ES2804538T3

ES2804538T3 - Moléculas de unión de alta avidez que reconocen MAGE-A1

Info

Publication number: ES2804538T3
Application number: ES14702238T
Authority: ES
Inventors: Thomas Blankenstein; Matthias Obenaus; Catarina Leitao
Original assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Current assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2014-01-29
Publication date: 2021-02-08
Anticipated expiration: 2034-01-29
Also published as: CN105377886B; HK1218551A1; PT2951202T; PL2951202T3; US11447536B2; US20230025572A1; WO2014118236A3; JP2016505635A; US20190375816A1; HUE050390T2; US20150353622A1; CA2899679C; AU2014211454B2; SI2951202T1; AU2018204891B2; CN105377886A; AU2014211454A1; AU2018204891A1; WO2014118236A8; JP6639233B2

Abstract

Una construcción de reconocimiento de antígenos que es un receptor de células T (TCR), que comprende (i) una región variable de la cadena alfa con CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO: 40, 41 y 1 respectivamente; y que comprende (ii) una región variable de la cadena beta con CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO: 46, 47 y 4 respectivamente; en donde dicho TCR se une específicamente al antígeno MAGE-A1.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de unión de alta avidez que reconocen MAGE-A1

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas construcciones de alta avidez que reconocen antígenos de acuerdo con el conjunto de reivindicaciones adjuntas, que son receptores de células T y que se unen específicamente al antígeno asociado al melanoma A1 (MAGE). Las construcciones de la invención son particularmente útiles para el diagnóstico, prevención o terapia de enfermedades tumorales que se caracterizan por la expresión específica del antígeno MAGE-A1. Además, se proporcionan ácidos nucleicos, vectores y células huésped, tales como células T CD4 o CD8 positivas, que codifican, comprenden o presentan las construcciones de reconocimiento de antígenos de la invención. Por lo tanto, la invención proporciona nuevos medios para la inmunoterapia, específicamente la terapia de células T adoptivas, para tratar el cáncer.

Descripción

A pesar de los notables avances tecnológicos en el diagnóstico y las opciones de tratamiento disponibles para los pacientes diagnosticados con cáncer, el pronóstico a menudo se mantiene deficiente y muchos pacientes no pueden curarse. La inmunoterapia promete ofrecer un tratamiento potente, pero orientado, a pacientes diagnosticados con varios tumores, con el potencial de erradicar las células tumorales malignas sin dañar los tejidos normales. En teoría, las células T del sistema inmunitario son capaces de reconocer patrones de proteínas específicos para las células tumorales y mediar su destrucción, a través de una variedad de mecanismos efectores. La terapia con células T adoptivas es un intento de aprovechar y amplificar la capacidad de erradicación de tumores de las propias células T de un paciente, y después devolver estos efectores al paciente, en un estado tal, que eliminen eficazmente el tumor residual, sin dañar el tejido sano. Aunque este enfoque no es nuevo en el campo de la inmunología tumoral, aún existen muchos inconvenientes en el uso clínico de la terapia con células T adoptivas, que afectan el uso completo de este enfoque en los tratamientos contra el cáncer.

Un TCR es una proteína de superficie celular heterodimérica de la superfamilia de inmunoglobulinas que está asociada con proteínas invariantes del complejo CD3, implicadas en la transducción de señales mediadoras. Los TCR existen en formas ap y y§, que son estructuralmente similares, pero tienen ubicaciones anatómicas, y probablemente, funciones bastante distintas. La porción extracelular del TCRap heterodimérico nativo consiste en dos polipéptidos, cada uno de los cuales tiene un dominio constante proximal a la membrana y un dominio variable distal a la membrana. Cada uno de los dominios constantes y variables incluye un enlace disulfuro intracatenario. Los dominios variables contienen los bucles altamente polimórficos, análogos a las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los anticuerpos. El uso de la terapia génica con TCR supera una serie de obstáculos actuales. Permite equipar las propias células T de los pacientes con las especificidades deseadas, y generar un número suficiente de células T en un corto período de tiempo, lo que evita su agotamiento. El TCR se transducirá a células T de memoria central o células T con características de células madre, lo que puede garantizar una mejor persistencia y función tras la transferencia. Las células T con TCR diseñados genéticamente se infundirán en pacientes con cáncer que se vuelven linfopénicos por la quimioterapia o irradiación, lo que permite un injerto eficaz sin inhibición de la supresión inmunitaria. Los ratones transgénicos que expresan moléculas del MHC humano y un repertorio diverso de t Cr humanos sirven como una herramienta para analizar rápidamente si los antígenos peptídicos son inmunogénicos, es decir, ¿son procesados y presentados eficientemente por moléculas del MHC, inducen eficazmente respuestas de células T después de la inmunización? (Li y otros 2010 Nat Med). El concepto de terapia de células T adoptivas con el ratón ABaóDII publicado por Li y otros se muestra en la Figura 1.

En resumen, las células T CD8+ en los ratones ABaóDII albergan receptores de células T humanas (TCR) que reconocen los antígenos presentados por las moléculas del MHC humano de clase I. A diferencia de los humanos, los ratones ABaóDII no son tolerantes a los antígenos asociados a tumores humanos (TAA). Por lo tanto, cuando se vacunan con un TAA humano, los ratones ABaóDII generan una respuesta inmunitaria adaptativa eficaz contra esos antígenos extraños, que incluyen la expansión de células T específicas de antígenos con alta avidez (Figura 1, lado derecho). Después de la inmunización con un TAA humano adecuado, puede extraerse la información genética que codifica los TCR de alta avidez de los ratones ABaóDII (Figura 1, centro). Estos TCR pueden volverse a expresar posteriormente en células T de pacientes con tumor a través de la transducción retroviral. Esas células T reorientadas pueden transferirse nuevamente al paciente que lucha contra el tumor (Figura 1, lado izquierdo).

