ES2968802T3 - Células T transfectadas y receptores de células T para su uso en inmunoterapia contra el cáncer - Google Patents

Células T transfectadas y receptores de células T para su uso en inmunoterapia contra el cáncer Download PDF

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Abstract

La presente descripción se refiere a receptores de células T (TCR) que se unen a antígenos asociados a tumores (TAA) para dirigirse a células cancerosas, células T que los expresan, métodos para producirlos y métodos para tratar cánceres que los utilizan. En particular, la presente descripción se refiere a TCR y sus variantes que se unen a moléculas HLA de clase I o II con un péptido, tal como MAG-003 que tiene la secuencia de aminoácidos de KVLEHVVRV (SEQ ID NO:1). La presente descripción se refiere además a péptidos, proteínas, ácidos nucleicos y células para uso en métodos inmunoterapéuticos. En particular, la presente descripción se refiere a la inmunoterapia del cáncer. La presente descripción se refiere además a epítopos peptídicos de células T asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores que pueden servir, por ejemplo, como ingredientes farmacéuticos activos de composiciones de vacunas que estimulan respuestas inmunitarias antitumorales, o para estimular células T asociadas a tumores. células ex vivo y transferencia a pacientes. Los péptidos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), o péptidos como tales, también pueden ser objetivos de anticuerpos, receptores de células T solubles y otras moléculas de unión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Células T transfectadas y receptores de células T para su uso en inmunoterapia contra el cáncer
Antecedentes
La inmunoterapia basada en células T se dirige a epítopos peptídicos derivados de proteínas asociadas a tumores o específicas de tumores, que se presentan mediante moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Estos antígenos asociados a tumores (TAAs) pueden ser péptidos derivados de todas las clases de proteínas, tales como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc., que se expresan y, en comparación con células inalteradas del mismo origen, normalmente están regulados positivamente en células del respectivo tumor.
Elementos específicos de la respuesta inmune celular son capaces de reconocer y destruir específicamente las células tumorales. El aislamiento de células T de poblaciones de células infiltrantes de tumores o de sangre periférica sugiere que dichas células desempeñan un papel importante en la defensa inmune natural contra el cáncer. En particular, las células T positivas para CD8, que reconocen moléculas de clase I del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), que contienen péptidos de normalmente de 8 a 10 residuos de aminoácidos derivados de proteínas o productos ribosómicos defectuosos (DRIPS) ubicados en el citosol, desempeñan un papel importante en esta respuesta. Las moléculas MHC del ser humano también se denominan antígenos leucocitarios humanos (HLA).
MAGEA4 es un miembro de la familia de genes MAGEA. La expresión de la proteína MAGEA4 y el ARNm se ha relacionado con el desarrollo y pronóstico de diversos cánceres. El péptido MAG-003, es decir, KVLEHWRV (SEQ ID NO:1), es un epítopo de linfocitos T citotóxicos (CTL) restringido a H<l>A-A*0201 de MAGEA4 (aminoácidos 286-294). (Jiaet al.2010; Wuet al.2011). MAG-003 provoca CTLs específicos de péptidos tantoin vitrode PBMCs positivas para HLA-A*0201 y en ratones transgénicos HLA-A*0201/Kb. Los CTLs inducidos por MAG-003 generan lisis de las células objetivo de forma restringida a HLA-A*0201, lo que demuestra que MAG-003 es un epítopo CTL restringido a HLA-A*0201.
Hay dos clases de moléculas MHC, MHC clase I y MHC clase II. Los complejos de péptido y MHC de clase I son reconocidos por las células T positivas para CD8 que portan el receptor de células T (TCR) apropiado, mientras que los complejos de péptidos y moléculas de MHC de clase II son reconocidos por las células T auxiliares positivas para CD4 que portan el TCR apropiado. Dado que ambos tipos de respuesta, dependientes de CD8 y CD4, contribuyen de forma conjunta y sinérgica al efecto antitumoral, la identificación y caracterización de antígenos asociados a tumores y sus correspondientes receptores de células T es importante en el desarrollo de inmunoterapias contra el cáncer tal como vacunas y terapias celulares.
En la reacción inmune dependiente del MHC de clase I, los péptidos no sólo tienen que poder unirse a determinadas moléculas del MHC de clase I expresadas por las células tumorales, sino que posteriormente también tienen que ser reconocidos por las células T que portan receptores de células T (TCR) específicos. Por lo tanto, los TAAs son un punto de partida para el desarrollo de una terapia basada en células T que incluye, entre otras, vacunas tumorales y terapias celulares.
En el caso de dirigirse al péptido-MHC mediante TCR específicos (por ejemplo, TCR solubles o TCRs de superficie celular) y anticuerpos u otras moléculas de unión (complejos) de acuerdo con la descripción, la inmunogenicidad de los péptidos subyacentes es secundaria. En estos casos, la presentación es un factor determinante.
Si bien se han logrado avances en el desarrollo de fármacos dirigidos a moléculas para la terapia del cáncer, sigue existiendo la necesidad en la técnica de desarrollar nuevos agentes anticancerígenos que se dirijan específicamente a moléculas altamente específicas de las células cancerosas. La presente descripción aborda esa necesidad proporcionando nuevos TCRs, ácidos nucleicos, vectores y células huésped de MAG-003 que se unen específicamente a MAG-003; y nuevos TCR MAG-003 para su uso en el tratamiento del cáncer.
Resumen
La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.
La presente descripción se refiere a receptores de células T (TCRs) que comprenden una cadena alfa y/o una cadena beta ("TCRs alfa/beta"). En otra realización, la presente descripción se refiere a TCRs que comprenden una cadena gamma y/o una cadena delta ("TCRs gamma/delta").
La presente descripción se refiere además a TCRs, subunidades de TCR individuales (solas o en combinación) y subdominios de los mismos, TCRs solubles (sTCRs), por ejemplo, TCRs alfa/beta diméricos solubles que tienen al menos un enlace intercatenario disulfuro entre residuos de dominio constante que no están presentes en TCRs nativos y TCRs clonados, dichos TCRs modificados en células T autólogas o alogénicas o células progenitoras de células T, y métodos para producirlas, así como otras células que portan dicho TCR.
La presente descripción se refiere además a un TCR que se une específicamente a un complejo de péptido MAG-003-molécula HLA, en donde el péptido MAG-003 se selecciona de kVl EHWRV (SEQ ID NO:1) y variantes del mismo, tales como las que se muestran en SEQ ID NO:1. NO:2 a SEQ ID NO:24. En una realización, la molécula HLA es HLA-A*02.
La presente descripción se refiere además a TCRs que comprenden un dominio variable de TCR alfa que tiene al menos 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia, preferiblemente 90 % de identidad de secuencia, con un dominio variable de TCR alfa mostrado en la Tabla 2; y el dominio variable de TCR beta tiene al menos al menos 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia, preferiblemente 90 % de identidad de secuencia, con un dominio variable de TCR beta mostrado en la Tabla 2.
En una realización, el dominio variable de TCR alfa tiene al menos una mutación con respecto a un dominio de TCR alfa mostrado en la Tabla 2; y/o el dominio variable de TCR beta tiene al menos una mutación relativa a un dominio de TCR alfa mostrado en la Tabla 2. En una realización, un TCR que comprende al menos una mutación en el dominio variable de TCR alfa y/o el dominio variable de TCR beta tiene una afinidad de unión y/o una vida media de unión para un complejo de péptido MAG-003-molécula de HLA que es al menos el doble que el de un TCR que comprende el dominio de TCR alfa no mutado y/o el dominio variable de TCR beta no mutado.
Las cadenas de TCR alfa de la presente descripción pueden comprender además un dominio constante de TCR alfa que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un dominio constante de TCR alfa mostrado en la Tabla 2. Las cadenas de TCR beta de la presente descripción pueden comprender además un dominio constante de TCR beta que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un dominio constante de TCR beta mostrado en la Tabla 2.
Las cadenas de TCR alfa de la presente descripción pueden comprender además un dominio transmembrana de TCR alfa y/o un dominio intracelular de TCR alfa. Las cadenas de TCR beta de la presente descripción pueden comprender además un dominio transmembrana de TCR beta y/o un dominio intracelular de TCR beta.
La descripción se refiere además a cadenas de TCR alfa que comprenden una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena alfa divulgadas en la Tabla 2, y variantes de las mismas que tienen una, dos, tres o cuatro sustituciones con respecto a las CDRs mostradas en la Tabla 2. Se describen además cadenas de TCR alfa que comprenden al menos una CDR seleccionada de CDR1, CDR2 y CDR<3>que se muestra en la Tabla 2. Se describen además cadenas de TCR alfa que comprenden una CDR<3>de cadena alfa que se muestra en la Tabla 2.
La descripción se refiere además a cadenas de TCR beta que comprenden una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena beta divulgadas en la Tabla 2, y variantes de las mismas que tienen una, dos, tres o cuatro sustituciones con respecto a las CDRs mostradas en la Tabla 2. Se describen además cadenas de TCR beta que comprenden al menos una CDR seleccionada de una CDR1, CDR2 y CDR<3>de cadena beta que se muestra en la Tabla 2. Se describen además cadenas de TCR beta que comprenden una CDR<3>de cadena beta que se muestra en la Tabla 2.
La descripción se refiere además a un ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un TCR de la presente descripción. En una realización, los ácidos nucleicos de la descripción codifican una cadena de TCR alfa y/o una cadena de TCR beta como se muestra en la Tabla 2.
La descripción se refiere además a un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una cadena alfa, una cadena beta o ambas de TCR, como se describe en el presente documento.
La descripción se refiere además a una célula huésped aislada que comprende un vector de expresión recombinante que expresa un ácido nucleico que codifica la cadena alfa, la cadena beta o ambas de TCR, como se describe en el presente documento.
La descripción se refiere además a una célula huésped aislada que comprende un vector de expresión recombinante de acuerdo con la presente descripción, preferiblemente en donde la célula es una célula humana, preferiblemente un linfocito de sangre periférica (PBL), más preferiblemente un linfocito T positivo para CD4 o CD8.
La descripción se refiere además a un PBL aislado que comprende el vector de expresión recombinante de la descripción, en donde el PBL es una célula T CD8+ o una célula T CD4+.
La descripción se refiere además a una población de células que comprende al menos una célula huésped descrita en el presente documento.
La descripción se refiere además a TCRs y células huésped de la presente descripción para su uso en el tratamiento de enfermedades proliferativas, tales como cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de células renales, cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer colorrectal. cáncer hepatocelular, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, cáncer de vesícula biliar y de vías biliares y cáncer de esófago.
En un aspecto, la célula huésped es una célula T CD8+ o una célula T CD4+ transfectada con un ácido nucleico que codifica al menos un TCR de acuerdo con la descripción, en donde el TCR comprende al menos una secuencia de aminoácidos divulgada en la Tabla 2. En otro aspecto, dichas células huésped se usan en la inmunoterapia de cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de células renales, cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, cáncer de vesícula biliar y de vías biliares y cáncer de esófago, y preferiblemente cáncer de pulmón de células no pequeñas.
La descripción se refiere además a métodos para matar o reducir el número de células cancerosas que comprenden poner en contacto las células cancerosas con un TCR, ácido nucleico, vector o célula huésped como se describe en el presente documento. También se proporcionan métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un sujeto que lo necesita un TCR, ácido nucleico, vector o célula huésped como se describe en el presente documento.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un péptido MAG-003, por ejemplo, un péptido aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la siguiente fórmula general I:
X<1>X<2>LEHWRX<3>(SEQ ID NO: 25) Fórmula I
en donde X<1>se selecciona de los aminoácidos K e Y, X<2>se selecciona de los aminoácidos V, L y A, y X<3>se selecciona de V, L, A e I, en donde dicho péptido se une a una molécula HLA de clase I o clase II y/o induce una reacción cruzada de células T con dicho péptido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En un aspecto, dicho péptido no es el polipéptido de longitud completa subyacente.
Se prefiere una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 o una secuencia variante de la misma que es al menos 66%, preferiblemente al menos 77%, y más preferiblemente al menos 88% homóloga (preferiblemente al menos 77% o al menos 88% idéntico) a SEQ ID NO:1, en donde dicha variante se une a una molécula HLA de clase I o clase II y/o induce una reacción cruzada de células T con dicho péptido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde dicho péptido no es el polipéptido subyacente de longitud completa.
La presente descripción se refiere además a un péptido de la presente descripción que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 o una variante de la misma, que es al menos 66 %, preferiblemente al menos 77 %, y más preferiblemente al menos 88% homólogo (preferiblemente al menos 77% o al menos 88% idéntico) a SEQ ID NO:1, en donde dicho péptido o variante del mismo tiene una longitud total de entre 8 y 100, preferiblemente entre 8 y 30, y lo más preferiblemente de entre 8 y 14 aminoácidos.
Las siguientes tablas muestran péptidos de ejemplo de acuerdo con la presente descripción y sus respectivas SEQ ID NOs. En un aspecto, los péptidos de la Tabla 1 pueden unirse a HLA-A*02. En otro aspecto, los TCR descritos en el presente documento son capaces de unirse o unirse específicamente a uno o más péptidos en la Tabla 1.
Tabla 1: Péptidos de acuerdo con la presente descripción.
En un aspecto, la presente descripción se refiere a los TCRs MAG-003 para su uso en el tratamiento de enfermedades proliferativas, tales como cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de células renales, cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer colorrectal. cáncer hepatocelular, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, cáncer de vesícula biliar y de vías biliares y cáncer de esófago mediante la utilización de uno o más péptidos descritos en el presente documento.
Son particularmente preferidos los péptidos, solos o en combinación, de acuerdo con la presente descripción seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:24. Más preferidos son los péptidos - solos o en combinación - seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:24 (ver Tabla 1), y sus usos en la inmunoterapia del cáncer de pulmón de células no pequeñas, células pequeñas cáncer de pulmón, cáncer de células renales, cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, cáncer de vesícula biliar y de vías biliares y cáncer de esófago, y preferiblemente cáncer de pulmón de células no pequeñas.
En un aspecto, la presente descripción se refiere a péptidos de acuerdo con la presente descripción que tienen la capacidad de unirse a una molécula de HLA de clase I o, en una forma más larga, tal como un HLA de clase II de variante de longitud.
En un aspecto, la presente descripción se refiere a los péptidos de acuerdo con la presente descripción en donde dichos péptidos (cada uno) comprenden, consisten en o consisten esencialmente en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con S<e>Q ID<n>O:1 a SEQ ID NO:24.
La presente descripción se refiere además a los péptidos de acuerdo con la presente descripción, en donde dicho péptido está modificado y/o incluye enlaces no peptídicos.
La presente descripción se refiere además a los péptidos de acuerdo con la presente descripción, en donde dicho péptido es parte de una proteína de fusión, en particular fusionada con los aminoácidos N-terminales de la cadena invariante asociada al antígeno HLA-DR (Ii), preferentemente los 80 aminoácidos N-terminales del mismo, o fusionados a (o en la secuencia de) un anticuerpo, tal como, por ejemplo, un anticuerpo que es específico para células dendríticas.
La descripción se refiere además a un ácido nucleico que codifica los péptidos de acuerdo con la descripción. La descripción se refiere además al ácido nucleico de acuerdo con la descripción, que es ADN, ADNc, PNA, ARN o combinaciones de los mismos.
La descripción se refiere además a un vector de expresión capaz de expresar y/o expresar un ácido nucleico de acuerdo con la descripción.
La descripción se refiere además a un péptido de acuerdo con la descripción, un ácido nucleico de acuerdo con la descripción o un vector de expresión de acuerdo con la descripción para uso en el tratamiento de enfermedades y en medicina, en particular para uso en el tratamiento del cáncer.
La descripción se refiere además a anticuerpos que se unen específicamente a los péptidos de acuerdo con la presente descripción o complejos de dichos péptidos de acuerdo con la descripción con MHC, y métodos para producir tales anticuerpos.
La descripción se refiere además a una célula huésped que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la descripción o un vector de expresión como se describió anteriormente.
La descripción se refiere además a la célula huésped de acuerdo con la descripción que es una célula presentadora de antígeno, y preferiblemente es una célula dendrítica.
La descripción se refiere además a un método para producir un péptido de acuerdo con la descripción, comprendiendo el método cultivar la célula huésped de acuerdo con la descripción y aislar el péptido de dicha célula huésped o su medio de cultivo.
La descripción se refiere además a métodos de acuerdo con la descripción, en donde el antígeno se carga en moléculas MHC de clase I o II expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada o de una célula presentadora de antígeno artificial poniendo en contacto una cantidad suficiente del antígeno con una célula presentadora de antígeno o el antígeno se carga en tetrámeros de MHC de clase I o II tetramerizando los monómeros del complejo antígeno/MHC de clase I o II.
La descripción se refiere además al método de acuerdo con la descripción, en donde la célula presentadora de antígeno comprende un vector de expresión capaz de expresar o expresar dicho péptido que contiene SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:24, preferiblemente que contiene SEQ ID NO:1 a<s>E<q>ID NO:24, o una secuencia de aminoácidos variante de la misma.
La descripción se refiere además a linfocitos T activados, producidos mediante el método de acuerdo con la descripción, en donde una célula T reconoce selectivamente una célula que expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la descripción.
La descripción se refiere además a métodos para matar el cáncer y/o suprimir células en un paciente, cuyas células cancerosas expresan de manera aberrante un polipéptido que comprende cualquier secuencia de aminoácidos de acuerdo con la descripción, comprendiendo los métodos administrar al paciente un número eficaz de células T tal como se produce. de acuerdo con la descripción.
La descripción se refiere además al uso de cualquier péptido descrito en el presente documento, ácidos nucleicos de acuerdo con lo descrito en el presente documento, vectores de expresión descritos en el presente documento, células descritas en el presente documento, linfocitos T activados descritos en el presente documento, receptores de células T, anticuerpos u otras moléculas de unión a péptido y/o péptido-MHC de acuerdo con la presente descripción como medicamento o en la fabricación de un medicamento. En un aspecto, el medicamento es activo contra el cáncer.
Preferiblemente, dicho medicamento es una terapia celular, una vacuna o una proteína basada en un TCR, un TCR soluble o un anticuerpo.
La presente descripción se refiere además a un uso de acuerdo con la presente descripción, en donde las células cancerosas son cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de células renales, cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, cáncer de vesícula biliar y de vías biliares y cáncer de esófago, y preferiblemente cáncer de pulmón de células no pequeñas.
La presente descripción se refiere además a biomarcadores basados en los péptidos de acuerdo con la presente descripción, denominados en el presente documento "objetivo", que pueden usarse en el diagnóstico de cáncer, preferiblemente cáncer de pulmón de células no pequeñas. El marcador puede ser la sobrepresentación de los propios péptidos o la sobreexpresión del gen correspondiente. Los marcadores también se pueden usar para predecir la probabilidad de éxito de un tratamiento, preferiblemente una inmunoterapia, y más preferiblemente una inmunoterapia dirigida al mismo objetivo identificado por el biomarcador. Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo o TCR soluble para teñir secciones del tumor para detectar la presencia de un péptido de interés en complejo con MHC. Opcionalmente, el anticuerpo o TCR soluble lleva una función efectora adicional tal como un dominio o toxina inmunoestimulante.
La presente descripción se refiere además al uso de estos nuevos objetivos para la identificación de TCRs que reconocen al menos uno de dichos objetivos, y preferiblemente la identificación de dichos TCRs que activan células T.
La presente descripción también se refiere al uso de estos nuevos objetivos en el contexto del tratamiento del cáncer.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra la presentación del péptido MAG-003 en tejidos sanos y cánceres.
Las FIGs. 2-4 muestran la expresión de MAG-003 en cáncer y tejidos sanos.
Las FIGs. 5-7 muestran la liberación de IFN<y>de células T CD8+ electroporadas con ARN de cadena alfa y beta de los TCRs R7P1D5, R20P1H7 y R10P2G12 (Tabla 2), respectivamente, después de la coincubación con células objetivos cargadas con el péptido<m>A<g>-003 (SEQ ID NO: 1) o péptido homólogo pero no relacionado RABGAP1L-001 (SEQ ID NO:91), AXIN1-001 (SEQ ID NO:92), ANO5-001 (SEQ ID NO:93), TPX2-001 (SEQ ID NO:94), SYNE3-001 (SEQ ID NO:95), MIA3-001 (SEQ ID NO:96), HERC4-001 (SEQ ID NO:97), PSME2-001 (SEQ ID NO:98), HEATR5A-001 (SEQ ID NO:99) o CNOT1-003 (SEQ ID NO:100) o péptido de control NYES01-001 (SEQ ID NO:101). Los datos de liberación de IFNy se obtuvieron con células T CD8+ derivadas de dos donantes diferentes (donante 1 en el eje X derecho, donante 2 en el eje X izquierdo). Las células T CD8+ electroporadas con ARN solas o en incubación conjunta con células objetivo descargadas sirvieron como controles.
La FIG. 8 muestra la tinción con tetrámero MHC/MAG-003 o tetrámero MHC/NYES01-001 de células T CD8+ electroporadas con ARN de cadena alfa y beta de los TCRs R7P1D5, R20P1H7 y R10P2G12 (Tabla 2), respectivamente. Las células T CD8+ electroporadas con ARN de 1G4 TCR que se une específicamente al complejo MHC/NYESO1-001 y las células T CD8+ electroporadas simuladas sirvieron como controles.
Las FIGs. 9-11 muestran la liberación de IFNy de células T CD8+ electroporadas con ARN de cadena alfa y beta de los TCRs R7P1D5, R20P1H7 y R10P2G12 (Tabla 2), respectivamente, después de la coincubación con células objetivo cargadas con el péptido MAG-003 (SEQ ID NO: 1) o diversas variantes de sustitución de alanina MAG-003 en las posiciones 1-9 de SEQ ID NO:1. Las células T CD8+ electroporadas con ARN solas o en incubación conjunta con células objetivo cargadas con el péptido de control NYESO1-001 o células objetivo no cargadas sirvieron como controles. Los datos de liberación de IFNy se obtuvieron con células T CD8+ derivadas de dos donantes diferentes (donante 1 en el eje X derecho, donante 2 en el eje X izquierdo).
La FIG. 12 liberación de IFN<y>de células T CD8+ electroporadas con ARN de cadena alfa y beta de TCRs (A) R7P1D5, (B) R20P1H7 y (C) R10P2G12 después de la coincubación con la línea celular de melanoma A-375, la línea celular de glioblastoma T98G y la línea celular de cáncer de mama SK-BR-3, respectivamente. Las células T CD8+ electroporadas con ARN solas sirvieron como control.
La FIG. 13 se cocultivaron células T transfectadas con ARN que codifica TCR R7P1D5, R10P2G12, R20P1H7, TCR 1G4 simulado o de control (SEQ ID NO:X) con diferentes células primarias de tejido sano humano (ver tabla 13 para abreviaturas), la línea celular tumoral objetivo negativa MCF-7 y las líneas celulares MAGEA4 y NY-ESO1 positivas A-375 y NCI-H1755. La expresión de los TCRs R7P1D5, R10P2G12, R20P1H7 y 1G4 en células T se logró mediante electroporación utilizando un vector de ARN. Los cultivos de células de tejido sano humano no condujeron a un reconocimiento significativo mediado por TCR ni a una activación de células T significativa para TCR R7P1D5, R10P2G12 o R20P1H7. Proporción E:T 1:1,20,000 células cada una, la media de liberación de IFN-<y>después de 20 h a partir de réplicas se muestra medida por ELISA. Las barras de error indican desviaciones estándar. Los resultados se normalizaron restando la liberación de IFN-<y>de las células T transfectadas con TCR únicamente y la liberación de IFN-<y>debido al cocultivo de células objetivo y células T que no expresan TCR de interés.
La Fig. 14 Datos acumulativos de 4 donantes seleccionados para determinar la expresión del transgén TCR R7P1D5 después de la transducción con 6 constructos lentivirales diferentes (R71-R78). Las células T CD3+/CD8+ se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la proporción de células de unión al tetrámero MHC/MAG-003 96 horas después de la transducción. Se utilizaron células T no transducidas (NT) teñidas con tetrámero MHC/MAG-003 y células T transducidas con TCR 1G4 (NY-ESO1) teñidas con tetrámero MHC/NYESO1-001 como control negativo y positivo, respectivamente. Las células se seleccionaron en población CD3+CD8+ viva.
