함하고, 더 바람직하게는, 시토카인의 컬렉션은 SCF, FLT-3L, TPO 및 IL-7을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 시토카인의 컬렉션은 GM-CSF, G-CSF 및 IL-6을 포함한다. 배양 배지 I가 SCF, FLT-3L, TPO, IL-7, GM-CSF, G-CSF 및 IL-6을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
배양 배지 II는 시토카인의 컬렉션을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 SCF, FLT-3L 인터루킨-15(IL-15) 및 IL-7 중 2종 이상 및 GM-CSF, G-CSF 및 IL-6 중 2종 이상을 포함한다. 바람직하게는, 시토카인의 컬렉션은 SCF, FLT-3L, IL-15 및 IL-7 중 3종 이상을 포함하고, 더 바람직하게는, 시토카인의 컬렉션은 SCF, FLT-3L, IL-15 및 IL-7을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 시토카인의 컬렉션은 GM-CSF, G-CSF 및 IL-6을 포함한다. 배양 배지 II가 SCF, FLT-3L, IL-15, IL-7, GM-CSF, G-CSF 및 IL-6을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
배양 배지 III은 시토카인의 컬렉션을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 SCF, IL-7, IL-15 및 인터루킨-2(IL-2) 중 2종 이상, 및 GM-CSF, G-CSF 및 IL-6 중 2종 이상을 포함한다. 바람직하게는 시토카인의 컬렉션은 SCF, IL-7, IL-15 및 IL-2 중 3종 이상을 포함하고, 더 바람직하게는 시토카인의 컬렉션은 SCF, IL-7, IL-15 및 IL-2를 포함한다. 바람직한 구현예에서 시토카인의 컬렉션은 GM-CSF, G-CSF 및 IL-6을 포함한다. 배양 배지 III이 SCF, IL-7, IL-15, IL-2, GM-CSF, G-CSF 및 IL-6을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
먼저, 본 발명의 방법은 CAR을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 갖는 CD34+ 줄기 세포를 함유하는 세포 집단을 생성하기 위한 조건을 제공한다. 세포 집단은 다음의 단계에 따라 생성된다:
본 발명의 방법에 사용되는 출발 물질은 체성 줄기 세포로도 칭해지는 성체(즉, 배아 후) 줄기 세포를 함유하는 생물학적 샘플이다. 본원에서 사용된 용어 생물학적 샘플은 인간으로부터 유래된 샘플을 의미한다. 바람직한 구현예에서 사용되는 출발 물질은 제대혈이다.
본 발명의 방법에 따라, CD34+ 줄기 세포는 생물학적 샘플로부터 단리된다. 면역자기 선택 또는 세포 분류에 기초한 방법을 포함하는 CD34+ 단리를 위한 여러가지 프로토콜이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 본원에서 사용된 면역자기 선택은 항체를 자기 입자에 결합시키므로 자석을 사용하여 항원 구조를 분리할 수 있게 하는 것을 의미한다.
바람직한 구현예에서, 생물학적 샘플은 먼저 구배 분리 또는 원심분리 기술을 사용하여 단핵 세포에 대해 농축된 후, 자기 비드에 접합된 특정 항-CD34+ 항체로 세포를 표지하고, 자기 컬럼을 사용하여 CD34+ 세포를 정제함으로써 면역자기 선택된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 면역자기 분리는 MidiMACS?? 세퍼레이터(Separator), CliniMACS® 플러스 인스트루먼트(Plus Instrument) 또는 CliniMACS?? 프로디지(Prodigy)® 장치를 사용하여 수행된다.
본 발명의 방법의 제1 단계 동안 단리된 CD34+ 줄기 세포는 먼저 배양된 후, 시토카인 및 성장 인자의 칵테일을 포함하는 기본 배지의 존재 하에 형질도입된다. 형질도입 전 배양 시간은 몇 초에서 4일 또는 그 이상의 임의의 기간일 수 있다. 바람직하게는, 배양 개시와 형질도입 사이의 시간은 30분 내지 48시간, 더 바람직하게는 60분 내지 36시간, 더 바람직하게는 2시간 내지 24시간, 가장 바람직하게는 6 내지 16시간이다. 다수의 기본 배양 배지가 공지되어 있다. 아래에 선택 항목이 제공되지만, 더 많은 항목이 적합할 수 있다. 기본 배지는 BEM(기본 이글 배지(Basic Eagle Medium)), DMEM(둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle Medium)), 글라스고우 최소 필수 배지(Glasgow minimal essential medium), M199 기본 배지, HAMs F-10, HAMs F-12, 이스코브(Iscove)의 DMEM, RPMI, 레이보비츠(Leibovitz) L15, MCDB, McCoy 5A, 스템스판(StemSpan) H3000® 및 스템스판SFEM® 스템라인(Stemline) I?? 및 스템라인 II?? 글리코스템 기본 성장 배지(Glycostem Basal growth medium)(GBGM??; 엑스-비보(X-Vivo)10??, 엑스-비보15?? 및 엑스-비보20?? 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 기본 배지의 조합이 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는 무혈청 제제, 예컨대 스템라인 I?? 및 스템라인 II??, 스템스판 H3000®, 스템스판 SFEM® 또는 엑스-비보10??, GBGM, 엑스-비보15?? 및 엑스-비보20??이 인간 혈청의 첨가와 함께 또는 첨가 없이 배양의 개시 시점에 사용된다. 본원에 제공된 양은 통상적으로 배양에 적합하다. 양은 배양이 시작되는 세포의 상이한 양에 맞게 조정될 수 있다. 본 발명에 따른 다양한 배양 단계에 사용되는 배지는 본 발명에 따른 한정된 시점에 확장 배지 또는 분화 배지 및/또는 대안적으로 확장+분화 배지를 제공하기 위하여 바람직하게는 시토카인의 상이한 조합과 함께 그의 혈청 함량이 달라질 수 있다.
단리 시, CD34+ 줄기 세포는 500 내지 2Х106 세포/ml 범위의 농도로 용기, 예컨대 플레이트, 플라스크, 세포 공장 또는 백(bag)에 시딩(seed)된다. 바람직한 구현예에서, 세포는 농도 1Х106 세포/ml로 단계 (i)c)에서 시딩된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 단계 c)의 세포 배양은 500 내지 10,000 CD34+ 세포/ml, 더 바람직하게는 1,000 내지 8,000 CD34+ 세포/ml, 더 바람직하게는 2,000 내지 6,000 CD34+ 세포/ml의 세포 밀도에서 개시된다. 본 발명자들은 이전에 수행한 것보다 낮은 세포 밀도로 세포를 시딩하는 것이 12 내지 15일의 배양 후에 조혈 줄기 또는 전구 세포의 절대적인 증가를 초래한다는 것을 발견하였을 뿐만 아니라, 놀랍게도 추가의 확장 및 분화 배양 방법이 (실시예 및 이전에 WO2017077096에 기재된 바와 같이) CD34+ 줄기 세포가 보다 조밀한 농도에서 배양된 방법과 동일한 또는 보다 더 우수한 품질의 NK 세포를 초래하고 확장을 추가로 증가시킨다는 것을 발견하였다. 정제 단계 (i)b) 후 저 밀도 세포 배양으로 출발하는 것의 또 다른 한 장점은 사전 수동 처리, 예컨대 더 적은 부피의 원심분리 및 재현탁 없이 자동 세포 분류기로부터 수득된 CD34+ 조혈모세포를 배양할 수 있게 한다는 것이다. 이것은 통상적으로 약 100,000 CD34+ 세포/ml 이상이 초기에 배양되는데 반해, 자동 세포 분류 후 세포 농도가 약 500 내지 10,000 CD34+ 세포/ml 범위이기 때문이다(Veluchamy et al, Front Immunol 2017, 8: 87; Roeven et al, Stem Cells and Development 2015, 24(24): 2886-2898). 이것은 선택 및 배양 과정을 추가로 자동화할 수 있게 하므로 표준화 및 판매 허가 획득에 유리하다.
일 구현예에서, 세포는 피브로넥틴의 단편, 예를 들어 단편 CH-296(레트로넥틴(RetroNectin)®) 또는 관능적 유도체로 미리 코팅된 용기에 시딩된다. 세포 용기의 표면 상에 코팅될 경우, 레트로넥틴®은 포유류 세포로의 바이러스 벡터-매개 유전자 형질도입을 상당히 향상시킨다. 바람직한 구현예에서, 세포 용기는 레트로넥틴®로 코팅된다.
시딩되면, CD34+ 줄기 세포는 배양 배지 I에서 배양된다. 바람직한 일 구현예에서, 배양 배지 I는 1종 이상의 시토카인을 다음의 농도 범위로 포함한다: GM-CSF 2 내지 100 pg/ml, 바람직하게는 5 내지 50 pg/ml, 가장 바람직하게는 약 10 pg/ml, G-CSF 100 내지 1000 pg/ml, 바람직하게는 150 내지 500 pg/ml, 가장 바람직하게는 약 250 pg/ml, SCF 4 ng/ml 내지 300 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, 가장 바람직하게는 약 25 ng/ml, Flt3-L 4 ng/ml 내지 300 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, 가장 바람직하게는 약 25 ng/ml, TPO 4 ng/ml 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 50 ng/ml, 가장 바람직하게는 약 25 ng/ml, IL-6 5 내지 500 pg/ml, 바람직하게는 25 내지 100 pg/ml, 가장 바람직하게는 약 50 pg/ml, 및/또는 IL7 4 ng/ml 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 50 ng/ml, 가장 바람직하게는 약 25 ng/ml. 본 발명의 보다 바람직한 양태에서, 배양 배지는 시토카인을 SCF 약 25 ng/ml, Flt3-L 약 25 ng/ml, TPO 약 25 ng/ml, G-CSF 약 250 pg/ml, GM-CSF 약 10 pg/ml, IL-6 약 50 pg/ml 및 IL7 약 25 ng/ml의 농도로 포함한다. 이 문맥에서 "약"은 약 20％, 바람직하게는 10％, 더 바람직하게는 5％, 가장 바람직하게는 2％의 편차를 의미한다. 바람직하게는, 배양 배지 I는 0.5 내지 10％ 혈청, 더 바람직하게는 1 내지 5％ 혈청, 가장 바람직하게는 약 2％ 혈청을 포함한다. 바람직하게는, 혈청은 인간 혈청이다.