Mediante el uso del ratón transgénico para TCR humano, cualquier secuencia peptídica humana no codificada por el genoma del ratón es, por lo tanto, adecuada para la inmunización y producirá los TCR con afinidad óptima. La afinidad óptima significa que las células T se restringen a moléculas propias del MHC humano y reconocen al antígeno peptídico como extraño, por ejemplo, representan el repertorio no tolerante. Mediante el uso de péptidos/multímeros del MHC, pueden clasificarse células T específicas de los ratones transgénicos, aislar los TCR humanos, por ejemplo, mediante PCR de una sola célula, los TCR optimizados para una expresión eficaz mientras se evita el apareamiento incorrecto con TCR endógeno y se usan para la transducción de las células T de los pacientes con vectores virales (Uckert y otros 2008 Cancer Immunol Immunother; Kammertoens T y otros 2009 Eur J Immunol).

Se encontró que los genes del antígeno de melanoma (MAGE-A) se expresaban en una variedad de tumores de diferente origen histológico. Las proteínas codificadas por los genes MAGe son antígenos de rechazo tumoral, que pueden inducir linfocitos T citotóxicos específicos (CTL) que tienen la capacidad de reconocer y matar células cancerosas. Los genes y proteínas MAGE son, por lo tanto, un objetivo preferencial para el desarrollo de nuevos fármacos para combatir el cáncer mediante inmunoterapia. Las proteínas MAGE-A constituyen una subfamilia de antígenos del cáncer de testículos que se expresan principalmente, pero no exclusivamente, en la línea germinal. Sin embargo, se expresan además en varios cánceres humanos en los que están asociados y pueden provocar malignidad. Esta expresión específica de antígenos MAGE en tumores, y no en el tejido sano circundante normal, hace que esta familia de antígenos sea muy interesante para la transferencia orientada de células T adoptivas. Sin embargo, hasta la fecha no se conoce una inmunoterapia satisfactoria debido a la falta de anticuerpos específicos y altamente ávidos o receptores de células T que se orienten al antígeno MAGE.

Ottavani S. y otros, 2005 (CANCER IMMUNOLOGY, IMMUNOTHERAPY: CII, (2005), vol. 54, no. 12, páginas 1214 -1220) describen clones de linfocitos T citotóxicos (CTL) que tienen especificidad para un péptido antigénico de Mage A1 restringido por HLA-A*0201.

En vista de los principales inconvenientes descritos anteriormente en la técnica anterior, el objetivo de la presente invención es proporcionar nuevas construcciones de reconocimiento de antígenos con alta avidez y especificidad, contra el antígeno de MAGE-A. Además, la presente invención pretende proporcionar nuevos métodos que permitan la producción de tales construcciones. En términos más generales, la invención busca proporcionar medios novedosos para la inmunoterapia del cáncer.

El problema anterior se resuelve en un primer aspecto mediante una construcción de reconocimiento de antígenos que es un receptor de células T (TCR), que comprende (i) una región variable de la cadena alfa con CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO: 40, 41 y 1 respectivamente; y que comprende (ii) una región variable de la cadena beta con CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO: 46, 47 y 4 respectivamente; en donde dicho TCR se une específicamente al antígeno de MAGE-A1. Sorprendentemente se descubrió que los TCR proporcionados en los ejemplos de la presente invención son muy ávidos en comparación con los TCR del estado de la técnica, dirigidos a antígenos de MAGE.

En el contexto de la invención, se prefiere además que la construcción de reconocimiento de antígenos comprenda además un elemento V seleccionado de TRAV5, TRAV13-1, TRAV12-3, TRBV28, TRBV29-1, TRBV13, TRBV20, TRBV12, y/o un elemento J seleccionado de TRAJ41, TRAJ29, TRAJ31, TRAJ49, TRAJ34, TRBJ2-7, TRBJ2-2, TRBJ2-6, TRBJ7, TRBJ1-2; preferentemente en la combinación como se representa en la tabla 1.

La construcción de reconocimiento de antígenos de acuerdo con la invención es específica y/o se une específicamente a un antígeno de MAGE-A1. Se conoce que varias proteínas forman parte de la familia MAGE, que incluye además algunos pseudogenes. Una región de homología compartida por todos los miembros de la familia MAGE es un tramo de aproximadamente 200 aminoácidos que se ha denominado dominio conservado de MAGE. El dominio conservado de MAGE generalmente se encuentra cerca del terminal C, aunque puede encontrarse además en una posición más central en algunas proteínas. El dominio conservado de MAGE generalmente está presente como una copia única, pero está duplicado en algunas proteínas. Los genes MAGE que son detectables por las construcciones de reconocimiento de antígenos de la invención se seleccionan de MAGE-B1, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-A2B, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B18, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B6B, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGE-L2, NDN, NDNL2. Se prefieren en el contexto de la presente invención las 12 proteínas MAGE homólogas seleccionadas de MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 o MAGE-A12.

