BR112013006718B1

BR112013006718B1 - Receptor de células t com especificidade para ny-eso-1, composição farmacêutica compreendendo o mesmo e uso do mesmo

Info

Publication number: BR112013006718B1
Application number: BR112013006718-7A
Authority: BR
Inventors: Tana Omokoko; Petra Simon; Ugur Sahin; Özlem Türeci
Original assignee: Tron - Translationale Onkologie An Der Universitätsmedizin Der Johannes Gutenberguniversität Mainz Gemeinnutzige Gmbh; Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh
Priority date: 2010-09-20
Filing date: 2011-09-19
Publication date: 2021-12-07
Also published as: HK1243003A1; EP3590530B1; JP6625705B2; BR122020026648B1; JP2016136939A; JP2013541332A; US20130273647A1; CN105255834A; LT2618835T; CA3088393C; JP2019004902A; AU2018201252B2; WO2012038055A1; ES2635335T3; JP6735893B2; BR112013006718A2; CN105255834B; CA2812153A1; AU2019202864B2; CA2812153C

Abstract

epítopos de células t e receptores de células t antígeno-específicos. a presente invenção refere-se a métodos eficientes para fornecer células linfoides antígeno-específicas. estas células linfoides podem ser utilizadas para fornecer receptores de células t antígeno-específicos que possuem uma restrição do mhc definida e para identificar epítopos de células t imunologicamente revelantes. além disso, a presente invenção refere-se a receptores de células t antígeno-específicos e a epítopos de células t e à sua utilização em imunoterapia.

Description

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se ao fornecimento de receptores de células T e epítopos de células T, os quais são úteis para imunoterapia.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A evolução do sistema imunológico resultou em vertebrados em uma rede altamente eficaz baseada em dois tipos de defesa: a imunidade inata e a adaptativa.

[0003] Em contraste com o sistema imunológico inato antigo evolutivo que se baseia em receptores invariáveis que reconhecem padrões moleculares comuns associados a agentes patogênicos, a imunidade adaptativa é baseada em receptores de antígenos altamente específicos em células B (linfócitos B) e células T (linfócitos T) e seleção clonal.

[0004] Embora as células B aumentem as respostas imunes humorais através da secreção de anticorpos, as células T atuam como mediadoras das respostas imunes celulares que conduzem à destruição de células reconhecidas.

[0005] As células T desempenham um papel central na imunidade mediada por células em humanos e animais. O reconhecimento e a ligação de um antígeno em particular são mediados pelos receptores de células T (TCRs) expressos sobre a superfície das células T.

[0006] O receptor de células T (TCR) de uma célula T é capaz de interagir com peptídeos imunogênicos (epítopos) ligados a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e apresentados sobre a superfície de células alvo. A ligação específica do TCR desencadeia uma cascata de sinais dentro da célula T, levando à proliferação e diferenciação em uma célula T efetora madura. Para ser capaz de alvejar uma ampla variedade de antígenos, os receptores de células T precisam ter uma grande diversidade.

[0007] Esta diversidade é obtida por rearranjo genético de diferentes segmentos descontínuos de genes que codificam para as diferentes regiões estruturais de TCRs. TCRs são compostos de uma cadeia α e de uma cadeia β ou de uma cadeia y e de uma cadeia δ. As cadeias α/β do TCR são compostas por uma região variável N-terminal altamente polimórfica envolvida no reconhecimento do antígeno e uma região constante invariável. No nível genético, estas cadeias são separadas em várias regiões, uma região variável (V), uma região de diversidade (D) (apenas cadeia β e δ), uma região de junção (J) e uma região constante (C). Os genes humanos de cadeia β contêm mais de 60 segmentos variáveis (V), 2 segmentos de diversidade (D), mais de 10 segmentos de junção (J) e dois segmentos de região constante (C). Os genes humanos de cadeia α contêm mais de 50 segmentos V e mais de 60 segmentos J, mas nenhum segmento D, bem como um segmento C. Os genes murinos de cadeia β contêm mais de 30 segmentos variáveis (V), 2 segmentos de diversidade (D), mais de 10 segmentos de junção (J) e dois segmentos de região constante (C). Os genes murinos de cadeia α contêm quase 100 segmentos V, 60 segmentos J, nenhum segmento D, mas um segmento C. Durante a diferenciação de células T, genes de receptores de células T específicos são criados pelo rearranjo de um gene de região V, um gene de região D (apenas cadeia β e δ), um gene de região J e um gene de região C. A diversidade dos TCRs é ainda amplificada pelo rearranjo impreciso V-(D)-J, em que nucleotídeos aleatórios são introduzidos e/ou eliminados nos sítios de recombinação. Uma vez que o rearranjo dos loci de genes de TCR ocorre no genoma durante a maturação de células T, cada célula T madura expressa apenas um TCR α/β ou TCR Y/δ específico.

[0008] A ligação ao antígeno e ao MHC é mediada pelas regiões determinantes de complementariedade 1, 2 e 3 (CDR1, CDR2, CDR3) do TCR. A CDR3 da cadeia β, a qual é a mais crítica para o reconhecimento e ligação ao antígeno, é codificada pela junção V-D-J do gene de cadeia β rearranjado do TCR.

[0009] O TCR é uma parte de um mecanismo de sinalização complexo, o qual inclui o complexo heterodimérico das cadeias α e β do TCR, o co-receptor CD4 ou CD8 e o módulo de transdução de sinal CD3 (Figura 1). Enquanto as cadeias de CD3 transferem o sinal de ativação dentro da célula, o heterodímero α/β do TCR é somente responsável pelo reconhecimento do antígeno. Assim, a transferência das cadeias α/β do TCR oferece a oportunidade de redirecionar as células T para qualquer antígeno de interesse.

Imunoterapia

[0010] A imunoterapia antígeno-específica tem como objetivo aumentar ou induzir respostas imunes específicas em pacientes para controlar doenças infecciosas ou malignas. A identificação de um número crescente de antígenos associados a tumores (TAA) e a agentes patogênicos conduz a um amplo conjunto de alvos adequados para imunoterapia. Células que apresentam peptídeos imunogênicos (epítopos) derivados destes antígenos podem ser especificamente alvejadas, seja por estratégias de imunização ativa ou passiva.

[0011] A imunização ativa tende a induzir e a expandir as células T antígeno-específicas no paciente, as quais são capazes de reconhecer especificamente e matar as células doentes. Em contraste, a imunização passiva baseia- se na transferência adaptativa de células T, as quais foram expandidas e, opcionalmente, geneticamente modificadas in vitro (terapia adaptativa de células T).

Vacinação

[0012] Vacinas tumorais têm como objetivo induzir respostas imunes endógenas específicas para tumores através de imunização ativa. Diferentes formatos de antígenos podem ser utilizados para a vacinação tumoral, incluindo células cancerígenas inteiras, proteínas, peptídeos ou vetores de imunização, tais como RNA, DNA ou vetores virais que podem ser aplicados diretamente in vivo ou in vitro através de pulsos de DCs seguidos de transferência para o paciente.

[0013] O número de ensaios clínicos em que as respostas imunes induzidas pela terapia podem ser identificadas está aumentando constantemente devido às melhorias nas estratégias de imunização e métodos para a detecção de respostas imunes antígeno-específicas (Connerotte, T. e cols. (2008). Cancer Res. 68, 3931-3940; Schmitt, M. e cols. (2008) Blood 111, 1357-1365; Speiser, D.E. e cols. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3849-3854; Adams, S. e cols. (2008) J. Immunol. 181, 776-784).

[0014] No entanto, na maioria dos casos, as respostas imunes detectadas não podem ser sistemicamente correlacionadas com resultados clínicos (Curigliano, G. e cols. (2006) Ann. Oncol. 17, 750-762; Rosenberg, S.A. e cols. (2004) Nat. Med. 10, 909-915).

[0015] A definição exata de epítopos de peptídeos derivados de antígenos tumorais pode, portanto, contribuir para melhorar a especificidade e a eficiência das estratégias de vacinação, bem como de métodos para imunomonitoramento.

Transferência adaptativa de células (ACT)

[0016] A imunoterapia baseada em ACT pode ser amplamente definida como uma forma de imunização passiva com células T previamente sensibilizadas que são transferidas para destinatários não imunes ou para hospedeiro autólogo após a expansão ex vivo de precursores de baixas frequências para números de células clinicamente relevantes. Os tipos celulares que foram utilizados para os experimentos de ACT são células matadoras ativadas por linfocina (LAK) (Mule, J.J. e cols. (1984) Science 225, 1487-1489; Rosenberg, S.A. e cols. (1985) N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492), linfócitos infiltrantes de tumores (TILs) (Rosenberg, S.A. e cols. (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159-1166), linfócitos de doador após transplante de células tronco hematopoiéticas (HSCT), bem como clones ou linhagens de células T específicas para tumores (Dudley, M.E. e cols. (2001) J. Immunother. 24, 363-373; Yee, C. e cols. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16168-16173).

[0017] A transferência adaptativa de células T demonstrou que possui atividade terapêutica contra infecções virais humanas, tal como CMV. Embora a infecção por CMV e a reativação de vírus latentes endógenos sejam controladas pelo sistema imunológico em indivíduos saudáveis, isso resulta em morbidade e mortalidade significativas em indivíduos imunocomprometidos, tais como receptores de transplantes ou pacientes com AIDS. Riddell e colaboradores demonstraram a reconstituição da imunidade viral através de terapia adaptativa de células T em pacientes imunossuprimidos após a transferência de clones de células T CD8+ CMV-específicas derivadas de doadores de transplante soropositivos para CMV e HLA-compatíveis (Riddell, S.R. (1992) Science 257, 238-241).

[0018] Como uma abordagem alternativa, populações de células T policlonais para CMV derivado de doador ou para EBV-específicas foram transferidas para receptores de transplante, resultando no aumento da persistência das células T transferidas (Rooney, C.M. e cols. (1998) Blood 92, 1549-1555; Peggs, K.S. e cols. (2003) Lancet 362, 13751377).

[0019] Para uma imunoterapia adaptativa de melanoma, Rosenberg e colaboradores estabeleceram uma abordagem de ACT que se baseia na infusão de linfócitos infiltrantes de tumores (TILs) autólogos expandidos in vitro isolados a partir de tumores excisados em combinação com uma quimioterapia linfodepletiva não mieloablativa e dose elevada de IL-2. Um estudo clínico publicado recentemente resultou em uma taxa de resposta objetiva de ~50% dos pacientes tratados que sofrem de melanoma metastático (Dudley, M.E. e cols. (2005) J. Clin. Oncol. 23:2346-2357).

[0020] No entanto, os pacientes devem cumprir várias premissas para serem elegíveis à imunoterapia de ACT. Eles devem ter tumores ressecáveis (operáveis). Os tumores devem gerar TILs viáveis sob as condições de cultura celular. Os TILs devem ser reativos contra antígenos tumorais e devem expandir-se in vitro para quantidades suficientes. Especialmente em outros cânceres além de melanoma, é difícil obter-se tais TILs reativos a tumores. Além disso, o estímulo repetitivo in vitro e a expansão clonal de linfócitos T humanos normais resultam na diminuição progressiva da atividade da telomerase e no encurtamento dos telômeros, resultando em senescência replicativa e diminuição do potencial para a persistência de células T transferidas (Shen, X. e cols. (2007) J. Immunother. 30:123-129).

[0021] Uma abordagem que supera as limitações da ACT é a transferência adaptativa de células T autólogas, reprogramadas para expressar um TCR reativo a tumores de especificidade definida durante uma cultura ex vivo de curta duração seguida por reinfusão no paciente. Esta estratégia torna a ACT aplicável a uma variedade de doenças malignas comuns, mesmo que as células T reativas a tumores estejam ausentes no paciente. Uma vez que a especificidade antigênica de células T baseia-se inteiramente no complexo heterodimérico das cadeias α e β do TCR, a transferência de genes clonados de TCR para as células T oferece potencial para redirecioná-las para qualquer antígeno de interesse. Portanto, a terapia gênica de TCR proporciona uma estratégia atrativa para o desenvolvimento de imunoterapia antígeno- específica com linfócitos autólogos como opção de tratamento. As principais vantagens da transferência de genes de TCR são a criação de quantidades terapêuticas de células T antígeno-específicas dentro de alguns dias e a possibilidade de introduzir especificidades que não estão presentes no repertório do TCR endógeno do paciente.

[0022] Vários grupos demonstraram que a transferência de genes de TCR é uma estratégia atrativa para redirecionar a antígeno-especificidade de células T primárias (Morgan, R.A. e cols. (2003) J. Immunol. 171, 32873295; Cooper, L.J. e cols. (2000) J. Virol. 74, 8207-8212; Fujio, K. e cols. (2000) J. Immunol. 165, 528-532; Kessels, H.W. e cols. (2001) Nat. Immunol. 2, 957-961; Dembic, Z. e cols. (1986) Nature 320, 232-238).

[0023] A viabilidade da terapia gênica de TCR em humanos foi recentemente demonstrada por Rosenberg e seu grupo em ensaios clínicos para o tratamento de melanoma maligno. A transferência adaptativa de linfócitos autólogos retroviralmente transduzidos com TCRs antígeno-específicos de melanoma/melanócitos resultou na regressão do câncer em até 30% dos pacientes com melanoma tratados (Morgan, R.A. e cols. (2006) Science 314, 126-129; Johnson, L.A. e cols. (2009) Blood 114, 535-546).

Estruturas alvo para a imunoterapia antígeno-específica

[0024] A descoberta de vários antígenos associados a tumores (TAAs) forneceu a base para os conceitos da imunoterapia antígeno-específica (Novellino, L. e cols. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54, 187-207). Os TAAs são proteínas incomuns expressas em células tumorais devido à sua instabilidade genética, as quais possuem nenhuma expressão ou expressão limitada em células normais. Estes TAAs podem levar ao reconhecimento específico de células malignas pelo sistema imunológico.

[0025] A clonagem molecular de TAAs através do rastreio de bibliotecas de expressão de cDNA derivado de tumor utilizando células T autólogas específicas para tumores (van der Bruggen, P. e cols. (1991) Science 254, 1643-1647) ou anticorpos circulantes (Sahin, U. e cols. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11810-11813), abordagens imunológicas reversas, métodos bioquímicos (Hunt, D.F. e cols. (1992) Science 256, 1817-1820), análises de expressão gênica ou estratégias de clonagem in silico (Helftenbein, G. e cols. (2008) Gene 414, 76-84) levaram a um número significativo de candidatos alvo para as estratégias imunoterapêuticas. Os TAAs caem em diversas categorias, incluindo antígenos de diferenciação, antígenos superexpressos, variantes de processamento específicas para tumores, produtos de genes mutados, antígenos virais e os chamados antígenos do câncer de testículos (CTAs). A família do câncer de testículos é uma categoria muito promissora de TAAs, uma vez que a sua expressão é restrita aos testículos e a uma multiplicidade de entidades tumorais diferentes (Scanlan, M.J. e cols. (2002) Immunol. Rev. 188, 22-32). Até agora, mais de 50 genes de CT foram descritos (Scanlan, M.J. e cols. (2004) Cancer Immun. 4, 1) e alguns deles foram abordados em estudos clínicos (Adams, S. e cols. (2008) J. Immunol. 181, 776-784; Atanackovic, D. e cols. (2004) J. Immunol. 172, 3289-3296; Chen, Q. e cols. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9363-9368; Connerotte, T. e cols. (2008). Cancer Res. 68, 3931-3940; Davis, I.D. e cols. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10697-10702; Jager, E. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12198-12203; Marchand, M. e cols. (1999) Int. J. Cancer 80, 219-230; Schuler-Thurner, B. e cols. (2000) J. Immunol. 165, 3492-3496).

[0026] Apesar do número crescente de estruturas alvo atrativas para abordagens imunoterapêuticas, linhagens ou clones específicos de células T de restrição definida para HLA existem apenas para algumas delas (Chaux, P. e cols. (1999) J. Immunol. 163, 2928-2936; Zhang, Y. e cols. (2002) Tissue Antigens 60, 365-371; Zhao, Y. e cols. (2005) J. Immunol. 174, 4415-4423). Para a maioria dos CTAs, incluindo TPTE, até mesmo a evidência de respostas específicas de células T está ausente.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO Sumário da invenção

[0027] Estratégias imunoterapêuticas são opções promissoras para o tratamento de doenças infecciosas e câncer. A identificação de um número crescente de antígenos associados a tumores e a agentes patogênicos levou a um conjunto amplo de alvos adequados para imunoterapia.

[0028] Por transferência adaptativa de células T modificadas para expressar um receptor de células T (TCR) antígeno-específico definido, estes antígenos podem ser especificamente alvejados, desse modo, levando à destruição seletiva de células alvo malignas ou infectadas. Como a especificidade do TCR é restringida por moléculas do MHC altamente polimórficas, a ampla aplicabilidade da transferência adaptativa de TCR é dependente da geração de um grande número de reagentes de TCR "prontos para uso", cobrindo uma vasta gama de antígenos e restrições do MHC. No entanto, até agora, apenas um número limitado de candidatos a TCR adequados foram identificados. Isto é principalmente devido ao difícil estabelecimento de clones de células T para o isolamento de genes de TCR.

[0029] A presente invenção refere-se a métodos eficientes para fornecer células linfoides antígeno- específicas. Estas células linfoides podem ser utilizadas para fornecer receptores de células T antígeno-específicos que possuem uma restrição do MHC definida e para identificar epítopos de células T imunologicamente relevantes.

[0030] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para fornecer células linfoides antígeno- específicas compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma única célula T reativa a antígeno a partir de uma amostra que compreende células T, em que a referida amostra é obtida a partir de um indivíduo previamente exposto ao referido antígeno; (b) fornecer um ácido nucleico que codifica um receptor de células T possuindo a especificidade do receptor de células T da referida única célula T reativa a antígeno; e (c) introduzir o referido ácido nucleico em uma célula linfoide para fornecer as referidas células linfoides antígeno-específicas.

[0031] Em uma modalidade, o método compreende ainda a etapa de determinação da especificidade do epítopo das referidas células linfoides antígeno-específicas e/ou a etapa de determinação da restrição do MHC das referidas células linfoides antígeno-específicas.

[0032] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método para fornecer um receptor de células T antígeno-específico que possui uma restrição do MHC definida compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma única célula T reativa a antígeno a partir de uma amostra que compreende células T, em que a referida amostra é obtida a partir de um indivíduo previamente exposto ao referido antígeno; (b) fornecer um ácido nucleico que codifica um receptor de células T possuindo a especificidade do receptor de células T da referida única célula T reativa a antígeno; (c) introduzir o referido ácido nucleico em uma célula linfoide para fornecer células linfoides antígeno- específicas; e (d) determinar a restrição do MHC das referidas células linfoides antígeno-específicas.

[0033] Em uma modalidade, o método compreende ainda a etapa de determinação da especificidade do epítopo das referidas células linfoides antígeno-específicas.

[0034] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método para a identificação de um epítopo de célula T em um antígeno compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma única célula T reativa a antígeno a partir de uma amostra que compreende células T, em que a referida amostra é obtida a partir de um indivíduo previamente exposto ao referido antígeno; (b) fornecer um ácido nucleico que codifica um receptor de células T possuindo a especificidade do receptor de células T da referida única célula T reativa a antígeno; (c) introduzir o referido ácido nucleico em uma célula linfoide para fornecer células linfoides antígeno- específicas; e (d) determinar a especificidade do epítopo das referidas células linfoides antígeno-específicas.

[0035] Em uma modalidade, o método compreende ainda a etapa de determinação da restrição do MHC das referidas células linfoides antígeno-específicas.

[0036] Em uma modalidade preferida, a referida única célula T reativa a antígeno e o referido ácido nucleico que codifica um receptor de células T possuindo a especificidade do receptor de células T da referida única célula T reativa a antígeno são reativos a um antígeno administrado a um indivíduo. Em uma modalidade preferida, a referida única célula T reativa a antígeno é fornecida por isolamento.

[0037] Em uma modalidade do método de acordo com todos os aspectos acima, o referido epítopo é um peptídeo apresentado pelo MHC. Em uma modalidade do método de acordo com todos os aspectos acima, a referida etapa de determinação da especificidade de epítopo das referidas células linfoides antígeno-específicas compreende a determinação da reatividade das referidas células linfoides antígeno- específicas às moléculas de MHC expostas a, preferivelmente pulsadas, isto é, carregadas com um peptídeo derivado do antígeno. Preferivelmente, as referidas moléculas de MHC são moléculas de MHC expressas no indivíduo. Preferivelmente, as referidas moléculas do MHC estão presentes em células alvo. O referido peptídeo pode ser parte de uma biblioteca de peptídeos derivados do antígeno e a biblioteca de peptídeos pode compreender um conjunto de peptídeos sobrepostos derivados do referido antígeno. Preferivelmente, o conjunto de peptídeos sobrepostos cobre toda a sequência do referido antígeno.

[0038] Em uma modalidade do método de acordo com todos os aspectos acima, a referida etapa de determinação da restrição do MHC das referidas células linfoides antígeno- específicas compreende a determinação da reatividade das referidas células linfoides antígeno-específicas às moléculas de MHC selecionadas. Preferivelmente, as referidas moléculas de MHC selecionadas estão presentes nas células alvo. Preferivelmente, as referidas moléculas de MHC selecionadas são moléculas de MHC expressas no indivíduo. Preferivelmente, as referidas moléculas de MHC selecionadas estão presentes em células alvo que expressam o antígeno ou uma porção do mesmo. Preferivelmente, as referidas células linfoides antígeno-específicas ou receptores de células T das mesmas são restritos às moléculas de MHC expressas no indivíduo.

[0039] Preferivelmente, a determinação da reatividade de células linfoides antígeno-específicas compreende a determinação da secreção de citocinas pelas células linfoides, em que a referida citocina pode ser interferon-Y (IFNY). Outros marcadores de ativação que podem ser utilizados são, por exemplo, CD154 e/ou CD137.

[0040] Em uma modalidade particularmente preferida do método de acordo com todos os aspectos acima, o referido ácido nucleico que codifica um receptor de células T que possui a especificidade do receptor de células T da referida única célula T reativa a antígeno é o RNA, preferivelmente RNA transcrito in vitro. Preferivelmente, a referida célula linfoide carece de expressão de superfície de um TCR endógeno ou é específica para um antígeno não relacionado. Em uma modalidade, a referida célula linfoide é um linfócito, preferivelmente uma célula T.

[0041] Em uma modalidade do método de acordo com todos os aspectos acima, a referida etapa de fornecimento de um ácido nucleico que codifica um receptor de células T que possui a especificidade do receptor de células T da referida única célula T reativa a antígeno compreende o fornecimento de um ácido nucleico que codifica um receptor de células T compreendendo pelo menos as sequências de CDR, preferivelmente pelo menos a região variável do receptor de células T da referida única célula T reativa a antígeno.

[0042] Em uma modalidade do método de acordo com todos os aspectos acima, a referida etapa de fornecimento de um ácido nucleico que codifica um receptor de células T que possui a especificidade do receptor de células T da referida única célula T reativa a antígeno compreende o isolamento do RNA, preferivelmente poli-A+-RNA, a partir da referida única célula T reativa a antígeno ou de uma população clonal da mesma e, preferivelmente, compreende ainda a obtenção de cDNA a partir do referido RNA. Em uma modalidade, a referida etapa de fornecimento de um ácido nucleico que codifica um receptor de células T que possui a especificidade do receptor de células T da referida única célula T reativa a antígeno compreende ainda a amplificação de pelo menos uma porção do cDNA que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica pelo menos as sequências de CDR, preferivelmente pelo menos a região variável do receptor de células T da referida única célula T reativa a antígeno.

[0043] Em uma modalidade do método de acordo com todos os aspectos acima, o referido indivíduo é soropositivo para o referido antígeno ou para um agente que compreende o referido antígeno. A soropositividade do indivíduo pode ser determinada através da determinação de uma resposta imune ao antígeno ou agente ou a um componente do mesmo.

[0044] Em uma modalidade do método de acordo com todos os aspectos acima, as referidas células T, antes do fornecimento de uma única célula T reativa a antígeno, são submetidas a uma expansão antígeno-específica e a uma re- exposição, em que a expansão antígeno-específica e a re- exposição podem ser efetuadas por exposição das células T preferivelmente a células autólogas apresentadoras de antígeno que apresentam um antígeno. Em uma modalidade do método de acordo com todos os aspectos acima, a referida única célula T reativa a antígeno é positiva para um marcador de ativação, tais como IFNY ou CD137 e CD8 ou CD4.

[0045] Em uma modalidade do método de acordo com todos os aspectos acima, a referida única célula T reativa a antígeno é isolada da amostra que compreende células T, utilizando-se citometria de fluxo. A triagem é preferivelmente efetuada com base na positividade para um marcador de ativação, em particular, IFNY ou CD137, e CD8 ou CD4.

[0046] Em uma modalidade do método de acordo com todos os aspectos acima, o referido receptor de células T compreende cadeias α e β de receptor de células T.

[0047] Em uma modalidade do método de acordo com todos os aspectos acima, o referido ácido nucleico que codifica um receptor de células T que possui a especificidade do receptor de células T da referido única célula T reativa a antígeno compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica pelo menos as sequências de CDR, preferivelmente pelo menos a região variável do receptor de células T da referida única célula T reativa a antígeno.

[0048] Em uma modalidade do método de acordo com todos os aspectos acima, o referido indivíduo é um mamífero, preferivelmente um ser humano. Preferivelmente, o referido indivíduo possui uma doença que envolve células que expressam o antígeno, preferivelmente uma doença relacionada às células T. A referida doença pode ser selecionada a partir do grupo constituído por distúrbios do sistema imunológico, infecções e doenças malignas.

[0049] Além disso, a presente invenção refere-se a receptores de células T específicos para o antígeno viral CMV-pp65 ou para o antígeno associado a tumor NY-ESO-1, TPTE ou PLAC1, em particular, quando apresentado na superfície de uma célula, tal como uma célula doente ou uma célula apresentadora de antígeno, bem como peptídeos que compreendem epítopos reconhecidos por estes receptores de células T.

[0050] Em um aspecto, a invenção refere-se a um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 e 196, ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0051] Em uma modalidade, o peptídeo é um peptídeo apresentado pelo MHC de classe I ou de classe II, preferivelmente um apresentado pelo MHC de classe I ou, se estiver presente no interior das células, pode ser processado para produzir um produto de processamento do mesmo que é um peptídeo apresentado pelo MHC de classe I ou de classe II, preferivelmente um peptídeo apresentado pelo MHC de classe I. Preferivelmente, o referido peptídeo apresentado por MHC de classe I ou de classe II possui uma sequência substancialmente correspondente à sequência de aminoácidos fornecida, isto é, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 e 196, ou uma variante da referida sequência de aminoácidos. Preferivelmente, um peptídeo de acordo com a invenção é capaz de estimular uma resposta celular contra uma doença que envolve células caracterizadas pela apresentação de um antígeno a partir do qual o peptídeo é derivado, isto é, CMV-pp65, NY-ESO-1, TPTE ou PLAC1 com MHC de classe I.

[0052] Em aspectos adicionais, a invenção refere-se a um ácido nucleico que codifica o peptídeo da invenção e a uma célula que compreende o ácido nucleico. Tal ácido nucleico pode estar presente em um plasmídeo ou em um vetor de expressão e pode estar funcionalmente ligado a um promotor. Preferivelmente, a célula expressa o peptídeo. A célula pode ser uma célula recombinante e pode secretar o peptídeo codificado ou um produto de processamento do mesmo, pode expressá-lo sobre a superfície e, preferivelmente, pode expressar adicionalmente uma molécula de MHC que se liga ao referido peptídeo ou a um produto de processamento do mesmo e, preferivelmente, apresenta o referido peptídeo ou um produto de processamento do mesmo sobre a superfície da célula. Em uma modalidade, a célula expressa a molécula de MHC de forma endógena. Em uma modalidade adicional, a célula expressa a molécula de MHC e/ou o peptídeo de uma maneira recombinante. A célula é preferivelmente não proliferativa. Em uma modalidade preferida, a célula é uma célula apresentadora de antígeno, em particular, uma célula dendrítica, um monócito ou um macrófago.

[0053] Em um aspecto adicional, a invenção refere- se a uma célula que apresenta o peptídeo da invenção ou um produto de processamento do mesmo, em que o produto de processamento é preferivelmente um peptídeo que possui a sequência de aminoácidos fornecida, isto é, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 e 196, ou uma variante da referida sequência de aminoácidos. A célula pode apresentar o peptídeo ou um produto de processamento do mesmo através de moléculas de MHC sobre a sua superfície. Em uma modalidade, a célula expressa uma molécula de MHC de forma endógena. Em uma modalidade adicional, a célula expressa uma molécula de MHC de forma recombinante. Em uma modalidade, as moléculas de MHC da célula são carregadas (pulsadas) com o peptídeo pela adição do peptídeo à célula. A célula pode expressar o peptídeo de forma recombinante e apresentar o referido peptídeo ou um produto de processamento do mesmo sobre a superfície da célula. A célula é preferivelmente não proliferativa. Em uma modalidade preferida, a célula é uma célula apresentadora de antígeno, tal como uma célula dendrítica, um monócito ou um macrófago.

[0054] Em um aspecto adicional, a invenção refere- se a uma célula imunorreativa reativa com um peptídeo da invenção, em particular, quando apresentado sobre a superfície de uma célula. A célula imunorreativa pode ser uma célula que foi sensibilizada in vitro para reconhecer o peptídeo. A célula imunorreativa pode ser uma célula T, preferivelmente, uma célula T citotóxica. Preferivelmente, a célula imunorreativa liga-se a uma sequência no peptídeo que corresponde substancialmente à sequência de aminoácidos fornecida, isto é, uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 e 196 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0055] Em um aspecto adicional, a invenção refere- se a um receptor de células T reativo com um peptídeo da invenção, ou uma cadeia polipeptídica do mesmo.