배양 개시 및 선택적으로 적어도 10분, 바람직하게는 적어도 1시간, 더 바람직하게는 적어도 2시간, 더 바람직하게는 적어도 16시간 이상 동안의 세포 배양 단계 후, CD34+ 줄기 세포는 CAR을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 줄기 세포의 유전자 조작을 수행하기 위하여 사용되는 기술은 바이러스 형질도입이다. 본원에서 사용된 용어 형질도입 또는 바이러스 형질도입은 바이러스 벡터를 사용하여 외래 폴리뉴클레오티드를 세포의 게놈으로 도입하는 것을 의미한다. 용어 바이러스 벡터는 핵산 전달을 매개하는 바이러스 입자를 나타내기 위하여 사용된다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 형질도입에 사용되는 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 센다이 바이러스 벡터로부터 선택된다. 특히 유용한 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 센다이 벡터는 세포질 내에서 복제되고, DNA 형태를 갖지 않고, 게놈 삽입의 위험 없이 고효율로 감염시키기 때문에 특히 유용하다. 렌티바이러스 벡터는 분열 및 비-분열 세포의 고효율 형질도입에 특히 유용하다.
본 발명의 방법에 따라, 형질도입은 CD34+ 줄기 세포를 배양 배지 I의 존재 하에 CAR을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 갖는 바이러스 벡터와 함께 인큐베이션함으로써 수행된다. 일 구현예에서, 인큐베이션은 배양 배지의 적어도 절반을 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 바이러스 벡터를 함유하는 새로운 배양 배지 I로 대체함으로써 수행된다.
또 다른 구현예에서, 인큐베이션은 CD34+ 줄기 세포를 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 바이러스 벡터를 함유하는 새로운 배양 배지 I에 재현탁시킴으로써 수행되며, 이어서 이러한 재현탁물은 500 내지 10Х106 세포/ml, 바람직하게는 1,000 내지 2Х106 세포/ml, 더 바람직하게는 2000 내지 1Х106 세포/ml, 가장 바람직하게는 5000 내지 5Х105 세포/ml 범위의 농도로 세포 용기에 시딩된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 세포 용기는 레트로넥틴®으로 코팅될 수 있다.
바이러스 벡터는 벡터의 성질에 따라 상이한 농도에서 CD34+ 줄기 세포와 인큐베이션될 수 있다. 바람직하게는 형질도입은 0.01 내지 100 범위의 감염다중도(MOI)에서 바이러스 벡터의 인큐베이션에 의해 수행된다. MOI는 한정된 공간에 존재하는 타겟 세포의 수에 대한 바이러스 벡터 입자의 수의 비이다. 바람직한 구현예에서, 바이러스 벡터는 0.1 내지 50, 더 바람직하게는 1 내지 10의 MOI에서 인큐베이션된다. 형질도입 실행 동안 CD34+ 줄기 세포는 5 내지 48시간, 바람직하게는 10 내지 24시간, 더 바람직하게는 12 내지 20시간의 시간 동안 바이러스 벡터와 함께 인큐베이션될 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 형질도입 단계는 하나 이상의 형질도입 실행을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 단계 (i)d) 및 (i)e)가 적어도 1회 반복되어 CD34+ 줄기 세포가 상기 CAR을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 바이러스 벡터와 함께 인큐베이션되는 형질도입 실행이 적어도 2회 실행되는 본 발명에 따른 방법이 제공된다.
형질도입은 CAR을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 갖는 CAR-CD34+ 줄기 세포를 함유하는 세포 집단을 생성한다.
특정 구현예에서, 본 출원인은 BCMA(다발성 골수종 치료용) 및 EGFR(전이성 결장암, 전이성 비소세포폐암 및 두경부암 치료용)에 대한 특정 CAR을 생성한다.
BCMA(출처: 특허 US 2016/0046724 A1):
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EGFR(출처: 세툭시맙 항체 서열):
Figure pct00002
이렇게 수득된 CAR-CD34+ 줄기 세포를 함유하는 세포 집단은 새로운 배양 배지 I의 존재 하에 적어도 하루의 추가의 날 동안 배양된 후, 제조 방법의 제2 단계로 이동될 수 있다.
또 다른 구현예에서, CAR-CD34+ 줄기 세포를 함유하는 세포 집단은 형질도입의 종료시 동결될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 세포 집단은 새로운 배양 배지 I의 존재 하에 적어도 하루의 추가의 날 동안 배양된 후, 동결될 수 있다.
제조는 형질도입의 종료 후 또는 1일 이상의 배양 후, 또는 CAR-CD34+ 줄기 세포를 함유하는 동결된 세포 집단의 해동시 계속될 수 있다. 바람직하게는, 제2 배양 단계는 배양 배지 I에서 적어도 총 7일의 배양일 후에 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 방법의 단계 i에 의해 수득가능한 CAR-CD34+ 줄기 세포를 함유하는 세포 집단을 제공한다.
이렇게 수득된 CAR-CD34+ 줄기 세포는 발현된 CAR에 대한 양성 선택에 의해 정제될 수 있다. 양성 선택은 발현된 CAR 또는 CAR과 공동 발현되고 CD34+ 세포에 의해 보통 발현되지 않는 선택가능한 단백질에 대해 지시된 항체를 통해 수행될 수 있다. 따라서, CAR 발현 줄기 세포를 양성으로 선택할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 형질도입이 수행되는 배양 조건(즉, 배양 배지 I에서 배양)은 바람직하게는 적어도 총 7일 동안 계속되며, 즉 형질도입 전 배양, 형질도입 실행 1 및 2 동안 배양, 및 형질도입 후 배양을 포함한다. 그 후, NK 세포로의 확장 및 분화를 포함하는 제2 단계가 개시되는 것이 바람직하다.
바람직한 구현예에서,
(ii) CAR-CD34+ 줄기 세포를 함유하는 단계 (i)로부터의 세포 집단을 배양 배지 III에서 배양하여 CAR-NK 세포 및 전구 CAR-NK 세포를 함유하는 세포 집단을 수득하는 것을 포함하고, 여기서 배양 배지 III는 시토카인의 컬렉션을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 SCF, IL-7, IL-15 및 인터루킨-2(IL-2) 중 2종 이상 및 GM-CSF, G-CSF 및 IL-6 중 2종 이상을 포함하는 것인, 단계 (i)로부터의 세포 집단이 CAR-NK 세포를 함유하는 세포 집단으로 확장 및 분화되는 제2 단계
를 더 포함하는 본 발명에 따른 방법이 제공된다.
대안적으로,
(ii) 단계 (i)로부터의 CAR-CD34+ 줄기 세포를 배양 배지 II에서 배양하여 CAR 줄기 세포 및 CAR 전구 세포를 함유하는 세포 집단을 수득하는 것을 포함하는, 단계 (i)로부터의 세포 집단이 CAR-NK 세포 및 전구 CAR-NK 세포를 함유하는 세포 집단으로 확장 및 분화되는 제2 단계, 및
(iii) 단계 (ii)로부터의 세포 집단이 CAR-NK 세포 및 전구 CAR-NK 세포를 함유하는 세포 집단으로 추가로 확장 및 분화되는 제3 단계
를 더 포함하고, 여기서 배양 배지 II는 시토카인의 컬렉션을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 SCF, FLT-3L 인터루킨-15(IL-15) 및 IL-7 중 2종 이상 및 GM-CSF, G-CSF 및 IL6 중 2종 이상을 포함하고,
여기서, 배양 배지 III는 시토카인의 컬렉션을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 SCF, IL-7, IL-15 및 인터루킨-2(IL-2) 중 2종 이상 및 GM-CSF, G-CSF, 및 IL-6 중 2종 이상을 포함하는 것인 본 발명에 따른 방법이 제공된다.
따라서, 상기 두 단락으로부터 추론될 수 있는 바와 같이, 배지 II를 이용하는 배양 단계는 선택 사항이며, 분화를 목표로 하는 배지 III를 이용하는 배양 단계로 들어가기 위하여 더 많은 CAR-줄기- 또는 CAR-NK-전구 세포를 수득하는 것에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 따라서
(i) a) CD34+ 조혈모세포를 포함하는 샘플을 제공하고,
b) 상기 샘플 중 CD34+ 조혈모세포를 정제하고,
c) 배양 배지 I의 존재 하에 정제된 CD34+ 조혈모세포를 배양하고,
d) CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 상기 CAR을 발현하는 CD34+ 줄기 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하고,
e) 선택적으로 세포 집단을 배양 배지 I에서 적어도 1일 동안 배양하는 것을 포함하고, 여기서 배양 배지 I는 시토카인의 컬렉션을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 인터루킨-7, 및 줄기 세포 인자(SCF), flt-3리간드(FLT-3L), 트롬보포이에틴(TPO) 중 1종 이상, 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 및 인터루킨-6(IL-6) 중 2종 이상을 포함하는 것인 제1 단계,
(ii) 단계 (i)로부터의 CAR-CD34+ 줄기 세포를 배양 배지 II에서 배양하여 CAR 줄기 세포 및 CAR 전구 세포를 함유하는 세포 집단을 수득하는 것을 포함하는, 단계 (i)로부터의 세포 집단이 CAR-NK 세포 및 전구 CAR-NK 세포를 함유하는 세포 집단으로 확장 및 분화되는 임의의 제2 단계, 및
(iii) 단계 (i) 또는 단계 (ii)로부터의 세포 집단이 CAR-NK 세포 및 전구 CAR-NK 세포를 함유하는 세포 집단으로 추가로 확장 및 분화되는 제3 단계
를 포함하고, 여기서 배양 배지 II는 시토카인의 컬렉션을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 SCF, FLT-3L 인터루킨-15(IL-15) 및 IL-7 중 2종 이상, 및 GM-CSF, G-CSF 및 IL6 중 2종 이상을 포함하고,
여기서, 배양 배지 III는 시토카인의 컬렉션을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 SCF, IL-7, IL-15 및 인터루킨-2(IL-2) 중 2종 이상 및 GM-CSF, G-CSF 및 IL-6 중 2종 이상을 포함하는 것인, NK 세포 및 전구 NK 세포의 집단의 제조 방법을 제공한다.
임의의 단계에서, 단계 (i)로부터 수집된 세포를 배양 배지 II에서 적어도 4일 동안 적어도 0.5 x 106ml의 세포 밀도로 배양하여 NK 세포 계통에 할당된 복수의 CAR 전구 세포를 함유하는 배양된 CAR 줄기 세포, CAR 전구 세포 또는 둘 다의 컬렉션을 수득한다.