Los términos "especificidad" o "especificidad de antígeno" o "específico para" de un antígeno dado, como se usan en la presente descripción significan que la construcción de reconocimiento de antígenos puede unirse específicamente y reconocer inmunológicamente a dicho antígeno MAGE-A1, con mayor preferencia con alta avidez. Por ejemplo, puede considerarse que un TCR tiene "especificidad antigénica" para MAGE-A1 si las células T que expresan el TCR secretan al menos aproximadamente 200 pg/ml o más (por ejemplo, 250 pg/ml o más, 300 pg/ml o más, 400 pg/ml o más, 500 pg/ml o más, 600 pg/ml o más, 700 pg/ml o más, 1000 pg/ml o más, 2000 pg/ml o más, 2500 pg/ml o más, 5000 pg/ml o más) de interferón y (IFN-y) después del cocultivo con células diana pulsadas con una baja concentración de un péptido MAGE, como el péptido MAGE-A1278-286 restringido a MAGE-A1 HLA-A02 (por ejemplo, aproximadamente 10'11 mol/l, 10'10 mol/l, 10'9 mol/l, 10'8 mol/l, 10'7 mol/l, 10'6 mol/l, 10'5 mol/l). Alternativa o adicionalmente, puede considerarse que un TCR tiene "especificidad antigénica" para MAGE-A1 si las células T que expresan el TCR secretan al menos el doble de IFN-y que el nivel de fondo sin transducir de IFN-y en el cocultivo con células diana pulsado con una baja concentración de MAGE-A1 restringido por HLA-A02. Una "especificidad" tal, como se describió anteriormente, puede, por ejemplo, analizarse con un ELISA.

Los TCR heterodiméricos alfa-beta nativos tienen una cadena alfa y una cadena beta. Cada cadena comprende regiones variables, de unión y constantes, y la cadena beta, además usualmente, contiene una región de diversidad corta entre las regiones variables y de unión, pero esta región de diversidad a menudo se considera parte de la región de unión. Cada región variable comprende tres CDR (regiones determinantes de la complementariedad) integradas en una secuencia marco, una de las cuales es la región hipervariable denominada CDR3. Existen varios tipos de regiones variables de la cadena alfa (Va) y varios tipos de regiones variables de la cadena beta (Vp) que se distinguen por su marco, las secuencias CDR1 y CDR2, y por una secuencia CDR3 parcialmente definida. Los tipos Va se mencionan en la nomenclatura de IMGT por un número TRAV único.

Las regiones CDR 1 y CDR2 de los respectivos tipos Va y Vp conocidos están de acuerdo con la base de datos IMGT:

TRAV5: CDR1 DSSSTY (SEQ ID NO: 40), CDR2: IFSNMDM (SEQ ID NO: 41)

TRAV13-1 CDR1 DSASNY (SEQ ID NO: 42), CDR2: IRSNVGE (SEQ ID NO: 43)

TRAV12-3 CDR1 NSAFQY (SEQ ID NO: 44), CDR2: TYSSGN (SEQ ID NO: 45)

TRBV28: CDR1 MDHEN (SEQ ID NO: 46), CDR2: SYDVKM (SEQ ID NO: 47).

TRBV29-1: CDR1 SQVTM (SEQ ID NO: 48), CDR2: ANQGSEA (SEQ ID NO: 49)

TRBV13: CDR1 PRHDT (SEQ ID NO: 50), CDR2: FYEKMQ (SEQ ID NO: 51).

Para los fines de la presente invención, un TCR es una porción que tiene al menos un dominio variable TCR alfa y/o TCR beta. Generalmente comprenden tanto un dominio variable TCR alfa como un dominio variable TCR beta. Pueden ser heterodímeros ap o pueden tener formato de una sola cadena. Para usar en terapia adoptiva, un TCR heterodimérico ap puede, por ejemplo, transfectarse como cadenas de longitud completa que tienen dominios tanto citoplasmáticos como transmembrana. Si se desea, puede estar presente un enlace disulfuro introducido entre los residuos de los dominios constantes respectivos.

Las SEQ ID NO: 13 a 21 representan las secuencias de nucleótidos de los mapas vectoriales de las figuras 8 a 16. Cada uno de estos vectores comprende una cadena alfa y una cadena beta de un TCR de la presente invención. En las figuras, la cadena beta se encuentra aguas arriba de la secuencia de la cadena alfa. Como se describe además más abajo, el ejemplo de la invención describe tres TCR aislados, que se optimizaron en diferentes grados mediante la murinización de la secuencia original del dominio constante de las cadenas de TCR. La abreviatura en la designación del vector "hc" representa la variante humana completa del TCR, "mc" para un dominio constante murinizado completo en la cadena de TCR, mientras que "mmc" representa la murinización mínima en el dominio constante de la cadena de TCR. La ubicación exacta de las cadenas alfa y beta en los mapas vectoriales (y, por lo tanto, en las secuencias correspondientes) puede derivarse de la leyenda de la figura.

En una modalidad preferida adicional del primer aspecto de la invención, la construcción de reconocimiento de antígenos es como se describió anteriormente un TCR. El TCR comprende, preferentemente, al menos una cadena de TCR alfa y/o beta, en donde dicha cadena de TCR comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las cadenas de TCR mostradas en las SEQ ID NO: 22-25, 34 o 35, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 22 a 25, 34 o 35.

