KR20170076775A - T 세포가 아닌 종양을 표적화하는 서바이빈 특이적인 t-세포 수용체 - Google Patents

Abstract

본 개시 내용의 실시형태는 서바이빈 종양 항원에 대해서 특이적이지만, "온-표적 오프 종양" 독성을 갖지 않는 조작된 T 세포 수용체에 관한 것이다. 특별한 실시형태에서, 특정 알파 쇄 및 베타 쇄가 효과적인 항-종양 활성을 갖지만, 프래트리사이드성 효과를 갖지 않는 세포 요법을 위한 조작된 T 세포 수용체에서 사용된다. 본 명세서에서 방법, 조성물 및 키트가 제공된다.

Description

T 세포가 아닌 종양을 표적화하는 서바이빈 특이적인 T-세포 수용체{SURVIVIN SPECIFIC T-CELL RECEPTOR TARGETING TUMOR BUT NOT T CELLS}

본 출원은 2014년 10월 31일자로 출원된 미국 가출원 제62/073,076호를 우선권 주장하며, 그 가출원은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다.

미국 연방 정부가 후원한 연구 또는 개발에 관련된 상태

본 발명은 미국 국립 암 연구소에 의해서 지원된 R01 CA131027 및 P50 CA126752 하의 정부 보조로 수행되었다. 정부가 본 발명의 특정 권리를 갖는다.

기술분야

본 개시 내용의 실시형태는 적어도 면역학, 세포 생물학, 분자 생물학, 및 암 의학을 비롯한 의학 분야에 관한 것이다.

유전자 조작된 αβT-세포 수용체(TCR)를 사용한 암-표적화된 입양(adoptive) T-세포 요법은 일부 환자에서 유망한 반응을 유발하였다(Morgan, et al., 2006; Johnson, et al., 2009; Robbins, et al., 2011). 이러한 접근법을 악성 종양의 더 큰 집합체로 확장하기 위해서는 보다 넓게 발현되는 종양-관련 항원(TAA)을 표적화할 필요가 있다. 그러나, 대부분의 TAA는 종양에만 특이적인 것이 아니고, 정상 성인 조직에서 낮은 수준으로 발현되는데, 이는 이들 중요한 항원의 TCR-매개된 표적화를 도전적이게 한다. TCR이 정상 세포 대 종양 세포 상에 존재하는 TAA의 수준을 식별하는 데 실패하는 경우, 예를 들어 항원이 동등하게 발현되거나, TCR이 표적화된 TAA-에피토프(epitope)의 낮은 수준뿐만 아니라 정상 세포 상에서 발현된 교차-반응성 에피토프를 인식하는 경우, "온-표적 오프-종양(on-target off-tumor)" 독성이 발생할 수 있다. 이어서, 그러한 조합된 표적 인식은 T 세포 활성화로 이어질 수 있고, 이것은 목적하는 TAA의 안전한 표적화를 명백하게 불가능하게 하는 독성을 유발한다. 이러한 추정 기전을 특징분석하기 위해서, TAA 서바이빈(survivin)이 모델로서 사용되었다. 서바이빈은 면역요법의 개발을 위해서 국립 암 연구소가 표적으로서 우선시하였는데(Chever, et al., 2009), 그 이유는 암에서의 그의 아주 흔한 과발현 및 종양 세포 표현형과 기능을 유지하는 그의 중요한 역할 때문이다. 추가로, 이전 연구로부터의 설득력있는 결과는, 그것이 항원 역치 감지 및 분자 식별 문제를 연구하기 위한 우수한 모델 항원임을 제안하였다. 서바이빈-유도된 펩타이드를 사용한 자가형(autologous) 백신접종은 안전하고(Rapoport, et al., 2011), 서바이빈-특이적인 T-세포 전구체 유도에 효과적이라고 증명되어 있지만, 객관적인 임상 반응은 제한적으로 남아있다(Becker, et al., 2012). 이에 반해서, 흉선 선택(thymic selection)을 회피하는 알로-제한형(allo-restricted) TCR 레퍼토리로부터 단리된 형질전환된 서바이빈-특이적인 TCR을 발현하는 T 세포는 항암 활성을 생성할 뿐만 아니라 활성화된 T 세포에 대해서 "프래트리사이드성(fratricidal)" 효과 또는 독성을 제공하였고, 따라서 종양으로부터 그 자신을 구별해 낼 수 없다(Leisegang, et al., 2010). 이러한 세포 독성 효과를 "온-표적 오프-종양"이라 간주하였는데, 이는 서바이빈 mRNA가 활성화된 T 림프구에서 상향-조절되는 것이 관찰되었기 때문이다(Leisegang, et al., 2010).

그러나, 자가형 TCR 레퍼토리로부터의 선택은 그 자신과 종양을 식별할 수 있는 높은 친화도 및 선택도를 갖는 서바이빈-특이적인 클론을 찾을 수 있어야 한다고 고려되었는데, 그 이유는 높은 자가/교차-반응성인 T-세포 클론이 이미 흉선 선택 하에 놓여있어서, 생존한 T 세포가 건강한 세포 및 조직 중에 존재하는 항원 역치값에 대해서 "내성인" TCR을 발현해야 하기 때문이다. 이러한 전략은 인간 흉선 선택이 없는 동종이형(allogeneic) 또는 이종형(xenogenic) 레퍼토리로부터의 T-세포 반응을 목적으로 하거나(Spranger, et al., 2012) 또는 높거나 또는 상위생리학적인 결합능(supraphysiologic avidity)을 갖는 TCR의 생체외(ex vivo) 생성을 목적으로 하는 다른 TCR 조작 접근법(Li, et al., 2005)과 상당히 대조적이다. 그러나, 이러한 방법은 건강한 조직에 의해서 발현될 수 있는 전혀 관련이 없는 단백질로부터의 인식되지 않은 교차-반응성 표적화 에피토프로 인해서 심각한 독성을 생성한다(Cameron, et al., 2013; Linette, et al., 2013). 본 명세서에서 항암 활성을 갖지만, 정상 조혈 줄기 세포/프로지니터(progenitor) 세포에 대해서 "프래트리사이드성" 효과 또는 독성이 없는 자가형 배양액으로부터의 서바이빈-특이적인 TCR의 성공적인 클로닝을 기술한다. 자가형 TCR 레퍼토리로부터 단리된 TCR 대 동종이형 TCR 레퍼토리로부터 단리된 TCR의 분자 인식에서의 이러한 충돌하는 차이의 기계론적 기초를 이해하기 위해서, 서바이빈 TCR의 알라닌-치환 분석을 수행하였다. 다른 TAA를 표적화하는 부가적인 TCR 세트 상에서 관찰을 검증하였다. 이러한 연구는 선택적인 TCR 분자 인식을 관할하는 결정 인자에 중요한 통찰력을 제공한다.

본 개시 내용은 서바이빈을 발현하는 비-암세포를 비롯한, 다른 세포에 대해서 독성이 없는 암을 위한 서바이빈-특이적인 면역요법을 제공함으로써 관련 분야에서의 요구를 충족시킨다.

본 개시 내용의 실시형태는 세포 요법을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 특별한 실시형태에서, 세포 요법은 특별한 수용체를 갖는 변형된 세포를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 세포는 특별한 수용체 내에 특별한 아미노산 서열을 포함하는 특별한 수용체를 갖는 T 세포인 면역 세포를 비롯한, 면역 세포이다. 특정 양상에서, 선택적인 항암 활성을 제공하는 특별한 알파 쇄 및 베타 쇄를 포함하는 변형된 T 세포 수용체를 갖는 세포를 갖는 조성물이 존재한다. 구체적인 실시형태에서, 세포는 서열번호 1 또는 그의 작용성 단편 또는 그의 작용성 유도체를 포함하는 상기 수용체의 알파 쇄; 및 서열번호 2 또는 그의 작용성 단편 또는 그의 작용성 유도체를 포함하는 상기 수용체의 베타 쇄 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.

제1 양상에서, 본 명세서에서 서바이빈과 관련되고, "온 표적 온 종양" 선택성에 대해서 특이적인 유전자 조작된 면역 세포, 예를 들어, T 세포(T 림프구), 자연 살해(natural killer:NK) 세포 또는 NKT 세포가 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 유전자 조작된 면역 세포는 T 세포이다. 구체적인 실시형태에서, 유전자 조작된 면역 세포, 예를 들어, T 세포는 비-암 세포 상에서의 서바이빈의 발현 수준(또는 적어도 암 세포와 비교하여 비-암세포 상에서의 감소된 서바이빈 수준)이 아니라 암 세포 상에서의 서바이빙 발현 수준에 감응성인 수용체를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, TCR이 암 세포 상에서 서바이빙-MHC 복합체에 결합하는 경우, 면역 세포는 암 세포를 죽인다. 특정 실시형태에서, 면역 세포, 예를 들어, T 세포는 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 그의 기능성 단편 또는 그의 유도체 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 TCR을 포함한다. 서바이빈을 발현하는 암을 표적화하도록 변형될 수 있는 본 개시 내용의 세포는 적어도 T-세포(이것은 세포독성 T 림프구(CTL)라 지칭될 수 있음), NK-세포, NKT-세포, 또는 이펙터(effector) 면역 반응을 유도하는 능력을 갖는 임의의 다른 세포 요소를 포함한다. 특별한 경우에, 세포는 서바이빈-특이적인 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 보유한다.

또 다른 양상에서, 본 명세서에서 본 명세서에서 기술된 서바이빈-특이적인 TCR 폴리펩타이드 중 임의의 것이 제공된다. 또한 그러한 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 본 발명의 실시형태에서, 서바이빈-특이적인 TCR, 특히 특이적인 알파 쇄 및/또는 베타 쇄를 갖는 것을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 존재한다. 본 발명의 실시형태에서, 서바이빈-특이적인 TCR을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 존재한다.

본 개시 내용의 임의의 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 아데노-관련 바이러스 벡터인 것을 비롯한, 발현 벡터에 포함될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 벡터는 비-바이러스 벡터-매개된 유전자 전달, 예컨대 슬리핑 뷰티(sleeping beauty) 또는 피기백(piggyback) 및 mRNA 전기천공을 비롯한 비-바이러스 벡터이다. 본 개시 내용의 실시형태에서, 본 개시 내용의 임의의 발현 벡터 중 적어도 하나를 포함하는 세포가 존재한다. 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포일 수 있다. 세포는 면역계 세포일 수 있다. 세포는 예를 들어, T 세포, NK 세포, 또는 NKT 세포일 수 있다.

실시형태에서, 암은 임의의 부류이고 임의의 단계일 수 있다. 암에 걸린 개체는 임의의 연령이거나 두 성별 중 하나일 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 개체는 암에 걸렸거나, 암에 걸릴 위험이 있거나, 암이 걸렸다고 의심된다고 알려져 있다. 암은 원발암 또는 전이성 암일 수 있고, 암은 다른 양상을 갖는 치료, 예를 들어 화학요법, 방사선 등에 대해서 난치성일 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 암은 혈액암(급성 백혈병 및 만성 백혈병, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma) 및 비-호지킨 림프종 및 다발성 골수종을 비롯한 혈액 및 혈액-형성 조직(예컨대, 골수)의 암) 또는 비-혈액암이다. 특별한 실시형태에서, 비-혈액암은 뇌, 피부, 폐, 유방, 전립선, 결장, 췌장, 갑상선, 뼈, 신장, 비장, 간, 담낭, 방광, 직장, 자궁내막, 난소, 고환, 자궁경부 등에 존재한다.

본 개시 내용의 특정 실시형태에서, 본 개시 내용은 치료 면역계 세포, 예컨대 종양-특이적인 세포독성 T 림프구를 비롯한, 치료 세포에 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다. 세포는 이펙터 면역 반응을 유도하는 능력을 갖는 세포 요소를 포함한다. 특정 양상에서, 세포는 특정 종양 항원을 표적화하는 적어도 하나의 비-내생 분자를 발현하고, 적어도 일부 경우에, 분자는 TCR을 포함한다.

본 개시 내용의 실시형태에서, 치료 유효량의 복수의 본 발명의 세포 중 임의의 것을 제공하는 단계를 포함하는, 암에 대해서 개체를 치료하는 방법이 존재한다. 암은 하나 이상의 종양을 포함할 수 있다.

본 개시 내용의 실시형태에서, 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 본 발명의 적어도 하나의 발현 벡터, 및/또는 본 발명의 적어도 하나의 세포 또는 세포들을 포함하는 키트가 존재한다.

본 개시 내용의 실시형태는 암을 표적화하지만, T 세포를 표적화하지 않는 서바이빈-특이적인 T-세포 수용체를 제공한다. 본 명세서에서 에피토프 특이성 및 서바이빈-발현 암에 대한 항암 활성을 제공하고, 자가반응성이 결핍된 T-세포 수용체가 개시된다.

특정 실시형태에서, 면역 세포를 포함하는 조성물이 존재하며, 상기 세포는 조작된 서바이빈-특이적인 T 세포 수용체를 포함하고, 여기서 수용체는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 서열번호 1 또는 그의 작용성 단편 또는 그의 작용성 유도체를 포함하는 상기 수용체의 알파 쇄; 서열번호 2 또는 그의 작용성 단편 또는 작용성 유도체를 포함하는 상기 수용체의 베타 쇄. 구체적인 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 T 세포 수용체가 아닌 항원 인식 모이어티를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 항원 인식 모이어티는 키메릭(chimeric) 항원 수용체, 인게이거(engager) 분자, 또는 또 다른 T 세포 수용체이다. 구체적인 실시형태에서, 항원 인식 모이어티는 서바이빙 또는 서바이빈이 아닌 종양 항원을 인식한다. 일부 경우에, 세포는 개체에 대해서 자가 유도된 것일 수 있지만, 그것은 개체에 대해서 동종이형일 수 있다. 특별한 실시형태에서, 서열번호 1의 작용성 단편은 서열번호 1의 서열의 N-말단 절단부를 갖는다. 일부 경우에, N-말단 절단부는 서열번호 1의 N-말단으로부터 절단된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 그 초과의 아미노산을 갖는다. 특정 경우에, 서열번호 1의 작용성 단편은 서열번호 1의 서열의 C-말단 절단부를 갖는다. 구체적인 실시형태에서, C-말단 절단부는 서열번호 1의 C-말단으로부터 절단된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 초과의 아미노산을 갖는다. 구체적인 실시형태는 서열번호 1의 작용성 유도체가 서열번호 1과 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 97％, 98％, 또는 99％ 동일한 것을 제공한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 2의 작용성 단편은 서열번호 2의 서열의 N-말단 절단부를 갖는다. 구체적인 실시형태에서, N-말단 절단부는 서열번호 2의 N-말단으로부터 절단된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 초과의 아미노산을 갖는다. 특별한 실시형태에서, 서열번호 2의 작용성 단편은 서열번호 2의 서열의 C-말단 절단부를 갖는다. 구체적인 실시형태에서, C-말단 절단부는 서열번호 2의 C-말단으로부터 절단된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 그 초과의 아미노산을 갖는다. 특별한 실시형태에서, 서열번호 2의 작용성 유도체는 서열번호 2와 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 97％, 98％, 또는 99％ 동일하다. 특별한 실시형태에서, 서열번호 1의 작용성 단편은 서열번호 1의 N-말단 절단부 및 C-말단 절단부를 갖는다. 일부 경우에, 서열번호 2의 작용성 단편은 서열번호 2의 서열의 N-말단 절단부 및 C-말단 절단부를 갖는다.

조성물의 특별한 실시형태에서, 세포는 자살 유전자 생성물을 발현한다. 구체적인 실시형태에서, 수용체는 HLA-A2 제한형이고, 수용체는 서열번호 15 또는 그의 작용성 단편 또는 그의 유도체를 포함하는 에피토프, 서열번호 16 또는 그의 작용성 단편 또는 그의 유도체를 포함하는 에피토프, 또는 둘 다로 이루어진 군으로부터 선택된 에피토프를 인식한다. 구체적인 실시형태에서, 서열번호 15를 포함하는 에피토프의 작용성 단편 또는 유도체는 서열번호 15와 70, 75, 77, 80, 85, 88, 90, 91, 91, 95, 97, 또는 99％ 동일하다.

특정 실시형태에서, 서열번호 16을 포함하는 에피토프의 작용성 단편 또는 유도체는 서열번호 16과 70, 75, 77, 80, 85, 88, 90, 91, 91, 95, 97, 또는 99％ 동일하다. 구체적인 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 15와 관련된 N-말단 연장부 또는 절단부를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, N-말단 연장부 및/또는 C-말단 연장부는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 또는 그 초과의 아미노산이다. 특정 실시형태에서, N-말단 절단부 및/또는 C-말단 절단부는 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 또는 그 초과의 아미노산이다. 특별한 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 16과 관련된 N-말단 연장부 또는 절단부를 포함한다. 특정 실시형태에서, N-말단 연장부 및/또는 C-말단 연장부는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 또는 그 초과의 아미노산이다. 구체적인 경우에, N-말단 절단부 및/또는 C-말단 절단부는 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 또는 그 초과의 아미노산이다.

한 실시형태에서, 치료 유효량의 본 명세서에서 고려된 임의의 조성물을 개체에게 제공하는 단계를 포함하는, 세포 요법이 필요한 개체에게 세포 요법을 제공하는 방법이 존재한다. 구체적인 실시형태에서, 개체는 서바이빈-양성 암을 갖는다. 특별한 실시형태에서, 서바이빈-양성 암은 백혈병, 골수종, 유방암, 폐암, 결장암, 흑색종, 림프종, 난소암, 전립선암, 중추신경계암, 또는 신장암이다. 구체적인 실시형태에서, 방법은 개체에게 부가적인 암 요법을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 부가적인 암 요법은 화학요법, 면역요법, 방사선, 수술 또는 호르몬 요법이다.

한 실시형태에서, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 1과 서열번호 2의 조합, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 발현하는 폴리뉴클레오타이드가 존재한다. 구체적인 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터이다.

특정 실시형태에서, 본 명세서에서 고려된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포가 존재한다.

특별한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려된 임의의 조성물, 본 명세서에서 고려된 임의의 폴리뉴클레오타이드, 본 명세서에서 고려된 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는 키트가 존재한다.

상기 내용은 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용이 보다 명확하게 이해될 수 있게 하기 위해서 본 발명의 특징부 및 기술적인 이점을 보다 넓게 개괄한다. 본 발명의 부가적인 특징부 및 이점은 본 발명의 청구범위의 대상을 형성하는 하기에 기술될 것이다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 개시된 개념 및 특별한 실시형태가 본 발명의 동일한 목적을 수행하기 위해서 다른 구조를 변형하거나 설계하기 위한 기초로서 쉽게 사용될 수 있다는 것을 인지해야 한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 그러한 동일한 구조가 첨부된 청구범위에 언급된 바와 같은 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않는다는 것을 또한 인지해야 한다. 추가 목적 및 이점과 함께, 그의 구성 및 작동 방법 모두와 관련하여 본 발명의 특징이라고 여겨지는 신규 특징부는 첨부된 도면과 관련하여 고려되는 경우 하기 설명으로부터 보다 명확하게 이해될 것이다. 그러나, 도면 각각은 단지 예시 및 설명의 목적을 위해서 제공되고, 본 발명의 제한의 정의로서 의도되지 않는다.