[0056] Em um aspecto adicional, a invenção refere- se a uma cadeia α de receptor de células T que compreende pelo menos uma, preferivelmente duas, mais preferivelmente todas as três sequências de CDR de uma cadeia α de receptor de células T selecionada a partir de SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 176, 188, 190, 192 e 194, ou uma variante das mesmas, ou um receptor de células T que compreende a referida cadeia α de receptor de células T. As sequências de CDR são mostrados sublinhadas nas sequências das cadeias α de receptor de células T mencionadas acima aqui fornecidas.

[0057] Em um aspecto adicional, a invenção refere- se a uma cadeia α de receptor de células T que compreende uma sequência de cadeia α de receptor de células T selecionada a partir de SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 176, 188, 190, 192 e 194, ou uma variante das mesmas, ou um receptor de células T que compreende a referida cadeia α de receptor de células T.

[0058] Em um aspecto adicional, a invenção refere- se a uma cadeia β de receptor de células T que compreende pelo menos uma, preferivelmente duas, mais preferivelmente todas as três sequências de CDR de uma cadeia β de receptor de células T selecionada a partir de SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 189, 191, 193 e 195, ou uma variante das mesmas, ou um receptor de células T que compreende a referida cadeia β de receptor de células T. As sequências de CDR são mostrados sublinhadas nas sequências das cadeias β de receptor de células T mencionadas acima aqui fornecidas.

[0059] Em um aspecto adicional, a invenção refere- se a uma cadeia β de receptor de células T que compreende uma sequência de cadeia β de receptor de células T selecionada a partir de SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 177, 189, 191, 193 e 195, ou uma variante das mesmas, ou um receptor de células T que compreende a referida cadeia β de receptor de células T.

[0060] Em um aspecto adicional, a invenção refere- se a um receptor de células T que compreende: (i) uma cadeia α de receptor de células T que compreende pelo menos uma, preferivelmente duas, mais preferivelmente todas as três sequências de CDR de uma cadeia α de receptor de células T de SEQ ID NO: x ou uma variante da mesma, e (ii) uma cadeia β de receptor de células T que compreende pelo menos uma, preferivelmente duas, mais preferivelmente todas as três sequências de CDR de uma cadeia β de receptor de células T de SEQ ID NO: x+1 ou uma variante da mesma; em que x é selecionado a partir de 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 176, 188, 190, 192 e 194.

[0061] Em um aspecto adicional, a invenção refere- se a um receptor de células T que compreende: (iii) uma cadeia α de receptor de células T que compreende a sequência de cadeia α de receptor de células T de SEQ ID NO: x ou uma variante da mesma, e (iv) uma cadeia β de receptor de células T que compreende a sequência de cadeia β de receptor de células T de SEQ ID NO: x+1 ou uma variante da mesma; em que x é selecionado a partir de 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 176, 188, 190, 192 e 194.

[0062] Os receptores de células T acima são, preferivelmente, específicos para o antígeno viral CMV-pp65 ou para o antígeno associado a tumor NY-ESO-1, TPTE ou PLAC1, em particular, quando apresentados sobre a superfície de uma célula, tal como uma célula doente ou um célula apresentadora de antígeno.

[0063] Em um aspecto adicional, a invenção refere- se a um ácido nucleico que codifica a cadeia de receptor de células T ou o receptor de células T, de acordo com qualquer um dos aspectos acima.

[0064] Em um aspecto adicional, a invenção refere- se a uma célula que compreende a cadeia de receptor de células T ou o receptor de células T, de acordo com qualquer um dos aspectos acima, ou o ácido nucleico que codifica a cadeia de receptor de células T ou o receptor de células T, de acordo com qualquer um dos aspectos acima. A célula pode ser uma célula tronco ou efetora, preferivelmente uma célula imunorreativa. A célula imunorreativa pode ser uma célula T, preferivelmente, uma célula T citotóxica. Preferivelmente, a célula imunorreativa é reativa com o antígeno viral CMV- pp65 ou com o antígeno associado a tumor NY-ESO-1, TPTE ou PLAC1, em particular, quando apresentada sobre a superfície de uma célula, tal como uma célula doente ou uma célula apresentadora de antígeno e, especificamente, com um peptídeo da invenção e, preferivelmente, liga-se a uma sequência no peptídeo que corresponde substancialmente à sequência de aminoácidos fornecida, isto é, uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 e 196, ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0065] Além disso, a presente invenção geralmente abrange o tratamento de doenças através do alvejamento de células doentes. Os métodos proporcionam a erradicação seletiva de células que apresentam um antígeno, isto é, o antígeno viral CMV-pp65 ou o antígeno tumoral NY-ESO-1, TPTE ou PLAC1, minimizando assim os efeitos adversos para as células normais que não apresentam o referido antígeno. Deste modo, as doenças preferidas para uma terapia são aquelas em que um dos antígenos aqui descritos é expresso e apresentado, tais como doenças infecciosas virais ou doenças malignas, em particular, doenças virais e doenças cancerígenas, tais como aquelas aqui descritas.

[0066] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um ou mais dos seguintes: (v) o peptídeo descrito acima; (vi) o ácido nucleico que codifica um peptídeo ou o ácido nucleico que codifica uma cadeia de receptor de células T ou o receptor de células T acima descrito; (vii) a célula que compreende um ácido nucleico que codifica um peptídeo descrito acima, a célula apresentando um peptídeo ou um produto de processamento descrito acima, ou a célula que compreende uma cadeia de receptor de células T ou o receptor de célula T ou um ácido nucleico descrito acima; (viii) o receptor de células T descrito acima; ou (ix) a célula imunorreativa descrita acima.

[0067] A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, pode compreender um ou mais adjuvantes, estabilizantes, etc. A composição farmacêutica pode estar sob a forma de uma vacina terapêutica ou profilática. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença viral, tal como infecção por hCMV ou uma doença maligna, tais como aquelas aqui descritas.

[0068] A administração de uma composição farmacêutica tal como descrita acima pode fornecer epítopos apresentados por MHC de classe II que são capazes de obter uma resposta de células T CD4+ auxiliares e/ou uma resposta de células T CD8+ contra os antígenos aqui descritos. Alternativa ou adicionalmente, a administração de uma composição farmacêutica tal como descrita acima pode fornecer epítopos apresentados por MHC de classe I que são capazes de obter uma resposta de células T CD8+ contra antígenos tumorais aqui descritos.

[0069] Em uma modalidade, o antígeno em questão é hCMV-pp65 e a composição farmacêutica da presente invenção é útil no tratamento e/ou prevenção da infecção por hCMV.

[0070] Em uma modalidade, o antígeno em questão é NY-ESO-1, TPTE ou PLAC1 e a composição farmacêutica da presente invenção é útil no tratamento e/ou prevenção de uma doença maligna.

[0071] Outro aspecto refere-se a um método para induzir uma resposta imune em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica da invenção.

[0072] Outro aspecto refere-se a um método para o estímulo, apresentação (priming) e/ou a expansão de células T, compreendendo o contato de células T com um ou mais dos seguintes: (x) o peptídeo descrito acima; (xi) o ácido nucleico que codifica um peptídeo descrito acima; e (xii) a célula que compreende um ácido nucleico que codifica um peptídeo descrito acima ou a célula que apresenta um peptídeo ou um produto de processamento descrito acima.

[0073] Neste aspecto, a invenção pode referir-se a um método para o preparo de células T antígeno-específicas. As células T podem ser estimuladas, apresentadas e/ou expandidas in vitro ou in vivo. Preferivelmente, as células T estão presentes em uma amostra obtida de um indivíduo. As células T estimuladas, apresentadas e/ou expandidas podem ser administradas a um indivíduo e podem ser autólogas, alogênicas, singênicas para o indivíduo.

[0074] A invenção, nos aspectos acima de um método para indução de uma resposta imune em um indivíduo ou de um método para estímulo, apresentação e/ou expansão de células T, pode estar relacionada a um método para o tratamento de infecções por hCMV ou doenças malignas em um indivíduo.

[0075] Em uma modalidade, o antígeno em questão é hCMV-pp65 e o tratamento é um tratamento profilático ou terapêutico de infecção por hCMV.

[0076] Em uma modalidade, o antígeno em questão é NY-ESO-1, TPTE ou PLAC1 e o tratamento é um tratamento terapêutico ou profilático de uma doença maligna. No caso do tratamento de uma doença maligna, os agentes e as composições aqui descritos são preferivelmente administrados de uma maneira tal que a substância terapeuticamente ativa não seja liberada ou não seja substancialmente liberada para um tecido ou órgão, em que as células, quando o tecido ou órgão é livre de uma doença maligna, expressam um antígeno associado a tumor aqui descrito, em particular, tecido testicular. Para este fim, os agentes e composições aqui descritos podem ser administrados localmente.

[0077] As composições e agentes aqui descritos são preferivelmente capazes de induzir ou promover uma resposta celular, preferivelmente a atividade de células T citotóxicas, contra uma doença caracterizada pela apresentação de um antígeno aqui descrito com MHC de classe I, por exemplo, uma doença viral ou uma doença maligna.

[0078] Em um aspecto, a invenção fornece os agentes e composições aqui descritos para utilização nos métodos de tratamento aqui descritos.

[0079] Os tratamentos de doenças malignas aqui descritos podem ser combinados com ressecção cirúrgica e/ou radioterapia e/ou quimioterapia tradicional.

[0080] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para a determinação de uma resposta imune em um indivíduo, compreendendo a determinação de células T reativas com um peptídeo descrito acima ou com uma célula que apresenta um peptídeo ou um produto de processamento descrito acima em uma amostra biológica isolada do indivíduo. O método pode compreender as etapas de: (a) incubar uma amostra que compreende células T isoladas de um indivíduo com um ou mais dos seguintes: (i) o peptídeo descrito acima; (ii) o ácido nucleico que codifica um peptídeo conforme descrito acima; e (iii) a célula que compreende um ácido nucleico que codifica um peptídeo descrito acima ou a célula que apresenta um peptídeo ou um produto de processamento descrito acima; e (b) detectar a ativação específica das células T e, a partir daí, determinar a presença ou a ausência de uma resposta imune no referido indivíduo.

[0081] A invenção nos aspectos acima de um método para a determinação de uma resposta imune em um indivíduo pode estar relacionada a um método para o diagnóstico de infecções por hCMV ou doenças malignas em um indivíduo.

[0082] Em uma modalidade, o antígeno em questão é hCMV-pp65 e o diagnóstico é um diagnóstico da infecção por hCMV.

[0083] Em uma modalidade, o antígeno em questão é NY-ESO-1, TPTE ou PLAC1 e o diagnóstico é um diagnóstico de uma doença maligna.

[0084] Em uma modalidade dos métodos de diagnóstico, a amostra biológica é de um tecido ou órgão em que as células, quando o tecido ou órgão está livre de doenças, não expressam substancialmente o antígeno em questão.

[0085] Tipicamente, o nível de células T em uma amostra biológica é comparado com um nível de referência, em que um desvio do referido nível de referência é indicativo da presença e/ou do estágio de uma doença em um indivíduo. O nível de referência pode ser um nível tal como determinado em uma amostra de controle (por exemplo, de um tecido ou indivíduo saudável) ou um nível mediano de indivíduos saudáveis. Um "desvio" do referido nível de referência designa qualquer alteração significativa, tal como um aumento de pelo menos 10%, 20% ou 30%, preferivelmente de pelo menos 40% ou 50%, ou até mesmo maior. Preferivelmente, a presença das células T na referida amostra biológica ou de uma quantidade de células T na amostra biológica que é aumentada em comparação com um nível de referência indica a presença de uma doença.

[0086] As células T podem ser isoladas a partir de sangue periférico, nódulos linfáticos, amostras de tecidos de um paciente, tais como derivados de biópsia e ressecção, ou de outra fonte. Os ensaios de reatividade podem ser realizados em células T primárias ou em outros derivados adequados. Por exemplo, as células T podem ser fundidas para gerar hibridomas. Ensaios para a medição da capacidade de resposta de células T são conhecidos na técnica e incluem ensaios de proliferação e ensaios de liberação de citocinas.

[0087] Os ensaios e índices para a detecção de células T reativas incluem, mas não estão limitados ao uso de ELISPOT de IFNY e coloração intracelular de citocina IFNY. Outros métodos diferentes são conhecidos na técnica para determinar se um clone de células T irá responder a um peptídeo em particular. Tipicamente, o peptídeo é adicionado a uma suspensão das células T durante um período de um a três dias. A resposta das células T pode ser medida por proliferação, por exemplo, absorção de timidina marcada, ou por liberação de citocinas, por exemplo, IL-2. Vários ensaios para detectar a presença de citocinas liberadas estão disponíveis. Ensaios de células T citotóxicas podem ser utilizados para detectar células T citotóxicas que possuem especificidade para antígenos. Em uma modalidade, as células T citotóxicas são testadas quanto à sua capacidade de matar as células alvo que apresentam um antígeno com moléculas de MHC de classe I. As células alvo que apresentam um antígeno podem ser marcadas e adicionadas a uma suspensão de células T de uma amostra do paciente. A citotoxicidade pode ser medida através da quantificação da liberação de marcador a partir de células lisadas. Controles para a liberação espontânea e total podem ser incluídos no ensaio.

[0088] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um ensaio não radioativo para monitorar e quantificar a atividade de destruição de células alvo, por exemplo, mediada por linfócitos T citotóxicos (CTLs). Este ensaio pode fornecer uma medida da atividade das células efetoras citotóxicas e pode detectar de forma confiável a morte por CTL antígeno-específico de células alvo. O ensaio fornece uma alternativa mais segura para o ensaio padrão de liberação de 51Cr, mais frequentemente utilizado para quantificar as respostas de CTL. O ensaio pode ser utilizado para estudar a morte mediada por CTL de células hospedeiras primárias alvo de diferentes linhagens celulares e fornece uma ferramenta valiosa para o desenvolvimento de novas vacinas e imunoterapias.

[0089] A invenção refere-se a um método para determinar a atividade citotóxica que compreende as etapas de: (i) fornecer uma amostra que compreende células alvo que produzem uma enzima repórter; (ii) submeter as células alvo a um agente, cuja atividade citotóxica deve ser determinada; e (iii) submeter a amostra a um ensaio de detecção para determinar o nível de enzima repórter contido em células viáveis na amostra.

[0090] Preferivelmente, a atividade citotóxica é uma atividade citotóxica mediada por células e o agente, cuja atividade citotóxica deve ser determinada, é uma célula efetora citotóxica, tal como uma célula selecionada a partir do grupo que consiste de um linfócito T citotóxico (CTL), uma célula matadora natural (NK) e um macrófago, preferivelmente, um linfócito T citotóxico (CTL). Em uma modalidade, a enzima repórter é dependente de ATP. Em uma modalidade, a enzima repórter é uma enzima emissora de luz, tal como uma enzima geradora de luminescência. Preferivelmente, a enzima repórter é a luciferase. Em uma modalidade, o RNA que codifica a referida enzima repórter foi introduzido nas referidas células alvo. O método pode compreender adicionalmente a etapa de adição de uma enzima degradante de ATP, tal como ATPase, à amostra para degradar substancialmente qualquer ATP extracelular na amostra. O método pode compreender adicionalmente a etapa de adição de um substrato que é pelo menos parcialmente permeável na célula viável. O substrato pode ser uma molécula luminogênica e pode ser um derivado de luciferina. Nesta modalidade, o método pode compreender a detecção de luminescência na amostra, deste modo, detectando a quantidade ou a presença de células viáveis na amostra.

[0091] Outras características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e reivindicações.

Descrição detalhada da invenção

[0092] Embora a presente invenção seja descrita em detalhes abaixo, deve ser entendido que esta invenção não se limita às metodologias, protocolos e reagentes particulares aqui descritos, uma vez que estes podem variar. Também deve ser compreendido que a terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrever apenas modalidades particulares e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, o qual será limitado apenas pelas reivindicações em anexo. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado conforme vulgarmente compreendido por um técnico no assunto.

[0093] A seguir, os elementos da presente invenção serão descritos. Estes elementos são listados com modalidades específicas, no entanto, deve ser compreendido que eles podem ser combinados de qualquer forma e em qualquer quantidade para criar modalidades adicionais. Os vários exemplos descritos e modalidades preferidas não devem ser interpretados de forma a limitar a presente invenção apenas às modalidades explicitamente descritas. Esta descrição deve ser entendida como suporte e abrangendo as modalidades que combinam as modalidades explicitamente descritas com qualquer quantidade dos elementos divulgados e/ou preferidos. Além disso, quaisquer alterações e combinações de todos os elementos descritos neste pedido devem ser consideradas divulgadas pela descrição do presente pedido, a menos que o contexto indique o contrário.

[0094] Preferivelmente, os termos aqui utilizados são definidos conforme descritos em "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, e H. Kolbl, Eds., (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suíça.

[0095] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, métodos convencionais de bioquímica, biologia celular, imunologia e técnicas de DNA recombinante que são explicadas na literatura da área (cf., por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook e cols. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

[0096] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações a seguir, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra "compreender" e variações, tais como "compreende" e "compreendendo", serão entendidas por significar a inclusão de um determinado membro, inteiro ou etapa ou grupo de membros, inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro membro, inteiro ou etapa ou grupo de membros, inteiros ou etapas, embora em algumas modalidades tal outro membro, inteiro ou etapa ou grupo de membros, inteiros ou etapas possam ser excluídos, isto é, a matéria consiste na inclusão de um determinado membro, inteiro ou etapa ou grupo de membros, inteiros ou etapas. Os termos "um" e "o" e referências similares utilizadas no contexto da descrição da invenção (em especial no contexto das reivindicações) devem ser compreendidos por abranger ambos o singular e o plural, a menos que aqui indicado de outra forma ou claramente contradito pelo contexto. A citação de faixas de valores aqui é meramente destinada a servir como um método abreviado de referir-se individualmente a cada valor separado que cai dentro da faixa. Salvo indicação contrária aqui, cada valor individual é incorporado no relatório descritivo como se ele fosse individualmente citado aqui.

[0097] Uma referência às SEQ ID NOs: 108 a 139 deve ser compreendida de forma a referir-se individualmente a cada uma das SEQ ID NOs: 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138 e 139.

[0098] De modo semelhante, uma referência às SEQ ID NOs: 178 a 187, deve ser compreendida de forma a referir-se individualmente a cada uma das SEQ ID NOs: 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186 e 187.

[0099] Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que aqui indicado de outra forma ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um e de todos os exemplos ou de linguagem exemplificativa (por exemplo, "tal como") aqui fornecida destina-se meramente a ilustrar melhor a invenção e não constitui uma limitação do escopo da invenção reivindicada. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser compreendida como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática da invenção.

[0100] Vários documentos são citados ao longo do texto deste relatório descritivo. Cada um dos documentos aqui citados (incluindo todas as patentes, pedidos de patente, publicações científicas, especificações de fabricantes, instruções, etc.), seja acima ou abaixo, são aqui incorporados como referência em sua totalidade. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem o direito de anteceder tal divulgação em virtude de uma invenção anterior.

[0101] O termo "recombinante", no contexto da presente invenção, significa "feito por meio de engenharia genética". Preferivelmente, um "objeto recombinante", tal como uma célula recombinante, no escopo da presente invenção, não é de ocorrência natural.

[0102] O termo "de ocorrência natural", tal como aqui utilizado, refere-se ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, um peptídeo ou ácido nucleico que está presente em um organismo (incluindo vírus) e pode ser isolado a partir de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem no laboratório é de ocorrência natural.

[0103] O termo "resposta imune" refere-se a uma resposta corporalmente integrada a um antígeno e preferivelmente refere-se a uma resposta imune celular ou a uma resposta celular, bem como a uma resposta imune humoral. A resposta imune pode ser protetora/preventiva/profilática e/ou terapêutica.

[0104] "Induzir uma resposta imune" pode significar que não houve uma resposta imune contra um determinado antígeno antes da indução, mas isso também pode significar que existe um certo nível de resposta imune contra um antígeno em particular antes da indução e após a indução da referida resposta imune ser intensificada. Assim, "induzir uma resposta imune" também inclui "intensificar uma resposta imune". Preferivelmente, após a indução de uma resposta imune em um indivíduo, o referido indivíduo é protegido contra o desenvolvimento de uma doença, tal como uma doença infecciosa, em particular, uma doença viral conforme aqui divulgada ou uma doença maligna, ou a condição da doença é melhorada através da indução de uma resposta imune. Por exemplo, uma resposta imune contra um antígeno viral, tal como hCMV-pp65, pode ser induzida em um paciente que possui uma doença viral ou em um indivíduo em risco de desenvolver uma doença viral. Por exemplo, uma resposta imune contra um antígeno associado a tumores, tais como NY-ESO-1, TPTE ou PLAC1, pode ser induzida em um paciente que possui uma doença maligna ou em um indivíduo em risco de desenvolver uma doença maligna. Induzir uma resposta imune, neste caso, pode significar que a condição de doença do indivíduo é melhorada, que o indivíduo não desenvolve metástases ou que o indivíduo em risco de desenvolver uma doença maligna não desenvolve uma doença maligna.

[0105] Uma "resposta imune celular", uma "resposta celular", uma "resposta celular contra um antígeno" ou um termo similar destina-se a incluir uma resposta celular dirigida a células caracterizadas pela apresentação de um antígeno com MHC de classe I ou de classe II. A resposta celular refere-se a células denominadas células T ou linfócitos T, que atuam como "auxiliares" ou "matadoras". As células T auxiliares (também denominadas células T CD4+) desempenham um papel central através da regulação da resposta imune e as células matadoras (também denominadas células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ ou CTLs) matam células doentes, tais como células infectadas ou células malignas, evitando a produção de mais células doentes.

[0106] O termo "antígeno" refere-se a um agente que compreende um epítopo contra o qual uma resposta imune deve ser gerada. Preferivelmente, um antígeno, no contexto da presente invenção, é uma molécula que, opcionalmente, após o processamento, induz uma reação imune, a qual é preferivelmente específica para o antígeno. O termo "antígeno" inclui, em particular, proteínas, peptídeos, polissacarídeos, ácidos nucleicos, especialmente RNA e DNA, e nucleotídeos.

[0107] Um antígeno é, preferivelmente, um produto que corresponde a ou é derivado de um antígeno de ocorrência natural. Tais antígenos de ocorrência natural podem incluir ou podem ser derivados de alérgenos, vírus, bactérias, fungos, parasitas e outros agentes infecciosos e agentes patogênicos ou um antígeno também pode ser um antígeno associado a tumores. De acordo com a presente invenção, um antígeno pode corresponder a um produto de ocorrência natural, por exemplo, uma proteína viral ou uma parte da mesma.

[0108] O termo "agente que compreende um antígeno" refere-se a uma entidade que compreende um antígeno, tal como um vírus que compreende um antígeno viral. Um exemplo é o hCMV que compreende hCMV-pp65.

[0109] Em uma modalidade preferida, um antígeno é um antígeno associado a tumores, isto é, um componente de células malignas que pode ser derivado do citoplasma, da superfície celular e do núcleo celular, em particular, aqueles antígenos que são produzidos, preferivelmente em grande quantidade, de modo intracelular ou como antígenos de superfície de células malignas.

[0110] Em particular, o antígeno ou peptídeos do mesmo deve ser reconhecível por um receptor de células T. Preferivelmente, o antígeno ou peptídeo, se reconhecido por um receptor de células T, é capaz de induzir, na presença de sinais co-estimulatórios apropriados, a expansão clonal da célula T que transporta o receptor de células T que reconhece especificamente o antígeno ou peptídeo. No contexto das modalidades da presente invenção, o antígeno é preferivelmente apresentado por uma célula, preferivelmente, por uma célula apresentadora de antígeno e/ou uma célula doente, no contexto de moléculas de MHC, o que resulta em uma reação imune contra o antígeno.

[0111] No contexto da presente invenção, os termos "antígeno associado a tumor" ou "antígeno de tumor" referem- se às proteínas que são, sob condições normais, especificamente expressas em um número limitado de tecidos e/ou órgãos ou em estágios de desenvolvimento específicos, por exemplo, o antígeno associado a tumor pode ser, sob condições normais, especificamente expresso no tecido do estômago, preferivelmente na mucosa gástrica, em órgãos reprodutores, por exemplo, nos testículos, no tecido trofoblástico, por exemplo, na placenta, ou em células da linhagem germinativa, e são expressos ou anormalmente expressos em um ou mais tecidos de tumor ou câncer. Neste contexto, "um número limitado" significa preferivelmente não mais do que 3, mais preferivelmente, não mais do que 2. Os antígenos associados a tumores, no contexto da presente invenção, incluem, por exemplo, antígenos de diferenciação, preferivelmente, antígenos de diferenciação específicos do tipo celular, isto é, proteínas que são, sob condições normais, especificamente expressas em um certo tipo de célula em um determinado estágio de diferenciação, antígenos de testículos/câncer, isto é, proteínas que são, sob condições normais, especificamente expressas em testículos e, às vezes, na placenta, e antígenos específicos de linhagem germinativa. No contexto da presente invenção, o antígeno associado a tumor é preferivelmente associado à superfície celular de uma célula maligna e, preferivelmente, não é ou é apenas raramente expresso em tecidos normais. Preferivelmente, o antígeno associado a tumor ou a expressão anormal do antígeno associado a tumor identifica células malignas. No contexto da presente invenção, o antígeno associado a tumor que é expresso por uma célula maligna em um indivíduo, por exemplo, um paciente que sofre de uma doença maligna, é preferivelmente um auto-proteína no referido indivíduo. Em modalidades preferidas, o antígeno associado a tumor, no contexto da presente invenção, é expresso, sob condições normais, especificamente em um tecido ou órgão que é não-essencial, isto é, tecidos ou órgãos que, quando danificados pelo sistema imune, não conduzem à morte do indivíduo ou em órgãos ou estruturas do corpo que não são ou que são apenas dificilmente acessíveis pelo sistema imune. Preferivelmente, a sequência de aminoácidos do antígeno associado a tumor é idêntica entre o antígeno associado a tumor que é expresso em tecidos normais e o antígeno associado a tumor que é expresso em tecidos malignos. Preferivelmente, um antígeno associado a tumor é apresentado por uma célula maligna na qual ele é expresso.

[0112] Em modalidades preferidas, um antígeno é um antígeno viral, tal como hCMV-pp65 e a presente invenção envolve o estímulo de uma resposta de CTL contra células infectadas que expressam tal antígeno viral e, preferivelmente, que apresentam tal antígeno viral com MHC de classe I.

[0113] Citomegalovírus é um gênero de herpes viral do grupo herpesvírus. Em seres humanos, ele é comumente conhecido como hCMV ou Herpesvírus Humano 5 (HHV-5). Todos os herpesvírus compartilham uma habilidade característica de permanecer latente dentro do corpo durante períodos longos.

[0114] Infecções por hCMV estão frequentemente associadas com as glândulas salivares, embora possam ser encontradas em todo o corpo. A infecção por hCMV também pode ser uma ameaça à vida para os pacientes que são imunocomprometidos (por exemplo, pacientes com HIV, receptores de transplante de órgãos ou recém-nascidos). Outros vírus CMV são encontrados em várias espécies de mamíferos, mas as espécies isoladas de animais diferem do hCMV em termos de estrutura genômica e não foram relatadas como causadoras de doença humana.

[0115] O hCMV é encontrado em todas as localizações geográficas e grupos socioeconômicos e infecta entre 50% e 80% dos adultos nos Estados Unidos (40% em todo o mundo), conforme indicado pela presença de anticorpos em grande parte da população em geral. O hCMV também é o vírus mais frequentemente transmitido a um feto em desenvolvimento. A infecção por hCMV é mais comum em países em desenvolvimento e em comunidades com nível socioeconômico mais baixo e representa a causa viral mais importante de defeitos de nascimento em países industrializados.

[0116] Duas proteínas de CMV, fosfoproteína 65 (pp65; CMV-pp65) e proteína-1 precoce imediata (IE-1), são os principais alvos da resposta imune celular.

[0117] O termo "hCMV-pp65" refere-se preferivelmente a uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0118] Sempre que, de acordo com os vários aspectos da invenção, hCMV-pp65, em particular SEQ ID NO: 1, uma sequência de epítopo de hCMV-pp65, em particular SEQ ID NOs: 108 a 110, ou uma sequência de receptor de células T específica para hCMV-pp65, em particular SEQ ID NOs: 4 a 29, estiver envolvida, o objetivo é preferivelmente induzir ou determinar uma resposta imune contra hCMV ou uma célula alvo infectada por hCMV e preferivelmente que é caracterizada pela apresentação de hCMV-pp65, e diagnosticar, tratar ou prevenir a infecção por hCMV. Preferivelmente, a resposta imune envolve o estímulo de uma resposta de CTL anti-hCMV- pp65 contra células infectadas que expressam hCMV-pp65 e, preferivelmente, que apresentam hCMV-pp65 com MHC de classe I.

[0119] Em modalidades preferidas, um antígeno é um antígeno associado a tumor, tais como NY-ESO-1, TPTE ou PLAC1 e a presente invenção envolve o estímulo de uma resposta de CTL anti-tumor contra células malignas que expressam tal antígeno associado a tumor e, preferivelmente, que apresentam tal antígeno associado a tumor com MHC de classe I.