Un scTCR puede comprender un polipéptido de una región variable de una primera cadena de TCR (por ejemplo, una cadena alfa) y un polipéptido de una segunda cadena de TCR completa (de longitud completa) (por ejemplo, una cadena beta), o viceversa. Además, el scTCR puede comprender opcionalmente uno o más conectores que unen los dos o más polipéptidos juntos. El conector puede ser, por ejemplo, un péptido que une dos cadenas individuales, como se describe en la presente descripción.

Además, se proporciona un scTCR tal de la invención, que se fusiona con una citocina humana, tales como IL-2, IL-7 o IL-15.

La construcción de reconocimiento de antígenos de acuerdo con la invención puede proporcionarse además en forma de un complejo multimérico, que comprende al menos dos moléculas de scTCR, en donde dichas moléculas de scTCR se fusionan al menos a una porción de biotina, y en donde dichos scTCR están interconectados por la interacción biotina-estreptavidina para permitir la formación de dicho complejo multimérico. Además, se proporcionan complejos multiméricos de un orden superior, que comprenden más de dos scTCR de la invención.

En una modalidad de la invención, la construcción de reconocimiento de antígenos se une a un péptido de MAGE, presentado por el antígeno leucocitario humano (HLA), preferentemente por HLA-A02. En una modalidad preferida, la construcción de reconocimiento de antígenos se une específicamente al epítopo humano MAGE-A1278-286.

En una modalidad preferida, la construcción que reconoce el antígeno es un TCR humano, o fragmento o derivado del mismo. Un TCR humano o fragmento o derivado del mismo es un TCR que comprende más de 50 % de la secuencia de TCR humano correspondiente. Preferentemente, solo una pequeña parte de la secuencia de TCR es de origen artificial o derivada de otras especies. Sin embargo, se conoce que los TCR quiméricos, por ejemplo, de origen humano con secuencias murinas en los dominios constantes, son ventajosos. Por lo tanto, son particularmente preferidos los TCR de acuerdo con la presente invención, que contienen secuencias murinas en la parte extracelular de sus dominios constantes.

Por lo tanto, se prefiere además que la construcción de reconocimiento de antígenos de la invención sea capaz de reconocer su antígeno de una manera dependiente de antígeno leucocitario humano (HLA), preferentemente de una manera dependiente de HLA-A02. El término "manera dependiente de HLA" en el contexto de la presente invención significa que la construcción de reconocimiento de antígenos se une al antígeno solo en el caso de que HLA presente el péptido antigénico.

La construcción de reconocimiento de antígenos de acuerdo con la invención en una modalidad preferentemente induce una respuesta inmunitaria, preferentemente, en donde la respuesta inmunitaria se caracteriza por el aumento en los niveles de interferón (IFN) y.

Además, se prefiere que la construcción de reconocimiento de antígenos de la invención, que es un receptor de células T, comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga al menos 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 22 a 25, y 34, 35. Particularmente se prefieren los TCR que tienen al menos 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con un TCR seleccionado de TCR1367hc, TCR1367mc o TCR1367mmc. Lo más preferido es un TCR seleccionado del grupo que consiste en TCR1367hc, TCR1367mc o TCR1367mmc. Las secuencias de aminoácidos de los TCR de la invención mencionadas anteriormente se representan en las SEQ ID NO: 22 a 25 y 34, 35.

La construcción de reconocimiento de antígenos de acuerdo con la invención son los TCR de alta avidez.

El problema de la invención se resuelve en otro aspecto al proporcionar un ácido nucleico que codifica una construcción de reconocimiento de antígenos de acuerdo con la presente invención. El ácido nucleico preferentemente (a) tiene una cadena que codifica una construcción que reconoce el antígeno de acuerdo con la invención; (b) tiene una cadena complementaria a la cadena en (a); o (c) tiene una cadena que se hibrida en condiciones rigurosas con una molécula como se describe en (a) o (b). El experto en la técnica conoce condiciones rigurosas, específicamente de Sambrook y otros, "Molecular Cloning". Adicionalmente a eso, el ácido nucleico opcionalmente tiene secuencias adicionales que son necesarias para expresar la secuencia de ácido nucleico correspondiente a la proteína, específicamente para la expresión en una célula de mamífero/humano. El ácido nucleico usado puede estar contenido en un vector adecuado para permitir la expresión de la secuencia de ácido nucleico correspondiente al péptido en una célula. Sin embargo, los ácidos nucleicos pueden usarse además para transformar una célula presentadora, que no se limitará a las células presentadoras de antígenos clásicas, tal como las células dendríticas, de tal manera que ellas mismas produzcan las proteínas correspondientes en su superficie celular.

Por "ácido nucleico" como se usa en la presente descripción se incluye "polinucleótido", "oligonucleótido" y "molécula de ácido nucleico", y generalmente, significa un polímero de ADN o ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado u obtenido (por ejemplo, aislado y/o purificado) de fuentes naturales, que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que pueden contener un enlace internucleotídico natural, no natural o alterado, tal como un enlace fosfoamidato o un enlace fosforotioato, en lugar del fosfodiéster encontrado entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado.

Preferentemente, los ácidos nucleicos de la invención son recombinantes. Como se usa en la presente descripción, el término "recombinante" se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de las células vivas mediante unión de segmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos, a moléculas de ácido nucleico que pueden replicarse en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de los descritos en (i) anteriormente. Para los fines de la presente descripción, la replicación puede ser replicación in vitro o replicación in vivo. El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que codifique cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas, o porciones funcionales o variantes funcionales de los mismos descritos en la presente descripción.