La Fig. 15 A. Respuesta efectora de células T transducidas con TCR R7P1D5 medida mediante la producción de IFN<y>tras el cocultivo de MAGEA4 que expresa la línea celular tumoral A375 y la línea celular tumoral negativa a MAGEA4 MCF-7. Las células T transducidas con sobrenadante concentrado de lentivirus R73 que codifica R7P1D5 TCR se compararon con células no transducidas (NT), ambas derivadas de PBMC de 4 donantes sanos. Los resultados se presentan como SEM por triplicado. B. Respuesta de IFNy de células T transducidas con R7P1D5 TCR (lentivirus R73) de PBMC de 2 donantes sanos (Donantes 6 y 7) tras la incubación conjunta con células objeto T2 pulsadas con concentraciones decrecientes de péptido MAG-003. Los resultados se presentan como SEM medio de triplicados medidos 96 horas después de la transducción.
La Fig. 16 (A, B) Respuesta citotóxica de células T (NT) transducidas y no transducidas con TCR R7P1D5 (lentivirus R73) medida contra MAGEA4 que expresa la línea celular tumoral A375 en diferentes proporciones E:T en un ensayo de liberación de Cr51 de 4 h. Los resultados se presentan como SEM medio de 3-4 réplicas. (C) Datos combinados de 7 productos de células T transducidas con R7P1D5 TCR (lentivirus R73) generados a partir de 5 donantes que muestran la matanza específica de antígeno de objetivos tumorales que expresan MAGEA4 (A375) y MAGEA4 negativo (MCF-7) en una proporción E:T de 40 :1.
Descripción detallada
La presente descripción se refiere a receptores de células T (TCRs) que comprenden tres CDRs en una cadena alfa y/o tres CDRs en una cadena beta ("TCRs alfa/beta"). También se proporcionan péptidos MAG-003 capaces de unirse a TCRs y anticuerpos cuando se presentan mediante una molécula de MHC. La presente descripción también se refiere a ácidos nucleicos, vectores y células huésped para expresar TCRs y péptidos de la presente descripción; y métodos de uso de los mismos.
El constructo que reconoce antígenos de acuerdo con la invención se selecciona preferiblemente entre un anticuerpo, o un derivado o fragmento del mismo, o un receptor de células T (TCR), o un derivado o fragmento del mismo. Un derivado o fragmento de un anticuerpo o TCR de la invención preferiblemente conservará la capacidad de unión/reconocimiento de antígeno de la molécula original, en particular su especificidad y/o selectividad como se explicó anteriormente. Dicha funcionalidad de unión puede conservarse mediante la presencia de las seis regiones CDR tal como se definen en el presente documento.
En una realización de la invención, los TCRs inventivos son capaces de reconocer antígenos TAA de una manera dependiente del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I. "Manera dependiente del MHC de clase I", como se usa en el presente documento, significa que el TCR provoca una respuesta inmune al unirse a antígenos TAA dentro del contexto de una molécula de MHC de clase I. La molécula de MHC de clase I puede ser cualquier molécula de MHC de clase I conocida en la técnica, por ejemplo, moléculas de HLA-A. En una realización preferida de la invención, la molécula de MHC de clase I es una molécula de HLA-A*02.
La invención proporciona tanto constructos de reconocimiento de antígenos de cadena sencilla como constructos de reconocimiento de antígenos de cadena doble.Las cadenas de TCR alfa de la presente descripción pueden comprender además un dominio transmembrana de TCR alfa y/o un dominio intracelular de TCR alfa. Las cadenas de TCR beta de la presente descripción pueden comprender además un dominio transmembrana de TCR beta y/o un dominio intracelular de TCR beta.
La invención en particular proporciona un TCR como constructo de reconocimiento de antígeno, o fragmento o derivado del mismo. El TCR es preferiblemente humano, entendiéndose que se genera a partir de un locus de TCR humano y que por lo tanto comprende secuencias de TCR humano. Además, el TCR de la invención puede caracterizarse porque es de origen humano y reconoce específicamente un antígeno TAA de la invención como se menciona en la tabla 1.
Otra realización de la invención proporciona adicional o alternativamente el constructo de reconocimiento de antígeno descrito anteriormente, que induce una respuesta inmune, preferiblemente en donde la respuesta inmune se caracteriza por un aumento en los niveles de interferón (IFN) y.
Los TCRs de la invención pueden proporcionarse como moléculas a o p de cadena sencilla, o y y 6, o alternativamente como constructos de doble cadena compuestas por las cadenas a y p, o y y 6.
Los TCRs de la invención pueden comprender además una región constante derivada de cualquier especie adecuada, tal como cualquier mamífero, por ejemplo, humano, rata, mono, conejo, burro o ratón. En una realización de la invención, los TCRs inventivos comprenden además una región constante humana. En algunas realizaciones preferidas, la región constante del t Cr de la invención puede modificarse ligeramente, por ejemplo, mediante la introducción de secuencias heterólogas, preferiblemente secuencias de ratón, que pueden aumentar la expresión y la estabilidad del TCR.
En una realización de la invención, se proporcionan TCR quiméricos, en donde las cadenas de TCR comprenden secuencias de múltiples especies. Preferiblemente, un TCR de la invención puede comprender una cadena a que comprende una región variable humana de una cadena a y, por ejemplo, una región constante murina de una cadena de TCR a murina.
En una realización, el TCR de la invención es un TCR humano que comprende regiones variables humanas de acuerdo con las realizaciones anteriores y regiones constantes humanas.
En algunas realizaciones, el constructo que reconoce antígenos está murinizado o humanizado. Estos términos se utilizan cuando se introducen secuencias de aminoácidos de una especie extraña en un constructo de la invención.
El TCR de la invención puede proporcionarse como un TCR de cadena sencilla (scTCR). Un scTCR de acuerdo con la invención comprenderá en una cadena polipeptídica una secuencia de cadena alfa completa o parcial y una secuencia de cadena beta completa o parcial, preferiblemente conectadas mediante un enlazador peptídico. Un scTCR puede comprender un polipéptido de una región variable de una primera cadena de TCR (por ejemplo, una cadena alfa) y un polipéptido de una segunda cadena de TCR completa (de longitud completa) (por ejemplo, una cadena beta), o viceversa. Además, el scTCR puede comprender opcionalmente uno o más enlazadores que unen los dos o más polipéptidos entre sí. El enlazador puede ser, por ejemplo, un péptido que une dos cadenas sencillas, como se describe en el presente documento. También se proporciona un scTCR de este tipo de la invención, que está fusionado a una citocina humana, tal como IL-2, IL-7 o iL-15.
El constructo de reconocimiento de antígenos de acuerdo con la invención también puede proporcionarse en forma de un complejo multimérico, que comprende al menos dos moléculas de scTCR, en donde dichas moléculas de scTCR están fusionadas cada una con al menos una fracción de biotina u otra molécula/enlazador de interconexión, y en donde dichos scTCR están interconectados mediante interacción biotina-estreptavidina para permitir la formación de dicho complejo multimérico. También son posibles y se incluyen en esta divulgación enfoques similares conocidos en la técnica para la generación de TCR multimérico. También se proporcionan complejos multiméricos de orden superior, que comprenden más de dos scTCR de la invención.
Para los fines de la presente invención, un TCR es una fracción que tiene al menos un dominio variable TCR alfa o gamma y/o TCR beta o delta. Generalmente, comprenden tanto un dominio variable TCR alfa como un dominio variable TCR beta, alternativamente tanto un dominio variable TCR gamma como un dominio variable TCR delta. Pueden ser heterodímeros apfy8 o pueden estar en formato de cadena sencilla. Para su uso en terapia adoptiva, un TCR heterodimérico ap o y§ puede transfectarse, por ejemplo, como cadenas de longitud completa que tienen dominios citoplasmáticos y transmembrana. Si se desea, puede estar presente un enlace disulfuro introducido entre residuos de los respectivos dominios constantes.
En una realización preferida, el constructo que reconoce antígenos es un TCR humano, o un fragmento o derivado del mismo. Un TCR humano o fragmento o derivado del mismo es un TCR que comprende más del 50% de la correspondiente secuencia de TCR humano. Preferiblemente, sólo una pequeña parte de la secuencia de TCR es de origen artificial o deriva de otras especies. Se sabe, sin embargo, que los TCR quiméricos, por ejemplo, derivados de origen humano con secuencias murinas en los dominios constantes, son ventajosos. Por lo tanto, son particularmente preferidos los TCRs de acuerdo con la presente invención, que contienen secuencias murinas en la parte extracelular de sus dominios constantes.
Por lo tanto, también se prefiere que el constructo de reconocimiento de antígeno inventivo sea capaz de reconocer su antígeno de una manera dependiente del antígeno leucocitario humano (HLA), preferiblemente de una manera dependiente de HLA-A02. La expresión "manera dependiente de HLA" en el contexto de la presente invención significa que el constructo que reconoce antígeno se une al antígeno sólo en el caso de que el péptido antigénico sea presentado por dicho HLA.
El constructo que reconoce antígenos de acuerdo con la invención en una realización induce preferiblemente una respuesta inmune, preferiblemente en donde la respuesta inmune se caracteriza por el aumento de los niveles de interferón (IFN)<y>.
La invención también proporciona un polipéptido que comprende una porción funcional de cualquiera de los TCRs (o variantes funcionales de los mismos) descritos en el presente documento, por ejemplo, de uno cualquiera de los TCRs como se proporciona en la sección de ejemplos y la tabla 2. El término "polipéptido", tal como se utiliza en el presente documento, incluye oligopéptidos y se refiere a una única cadena de aminoácidos conectados por uno o más enlaces peptídicos. Con respecto a los polipéptidos de la invención, la porción funcional puede ser cualquier porción que comprenda aminoácidos contiguos del TCR (o variante funcional del mismo), del cual forma parte, siempre que la porción funcional se una específicamente al antígeno TAA, preferiblemente como se divulga en el presente documento en la Tabla 1. El término "porción funcional" cuando se usa en referencia a un TCR (o variante funcional del mismo) se refiere a cualquier parte o fragmento del TCR (o variante funcional del mismo) de la invención, cuya parte o fragmento conserva la actividad biológica del TCR (o variante funcional del mismo), del cual forma parte (el TCR original o variante funcional original del mismo). Las porciones funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas partes de un TCR (o variante funcional del mismo) que conservan la capacidad de unirse específicamente al antígeno TAA (de manera dependiente de HLA), o detectar, tratar o prevenir el cáncer, en un grado similar, en la misma medida, o en mayor medida, que el TCR original (o variante funcional del mismo). En referencia al TCR original (o variante funcional del mismo), la porción funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente 10 %, 25 %, 30 %, 50 %, 68 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, de las secuencias variables del TCR original (o variante funcional de las mismas).
La porción funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxi de la porción, o en ambos terminales, en donde no se encuentran aminoácidos adicionales en la secuencia de aminoácidos del TCR original o variante funcional del mismo. Deseablemente, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica de la porción funcional, por ejemplo, uniéndose específicamente a los antígenos TAA; y/o tener la capacidad de detectar cáncer, tratar o prevenir el cáncer, etc. Más deseablemente, los aminoácidos adicionales mejoran la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del TCR original o variante funcional del mismo.
En algunos casos, el constructo de la invención puede comprender una o dos cadenas polipeptídicas que comprenden secuencias de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 39 a 86 (secuencias CDR, regiones constantes y variables y secuencias de longitud completa), o fragmentos funcionales de los mismos, y comprende además otras secuencias de aminoácidos, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que codifica una inmunoglobulina o una porción de la misma, entonces la proteína inventiva puede ser una proteína de fusión. A este respecto, la invención también proporciona una proteína de fusión que comprende al menos uno de los polipéptidos inventivos descritos en el presente documento junto con al menos otro polipéptido. El otro polipéptido puede existir como un polipéptido separado de la proteína de fusión, o puede existir como un polipéptido, que se expresa en marco (en conjunto) con uno de los polipéptidos inventivos descritos en el presente documento. El otro polipéptido puede incluir cualquier molécula peptídica o proteica, o una porción de la misma, incluyendo, entre otros, una inmunoglobulina, CD3, CD4, CD8, una molécula de MHC, una molécula de CD1, por ejemplo, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, etc.
La proteína de fusión puede comprender una o más copias del polipéptido inventivo y/o una o más copias del otro polipéptido. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o más copias del polipéptido inventivo y/o del otro polipéptido. En la técnica se conocen métodos adecuados para preparar proteínas de fusión e incluyen, por ejemplo, métodos recombinantes. En algunas realizaciones de la invención, los TCR (y porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos), polipéptidos y proteínas de la invención pueden expresarse como una única proteína que comprende un péptido enlazador que une la cadena a y la cadena p, y que enlaza la cadena y y la cadena 8. A este respecto, los TCR (y variantes funcionales y porciones funcionales de los mismos), polipéptidos y proteínas de la invención que comprenden las secuencias de aminoácidos de las regiones variables del t Cr de la invención y pueden comprender además un péptido enlazador. El péptido enlazador puede facilitar ventajosamente la expresión de un TCR recombinante (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales del mismo), polipéptido y/o proteína en una célula huésped. El péptido enlazador puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos adecuada. Las secuencias enlazadoras para constructos de TCR de cadena sencilla son bien conocidas en la técnica. Tal constructo de cadena única puede comprender además una o dos secuencias de dominio constante. Tras la expresión del constructo que incluye el péptido enlazador por una célula huésped, el péptido enlazador también puede escindirse, dando como resultado cadenas a y p separadas, y cadenas<y>y 8 separadas.
Como ya se mencionó anteriormente, la funcionalidad de unión del TCR de la invención puede proporcionarse en el marco de un anticuerpo. Por ejemplo, las secuencias CDR del TCR de la invención, que posiblemente incluyen residuos estructurales terminales 3, 2 o 1N y/o C adicionales, pueden injertarse directamente en una secuencia de cadena pesada/ligera variable de anticuerpo. El término "anticuerpo" en sus diversas formas gramaticales se usa en el presente documento para referirse a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno o un paratopo. Estas moléculas también se denominan "fragmentos de unión a antígeno" de moléculas de inmunoglobulina. La invención proporciona además un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a los antígenos descritos en el presente documento. El anticuerpo puede ser cualquier tipo de inmunoglobulina conocida en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser de cualquier isotipo, por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, etc. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de origen natural, por ejemplo, un anticuerpo aislado y/o purificado de un mamífero, por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, hámster, humano, etc. Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo genéticamente modificado, por ejemplo, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. El anticuerpo puede estar en forma monomérica o polimérica.
El término "anticuerpo" incluye, entre otros, formas de inmunoglobulinas genéticamente modificadas o modificadas de otro modo, tales como intracuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados (por ejemplo, generados mediante "injerto de CDR"), fragmentos de anticuerpos y anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos, etc.). El término "anticuerpo" incluye cis-diacuerpos y minicuerpos. Por lo tanto, todas y cada una de las realizaciones proporcionadas en el presente documento con respecto a "anticuerpos" o "constructos similares a anticuerpos" también se consideran anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, fragmentos scFv, constructos de receptor de anticuerpos quiméricos (CAR), realizaciones de diacuerpos y/o minicuerpos, a menos que se indique explícitamente lo contrario. El término "anticuerpo" incluye un polipéptido de la familia de las inmunoglobulinas o un polipéptido que comprende fragmentos de una inmunoglobulina que es capaz de unirse de manera no covalente, reversible y específica a un antígeno correspondiente, preferiblemente el TAA de la invención, como se divulga en el presente documento. Una unidad estructural de anticuerpo ejemplar comprende un tetrámero. En algunas realizaciones, un anticuerpo de longitud completa puede estar compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" y una cadena "pesada" (conectadas a través de un enlace disulfuro). La estructura y los isotipos de los anticuerpos son bien conocidos por el experto en la técnica (por ejemplo, de Janeway's Immunobiolog, novena edición, 2016).
Los genes de inmunoglobulina reconocidos de los mamíferos incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como una miríada de genes de la región variable de inmunoglobulina (para obtener más información sobre los genes de inmunoglobulina, véase el documento internacional Im-Muno-GeneTics information system®, Lefranc M-P et al, Nucleic Acids Res. enero de 2015; 43 (problema de base de datos): D413-22; y http://www.imgt.org/). Para las cadenas de longitud completa, las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Para las cadenas de longitud completa, las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. El N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas regiones de cadenas ligeras y pesadas respectivamente. Tal como se utiliza en esta invención, un "anticuerpo" abarca todas las variaciones de anticuerpo y fragmentos de los mismos. Por tanto, dentro del alcance de este concepto se encuentran los anticuerpos de longitud completa, los anticuerpos quiméricos, los anticuerpos humanizados, los anticuerpos de cadena sencilla (scFv), Fab, Fab' y las versiones multiméricas de estos fragmentos (por ejemplo, F(ab')2) con el mismo, esencialmente la misma o similar especificidad de unión. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a un péptido TAA de la invención. Los constructos de reconocimiento de antígenos preferidos de acuerdo con la invención incluyen una cadena pesada de anticuerpo, preferiblemente su dominio variable, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, y/o una cadena ligera de anticuerpo, preferiblemente su dominio variable, o un fragmento de unión a antígeno de la misma. De manera similar, se pueden preparar fragmentos de región variable estabilizados con disulfuro (dsFv) mediante tecnología de ADN recombinante; sin embargo, los fragmentos de anticuerpos de la invención no se limitan a estos tipos ejemplares de fragmentos de anticuerpos. Además, el anticuerpo, o su porción de unión a antígeno, puede modificarse para comprender un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) y partículas de elementos (por ejemplo, partículas de oro). En algunos casos, la secuencia TCR CDR3 puede estar ligeramente modificada, pero preferiblemente por no más de 3 residuos de aminoácidos, preferiblemente solo dos y más preferiblemente solo una posición de aminoácido, en comparación con las secuencias de CDR3 proporcionadas en las SEQ ID Nos 44, 52, 60, 68, 76 y 84. Preferiblemente, los anticuerpos comprenden la CDR3, preferiblemente todas las regiones de CDR1 a CDR3 en la combinación, como se indica para el TCR de la invención en la tabla 2, en cada caso de forma independiente, opcionalmente con no más de tres o dos, preferiblemente una sustitución(es), inserción(es) y/o deleción(es) de aminoácidos en comparación con estas secuencias.
En la técnica se conocen métodos adecuados para producir anticuerpos. Por ejemplo, los métodos de hibridoma estándar se describen, por ejemplo, en Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol, 5, 511-519 (1976), Har-low and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), y C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 8 Ed., Garland Publishing, Nueva York, NY (2011)). Alternativamente, otros métodos, como los métodos de hibridoma EBV (Haskard y Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), y Roder et al, Methods Enzymol, 121, 140-67 (1986)), y sistemas de expresión de vectores de bacteriófagos (ver, por ejemplo, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)) son conocidos en la técnica. Además, los métodos para producir anticuerpos en animales no humanos se describen, por ejemplo, en Patentes de EE.UU. 5,545,806, 5,569,825, y 5,714,352,Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No.
2002/0197266.
Algunas realizaciones de la invención también se refieren a TCR, o fragmentos funcionales y polipéptidos de los mismos, que son TCR solubles. Como se usa en el presente documento, el término "receptor de células T soluble" se refiere a variantes heterodiméricas truncadas de TCR nativos, que comprenden porciones extracelulares de la cadena a y cadena p de TCR, por ejemplo, enlazadas por un enlace disulfuro, pero que carecen de los dominios transmembrana y citosólico de la proteína nativa. Los términos "secuencia de cadena a del receptor de células T soluble y secuencia de cadena p del receptor de células T soluble" se refieren a secuencias de cadena a y cadena p de TCR que carecen de los dominios transmembrana y citosólico. La secuencia (aminoácido o ácido nucleico) de la cadena a y de las cadenas p de TCR solubles puede ser idéntica a las secuencias correspondientes en un TCR nativo o puede comprender secuencias de cadena a y de cadena p de TCR solubles variantes, en comparación con las secuencias TCR nativas correspondientes. El término "receptor de células T soluble" como se usa en el presente documento abarca TCR solubles con secuencias de cadena a y cadena p de TCR soluble variante o no variante. Las variaciones pueden estar en las regiones variables o constantes de las secuencias de cadena a y cadena p de TCR solubles y pueden incluir, entre otras, deleción, inserción, mutaciones de sustitución de aminoácidos, así como cambios en la secuencia de ácido nucleico que no alteran la secuencia de aminoácidos. Los TCR solubles de la invención conservan en cualquier caso la funcionalidad de unión de sus moléculas originales.
Definiciones
Tal como se utilizan en el presente documento y salvo que se indique lo contrario, todos los términos se definen como se indica a continuación.
El término "receptor de células T" (abreviado TCR) se refiere a una molécula heterodimérica que comprende una cadena polipeptídica alfa (cadena alfa) y una cadena polipeptídica beta (cadena beta), en donde el receptor heterodimérico es capaz de unirse a un antígeno peptídico presentado por una molécula HLA.
El término "respuesta de células T" significa la proliferación y activación específicas de funciones efectoras inducidas por un péptidoin vitroo invivo.Para las células T citotóxicas restringidas al MHC de clase I, las funciones efectoras pueden ser la lisis de células objetivo pulsadas con péptidos, pulsadas con precursores de péptidos o que presentan péptidos naturales, secreción de citoquinas, preferiblemente interferón gamma, TNF-alfa, o IL-2 inducida por péptido, secreción de moléculas efectoras, preferiblemente granzimas o perforinas inducidas por péptido, o desgranulación.
El término "péptido" se utiliza en el presente documento para designar una serie de residuos de aminoácidos, conectados entre sí normalmente mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. Los péptidos tienen preferiblemente 9 aminoácidos de longitud, pero pueden tener una longitud tan corta como de 8 aminoácidos y tan largos como 10, 11 o 12 o más, y en el caso de los péptidos MHC de clase II (variantes más largas de los péptidos de la descripción) pueden tener hasta 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más aminoácidos de longitud.
Además, el término "péptido" incluirá sales de una serie de residuos de aminoácidos, conectados entre sí normalmente mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. Preferiblemente, las sales son sales farmacéuticamente aceptables de los péptidos, tales como, por ejemplo, las sales de cloruro o acetato (trifluoroacetato). Cabe señalar que las sales de los péptidos de acuerdo con la presente descripción difieren sustancialmente de los péptidos en su(s) estado(s)invivo,ya que los péptidos no son sales invivo.
El término "péptido" incluirá también "oligopéptido". El término "oligopéptido" se utiliza en el presente documento para designar una serie de residuos de aminoácidos, conectados entre sí normalmente mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del oligopéptido no es crítica para la descripción, siempre que en él se mantengan el epítopo o los epítopos correctos. Los oligopéptidos suelen tener menos de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos de longitud y más de aproximadamente 15 aminoácidos de longitud.
El término "polipéptido" designa una serie de residuos de aminoácidos, conectados entre sí normalmente mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del polipéptido no es crítica para la descripción siempre que se mantengan los epítopos correctos. En contraste con los términos péptido u oligopéptido, el término polipéptido pretende referirse a moléculas que contienen más de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos.
Un péptido, oligopéptido, proteína o polinucleótido que codifica dicha molécula es "inmunogénico" (y por lo tanto es un "inmunógeno" dentro de la presente descripción), si es capaz de inducir una respuesta inmune. En el caso de la presente descripción, la inmunogenicidad se define más específicamente como la capacidad de inducir una respuesta de células T Así, un "inmunógeno" sería una molécula que es capaz de inducir una respuesta inmune y, en el caso de la presente descripción, una molécula capaz de inducir una respuesta de células T En otro aspecto, el inmunógeno puede ser el péptido, el complejo del péptido con MHC, oligopéptido y/o proteína que se usa para generar anticuerpos específicos o TCRs contra él.
Un "epítopo" de célula T de clase I requiere un péptido corto que está unido a un receptor de MHC de clase I, formando un complejo ternario (cadena alfa de MHC de clase I, beta-2-microglobulina y péptido) que puede ser reconocido por una célula T que porta un receptor de célula T correspondiente que se une al complejo MHC/péptido con afinidad apropiada. Los péptidos que se unen a moléculas de MHC de clase I suelen tener entre 8 y 14 aminoácidos de longitud, y lo más habitual es que tengan una longitud de 9 aminoácidos.