제2 배양 단계 동안, 배지 I를 이용한 배양 단계 후 수득된 CAR-CD34+줄기 세포를 함유하는 세포 집단, 또는 배지 II를 이용한 배양 단계 후 수득된 CAR-줄기- 또는 CAR-NK-전구 세포를 함유하는 세포 집단을 배양 배지 III에서 적어도 7일 동안 적어도 1 x 106/ml의 세포 밀도로 배양하여 복수의 CAR-NK 세포 또는 CAR-NK 전구 세포 또는 둘 다를 함유하는 배양된 세포의 컬렉션을 수득한다.
바람직한 일 구현예에서, 배양 배지 II는 1종 이상의 시토카인을 다음의 농도 범위로 포함한다: G-CSF 50 pg/ml 내지 1000 ng/ml, 바람직하게는 150 내지 400 ng/ml, GM-CSF 2 내지 100 pg/ml, 바람직하게는 5 내지 25 ng/ml, SCF 4 내지 300 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, Flt3-L 4 ng/ml 내지 300 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, IL15 4 ng/ml 내지 300 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, IL-6 2 내지 500 pg/ml, 바람직하게는 20 내지 200 pg/ml 및/또는 IL7 4 ng/ml 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 50 ng/ml. 본 발명의 보다 바람직한 양태에서, 배양 배지 II는 GM-CSF 약 10 pg/ml, G-CSF 약 250 pg/ml, SCF 약 25 ng/ml, Flt3-L 약 25 ng/ml, IL-15 약 20 ng/ml, IL-6 약 50 pg/ml 및 IL7 약 25 ng/ml의 농도로 시토카인을 포함한다. 본 문맥에서 "약"은 약 20％, 바람직하게는 10％, 더 바람직하게는 5％, 가장 바람직하게는 2％의 편차를 의미한다. 바람직하게는, 배양 배지 II는 4 내지 20％ 혈청, 더 바람직하게는 6 내지 15％ 혈청, 가장 바람직하게는 약 10％ 혈청을 포함한다. 바람직하게는, 혈청은 인간 혈청이다. 바람직한 일 구현예에서 배양 배지 III는 1종 이상의 시토카인을 다음의 농도 범위로 포함한다: G-CSF 50 pg/ml 내지 1000 ng/ml, 바람직하게는 150 내지 400 ng/ml, GM-CSF 2 내지 100 pg/ml, 바람직하게는 5 내지 25 ng/ml, SCF 4 내지 300 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, IL-2 200 U/ml 내지 5000 U/ml, 바람직하게는 500 내지 2000 U/ml, IL15 4 ng/ml 내지 300 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, IL-6 2 내지 500 pg/ml, 바람직하게는 20 내지 200 pg/ml 및/또는 IL7 4 ng/ml 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 10 내지 50 ng/ml. 본 발명의 보다 바람직한 양태에서, 배양 배지 III는 시토카인을 GM-CSF 약 10 pg/ml, G-CSF 약 250 pg/ml, SCF 약 20 ng/ml, IL-15 약 20 ng/ml, IL-6 약 50 pg/ml, IL-2 약 1000 U/ml 및 IL7 약 20 ng/ml의 농도로 포함한다. 본 문맥에서 "약"은 약 20％, 바람직하게는 10％, 더 바람직하게는 5％, 가장 바람직하게는 2％의 편차를 의미한다. 바람직하게는, 배양 배지 II는 4 내지 100 ㎍/ml의 헤파린, 바람직하게는 10 내지 40 ㎍/ml의 헤파린, 더 바람직하게는 약 20 ㎍/ml의 헤파린을 포함한다. 바람직하게는, 배양 배지 III는 0.5 내지 10％ 혈청, 더 바람직하게는 1 내지 5％ 혈청, 가장 바람직하게는 약 2％ 혈청을 포함한다. 바람직하게는, 혈청은 인간 혈청이다.
키메라 항원 수용체
본 발명의 방법에 사용되는 바이러스 벡터는 CAR을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 갖는다. 본 발명의 방법에 사용되는 CAR은 다음을 포함하는 재조합 키메라 수용체이다:
(i) 세포외 부분: 이 부분은 세포막 외부로의 CAR의 분비를 담당하는 신호 펩티드로 이루어진다. 신호 서열 바로 뒤에 표적화 또는 항원-특이적 결합 도메인이 온다. 이 도메인은 높은 특이도로 항원과 결합하는 폴리펩티드 서열로 이루어진다. 이 도메인은 높은 특이도를 갖는 임의의 종류의 항체(모노클로날, 폴리클로날, 단일 또는 다중 쇄)로 이루어질 수 있다. 가장 일반적으로, 단일 사슬 가변 단편(scFv)이 CAR-특이도를 전달하기 위하여 사용된다. 표적화 도메인 다음에는 CAR에 유연성을 제공하는 힌지(hinge) 영역, 및 일반적으로 IgG1 중쇄의 불변 영역인 스페이서(spacer) 도메인이 온다.
(ii) 막횡단 부분: 이 부분은 CAR을 NK-세포막에 고정시킨다.
(iii) 세포질 부분: 이 부분은 다양한 활성화 및 공동 자극 도메인을 함유한다. 이러한 도메인은 scFv의 그의 타겟으로의 결합시 세포내 신호 전달 경로로 신호를 전달한다.
용어 종양 항원은 종양 세포에서 발현되는 항원, 예컨대 종양 세포에서 발견되고 정상 조직에 실질적으로 존재하지 않거나 그의 발현이 필수적이지 않은 정상 조직에 제한된 바이오마커 또는 세포 표면 마커를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 용어 "실질적으로 존재하지 않는"은 적어도 생명 유지에 필수적인 정상 세포에 대한 발현 수준이 너무 낮아서 CAR-NK 세포가 상기 정상 세포에 대해 상대적으로 거의 결합을 나타내지 않으므로 독성이 낮다는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 CAR-NK 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 놀랍게도, 키메라 항원 수용체를 갖는 바이러스 벡터를 줄기 세포에 형질도입하기 위하여 적용된 조건이 CAR-CD34+ 줄기 세포를 함유하는 세포 집단의 특정 및 조성 뿐만 아니라, 확장 및 분화 단계로부터 생성된 CAR-NK 세포를 함유하는 최종 세포 집단에도 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다. 본 발명의 방법에 따라 수득가능한 CAR-NK 세포는 NK-세포와 CAR 사이에 상승작용적 치료 효과를 나타낸다. 이러한 효과는 다른 제조 방법으로 수득되는 것보다 더 강력하다. 따라서, 본 발명은 또한 특히 종양 및 혈액암의 치료를 위한 약물에 사용하기 위한, 더 바람직하게는 면역요법에 사용하기 위한, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 CAR-NK 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
용어 "면역 요법"은 질병, 예컨대 암과 싸우기 위해 사람의 면역 체계의 특정 부분을 사용하는 치료를 의미한다. 면역 체계의 일부는 질병을 앓고 있는 사람의 것일 수 있지만, 또한 본 발명의 경우와 같이 "공여자"로 불리는 또 다른 사람의 것일 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 바람직하게는 자가, 비-홑배수 공여자로부터 유래된 면역 이펙터 세포가 면역요법을 필요로 하는 수용자에게 투여되는 세포-기반 면역요법에 사용된다.
본 발명은 바람직하게는, 예를 들어 바람직하게는 T 세포 오염 없이 제대혈(UCB)-유래 CD34+ 전구 세포로부터 면역 이펙터 세포의 대량의 배치의 생성을 위한 GMP-순응 배양 시스템으로 생성된 세포를 사용한다. 이러한 세포는 예를 들어 규제 프로세스를 훨씬 더 쉽게 만드는 더 높은 순응도를 갖기 때문에 이러한 세포를 사용하는 것이 유리하다. 동시에, 본 발명은 면역 이펙터 세포의 이러한 대량의 배치의 사용을 가능하게 하는데, 그 이유는 이전에는 안전성 문제로 인해 예상되는 수용자와의 적어도 부분적 일치에 기초하여 개별 배치가 생성되어야 했기 때문이다. 그러나, 본 발명은, 홑배수일치(haploidentical)인 것을 넘어서 부정합되는, 본 발명에 의해 정의된 바와 같은 면역 이펙터 세포가 면역요법에 사용하기에 안전하고, 효능을 나타낸다는 것을 보여준다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 적어도 하나의 부형제, 예를 들어 주입용 물, 생리 식염수(0.9％ NaCl), 또는 바람직하게는 단백질 성분, 예컨대 인간 혈청 알부민(HAS)으로 치환된 생리 식염수로 이루어진 세포 완충제를 더 포함한다.
본 발명의 조성물을 예를 들어, 비-홑배수 부정합 상황에 사용하기 위하여, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 이식편 대 숙주 질환을 피하기 위하여 B-세포 또는 T-세포 수에 대하여 낮은 것이 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 이식편 대 숙주 질환을 초래하지 않는다. 바람직하게는, 조성물은 5％ 이하의 T 세포 및 5％ 이하의 B 세포, 더 바람직하게는 2％ 이하의 T 세포 및 2％ 이하의 B 세포, 가장 바람직하게는 1％ 미만의 T 세포 및 1％ 미만의 B 세포를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 면역 이펙터 세포가 CAR에 대해 양성인 것 다음으로, 신경 세포 부착 분자(NCAM)에 대해 양성인 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물이 제공된다.
신경 세포 부착 분자(NCAM)는 뉴런, 아교세포, 골격근 및 자연 살해 세포의 표면에서 발현되는 면역글로불린(Ig) 상과의 당단백질이다. CD56으로도 칭해지는 NCAM은 세포-세포 부착, 신경 돌기 생성, 시냅스 가소성, 및 학습 및 기억에 역할을 하는 것으로 나타났다. NCAM은 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 분화된 면역 이펙터 세포의 집단을 한정하기 위하여 사용되고, 말초 혈액에서 환자의 자연 살해 세포로부터 주입된 이펙터 세포를 구별하기 위하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 90％ 초과의 CD56+ 세포, 더 바람직하게는 95％ 초과의 CD56+ 세포, 가장 바람직하게는 98％ 초과의 CD56+ 세포를 포함한다.