도 1. 독성 없이 항종양 효과를 갖는 서바이빈 -특이적인 T-세포 클론. (A) CD8 및 LML-특이적이거나 특이적이지 않은 테트라머에 대해서 염색된 서바이빈-특이적인 T-세포 클론의 FACS 분석. (B) LML 펩타이드에 대해서 특이적이지 않은 클론의 인터페론-γ 엘리스팟(IFN-γ ELISpot) 검정법에 의해서 평가된 T-세포 결합능(흑색 막대), LML 펩타이드에 대해서 서바이빈-특이적인 클론의 인터페론-γ 엘리스팟 검정법에 의해서 평가된 T-세포 결합능(회색 막대) 또는 ELT 펩타이드에 대해서 서바이빈-특이적인 클론의 인터페론-γ 엘리스팟 검정법에 의해서 평가된 T-세포 결합능(백색 막대). 스팟 형성 세포(spot forming cell: SFC)/10⁵세포, 3회 반복의 평균 ± SD (C) LML-펄싱된(pulsed) T2 세포에 대해서 ⁵¹Cr-방출 검정법에 의해서 평가된 T-세포 결합능(사각형, 실선) 또는 ELT-펄싱된 T2 세포에 대해서 ⁵¹Cr-방출 검정법에 의해서 평가된 T-세포 결합능(삼각형, 파선). 10:1 E:T 비율에서 특이적인 용해의 3회 반복의 평균 ± SD를 나타냄. (D) HLA-A^*02⁺서바이빈⁺ 표적 세포주인 BV173과 U266, 및 HLA-A^*02^-서바이빈⁺ 표적 세포주인 HL-60에 대한 동일한 공여자로부터 유도된 특이적이지 않은 클론의 ⁵¹Cr-방출 검정법에 의한 항암 활성(좌측 패널) 및 서바이빈-특이적인 클론의 ⁵¹Cr-방출 검정법에 의한 항암 활성(우측 패널). 두 실험 중 대표적인 하나의 3회 반복의 평균 ± SD를 나타냄. (E) 2명의 CML 아구성 발증(blast crisis) 환자로부터의 HLA-A^*02⁺서바이빈⁺ 1기 백혈병 모세포(primary leukemic blast) 및 HLA-A^*02⁺ 정상 공여자 골수(BM) 공여자에 대한 서바이빈-특이적인 클론의 CFU 검정법(빈 사각형) 및 특이적이지 않은 클론의 CFU 검정법(흑색원)에 의한 항-백혈병 활성 및 정상 조혈 프로지니터에 대한 독성의 부재. 세 독립적인 실험의 2회 반복의 요약(평균 ± SD)을 나타냄, * p<0.001, ** p=0.001. (F) 서바이빈-특이적인 클론(빈 사각형, 파선) 및 특이적이지 않은 클론(흑색 원, 실선)의 과발현 후 배양액에서 3주에 걸쳐서 배수 확장시켜서 평가되는 바와 같은, T-세포 프래트리사이드의 부재
도 2. 다클론성 CD8+ T 세포에 의한 형질전환된 서바이빈 TCR의 효율적인 발현. (A) 레트로바이러스 벡터의 도식. (B) 뮤린 불변 β 쇄(mCβ) 및 LML-테트라머에 대한 염색에 의해서 검출된 형질도입 효율. LML-펄싱된 aAPC의 존재 하에서 T-세포 증폭 동안 LML-테트라머+ 세포의 증가(2주 마다 자극). 형질도입 직후(TD 이후)의 대표적인 FACS 플롯(좌측), 및 1회 자극 이후(엔드 S1) 또는 2회 자극 이후(엔드 S2) 대표적인 FACS 플롯. 우측 그래프는 4명의 공여자의 평균 ± SD를 나타냄. (C) 매주 항원-특이적인 자극 후의 LML-테트라머 평균 형광 강도(MFI)의 증가. 특이적이지 않은 테트라머(회색)로 염색한 대표적인 히스토그램(좌측), TD 이후의 LML 테트라머로 염색한 대표적인 히스토그램(흑색), 엔드 S1 이후의 LML 테트라머로 염색한 대표적인 히스토그램(청색) 및 엔드 S2 이후의 LML 테트라머로 염색한 대표적인 히스토그램(적색). 그래프(우측)는 4명 공여자의 평균 ± SD를 나타냄.
도 3. 이소적으로 발현된 서바이빈 TCR은 기능적이고, 특이적이지만, 시험관 내에서 프래트리사이드성이 아니다. (A 내지 C, E, F) 상징은 3회 반복/공여자의 평균을 나타내고, 수평 막대는 평균 ± SD를 나타낸다. (A) 형질도입되지 않은 T 세포에 의해서 LML 펩타이드 및 ELT 펩타이드에 반응한 IFN-γ(엘리스팟)의 생성(NT, 흑색 원) 및 형질도입된 T 세포에 의해서 LML 펩타이드 및 ELT 펩타이드에 반응한 IFN-γ(엘리스팟)의 생성(TD, 빈 사각형), n=5. (B) NT T 세포 및 TD T 세포에 의한 LML-펄싱된 T2 세포(⁵¹Cr-방출)의 사멸, E:T 20:1에서의 ％ 특이적인 용해, n=3. (C) HLA 클래스 I 차단 항체와 함께(점선), HLA 클래스 II 차단 항체와 함께(파선), 또는 항체 없이(실선) 미리 인큐베이션함으로써 TD T 세포(백색 사각형) 및 NT T 세포(흑색 사각형, 실선)에 의한 LML-펄싱된 T2 세포의 사멸의 HLA 제한을 평가함. 두 실험 중 대표적인 하나. (D) HLA-A^*02⁺ 공여자로부터 생성된 매주 항원-특이적인 자극으로의 형질전환 T 세포의 증폭(흑색 원, 실선) 또는 HLA-A^*02^- 공여자로부터 생성된 매주 항원-특이적인 자극으로의 형질전환 T 세포의 증폭(빈 사각형, 파선). 평균 ± SD, n=7, p=NS. (E 및 F). LML 펩타이드 또는 ELT 펩타이드가 존재하거나 존재하지 않는 활성화된 HLA-A^*02⁺ 표적 T 세포에 대한 NT T 세포의 ⁵¹Cr-방출 검정법(흑색 원) 및 TD T 세포(백색 원)의 ⁵¹Cr-방출 검정법. (E) HLA-A^*02^- 공여자(n=7)에서 발현된 서바이빈 TCR의 E:T 20:1에서의 ％ 특이적인 용해 또는 (F) HLA-A^*02⁺ 공여자(n=7)에서 발현된 서바이빈 TCR의 E:T 20:1에서의 ％ 특이적인 용해.
도 4. 서바이빈 - TCR 재안내된(redirected) T 세포는 정상 조혈 줄기 세포 / 프로지니터 세포에 대해서 독성을 나타내지 않으면서 생체내에서 항암 활성을 갖는다. (A) HLA-A^*02⁺서바이빈⁺ 암 세포주인 BV173과 U266, 및 HLA-A^*02^-서바이빈⁺ 표적인 HL-60 및 K562에 대한 서바이빈 TCR⁺ TD에 의한 ⁵¹Cr-방출 검정법(빈 사각형) 및 NT 대조군 T 세포에 의한 ⁵¹Cr-방출 검정법(흑색 원). 상징: 3회 반복의 평균/공여자, 막대: 특이적인 용해(E:T 20:1)의 평균 ± SD, n=12 공여자. *p<0.001, **p=0.003. (B) BV173(좌측 패널, 삼각형) 또는 U266(우측 패널, 원)을 HLA 클래스 I 차단 항체와 함께(점선), HLA 클래스 II 차단 항체와 함께 (파선) 또는 항체 없이(Ab 없음, 실선) 미리 인큐베이션시킴으로써 평가된 TCR⁺ TD(빈 상징) 및 NT T 세포(흑색 상징)의 HLA 제한. 3회 반복의 평균 ± SD, 2명의 공여자 중 대표적인 1명. (C) BV173, U266, K562 및 HL-60 세포(E:T 5:1)와 공동 배양된 TCR⁺ TD T 세포(빈 사각형) 및 NT T 세포(흑색 원)의 5일차의 공동 배양액 중의 잔류 종양 세포의 정량. 잔류 종양 세포의 평균 ± SD, n=6. *p<0.001, ** p=0.02. (D) 엘리스팟에 의한 BV173, U266, K562 및 HL-60 세포에 대한 TCR⁺ TD T 세포에 의한 IFN-γ 생성(빈 사각형) 및 NT T 세포에 의한 IFN-γ 생성(흑색 원). 상징: 3회 반복의 평균/공여자, 막대: 평균 ± SD, n=5. *p<0.001, **p=0.01. (E, F, G) HLA-A^*02⁺ CML 아구성 발증(n=2) 및 AML(n=3)(E), HLA-A^*02^- 백혈병 모세포(F), 및 HLA-A^*02⁺ 건강한 공여자-유도된 골수(BM, n=1) 또는 제대혈(CB, n=4) 프로지니터(G)에 대한 TCR⁺ TD T 세포(빈 사각형) 및 NT T 세포(흑색 원)에 의한 백혈병 집락 형성의 평가. 2회 반복 플레이팅된 5명의 공여자에 대한 CFU의 평균 ± SD. *p<0.001.
도 5. 서바이빈 - TCR 재안내된 T 세포는 생체내 항백혈병 활성을 갖는다. (A) 실험 계획. 치사량 미만으로 조사(120cGy)한 후 NSG 마우스에게 3x10⁶ BV173-FFluc 세포를 정맥내 투여하고, 이어서 T 세포를 주입하고, IL2를 주입하고, 18일차에 매주 생물발광 영상화(BLI)를 시작함. (B) 두 치료 군으로부터의 대표적인 개별 마우스에서의 BLI의 시간 경과, 스케일 5x10⁴ 내지 5x10⁵ 광자/초/㎠/sr. (C) 대조군 T 세포로 치료된 마우스(NT, n=9, 흑색 원) 또는 서바이빈 TCR⁺ T 세포로 치료된 마우스(TD, n=10, 빈 원)를 비교한, BLI에 의해서 측정된 마우스 당 평균 광자/초/㎠/sr. 평균 ± SD, 32일차에 *p=0.01 및 39일차에 0.009, 다중 비교를 위한 조정 후. 강도 신호를 또한 log-변환하였고, 강력한 일반화 추정식 방법에 의해서 시간에 따른 반응 프로파일을 분석하였다(p<0.0001). 두 독립적인 실험의 요약. (D) 서바이빈 TCR⁺ T 세포(TD)로 치료된 마우스 또는 대조군 T 세포(NT)로 치료된 마우스의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선(p<0.001).
도 6. 서바이빈 - TCR ⁺ T 세포는 높은 백혈병 존재량을 갖는 마우스의 생존을 연장시킨다. (A) 실험 계획. 치사량 미만으로 조사(120cGy)한 후 NSG 마우스에게 3x10⁶ BV173-FFluc 세포를 정맥내 투여함. 백혈병이 퍼지고, BLI에 의해서 검출되는 바와 같이 다수의 기관에서 확고해지는 경우, T 세포를 14일 내지 17일 이후에 주입하였음, T 세포 주입, IL-2 및 매주 BLI. (B) 두 치료군으로부터의 대표적인 개별 마우스에서의 BLI의 시간 경과, 스케일 1x10³ 내지 1x10⁴ 광자/초/㎠/sr(0일), 1x10⁵ 내지 1x10⁶ 광자/초/㎠/sr(7일 내지 28일). (C) 대조군 T 세포로 치료된 마우스(NT, n=16) 또는 서바이빈-TCR⁺ T 세포로 치료된 마우스(TD, n=15)를 비교한, 평균 광자/초/㎠/sr. 평균 ± SD. 강도 신호를 또한 log-변환하였고, 강력한 일반화 추정식 방법에 의해서 시간에 따른 반응 프로파일을 분석하였다(p=0.006). 세 독립적인 실험의 요약. (D) 서바이빈 TCR⁺ T 세포(TD)로 치료된 마우스 또는 대조군 T 세포(NT)로 치료된 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선(p=0.01).
도 7. 동종이형 레퍼토리 유도된 서바이빈 TCR의 프래트리사이드성 활성. (A 내지 E) s24-서바이빈 TCR로 형질도입된 TCR⁺ T 세포(s24-TD, 백색 막대), A72 서바이빈-TCR로 형질도입된 TCR⁺ T 세포(A72-TD, 회색 막대) 또는 NT 대조군 T 세포(흑색 막대)의 비교. 2명 내지 4명의 공여자 중 대표적인 1명, 3회 반복의 평균 ± SD. (A) HLA-A2⁺서바이빈⁺ 암 세포주(BV173, U266) 및 HLA-A2^-서바이빈⁺ 암 세포주(HL-60, K562)에 대한 ⁵¹Cr-방출 검정법. 특이적인 용해(E:T 20:1)에 대해서 3회 반복의 평균 ± SD. (B) 외인성 펩타이드의 부재 하에서(-), 또는 LML 펩타이드로 펄싱되거나 또는 ELT 펩타이드로 펄싱된 활성화된 HLA-A^*0201+ 표적 T 세포에 대한 ⁵¹Cr-방출 검정법. 3회 반복의 평균 ±SD ％ 특이적인 용해, E:T 20:1. (C) 정상 HLA-A2⁺ 제대혈 공여자로의 CFU 검정법. 2회 반복의 평균, E:T 10:1. IFN-γ 예비처리되거나, IFN-γ 예비처리되고 LML 펩타이드로 펄싱된 HLA-A^*0201⁺ 섬유모세포에 대한 ⁵¹Cr-방출 검정(D) 및 HLA-A^*0201⁺ 심장근육세포 세포주 AC10에 대한 ⁵¹Cr-방출 검정(E). 평균 ± SD ％ 특이적인 용해, 4명의 공여자의 요약, E:T 20:1.
도 8. 자가형 레퍼토리 유도된 서바이빈 - TCR 대 동종이형 레퍼토리 유도된 서바이빈-TCR의 상이한 분자 인식 패턴. IFN-γ 엘리스팟에 의해서 펩타이드-펄싱된 T2 세포의 인식에 대해서 s24 TD T 세포를 시험하는 알라닌-치환 분석(백색 막대) 또는 A72 TD T 세포를 시험하는 알라닌-치환 분석(회색 막대). 평균 ± SD, n=4 공여자.
도 9. HLA -A2 ⁺ 공여자 및 HLA -A2 ^- 공여자에서 형질전환 TCR 발현이 대등하다. 2회의 항원-특이적인 자극 이후에 HLA-A^*02⁺ 건강한 성인 공여자로부터의 서바이빈-TCR 형질도입된 CD8+ T 세포(흑색 원) 및 HLA-A^*02^- 건강한 성인 공여자로부터의 서바이빈-TCR 형질도입된 CD8+ T 세포(빈 사각형)는 형질도입 효율 및 테트라머 평균 형광 강도(MFI)가 대등하였음. (A) mCβ+ 세포 및 LML-테트라머+ 세포의 백분율 및 (B) HLA-A2⁺ 형질도입된 T 세포 및 HLA-A2^- 형질도입된 T 세포 중의 LML-테트라머의 MFI. 평균 ± SD, n=5.
도 10. 공동 배양액의 대표적인 FACS 분석. 사이토카인의 부재 하에서 5:1의 E:T 비율에서 HLA-A^*02⁺서바이빈⁺ 암 세포주(BV173, U266) 또는 HLA-A^*02^-서바이빈⁺ 암 세포주(HL-60, K562)와 함께 대조군 T 세포(NT, 상부 열) 또는 서바이빈 TCR⁺ T 세포(TD, 하부 열)를 공동 배양함. 5일차의 FACS 분석은 CD3(T 세포) 및 종양 마커인 CD19(BV173), CD138(U266), CD33(HL-60 및 K562)에 대한 염색을 보여준다. 8명의 공여자 중 대표적인 하나의 실험을 나타낸다.
도 11. 공동 배양액 중에서의 TCR ⁺ T 세포의 사이토카인 제조. TCR⁺ T 세포(TD, 백색 막대) 및 대조군(NT, 흑색 막대)에 의한 인터페론-γ(IFN-γ), 종양 괴사 인자-α(TNF-α), IL10, IL4 및 IL2의 농도(pg/ml)를 측정하기 위해서 공동 배양액으로부터 24시간 후 수집된 상청액을 사이토메트릭 비드 어레이(cytometric bead array: CBA)에 의해서 분석함. 2명의 공여자 중 대표적인 하나의 실험을 나타낸다.
도 12. 자가형 레퍼토리로부터 유도된 TCR은 교차-반응성에 대해서 더 낮은 가능성을 갖는다. 상이한 TAA를 표적화하는 경우 IFN-γ 엘리스팟에 의한 펩타이드-펄싱된 T2 세포의 인식을 위해서 형질전환 자가형 TCR(A) 및 동종이형 TCR(B)을 발현하기 위해서 조작된 T 세포의 알라닌-치환 분석법. 3회 반복의 평균 ± SD, 각각의 TCR에 대해서 시험된 2명의 공여자 중 대표적인 1명.
도 13. 섬유모세포 및 심장근육세포의 HLA -A2 및 서바이빈 발현. IFN-γ 치료가 동반되지 않거나(회색선) IFN-γ 치료가 동반된(흑색 선) HLA-A2(표면) 및 서바이빈(세포내)에 대한 섬유모세포(A) 및 심장근육세포 세포주 AC10(B)의 FACS 분석. 아이소타입 대조군(흑색선, 음영 면적).
도 14. BV173 마우스 모델에서 생체내에서의 s24- TCR ⁺ T 세포 대 A72- TCR ⁺ T 세포의 항-종양 활성. 마우스에서 BLI에 의해서 s24-TCR⁺ T 세포(n=15) 및 A72-TCR⁺ T 세포(n=10)의 항-종양 활성을 비교한 도 5(A)에 도시된 것과 동일한 실험 계획. 강도 신호를 로그-변환하고, 시간에 따른 반응 프로파일을 강력한 일반화 추정식 방법을 사용하여 분석하였다(p<0.0001).

전통적인 특허법 관습의 유지에서, 청구범위를 비롯하여, 단어 포함하는과 함께 본 명세서에서 사용되는 경우 단수 표현은 "하나 이상"을 나타낸다. 본 발명의 일부 실시형태는 본 발명의 하나 이상의 요소, 방법 단계 및/또는 방법으로 이루어지거나 본질적으로 이루어질 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 방법 또는 조성물은 개시된 본 명세서의 실시형태에 기술된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 실시될 수 있고, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 얻는다고 생각된다.

서바이빈은 암 세포에서 중요한 기능을 실행하는 광범위하게 발현되는 종양-관련 항원이다. 그러나, 형질전환 T-세포 수용체(TCR)를 사용한 이러한 항원의 면역치료 표적화는 동종이형 HLA-미스매치트(mismatched) TCR 레퍼토리로부터 단리된 고-결합능 서바이빈-특이적인 TCR을 발현하는 T 세포에서 발견되는 "프래트리사이드" 활성에 의해서 방해받아왔다. 본 명세서에서, 자가형 TCR 레퍼토리로부터 출발하는 경우 시험관내 및 생체내에서 항암 활성을 갖지만 프래트리사이드성 독성이 없는 HLA-A2-제한형 서바이빈-특이적인 TCR이 단리될 수 있다고 증명된다. 이러한 선택적인 활성의 기계론적 기본을 이해하기 위해서, 알라닌-스캐닝을 수행하였는데, 이는 자가-유도된 TCR이 "프래트리사이드" TCR과 비교할 때 서바이빙 펩타이드와 보다 특이적인 상호작용을 갖는다는 것을 나타내었다. 따라서, 최대 펩타이드 인식이 TCR 선택성에 대한 비결이고, 이것은 원치않는 오프-표적 독성을 감소시키는 데 중요할 수 있다. 이러한 전략은 선택적인 항암 활성을 보유할 다른 공유된 종양/자기-항원-특이적인 TCR을 확인하고 선택하도록 개작될 수 있다.

I. 예시적인 서바이빈 -특이적인 T 세포 수용체

본 개시 내용은 특정 알파 쇄 및 베타 쇄를 갖는 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것이며, 여기서 T 세포는 서바이빈 항원에 대해서 특이적이다. 특별한 양상에서, 수용체는 사람의 손에 의해서 조작된 수용체이다. 수용체는 특별한 실시형태에서 재조합되어 제조되고, 면역 세포, 예컨대 T 세포 상에서 발현된다. 수용체는 암 세포 상의 서바이빈 항원을 인식할 수 있고, 구체적인 실시형태에서, 수용체는 비-암 세포 상의 서바이빈 항원을 인식하지 않거나 그것을 암 세포에 비해서 감소된 수준으로 인식한다.

구체적인 실시형태에서, TCR은 서열번호 1 또는 그의 작용성 단편 또는 작용성 유도체를 포함하는 알파 쇄를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, TCR은 서열번호 2 또는 그의 작용성 단편 또는 작용성 유도체를 포함하는 베타 쇄를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, TCR은 서열번호 1 또는 그의 작용성 단편 또는 작용성 유도체를 포함하는 알파 쇄 및 서열번호 2 또는 그의 작용성 단편 또는 작용성 유도체를 포함하는 베타 쇄 둘 다를 포함한다.

본 개시 내용의 실시형태에서, T 세포 수용체는 서바이빈 상의 하나 이상의 에피토프에 결합한다. 에피토프는 임의의 부류일 수 있지만, 구체적인 실시형태에서 에피토프는 서열번호 15 또는 서열번호 16 또는 그의 작용성 단편을 비롯한 그의 단편을 포함하거나, 그것으로 이루어지거나, 그것으로 본질적으로 이루어진다. 특별한 실시형태에서, 본 개시 내용의 T 세포 수용체에 의해서 인식된 에피토프는 서열번호 15 또는 서열번호 16 또는 그의 작용성 단편을 비롯한 그의 단편과 70, 75, 77, 80, 85, 88, 90, 91, 91, 95, 97, 또는 99％ 동일하거나 적어도 그러하다. 에피토프는 서열번호 15 또는 서열번호 16과 관련된 N-말단 연장부 및/또는 C-말단 연장부 또는 절단부를 가질 수 있다. 그러한 N-말단 연장부 및/또는 C-말단 연장부는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 또는 그 초과의 아미노산일 수 있다. 그러한 N-말단 절단부 및/또는 C-말단 절단부는 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 또는 그 초과의 아미노산일 수 있다. 본 개시 내용의 TCR은 서열번호 15 또는 서열번호 16과 비교하여 특정 잔기에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 초과의 변경부를 갖는 서바이빈 에피토프를 결합할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 서열번호 15의 Leu4, Gly5 및/또는 Phe7d은 변경되지 않지만, 대안적인 실시형태에서 이들 중 하나 이상이 변경된다.

A. 단백질 조성물, 일반적임

특정 실시형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 단백질 분자를 포함하는 신규 TCR 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "단백질 분자", "단백질 조성물", "단백질 화합물", "단백질 쇄" 또는 "단백질 물질"은 일반적으로 약 200개를 초과하는 아미노산 또는 유전자로부터 번역된 전장의 내생 서열의 단백질; 약 100개를 초과하는 아미노산의 폴리펩타이드; 및/또는 약 3개 내지 약 100개의 아미노산의 펩타이드를 말하지만, 그에 제한되는 것은 아니다. 상기에 기술된 "단백질" 용어 전부는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

특정 실시형태에서, 적어도 하나의 단백질 분자의 크기는 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개, 약 7개, 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 21개, 약 22개, 약 23개, 약 24개, 약 25개, 약 26개, 약 27개, 약 28개, 약 29개, 약 30개, 약 31개, 약 32개, 약 33개, 약 34개, 약 35개, 약 36개, 약 37개, 약 38개, 약 39개, 약 40개, 약 41개, 약 42개, 약 43개, 약 44개, 약 45개, 약 46개, 약 47개, 약 48개, 약 49개, 약 50개, 약 51개, 약 52개, 약 53개, 약 54개, 약 55개, 약 56개, 약 57개, 약 58개, 약 59개, 약 60개, 약 61개, 약 62개, 약 63개, 약 64개, 약 65개, 약 66개, 약 67개, 약 68개, 약 69개, 약 70개, 약 71개, 약 72개, 약 73개, 약 74개, 약 75개, 약 76개, 약 77개, 약 78개, 약 79개, 약 80개, 약 81개, 약 82개, 약 83개, 약 84개, 약 85개, 약 86개, 약 87개, 약 88개, 약 89개, 약 90개, 약 91개, 약 92개, 약 93개, 약 94개, 약 95개, 약 96개, 약 97개, 약 98개, 약 99개, 약 100개, 약 110개, 약 120개, 약 130개, 약 140개, 약 150개, 약 160개, 약 170개, 약 180개, 약 190개, 약 200개, 약 210개, 약 220개, 약 230개, 약 240개, 약 250개, 약 275개, 약 300개, 약 325개, 약 350개, 약 375개, 약 400개, 약 425개, 약 450개, 약 475개, 약 500개, 약 525개, 약 550개, 약 575개, 약 600개, 약 625개, 약 650개, 약 675개, 약 700개, 약 725개, 약 750개, 약 775개, 약 800개, 약 825개, 약 850개, 약 875개, 약 900개, 약 925개, 약 950개, 약 975개, 약 1000개, 약 1100개, 약 1200개, 약 1300개, 약 1400개, 약 1500개, 약 1750개, 약 2000개, 약 2250개, 약 2500개 또는 그 초과, 및 그 내의 유도 가능한 임의의 범위의 아미노 분자 잔기를 포함할 수 있지만, 그에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "아미노 분자"는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지될 바와 같은 임의의 아미노산, 아미노산 유도체 또는 아미노산 모방체를 말한다. 특정 실시형태에서, 단백질 분자의 잔기는 아미노 분자 잔기의 서열을 중단하는 임의의 비-아미노 분자 없이, 순차적이다. 다른 실시형태에서, 서열은 하나 이상의 비-아미노 분자 모이어티를 포함할 수 있다. 특별한 실시형태에서, 단백질 분자의 잔기의 서열은 하나 이상의 비-아미노 분자 모이어티에 의해서 중단될 수 있다.

따라서, 용어 "단백질 조성물"은 자연에서 합성된 단백질에서 20개의 공통 아미노산 중 적어도 하나 또는 적어도 하나의 변경되거나 일반적이지 않은 아미노산을 포함하는 아미노산 분자 서열을 포함한다.

특정 실시형태에서, 단백질 조성물은 적어도 하나의 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함한다. 추가 실시형태에서, 단백질 조성물은 생체적합성 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체적합성"은 본 명세서에 기술된 방법 및 양에 따라서 특정 유기체에 적용되거나 투여될 때 어떤 유의한 불리한 효과도 생성하지 않는 물질을 말한다. 유기체는 그러한 불리하거나 바람직하지 않은 효과가 예컨대 상당한 독성 또는 부정적인 면역학적 반응인 것을 포함하지만, 그에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 실시형태에서, 생체적합성 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 함유 조성물은 일반적으로 각각 톡신, 병원체 및 유해한 면역원이 본질적으로 존재하지 않는 포유동물 단백질 또는 펩타이드 또는 합성 단백질 또는 펩타이드일 것이다.

단백질 조성물은 표준 분자 생물학적 기술을 통한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현, 천연 공급원으로부터의 단백질 화합물의 단리, 또는 단백질 물질의 화학적 합성을 비롯하여, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기술에 의해서 제조될 수 있다. 다양한 유전자에 대한 뉴클레오타이드 및 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드 서열이 이미 개시되어 있으며, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 컴퓨터 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. 그러한 한 데이터베이스는 바이오테크놀로지 인포메이션(Biotechnology Information)의 젠뱅크(GenBank)(등록상표) 및 젠펩트(GenPept)(등록상표) 데이터베이스의 내셔널 센터(National Center)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)이다. 이러한 공지된 유전자에 대한 코딩 영역은 본 명세서에 개시된 기술을 사용하거나 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 증폭되고/증폭되거나 발현될 수 있다. 대안적으로, 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드의 다양한 시판 제제가 관련 기술 분야에 공지되어 있다.

특정 실시형태에서, 단백질 화합물은 정제될 수 있다. 일반적으로, "정제된"은 특이적이거나, 다양한 다른 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드를 제거하기 위해서 분별에 적용된 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드 조성물을 지칭할 것이며, 조성물은 예를 들어, 특이적이거나 목적하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 대해서 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지될 바와 같은 단백질 검정법에 의해서 평가될 수 있는 바와 같은, 그의 활성을 실질적으로 보유한다.

사실상 임의의 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 함유 성분이 조성물에서 사용될 수 있다고 고려된다. 그러나, 단백질 물질이 생체적합성인 것이 바람직하다. 특정 실시형태에서, 보다 점성인 조성물의 형성이 그 조성물을 조직에 정확하거나 용이하게 적용하게 하고, 그 절차 전체에 걸쳐서 조직과 접촉하여 유지되게 할 것이라는 이점이 있을 것이라고 고려된다. 그러한 경우에, 펩타이드 조성물, 또는 보다 바람직하게는, 폴리펩타이드 또는 단백질 조성물의 사용이 고려된다. 점도 범위는 약 40 내지 약 100 푸아즈를 포함하지만, 그에 제한되는 것은 아니다. 특정 양상에서, 약 80 내지 약 100 푸아즈의 점도가 바람직하다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 단백질 및 펩타이드는 자가형 단백질 또는 펩타이드일 수 있지만, 본 발명은 그러한 자가형 단백질의 사용에 명백하게 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "자가형 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드"는 유기체로부터 유도되거나 수득된 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 말하며, 선택된 동물 또는 인간 대상체가 바람직하다. 이제 "자가형 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드"는 선택된 동물 또는 인간 대상체에 적용할 의도의 조성물의 성분으로서 사용될 수 있다. 특정 양상에서, 자가형 단백질 또는 펩타이드는 예를 들어, 선택된 공여자의 전체 혈장으로부터 제조된다. 혈장을 튜브에 넣거나 약 80℃에서 적어도 약 12시간 동안 동결기에 넣고, 이어서 약 12,000회 g에서 약 15분 동안 원심분리하여 침전물을 수득한다. 침전물, 예컨대 피브리노겐은 최대 약 1년 동안 저장될 수 있다(Oz, 1990).