La secuencia de nucleótidos que codifica un péptido, oligopéptido o polipéptido particular puede ser natural o puede construirse sintéticamente. Generalmente, los segmentos de ADN que codifican los péptidos, polipéptidos y proteínas de esta descripción se ensamblan a partir de fragmentos de ADNc y enlazadores oligonucleotídicos cortos, o de una serie de oligonucleótidos, para proporcionar un gen sintético que es capaz de expresarse en una unidad transcripcional recombinante que comprende elementos reguladores derivados de un operón microbiano o viral.
Como se usa en el presente documento, el término "un nucleótido que codifica (o codifica) un péptido" se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica para el péptido que incluye codones de inicio y parada artificiales (hechos por el hombre) compatibles con el sistema biológico mediante el cual se va a expresar la secuencia, por ejemplo, por una célula dendrítica u otro sistema celular útil para la producción de TCRs.
Como se usa en el presente documento, el término "un nucleótido que codifica (o codificante) un TCR" se refiere a una o más secuencias de nucleótidos que codifican el TCR, incluyendo codones de inicio y parada artificiales (artificiales) compatibles para el sistema biológico, la secuencia va a ser expresada, por ejemplo, por células T u otro sistema celular útil para la producción de TCRs.
Como se usa en el presente documento, la referencia a una secuencia de ácido nucleico incluye ácido nucleico tanto monocatenario como bicatenario. Así, por ejemplo, para el ADN, la secuencia específica, a menos que el contexto indique lo contrario, se refiere al ADN monocatenario de dicha secuencia, al dúplex de dicha secuencia con su complemento (ADN bicatenario) y al complemento de dicha secuencia.
El término "región codificante" se refiere a esa porción de un gen que codifica natural o normalmente el producto de expresión de ese gen en su entorno genómico natural, es decir, la región que codifica invivopara el producto de expresión nativo del gen.
La región codificante puede derivarse de un gen no mutado ("normal"), mutado o alterado, o incluso puede derivarse de una secuencia de ADN, o gen, totalmente sintetizado en el laboratorio utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica de la síntesis de ADN.
El término "producto de expresión" significa el polipéptido o proteína que es el producto de traducción natural del gen y cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique equivalentes resultantes de la degeneración del código genético y que, por tanto, codifique los mismos aminoácidos.
El término "fragmento", cuando se refiere a una secuencia codificante, significa una porción de ADN que comprende menos de la región codificante completa, cuyo producto de expresión conserva esencialmente la misma función o actividad biológica que el producto de expresión de la región codificante completa.
El término "segmento de ADN" se refiere a un polímero de ADN, en forma de un fragmento separado o como componente de un constructo de ADN más grande, que se ha derivado de ADN aislado al menos una vez en forma sustancialmente pura, es decir, libre de materiales endógenos contaminantes y en una cantidad o concentración que permita la identificación, manipulación y recuperación del segmento y las secuencias de nucleótidos que lo componen mediante métodos bioquímicos estándar, por ejemplo, utilizando un vector de clonación. Dichos segmentos se proporcionan en forma de un marco de lectura abierto ininterrumpido por secuencias internas no traducidas, o intrones, que normalmente están presentes en genes eucariotas. Pueden estar presentes secuencias de ADN no traducido aguas abajo del marco de lectura abierto, donde las mismas no interfieren con la manipulación o expresión de las regiones codificantes.
El término "cebador" significa una secuencia corta de ácido nucleico que puede emparejarse con una cadena de ADN y proporciona un extremo 3'-OH libre en donde una ADN polimerasa inicia la síntesis de una cadena de desoxirribonucleótidos.
El término "promotor" significa una región del ADN implicada en la unión de la ARN polimerasa para iniciar la transcripción.
El término "aislado" significa que el material se retira de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural, si se produce de forma natural). Por ejemplo, no se aísla un polinucleótido o polipéptido natural presente en un animal vivo, sino que se aísla el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. En un aspecto, dichos polinucleótidos son parte de un vector y/o dichos polinucleótidos o polipéptidos son parte de una composición, y aún están aislados porque dicho vector o composición no es parte de su entorno natural.
Los polinucleótidos y polipéptidos recombinantes o inmunogénicos divulgados de acuerdo con la presente descripción también pueden estar en forma "purificada". El término "purificado" no requiere pureza absoluta; más bien, pretende ser una definición relativa y puede incluir preparaciones que están altamente purificadas o preparaciones que están sólo parcialmente purificadas, tal como entienden esos términos los expertos en la técnica relevante. Por ejemplo, los clones individuales aislados de una biblioteca de ADNc se han purificado convencionalmente hasta lograr homogeneidad electroforética. Se contempla expresamente la purificación del material de partida o material natural hasta al menos un orden de magnitud, preferiblemente dos o tres órdenes, y más preferiblemente cuatro o cinco órdenes de magnitud. Además, se reivindica un polipéptido que tiene una pureza de preferentemente 99.999 %, o al menos 99.99 % o 99.9 %; e incluso deseablemente se incluye expresamente el 99% en peso o más.
Los ácidos nucleicos y productos de expresión de polipéptidos divulgados de acuerdo con la presente descripción, así como los vectores de expresión que contienen dichos ácidos nucleicos y/o dichos polipéptidos, pueden estar en "forma enriquecida". Como se usa en el presente documento, el término "enriquecido" significa que la concentración del material es al menos aproximadamente 2, 5, 10, 100 o 1000 veces su concentración natural (por ejemplo), ventajosamente 0.01%, en peso, preferiblemente al menos aproximadamente 0.1% en peso. También se contemplan preparaciones enriquecidas de aproximadamente 0.5%, 1%, 5%, 10% y 20% en peso. Las secuencias, constructos, vectores, clones y otros materiales que comprenden la presente descripción pueden estar ventajosamente en forma enriquecida o aislada. El término "fragmento activo" significa un fragmento, generalmente de una secuencia de péptido, polipéptido o ácido nucleico, que genera una respuesta inmune (es decir, tiene actividad inmunogénica) cuando se administra, solo u opcionalmente con un adyuvante adecuado o en un vector, a un animal, tal como un mamífero, por ejemplo, un conejo o un ratón, y también incluye un ser humano, tomando dicha respuesta inmune la forma de estimular una respuesta de células T dentro del animal receptor, tal como un ser humano. Alternativamente, el "fragmento activo" también puede usarse para inducir una respuesta de células Tin vitro.
Como se usan en el presente documento, los términos "porción", "segmento" y "fragmento", cuando se usan en relación con polipéptidos, se refieren a una secuencia continua de residuos, tal como residuos de aminoácidos, cuya secuencia forma un subconjunto de una secuencia más grande. Por ejemplo, si un polipéptido se sometiera a tratamiento con cualquiera de las endopeptidasas comunes, tales como tripsina o quimotripsina, los oligopéptidos resultantes de dicho tratamiento representarían porciones, segmentos o fragmentos del polipéptido de partida. Cuando se usan en relación con polinucleótidos, estos términos se refieren a los productos producidos mediante el tratamiento de dichos polinucleótidos con cualquiera de las endonucleasas.
De acuerdo con la presente descripción, el término "porcentaje de identidad" o "porcentaje idéntico", cuando se refiere a una secuencia, significa que una secuencia se compara con una secuencia reivindicada o descrita después del alineamiento de la secuencia que se va a comparar (la "Secuencia Comparada ") con la secuencia descrita o reivindicada (la "Secuencia de Referencia"). Luego se determina el porcentaje de identidad de acuerdo con la siguiente fórmula:
porcentaje de identidad = 100 [ l -(C /R )]
en donde C es el número de diferencias entre la Secuencia de Referencia y la Secuencia Comparada a lo largo de la longitud de alineación entre la Secuencia de Referencia y la Secuencia Comparada, en donde
(i) cada base o aminoácido en la Secuencia de Referencia que no tiene una base o aminoácido alineado correspondiente en la Secuencia Comparada y
(ii) cada brecha en la Secuencia de Referencia y
(iii) cada base o aminoácido alineado en la Secuencia de Referencia que es diferente de una base o aminoácido alineado en la Secuencia Comparada constituye una diferencia y
(iv) la alineación tiene que comenzar en la posición 1 de las secuencias alineadas;
y R es el número de bases o aminoácidos en la Secuencia de Referencia a lo largo de la alineación con la Secuencia Comparada, contando también cualquier espacio creado en la Secuencia de Referencia como una base o aminoácido.
Si existe una alineación entre la Secuencia comparada y la Secuencia de referencia para la cual el porcentaje de identidad calculado anteriormente es aproximadamente igual o mayor que un Porcentaje de Identidad mínimo especificado, entonces la Secuencia comparada tiene el porcentaje mínimo de identidad especificado con la Secuencia de Referencia, aunque pueden existir alineaciones en donde el porcentaje de identidad calculado anteriormente en el presente documento es menor que el porcentaje de identidad especificado.
En la descripción, el término "homólogo" se refiere al grado de identidad (ver porcentaje de identidad más arriba) entre secuencias de dos secuencias de aminoácidos, es decir, secuencias peptídicas o polipeptídicas. La "homología" antes mencionada se determina comparando dos secuencias alineadas en condiciones óptimas sobre las secuencias que se van a comparar. Tal homología de secuencia se puede calcular creando una alineación usando, por ejemplo, el algoritmo ClustalW. Las bases de datos públicas proporcionan software de análisis de secuencias comúnmente disponible, más específicamente Vector NTI, GENETYX u otras herramientas.
Un experto en la técnica podrá evaluar si las células T inducidas por una variante de un péptido específico podrán reaccionar de forma cruzada con el propio péptido (Appayet al.,2006; Colombettiet al.,2006; Fonget al.,2001; Zarembaet al.,1997).
Por una "variante" de la secuencia de aminoácidos dada los inventores quieren decir que las cadenas laterales de, por ejemplo, uno o dos de los residuos de aminoácidos están alteradas (por ejemplo reemplazándolas con la cadena lateral de otro residuo de aminoácido de origen natural o alguna otra cadena lateral) de modo que el péptido todavía sea capaz de unirse a una molécula de HLA sustancialmente de la misma manera que un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos dada seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:1 a SEQ ID<n>O:24. Por ejemplo, un péptido puede modificarse de modo que al menos mantenga, si no mejora, la capacidad de interactuar y unirse al surco de unión de una molécula de MHC adecuada, tal como HLA-A*02 o -DR, y en ese de esta manera al menos mantiene, si no mejora, la capacidad de unirse al TCR de los linfocitos T activados. De manera similar, un TCR puede modificarse de modo que al menos mantenga, si no mejora, la capacidad de interactuar y unirse a un complejo molécula MHC/KVLE<h>W<r>V (SEQ ID NO:1) adecuado, tal como HLA-A*02 o -DR, y de esa manera al menos mantiene, si no mejora, la capacidad de activar las células T
Estas células T pueden posteriormente reaccionar de forma cruzada con células y matar células que expresan un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos natural del péptido afín, tal como KVLEHWRV (SEQ ID NO:1), como se define en los aspectos de la descripción. Como se desprende de la literatura científica y de las bases de datos (Rammenseeet al.,1999; Godkinet al.,1997), ciertas posiciones de los péptidos de unión a<h>L<a>son típicamente residuos de anclaje que forman una secuencia central que se adapta al motivo de unión del receptor de HLA, que se define por las propiedades polares, electrofísicas, hidrófobas y espaciales de las cadenas polipeptídicas que constituyen el surco de unión. En un aspecto, un experto en la técnica tendría la capacidad, dadas las enseñanzas de la descripción, de modificar la secuencia de aminoácidos de un TCR, manteniendo los residuos de anclaje conocidos, y sería capaz de determinar si tales variantes de TCR mantienen la capacidad de unirse a complejos de moléculas de MHC de clase I o II/KVLEHWRV (SEQ ID NO:1). Las variantes de TCR de la descripción conservan la capacidad de unirse a complejos de moléculas de MHC de clase I o II/KVLEHWRV (SEQ ID NO:1). Las células T que expresan las variantes de TCR de la descripción pueden matar posteriormente células que expresan un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos natural del péptido afín, tal como KVLEHVVRV (SEQ ID NO:1).
En un aspecto, los péptidos o TCR divulgados en el presente documento pueden modificarse mediante la sustitución de uno o más residuos en sitios diferentes, posiblemente selectivos, dentro de la cadena peptídica, si no se indica lo contrario. Preferiblemente esas sustituciones están ubicadas al final de la cadena de aminoácidos de dicho péptido. Para los TCRs, preferiblemente esas sustituciones están ubicadas en dominios variables de la cadena de TCR alfa y la cadena de TCR beta. Tales sustituciones pueden ser de naturaleza conservadora, por ejemplo, cuando un aminoácido se reemplaza por un aminoácido de estructura y características similares, tal como cuando un aminoácido hidrófobo se reemplaza por otro aminoácido hidrófobo. Aún más conservador sería el reemplazo de aminoácidos del mismo o similar tamaño y naturaleza química, tal como cuando la leucina se reemplaza por isoleucina. En estudios de variaciones de secuencia en familias de proteínas homólogas naturales, ciertas sustituciones de aminoácidos se toleran más a menudo que otras, y éstas a menudo muestran correlación con similitudes en tamaño, carga, polaridad e hidrofobicidad entre el aminoácido original y su reemplazo, y tal es la base para definir "sustituciones conservadoras".
Las sustituciones conservadoras se definen en el presente documento como intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos: Grupo 1-pequeños residuos alifáticos, no polares o ligeramente polares (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupo 2-residuos polares cargados negativamente y sus amidas (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupo 3-Residuos polares, cargados positivamente (His, Arg, Lys); Grupo 4-residuos grandes, alifáticos y no polares (Met, Leu, Ile, Val, Cys); y Grupo 5-residuos aromáticos grandes (Phe, Tyr, Trp).
Las sustituciones menos conservadoras podrían implicar la sustitución de un aminoácido por otro que tenga características similares pero que tenga un tamaño algo diferente, tal como la sustitución de una alanina por un residuo de isoleucina. Los reemplazos altamente no conservadores podrían implicar la sustitución de un aminoácido ácido por uno que sea polar, o incluso por uno que sea de carácter básico. Sin embargo, tales sustituciones "radicales" no pueden descartarse como potencialmente ineficaces, ya que los efectos químicos no son totalmente predecibles y las sustituciones radicales bien podrían dar lugar a efectos fortuitos que de otro modo no serían predecibles a partir de principios químicos simples.
En un aspecto, dichas sustituciones pueden implicar estructuras distintas de los L-aminoácidos comunes. Por lo tanto, los D-aminoácidos podrían sustituir a los L-aminoácidos que se encuentran comúnmente en los péptidos antigénicos de la descripción y aun así estar abarcados por la descripción en el presente documento. Además, también se pueden usar aminoácidos no estándar (es decir, distintos de los aminoácidos proteinógenos naturales comunes) con fines de sustitución para producir inmunógenos y polipéptidos inmunogénicos de acuerdo con la presente descripción.
Si se encuentra que las sustituciones en más de una posición dan como resultado un péptido con actividad antigénica sustancialmente equivalente o mayor como se define a continuación, entonces se probarán combinaciones de esas sustituciones para determinar si las sustituciones combinadas dan como resultado efectos aditivos o sinérgicos sobre la antigenicidad del péptido. Como máximo, no se sustituirían simultáneamente más de 4 posiciones dentro del péptido.
Como se usa en el presente documento, el término "murino" o "humano", cuando se refiere a un constructo que reconoce antígenos, o un TCR, o cualquier componente de un TCR descrito en el presente documento (por ejemplo, región determinante de la complementariedad (CDR), región variable, región constante, cadena a y/o cadena p), significa un TCR (o componente del mismo), que se deriva de un locus de TCR no reordenado de ratón o humano, respectivamente.
Receptores de células T (TCR)
En una realización preferida, la descripción se refiere a un TCR que comprende una cadena de TCR alfa mostrada en la Tabla 2, y variantes de la misma; y una cadena de TCR beta mostrada en la Tabla 2, y variantes de la misma. En un aspecto, un TCR descrito en el presente documento tiene la capacidad de unirse o unirse específicamente a una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) humano de clase I/KVLEHVVRV (SEQ ID NO:1)/complejo o a clase II/KVLEHWRV (SEQ ID NO:1) ID NO:1)/complejo.
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En la presente descripción, el término "dominio variable de TCR alfa" se refiere por lo tanto a la concatenación de la región TCR alfa V (TRAV) sin región líder (L), y la región TCR alfa J (TRAJ); y el término "dominio constante de TCR alfa " se refiere a la región TRAC extracelular, o a una secuencia TRAC truncada C-terminal, y opcionalmente un dominio transmembrana alfa (VIGFRILLLKVAGFNLLMTL (SEQ ID NO:87)).
Asimismo, el término "dominio variable de TCR beta" se refiere a la concatenación de la región TCR beta V (TRBV) sin región líder (L), y la región TCR beta D/J (TRBD/TRBJ); y el término dominio constante de TCR beta se refiere a la región TRBC extracelular, o a una secuencia TRBC truncada C-terminal, y opcionalmente un dominio transmembrana beta (TILYEILLGKATLYAVLVSALVL (SEQ ID NO:88)).
Con respecto a los TCR gamma/delta, el término "dominio variable de TCR gamma" como se usa en el presente documento se refiere a la concatenación de las regiones TCR gamma V (TRGV) sin región líder (L) y TCR gamma J (TRGJ); y el término dominio constante de TCR gamma se refiere a la región TRGC extracelular, o a una secuencia TRGC truncada C-terminal. Asimismo, el término "dominio variable de TCR delta" se refiere a la concatenación de las regiones TCR delta V (TRDV) sin región líder (L) y TCR delta D/J (TRDD/TRDJ); y el término dominio constante de TCR delta se refiere a la región TRDC extracelular, o a una secuencia TRDC truncada C-terminal.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende o consiste en una cadena de TCR alfa como se muestra en la Tabla 2. Las cadenas de TCR alfa que se muestran en la Tabla 2 contienen un segmento líder (L); una cadena V; tres regiones determinantes complementarias (CDR1, CDR2 y CDR3); una región de unión (J) y una región constante, como se define en la Tabla 2.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende o consiste en un dominio variable de TCR alfa al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico, preferiblemente 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico, a un dominio variable de TCR alfa mostrado en la Tabla 2.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende o consiste en un dominio constante de TCR alfa al menos 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico, preferiblemente 75 % idéntico, a un dominio constante de TCR alfa mostrado en la Tabla 2.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende, o consiste en, un dominio variable de TCR alfa que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) de cadena alfa seleccionada del grupo que consiste en una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena alfa que se muestran en la Tabla 2. En una realización preferida, el dominio variable de TCR alfa comprende una CDR<3>de cadena alfa. que se muestra en la Tabla 2. En otra realización preferida, el dominio variable de TCR alfa comprende una CDR1,<c>DR2 y CDR3 de cadena alfa que se muestran en la Tabla 2.
En una realización particularmente preferida, un TCR de la presente descripción comprende, o consiste en, un dominio variable de TCR alfa que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con un dominio variable de TCR alfa de la Tabla 2, y comprende CDR1, CDR2 y CDR3 del mismo dominio variable alfa de la Tabla 2.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende, o consiste en, una cadena de TCR beta como se muestra en la Tabla 2. Las cadenas de TCR beta que se muestran en la Tabla 2 contienen un segmento líder (L); una cadena en V; tres regiones determinantes complementarias (CDR1, CDR2 y CDR3); una región de unión (J) y una región constante, como se define en la Tabla 2.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende, o consiste en, un dominio variable de TCR beta al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99% idéntico, preferiblemente 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico, a un dominio variable de TCR beta mostrado en la Tabla 2.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende, o consiste en, un dominio constante de TCR beta al menos 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico, preferiblemente 75 % idéntico, a un dominio constante de TCR beta mostrado en la Tabla 2.
Se divulga un TCR de la presente descripción que comprende, o consiste en, un dominio variable de TCR beta que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena beta que se muestra en la Tabla 2.
En una realización particularmente preferida, un TCR de la presente descripción comprende, o consiste en, un dominio variable de TCR beta que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad de secuencia con un dominio variable de TCR beta de la Tabla 2, y comprende CDR1, CDR2 y CDR<3>del mismo dominio variable de TCR beta de la Tabla 2.
La cadena de TCR alfa y la cadena de TCR beta pueden fusionarse para formar un TCR de cadena única. Alternativamente, las cadenas de TCR alfa y beta pueden expresarse como proteínas separadas que pueden ensamblarse en un heterodímero.
Se divulga que cualquier cadena de TCR alfa de la Tabla 2 se empareja con cualquier cadena de TCR beta de la Tabla 2 para producir un TCR que se une específicamente a un complejo de péptido MAG-003-molécula de HLA.
TCR R20P1H7
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende, o consiste en, la cadena alfa y/o la cadena beta de TCR R20P1H7, correspondiente a las SEQ ID NO: 39 y 47, respectivamente.
El dominio variable de TCR alfa de TCR R20P1H7 comprende, o alternativamente consiste en, los aminoácidos 22 a 133 de SEQ ID NO:39; el dominio constante de TCR alfa de TCR R20P1H7 comprende, o alternativamente consiste en, los aminoácidos 134-275 de SEQ ID NO:39; el dominio variable de TCR beta de TCR R20P1H7 comprende, o alternativamente consiste en, los aminoácidos 20 a 135 de SEQ ID NO:47; y el dominio constante de TCR beta comprende, o alternativamente consiste en, los aminoácidos 136 a 315 de SEQ ID NO:47.
En una realización particular, un TCR de la presente descripción comprende una cadena de TCR alfa de SEQ ID NO:39.
En otra realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de TCR alfa al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico, preferiblemente 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico al dominio variable de TCR alfa de SEQ ID NO:39.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio constante de TCR alfa al menos 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99% idéntico, preferiblemente 75% idéntico, al dominio constante de TCR alfa de SEQ ID NO:39.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de TCR alfa que comprende las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO:39.
En una realización particularmente preferida, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de TCR alfa que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad de secuencia con el dominio variable de TCR alfa de SEQ ID NO:39, y comprende las CDR1, CDR2 y CDR<3>de SEQ ID NO:39.
En otra realización particular, un TCR de la presente descripción comprende una cadena de TCR beta de SEQ ID NO:47.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de TCR beta al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico, preferiblemente 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico al dominio variable de TCR beta de SEQ ID NO:47.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio constante de TCR beta al menos 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99% idéntico, preferiblemente 75% idéntico, al dominio constante de TCR beta de SEQ ID NO:47.
Se divulga un TCR de la presente descripción que comprende un dominio variable de TCR beta que comprende las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO:47.
En una realización particularmente preferida, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de TCR beta que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad de secuencia con el dominio variable de TCR beta de SEQ ID NO:47, y comprende CDR1, CDR2 y CDR<3>de SEQ ID NO:47.
TCR R7P1D5
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende, o consiste en, la cadena alfa y/o la cadena beta de TCR R7P1D5, correspondiente a las SEQ ID NO: 55 y 63, respectivamente.
El dominio variable de TCR alfa de TCR R7P1D5 comprende, o alternativamente consiste en, los aminoácidos 22 a 131 de SEQ ID NO:55; el dominio constante de TCR alfa de TCR R7P1D5 comprende, o alternativamente consiste en, los aminoácidos 132 a 272 de SEQ ID NO:55; el dominio variable de TCR beta de TCR R7P1D5 comprende, o alternativamente consiste en, los aminoácidos 20 a 131 de SEQ ID NO:63; y el dominio constante de TCR beta comprende, o alternativamente consiste en, los aminoácidos 132 a 310 de SEQ ID NO:63.
En una realización particular, un TCR de la presente descripción comprende una cadena de TCR alfa al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica, preferiblemente 90%, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la cadena de TCR alfa de SEQ ID NO:55.
En otra realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de TCR alfa al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico, preferiblemente 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico al dominio variable de TCR alfa de SEQ ID NO:55.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio constante de TCR alfa al menos 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99% idéntico, preferiblemente 75% idéntico, al dominio constante de TCR alfa de SEQ ID NO:55.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de TCR alfa que comprende las CDR1, CDR2 y CDR<3>de cadena alfa de SEQ ID NO: 55.
En una realización particularmente preferida, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de TCR alfa que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad de secuencia con el dominio variable de TCR alfa de SEQ ID NO:55, y comprende las CDR1, CDR2 y CDR<3>de SEQ ID NO:55.