[0120] NY-ESO-1 é um antígeno de testículos/câncer expresso em tecidos de adultos normais somente nas células germinativas testiculares de adultos normais e em vários cânceres. Ele induz imunidade celular e humoral específica em pacientes cujo câncer expressa NY-ESO-1.

[0121] O termo "NY-ESO-1" refere-se preferivelmente a NY-ESO-1 humano, e, em particular, a uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2 da listagem de sequências ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0122] Sempre que, de acordo com os vários aspectos da invenção, NY-ESO-1, em particular SEQ ID NO: 2, uma sequência de epítopo de NY-ESO-1, em particular SEQ ID NOs: 111 a 117 e 175 ou uma sequência de receptor de células T específica para NY-ESO-1, em particular SEQ ID NOs: 30 a 47, 140 a 151, 176 e 177, estiver envolvida, o objetivo é preferivelmente induzir ou determinar uma resposta imune contra células malignas que expressam NY-ESO-1 e, preferivelmente, que são caracterizadas pela apresentação de NY-ESO-1, e diagnosticar, tratar ou prevenir uma doença maligna que envolve células que expressam NY-ESO-1. Preferivelmente, a resposta imune envolve o estímulo de uma resposta de CTL anti-NY-ESO-1 contra células malignas que expressam NY-ESO-1 e que preferivelmente apresentam NY-ESO- 1 com MHC de classe I.

[0123] O termo "TPTE" refere-se à "fosfatase transmembranar com homologia de tensina". O termo "TPTE" refere-se preferivelmente à TPTE humana e, em particular, a uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3 da listagem de sequências ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0124] A expressão de TPTE em tecidos saudáveis é restrita aos testículos e quantidades de transcritos estão abaixo do limite de detecção em todos os outros espécimes de tecido normal. Em contraste, a expressão de TPTE é encontrada em vários tipos diferentes de câncer, incluindo melanoma maligno, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer mamário, câncer de ovário, carcinoma de células renais e câncer cervical.

[0125] A transcrição de TPTE é iniciada no decurso da transformação maligna por hipometilação de DNA associada a câncer. Além disso, a TPTE promove a progressão do câncer e a propagação metastática de células cancerígenas. Em particular, a TPTE é vital para a quimiotaxia eficiente, um processo que está envolvido em vários aspectos da progressão do câncer, incluindo a invasão do câncer e metástases, com impacto sobre a migração para o órgão de origem (homing) e o destino metastático de células cancerígenas. A expressão de TPTE em tumores primários está associada a uma taxa significativamente mais elevada de doença metastática.

[0126] Sempre que, de acordo com os vários aspectos da invenção, TPTE, em particular SEQ ID NO: 3, uma sequência de epítopo de TPTE, em particular SEQ ID NOs: 118 a 139 e 178 a 187, ou uma sequência de receptor de células T específico para TPTE, em particular SEQ ID NOs: 48 a 107 e 188 a 193, está envolvida, o objetivo é preferivelmente induzir ou determinar uma resposta imune contra células malignas que expressam TPTE e preferivelmente que são caracterizadas pela apresentação de TPTE, e diagnosticar, tratar ou prevenir uma doença maligna que envolve células que expressam TPTE. Preferivelmente, a resposta imune envolve o estímulo de uma resposta de CTL anti-TPTE contra células malignas que expressam TPTE e, preferivelmente, que apresentam TPTE com MHC de classe I.

[0127] O termo "PLAC1" refere-se à "proteína 1 específica da placenta". O termo "PLAC1" refere-se preferivelmente à PLAC1 humana e, em particular, a uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 174 da listagem de sequências ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0128] PLAC1 é um gene específico da placenta que é frequentemente ativado de modo anormal e altamente expresso em uma variedade de tipos de tumor. A expressão de PLAC1 foi encontrada, por exemplo, em câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de células renais, câncer hepático, sarcoma, câncer de tireoide e câncer de cabeça e pescoço. O PLAC1 é expresso em 82% dos pacientes com câncer de mama. Em relação ao câncer de pulmão e câncer gástrico, o PLAC1 é expresso em 42 e 58% dos casos, respectivamente.

[0129] O silenciamento mediado por RNAi de PLAC1 em células de câncer de mama MCF-7 e BT-549 prejudica profundamente a motilidade, migração e invasão e induz um bloqueio do ciclo celular G1/S com anulação quase completa da proliferação. O knock down de PLAC1 está associado à expressão diminuída de ciclina D1 e à fosforilação reduzida de AKT quinase. O PLAC1 está envolvido não só na proliferação celular, mas também na motilidade, migração e invasão celular.

[0130] Sempre que, de acordo com os vários aspectos da invenção, PLAC1, em particular SEQ ID NO: 174, uma sequência de epítopo de PLAC1, em particular SEQ ID NOs: 172, 173 e 196, ou uma sequência de receptor de células T específico para PLAC1, em particular SEQ ID NOs: 152 a 171, 194 e 195, está envolvida, o objetivo é preferivelmente induzir ou determinar uma resposta imune contra células malignas que expressam PLAC1 e que preferivelmente são caracterizadas pela apresentação de PLAC1, e diagnosticar, tratar ou prevenir uma doença maligna envolvendo células que expressam PLAC1. Preferivelmente, a resposta imune envolve o estímulo de uma resposta de CTL anti-PLAC1 contra células malignas que expressam PLAC1 e que preferivelmente apresentam PLAC1 com MHC de classe I.

[0131] As sequências de antígenos descritas acima incluem quaisquer variantes das referidas sequências, em particular, mutantes, variantes de splicing, conformações, isoformas, variantes alélicas, variantes de espécies e homólogos de espécies, em particular, aqueles que estão naturalmente presentes. Uma variante alélica refere-se a uma alteração na sequência normal de um gene, cuja significância é frequentemente incerta. O sequenciamento do gene completo frequentemente identifica numerosas variantes alélicas para um determinado gene. Um homólogo de espécie é um ácido nucleico ou uma sequência de aminoácidos com uma espécie de origem diferente daquela de um determinado ácido nucleico ou sequência de aminoácidos. Os termos "CMV-pp65", "NY-ESO-1", "TPTE" e "PLAC1" devem abranger (i) variantes, de splicing, (ii) variantes modificadas de modo pós-traducional, particularmente incluindo variantes com glicosilação diferente, tal como condição de N-glicosilação, (iii) variantes de conformação e (iv) variantes relacionadas a doenças e não relacionadas a doenças. Preferivelmente, "CMV- pp65", "NY-ESO-1", "TPTE" ou "PLAC1" estão presentes em sua conformação nativa.

[0132] "Célula alvo" significa uma célula que é um alvo para uma resposta imune, tal como uma resposta imune celular. As células alvo incluem células que apresentam um antígeno ou um epítopo de antígeno, isto é, um fragmento de peptídeo derivado de um antígeno, e incluem qualquer célula indesejável, tal como uma célula infectada por vírus ou célula maligna, conforme descrito acima. Em modalidades preferidas, a célula alvo é uma célula que expressa um antígeno, conforme aqui descrito, e que preferivelmente apresenta o referido antígeno com MHC de classe I.

[0133] O termo "indivíduo previamente exposto a um antígeno" designa um indivíduo, tal como um ser humano, que teve contato prévio com um antígeno e que é preferivelmente soropositivo para o antígeno e/ou para um agente que compreende o antígeno. Tal soropositividade pode ser determinada por meio da determinação de uma resposta imune ao antígeno ou a um agente que compreende o antígeno ou a um componente do referido agente que não seja o antígeno, por exemplo, outro antígeno, no indivíduo. A referida determinação de uma resposta imune compreende preferivelmente a determinação de uma resposta de anticorpo, tal como uma resposta de IgG.

[0134] O termo "epítopo" refere-se a um determinante antigênico em uma molécula, tal como um antígeno, isto é, uma parte ou fragmento da molécula que é reconhecida pelo sistema imune, por exemplo, que é reconhecida por uma célula T, em particular quando apresentada no contexto de moléculas do MHC. Um epítopo de uma proteína, tal como um antígeno associado a tumor ou antígeno viral compreende preferivelmente uma porção contínua ou descontínua da referida proteína e possui preferivelmente entre 5 e 100, preferivelmente entre 5 e 50, mais preferivelmente entre 8 e 30, mais preferivelmente entre 10 e 25 aminoácidos de comprimento, por exemplo, o epítopo pode ter preferivelmente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos de comprimento. É particularmente preferido que o epítopo, no contexto da presente invenção, seja um epítopo de célula T.

[0135] Os termos "epítopo", "fragmento de um antígeno", "peptídeo de antígeno" e "peptídeo" são aqui utilizados indiferentemente e referem-se preferivelmente a uma representação incompleta de um antígeno que é preferivelmente capaz de obter uma resposta imune contra o antígeno ou uma célula que expressa ou compreende e, preferivelmente, que apresenta o antígeno. Preferivelmente, os termos referem-se uma porção imunogênica de um antígeno. Preferivelmente, é uma porção de um antígeno que é reconhecida (isto é, ligada especificamente) por um receptor de células T, em particular, se apresentada no contexto das moléculas do MHC. Certas porções imunogênicas preferidas ligam-se a um MHC de classe I ou molécula de classe II. Conforme aqui utilizado, diz-se que uma porção imunogênica "liga-se a" um MHC de classe I ou molécula de classe II, se tal ligação é detectável utilizando-se qualquer ensaio conhecido na técnica.

[0136] Preferivelmente, os peptídeos antigênicos aqui descritos que compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 e 196, ou uma variante da referida sequência de aminoácidos, são capazes de estimular uma resposta imune, preferivelmente uma resposta celular contra o antígeno a partir do qual eles são derivados ou células caracterizadas pela expressão do antígeno e preferivelmente caracterizadas pela apresentação do antígeno. Preferivelmente, um peptídeo de antígeno é capaz de estimular uma resposta celular contra uma célula caracterizada pela apresentação do antígeno com MHC de classe I e, preferivelmente, é capaz de estimular um CTL que responde a antígeno. Preferivelmente, os peptídeos antigênicos de acordo com a invenção são peptídeos apresentados por MHC de classe I e/ou de classe II ou podem ser processados para produzir peptídeos apresentados por MHC de classe I e/ou de classe II. Preferivelmente, a sequência ligada à molécula de MHC é selecionada a partir de SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 e 196.

[0137] Se um peptídeo de antígeno deve ser apresentado diretamente, isto é, sem processamento, em particular, sem clivagem, ele possui um comprimento que é adequado para ligação a uma molécula de MHC, em particular, uma molécula de MHC de classe I e, preferivelmente, possui de 7 a 20 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente, de 7 a 12 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente, de 8 a 11 aminoácidos de comprimento, em particular, 9 ou 10 aminoácidos de comprimento. Preferivelmente, a sequência de um peptídeo de antígeno que deve ser apresentado diretamente corresponde substancialmente e é, preferivelmente, completamente idêntica a uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 e 196.

[0138] Se um peptídeo de antígeno deve ser apresentado após o processamento, em particular, após a clivagem, o peptídeo produzido por processamento possui um comprimento que é adequado para ligação a uma molécula do MHC, em particular, uma molécula de MHC de classe I e, preferivelmente, possui de 7 a 20 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente, de 7 a 12 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente, de 8 a 11 aminoácidos de comprimento, em particular, 9 ou 10 aminoácidos de comprimento. Preferivelmente, a sequência do peptídeo que deve ser apresentado após o processamento corresponde substancialmente e é, preferivelmente, completamente idêntica a uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 e 196. Assim, um peptídeo de antígeno de acordo com a invenção compreende, em uma modalidade, uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 e 196 e, após o processamento do peptídeo de antígeno, constitui uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs: 108 a 139, 172, 173, 175, 178 a 187 e 196.

[0139] Os peptídeos que possuem sequências de aminoácidos substancialmente correspondentes a uma sequência de um peptídeo que é apresentado por moléculas de MHC podem diferir em um ou mais resíduos que não são essenciais para o reconhecimento do TCR do peptídeo, conforme apresentado pelo MHC, ou para a ligação do peptídeo ao MHC. Tais peptídeos substancialmente correspondentes, preferivelmente, também são capazes de estimular uma resposta celular antígeno-específica, tal como o CTL antígeno-específico. Os peptídeos que possuem sequências de aminoácidos que diferem de um peptídeo apresentado em resíduos que não afetam o reconhecimento do TCR, mas melhoram a estabilidade de ligação ao MHC, podem melhorar a imunogenicidade do peptídeo de antígeno e podem ser aqui referidos como "peptídeos otimizados". Utilizando-se o conhecimento existente sobre quais destes resíduos podem ser mais suscetíveis a afetar a ligação ao MHC ou ao TCR, uma abordagem racional para a concepção de peptídeos substancialmente correspondentes pode ser empregada. Peptídeos resultantes que são funcionais estão contemplados como peptídeos de antígenos. As sequências, conforme discutido acima, estão englobadas pelo termo "variante" aqui utilizado.

[0140] Um peptídeo de antígeno pode ligar-se a moléculas de MHC, tais como moléculas de MHC sobre a superfície de uma célula e, assim, pode ser um "peptídeo de ligação ao MHC". O termo "peptídeo de ligação ao MHC" refere- se a um peptídeo que se liga a um MHC de classe I e/ou a uma molécula de MHC de classe II. No caso de complexos de peptídeo/MHC de classe I, os peptídeos de ligação possuem tipicamente de 8 a 10 aminoácidos de comprimento, embora peptídeos mais longos ou mais curtos possam ser eficazes. No caso de complexos de peptídeo/MHC de classe II, os peptídeos de ligação possuem tipicamente de 10 a 25 aminoácidos de comprimento e possuem, em particular, de 13 a 18 aminoácidos de comprimento, embora peptídeos mais longos e mais curtos possam ser eficazes.

[0141] O termo "porção" refere-se a uma fração. No que diz respeito a uma estrutura particular, tal como uma sequência de aminoácidos ou proteína, o termo "porção" da mesma pode designar uma fração contínua ou descontínua da referida estrutura. Preferivelmente, uma porção de uma sequência de aminoácidos compreende pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, preferivelmente pelo menos 40%, preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, ainda mais preferivelmente pelo menos 80%, e mais preferivelmente pelo menos 90% dos aminoácidos da referida sequência de aminoácidos. Preferivelmente, se a porção é uma fração descontínua, a referida fração descontínua é composta por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais partes de uma estrutura, cada parte sendo um elemento contínuo da estrutura. Por exemplo, uma fração descontínua de uma sequência de aminoácidos pode ser composta por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais, preferivelmente não mais do que 4 partes da referida sequência de aminoácidos, em que cada parte compreende, preferivelmente, pelo menos 5 aminoácidos contínuos, pelo menos 10 aminoácidos contínuos, preferivelmente pelo menos 20 aminoácidos contínuos, preferivelmente pelo menos 30 aminoácidos contínuos da sequência de aminoácidos.

[0142] Os termos "parte" e "fragmento" são aqui utilizados indiferentemente e referem-se a um elemento contínuo. Por exemplo, uma parte de uma estrutura, tal como uma sequência de aminoácidos ou proteína, refere-se a um elemento contínuo da referida estrutura. Uma porção, uma parte ou um fragmento de uma estrutura compreende preferivelmente uma ou mais propriedades funcionais da referida estrutura. Por exemplo, uma porção, uma parte ou um fragmento de um epítopo, peptídeo ou proteína é, preferivelmente, imunologicamente equivalente ao epítopo, peptídeo ou proteína de que é derivado. No contexto da presente invenção, uma "parte" de uma estrutura, tal como uma sequência de aminoácidos, compreende preferivelmente, consiste preferivelmente de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de toda a estrutura ou sequência de aminoácidos. Porções, partes ou fragmentos, conforme discutido acima, são englobados pelo termo "variante" aqui utilizado.

[0143] "Processamento de antígeno" refere-se à degradação de um antígeno em produtos de processamento, os quais são fragmentos do referido antígeno (por exemplo, a degradação de uma proteína em peptídeos), e à associação de um ou mais destes fragmentos (por exemplo, através de ligação) com moléculas de MHC para apresentação pelas células, preferivelmente, células apresentadoras de antígenos para células T específicas.

[0144] Uma célula apresentadora de antígeno (APC) é uma célula que apresenta antígeno no contexto do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) sobre a sua superfície. As células T podem reconhecer este complexo utilizando o seu receptor de células T (TCR). As células apresentadoras de antígenos processam antígenos e apresentam os mesmos às células T.

[0145] As células apresentadoras de antígenos profissionais são muito eficientes na internalização de antígenos, seja por fagocitose ou por endocitose mediada por receptor e, em seguida, na exibição de um fragmento do antígeno ligado a uma molécula de MHC de classe II, em suas membranas. A célula T reconhece e interage com o complexo de antígeno- molécula de MHC de classe II sobre a membrana da célula apresentadora de antígeno. Um sinal co-estimulante adicional é então produzido pelas células apresentadoras de antígenos, conduzindo à ativação da célula T. A expressão de moléculas co-estimulantes é uma característica definidora de células apresentadoras de antígenos profissionais.

[0146] Os principais tipos de células apresentadoras de antígenos profissionais são as células dendríticas, as quais possuem a gama mais ampla de apresentação de antígenos e são, provavelmente, as células apresentadoras de antígenos mais importantes, macrófagos, células B e certas células epiteliais ativadas.

[0147] Células apresentadoras de antígenos não profissionais não expressam constitutivamente as proteínas de MHC de classe II necessárias para a interação com as células T virgens; estas são expressas apenas mediante o estímulo das células apresentadoras de antígenos não profissionais por certas citocinas, tais como IFNY.

[0148] As células dendríticas (CDs) são populações de leucócitos que apresentam antígenos capturados em tecidos periféricos para as células T por meio de ambas as vias de apresentação de antígenos de MHC de classe II e I. É amplamente conhecido que as células dendríticas são indutores potentes de respostas imunes e que a ativação destas células é uma etapa crítica para a indução de imunidade antitumoral.

[0149] As células dendríticas e progenitoras podem ser obtidas de sangue periférico, medula óssea, células infiltrantes tumorais, células infiltrantes de tecidos peritumorais, linfonodos, baço, pele, sangue do cordão umbilical ou qualquer outro tecido ou fluido adequado. Por exemplo, as células dendríticas podem ser diferenciadas ex vivo pela adição de uma combinação de citocinas, tais como GM-CSF, IL-4, IL-13 e/ou TNFa, às culturas de monócitos colhidas de sangue periférico. Alternativamente, as células positivas CD34 colhidas de sangue periférico, de sangue do cordão umbilical ou de medula óssea podem ser diferenciadas em células dendríticas através da adição, ao meio de cultura, de combinações de GM-CSF, IL-3, TNFα, ligante CD40, LPS, ligante flt3 e/ou outro(s) composto(s) que induzem a maturação, diferenciação e proliferação de células dendríticas.

[0150] As células dendríticas são convenientemente categorizadas como células "imaturas" e "maduras", as quais podem ser utilizadas como uma forma simples de discriminação entre dois fenótipos bem caracterizados. No entanto, esta nomenclatura não deve ser interpretada para excluir todos os estágios intermediários de diferenciação possíveis.

[0151] Células dendríticas imaturas são caracterizadas como células apresentadoras de antígenos com uma elevada capacidade de absorção e processamento de antígenos, o que se correlaciona com a elevada expressão do receptor FCY e do receptor de manose. O fenótipo maduro é tipicamente caracterizado por uma menor expressão destes marcadores, mas por uma elevada expressão de moléculas da superfície celular responsáveis pela ativação de células T, tais como MHC de classe I e de classe II, moléculas de adesão (por exemplo, CD54 e CD11) e moléculas co-estimulantes (por exemplo, CD40, CD80, CD86 e 4-1 BB).

[0152] A maturação de células dendríticas é referida como o estado de ativação das células dendríticas em que tais células dendríticas apresentadoras de antígenos conduzem à apresentação de células T, enquanto que a apresentação por células dendríticas imaturas resultada em tolerância. A maturação de células dendríticas é principalmente causada por biomoléculas com características microbianas detectadas por receptores inatos (DNA bacteriano, RNA viral, endotoxinas, etc.), citocinas pró- inflamatórias (TNF, IL-1, IFNs), ligação de CD40 na superfície de células dendríticas por CD40L e substâncias libertadas de células submetidas à morte celular estressante. As células dendríticas podem ser obtidas pelo cultivo in vitro de células de medula óssea com citocinas, tais como fator estimulante de colônias de granulócitos- macrófagos (GM-CSF) e fator de necrose tumoral alfa.

[0153] Células, tais como células apresentadoras de antígenos ou células alvo, podem ser carregadas com peptídeos apresentados por MHC de classe I através da exposição, isto é, pulso das células com o peptídeo ou transdução das células com ácido nucleico, preferivelmente RNA, que codifica um peptídeo ou proteína que compreende o peptídeo a ser apresentado, por exemplo, um ácido nucleico que codifica o antígeno.

[0154] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica da invenção compreende uma célula apresentadora de antígeno carregada com peptídeo de antígeno. A este respeito, os protocolos podem depender da cultura/diferenciação in vitro de células dendríticas manipuladas, de tal forma que elas apresentem peptídeo de antígeno artificialmente. A produção de células dendríticas geneticamente modificadas pode envolver a introdução de ácidos nucleicos que codificam antígenos ou peptídeos de antígenos em células dendríticas. A transfecção de células dendríticas com mRNA é uma técnica promissora de carregamento de antígenos para estimular a imunidade antitumoral forte. Tal transfecção pode ocorrer ex vivo e uma composição farmacêutica compreendendo tais células transfectadas pode então ser utilizada para fins terapêuticos. Alternativamente, um veículo de liberação de genes que alveja uma célula dendrítica ou outra célula apresentadora de antígeno pode ser administrado a um paciente, resultando na transfecção que ocorre in vivo. A transfecção in vivo e ex vivo de células dendríticas pode, por exemplo, geralmente ser realizada utilizando-se quaisquer métodos conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos na publicação internacional WO 97/24447 ou na abordagem de biolística descrita por Mahvi e cols., Immunology and cell Biology 75: 456-460, 1997. O carregamento de antígeno das células dendríticas pode ser obtido por incubação de células dendríticas ou células progenitoras com o antígeno, DNA (puro ou dentro de um vetor de plasmídeo) ou RNA; ou com bactérias ou vírus recombinantes que expressam antígenos (por exemplo, vetores de vaccinia, varíola aviária, adenovírus ou lentivirus).

[0155] O termo "imunogenicidade" refere-se à eficiência relativa de um antígeno para induzir uma reação imune.

[0156] O termo "célula imunorreativa", no contexto da presente invenção, refere-se a uma célula que exerce funções efetoras durante uma reação imune. Uma "célula imunorreativa" é preferivelmente capaz de ligar-se a um antígeno ou a uma célula caracterizada pela apresentação de um antígeno ou de um peptídeo de antígeno derivado de um antígeno e mediar uma resposta imune. Por exemplo, tais células secretam citocinas e/ou quimiocinas, matam micróbios, secretam anticorpos, reconhecem células infectadas ou cancerígenas e, opcionalmente, eliminam tais células. Por exemplo, as células imunorreativas compreendem células T (células T citotóxicas, células T auxiliares, células T infiltrantes tumorais), células B, células matadoras naturais, neutrófilos, macrófagos e células dendríticas. Preferivelmente, no contexto da presente invenção, "células imunorreativas" são células T, preferivelmente, células T CD4+ e/ou CD8+.

[0157] Preferivelmente, uma "célula imunorreativa" reconhece um antígeno ou um peptídeo de antígeno derivado de um antígeno com um certo grau de especificidade, em particular, se apresentado no contexto das moléculas do MHC, tal como sobre a superfície de células apresentadoras de antígenos ou de células doentes, tais como células malignas ou células infectadas por vírus. Preferivelmente, o referido reconhecimento permite que a célula que reconhece um antígeno ou um peptídeo de antígeno derivado do referido antígeno seja responsiva ou reativa. Se a célula é uma célula T auxiliar (célula T CD4+) que suporta receptores que reconhecem um antígeno ou um peptídeo de antígeno derivado de um antígeno no contexto das moléculas de MHC de classe II, tal capacidade de resposta ou reatividade pode envolver a liberação de citocinas e/ou a ativação de linfócitos CD8+ (CTLs) e/ou células B. Se a célula é um CTL, tal capacidade de resposta ou reatividade pode envolver a eliminação de células apresentadas no contexto de moléculas de MHC de classe I, isto é, células caracterizadas pela apresentação de um antígeno com o MHC de classe I, por exemplo, via apoptose ou lise celular mediada por perforina. De acordo com a invenção, a capacidade de resposta do CTL pode incluir fluxo sustentado de cálcio, divisão celular, produção de citocinas, tais como IFN-y e TNF-α, regulação positiva de marcadores de ativação, tais como CD44 e CD69, e morte citolítica específica de antígeno que expressa células alvo. A capacidade de resposta do CTL também pode ser determinada utilizando-se um repórter artificial que indica com precisão a capacidade de resposta do CTL. Tal CTL que reconhece um antígeno ou um peptídeo de antígeno derivado de um antígeno e é responsivo ou reativo é também aqui denominado "CTL antígeno-responsivo". Se a célula é uma célula B, tal capacidade de resposta pode envolver a liberação de imunoglobulinas.

[0158] De acordo com a invenção, o termo "célula imunorreativa" também inclui uma célula que pode amadurecer para uma célula imune (tal como célula T, em particular, célula T auxiliar ou célula T citolítica) com o estímulo apropriado. Células imunorreativas compreendem células- tronco hematopoiéticas CD34+, células T imaturas e maduras e células B imaturas e maduras. Se a produção de células T auxiliares ou citolíticas que reconhecem um antígeno for desejada, a célula imunorreativa é contatada com uma célula que apresenta um antígeno ou peptídeo de antígeno sob condições que favorecem a produção, diferenciação e/ou seleção de células T citolíticas e de células T auxiliares. A diferenciação de precursores de células T para uma célula T citolítica, quando expostos a um antígeno, é semelhante à seleção clonal do sistema imune.

[0159] A "célula linfoide" é uma célula que, opcionalmente, após modificação apropriada, por exemplo, após a transferência de um receptor de células T, é capaz de produzir uma resposta imune, tal como uma resposta imune celular, ou uma célula precursora de tal célula, e inclui linfócitos, preferivelmente linfócitos T, linfoblastos e células plasmáticas. Uma célula linfoide pode ser uma célula imunorreativa conforme aqui descrita. Uma célula linfoide preferida é uma célula T sem expressão endógena de um receptor de células T e que pode ser modificada para expressar tal receptor de células T sobre a superfície da célula.

[0160] Os termos "célula T" e "linfócito T" são aqui utilizados indiferentemente e incluem células T auxiliares (células T CD4+) e células T citotóxicas (CTLs, células T CD8+) que compreendem células T citolíticas.

[0161] As células T pertencem a um grupo de células brancas do sangue conhecidas como linfócitos e desempenham um papel central na imunidade mediada por células. Elas podem ser distinguidas de outros tipos de linfócitos, tais como células B ou células matadoras naturais, pela presença de um receptor especial sobre a sua superfície celular denominado receptor de células T (TCR). O timo é o principal órgão responsável pela maturação das células T. Vários subconjuntos de células T diferentes têm sido descobertos, cada um com uma função distinta.

[0162] As células T auxiliares auxiliam outras células brancas do sangue em processos imunológicos, incluindo a maturação de células B em células plasmáticas e a ativação de células T citotóxicas e macrófagos, dentre outras funções. Estas células também são conhecidas como células T CD4+ porque expressam a proteína CD4 sobre a sua superfície. As células T auxiliares tornam-se ativadas quando são apresentadas com antígenos de peptídeo por moléculas de MHC de classe II, que são expressas sobre a superfície de células apresentadoras de antígeno (APCs). Uma vez ativadas, elas dividem-se rapidamente e secretam pequenas proteínas denominadas citocinas que regulam ou auxiliam na resposta imune ativa.

[0163] As células T citotóxicas destroem células infectadas por vírus e células tumorais e também implicam em rejeição de transplantes. Estas células também são conhecidas como células T CD8+, uma vez que expressam a glicoproteína CD8 em sua superfície. Estas células reconhecem seus alvos através da ligação ao antígeno associado com MHC de classe I, o qual está presente sobre a superfície de quase todas as células do corpo.

[0164] A maioria das células T possui um receptor de células T (TCR) que existe como um complexo de várias proteínas. O receptor de células T real é composto por duas cadeias peptídicas separadas que são produzidas a partir dos genes independentes alfa e beta do receptor de células T (TCRα e TCRβ) e são denominadas cadeias de TCR α e β. Células T Yδ (células T gama delta) representam um pequeno subconjunto de células T que possuem um receptor de células T (TCR) diferente sobre a sua superfície. No entanto, em células T Yδ, o TCR é feito de uma cadeia Y e de uma cadeia δ. Este grupo de células T é muito menos comum (2% do total de células T) do que as células T αβ.

[0165] A estrutura do receptor de células T é muito semelhante aos fragmentos Fab de imunoglobulina, que são regiões definidas como as cadeias leve e pesada combinadas de um braço de anticorpo. Cada cadeia do TCR é um membro da superfamília de imunoglobulinas e possui um domínio variável (V) de imunoglobulina (Ig) N-terminal, um domínio constante (C) de Ig, uma região de expansão de transmembrana/membrana celular e uma cauda citoplasmática curta na extremidade C- terminal.

[0166] De acordo com a invenção, o termo "região variável de um receptor de células T" refere-se aos domínios variáveis das cadeias de TCR.