B. 생물학적 작용성 등가물

유사하거나 개선된 특징을 갖는 분자를 수득하면서 본 발명에 따른 TCR 폴리뉴클레오타이드 및/또는 단백질의 구조에서 변형 및/또는 변경이 수행될 수 있기 때문에, 그러한 생물학적 작용성 등가물이 또한 본 발명에 포함된다.

본 개시 내용은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 단편 및/또는 유도체인 TCR 알파 쇄 및 베타 쇄를 제공한다. 그러한 단편 및/또는 유도체는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 활성을 유지할 것이다. 특별한 실시형태에서, 전체적으로 TCR의 부분으로서 단편 및/또는 유도체는 선택적인 항암 활성을 제공할 것이다.

1. 변형된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드

생물학적 작용성 등가물은 "야생형(wild-type)" 또는 표준 단백질을 코딩하기 위한 능력을 보유하면서 동시에 구별되는 서열을 함유하도록 조작된 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이는 유전자 코드의 퇴보(degeneracy), 즉 동일한 아미노산을 위해서 코딩하는 다중 코돈의 존재로 성취될 수 있다. 한 예에서, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 능력을 방해하지 않으면서 제한 효소 인식 서열을 폴리뉴클레오타이드에 도입하려고 할 수 있다.

또 다른 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 보다 상당한 변화를 갖는 생물학적 작용성 등가물일 수 있다(그리고 그것을 코딩할 수 있다). 특정 아미노산은 구조, 예를 들어 항체의 항원-결합 영역, 기질 분자 및 수용체 등 상의 결합 부위와의 상호적인 결합 능력을 감지할 수 있게 손상시키지 않으면서 단백질 구조 내의 다른 아미노산을 위해서 대체될 수 있다. 소위 "보존적" 변경은 단백질의 생물학적 활성을 방해하지 않는데, 그 이유는 구조 변경은 그의 설계된 기능을 수행하기 위한 단백질의 능력에 영향을 주는 것이 아니기 때문이다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명의 목적을 여전히 충족시키면서, 본 명세서에 개시된 유전자 및 단백질의 서열을 다양하게 변경할 수 있다고 생각한다.

작용성 등가물과 관련하여, 통상의 기술자는 "생물학적 작용성 등가물" 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 정의에서 분자가 허용 가능한 수준의 동등한 생물학적 활성을 보유하면서 분자의 정의된 부분에서 수행될 수 있는 변화의 수에 제한이 있는 개념이 내재한다는 것을 이해할 것이다. 따라서 생물학적 작용성 등가물은 본 명세서에서 선택된 아미노산(또는 코돈)에서 치환될 수 있는 그러한 단백질(및 폴리뉴클레오타이드)로서 정의된다. 구체적인 실시형태에서, 작용성 활성은 정상 조혈 줄기 세포/프로지니터 세포에 대해서 프래트리사이드성 효과 또는 독성이 없는 활성을 비롯하여, 선택적인 항암 활성을 포함한다. 특별한 실시형태에서, 작용성 활성은 자가독성이 없다. 특정 양상에서, 작용성 활성은 자가 조직 상의 서바이빈을 종양-관련 서바이빈 발현으로부터 식별하는 것을 가능하게 하고, "온 표적 오프-종양 활성 없이 항종양 반응성을 선택적으로 매개한다.

일반적으로, 분자의 길이가 짧을수록, 기능을 유지하면서 분자 내에서 행해질 수 있는 변화가 적다. 더 긴 도메인은 중간 정도의 수의 변화를 가질 수 있다. 전장의 단백질이 더 많은 수의 변화에 대해서 최대의 허용성을 가질 것이다. 그러나, 그의 구조에 상당히 좌우되는 특정 분자 또는 도메인은 적은 변형을 허용하거나 전혀 허용하지 않을 수 있다는 것을 인지해야 한다.

아미노산 치환은 일반적으로 아미노 측-쇄 치환기의 상대적인 유사성, 예를 들어 그의 소수성, 친수성, 전하, 크기 및/또는 그 밖의 것을 기준으로 한다. 아미노산 측-쇄 치환기의 크기, 형상 및/또는 유형의 분석은 알기닌, 라이신 및/또는 히스티딘은 모두 양으로 하전된 잔기이고; 알라닌, 글리신 및/또는 세린은 모두 유사한 크기이고; 그리고/또는 페닐알라닌, 트립토판 및/또는 티로신은 모두 대체로 유사한 형상을 가짐을 나타낸다. 따라서, 이러한 고려사항을 기초로, 알기닌, 라이신 및/또는 히스티딘; 알라닌, 글리신 및/또는 세린; 및/또는 페닐알라닌, 트립토판 및/또는 티로신은 본 명세서에서 생물학적 작용성 등가물로서 정의된다.

보다 정량적인 변화를 달성하기 위해서, 아미노산의 수치요법 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 그의 소수성 및/또는 전하 특징을 기준으로 수치요법 지수가 할당되어 있는데, 이것은 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신( 0.4); 트레오닌( 0.7); 세린( 0.8); 트립토판( 0.9); 티로신( 1.3); 프롤린( 1.6); 히스티딘( 3.2); 글루타메이트( 3.5); 글루타민( 3.5); 아스파테이트( 3.5); 아스파라긴( 3.5); 라이신( 3.9); 및/또는 알기닌( 4.5)이다.

단백질 상에 상호작용 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서 수치요법 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 관련 기술 분야에서 이해된다(Kyte & Doolittle, 1982, 본 명세서에 참고로 포함됨). 특정 아미노산이 유사한 수치요법 지수 및/또는 점수를 갖는 다른 아미노산에 대해서 대체될 수 있고/있거나 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유한다. 수치요법 지수를 기초로 변경하는데 있어서, 수치요법 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, 그것은 ±1 이내인 것이 특히 바람직하고 그리고/또는 ±0.5 이내인 것이 보다 더 특히 바람직하다.

특히, 본 발명의 특정 실시형태에서와 같이, 유사한 아미노산 치환으로 인해서 생성된 생물학적 작용성 등가물 단백질 및/또는 펩타이드가 면역학적 실시형태에서 사용되려는 경우, 유사한 아미노산의 치환은 친수성을 기초로 효과적으로 행해질 수 있다는 것이 관련 분야에서 이해된다. 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제4,554,101호는 인접한 아미노산의 친수성에 의해서 지배되는 바와 같은, 단백질의 최대 국지적인 평균 친수성은 그의 면역원성 및/또는 항원성, 즉 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있다고 언급하고 있다.

미국 특허 제4,554,101호에 상술되어 있는 바와 같이, 아미노산 잔기에 하기 친수성 값이 할당되어 있다: 알기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파테이트(+3.0 ± 1); 글루타메이트(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌( 0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌( 0.5); 히스티딘( 0.5); 시스테인( 1.0); 메티오닌( 1.3); 발린( 1.5); 류신( 1.8); 아이소류신( 1.8); 티로신( 2.3); 페닐알라닌( 2.5); 트립토판( 3.4). 유사한 친수성 값을 기초로 변경하는데 있어서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내의 것이 특히 바람직하고, 그리고/또는 ±0.5 이내인 것이 보다 더 특별히 바람직하다.

2. 변경된 아미노산

본 발명은 다수의 양상에서 적절한 폴리뉴클레오타이드의 전사 및 번역을 통해서 세포내에서 펩타이드 및 폴리펩타이드를 합성하는 것에 관한 것이다. 이들 펩타이드 및 폴리펩타이드는 20개의 "자연" 아미노산, 및 이들의 번역 후 변형체를 포함할 것이다. 그러나. 시험관내 펩타이드 합성법이 변형된/변형되거나 일반적이지 않은 아미노산의 사용을 가능하게 한다. 예시이지만, 비제한적인, 변형된/변형되거나 일반적이지 않은 아미노산은 다음과 같다: 2-아미노아디프산, N-에틸아스파라긴, 3-아미노아디프산, 하이드록시라이신, 베타-알라닌, 베타-아미노-프로피온산, 알로-하이드록시라이신, 2-아미노부티르산, 3-하이드록시프롤린, 4-아미노부티르산, 피페리딘산, 4-하이드록시프롤린, 6-아미노카프로산, 아이소데스모신, 2-아미노헵탄산, 알로-아이소류신, 2-아미노아이소부티르산, N-메틸글리신, 사르코신, 3-아미노아이소부티르산, N-메틸아이소류신, 2-아미노피멜산, 6-N-메틸라이신, 2,4-다이아미노부티르산, N-메틸발린, 데스모신, 노르발린, 2,2'-다이아미노피멜산, 노르류신, 2,3-다이아미노프로피온산, 오르니틴, 및 N-에틸글리신.

3. 모방체

상기에 논의된 생물학적 작용성 등가물에 더하여, 본 발명자들은 또한 구조적으로 유사한 화합물이 본 발명의 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 주요 부분을 모방하도록 제제화될 수 있다고 생각한다. 펩타이드모방체라 지칭될 수 있는 그러한 화합물은 본 발명의 펩타이드와 동일한 방식으로 사용될 수 있고, 따라서 그것은 작용성 등가물이다.

단백질 2차 구조 및 3차 구조의 요소를 모방하는 특정 모방체가 문헌 [Johnson et al.(1993)]에 기술되어 있다. 펩타이드 모방체를 사용하는 근본적인 이유는 단백질의 펩타이드 골격이, 분자 상호작용, 예컨대 항체 및/또는 항원의 상호 작용을 가능하게 하는 그러한 방식으로 아미노산 측 쇄를 배향하도록 주로 존재하기 때문이다. 따라서, 펩타이드 모방은 자연 분자와 유사한 분자 상호작용을 허용하도록 설계된다.

펩타이드 모방 개념의 일부 성공적인 응용은 항원성이 높다고 공지되어 있는 단백질 내의 β-턴의 모방체에 초점을 맞추고 있다. 마찬가지로, 폴리펩타이드 내의 β-턴 구조가 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 컴퓨터-기반 알고리즘에 의해서 예측될 수 있다. 그 턴의 성분 아미노산이 결정되면, 모방체는 아미노산 측 쇄의 필수 원소의 유사한 공간적인 배향을 성취하도록 구축될 수 있다.

다른 접근법은 큰 단백질의 결합 부위를 모방하는 생물학적 활성 입체구조를 제조하기 위한 매력적인 구조 템플레이트로서 작은 다중다이설파이드-함유 단백질을 사용하는 것에 초점을 맞추고 있다. 문헌[Vita et al. (1998)]. 특정 톡신 내에 진화론적으로 보호되어 있는 것처럼 보이는 구조적 모티프(motif)는 작고(30 내지 40개의 아미노산), 안정하고, 돌연변이에 대해서 매우 관대하다. 이러한 모티프는 베타 시트 및 3개의 다이설파이드에 의해서 내부 코어 내에서 브릿징된 알파 헬릭스로 구성된다.

베타 II 턴은 사이클릭 L-펜타펩타이드 및 D-아미노산을 갖는 것을 사용하여 성공적으로 모방되었다. 문헌[Weisshoff et al. (1999]. 또한, 문헌[Johannesson et al. (1999)]은 특성을 유도하는 반전 턴을 갖는 바이사이클릭 트라이펩타이드를 보고한다.

특이적인 구조를 생성하는 방법은 관련 기술 분야에 개시되어 있다. 예를 들어, 알파-헬릭스 모방체가 미국 특허 제5,446,128호; 제5,710,245호; 제5,840,833호; 및 제5,859,184호에 개시되어 있다. 이러한 구조는 펩타이드 또는 단백질이 열적으로 더 안정하게 하고, 또한 단백질분해 절단에 대한 저항성을 증가시킨다. 6원, 7원, 8원, 12원, 13원 및 14원 고리 구조가 개시되어 있다.

입체구조적으로 제한된 베타 턴 및 베타 벌지(bulge)를 생성하는 방법이 예를 들어, 미국 특허 제5,440,013호; 제5,618,914호; 및 제5,670,155호에 기술되어 있다. 베타-턴은 상응하는 골격 입체구조를 변경하지 않고 변경된 측 치환을 허용하고, 표준 합성 절차에 의해서 펩타이드 내로 도입하기에 적절한 말단을 갖는다. 다른 유형의 모방 턴은 반전 턴 및 감마 턴을 포함한다. 반전 턴 모방체는 미국 특허 제5,475,085호 및 제5,929,237호에 개시되어 있고, 감마 턴 모방체는 미국 특허 제5,672,681호 및 제5,674,976호에 기술되어 있다.

4. 구체적인 실시형태

마우스 기원의 TCR알파와 TCR베타의 베타 쇄, 알파 쇄, 다중 프레임워크 영역, 다중 다양성 영역, 결합 영역 및 불변 영역을 포함하는 서바이빈-특이적인 T 세포 수용체의 예가 서열 번호 3에 제공되어 있다. 마우스 기원의 TCR알파 및 TCR베타의 베타 쇄, 알파 쇄, 다중 프레임워크 영역, 다중 다양성 영역, 결합 영역, 및 불변 영역을 포함하는 서바이빈-특이적인 T 세포 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 예가 서열번호 5에 제공되어 있다. 마우스 기원의 TCR알파 및 TCR베타의 베타 쇄, 알파 쇄, 다중 프레임워크 영역, 다중 다양성 영역, 다중 결합 영역, 및 불변 영역을 코딩하는 벡터의 예가 서열번호 4에 제공되어 있고; 상기 폴리뉴클레오타이드는 또한 5' LTR 및 3' LTR을 포함한다.

II. 서바이빈 -특이적인 TCR을 발현하는 숙주 세포

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포," "세포주" 및 "세포 배양액"은 상호 교환가능하게 사용될 수 있다. 이러한 용어 전부는 또한 그의 자손을 포함하며, 그것은 임의의 그리고 모든 후속 세대이다. 의도적이거나 의도적이지 않은 돌연변이로 인해서 모든 자손이 동일할 수는 없다는 것이 이해된다. 이종(heterologous) 핵산 서열의 발현과 관련하여, "숙주 세포"는 벡터를 복제하고/복제하거나 벡터에 의해서 코딩된 이종 유전자를 발현할 수 있는 진핵 세포를 말한다. 숙주 세포는 벡터에 대한 수용자로서 사용될 수 있고, 사용되어 왔다. 숙주 세포는 "감염"되거나 "변형"될 수 있는데, 이는 외인성 핵산이 숙주 세포로 전달되거나 도입되는 과정을 말한다. 변형된 세포는 1차 대상체 세포 및 그의 자손을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조작된" 및 "재조합" 세포 또는 숙주 세포는 외인성 핵산 서열, 예컨대, 예를 들어, 벡터가 도입된 세포를 지칭하고자 한다. 따라서, 재조합 세포는 재조합적으로 도입된 핵산을 함유하지 않는 자연 발생 세포와 구별된다. 본 발명의 실시형태에서, 숙주 세포는 세포독성 T-세포(TC, 세포독성 T 림프구, CTL, T-살해 세포, 세포용해 T 세포, CD8+ T-세포, CD4+ T-세포, 또는 살해 T-세포라고도 공지됨)를 비롯한 T 세포이고; NK 세포 및 NKT 세포가 또한 본 발명에 포함된다.

한 양상에서, 본 명세서에서 하나 이상의 TCR을 발현하도록 유전자 조작된 세포가 제공된다. 특정 실시형태에서, 유전자 조작된 세포는 예를 들어, T 림프구(T-세포), 자연 살해(NK) T-세포, 또는 NK 세포이다. 특정 다른 실시형태에서, 유전자 조작된 세포는 비-면역 세포, 예를 들어, 간엽 줄기 세포(MSC), 뉴런 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포), 또는 배아 줄기 세포이다. 구체적인 실시형태에서, 세포는 또한 조작된 TCR 또는 그의 기능을 향상시킬 수 있는 임의의 다른 유전 변형체를 포함한다.

특정 실시형태에서, RNA 또는 단백질 서열은 동일한 세포, 예컨대 동일한 CTL에서 다른 선택된 RNA 또는 단백질 서열과 함께 공동 발현될 수 있다고 생각된다. 공동 발현은 CTL을 2개 이상의 구별되는 재조합 벡터를 사용하여 공동 감염시킴으로써 성취될 수 있다. 대안적으로, RNA를 위한 다수의 구별되는 코딩 영역을 포함하도록 단일 재조합 벡터를 구축할 수 있고, 이어서 이것을 단일 벡터로 감염된 CTL에서 발현시킬 수 있다.

일부 벡터는 그것이 원핵 세포 및 진핵 세포 둘 다에서 복제되고/복제되거나 발현되는 것을 가능하게 하는 제어 서열을 사용할 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 숙주 세포를 유지시키고, 벡터의 복제를 허용하기 위해서 상기에 기술된 숙주 세포 전부를 인큐베이션시키기 위한 조건을 추가로 이해할 것이다. 또한 벡터의 큰 규모 제조, 뿐만 아니라 벡터에 의해서 코딩된 핵산의 제조 및 그의 동족 폴리펩타이드, 단백질, 또는 펩타이드의 제조를 가능하게 하는 기술 및 조건이 이해되고, 공지되어 있다.

세포는 자가형 세포, 동형(syngeneic) 세포, 동종이형 세포 및 심지어는 일부 경우에, 이종 세포일 수 있다.

유전자 조작된 T-세포를 사멸시킬 수 있는 것을 원하는 많은 경우에, 치료를 중단하고자 하는 경우, 세포의 존재 이후의 세포의 부재가 흥미롭거나 다른 목적인 연구에서, 세포는 신생물이 된다. 이러한 목적을 위해서, 제어된 조건 하에서 조작된 세포를 사멸시킬 수 있는 특정 유전자 생성물, 예컨대 유도성 자살 유전자의 발현을 제공할 수 있다. 그러한 자살 유전자는 관련 기술 분야에 공지되어 있는데, 예를 들어 카스파제 9의 변형된 형태가 소분자, 예를 들어, AP1903와 이량체화될 수 있는 i카스파제9 시스템이다. 예를 들어, 문헌[Straathof et al., Blood 105:4247-4254(2005)]을 참고하기 바란다.

본 개시 내용의 제약 조성물은 본 명세서에 정의된 벡터로 변형되거나 감염된 숙주 세포를 포함한다고 추가로 예상된다. 숙주 세포는 상기에 기술된 벡터 중 적어도 하나 또는 상기에 기술된 핵산 분자 중 적어도 하나를 숙주 세포에 도입함으로써 제조될 수 있다. 숙주 세포 중의 적어도 하나의 벡터 또는 적어도 하나의 핵산 분자의 존재는 특이적인 단일 쇄 항체 구축물이라고 기술된 상기의 것을 코딩하는 유전자의 발현을 매개할 수 있다.

숙주 세포에 도입된 기술된 핵산 분자 또는 벡터는 숙주의 게놈에 통합될 수 있거나 그것은 염색체 외에서 유지될 수 있다.

숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있지만, 구체적인 실시형태에서 그것은 진핵 세포이다. 구체적인 실시형태에서, 숙주 세포는 박테리아, 곤충, 진균, 식물 또는 동물 세포이다. 특히 언급된 숙주는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포 또는 인간 세포주일 수 있다고 예상된다. 특별하게 바람직한 숙주 세포는 면역 세포, CHO 세포, COS 세포, 골수종 세포주, 예컨대 SP2/0 또는 NS/0를 포함한다.

본 개시 내용의 제약 조성물은 또한 세포 증식 또는 세포 자극에 유용한 면역 이펙터 세포에 활성화 신호를 제공할 수 있는 단백질 화합물을 포함할 수 있다. 본 개시 내용에 비추어, 면역 이펙터 세포에 활성화 신호를 제공하는 "단백질 화합물"은 예를 들어, T-세포를 위한 추가 활성화 신호(예를 들어, 추가의 보조자극 분자: B7-군의 분자, OX40 L, 4-1BBL), 또는 추가 사이토카인: 인터류킨(예를 들어, IL-2, IL-7, 또는 IL-15), 또는 NKG-2D 인게이징(engaging) 화합물일 수 있다. 단백질 화합물은 또한 비-T-세포인 면역 이펙터 세포에 활성화 신호를 제공할 수 있다. 비-T-세포인 면역 이펙터 세포에 대한 예는 그 중에서도, NK 세포, 또는 NKT-세포를 포함한다.

한 실시형태는 본 명세서에 상기에 정의된 숙주 세포를 구축물의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 본 개시 내용의 조성물의 제조 방법에 관한 것이고, 그 세포 또는 복수의 세포는 개체에게 제공된다.

TCR 분자의 발현을 가능하게 하는 발현 구축물을 보유하는 세포의 배양을 위한 조건은, 목적하는 경우 구축물의 정제/회수를 위한 절차와 같이, 관련 기술 분야에 공지되어 있다.

한 실시형태에서, 숙주 세포는 선택되고/되거나 클로닝되고/되거나 그 후에 입양 면역요법을 위해서 사용되는 T-세포의 집단에 도입되는 표적 황원에 대한 높은-결합능 및 반응성을 갖는 TCR을 포함하는 유전자 조작된 T-세포(예를 들어, 세포독성 T 림프구)이다.

III. 제약 조성물

본 명세서에서 유전자 조작된 면역 세포, 예를 들어, 유전자 조작된 서바이빈-특이적인 TCR-발현 T 세포를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.

본 개시 내용에 따라서, 용어 "제약 조성물"은 개체에게 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 제약 조성물은 비경구, 경피, 관내(intraluminal), 동맥내, 척추강내 또는 정맥내 투여하거나 암에 직접 주사하기 위한 조성물을 포함한다. 특히 상기 제약 조성물은 주입 또는 주사를 통해서 개체에게 투여된다고 예상된다. 적합한 조성물의 투여는 상이한 방식에 의해서, 예를 들어 정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 국소 또는 피내 투여에 의해서 달성될 수 있다.

본 개시 내용의 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 제약 담체의 예는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 인산 완충 염수 용액, 물, 에멀전, 예컨대 오일/물 에멀전, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 그러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 종래의 방법에 의해서 제제화될 수 있다. 이러한 제약 조성물은 적합한 투여량으로 대상체에 투여될 수 있다.

투여 요법은 참여 의료진 및 임상 인자에 의해서 결정될 것이다. 의료 분야에서 널리 공지된 바와 같이, 임의의 한 환자를 위한 투여량은 환자의 체격, 신체 표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 투여 경로, 일반적인 건강, 및 공동으로 투여되는 다른 약물을 비롯한 다수의 인자에 좌우된다. 투여를 위한 투여량의 예는 2x10⁷ 세포/신체 표면적 ㎡ 또는 1x10⁶ 세포/체중 Kg 내지 최대 2x10⁸ 세포/㎡ 또는 5x10⁶ 세포/Kg 범위일 수 있다. 이러한 주입은 반복될 수 있다. 주기적인 평가에 의해서 진척을 모니터링할 수 있다.

본 개시 내용의 TCR 세포 조성물은 국지적으로 또는 전신에 투여될 수 있다. 투여는 일반적으로 비경구, 예를 들어 정맥내일 것이고; DNA가 또한 예를 들어, 내부 또는 외부 표적 부위로의 유전자총 전달에 의해서 또는 동맥 내의 부위의 카테터에 의해서 표적 부위에 직접 투여될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 제약 조성물은 피하 투여되고, 보다 더 바람직한 실시형태에서 정맥내 투여된다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수용액 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀전을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스터, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 염류 완충 매질을 비롯한, 물, 알코올/수성 용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 린저 덱스트로즈(Ringer's dextrose), 덱스트로즈 및 염화나트륨, 락테이트화 린저 오일 또는 락테이트화 고정유(fixed oil)를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제(예컨대 린저 덱스트로즈를 기재로 하는 것) 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대, 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체 등이 또한 존재할 수 있다. 또한 본 개시 내용의 제약 조성물은 단백질 담체 등, 예를 들어 바람직하게는 인간 기원의 혈청 알부민 또는 면역글로불린을 포함한다. 본 개시 내용의 제약 조성물은 단백질 이중특이적인 단일 쇄 항체 구축물 또는 핵산 분자 또는 그를 코딩하는 벡터(본 개시 내용에 기술된 바와 같음)에 더하여, 제약 조성물의 의도되는 용도에 따라서, 생물학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다고 고려된다.