En otra realización particular, un TCR de la presente descripción comprende una cadena de TCR beta en la SEQ ID NO:63.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de TCR beta al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico, preferiblemente 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico al dominio variable de TCR beta de SEQ ID NO:63.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio constante de TCR beta al menos 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99% idéntico, preferiblemente 75% idéntico, al dominio constante de TCR beta de SEQ ID NO:63.
Se divulga un TCR de la presente descripción que comprende un dominio variable de TCR beta que comprende las CDR1, CDR2 y CDR<3>de cadena beta de SEQ iD NO:63.
En una realización particularmente preferida, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de TCR beta que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad de secuencia con el dominio variable de TCR beta de SEQ ID NO:63, y comprende CDR1, CDR2 y CDR<3>de SEQ ID NO:63.
TCR R10P2G12
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende, o consiste en, la cadena alfa y/o la cadena beta de TCR R10P2G12, correspondiente a las SEQ iD NO: 71 y 79, respectivamente.
El dominio variable de TCR alfa de TCR R10P2G12 comprende, o alternativamente consiste en, los aminoácidos 21 a 136 de SEQ ID NO:71; el dominio constante de TCR alfa de TCR R10P2G12 comprende, o alternativamente consiste en, los aminoácidos 137 a 277 de SEQ ID NO:71; el dominio variable de TCR beta de TCR R10P2G12 comprende, o alternativamente consiste en, los aminoácidos 20 a 134 de SEQ ID NO:79; y el dominio constante de TCR beta comprende, o alternativamente consiste en, los aminoácidos 135 a 313 de SEQ ID NO:79.
En una realización particular, un TCR de la presente descripción comprende un TCR alfa de SEQ ID NO:71.
En otra realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de TCR alfa al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico, preferiblemente 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico al dominio variable de TCR alfa de SEQ ID NO:71.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio constante de TCR alfa al menos 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99% idéntico, preferiblemente 75% idéntico, al dominio constante de TCR alfa de SEQ ID NO:71.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de TCR alfa que comprende las CDR1, CDR2 y CDR<3>de cadena alfa de SEQ ID NO: 71.
En una realización particularmente preferida, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de TCR alfa que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad de secuencia con el dominio variable de TCR alfa de SEQ ID NO:71, y comprende las CDR1, CDR2 y CDR<3>de SEQ ID NO:71.
En otra realización particular, un TCR de la presente descripción comprende una cadena de TCR beta de SEQ ID NO:79.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de TCR beta al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico, preferiblemente 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico al dominio variable de TCR beta de SEQ ID NO:79.
En una realización, un TCR de la presente descripción comprende un dominio constante de TCR beta al menos 75 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99% idéntico, preferiblemente 75% idéntico, al dominio constante de TCR beta de SEQ ID NO:79.
Se divulga un TCR de la presente descripción que comprende un dominio variable de TCR beta que comprende las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO:79.
En una realización particularmente preferida, un TCR de la presente descripción comprende un dominio variable de TCR beta que tiene al menos 90 % o 95 % de identidad de secuencia con el dominio variable de TCR beta de SEQ ID NO:79, y comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO:79.
En una realización preferida adicional, un TCR de la presente descripción se une específicamente a un complejo de péptido MAG-003-molécula HLA, en donde el péptido MAG-003 es KVLEHWRV (SEQ ID NO:1). En una realización, la molécula de HLA es una molécula de MHC de clase I seleccionada del grupo que consiste en moléculas de HLA-A, HLA-B y HLA-C. En una realización, la molécula HLA es HLA-A*02. En otra realización, la molécula de HLA es una molécula de MHC de clase II seleccionada del grupo que consiste en HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR.
Los TCR de la presente descripción se unen preferiblemente a un complejo péptido MAG-003-molécula HLA con una afinidad de unión (K<d>) de aproximadamente 100 pM o menos, aproximadamente 50 pM o menos, aproximadamente 25 pM o menos, o aproximadamente 10 pM o menos. Más preferidos son los TCR de alta afinidad que tienen afinidades de unión de aproximadamente 1 pM o menos, aproximadamente 100 nM o menos, aproximadamente 50 nM o menos, aproximadamente 25 nM o menos. Los ejemplos no limitantes de intervalos de afinidad de unión preferidos para los TCR de la presente descripción incluyen aproximadamente 1 nM a aproximadamente 10 nM; aproximadamente 10 nM a aproximadamente 20 nM; aproximadamente 20 nM a aproximadamente 30 nM; aproximadamente 30 nM a aproximadamente 40 nM; aproximadamente 40 nM a aproximadamente 50 nM; aproximadamente 50 nM a aproximadamente 60 nM; aproximadamente 60 nM a aproximadamente 70 nM; aproximadamente 70 nM a aproximadamente 80 nM; aproximadamente 80 nM a aproximadamente 90 nM; y aproximadamente 90 nM a aproximadamente 100 nM.
Como se usa en el presente documento en relación con los TCRs de la presente descripción, "unión específica" y variantes gramaticales del mismo se usan para referirse a un TCR que tiene una afinidad de unión (K<d>) para un complejo péptido MAG-003-molécula HLA de 100 pM o menos.
Los TCRs heterodiméricos alfa/beta de la presente descripción pueden tener un enlace disulfuro introducido entre sus dominios constantes. Los TCRs preferidos de este tipo incluyen aquellos que tienen una secuencia de dominio constante TRAC y una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 excepto que Thr 48 de TRAC y Ser 57 de TRBC1 o TRBC2 se reemplazan por residuos de cisteína, formando dichas cisteínas un enlace disulfuro entre la secuencia del dominio constante TRAC y la secuencia del dominio constante TRBC1 o TRBC2 del TCR.
Con o sin el enlace entre cadenas introducido mencionado anteriormente, los TCR heterodiméricos alfa/beta de la presente descripción pueden tener una secuencia de dominio constante TRAC y una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2, y la secuencia del dominio constante de TRAC y la secuencia del dominio constante TRBC1 o TRBC2 del TCR pueden estar enlazadas mediante el enlace disulfuro nativo entre Cys4 del exón 2 de TRAC y Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2.
Los TCRs de la presente descripción pueden comprender un marcador detectable seleccionado del grupo que consiste en un radionúclido, un fluoróforo y biotina. Los TCRs de la presente descripción pueden conjugarse con un agente terapéuticamente activo, tal como un radionúclido, un agente quimioterapéutico o una toxina.
En una realización, un TCR de la presente descripción que tiene al menos una mutación en la cadena alfa y/o que tiene al menos una mutación en la cadena beta tiene una glicosilación modificada en comparación con el TCR no mutado.
En una realización, un TCR que comprende al menos una mutación en la cadena de TCR alfa y/o la cadena de TCR beta tiene una afinidad de unión y/o una vida media de unión para, un complejo péptido MAG-003-molécula HLA, que es al menos el doble que un TCR que comprende la cadena de TCR alfa no mutada y/o la cadena de TCR beta no mutada. La mejora de la afinidad de los TCRs específicos de tumores y su explotación se basa en la existencia de una ventana para afinidades óptimas de los TCR. La existencia de dicha ventana se basa en observaciones de que los TCRs específicos para patógenos restringidos por HLA-A2 tienen valoresKDque generalmente son aproximadamente 10 veces más bajos en comparación con los TCRs específicos para autoantígenos asociados a tumores restringidos por HLA-A2 (Aleksicet al.2012; Kunertet al.2013). Ahora se sabe que, aunque los antígenos tumorales tienen el potencial de ser inmunogénicos, debido a que los tumores surgen de las propias células del individuo, sólo las proteínas mutadas o las proteínas con un procesamiento de traducción alterado serán consideradas extrañas por el sistema inmunológico. Los antígenos que están regulados positivamente o sobreexpresados (los llamados autoantígenos) no necesariamente inducirán una respuesta inmune funcional contra el tumor: Las células T que expresan TCRs que son altamente reactivos a estos antígenos habrán sido seleccionadas negativamente dentro del timo en un proceso conocido como tolerancia central (Xinget al.2012; Ruellaet al.2014; Sharpeet al.2015), lo que significa que solo quedan células T con TCR de baja afinidad por los autoantígenos. Por lo tanto, la afinidad de los TCR o variantes de la presente descripción a MAG-003 se ha mejorado mediante métodos bien conocidos en la técnica como se describe a continuación.
Péptidos MAG-003
La descripción proporciona un péptido que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:24 o una variante del mismo que es 88 % homóloga a SEQ ID NO:1 a s Eq ID NO:24, o una variante del mismo que inducirá una reacción cruzada de las células T con un péptido descrito en el presente documento. En un aspecto, los péptidos de la descripción tienen la capacidad de unirse a una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) humano de clase I o versiones más largas de un péptido descrito en el presente documento de clase II. En un aspecto, un TCR descrito en el presente documento es capaz de unirse o unirse específicamente a un péptido descrito en el presente documento.
En los seres humanos existen tres loci genéticos diferentes que codifican moléculas MHC de clase I (las moléculas MHC del ser humano también se denominan antígenos leucocitarios humanos (HLA)): HLA-A, HLA-B y HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 y HLA-B*07 son ejemplos de diferentes alelos del MHC de clase I que pueden expresarse a partir de estos loci.
Tabla 3: Frecuencias de expresión F de HLA-A*02 y HLA-A*24 y los serotipos HLA-DR más frecuentes. Las frecuencias se deducen de las frecuencias del haplotipo Gf dentro de la población estadounidense adaptadas de Mori.et al.(Moriet al.,1997) empleando la fórmula de Hardy-Weinberg F = 1 - (1-Gf)2 Las combinaciones de A*02 o A*24 con ciertos alelos HLA-DR podrían enriquecerse o ser menos frecuentes de lo esperado a partir de sus frecuencias únicas debido a un desequilibrio de enlazado. Para obtener más información, consulte Chanock.et al.(Chanocket al.,2004).
Tabla 3
Gen MAGEA4
Este gen es miembro de la familia de genes MAGEA. Los miembros de esta familia codifican proteínas con una identidad de secuencia del 50 al 80% entre sí. Los promotores y primeros exones de los genes MAGEA muestran una variabilidad considerable, lo que sugiere que la existencia de esta familia de genes permite expresar la misma función bajo diferentes controles transcripcionales. Los genes MAGEA están agrupados en la ubicación cromosómica Xq28. Se les ha implicado en algunos trastornos hereditarios, como la disqueratosis congénita. Para este gen se han encontrado al menos cuatro variantes que codifican la misma proteína. (Proporcionado por RefSeq, julio de 2008).
La localización de MAGEA4 se ha descrito como citoplasmática (Kimet al.,2015). Sin embargo, la tinción MAGEA4 también se ha detectado en núcleos, con distribución diferencial entre núcleo y citoplasma en cánceres bien diferenciados versus menos diferenciados (Sarcevicet al.,2003).
MAGEA4 se utiliza como marcador de células germinales masculinas. No se expresa en gonocitos, pero sí en preespermatogonias y células germinales maduras (Mitchellet al.,2014).
Tabla 4: Objetivo general del cáncer
pMHC como objetivo
Un ensayo clínico de fase I investigó la transferencia adoptiva de CTL autólogos diseñados con TCR reactivos hacia MAGEA4(143-151) unidos a HLA-A*24:02 en pacientes con cáncer de esófago. Los pacientes recibieron linfocitos transducidos con TCR una vez, sin tratamiento previo, seguidos de inmunizaciones subcutáneas con el péptido MAGEA4 después de 2 y 4 semanas. No se observó regresión tumoral objetiva, posiblemente debido a la falta de un régimen linfodeplector y de la administración de IL2 (Kageyamaet al.,2015). Los estudios preclínicos en ratones habían demostrado que las células T transferidas inhibían el crecimiento de líneas celulares tumorales que expresaban MAGEA4 inoculadas en los ratones, y que la vacunación con péptidos adicionales mejoraba esta actividad antitumoral (Shirakuraet al.,2012).
Se propone apuntar a MAGEA4 con transferencia adoptiva de CTL como una opción de tratamiento para el linfoma de Hodgkin y no Hodgkin negativo para EBV. Se ha descrito que los CTL infundidos dirigidos a péptidos derivados del EBV inducen remisiones completas en pacientes con linfoma del EBV (+). Por lo tanto, se está explorando como posible opción de tratamiento apuntar a otros antígenos expresados por el linfoma, incluido MAGEA4 (Cruzet al.,2011; Gerdemannet al.,2011).
Varios estudios han demostrado la generación de células T CD4(+) específicas de MAGEA4 de donantes sanos y pacientes con cáncer después de la incubación con células presentadoras de antígenos autólogas pulsadas con grupos de péptidos superpuestos (Cessonet al.,2011; Gerdemannet al.,2011; Ohkuriet al.,2009).
El péptido MAG-003, es decir, KVLEHVVRV (SEQ ID NO:1), es un epítopo de linfocito T citotóxico (CTL) restringido a HLA-A*0201 de MAGEA4 (aminoácidos 286-294). (Jiaet al.2010; Wuet al.2011). En un aspecto, MAG-003 provoca CTLs específicos de péptidos tantoin vitrode PBMCs positivas para HLA-A*0201 y en ratones transgénicos HLA-A*0201/Kb. En otro aspecto, los CTLs inducidos generan lisis de células objetivo de forma restringida a HLA-A*0201, lo que demuestra que MAG-003 es un epítopo de CTL restringido a HLA-A*0201 y sirve como objetivo para la vacunación antitumoral terapéutica (Jiaet al.2010).
La FIG. 1 muestra la presentación del péptido MAG-003 en tejidos sanos y cánceres. Los resultados se resumen en la Tabla 5. En concreto, se estiman alrededor de 4,000 y 2,000 copias de MAG-003 por célula en tejidos tumorales de cáncer de ovario (OC) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), respectivamente.
Tabla 5: Presentación de MAG-003 en tejidos sanos y cánceres.
Perfiles de expresión de genes que codifican los péptidos de la descripción.
La presentación excesiva o específica de TAA en células tumorales en comparación con células sanas es suficiente para su utilidad en inmunoterapia, y algunos péptidos son específicos de tumores a pesar de que su fuente de proteína también se encuentra en tejidos sanos. Aun así, el perfil de expresión de ARNm añade un nivel adicional de seguridad en la selección de objetivos peptídicos para inmunoterapias. Especialmente para las opciones terapéuticas con altos riesgos de seguridad, tal como los TCRs madurados por afinidad, el péptido objetivo ideal se derivará de una proteína que sea exclusiva del tumor y que no se encuentre en los tejidos sanos.
Fuentes y preparación de ARN.
Las muestras de tejido extraídas quirúrgicamente se proporcionaron como se indicó anteriormente después de obtener el consentimiento informado por escrito de cada paciente. Las muestras de tejido tumoral se congelaron inmediatamente después de la cirugía y luego se homogeneizaron con mortero bajo nitrógeno líquido.
El ARN total se preparó a partir de estas muestras utilizando el reactivo TRI (Ambion, Darmstadt, Alemania) seguido de una limpieza con RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania); Ambos métodos se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Experimentos de ARNseq
El análisis de la expresión génica de muestras de ARN de tejido sano y tumoral se realizó mediante secuenciación de próxima generación (ARNseq) por CeGaT (Tübingen, Alemania). Las bibliotecas de secuenciación se preparan utilizando el kit de reactivos Illumina HiSeq v4 de acuerdo con el protocolo del proveedor (Illumina Inc, San Diego, CA, EE. UU.), que incluye fragmentación de ARN, conversión de ADNc y adición de adaptadores de secuenciación. Las bibliotecas derivadas de varias muestras se mezclan de forma equimolar y se secuencian en el secuenciador Illumina HiSeq 2500 de acuerdo con las instrucciones del fabricante, generando lecturas de un solo extremo de 50 pb. Las lecturas procesadas se asignan al genoma humano (GRCh38) utilizando el software STAR. Los datos de expresión se proporcionan a nivel de transcripción como RPKM (lecturas por kilobase por millón de lecturas mapeadas, generadas por el software Cufflinks) y a nivel de exón (lecturas totales, generadas por el software Bedtools), con base en las anotaciones de la base de datos de secuencias del conjunto (Ensembl77). Las lecturas de exones se normalizan de acuerdo con la longitud del exón y el tamaño de alineación para obtener valores de RPKM. Como se muestra en las FIGs. 2-4, MAG-003 se expresa altamente en tejidos cancerosos y en tejidos sanos de bajo riesgo, tal como los testículos, en comparación con los tejidos sanos de alto y medio riesgo.
Las Tablas 6 a 8 muestran datos de ARNSeq (puntuaciones de expresión) de la expresión de MAG-003 en diversos cánceres.
Tabla 6: Puntuación 1 de ARNSeq
Tabla7:Puntuación 3 de ARNSeq
Tabla 8: Expresión tumoral
En un aspecto, un péptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos como se indica en el presente documento puede tener uno o dos aminoácidos no ancla (ver más adelante con respecto al motivo anclaje) intercambiados sin que la capacidad de unirse a una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) humano de clase I o II cambia sustancialmente o se ve afectado negativamente, en comparación con el péptido no modificado. En otra realización, en un péptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos como se indica en el presente documento, uno o dos aminoácidos pueden intercambiarse con sus compañeros de intercambio conservadores (ver a continuación en el presente documento) sin que la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano de clase I o II cambie sustancialmente, o se vea afectada negativamente, en comparación con el péptido no modificado.
Los residuos de aminoácidos que no contribuyen sustancialmente a las interacciones con el TCR pueden modificarse reemplazándolos con otros aminoácidos cuya incorporación no afecte sustancialmente la reactividad de las células T y no elimine la unión al MHC relevante. Por tanto, aparte de la condición dada, el péptido de la descripción puede ser cualquier péptido (término mediante el cual los inventores incluyen oligopéptido o polipéptido), que incluye las secuencias de aminoácidos o una porción o variante de las mismas tal como se proporciona.
Tabla 9: Variantes y motivo de los péptidos.
Los péptidos más largos también pueden ser adecuados en un aspecto. Es posible que los epítopos del MHC de clase I, aunque normalmente el epítopo real sean residuos que no afectan sustancialmente la escisión proteolítica necesaria para exponer el epítopo real durante el procesamiento.
En un aspecto, los péptidos de la descripción se pueden alargar hasta en 1, 2, 3 o 4 aminoácidos, es decir, se pueden añadir 1, 2, 3 o 4 aminoácidos a cualquier extremo del péptido en cualquier combinación entre 8 y 11 aminoácidos de longitud. Se prefiere que los residuos que flanquean estén entre 4:0 y 0:4. Las combinaciones de alargamientos de acuerdo con la descripción se pueden encontrar en la Tabla 10.
Tabla 10: Combinaciones de las elongaciones de péptidos de la descripción.
Los aminoácidos para el alargamiento/extensión pueden ser los péptidos de la secuencia original de la proteína o cualquier otro aminoácido. El alargamiento se puede utilizar para mejorar la estabilidad o solubilidad de los péptidos.
Por tanto, los epítopos de la presente descripción pueden ser idénticos a los epítopos asociados a tumores o específicos de tumores que se producen de forma natural o pueden incluir epítopos que difieren en no más de cuatro residuos del péptido de referencia, siempre que tengan una actividad antigénica sustancialmente idéntica.
En una realización alternativa, el péptido se alarga en uno o ambos lados en más de 4 aminoácidos, preferiblemente hasta una longitud total de hasta 30 aminoácidos. En un aspecto, este alargamiento conduce a péptidos de unión al MHC de clase II. La unión al MHC de clase II se puede probar mediante métodos conocidos en la técnica.
Por consiguiente, la presente descripción proporciona péptidos y variantes de epítopos de MHC de clase I, en donde el péptido o variante tiene una longitud total de entre 8 y 100, preferiblemente entre 8 y 30, y lo más preferido entre 8 y 14, concretamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 aminoácidos, en el caso de los péptidos de unión de clase II más largos, la longitud también puede ser de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 aminoácidos.
En un aspecto, el péptido o variante de acuerdo con la presente descripción tendrá la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano de clase I o II. La unión de un péptido o una variante a un complejo MHC se puede probar mediante métodos conocidos en la técnica.
Preferiblemente, cuando las células T específicas para un péptido de acuerdo con la presente descripción se prueban frente a los péptidos sustituidos, la concentración de péptido a la que los péptidos sustituidos alcanzan la mitad del aumento máximo en la lisis con respecto al fondo no es más de aproximadamente 1 mM, preferiblemente no más de aproximadamente 1 pM, más preferiblemente no más de aproximadamente 1 nM, y aún más preferiblemente no más de aproximadamente 100 pM, y lo más preferiblemente no más de aproximadamente 10 pM. También se prefiere que el péptido sustituido sea reconocido por células T de más de un individuo, al menos dos y más preferiblemente tres individuos.
Como se usa en el presente documento, el término "complejo" se refiere a una molécula que se une específicamente a un determinante (por ejemplo, antigénico). En una realización, un complejo es capaz de dirigir la entidad a la que está unido (por ejemplo, una (segunda) fracción de unión a antígeno) a un sitio objetivo, por ejemplo, a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que porta el determinante antigénico (por ejemplo, el complejo de un péptido con MHC, de acuerdo con la aplicación en cuestión). En otra realización, un complejo es capaz de activar la señalización a través de su antígeno objetivo, por ejemplo, un antígeno del complejo receptor de células T Los complejos incluyen, entre otros, anticuerpos y fragmentos de los mismos, dominios de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprenden una región variable de cadena pesada de anticuerpo y una región variable de cadena ligera de anticuerpo, proteínas de unión que comprenden al menos un motivo repetido de anquirina y moléculas de unión a antígeno de dominio único (SDAB), aptámeros, TCRs (solubles) y células (modificadas) tales como células T alogénicas o autólogas. Para evaluar si una molécula es un complejo que se une a un objetivo, se pueden realizar ensayos de unión.
Unión "específica" significa que el complejo (por ejemplo, TCR) se une al complejo péptido-MHC de interés mejor que otros complejos péptido-MHC de origen natural, hasta el punto de que un complejo armado con una molécula activa que sea capaz de matar una célula que porta el objetivo específico no es capaz de matar otra célula sin el objetivo específico, pero presenta otros complejos péptido-MHC. La unión a otros complejos péptido-MHC es irrelevante si el péptido del péptido de reacción cruzada-MHC no se produce de forma natural, es decir, no se deriva del peptidoma HLA humano. Las pruebas para evaluar la matanza de células objetivo son bien conocidas en la técnica. Deben realizarse utilizando células objetivo (células primarias o líneas celulares) con una presentación de péptido-MHC inalterada, o células cargadas con péptidos de modo que se alcancen los niveles de péptido-MHC naturales.
Cada complejo puede comprender un marcaje que proporcione que el complejo unido pueda detectarse determinando la presencia o ausencia de una señal proporcionada por el marcador. Por ejemplo, el complejo puede marcarse con un tinte fluorescente o cualquier otra molécula marcadora celular aplicable. Estas moléculas marcadoras son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un marcaje fluorescente, por ejemplo, proporcionado por un tinte fluorescente, puede proporcionar una visualización del aptámero unido mediante microscopía de escaneo láser o de fluorescencia o citometría de flujo.
Cada complejo puede conjugarse con una segunda molécula activa tal como, por ejemplo, IL-21, anti-CD3 y anti-CD28.
Se puede encontrar más información sobre complejos polipeptídicos, por ejemplo, en la sección de antecedentes del documento WO 2014/071978A1.
Una "composición farmacéutica" es una composición adecuada para su administración a un ser humano en un entorno médico. Preferiblemente, una composición farmacéutica es estéril y se produce de acuerdo con las directrices GMP
Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción también incluyen al menos un TCR, TCR soluble, ácido nucleico y/o célula huésped que expresa un TCR de la presente descripción, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción también pueden incluir excipientes y/o estabilizadores farmacéuticamente aceptables.
Esta composición se usa para administración parenteral, tal como administración subcutánea, intradérmica, intramuscular u oral. Para ello, los péptidos y, dado el caso, otras moléculas se disuelven o suspenden en un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente acuoso. Además, la composición puede contener excipientes, tales como tampones, agentes aglutinantes, agentes explosivos, diluyentes, aromas, lubricantes, etc. Una lista extensa de excipientes que se pueden usar en dicha composición se puede tomar, por ejemplo, de A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). La composición se puede utilizar para la prevención, profilaxis y/o terapia de enfermedades adenomáticas o cancerosas. Se pueden encontrar formulaciones ejemplares en, por ejemplo, el documento EP2112253.