[0167] O domínio variável de ambas as cadeias α e β do TCR possui três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) ou hipervariáveis, enquanto que a região variável da cadeia β possui uma área adicional de hipervariabilidade (HV4) que normalmente não entra em contato com o antígeno e, por conseguinte, não é considerada uma CDR. A CDR3 é a principal CDR responsável pelo reconhecimento de antígeno processado, embora a CDR1 da cadeia α também tenha demonstrado interagir com a parte N- terminal do peptídeo de antígeno, enquanto a CDR1 da cadeia β interage com a parte C-terminal do peptídeo. Acredita-se que a CDR2 reconheça o MHC. Não se acredita que a CDR4 da cadeia β participe do reconhecimento do antígeno, mas ela demonstrou que interage com superantígenos.

[0168] De acordo com a invenção, o termo "pelo menos uma das sequências de CDR" significa, preferivelmente, pelo menos a sequência de CDR3. O termo "sequências de CDR de uma cadeia de receptor de células T" refere-se preferivelmente à CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia α ou da cadeia β de um receptor de células T.

[0169] O domínio constante do domínio de TCR consiste de sequências curtas de ligação em que um resíduo de cisteína forma ligações de dissulfeto, as quais formam uma ligação entre as duas cadeias.

[0170] Todas as células T originam-se de células- tronco hematopoiéticas na medula óssea. Progenitoras hematopoiéticas derivadas de células-tronco hematopoiéticas populam o timo e expandem-se por divisão celular para gerar uma grande população de timócitos imaturos. Os primeiros timócitos não expressam CD4 nem CD8 e são, por conseguinte, classificados como células duplo-negativas (CD4-CD8-). Conforme eles progridem em seu desenvolvimento, tornam-se timócitos duplo-positivos (CD4+CD8+) e, finalmente, amadurecem para timócitos único-positivos (CD4+CD8- ou CD4- CD8+) que são então liberados do timo para os tecidos periféricos.

[0171] O primeiro sinal de ativação de células T é fornecido pela ligação do receptor de células T a um peptídeo curto apresentado pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC) em outra célula. Isso garante que apenas uma célula T com um TCR específico para o peptídeo seja ativada. A célula parceira é geralmente uma célula apresentadora de antígeno profissional (APC), geralmente uma célula dendrítica, no caso de respostas virgens, embora as células B e os macrófagos possam ser APCs importantes. Os peptídeos apresentados para células T CD8+ por moléculas de MHC de classe I possuem de 8 a 10 aminoácidos de comprimento; os peptídeos apresentados para células T CD4+ por moléculas de MHC de classe II são mais longos, uma vez que as extremidades da fenda de ligação da molécula de MHC de classe II estão abertas.

[0172] As células T podem ser geralmente preparadas in vitro ou ex vivo, utilizando-se procedimentos padrão. Por exemplo, as células T podem estar presentes dentro (ou isoladas a partir) da medula óssea, sangue periférico ou de uma fração de medula óssea ou de sangue periférico de um mamífero, tal como um paciente, utilizando-se um sistema de separação celular comercialmente disponível. Alternativamente, as células T podem ser derivadas de humanos relacionados ou não relacionados, animais não-humanos, linhagens ou culturas celulares. Uma "amostra que compreende células T" pode, por exemplo, ser células mononucleares do sangue periférico (PBMC).

[0173] As células T podem ser estimuladas com antígeno, peptídeo, ácido nucleico e/ou células apresentadoras de antígenos (APCs) que expressam um antígeno. Tal estímulo é realizado sob condições e durante um tempo suficiente para permitir a geração de células T que são específicas para um antígeno, um peptídeo e/ou células que apresentam um antígeno ou um peptídeo.

[0174] A ativação específica de células T CD4+ ou CD8+ pode ser detectada em uma variedade de maneiras. Os métodos para detectar a ativação específica de células T incluem a detecção da proliferação de células T, a produção de citocinas (por exemplo, linfocinas) ou a geração de atividade citolítica. Para as células T CD4+, um método preferido para a detecção da ativação específica de células T é a detecção da proliferação de células T. Para as células T CD8+, um método preferido para a detecção específica da ativação de células T é a detecção da geração de atividade citolítica.

[0175] A fim de gerar linhagens de células T CD8+, células apresentadoras de antígenos, preferivelmente, células apresentadoras de antígeno autólogas, transfectadas com um ácido nucleico que produz o antígeno, podem ser utilizadas como células estimulantes.

[0176] Ácidos nucleicos, tal como RNA que codifica cadeias de receptor de células T (TCR), podem ser introduzidos em células linfoides, tais como células T ou outras células com potencial lítico. Em uma modalidade adequada, as cadeias α e β de TCR são clonadas a partir de uma linhagem de células T antígeno-específicas e utilizadas para terapia adaptativa de células T. A presente invenção fornece receptores de células T específicos para um antígeno ou peptídeo de antígeno aqui descrito. Em geral, este aspecto da invenção refere-se a receptores de células T que reconhecem ou ligam peptídeos de antígeno apresentados no contexto do MHC. Os ácidos nucleicos que codificam cadeias α e β de um receptor de células T, por exemplo, um receptor de células T fornecido de acordo com a presente invenção, podem estar contidos em moléculas de ácidos nucleicos separadas, tais como vetores de expressão ou, alternativamente, em uma única molécula de ácido nucleico. Por conseguinte, o termo "um ácido nucleico que codifica um receptor de células T" refere-se a moléculas de ácidos nucleicos que codificam as cadeias de receptor de células T nas mesmas ou, preferivelmente, em diferentes moléculas de ácido nucleico.

[0177] O termo "célula imunorreativa reativa com um peptídeo" refere-se a uma célula imunorreativa que, quando reconhece o peptídeo, em particular, se apresentado no contexto das moléculas do MHC, tal como sobre a superfície de células apresentadoras de antígenos ou células doentes, tais como células malignas ou células infectadas por vírus, exerce funções efetoras de células imunorreativas, tal como descrito acima.

[0178] O termo "receptor de células T reativo com um peptídeo" refere-se a um receptor de células T que, quando presente em uma célula imunorreativa, reconhece o peptídeo, em particular, se apresentado no contexto de moléculas do MHC, tal como sobre a superfície de células apresentadoras de antígenos ou células infectadas, tais como células malignas ou células infectadas por vírus, tal que a célula imunorreativa exerce funções efetoras de células imunorreativas, conforme descrito acima.

[0179] O termo "célula T reativa a antígeno" refere- se a uma célula T que reconhece um antígeno se apresentada no contexto de moléculas do MHC, tal como sobre a superfície de células apresentadoras de antígenos ou células doentes, tais como células malignas ou células infectadas por vírus, e exerce funções efetoras de células T, conforme descrito acima.

[0180] O termo "célula linfoide antígeno-específica" refere-se a uma célula linfoide que, em particular, quando provida de um receptor de células T antígeno-específico, reconhece o antígeno se apresentada no contexto de moléculas do MHC, tal como sobre a superfície de células apresentadoras de antígenos ou células doentes, tais como células malignas ou células infectadas por vírus, e preferivelmente exerce funções efetoras de células T, conforme descrito acima. As células T e outras células linfoides são consideradas específicas para antígeno, se as células matam células alvo que expressam um antígeno e/ou que apresentam um peptídeo de antígeno. A especificidade das células T pode ser avaliada utilizando-se qualquer uma de uma variedade de técnicas padrão, por exemplo, dentro de um ensaio de liberação de cromo ou ensaio de proliferação. Alternativamente, a síntese de linfocinas (tal como o interferon-Y) pode ser medida.

[0181] O termo "complexo principal de histocompatibilidade" e a abreviatura "MHC" incluem moléculas de MHC de classe I e de MHC de classe II e referem- se a um complexo de genes que ocorrem em todos os vertebrados. Proteínas ou moléculas do MHC são importantes para a sinalização entre linfócitos e células apresentadoras de antígenos ou células doentes em reações imunes, em que as proteínas ou moléculas do MHC ligam peptídeos e apresentam os mesmos para o reconhecimento pelos receptores de células T. As proteínas codificadas pelo MHC são expressas sobre a superfície de células e exibem ambos os auto-antígenos (fragmentos de peptídeos da própria célula) e não auto- antígenos (por exemplo, fragmentos de microrganismos invasores) para uma célula T.

[0182] A região do MHC é dividida em três subgrupos, classe I, classe II e classe III. As proteínas do MHC de classe I contêm uma cadeia-α e β2-microglobulina (não fazem parte do MHC codificado pelo cromossomo 15). Elas apresentam fragmentos de antígenos para as células T citotóxicas. Na maioria das células do sistema imune, especificamente em células apresentadoras de antígenos, as proteínas do MHC de classe II contêm cadeias α e β e apresentam fragmentos de antígenos para as células T auxiliares. A região do MHC de classe III codifica para outros componentes imunes, tais como componentes do complemento e alguns que codificam citocinas.

[0183] Em humanos, os genes na região do MHC que codificam as proteínas apresentadoras de antígenos sobre a superfície celular são referidos como genes de antígenos leucocitários humanos (HLA). No entanto, a abreviatura MHC é geralmente utilizada para se referir a produtos de genes de HLA. Genes de HLA incluem os chamados nove genes clássicos do MHC: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA e HLA-DRB1.

[0184] Em uma modalidade preferida de todos os aspectos da invenção, uma molécula de MHC é uma molécula de HLA.

[0185] Por "célula caracterizada pela apresentação de um antígeno", "célula que apresenta um antígeno", "antígeno apresentado por uma célula", "antígeno apresentado" ou expressões semelhantes entende-se uma célula, tal como uma célula doente, tal como uma célula infectada por vírus ou uma célula maligna, ou uma célula apresentadora de antígeno que apresenta o antígeno que ela expressa ou um fragmento derivado do referido antígeno, por exemplo, através do processamento do antígeno, no contexto de moléculas do MHC, em particular, moléculas do MHC de classe I. De forma similar, o termo "doença caracterizada pela apresentação de um antígeno" denota uma doença que envolve células caracterizadas pela apresentação de um antígeno, em particular, com MHC de classe I. A apresentação de um antígeno por uma célula pode ser efetuada por transfecção da célula com um ácido nucleico, tal como RNA que codifica o antígeno.

[0186] Por "fragmento de um antígeno que é apresentado" ou expressões similares entende-se que o fragmento pode ser apresentado pelo MHC de classe I ou de classe II, preferivelmente MHC de classe I, por exemplo, quando adicionado diretamente às células apresentadoras de antígenos. Em uma modalidade, o fragmento é um fragmento que é naturalmente apresentado pelas células que expressam um antígeno.

[0187] Alguns métodos terapêuticos baseiam-se em uma reação do sistema imune de um paciente, o que resulta em uma lise de células doentes que apresentam um antígeno com MHC de classe I. A este respeito, por exemplo, linfócitos T citotóxicos autólogos específicos para um complexo de um peptídeo de antígeno e uma molécula de MHC podem ser administrados a um paciente que possui uma doença. A produção in vitro de tais linfócitos T citotóxicos é conhecida. Um exemplo de um método de diferenciação de células T pode ser encontrado na publicação internacional WO-A-9633265. Geralmente, uma amostra contendo células, tais como células de sangue, é retirada do paciente e as células são contatadas com uma célula que apresenta o complexo e que pode causar a propagação de linfócitos T citotóxicos (por exemplo, células dendríticas). A célula alvo pode ser uma célula transfectada, tal como uma célula COS. Estas células transfectadas apresentam o complexo desejado sobre a sua superfície e, quando contatadas com linfócitos T citotóxicos, estimulam a propagação destes. Os linfócitos T citotóxicos autólogos clonalmente expandidos são então administrados ao paciente.

[0188] Em um outro método de seleção de linfócitos T citotóxicos, tetrâmeros fluorogênicos de complexos de molécula de MHC de classe I/peptídeo são utilizados para a obtenção de clones específicos de linfócitos T citotóxicos (Altman e cols. (1996), Science 274:94-96; Dunbar e cols. (1998), Curr. Biol. 8:413-416, 1998).

[0189] Além disso, as células que apresentam o complexo desejado (por exemplo, células dendríticas) podem ser combinadas com linfócitos T citotóxicos de indivíduos saudáveis ou de outra espécie (por exemplo, camundongo), o que pode resultar na propagação de linfócitos T citotóxicos específicos com elevada afinidade. O receptor de células T de elevada afinidade destes linfócitos T específicos propagados pode ser clonado e, opcionalmente, humanizado de uma forma diferente, e os receptores de células T assim obtidos são então transduzidos via transferência de genes, por exemplo, utilizando vetores retrovirais, para células T de pacientes. A transferência adaptativa pode então ser realizada utilizando-se estes linfócitos T geneticamente alterados (Stanislawski e cols. (2001), Nat Immunol. 2:96270; Kessels e cols. (2001), Nat Immunol. 2:957-61.

[0190] Os linfócitos T citotóxicos também podem ser gerados in vivo de uma forma conhecida per se. Um método utiliza células não proliferativas que expressam um complexo de MHC de classe I/peptídeo. As células aqui utilizadas serão aquelas que normalmente expressam o complexo, tais como as células tumorais irradiadas ou as células transfectadas com um ou ambos os genes necessários para a apresentação do complexo (isto é, o peptídeo antigênico e a molécula que apresenta o MHC). Outra forma preferida é a introdução de um antígeno na forma de RNA recombinante que pode ser introduzido nas células por transferência lipossomal ou por eletroporação, por exemplo. As células resultantes apresentam o complexo de interesse e são reconhecidas por linfócitos T citotóxicos autólogos que então se propagam.

[0191] Um efeito semelhante pode ser obtido pela combinação de um antígeno ou de um peptídeo de antígeno com um adjuvante, de modo a tornar possível a incorporação in vivo em células apresentadoras de antígenos. O antígeno ou peptídeo de antígeno pode ser representado como uma proteína, como DNA (por exemplo, dentro de um vetor) ou como RNA. O antígeno pode ser processado para produzir um parceiro peptídico para a molécula de MHC, enquanto que um fragmento do mesmo pode ser apresentado sem a necessidade de processamento adicional. O último é o caso, em particular, se estes podem ligar-se a moléculas de MHC. É dada preferência às formas de administração em que o antígeno completo é processado in vivo por uma célula dendrítica, uma vez que esta também pode produzir respostas de células T auxiliares que são necessárias para uma resposta imune eficaz (Ossendorp e cols., Immunol Lett. (2000), 74:75-9; Ossendorp e cols. (1998), J. Exp. Med. 187:693-702). Em geral, é possível administrar uma quantidade eficaz do antígeno associado a tumor a um paciente através de injeção intradérmica, por exemplo. No entanto, a injeção também pode ser realizada por via intranodal em um linfonodo (Maloy e cols. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303).

[0192] De acordo com a invenção, uma "referência", tal como uma amostra de referência ou organismo de referência, pode ser utilizada para correlacionar e comparar os resultados obtidos nos métodos da invenção a partir de uma amostra de teste ou organismo de teste. Tipicamente, o organismo de referência é um organismo saudável, em particular, um organismo que não sofre de uma doença, tal como uma doença maligna ou doença viral. Um "valor de referência" ou "nível de referência" pode ser determinado empiricamente a partir de uma referência através da medição de um número suficientemente grande de referências. Preferivelmente, o valor de referência é determinado pela medição de pelo menos 2, preferivelmente pelo menos 3, preferivelmente pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 8, preferivelmente pelo menos 12, preferivelmente pelo menos 20, preferivelmente pelo menos 30, preferivelmente pelo menos 50 ou preferivelmente pelo menos 100 referências.

[0193] O termo "imunoglobulina" refere-se a proteínas da superfamília das imunoglobulinas, preferivelmente aos receptores de antígenos, tais como anticorpos ou o receptor de células B (BCR). As imunoglobulinas são caracterizadas por um domínio estrutural, isto é, o domínio de imunoglobulina, que possui uma dobra característica de imunoglobulina (Ig). O termo abrange imunoglobulinas ligadas à membrana, bem como imunoglobulinas solúveis. Imunoglobulinas ligadas à membrana são também chamadas de imunoglobulinas de superfície ou imunoglobulinas de membrana, que geralmente são parte do BCR. Imunoglobulinas solúveis são geralmente denominadas anticorpos. As imunoglobulinas geralmente compreendem várias cadeias, tipicamente duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas que estão ligadas através de ligações de dissulfeto. Estas cadeias são compostas principalmente de domínios de imunoglobulina, tais como o domínio VL (variável de cadeia leve), o domínio CL (constante de cadeia leve) e os domínios CH (constante de cadeia pesada) CH1, CH2, CH3 e CH4. Existem cinco tipos de cadeias pesadas de imunoglobulina de mamíferos, isto é, α, δ, ε, y e μ, que representam as diferentes classes de anticorpos, isto é, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Ao contrário das cadeias pesadas de imunoglobulinas solúveis, as cadeias pesadas de imunoglobulinas da superfície ou de membrana compreendem um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático curto em seu terminal carbóxi. Em mamíferos, existem dois tipos de cadeias leves, isto é, lambda e kappa.

[0194] As cadeias de imunoglobulina compreendem uma região variável e uma região constante. A região constante é essencialmente conservada dentro dos diferentes isotipos de imunoglobulinas, em que a parte variável é altamente diversa e é responsável pelo reconhecimento de antígenos.

[0195] O termo "anticorpo" refere-se a uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por pontes de dissulfeto e inclui qualquer molécula que compreende uma porção de ligação ao antígeno da mesma. O termo "anticorpo" inclui anticorpos monoclonais e fragmentos ou derivados dos mesmos, incluindo, sem limitação, anticorpos monoclonais humanos, anticorpos monoclonais humanizados, anticorpos monoclonais quiméricos, anticorpos de cadeia única, por exemplo, fragmentos scFv e fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos, tais como fragmentos Fab e Fab' e também inclui todas as formas recombinantes de anticorpos, por exemplo, anticorpos expressos em procariontes, anticorpos não glicosilados e quaisquer fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos e derivados. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões framework (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino até o terminal carbóxi, na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias leves e pesadas contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema clássico de complemento.

[0196] De acordo com a presente invenção, um receptor de células T ou um anticorpo é capaz de ligar-se a um alvo pré-determinado, se ele possui uma afinidade significativa para o referido alvo pré-determinado e liga-se ao referido alvo pré-determinado em ensaios padrão. A "afinidade" ou "afinidade de ligação" é geralmente medida pela constante de dissociação de equilíbrio (KD). Um receptor de células T ou um anticorpo não é (substancialmente) capaz de se ligar a um alvo se ele não possuir qualquer afinidade significativa para o referido alvo e não se liga significativamente ao referido alvo em ensaios padrão.

[0197] Um receptor de células T ou um anticorpo é preferivelmente capaz de ligar-se especificamente a um alvo pré-determinado. Um receptor de células T ou um anticorpo é específico para um alvo pré-determinado, se ele for capaz de ligar-se ao referido alvo pré-determinado, enquanto que não é (substancialmente) capaz de se ligar a outros alvos, isto é, não possui qualquer afinidade significativa por outros alvos e não se liga significativamente a outros alvos em ensaios padrão.

[0198] O termo "imunologicamente equivalente" significa que a molécula imunologicamente equivalente, tal como a sequência de aminoácidos imunologicamente equivalente, exibe as mesmas propriedades imunológicas ou propriedades imunológicas essencialmente iguais e/ou exerce os mesmos efeitos imunológicos ou efeitos imunológicos essencialmente iguais, por exemplo, no que diz respeito ao tipo de efeito imunológico, tal como a indução de uma resposta imune celular e/ou humoral, a resistência e/ou a duração da reação imune induzida ou a especificidade da reação imune induzida. No contexto da presente invenção, o termo "imunologicamente equivalente" é preferivelmente utilizado em relação aos efeitos ou propriedades imunológicas de um peptídeo ou variante de peptídeo utilizada para a imunização. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos é imunologicamente equivalente a uma sequência de aminoácidos de referência, se a referida sequência de aminoácidos, quando exposta ao sistema imune de um indivíduo, induz a uma reação imunitária que possui uma especificidade de reação com a sequência de aminoácidos de referência.

[0199] O termo "funções efetoras imunes", no contexto da presente invenção, inclui quaisquer funções mediadas por componentes do sistema imune que resultam, por exemplo, na morte de células infectadas por vírus ou células tumorais, ou na inibição do crescimento de tumores e/ou na inibição do desenvolvimento de tumores, incluindo a inibição da disseminação de tumores e metástases. Preferivelmente, as funções efetoras imunes, no contexto da presente invenção, são funções efetoras mediadas por células T. Tais funções compreendem, no caso de uma célula T auxiliar (células T CD4+), o reconhecimento de um antígeno ou de um peptídeo de antígeno derivado de um antígeno no contexto das moléculas de MHC de classe II pelos receptores de células T, a liberação de citocinas e/ou a ativação de linfócitos CD8+ (CTL) e/ou de células B e, no caso de CTL, o reconhecimento de um antígeno ou de um peptídeo de antígeno derivado de um antígeno no contexto das moléculas de MHC de classe I pelos receptores de células T, a eliminação de células apresentadas no contexto de moléculas de MHC de classe I, isto é, células caracterizadas pela apresentação de um antígeno com MHC de classe I, por exemplo, via apoptose ou lise celular mediada por perforina, a produção de citocinas, tais como IFN-Y e TNF-α, e a morte citolítica específica de antígeno que expressa células alvo.

[0200] O termo "receptor de células T que possui a especificidade de outro receptor de células T" significa que os dois receptores de células T, em particular, quando presentes em uma célula imunorreativa, reconhecem o mesmo epítopo, em particular, quando apresentados no contexto de moléculas de MHC, tais como sobre a superfície de células apresentadoras de antígenos ou de células doentes, tais como células infectadas por vírus ou células malignas, e preferivelmente fornecem a célula imunorreativa com funções efetoras, conforme divulgado acima. Preferivelmente, a especificidade de ligação e/ou a afinidade de ligação dos receptores de células T são semelhantes ou idênticas. Em uma modalidade preferida, um "receptor de células T que possui a especificidade de outro receptor de células T" refere-se a um receptor de células T que compreende, pelo menos nas regiões CDR, preferivelmente, pelo menos a região variável do outro receptor de células T. Em uma modalidade, os dois receptores de células T são essencialmente idênticas ou são idênticos.

[0201] Um ácido nucleico é, de acordo com a invenção, preferivelmente ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA), mais preferivelmente RNA, ainda mais preferivelmente RNA transcrito in vitro (IVT RNA). Os ácidos nucleicos incluem, de acordo com a invenção, DNA genômico, mRNA, cDNA, preparados de modo recombinante e moléculas quimicamente sintetizadas. Um ácido nucleico pode, de acordo com a invenção, estar na forma de uma molécula que é de fita única ou de fita dupla e linear ou é covalentemente fechada de modo a formar um círculo. Um ácido nucleico pode ser utilizado para a introdução, isto é, a transfecção de células, por exemplo, sob a forma de RNA que pode ser preparado por transcrição in vitro a partir de um molde de DNA. O RNA pode, além disso, ser modificado antes da aplicação através de sequências de estabilização, capping e poliadenilação.

[0202] Os ácidos nucleicos aqui descritos podem estar compreendidos em um vetor. O termo "vetor", tal como aqui utilizado, inclui quaisquer vetores conhecidos pelo técnico no assunto, incluindo vetores de plasmídeo, vetores de cosmídeo, vetores fágicos, tal como fago lambda, vetores virais, tais como vetores adenovirais ou baculovirais, ou vetores de cromossomos artificiais, tais como cromossomos artificiais bacterianos (BAC), cromossomas artificiais de leveduras (YAC) ou cromossomas artificiais de P1 (PAC). Os referidos vetores incluem vetores de expressão, bem como vetores de clonagem. Os vetores de expressão compreendem plasmídeos, bem como vetores virais e, geralmente, contêm uma sequência de codificação desejada e sequências de DNA adequadas necessárias para a expressão da sequência de codificação operativamente ligada em um organismo hospedeiro particular (por exemplo, bactérias, leveduras, plantas, insetos ou mamíferos) ou em sistemas de expressão in vitro. Vetores de clonagem são geralmente utilizados para modificar geneticamente e amplificar um determinado fragmento de DNA desejado e podem carecer de sequências funcionais necessárias para a expressão dos fragmentos de DNA desejados.

[0203] Como o vetor para a expressão de um receptor de células T, tanto um tipo de vetor em que as cadeias do receptor de células T estão presentes em vetores diferentes como um tipo de vetor em que as cadeias do receptor de células T estão presentes no mesmo vetor podem ser utilizados.

[0204] Naqueles casos da invenção em que uma molécula de MHC apresenta um antígeno ou um peptídeo de antígeno, um ácido nucleico também pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para a referida molécula de MHC. A sequência de ácidos nucleicos que codifica para a molécula de MHC pode estar presente na molécula de ácido nucleico como a mesma sequência de ácidos nucleicos que codifica para o antígeno ou peptídeo de antígeno, ou ambas as sequências de ácidos nucleicos podem estar presentes em diferentes moléculas de ácido nucleico. No último caso, as duas moléculas de ácido nucleico podem ser cotransfectadas para uma célula. Se uma célula hospedeira não expressa o antígeno ou o peptídeo de antígeno nem a molécula de MHC, ambas as sequências codificantes de ácidos nucleicos podem, portanto, ser transfectadas para a célula na mesma molécula de ácido nucleico ou em moléculas de ácido nucleico diferentes. Se a célula já expressa a molécula de MHC, apenas a sequência de ácidos nucleicos que codifica para o antígeno ou para o peptídeo de antígeno pode ser transfectada para a célula.

[0205] Conforme aqui utilizado, o termo "RNA" significa uma molécula que compreende pelo menos um resíduo de ribonucleotídeo. Por "ribonucleotídeo" entende-se um nucleotídeo com um grupo hidróxila na posição 2' de um grupo beta-D-ribo-furanose. O termo inclui RNA de fita dupla, RNA de fita única, RNA isolado, tal como RNA parcialmente purificado, RNA essencialmente puro, RNA sintético, RNA produzido de modo recombinante, bem como RNA alterado, que difere do RNA de ocorrência natural pela adição, substituição, deleção e/ou alteração de um ou mais nucleotídeos. Tais alterações podem incluir a adição de material não nucleotídico, tal como na(s) extremidade(s) de um RNA ou internamente, por exemplo, em um ou mais nucleotídeos do RNA. Os nucleotídeos em moléculas de RNA também podem compreender nucleotídeos não padronizados, tais como nucleotídeos que não sejam de ocorrência natural ou nucleotídeos sintetizados quimicamente ou desoxinucleotídeos. Estes RNAs alterados podem ser referidos como análogos ou análogos de ocorrência natural de RNA.

[0206] De acordo com a presente invenção, o termo "RNA" inclui e preferivelmente refere-se a "mRNA", que significa "RNA mensageiro", e refere-se a um "transcrito", que pode ser produzido utilizando-se DNA como molde e codifica um peptídeo ou proteína. O mRNA compreende, tipicamente, uma região 5' não traduzida, uma região de codificação de proteína ou peptídeo e uma região 3' não traduzida. O mRNA possui um intervalo limitado em células e in vitro. Preferivelmente, o mRNA é produzido por transcrição in vitro utilizando-se um molde de DNA. Em uma modalidade da invenção, o RNA que deve ser introduzido em uma célula é obtido por transcrição in vitro de um molde de DNA adequado.

[0207] No contexto da presente invenção, o termo "transcrição" refere-se a um processo em que o código genético de uma sequência de DNA é transcrito para RNA. Subsequentemente, o RNA pode ser traduzido em proteína. De acordo com a presente invenção, o termo "transcrição" compreende "transcrição in vitro", em que o termo "transcrição in vitro" refere-se a um processo em que o RNA, em particular, o mRNA, é sintetizado in vitro em um sistema isento de células, utilizando-se preferivelmente extratos celulares apropriados. Preferivelmente, vetores de clonagem são aplicados para a geração de transcritos. Estes vetores de clonagem são geralmente designados como vetores de transcrição e são, de acordo com a presente invenção, englobados pelo termo "vetor". De acordo com a presente invenção, o RNA pode ser obtido por transcrição in vitro de um molde de DNA adequado. O promotor para controle de transcrição pode ser qualquer promotor para qualquer RNA polimerase. Exemplos particulares de RNA polimerases são as RNA polimerases T7, T3 e SP6. Um molde de DNA para transcrição in vitro pode ser obtido por clonagem de um ácido nucleico, em particular, cDNA, e introdução do mesmo em um vetor apropriado para transcrição in vitro. O cDNA pode ser obtido por transcrição reversa do RNA. Vetores de clonagem são utilizados preferivelmente para a produção de transcritos que são geralmente vetores de transcrição designados.

[0208] O molde de vetor que contém cDNA pode compreender vetores que transportam diferentes insertos de cDNA que, após a transcrição, resultam em uma população de diferentes moléculas de RNA, opcionalmente capazes de expressar fatores diferentes, ou podem compreender vetores que transportam apenas uma espécie de inserto de cDNA que, após a transcrição, resultam apenas em uma população de uma espécie de RNA capaz de expressar apenas um fator. Desta forma, é possível produzir RNA capaz de expressar apenas um único fator ou produzir composições de RNAs diferentes.

[0209] Os ácidos nucleicos descritos de acordo com a invenção foram preferivelmente isolados. O termo "ácido nucleico isolado" significa, de acordo com a invenção, que o ácido nucleico foi (i) amplificado in vitro, por exemplo, por reação em cadeia da polimerase (PCR), (ii) produzido de modo recombinante por clonagem, (iii) purificado, por exemplo, por clivagem e fracionamento eletroforético em gel ou (iv) sintetizado, por exemplo, por síntese química. Um ácido nucleico isolado é um ácido nucleico que está disponível para manipulação através de técnicas de DNA recombinante.