V. TCR 및 TCR을 포함하는 숙주 T-세포의 치료 용도

다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 TCR 구축물, 핵산 서열, 벡터, 숙주 세포 및/또는 그를 포함하는 제약 조성물은 암 질환, 예컨대 종양 질환의 예방, 치료 또는 호전을 위해서 사용된다. 특별한 실시형태에서, 본 개시 내용의 제약 조성물은 예를 들어, 종양을 갖는 암을 비롯한 암의 예방, 호전 및/또는 치료에 특히 유용할 수 있다.

특별한 실시형태에서, 치료 유효량의 복수의 본 개시 내용의 세포 중 임의의 것을 개체에게 제공하는 단계를 포함하는, 암에 대해서 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 특정 양상에서, 암은 고형 종양이고, 종양은 임의의 크기를 가질 수 있다. 특정 양상에서, 방법은 치료 유효량의 부가적인 암 요법을 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "치료" 또는 "치료하는"은 질환 또는 병리학적 병태의 증상 또는 병리학에 대한 임의의 이로운 효과 또는 바람직한 효과를 포함하고, 심지어는 치료될 질환 또는 병태, 예를 들어 암의 하나 이상의 측정 가능한 마커의 최소한의 감소를 포함할 수 있다. 치료는 질환 또는 병태의 증상의 감소 또는 호전, 또는 질환 또는 병태의 진척의 지연을 임의적으로 포함할 수 있다. "치료"는 질환 또는 병태, 또는 그의 관련 증상의 완전한 근절 또는 치유를 반드시 나타내는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "예방하다" 및 유사한 단어, 예컨대 "예방되는", "예방하는" 등은 질환 또는 병태, 예를 들어, 암의 발생 또는 재발생 가능성을 예방하거나, 억제하거나, 감소시키기 위한 접근법을 나타낸다. 그것은 또한 질환 또는 병태의 개시 또는 재발생을 지연시키거나 질환 또는 병태의 증상의 발생 또는 재발생을 지연시키는 것을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "예방" 및 유사한 단어는 또한 질환 또는 병태의 개시 또는 재발생 전에 질환 또는 병태의 강도, 효과, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.

특별한 실시형태에서, 본 발명은 적어도 일부 양상에서는 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께, 표준 벡터 및/또는 유전자 전달 시스템을 사용하여 단독으로 또는 임의의 조합으로 투여될 수 있는 세포, TCR 구축물, 핵산 분자 및 벡터를 부분적으로 고려한다. 특정 실시형태에서, 투여 이후에, 상기 핵산 분자 또는 벡터는 대상체의 게놈에 안정하게 통합될 수 있다.

구체적인 실시형태에서, 특정 세포 또는 조직에 대해서 특이적이고 상기 세포에서 유지되는 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 제약 담체 및 부형제는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 본 개시 내용에 따라서 제조된 조성물은 상기에 식별된 질환을 예방 또는 치료 또는 지연시키는데 사용될 수 있다.

추가로, 본 개시 내용은 본 명세서에 기술되고/기술되거나 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 의해서 제조된, 유효량의 (서바이빈-특이적인 TCR-발현 세포를 보유하는) 면역 세포, 예를 들어, T 세포 또는 세포독성 T 림프구; 그러한 TCR을 코딩하는 핵산 서열; 그러한 TCR을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 종양 질환의 예방, 치료 또는 호전이 필요한 대상체 또는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 질환의 예방, 치료 또는 호전 방법에 관한 것이다.

예시적인 TCR 세포의 조성물(들)의 투여를 위한 가능한 적응증은 유방암, 전립선암, 폐암 및 결장암 또는 상피암/암종, 예컨대 유방암, 결장암, 전립선암, 두경부암, 피부암, 비뇨생식관의 암, 예를 들어, 난소암, 자궁내막암, 자궁암 및 신장암, 폐암, 위암, 소장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 식도암, 타액샘암 및 갑상샘암을 비롯한 종양 질환을 비롯한, 암 질환이다. 본 개시 내용의 조성물(들)의 투여는 예를 들어, 미세 잔존 질환, 초기암, 진행암, 및/또는 전이성 암 및/또는 불응성 암을 비롯한 암의 모든 단계 및 유형에 유용하며, 여기서 암은 병원체 혈관신생과 관련된다.

본 개시 내용은 다른 화합물, 예를 들어 이중특이적인 항체 구축물, 표적화된 톡신 또는 면역 세포를 통해서 작용하는 다른 화합물과 공동 투여하는 프로토콜을 추가로 포함한다. 본 발명의 화합물(들)의 공동 투여를 위한 임상 요법은 동시에, 다른 성분을 투여하기 전에 또는 다른 성분을 투여한 후의 공동 투여를 포함할 수 있다. 특별한 조합 요법은 화학요법, 방사선, 수술, 호르몬 요법 또는 다른 유형의 면역요법을 포함한다.

치료를 위한 특별한 투여량은 관련 기술 분야에서 일반적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 그러나, 구체적인 실시형태에서, T 세포는 T 세포의 전달이 필요한 개체에게 1회 전달되지만, 일부 경우에는 그것은 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 또는 그 초과의 횟수를 비롯하여 다회이다. 다회 투여가 제공되는 경우, 투여 사이의 시간 기간은 임의의 적합한 시간을 가질 수 있지만, 구체적인 실시형태에서, 시간 간격은 투여 사이에서 수주 또는 수개월이다. 투여 사이의 시간은 단일 요법에서 달라질 수 있다. 특별한 실시형태에서, 투여 사이의 시간은 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 또는 그 초과의 주수이다. 구체적인 경우에, 그것은 예를 들어, 4 내지 8주, 예를 들어 6 내지 8주이다.

특별한 실시형태에서, 서바이빈-특이적인 TCR을 발현하는 세포를 포함하는 제약 조성물이 존재한다. 유효량의 세포가 유효량의 세포가 필요한 개체에게 제공된다.

예의 방식으로, 암 환자 또는 암에 민감한 환자 또는 암을 갖는 것으로 의심되는 환자가 다음과 같이 치료될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이 변형된 세포를 환자에게 투여하고, 연장된 시간 동안 유지될 수 있다. 개체에게 1회 이상의 세포 투여가 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자 조작된 세포는 면역 인식을 억제하도록 캡슐화되고, 종양 부위에 배치된다.

특별한 경우에, 서바이빈에 대해서 특이적인 TCR을 포함하도록 조작된 치료용 T-세포가 개체에게 제공된다. 다회의 전달 반복에서, 세포는 동일한 제제 또는 별개의 제제로 전달될 수 있다. 세포는 별개의 전달 경로로 개체에게 제공될 수 있다. 세포는 예를 들어, 종양 부위에 주사에 의해서 또는 정맥내로 또는 경구로 전달될 수 있다. 그러한 조성물에 대한 일반적인 전달 경로가 관련 기술 분야에 공지되어 있다.

TCR을 코딩하는 발현 벡터가 하나 이상의 DNA 분자 또는 구축물로서 도입될 수 있고, 여기서 그 구축물(들)을 함유하는 숙수 세포의 선택을 가능하게 할 적어도 하나의 마커가 존재할 수 있다. 구축물은 종래의 방식으로 제조될 수 있고, 여기서 유전자 및 조절 영역은 적절한 경우 단리되고, 결찰되고, 적절한 클로닝 숙주 내에서 클로닝되고, 제한 또는 시퀀싱 또는 다른 편리한 수단에 의해서 분석될 수 있다. 특별하게, PCR을 사용하여, 작용성 단위의 전부 또는 일부를 포함하는 개별 단편이 단리될 수 있고, 여기서 적절한 경우 하나 이상의 돌연변이가 "프라이머 리페어(primer repair)", 결찰, 시험관내 돌연변이유발 등을 사용하여 도입될 수 있다. 구축물(들)이 완결되어 적절한 서열을 갖는 것으로 입증되면, 이어서 임의의 편리한 수단에 의해서 CTL에 도입될 수 있다. 구축물은 세포에 감염시키거나 형질도입하기 위해서, 레트로바이러스 벡터를 비롯한 비-복제성 결손 바이러스 게놈, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 또는 단순 허피스 바이러스(HSV) 등에 통합되거나 패키징될 수 있다. 구축물은 바람직하다면 감염을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 구축물은 퓨전, 전기천공법, 유전자총, 감염, 리포펙션(lipofection) 등에 의해서 도입될 수 있다. 숙주 세포는 구축물(들)의 도입 이전에 배양액에서 성장되고, 확장될 수 있고, 이어서 구축물(들)의 도입을 위해서 적절하게 처리될 수 있고, 구축물(들)에 통합될 수 있다. 이어서 세포는 확장되어, 구축물 중에 존재하는 마커에 의해서 스크리닝된다. 성공적으로 사용될 수 있는 다양한 마커는 hprt, 네오마이신 내성, 티미딘 키나제, 하이그로마이신 내성 등을 포함한다.

일부 예에서, 상동 재조합을 위한 표적 부위를 가질 수 있는데, 여기서 구축물이 특정 유전자자리(locus)에서 통합될 수 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, 내생 유전자를 녹-아웃하고, 그것을 (동일한 유전자자리 또는 다른 곳에서) 상동 재조합을 위해서 관련 기술 분야에 공지된 바와 같은 물질 및 방법을 사용하여 구축물에 의해서 코딩되는 유전자로 대체할 수 있다. 상동 재조합을 위해서, OMEGA 또는 O-벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Thomas and Capecchi, Cell(1987) 51, 503-512]; [Mansour, et al., Nature(1988) 336, 348-352]; 및 [Joyner, et al., Nature(1989) 338, 153-156]을 참고하기 바란다.

구축물은 적어도 TCR 및 임의적으로는 또 다른 유전자를 코딩하는 단일 DNA 분자, 또는 하나 이상의 유전자를 갖는 상이한 DNA 분자로서 도입될 수 있다. 구축물은 각각 동일하거나 또는 상이한 마커를 사용하여 동시에 또는 연속적으로 도입될 수 있다.

구축물 DNA의 스톡을 제조하고, 감염을 수행하기 위해서 사용될 수 있는 유용한 요소, 예컨대 박테리아 또는 효모 복제원점 선택성 및/또는 증폭성 마커, 원핵생물 또는 진핵생물에서의 발현을 위한 프로모터/인핸서 요소 등을 함유하는 벡터는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 구매 가능하다.

이어서, TCR 구축물(들)을 포함하도록 조작된 예시적인 T 세포가 선택적인 조건 하에서 배양액 중에서 성장되고, 이어서 그 구축물을 갖는 것으로서 선택된 세포가 확장되고, 예를 들어, 숙주 세포에서 구축물의 존재를 결정하기 위해서 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 추가로 분석될 수 있다. 조작된 숙주 세포가 확인되자 마자, 이어서 그것은 계획된 바와 같이, 사용될 수 있고, 예를 들어 배양액에서 확장되거나 숙주 유기체에 도입될 수 있다.

세포의 본성에 따라서, 세포는 숙주 유기체, 예를 들어, 포유동물에 매우 다양한 방식으로 도입될 수 있다. 세포는 구체적인 실시형태에서 종양 부위에 도입될 수 있지만, 대안적인 실시형태에서, 세포는 암에 호닝(honning)되거나 또는 암에 호닝되도록 변형된다. 사용되는 세포의 수는 다수의 상황, 도입을 위한 목적, 세포의 수명, 사용될 프로토콜, 예를 들어, 투여 횟수, 세포의 번식 능력, 재조합 구축물의 안정성 등에 좌우될 것이다. 세포는 일반적으로는 관심 부위에 또는 그 근처에 주사될 분산액으로서 적용될 수 있다. 세포는 생리학상-허용되는 배지 중에 존재할 수 있다.

DNA 도입은 모든 경우에 통합을 유발할 필요는 없다. 일부 상황에서, 도입된 DNA의 일시적인 유지가 충분할 수 있다. 이러한 방식에서, 단기 효과를 가질 수 있는데, 여기서 세포는 숙주에 도입되고, 이어서 소정의 시간 이후에, 예를 들어 세포가 특정 부위로 귀소될 수 있게 된 후에 터닝(turnning)될 수 있다.

세포는 필요에 따라서 투여될 수 있다. 목적하는 반응, 투여 방식, 세포의 수명, 존재하는 세포의 수에 따라서, 다양한 프로토콜이 사용될 수 있다. 투여 횟수는 적어도 부분적으로는 상기에 기술된 인자에 좌우될 것이다.

계는 다수의 변수, 예컨대 리간드에 대한 세포 반응, 발현의 효능, 적절한 경우, 발현 생성물의 활성, 시간 및 상황에 따라서 달라질 수 있는 환자의 특정 요구, 세포의 손실 또는 개별 세포의 발현 활성의 결과로서의 세포 활성의 손실률 등에 영향을 받는다는 것을 인식해야 한다. 따라서, 집단에 다량으로 투여될 수 있는 일반적인 세포가 존재하더라고, 각각의 개별 환자에 대해서, 각각의 환자는 개인을 위한 적절한 투여량에 대해서 모니터링될 것이고, 그러한 환자 모니터링 실시는 관련 기술 분야에서 일반적임이 예상된다.

또 다른 양상에서, 본 명세서에서 치료 유효량의 적어도 TCR을 발현하는 세포를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포를 갖는 개체의 치료 방법이 제공된다. 관련된 양상에서, 본 명세서에서 치료 유효량의 적어도 서바이빈-특이적인 TCR을 발현하는 세포를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포를 갖는 개체의 치료 방법이 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 상기 투여는 개체에서 종양의 성장을 측정 가능하게 감소시킨다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 상기 투여는 개체에서 종양의 크기를 측정 가능하게 감소시킨다. 다양한 실시형태에서, 종양의 크기 또는 성장률은 예를 들어, 직접 영상화(예를 들어, CT 스캔, MRI, PET 스캔 등), 형광 영상화, 조직 생검, 및/또는 관련 생리학적 마커(예를 들어, 전립선암의 경우 PSA 수준; 융모막암의 경우 HCG 수준 등)의 평가에 의해서 측정될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시형태에서, 개체는 불량한 예후와 상관관계가 있는 높은 항원 수준을 갖는다. 일부 실시형태에서, 개체에게 부가적인 암 요법, 예컨대 수술, 방사선, 화학요법, 호르몬 요법, 면역요법 또는 이들의 조합 등이 제공된다.

IV. 본 개시 내용 의 키트

실시형태는 본 명세서에 정의된 바와 같은 세포, 본 명세서에 정의된 바와 같은 TCR 구축물, 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 서열 및/또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 개시 내용의 키트는 상기 본 명세서에 기술된 바와 같은 제약 조성물을 단독으로 또는 의학적 치료 또는 중재가 필요한 개체에게 투여될 추가 의약과의 조합으로 포함한다.

본 명세서에 기술된 조성물 중 임의의 것이 키트에 포함될 수 있다. 비제한적인 예에서, 세포 요법을 위한 세포 또는 세포를 제조하기 위한 하나 이상의 시약이 키트에 포함될 수 있다. 따라서, 키트는 적합한 용기 수단 내에 키트 내에 포함될 수 있는 세포, 벡터, 프라이머, 효소, 완충액, 염, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 등을 포함할 것이다. 특별한 실시형태에서, 세포는 서열번호 1 또는 그의 작용성 단편 또는 작용성 유도체를 포함하는 상기 수용체의 알파 쇄; 및 서열번호 2 또는 그의 작용성 단편 또는 작용성 유도체를 포함하는 상기 수용체의 베타 쇄 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 TCR을 비롯한, 서바이빈에 대해서 특이적인 TCR을 코딩하는 특정 벡터가 형질도입되어 있다. 키트는 또한 수용체 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 추가 조작을 위해서 박테리아를 또한 포함할 수 있다. 키트는 형질도입되지 않은 포유동물 면역 세포, 예컨대 본 개시 내용의 TCR의 일부 또는 전부를 코딩하는 벡터가 형질도입될 수 있는 면역 세포를 포함할 수 있다. 키트는 벡터 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 발현 구축물을 포함하는 것을 비롯한, 본 개시 내용의 TCR의 일부 또는 전부를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

키트는 본 개시 내용의 적합하게 분취된 세포 조성물, 또는 세포를 생성하도록 적합하게 분취된 시약을 포함할 수 있다. 키트의 성분은 수성 배지 중에 또는 동결 건조된 형태로 패키징될 수 있다. 키트의 용기 수단은 일반적으로 성분을 넣고, 바람직하게는 적합하게 분취할 수 있는 적어도 하나의 바이알, 시험 튜브, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함할 수 있다. 키트는 또한 멸균된 제약상 허용되는 완충액 및/또는 다른 희석액을 함유하는 제2 용기 수단을 포함할 수 있다. 하나를 초과하는 성분이 키트에 존재하는 경우, 키트는 또한 일반적으로 부가적인 성분(들)을 별도로 넣을 수 있는 제2, 제3 또는 다른 부가적인 용기를 함유할 것이다. 그러나, 성분의 다양한 조합이 바이알에 포함될 수 있다. 키트는 단일 용기 수단을 가질 수 있고/있거나 그것은 각각의 화합물을 위한 구별되는 용기 수단을 가질 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로는 상업적인 판매를 위해서 밀폐 구속된 임의의 용기(들)를 함유하는 수단을 포함할 것이다. 그러한 용기는 목적하는 바이알이 보유된 사출 성형되거나 취입 성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.

본 개시 내용의 키트는 예컨대 증폭에 의해서 그러한 폴리뉴클레오타이드를 제조하기 위해서 T 세포 수용체 및/또는 프라이머의 일부 또는 전부를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 그러한 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, T 세포 수용체 베타 쇄, T 세포 수용체 알파 쇄 또는 수용체의 또 다른 영역을 코딩할 수 있다.

키트의 성분이 하나 및/또는 그 초과의 액체 용액 중에 제공되는 경우, 액체 용액은 수용액일 수 있고, 멸균 수용액이 특별하게 바람직하다. 조성물은 또한 전달 가능한 조성물로 제제화될 수 있다. 그러한 경우, 용기 수단 자체가 제제를 신체의 감염된 면적에 적용할 수 있고/있거나 동물에게 주사할 수 있고/있거나 심지어는 키트의 다른 성분에 적용하고/적용하거나 키트의 다른 성분과 혼합할 수 있는 주사기, 파이펫 및/또는 다른 그러한 유사한 장치일 수 있다.

그러나, 특정 실시형태에서 키트의 성분은 건조 분말(들)로서 제공될 수 있다. 시약 및/또는 성분이 건조 분말로서 제공되는 경우, 분말은 적합한 용매의 첨가에 의해서 재구성될 수 있다. 용매는 또한 또 다른 용기 수단 내에 제공될 수 있다고 예상된다.

용기의 수 및/또는 유형에 관계없이, 본 발명의 키트는 또한 극치값의 주입/투여 및/또는 배치를 돕기 위한 장비를 포함하고/포함하거나 그와 함께 패키징될 수 있다. 그러한 장비는 주사, 파이펫, 포세프(forcep), 및/또는 임의의 그러한 의학적으로 승인된 전달 비히클일 수 있다.

본 개시 내용의 특정 실시형태에서, 키트는 특별한 유형의 암의 진단을 위한 하나 이상의 장치 또는 시약을 포함한다. 본 개시 내용의 특별한 실시형태에서, 예를 들어, 키트는 암을 위한 하나 이상의 부가적인 치료법, 예컨대 화학요법을 포함한다.

V. TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드

본 개시 내용은 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 TCR을 코딩하는 핵산 서열 및 핵산 서열을 보유하는 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 특별한 양상에서 핵산 분자는 재조합 핵산 분자이고, 합성될 수 있다. 그것은 DNA, RNA뿐만 아니라 PNA(펩타이드 핵산)를 포함할 수 있고, 그것은 그의 혼성체일 수 있다.

관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 하나 이상의 조절 서열이 본 개시 내용의 조성물에 포함된 핵산 분자에 추가될 수 있다는 것은 명백하다. 예를 들어, 본 개시 내용의 폴리뉴클레오타이드의 유도된 발현을 가능하게 하는 프로모터, 전사 인핸서 및/또는 서열이 사용될 수 있다. 적합한 유도성 시스템은 예를 들어 문헌[Gossen and Bujard(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992), 5547-5551)] 및 [Gossen et al. (Trends Biotech. 12(1994), 58-62)]에 기술된 바와 같은 예를 들어, 테트라사이클린-조절되는 유전자 발현 또는 예를 들어, 문헌[Crook(1989) EMBO J. 8, 513-519]에 기술된 바와 같은 덱사메타손-유도성 유전자 발현 시스템이다.

추가로, 추가 목적을 위해서 핵산 분자가 예를 들어, 티오에스터 결합 및/또는 뉴클레오타이드 유사체를 함유할 수 있다고 예상된다. 세포 중의 엔도뉴클리아제 및/또는 엑소뉴클리아제에 대한 핵산 분자의 안정화를 위해서 변형이 유용할 수 있다. 핵산 분자는 세포 중의 상기 핵산 분자의 전사를 가능하게 하는 키메릭 유전자를 포함하는 적절한 벡터에 의해서 전사될 수 있다. 이와 관련하여, 그러한 폴리뉴클레오타이드가 "유전자 표적화" 또는 "유전자 요법" 접근법을 위해서 사용될 수 있다고 또한 이해되어야 한다. 또 다른 실시형태에서, 핵산 분자는 표지될 수 있다. 핵산의 검출 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 서던 블로팅 및 노던 블로팅, PCR 또는 프라이머 연장이 있다. 이러한 실시형태는 유전자 요법 접근법 동안 상기에 기술된 핵산 분자의 성공적인 도입을 입증하기 위한 스크리닝 방법에 유용할 수 있다.

핵산 분자(들)는 상기에 언급된 핵산 분자 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합으로 포함하는 재조합으로 제조된 키메릭 핵산 분자일 수 있다. 구체적인 양상에서, 핵산 분자는 벡터의 일부이다.

따라서 본 개시 내용은 본 개시 내용에 기술된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

다수의 적합한 벡터가 분자 생물학 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 그것의 선택은 목적하는 기능에 좌우될 것이고, 그러한 백터는 유전자 조작에서 전통적으로 사용되는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리아파지 및 다른 벡터를 포함한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 다양한 플라스미드 및 벡터를 구축할 수 있다; 예를 들어, 문헌[Sambrook et al.(1989) and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.(1989),(1994)]에 기술된 기술을 참고하기 바란다. 대안적으로, 본 개시 내용의 폴리뉴클레오타이드 및 벡터는 표적 세포로의 전달을 위해서 리포좀 내에서 재구성될 수 있다. DNA의 개별 서열을 단리하기 위해서 클로닝 벡터가 사용될 수 있다. 특정 폴리펩타이드의 발현이 요구되는 발현 벡터로 관련 서열이 전달될 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 피블루스크립트(pBluescript) SK, pGEM, pUC9, pBR322 및 pGBT9를 포함한다. 전형적인 발현 벡터는 pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT를 포함한다.

구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 정의된 TCR 구축물을 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열인 핵산 서열을 포함하는 벡터가 존재한다. 그러한 조절 서열(제어 요소)은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 프로모터, 스플라이스(splice) 카세트, 번역 개시 코돈, 벡터에 삽입부를 도입하기 위한 번역 및 삽입 자리를 포함할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 핵산 분자는 진핵 세포 또는 원핵 세포에서의 발현을 가능하게 하는 상기 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된다.

벡터는 본 명세서에 정의된 TCR 구축물을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터라고 예상된다. 구체적인 양상에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터이다. 렌티바이러스 벡터는 예를 들어, 클론테크(Clontech)(미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재) 또는 젠코포에이아(GeneCopoeia)(미국 메릴랜드주 락빌 소재)를 비롯하여 공급원으로부터 구매 가능하다.

용어 "조절 서열"은 그것이 결찰된 코딩 서열의 발현을 달성하는 데 필요한 DNA 서열을 말한다. 그러한 제어 서열의 본성은 숙주 유기체에 따라서 상이하다. 원핵생물에서, 제어 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 자리 및 종결자를 포함한다. 진핵생물에서, 일반적으로 제어 서열은 프로모터, 종결자 및 일부 예에서 인핸서, 트랜스작용인자(transactivator) 또는 전사 인자를 포함한다. 용어 "제어 서열"은 발현을 위해서 존재하는 것이 필요한 최소한 모든 성분을 포함하고자 하고, 그것은 또한 부가적인 이로운 성분을 포함할 수 있다.