통상적으로, 본 발명의 조성물은 복수의 세포를 포함한다. 조성물 중 모든 세포가 본 발명에 의해 정의된 바와 같은 특징 및 효과를 가질 필요는 없다. 그러나, 효율(생성 동안) 및 효능(임상에서)과 관련하여 올바른 균형을 유지하기 위해 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물에 본 발명에서 정의된 바와 같은 면역 이펙터 세포의 적어도 특정 백분율을 갖는 것이 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 복수의 세포를 포함하고, 30 내지 100％, 바람직하게는 30 내지 90％, 더 바람직하게는 30 내지 80％, 더 바람직하게는 30 내지 70％, 더 바람직하게는 30 내지 60％, 더 바람직하게는 30 내지 50％, 가장 바람직하게는 30 내지 40％의 복수의 세포가 본 발명에 의해 정의된 바와 같은 CAR-NK 세포인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물이 제공된다. 바람직하게는, 복수의 세포를 포함하는 조성물은 40 내지 100％, 더 바람직하게는 50 내지 100％, 더 바람직하게는 60 내지 100％, 더 바람직하게는 70 내지 100％, 더 바람직하게는 80 내지 100％, 가장 바람직하게는 90 내지 100％의 복수의 세포가 본 발명에 의해 정의된 바와 같은 CAR-NK 세포인 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물내에서 본 발명에 의해 정의된 바와 같은 CAR-NK 세포의 다른 바람직한 범위는 40 내지 90％, 50 내지 90％, 60 내지 90％, 70 내지 90％, 80 내지 90％, 40 내지 80％, 50 내지 80％, 60 내지 80％, 40 내지 70％, 40 내지 60％, 50 내지 60％ 또는 40 내지 50％이다. 생성 효율을 위하여, 본 발명에 의해 정의된 바와 같은 CAR-NK 세포의 더 낮은 분율이 바람직한 한편, 임상 효능 및 규제 이유를 위하여 본 발명에 의해 정의된 바와 같은 CAR-NK 세포의 더 높은 분율이 바람직하다.
규제의 관점에서 뿐만 아니라, 효율의 관점에서도, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 단일 공여자로부터 수득되는 것이 바람직하다. 단일 공여자가 하나 초과의 치료 용량을 제공하여, 대규모 배치가 제조될 수 있고, 삭제 또는 인증될 수 있고, 무작위의 개체가 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물로 처리되어야 하는 순간에 기성품으로 사용될 수 있는 것이 훨씬 더 바람직하다. 바람직하게는, CAR-NK 세포의 생성은 본 발명에 따라 사용하기 위하여 적어도 10회, 더 바람직하게는 적어도 20회, 더 바람직하게는 적어도 50회, 더 바람직하게는 적어도 100회, 가장 바람직하게는 적어도 200회 이상의 단일 치료 용량에 충분하다. 예를 들어, 약 5Х108 내지 1Х1010개의 세포가 단일 치료에 사용될 경우, 예를 들어 10개의 개체를 치료하기 위하여, 적어도 1011개의 면역 이펙터 세포가 하나의 단일 공여자로부터의 CD34 양성 줄기 또는 전구 세포로부터 생성된다. 이렇게 생성된 세포의 대량의 배치는 바이알 또는 백 당 정확한 양의 세포(예를 들어, 약 5Х108 내지 1Х1010) 세포를 갖는 바이알 또는 백으로 쉽게 옮겨지고, 동결 및 저장될 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물이 필요한 순간에, 이러한 바이알 중 하나 또는 이러한 백 중 하나가 해동되고, 면역요법을 필요로 하는 개체에게 투여하기 위하여 준비될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 복수의 세포가 단일 공여자로부터 수득된 세포로부터 유래된 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물이 제공된다. 바람직하게는, 복수의 세포는 CD34 양성 줄기 및/또는 전구 세포의 풍부한 공급원이기 때문에, 제대혈 및 골수 중 적어도 하나로부터 유래된다.
CAR-NK 세포를 포함하는 기성품 조성물을 사용할 가능성 때문에, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 개별 수용자와 일치하는 개별 공여자를 더 이상 찾을 필요가 없기 때문에 세포 입양 요법을 개인 맞춤형 약물에서 보다 일반적인 약물로 한 단계 더 이동시킨다. 이것은 또한 치료 비용에 유익한 영향을 미친다.
본원에서 사용된 "기성품"이란 이러한 조성물이 필요할 때 직접 사용하기 위하여 제조 및 저장된다는 것을 의미한다. 특히, "기성품"으로 이용가능한 조성물은 한 특정 수용자를 위해 생성되는 것이 아니라, 일반적으로 여러 시점에 여러 수용자를 위하여 사용될 수 있다. 본원에 의해 정의된 바와 같은 조성물은, 예를 들어 동결되고, 필요할 때 해동되고, 본원에 의해 정의된 바와 같이 사용될 수 있다. 본원에 의해 정의된 바와 같은 조성물은 임의의 무작위 수용자를 위하여 필요할 때 이론적으로 몇 분이내에 제공될 수 있는 GMP 생성 면역 이펙터 세포의 대규모 생성을 가능하게 한다.
일 구현예에서, 본 발명은 CAR-NK 세포를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 다음의 단계:
(i) a) CD34+ 조혈모세포를 포함하는 샘플을 제공하고,
b) 상기 샘플 중 CD34+ 조혈모세포를 정제하고,
c) 배양 배지 I의 존재 하에 정제된 CD34+ 조혈모세포를 배양하고,
d) CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 상기 CAR을 발현하는 CD34+ 줄기 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하고,
e) 선택적으로 세포 집단을 배양 배지 I에서 적어도 1일 동안 배양하는 것을 포함하고, 여기서 배양 배지 I는 시토카인의 컬렉션을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 인터루킨-7, 및 줄기 세포 인자(SCF), flt-3리간드(FLT-3L), 트롬보포이에틴(TPO) 중 1종 이상, 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 및 인터루킨-6(IL-6) 중 2종 이상을 포함하는 것인 제1 단계,
(ii) 단계 (i)로부터의 CAR-CD34+ 줄기 세포를 배양 배지 II에서 배양하여 CAR 줄기 세포 및 CAR 전구 세포를 함유하는 세포 집단을 수득하는 것을 포함하는, 단계 (i)로부터의 세포 집단이 CAR-NK 세포 및 전구 CAR-NK 세포를 함유하는 세포 집단으로 확장 및 분화되는 임의의 제2 단계 및
(iii) 단계 (i) 또는 단계 (ii)로부터의 세포 집단이 CAR-NK 세포 및 전구 CAR-NK 세포를 함유하는 세포 집단으로 추가로 확장 및 분화되는 제3 단계
를 포함하고, 여기서 배양 배지 II는 시토카인의 컬렉션을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 SCF, FLT-3L 인터루킨-15(IL-15) 및 IL-7 중 2종 이상 및 GM-CSF, G-CSF 및 IL6 중 2종 이상을 포함하고,
여기서, 배양 배지 III는 시토카인의 컬렉션을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 SCF, IL-7, IL-15 및 인터루킨-2(IL-2) 중 2종 이상 및 GM-CSF, G-CSF 및 IL-6 중 2종 이상을 포함하는 것인 방법에서 생체외 생성된다.
조혈 줄기 및/또는 전구 세포를 포함하는 샘플은, 예를 들어 줄기 및/또는 전구 함유 세포 공급원, 예컨대 골수, 제대혈, 태반 물질, 말초 혈액, 세포 배양 단계를 사용하여 배아 줄기 세포 또는 이의 임의의 변형체로부터 생체외 생성되거나, 세포 배양 단계를 사용하여 유도된 만능 줄기 세포 및 이의 임의의 변형체로부터 생체외 생성된 줄기 세포 동원제로 치료된 사람의 말초 혈액을 수득 또는 수집하는 것과 같은 임의의 가능한 방식으로 수득될 수 있다. 조혈 줄기 및/또는 전구 세포는 친화성 정제 방법을 사용하여 이러한 줄기 및/또는 전구 함유 세포 공급원으로부터 추가로 정제될 수 있다.
용어 "생체외"는 수행되는 프로세스 또는 방법이 살아있는 개체내에서 사용되는 것이 아니라, 예를 들어 세포를 배양할 수 있는 장치, 바람직하게는 개방형 또는 폐쇄형 세포 배양 장치, 예컨대 배양 플라스크, 일회용 백 또는 생물반응기에서 사용된다는 것을 의미한다.
용어 "CD34+ 줄기 세포"는 세포 표면에서 CD34 항원을 발현하는 다능성 줄기 세포를 의미하며, 바람직하게는 모든 특정 유형의 혈액 세포에서 발달할 수 있는 줄기 세포 및 더 바람직하게는 혈통의 계통 특이적 전구 세포를 야기할 수 있는 세포이다.
용어 "CD34+ 전구 세포"는 세포 표면에서 CD34 항원을 발현하는 다능성 전구 세포를 의미하며, 바람직하게는 다양한 유형의 혈액 세포에서 발달할 수 있는 전구 세포 및 더 바람직하게는 특정 혈통의 계통 특이적 전구 세포를 야기할 수 있는 세포이다.
본원에서 사용된 용어 "친화성 정제"는 정제될 세포가, 예를 들어 분리 목적을 위하여 특정한 관심 에피토프를 표적화함으로써, 예를 들어 분리를 위한 방법에 의한 검출에 적합한 제제와 결합된 항체로 항원을 표적화하고, 예를 들어 정제 방법, 예컨대 형광 발광 활성화 세포 분류(FACS)를 위하여 형광색소와 결합된 항체를 사용하고/거나 예를 들어 자기 선택 절차를 위해 자기 입자에 결합된 항체를 사용함으로써 표지되는 것을 의미한다. 친화성 정제 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 항원과 항체, 효소와 기질, 또는 수용체와 리간드 사이의 상호작용과 같은 고도로 특이적인 상호작용에 기초하여 생화학적 혼합물을 분리하는 임의의 방법일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "확장"은 바람직하게는 일반적으로 "분화"라고 칭해지는 세포의 표현형의 본질적인 변화 없이 세포 배양 단계에 의해 야기되는 세포 분열 사건으로 인한 세포의 증식을 의미한다. 구 "세포의 표현형의 본질적인 변화 없이"는 세포가 바람직하게는 그의 기능, 그의 세포 표면 마커 및/또는 그의 형태가 변하지 않는다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "분화하는"은 세포의 표현형이 변하는 것을 의미하며, 이는 세포 배양 과정 동안 특정 표면 분자의 발현이 변화되고, 세포 기능이 변화되고/거나 세포의 형태가 변화되는 것을 의미하며, 여기서 세포는 바람직하게는 세포 배양 배지의 첨가로 인하여 여전히 확장될 수 있다. 상기 지시된 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명에 의해 정의된 바와 같은 면역요법에 사용하기 위한 조성물이 종양의 치료에 특히 유용하다는 것을 알아내었다. 바람직한 구현예에 따라, 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 종양의 치료를 위한 것이다. 종양은 본 발명의 의미내에서 조혈 종양 또는 고형 종양을 포함한다. 종양은 악성 또는 양성일 수 있다.