Un aspecto adicional de la descripción proporciona ácidos nucleicos (por ejemplo, polinucleótidos) que codifican un péptido, variantes peptídicas, TCR y variantes de TCR de la descripción. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, PNA, ARN o combinaciones de los mismos, formas de polinucleótidos monocatenarias y/o bicatenarias, o nativas o estabilizadas, tales como, por ejemplo, polinucleótidos con una cadena principal de fosforotioato y puede contener o no intrones siempre que codifique el péptido. Por supuesto, sólo los péptidos que contienen residuos de aminoácidos naturales unidos por enlaces peptídicos naturales son codificables por un polinucleótido. Aún otro aspecto de la descripción proporciona un vector de expresión capaz de expresar un polipéptido de acuerdo con la descripción.
Se han desarrollado diversos métodos para unir polinucleótidos, especialmente ADN, a vectores, por ejemplo, mediante extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo, se pueden añadir tractos de homopolímero complementarios al segmento de ADN que se va a insertar en el ADN del vector. Luego, el vector y el segmento de ADN se unen mediante enlaces de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante.
Los enlazadores sintéticos que contienen uno o más sitios de restricción proporcionan un método alternativo para unir el segmento de ADN a los vectores. Los enlazadores sintéticos que contienen una variedad de sitios de endonucleasas de restricción están disponibles comercialmente en varias fuentes, incluida International Biotechnologies Inc. New Haven, CN, EE. UU.
Un método deseable para modificar el ADN que codifica el polipéptido de la descripción emplea la reacción en cadena de la polimerasa como lo divulgada Saiki r K.et al.(Saikiet al.,1988). Este método puede usarse para introducir el ADN en un vector adecuado, por ejemplo, mediante ingeniería genética en sitios de restricción adecuados, o puede usarse para modificar el ADN de otras formas útiles como se conoce en la técnica. Si se utilizan vectores virales, se prefieren vectores de viruela o adenovirus.
En un aspecto, para obtener células T que expresan TCRs de la presente descripción, los ácidos nucleicos que codifican las cadenas de TCR-alfa y/o TCR-beta de la presente descripción se clonan en vectores de expresión, tales como retrovirus gamma o lentivirus. Los virus recombinantes se generan y luego se prueban su funcionalidad, como la especificidad del antígeno y la avidez funcional. Luego se utiliza una alícuota del producto final para transducir la población de células T objetivo (generalmente purificadas a partir de PBMC del paciente), que se expande antes de la infusión en el paciente.
En otro aspecto, para obtener células T que expresan TCRs de la presente descripción, se sintetizan los ARNs de TCR mediante técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, sistemas de transcripciónin vitro.Los ARNs de TCR sintetizadosin vitroluego se introducen en células T CD8+ primarias obtenidas de donantes sanos mediante electroporación para reexpresar cadenas de TCR-alfa y/o TCR-beta específicas del tumor.
Las cadenas de TCR introducidas en una célula T periférica pueden competir con las cadenas de TCR endógenas por la asociación con el complejo CD3, que es necesario para la expresión de la superficie del TCR. Debido a que un alto nivel de expresión de superficie de TCR es esencial para conferir una sensibilidad adecuada para la activación por parte de las células que expresan el antígeno tumoral objetivo (Cooperet al.,2000; Labrecqueet al.,2001), las estrategias que mejoran los niveles de expresión de los genes TCR-alfa y TCR-beta son una consideración importante en la terapia génica TCR.
Para aumentar la expresión, los ácidos nucleicos que codifican los TCRs de la presente descripción pueden unirse operativamente a promotores fuertes, tales como repeticiones terminales largas (LTRs) retrovirales, citomegalovirus (CMV), virus de células madre murinas (MSCV) U3, fosfoglicerato quinasa (PGK), p-actina, ubiquitina y un promotor compuesto del virus de los simios 40 (SV40)/CD43 (Cooperet al.,2004; Joneset al.,2009), factor de alargamiento (EF)-1a (Tsujiet al.,2005) y el promotor del virus formador de focos del bazo (SFFV) (Josephet al.,2008). En una realización preferida, el promotor es heterólogo con respecto al ácido nucleico que se expresa.
Además de promotores fuertes, los casetes de expresión de TCR de la presente descripción pueden contener elementos adicionales que pueden mejorar la expresión transgénica, incluyendo un tracto polipurínico central (cPPT), que promueve la translocación nuclear de constructos lentivirales (Follenziet al.,2000), y el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (wPRE), que aumenta el nivel de expresión transgénica al aumentar la estabilidad del ARN (Zuffereyet al.,1999).
Las cadenas alfa y beta de un TCR de la presente invención pueden estar codificadas por ácidos nucleicos ubicados en vectores separados, o pueden estar codificadas por polinucleótidos ubicados en el mismo vector.
Lograr una expresión superficial de TCR de alto nivel requiere que tanto las cadenas TCR-alfa como TCR-beta del TCR introducido se transcriban en niveles altos. Para ello, las cadenas TCR-alfa y TCR-beta de la presente descripción pueden clonarse en constructos bicistrónicos en un único vector, que ha demostrado ser capaz de superar este obstáculo. El uso de un sitio de entrada intrarribosomal viral (IRES) entre las cadenas TCR-alfa y TCR-beta da como resultado la expresión coordinada de ambas cadenas, porque las cadenas TCR-alfa y TCR-beta se generan a partir de un único transcrito que se divide en dos proteínas durante la traducción, asegurando que se produzca una proporción molar igual de cadenas TCR-alfa y TCR-beta. (Schmidtet al.2009).
Los ácidos nucleicos que codifican los TCR de la presente descripción pueden optimizarse con codones para aumentar la expresión de una célula huésped. La redundancia en el código genético permite que algunos aminoácidos sean codificados por más de un codón, pero ciertos codones son menos "óptimos" que otros debido a la relativa disponibilidad de ARNt coincidentes, así como a otros factores (Gustafssonet al.,2004). Se ha demostrado que la modificación de las secuencias de los genes TCR-alfa y TCR-beta de modo que cada aminoácido esté codificado por el codón óptimo para la expresión de genes de mamíferos, así como la eliminación de motivos de inestabilidad del ARNm o sitios de empalme crípticos, mejora significativamente la expresión de los genes TCR-alfa y TCR-beta (Scholtenet al.,2006).
Además, el emparejamiento incorrecto entre las cadenas de TCR introducidas y endógenas puede dar lugar a la adquisición de especificidades que suponen un riesgo significativo para la autoinmunidad. Por ejemplo, la formación de dímeros de t Cr mixtos puede reducir el número de moléculas de CD3 disponibles para formar complejos TCR emparejados adecuadamente y, por lo tanto, puede disminuir significativamente la avidez funcional de las células que expresan el TCR introducido (Kuballet al.,2007).
Para reducir el emparejamiento incorrecto, el dominio C-terminal de las cadenas de TCR introducidas de la presente descripción puede modificarse para promover la afinidad entre cadenas, al tiempo que disminuye la capacidad de las cadenas introducidas para emparejarse con el TCR endógeno. Estas estrategias pueden incluir la sustitución de los dominios C-terminales TCR-alfa y TCR-beta humanos con sus homólogos murinos (dominio C-terminal murinizado); generar un segundo enlace disulfuro entre cadenas en el dominio C-terminal mediante la introducción de un segundo residuo de cisteína en las cadenas TCR-alfa y TCR-beta del TCR introducido (modificación de cisteína); intercambiar residuos que interactúan en los dominios C-terminales de las cadenas TCR-alfa y TCR-beta ("perilla en el agujero"); y fusionar los dominios variables de las cadenas TCR-alfa y TCR-beta directamente a CD3Z (fusión de CD3Z). (Schmidtet al.2009).
El ADN (o en el caso de vectores retrovirales, el ARN) puede entonces expresarse en un huésped adecuado para producir un polipéptido que comprende el péptido o variante de la descripción. Así, el ADN que codifica el péptido o variante de la descripción puede usarse de acuerdo con técnicas conocidas, modificadas apropiadamente en vista de las enseñanzas contenidas en el presente documento, para construir un vector de expresión, que luego se usa para transformar una célula huésped apropiada para la expresión y producción del polipéptido de la descripción. Tales técnicas incluyen las divulgadas, por ejemplo, en los documentos US 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075, and 4,810,648.
El ADN (o en el caso de vectores retrovirales, el ARN) que codifica el polipéptido que constituye el compuesto de la descripción puede unirse a una amplia variedad de otras secuencias de ADN para su introducción en un huésped apropiado. El ADN acompañante dependerá de la naturaleza del huésped, la forma de introducción del ADN en el huésped y de si se desea el mantenimiento episomal o la integración.
Generalmente, el ADN se inserta en un vector de expresión, tal como un plásmido, en la orientación adecuada y en el marco de lectura correcto para la expresión. Si es necesario, el ADN puede unirse a las secuencias de nucleótidos de control reguladoras de la transcripción y la traducción apropiadas reconocidas por el huésped deseado, aunque dichos controles generalmente están disponibles en el vector de expresión. Luego, el vector se introduce en el huésped mediante técnicas estándar. Generalmente, no todos los huéspedes serán transformados por el vector. Por lo tanto, será necesario seleccionar células huésped transformadas. Una técnica de selección implica incorporar en el vector de expresión una secuencia de ADN, con cualquier elemento de control necesario, que codifique un rasgo seleccionable en la célula transformada, tal como la resistencia a los antibióticos.
Alternativamente, el gen para dicho rasgo seleccionable puede estar en otro vector, que se usa para cotransformar la célula huésped deseada.
Las células huésped que han sido transformadas por el ADN recombinante de la descripción se cultivan luego durante un tiempo suficiente y en condiciones apropiadas conocidas por los expertos en la técnica en vista de las enseñanzas divulgadas en el presente documento para permitir la expresión del polipéptido, que luego puede recuperarse.
Se conocen muchos sistemas de expresión, incluyendo las bacterias (por ejemploE. coliyBacillus subtilis),levaduras (por ejemplo,Saccharomyces cerevisiae),hongos filamentosos (por ejemploAspergillus spec.),células vegetales, células animales y células de insectos. Preferiblemente, el sistema puede ser células de mamífero tales como células CHO disponibles en la ATCC Cell Biology Collection.
En una realización, se modifica una célula huésped para expresar un TCR de la presente descripción. En realizaciones preferidas, la célula huésped es una célula T humana o una célula T progenitora. En algunas realizaciones, la célula T o el progenitor de célula T se obtiene de un paciente con cáncer. En otras realizaciones, la célula T o el progenitor de células T se obtiene de un donante sano. Las células huésped de la presente descripción pueden ser alogénicas o autólogas con respecto a un paciente a tratar. En una realización, el huésped es una célula T gamma/delta transformada para expresar un TCR alfa/beta.
Un plásmido vector de células de mamífero típico para expresión constitutiva comprende el promotor CMV o SV40 con una cola poli A adecuada y un marcador de resistencia, tal como neomicina. Un ejemplo es pSVL disponible en Pharmacia, Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU. Un ejemplo de un vector de expresión inducible en mamíferos es pMSG, también disponible en Pharmacia. Los vectores plasmídicos de levadura útiles son pRS403-406 y pRS413-416 y generalmente están disponibles en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE.UU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos integradores de levadura (YIps) e incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, TRP1, l EU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos centrómeros de levadura (Ycps). Los vectores basados en promotores de CMV (por ejemplo, de Sigma-Aldrich) proporcionan expresión transitoria o estable, expresión o secreción citoplásmica y etiquetado N-terminal o C-terminal en diversas combinaciones de FLAG, 3xFLAG, c-myc o MAT. Estas proteínas de fusión permiten la detección, purificación y análisis de proteínas recombinantes. Las fusiones con etiquetas dobles brindan flexibilidad en la detección.
La fuerte región reguladora del promotor del citomegalovirus humano (CMV) impulsa niveles de expresión de proteínas constitutivas de hasta 1 mg/l en las células COS. Para líneas celulares menos potentes, los niveles de proteína suelen ser de ~0.1 mg/L. La presencia del origen de replicación de SV40 dará como resultado altos niveles de replicación de ADN en células COS permisivas a la replicación de SV40. Los vectores CMV, por ejemplo, pueden contener el origen pMB1 (derivado de pBR322) para la replicación en células bacterianas, el gen de la b-lactamasa para la selección de resistencia a ampicilina en bacterias, hGH poliA y el origen f1. Los vectores que contienen la secuencia líder de preprotripsina (PPT) pueden dirigir la secreción de proteínas de fusión FLAG al medio de cultivo para su purificación utilizando anticuerpos, resinas y placas ANTI-FLAG. Otros vectores y sistemas de expresión son bien conocidos en la técnica para su uso con una variedad de células huésped.
En otra realización, dos o más péptidos o variantes peptídicas de la descripción se codifican y, por lo tanto, se expresan en un orden sucesivo (similar a constructos de "perlas en una cuerda"). Al hacerlo, los péptidos o variantes peptídicas pueden unirse o fusionarse entre sí mediante tramos de aminoácidos enlazadores, tales como por ejemplo LLLLLL, o pueden unirse sin ningún péptido adicional entre ellos. Estos constructos también se pueden utilizar para la terapia del cáncer y pueden inducir respuestas inmunitarias que impliquen tanto al MHCI como al MHC II.
La presente descripción también se refiere a una célula huésped transformada con un constructo de vector polinucleotídico de la presente descripción. La célula huésped puede ser procariótica o eucariota. En algunas circunstancias, las células bacterianas pueden ser células huésped procarióticas preferidas y, por lo general, son una cepade E. colital como, por ejemplo, cepas deE. coliDH5 disponibles en Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EE. UU., y RR1 disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, EE. UU. (No ATCC 31343). Las células huésped eucariotas preferidas incluyen células de levadura, insectos y mamíferos, preferiblemente células de vertebrados tales como las de ratón, rata, mono o líneas celulares fibroblásticas y de colon humanas. Las células huésped de levadura incluyen YPH499, YPH500 y YPH501, que generalmente están disponibles en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Las células huésped de mamífero preferidas incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) disponibles en la ATCC como CCL61, células de embrión de ratón suizo NIH/3T3 disponibles en la ATCC como CRL 1658, células COS-1 derivadas de riñón de mono disponibles de la ATCC como células CRL 1650 y 293 que son células de riñón embrionario humano. Las células de insecto preferidas son células Sf9 que pueden transfectarse con vectores de expresión de baculovirus. Se puede encontrar una descripción general sobre la elección de células huésped adecuadas para la expresión, por ejemplo, en el libro de texto de Paulina Balbas y Argelia Lorence "Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols,", primera parte, segunda edición, ISBN 978-1-58829-262-9y otra literatura conocida por el experto.
La transformación de células huésped apropiadas con un constructo de ADN de la presente descripción se logra mediante métodos bien conocidos que típicamente dependen del tipo de vector utilizado. Con respecto a la transformación de células huésped procarióticas, véase, por ejemplo, Cohenet al.(Cohenet al.,1972) y(Green y Sambrook, 2012). La transformación de las células de levadura se describe en Sherman.et al.(Shermanet al.,1986). También resulta útil el método de Beggs (Beggs, 1978). Con respecto a las células de vertebrados, los reactivos útiles para transfectar dichas células, por ejemplo, fosfato cálcico y DEAE-dextrano o formulaciones de liposomas, están disponibles en Stratagene Cloning Systems o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EE.UU. La electroporación también es útil para transformar y/o transfectar células y es bien conocida en la técnica para transformar células de levadura, células bacterianas, células de insecto y células de vertebrados.
Células transformadas con éxito,es decir,las células que contienen un constructo de ADN de la presente descripción pueden identificarse mediante técnicas bien conocidas tales como PCR. Alternativamente, la presencia de la proteína en el sobrenadante se puede detectar usando anticuerpos.
Se apreciará que ciertas células huésped de la descripción son útiles en la preparación de los péptidos de la descripción, por ejemplo, células bacterianas, de levadura e insectos. Sin embargo, otras células huésped pueden resultar útiles en determinados métodos terapéuticos. Por ejemplo, pueden usarse de manera útil células presentadoras de antígenos, tales como células dendríticas, para expresar los péptidos de la descripción de manera que puedan cargarse en moléculas de MHC apropiadas. Por tanto, la descripción actual proporciona una célula huésped que comprende un ácido nucleico o un vector de expresión de acuerdo con la descripción.
En una realización preferida, la célula huésped es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica o una célula presentadora de antígeno. Las APC cargadas con una proteína de fusión recombinante que contiene fosfatasa ácida prostática (PAP) fueron aprobadas por la U.S. Food and Drug Administration (FDA) el 29 de abril de 2010 para tratar la HRPC metastásica asintomática o mínimamente sintomática (Sipuleucel-T) (Riniet al.,2006; Smallet al.,2006).
Un aspecto adicional de la descripción proporciona un método para producir un péptido o su variante, comprendiendo el método cultivar una célula huésped y aislar el péptido de la célula huésped o su medio de cultivo.
En otra realización, los TCR, el ácido nucleico o el vector de expresión de la descripción se usan en medicina. Por ejemplo, el péptido o su variante se puede preparar para inyección intravenosa (i.v.), inyección subcutánea (s.c.), inyección intradérmica (i.d.), inyección intraperitoneal (i.p.), inyección intramuscular (i.m.). Los métodos preferidos de inyección de péptidos incluyen sc, i.d., i.p., i.m. e i.v. Los métodos preferidos de inyección de ADN incluyen i.d., i.m., sc, i.p. y i.v. Se pueden administrar dosis de, por ejemplo, entre 50 |jg y 1.5 mg, preferiblemente de 125 |jg a 500 |jg, de péptido o ADN y dependerán del péptido o ADN respectivo. Dosificaciones de este intervalo se utilizaron con éxito en ensayos anteriores (Walteret al.,2012).
El polinucleótido usado para la vacunación activa puede ser sustancialmente puro o estar contenido en un vector o sistema de administración adecuado. El ácido nucleico puede ser ADN, ADNc, PNA, ARN o una combinación de los mismos. Los métodos para diseñar e introducir dicho ácido nucleico son bien conocidos en la técnica. Una visión general es proporcionada por, por ejemplo, Teufelet al.(Teufelet al.,2005). Las vacunas de polinucleótidos son fáciles de preparar, pero no se comprende completamente el modo de acción de estos vectores para inducir una respuesta inmune. Los vectores y sistemas de administración adecuados incluyen ADN y/o ARN viral, tales como sistemas basados en adenovirus, virus vaccinia, retrovirus, virus del herpes, virus adenoasociados o híbridos que contienen elementos de más de un virus. Los sistemas de administración no virales incluyen lípidos catiónicos y polímeros catiónicos y son bien conocidos en la técnica de la administración de ADN. También se puede utilizar la entrega física, por ejemplo, a través de una "pistola genética". El péptido o péptidos codificados por el ácido nucleico pueden ser una proteína de fusión, por ejemplo, con un epítopo que estimula las células T para la CDR opuesta respectiva como se indicó anteriormente.
La presente descripción se refiere además a aptámeros. Aptámeros (ver por ejemplo el documento WO 2014/191359 y la literatura citada allí) son moléculas cortas de ácido nucleico monocatenario, que pueden plegarse en estructuras tridimensionales definidas y reconocer estructuras objetivo específicas. Han parecido ser alternativas adecuadas para desarrollar terapias dirigidas. Se ha demostrado que los aptámeros se unen selectivamente a una variedad de objetivos complejos con alta afinidad y especificidad.
En la última década se han identificado aptámeros que reconocen moléculas ubicadas en la superficie celular y proporcionan medios para desarrollar enfoques diagnósticos y terapéuticos. Dado que se ha demostrado que los aptámeros casi no poseen toxicidad ni inmunogenicidad, son candidatos prometedores para aplicaciones biomédicas. De hecho, los aptámeros, por ejemplo, los aptámeros que reconocen el antígeno de membrana específico de la próstata se han empleado con éxito para terapias dirigidas y se ha demostrado que son funcionales en modelos de xenoinjertoin vivo.Además, se han identificado aptámeros que reconocen líneas celulares tumorales específicas.
Los aptámeros de ADN se pueden seleccionar para revelar propiedades de reconocimiento de amplio espectro para diversas células cancerosas, y particularmente aquellas derivadas de tumores sólidos, mientras que las células sanas primarias y no tumorigénicas no se reconocen. Si los aptámeros identificados reconocen no sólo un subtipo de tumor específico, sino que interactúan con una serie de tumores, esto hace que los aptámeros sean aplicables como los llamados diagnósticos y terapéuticos de amplio espectro.
Además, la investigación del comportamiento de unión celular con citometría de flujo mostró que los aptámeros revelaron afinidades aparentes muy buenas que se encuentran dentro del intervalo nanomolar.
Los aptámeros son útiles con fines diagnósticos y terapéuticos. En un aspecto, las células tumorales absorben al menos uno o más aptámeros y, por lo tanto, pueden funcionar como vehículos moleculares para la administración dirigida de agentes anticancerígenos tales como ARNip a las células tumorales.
Los aptámeros pueden seleccionarse frente a objetivos complejos tales como células y tejidos y complejos de los péptidos o los TCR que comprenden, preferiblemente que consisten en, una secuencia de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NO 25 a SEQ ID NO 26, de acuerdo con la descripción que nos ocupa con el Molécula MHC, mediante la técnica celular-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment).
En una realización, la descripción proporciona un método para producir un TCR como se describe en el presente documento, comprendiendo el método cultivar una célula huésped capaz de expresar el TCR en condiciones adecuadas para promover la expresión del TCR.
La presente descripción se refiere además a un método para identificar y aislar un TCR de acuerdo con la presente descripción, comprendiendo dicho método incubar PBMC de donantes sanos HLA-A*02 negativos con monómeros A2/MAG-003, incubar las PBMC con tetrámero-ficoeritrina. (PE) y aislar las células T de alta avidez mediante análisis Calibur de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
La presente descripción se refiere además a un método para identificar y aislar un TCR de acuerdo con la presente descripción, comprendiendo dicho método incubar PBMC de donantes sanos HLA-A*02 negativos con monómeros A2/p286-1Y2L, incubar las PBMC con tetrámero-ficoeritrina. (PE) y aislar las células T de alta avidez mediante análisis Calibur de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
La presente descripción se refiere además a un método para identificar y aislar un TCR de acuerdo con la presente descripción, comprendiendo dicho método incubar PBMC de donantes sanos HLA-A*02 negativos con monómeros A2/p286-1Y2L9L, incubar las PBMC con tetrámero-ficoeritrina. (PE) y aislar las células T de alta avidez mediante análisis Calibur de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
La presente descripción se refiere además a un método para identificar y aislar un TCR de acuerdo con la presente descripción, comprendiendo dicho método obtener un ratón transgénico con todos los loci del gen TCRap humano (1.1 y 0.7 Mb), cuyas células T expresan un repertorio diverso de TCR humanos que compensa la deficiencia de TCR de ratón, inmunizando al ratón con MAG-003, incubando PBMC obtenidas de ratones transgénicos con tetrámeroficoeritrina (PE) y aislando las células T de alta avidez mediante análisis Calibur de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
La presente descripción se refiere además a un método para identificar y aislar un TCR de acuerdo con la presente descripción, comprendiendo dicho método obtener un ratón transgénico con todos los loci del gen TCRap humano (1.1 y 0.7 Mb), cuyas células T expresan un repertorio diverso de TCR humano que compensa la deficiencia de TCR de ratón, inmunizando al ratón con p286-1Y2L, incubando PBMC obtenidas de ratones transgénicos con tetrámeroficoeritrina (PE) y aislando las células T de alta avidez mediante análisis Calibur de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
La presente descripción se refiere además a un método para identificar y aislar un TCR de acuerdo con la presente descripción, comprendiendo dicho método obtener un ratón transgénico con todos los loci del gen TCRap humano (1.1 y 0.7 Mb), cuyas células T expresan un repertorio diverso de TCR humano que compensa la deficiencia de TCR de ratón, inmunizando al ratón con p286-1Y2L9L, incubando PBMC obtenidas de ratones transgénicos con tetrámeroficoeritrina (PE) y aislando las células T de alta avidez mediante análisis Calibur de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
La presente descripción se refiere además al método de acuerdo con la descripción, en donde la célula T comprende un vector de expresión capaz de expresar A TCR de acuerdo con la presente descripción.