용어 "작동 가능하게 연결된"은 그렇게 기술된 성분이, 그것이 그의 의도되는 방식으로 기능하도록 하는 관계로 존재하는 병치를 말한다. 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 제어 서열은 제어 서열과 상용성인 조건 하에서 코딩 서열의 발현이 성취되도록 하는 그러한 방식으로 결찰된다. 제어 서열이 프로모터인 경우에, 이중-가닥 핵산이 바람직하게 사용된다는 것은 통상의 기술자에게 명백하다.

따라서, 특정 실시형태에서, 언급된 벡터는 발현 벡터이다. "발현 벡터"는 선택된 숙주를 변형시키는 데 사용될 수 있고, 선택된 숙주에서 코딩 서열의 발현을 제공하는 구축물이다. 발현 벡터는 예를 들어, 클로닝 벡터, 이원 벡터 또는 통합 벡터일 수 있다. 발현은 바람직하게는 번역 가능한 mRNA로의 핵산 분자의 전사를 포함한다. 원핵 세포 및/또는 진핵 세포에서의 발현을 보장하는 조절 요소가 또한 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 진핵 세포의 경우에, 그것은 일반적으로 전사의 개시를 보장하는 프로모터 및 임의로는 전사의 종결 및 전사물의 안정화를 보장하는 폴리-A 신호를 포함한다. 원핵 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절 요소는 예를 들어, 대장균 중의 PL, lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함하고, 진핵 숙주 세포에서의 발현을 가능하게 하는 조절 요소의 예는 효모 중의 AOX1 또는 GAL1 포로모터 또는 포유동물 및 다른 동물 세포 중의 CMV-, SV40-, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 글로빈 인트론이다.

전사의 개시의 책임이 있는 요소 이외에, 그러한 조절 요소는 또한 폴리뉴클레오타이드의 하류에서 전사 종결 신호, 예컨대 SV40-폴리-A 자리 또는 tk-폴리-A 자리를 포함할 수 있다. 추가로, 사용되는 발현계에 따라서 폴리펩타이드를 세포 구획으로 안내할 수 있거나 그것을 매질로 분비할 수 있는 리더 서열이 언급된 핵산 서열의 코딩 서열에 추가될 수 있고, 관련 기술 분야에서 널리 공지되어 있다. 번역, 개시 및 종결 서열을 갖는 리더 서열(들)은 적절한 상에서 조립되고, 리더 서열은 바람직하게는 번역된 단백질 또는 그의 일부가 주변세포질 공간 또는 세포외 매질로 분비되는 것을 안내할 수 있다. 임의로는, 이종 서열은 목적하는 특징, 예를 들어 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순화된 정제를 부여하는 N-말단 확인 펩타이드를 포함하는 퓨전 단백질을 코딩할 수 있고; 상기를 참고하기 바란다. 이와 관련하여, 적합한 발현 벡터는 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예컨대 오카야마-버그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(파마시아(Pharmacia)), pEF-네오(Neo), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(인비트로젠(Invitrogen)), pEF-DHFR 및 pEF-ADA(Raum et al. Cancer Immunol Immunother(2001) 50(3), 141-150) 또는 pSPORT1(기브코 비알엘(GIBCO BRL))이다.

일부 실시형태에서, 발현 제어 서열은 감염 진핵 숙주 세포를 변형시킬 수 있는 벡터 중의 진핵 프로모터 시스템이지만, 원핵 숙주를 위한 제어 서열이 또한 사용될 수 있다. 벡터가 적절한 숙주로 도입되자마자, 숙주는 뉴클레오타이드 서열의 높은 수준의 발현에 적합한 조건 하에서 유지되고, 필요에 따라서, 본 개시 내용의 폴리펩타이드의 수집 및 정제가 이어질 수 있다.

부가적인 조절 요소는 전사 인핸서뿐만 아니라 번역 인핸서를 포함할 수 있다. 이롭게는, 상기에 기술된 본 개시 내용의 벡터는 선택성 및/또는 스코어성(scorable) 마커를 포함한다. 변형된 세포의 선택에 유용한 선택성 마커 유전자는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Reiss, Plant Physiol.(Life-Sci. Adv.) 13(1994), 143-149); 아미노글라이코시드 네오마이신, 카나마이신 및 파로마이신에 대한 내성을 부여하는 npt(Herrera-Estrella, EMBO J. 2(1983), 987-995) 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로(hygro)(Marsh, Gene 32(1984), 481-485)에 대한 선택을 기초로 할 때 항대사물질 내성을 포함한다. 부가적인 선택 가능한 유전자, 즉 세포가 트립토판 대신에 인돌을 사용하는 것을 가능하게 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신에 히스틴올을 사용하는 것을 가능하게 하는 hisD(Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988), 8047); 세포가 만노스를 사용하는 것을 가능하게 하는 만노스-6-포스페이트 아이소머라제(WO 94/20627) 및 오르니틴 디카복실라제 저해제에 대한 내성을 부여하는 ODC(오르니틴 디카복실라제), 2-(다이플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO(McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) 또는 블라스티시딘 S에 대한 내성을 부여하는 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 디아미나제(Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59(1995), 2336-2338)가 기술되어 있다.

유용한 스코어성 마커는 또한 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 구매 가능하다. 이롭게는, 상기 마커는 루시퍼라제를 코딩하는 유전자(Giacomin, Pl. Sci. 116(1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178(1996), 121), 녹색 형광 단백질을 코딩하는 유전자(Gerdes, FEBS Lett. 389(1996), 44-47) 또는 베타-글루쿠로니다제를 코딩하는 유전자(Jefferson, EMBO J. 6(1987), 3901-3907)이다. 이러한 실시형태는 언급된 벡터를 함유하는 세포, 조직 및 유기체의 단순하고 신속한 스크리닝에 특히 유용하다.

상기에 기술된 바와 같이, 언급된 핵산 분자는 세포에서 코딩된 폴리펩타이드를 발현하기 위해서 세포에서 단독으로 또는 벡터의 일부로서 사용될 수 있다. TCR 구축물 중 임의의 하나를 코딩하는 DNA 서열(들)을 함유하는 핵산 분자 또는 벡터가 세포에 도입되고, 그 다음에 관심 폴리펩타이드를 생성한다. 언급된 핵산 분자 및 벡터는 세포로 직접 도입하기 위해서 또는 리포좀, 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스)를 통해서 세포로 도입하기 위해서 설계될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포는 예를 들어, T-세포, TCR T-세포, NK 세포, NKT-세포, MSC, 뉴런 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 세포이다.

상기 내용에 따라서, 본 개시 내용은 본 명세서에 정의된 TCR의 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 조작에서 전통적으로 사용되는 벡터, 특히 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리아파지를 유도하는 방법에 관한 것이다. 특정 경우에, 상기 벡터는 발현 벡터 및/또는 유전자 전달 또는 표적화 벡터이다. 바이러스, 예컨대 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 허피스 바이러스, 또는 소 유두종 바이러스로부터 유도된 발현 벡터가 언급된 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 표적화된 세포 집단에 전달하는 데 사용될 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 재조합 벡터를 구축할 수 있고; 예를 들어, 문헌[Sambrook et al.(상기 참조), Ausubel(1989, 상기 참조)] 또는 다른 교재에 기술된 기술을 참고하기 바란다. 대안적으로, 언급된 핵산 분자 및 벡터는 표적 세포로의 전달을 위해서 리포좀 중에서 재구성될 수 있다. 본 개시 내용의 핵산 분자를 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라서 달라지는 널리 공지된 방법에 의해서 숙주 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, 원핵 세포의 경우 염화칼슘 감염이 일반적으로 사용되는 반면 다른 세포 숙주의 경우 인산칼슘 처리 또는 전기천공법이 사용될 수 있고; 상기 삼브루크(Sambrook) 문헌을 참고하기 바란다.

VI. 조합 요법

본 발명의 특정 실시형태에서, 임상 측면을 위한 본 발명의 방법은 과증식성 질환의 치료에 효과적인 다른 작용제, 예컨대 항암제와 조합된다. "항암"제는 예를 들어, 암 세포를 사멸시키거나, 암 세포에서 세포자멸(apoptosis)을 유도하거나, 암 세포의 성장 속도를 감소시키거나, 전이의 발생 또는 수를 감소시키거나, 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 억제하거나, 종양 또는 암 세포에 혈액 공급을 감소시키거나, 암 세포 또한 종양에 대한 면역 반응을 촉진시키거나, 암의 진척을 방해 또는 억제하거나, 암을 갖는 대상체의 수명을 늘림으로써, 대상체의 암에 악영향을 줄 수 있다. 보다 일반적으로, 이러한 다른 조성물은 세포의 증식을 없애거나 억제하는 데 유효한 조합된 양으로 제공될 것이다. 이러한 방법은 암 세포를 발현 구축물 및 작용제(들) 또는 다중 인자(들)와 동시에 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이것은 세포를 작용제 둘 다를 포함하는 단일 조성물 또는 약리학상 제제와 접촉시킴으로써, 또는 세포를 2종의 별개의 조성물 또는 제제와 동시에 접촉시킴으로써 성취될 수 있는데, 여기서 하나의 조성물은 발현 구축물을 포함하고, 나머지 것은 제2 작용제(들)를 포함한다.

화학요법 및 방사선요법 작용제에 대해서 내성인 종양 세포가 임상 종양학에서 주요 문제점을 나타낸다. 현재 암 연구의 한 목적은 화학요법 및 방사선요법을 유전자 요법과 조합함으로써 그것의 효능을 개선시키는 방식을 찾는 것이다. 본 발명의 내용에서, 세포 요법이 다른 프로-세포자멸제(pro-apoptotic agent) 또는 세포 순환 조절제에 더하여, 화학요법, 방사선요법 또는 면역요법 중재와 함께 유사하게 사용될 수 있다고 고려된다.

대안적으로, 본 발명의 요법은 수분 내지 수주 범위의 간격으로 다른 작용제 치료에 앞서서 진행되거나 그러한 치료 이후에 진행될 수 있다. 다른 작용제 및 본 발명이 개체에게 별개로 적용되는 실시형태에서, 작용제 및 본 발명의 요법이 세포에 이로운 조합된 효과를 여전히 발휘할 수 있도록, 각각의 전달 시간 사이에서 유의한 시간 간격이 만료되지 않는 것을 일반적으로 보장할 것이다. 그러한 예에서, 세포를 두 기법 모두와 서로 약 12 내지 24시간 내에, 보다 바람직하게는 서로 약 6 내지 12시간 내에 접촉시킬 수 있다고 고려된다. 일부 상황에서, 치료를 위한 시간 간격을 유의하게 연장하는 것이 바람직할 수 있지만, 각각의 투여 사이에 수일(2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일) 내지 수주(1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주 또는 8주)의 시간 차이가 있다.

다양한 조합이 사용될 수 있고, 본 개시 내용은 "A"이고, 2차 작용제, 예컨대 방사선요법 또는 화학요법은 "B"이다:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

치료 사이클은 필요에 따라서 반복될 것이라고 예상된다. 또한, 다양한 표준 요법, 뿐만 아니라 수술 중재가 본 발명의 세포 요법과 조합되어 적용될 수 있다고 고려된다.

A. 화학요법

암 요법은 또한 화학 기반 치료 및 방사선 기반 치료 둘 다와 함께 다양한 조합 요법을 포함한다. 조합 항암제는 예를 들어, 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸 하이드로클로라이드; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스루킨; 알트레트아민; 암보마이신; 아메탄트론 아세테이트; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나제; 아스페린; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 벤조데파; 비칼루트아미드; 비산트렌 하이드로클로라이드; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신 설페이트; 브레퀴나 소듐; 브로피리민; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카라세마이드; 카베티머; 카보플라틴; 카무스틴; 카루비신 하이드로클로라이드; 카젤레신; 세데핀골; 셀레콕시브(COX-2 저해제); 클로암부실; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 크리스나톨 메실레이트; 시클로포스파미드; 시타라빈; 다카바진; 닥티노마이신; 다우노루비신 하이드로클로라이드; 데시타빈; 덱소 마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 디아지쿠온; 도세탁셀; 독소루비신; 독소루비신 하이드로클로라이드; 드롤록시펜; 드롤록시펜 시트레이트; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에다트렉세이트; 에플로미틴 하이드로클로라이드; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로피딘; 에피루비신 하이드로클로라이드; 에르불로졸; 에소루비신 하이드로클로라이드; 에스트라르누스틴; 에스트라무스틴 포스페이트 소듐; 에타니다졸; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; 에토프린; 파드로졸 하이드로클로라이드; 파자라빈; 펜레티니드; 플록수리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플로오로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 소듐; 젬시타빈; 젬시타빈 하이드로클로라이드; 히드록시우레아; 이다루비신 하이드로클로라이드; 이포스파미드; 일모포신; 이프로플라틴; 이리노테칸; 이리노테칸 하이드로클로라이드; 란레오티드 아세테이트; 레트로졸; 류프롤리드 아세테이트; 리아로졸 하이드로클로라이드; 로메트렉솔 소듐; 로무스틴; 로속산트론 하이드로클로라이드; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민 하이드로클로라이드; 메게스트롤 아세테이트; 멜렌게스트롤 아세테이트; 멜파란; 메노가릴; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 소듐; 메토프린; 메투레데파; 미틴도미드; 미토카신; 미토크로민; 미토길린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토테인; 미토잔트론 하이드로클로라이드; 마이코페놀산; 노코다졸; 노갈라마이신; 오마플라틴; 옥시수란; 파클리탁셀; 페가스파가제; 펠리오마이신; 펜타무스틴; 페플로마이신 설페이트, 퍼포스파미드; 피포브로만; 피포술판; 피로잔트론 하이드로클로라이드; 플리카마이신; 플로메스탄; 포피머 소듐; 포피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카바진 하이드로클로라이드; 푸로마이신; 푸로마이신 하이드로클로라이드; 피라조푸린; 리보프린; 사핀골; 사핀골 하이드로클로라이드; 세무스틴; 심트라젠; 스파포세이트 소듐; 스파소마이신; 스피로게르마늄 하이드로클로라이드; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 술로페너; 탈리소마이신; 테코갈란 소듐; 탁소테레; 테가퍼; 텔로잔트론 하이드로클로라이드; 테모포르핀; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조푸린; 티라파자민; 토레미펜 시트레이트; 트레스톨론 아세테이트; 트리시리빈 포스페이트; 트리메트렉세이트; 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트립토렐린; 투불로졸 하이드로클로라이드; 우라실 머스타드; 우레데파; 바프레오타이드; 베르테포르핀; 빈블라스틴 설페이트; 빈크리스틴 설페이트; 빈데신; 빈데신 설페이트; 빈에피딘 설페이트; 빈글리시네이트 설페이트; 빈루로신 설페이트; 비노렐빈 타트레이트; 빈로시딘 설페이트; 진졸리딘 설페이트; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 및 조루비신 하이드로클로라이드, 20-에피-1,25 다이히드록시비타민 D3; 5-에티닐우라실; 아비라테론; 아클라루비신; 아실풀벤; 아데시페놀; 아도젤레신; 알데스루킨; ALL-TK 길항제; 알트레타민; 암바무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미노레불린산; 암루비신; 암사크린; 아나그렐리드; 아나스트로졸; 안드로그라폴리드; 혈관신생 저해제; 길항제 D; 길항제 G; 안타렐릭스; 안티-도살라이징 형태발생 단백질-1(anti-dorsalizing morphogenetic protein-1); 안티안드로겐, 전립선 암종; 안티에스트로겐; 안티네오플라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 아피디콜린 글라이시네이트; 아폽토시스 유전자 조정자(apoptosis gene modulator); 아폽토시스 조절자(apoptosis regulator); 아푸린산; 아라-CDP-DL-PTBA; 알기닌 디아미나제; 아술아크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 악시나스타틴 1; 악시나스타틴 2; 악시나스타틴 3; 아자세트론; 아자톡신; 아자티로신; 박카틴 III 유도체; 발라놀; 바티마스타트; BCR/ABL 길항제; 벤조클로린; 벤조일스타우로스포린; 베타락탐 유도체; 베타-알레틴; 베타클라마이신 B; 베툴린산; bFGF 저해제; 비칼루타미드; 비스안트렌; 비스아지리디닐스퍼민; 비스나피드; 비스트라텐 A; 비젤레신; 브레플레이트; 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 설폭시민; 칼시포트리올; 칼포스틴 C; 캄프토테신 유도체; 카페시타빈; 카복스아미드-아미노-트라이아졸; 카복시아미도트라이아졸; CaRest M3; CARN 700; 연골 유래 저해제(cartilage derived inhibitor); 카젤레신; 카제인 키나제 저해제(ICOS); 카스타노스퍼민; 세크로핀 B; 세트로렐릭스; 클로른즈; 클로로퀴녹살린 설폰아마이드; 시카프로스트; 시스-포피린; 클라드리빈; 클로미펜 유사체; 클로트라이마졸; 콜리스마이신 A; 콜리스마이신 B; 콤브레타스타틴 A4; 콤브레타스타틴 유사체; 코나게닌; 크람베시딘 816; 크리스나톨; 크립토파이신 8; 크립토파이신 A 유도체; 쿠라신 A; 시클로펜트안트라퀴논; 사이클로플라탐; 파이페마이신; 사이타라빈 옥포스페이트; 사이톨리틱 인자; 사이토스타틴; 다클릭시맙; 데시타빈; 디하이드로다이데민 B; 데슬로렐린; 덱사메타손; 덱시포스파미드; 덱스라족산; 덱스베라파밀; 디아지쿠온; 다이뎀닌 B; 다이독스; 다이에틸노르스퍼민; 다이하이드로-5-아자사이티딘; 다이하이드로탁솔, 9-; 다이옥사마이신; 다이페닐 스피로무스틴; 도세탁셀; 도코사놀; 도라세트론; 독시플루리딘; 독소루비신; 드롤록시펜; 드로나비놀; 두오카마이신 SA; 에브셀렌; 에코무스틴; 에델포신; 에드로콜로맙; 에플로니틴; 엘레멘; 에미테퍼; 에피루비신; 에피리스터라이드; 에스트라무스틴 유사체; 에스트로겐 작용제; 에스트로겐 길항제; 에타니다졸; 에토포사이드 포스페이트; 엑서메스탄; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티나이드; 필그라스팀; 피나스테라이드; 플라보피리돌; 플레젤라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루니신 하이드로클로라이드; 포페니멕스; 포메스탄; 포스트리에신; 가돌리늄 텍사파이린; 갈륨 나이트레이트; 갈로시타빈; 가니렐릭스; 젤라티나제 저해제; 젬시타빈; 글루타티온 저해제; 헤프설팜; 헤레굴린; 헥사메틸렌 비스아세트아마이드; 하이페리신; 이반드론산; 이다루비신; 이독시펜; 이드라만톤; 일모포신; 일로마스타트; 이마티닙(예를 들어, 글리벡(GLEEVEC)(등록상표)), 이미퀴모드; 면역자극 펩타이드; 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 저해제; 인터페론 길항제; 인터페론; 인터류킨; 아이오벤구안; 아이오도독소루비신; 아이포미아놀, 4-; 이로플락트; 이르소글라딘; 이소벤가졸; 아이소호모할리콘드린 B; 이타세트론; 자스플라카이놀라이드; 카할랄라이드 F; 라멜라린-N 트라이아세테이트; 란레오타이드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 렌티난 설페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸; 루케미아 저해 인자; 루코사이트 알파 인터페론; 루프롤라이드+에스트로겐+프로게스테론; 루프로렐린; 레바미솔; 리아로졸; 선형 폴리아민 유사체; 친유성 다이사카라이드 펩타이드; 친유성 백금 화합물; 라이소클린아마이드 7; 로바플라틴; 롬브라이신; 로메트렉솔; 로니다민; 로속잔트론; 록소리빈; 루토테칸; 루테티엄 텍사파이린; 라이소파일린; 라이틱 펩타이드; 마이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 마트라이라이신 저해제; 매트릭스 메탈로프로테이나제 저해제; 메노가릴; 머바론; 메테렐린; 메티오니나제; 메토클로프라마이드; MIF 저해제; 미페프리스톤; 밀테포신; 미리모스팀; 미토구아존; 미토락톨; 미토마이신 유사체; 미토나피드; 미토톡신 피브로블라스트 성장 인자-사포린; 미토잔트론; 모파로텐; 몰그라모스팀; 에르비턱스, 인간 융모막 고나도트로핀; 모노포스포릴 리피드 A+미오박테리럼 세포벽 sk; 모피다몰; 머스타드 항암제; 마이카페록사이드 B; 마이코박테이라 세포벽 추출물; 마이리아포론; N-아세틸다이날린; N-치환 벤즈아미드; 나파렐린; 나그레스팁; 날록손+펜타조신; 나파빈; 나프터핀; 나토그라스팀; 네다플라틴; 네모루비신; 네리드론산; 닐루트아마이드(nilutamide); 니사마이신; 산화질소 조정자; 나이트록사이드 항산화제; 나이트룰라인; 오블리머센(제나센스(GENASENSE(등록상표)); O6-벤질구아닌; 옥트레오타이드; 오키세논; 올리고뉴클레오타이드; 오나프리스톤; 온단세트론; 온단세트론; 오라신; 경구 사이토카인 유도제; 오마플라틴; 오사테론; 옥살리플라틴; 옥사우노마이신; 파클리탁셀; 파클리탁셀 유사체; 파클리탁셀 유도체; 팔라우아민; 팔미토일리족신; 파미드론산; 파낙시트라이올; 파노미펜; 파라박틴; 파젤립틴; 페가파가제; 펠데신; 펜토산 폴리설페이트 소듐; 펜토스타틴; 펜트로졸; 퍼플루브론; 퍼포스파마이드; 페릴릴 알코올; 페나지노마이신; 페닐아세테이트; 포스파타제 저해제; 피시바닐; 필로카핀 하이드로클로라이드; 피라루비신; 피리트렉심; 플라세틴 A; 플라세틴 B; 플라스미노겐 활성자 저해제; 백금 복합체; 백금 화합물; 백금-트라이아민 복합체; 포르피머 소듐; 포르피로마이신; 프레드니손; 프로필 비스-아크리돈; 프로스탄글란딘 J2; 프로테아좀 저해제; 단백질 A-기재 면역 조절자; 단백질 키나제 C 저해제; 단백질 키나제 C 저해제, 마이크로알갈; 단백질 티로신 포스파타제 저해제; 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 저해제; 푸푸린; 파이라졸로아크리딘; 파이리독실레이티드 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 컨쥬게이트; 라프(raf) 길항제; 랄티트렉세드; 라모세트론; 라스 파네실 단백질 트랜스퍼라제 저해제; 라스 저해제; 라스-GAP 저해제; 레텔리프틴 디메틸레이티드; 레늄 Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레티나마이드; 로히투킨; 로머타이드; 로퀴니멕스; 루비기논 B1; 루복실; 사핀골; 사인토핀; SarCNU; 사르코파이톨 A; 사르그라모스팀; Sdi 1 유사체; 세무스틴; 노화 유래 저해제 1; 감각 올리고뉴클리오타이드; 신호 전달 저해제; 시조푸란; 소부족산; 소듐 보로캅테이트; 소듐 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소네르민; 스파르포스산; 스피카마이신 D; 스피로무스틴; 스플레노펜틴; 스폰지스타틴 1; 스쿠알라민; 스티피아마이드; 스트로멜라이신 저해제; 설피노신; 슈퍼액티브 바소액티브 인테스티날 펩타이드 길항제; 수라디스타; 수라민; 스웨인소닌; 탈리무스틴; 타목시펜 메티오다이드; 타우로무스틴; 타자로텐; 테코갈란 소듐; 테카퍼; 텔루라파이릴륨; 텔로머라제 저해제; 테모포핀; 테니포시드; 테트라클로로데카옥사이드; 테트라조민; 탈리블라스틴; 티오코랄린; 트롬보포이에틴; 트롬보포이에틴 유사체; 타이말파신; 타이모포이에틴 수용체 작용제; 타이모트리난; 티로이드 자극 호르몬; 틴 에틸 에티오푸푸린; 티라파자민; 티타노센 바이클로라이드; 토프센틴; 토레미펜; 번역 저해제; 트레티노인; 트라이아세틸우리딘; 트라이시리빈; 트라이메트렉세이트; 트라이프토렐린; 트로피세트론; 투로스테라이드; 티로신 키나제 저해제; 타이르포스틴; UBC 저해제; 유베니멕스; 비뇨생식굴-유래 성장 저해 인자; 유로키나제 수용체 길항제; 바프레오타이드; 바리올린 B; 베라레솔; 베라민; 베르딘스; 베르테포핀; 비노렐빈; 빈잘틴; 비탁신; 보로졸; 자노테론; 제니플라틴; 질라스코릅; 및 지노스타틴 스티말라머를 포함하지만, 그에 제한되는 것은 아니다.