[0210] Os ácidos nucleicos podem, de acordo com a invenção, estar presentes isoladamente ou em combinação com outros ácidos nucleicos, os quais podem ser homólogos ou heterólogos. Em modalidades preferidas, um ácido nucleico está funcionalmente ligado a sequências de controle de expressão que podem ser homólogas ou heterólogas em relação ao referido ácido nucleico. O termo "homólogo" significa que os ácidos nucleicos também estão funcionalmente ligados de forma natural e o termo "heterólogo" significa que os ácidos nucleicos não estão funcionalmente ligados de forma natural.

[0211] Um ácido nucleico e uma sequência de controle de expressão estão "funcionalmente" ligados um ao outro, se eles estão covalentemente ligados um ao outro de tal modo que a expressão ou a transcrição do referido ácido nucleico está sob o controle ou sob a influência da referida sequência de controle de expressão. Se o ácido nucleico deve ser traduzido para uma proteína funcional, então, com uma sequência de controle de expressão funcionalmente ligada a uma sequência de codificação, a indução da referida sequência de controle de expressão resulta na transcrição do referido ácido nucleico sem causar um deslocamento do quadro de leitura na sequência de codificação ou a referida sequência de codificação não é capaz de ser traduzida para a proteína ou para o peptídeo desejado.

[0212] O termo "sequência de controle de expressão" ou "elemento de controle de expressão" compreende, de acordo com a invenção, promotores, sítios de ligação dos ribossomos, acentuassomos (enhancers) e outros elementos de controle que regulam a transcrição de um gene ou a tradução de um mRNA. Em modalidades particulares da invenção, as sequências de controle da expressão podem ser reguladas. A estrutura exata das sequências de controle de expressão pode variar em função da espécie ou do tipo de célula, mas geralmente compreende as sequências 5' não transcritas e as sequências 5' e 3' não traduzidas que estão envolvidas no início da transcrição e da tradução, respectivamente, tais como TATA box, sequência de capping, sequência CAAT e semelhantes. Mais especificamente, sequências de controle de expressão 5' não transcritas compreendem uma região promotora que inclui uma sequência promotora para o controle da transcrição do ácido nucleico funcionalmente ligado. As sequências de controle de expressão também podem compreender sequências de acentuassomos ou sequências ativadoras à montante.

[0213] De acordo com a invenção, o termo "promotor" ou "região promotora" refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos que está localizada à montante (5') em relação à sequência de ácidos nucleicos sendo expressa e controla a expressão da sequência através do fornecimento de um reconhecimento e sítio de ligação para a RNA-polimerase. A "região promotora" pode incluir reconhecimento e sítios de ligação adicionais para outros fatores que estão envolvidos na regulação da transcrição de um gene. Um promotor pode controlar a transcrição de um gene procariótico ou eucariótico. Além disso, um promotor pode ser "induzível" e pode iniciar a transcrição em resposta a um agente indutor ou pode ser "constitutivo" se a transcrição não é controlada por um agente indutor. Um gene que está sob o controle de um promotor induzível não é expresso ou é apenas expresso em pequeno grau, se um agente indutor está ausente. Na presença do agente de indução, o gene é ligado ou o nível de transcrição é aumentado. Isto é mediado, em geral, pela ligação de um fator de transcrição específico.

[0214] Os promotores que são preferidos, de acordo com a invenção, incluem os promotores para SP6, T3 e T7 polimerase, promotor U6 de RNA humano, promotor de CMV e os promotores híbridos artificiais dos mesmos (por exemplo, CMV), onde uma parte ou partes são fundidas a uma parte ou partes de promotores de genes de outras proteínas celulares, tais como, por exemplo, GAPDH humana (gliceraldeído-3- fosfato-desidrogenase), e incluem ou não íntrons adicionais.

[0215] O termo "expressão" é aqui utilizado em seu sentido mais amplo e compreende a produção de RNA ou de RNA e proteína ou peptídeo. No que diz respeito ao RNA, o termo "expressão" ou "tradução" refere-se, em particular, à produção de peptídeos ou proteínas. A expressão pode ser transitória ou pode ser estável. De acordo com a invenção, o termo expressão também inclui uma "expressão anômala" ou "expressão anormal".

[0216] "Expressão anômala" ou "expressão anormal" significa, de acordo com a invenção, que a expressão é alterada, preferivelmente aumentada, em comparação com uma referência, por exemplo, um estado em um indivíduo que não possui uma doença associada à expressão anômala ou anormal de uma determinada proteína, por exemplo, um antígeno associado a tumor. Um aumento na expressão refere-se a um aumento de pelo menos 10%, em particular, de pelo menos 20%, pelo menos 50% ou pelo menos 100%, ou mais. Em uma modalidade, a expressão é encontrada apenas em um tecido doente, enquanto que a expressão em um tecido saudável é reprimida.

[0217] O termo "especificamente expressa" significa que a proteína é essencialmente expressa apenas em um tecido ou órgão específico. Por exemplo, um antígeno associado a tumor especificamente expresso na mucosa gástrica significa que a referida proteína é expressa principalmente na mucosa gástrica e não é expressa em outros tecidos ou não é expressa de forma significativa em outros tipos de tecidos ou órgãos. Assim, uma proteína que é exclusivamente expressa em células da mucosa gástrica e, em um grau significativamente menor, em qualquer outro tecido, tal como testículos, é especificamente expressa em células da mucosa gástrica. Em algumas modalidades, um antígeno associado a tumor também pode ser expresso especificamente sob condições normais em mais de um tipo de tecido ou órgão, tal como em 2 ou 3 tipos de tecidos ou órgãos, mas preferivelmente em não mais do que 3 tipos de tecidos ou órgãos diferentes. Neste caso, o antígeno associado a tumor é então especificamente expresso nestes órgãos. Por exemplo, se um antígeno associado a tumor é expresso sob condições normais, preferivelmente, em um grau aproximadamente igual nos pulmões e no estômago, o referido antígeno associado a tumor é especificamente expresso nos pulmões e no estômago.

[0218] O termo "tradução", de acordo com a invenção, refere-se ao processo nos ribossomos de uma célula, através do qual uma fita de RNA mensageiro dirige a montagem de uma sequência de aminoácidos para produzir uma proteína ou peptídeo.

[0219] De acordo com a invenção, o termo "ácido nucleico que codifica" significa que o ácido nucleico, se presente no ambiente adequado, preferivelmente dentro de uma célula, pode ser expresso para produzir uma proteína ou um peptídeo que ele codifica.

[0220] De acordo com a invenção, a estabilidade e a eficiência de tradução do RNA introduzido em uma célula podem ser modificadas conforme necessário. Por exemplo, o RNA pode ser estabilizado e a sua tradução aumentada por uma ou mais modificações que possuem efeitos de estabilização e/ou eficiência de tradução de RNA aumentada. Tais modificações são descritas, por exemplo, no pedido internacional PCT/EP2006/009448, aqui incorporado como referência.

[0221] Por exemplo, o RNA que possui uma sequência poli-A não mascarada é traduzido de forma mais eficiente do que o RNA que possui uma sequência poli-A mascarada. O termo "sequência poli-A" ou "poli-A+" refere-se a uma sequência de resíduos de adenila (A) que tipicamente está localizada na extremidade 3' de uma molécula de RNA e "sequência poli-A não mascarada" significa que a sequência poli-A na extremidade 3' de uma molécula de RNA termina com uma A da sequência poli-A e não é seguida pelos nucleotídeos que não sejam A localizados na extremidade 3', isto é, à jusante da sequência poli-A. Além disso, uma longa sequência poli-A de cerca de 120 pares de bases resulta em uma estabilidade de transcrição e eficiência de tradução de RNA ótimas.

[0222] Portanto, a fim de aumentar a estabilidade e/ou a expressão do RNA utilizado, de acordo com a presente invenção, ele pode ser modificado de modo a estar presente em conjunto com uma sequência poli-A, preferivelmente com um comprimento de 10 a 500, mais preferivelmente de 30 a 300, ainda mais preferivelmente de 65 a 200 e, especialmente, de 100 a 150 resíduos de adenosina. Em uma modalidade especialmente preferida, a sequência poli-A possui um comprimento de cerca de 120 resíduos de adenosina. Para aumentar adicionalmente a estabilidade e/ou a expressão do RNA utilizado de acordo com a invenção, a sequência poli-A pode ser não mascarada.

[0223] Além disso, a incorporação de uma região 3' não traduzida (UTR) na 3 região 3' não traduzida de uma molécula de RNA pode resultar em um aumento na eficiência da tradução. Um efeito sinérgico pode ser obtido através da incorporação de duas ou mais de tais regiões 3' não traduzidas. As regiões 3' não traduzidas podem ser autólogas ou heterólogas em relação ao RNA em que elas são introduzidas. Em uma modalidade particular, a região 3' não traduzida é derivada a partir do gene de β-globina humana.

[0224] Uma combinação das modificações descritas acima, isto é, a incorporação de uma sequência poli-A, o não mascaramento de uma sequência poli-A e a incorporação de uma ou mais regiões 3' não traduzidas, possui uma influência sinérgica sobre a estabilidade do RNA e sobre o aumento da eficiência de tradução.

[0225] De modo a aumentar a expressão do RNA utilizado de acordo com a presente invenção, este pode ser modificado dentro da região de codificação, isto é, a sequência que codifica o fator expresso, preferivelmente sem alterar a sequência do fator expresso, de modo a aumentar o teor de GC e, assim, aumentar a tradução nas células.

[0226] Em modalidades adicionais da invenção, o RNA que é introduzido em uma célula possui, em sua extremidade 5', uma estrutura Cap ou uma sequência reguladora que promove a tradução na célula hospedeira. Preferivelmente, o RNA é protegido em sua extremidade 5' por uma 7-metilguanosina opcionalmente modificada, ligada por uma ponte 5'-5' ao primeiro nucleotídeo transcrito da cadeia de mRNA. Preferivelmente, a extremidade 5' do RNA inclui uma estrutura Cap que possui a seguinte fórmula geral:

[0227] em que R1 e R2 são, independentemente, hidróxi ou metóxi e W-, X- e Y- são, independentemente, oxigênio ou enxofre. Em uma modalidade preferida, R1 e R2 são hidróxi e W-, X- e Y- são oxigênio. Em uma modalidade preferida adicional, um de R1 e R2, preferivelmente R1, é hidróxi e o outro é metóxi, e W-, X- e Y- são oxigênio. Em uma modalidade preferida adicional, R1 e R2 são hidróxi e um de W-, X- e Y-, preferivelmente X-, é enxofre, enquanto os outros são oxigênio. Em uma modalidade preferida adicional, um de R1 e R2, preferivelmente R2, é hidróxi e o outro é metóxi e um de W-, X- e Y-, preferivelmente X-, é enxofre, enquanto os outros são oxigênio. Em todas as modalidades descritas acima, em particular, naquelas modalidades em que X- é definido como enxofre, X- pode ser alternativamente boro ou selênio.

[0228] Na fórmula acima, o nucleotídeo no lado direito está ligado à cadeia de RNA através do seu grupo 3'.

[0229] Essas estruturas Cap, em que pelo menos um de W-, X- e Y- é enxofre, isto é, o qual possui uma porção de fosforotioato, existem em formas diastereoisoméricas diferentes, todas as quais estão abrangidas aqui. Além disso, a presente invenção abrange todos os tautômeros e estereoisômeros da fórmula acima.

[0230] É evidente que, se de acordo com a presente invenção é desejável reduzir a estabilidade e/ou a eficiência da tradução de RNA, é possível modificar o RNA de modo a interferir com a função de elementos, conforme descrito acima, aumentando a estabilidade e/ou a eficiência da tradução de RNA.

[0231] De acordo com a presente invenção, qualquer técnica útil para a introdução, isto é, transferência ou transfecção, de ácidos nucleicos em células pode ser utilizada. Preferivelmente, o RNA é transfectado para as células através técnicas convencionais. Tais técnicas incluem eletroporação, lipofecção e microinjeção. Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, o RNA é introduzido nas células por eletroporação.

[0232] Eletroporação ou eletropermeabilização referem-se a um aumento significativo na condutividade elétrica e na permeabilidade da membrana plasmática da célula causadas por um campo elétrico aplicado externamente. É normalmente utilizado em biologia molecular como uma forma de introduzir alguma substância em uma célula.

[0233] A eletroporação geralmente é realizada com eletroporadores, aparelhos que criam um campo eletromagnético na solução celular. A suspensão de células é pipetada em uma cubeta de plástico ou de vidro que possui dois eletrodos de alumínio em suas laterais. Para a eletroporação, tipicamente, uma suspensão de células de cerca de 50 microlitros é utilizada. Antes da eletroporação, ela é misturada com o ácido nucleico a ser transfectado. A mistura é pipetada para a cubeta, a voltagem e a capacitância são definidas e a cubeta é inserida no eletroporador. Preferivelmente, o meio líquido é adicionado imediatamente após a eletroporação (na cubeta ou em um tubo eppendorf) e o tubo é incubado à temperatura ótima das células durante uma hora ou mais para permitir a recuperação das células e, opcionalmente, a expressão de resistência a antibióticos.

[0234] De acordo com a invenção, é preferido que a introdução de ácido nucleico que codifica uma proteína ou peptídeo em células resulte na expressão da referida proteína ou peptídeo.

[0235] O termo "peptídeo" compreende oligo e polipeptídeos e refere-se a substâncias que compreendem dois ou mais, preferivelmente 3 ou mais, preferivelmente 4 ou mais, preferivelmente 6 ou mais, preferivelmente 8 ou mais, preferivelmente 9 ou mais, preferivelmente 10 ou mais, preferivelmente 13 ou mais, preferivelmente 16 ou mais, preferivelmente 21 ou mais e preferivelmente até 8, 10, 20, 30, 40 ou 50, em particular, 100 aminoácidos ligados covalentemente por ligações peptídicas. O termo "proteína" refere-se a grandes peptídeos, preferivelmente aos peptídeos com mais de 100 resíduos de aminoácidos, mas em geral, os termos "peptídeos" e "proteínas" são sinônimos e são aqui utilizados indiferentemente.

[0236] Preferivelmente, as proteínas e peptídeos descritos de acordo com a invenção foram isolados. Os termos "proteína isolada" ou "peptídeo isolado" significam que a proteína ou o peptídeo foi separado(a) de seu ambiente natural. Uma proteína ou peptídeo isolado(a) pode estar em um estado essencialmente purificado(a). O termo "essencialmente purificado(a)" significa que a proteína ou o peptídeo é essencialmente isento(a) de outras substâncias com as quais estão associados(as) na natureza ou in vivo.

[0237] O ensinamento aqui fornecido com respeito às sequências de aminoácidos específicas, por exemplo, aquelas mostradas na listagem de sequências, deve ser interpretado de forma a também se relacionar com as modificações, isto é, variantes das referidas sequências específicas que resultam em sequências que sejam funcionalmente equivalentes às referidas sequências específicas, por exemplo, sequências de aminoácidos com propriedades idênticas ou similares às das sequências de aminoácidos específicas. Uma propriedade importante é a de reter a ligação de um peptídeo a uma molécula do MHC e/ou a um receptor de células T ou de um receptor de células T ao seu alvo ou sustentar as funções efetoras de uma célula T. Preferivelmente, uma sequência modificada em relação a uma sequência específica, quando substitui a sequência específica de um receptor de células T, retém a ligação do referido receptor de células T ao alvo e, preferivelmente, funções do referido receptor de células T ou célula T que transporta o receptor de células T, conforme aqui descrito.

[0238] Será observado pelos técnicos no assunto que, em particular, as sequências das sequências de CDR, regiões hipervariáveis e variáveis, podem ser modificadas sem perda da capacidade de ligação a um alvo. Por exemplo, as sequências de CDR serão idênticas ou altamente homólogas às sequências de CDR aqui especificadas.

[0239] Uma "variante" de peptídeo pode reter a imunogenicidade de um dado peptídeo (por exemplo, a capacidade da variante de reagir com linhagens de células T ou clones não é substancialmente reduzida em relação ao dado peptídeo). Em outras palavras, a capacidade de uma variante de reagir com linhagens de células T ou clones pode ser melhorada ou inalterada, em relação ao dado peptídeo, ou pode ser diminuída para menos de 50% e, preferivelmente, menos de 20% em relação ao dado peptídeo.

[0240] Uma variante pode ser identificada pela avaliação da sua capacidade de ligação a uma molécula de MHC. Em uma modalidade preferida, um peptídeo variante possui uma modificação, tal que a capacidade do peptídeo variante para se ligar a uma molécula de MHC é elevada em relação ao dado peptídeo. A capacidade do peptídeo variante para se ligar a uma molécula de MHC pode ser aumentada em pelo menos 2 vezes, preferivelmente pelo menos 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes em relação ao dado peptídeo. Deste modo, dentro de certas modalidades preferidas, um peptídeo compreende uma variante em que de 1 a 3 aminoácidos que residem dentro de uma porção imunogênica são substituídos, de tal forma que a capacidade de reagir com as linhagens de células T ou clones é estatisticamente maior do que para o peptídeo não modificado. Tais substituições são preferivelmente localizadas dentro de um sítio de ligação ao MHC do peptídeo. As substituições preferidas permitem o aumento da ligação de moléculas de MHC de classe I ou de classe II. Certas variantes contêm substituições conservativas.

[0241] Por "altamente homólogo", considera-se que de 1 a 5, preferivelmente de 1 a 4, tal como de 1 a 3 ou de 1 ou 2 substituições podem ser realizadas.

[0242] O termo "variante", de acordo com a invenção, também inclui mutantes, variantes de splicing, conformações, isoformas, variantes alélicas, variantes de espécies e homólogos de espécies, em particular, aquelas que estão naturalmente presentes. Uma variante alélica refere-se a uma alteração na sequência normal de um gene, a significância da mesma sendo frequentemente incerta. O sequenciamento completo de um gene frequentemente identifica inúmeras variantes alélicas de um determinado gene. Um homólogo de espécie é um ácido nucleico ou sequência de aminoácidos com uma espécie de origem diferente daquela de um dado ácido nucleico ou sequência de aminoácidos.

[0243] Para os fins da presente invenção, "variantes" de uma sequência de aminoácidos compreendem variantes de inserção de aminoácidos, variantes de adição de aminoácidos, variantes de deleção de aminoácidos e/ou variantes de substituição de aminoácidos. Variantes de deleção de aminoácidos que compreendem a deleção na extremidade N-terminal e/ou C-terminal da proteína também são chamadas de variantes de truncamento de N-terminal e/ou de C-terminal.

[0244] Variantes de inserção de aminoácidos compreendem inserções de um ou dois ou mais aminoácidos em uma sequência particular de aminoácidos. No caso de variantes de sequência de aminoácidos que possuem uma inserção, um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos em um sítio particular de uma sequência de aminoácidos, embora a inserção aleatória com rastreio apropriado do produto resultante também seja possível.

[0245] Variantes de adição de aminoácidos compreendem fusões amino- e/ou carbóxi-terminais de um ou mais aminoácidos, tal como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos.

[0246] Variantes de deleção de aminoácidos são caracterizadas pela remoção de um ou mais aminoácidos da sequência, tal como pela remoção de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos. As deleções podem ser em qualquer posição da proteína.

[0247] Variantes de substituição de aminoácidos são caracterizadas por pelo menos um resíduo na sequência que é removido e outro resíduo que é inserido em seu lugar. É dada preferência às modificações que ocorrem em posições na sequência de aminoácidos, as quais não são conservadas entre proteínas ou peptídeos homólogos, e/ou à substituição de aminoácidos por outros que possuem propriedades semelhantes. Preferivelmente, as alterações de aminoácidos em variantes de proteína são alterações conservadoras de aminoácidos, isto é, substituições de aminoácidos similarmente carregados ou descarregados. Uma mudança conservadora de aminoácidos envolve a substituição de um de uma família de aminoácidos que estão relacionados em suas cadeias laterais. Os aminoácidos de ocorrência natural são geralmente divididos em quatro famílias: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), não- polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) e polares descarregados (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). Fenilalanina, triptofano e tirosina são, às vezes, classificados em conjunto como aminoácidos aromáticos.

[0248] Preferivelmente, o grau de similaridade, preferivelmente, a identidade entre uma dada sequência de aminoácidos e uma sequência de aminoácidos que é uma variante da referida dada sequência de aminoácidos é pelo menos de cerca de 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. O grau de similaridade ou de identidade é dado preferivelmente para uma região de aminoácidos que é pelo menos de cerca de 10%, pelo menos de cerca de 20%, pelo menos de cerca de 30%, pelo menos de cerca de 40%, pelo menos de cerca de 50%, pelo menos de cerca de 60%, pelo menos de cerca de 70%, pelo menos de cerca de 80%, pelo menos de cerca de 90% ou de cerca de 100% do comprimento total da sequência de aminoácidos de referência. Por exemplo, se a sequência de aminoácidos de referência é constituída por 200 aminoácidos, o grau de similaridade ou de identidade é dado preferivelmente para pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 120, pelo menos cerca de 140, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de 180 ou cerca de 200 aminoácidos, preferivelmente aminoácidos contínuos. Em modalidades preferidas, o grau de similaridade ou de identidade é determinado por todo o comprimento da sequência de aminoácidos de referência. O alinhamento para determinar a similaridade de sequência, preferivelmente a identidade de sequência, pode ser realizado com as ferramentas conhecidas na técnica, utilizando-se preferivelmente o melhor alinhamento de sequência, por exemplo, utilizando-se Align, utilizando-se as configurações padrão, preferivelmente, EMBOSS::needle, Matriz: BLOSUM62, Abertura de Gap 10.0, Extensão de Gap 0.5.

[0249] A "similaridade de sequência" indica a porcentagem de aminoácidos que são idênticos ou que representam substituições conservadoras de aminoácidos. A "identidade de sequência" entre duas sequências de aminoácidos indica a porcentagem de aminoácidos ou nucleotídeos que são idênticos entre as sequências.

[0250] O termo "identidade percentual" é destinado a denotar uma porcentagem de resíduos de aminoácidos que são idênticos entre as duas sequências a serem comparadas, obtida após o melhor alinhamento, sendo esta porcentagem puramente estatística e as diferenças entre as duas sequências sendo distribuídas aleatoriamente e ao longo de todo o seu comprimento. As comparações de sequências entre duas sequências de aminoácidos são convencionalmente realizadas por comparação destas sequências após o alinhamento das mesmas de modo otimizado, a referida comparação sendo efetuada pelo segmento ou pela "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. O alinhamento ótimo das sequências para comparação pode ser produzido, além de manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por meio do método de busca de similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444, ou por meio de programas de computador que utilizam estes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

[0251] A identidade percentual é calculada através da determinação do número de posições idênticas entre as duas sequências comparadas, divisão deste número pelo número de posições comparadas e multiplicação do resultado obtido por 100, de modo a obter a porcentagem de identidade entre estas duas sequências.

[0252] As sequências homólogas de aminoácidos apresentam, de acordo com a invenção, pelo menos 40%, em particular, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e, preferivelmente, pelo menos 95%, pelo menos 98 ou pelo menos 99% de identidade dos resíduos de aminoácidos.

[0253] As variantes de sequências de aminoácidos aqui descritas podem ser facilmente preparadas pelo técnico no assunto, por exemplo, por manipulação do DNA recombinante. A manipulação de sequências de DNA para a preparação de proteínas e peptídeos que possuem substituições, adições, inserções ou deleções, é descrita em detalhes em Sambrook e cols. (1989), por exemplo. Além disso, os peptídeos e os variantes de aminoácidos aqui descritos podem ser facilmente preparados com o auxílio de técnicas conhecidas de síntese de peptídeos, tais como, por exemplo, por síntese em fase sólida e métodos semelhantes.

[0254] A invenção inclui derivados dos peptídeos ou proteínas aqui descritos, que são compreendidos pelos termos "peptídeo" e "proteína". De acordo com a invenção, "derivados" de proteínas e peptídeos são formas modificadas de proteínas e peptídeos. Tais modificações incluem qualquer modificação química e compreendem substituições simples ou múltiplas, deleções e/ou adições de qualquer molécula associada com a proteína ou com o peptídeo, tais como carboidratos, lipídios e/ou proteínas ou peptídeos. Em uma modalidade, "derivados" de proteínas ou peptídeos incluem aqueles análogos modificados resultantes de glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, palmitoilação, miristoilação, isoprenilação, lipidação, alquilação, derivatização, introdução de grupos bloqueadores/protetores, clivagem proteolítica ou ligação a um anticorpo ou a outro ligante celular. O termo "derivado" também se estende a todos os equivalentes químicos funcionais das referidas proteínas e peptídeos. Preferivelmente, um peptídeo modificado possui estabilidade aumentada e/ou imunogenicidade aumentada.

[0255] Miméticos de peptídeos também estão incluídos. Tais miméticos podem compreender aminoácidos ligados a um ou mais miméticos de aminoácidos (isto é, um ou mais aminoácidos dentro do peptídeo podem ser substituídos por um aminoácido mimético) ou podem ser totalmente miméticos não peptídicos. Um aminoácido mimético é um composto que é conformacionalmente semelhante a um aminoácido, por exemplo, de tal forma que possa ser substituído por um aminoácido sem diminuir substancialmente a capacidade de reação com as linhagens de células T ou clones. Um mimético não peptídico é um composto que não contém aminoácidos e que possui uma conformação global que é semelhante a um peptídeo, por exemplo, de tal modo que a capacidade de reação do mimético com linhagens de células T ou clones não é substancialmente diminuída em relação à capacidade de um dado peptídeo.

[0256] De acordo com a invenção, uma variante, derivado, forma modificada, fragmento, parte ou porção de uma sequência de aminoácidos, peptídeo ou proteína, possui preferivelmente uma propriedade funcional da sequência de aminoácidos, peptídeo ou proteína, respectivamente, a partir da qual foi derivada, isto é, é funcionalmente equivalente. Em uma modalidade, uma variante, derivado, forma modificada, fragmento, parte ou porção de uma sequência de aminoácidos, peptídeo ou proteína é imunologicamente equivalente à sequência de aminoácidos, peptídeo ou proteína, respectivamente, a partir da qual foi derivada. Em uma modalidade, a propriedade funcional é uma propriedade imunológica.

[0257] Uma propriedade particular é a capacidade de formar um complexo com moléculas de MHC e, onde apropriado, gerar uma resposta imune, preferivelmente através do estímulo de células T auxiliares ou citotóxicas.

[0258] O termo "derivado" significa, de acordo com a invenção, que uma entidade particular, em particular, uma sequência particular, está presente no objeto a partir do qual é derivada, em particular, um organismo ou uma molécula. No caso de sequências de aminoácidos, especialmente regiões de sequências em particular, "derivado" significa, em particular, que a sequência de aminoácidos relevante é derivada de uma sequência de aminoácidos na qual está presente.

[0259] O termo "célula" ou "célula hospedeira" é preferivelmente uma célula intacta, isto é, uma célula com uma membrana intacta que não liberou os seus componentes intracelulares normais, tais como enzimas, organelas ou material genético. Uma célula intacta é preferivelmente uma célula viável, isto é, uma célula viva capaz de realizar as suas funções metabólicas normais. Preferivelmente, o referido termo se refere, de acordo com a invenção, a qualquer célula que pode ser transformada ou transfectada com um ácido nucleico exógeno. O termo "célula" inclui, de acordo com a invenção, células procarióticas (por exemplo, E. coli) ou células eucarióticas (por exemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células HEK293, células HELA, células de leveduras e células de insetos). O ácido nucleico exógeno pode ser encontrado no interior da célula (i) livremente disperso como tal, (ii) incorporado em um vetor recombinante ou (iii) integrado no genoma da célula hospedeira ou no DNA mitocondrial. As células de mamíferos são particularmente preferidas, tais como as células de humanos, camundongos, hamsters, porcos, cabras e primatas. As células podem ser derivadas a partir de um grande número de tipos de tecidos e incluem células primárias e linhagens de células. Exemplos específicos incluem queratinócitos, leucócitos do sangue periférico, células tronco da medula óssea e células tronco embrionárias. Em outras modalidades, a célula é uma célula apresentadora de antígeno, em particular, uma célula dendrítica, um monócito ou macrófago.

[0260] Uma célula que compreende uma molécula de ácido nucleico expressa preferivelmente o peptídeo ou a proteína codificada pelo ácido nucleico.

[0261] A célula pode ser uma célula recombinante e pode secretar o peptídeo ou a proteína codificada, pode expressar o(a) mesmo(a) sobre a superfície e preferivelmente pode, adicionalmente, expressar uma molécula de MHC que se liga ao referido peptídeo ou proteína ou a um produto de processamento dos mesmos. Em uma modalidade, a célula expressa a molécula de MHC de forma endógena. Em uma outra modalidade, a célula expressa a molécula de MHC e/ou o peptídeo ou proteína ou o produto de processamento dos mesmos de uma forma recombinante. A célula é preferivelmente não proliferativa. Em uma modalidade preferida, a célula é uma célula apresentadora de antígeno, em particular, uma célula dendrítica, um monócito ou um macrófago.

[0262] O termo "expansão clonal" refere-se a um processo no qual uma entidade específica é multiplicada. No contexto da presente invenção, o termo é preferivelmente utilizado no contexto de uma resposta imunológica em que os linfócitos são estimulados por um antígeno, se proliferam e o linfócito específico que reconhece o referido antígeno é amplificado. Preferivelmente, a expansão clonal conduz à diferenciação dos linfócitos.