Además, la invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención como se describió anteriormente. Convenientemente, el vector es un vector de expresión o un vector de expresión recombinante. El término "vector de expresión recombinante" se refiere en el contexto de la presente invención a una construcción de ácido nucleico que permite la expresión de un ARNm, proteína o polipéptido en una célula huésped adecuada. El vector de expresión recombinante de la invención puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado, y puede usarse para transformar o transfectar cualquier huésped adecuado. Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para propagación y expansión o para expresión o ambos, tales como plásmidos y virus. Los ejemplos de vectores de expresión en animales incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo. Preferentemente, el vector de expresión recombinante es un vector viral, por ejemplo, un vector retroviral. El vector de expresión recombinante comprende secuencias reguladoras, tales como los codones de iniciación y terminación de la transcripción y traducción, que son específicos del tipo de célula huésped (por ejemplo, bacteria, hongo, planta o animal) en el que se va a introducir el vector y en el que se realizará la expresión del ácido nucleico de la invención. Además, el vector de la invención puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de huéspedes transformados o transfectados. El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor nativo o normativo unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica las construcciones de la invención, o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria o que se hibrida con la secuencia de nucleótidos que codifica las construcciones de la invención. La selección de promotores incluye, por ejemplo, promotores fuertes, débiles, inducibles, específicos de tejido y específicos del desarrollo. El promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral. Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse para la expresión transitoria, para expresión estable o para ambas. Además, los vectores de expresión recombinantes pueden prepararse para expresión constitutiva o para expresión inducible.

La invención se refiere además a una célula huésped que comprende una construcción que reconoce el antígeno de acuerdo con la invención. Específicamente, la célula huésped de la invención comprende un ácido nucleico, o un vector como se describió anteriormente en la presente descripción. La célula huésped puede ser una célula eucariota, por ejemplo, de plantas, animales, hongos o algas, o puede ser una célula procariota, por ejemplo, bacterias o protozoos. La célula huésped puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, por ejemplo, un ser humano. La célula huésped puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. Para los propósitos de producir un TCR, polipéptido o proteína recombinante, la célula huésped es, preferentemente, una célula de mamífero. Con mayor preferencia, la célula huésped es una célula humana. Si bien la célula huésped puede ser de cualquier tipo de célula, puede originarse de cualquier tipo de tejido y puede ser de cualquier etapa de desarrollo, la célula huésped es, preferentemente, un leucocito de sangre periférica (PBL) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMc ). Con mayor preferencia, la célula huésped es una célula T. La célula T puede ser cualquier célula T, tal como una célula T cultivada, por ejemplo, una célula T primaria, o una célula T de una línea de células T cultivadas, por ejemplo, Jurkat, SupTl, etc., o una célula T obtenida de un mamífero, preferentemente un precursor de células T o células T de un paciente humano. Si se obtiene de un mamífero, la célula T puede obtenerse de numerosas fuentes, que incluyen, entre otras, sangre, médula ósea, ganglios linfáticos, el timo u otros tejidos o fluidos. Las células T además pueden enriquecerse o purificarse. Preferentemente, la célula T es una célula T humana. Con mayor preferencia, la célula T es una célula T aislada de un ser humano. La célula T puede ser cualquier tipo de célula T y puede ser de cualquier etapa de desarrollo, que incluye, pero sin limitarse a, células T CD4 positivas y/o CD8 positivas, auxiliares CD4 positivas, por ejemplo, células Th1 y Th2, células T CD8 positivas (por ejemplo, células T citotóxicas), células infiltrantes de tumores (TIL), células T de memoria, células T indiferenciadas y similares. Preferentemente, la célula T es una célula T CD8 positiva o una célula T CD4 positiva.

Preferentemente, la célula huésped de la invención es un linfocito, preferentemente, un linfocito T, tal como una célula T CD4 o CD8 positiva. Además, la célula huésped es, preferentemente, una célula T reactiva a tumores específica para células tumorales que expresan MAGE-A1.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a las construcciones de reconocimiento de antígenos, ácidos nucleicos, vectores y/o células huésped descritas en la presente descripción para uso en medicina. El uso en medicina en una modalidad preferida incluye el uso en el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de una enfermedad proliferativa, tal como una enfermedad tumoral maligna o benigna.

Por lo tanto, se describe además por la presente invención un método para tratar a un sujeto que padece un tumor o enfermedad tumoral que comprende la administración de construcciones que reconocen antígenos, ácidos nucleicos, vectores y/o células huésped como se describe por la presente invención. Preferentemente, el sujeto es un sujeto que necesita tal tratamiento. El sujeto en las modalidades preferidas es un sujeto mamífero, preferentemente un paciente humano, que padece un tumor o enfermedad tumoral.

En un aspecto preferido de la invención, el tumor o enfermedad tumoral es una enfermedad caracterizada por la expresión de un antígeno de MAGE como se describió anteriormente en la presente descripción. Con mayor preferencia, el tumor o la enfermedad tumoral expresa el antígeno de MAGE-A1, incluso con mayor preferencia, en donde el tumor o la enfermedad tumoral presenta el epítopo MAGE-A1278-286 a través de HLA. Aún más preferido es que el tumor o la enfermedad tumoral se caracterice por la expresión diferencial del antígeno de MAGE-A1 en comparación con el tejido sano. El antígeno de MAGE-A1 puede expresarse en una extensión baja en células normales (no cancerosas), mientras que el antígeno se expresa significativamente más fuerte en las células tumorales.