구체적인 실시형태에서, 예를 들어, 본 발명의 투여 전에 그리고/또는 투여 동안 그리고/또는 투여 후에 개체를 위한 화학요법이 본 발명과 함께 사용된다.

B. 방사선요법

DNA 손상을 유발하고, 광범위하게 사용되어온 다른 인자는 일반적으로 감마-선, X-선 및/또는 종양 세포로의 방사성 동위원소의 직접 전달로서 일반적으로 공지된 것을 포함한다. 다른 형태의 DNA 손상 인자, 예컨대 마이크로파 및 UV-조사가 또한 고려된다. 이러한 인자 전부는 DNA, DNA의 전구체, DNA의 복제 및 수리, 및 염색체의 조립 및 유지에 다양한 손상을 유발하는 것으로 보인다. X-선의 투여량 범위는 장기간(3 내지 4주)의 경우 50 내지 200 뢴트겐의 1일 투여량에서, 2000 내지 6000 뢴트겐의 단회 투여까지의 범위이다. 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 따라서 방사성 동위원소의 투여 범위는 다양하게 달라진다

세포에 적용되는 경우, 용어 "접촉된" 및 "노출된"은 본 명세서에서 치료 구축물 및 화학치료제 또는 방사선치료제가 표적 세포에 전달되거나 표적 세포와 직접 병치되게 놓이는 방법을 기술하는 데 사용된다. 세포 사멸 또는 정체를 성취하기 위해서, 두 작용제 모두는 세포를 사멸시키거나 그것이 분화하는 것을 방지하는 데 유효한 조합된 양으로 세포에 전달된다.

C. 면역요법

면역요법은 일반적으로 암 세포를 표적으로 하여 그것을 파괴하기 위해서 면역 이펙터 세포 및 분자를 사용하는 것을 필요로 한다. 면역 이펙터는 예를 들어, 종양 세포의 표면 상의 일부 마커에 대해서 특이적인 항체일 수 있다. 항체 단독은 요법의 이펙터로서 기능할 수 있거나 그것은 세포 사멸에 실제로 영향을 주기 위해서 다른 세포를 리쿠르팅(recruiting)할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 톡신(화학요법, 방사선핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 톡신, 백일해 톡신 등)에 접합되어, 표적화제로서만 기능할 수 있다. 대안적으로, 이펙터는 종양 세포 표적과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 보유하는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.

따라서 본 명세서에 기술된 본 발명의 요법이 아닌 면역요법이 본 발명의 세포 요법과 함께, 조합 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 조합 요법에 대한 일반적인 접근법이 하기에 논의되어 있다. 일반적으로, 종양 세포는 표적화를 받아들일 수 있는, 즉 대부분의 다른 세포 상에 존재하지 않는 일부 마커를 보유해야 한다. 많은 종양 마커가 존재하고, 이들 중 임의의 것이 본 발명과 관련하여 표적화에 적합할 수 있다. 일반적인 종양 마커는 암배아 항원, 전립선 특이적인 항원, 비뇨기 종양 관련 항원, 태아 항원, 티로시나제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스(Sialyl Lewis) 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erb B 및 p155를 포함한다.

특정 실시형태에서, 면역요법은 노치(Notch) 경로 리간드 또는 수용체에 대한 항체, 예를 들어 DLL4, 노치1, 노치2/3, Fzd7, 또는 Wnt에 대한 항체이다. 특정 다른 실시형태에서, 면역요법은 r-스폰딘(spondin)(RSPO) 1, RSPO2, RSPO3 또는 RSPO4에 대한 항체이다.

D. 유전자

추가의 또 다른 실시형태에서, 2차 치료는, 치료적 폴리뉴클레오타이드가 본 발명의 임상 실시형태 이전에 또는 이후에 또는 그것과 동시에 투여되는 유전자 요법이다. 세포 증식 유도제, 세포 증식 저해제 또는 프로그래밍된 세포 죽음의 조절제를 비롯한, 다양한 발현 생성물이 본 발명에 포함된다.

E. 수술

암이 있는 인간의 대략 60％가 예방, 진단 또는 병기 설정, 치료 및 완화 수술을 포함하는 일부 유형의 수술을 경험할 것이다. 치료적 수술은 다른 요법, 예컨대 본 발명의 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대안적인 요법과 함께 사용될 수 있는 암 치료법이다.

치료적 수술은 암 조직의 전부 또는 일부를 물리적으로 제거하고/제거하거나, 잘라내고/잘라내거나, 파괴하는 절제를 포함한다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부의 물리적인 제거를 말한다. 종양 절제 외에, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 냉동외과수술, 전기외과수술, 및 미스코피컬(miscopically) 조절된 수술(모즈 수술)을 포함한다. 본 발명은 정상 조직의 피상적인 암, 전암, 또는 부수적인 양의 제거와 함께 사용될 수 있다는 것이 추가로 고려된다.

모든 암 세포, 조직, 또는 종양의 일부의 적출 시, 구멍이 신체에 형성될 수 있다. 치료는 부가적인 항암 요법과 함께 그 면의 관류, 직접 주사 또는 국소 적용에 의해서 성취될 수 있다. 그러한 치료는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 및 5주 마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 마다 반복될 수 있다. 이들 치료는 마찬가지로 가변 투여량일 수 있다.

F. 다른 작용제

치료의 치료 효능을 개선시키기 위해서 다른 작용제가 본 발명과 조합되어 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 이러한 부가적인 작용제는 면역조절제, 즉 세포 표면 수용체 및 GAP 정션의 상향조절에 영향을 미치는 작용제, 세포성장저해제 및 분화제, 세포 접착 저해제, 또는 세포자멸 유도자에 대한 과증식성 세포의 감도를 증가시키는 작용제를 포함한다. 면역조절제는 종양 괴사 인자; 인터페론 알파, 베타, 및 감마; IL-2 및 다른 사이토카인; F42K 및 다른 사이토카인 유사체; 또는 MIP-1, MIP-1베타, MCP-1, RANTES, 및 다른 사이토카인을 포함한다. 세포 표면 수용체 또는 이들의 리간드, 예컨대 Fas / Fas 리간드, DR4 또는 DR5 / TRAIL의 상향 조절이 과증식성 세포에 대한 자가분비 또는 주변분비의 설정에 의한 본 발명의 세포자멸 유도 능력을 가능하게 할 것이라고 추가로 고려된다. GAP 정션의 수를 상승시킴으로써 세포간 신호전달을 증가시키는 것은 이웃하는 과증식성 세포 집단에 대한 항-과증식성 효과를 증가시킬 것이다. 다른 실시형태에서, 세포성장저해제 또는 분화제는 치료의 항-과증식성 효능을 개선시키기 위해서 본 발명과 조합되어 사용될 수 있다. 세포 접착 저해제가 본 발명의 효능을 개선시킨다고 고려된다. 세포 접착 저해제의 예는 초점 접착 키나제(focal adhesion kinase: FAK) 저해제 및 로바스타틴이다. 세포자멸에 대한 과증식성 세포의 감도를 증가시키는 다른 작용제, 예컨대 항체 c225가 치료 효능을 개선시키기 위해서 본 발명과 조합되어 사용될 수 있다고 추가로 고려된다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 입증하기 위해서 포함된다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 하기 실시예에 개시된 기술이 본 발명자에 의해서 발견된 본 발명의 실행시 잘 기능하는 기술을 대표하는 것임을 인식해야 하고, 따라서 그의 실행을 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다. 그러나, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 개시 내용에 비추어, 개시된 구체적인 실시형태에서 많은 변화가 행해질 수 있고, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 유사하거나 비슷한 결과를 여전히 얻을 수 있음을 인식해야 한다.

실시예 1

선택적인 항종양 효과를 갖는 자가형 서바이빈 -특이적인 T-세포 클론의 생성

헤테로클리틱 변이체(heteroclitic variant) 서바이빈_{96 -104}97M(LML이라 칭함; LMLGEFLKL; 서열번호 16)을 사용하여, HLA-A^*0201-제한형 서바이빈_{95 -104}(ELT라 칭함; ELTLGEFLKL; 서열번호 15) 에피토프에 대해서 특이적인 CD8⁺ 세포독성 T 세포(CTL)를 생성하기 위해서 HLA-A^*02⁺ 건강한 공여자로부터 수집된 말초 혈액 샘플을 사용하였다(Andersen, et al., 2001).

IFN-γ 엘리스팟에 의해서 평가되는 바와 같이, 5개의 CTL주 중 3개(공여자(#2, 4 및 5)가 3회의 항원-특이적인 자극 이후에 LML 펩타이드(643 ± 5, 49 ± 1 및 96 ± 7 SFC/10⁵ T 세포) 및 ELT 펩타이드(662 ± 65, 45 ± 6 및 86 ± 9 SFC/10⁵ T 세포) 둘 다에 대해서 특이적으로 반응성이었다. 가장 반응성인 공여자(#2)로부터의 희석을 제한함으로써 단일 T-세포 클론을 생성하였고, 서바이빈-특이적인 클론 및 비-특이적인(특이적이지 않은) 클론을 비교하는 다중 검정법을 사용하여, 최적의 작용성 결합능을 갖는 것으로 확인되는 것이 존재하였다. 구체적으로, 클론 #24는 LML-테트라머에 대해서 최고 특이성을 나타내었고(>99％)(도 1A), LML 펩타이드 및 ELT 펩타이드 둘 다에 대해서 최고 TCR 결합능을 나타내었고(IFN-γ 엘리스팟 검정법에 의해서 평가할 때 10^-7M)(도 1B), 표준 ⁵¹Cr-방출에 의해서 평가할 때 LML의 경우 5x10^-8M이었고, ELT의 경우 10^-6M이었다(도 1C). 클론 #24의 작용성 결합능은 "프래트리사이드" TCR에 대해서 이미 기술된 넓은 범위의 결합능과 중복되었다(표 1). 중요하게는, 클론 #24는 HLA-A^*02⁺서바이빈⁺ 종양 세포주인 BV173(백혈병) 및 U266(골수종)에 대해서 세포독성 활성을 나타내었고(도 1D), HLA-A^*02⁺서바이빈⁺ 백혈병 프로지니터의 집락 형성 단위(colony forming unit: CFU)의 억제를 나타내었다(도 1E). 이에 반해서, 동일한 클론은 HLA-A^*02^-서바이빈⁺ 세포주 HL-60 또는 HLA-A^*02⁺ 정상 조혈 프로지니터 세포에 대해서 세포독성이 아니었다(도 1D, 도 1E). 이러한 클론은 시험관내에서 효과적으로 확장되었고(3주 후 63배 초과의 확장)(도 1F), 이는 검출가능한 T-세포 프래트리사이드 효과가 없음을 나타낸다.

TCR A66, A71 및 A72은 공개된 알로-제한형 서바이빈-특이적인 TCR이다(Leisegang, et al, 2010).

실시예 2

서바이빈 -특이적인 TCR을 발현하도록 조작된 다클론성 T 세포는 프래트리사이드성이 아니다.

불변 영역을 해당 뮤린 영역으로 대체한 후에 클론 #24의 TCR α-쇄 및 β-쇄(이하 s24-TCR이라 함)를 클로닝하고, 코돈-최적화하고, 레트로바이러스 벡터 내로 코딩하였다(도 2A). TCR 쇄 사용 및 상보성 결정 영역은 이미 공개된 프래트리사이드 TCR과 완전히 상이하였다(표 2 및 표 3).

국제 면역유전학 정보 시스템(international Immunogenetics information system) 웹사이트 www.imgt.org에 따른 명명법. TCR A66, A71 및 A72의 서열은 프래트리사이드를 갖는 공개된 알로-제한형 서바이빈-특이적인 TCR이다(Leisegang, et al., 2010).

국제 면역유전학 정보 시스템 웹사이트 www.imgt.org에 따른 명명법. TCR A66, A71 및 A72의 서열은 프래트리사이드를 갖는 공개된 알로-제한형 서바이빈-특이적인 TCR이다(Leisegang, et al., 2010).

CD8+ T 세포를 LML-펩타이드 펄싱된 인공 APC(aAPC) 및 IL-2의 존재 하에서 형질도입하고, 확장시켰다. 형질도입 직후에, T 세포의 89％ ± 4％가 뮤린 불변 β-쇄(mCβ+)에 대해서 염색되었고, LML-테트라머로 47％ ± 32％염색되었다(도 2B). LML-테트라머에 대한 양성은 보통이었고, 평균 형광 강도(MFI)는 26 ± 12였지만, LML-펄싱된 aAPC의 존재 하에서의 확장 후에, LML-테트라머⁺ 세포가 상당히 풍부해졌다(97％ ± 1％)(도 2B, 도 2C). 이소적으로 발현된 s24-TCR은 LML 펩타이드(725 ± 274 SFC/10⁵ T 세포) 및 ELT(978 ± 341 SFC/10⁵ T 세포) 펩타이드 둘 다에 반응하여 IFN-γ를 생성하는 s24-TCR⁺ T 세포와 작용성이었다(도 3A). s24-TCR⁺ T 세포는 또한 HLA-제한형 방식으로 LML-펩타이드 펄싱된 T2 세포를 용해하였는데(77％ ± 8％ 특이적인 용해, E:T 20:1)(도 3B), 이는 MHC 클래스-I 차단 항체와 미리-인큐베이션시킴으로써 세포독성 활성이 상당히 감소되었기 때문이다(도 3C)(53％ ± 10％ 특이적인 용해, E:T 20:1; p=0.03). s24-TCR⁺ T 세포가 프래트리사이드 표현형을 생성하지 않았음을 확인하기 위해서, 확장 및 세포독성 활성을 HLA-A^*02⁺ 공여자 및 HLA-A^*02^- 공여자 둘 다로부터 생성된 s24-TCR⁺ 세포와 비교하였다. TCR은 둘 다에서 효율적으로 발현되었고(도 9), s24-TCR⁺ T 세포는 LML-펄싱된 aAPC 및 IL-2에 반응하여 동일하게 확장되었다(각각 HLA-A^*02⁺ 공여자 및 HLA-A^*02^- 공여자에 대해서 3회 자극 후에 66 ± 38배 확장 대 76 ± 38배 확장)(도 3D). 추가로, HLA-A^*0201⁺ T 세포에 대한 s24-TCR⁺ T 세포의 세포독성 활성은 검출가능하지 않았다. 도 3E 및 도 3F에 나타내어진 바와 같이, 활성화된 T 세포의 용해는 무시해도 될 정도이고(2％ ± 4％ 대 6％ ± 3％ 특이적인 용해, E:T 20:1, HLA-A^*02⁺ 공여자 대 HLA-A^*02^- 공여자), 이들 세포는 LML 펩타이드 또는 ELT 펩타이드가 적재된 후에만 s24-TCR⁺ T 세포에 의해서 표적화될 수 있다(LML-적재된 T 세포의 경우 46％ ± 12％ 대 55％ ± 7％ 특이적인 용해; ELT-적재된 T 세포의 경우 68％ ± 14％ 대 62％ ± 16％, E:T 20:1, HLA-A^*02⁺ 대 HLA-A^*02^- 공여자). 예상된 바와 같이, 대조군 T 세포는 활성화된 T 세포에 대한 세포독성 활성을 갖지 않았다(도 3E, 도 3F).

실시예 3

서바이빈 - TCR 재안내된 T 세포는 독성없이 정상 조혈 프로지니터 세포에 항암 활성을 부여한다.

감소된 항암 활성의 대가로 프래트리사이드의 결핍이 일어나지 않는 것을 보장하기 위해서, 서바이빈⁺ 혈액 악성종양에 대한 s24-TCR⁺ T 세포의 세포독성 활성을 평가하였다. s24-TCR⁺ T 세포는 대조군 T 세포와 비교할 때 HLA-A^*02⁺서바이빈⁺ 백혈병 세포주 BV173(20:1 E:T 비율에서 46％ ± 14％ 특이적인 용해) 및 HLA-A^*02⁺서바이빈⁺ 다발성 골수종-유도된 세포주 U266(27％ ± 12％)의 상당히 더 큰 용해를 생성하였다(각각 8％ ± 6％ 및 14％ ± 6％)(BV173의 경우 p<0.001, U266의 경우 p=0.003)(도 4A). 이에 반해서, 형질도입된 T 세포 및 대조군 T 세포 모두의 경우 대조군 표적인 HLA-A^*02^-서바이빈⁺ 백혈병 세포주 K562 및 HL-60에 대해서 무시해도 될 정도의 사멸이 관찰되었다(도 4A). s24-TCR⁺ T 세포의 세포독성 활성은, 표적 세포를 HLA 클래스-I 차단 항체와 함께 미리 인큐베이션시켜서 BV173 세포 및 U266 세포에 대한 세포독성 활성을 없앴기 때문에 MHC 클래스-I 제한형이었다(도 4B). 5일 동안 이러한 HLA-A^*02⁺서바이빈⁺ 종양 세포와 함께 대조군 T 세포 또는 s24-TCR⁺ T 세포를 공동 배양하는 더 장기간 검정법에서, s24-TCR⁺ T 세포의 존재 하에서 만이 BV173 종양 세포 및 U266 종양 세포 둘 다가 상당히 감소하였다(도 4C, 도 10). 이러한 세포독성 효과는 엘리스팟 검정법(도 4D)에 의해서 평가된 바와 같은 BV173 세포주 및 U266 세포주에 대한 s24-TCR⁺ T 세포에 의한 IFN-γ 제조 및 사이토메트릭 비드 어레이(도 11)에 의해서 평가되는 바와 같은 Th1 사이토카인 방출과 상응하였다. s24-TCR⁺ T 세포의 항종양 효과를 또한 1기 백혈병 샘플에 대한 CFU 검정법으로 확인하였다. 도 4E에 나타내어진 바와 같이, 백혈병 CFU 형성은 대조군 T 세포와 비교할 때, s24-TCR⁺ T 세포와 함께 인큐베이션된 5종의 HLA-A^*02⁺ 백혈병 샘플 모두에서 상당히 감소하였는데, s24-TCR⁺ T 세포의 존재 하에서 CFU 형성의 중간 감소는 48％이다(범위 32 내지 78％; p=0.03). 또한, 2종의 HLA-A^*0201^- 백혈병 샘플에 대해서 어떤 세포독성 효과도 관찰되지 않았다(도 4F). 현저히 다르게, HLA-A^*0201⁺ 건강한 공여자로부터의 조혈 줄기 세포/프로지니터 세포의 CFU 형성은 s24-TCR⁺ T 세포와의 인큐베이션에 의해서 영향을 받지 않았는데, 이는 대조군 T 세포를 갖는 배양액과 비교할 때 s24-TCR⁺ T 세포의 존재 하에서 CFU의 중간 감소가 단지 3％이다(도 4G).

실시예 4

서바이빈 - TCR 형질전환 T 세포는 생체내에서 항암 활성을 갖고, 생존율을 개선시킨다 .

s24-TCR⁺ T 세포의 생체내 항종양 기능을 확인하기 위해서, 파이어플라이 루시퍼라제(Firefly luciferase: FFLuc)로 유전자 변형된 BV 173 세포로 계내 이식된 이종 NSG 마우스 모델을 사용하고, 생물발광 영상화(bioluminescent imaging: BLI)를 사용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 잔류 백혈병을 모방하는 조건에서, 백혈병 주입 다음 날에 마우스에게 대조군 T 세포 또는 s24-TCR⁺ T 세포를 갖는 입양 T-세포 이식체를 제공하였다(도 5A). 주입 후 40일차에, s24-TCR⁺ T 세포로 치료된 마우스는 대조군 T 세포가 제공된 마우스와 비교할 때 백혈병 성장이 상당히 더 양호하게 제어되었다(8.1 x 10⁶ ± 9 x 10⁶ 대 195 x 10⁶ ± 85 x 10⁶ 광자/초)(p=0.003)(도 5B, 도 5C). 이는, s24-TCR⁺ 치료된 마우스가 80일까지 전체-생존율이 개선된 것으로 해석되며(p<0.001)(도 5D), s24-TCR⁺ T-세포 치료된 마우스 3/10이 종양이 없는 것이다. 백혈병이 심한 마우스에서 항암 활성을 측정하기 위해서, 질환 파종(dissemination) 및 질환 발병이 BLI에 의해서 입증된 경우 T 세포를 백혈병 접종 후 2주차에 주입하였다(도 6A). s24-TCR⁺ T 세포가 제공된 마우스는 대조군 마우스와 비교할 때 상당히 더 느린 백혈병 진척을 가졌으며, 이는 28일까지 더 낮은 생물발광 신호를 생성하였다(도 6B, 도 6C)(40 x 10⁶ ± 71 x 10⁶ 대 128 x 10⁶ ± 176 x 10⁶ 광자/초)(p=0.04). 이러한 TCR-매개된 항-백혈병 활성은 마우스의 상당히 개선된 생존율로 해석되었다(p=0.01)(도 6D).

실시예 5

알라닌-스캐닝은 서바이빈 에피토프의 인식을 위해서 최적화된 TCR 결합 모드를 나타낸다.

s24-TCR이 정상 조혈 세포에 대해서 프래트리사이드 또는 독성을 나타내지 않으면서, 항암 활성을 생성하는 기전을 이해하기 위해서, s24-TCR 또는 보고된 "프래트리사이드" TCR(A72-TCR)(Leisegang, et al., 2010)을 발현하는 T 세포를 나란한 실험으로 비교하였다. 시험관 내에서 항암 활성과 관련하여 두 TCR 중 하나를 발현하는 T 세포들 간에는 어떤 유의한 차이점도 관찰되지 않았지만(도 7A), A72-TCR을 발현하는 T 세포 만이 정상 조혈 줄기 세포/프로지니터 세포에 대해서 자가반응성(도 7B) 및 독성을 나타내었다(도 7C). 추가로, s24-TCR⁺ 세포가 아니라 A72-TCR⁺ T 세포는 또한 비-조혈 세포, 예컨대 섬유모세포(도 7D) 및 심장근육세포(도 7E)에 대해서 세포독성 활성을 나타내었다. 중요하게는, 염증성 손상을 모방하는 조건에서 조차, 예컨대 표적이 HLA-A^*0201 발현을 조절하는 IFN-γ와 함께 미리 인큐베이션된 경우에도, s24-TCR⁺ T 세포에 의한 더 안전한 프로파일이 유지되었다(도 13). 이러한 선호되는 독성 프로파일은 BV173 종양 모델에서 생체내에서 감소된 항암 활성으로 인한 것이 아니었는데, 그 이유는 s24-TCR⁺ T 세포가 A72-TCR⁺ T 세포에 비해서 탁월한 종양 제어를 매개하였기 때문이다(p<0.0001)(도 14).

컴퓨터 모델링 연구는, s24-TCR의 선택적인 종양 특이성은, HLA-A^*02 그루브(groove)와 주로 상호작용하는 A72-TCR에 반해서, TCR과 서바이빈-MHC 복합체의 단단하고, 연장된 계면에 관련된다는 것을 보여주었다. 구체적으로, s24-TCR은 Leu4, Gly5 및 Phe7을 포함하는 서바이빈 펩타이드의 국지적인 영역과 다수의 방향족 잔기를 포함하는 고도로-최적화된 물리적인 상호작용의 네트워크를 생성하였다. 이어서, 서바이빈 펩타이드의 알라닌-치환 실험에 의해서 TCR-펩타이드-MHC 상호작용의 기능성 분석을 수행함으로써 구조적 분석을 입증하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 서바이빈 펩타이드의 모든 단일 잔기(10/10)는 s24-TCR 작용성 활성화에 중요한 것처럼 보였는데, 그 이유는 7/10 단일 치환이 IFN-γ 방출을 완전히 제거하였고, 3/10이 그것을 상당히 감소시켰기 때문이다. 이에 반해서, 단지 3/10 치환은 A72-TCR 활성화의 완전한 기능성 손실에 중요하였는데(도 8), 이는 더 작고 덜 최적인 TCR-펩타이드 결합 모드를 제안한다. 예상 모델 및 알라닌 치환 분석법 둘 다를 기초로, 유니프로트(UniProt)KB/스위스-프로트(Swiss-Prot) 데이터베이스 서열을 모티프인 XLTXGEFLKX(서열번호 13) 및 XXXLXXFLKL(서열번호 14)을 함유하는 단백질 서열에 대해서 쿼링(querying)하여 잠재적인 교차-반응성 에피토프를 확인하였다. T 림프구를 비롯한, 조혈계 또는 면역계의 세포와 연관된 7종의 펩타이드를 선택하였다. IFN-γ엘리스팟 검정법은 s24-TCR이 아니라 A72-TCR이 이러한 펩타이드 중 몇몇으로 펄싱된 T2 세포에 대해서 반응하는 것을 보여준다(표 4).