[0263] A doença associada com a expressão de antígenos pode ser detectada com base na presença de células T que reagem especificamente com um peptídeo em uma amostra biológica. Dentro de determinados métodos, uma amostra biológica que compreende células T CD4+ e/ou CD8+ isoladas de um paciente é incubada com um peptídeo da invenção, um ácido nucleico que codifica tal peptídeo e/ou uma célula apresentadora de antígeno que expressa e/ou apresenta pelo menos uma porção imunogênica de um tal peptídeo, e a presença ou ausência de ativação específica das células T é detectada. Amostras biológicas adequadas incluem, mas não estão limitadas a células T isoladas. Por exemplo, as células T podem ser isoladas de um paciente por meio de técnicas de rotina (tal como por centrifugação de linfócitos do sangue periférico em gradiente de densidade de Ficoll/Hypaque). Para células T CD4+, a ativação é preferivelmente detectada por meio da avaliação da proliferação das células T. Para células T CD8+, a ativação é preferivelmente detectada por meio da avaliação da atividade citolítica. Um nível de proliferação que é pelo menos duas vezes maior e/ou um nível de atividade citolítica que é pelo menos 20% maior do que em indivíduos sem doença indica a presença de uma doença associada à expressão de antígenos no indivíduo.

[0264] "Reduzir" ou "inibir", tal como aqui utilizado, significa a capacidade de provocar uma diminuição global no nível de preferivelmente 5% ou superior, 10% ou superior, 20% ou superior, mais preferivelmente de 50% ou superior e mais preferivelmente de 75% ou superior. O termo "inibir" ou expressões semelhantes inclui uma inibição completa ou essencialmente completa, isto é, uma redução a zero ou essencialmente a zero.

[0265] Termos tais como "aumentar" ou "melhorar" referem-se, preferivelmente, a um aumento ou melhoria de cerca de pelo menos 10%, preferivelmente de pelo menos 20%, preferivelmente de pelo menos 30%, mais preferivelmente de pelo menos 40%, mais preferivelmente de pelo menos 50%, ainda mais preferivelmente de pelo menos 80%, e mais preferivelmente de pelo menos 100%.

[0266] Os agentes, composições e métodos aqui descritos podem ser utilizados para tratar um indivíduo com uma doença, por exemplo, uma doença caracterizada pela presença de células doentes que expressam um antígeno e que apresentam um peptídeo de antígeno. Exemplos de doenças que podem ser tratadas e/ou prevenidas englobam todas as doenças que expressam um dos antígenos aqui descritos. Doenças particularmente preferidas são as doenças virais, tais como infecção por hCMV e doenças malignas.

[0267] Os agentes, composições e métodos aqui descritos também podem ser utilizados para a imunização ou vacinação para prevenir uma doença aqui descrita.

[0268] De acordo com a invenção, o termo "doença" refere-se a qualquer estado patológico, incluindo infecções virais e doenças malignas, em particular, aquelas formas de infecções virais e doenças malignas aqui descritas.

[0269] Os termos "tecido normal" ou "condições normais" referem-se ao tecido saudável ou às condições em um indivíduo saudável, isto é, condições não patológicas, em que "saudável" significa, preferivelmente, não infectado por vírus ou não cancerígeno.

[0270] "Doença envolvendo células que expressam um antígeno" significa, de acordo com a invenção, que a expressão do antígeno em células de um tecido ou órgão doente é, preferivelmente, aumentada em comparação com o estado de um tecido ou órgão saudável. Um aumento se refere a um aumento de pelo menos 10%, de pelo menos 20%, em particular, de pelo menos 50%, de pelo menos 100%, de pelo menos 200%, de pelo menos 500%, de pelo menos 1.000%, de pelo menos 10.000% ou ainda mais. Em uma modalidade, a expressão é encontrada apenas em um tecido doente, enquanto que a expressão em um tecido saudável é reprimida. De acordo com a invenção, as doenças que envolvem ou estão associadas a células que expressam um antígeno incluem infecções virais e doenças malignas, em particular, aquelas formas de infecções virais e doenças malignas aqui descritas.

[0271] A malignidade é a tendência de uma condição médica, especialmente tumores, de se tornar progressivamente pior e de resultar, potencialmente, em morte. Ela é caracterizada pelas propriedades de anaplasia, capacidade invasiva e metástase. Maligno é um termo médico adjetivo correspondente utilizado para descrever uma doença grave e de piora progressiva. O termo "doença maligna", tal como aqui utilizado, refere-se preferivelmente ao câncer ou a uma doença tumoral. De forma similar, o termo "células malignas", conforme aqui utilizado, refere-se preferivelmente a células cancerígenas ou a células tumorais. Um tumor maligno pode ser contrastado com um tumor benigno não cancerígeno pelo fato de que uma malignidade não é auto-limitada em seu crescimento, é capaz de invadir tecidos adjacentes e pode ser capaz de espalhar-se para tecidos distantes (sofrer metástases), enquanto que um tumor benigno não possui nenhuma destas propriedades. Tumor maligno é essencialmente sinônimo de câncer. Malignidade, neoplasia maligna e tumor maligno são essencialmente sinônimos de câncer.

[0272] De acordo com a invenção, o termo "doença tumoral" ou "tumor" refere-se a um inchaço ou lesão formado por um crescimento anormal de células (chamadas células neoplásicas ou células tumorais). "Célula tumoral" significa uma célula anormal que cresce através de uma proliferação celular rápida e descontrolada e continua crescendo após o término dos estímulos que iniciaram o novo crescimento. Os tumores apresentam ausência parcial ou completa de organização estrutural e coordenação funcional com o tecido normal e, normalmente, formam uma massa distinta de tecido, que pode ser benigna, pré-maligna ou maligna.

[0273] Um tumor benigno é um tumor que não possui todas as três propriedades malignas de um câncer. Assim, por definição, um tumor benigno não cresce de uma forma ilimitada e agressiva, não invade tecidos vizinhos e não se espalha para tecidos não adjacentes (sofre metástase). Exemplos comuns de tumores benignos incluem molas e fibroses uterinas.

[0274] O termo "benigno" implica uma doença leve e não progressiva e, de fato, muitos tipos de tumores benignos são inofensivos à saúde. No entanto, algumas neoplasias que são definidas como "tumores benignos", uma vez que não possuem as propriedades invasivas de um câncer, ainda podem produzir efeitos negativos na saúde. Exemplos disso incluem tumores que produzem um "efeito de massa" (compressão de órgãos vitais, tais como vasos sanguíneos) ou tumores "funcionais" de tecidos endócrinos, que podem produzir certos hormônios demasiadamente (exemplos incluem adenomas de tiroide, adenomas adrenocorticais e adenomas de hipófise).

[0275] Os tumores benignos são geralmente circundados por uma superfície externa que inibe a sua capacidade de se comportar de forma maligna. Em alguns casos, certos tumores "benignos" podem, mais tarde, dar origem a cânceres malignos, que resultam de alterações genéticas adicionais em uma subpopulação das células neoplásicas do tumor. Um exemplo proeminente deste fenômeno é o adenoma tubular, um tipo comum de pólipo de cólon, que é um precursor importante para o câncer de cólon. As células de adenomas tubulares, como a maioria dos tumores que frequentemente evoluem para câncer, mostram determinadas anomalias de maturação celular e uma aparência coletivamente conhecida como displasia. Essas anomalias celulares não são vistas em tumores benignos que raramente ou nunca se tornam cancerígenos, mas são vistas em outras anomalias de tecidos pré-cancerígenos que não formam massas discretas, tais como lesões pré-cancerígenas do colo do útero. Algumas autoridades preferem se referir a tumores displásicos como "pré-malignos" e reservam o termo "benigno" para os tumores que nunca ou raramente dão origem a um câncer.

[0276] Neoplasia é uma massa anormal de tecido resultante de neoplasia. Neoplasia (novo crescimento, em grego) é a proliferação anormal de células. O crescimento das células excede e é descoordenado com o crescimento dos tecidos normais em torno deste. O crescimento persiste do mesmo modo excessivo, mesmo após o término dos estímulos. Ele geralmente causa um nódulo ou tumor. As neoplasias podem ser benignas, pré-malignas ou malignas.

[0277] "Crescimento de um tumor" ou "crescimento de tumor", de acordo com a invenção, refere-se à tendência de um tumor de aumentar o seu tamanho e/ou à tendência de proliferação de células tumorais.

[0278] Preferivelmente, uma "doença maligna", de acordo com a invenção, é uma doença cancerígena ou doença tumoral, e uma célula maligna é uma célula cancerígena ou célula tumoral. Preferivelmente, uma "doença maligna" é caracterizada por células que expressam um antígeno associado a tumor, tais como NY-ESO-1, TPTE ou PLAC1.

[0279] O câncer (termo médico: neoplasia maligna) é uma classe de doenças em que um grupo de células apresenta crescimento descontrolado (divisão além dos limites normais), invasão (intrusão em e destruição de tecidos adjacentes) e, às vezes, metástase (disseminação para outros locais do corpo através da linfa ou do sangue). Estas três propriedades malignas de cânceres diferenciam os mesmos dos tumores benignos, que são auto-limitados e não invadem ou sofrem metástase. A maioria dos cânceres forma um tumor, mas alguns, como a leucemia, não o fazem.

[0280] Os cânceres são classificados pelo tipo de célula que se assemelha ao tumor e, portanto, o tecido que se presume ser a origem do tumor. Estes são a histologia e a localização, respectivamente.

[0281] O termo "câncer", de acordo com a invenção, compreende leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, câncer retal, câncer de endométrio, câncer renal, câncer de adrenal, câncer de tireoide, câncer do sangue, câncer de pele, câncer cerebral, câncer cervical, câncer intestinal, câncer de fígado, câncer de cólon, câncer de estômago, câncer de intestino, câncer de cabeça e pescoço, câncer gastrointestinal, câncer de linfonodos, câncer de esôfago, câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer de ouvido, nariz e garganta (ENT), câncer de mama, câncer de próstata, câncer de útero, câncer de ovário e câncer de pulmão, e as metástases dos mesmos. Exemplos destes são os carcinomas pulmonares, carcinomas de mama, carcinomas da próstata, carcinomas do cólon, carcinomas das células renais, carcinomas cervicais ou metástases dos tipos de câncer ou tumores descritos acima. O termo câncer, de acordo com a invenção, também compreende as metástases cancerígenas.

[0282] Os principais tipos de câncer de pulmão são o carcinoma pulmonar de células pequenas (SCLC) e o carcinoma pulmonar de células não pequenas (NSCLC). Há três principais subtipos de carcinomas pulmonares de células não pequenas: carcinoma pulmonar de células escamosas, adenocarcinoma e carcinoma pulmonar de células grandes. Os adenocarcinomas representam cerca de 10% dos cânceres de pulmão. Este câncer geralmente é visto perifericamente nos pulmões, ao contrário do câncer pulmonar de células pequenas e do câncer pulmonar de células escamosas, ambos tendendo a estar localizados mais centralmente.

[0283] O câncer de pele é um crescimento maligno sobre a pele. Os cânceres de pele mais comuns são câncer de célula basal, câncer de célula escamosa e melanoma. O melanoma maligno é um tipo grave de câncer de pele. Ele ocorre devido ao crescimento descontrolado de células de pigmento, chamadas melanócitos.

[0284] De acordo com a invenção, um "carcinoma" é um tumor maligno derivado de células epiteliais. Este grupo representa os cânceres mais comuns, incluindo as formas mais comuns de câncer de mama, próstata, pulmão e cólon.

[0285] O "carcinoma bronquiolar" é um carcinoma do pulmão, que se acredita ser derivado do epitélio de bronquíolos terminais, nos quais o tecido neoplásico se estende ao longo das paredes alveolares e cresce em pequenas massas dentro dos alvéolos. Mucina pode ser demonstrada em algumas das células e no material nos alvéolos, o que também inclui as células desnudas.

[0286] "Adenocarcinoma" é um câncer que se origina no tecido glandular. Este tecido é também parte de uma categoria maior de tecido conhecido como tecido epitelial. O tecido epitelial inclui a pele, glândulas e uma variedade de outros tecidos que revestem as cavidades e órgãos do corpo. O epitélio é embriologicamente derivado do ectoderma endoderma e mesoderma. Para ser classificado como adenocarcinoma, as células não necessariamente precisam ser parte de uma glândula, contanto que eles possuam propriedades secretoras. Esta forma de carcinoma pode ocorrer em alguns mamíferos superiores, incluindo humanos. Os adenocarcinomas bem diferenciados tendem a assemelhar-se ao tecido glandular de que são derivados, enquanto os pouco diferenciados não. Através da coloração das células de uma biópsia, um patologista irá determinar se o tumor é um adenocarcinoma ou algum outro tipo de câncer. Os adenocarcinomas podem surgir em muitos tecidos do corpo, devido à natureza ubíqua das glândulas dentro do corpo. Embora cada glândula possa não estar secretando a mesma substância, enquanto existe uma função exócrina para a célula, ela é considerada glandular e a sua forma maligna é, portanto, chamada de adenocarcinoma. Os adenocarcinomas malignos invadem outros tecidos e geralmente realizam metástase, caso haja tempo suficiente para isso. O adenocarcinoma de ovário é o tipo mais comum de carcinoma de ovário. Ele inclui os adenocarcinomas serosos e mucinosos, o adenocarcinoma de células claras e o adenocarcinoma endometrioide.

[0287] O carcinoma de células renais, também conhecido como câncer de células renais ou adenocarcinoma de células renais, é um câncer de rim que se origina no revestimento do túbulo convoluto proximal, os tubos muito pequenos dos rins que filtram o sangue e removem resíduos. O carcinoma de células renais é, de longe, o tipo mais comum de câncer renal em adultos e o mais letal dentre todos os tumores genito-urinários. Subtipos distintos de carcinoma de células renais são o carcinoma de células renais de células claras e o carcinoma papilar renal. O carcinoma de células renais de células claras é a forma mais comum de carcinoma de células renais. Quando visto sob um microscópio, as células que compõem o carcinoma de células renais de células claras aparecem muito pálidas ou claras. O carcinoma papilar renal é o segundo subtipo mais comum. Estes cânceres formam pequenas projeções digitiformes (denominadas papilas) em alguns, se não na maioria, dos tumores.

[0288] O linfoma e a leucemia são malignidades derivadas de células (formadoras de sangue) hematopoiéticas.

[0289] O tumor blástico ou blastoma é um tumor (geralmente maligno) que se assemelha a um tecido imaturo ou embrionário. Muitos desses tumores são mais comuns em crianças.

[0290] Por "metástase" entende-se a propagação de células de câncer a partir do seu local de origem para uma outra parte do corpo. A formação de metástase é um processo muito complexo e depende do desprendimento de células malignas do tumor primário, da invasão da matriz extracelular, da penetração nas membranas basais endoteliais para entrarem na cavidade do corpo e nos vasos e, em seguida, depois de terem sido transportadas pelo sangue, da infiltração em órgãos alvo. Por fim, o crescimento de um novo tumor, isto é, um tumor secundário ou tumor metastático, no sítio alvo depende da angiogênese. A metástase de tumores geralmente ocorre mesmo após a remoção do tumor primário, porque as células ou os componentes tumorais podem permanecer e desenvolver potencial metastático. Em uma modalidade, o termo "metástase", de acordo com a invenção, refere-se à "metástase distante", a qual se refere a uma metástase que é remota a partir do tumor primário e do sistema de linfonodos regional.

[0291] As células de um tumor secundário ou metastático são como aquelas do tumor original. Isto significa que, por exemplo, se o câncer de ovário sofre metástase para o fígado, o tumor secundário é constituído por células de ovário anormais e não células do fígado anormais. O tumor no fígado é então chamado de câncer de ovário metastático, e não câncer de fígado.

[0292] No câncer de ovário, a metástase pode ocorrer das seguintes maneiras: por contato direto ou extensão, ela pode invadir tecidos ou órgãos próximos localizados perto ou em torno do ovário, tais como as trompas de Falópio, útero, bexiga, reto, etc.; por disseminação ou vazamento na cavidade abdominal, que é a forma mais comum de espalhamento do câncer de ovário, as células cancerígenas rompem a superfície da massa do ovário e "caem" em outras estruturas do abdômen, tais como fígado, estômago, cólon, ou diafragma; por desprendimento a partir da massa do ovário, invasão dos vasos linfáticos e, em seguida, deslocamento para outras áreas do corpo ou órgãos distantes, tais como pulmão ou fígado; por desprendimento a partir da massa do ovário, invasão da corrente sanguínea e deslocamento para outras áreas do corpo ou órgãos distantes.

[0293] De acordo com a invenção, o câncer de ovário metaestático inclui câncer nas trompas de Falópio, câncer em órgãos do abdômen, tais como câncer no intestino, câncer no útero, câncer na bexiga, câncer no reto, câncer no fígado, câncer no estômago, câncer no cólon, câncer no diafragma, câncer nos pulmões, câncer no revestimento do abdômen ou pélvis (peritônio) e câncer no cérebro. De forma similar, o câncer de pulmão metastático refere-se ao câncer que se espalhou dos pulmões para locais distantes e/ou diversos no corpo e inclui câncer no fígado, câncer nas glândulas adrenais, câncer nos ossos e câncer no cérebro.

[0294] Uma recaída ou recorrência ocorre quando uma pessoa é novamente afetada por uma condição que a afetou no passado. Por exemplo, se um paciente sofreu de uma doença tumoral, recebeu um tratamento bem sucedido da referida doença e novamente desenvolve a referida doença, a referida doença recentemente desenvolvida pode ser considerada como uma recaída ou uma recorrência. No entanto, de acordo com a invenção, uma recaída ou uma recorrência de uma doença tumoral pode, mas não necessariamente ocorre no local da doença tumoral original. Assim, por exemplo, se um paciente sofreu de tumor de ovário e recebeu um tratamento bem sucedido, uma recaída ou uma recorrência pode ser a ocorrência de um tumor de ovário ou a ocorrência de um tumor em um local diferente do ovário. A recaída ou recorrência de um tumor inclui também situações em que um tumor ocorre em um local diferente do local do tumor original, bem como no local do tumor original. Preferivelmente, o tumor original, para o qual o paciente recebeu um tratamento, é um tumor primário e o tumor em um local diferente do local do tumor original é um tumor secundário ou metastático.

[0295] Por "tratar" entende-se administrar um composto ou uma composição, conforme aqui descrito, a um indivíduo, a fim de prevenir ou eliminar uma doença, incluindo a redução do tamanho de um tumor ou do número de tumores em um indivíduo; parar ou retardar uma doença em um indivíduo; inibir ou retardar o desenvolvimento de uma nova doença em um indivíduo; diminuir a frequência ou a gravidade de sintomas e/ou recorrências em um indivíduo que atualmente possui ou que já possuiu uma doença; e/ou prolongar, isto é, aumentar o tempo de vida do indivíduo.

[0296] Em particular, o termo "tratamento de uma doença" inclui cura, encurtamento da duração, melhora, prevenção, retardamento ou inibição da progressão ou agravamento, ou prevenção ou atraso no aparecimento de uma doença ou dos sintomas da mesma.

[0297] Por "estar em risco" entende-se um indivíduo, isto é, um paciente, que é identificado como tendo uma possibilidade maior do que a normal de desenvolvimento de uma doença, em particular, câncer, em comparação com a população em geral. Além disso, um indivíduo que teve ou que atualmente tem uma doença, em particular, câncer, é um indivíduo que possui um risco aumentado para o desenvolvimento de uma doença, uma vez que tal indivíduo pode continuar a desenvolver uma doença. Indivíduos que atualmente têm ou que tiveram um câncer também possuem um risco aumentado para metástases de câncer.

[0298] O termo "imunoterapia" refere-se a um tratamento que envolve uma reação imune específica. No contexto da presente invenção, termos tais como "proteger", "prevenir", "profilático", "preventivo" ou "protetor" referem-se à prevenção ou tratamento, ou ambos, da ocorrência e/ou propagação de uma doença em um indivíduo e, em particular, à minimização da possibilidade de um indivíduo desenvolver uma doença ou ao retardamento do desenvolvimento de uma doença. Por exemplo, uma pessoa com risco para um tumor, conforme descrito acima, poderia ser uma candidata para a terapia para prevenir um tumor.

[0299] Uma administração profilática de uma imunoterapia, por exemplo, uma administração profilática da composição da invenção, preferivelmente protege o receptor do desenvolvimento de uma doença. A administração terapêutica de uma imunoterapia, por exemplo, uma administração terapêutica da composição da invenção, pode levar à inibição da evolução/crescimento da doença. Isto compreende a desaceleração da evolução/crescimento da doença, em particular, uma interrupção da evolução da doença, o que preferivelmente leva à eliminação da doença.

[0300] A imunoterapia pode ser realizada utilizando- se qualquer uma de uma variedade de técnicas, em que os agentes aqui fornecidos agem para remover as células que expressam antígeno de um paciente. Tal remoção pode ser realizada como resultado do aumento ou indução de uma resposta imune em um paciente específico para um antígeno ou uma célula que expressa um antígeno.

[0301] Dentro de certas modalidades, a imunoterapia pode ser imunoterapia ativa, na qual o tratamento depende do estímulo in vivo do sistema imune endógeno do hospedeiro para reagir contra células doentes com a administração de agentes modificadores de resposta imune (tais como peptídeos e ácidos nucleicos conforme aqui fornecidos).

[0302] Dentro de outras modalidades, a imunoterapia pode ser imunoterapia passiva, na qual o tratamento envolve a liberação de agentes com reatividade imune a tumores estabelecida (tal como células efetoras) que podem, direta ou indiretamente, mediar efeitos antitumorais e não necessariamente dependem de um sistema imune intacto do hospedeiro. Exemplos de células efetoras incluem os linfócitos T (tais como linfócitos T CD8+ citotóxicos e linfócitos T CD4+ auxiliares) e as células apresentadoras de antígeno (tais como células dendríticas e macrófagos). Os receptores de células T específicos para os peptídeos aqui descritos podem ser clonados, expressos e transferidos para outras células efetoras para imunoterapia adaptativa.

[0303] Conforme referido acima, os peptídeos imunorreativos, conforme aqui fornecidos, podem ser utilizados para expandir rapidamente as culturas de células T antígeno-específicas, de forma a gerar um número suficiente de células para a imunoterapia. Em particular, as células apresentadoras de antígeno, tais como células dendríticas, macrófagos, monócitos, fibroblastos e/ou células B, podem ser pulsadas com peptídeos imunorreativos ou transfectadas com um ou mais ácidos nucleicos, utilizando-se técnicas padrão bem conhecidas na técnica. As células efetoras cultivadas para uso em terapia devem ser capazes de crescer e se distribuir amplamente e de sobreviver durante um longo prazo in vivo. Estudos demonstraram que as células efetoras cultivadas podem ser induzidas a crescer in vivo e sobreviver durante um longo prazo em quantidades substanciais através de estímulo repetido com antígeno suplementado com IL-2 (veja, por exemplo, Cheever e cols. (1997), Immunological Reviews 157, 177).

[0304] Alternativamente, um ácido nucleico que expressa um peptídeo aqui citado pode ser introduzido em células apresentadoras de antígenos retiradas de um paciente e clonalmente propagadas ex vivo para serem transplantadas de volta para o mesmo paciente.

[0305] As células transfectadas podem ser reintroduzidas no paciente, utilizando-se qualquer meio conhecido na técnica, preferivelmente na forma estéril, por administração intravenosa, intracavitária, intraperitoneal ou intratumoral.

[0306] Os métodos aqui descritos podem envolver a administração de células T autólogas que foram ativadas em resposta a um peptídeo ou célula apresentadora de antígeno que expressa um peptídeo. Tais células T podem ser CD4+ e/ou CD8+ e podem ser proliferadas conforme descrito acima. As células T podem ser administradas ao indivíduo em uma quantidade eficaz para inibir o desenvolvimento de uma doença.

[0307] Os agentes e composições aqui fornecidos podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com regimes terapêuticos convencionais, tais como cirurgia, radiação, quimioterapia e/ou transplante de medula óssea (autólogo, singênico, alogênico ou não relacionado).

[0308] O termo "imunização" ou "vacinação" descreve o processo de tratamento de um indivíduo com o objetivo de induzir uma resposta imune por razões terapêuticas ou profiláticas.

[0309] O termo "in vivo" refere-se à situação em um indivíduo.

[0310] Os termos "indivíduo", "pessoa", "organismo" ou "paciente" são utilizados indiferentemente e referem-se a vertebrados, preferivelmente mamíferos. Por exemplo, os mamíferos, no contexto da presente invenção, são humanos, primatas não humanos, animais domésticos, tais como cães, gatos, ovelhas, gado bovino, cabras, porcos, cavalos, etc., animais de laboratório tais como camundongos, ratos, coelhos, porquinhos da Índia, etc., bem como animais em cativeiro, tais como animais de zoológicos. O termo "animal", conforme aqui utilizado, também inclui humanos. O termo "indivíduo" também pode incluir um paciente, isto é, um animal, preferivelmente um humano que possui uma doença, preferivelmente uma doença conforme aqui descrita.

[0311] O termo "autólogo" é utilizado para descrever qualquer coisa que seja derivada do mesmo indivíduo. Por exemplo, "transplante autólogo" refere-se a um transplante de tecidos ou órgãos derivados do mesmo indivíduo. Tais procedimentos são vantajosos, uma vez que superam a barreira imunológica que, caso contrário, resultaria em rejeição.

[0312] O termo "heterólogo" é utilizado para descrever qualquer coisa que consiste em vários elementos diferentes. Como um exemplo, a transferência de medula óssea de um indivíduo para um indivíduo diferente constitui um transplante heterólogo. Um gene heterólogo é um gene derivado de uma fonte que não seja o próprio indivíduo.

[0313] Como parte da composição para imunização ou vacinação, preferivelmente um ou mais agentes, conforme aqui descritos, são administrados em conjunto com um ou mais adjuvantes para a indução de uma resposta imune ou para aumentar uma resposta imune. O termo "adjuvante" refere-se a compostos que prolongam ou aumentam ou aceleram uma resposta imune. A composição da presente invenção, preferivelmente, exerce o seu efeito sem a adição de adjuvantes. Ainda assim, a composição do presente pedido pode conter qualquer adjuvante conhecido. Os adjuvantes compreendem um grupo heterogêneo de compostos, tais como emulsões de óleo (por exemplo, adjuvantes de Freund), compostos minerais (tal como alúmen), produtos bacterianos (tais como toxina de Bordetella pertussis), lipossomos e complexos imuno-estimulantes. Exemplos de adjuvantes são monofosforil-lipídio A (MPL SmithKline Beecham), saponinas, tais como QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; publicação internacional WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 e QS-L1 (So e cols., 1997, Mol. Cells 7:178-186), adjuvantes de Freund incompletos, adjuvantes de Freund completos, vitamina E, montanide, alúmen, oligonucleotídeos CpG (Krieg e cols., 1995, Nature 374:546-549) e várias emulsões água-em-óleo, que são preparadas a partir de óleos biologicamente degradáveis, tais como esqualeno e/ou tocoferol.

[0314] De acordo com a invenção, uma "amostra" pode ser qualquer amostra útil de acordo com a presente invenção, em particular, uma amostra biológica, tal como um amostra de tecido, incluindo fluidos corporais, e/ou uma amostra celular, e podem ser obtidas de maneira convencional, tal como por biópsia de tecido, incluindo biópsia por punção, e por retirada de sangue, aspiração brônquica, saliva, urina, fezes ou outros fluidos corporais. De acordo com a invenção, o termo "amostra" também inclui amostras processadas, tais como frações ou isolados de amostras biológicas, por exemplo, isolados de ácidos nucleicos e peptídeos/proteínas.

[0315] Outras substâncias que estimulam uma resposta imune do paciente também podem ser administradas. É possível, por exemplo, utilizar citocinas em uma vacina, devido às suas propriedades reguladoras sobre linfócitos. Tais citocinas compreendem, por exemplo, a interleucina-12 (IL- 12), a qual demonstrou aumentar as ações de proteção da vacina (cf. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF e IL-18.

[0316] Existe uma série de compostos que aumentam a resposta imune e que, portanto, podem ser utilizados em uma vacinação. Os referidos compostos compreendem moléculas co- estimulantes fornecidas sob a forma de proteínas ou ácidos nucleicos, tais como B7-1 e B7-2 (CD80 e CD86, respectivamente).

[0317] Os agentes terapeuticamente ativos aqui descritos podem ser administrados por qualquer via convencional, incluindo injeção ou infusão. A administração pode ser realizada, por exemplo, por via oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea ou transdérmica.

[0318] Os agentes aqui descritos são administrados em quantidades eficazes. Uma "quantidade eficaz" refere-se à quantidade que alcança uma reação desejada ou um efeito desejado sozinho ou juntamente com doses adicionais. No caso do tratamento de uma determinada doença ou de uma condição em particular, a reação desejada preferivelmente refere-se à inibição do desenvolvimento da doença. Isto compreende o retardamento da evolução da doença e, em particular, a interrupção ou reversão do progresso da doença. A reação desejada em um tratamento de uma doença ou de uma condição também pode ser o retardamento do aparecimento ou uma prevenção do aparecimento da referida doença ou referida condição.

[0319] Uma quantidade eficaz de um agente aqui descrito dependerá da condição a ser tratada, da gravidade da doença, dos parâmetros individuais do paciente, incluindo idade, condição fisiológica, tamanho e peso, da duração do tratamento, do tipo de uma terapia acompanhante (se presente), da via de administração específica e de fatores semelhantes. Deste modo, as doses administradas dos agentes aqui descritos podem depender de vários de tais parâmetros. No caso em que uma reação em um paciente não é suficiente com uma dose inicial, doses mais elevadas (ou doses efetivamente mais elevadas alcançadas por uma via de administração diferente, mais localizada) podem ser utilizadas.