Además, en un aspecto preferido de la invención, la expresión de MAGE-A1 en el tumor es inducida o potenciada por un tratamiento farmacológico previo, por ejemplo, con 5-aza-2-desoxicitabina.

El término "tumor" o "enfermedad tumoral" en el contexto de la presente invención denota una enfermedad seleccionada de melanomas, carcinomas hepatocelulares, carcinomas colangiocelulares intra y extrahepáticos, carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, así como también, carcinomas indiferenciados de cabeza, cuello, pulmón o esófago, carcinomas colorrectales, condrosarcomas, osteosarcomas, meduloblastomas, neuroblastomas, carcinomas de células no escamosas de cabeza o cuello, tumores de ovario, linfomas, leucemias linfocíticas agudas y crónicas, leucemia mieloide aguda y crónica, carcinomas de vejiga, carcinomas de próstata, adenocarcinomas pancreáticos, carcinomas mamarios y carcinomas gástricos. Las enfermedades preferidas para ser tratadas por los productos y/o métodos de la invención incluyen melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma pancreático y carcinoma colangiocelular.

Un uso medicinal preferido de la invención se relaciona con la inmunoterapia, preferentemente la terapia con células T adoptivas. El producto y los métodos de la invención son particularmente útiles en el contexto de la terapia con células T adoptivas. La administración de los compuestos de la invención puede implicar, por ejemplo, la infusión de células T de la invención en dicho paciente. Preferentemente, tales células T son células T autólogas del paciente que se transdujeron in vitro con un ácido nucleico o construcciones de reconocimiento de antígenos de la presente invención.

La invención, en otro aspecto, describe un método para la fabricación de una línea celular que expresa la construcción de reconocimiento de antígenos (ARC) específica de MAGE-A1, la ARC que es un receptor de células T (TCR), que comprende:

a. Proporcionar una célula huésped adecuada,

b. Proporcionar una construcción genética que codifica una ARC de acuerdo con la invención,

c. Introducir en dicha célula huésped adecuada dicha construcción genética,

d. Expresar dicha construcción genética por dicha célula huésped adecuada.

El método anterior puede en una modalidad preferida comprender además la etapa de incluir una presentación en la superficie celular de dicha ARC.

Por supuesto, es que, en el contexto de este aspecto de la invención, dicha ARC es una ARC de acuerdo con los aspectos de la invención descritos anteriormente en la presente descripción. Con respecto a esto, además se prefiere adicional o alternativamente que dicha ARC sea de origen de mamífero, preferentemente de origen humano.

La célula huésped adecuada preferida para usar en el método de la invención es de un mamífero, en particular una célula humana, tal como una célula T humana. Las células T para uso en la invención se describieron anteriormente en detalle, en la presente descripción.

La ARC producida de acuerdo con el método de la invención es un TCR. Por ejemplo, se incluyen además TCR con dominios adicionales (funcionales) o un TCR provisto de dominios alternativos, por ejemplo, un TCR provisto de un dominio transmembrana foráneo como ancla de membrana. Un TCR producido de acuerdo con la presente invención es, por ejemplo, un TCR alfa/beta, TCR gamma/delta o un TCR de cadena sencilla (scTCR). Además, las formas de TCR que se incluyen en la presente invención son generalmente cualquier TCR conocido en la técnica, específicamente los descritos anteriormente en la presente descripción.

Convenientemente, el sistema de transfección para usar en el método de acuerdo con la invención es un sistema de vector retroviral. Tales sistemas son bien conocidos por los expertos en la técnica.

La presente invención comprende además en una modalidad la etapa adicional del método de purificación de la ARC a partir de la célula y, opcionalmente, la reconstitución de los fragmentos de la ARC traducidos en una célula T.

Además, se describe una célula T obtenida u obtenible por un método para la producción de un receptor de células T (TCR), que es específico para células tumorales y tiene una gran avidez como se describió anteriormente en la presente descripción. Dicha célula T es dependiente de la célula huésped usada en el método de la invención, por ejemplo, una célula T humana o no humana, preferentemente un TCR humano.

Por lo tanto, se proporciona además una composición farmacéutica, que comprende cualquiera de los productos de la invención descritos en la presente descripción, específicamente cualquier proteína, ácido nucleico o célula huésped. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica es para inmunoterapia.

Los ejemplos de portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables útiles en la presente invención incluyen estabilizadores tales como SPGA, carbohidratos (por ejemplo, sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano), proteínas como albúmina o caseína, agentes que contienen proteínas como suero bovino o leche descremada y tampones (por ejemplo, tampón fosfato).

La presente invención se describirá ahora aún más en los siguientes ejemplos con referencia a las figuras y secuencias adjuntas, sin embargo, sin limitarse a las mismas. Para los fines de la presente invención, todas las referencias citadas en la presente descripción se incorporan como referencia en su totalidad. En las figuras y secuencias:

Figura 1: muestra el concepto de terapia con células T adoptivas

Figura 2: muestra el MAGE-A1 y su localización del epítopo

Figura 3: muestra la respuesta inmunitaria contra MAGE-A1 en ratones ABaóDII

Figura 4: muestra una representación esquemática de los vectores del TCR

Figura 5: muestra los resultados de FACS de células Jurkat 76 transducidas con TCR

Figura 6: muestra la avidez funcional de las células T específicas de MAGE-A1

Figura 7: muestra el reconocimiento de células tumorales de MAGE-A1 por células T transducidas con los TCR específicos de MAGE-A1 de la invención.