La presente descripción se refiere además a un método para matar células objetivo en un paciente cuyas células objetivo expresan de manera aberrante MAG-003, comprendiendo el método administrar al paciente un número eficaz de TCRs, TCRs solubles y/o células T de acuerdo con la presente descripción.
La presente descripción se refiere además al uso de cualquier TCR descrito, un ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción, un vector de expresión de acuerdo con la presente descripción, una célula de acuerdo con la presente descripción o un linfocito T citotóxico activado de acuerdo con la presente descripción como un medicamento o en la fabricación de un medicamento. La presente descripción se refiere además a un uso de acuerdo con la presente descripción, en donde el medicamento es activo contra el cáncer.
La presente descripción se refiere además a un uso de acuerdo con la descripción, en donde dichas células cancerosas son células de cáncer de pulmón de células no pequeñas u otras células tumorales sólidas o hematológicas tales como cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de células renales, cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, cáncer de vesícula biliar y de vías biliares y cáncer de esófago.
La presente descripción se refiere además a un método para matar células cancerosas que comprende poner en contacto las células cancerosas con una célula huésped de la presente descripción. En una realización, la célula huésped expresa un TCR de la presente descripción. En una realización, la célula huésped es una célula T o una célula T progenitora. En una realización, las células cancerosas se seleccionan de células de cáncer de pulmón de células no pequeñas u otras células tumorales sólidas o hematológicas tales como cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de células renales, cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, cáncer de vesícula biliar y de vías biliares y cáncer de esófago. En algunas realizaciones, el TCR está conjugado con un agente terapéuticamente activo. En determinadas realizaciones, el agente terapéuticamente activo se selecciona del grupo que consiste en un radionucleido, un agente quimioterapéutico y una toxina.
La presente invención se refiere además a un constructo que reconoce antígenos para su uso en el tratamiento del cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una célula huésped de la presente invención. En una realización, la célula huésped expresa un TCR de la presente descripción. En una realización, la célula huésped es una célula T o una célula T progenitora. En una realización, la célula huésped es autóloga del sujeto que se va a tratar. En otra realización, la célula huésped es alogénica para el sujeto que se va a tratar. En una realización preferida, las células cancerosas se seleccionan de células de cáncer de pulmón de células no pequeñas u otras células tumorales sólidas o hematológicas tales como cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de células renales, cáncer de cerebro, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, leucemia, cáncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, cáncer de vesícula biliar y de vías biliares y cáncer de esófago.
En algunas realizaciones, el TCR está conjugado con un agente terapéuticamente activo. Como se usa en el presente documento, el término "agente terapéuticamente activo" significa un compuesto usado para tratar o prevenir una enfermedad o condición médica indeseable. En una realización, el agente terapéuticamente activo se usa para tratar o prevenir el cáncer. En determinadas realizaciones, el agente terapéuticamente activo se selecciona del grupo que consiste en un radionucleido, un agente quimioterapéutico y una toxina.
Los TCR, los ácidos nucleicos y las células huésped de la presente descripción, y sus composiciones farmacéuticas, pueden administrarse a un sujeto que los necesite mediante rutas conocidas en la técnica, y pueden variar dependiendo del tipo de cáncer a tratar. Las vías de administración incluyen, por ejemplo, administración local (tal como intratumoral) y administración parenteral tal como subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intraportal e intrahepática. En una realización preferida, los TCRs, ácidos nucleicos o células huésped de la presente descripción, o composiciones farmacéuticas de los mismos, se administran a un sujeto mediante infusión local, por ejemplo, usando una bomba de infusión y/o un sistema de catéter, en un sitio que se va a tratar, tal como por ejemplo un tumor sólido. En una realización, una composición de la presente descripción se infunde en un tumor sólido, un vaso sanguíneo que alimenta un tumor sólido y/o el área que rodea un tumor sólido.
En realizaciones preferidas, las composiciones de la presente descripción se administran a un sujeto usando un régimen de dosificación de al menos dos administraciones separadas por al menos 24 horas. Los regímenes de dosificación adecuados para administrar composiciones de la presente descripción incluyen, por ejemplo, una vez al día, una vez cada dos días y una vez cada tres días. Los regímenes de dosificación más preferidos incluyen una vez por semana, dos veces por semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes y dos veces al mes. En realizaciones particulares, se usa un régimen de aumento de dosis, en donde se administra una serie de dosis crecientes a un sujeto durante un período de días, semanas o meses.
Las dosis eficaces de células huésped que expresan TCRs de la presente invención incluyen, por ejemplo, al menos aproximadamente 104, al menos aproximadamente 105, al menos aproximadamente 106, al menos aproximadamente 107, al menos aproximadamente 108, al menos aproximadamente 109y al menos 1010 células huésped por dosis. En una realización, las células huésped de la presente descripción se administran en una dosis de entre aproximadamente 104 a aproximadamente 1010 células por dosis, preferiblemente en una dosis de entre aproximadamente 105 a aproximadamente 109 células por dosis. En realizaciones preferidas, las dosis se administran en un régimen de dosificación en el transcurso de al menos dos o más ciclos de dosificación.
La presente invención también se refiere a un constructo que reconoce antígenos para su uso en el tratamiento del cáncer que comprende administrar un TCR, un ácido nucleico o una célula huésped de la presente descripción en combinación con al menos un agente quimioterapéutico y/o radioterapia.
También se proporciona un constructo que reconoce antígenos para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende:
a) aislar una célula de dicho sujeto;
b) transformar la célula con al menos un vector que codifica un TCR de la presente descripción para producir una célula transformada;
c) expandir la célula transformada para producir una pluralidad de células transformadas; y
d) administrar la pluralidad de células transformadas a dicho sujeto.
También se proporciona un constructo que reconoce antígenos para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende:
a) aislar una célula de un donante sano;
b) transformar la célula con un vector que codifica un TCR de la presente descripción para producir una célula transformada;
c) expandir la célula transformada para producir una pluralidad de células transformadas; y
d) administrar la pluralidad de células transformadas a dicho sujeto.
También se proporciona un método para detectar cáncer en una muestra biológica que comprende:
a) poner en contacto la muestra biológica con un TCR de la presente descripción;
b) detectar la unión del TCR a la muestra biológica.
La presente descripción se refiere además a proteínas marcadoras y biomarcadores particulares basados en los péptidos de acuerdo con la presente descripción, denominados en el presente documento "objetivos" que pueden usarse en el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de pulmón de células no pequeñas. La presente descripción también se refiere al uso de estos nuevos objetivos para el tratamiento del cáncer.
Un aspecto adicional de la descripción es proporcionar un método para producir un receptor de células T soluble (sTCR) que reconoce un complejo péptido-MHC específico. Estos receptores de células T solubles pueden generarse a partir de clones de células T específicos y su afinidad puede aumentarse mediante mutagénesis dirigida a las regiones determinantes de la complementariedad. Para la selección del receptor de células T, se puede utilizar la presentación en fagos (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). Con el fin de estabilizar los receptores de células T durante la presentación en fagos y en caso de uso práctico como fármaco, se pueden enlazar las cadenas alfa y beta,por ejemplo,por enlaces disulfuro no nativos, otros enlaces covalentes (receptor de células T de cadena sencilla) o por dominios de dimerización (Boulteret al.,2003; Cardet al.,2004; Willcoxet al.,1999). El receptor de células T puede estar vinculado a toxinas, fármacos, citoquinas (véase, por ejemplo, el documento US 2013/0115191)), dominios que reclutan células efectoras tales como un dominio anti-CD3, etc. para ejecutar funciones particulares en las células objetivo. En otro aspecto, se expresa en células T utilizadas para la transferencia adoptiva. Véase, por ejemplo, el documento WO 2004/033685A1, el documento WO 2004/074322A1, y el documento WO 2013/057586A1.
Además, los péptidos y/o los TCRs o anticuerpos u otras moléculas de unión de la presente descripción se pueden usar para verificar el diagnóstico de un cáncer por parte de un patólogo basándose en una muestra de biopsia.
Los anticuerpos o TCRs también pueden usarse paraen vivoensayos de diagnóstico. Generalmente, el anticuerpo o TCR está marcado con un radionucleótido (tal como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P o 35S) para que el tumor pueda localizarse mediante inmunogammagrafía. En una realización, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen a los dominios extracelulares de dos o más objetivos de una proteína seleccionada del grupo que consiste en las proteínas mencionadas anteriormente, y el valor de afinidad (Kd) es inferior a 1 x 10 pM.
Los anticuerpos o TCRs para uso diagnóstico pueden marcarse con sondas adecuadas para la detección mediante diversos métodos de formación de imágenes. Los métodos para la detección de sondas incluyen, entre otros, microscopía de fluorescencia, óptica, confocal y electrónica; imágenes por resonancia magnética y espectroscopia; fluoroscopia, tomografía computarizada y tomografía por emisión de positrones. Las sondas adecuadas incluyen, entre otras, fluoresceína, rodamina, eosina y otros fluoróforos, radioisótopos, oro, gadolinio y otros lantánidos, hierro paramagnético, flúor-18 y otros radionucleidos emisores de positrones. Además, las sondas pueden ser bi o multifuncionales y ser detectables mediante más de uno de los métodos enumerados. Estos anticuerpos y/o TCRs pueden marcarse directa o indirectamente con dichas sondas. La unión de sondas a los anticuerpos y/o TCRs incluye la unión covalente de la sonda, la incorporación de la sonda al anticuerpo o TCR y la unión covalente de un compuesto quelante para la unión de la sonda, entre otros bien reconocidos en la técnica. Para la inmunohistoquímica, la muestra de tejido de la enfermedad puede ser fresca o congelada o puede incluirse en parafina y fijarse con un conservante tal como formalina. La sección fijada o incrustada que contiene la muestra se pone en contacto con un anticuerpo primario marcado y un anticuerpo secundario, en donde el anticuerpo se usa para detectar la expresión de las proteínas in situ.
Ejemplos
Se pueden utilizar entornos alorreactivos para eludir la autotolerancia y producir células T con una mayor avidez en comparación con las células T derivadas de entornos autólogos, es decir, pacientes. Ejemplos de tales configuraciones incluyen generaciónin vitrode células T reactivas alo-HLA y específicas de péptidos (Sadovnikovaet al.1998; Savageet al.2004; Wildeet al.2012), e inmunización de ratones transgénicos para MHC humano o TCR humano (Stanislawskiet al.2001; Liet al.2010).
Ejemplo 1: Generaciónin vitrode células T específicas de péptidos reactivas alo-HLA (Savage et al. 2004)
Se utilizaron PBMC de donantes sanos HLA-A*02 positivos y HLA-A*02 negativos después de obtener el consentimiento informado. Los monómeros HLA-A2 clase I biotinilados recombinantes y los tetrámeros fluorescentes A2 que contienen MAG-003 se obtuvieron de MBLI (Woburn, MA). Las PBMC se incubaron con anti-CD20SA diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron y se incubaron con los monómeros A2/MAG-003 biotinilados durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron y se sembraron en placas a 3x106 células/pocillo en placas de 24 pocillos en RPMI con suero AB humano al 10%. Se añadió interleucina 7 (IL-7; R&D Systems, Minneapolis, MN) el día 1 a 10 ng/ml y se añadió IL-2 (Chiron, Harefield, Reino Unido) a 10 U/ml el día 4. Durante un período de 5 semanas, las células se reestimularon semanalmente con PBMC frescas, se mezclaron con células respondedoras en una proporción de 1:1 y se sembraron en placas a 3x106/pocillo en placas de 24 pocillos.
Para obtener células T de alta avidez, aproximadamente 106 PBMC con tetrámero-ficoeritrina (PE) HLA-A2/MAG-003 (obtenido de MBLI) se incubaron durante 30 minutos a 37 °C, seguido de isotiocianato de fluoresceína anti-CD8 (FITC)/aloficocianina (APC) durante 20 minutos a 4°C, seguido de análisis Calibur de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). La clasificación se realizó con un FACS-Vantage (Becton Dickinson, Cowley, Oxford, Reino Unido). Las células positivas para tetrámero clasificadas se expandieron en placas de 24 pocillos usando, por pocillo, 2x105 células ordenadas, 2*10® PBMC A2 negativas irradiadas como alimentadores, 2 * 104 perlas CD3/CD28/ml (Dynal, Oslo Noruega) e IL-2 (1000 U/ml). Las células T de alta avidez así obtenidas se usaron luego para identificar y aislar TCR usando técnicas conocidas en la técnica, tales como 5' RACE (Amplificación Rápida de Extremos de ADNc) de células individuales. Luego se analizaron los ADN de TCR no redundantes para la determinación de secuencias de aminoácidos/ADN y la clonación en vectores de expresión usando métodos bien conocidos en la técnica.
Ejemplo 2: Inmunización de ratones transgénicos para MHC humano o TCR humano
MAG-003 se utilizan para inmunizar ratones transgénicos con todos los loci del gen TCRap humano (1.1 y 0.7 Mb), cuyas células T expresan un repertorio diverso de TCR humano que compensa la deficiencia de TCR de ratón. (Liet al.2010). Para obtener células T de alta avidez, las PBMCs obtenidas de ratones transgénicos se incuban con tetrámero-ficoeritrina (PE) y luego se clasifican las células como se describe anteriormente. Las células T de alta avidez, así obtenidas, se usan luego para identificar y aislar TCRs para la determinación de secuencias de aminoácidos/ADN y la clonación en vectores de expresión usando métodos descritos en la técnica.
En un aspecto, MAG-003 y sus variantes, es decir, p286-1Y2L (que tiene 2 sustituciones de aminoácidos, SEQ ID NO:13) y p286-1Y2L9L (que tiene 3 sustituciones de aminoácidos, SEQ ID NO:14) exhiben una potente afinidad de unión y estabilidad hacia la molécula HLA-A*0201. En particular, p286-1Y2L9L mostró la capacidad de inducir CTLs específicos que, en un aspecto, generan lisis de las células cancerosas objetivo tanto de<p>B<m>C de donantes sanos como de ratones transgénicos HLA-A2.1/Kb. Véase, por ejemplo, (Wuet al.2011).
Para obtener TCRs de alta avidez para los complejos MHC I o II/p286-1Y2L o p286-1Y2L9L, estos péptidos se pueden usar en los métodos descritos en los Ejemplos 1 y 2. Las células T de alta avidez, así obtenidas, se usan luego para identificar y aislar TCRs para la determinación de secuencias de aminoácidos/ADN y la clonación en vectores de expresión usando métodos descritos en la técnica.
Ejemplo 3: Clonación de TCR
Los métodos de clonación de TCR se conocen en la técnica, por ejemplo, como se describe en el documento U.S.
8,519,100 para dichos métodos. El oligonucleótido A1 específico de la secuencia de la región variable de la cadena alfa (ggaattccatatgagtcaacaaggagaagaagatcc SEQ ID NO:26) que codifica el sitio de restricción NdeI, una metionina introducida para el inicio eficiente de la expresión en bacterias, y un oligonucleótido A2 específico de la secuencia de la región constante de la cadena alfa (ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg SEQ ID NO :27) que codifica el sitio de restricción SalI se utilizan para amplificar la región variable de la cadena alfa. En el caso de la cadena beta, un oligonucleótido B1 específico de la secuencia de la región variable de la cadena beta (tctctcatatggatggtggaattactcaatccccaa SEQ ID NO:28) que codifica el sitio de restricción NdeI, una metionina introducida para el inicio eficiente de la expresión en bacterias, y un oligonucleótido B2 específico de la secuencia de la región constante de la cadena beta (tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc SEQ ID NO:29) que codifica el sitio de restricción AgeI se usan para amplificar la región variable de la cadena beta.
Las secuencias de ADN que codifican la cadena de TCR alfa cortada con NdeI y SalI se ligan en el vector pGMT7+Ca, que se cortó con NdeI y XhoI. Las secuencias de ADN que codifican la cadena de TCR beta cortada con NdeI y AgeI se ligaron en un vector pGMT7+Cp separado, que también se cortó con NdeI y AgeI. Los plásmidos ligados se transforman en células competentes de la cepa xL1-blue deEscherichia coliy se siembran en placas de LB/agar que contienen 100 pg/ml de ampicilina. Después de la incubación durante la noche a 37°C, se recogen colonias individuales y se cultivan en 10 ml de LB que contiene 100 pg/ml de ampicilina durante la noche a 37°C con agitación. Los plásmidos clonados se purifican utilizando un kit Miniprep (Qiagen) y el inserto se secuencia utilizando un secuenciador de ADN automatizado (Lark Technologies).
Se aislaron y amplificaron tres TCR (R20P1H7, R7P1D5 y R10P2G12, ver tabla 2), cada uno de los cuales codifica cadenas TCR-alfa y TCR-beta específicas de tumores, a partir de células T de donantes sanos. Se estimularon in vitro células de donantes sanos de acuerdo con el método descrito en Walter et. Alabama. 2003. Las células específicas objetivo se clasificaron de forma individual utilizando multímeros específicos objetivo para el posterior aislamiento de TCR. Las secuencias de TCR se aislaron mediante 5' RACE mediante métodos estándar como se describe, por ejemplo, por Molecular Cloning a laboratory manual cuarta edición por Green and Sambrook. Los tres TCRs se derivaron de donantes positivos para HLA-A2. Se secuenciaron las regiones variables alfa y beta de los TCRs R20P1H7, R7P1D5 y R10P2G12.
Se encontró que el dominio variable de TCR alfa R20P1H7 tenía una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos 22-133 de SEQ ID NO:39. Se encontró que el dominio variable de TCR beta R20P1H7 tenía una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos 20-135 de SEQ ID NO:47.
El dominio variable de TCR alfa R7P1D5 tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos 22-131 de SEQ ID NO:55. El dominio variable de TCR beta R7P1D5 tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos 20-131 de SEQ ID NO:63.
El dominio variable de TCR alfa R10P2G12 tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos 21 136 de SEQ ID NO:71. El dominio variable de TCR beta R10P2G12 tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos 20-134 de SEQ ID NO:79.
La presentación en fagos se puede utilizar para generar bibliotecas de variantes de TCR para identificar mutantes de alta afinidad. Los métodos de detección y visualización de fagos TCR descritos en (Li et al, (2005) Nature Biotech 23 (3): 349-354) se puede aplicar a un TCR de referencia seleccionado entre los TCR descritos en la Tabla 2.
Por ejemplo, las tres regiones CDR de la secuencia de la cadena alfa de las SEQ ID NO: 39, 55 y 71; y las tres regiones CDR de la secuencia de la cadena beta de SEQ ID NO: 47, 55 y 79 pueden ser objeto de mutagénesis, y cada biblioteca de CDR se analiza y criba por separado.
En consecuencia, se identifican TCRs con afinidades y/o vidas medias de unión al menos dos veces mayores que las de un TCR de referencia (y, por lo tanto, implícitamente, al menos dos veces mayores que las del TCR nativo).
Los heterodímeros de TCR se repliegan utilizando el método que incluye las cisteínas introducidas en las regiones constantes para proporcionar el enlace disulfuro entre cadenas artificial. De esa manera se preparan TCRs, que consisten en (a) la cadena de TCR beta de referencia, junto con cadenas alfa mutadas; (b) la cadena de TCR alfa de referencia junto con las cadenas beta mutadas; y (c) diversas combinaciones de cadenas beta y alfa, incluyendo los dominios variables mutantes.
La interacción entre los TCRs enlazados por disulfuro solubles de alta afinidad y las variantes de TCR y el complejo HLA-A*02 del péptido nativo KVLEHWRV (SEQ ID NO:1) se puede analizar utilizando el método BIAcore.
También se pueden seleccionar variantes de TCR de alta avidez a partir de una biblioteca de mutantes de CDR mediante presentación de levadura o células T (Holleret al.2003; Chervinet al.2008). Las variantes candidatas de TCR, por tanto, proporcionan orientación para diseñar mutaciones de las CDRs de TCR para obtener variantes de TCR de alta avidez (Robbinset al.2008; Zoeteet al.2007).
Ejemplo 4: Modificación de células T autólogas
Las células T se pueden diseñar para expresar TCR de alta avidez (las llamadas terapias TCR) o receptores de antígenos quiméricos (CARs) derivados de fusión de proteínas que tienen una especificidad de antígeno mejorada para el complejo MHC I/MAG-003 o el complejo MHC II/MAG-003. En un aspecto, este enfoque supera algunas de las limitaciones asociadas con la tolerancia central y periférica, y genera células T que serán más eficientes para dirigirse a tumores sin el requisito de activaciónde novode células T en el paciente.
En un aspecto, para obtener células T que expresan TCRs de la presente descripción, los ácidos nucleicos que codifican las cadenas TCR-alfa y/o TCR-beta específicas del tumor identificadas y aisladas, como se describe en los Ejemplos 1-3, se clonan en vectores de expresión, tal como el retrovirus gamma o el lentivirus. Los virus recombinantes se generan y luego se prueban su funcionalidad, como la especificidad del antígeno y la avidez funcional. Luego se utiliza una alícuota del producto final para transducir la población de células T objetivo (generalmente purificadas a partir de PBMC del paciente), que se expande antes de la infusión en el paciente.
En otro aspecto, para obtener células T que expresan TCRs de la presente descripción, se sintetizaron ARNs de TCR mediante técnicas descritas en la técnica, por ejemplo, sistemas de transcripciónin vitro.Los ARNs de TCR sintetizados in vitro se introdujeron luego en células T CD8+ primarias obtenidas de donantes sanos mediante electroporación para reexpresar cadenas de TCR-alfa y/o TCR-beta específicas del tumor.
Para determinar la especificidad y afinidad de los TCR, las células T CD8+ transformadas se incubaron conjuntamente con células objetivo cargadas con MAG-003 o con células objetivo cargadas con el péptido homólogo pero no relacionado RABGAP1L-001 (SEQ ID NO:91), AXIN1-001 (SEQ ID NO:92), ANO5-001 (SEQ ID NO:93), TPX2-001 (SEQ ID NO:94), SYNE3-001 (SEQ ID NO:95), MIA3-001 (SEQ ID NO:96), HERC4-001 (SEQ ID NO:97), PSME2-001 (SEQ ID NO:98), HEATR5A-001 (SEQ ID NO:99) o CNOT1-003 (SEQ ID NO:100) o péptido de control NYESO1- 001 (SEQ ID NO:101), seguido del ensayo de liberación de IFN-y. Las células objetivo descargadas y las células T CD8+ solas sirvieron como controles. La secreción de IFN-<y>de las células T CD8+ es indicativa de la activación de las células T con actividad citotóxica.
Tabla 11
Como se muestra en las FIGS. 5-7 todas las células T CD8+ primarias transformadas con TCRs de la presente divulgación, después de la coincubación con células objetivo cargadas con MAG-003, liberaron niveles mucho más altos de IFN-y que los estimulados por células objetivo cargadas con péptidos no relacionados, y los controles. El análisis de valoración del péptido objetivo mostró que la EC50 oscila entre aproximadamente 3 nM y aproximadamente 10 nM (Tabla 11). Estos resultados sugieren que los TCRs de la presente invención pueden activar la actividad de las células T citotóxicas, por ejemplo, la liberación de IFN-<y>, mediante interacción específica con el complejo MHC/MAG-003.
La activación de las células T se confirmó además mediante una técnica de tinción con tetrámeros para detectar células T citotóxicas activadas que se unen a MHC/MAG-003. Como se muestra en la FIG. 8 y la Tabla 11, un mayor porcentaje de células T CD8+ que expresan TCR se tiñeron con tetrámero MHC/MAG-003 marcado con fluorescencia positiva que con el tetrámero de control MHC/NYESO1-001 o control imitación. Como control, las células T CD8+ primarias transformadas con TCRs, tal como TCR 1G4, que se sabe que se une específicamente al complejo MHC/NYESO1-001, se activaron fácilmente mediante células objetivo cargadas con NYESO1-001. Las cadenas alfa y beta de TCR 1G4 se muestran en SEQ ID NO: 89 y 90, respectivamente:
Cadena alfa 1G4 (SEQ ID NO:89):
METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKG
LTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGT
SLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFrDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMD
FKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIG
FRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
Cadena beta 1G4 (SEQ ID NO:90):
MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPG
MGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSWFCASSYVGNTGELF
FGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEV
HSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQD
RAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKR
KDSRG
Para determinar el motivo de unión de los TCR para el complejo MAG-003/MHC, se realizó un análisis de escaneo de alanina posicional en cada uno de los 9 aminoácidos del péptido MAG-003. Los péptidos MAG-003 sustituidos con alanina se muestran en la Tabla 12.