본 발명에 따른 면역요법에 사용하기 위한 조성물은 종양의 치료에서, 특히 조혈 종양, 예컨대 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료에서 상이한 단계에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 의해 예시된 바와 같이, 조성물은 바람직하게는 골수 이식을 받을 수 없는 환자(노인)에서 강화 요법으로 사용될 수 있다. 또한, 또 다른 치료를 사용한 다른 환자들에 의해 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 면역 이펙터 세포 요법은 바람직하게는 유도 요법에 대해 완전한 완화에 도달하지 못한 환자(난치성 환자) 또는 유도 요법 직후에 재발하는 환자(재발성 환자)를 위해 사용될 수 있다. 동종 HSTC 요법에 있어서 본 발명에 의해 정의된 바와 같은 면역 이펙터 세포의 추가의 용도와 같이, 면역 이펙터 세포 요법의 다른 강화 요법으로의 도입이 또한 가능하고 바람직하다.
바람직한 구현예에서, 하나의 치료로 투여되는 조성물이 적어도 5Х105개의 세포 및 5Х1011개 이하의 세포를 포함하는 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물이 제공된다.
본 발명의 조성물은 임의의 허용가능한 방법을 통해 투여될 수 있되, 단 면역 이펙터 세포는 개체에서 그의 타겟에 도달할 수 있다. 예를 들어, 정맥내 경로 또는 안구, 피부, 폐, 협측 및 비강내 경로를 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 국부 경로를 통해 본 발명의 조성물을 투여할 수 있다. 본원에서 사용된 국부 경로는 또한 예를 들어 골수에서와 같은 임의의 직접적인 국소 투여를 의미하지만, 또한 예를 들어 고형 종양에 직접 주사되는 것을 의미한다. 예를 들어, 면역요법이 위장관의 점막층에 대한 영향을 목표로 하는 특정 경우에, 경구 경로가 사용될 수 있다.
바람직하게는, 조성물이 정맥내 경로 또는 국부 경로 또는 경구 경로 또는 이들 경로의 임의의 조합에 의해 투여되는 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물이 제공된다. 본원에서 사용된 용어 "국부"는 면역 이펙터 세포가 바람직하게는 종양 부위에 국소적으로 적용되는 것을 의미하며, 이는 임의의 해부학적 부위에 국한될 수 있고, 보다 구체적으로 종양은 골수 또는 임의의 다른 기관에 국한될 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 한번 투여될 수 있지만, 필요하다고 여겨질 경우, 조성물은 여러 번 투여될 수 있다. 이는 1일, 1주 또는 심지어 1달에 여러 번일 수 있다. 또한, 제1 투여, 예를 들어 주입의 임상 결과를 먼저 기다리고, 필요하다고 여겨질 경우, 조성물이 효과적이지 않을 경우, 제2 투여, 및 심지어 제3, 제4 등이 제공될 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 종양의 치료를 위하여 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 종양은 조혈 또는 림프 종양이거나, 종양은 고형 종양이다.
용어 "혈액학적", "조혈" 또는 "림프" 종양은, 이들이 조혈 및 림프 조직의 종양인 것을 의미한다. 조혈 및 림프 악성 종양은 혈액, 골수, 림프 및 림프계에 영향을 미치는 종양이다.
종양이 조혈 또는 림프 종양일 경우, 종양이 백혈병, 림프종, 골수형성이상 증후군 또는 골수종 중 1종 이상, 바람직하게는 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 T 세포 백혈병, 급성 림프모구 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 단핵구 백혈병(AMoL), 외투 세포 림프종(MCL), 조직구 림프종 또는 다발성 골수종, 바람직하게는 AML로부터 선택된 백혈병, 림프종 또는 골수종인 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물이 제공된다.
종양이 고형 종양인 경우, 종양이 선암, 편평 세포 암종, 선편평세포암종 역형성암종, 대세포 암종 또는 소세포 암종, 간세포 암종, 간모세포종, 결장 선암, 신장 세포 암종, 신장 세포 선암, 결장 암종, 결장 선암, 교모세포종, 신경아교종, 두경부암, 폐암, 유방암, 메르켈(Merkel) 세포 암, 횡문근육종, 악성 흑색종, 표피모양 암종, 폐 암종, 신장 암종, 신장 선암, 유방 암종, 유방 선암, 유방관 암종, 비소세포폐암, 난소암, 경구암, 항문암, 피부암, 유잉육종, 위암, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 빌름스(Wilms) 종양, 발덴스트룀(Waldenstroem) 거대글로불린혈증, 췌장 암종, 췌장 선암, 자궁경부 암종, 편평 세포 암종, 수모세포종, 전립선 암종, 결장 암종, 결장 선암, 이행 세포 암종, 골육종, 관 암종, 대세포 폐 암종, 소세포 폐 암종, 난소 선암, 난소 기형암종, 방광 유두종, 신경아세포종, 교모세포종 다형성, 교모세포종 성상세포종, 상피모양 암종, 흑색종 또는 망막아종의 악성 신생물 또는 전이성 유도 이차 종양 중 하나인 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물이 제공된다.
바람직한 구현예에서, 고형 종양이 선암, 편평 세포 암종, 선편평세포암종, 자궁경부 암종, 소세포 암종 및 흑색종으로부터 선택된 자궁경부암의 악성 신생물 또는 전이성 유도 이차 종양으로부터 선택된 것인 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물이 제공된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 고형 종양이 선암, 편평 세포 암종, 결장 선암, 결장 암종, 결장 선암, 결장 암종 및 흑색종으로부터 선택된 결장암의 악성 신생물 또는 전이성 유도 이차 종양으로부터 선택된 것인 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물이 제공된다.
본 발명의 조성물은 현재까지 알려진 치료 옵션과 관련하여 몇가지 이점을 갖는다. 본 발명의 조성물은 HPV 유형, 종양 조직학, 종양 EGFR 발현 및 KRAS 상태와 무관하게 유익하다. 그 외에, 본 발명의 면역 이펙터 세포는 또한 HLA-E, HLA-G 및 (IDO) 억제를 극복하여, 종양, 특히 자궁경부암 및 결장암에 대한 향상된 항종양 효과를 초래한다.
일반적으로 설명되는 바와 같이, 용어 "표피 성장 인자 수용체" 또는 EGFR은 거의 모든 건강한 조직에서 널리 발현되는 세포 표면 단백질을 의미한다. EGFR 단백질은 막횡단 당단백질에 의해 코딩되고, 단백질 키나제 집단의 구성원이다. 하류 신호 전달 경로에서 EGFR 및 돌연변이의 과발현은 결장, 폐 및 자궁경부와 같은 여러 고형 종양에서 나쁜 예후와 관련이 있었다.
용어 키르스텐(Kirsten) 래트 육종 바이러스 종양 유전자(KRAS)는 EGFR 하류 신호 전달 경로의 일부인 정상 조직 신호 전달을 조절하는데 적극적으로 관여하는 유전자를 의미한다. 그러나, 결장, 직장 및 폐의 고형 종양 중 종양 세포에서 KRAS 유전자의 돌연변이가 보고되었다. 결장암 환자의 50％ 초과에서 발생하는 이러한 활성화 돌연변이는 종양 세포가 세툭시맙(cetuximab) 및 파니투무맙(panitumumab)과 같은 EGFR 표적화 약물을 회피하는데 도움을 준다.
본원에서 사용된 용어 "인유두종 바이러스(HPV)"는 여성에서 자궁경부암을 유발하는 바이러스 군을 의미한다. HPV 바이러스는 입, 인후, 외음부, 자궁경부 및 질을 둘러싼 피부 및 습한 막에 영향을 미친다. HPV 감염은 비정상적인 세포 변화를 야기시켜 자궁경부에 암을 유발한다.
본원에 사용된 용어 인돌레아민 2,3 디옥시게나제(IDO)는 아미노산 L-트립토판의 N-포르밀키누레닌으로의 분해에 있어서 촉매로서 작용하는 효소를 나타낸다. 전립선, 위, 난소, 자궁경부 및 결장의 고형 종양에서 일반적으로 보고되는 IDO의 과발현은 종양 세포가 세포독성 T 세포 및 NK 세포에 의한 사멸을 회피할 수 있게 한다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에서 보다 상세하게 기재된다.
도 1:본 발명자들은 단일 클로닝 절차를 통한 신규 scFv 단백질의 용이한 도입을 허용하는 모듈식 CAR 분자를 설계하였다. FseI-SbfI-플랭킹된 스터퍼(stuffer) 단편은 표적화 분자의 빈 CAR 주쇄로의 용이한 원활한 클로닝을 허용한다. 도 1b 및 c에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 형질도입된 NK 세포를 각각 BCMA+ 또는 EGFR+ 종양 세포에 대해 표적화하는 scFv 단백질을 이러한 공간으로 삽입하였다. 도 1d는 임의의 인간 단백질에 대해 결합 친화성을 갖지 않는 무관한 scFv를 함유하는 대조군 벡터를 예시한다. IgD 힌지 영역은 CAR에 유연성을 부여하는 한편, 최적화된 IgG1 중쇄 서열은 스페이서 영역으로 기능한다. CAR은 CD28 막횡단 서열을 통해 막에 고정된다. 이러한 3세대 CAR은 CD28 및 OX-40의 공동 자극 도메인 및 CD3제타의 활성화 도메인을 함유한다. 도 1e는 세포막에 대한 각각의 도메인의 위치를 나타낸다. 화살표는 scFvs(FseI 및 SbfI를 통해)를 도입하고, CAR을 렌티바이러스 전달 플라스미드(CAR의 양쪽에 있는 화살표)로 전달하거나, 공동 자극 또는 활성화 도메인(각각의 도메인 옆에 있는 화살표)을 변화시키는데 사용될 수 있는 고유한 제한 부위를 나타낸다.
도 2: 2개의 공여자를 사용한 2가지 상이한 배양 조건으로부터의 유동 세포 분석 데이터의 대표적인 예. 생존가능한 세포는 CD45+ 림프구에 대해 게이팅(gate)된다. 도면은 조혈 줄기 및 전구 세포가 본 발명에 기재된 기술에 따라 확장 및 분화될 경우 NK 세포 (A) 및 전구 세포 (B)에서 CD44v6의 발현을 예시한다. A. 29일째 oNKord 세포의 CD44v6 발현(％CD56: 92％), B. 14일째 oNKord 전구 세포에서 CD44v6 발현(％CD56: 1.2％).