Figura 8: Mapa vectorial de pMP71-TCR1367hc. La secuencia de codificación de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 2864 de la SEQ ID NO: 13. La cadena beta de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 1970, la cadena alfa entre 2037 y 2864.

Figura 9: Mapa vectorial de pMP71-TCR1367mc. La secuencia de codificación de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 2834 de la SEQ ID NO: 14. La cadena beta de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 1952, la cadena alfa entre 2019 y 2834.

Figura 10: Mapa vectorial de pMP71-TCR1367mmc. La secuencia de codificación de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 2864 de la SEQ ID NO: 15. La cadena beta de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 1970, la cadena alfa entre 2037 y 2864.

Figura 11: Mapa vectorial de pMP71-TCR1405hc. La secuencia de codificación de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 2855 de la SEQ ID NO: 16. La cadena beta de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 1967, la cadena alfa entre 2034 y 2855.

Figura 12: Mapa vectorial de pMP71-TCR1405mc. La secuencia de codificación de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 2825 de la SEQ ID NO: 17. La cadena beta de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 1949, la cadena alfa entre 2016 y 2825.

Figura 13: Mapa vectorial de pMP71-TCR1405mmc. La secuencia de codificación de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 2854 de la SEQ ID NO: 18. La cadena beta de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 1967, la cadena alfa entre 2034 y 2854.

Figura 14: Mapa vectorial de pMP71-TCR1705hc. La secuencia de codificación de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 2894 de la SEQ ID NO: 19. La cadena beta de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 2006, la cadena alfa entre 2073 y 2894.

Figura 15: Mapa vectorial de pMP71-TCR1705mc. La secuencia de codificación de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 2864 de la SEQ ID NO: 20. La cadena beta de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 1988, la cadena alfa entre 2055 y 2864.

Figura 16: Mapa vectorial de pMP71-TCR1705mmc. La secuencia de codificación de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 2894 de la s Eq ID No. 21. La cadena beta de TCR se encuentra entre los nucleótidos 1041 y 2006, la cadena alfa entre 2073 y 2894.

Figura 17: Las células T2 se incubaron con concentraciones crecientes de MAGE-A1278 y se cocultivaron con células T humanas que se habían transducido con diferentes TCR como se indica. Después de 12 horas, se evaluó la respuesta funcional mediante medición de IFNy en los cultivos.

Figura 18: Las células T2 se cargaron con 10-5 mol/l de MAGE-A1278 o los 2 epítopos más similares en el proteoma humano (MAGE-B16 y MAGE-B5) que diferían en solo 2 aminoácidos de MAGE-A1278 y se cultivaron conjuntamente con células T con TCR modificado. La respuesta funcional se evaluó en función de la producción de IFNy.

Figura 19: Las células T2 se cargaron con uno de 114 péptidos propios restringidos por HLA-A2 diferentes, a una concentración de 10-5 mol/l y se cultivaron conjuntamente con células T de 2 donantes diferentes que se transdujeron con TCR 1367. Los resultados del donante 1 se muestran como puntos negros, los resultados del donante 2 por puntos blancos.

SEQ ID NO: 1 a 6: muestra secuencias de CDR3 alfa y beta de los TCR de la invención.

SEQ ID NO: 7 a 10: muestra secuencias de CDR3 de cadena alfa y beta de humanos sanos.

SEQ ID NO: 11 a 12: muestra las secuencias de epítopos de MAGE-A1 humano (11) y de ratón (12).

SEQ ID NO: 13 a 21: muestra las secuencias de nucleótidos del vector de las figuras 8 a 16.

SEQ ID NO: 22 a 39: muestra las secuencias de aminoácidos completas de las cadenas alfa y beta de los TCR de la invención

SEQ ID NO: 40 a 51: muestra las secuencias de CDR1 y CDR2 alfa y beta de los genes Va y Vp.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de células T con un epítopo MAGE mediante el uso del ratón ABadDII

La figura 2 muestra la ubicación del epítopo restringido por HLA-A2 MAGE-A1278-286 en relación con la proteína MAGE-A1 de longitud completa (parte superior). El epítopo MAGE-A1278-286 humano es suficientemente diferente de su homólogo de ratón para evitar la tolerancia contra MAGE-A1278-286 humano en ratones ABadDII (parte inferior).

MAGE-A1 se expresa en una variedad de tumores humanos, mientras que se cree que su expresión en tejido humano normal está restringida a los testículos. Por lo tanto, la orientación específica de las células que expresan MAGE-A1 debería limitar la toxicidad al mínimo.

Los ratones ABadDII se inmunizaron con un péptido 30mer que abarca el MAGE-A1278-286 más CpG en adyuvante de Freund incompleto. Los refuerzos se realizaron con el nonámero MAGE-A^1278-286más CpG en adyuvante de Freund incompleto. El día del análisis, se extrajo sangre y se tiñó con un tetrámero específico MAGE-A1/HLA-A2 y con anticuerpos para ciertas cadenas TRBV (nomenclatura de IMGT). Después de varios refuerzos, se detecta una población monoclonal de células T específicas de MAGE-A1 en la sangre de ratones ABaóDII. La Figura 3 muestra la respuesta inmunitaria del animal inmunizado y el esquema de inmunización. Se observa un cambio significativo en el análisis de FACS de las células inmunizadas con la tinción del tetrámero que indica que se generaron células T específicas de MAGE.