[0320] As composições farmacêuticas da invenção são preferivelmente estéreis e contêm uma quantidade eficaz da substância terapeuticamente ativa para gerar a reação desejada ou o efeito desejado.

[0321] As composições farmacêuticas da invenção são geralmente administradas em quantidades farmaceuticamente compatíveis e em preparações farmaceuticamente compatíveis. O termo "farmaceuticamente compatível" refere-se a um material não tóxico que não interage com a ação do componente ativo da composição farmacêutica. As preparações deste tipo geralmente podem conter sais, substâncias tampão, conservantes, veículos, substâncias que complementam o reforço da imunidade, tais como adjuvantes, por exemplo, oligonucleotídeos CpG, citocinas, quimiocinas, saponinas, GM-CSF e/ou RNA e, onde apropriado, outros compostos terapeuticamente ativos. Quando utilizados em medicina, os sais devem ser farmaceuticamente compatíveis. No entanto, os sais que não são farmaceuticamente compatíveis podem ser utilizados para preparar sais farmaceuticamente compatíveis e estão incluídos na invenção. Os sais farmacológica e farmaceuticamente compatíveis deste tipo compreendem, de uma forma não limitante, aqueles preparados a partir dos seguintes ácidos: clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malônico, succínico e semelhantes. Os sais farmaceuticamente compatíveis também podem ser preparados na forma de sais de metais alcalinos ou de sais de metais alcalino-terrosos, tais como sais de sódio, sais de potássio ou sais de cálcio.

[0322] Uma composição farmacêutica da invenção pode compreender um veículo farmaceuticamente compatível. O termo "veículo" refere-se a um componente orgânico ou inorgânico, de origem natural ou sintética, em que o componente ativo é combinado para facilitar a aplicação. De acordo com a invenção, o termo "veículo farmaceuticamente compatível" inclui um ou mais agentes de enchimento sólidos ou líquidos compatíveis, diluentes ou substâncias de encapsulamento, que são adequados para administração a um paciente. Os componentes da composição farmacêutica da invenção são geralmente de tal forma que nenhuma interação que prejudique substancialmente a eficácia farmacêutica desejada ocorra.

[0323] As composições farmacêuticas da invenção podem conter substâncias tampão adequadas, tais como ácido acético em um sal, ácido cítrico em um sal, ácido bórico em um sal e ácido fosfórico em um sal.

[0324] As composições farmacêuticas podem, onde apropriado, conter também conservantes adequados, tais como cloreto de benzalcônio, clorobutanol, parabenos e timerosal.

[0325] As composições farmacêuticas são geralmente fornecidas em uma forma de dosagem uniforme e podem ser preparadas de um modo conhecido per se. As composições farmacêuticas da invenção podem estar na forma de cápsulas, comprimidos, pastilhas, soluções, suspensões, xaropes, elixires ou na forma de uma emulsão, por exemplo.

[0326] As composições adequadas para administração parentérica normalmente compreendem uma preparação estéril aquosa ou não aquosa do composto ativo, que é preferidamente isotônica para o sangue do receptor. Exemplos de veículos e solventes compatíveis são solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Além disso, óleos fixos, geralmente estéreis, são utilizados como solução ou meio de suspensão.

[0327] A presente invenção é descrita em detalhes pelas figuras e exemplos abaixo, que são utilizados apenas para fins de ilustração e não pretendem ser limitantes. Devido à descrição e aos exemplos, modalidades adicionais que estão igualmente incluídas na invenção estão disponíveis para o técnico no assunto.

FIGURAS

[0328] Figura 1: Representação do complexo TCR-CD3. Os motivos de ativação de imunorreceptores baseados em tirosina (ITAMs) de CD3 intracitoplasmático são indicados como cilindros (adaptado de "The T cell receptor facts book", MP Lefranc, G Lefranc, 2001).

[0329] Figura 2. Plataforma tecnológica para isolamento/validação de TCR. A abordagem integra todas as etapas a partir do isolamento de células T antígeno- específicas (parte superior) até a clonagem de TCR (meio) e validação de TCR (parte inferior). Os pacientes são rastreados para respostas de auto-anticorpos contra o antígeno de interesse por CrELISA (Ensaio de Imunoabsorção Ligado a Enzima de lisado Bruto, do inglês Crude lysate Enzyme-Linked ImuunoSorbent Assay). As células T antígeno- específicas de doadores soropositivos foram estimuladas com peptídeo ou DCs autólogas carregadas com RNA e células T CD8+ ou CD4+ secretoras de IFNY são isoladas por citometria de fluxo (parte superior). As células individuais são coletadas em placas de múltiplos poços e submetidas à síntese da primeira fita de cDNA e ao enriquecimento através de uma etapa global de amplificação por PCR. As regiões variáveis α/β do TCR são clonadas em vetores para transcrição in vitro (IVT) contendo os cassetes de região constante (meio). RNAs de cadeias α/β do TCR são transferidos para células T CD4+ ou CD8+, co-cultivados com APCs que expressam o antígeno apropriado e moléculas de HLA e testados para a reprogramação funcional de células T geneticamente modificadas (parte inferior).

[0330] Figura 3. Classificação por citometria de fluxo de células T CD8+ pp65-específicas de um doador soropositivo para CMV após uma semana de expansão. células T CD8+ secretoras de IFNg foram isoladas após a reexposição com iDCs autólogas transfectadas com RNA de pp65. Controle: iDCs transfectadas com eGFP RNA.

[0331] Figura 4. Verificação da expressão de superfície do TCR sobre células SupT1 Transfectadas com TCR analisadas por citometria de fluxo. Células SupT1 eletroporadas com RNAs de cadeia α/β do TCR foram coradas com um anticorpo pan TCR e analisadas por citometria de fluxo. As células SupT1 eletroporadas sem RNA serviram como um controle negativo.

[0332] Figura 5. Teste de especificidade de TCRs obtidos a partir de células T CD8+ CMV-pp65-específicas de um doador soropositivo para CMV após expansão in vitro por IFNY-ELISPOT. Células IVSB geneticamente modificadas por TCR foram testadas em iDCs autólogas carregadas com antígeno e células K562-A*0201 para o reconhecimento específico do pool de peptídeo de pp65, pp65495-503 ou RNA de IVT de pp65. Os peptídeos que se sobrepõem parcialmente derivados de TPTE foram utilizados como um pool de peptídeo de controle e SSX- 2241-249 foi utilizado como controle único de peptídeo. O epítopo Tyr368-376 derivado da tirosinase foi aplicado como um controle positivo. TCR de controle: TCR clonado a partir de um doador soronegativo para CMV.

[0333] Figura 6. Determinação de restrição a HLA e especificidade de peptídeo de TCRCD8-CMV#1 por IFNY-ELISPOT. Células IVSB transgênicas de TCR foram analisadas para o reconhecimento de células K562 que expressam alelos de HLA de classe I selecionados do doador pulsadas com peptídeos sobrepostos de pp65 ou sem antígeno como um controle. Células K562-B*3501 foram subsequentemente utilizadas para analisar o reconhecimento mediado por TCRCD8-CMV#1 de peptídeos de 15- meros individuais derivados de CMV-pp65.

[0334] Figura 7. Teste de especificidade de TCRs clonados a partir de células T CD8+ CMV-pp65-específicas isoladas ex vivo de um doador soropositivo para CMV por IFNY- ELISPOT. Células IVSB foram transfectadas com RNAs de cadeia α/β de TCR e estimuladas com K562-A*0201 pulsadas com pp65495- 503. O peptídeo não relacionado SSX-2241-249 e um TCR clonado a partir de um doador soronegativo para CMV serviram como controle negativo, o epítopo Tyr368-376 derivado de tirosinase serviu como controle positivo.

[0335] Figura 8. Morte específica de células alvo através de células T Transfectadas com TCR analisadas por ensaio de citotoxicidade de luciferase. Células alvo K562 pulsadas com peptídeo que expressam o tipo de alelo apropriado de HLA foram utilizadas como alvos para as células IVSB geneticamente modificadas com TCRs CMV-pp65- específicos. Como referência, a morte de células alvo pulsadas com Tyr368-376 mediada pelo receptor endógeno foi analisada. Um TCR obtido a partir de um doador soronegativo para CMV foi utilizado como controle para excluir a lise não específica. E:T: razão efetora para alvo.

[0336] Figura 9. Teste de especificidade de TCRs isolados a partir de células T CD8+ NY-ESO-1-específicas por IFNY-ELISPOT. TCRCD8-NY#2 e #5 foram transferidos para células IVSB e testados para o reconhecimento de iDCs autólogas carregadas com RNA de NY-ESO-1 ou pool de peptídeos. Controles negativos: iDCs pulsadas com pool de peptídeo de TPTE; um TCR de controle isolado a partir de um doador saudável. Controle positivo: K562-A*0201 pulsado com Tyr368- 376.

[0337] Figura 10. Identificação de elementos de restrição HLA para TCRs NY-ESO-1-específicos por IFNy- ELISPOT. Células IVSB geneticamente modificadas por TCR foram analisadas por IFNg-ELISPOT para o reconhecimento de células K562 transfectadas com alelos individuais de HLA de classe I do doador e pulsadas com pool de peptídeos de NY- ESO-1. Controles negativos: pool de peptídeo de HIV-gag; K562 eletroporadas sem RNA de HLA (falso). Controle positivo: peptídeo de Tyr368-376.

[0338] Figura 11: Identificação de peptídeos de 15 meros reconhecidos por TCRs NY-ESO-1-específicos por IFNy- ELISPOT. Células T IVSB Transfectadas com TCR foram analisadas para o reconhecimento de células K562 que expressam o alelo de HLA de classe I adequado e pulsadas com 15-meros individuais parcialmente sobrepostos derivados de NY-ESO-1.

[0339] Figura 12. Mapeamento de epítopo para TCRs NY-ESO-1-específicos por IFNY—ELISPOT. Células IVSB transfectadas com TCRCD8-NY#5, #6, #8 ou #15 foram analisadas para o reconhecimento de células K562-B*3508 pulsadas com peptídeos de nonâmeros individuais que cobrem os aminoácidos 77-107 da proteína NY-ESO-1.

[0340] Figura 13. Morte específica de células alvo mediada por TCRCD8-NY#2 analisada por ensaio de citotoxicidade de luciferase. A lise específica de células K562-A*6801 pulsadas com pool de peptídeos de NY-ESO-1 por células IVSB TCRCD8-NY#2-transfectadas foi analisada utilizando-se diferentes razões efetora para alvo (E:T). Controle: células alvo pulsadas com pool de peptídeos de TPTE.

[0341] Figura 14: Determinação de elementos de restrição a HLA para TCRs NY-ESO-1—específicos obtidos a partir de células T CD4+ por IFNY—ELISPOT. Células T CD4 + transfectadas com TCR foram analisadas para o reconhecimento de K562 que expressam alelos individuais de HLA de classe II do paciente pulsadas com pools de peptídeos de NY-ESO-1 ou HIV-gag como um controle negativo.

[0342] Figura 15. Mapeamento de epítopos para TCRCD4 - NY#5 por IFNY—ELISPOT. células T CD4+ geneticamente modificadas por TCR foram testadas para o reconhecimento de células K562 que expressam o alelo de HLA de classe II apropriado e pulsadas com 15-meros parcialmente sobrepostos que representam a proteína NY-ESO-1.

[0343] Figura 16. Determinação de restrição a HLA e especificidade de peptídeo de TCRCD8-TPT#3 por IFNY-ELISPOT. Células IVSB transfectadas com TCR foram analisadas para o reconhecimento de células K562 que expressam moléculas de HLA de classe I do paciente pulsadas com pool de peptídeo de TPTE (parte superior). Células K562-B*3501 pulsadas com 15 meros individuais que representam o antígeno inteiro (meio) e peptídeos de 9 meros que abrangem os aminoácidos 521-535 da TPTE (parte inferior) foram utilizados para definir o epítopo reconhecido pelo TCRCD8-TPT#3. Aminoácidos de âncora do epítopo reconhecido para ligação a HLA-B*3501 são apresentados em negrito.

[0344] Figura 17. Determinação de elementos de restrição a HLA para TCRs TPTE-específicos isolados de células T CD4+ por IFNY-ELISPOT. Células T CD4+ transfectadas com TCR foram analisadas para o reconhecimento de células K562 transfectadas com alelos de HLA de classe II do paciente e pulsadas com peptídeos de sobreposição correspondentes a TPTE ou HIV-gag como controle.

[0345] Figura 18. Mapeamento de epítopos para TCRs TPTE-específicos isolados de células T CD4+ por IFNY- ELISPOT. Localizações de epítopo de TCRs foram determinadas utilizando-se células T CD4+ transfectadas com TCR em combinação com células K562 transfectadas com o antígeno de HLA de classe II apropriado e pulsadas com peptídeos individuais de 15 meros parcialmente sobrepostos que abrangem a proteína TPTE.

[0346] Figura 19. Classificação por citometria de fluxo de células T CD8+ PLACl-específicas obtidas a partir de camundongos imunizados. Células do baço de camundongos transgênicos HLA A*0201 imunizados com PLAC1 (camundongos A2.1/DR1) foram pulsadas com peptídeos de sobreposição correspondentes a PLAC1 ou a um antígeno de controle (WT1). 24 horas mais tarde, as células foram coletadas, coradas com anticorpos conjugados com fluorocromo e células CD3+/CD8+/CD137+ foram isoladas. Gráficos de histograma foram fechados em células CD3+/CD8+. M1-5: camundongos imunizados com PLAC1; Con1-3: camundongos de controle.

[0347] Figura 20. Teste de especificidade de TCRs clonados a partir de células T CD8+ de camundongos imunizados com PLAC1 por IFNY—ELISPOT. Células IVSB geneticamente modificadas por TCR foram testadas para o reconhecimento de células K562-A*0201 pulsadas com peptídeos de sobreposição correspondentes a PLAC1 ou NY-ESO-1 como um antígeno de controle. Como um controle positivo, a secreção de IFNY em resposta a células alvo pulsadas com Tyr368-376 foi analisada.

[0348] Figura 21. Determinação da especificidade de peptídeo de TCRCD8-P1#8 por IFNY—ELISPOT. Células T CD8 + transfectadas com TCR foram testadas para o reconhecimento específico de células K562-A*0201 pulsadas com peptídeos individuais de 15 meros parcialmente sobrepostos que abrangem a proteína PLAC1.

[0349] Figura 22.Definição de epítopos imunodominantes restritos por A*0201 reconhecidos pelos TCRs PLACl-específicos por IFNY-ELISPOT. Células IVSB transfectadas por TCR foram analisadas para o reconhecimento de células K562-A*0201 pulsadas com peptídeos individuais de 9 meros que abrangem os aminoácidos 25 a 43 de PLAC1 para definir o epítopo reconhecido pelo TCRCD8-P1#11. Os peptídeos reconhecidos são mostrados em negrito. Controle positivo: peptídeo 7 de 15 meros de PLAC1.

EXEMPLOS

[0350] As técnicas e métodos aqui utilizados são aqui descritos ou realizados de uma maneira conhecida per se e conforme descrito, por exemplo, em Sambrook e cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. Todos os métodos que incluem a utilização de kits e reagentes são realizados de acordo com as informações dos fabricantes, a menos que especificamente indicado.

Exemplo 1: Materiais e Métodos Sorotipagem

[0351] Um ELISA baseado em lisados brutos de bactérias (CrELISA ou Crude Lysate Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) que expressam NY-ESO-1 de cadeia completa ou o N-terminal do TPTE (aminoácidos 1-51) foi utilizado de acordo como o protocolo anteriormente descrito para a determinação de auto-anticorpos IgG (Tureci, O. e cols. (2004), J. Immunol. Methods 289, 191-199).

[0352] A soropositividade para CMV foi analisada por um ELISA padrão que detecta respostas CMV-específicas de IgG policlonal.

Linhagens celulares e reagentes

[0353] As linhagens de células de linfoma humano SupTl (ATCC n° CRL-1942) ou Jurkat76 (Heemskerk, M.H. e cols. (2003), Blood 102, 3530-3540), ambas sem expressão de superfície de TCR endógeno, a linhagem de células de fibroblastos embrionários de camundongos NIH3T3 (DSMZ n° ACC 59) e a linhagem de células de leucemia mieloide crônica humana K562 (Lozzio, C.B. & Lozzio, B.B. (1975), Blood 45, 321-334) foram cultivadas sob condições padrão. Células K562 transiente ou estavelmente transfectadas com tipos de alelos de HLA (Britten, C.M. e cols. (2002), J. Immunol. Methods 259, 95-110) (referidas como, por exemplo, K562-A*0201) foram utilizadas para ensaios de validação. A linhagem celular primária de fibroblastos do prepúcio de recém- nascido humano CCD-1079Sk (ATCC n° CRL-2097) foi cultivada de acordo com as instruções do fabricante. A linhagem celular de CTL monoespecífico IVSB, específica para o epítopo derivado da tirosinase restrito para HLA A*0201 Tyr368-376 (Wolfel, T. e cols. (1993), Int. J. Cancer 55, 237-244; Wolfel, T. e cols. (1994) Eur. J. Immunol. 24, 759-764), foi cultivada em meio AIM-V (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) com 10% de soro AB humano (Lonza, Basel, Suíça), 350 IU/mL de IL-2 (Richter-Helm BioLogics, Hamburg, Alemanha), 5 ng/mL de IL-7 (PeproTech, Frankfurt, Alemanha) e 10 ng/mL de IL- 15 (R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt, Alemanha) e estimuladas semanalmente com células AK-EBV e SK29-Mel irradiadas.

Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), monócitos e células dendríticas (CDs)

[0354] PBMCs foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia), a partir de cremes leucocitários ou a partir de amostras de sangue. Tipos de alelos de HLA foram determinados por métodos de PCR padrão. Monócitos foram enriquecidos com microgrânulos de anti-CD14 (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Alemanha). DCs imaturas (iDCs) foram obtidas por diferenciação de monócitos durante 5 dias em meio de cultura suplementado com citocina, tal como descrito em Kreiter e cols. (2007), Cancer Immunol. Immunother., CII, 56, 1577-87.

Peptídeos e pulso de peptídeo de células estimulantes

[0355] Pools de peptídeos de 15 meros N -terminais e C-terminais livres com 11 sobreposições de aminoácidos correspondentes às sequências de CMV-pp65, HIV-gag, TPTE, NY-ESO-I ou PLAC1 (referidos como pool de peptídeo de antígeno) foram sintetizados por química de fase sólida padrão (JPT GmbH, Berlim, Alemanha) e dissolvidos em DMSO até uma concentração final de 0,5 mg/mL. Os peptídeos nonâmeros foram reconstituídos em DMSO a 10% em PBS. Para o pulso, células estimulantes foram incubadas durante 1 hora a 37 °C em meio de cultura, utilizando-se concentrações diferentes de peVetores para transcrição in vitro (IVT) de RNA

[0356] Todos os constructos são variantes do plasmídeo pST1-sec-insert-2βgUTR-A(120)-Sap1 previamente descrito (Holtkamp, S. e cols. (2006), Blood 108, 4009-4017). Para se obter os plasmídeos que codificam cadeias de TCR humano, o cDNA que codifica para regiões constantes de TCR- α ou TCR-β1 e TCR-β2 foi amplificado a partir de células T CD8+ humanas e clonado para esta cadeia principal. Para a geração de plasmídeos que codificam cadeias de TCR de murinos, os cDNAs que codificam para regiões constantes de TCR-α, -β1 e -β2 foram encomendados de um fornecedor comercial e clonados de forma análoga (números de acesso GenBank M14506, M64239 e X67127, respectivamente). Produtos de PCR V(D)J específicos foram introduzidos em tais cassetes para produzir cadeias de TCR completas (referidas como pST1- human/murineTCRαβ-2βgUTR-A(120)).

[0357] Analogamente, alelos individuais de HLA de classe I e II clonados a partir de PBMCs de doadores e cDNA de beta-2-microglobulina (B2M) de DCs humanas foram inseridos nesta cadeia principal (referida como pST1-HLA class I/II-2βgUTR-A(120) e pST1-B2M-2βgUTR-A (120)).

[0358] Os plasmídeos que codificam para o antígeno pp65 de CMV (pST1-sec-pp65-MITD-2βgUTR-A (120)) e NY-ESO-I (pST1-sec-NY-ESO-1-MITD-2βgUTR-A(120)), ligados a um sinal de secreção (sec) e o sinal de tráfego de MHC de classe I (MITD), foram descritos anteriormente (Kreiter, S. e cols. (2008), J. Immunol. 180, 309-318). O plasmídeo que codifica PLAC1 pST1-sec-PLAC1-MITD-2βgUTR-A(120) foi gerado por clonagem de um cDNA obtido a partir de um fornecedor comercial (número de acesso GenBank NM_021796) para a cadeia principal de Kreiter e cols. Os plasmídeos que codificam TPTE pST1-αgUTR-TPTE-2βgUTR-A(120) e pST1-αgUTR-TPTE-MITD- 2βgUTR-A(120) foram gerados por clonagem de um cDNA obtido a partir de um fornecedor comercial (número de acesso GenBank AF007118) em um variante do vetor de Holtkamp e cols. com uma região de alfa-globina 5' não traduzida adicional.

[0359] Os primers foram adquiridos da Operon Biotechnologies, Cologne, Alemanha.

Geração de RNA transcrito in vitro (IVT) e transferência para células

[0360] A geração de RNA IVT foi realizada conforme descrito anteriormente (Holtkamp, S. e cols. (2006), Blood 108, 4009-4017) e adicionado às células suspensas em meio X- VIVO 15 (Lonza, Basel, Suíça) em uma cubeta de eletroporação estéril pré-resfriada de 4 mm de fenda (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Alemanha). A eletroporação foi realizada com um aparelho Gene-Pulser-II (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Alemanha) (células T: 450 V/250 μF; células T IVSB: 350 V/200 μF; SupT1 (ATCC no CRL-1942): 300 V/200 μF; DC humana: 300 V/150 μF; K562: 200 V/300 μF).

Expansão in vitro de células T antígeno-específicas

[0361] 2,5 x l06 PBMCs/poço foram semeadas em places de 24 poços, pulsadas com pool de peptídeo e cultivadas durante 1 semana em um meio de cultura completo suplementado com 5% de soro AB, 10 U/mL de IL-2 e 5 ng/mL de IL-7. Para alguns experimentos, células T CD8+ ou CD4+ foram purificadas a partir de PBMC por classificação magnética positiva de células (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Alemanha) e então expandidas por cocultura de 2 x l06 efetoras com 3 x 105 DCs autólogas eletroporadas com RNA que codifica antigen ou pulsadas com o pool de peptídeos durante 1 semana em meio completo suplementado com 5% de soro AB, 10 U/mL de IL-2 e 5 ng/mL de IL-7.

Classificação de célula única de células T CD4+ ou CD8+ antígeno-específicas após teste de secreção de IFNY

[0362] A classificação por citometria de fluxo de células T CD4+ ou CD8+ antígeno-específicas únicas foi conduzida diretamente ex vivo a partir de células T recém- isoladas ou PBMC ou após uma semana de expansão antígeno- específica. 2 x 106 células T ou PBMC foram estimuladas com 3 x l05 DCs autólogas carregadas com pool de peptídeo ou transfectadas com RNA IVT que codifica o respectivo antígeno ou um antígeno de controle durante 4 a 15 horas, dependendo do modo de estímulo. As células foram coletadas, tratadas com um anticorpo anti-IFNY conjugado com ficoeritrina (PE), um anticorpo anti-CD8 conjugado com fluoresceinisotiocianato (FITC) e um anticorpo anti-CD4 conjugado com aloficocianina (APC), de acordo com o kit de ensaio de secreção de IFNY (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Alemanha). A classificação foi conduzida em um citômetro de fluxo BD FACS Aria (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). As células duplo-positivas para IFNY e CD8 ou CD4 foram classificadas e uma célula por poço foi coletada em uma placa de fundo em V de 96 cavidades (Greiner Bio-One GmbH, Solingen, Alemanha) contendo fibroblastos de camundongos NIH3T3 como células alimentadoras, centrifugadas a 4 °C e armazenadas imediatamente a -80 °C.

Priming in vivo de células T por imunização intranodal de camundongos HLA A2.1/DR1 com RNA IVT

[0363] As células T de camundongos A2.1/DR1 (Pajot A. e cols. (2004), Eur. J. Immunol. 34, 3060-69) foram sensibilizadas in vivo contra o antígeno de interesse através de imunização intranodal repetitiva utilizando o RNA IVT que codifica o antígeno (Kreiter S. e cols. (2010), Cancer Research 70, 9031-40). Para imunizações intranodais, os camundongos foram anestesiados com xilazina/cetamina. O linfonodo inguinal foi exposto cirurgicamente, 10 μL de RNA (20 μg) diluído em solução de Ringer e água livre de Rnase foram lentamente injetados, utilizando-se uma seringa descartável de 0,3 mL com uma agulha ultrafina (31G, BD Biosciences) e a ferida foi fechada. Após seis ciclos de imunização, os camundongos foram sacrificados e as células do baço foram isoladas.

Coleta de células do baço

[0364] Após a sua dissecação sob condições estéreis, os baços foram transferidos para tubos falcon contendo PBS. Os baços foram mecanicamente divididos com um fórceps e as suspensões de células foram obtidas com um filtro de células (40 μm). Os esplenócitos foram lavados com PBS, centrifugados e ressuspensos em um tampão hipotônico para a lise dos eritrócitos. Após 5 minutos de incubação à temperatura ambiente, a reação foi interrompida pela adição de 20 mL a 30 mL de meio ou PBS. As células do baço foram centrifugadas e lavadas duas vezes com PBS.

Classificação de célula única de células T CD4+ ou CD8+ antígeno-específicas após coloração com CD137

[0365] Para o re-estímulo antígeno-específico, 2,5 x 106 células de baço/poço de camundongos A2.1/DR1 imunizados foram semeadas em uma placa de 24 poços e pulsadas com um pool de peptídeos sobrepostos que codificam o antígeno de interesse ou um antígeno de controle. Após 24 horas de incubação, as células foram coletadas, coradas com um anticorpo anti-CD3 conjugado com FITC, um anticorpo anti-CD4 conjugado com PE, um anticorpo anti-CD8 conjugado com PerCP- Cy5.5 e um anticorpo anti-CD137 conjugado com Dylight-649. A classificação foi conduzida em citometro de fluxo BD FACS Aria (BD Biosciences). As células positivas para CD137, CD3 e CD8 ou CD4 foram classificadas, uma célula por poço foi coletada em uma placa de 96 poços de fundo em V (Greiner Bio-One) contendo células CCD-1079Sk humanas como células alimentadoras, centrifugadas a 4 °C e imediatamente armazenadas a -80 °C.

Extração de RNA, síntese de cDNA baseada em SMART e amplificação não específica a partir de células classificadas

[0366] O RNA de células T classificadas foi extraído com o RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com as instruções do fornecedor. Um protocolo BD SMART modificado foi utilizado para a síntese de cDNA: a BD PowerScript Reverse Transcriptase (BD Clontech, Mountain View, CA) foi combinada com oligo(dT)-T-primer long para o priming da reação de síntese da primeira fita e com TS-short (Eurogentec S.A., Seraing, Bélgica) para a introdução de uma sequência oligo(riboG) para permitir a criação de um molde estendido pela atividade terminal de transferase da transcriptase reversa e para a troca do molde (Matz, M. e cols. (1999) Nucleic Acids Res. 27, 1558-1560). A primeira fita de cDNA sintetizada de acordo com as instruções do fabricante foi submetida a 21 ciclos de amplificação com 5 U de PfuUltra Hotstart High-Fidelity DNA Polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) e 0,48 μM de primer TS-PCR na presença de 200 μM de dNTP (condições de ciclos: 2 minutos a 95 °C, 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 65 °C, 1 minuto a 72 °C, extensão final de 6 minutos a 72 °C). A amplificação bem sucedida de genes de TCR foi controlada com primers específicos de região constante de TCR-β de humanos ou murinos e Vα-/Vβ-PCRs de humanos ou murinos específicas de clonotipos consecutivos foram realizados apenas se bandas fortes fossem detectadas.

[0367] A primeira fita de cDNA para a amplificação de sequências de HLA de classe I ou II foi sintetizada com SuperScriptII Reverse Transcriptase (Invitrogen) e primer Oligo(dT) com 1-5 μg de RNA extraído de PBMCs derivadas do paciente.

Desenho de primers de PCR para a amplificação de TCR e HLA

[0368] Para o desenho de primers de consenso de TCR humano, todos os 67 genes de TCR-Vβ e os 54 genes de TCR-Vα (quadros de leitura aberta e pseudogenes) conforme listados no banco de dados ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www.imgt.org), juntamente com as suas sequências de comando correspondentes, foram alinhados com o Editor de Alinhamento de Sequências BioEdit (por exemplo, http://www.bio-soft.net). Primers do tipo forward de 24 bp a 27 bp de comprimento com um máximo de 3 bases degeneradas, um teor de GC entre 40% e 60% e um G ou C na extremidade 3' foram desenhados para hibridizarem-se com o máximo de sequências de comando possível e equipados com uma extensão 5' de 15 bp com um sítio de enzima de restrição raro e sequência Kozak. Primers do tipo reverse foram desenhados para hibridizarem-se com os primeiros éxons dos genes da região constante, com o primer TRACex1_as ligando-se a sequências que correspondem aos aminoácidos 7 a 16 de Cα e o TRBCex1_as aos aminoácidos (aa) 8 a 16 em Cβ1 e Cβ2. Ambos os oligonucleotídeos foram sintetizados com um fosfato 5'. Os primers foram agrupados em pools de 2 a 5 oligos do tipo forward com temperatura de hibridização idêntica.