도 3: CD34+ 세포에서 형질도입 효율. MOI 20에서 EGFP를 함유하는 VSV-G 위형(pseudotyped) 렌티바이러스 입자를 사용하여 CD34+ HSC 세포를 형질도입하였다. 세포를 이후 29일 동안 확장/분화 배지에서 확장시키고, EGFP 양성 세포의 백분율을 유동 세포 분석에 의해 결정하였다. 3개의 상이한 공여자를 형질도입에 사용하고, 측정을 3번 수행하였으며, 평균±SD를 나타낸다.
도 4: CD34+ HSC로부터 유래된 전구체의 형질도입. CD34+ HSC(NK)로부터 유래된 전구체 세포를 확장/분화 배지에서 배양 21, 28 및 34일 후에 MOI 20에서 EGFP를 함유하는 VSV-G 위형 렌티바이러스 입자를 사용하여 형질도입하였다. 세포를 형질도입 후 후속 6일 동안 분화 배지에서 유지시키고, EGFP 양성 세포의 백분율을 유동 세포 분석에 의해 결정하였다. 3개의 상이한 공여자를 형질도입에 사용하고, 측정을 2번 수행하였으며, 3개의 상이한 공여자의 평균±SD를 나타낸다.
실시예 1: 3세대 CAR 구조물의 생성
본 실시예에서 사용된 CAR 구조물은 적합한 발현 벡터로의 용이한 전달을 허용하는 플랭킹 제한 부위를 갖는 단일 폴리뉴클레오티드로서 ID&T DNA 테크놀로지즈(technologies)에 의해 합성으로 생성되었다. CAR 발현 카세트(cassette)는 인간 세포에서 효율적인 발현을 위해 충분히 인간 코돈 최적화되었다. 벡터는 CD8a 신호 펩티드, FseI-SbfI 플랭킹된 스터퍼 단편, IgD 힌지 영역, IgG Fc 감마 수용체에 대한 결합을 피하고 따라서 선천 면역 세포의 의도하지 않은 활성화를 억제하도록 최적화된 IgG1 중질 불변 단편(Hombach et al., Gene Therapy, 2010), CD28 막횡단 도메인, CD28 공동-활성화 도메인, OX40 공동-활성화 도메인 및 CD3제타 활성화 도메인으로 이루어졌다. 각각의 (공동)활성화 도메인은 각각의 개별 도메인의 시험을 허용하는 고유한 제한 부위에 의해 플랭킹되었다.
이러한 CAR 카세트의 개략적인 버전이 도 1에 도시되어 있다.
이러한 CAR 카세트의 단백질 서열이 하기에 나타나있다:
CD8a 선도 서열:
Figure pct00003
FseI-SbfI 플랭킹된 스터퍼 단편:
Figure pct00004
IgD 힌지 영역:
Figure pct00005
최적화된 IgG1 중쇄 Fc 부분, 최적화됨:
Figure pct00006
CD28 막횡단 도메인:
Figure pct00007
CD28 공동-활성화 도메인:
Figure pct00008
OX40 공동-활성화 도메인:
Figure pct00009
CD3제타 활성화 도메인:
Figure pct00010
(다발성 골수종의 치료를 위하여) BCMA 및 (전이성 결장암, 전이성 비소세포폐암 및 두경부암의 치료를 위하여) EGFR에 대한 특이적 CAR을 생성하기 위하여, 본 발명자들은 원활한 클로닝에 의해 BCMA 및 EGFR에 대한 단일-쇄 가변 단편 단백질 서열을 스터퍼 단편으로 대체하였다.
BCMA(출처: 특허 US 2016/0046724 A1):
Figure pct00011
EGFR(출처: 세툭시맙 항체 서열):
Figure pct00012
전체 CAR 카세트(관련 ScFv 서열 포함)는 CAR 카세트를 플랭킹하는 고유한 제한 부위를 통해 3세대 렌티바이러스 주쇄 플라스미드로 삽입되었다. 이 벡터에서, EF1알파 프로모터는 CAR 폴리뉴클레오티드의 구성적 발현을 유도하였다.
바이러스 벡터는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 선택된 렌티바이러스 전달 플라스미드와 조합하여 3세대 보조(helper) 플라스미드의 형질감염에 의해 HEK293T 세포에서 생성되었다. 24시간 형질감염 후, 세포는 10％ FBS로 보충된 기본 배양 배지를 보충하고, 5％ CO2 및 37
Figure pct00013
에서 인큐베이션하였다. 48시간 후, 바이러스 벡터의 제1 수거를 수행하고, 생산자 세포에 상기한 배지를 보충하였다. 또 다른 24시간 후, 제2 및 최종 수거를 수행하였다.
그 다음, 두 수거물을 합하고, 0.22 um 또는 0.45 um PES 필터를 통해 여과하고, 벤조나제(50 U/ml)로 처리하여 임의의 잔여 플라스미드 DNA를 제거하였다. 그 다음, 바이러스 상청액을 PEG6000 침전에 의해 농축하였다. 간단히, 바이러스 상청액을 4x 침전 완충제(0.5 M NaCl 및 7.5％ PEG6000으로 이루어짐)와 혼합하고, 4
Figure pct00014
에서 7000 x g에서 20분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 상청액을 제거하고, 적절한 배양 배지에 재현탁시키고, 하류 형질도입에 즉시 사용하거나, 후속 사용을 위하여 -80
Figure pct00015
에서 저장하였다.
여기서, 본 발명자들은 4가지 상이한 성장 배지를 구별하였다:
기본 배지 추가의 시토카인
배지 A 셀제닉스(CellGenix)®GMP 줄기 세포 성장 배지 100 ng/ml Flt3-L, 100 ng/ml SCF, 50 ng/ml TPO 및 50 ng/ml IL-3
배지 B 셀제닉스®GMP 줄기 세포 성장 배지 100 ng/ml Flt3-L, 100 ng/ml SCF, 50 ng/ml TPO 및 50 ng/ml IL-6
배지 C 글리코스템(Glycostem) 기본 성장 배지 100 ng/ml Flt3-L, 100 ng/ml SCF, 50 ng/ml TPO 및 50 ng/ml IL-7
배지 D 글리코스템 기본 성장 배지 25 ng/ml Flt3-L, 25 ng/ml SCF, 25 ng/ml TPO 및 25 ng/ml IL-7, 10％ 인간 혈청, 10 pg/ml GM-CSF, 250 pg/ml G-CSF 및 50 pg/ml IL6
실시예 2: 렌티바이러스 벡터에 의한 CD34 + 조혈모세포의 형질도입
본 발명의 방법의 제1 단계 동안, CD34+ 줄기 세포를 면역자기 분리 기술에 의해 출발 물질로부터 단리시키고, 이후에 CAR을 코딩하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 렌티바이러스 벡터에 의해 형질도입시켜 CAR-NK 세포를 생성하였다. 목표는 본 발명의 방법의 제2 단계에서 확장되는 CAR-NK 세포의 안정한 집단을 얻는 것이었다.
출발 물질
본 발명의 방법에 사용되는 출발 물질은 체성 줄기 세포로도 칭해지는 성체(배아 후) 줄기 세포를 함유하는 생물학적 샘플이었다. 본원에서 사용된 용어 생물학적 샘플은 인간으로부터 유래된 샘플을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 사용된 출발 물질은 제대혈이었다.
CD34+ 줄기 세포 집단의 단리
CD34+ 줄기 세포를 밀테니 프로디지(Miltenyi Prodigy)® 폐쇄계 세포 제조 플랫폼을 통해 제대혈로부터 단리시켰다. 간단히, CD34-접합된 자기 비드를 통해 자기 분리에 의해 세포를 정제하였다. 최종 생성물은 배양 배지 I에서 수집된 순수한 CD34+ 집단이며, 확장 및/또는 분화, 형질도입에 사용되거나, 제어된 온도 프로파일을 통해 냉동기에서 동결되었다.
CAR-NK 집단을 수득하기 위한 CD34+ 세포의 형질도입
단리 또는 해동 직후, CD34+ 줄기 세포를 계수하고, 1-50의 MOI에서 실시예 1에서 제조된 바이러스 스톡(stock)에 즉시 재현탁시키고, 레트로넥틴-코팅된 플레이트에 플레이팅하였다. 선택적으로, 형질도입 효율은 폴리브렌 10 ug/ml 또는 프로타민 설페이트 10 ug/ml의 첨가에 의해 향상될 수 있다.
대조군 세포를 포함하여, 본 발명자들은 다음과 같이 구별하였다:
세포 배지 MOI 조건
CD34+ 배지 A 1 BCMA에 대한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 A 10 BCMA에 대한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 A 50 BCMA에 대한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 A 1 EGFR에 대한 scFv를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 A 10 EGFR에 대한 scFv를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 A 50 EGFR에 대한 scFv를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 A 1 무관한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터 (CAR-NK-IRR)
CD34+ 배지 A 10 무관한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터 (CAR-NK-IRR)
CD34+ 배지 A 50 무관한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터 (CAR-NK-IRR)
CD34+ 배지 A N/A MOCK
CD34+ 배지 B 1 BCMA에 대한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 B 10 BCMA에 대한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 B 50 BCMA에 대한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 B 1 EGFR에 대한 scFv를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 B 10 EGFR에 대한 scFv를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 B 50 EGFR에 대한 scFv를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 B 1 무관한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터 (CAR-NK-IRR)
CD34+ 배지 B 10 무관한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터 (CAR-NK-IRR)
CD34+ 배지 B 50 무관한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터 (CAR-NK-IRR)
CD34+ 배지 B N/A MOCK
CD34+ 배지 C 1 BCMA에 대한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 C 10 BCMA에 대한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 C 50 BCMA에 대한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 C 1 EGFR에 대한 scFv를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 C 10 EGFR에 대한 scFv를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 C 50 EGFR에 대한 scFv를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 C 1 무관한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터 (CAR-NK-IRR)
CD34+ 배지 C 10 무관한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터 (CAR-NK-IRR)
CD34+ 배지 C 50 무관한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터 (CAR-NK-IRR)
CD34+ 배지 C N/A MOCK
CD34+ 배지 D 1 BCMA에 대한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 D 10 BCMA에 대한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 D 50 BCMA에 대한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 D 1 EGFR에 대한 scFv를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 D 10 EGFR에 대한 scFv를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 D 50 EGFR에 대한 scFv를 함유하는 CAR-T 벡터
CD34+ 배지 D 1 무관한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터 (CAR-NK-IRR)
CD34+ 배지 D 10 무관한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터 (CAR-NK-IRR)
CD34+ 배지 D 50 무관한 scFV를 함유하는 CAR-T 벡터 (CAR-NK-IRR)
CD34+ 배지 D N/A MOCK
선택적으로, 24시간 형질도입 후, 세포를 선택된 배지로 세척하고, 동일한 MOI에서 다시 형질도입하였다. 24시간의 인큐베이션 후, 세포에 배양 배지 II를 보충하였다.