Tabla 12
Las células T CD8+ electroporadas con ARN que codifica el TCR de interés se incubaron conjuntamente con células objetivo cargadas con MAG-003, MAG-003-A1 a MAG-003-A9, o un péptido NYESO1-001 no relacionado, seguido de un ensayo de liberación de IFNy como se describió anteriormente.
Los resultados del análisis de escaneo de alanina posicional se muestran en las FIGS. 9-11 y resumido en la Tabla 13.
Tabla 13
Un cribado de todo el genoma para péptidos de unión a A*02 con un motivo idéntico no reveló péptidos potencialmente de reacción cruzada para los TCRs R20P1H7, R7P1D5 y R10P2G12, respectivamente. Estos resultados sugieren que los TCRs descritos en el presente documento exhiben un patrón de reconocimiento muy específico con un riesgo reducido de efectos no deseados.
Para determinar la eficacia de las células T que expresan los TCRs descritos en el presente documento, se incubaron conjuntamente células T CD8+ primarias electroporadas con ARN de los TCRs R7P1D5, R20P1H7 y R10P2G12 con diferentes líneas celulares de cáncer humano, por ejemplo, A-375 (línea celular de melanoma humano, que es positiva para la expresión de HLA-A2 y MAG-003), T98G (línea celular de glioblastoma humano, que es positiva para HLA-A2 y negativa para MAG-003) y SK-BR-3 (línea celular de cáncer de mama humano, que es HLA-A2 negativo y MAG-003 negativo), seguido del ensayo de liberación de IFN<y>.
Como se muestra en la FIG. 12A-C, se observó liberación de IFNy en células A-375, que son positivas para HLA-A2 y MAG-003, pero no en células T98G y SK-BR-3, que tienen niveles basales de liberación de IFNy que son comparables. al del control de células efectoras únicamente. Además, las células T CD8+ transformadas con TCR R7P1D5, pero no los controles, también mostraron una mayor liberación de IFNy cuando se incubaron conjuntamente con la línea celular de cáncer de células no pequeñas humana, H1755 (datos no mostrados). Estos resultados indican que las células T que expresan los TCRs R7P1D5, R20P1H7 y R10P2G12 pueden inducir específicamente actividad citotóxica dirigida a las células cancerosas de una manera específica HLA-A2/MAG-003.
La presente descripción proporciona TCRs que son útiles en el tratamiento de cánceres/tumores, preferiblemente melanoma y cáncer de pulmón de células no pequeñas que presentan en exceso o exclusivamente MAG-003.
Ejemplo 5: Modificación alogénica de células T
Las células T gamma delta (y§), que son efectores de linfocitos T no convencionales implicados en la primera línea de defensa contra patógenos, pueden interactuar y erradicar las células tumorales de manera independiente del MHC mediante la activación de receptores, entre otros, cadenas TCR-gamma y TCR-delta. Estas células T<y>§ muestran un fenotipo preactivado que permite una producción rápida de citoquinas (IFN-y, TNF-a) y una fuerte respuesta citotóxica tras la activación. Estas células T tienen actividad antitumoral contra muchos cánceres y sugieren que la inmunoterapia mediada por células T y§ es factible y puede inducir respuestas tumorales objetivas. (Brazaet al.2013).
Los avances recientes que utilizan antígenos inmovilizados, anticuerpos monoclonales agonistas (mAbs), células presentadoras de antígenos artificiales derivadas de tumores (aAPC) o combinaciones de mAb activadores y aAPC han logrado expandir las células T gamma delta con repertorios de TCR oligoclonales o policlonales. Por ejemplo, el complejo mayor de histocompatibilidad inmovilizado relacionado con la cadena de Clase I A fue un estímulo para las células T y6 que expresan isotipos TCR61, y los anticuerpos activadores unidos a la placa han expandido células V61 y V62ex vivo.Cantidades clínicamente suficientes de TCR61, TCR62 y TCR61negTCR62neg se han producido después del cocultivo en aAPC, y estos subconjuntos mostraron diferencias en el fenotipo de la memoria y la reactividad a los tumoresin vitroy envivo.(Denigeret al.2014).
Además, las células T y§ son susceptibles de modificación genética, como lo demuestra la introducción de cadenas TCR-alfa y TCR-beta. (Hiasaet al.2009). Otro aspecto de la presente descripción se relaciona con la producción de células T<y>6 que expresan TCR-alfa y TCR-beta que se unen a MAG-003. Para ello, las células T<y>§ se expanden mediante los métodos descritos por Deniger.et al.2014, seguido de la transducción de los virus recombinantes que expresan los TCRs que se unen a MAG-003 (como se describe en el Ejemplo 3) en las células T<y>§ expandidas. Luego, las células T y§ transducidas con virus se infunden en el paciente.
Ejemplo 6: Seguridad de los TCR específicos de MAG-003
Se aislaron y amplificaron tres TCRs específicos de MAG-003 (R7P1D5, R10P2G12, R20P1H7, ver Tabla 2), cada uno de los cuales codifica cadenas TCR-alfa y TCR-beta específicas de tumores, a partir de células T de donantes sanos. Las células de donantes sanos se estimularonin vitrode acuerdo con un método previamente descrito (Walter et al., 2003 J Immunol., 15 de noviembre;171(10):4974-8) y las células específicas objetivo se clasificaron de forma individual usando multímeros HLA-A*02 y luego se usaron para el posterior aislamiento de TCR. Las secuencias de TCR se aislaron mediante 5' RACE mediante métodos estándar como se describe, por ejemplo, por Molecular Cloning a laboratory manual cuarta edición por Green and Sambrook. Las regiones variables alfa y beta de los TCRs R7P1D5, R10P2G12 y R20P1H7 se secuenciaron y clonaron para una mayor caracterización funcional. Los TCRs R7P1D5, R10P2G12 y R20P1H7 se derivan de un donante positivo para HlA-A*02.
Tabla 13: Tipos de células objetivo
Los TCRs de interés se expresaron en células T humanas mediante electroporación de ARN y se evaluó la liberación de IFN-<y>de las células T después del cocultivo con diferentes células objetivo, tales como células T2 cargadas con diferentes péptidos, así como líneas celulares tumorales y células primarias de tejidos sanos. Los datos de activación de células T se muestran en niveles absolutos de IFN-y o de forma normalizada como se indica a continuación.
La eficacia de las células T CD8+ que expresan los TCRs R7P1D5, R10P2G12 y R20P1H7 se determinó mediante estudios de activación de células T (liberación de IFN-<y>) utilizando diferentes líneas de células tumorales como células objetivo. La caracterización del perfil de seguridad de los TCRs de interés se abordó probando la activación potencial de las células T que expresan TCR tras el cocultivo con tipos de células primarias aisladas de tejidos sanos y tipos de células derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) de HLA- A*02-donantes positivos. Los tipos de células se seleccionaron de manera que cubrieran la mayoría de los órganos críticos, como por ejemplo cerebro, corazón e hígado y diferentes tipos de células como epitelio, endotelio o músculo liso. Las líneas de células tumorales se analizaron una al lado de la otra como controles positivos y negativos.
Método de normalización para la liberación de IFN<y>:
Mediai,n o r m ( T C R o i ; c o ) [ m e d i a C T C R o i ; c o ) - m e d i a ( T C R o i ; s o l o e f e c t o r ) ] - ! m e d i a (jmjBcjjn ; C 0 ) - m e d i a ( ¡ m i t a c i ó n ; s o lo e f e c to r ) ]
El CVnorm se calculó:
C V norm (TCRoi: co) = [CV(TCRoi; co)2 CV(TCRoi; solo efector)''+ CV,(imitación:; co) c v .(im itación; solo efector) !] A[ l / 2 ]
TCRoi = células efectoras que expresan TCR de interés
Imitación = células efectoras sin expresión de TCR exógeno
Co = células efectoras cocultivadas con células objetivo
Sólo efector = células efectoras no cocultivadas
Media(norm) = liberación media de IFNy (normalizada)
CV(norm) = coeficiente de variación (normalizado)
Resultados:
Para las células T CD8+ que expresan TCR R7P1D5, R10P2G12 o R20P1H7, no se observó activación tras el cocultivo con tipos de células positivas para HLA-A*02 de tejidos sanos (ver Figura 13), mientras que hubo actividad hacia las líneas celulares tumorales A- 375 y NCI-H1755 que expresan HLA-A*02 y MAGEA4 como gen fuente del péptido MAG-003. Se observó un patrón similar de reactividad con las células T<c>D8+ que expresan el TCR 1G4 específico de NYESO1, que se encontró que eran reactivas hacia NYESO1 que expresa líneas celulares tumorales positivas para HLA-A*02, pero no hacia el panel indicado de células de tejido sano.
La activación de células T tras el cocultivo con líneas celulares que expresan HLA-A*02 y MAGEA4 refleja el reconocimiento del pHLA objetivo expresado y procesado endógenamente por los TCRs R7P1D5, R10P2G12 y R20P1H7.
El análisis de seguridad indica la ausencia de reactividad cruzada inesperada o posible aloreactividad de TCR R7P1D5, R10P2G12 y R20P1H7 hacia células primarias de tejido sano. Esto es digno de mención ya que los tipos de células primarias probadas representan miles de ligandos HLA normales en el contexto de HLA-A*02 y probablemente también representan alelos HLA alogénicos adicionales que varían de un tipo de célula normal a un tipo de célula normal.
Ejemplo 7: Expresión lentiviral del TCR de la invención
Los productos de células T se generaron a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) totales en masa aisladas de donantes sanos siguiendo un proceso de fabricación ACTengine a pequeña escala. La columna vertebral del vector lentiviral que expresa el TCR R7P1D5 de la invención para fabricar células T ACTengine se diseñó basándose en estudios previos y múltiples ensayos clínicos (Porter et al., 2011; Kalos et al., 2011; y otros). Brevemente, se activaron PBMCs descongeladas y en reposo con anticuerpos CD3/CD28 y se transdujeron con sobrenadantes virales concentrados fabricados usando diversos vectores lentivirales que portaban el transgén TCR R7P1D5 con diferentes orientaciones de cadenas a y p y diversas combinaciones de promotores y secuencias potenciadoras (los constructos se denominaron R71 -R78). Dos de los 8 constructos (R74, R75) se eliminaron debido a títulos bajos y/o productividad deficiente. Las células transducidas con los 6 sobrenadantes virales restantes se expandieron y se evaluaron para determinar la expresión del transgén mediante citometría de flujo.
Las orientaciones fueron las siguientes: Alfa Beta: R71, R72, 75, 76; beta-alfa: R73, R74, R77, 78, IG4.
Todos los productos de células T mostraron una viabilidad comparable, porcentaje de linfocitos y células T CD3+. El porcentaje de células T CD4+ y CD8+ varió entre los donantes. No se observaron diferencias en términos de toxicidad entre los 6 sobrenadantes virales. El constructo lentiviral R7P1D5 TCR R73 indujo consistentemente una mayor expresión de TCR como se detectó en la superficie mediante la unión del tetrámero. De acuerdo con la expresión transgénica, los constructos lentivirales siguen el orden: R73>R78>R77>R71>R76>R72 (Figura 14).
Se realizaron experimentos adicionales con 2 nuevos donantes para confirmar la transducibilidad del virus R7P1D5 TCR R73. Las células transducidas de todos los experimentos se analizaron para su evaluación funcional en ensayos de liberación y matanza de citoquinas. En todos los donantes analizados, las células T transducidas con R73 derivadas de PBMCs completas de cuatro donantes exhibieron una producción de IFNy significativamente mayor tras el cocultivo con células A375 que expresan el antígeno MAGE-A4 en comparación con las células T no transducidas (Fig. 15A). La respuesta de IFN<y>fue estrictamente específica de antígeno ya que la inducción en presencia de células MCF-7 que carecen de expresión de MAGE-A4 estaba por debajo de los niveles de fondo. Además, el valor de EC50 derivado de las curvas de titulación T2 que representan cantidades de IFN<y>detectadas en respuesta a una concentración decreciente del péptido MAG-003 fue de 10.0 nM en ambos donantes (Fig. 15B).
Además de la liberación de citoquinas, se probaron productos de células T transducidas con R7P1D5 TCR (virus R73) en un ensayo de matanza de liberación de Cr51 de 4 horas. Se evaluó el reconocimiento y la lisis de células tumorales MAGE-A4+ A375 que presentan el péptido MAG-003 procesado endógenamente. Las células T transducidas con R73 mostraron una mayor matanza que las células no transducidas en todas las proporciones E:T (Fig. 16A, B). Los efectos citotóxicos observados con células transducidas con R73 estuvieron mediados de manera específica de antígeno, ya que el porcentaje de lisis observado con MAGE-A4+ objetivo fue significativamente mayor que el observado con células objetivo negativas para MAGEA-A4 (Fig. 16C).
Lista de referencia
Adair SJ, Hogan KT (2009). Treatment of ovarian cancer cell lines with 5-aza-2'-deoxycytidine upregulates the expression of cancer-testis antigens and class I major histocompatibility complex-encoded molecules. Cancer Immunol. Immunother. 58, 589-601.
Alves PM, Levy N, Bouzourene H, Viatte S, Bricard G, Ayyoub M, Vuilleumier H, Givel JC, Halkic N, Speiser DE, Romero P, Levy F (2007). Molecular and immunological evaluation of the expression of cancer/testis gene products in human colorectal cancer. Cancer Immunol. Immunother. 56, 839-847.
Andrade VC, Vettore AL, Felix RS, Almeida MS, Carvalho F, Oliveira JS, Chauffaille ML, Andriolo A, Caballero OL, Zago MA, Colleoni GW (2008). Prognostic impact of cancer/testis antigen expression in advanced stage multiple myeloma patients. Cancer Immun. 8, 2.
Aubry F, Satie AP, Rioux-Leclercq N, Rajpert-De ME, Spagnoli GC, Chomez P, De BO, Jegou B, Samson M (2001). MAGE-A4, a germ cell specific marker, is expressed differentially in testicular tumors. Cancer 92, 2778-2785.
Barrow C, Browning J, MacGregor D, Davis ID, Sturrock S, Jungbluth AA, Cebon J (2006). Tumor antigen expression in melanoma varies according to antigen and stage. Clin Cancer Res 12, 764-771.
Bellati F, Napoletano C, Tarquini E, Palaia I, Landi R, Manci N, Spagnoli G, Rughetti A, Panici PB, Nuti M (2007). Cancer testis antigen expression in primary and recurrent vulvar cancer: association with prognostic factors. Eur. J Cancer 43, 2621-2627.
Bergeron A, Picard V, LaRue H, Harel F, Hovington H, Lacombe L, Fradet Y (2009). High frequency of MAGE-A4 and MAGE-A9 expression in high-risk bladder cancer. Int. J Cancer 125, 1365-1371.
Bhan S, Chuang A, Negi SS, Glazer CA, Califano JA (2012). MAGEA4 induces growth in normal oral keratinocytes by inhibiting growth arrest and apoptosis. Oncol Rep. 28, 1498-1502.
Bode PK, Thielken A, Brandt S, Barghorn A, Lohe B, Knuth A, Moch H (2014). Cancer testis antigen expression in testicular germ cell tumorigenesis. Mod. Pathol. 27, 899-905.
Cabezon T, Gromova I, Gromov P, Serizawa R, Timmermans W, V, Kroman N, Celis JE, Moreira JM (2013). Proteomic profiling of triple-negative breast carcinomas in combination with a three-tier orthogonal technology approach identifies Mage-A4 as potential therapeutic target in estrogen receptor negative breast cancer. Mol. Cell Proteomics. 12, 381 394.
Cesson V, Rivals JP, Escher A, Piotet E, Thielemans K, Posevitz V, Dojcinovic D, Monnier P, Speiser D, Bron L, Romero P (2011). MAGE-A3 and MAGE-A4 specific CD4(+) T-cells in head and neck cancer patients: detection of naturally acquired responses and identification of new epitopes. Cancer Immunol. Immunother. 60, 23-35.
Chambost H, Van BN, Brasseur F, Godelaine D, Xerri L, Landi SJ, Theate I, Plumas J, Spagnoli GC, Michel G, Coulie PG, Olive D (2000). Expression of gene MAGE-A4 in Reed-Sternberg cells. Blood 95, 3530-3533.
Chitale DA, Jungbluth AA, Marshall DS, Leitao MM, Hedvat CV, Kolb D, Spagnoli GC, Iversen K, Soslow RA (2005). Expression of cancer-testis antigens in endometrial carcinomas using a tissue microarray. Mod. Pathol. 18, 119-126.
Coral S, Parisi G, Nicolay HJ, Colizzi F, Danielli R, Fratta E, Covre A, Taverna P, Sigalotti L, Maio M (2013). Immunomodulatory activity of SGI-110, a 5-aza-2'-deoxycytidine-containing demethylating dinucleotide. Cancer Immunol. Immunother. 62, 605-614.
Cruz CR, Gerdemann U, Leen AM, Shafer JA, Ku S, Tzou B, Horton TM, Sheehan A, Copeland A, Younes A, Rooney CM, Heslop HE, Bollard CM (2011). Improving T-cell therapy for relapsed EBV-negative Hodgkin lymphoma by targeting upregulated MAGE-A4. Clin Cancer Res 17, 7058-7066.
Cuffel C, Rivals JP, Zaugg Y, Salvi S, Seelentag W, Speiser DE, Lienard D, Monnier P, Romero P, Bron L, Rimoldi D (2011). Pattern and clinical significance of cancer-testis gene expression in head and neck squamous cell carcinoma. Int. J Cancer 128, 2625-2634.
Daudi S, Eng KH, Mhawech-Fauceglia P, Morrison C, Miliotto A, Beck A, Matsuzaki J, Tsuji T, Groman A, Gnjatic S, Spagnoli G, Lele S, Odunsi K (2014). Expression and immune responses to MAGE antigens predict survival in epithelial ovarian cancer. PLoS. ONE. 9, 0104099.
Duffour MT, Chaux P, Lurquin C, Cornelis G, Boon T, van der Bruggen P (1999). A MAGE-A4 peptide presented by HLA-A2 is recognized by cytolytic T lymphocytes. Eur. J Immunol. 29, 3329-3337.
Forghanifard MM, Gholamin M, Farshchian M, Moaven O, Memar B, Forghani MN, Dadkhah E, Naseh H, Moghbeli M, Raeisossadati R, Abbaszadegan MR (2011). Cancer-testis gene expression profiling in esophageal squamous cell carcinoma: identification of specific tumor marker and potential targets for immunotherapy. Cancer Biol Ther. 12, 191 197.
Gerdemann U, Katari U, Christin AS, Cruz CR, Tripic T, Rousseau A, Gottschalk SM, Savoldo B, Vera JF, Heslop HE, Brenner MK, Bollard CM, Rooney CM, Leen AM (2011). Cytotoxic T lymphocytes simultaneously targeting multiple tumor-associated antigens to treat EBV negative lymphoma. Mol. Ther. 19, 2258-2268.
Gunda V, Cogdill AP, Bernasconi MJ, Wargo JA, Parangi S (2013). Potential role of 5-aza-2'-deoxycytidine induced MAGE-A4 expression in immunotherapy for anaplastic thyroid cancer. Surgery 154, 1456-1462.
Gure AO, Chua R, Williamson B, Gonen M, Ferrera CA, Gnjatic S, Ritter G, Simpson AJ, Chen YT, Old LJ, Altorki NK (2005). Cancer-testis genes are coordinately expressed and are markers of poor outcome in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 11, 8055-8062.
Hartmann S, Meyer TJ, Brands RC, Haubitz IR, Linz C, Seher A, Kubler AC, Muller-Richter UD (2015). MAGE-A expression clusters and antineoplastic treatment in head and neck cancer. Int. J Mol. Med. 35,1675-1682.
Hussein YM, Morad FE, Gameel MA, Emam WA, El Sawy WH, El Tarhouny SA, Bayomy ES, Raafat N (2012). MAGE-4 gene m-RNA and TGF in blood as potential biochemical markers for HCC in HCV-infected patients. Med. Oncol 29, 3055-3062.
Jacobs JF, Grauer OM, Brasseur F, Hoogerbrugge PM, Wesseling P, Gidding CE, van de Rakt MW, Figdor CG, Coulie PG, de Vries IJ, Adema GJ (2008). Selective cancer-germline gene expression in pediatric brain tumors. J Neurooncol.
88, 273-280.
Jia ZC, Ni B, Huang ZM, Tian Y, Tang J, Wang JX, Fu XL, Wu YZ (2010). Identification of two novel HLA-A*0201-restricted CTL epitopes derived from MAGE-A4. Clin Dev. Immunol. 2010, 567594.
Kageyama S, Ikeda H, Miyahara Y, Imai N, Ishihara M, Saito K, Sugino S, Ueda S, Ishikawa T, Kokura S, Naota H, Ohishi K, Shiraishi T, Inoue N, Tanabe M, Kidokoro T, Yoshioka H, Tomura D, Nukaya I, Mineno J, Takesako K, Katayama N, Shiku H (2015). Adoptive Transfer of MAGE-A4 T-cell Receptor Gene-Transduced Lymphocytes in Patients with Recurrent Esophageal Cancer. Clin. Cancer Res.
Kang J, Lee HJ, Kim J, Lee JJ, Maeng LS (2015). Dysregulation of X chromosome inactivation in high grade ovarian serous adenocarcinoma. PLoS. ONE. 10, e0118927.
Kawagoe H, Yamada A, Matsumoto H, Ito M, Ushijima K, Nishida T, Yakushiji M, Itoh K (2000). Serum MAGE-4 protein in ovarian cancer patients. Gynecol. Oncol 76, 336-339.
Kim K, Cho YM, Park BH, Lee JL, Ro JY, Go H, Shim JW (2015). Histological and immuno-histochemical markers for progression prediction in transurethrally resected high-grade non-muscle invasive bladder cancer. Int. J Clin Exp. Pathol. 8, 743-750.
Kobayashi T, Lonchay C, Colau D, Demotte N, Boon T, van der Bruggen P (2003). New MAGE-4 antigenic peptide recognized by cytolytic T lymphocytes on HLA-A1 tumor cells. Tissue Antigens 62, 426-432.
Kocher T, Zheng M, Bolli M, Simon R, Forster T, Schultz-Thater E, Remmel E, Noppen C, Schmid U, Ackermann D, Mihatsch MJ, Gasser T, Heberer M, Sauter G, Spagnoli GC (2002). Prognostic relevance of MAGE-A4 tumor antigen expression in transitional cell carcinoma of the urinary bladder: a tissue microarray study. Int. J Cancer 100, 702-705. Kubuschok B, Xie X, Jesnowski R, Preuss KD, Romeike BF, Neumann F, Regitz E, Pistorius G, Schilling M, Scheunemann P, Izbicki JR, Lohr JM, Pfreundschuh M (2004). Expression of cancer testis antigens in pancreatic carcinoma cell lines, pancreatic adenocarcinoma and chronic pancreatitis. Int. J Cancer 109, 568-575.
Li J, Yang Y, Fujie T, Tanaka F, Mimori K, Haraguchi M, Ueo H, Mori M, Akiyoshi T (1997). Expression of the MAGE gene family in human gastric carcinoma. Anticancer Res 17, 3559-3563.
Li M, Yuan YH, Han Y, Liu YX, Yan L, Wang Y, Gu J (2005). Expression profile of cancer-testis genes in 121 human colorectal cancer tissue and adjacent normal tissue. Clin Cancer Res 11, 1809-1814.
Lifantseva N, Koltsova A, Krylova T, Yakovleva T, Poljanskaya G, Gordeeva O (2011). Expression patterns of cancertestis antigens in human embryonic stem cells and their cell derivatives indicate lineage tracks. Stem Cells Int. 2011, 795239.
Luftl M, Schuler G, Jungbluth AA (2004). Melanoma or not? Cancer testis antigens may help. Br. J Dermatol. 151, 1213 1218.