Ejemplo 2: Aislamiento y caracterización de receptores de células T

El ADNc de los clones de células T específicas de MAGE-A1 como se generó en el Ejemplo 1, se amplificó por 5'-RACE y se secuenció.

La tabla 1 muestra las secuencias de aminoácidos de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) de las cadenas alfa y beta para tres TCR diferentes de ratones ABaóDII y dos TCR obtenidos de humanos sanos (Ottaviani, S., Zhang, Y., Boon, T., y van der Bruggen, P. (2005). Un péptido antigénico MAGE-1 reconocido por linfocitos T citolíticos humanos en células tumorales HLA-A2. Cancer Immunology, Immunotherapy: CII, 54 (12), 1214-1220J.

Tabla 1: Secuencias de aminoácidos de las regiones CDR3 para tres diferentes TCR específicos de MAGE-A1.

El TCR aislado que comprende las secuencias CDR3 anteriores después se clonó. El vector retroviral MP71 se usa para la transducción de linfocitos primarios de sangre periférica humana (hPBL). Los genes alfa y beta de cada TCR se unen con un elemento P2A que se corta por una proteasa celular durante la traducción del TCR transducido lo que asegura la expresión equimolar de ambas cadenas (Figura 4).

Todos los genes son codones optimizados para una expresión óptima. Con el fin de optimizar aún más la expresión en hPBL, se introdujeron modificaciones adicionales en las regiones constantes del TCR de tipo salvaje. La murinización completa (A) y mínima (B) de las regiones constantes de las cadenas del TCR usualmente produce niveles de expresión más altos en hPBL que la región constante humana no modificada (C).

Después, las células Jurkat 76 hCD8+ se transdujeron con diferentes TCR derivados de ratones ABaóDII y voluntarios humanos. Las células transducidas se tiñen positivamente para CD3. Todas las células transducidas se unen específicamente al tetrámero MAGE-A1/HLA-A2 (Figura 5).

Sorprendentemente, los TCR de la presente invención proporcionan una avidez inusualmente alta en comparación con los TCR del estado de la técnica. Los hPBL se transdujeron con diferentes TCR específicos de MAGE-A1. Los PBL transducidos se incubaron después con células T2, que habían sido pulsadas con diferentes concentraciones de péptido MAGE-A1278-286. Después de la incubación durante la noche, se midió la producción de IFNy por ELISA.

En respuesta a la estimulación con células T2 pulsadas con péptidos, los TCR de los ratones ABaóDII (Figura 6, círculos cerrados) muestran una respuesta a concentraciones peptídicas más bajas y una mayor cantidad de producción de IFNy que los TCR derivados del sistema humano tolerante (Figura 6, círculos abiertos).

Esto se confirmó adicionalmente mediante prueba del reconocimiento de células tumorales mediante el uso de los TCR de la invención (Figura 7). Los hBL transducidos se incubaron con diferentes líneas celulares tumorales. Después de la incubación durante la noche, se midió la producción de IFNy por ELISA. Los hPBL transducidos reconocen específicamente MAGE-A1 en el contexto de la presentación restringida de HLA-A2. Los PBL transducidos con TCR

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una construcción de reconocimiento de antígenos que es un receptor de células T (TCR), que comprende (i) una región variable de la cadena alfa con CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO: 40, 41 y 1 respectivamente; y que comprende (ii) una región variable de la cadena beta con CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO: 46, 47 y 4 respectivamente; en donde dicho TCR se une específicamente al antígeno MAGE-A1.

2. La construcción de reconocimiento de antígenos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha construcción de reconocimiento de antígenos induce una respuesta inmunitaria.

3. La construcción de reconocimiento de antígenos de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende el elemento variable de la cadena alfa TRAV5-CAESIGSNSGYALNF-TRAJ41 y el elemento variable de la cadena beta: TRBV28-CASRGLAGYEQYF-TRBJ2-7.

4. La construcción de reconocimiento de antígenos de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende una cadena alfa que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 22 o 24; y que comprende una cadena beta que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 23 o 25.

5. Un ácido nucleico que codifica una construcción de reconocimiento de antígenos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Una célula huésped que comprende una construcción de reconocimiento de antígenos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, o un vector de acuerdo con la reivindicación 6.

8. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 7, que es un linfocito T.

9. La construcción de reconocimiento de antígenos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, o el vector de acuerdo con la reivindicación 6, o la célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, para uso en medicina.

10. La construcción de reconocimiento de antígenos, o el ácido nucleico, o el vector, o la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9, para uso en el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de una enfermedad tumoral maligna o benigna.

11. La construcción de reconocimiento de antígenos, o el ácido nucleico, o el vector, o la célula huésped para el uso de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en donde el uso en medicina es un uso en inmunoterapia.

12. Un método para la fabricación de una línea celular que expresa la construcción de reconocimiento de antígenos (ARC) específica de MAGE-A1, la ARC que es un receptor de células T (TCR), que comprende

a. Proporcionar una célula huésped adecuada,

b. Proporcionar una construcción genética que codifica para una ARC de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,

c. Introducir en dicha célula huésped adecuada dicha construcción genética,

d. Expresar dicha construcción genética por dicha célula huésped adecuada.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende además la purificación de la ARC a partir de la célula.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende además la reconstitución de los fragmentos de la ARC traducidos en una célula T.