실시예 3: CAR-CD34+ 세포의 확장 및 분화
세포 배양
조건 A-D의 형질도입된 세포를 직접 배양하거나, 냉동보존된 CAR이 형질도입될 경우, 조건 A-D로부터의 MOCK 전구 세포를 2.5mM MgCl2 및 0.13mg/ml DNAse로 보충된 인간 혈청 알부민으로 이루어진 해동 완충제에서 해동시켰다. CD34+ UCB 세포를 조건 A-D에 대해 0.02-2Х10^6 세포/ml의 세포 농도로 새로운 배양 배지 I에서 조직 배양 처리된 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다.
확장 단계
세포 생존력, CD34 함량 및 CAR 발현에 대한 유동 세포 분석 데이터를 확장 단계에서 측정하여 최적의 세포 배양 조건을 모니터링하고 제공하였다. CD34+ UCB 세포를 10％ 인간 혈청으로 보충된 GBGM, 10 pg/ml GM-CSF, 250 pg/ml G-CSF 및 50 pg/ml IL-6; 25 ng/ml SCF, Flt-3L, TPO, IL-7을 함유하는 저 용량 시토카인 칵테일로 이루어진 새로운 배양 배지 I에서 배양하였다. 조건 A-D로부터의 세포를 9일까지 배양 배지 I에서 배양하였다. 배양 배지 I는 일주일에 2 내지 3일마다 다시 채웠다. 10일째에, 전구 세포를 배양 배지 II를 첨가하여 25 mg/ml TPO를 20 ng/ml IL-15로 대체함으로써 배양하였다.
분화 단계
분화 동안, NK-세포의 마커로서 CD56 함량을 세포 생존력 및 CAR 발현과 함께 CD34 함량 대신 측정하였다. 분화 배지(배양 배지 III로도 공지됨)는 2％ 인간 혈청으로 보충된 GBGM, 10 pg/ml GM-CSF, 250 pg/ml G-CSF 및 50 pg/ml IL-6; 20 ng/ml SCF, IL-15, IL-7 및 1000U/ml IL-2(프로류킨(Proleukin))를 함유하는 저 용량 시토카인 칵테일로 이루어졌다. 배양이 끝날 때까지 일주일에 2번 분화 배지를 다시 채웠다.
BCMA 및 EGFR 형질도입된 UCB-NK 세포에서 CAR 발현은 조건 A-C 형질도입된 NK-세포에서 비교적 높은 CAR 발현, 및 조건 D 형질도입된 NK-세포에서 중간 발현을 나타내었다.
실시예 4: CAR-NK-BCMA 및 CAR-NK-EGFR 세포 대 대조군 CAR-NK-IRR 및 MOCK 세포의 항-종양 가능성
NK-세포 세포독성에 대해 민감-, 중간- 및 저항을 나타내는 일련의 다발성 골수종 및 결장암 세포주(하기 표 참조)에 대하여 조건 A 내지 D로부터의 Mock 및 CAR 형질도입된 UCB-NK 세포를 사용한 배양의 종료시 시험관내 기능 분석을 수행하였다.
골수종 세포주 결장암 세포주
RPMI-8226 HT-29
U-266 TC71
OPM-2 HCT-15
LP-1 SW480
SK-MM2 COLO320
NCI-H929 RKO
타겟 세포(상기 표 참조)를 37
Figure pct00016
에서 10분 동안 1Х10^7 세포/ml의 농도에서 5 μM 퍼시픽 블루 숙신이미딜 에스테르(PBSE)로 표지하였다. 타겟 세포를 타겟 배양 배지에서 세척하고, 5Х10^5 세포/ml로 농축시켰다. NK-세포를 5Х10^5 세포/ml로 또한 농축시키고, 밤새 분석에서 타겟 세포(100 ㎕ 이펙터 + 100 ㎕ 타겟)와 공동 배양하였다. 탈과립 측정 동안 인큐베이션의 개시시 항-CD107a를 첨가하고, 인큐베이션의 종료시 NK-세포 구별을 위하여 항-CD56을 첨가하였다. 1:1의 이펙터:타겟(E:T) 비에 대한 세포사멸 7AAD 생존성 마커에 대하여 유동 세포 분석 판독을 기반으로 세포 독성을 계산하였다.
민감 종양 세포주(상기 표 참조)에 대하여 조건 D에 비해 조건 A 내지 C로부터의 BCMA 및 EGFR 형질도입된 UCB-NK 세포에 대해 더 낮은 세포독성이 관찰되었다.
실시예 5: CD34+ 세포의 확장 및 분화
세포 배양
CD34+ UCB 세포를 조건 A 내지 D에 대해 0.02~2Х10^6 세포/ml의 세포 농도로 새로운 배양 배지 I에서 조직 배양 처리된 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다.
확장 단계
CD45 및 CD56 뿐만 아니라 CD44v6에 대한 유동 세포 분석 데이터를 확장 단계에서 측정하여 최적의 세포 배양 조건을 모니터링하고 제공하였다. CD34+ UCB 세포를 10％ 인간 혈청으로 보충된 GBGM, 10 pg/ml GM-CSF, 250 pg/ml G-CSF 및 50 pg/ml IL-6; 25 ng/ml SCF, Flt-3L, TPO, IL-7을 함유하는 저 용량 시토카인 칵테일로 이루어진 새로운 배양 배지 I에서 배양하였다. 세포를 9일까지 배양 배지 I에서 배양하였다. 배양 배지 I는 일주일에 2 내지 3일마다 다시 채웠다. 10일째에, 전구 세포를 배양 배지 II를 첨가하여 25 mg/ml TPO를 20 ng/ml IL-15로 대체함으로써 배양하였다. 14일째에 도 2에 나타낸 바와 같이 CD56 NK 세포 함량 및 CD44v6 발현에 대해 세포 배양을 분석하였다.
분화 단계
분화 동안, NK-세포의 마커로서 CD56 함량을 CD45 및 CD44v6 발현과 함께 측정하였다. 분화 배지(배양 배지 III로도 공지됨)는 2％ 인간 혈청으로 보충된 GBGM, 10 pg/ml GM-CSF, 250 pg/ml G-CSF 및 50 pg/ml IL-6; 20 ng/ml SCF, IL-15, IL-7 및 1000U/ml IL-2(프로류킨)를 함유하는 저 용량 시토카인 칵테일로 이루어졌다. 배양이 끝날 때까지 일주일에 2번 분화 배지를 다시 채웠다. 29일째에 도 2에 나타낸 바와 같이 CD56 NK 세포 함량 및 CD44v6 발현에 대해 세포 배양을 분석하였다.
실시예 6: 렌티바이러스 벡터에 의한 CD34 + 조혈모세포 및 CD34+ 조혈모세포로부터 유래된 전구체 세포의 형질도입
CD34+ 줄기 세포를 면역자기 분리 기술에 의해 출발 물질로부터 단리시키고, 이후에 EGFP를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 VSVG 엔벨로프(envelop)에 의해 위형된 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켜 EGFP-NK 세포를 생성하였다(pLenti CMV GFP Puro (658-5) ; Addgene plasmid # 17448 ; n2t.net/addgene:17448 ; RRID:Addgene_17448 ; Campeau E, Ruhl VE, Rodier F, Smith CL, Rahmberg BL, Fuss JO, Campisi J, Yaswen P, Cooper PK, Kaufman PD.. PLoS One. 2009 Aug 6;4(8):e6529). 대안적으로, CD34+ 줄기 세포를 이전에 기재된 바와 같이 배양하여(Method III in Spanholtz J, Tordoir M, Eissens D, Preijers F, van der Meer A, Joosten I, et al. PLoS ONE 2010 5(2): e9221) 전구체 세포를 얻고; 이러한 전구체 세포를 추가의 확장 및 분화 전에 21, 28 또는 34일에 상기 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다.
출발 물질
여기서, 본 발명자들은 2가지 상이한 성장 배지를 구별하였다:
기본 배지 추가의 시토카인
배지 A 글리코스템 기본 성장 배지 50 ng/ml Flt3-L, 50 ng/ml SCF, 50 ng/ml TPO 50 ng/ml IL-7, 20 pg/ml GM-CSF, 500 pg/ml G-CSF 및 100 pg/ml IL6
배지 B 글리코스템 기본 성장 배지 20 ng/ml SCF, 20 ng/ml IL-7, 2％ 인간 혈청, 10 pg/ml GM-CSF, 250 pg/ml G-CSF, 50 pg/ml IL6, 25 ng/mL IL-7, 20 ng/mL IL-15, 20 ng/mL SCF, 1000 U/mL IL-2
CD34+ 줄기 세포 집단의 단리
CD34+ 줄기 세포를 밀테니 프로디지® 폐쇄계 세포 제조 플랫폼(밀테니 바이오테크 비.브이.앤드코 케이지(Miltenyi Biotec B.V.&Co KG), 독일 베르기슈 글라트바흐 소재)을 통해 제대혈로부터 단리시켰다. 간단히, CD34-접합된 자기 비드를 통해 자기 분리에 의해 세포를 정제하였다. 최종 생성물은 배양 배지 I에서 수집된 순수한 CD34+ 집단이며, 확장 및/또는 분화에 사용되거나, 제어된 온도 프로파일을 통해 냉동기에서 동결되었다.