Melo DH, Mamede RC, Neder L, Saggioro FP, Figueiredo DL, da Silva WAJ, Jungbluth AA, Zago MA (2011). Expression of MAGE-A4 and MAGE-C1 tumor-associated antigen in benign and malignant thyroid diseases. Head Neck 33, 1426 1432.
Mischo A, Kubuschok B, Ertan K, Preuss KD, Romeike B, Regitz E, Schormann C, de BD, Wadle A, Neumann F, Schmidt W, Renner C, Pfreundschuh M (2006). Prospective study on the expression of cancer testis genes and antibody responses in 100 consecutive patients with primary breast cancer. Int. J Cancer 118, 696-703.
Mitchell RT, Camacho-Moll E, MacDonald J, Anderson RA, Kelnar CJ, O'Donnell M, Sharpe RM, Smith LB, Grigor KM, Wallace WH, Stoop H, Wolffenbuttel KP, Donat R, Saunders PT, Looijenga LH (2014). Intratubular germ cell neoplasia of the human testis: heterogeneous protein expression and relation to invasive potential. Mod. Pathol. 27,1255-1266. Miyahara Y, Naota H, Wang L, Hiasa A, Goto M, Watanabe M, Kitano S, Okumura S, Takemitsu T, Yuta A, Majima Y, Lemonnier FA, Boon T, Shiku H (2005). Determination of cellularly processed HLA-A2402-restricted novel CTL epitopes derived from two cancer germ line genes, MAGE-A4 and SAGE. Clin Cancer Res 11, 5581-5589.
Montoro JR, Mamede RC, Neder SL, Saggioro FP, Figueiredo DL, Silva WA, Jr., Jungbluth AA, Spagnoli GC, Zago MA (2012). Expression of cancer-testis antigens MAGE-A4 and MAGE-C1 in oral squamous cell carcinoma. Head Neck 34, 1123-1128.
Nagao T, Higashitsuji H, Nonoguchi K, Sakurai T, Dawson S, Mayer RJ, Itoh K, Fujita J (2003). MAGE-A4 interacts with the liver oncoprotein gankyrin and suppresses its tumorigenic activity. J Biol Chem 278, 10668-10674.
Naota H, Miyahara Y, Okumura S, Kuzushima K, Akatsuka Y, Hiasa A, Kitano S, Takahashi T, Yuta A, Majima Y, Shiku H (2006). Generation of peptide-specific CD8+ T-cells by phytohe-magglutinin-stimulated antigen-mRNA-transduced CD4+ T-cells. J Immunol. Methods 314, 54-66.
Nishikawa H, Maeda Y, Ishida T, Gnjatic S, Sato E, Mori F, Sugiyama D, Ito A, Fukumori Y, Utsunomiya A, Inagaki H, Old LJ, Ueda R, Sakaguchi S (2012). Cancer/testis antigens are novel targets of immunotherapy for adult T-cell leukemia/lymphoma. Blood 119, 3097-3104.
Oba-Shinjo SM, Caballero OL, Jungbluth AA, Rosemberg S, Old LJ, Simpson AJ, Marie SK (2008). Cancer-testis (CT) antigen expression in medulloblastoma. Cancer Immun. 8, 7.
Ohkuri T, Wakita D, Chamoto K, Togashi Y, Kitamura H, Nishimura T (2009). Identification of novel helper epitopes of MAGE-A4 tumour antigen: useful tool for the propagation of Th1 cells. Br. J Cancer 100, 1135-1143.
Ottaviani S, Colau D, van der Bruggen P, van der Bruggen P (2006). A new MAGE-4 antigenic peptide recognized by cytolytic T lymphocytes on HLA-A24 carcinoma cells. Cancer Immunol. Immunother. 55, 867-872.
Otte M, Zafrakas M, Riethdorf L, Pichlmeier U, Loning T, Janicke F, Pantel K (2001). MAGE-A gene expression pattern in primary breast cancer. Cancer Res 61, 6682-6687.
Peikert T, Specks U, Farver C, Erzurum SC, Comhair SA (2006). Melanoma antigen A4 is expressed in non-small cell lung cancers and promotes apoptosis. Cancer Res 66, 4693-4700.
Peng JR, Chen HS, Mou DC, Cao J, Cong X, Qin LL, Wei L, Leng XS, Wang Y, Chen WF (2005). Expression of cancer/testis (CT) antigens in Chinese hepatocellular carcinoma and its correlation with clinical parameters. Cancer Lett. 219, 223-232.
Perez D, Herrmann T, Jungbluth AA, Samartzis P, Spagnoli G, Demartines N, Clavien PA, Marino S, Seifert B, Jaeger D (2008). Cancer testis antigen expression in gastrointestinal stromal tumors: new markers for early recurrence. Int. J Cancer 123, 1551-1555.
Prasad ML, Jungbluth AA, Patel SG, Iversen K, Hoshaw-Woodard S, Busam KJ (2004). Expression and significance of cancer testis antigens in primary mucosal melanoma of the head and neck. Head Neck 26, 1053-1057.
Quillien V, Raoul JL, Heresbach D, Collet B, Toujas L, Brasseur F (1997). Expression of MAGE genes in esophageal squamous-cell carcinoma. Anticancer Res. 17, 387-391.
Rammensee HG, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S (1999). SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics 50, 213-219.
Rammensee HG, Bachmann J, Stevanovic S (1997). MHC Ligands and Peptide Motifs. (Heidelberg, Alemania: Springer-Verlag).
Resnick MB, Sabo E, Kondratev S, Kerner H, Spagnoli GC, Yakirevich E (2002). Cancer-testis antigen expression in uterine malignancies with an emphasis on carcinosarcomas and papillary serous carcinomas. Int. J Cancer 101, 190 195.
Ries J, Schultze-Mosgau S, Neukam F, Diebel E, Wiltfang J (2005). Investigation of the expression of melanoma antigen-encoding genes (MAGE-A1 to -A6) in oral squamous cell carcinomas to determine potential targets for genebased cancer immunotherapy. Int. J Oncol. 26, 817-824.
Saito T, Wada H, Yamasaki M, Miyata H, Nishikawa H, Sato E, Kageyama S, Shiku H, Mori M, Doki Y (2014). High expression of MAGE-A4 and MHC class I antigens in tumor cells and induction of MAGE-A4 immune responses are prognostic markers of CHP-MAGE-A4 cancer vaccine. Vaccine 32, 5901-5907.
Sakurai T, Itoh K, Higashitsuji H, Nagao T, Nonoguchi K, Chiba T, Fujita J (2004). A cleaved form of MAGE-A4 binds to Miz-1 and induces apoptosis in human cells. J Biol Chem 279, 15505-15514.
Sarcevic B, Spagnoli GC, Terracciano L, Schultz-Thater E, Heberer M, Gamulin M, Krajina Z, Oresic T, Separovic R, Juretic A (2003). Expression of cancer/testis tumor associated antigens in cervical squamous cell carcinoma. Oncology 64, 443-449.
Schirmer U, Fiegl H, Pfeifer M, Zeimet AG, Muller-Holzner E, Bode PK, Tischler V, Altevogt P (2013). Epigenetic regulation of L1CAM in endometrial carcinoma: comparison to cancer-testis (CT-X) antigens. BMC. Cancer 13, 156. Shafer JA, Cruz CR, Leen AM, Ku S, Lu A, Rousseau A, Heslop HE, Rooney CM, Bollard CM, Foster AE (2010). Antigen-specific cytotoxic T lymphocytes can target chemoresistant sidepopulation tumor cells in Hodgkin lymphoma. Leuk. Lymphoma 51, 870-880.
Sharma P, Shen Y, Wen S, Bajorin DF, Reuter VE, Old LJ, Jungbluth AA (2006). Cancer-testis antigens: expression and correlation with survival in human urothelial carcinoma. Clin Cancer Res 12, 5442-5447.
Shichijo S, Hoshino T, Koufuji K, Hayashi A, Kawamoto M, Kikuchi M, Higuchi T, Ichiki M, Oizumi K, Itoh K (1997). Detection of MAGE-4 protein in sera of lung cancer patients. Jpn. J Cancer Res 88, 414-419.
Shigematsu Y, Hanagiri T, Shiota H, Kuroda K, Baba T, Mizukami M, So T, Ichiki Y, Yasuda M, So T, Takenoyama M, Yasumoto K (2010). Clinical significance of cancer/testis antigens expression in patients with non-small cell lung cancer. Lung Cancer 68, 105-110.
Shirakura Y, Mizuno Y, Wang L, Imai N, Amaike C, Sato E, Ito M, Nukaya I, Mineno J, Takesako K, Ikeda H, Shiku H (2012) . T-cell receptor gene therapy targeting melanoma-associated antigen-A4 inhibits human tumor growth in nonobese diabetic/SCID/gammacnull mice. Cancer Sci. 103, 17-25.
Soga N, Hori Y, Yamakado K, Ikeda H, Imai N, Kageyama S, Nakase K, Yuta A, Hayashi N, Shiku H, Sugimura Y (2013) . Limited expression of cancer-testis antigens in renal cell carcinoma patients. Mol. Clin Oncol 1, 326-330. Su C, Xu Y, Li X, Ren S, Zhao C, Hou L, Ye Z, Zhou C (2015). Predictive and prognostic effect of CD133 and cancertestis antigens in stage Ib-IIIA non-small cell lung cancer. Int. J Clin Exp. Pathol. 8, 5509-5518.
Takahashi N, Ohkuri T, Homma S, Ohtake J, Wakita D, Togashi Y, Kitamura H, Todo S, Nishimura T (2012). First clinical trial of cancer vaccine therapy with artificially synthesized helper/ killer-hybrid epitope long peptide of MAGE-A4 cancer antigen. Cancer Sci. 103, 150-153.
Tanaka F, Mori M, Li J, Fujie T, Mimori K, Haraguchi M, Tanaka Y, Mafune K, Akiyoshi T (1997). High frequency of the expression of the MAGE gene family in human esophageal carcinoma. Int. J Oncol 10, 1113-1117.
Tsuzurahara S, Sata M, Iwamoto O, Shichijo S, Kojiro M, Tanikawa K, Itoh K (1997). Detection of MAGE-4 protein in the sera of patients with hepatitis-C virus-associated hepatocellular carcinoma and liver cirrhosis. Jpn. J Cancer Res 88, 915-918.
Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Bühring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. (2003). Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J Immunol.
171(10), 4974-8
Wang M, Li J, Wang L, Chen X, Zhang Z, Yue D, Ping Y, Shi X, Huang L, Zhang T, Yang L, Zhao Y, Ma X, Li D, Fan Z, Zhao L, Tang Z, Zhai W, Zhang B, Zhang Y (2015). Combined cancer testis antigens enhanced prediction accuracy for prognosis of patients with hepatocellular carcinoma. Int. J Clin Exp. Pathol. 8, 3513-3528.
Wu ZY, Gao YF, Wu YH, Liu W, Sun M, Zhai MX, Qi YM, Ye Y (2011). Identification of a novel CD8+ T-cell epitope derived from cancer-testis antigen MAGE-4 in oesophageal carcinoma. Scand. J Immunol. 74, 561-567.
Yakirevich E, Sabo E, Lavie O, Mazareb S, Spagnoli GC, Resnick MB (2003). Expression of the MAGE-A4 and NY-ESO-1 cancer-testis antigens in serous ovarian neoplasms. Clin Cancer Res 9, 6453-6460.
Yamada R, Takahashi A, Torigoe T, Morita R, Tamura Y, Tsukahara T, Kanaseki T, Kubo T, Watarai K, Kondo T, Hirohashi Y, Sato N (2013). Preferential expression of cancer/testis genes in cancer stem-like cells: proposal of a novel subcategory, cancer/testis/stem gene. Tissue Antigens 81, 428-434.
Yoshida N, Abe H, Ohkuri T, Wakita D, Sato M, Noguchi D, Miyamoto M, Morikawa T, Kondo S, Ikeda H, Nishimura T (2006). Expression of the MAGE-A4 and NY-ESO-1 cancer-testis antigens and T-cell infiltration in non-small cell lung carcinoma and their prognostic significance. Int. J Oncol 28, 1089-1098.
Zhang Y, Stroobant V, Russo V, Boon T, van der Bruggen P (2002). A MAGE-A4 peptide presented by HLA-B37 is recognized on human tumors by cytolytic T lymphocytes. Tissue Antigens 60, 365-371.
Zimmermann AK, Imig J, Klar A, Renner C, Korol D, Fink D, Stadlmann S, Singer G, Knuth A, Moch H, Caduff R (2013). Expression of MAGE-C1/CT7 and selected cancer/testis antigens in ovarian borderline tumours and primary and recurrent ovarian carcinomas. Virchows Arch. 462, 565-574.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un constructo que reconoce antígenos y que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en complejo con una molécula de clase I de antígeno leucocitario humano (HLA), en donde dicho constructo de reconocimiento de antígeno comprende un dominio variable de TCR alfa y un dominio variable de TCR beta, o un dominio variable de TCR gamma y un dominio variable de TCR delta, y en donde
(i) el dominio variable de TCR alfa o el dominio variable de TCR gamma comprenden las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) que tienen la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44 y el dominio variable de TCR beta o variable de TCR delta comprende las CDRs que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52, o
(ii) el dominio variable de TCR alfa o el dominio variable de TCR gamma comprende las CDRs que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60 y el dominio variable de Tc R beta o variable de TCR delta comprende las CDRs que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68, o
(iii) el dominio variable de TCR alfa o el dominio variable de TCR gamma comprende las CDRs que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76 y el dominio variable de Tc R beta o variable de TCR delta comprende las CDRs que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 84.
2. El constructo de reconocimiento de antígenos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el constructo de reconocimiento de antígenos es un a/p-TCR, o un fragmento o derivado del mismo; o el constructo es un<y>/8-TCR, o un fragmento o derivado del mismo.
3. El constructo de reconocimiento de antígenos de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho constructo de reconocimiento de antígenos es capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, opcionalmente en donde la respuesta inmunitaria es caracterizada por un aumento en los niveles de interferón (IFN) y.
4. El constructo que reconoce antígenos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el constructo está humanizado, quimerizadao y/o murinizado.
5. El constructo que reconoce antígenos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una cadena de TCR a o y; y/o una cadena de TCR p o 8 ; en donde
(i) dicha cadena de TCR a o y comprende las secuencias de CDR1 a CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 a 44, y dicha secuencia de cadena de TCR p o 8 comprende las secuencias de CDR1 a CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 a 52; o
(ii) dicha secuencia de cadena de TCR a o<y>comprende las secuencias de CDR1 a CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 a 60, y dicha secuencia de cadena de TCR p o 8 comprende las secuencias de CDR1 a CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 a 68; o
(iii) dicha secuencia de cadena de TCR a o y comprende las secuencias de CDR1 a CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 a 76, y dicha secuencia de cadena de TCR p o 8 comprende las secuencias de CDR1 a CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 82 a 84.
6. El constructo que reconoce antígenos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el constructo es un TCR, o un fragmento del mismo, que comprende al menos una secuencia de cadena de TCR a y TCR p, en donde
(i) dicha secuencia de cadena de TCR a comprende una secuencia de región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 41 o una secuencia de región variable al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 41, en donde dicha secuencia de región variable al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 41 comprende las secuencias de CDR1 a CDR3 de SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, y en donde dicha secuencia de cadena de TCR p comprende una secuencia de región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 49 o una secuencia de región variable al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 49, en donde dicha secuencia de región variable al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 49 comprende las CDRs que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52; o
(ii) dicha secuencia de cadena de TCR a comprende una secuencia de región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 57 o una secuencia de región variable al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 57, en donde dicha secuencia de región variable al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 57 comprende las CDRs que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60, y en donde dicha secuencia de cadena de TCR p comprende una secuencia de región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 65 o una secuencia de región variable al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 65, en donde dicha secuencia de región variable al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 65 comprende las CDRs que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68; o
(iii) dicha secuencia de cadena de TCR a comprende una secuencia de región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 73 o una secuencia de región variable al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 73, en donde dicha secuencia de región variable al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 73 comprende las CDRs que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76, y en donde dicha secuencia de cadena de TCR p comprende una secuencia de región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 81, o una secuencia de región variable al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 81, en donde dicha secuencia de región variable al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 81 comprende las CDRs que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 84.
7. El constructo que reconoce antígenos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el constructo es un TCR que comprende al menos una secuencia de cadena de TCR a y una TCR p, en donde la secuencia de cadena de TCR a comprende una región constante que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID Nos. 46, 62 y 78; y en donde la secuencia de cadena de TCR p comprende una región constante que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID Nos. 54, 70 y 86.
8. El constructo que reconoce antígenos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el TCR es un TCR de cadena sencilla (scTCR).
9. Un ácido nucleico que codifica un constructo que reconoce antígenos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9.
11. Una célula huésped que comprende el constructo que reconoce antígenos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, o el vector de acuerdo con la reivindicación 10.
12. Una composición farmacéutica que comprende el constructo que reconoce antígenos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, o el vector de acuerdo con la reivindicación 10, o la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11, y un vehículo, estabilizador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
13. El constructo que reconoce antígenos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, o el vector de acuerdo con la reivindicación 10, o la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, para uso en medicina.
14. El constructo que reconoce antígenos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, o el vector de acuerdo con la reivindicación 10, o la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, para uso en el diagnóstico, prevención, y/o tratamiento de una enfermedad proliferativa, en donde la enfermedad comprende una enfermedad tumoral maligna o benigna.
15. Un método para fabricar un constructo de reconocimiento de antígeno específico de antígeno asociado a tumor (TAA) que expresa una línea celular, que comprende
a. proporcionar una célula huésped adecuada,
b. proporcionar un constructo genético que comprende una secuencia codificante que codifica el constructo de reconocimiento de antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,
c. introducir en dicha célula huésped adecuada dicho constructo genético,
d. expresar dicho constructo genético mediante dicha célula huésped adecuada.
16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde
dicho constructo de reconocimiento de antígeno es un TCR modificado, en donde dicha modificación comprende la adición de un dominio funcional que comprende un marcador o un dominio que comprende un dominio de anclaje de membrana.
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201604458D0 (en) 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against cancers
CN116731156A (zh) * 2016-03-16 2023-09-12 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于癌症免疫治疗的转染t细胞和t细胞受体
ES2914648T3 (es) 2016-04-08 2022-06-15 Immunocore Ltd Receptores de células T
PH12021552979A1 (en) 2019-05-27 2023-10-09 Immatics Us Inc Viral vectors and their use in adoptive cellular therapy
DE102019121007A1 (de) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigenbindende Proteine, die spezifisch an MAGE-A binden
IL295891A (en) 2020-02-24 2022-10-01 Immatics Us Inc Methods for propagating t cells for the treatment of cancer and related malignancies
US11826386B2 (en) * 2020-05-05 2023-11-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating cancer
US20220056411A1 (en) * 2020-08-21 2022-02-24 Immatics US, Inc. Methods for isolating cd8+ selected t cells
CN112279908B (zh) * 2020-10-23 2024-03-19 魏放 识别ebv抗原短肽的t细胞受体及其应用
DE102021100038A1 (de) 2020-12-31 2022-06-30 Immatics US, Inc. Modifizierte cd8-polypeptide, zusammensetzungen und verfahren zu deren verwendung
WO2022147029A2 (en) 2020-12-31 2022-07-07 Immatics US, Inc. Cd8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof
TW202332765A (zh) 2021-09-20 2023-08-16 美商英麥提克斯股份有限公司 用於ｔ細胞療法之ｔ細胞群體的單核球耗盡
US20230142468A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Immatics US, Inc. Methods for generating cell spheroids
EP4472742A1 (en) * 2022-02-03 2024-12-11 University College Cardiff Consultants Limited Novel t-cell receptor
EP4514834A1 (en) 2022-04-28 2025-03-05 Immatics US, Inc. Dominant negative tgfbeta receptor polypeptides, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof
AU2023262596A1 (en) 2022-04-28 2024-12-05 Immatics US, Inc. Membrane-bound il-15, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof
EP4514821A1 (en) 2022-04-28 2025-03-05 Immatics US, Inc. Il-12 polypeptides, il-15 polypeptides, il-18 polypeptides, cd8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof
WO2023215825A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Immatics US, Inc. Methods for improving t cell efficacy
CN116813744B (zh) * 2023-02-23 2024-02-23 暨南大学 一种识别mage-a3抗原短肽的t细胞受体及其应用
CN121464154A (zh) * 2023-07-07 2026-02-03 香港大学 趋同重组衍生的肝细胞癌特异性tcr及其应用
WO2025096649A1 (en) 2023-11-01 2025-05-08 Immatics US, Inc. Membrane-bound il-15, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof
WO2025181329A1 (en) * 2024-03-01 2025-09-04 Immunoscape Pte. Ltd. Human t cell receptors and uses thereof
WO2025233432A1 (en) * 2024-05-07 2025-11-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Use and dosage of an antigen-binding protein comprising a tcr specific for an hla-a*02 restricted peptide

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US806A (en) 1838-06-23 Construction of stoves and fibeplaces
US4440859A (en) 1977-05-27 1984-04-03 The Regents Of The University Of California Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
IE53176B1 (en) 1978-12-22 1988-08-17 Biogen Nv Recombinant dna molecules and their method of production
US4530901A (en) 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4678751A (en) 1981-09-25 1987-07-07 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
US4766075A (en) 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US4582800A (en) 1982-07-12 1986-04-15 Hoffmann-La Roche Inc. Novel vectors and method for controlling interferon expression
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4677063A (en) 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US20020197266A1 (en) 2000-02-08 2002-12-26 Waldemar Debinski Immunotherapy using interleukin 13 receptor subunit alpha 2
US20030144474A1 (en) 2000-06-05 2003-07-31 Sunol Molecular Corporation T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof
NZ539225A (en) 2002-10-09 2006-09-29 Avidex Ltd Single chain recombinant T cell receptors
ES2327229T3 (es) 2002-11-09 2009-10-27 Immunocore Ltd. Presentacion del receptor de linfocitos t.
GB0304068D0 (en) 2003-02-22 2003-03-26 Avidex Ltd Substances
KR101130597B1 (ko) 2005-09-13 2012-04-02 다카라 바이오 가부시키가이샤 Ｔ 세포 리셉터 및 그 리셉터를 코드하는 핵산
WO2008053573A1 (fr) * 2006-10-30 2008-05-08 National University Corporation Hokkaido University Remède pour néoplasme malin
GB0911566D0 (en) 2009-07-03 2009-08-12 Immunocore Ltd T cell receptors
BR112013006718B1 (pt) 2010-09-20 2021-12-07 Tron - Translationale Onkologie An Der Universitätsmedizin Der Johannes Gutenberguniversität Mainz Gemeinnutzige Gmbh Receptor de células t com especificidade para ny-eso-1, composição farmacêutica compreendendo o mesmo e uso do mesmo
AU2012302778B2 (en) * 2011-08-31 2016-11-24 Mie University Vaccine preparation for cancer treatment
WO2013057586A1 (en) 2011-10-19 2013-04-25 Oslo Universitetssykehus Hf Compositions and methods for producing soluble t - cell receptors
WO2013057596A1 (en) 2011-10-21 2013-04-25 Atena Srl Anatomic cushion accumulator for thermal treatment with heat or cold
EP2808392A1 (en) 2013-05-28 2014-12-03 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Aptamers and use of the aptamers in the diagnosis and treatment of cancer
US11203783B2 (en) * 2013-11-21 2021-12-21 Repertoire Genesis Incorporation T cell receptor and B cell receptor repertoire analysis system, and use of same in treatment and diagnosis
US10202640B2 (en) * 2014-05-07 2019-02-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Single cell analysis of T cells using high-throughput multiplex amplification and deep sequencing
CN116731156A (zh) * 2016-03-16 2023-09-12 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于癌症免疫治疗的转染t细胞和t细胞受体
GB201604492D0 (en) 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Transfected t-cells and t-cell receptors for use in immunotherapy against cancers
GB201604458D0 (en) * 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against cancers

Also Published As

Publication number Publication date
US10626160B2 (en) 2020-04-21
US20240279308A1 (en) 2024-08-22
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CO2018010811A2 (es) 2018-10-22
US11945854B2 (en) 2024-04-02
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US20210101956A1 (en) 2021-04-08
PH12018501933A1 (en) 2019-06-17
TWI826891B (zh) 2023-12-21
DK3430030T3 (da) 2024-01-22
NZ747154A (en) 2021-10-29
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