^A알라닌-치환 분석에 의해서 예상된 에피토프를 T2 세포 상에 적재하였고, s24-TCR⁺ 또는 A72-TCR⁺ T 세포에 의한 반응성을 IFN-γ 엘리스팟 검정법에 의해서 평가하였다. 3명의 공여자의 대표적인 결과. 약어: CD3d: CD3 델타; CD81: CD81 항원; CSF3R: 과립구 집락 자극 인자 수용체(Granulocyte colony stimulating factor receptor); CRLS1: 카디올리핀 신타제; EPB42: 적혈구 막 단백질 밴드 4.2.; INGR2: 인터페론 감마 수용체 2.

실시예 6

특정 실시형태의 요약

본 개시 내용은 다클론성 T 세포 중에서 이식되는 경우 자가 독성을 생성하지 않으면서 시험관내 및 생체내 둘 다에서 다양한 종양 세포를 제거하기에 충분한 기능성 결합능을 나타내는 신규 서바이빈-특이적인 s24-TCR의 자가형 TCR 레퍼토리로부터의 단리를 예증한다. 이러한 신규 TCR은 자가-조직 상의 서바이빈을 종양-관련 서바이빈 발현으로부터 구별할 수 있고, "온-표적 오프-종양" 독성 없이 항종양 반응성을 선택적으로 매개한다. 기능성 데이터는, s24-TCR의 선택적인 종양 특이성이 TCR과 서바이빈-MHC 복합체의 상당히 특이적인 상호작용에 의존한다는 것을 보여준다. 따라서, TCR에 의한 자가 펩타이드의 최적의 인식이 그의 선택성을 제공하고, 교차-반응성을 최소화하고, 따라서 자가-반응성을 최소화한다. 이러한 발견은 작용성 서바이빈-특이적인 TCR이 독성이 있고, 따라서 임상적인 사용에 적합하지 않다는 이전의 결론, 및 그러한 TCR에 의해서 매개된 프래트리사이드 효과가 오직 활성화된 T 세포의 "온-표적" 인식으로 인한 것이라는 주장에 도전적이다(Leisegang, et al., 2010). 그러한 관찰은 몇몇 상이한 TAA를 표적화하는 자가형 레퍼토리 또는 동종이형 레퍼토리로부터 유도된 7종의 부가적인 TCR 세트를 비교 분석하여 일반화되었는데, 이는 흉선 선택 단계가 TCR 교차-반응성을 최소화하기 위한 열쇠임을 제안한다.

다수의 연구는, 서바이빈이 대부분의 암에서 상향조절되지만, 그것은 또한 정상 세포, 예컨대 CD34⁺ 조혈 줄기 세포, T 림프구(Altieri, 2003) 및 심장근육세포(Wohlschlaeger, et al., 2010; Levkau, 2011)에서 또한 기능성임을 보여주었다. 예를 들어, 컨디셔널 넉아웃(conditional knockout) 마우스는 초기에 서바이빈의 손실이 더블-네거티브(double-negative) 세포로부터 더블-양성(double-positive) 세포로의 T-세포 전이를 차단하지만, 후기에서는 순환에서의 그의 수를 감소시킨다는 것을 보여준다(Xing, et al., 2004). 서바이빈은 또한 인간 T 세포에서 TCR 가교시 상향조절된다는 것을 발견하였고(Leisegang, et al., 2010; Kornacker, et al., 2001), 그것은 울혈성 심부전 동안 심장 근육세포 리모델링의 증식(Wohlschlaeger, et al., 2010) 및 허혈성/리퍼퓨즈드(reperfused) 심장에 포함된다(Levkau, 2011). 서바이빈의 이러한 기능성 활성에도 불구하고, 서바이빈-특이적인 CTL을 유도할 때조차 자가형 줄기 세포 이식 이후에 서바이빈-기반 백신이 수여된 환자에게서 어떤 심장 독성 및 줄기 세포 생착 또는 T-세포 재구성에서의 어떤 지연도 보고되어 있지 않다(Rapoport, et al., 2011). 이러한 임상적 경험과 유사하게, 정상 조혈 프로지니터의 성장에서 어떤 손상도 존재하지 않거나, s24-TCR 재안내된 T 세포의 존재 하에서 T-세포 확장에 대한 어떤 부정적인 영향도 존재하지 않는다. 이러한 안전성 프로파일은 항종양 효과를 손상시키지 않으면서 일어날 수 있는데, 그 이유는 백혈병 프로지니터 및 종양 세포가 s24-TCR을 발현하는 다클론성 T 세포에 의해서 시험관내 및 생체내 둘 다에서 상당히 제거되었기 때문이다. 따라서, 이러한 데이터는 s24-TCR이 종양 표적을 인식하지만, 인식의 역치값 미만으로 항원을 발현하는 건강한 세포에 대해서는 "내성"임을 제안한다. 이에 반해서, 독성 효과는 동종이형 HLA-미스매치트 TCR 레퍼토리로부터 단리된 A72-TCR을 발현하는 다클론성 T 세포에 의해서 지속적으로 유도되었다.

s24-TCR이 종양 세포를 선택적으로 인식한다는 결론은, 적어도 서바이빈 에피토프의 작용성 알라닌 치환 분석에 의해서 지지된다. 이러한 연구는 s24-TCR이 "프래트리사이드성" 또는 자가-반응성이 아니라는 것을 예증하는데, 그 이유는 그것이 서바이빈 펩타이드와 그의 가장 강한 상호작용의 대부분을 설정하지만, 공지된 "프래트리사이드성" A72-TCR은 펩타이드 교차-반응성을 선호하기 때문이다. 그러한 발견은, 네이티브(native) 교차-반응성이 임의의 특정 펩타이드-MHC 복합체 내의 핫 스팟 잔기의 제한된 수에 중점을 두고 있는 것 같다는 것을 보여주는 이전의 연구와 일치한다(Tynan, et al., 2005; Birnbaum, et al., 2014). 뮤린 연구는 이미 펩타이드 교차-반응성이 동종이형 설정에서만 일어난다는 것을 보여주었는데, 이는 생리학적 조건에서 일어나는 네거티브 선택이 TCR에 의해서 인식된 구별되는 리간드의 수를 상당히 제한하기 때문이다(Huseby, et al., 2003). 교차-반응성 TCR은 네거티브 선택이 실험적으로 제한되어, 표적화된 펩타이드 내에서 아미노산 치환을 "수용한" 마우스에서만 발견될 수 있다(Huseby, et al., 2006). 자가형 서바이빈-TCR 대 알로제한형 서바이빈-TCR의 분자 인식 패턴을 비교함으로써, 네이티브를 종양 서바이빈 발현 수준으로부터 구별하는 s24-TCR의 능력에 대한 기전을 설명하는 분자 결정인자를 확인하였다. 따라서, 동종이형 TCR 레퍼토리로부터 생성된 서바이빈 특이적인 A72-TCR을 사용하여 보고된 "프래트리사이드성" 효과는 활성화된 T 세포 상에서의 "온-표적" 인식의 하한 역치값으로 인해서 그리고 비최적 펩타이드-TCR 상호작용으로 인한 교차-반응성 펩타이드의 "오프-표적" 인식으로 인한 것일 수 있다고 고려되었다. 결과로서, A72-TCR⁺ T 세포의 생체내 항종양 기능은 s24 TCR에 비해서 제한될 수 있는데, 그 이유는 그것이 사실 BV173 마우스 모델에서 관찰되었기 때문이다. 상이한 TAA를 표적화하는 자가형 TCR 및 동종이형 TCR의 추가 세트를 사용하여 그러한 발견을 입증함으로써, 연구는 "오프-표적" 독성에 대한 가능성을 갖는 교차-반응성이 동종이형 레퍼토리로부터 단리된 TCR의 보다 일반적인 문제일 수 있음을 제안한다. 이러한 발견은 형질전환 TCR에 의한 치료 종양 표적화에 대해서 더 넓은 결과를 갖는다. 동종이형 레퍼토리 또는 이종형 레퍼토리로부터 유도되거나, 또는 실험적으로 향상된 친화성을 갖는 TCR이 높은-친화도 TCR을 달성하기 위한 수단으로서 널리 사용되어 왔지만, 자가형 레퍼토리가 여전히 유효한 전략으로 존재한다.

결론적으로, 본 개시 내용은 에피토프 특이성, 항암 활성 및 자가반응성 결핍의 요건을 충족시키는 TCR의 이소적 발현에 의해서 암 면역요법에서 표적으로서의 서바이빈의 타당성을 재수립한다. 이러한 TCR은 MHC-에피토프 복합체의 최적의 선택적인 인식에 좌우되며, 자가-조직 대 종양 표적에 대한 서바이빈 항원 수준을 감지할 수 있다. 이러한 접근법은 다른 공유된 종양/자가-항원을 표적화하는 부가적인 TCR의 확인을 위해서 조정가능하며, 이는 TCR-매개된 자가반응성 생성 위험을 감소시킨다.

실시예 7

예시적인 방법

세포주

종양 세포주 BV173(B-급성 림프성 백혈병)을 저먼 셀 컬쳐 컬렉션(German Cell Culture Collection)(DSMZ, 독일 브라운슈바이크 소재)으로부터 입수하였고, 종양 세포주 U266B1(다발성 골수종), K562(적백혈병), HL-60(급성 골수성 백혈병), CEM-T2(TAP 수송체 결핍), 293T 및 심장근육세포 세포주 AC10을 아메리칸 티슈 컬쳐 컬랙션(American Tissue Culture Collection)(ATCC, 미국 버지니아주 머내서스 소재)으로부터 입수하였다. 세포를 RPMI 1640 배지(하이클론(HyClone), 미국 매사추세스주 왈탐 소재의 써모 사이언티픽)가 있는 배양액 중에서 유지시키거나, 293T 세포의 경우 IMDM 배지(기브코, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 인비트로젠 라이프 테크놀로지즈(Invitrogen Life Technologies))가 있는 배양액 중에서 유지시키거나, AC10 세포의 경우 DMEM/F12 배지(기브코)가 있는 배양액 중에서 유지시켰는데, 이것은 37℃에서 5％ CO₂를 함유하는 가습 분위기에서 제조원 권고 사항에 따라서 10％ 또는 20％ 소 태아 혈청(FBS, 하이클론), 1％ L-글루타민 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신(인비트로젠)을 함유한다. BV173 세포주에 이미 기술된 바와 같은 파이어플라이-루시퍼라제(FFluc) 및 네오마이신 내성 유전자를 코딩하는 레트로바이러스 벡터를 형질도입하였다(Hoyos, et al., 2010). K562 세포주를 HLA-A^*0201 분자, 및 공자극성 분자로서 CD40L, CD80 및 OX40L을 발현하도록 조작하였고, T 세포 확장을 위한 인공 항원 전달 세포(artificial antigen presenting cell: aAPC)로서 사용하였다(Quintarelli, et al., 2008). 세포주는 유니버시티 오브 텍사스 엠디 앤더슨 캔서 센터 캐릭터라이즈드 셀 라인 코어 퍼실러티(University of Texas MD Anderson Cancer Center Characterized Cell Line Core Facility)에 의해서 증명되었다. AC10 세포는 고해상도 시퀀스 베이스트 타이핑(Sequence Based Typing)(미국 텍스사주 휴스톤 소재의 휴스톤 메토디스트 호스피탈(Houston Methodist Hospital))에 의해서 HLA-A^*0201⁺인 것으로 확인되었다.

건강한 기증자 및 백혈병 환자로부터의 샘플

건강한 자발적 혈액 공여자로부터의 연막(buffy coat)을 미국 텍사스주 휴스톤 소재의 걸프 코스트 리지날 블러드 센터(Gulf Coast Regional Blood Center)를 통해서 입수하였다. 익명 제대혈(CB) 단위를 IRB-승인 프로토콜에 따라서 엠디 앤더슨 코드 플러드 뱅크(MD Anderson Cord Blood Bank)(미국 텍사스주 휴스톤 소재의 유니버시티 오브 텍사스)를 통해서 입수하였다. AML 또는 CML이 있는 익명 환자로부터의 말초 혈액(PB) 및 골수(BM) 샘플을 생명 윤리 위원회(local institutional review board:IRB)-승인된 프로토콜(미국 텍사스주 휴스톤 소재의 배일러 컬리지 오브 메디슨(Baylor College of Medicine))에 따라서 수집하거나 텍사스 췰드런즈 캔서 센터 티슈 뱅크(Texas Children's Cancer Center Tissue Bank)에서 제공받았다. 진피 섬유모세포를 로컬 BCM-IRB-승인된 프로토콜에 따라서 HLA-A^*0201⁺ 건강한 공여자(고해상도 시퀀스 베이스트 타이핑(미국 텍사스주 휴스톤 소재의 휴스톤 메토디스트 호스피탈)에 의해서 확인됨)로부터 수집하거나, 이미 보고된 바와 같이 생성하였다(Leen, et al., 2004).

펩타이드 및 알라닌 치환 실험

네이티브 10-mer 펩타이드 서바이빈95-104 ELTLGEFLKL(ELT; 서열번호 15), 그의 헤테로클리틱 9-mer 변이체 서바이빈_{96 -104}97M LMLGEFLKL(LML; 서열번호 16), 흑색종에서 우세하게 발현되는 항원(Preferentially Antigen Expressed in Melanoma: PRAME) P435(P435, NLTHVLYPV [서열번호 29]), PRAME P300(P300, ALYVDSLFFL [서열번호 30]), MART-1 ELA(ELAGIGILTV [서열번호 31]), 티로시나제 YMD(YMDGTMSQV [서열번호 32]) 및 모든 펩타이드의 각각의 아미노산 위치에 대한 알라닌 치환 변이체를 지넴드 신테시즈(Genemed Synthesis)(미국 텍사스주 샌 안토니오 소재)에 의해서 합성하였다. 모든 펩타이드를 DMSO 중에서 재구성하였고, 달리 언급되지 않는 한 5μM의 농도로 사용하였다. 흑색종에서 우세하게 발현되는 항원(PRAME) P435 펩타이드(P435, NLTHVLYPV; 서열번호 17) 또는 인플루엔자 매트릭스 단백질_{58 -66}(flu, GILGFVFTL; 서열번호 18)을 특이적이지 않은 대조군으로서 사용하였다(Quintarelli, et al., 2008). 형질전환 T 세포에 의한 HLA-펩타이드 복합체의 인식은 표적으로서 펩타이드 펄싱된 T2 세포를 사용하여 IFN-γ 엘리스팟 검정법에 의해서 분석하였다.

서바이빈 -특이적인 T-세포주 및 클론의 생성 및 확장

말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 림포프렙(Lymphoprep)(미국 뉴욕주 웨스트버리 소재의 어큐레이트 케미컬 앤드 사이언티픽 코퍼레이션(Accurate Chemical and Scientific Corp.)) 밀도 구배 원심법에 의해서 단리하였다. HLA-A2 상태를 유세포분석기(FACS)에 의해서 평가하였고, 서바이빈-특이적인 T-세포주를 이미 기술된 바와 같이 HLA-A2 양성 공여자로부터 생성하였다(Quintarelli, et al., 2008). 간략하면, 수지상 세포(DC)를 CD14-선택 단핵구(CD14⁺ 비드 및 수동 MACS 컬럼 사용, 미국 캘리포니아주 아우번 소재의 밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotech))로부터 생성하고, 성숙시킨 후, 37℃에서 2시간 동안 특정 펩타이드 5μM로 펄싱하였다. 이어서 DC를 사용하여, 이미 검증된 사이토카인의 조합물(IL-7(10ng/ml), IL-12(1ng/ml), 및 IL-15(2ng/ml))(미국 뉴저지주 로키 힐 소재의 페프로테크(Peprotec) 또는 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재의 알앤디 시스템즈(R&D Systems) 제품)의 존재 하에서, 완전 CTL 배지(45％ 클릭스 배지(Click's media)(미국 캘리포니아주 산타 안나 소재의 이르빈 사이언티픽(Irvine Scientific)), 45％ RPMI 1640, 5％ 열-불활성화된 인간 AB 혈청(미국 버지니아주 윈체스터 소재의 밸리 바이오메디컬(Valley Biomedical)), 1％ L-글루타민 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신(미국 캘리포니아주 카를스배드 소재의 인비트로젠)) 중에서, 20:1의 이펙터 대 표적(E:T) 비율에서 자가형 CD8+ T 세포(면역자성 선택(immunomagnetic selection)에 의해서 수득됨, 밀테니이 바이오테크)를 자극하였다. 배양 9일차 및 16일차에, T 세포를 IL-7, IL-12, 및 IL-15를 함유하는 배지 중에서 10:1의 E:T의 비율에서 펩타이드-펄싱된 인공 항원 전달 세포(aAPC)로 재자극하였다. 인터류킨-2(50U/ml)(테셀류킨(Teceleukin), 미국 뉴저지주 너틀레이 소재의 호프만 라-로슈(Hoffmann La-Roche))을 상기에 기술된 바와 같이 16일차로부터의 배양액에 첨가하였다(Quintarelli, et al., 2008).

상기에 기술된 바와 같이 희석을 제한함으로써 단일 세포 서바이빈-특이적인 T-세포 클론을 LML 반응성 T-세포주 및 ELT 반응성 T-세포주로부터 생성하였다(Perna, et al., 2013). 성장 세포를 IFN-γ 엘리스팟 검정법에서 서바이빈-특이적인 반응성에 대해서 스크리닝하였고, 동종이형 피더(feeder) 세포, IL-2 및 OKT3(오르토클론(Orthoclone))의 존재 하에서 추가로 확장시켰다. 동시에, 비-특이적인(특이적이지 않은) 클론을 동일한 공여자로부터 확장시켰고, 대조군으로서 제공하였다. 확장된 클론은 고해상도 시퀀스 베이스트 타이핑(미국 텍스사주 휴스톤 소재의 휴스톤 메토디스트 호스피탈)에 의해서 HLA-A^*0201⁺인 것으로 확인되었다. PRAME-특이적인 클론을 동일한 방법에 따라서 생성하였다.

면역표현형

세포를 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)(미국 캘리포니아주 새너제이 소재) 또는 베크만 쿨터(Beckman Coulter)(미국 캘리포니아주 브레아 소재)로부터의 HLA-A2, CD3, CD4, CD8, CD33, CD34, CD38, CD56, CD45용 플루오레세인 아이소타이오사이아네이트(FITC)-, 피코에리트린(PE)-, 페리디닌 클로로필 단백질(PerCP)- 또는 알로피코사이아닌(APC)-접합된 항체로 염색하였고, 서바이빈용 PE-접합된 항체(알앤디 시스템즈(R&D Systems))로 염색하였고, 뮤린 TCR 불변 β-쇄용 APC-접합된 항체(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 이바이오사이언스(eBioscience)), 또는 배일러 컬리지 오브 메디슨 MHC 테트라머 프로덕션 퍼실리티에 의해서 제조된 PE-접합된 LML 또는 ELT 서바이빈 특이적인 테트라머로 염색하였다. 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어(BD)를 사용하여 FACS 캘리버(Calibur) 상에서 데이터 획득을 수행하였다. 플로우조 소프트웨어(FlowJo Software)(미국 오레곤주 애쉬랜드 소재의 트리스타(Treestar))를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.

엘리스팟 검정법

이미 기술된 바와 같이 인터페론-γ(IFN-γ) 엘리스팟 검정법을 수행하였다(Quintarelli, et al., 2008). 간략하면, 1x10⁵ T 세포/웰을 3회 반복 플레이팅하고, 이어서 5μM 또는 제시된 농도의 특정 펩타이드, 또는 각각의 표적 세포주 1x10⁵ 세포 또는 배지만으로 자극하였다. 양성 대조군으로서, T 세포를 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)(미국 미조리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 25ng/ml 및 아이오노마이신(시그마-알드리치) 1μg/mL로 자극하였다. IFN-γ 스팟 형성 세포(SFC)를 나열하였다(미국 뉴저지주 포트 리 소재의 젤네트(ZellNet)).

크로뮴-방출 검정법

이미 기술된 바와 같이 표준 4-시간(펩타이드-펄싱된 T2 세포를 사용하여 TCR 결합능을 측정하는 경우) 내지 6-시간(종양 세포주, 활성화된 T 세포, 섬유모세포 및 심장근육세포의 사멸을 평가하는 경우) ⁵¹Cr-방출 검정법을 사용하여 T 세포의 세포독성 활성을 평가하였다(Quintarelli, et al., 2008). 표적 세포를 각각 배지 단독 중에서 또는 1％ 트라이톤(Triton) X-100(시그마-알드리치) 중에서 인큐베이션시켜서 자발적인 ⁵¹Cr-방출 및 최대 ⁵¹Cr-방출을 측정하였다. 3회 반복한 웰의 특이적인 용해의 평균 백분율을 다음과 같이 계산하였다: [(시험 카운트 - 자발적인 카운트)/(최대 카운트 - 자발적인 카운트)] × 100％. 차단 실험을 위해서, 이미 기술된 바와 같이 표적 세포를 항-HLA 클래스 I 또는 클래스 II 차단 항체(미국 캘리포니아주 카르핀테리아 소재의 다코(DAKO))와 함께 미리 인큐베이션시켰다(Quintarelli, et al., 2008). 선택된 실험에서, 섬유모세포 및 심장근육세포를 48시간 동안 IFN-γ(100U/ml)(펩프로테크(Peprotech))와 함께 미리 인큐베이션시켰고, 그 후에 LML 펩타이드(28)의 부재 또는 존재 하에서 표적으로서 사용하였다.

공동 배양 및 사이토메트릭 비드 어레이

형질도입되거나 형질도입되지 않은 T 세포(1x10⁶/웰)를 사이토카인의 부재 하에서 24-웰 플레이트에서 5:1의 이펙터 대 표적(E:T) 비율에서 종양 세포주(2x10⁵/웰)와 함께 공동 배양하였다. 배양 5일차 이후에, 세포를 수집하고, CD3 및 특이적인 종양 마커에 대해서 염색하였다(BV173의 경우 CD19, U266의 경우 CD138, HL-60 및 K562의 경우 CD33). 배양액 중의 잔류 종양 세포를 카운트브라이트 비즈(CountBrigth beads)(인비트로젠)를 사용하여 FACS에 의해서 나열하였다. 배양 24시간 후에 공동 배양액 상청액을 수집하였고, 사이토카인을 제조자의 설명서에 따라서 특이적인 사이토메트릭 비드 어레이(BD)를 사용하여 측정하였다.

백혈병 및 정상 조혈 프로지니터의 집락 형성 단위 검정법( CFU )

이미 기술된 바와 같이, 건강한 공여자 또는 백혈병 환자의 BM, CB 또는 PB로부터의 단핵 세포(MNC)를 10:1의 이펙터 대 표적(E:T) 비율에서 6시간 동안 서바이빈-특이적인 T-세포 클론 또는 비-특이적인 T-세포 클론, 또는 서바이빈-TCR 형질도입된 T 세포 또는 형질도입되지 않은 T 세포와 함께 공동 인큐베이션시키고, 이어서 재조합 사이토카인(메토컬트 에이치4434 클래식(Methocult H4434 classic), 미국 워싱톤주 투킬라 소재의 스템 셀 테크놀로지즈(Stem Cell Technologies))이 보충된 메틸셀룰로스-기재 배지 중에서 2회 반복 플레팅하였다(Quintarelli, et al., 2008). 배양 2주 후 고품질 도립 현미경(inverted microscope)을 사용하여 과립 대식 세포 집락 형성 단위 및 적혈구 CFU를 스코어링하였다.