EGFP-NK 집단을 수득하기 위한 CD34+ 세포 또는 이로부터 유래된 전구체의 형질도입
해동 직후, CD34+ 줄기 세포를 배지 A에 재현탁시켰다. 24시간 후, 세포를 계수하고, 96-웰 플레이트에서 웰 당 100 μl의 새로운 배지 A 당 5,000개의 세포의 농도로 재현탁시켰다. 실시예 1에서 제조된 바이러스 스톡을 레트로넥틴-코팅된 플레이트에서 100 μl 당 20의 MOI에서 배지 A에서 희석시켰다(타카라 바이오 유럽 에스에이에스(Takara Bio Europe SAS), 프랑스 상제르망안레 소재). 이후에 세포를 플레이트에 첨가하였다. 선택적으로, 배지 A에서 이러한 최종 농도에 도달하기 위하여 바이러스 스톡에 하기 형질도입 인핸서(enhancer)를 첨가하여 형질도입 효율을 향상시킬 수 있다: 8 μg/ml 폴리브렌(시그마-알드리치 케미 엔.브이.(Sigma-Aldrich Chemie N.V.), 네덜란드 즈비인드레흐트 소재), 4 μ/ml 프로타민 설페이트(시그마-알드리치 케미 엔.브이.), 1 μg/ml 벡토푸신(Vectofusin)®-1(밀테니 바이오테크 비.브이.앤드코 케이지), 4 μ/ml 프로타민 설페이트 + 1 μg/ml 벡토푸신®-1, 1 mg/ml 렌티부스트(LentiBOOST)??(시리온 바이오테크 게엠베하(Sirion Biotech GmbH), 독일 마틴스리에드 소재), 또는 1 μl/100 μl 렌티블라스트 프리미엄(LentiBlast Premium)의 배지(오즈바이오사이언시즈 에스에이에스(OZBiosciences SAS), 프랑스 마르세유 소재).
대안적으로, CD34+ 세포를 확장 및 분화 배지에서 배양하고, 생성된 전구체 세포를 상기 기재된 바와 같이 형질도입하였다. 24-웰 플레이트에서 웰 당 250 μl의 새로운 배지 B 당 200,000개의 세포의 농도로 재현탁된 세포로 형질도입을 수행하였다. 실시예 1에서 제조된 바이러스 스톡을 250 μl 당 20의 MOI에서 배지 B에서 희석하였다. 형질도입 인핸서를 상기 기재된 바와 동일한 최종 농도에서 사용하였다.
대조군 세포를 포함하여, 본 발명자들은 다음과 같이 구별하였다:
세포 배지 MOI 조건
CD34+ 배지 A 20 EGFP 벡터
CD34+ 배지 A N/A MOCK
21일에 CD34+ 세포로부터 유래된 전구체 배지 B 20 EGFP 벡터
21일에 CD34+ 세포로부터 유래된 전구체 배지 B N/A MOCK
28일에 CD34+ 세포로부터 유래된 전구체 배지 B 20 EGFP 벡터
28일에 CD34+ 세포로부터 유래된 전구체 배지 B N/A MOCK
35일에 CD34+ 세포로부터 유래된 전구체 배지 B 20 EGFP 벡터
35일에 CD34+ 세포로부터 유래된 전구체 배지 B N/A MOCK
24시간의 인큐베이션 후, CD34+ 세포에 배양 배지 II를 다시 채웠다. 24시간의 인큐베이션 후, CD34+ 세포로부터 유래된 전구체에 배양 배지 III를 다시 채웠다.
SEQUENCE LISTING <110> Glycostem Therapeutics B.V. <120> Method for obtaining CAR-NK cells <130> IP-10 <150> N2024334 <151> 2019-11-28 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 239 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ala Leu Ser Asn His 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Val Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser 85 90 95 Ala His Gly Gly Glu Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ala Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 130 135 140 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser 145 150 155 160 Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 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<400> 8 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 9 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Part of CAR cassette - OX40 co-activation domain <400> 9 Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser 20 25 30 Thr Leu Ala Lys Ile 35 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Part of CAR cassette - CD3zeta activation domain <400> 10 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 11 <211> 8619 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLenti CMV GFP Puro (658-5) <400> 11 aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 60 ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 120 aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt 180 ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca 240 gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag 300 ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc 360 ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca 420 gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt 480 aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct 540 gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt 600 aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga 660 caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact 720 tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc 780 acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga 840 gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt 900 agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga 960 gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact 1020 ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 1080 taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 1140 agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 1200 aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 1260 ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta 1320 gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 1380 aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 1440 aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 1500 gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 1560 aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 1620 aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 1680 cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 1740 cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 1800 tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt 1860 tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga 1920 ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta 1980 atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa 2040 tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat 2100 gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta 2160 cgccaagcgc gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag ctggagctgc aagcttaatg 2220 tagtcttatg caatactctt gtagtcttgc aacatggtaa cgatgagtta gcaacatgcc 2280 ttacaaggag agaaaaagca ccgtgcatgc cgattggtgg aagtaaggtg gtacgatcgt 2340 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tggagaagtg aattatataa atataaagta gtaaaaattg aaccattagg agtagcaccc 3240 accaaggcaa agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg 3300 ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg 3360 gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct 3420 attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca 3480 agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc 3540 tctggaaaac tcatttgcac cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag taataaatct 3600 ctggaacaga tttggaatca cacgacctgg atggagtggg acagagaaat taacaattac 3660 acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa 3720 gaattattgg aattagataa atgggcaagt ttgtggaatt ggtttaacat aacaaattgg 3780 ctgtggtata taaaattatt cataatgata gtaggaggct tggtaggttt aagaatagtt 3840 tttgctgtac tttctatagt gaatagagtt aggcagggat attcaccatt atcgtttcag 3900 acccacctcc caaccccgag gggacccgac aggcccgaag gaatagaaga agaaggtgga 3960 gagagagaca gagacagatc cattcgatta gtgaacggat ctcgacggta tcggttaact 4020 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Claims (16)

  1. (i) a) CD34+ 조혈모세포를 포함하는 샘플을 제공하고,
    b) 상기 샘플 중 CD34+ 조혈모세포를 정제하고,
    c) 배양 배지 I의 존재 하에 정제된 CD34+ 조혈모세포를 배양하고,
    d) 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 존재 하에 배양 배지 I에서 세포 집단을 적어도 10시간, 바람직하게는 적어도 16시간, 더 바람직하게는 적어도 24시간, 더 바람직하게는 적어도 36시간, 더 바람직하게는 적어도 48시간, 더 바람직하게는 적어도 60시간, 가장 바람직하게는 적어도 72시간 동안 배양하여 정제된 CD34+ 조혈모세포에 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 형질도입함으로써, 상기 CAR을 발현하는 CD34+ 줄기 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하고,
    e) 세포 집단을 배양 배지 I에서 적어도 10시간, 바람직하게는 적어도 16시간, 더 바람직하게는 적어도 24시간, 더 바람직하게는 적어도 36시간, 더 바람직하게는 적어도 48시간, 더 바람직하게는 적어도 60시간, 가장 바람직하게는 적어도 72시간 동안 배양하는 것을 포함하고,
    여기서, 배양 배지 I는 시토카인의 컬렉션(collection)을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 인터루킨-7, 및 줄기 세포 인자(SCF), flt-3리간드(FLT-3L), 트롬보포이에틴(TPO) 중 1종 이상, 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 및 인터루킨-6(IL-6) 중 2종 이상을 포함하는 것인 제1 단계
    를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR)로 유전적으로 변형된 세포 집단의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 c)의 세포 배양이 500 내지 10,000 CD34+ 세포/ml, 더 바람직하게는 1,000 내지 8,000 CD34+ 세포/ml, 더 바람직하게는 2,000 내지 6,000 CD34+ 세포/ml의 세포 밀도에서 개시되는 방법.
  3. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 조혈모세포, 자연 살해(NK) 전구 세포 또는 NK 세포에서 발현되는 항원에 특이적인 CAR을 코딩하지 않는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    (ii) CAR-CD34+ 줄기 세포를 함유하는 단계 (i)로부터의 세포 집단을 배양 배지 III에서 배양하여 CAR-NK 전구 세포 및/또는 CAR-NK 세포를 함유하는 세포 집단을 수득하는 것을 포함하고, 여기서 배양 배지 III는 시토카인의 컬렉션을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 SCF, IL-7, IL-15 및 인터루킨-2(IL-2) 중 2종 이상 및 GM-CSF, G-CSF 및 IL-6 중 2종 이상을 포함하는 것인, 단계 (i)로부터의 세포 집단이 CAR-NK 전구 세포 및/또는 CAR-NK 세포를 함유하는 세포 집단으로 확장 및 분화되는 제2 단계를 더 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    (ii) 단계 (i)로부터의 CAR-CD34+ 줄기 세포를 배양 배지 II에서 배양하여 CAR 줄기 세포 및 CAR 전구 세포를 함유하는 세포 집단을 수득하는 것을 포함하는, 단계 (i)로부터의 세포 집단이 CAR 줄기 세포 및/또는 CAR 전구 세포를 함유하는 세포 집단으로 확장 및 분화되는 제2 단계, 및
    (iii) 단계 (ii)로부터의 세포 집단이 CAR-NK 전구 세포 및/또는 CAR-NK 세포를 함유하는 세포 집단으로 추가로 확장 및 분화되는 제3 단계
    를 더 포함하며, 여기서 배양 배지 II는 시토카인의 컬렉션을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 SCF, FLT-3L 인터루킨-15(IL-15) 및 IL-7 중 2종 이상 및 GM-CSF, G-CSF 및 IL6 중 2종 이상을 포함하고, 여기서 배양 배지 III는 시토카인의 컬렉션을 포함하는 기본 배양 배지이고, 여기서 상기 시토카인의 컬렉션은 SCF, IL-7, IL-15 및 인터루킨-2(IL-2) 중 2종 이상 및 GM-CSF, G-CSF 및 IL-6 중 2종 이상을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 제대혈로부터 수득된 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포를 CD34+ 면역자기 선택 방법을 사용하여 정제하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지 I가 농도 4 ng/ml 내지 300 ng/ml의 SCF, 또는 농도 4 ng/ml 내지 300 ng/ml의 Flt3-L, 또는 농도 4 ng/ml 내지 100 ng/ml의 TPO, 또는 농도 4 ng/ml 내지 50 ng/ml의 IL7, 또는 이들 시토카인의 임의의 조합을 바람직하게는 명시된 농도로 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d) 및 e)를 적어도 1회 반복하여 CD34+ 줄기 세포가 상기 CAR을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 바이러스 벡터와 함께 인큐베이션되는 형질도입 실행을 적어도 2회 실행하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, CD34+ 줄기 세포를 0.01 내지 100, 바람직하게는 1 내지 10의 감염다중도(MOI)에서 상기 CAR을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 바이러스 벡터와 함께 인큐베이션하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 센다이(Sendai) 바이러스 벡터인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, CAR이 종양 항원에 대해 지시되는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 NK-CAR 세포를 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, NK-CAR 세포가 신경 세포 부착 분자(NCAM) 및 CAR에 대해 양성인 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 약물에 사용하기 위한, 바람직하게는 면역요법에 사용하기 위한, 더 바람직하게는 종양 및 혈액암의 치료에 사용하기 위한 조성물.
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