서바이빈 -특이적인 TCR 유전자의 단리 및 레트로바이러스 벡터의 생성

퀴아젠(Qiagen)(미국 매릴랜드주 저먼타운 소재)으로부터의 알엔이지 키트(RNeasy kit)를 사용하여 서바이빈-특이적인 클론 #24(s24), #16(s16) 또는 PRAME-특이적인 클론 p11, p28 및 p300으로부터 전체 RNA를 단리하고, 제조원의 지시에 따라서 5' 레이스(RACE) PCR(제너레이서 키트(Generacer Kit), 인비트로젠)에 의해서 TCR cDNA를 클로닝하였다. PCR 생성물을 pCR4 TOPO 벡터(인비트로젠) 중에서 클로닝하고, 원 샷(One Shot) TOP10 수용(competent) 세포(인비트로젠) 중에서 변형시켰다. 플라스미드 DNA를 40개의 개별 군락으로부터 제조하였는데, 20개는 TCR α-쇄 cDNA를 함유하고, 20개는 TCR β-쇄 cDNA를 함유한다. TCR 쇄 당 10개의 플라스미드로부터의 전장 삽입물을 서열분석하여(미국 텍사스주 휴스톤 소재의 세크라이트(Seqwright)) CTL 클론 s24의 TCR 사용을 결정하였다. 확인 후, 인간을 뮤린 TCR 불변 영역으로 대체함으로써 TCR 서열을 변형시키고, 2A 서열에 의해서 연결하고, 젠아트(Geneart)(인비트로젠)에 의해서 코돈 최적화하고, 마지막으로 SFG 레트로바이러스 벡터에 도입하였다(도 2A). A72-TCR의 네이티브 α-쇄 TCR 서열 및 β-쇄 TCR 서열(Leisegang, et al., 2010)을 코돈-최적화하고, 젠아트(인비트로젠)에 의해서 합성하고, 추가로 변형시키지 않고 SFG 레트로바이러스 벡터 내에 개별적으로 도입하였다. MART-1(M1-29 및 M1-67) 및 티로시나제(T58) TCR 서열(Wilde, et al., 2009)을 코돈-최적화하고, 2A 서열에 의해서 연결하고, 젠아트에 의해서 합성하고, SFG 레트로바이러스 벡터 내에 도입하였다.

레트로바이러스 상청액의 생성, T-세포 형질도입 및 확장

이미 기술된 바와 같이 293T 세포의 감염에 의해서 일시적인 레트로바이러스 상청액을 제조하고(Quintarelli, et al., 2007), 그것을 사용하여, 자기 비드(밀리테니이 바이오테크)를 사용하여 건강한 공여자의 PBMC로부터 단리된 CD8⁺ T 세포를 형질도입하였다. 형질도입된 세포를 10％ FBS를 함유하는 CTL 배지 중에서 확장시키고, 4:1의 E:T 비율 및 IL-2(50U/ml)에서 서바이빈 LML 펩타이드-적재된 γ-조사된(80Gy) aAPC로 매주 자극하였다. 형질도입되지 않은 T 세포를 10％ FBS 및 IL2(50U/ml)를 함유하는 CTL 배지 중에서 유지시키고, 고정화된 OKT3 및 항-CD28(BD) 항체로 재자극하였다.

BV173 백혈병 이종이식 모델 및 생체내 생물발광 영상화

NSG 마우스(8 내지 10주령)를 잭슨 래보러토리(Jackson laboratory)(미국 메인주 바 하버 소재)로부터 구입하였고, IACUC 승인된 프로토콜 하에서 배일러 컬리지 오브 메디슨 애니멀 퍼실리티에서 유지시켰다. 치사량 미만으로 조사된(120 cGy) NSG 마우스에 3x10⁶ FFluc 표지된 BV173 세포를 꼬리 정맥을 통해서 i.v. 주입하였다. IVIS 시스템(제노젠(Xenogen), 미국 캘리포니아주 알라메다 소재의 칼리퍼 라이프 사이언스즈(Caliper Life Sciences))을 사용한 생물발광 영상화(광자/초/㎠/sr)에 의해서 백혈병 존재량을 모니터링하였다. BV173을 접종하고, 24시간(낮은 종양 존재 모델; 도 5A) 후에 또는 14 내지 17일(높은 종양 존재 모델; 도 6A) 후에 형질도입된 T 세포 또는 형질도입되지 않은 T 세포(10x10⁶/마우스)의 총 3회의 T-세포 주입물(2일 간격)을 눈 뒤로 주입하였다. 재조합 인간 IL-2(1000U/마우스)를 T-세포 주입 동안 그리고 그 다음 주에 총 6회 i.p. 투여하였다. 영상화에 의해서 백혈병 성장을 매주 모니터링하였고, 생존율을 기록하였다. 아픈 마우스를 죽이고, 기관(비장, 혈액, 골수, 및 림프절, 간)을 백혈병 및 T 세포의 존재에 대해서 FACS에 의해서 분석하였다.

교차-반응성 펩타이드를 위한 엑스패시 프로지트 모티프 연구( Expasy prosite motif search)

s24 및 A72 TCR(14년 7월 9일의 2014_07 배포, 546000 엔트리를 가짐, 모든 TCR)의 비교를 위해서 엑스패시-프로지트(Expasy-PROSITE) 웹서버(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)를 사용하여 모든 유니프로트케이비/스위스-프로트 데이터 엔트리(UniProtKB/Swiss-Prot data entries)(13년 10월 16일의 2013_10 배포: 541561 엔트리) 내에서 펩타이드 모티프를 찾았다. 호모 사피엔스 및 조혈계에 대해서 필터를 설정하였다.

통계학적 분석법

평균 및 표준 편차(SD)에 의해서 데이터를 요약하였다. 스튜던트 t-검정(Student's t-test)을 사용하여 치료군들 간의 통계적으로 유의한 차이를 결정하였고, 적절한 경우 다중 비교를 본페로니 방법(Bonferroni method)에 의해서 조정하였다. 시간에 따른 마우스에서의 백혈병 성장 경향을 비교하기 위해서, 매시간 지점에서 생물발광 신호 강도를 로그-변환하고, 반복된 측정을 위한 강력한 일반화 추정식에 의해서 분석하였다. 그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software)(미국 캘리포니아주 라 호야 소재)에서 카플란-마이어 방법을 사용하여 생존율 분석을 수행하였다. 로그-랭크 시험을 사용하여 마우스군들 간의 통계적으로 유의한 차이를 평가하였고, P-값 <0.05은 유의한 차이를 나타낸다.

참고 문헌

본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 발명이 속한 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 수준을 대표한다. 모든 특허 및 간행물은 각각의 개별 간행물이 구체적으로 개별적으로 참고로 포함된 것을 나타내는 것처럼 동일한 정도로 참고로 포함된다.

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본 발명 및 그의 이점이 상세하게 기술되어 있지만, 첨부된 청구범위에 의해서 정의된 바와 같은 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변화, 치환 및 변경이 본 명세서에서 행해질 수 있음을 이해해야 한다. 더욱이, 본 출원의 범주는 명세서에 기술된 공정, 기계, 제조, 대상의 조성물, 수단, 방법 및 단계의 특정 실시형태로 제한되고자 함이 아니다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 본 발명의 개시로부터 쉽게 인식할 바와 같이, 본 명세서에 기술된 상응하는 실시형태와 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나 실질적으로 동일한 결과를 성취하는 현재 존재하거나 추후에 개발될 공정, 기계, 제조, 대상의 조성물, 수단, 방법 또는 단계가 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 따라서, 첨부된 청구범위는 그러한 공정, 기계, 제조, 대상의 조성물, 수단, 방법 또는 단계를 그의 범주 내에 포함시키고자 한다.

SEQUENCE LISTING <110> BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE <120> SURVIVIN SPECIFIC T-CELL RECEPTOR TARGETING TUMOR BUT NOT T CELLS <130> WO/2016/070119 <140> PCT/US2015/058452 <141> 2015-10-30 <150> US 62/073076 <151> 2014-10-31 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCR beta chain <400> 1 Asp Ala Met Val Ile Gln Asn Pro Arg Tyr Gln Val Thr Gln Phe Gly 1 5 10 15 Lys Pro Val Thr Leu Ser Cys Ser Gln Thr Leu Asn His Asn Val Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Gln Ala Pro Lys Leu Leu Phe His 35 40 45 Tyr Tyr Asp Lys Asp Phe Asn Asn Glu Ala Asp Thr Pro Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Ser Arg Arg Pro Asn Thr Ser Phe Cys Phe Leu Asp Ile Arg Ser 65 70 75 80 Pro Gly Leu Gly Asp Ala Ala Met Tyr Leu Cys Ala Thr Ser Arg Gly 85 90 95 Asp Ser Thr Ala Glu Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Ser 100 105 110 Ile Leu <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCR alpha chain <400> 2 Gly Glu Ser Val Gly Leu His Leu Pro Thr 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tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg caaggcatgg aaaaatacat aactgagaat 480 agaaaagttc agatcaaggt caggaacaga tggaacagct gaatatgggc caaacaggat 540 atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagatggaa cagctgaata 600 tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga 660 tggtccccag atgcggtcca gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg 720 gtgccccaag gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc 780 tcgcttctgt tcgcgcgctt atgctccccg agctcaataa aagagcccac aacccctcac 840 tcggggcgcc agtcctccga ttgactgagt cgcccgggta cccgtgtatc caataaaccc 900 tcttgcagtt gcatccgact tgtggtctcg ctgttccttg ggagggtctc ctctgagtga 960 ttgactaccc gtcagcgggg gtctttcatt tgggggctcg tccgggatcg ggagacccct 1020 gcccagggac caccgaccca ccaccgggag gtaagctggc cagcaactta tctgtgtctg 1080 tccgattgtc tagtgtctat gactgatttt atgcgcctgc gtcggtacta gttagctaac 1140 tagctctgta tctggcggac ccgtggtgga actgacgagt tcggaacacc cggccgcaac 1200 cctgggagac gtcccaggga cttcgggggc cgtttttgtg gcccgacctg agtcctaaaa 1260 tcccgatcgt ttaggactct ttggtgcacc ccccttagag gagggatatg tggttctggt 1320 aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa tttttgcttt cggtttggga 1380 ccgaagccgc gccgcgcgtc ttgtctgctg cagcatcgtt ctgtgttgtc tctgtctgac 1440 tgtgtttctg tatttgtctg aaaatatggg cccgggctag cctgttacca ctcccttaag 1500 tttgacctta ggtcactgga aagatgtcga gcggatcgct cacaaccagt cggtagatgt 1560 caagaagaga cgttgggtta ccttctgctc tgcagaatgg ccaaccttta acgtcggatg 1620 gccgcgagac ggcaccttta accgagacct catcacccag gttaagatca aggtcttttc 1680 acctggcccg catggacacc cagaccaggt ggggtacatc gtgacctggg aagccttggc 1740 ttttgacccc cctccctggg tcaagccctt tgtacaccct aagcctccgc ctcctcttcc 1800 tccatccgcc ccgtctctcc cccttgaacc tcctcgttcg accccgcctc gatcctccct 1860 ttatccagcc ctcactcctt ctctaggcgc ccccatatgg ccatatgaga tcttatatgg 1920 ggcacccccg ccccttgtaa acttccctga ccctgacatg acaagagtta ctaacagccc 1980 ctctctccaa gctcacttac aggctctcta cttagtccag cacgaagtct ggagacctct 2040 ggcggcagcc taccaagaac aactggaccg accggtggta cctcaccctt accgagtcgg 2100 cgacacagtg 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gccaccttct ggcacaaccc ccggaaccac ttcagatgcc aggtgcagtt 3000 ccacggcctg agcgaagagg acaagtggcc cgagggcagc cccaagcctg tgacccagaa 3060 catcagcgcc gaggcctggg gcagagccga ctgtggcatc accagcgcca gctaccacca 3120 gggcgtgctg agcgccacca tcctgtacga gatcctgctg ggcaaggcca ccctgtacgc 3180 cgtgctggtg tctggcctgg tgctgatggc catggtcaag aagaagaaca gcagagccga 3240 gggcagaggc agtctgctga cctgcggcga cgtggaagag aaccctggcc ctatggaatt 3300 tggactctcc tggctgtttc tcgtcgctat tctgaaaggc gtccagtgtg gcgagagcgt 3360 gggcctgcat ctgcccaccc tgtccgtgca ggaaggcgac aacagcatca tcaactgcgc 3420 ctacagcaac agcgccagcg actacttcat ctggtacaag caggaaagcg gcaagggccc 3480 ccagttcatc atcgacatcc ggtccaacat ggacaagcgg cagggccagc gcgtgaccgt 3540 gctgctgaac aagaccgtga agcacctgag cctgcagatc gccgccaccc agcctggcga 3600 tagcgccgtg tacttctgcg ccgagacagt gaccgacagc tggggcaagc tgcagttcgg 3660 agccggcacc caggtggtgg tcacccccga tatccagaat cccgagcccg ccgtgtacca 3720 gctgaaggac cccagaagcc aggacagcac cctgtgcctg ttcaccgact tcgacagcca 3780 gatcaacgtg 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aaccaatcag ttcgcttctc gcttctgttc gcgcgcttct gctccccgag 4680 ctcaataaaa gagcccacaa cccctcactc ggggcgccag tcctccgatt gactgagtcg 4740 cccgggtacc cgtgtatcca ataaaccctc ttgcagttgc atccgacttg tggtctcgct 4800 gttccttggg agggtctcct ctgagtgatt gactacccgt cagcgggggt ctttcacaca 4860 tgcagcatgt atcaaaatta atttggtttt ttttcttaag tatttacatt aaatggccat 4920 agtacttaaa gttacattgg cttccttgaa ataaacatgg agtattcaga atgtgtcata 4980 aatatttcta attttaagat agtatctcca ttggctttct actttttctt ttattttttt 5040 ttgtcctctg tcttccattt gttgttgttg ttgtttgttt gtttgtttgt tggttggttg 5100 gttaattttt ttttaaagat cctacactat agttcaagct agactattag ctactctgta 5160 acccagggtg accttgaagt catgggtagc ctgctgtttt agccttccca catctaagat 5220 tacaggtatg agctatcatt tttggtatat tgattgattg attgattgat gtgtgtgtgt 5280 gtgattgtgt ttgtgtgtgt gactgtgaaa atgtgtgtat gggtgtgtgt gaatgtgtgt 5340 atgtatgtgt gtgtgtgagt gtgtgtgtgt gtgtgtgcat gtgtgtgtgt gtgactgtgt 5400 ctatgtgtat gactgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 5460 tgtgaaaaaa tattctatgg tagtgagagc caacgctccg gctcaggtgt caggttggtt 5520 tttgagacag agtctttcac ttagcttgga attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 5580 actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 5640 gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 5700 atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 5760 gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac 5820 acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca 5880 gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga 5940 aacgcgcgat gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 6000 ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 6060 tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 6120 atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 6180 attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 6240 gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 6300 agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 6360 aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt 6420 cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 6480 cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 6540 actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 6600 cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc 6660 ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 6720 ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 6780 gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 6840 gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 6900 ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 6960 cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 7020 caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 7080 taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 7140 cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 7200 cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 7260 gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 7320 aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 7380 cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 7440 tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 7500 acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 7560 ctacagcgtg agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 7620 ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 7680 tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 7740 tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 7800 ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg 7860 gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag 7920 cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc 7980 gcgcgttggc 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aggcctacaa agagagcaac 600 tacagctact gcctgagcag ccggctgaga gtgtccgcca ccttctggca caacccccgg 660 aaccacttca gatgccaggt gcagttccac ggcctgagcg aagaggacaa gtggcccgag 720 ggcagcccca agcctgtgac ccagaacatc agcgccgagg cctggggcag agccgactgt 780 ggcatcacca gcgccagcta ccaccagggc gtgctgagcg ccaccatcct gtacgagatc 840 ctgctgggca aggccaccct gtacgccgtg ctggtgtctg gcctggtgct gatggccatg 900 gtcaagaaga agaacagcag agccgagggc agaggcagtc tgctgacctg cggcgacgtg 960 gaagagaacc ctggccctat ggaatttgga ctctcctggc tgtttctcgt cgctattctg 1020 aaaggcgtcc agtgtggcga gagcgtgggc ctgcatctgc ccaccctgtc cgtgcaggaa 1080 ggcgacaaca gcatcatcaa ctgcgcctac agcaacagcg ccagcgacta cttcatctgg 1140 tacaagcagg aaagcggcaa gggcccccag ttcatcatcg acatccggtc caacatggac 1200 aagcggcagg gccagcgcgt gaccgtgctg ctgaacaaga ccgtgaagca cctgagcctg 1260 cagatcgccg ccacccagcc tggcgatagc gccgtgtact tctgcgccga gacagtgacc 1320 gacagctggg gcaagctgca gttcggagcc ggcacccagg tggtggtcac ccccgatatc 1380 cagaatcccg agcccgccgt gtaccagctg aaggacccca gaagccagga cagcaccctg 1440 tgcctgttca ccgacttcga cagccagatc aacgtgccca agaccatgga atccggcacc 1500 ttcatcaccg ataagaccgt gctggacatg aaggccatgg acagcaagag caacggcgcc 1560 attgcctggt ccaaccagac cagcttcaca tgccaggaca tcttcaaaga gacaaacgcc 1620 acctacccca gcagcgacgt gccctgtgat gccaccctga ccgagaagtc cttcgagaca 1680 gacatgaacc tgaacttcca gaacctgagc gtgatgggcc tgcggatcct gctgctgaag 1740 gtggccggct tcaacctgct gatgaccctg cggctgtggt ccagctga 1788 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 6 Cys Ala Ala Arg Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 7 Cys Ala Val Asn Asn Ala Arg Leu Met Phe 1 5 10 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 8 Cys Ala Met Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Asn Lys Leu Ile Phe 1 5 10 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 9 Cys Ala Thr Ser Arg Gly Asp Ser Thr Ala Glu Pro Gln His Phe 1 5 10 15 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 10 Cys Ala Trp Gly Thr Gly Leu Ala Leu Tyr Glu Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 11 Cys Ala Trp Ser Ile Gly Ala Glu Gln Phe Phe 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 12 Cys Ala Gly Gln Asp Leu Asn Thr Glu Ala Phe Phe 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 13 Xaa Leu Thr Xaa Gly Glu Phe Leu Lys Xaa 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 14 Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Phe Leu Lys Leu 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 15 Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu 1 5 10 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 16 Leu Met Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 17 Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 18 Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu 1 5 <210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 19 Cys Ala Glu Thr Val Thr Asp Ser Trp Gly Lys Leu Gln Phe 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 20 Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu 1 5 10 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 21 Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala 1 5 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 22 Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 23 Gln Cys Leu Leu Gly Thr Phe Phe Thr Cys 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 24 His Ile Ile Leu Gly Leu Phe Gly Leu Leu 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 25 Asn Ile Ala Leu Gly Val Phe Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 26 Gln Leu Leu Leu Gly Gln Phe Thr Leu Leu 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 27 Leu Leu Leu Leu Gly Val Phe Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 28 Gln Ala Tyr Leu Ala Leu Phe Leu Lys Leu 1 5 10 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 29 Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val 1 5 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 30 Ala Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu 1 5 10 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 31 Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 10 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 32 Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val 1 5

Claims (40)

1. 면역 세포를 포함하는 조성물로서, 상기 세포는 조작된 서바이빈(survivin)-특이적인 T 세포 수용체를 포함하되, 상기 수용체는
   서열번호 1 또는 그의 작용성 단편 또는 작용성 유도체를 포함하는 상기 수용체의 알파 쇄; 및
   서열번호 2 또는 그의 작용성 단편 또는 작용성 유도체를 포함하는 상기 수용체의 베타 쇄 중 하나 또는 둘 다를 포함하는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포인, 면역 세포를 포함하는 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 세포가 T 세포 수용체가 아닌 항원 인식 모이어티를 포함하는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 항원 인식 모이어티가 키메릭(chimeric) 항원 수용체, 인게이거(engager) 분자, 또는 또 다른 T 세포 수용체인, 면역 세포를 포함하는 조성물.
5. 제3항에 있어서, 상기 항원 인식 모이어티가 서바이빈을 인식하는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
6. 제3항에 있어서, 상기 항원 인식 모이어티가 서바이빈이 아닌 종양 항원을 인식하는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 세포가 개체에 대해서 자가형(autologous)인, 면역 세포를 포함하는 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 세포가 개체에 대해서 동종이형(allogeneic)인, 면역 세포를 포함하는 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 작용성 단편이 상기 서열번호 1의 서열의 N-말단 절단부를 갖는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 N-말단 절단부가 상기 서열번호 1의 N-말단으로부터 절단된, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 그 초과의 아미노산을 갖는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
11. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 작용성 단편이 상기 서열번호 1의 서열의 C-말단 절단부를 갖는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 C-말단 절단부가 상기 서열번호 1의 C-말단으로부터 절단된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 그 초과의 아미노산을 갖는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
13. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 작용성 유도체가 서열번호 1과 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 97％, 98％, 또는 99％ 동일한, 면역 세포를 포함하는 조성물. 조성물.
14. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 2의 작용성 단편이 상기 서열번호 2의 서열의 N-말단 절단부를 갖는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
15. 제14항에 있어서, 상기 N-말단 절단부가 상기 서열번호 2의 N-말단으로부터 절단된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 그 초과의 아미노산을 갖는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
16. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 2의 작용성 단편이 상기 서열번호 2의 서열의 C-말단 절단부를 갖는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
17. 제16항에 있어서, 상기 C-말단 절단부가 상기 서열번호 2의 C-말단으로부터 절단된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 그 초과의 아미노산을 갖는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
18. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 2의 작용성 유도체가 서열번호 2와 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 97％, 98％, 또는 99％ 동일한, 면역 세포를 포함하는 조성물.
19. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 작용성 단편이 상기 서열번호 1의 서열의 N-말단 절단부 및 C-말단 절단부를 갖는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
20. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 2의 작용성 단편이 상기 서열번호 2의 서열의 N-말단 절단부 및 C-말단 절단부를 갖는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
21. 제1항에 있어서, 상기 세포가 자살 유전자 생성물을 발현하는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
22. 제1항에 있어서, 상기 수용체가 HLA-A2 제한형(restricted)인, 면역 세포를 포함하는 조성물.
23. 제1항에 있어서, 상기 수용체가 서열번호 15 또는 그의 작용성 단편 또는 그의 유도체를 포함하는 에피토프, 서열번호 16 또는 그의 작용성 단편 또는 그의 유도체를 포함하는 에피토프, 또는 둘 다로 이루어진 군으로부터 선택된 에피토프를 인식하는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
24. 제23항에 있어서, 상기 서열번호 15를 포함하는 에피토프의 상기 작용성 단편 또는 유도체가 서열번호 15와 70, 75, 77, 80, 85, 88, 90, 91, 91, 95, 97, 또는 99％ 동일한, 면역 세포를 포함하는 조성물.
25. 제23항에 있어서, 상기 서열번호 16을 포함하는 에피토프의 상기 작용성 단편 또는 유도체가 서열번호 16과 70, 75, 77, 80, 85, 88, 90, 91, 91, 95, 97, 또는 99％ 동일한, 면역 세포를 포함하는 조성물.
26. 제23항에 있어서, 상기 에피토프가 서열번호 15와 관련된 N-말단 연장부 또는 절단부를 포함하는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
27. 제26항에 있어서, 상기 N-말단 연장부 및/또는 C-말단 연장부가 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 또는 그 초과의 아미노산인, 면역 세포를 포함하는 조성물.
28. 제26항에 있어서, 상기 N-말단 절단부 및/또는 C-말단 절단부가 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 또는 그 초과의 아미노산인, 면역 세포를 포함하는 조성물.
29. 제23항에 있어서, 상기 에피토프가 서열번호 16과 관련된 N-말단 연장부 또는 절단부를 포함하는, 면역 세포를 포함하는 조성물.
30. 제29항에 있어서, 상기 N-말단 연장부 및/또는 C-말단 연장부가 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 또는 그 초과의 아미노산인, 면역 세포를 포함하는 조성물.
31. 제29항에 있어서, 상기 N-말단 절단부 및/또는 C-말단 절단부가 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 또는 그 초과의 아미노산인, 면역 세포를 포함하는 조성물.
32. 치료 유효량의 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 조성물을 개체에게 제공하는 단계를 포함하는, 세포 요법이 필요한 개체에게 세포 요법을 제공하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 개체가 서바이빈-양성 암을 갖는, 세포 요법을 제공하는 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 서바이빈-양성 암이 백혈병, 골수종, 유방암, 폐암, 결장암, 흑색종, 림프종, 난소암, 전립선암, 중추 신경계암, 또는 신장암인, 세포 요법을 제공하는 방법.
35. 제32항에 있어서, 상기 개체에게 부가적인 암 요법을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 세포 요법을 제공하는 방법.
36. 제35항에 있어서, 상기 부가적인 암 요법이 화학요법, 면역요법, 방사선, 수술, 또는 호르몬 요법인, 세포 요법을 제공하는 방법.
37. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 1과 서열번호 2의 조합, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 발현하는, 폴리뉴클레오타이드.
38. 제37항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 발현 벡터인, 폴리뉴클레오타이드.
39. 제37항 및 제38항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포.
40. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 조성물, 제37 및 제38항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 제39항의 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는 키트.

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