[0369] Esta estratégia foi replicada para o desenho de primers de consenso de TCR de murinos, alinhando-se 129 genes de TCR-Vα listados e 35 genes de TCR-Vβ listados. Primers do tipo reverse mTRACex1_as e mTRBCex1_as são homólogos às sequências correspondentes aos aa 24 a 31 e 8 a 15, respectivamente.

[0370] Primers de consenso de HLA foram desenhados através do alinhamento de todas as sequencias de HLA de classe I e II listadas no sítio eletrônico do Anthony Nolan Research Institute (www.anthonynolan.com) com o Editor de Alinhamento de Sequências BioEdit. Primers do tipo forward de 23 a 27 bp de comprimento com um máximo de 3 bases degeneradas, mas com o código preservado, que hibridizam-se com o máximo de sequências de HLA possível de um locus foram equipados com um fosfato 5' e uma extensão de sequência Kozak. Primers do tipo reverse foram desenhados de forma análoga, mas sem a introdução de bases oscilantes, e equipados com uma extensão 5' de 14 bp que codifica um sítio de enzima de restrição AsiSI.

Amplificação de PCR e clonagem de sequências de V(D)J e HLA

[0371] De 3 a 6 μL de cDNA pré-amplificado a partir de células T isoladas foram submetidos a 40 ciclos de PCR na presença de 0,6 μM de pool de oligo específicos de Vα/Vβ, 0,6 μM de oligo-Cα ou oligo-Cβ, 200 μM de dNTP e 5 U de Pfu polimerase (condições de ciclos: 2 minutos a 95 °C, 30 segundos a 94 °C, 30 segundos em temperatura de hibridização, 1 minuto a 72 °C, tempo de extensão final de 6 minutos a 72 °C). Os produtos de PCR foram analisados utilizando-se o sistema Qiagen de eletroforese capilar. As amostras com bandas em 400 a 500 bp tiveram seus tamanhos fracionados em gel de agarose, as bandas foram cortadas e purificadas utilizando-se um Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). A análise da sequência foi realizada para revelar a sequência de ambos o domínio V(D)J e a região constante β, uma vez que os primers TRBCex1_as e mTRBCex1_as, respectivamente, correspondem a ambos os genes das regiões constantes de TCR β1 e β2 em humanos e em camundongos, respectivamente. O DNA foi digerido e clonado para os vetores de IVT contendo a cadeia principal adequada para uma cadeia completa de TCR-α/β.

[0372] As sequências de HLA foram amplificadas, de acordo com as instruções do fabricante, com 2,5 U de Pfu polimerase a partir de cDNA específico do doador, utilizando- se primers específicos sense e antisense de HLA de classe I ou II. Como a transcrição de genes DRB3 é pelo menos cinco vezes menor do que a dos genes DRB1 (Berdoz, J. e cols. (1987) J. Immunol. 139, 1336-1341), a amplificação de genes DRB3 foi realizada em duas etapas, utilizando-se uma abordagem de PCR aninhada. Os fragmentos de PCR foram purificados, digeridos com AsiSI e clonados para o vetor IVT digerido com EcoRV e AsiSI. Sítios EciI ou SapI no interior dos insertos foram mutados utilizando-se o QuikChange Site- Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA).

Análises por citometria de fluxo

[0373] A expressão na superfície celular de genes de TCR transfectados foi analisada por citometria de fluxo utilizando-se anticorpo anti-TCR conjugado com PE contra a família da região variável apropriada ou a região constante da cadeia β de TCR (Beckman Coulter Inc., Fullerton, EUA) e anticorpos anti-CD8/CD4 marcados com FITC/APC (BD Biosciences). Os antígenos HLA foram detectados por coloração com anticorpos específicos de HLA de classe II marcados com FITC (Beckman Coulter Inc., Fullerton, EUA) e anticorpos específicos de HLA de classe I marcados com PE (BD Biosciences). A análise por citometria de fluxo foi realizada em um citômetro de fluxo analítico FACS Calibur utilizando-se o software CellQuest-Pro (BD Biosciences).

Ensaio de citotoxicidade da luciferase

[0374] Para a avaliação da citotoxicidade mediada por células, um ensaio baseado em bioluminescência foi estabelecido como uma alternativa e otimização para a liberação de 51Cr. Em contraste com o ensaio padrão de liberação de cromo, este ensaio mede a atividade lítica de células efetoras através do cálculo do número de células alvo viáveis que expressam luciferase após co-incubação. As células alvo foram estável ou transientemente transfectadas com o gene de luciferase que codifica para a luciferase de vagalume a partir do vagalume Photinus pyralis (EC 1.13.12.7). A luciferase é uma enzima que catalisa a oxidação de luciferina. A reação é dependente de ATP e ocorre em duas etapas: luciferina + ATP ^ luciferil adenilato + PPi luciferil adenilato + O2 ^ oxiluciferina + AMP + luz

[0375] As células alvo foram plaqueadas em uma concentração de 104 células por poço em placas brancas de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Alemanha) e foram cocultivadas com números variáveis de células T TCR-transfectadas em um volume final de 100 μL. Após 3 horas, 50 μL de uma D-luciferina (BD Biosciences) contendo uma mistura de reação (Luciferina (1 μg/μL), tampão HEPES (50 mM, pH), adenosina 5'-trifosfatase (ATPase, 0,4 mU/μL, Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA)) foram adicionados às células. Através da adição de ATPase à mistura de reação, a luminescência resultante da luciferase liberada de células mortas foi diminuída.

[0376] Após um tempo total de incubação de 4 horas, a bioluminescência emitida pelas células viáveis foi medida utilizando-se o leitor Tecan Infinite 200 (Tecan, Crailsheim, Alemanha). A atividade de destruição de células foi calculada em relação aos valores de luminescência obtidos após a lise celular completa induzida pela adição de 2% de Triton-X 100 e em relação à luminescência emitida pelas células alvo sozinhas. A saída de dados estava em contagens por segundo (CPS) e a lise específica percentual foi calculada como se segue: (1-(CPSexp — CPSmin)/(CPSmax — CPSmin )))* 100.

[0377] A luminescência máxima (contagens máximas por segundo, CPSmax) foi avaliada após a incubação das células alvo sem efetores e a luminescência mínima (CPSmin) foi avaliada após o tratamento de alvos com Triton-X-100 detergente para lise completa.

ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSPOT assay)

[0378] As placas de microtitulação (Millipore, Bedford, MA, EUA) foram revestidas durante a noite, à temperatura ambiente, com um anticorpo anti-IFNY 1-D1k (Mabtech, Stockholm, Suécia) e bloqueadas com 2% de albumina humana (CSL Behring, Marburg, Alemanha). 2-5x104 células estimulantes apresentadoras de antígeno/poço foram plaqueadas em triplicata juntamente com 0,3-3x105 células efetoras CD4+ ou CD8+ TCR-transfectadas/poço, 24 horas após a eletroporação. As placas foram incubadas durante a noite (37 °C, 5% de CO2), lavadas com 0,05% de Tween 20 em PBS e incubadas durante 2 horas com o mAB anti-IFNY biotinilado 7- B6-1 (Mabtech) em uma concentração final de 1 μg/mL a 37 °C. Peroxidase H de raiz forte ligada à avidina (Vectastain Elite Kit, Vector Laboratories, Burlingame, EUA) foi adicionada aos poços, incubada durante 1 hora à temperatura ambiente e desenvolvida com 3-amino-9-etil-carbazol (Sigma, Deisenhofen, Alemanha).

Exemplo 2: Isolamento de TCRs específicos para o antígeno viral CMV-pp65

[0379] O protocolo de isolamento/validação de TCR (Figura 2) foi estabelecido utilizando-se a fosfoproteína 65 de citomegalovírus (CMV) humano (CMV-pp65, pp65, fosfoproteína da matriz inferior de 65kDa, UL83) como um antígeno modelo, que é conhecido por induzir frequências elevadas de células T antígeno-específicas no sangue periférico de doadores saudáveis.

[0380] O CMV é um β-herpesvirus ubíquo que infecta o hospedeiro através de fluidos corporais, tais como sangue ou saliva. Em indivíduos saudáveis, a infecção primária por CMV e a reativação de vírus latentes endógenos é controlada pelo sistema imune, enquanto que, em indivíduos imunocomprometidos, tais como receptores de transplantes ou pacientes com AIDS, resulta em morbidez e mortalidade significativas.

[0381] A proteína viral do tegumento pp65 é um dos principais alvos de linfócitos T citotóxicos específicos de CMV que estão presentes em frequências elevadas no sangue periférico de indivíduos soropositivos não imunocomprometidos (Kern, F. e cols. (1999), J. Virol. 73, 8179-8184; Wills, M.R. e cols. (1996), J. Virol. 70, 75697579; Laughlin-Taylor, E. e cols. (1994), J. Med. Virol. 43, 103-110).

[0382] Células T CD8+ secretoras de IFNY específicas de CMV-pp65 de um doador soropositivo saudável foram isoladas por citometria de fluxo após uma semana de expansão antígeno- específica e reexposição com DCs autólogas transfectadas com RNA IVT que codifica todo o antígeno pp65 (parte superior da Figura 2, Figura 3).

[0383] Regiões variáveis α/β de TCR foram amplificadas a partir de células T individuais utilizando- se um conjunto de oligonucleotídeos específicos de sequências, parcialmente degenerados. Os produtos de amplificação foram clonados direto no sítio para os vetores que contêm as regiões constantes α/β de TCR que fornecem moldes de cadeia completa para transcrição in vitro instantânea (Figura 2, meio).

[0384] Para a verificação da expressão de superfície celular, RNAs α/β de TCR foram transferidos para células SupT1 que, de outra forma, carecem da expressão de cadeias de TCR endógeno, e analisados por citometria de fluxo (Figura 4).

[0385] Para a validação funcional dos TCRs clonados, a linhagem de células T monoespecíficas IVSB que reconhece o epítopo derivado de tirosinase Tyr368-376 (Wolfel T. e cols. (1994), Eur. J. Immunol. 24, 759-64) foi transfectada com RNa de TCR e analisada para a secreção específica de citocinas em resposta ao antígeno pp65 por IFNY—ELISPOT (parte inferior da Figura 2, Figura 5). Conforme os TCRs foram gerados por estímulo com o antígeno inteiro, eles foram avaliados quanto à mediação do reconhecimento específico de DCs autólogas pulsadas com pool de peptídeo de pp65 ou pp65 que codifica RNA IVT. Um pool de peptídeo de TPTE não relacionado foi utilizado como um controle. Ambos TCRCD8- CMV#1 e TCRCD8-CMV#4 reconheceram especificamente pp65 que expressa células alvo, em comparação com um TCR de controle isolado a partir de um doador soronegativo para CMV.

[0386] Para determinar o elemento de restrição de HLA, as células IVSB transfectadas com TCRCD8-CMV#1 foram analisadas para a secreção específica de IFNY, após a cocultura com células K562 pulsadas com peptídeo que expressam alelos de HLA selecionados do paciente (parte superior da Figura 6). HLA-B*3501 foi identificado como um elemento de restrição. A análise de 15 meros individuais do pool de peptídeo de pp65 revelou o reconhecimento dos peptídeos P30, P31 e P32, com reatividade gradualmente decrescente (parte inferior da Figura 6). Isto localizou o epítopo reconhecido por TCRCD8-CMV#1 dentro da região dos aminoácidos 117-131 de pp65, sugerindo a sua identidade com o epítopo restrito de HLA-B*3501 relatado anteriormente e altamente imunogênico CMV-pp65123-131 (Seq. IPSINVHHY) (Gavin, M.A. e cols. (1993), J. Immunol. 151, 3971-3980).

[0387] Após o isolamento bem sucedido de TCRs a partir de células T CD8+ pp65-específicas expandidas in vitro a uma frequência elevada, o protocolo de isolamento do TCR foi aplicado a células T classificadas ex vivo presentes em frequências menores.

[0388] Células T CD8+ magneticamente purificadas a partir de PBMCs de um doador positivo para HLA A*0201 foram estimuladas com células alvo autólogas pulsadas com o epítopo restrito de HLA A*0201 imunodominante pp65495-503 e células T secretoras de IFNY ativadas foram classificadas por citometria de fluxo.

[0389] A especificidade de TCRs obtidos ex vivo a partir de células T CD8+ após apresentação com pp65495-503 foi analisada em um ensaio de IFNY-ELISPOT. Conforme mostrado na Figura 7, quatro de seis TCRs foram capazes de redirecionar células IVSB para reconhecer células K562-A*0201 pulsadas com pp65495-503, em comparação com um peptídeo de controle. Em contraste, as células IVSB equipadas com um TCR de controle isolado a partir de um doador soronegativo para CMV não secretaram IFNY quando da cocultura com células K562-A*0201 pulsadas pp65495-503.

[0390] De forma a mostrar que TCRs pp65-específicos clonados também são capazes de mediar a função efetora citolítica, um ensaio de citotoxicidade baseado em luciferase foi realizado utilizando-se células IVSB transfectadas com TCRCD8-CMV#1 ou TCRCD8-CMV#14.

[0391] A morte específica de células alvo apropriadas (células K562-B*3501 pulsadas com pp65117-131 e células K562-A*0201 pulsadas com peptídeo pp65495-503, respectivamente) foi comparada com a morte de células K562- A*0201 pulsadas com Tyr368-376 mediada pelo TCR endógeno de efetores IVSB (Figura 8).

[0392] A titulação da razão efetora para alvo (E:T) confirmou que as células alvo pulsadas com o peptídeo pp65 apropriado foram especificamente lisadas por células IVSB TCR-transfectadas. Até 85% das células alvo foram destruídas por células IVSB transfectadas com TCRCD8-CMV#1 e TCRCD8- CMV#14, respectivamente. Notavelmente, os TCRs recombinantes mediaram a lise de modo igualmente eficiente ao TCR natural, em uma ampla faixa de razões E:T.

[0393] Em resumo, 13 TCRs hCMV-pp65-específicos foram isolados a partir de células T CD4+ e CD8+ obtidas a partir de quatro doadores diferentes soropositivos para CMV, seja ex vivo ou após a expansão antígeno-específica, conforme listado na Tabela 1.

Exemplo 3: Isolamento de TCRs específicos para o antígeno tumoral NY-ESO-1

[0394] Após a prova dos estudos de conceito utilizando-se CMV-pp65 como um modelo de antígeno viral que provoca altas frequências de células T antígeno-específicas, avaliou-se a capacidade de nossa abordagem para clonar TCRs a partir de populações de células T tumorais antígeno- específicas de baixa abundância. As frequências de células T preexistentes contra autoproteínas associadas a tumores são geralmente muito menores do que as frequências de células T provocadas por vírus persistentes. Para a aplicação do nosso método à configuração do tumor, recorreu-se ao antígeno tumoral altamente imunogênico NY-ESO-1.

[0395] O NY-ESO-1 é um antígeno do câncer de testículo expresso em tecidos de adultos normais exclusivamente nas células germinativas testiculares. NY- ESO-1 (sinônimos: CTG, CTAG, CTAG1, ESO1, LAGE-2, LAGE2, LAGE2A, LAGE2B, OTTHUMP00000026025, OTTHUMP00000026042) é um dos mais bem caracterizados antígenos do câncer de testículo identificado por SEREX (Chen, Y.T. e cols. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1914-1918), que é expresso em uma variedade de neoplasias malignas, incluindo melanomas, cânceres do esôfago, mama, próstata, trato urinário, ovário e pulmão (Chen, Y.T. e cols. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1914-1918; Jungbluth, A.A. e cols. (2001) Int. J. Cancer 92, 856-860; Schultz-Thater, E. e cols. (2000) Br. J. Cancer 83, 204-208). Devido à sua imunogenicidade natural, este é favorecido como um antígenos modelo para estratégias de vacinação tumorais. Frequentemente, o NY-ESO-1 provoca respostas de anticorpos de alto grau em pacientes portadores de NY-ESO-1 que expressa tumores e foi mostrado que as respostas de auto-anticorpos contra NY-ESO-1 são frequentemente associadas com a presença de células T CD8+ e CD4+ antígeno-específicas (Zeng, G. e cols. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3964-3969; Jager, E. e cols. (1998), J. Exp. Med. 187, 265-270; Gnjatic, S. e cols. (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 8862-8867; Valmori, D. e cols. (2007), Clin. Immunol. 122, 163-172).

[0396] Selecionou-se um paciente de NSCLC com base em sua reatividade de auto-anticorpo contra NY-ESO-1, suas PBMCs em massa foram pulsadas com pool de peptídeo de NY- ESO-1 e expandidas durante uma semana. Após a exposição a DCs transfectadas com RNA autólogo de NY-ESO-1, células T CD8+ secretoras de IFNY foram classificadas e TCRs foram clonados a partir de células individuais. A validação dos TCRs identificados para o reconhecimento específico de células alvo que expressam NY-ESO-1 por IFNy ELISPOT resultou em sete TCRs funcionais NY-ESO-1-específicos obtidos a partir deste paciente. Conforme mostrado na Figura 9, os TCRs reconheceram as DCs pulsadas com pool de peptídeo de NY-ESO-1 ou transfectadas com RNA de NY-ESO-1, o último confirmando o reconhecimento de um epítopo processado naturalmente.

[0397] Restrições de HLA de TCRs NY-ESO-1- específicos foram determinadas por IFNy-ELISPOT utilizando- se efetores IVSB TCR-transfectados cocultivados com células K562 que expressam alelos individuais de HLA de classe I do paciente e pulsadas com pool de peptídeo de NY-ESO-1. Um resultado representativo é mostrado na Figura 10.

[0398] Para o mapeamento de epítopos, células T IVSB foram transfectadas com TCRs NY-ESO-1-específicos e cocultivadas com células K562 que expressam o antígeno HLA apropriado pulsado com peptídeos individuais de 15 meros sobrepostos que abrangem a proteína NY-ESO-1. A reatividade de células T TCR-transfectadas contra os peptídeos de NY- ESO-1 foi testada em ensaios IFNY-ELISPOT (Figura 11).

[0399] Notavelmente, os epítopos de todos os sete TCRs foram localizados para os aminoácidos 85 a 111 da proteína NY-ESO-1 (Figuras 11, 12). Esta região é conhecida por submeter-se à clivagem proteossomal eficiente, devido às sequências hidrofóbicas, e é processada em múltiplos epítopos com várias restrições de HLA (Valmori, D. e cols. (2007), Clin. Immunol. 122, 163-172). Através do rastreio de nanômeros seriais, reduziu-se o epítopo restrito de HLA- B*3508 de TCRCD8-NY#5, #6, #8 e #15 para NY-ESO-192-100 (seq. LAMPFATPM) (Figura 12).

[0400] De forma a mostrar que os TCRs NY-ESO-1 específicos isolados a partir de células T CD8+ são capazes de mediar funções efetoras citolíticas, células IVSB transgênicas de TCR foram analisadas para a destruição específica de células K562-A*6801 pulsadas com peptídeo. Conforme mostrado na Figura 13, efetores IVSB foram reprogramados por TCRCD8-NY#2 para lisar especificamente células alvo em diferentes razões E:T.

[0401] A validação de TCRs isolados a partir de células T CD4+ de dois outros pacientes de NSCLC soropositivos resultou na clonagem de 9 TCRs funcionais independentes NY-ESO-1-específicos. A determinação de elementos de restrição (Figura 14) e o confinamento das localizações do epítopo (Figura 15) revelaram que 7 destes TCRs reconheceram epítopos em um trecho de peptídeo que compreende aa 117-147, no contexto de diferentes tipos de alelos de HLA de classe II, sugerindo um local de conflito para epítopos de células T auxiliares (Tabela 5).

[0402] Até agora, 16 TCRs NY-ESO-1-específicos foram clonados a partir de CD4+ e CD8+ derivadas de três pacientes de NSCLC diferentes e caracterizados em relação a restrição de HLA e especificidade de peptídeo (Tabela 2).

Exemplo 4: Isolamento de TCRs específicos para a TPTE de antígeno tumoral

[0403] TPTE (Fosfatase Transmembranar com homologia de Tensina; sinônimos: CT44, PTEN2, EC 3.1.3.48, OTTHUMP00000082790) é uma fosfatase de lípideo específica de células de esperma, que é anormalmente transcrita em muitos cânceres humanos (Chen, H. e cols. (1999), Hum. Genet. 105, 399-409; Dong, X.Y. e cols. (2003), Br. J. Cancer 89, 291297; Singh, A.P. e cols. (2008), Cancer Lett. 259, 28-38), mas pouco se sabe sobre a sua imunogenicidade e respostas de células T não tinham sido relatadas até agora.

[0404] De modo a isolar TCRs TPTE-específicos, 3 pacientes de NSCLC demonstrando valores de absorbância significativos no pré-rastreio por CrELISA foram selecionados para expansão antígeno-específica e classificação por citometria de fluxo de células T CD8+ e CD4+ TPTE-específicas.

[0405] TCRs isolados de células T CD8+ foram validados para o reconhecimento de células alvo que expressam TPTE e foram caracterizados em relação à restrição de HLA e à especificidade de epítopo, conforme mostrado de modo exemplificativo para TCRCD8TPT#3 na Figura 16. Este TCR demonstrou a reprogramação de células IVSB para o reconhecimento específico de células K562 que apresentam peptídeos de TPTE em HLA-B*3501 (Figura 16, parte superior). O epítopo restrito de HLA-B*3501 pode ser localizado para TPTE de 15 meros, P130, P131 e P132, com a maior reatividade para o peptídeo P131, que representa os aminoácidos 521-535 do TPTE (Figura 16, meio). Ao analisar os nanômeros seriais que cobrem esta região, o novo epítopo TPTE527-535 (seq. YPSDFAVEI) pode ser definido, o que está em conformidade com os requisitos de um motivo de ligação B*3501, com prolina como um resíduo de âncora na posição 2, ácido aspártico como um resíduo carregado na posição 4 e isoleucina como um aminoácido hidrofóbico na posição 9 (Falk, K. e cols. (1993), Immunogenetics 38, 161-162) (Figura 16, parte inferior).

[0406] Analogamente, os TCRs isolados de células T CD4+ foram validados para o reconhecimento específico de células K562 que expressam TPTE e alelos individuais de HLA de classe II do doador (Figura 17). Após a determinação das restrições de HLA, TCRs TPTE-específicos foram analisados para o reconhecimento de peptídeos de TPTE de 15 meros, a fim de localizar os epítopos reconhecidos (Figura 18).

[0407] Um total de 31 TCRs funcionais reativos a TPTE foram identificados até agora, a partir dos quais dois são derivados de células CD8+ e 29 são derivados de células T CD4+ de três pacientes de NSCLC diferentes (Tabela 3). O mapeamento fino de epítopos através da utilização de células alvo K562 que expressam um alelo de HLA pulsado com peptídeo único revelou que os epítopos foram distribuídos por toda a sequência de proteína TPTE (Tabela 5).

Exemplo 5: Isolamento de TCRs PLACl-específicos de alta afinidade a partir de células T de camundongos A2.1/DR1 imunizados

[0408] O gene trofoblasto-específico PLAC1 (PLACenta-specific 1, sinônimos: OTTHUMP00000024066; antígeno 92 de câncer/testículo) é um novo membro de genes placentários associados ao câncer (Koslowski M. e cols. (2007), Cancer Research 67, 9528-34). O PLAC1 é ectopicamente expresso em uma ampla gama de malignidades de humanos, mais frequentemente no câncer de mama, e é essencialmente envolvido na proliferação, migração e invasão de células cancerígenas.

[0409] De forma a obter TCRs específicos para PLAC1, alterou-se a fonte de células T antígeno-específicas. Uma vez que TCRs isolados do repertório natural de pacientes de câncer são geralmente de baixa afinidade devido a mecanismos centrais de tolerância, aplicou-se uma abordagem alternativa, ignorando-se a tolerância para gerar células T de alta afinidade específicas para PLAC1. As células T de de camundongos transgênicos HLA A2.1/DR1 (Pajot A. e cols. (2004), Eur. J. Immunol. 34, 3060-69) foram sensibilizados in vivo contra o antígeno de PLAC1 humano por imunização intranodal repetitiva, utilizando-se RNA IVT que codifica PLAC1 (Kreiter S. e cols. (2010), Cancer Research 70, 9031- 40). As células de baço obtidas destes camundongos foram reexpostas com peptídeos sobrepostos de PLAC1 após a detecção e o isolamento de células T antígeno-específicas, com base em sua regulação positiva de CD137 induzida por ativação (Figura 19). Notavelmente, em todos os cinco camundongos, uma porcentagem significativa de células T específicas para PLAC1 (variando de 16% a 48% de células CD8+) puderam ser estabelecidas pela imunização intranodal com RNA IVT de PLAC1.

[0410] Para a validação de TCRs clonados a partir de células T CD8+ de murinos, células IVSB geneticamente modificadas por TCR foram analisadas para a secreção específica de citocinas em resposta às células K562-A*0201 pulsadas com peptídeo de PLAC1 por IFNY-ELISPOT (Figura 20). Um total de 11 TCRs demonstraram mediar o reconhecimento específico de células K562-A*0201 pulsadas com peptídeos derivados a partir de PLAC1, em comparação com um antígeno de controle. Notavelmente, a secreção de IFNY mediada pelos TCRs PLAC1-específicos foi ainda mais elevada em comparação com aqueles que são mediados pelo TCR endógeno de efetores IVSB. O mapeamento de epítopos através da utilização de células alvo K562 que expressam alelos de HLA pulsados com um único peptídeo revelou que todas os TCRs PLAC1-específicos identificados reconhecem os peptídeos 7 e 8 de 15 meros que representam os aminoácidos 25-43 de PLAC1 (Figura 21). Através do rastreio de nanômeros seriais que cobrem esta região, foram identificados dois epítopos restritos de HLA- A*0201: aminoácidos 28 a 36 e aminoácidos 30 a 41 de PLAC1, com o melhor reconhecimento dos aminoácidos 31 a 39 (Figura 22, Tabela 5). Notavelmente, todos os TCRs PLAC1-específicos obtidos a partir de 4 camundongos diferentes demonstraram o reconhecimento destes dois epítopos, indicando o processamento preferencial destes peptídeos de PLAC1, bem como ligação e apresentação eficientes em HLA A*0201. Todos os TCRs mediados aumentaram a secreção de IFNY em resposta aos aminoácidos 31 a 39, em comparação com os aminoácidos 28 a 36. O último foi devidamente reconhecido por apenas alguns dos TCRs.

[0411] Através da clonagem de 11 TCRs PLAC1- específicos (Tabela 4) e da identificação de dois epítopos de PLAC1 imunodominantes que apresentam HLA-A*0201 (Tabela 5), foi possível mostrar que as células T de camundongos A2/DR1 sensibilizados in vivo através de vacinação intranodal com RNA IVT que codifica o antígeno são exploráveis como uma fonte para o isolamento de TCR.

Conclusão

[0412] Foi possível estabelecer uma plataforma tecnológica versátil para a clonagem eficiente e a rápida caracterização de TCRs imunologicamente relevantes a partir de pequenas populações de células T antígeno-específicas, sem a necessidade da geração de clones ou linhagens de células T e sem o conhecimento prévio de elementos de restrição ou epítopos de células T.

[0413] O uso desta abordagem de isolamento/validação de TCR para antígenos virais e tumorais resultou na descoberta de mais de 70 TCRs antígeno-específicos (Tabelas 1, 2, 3 e 4), a partir do que muito mais do que a metade foram dirigidos contra novos epítopos que apresentam HLA (Tabela 5).

[0414] Notavelmente, a partir de doadores individuais, várias especificidades de TCR derivadas de linfócitos T CD8+, bem como de linfócitos T CD4+, foram clonadas em paralelo e demonstraram que reprogramam efetores de células T para o reconhecimento do respectivo antígeno.

[0415] Esta abordagem permite a geração de uma grande biblioteca de TCRs de uma maneira oportuna "pronta para uso", preenchendo a lacuna entre a disponibilidade de uma grande quantidade de estruturas alvo e o pequeno número de candidatos de TCR adequados para as abordagens de terapia antígeno-específica no campo do câncer, da auto-imunidade e das doenças infecciosas. TABELAS Tabela 1: TCRs hCMV pp65-específicos

Tabela 2: TCRs NY-ESO-1 específicos

Tabela 3: TCRs TPTE-específicos

Tabela 4: TCRs PLAC1-específicos

a Designações dos genes V(D)J de TCR, de acordo com a nomenclatura IMGT; Exemplo: Vβ7.9 é o nono gene do subgrupo 7 do gene Vβ, enquanto que V7.9_3 é terceiro alelo do gene 9 do subgrupo 7. Os alelos são especificados apenas por um sublinhado, se eles diferem do alelo 1. b Designações dos alelos de HLA começam com HLA- e o nome do locus, em seguida, * e um número de dígitos que especificam o alelo. Os dois primeiros dígitos especificam um grupo de alelos. O terceiro e o quarto dígitos especificam um alelo sinônimo. O quinto e o sexto dígitos indicam quaisquer mutações de sinônimos dentro do quadro de codificação do gene. O sétimo e o oitavo dígitos distinguem mutações fora da região de codificação. c O gene beta do TCR é V12.4_1 ou V12.4_2 d O gene beta do TCR é V6.2 ou V6.3 e O gene alfa do TCR é V9D.1_1 ou V9D.1_2 f O gene alfa do TCR é J31_1 ou J31_2 g TCRs promíscuos que reconhecem mais do que um epítopo aa = aminoácidos Tabela 5: epítopos de células T derivados dos antígenos hCMV pp65, NY-ESO-1, TPTE, PLAC1

[0416] A seguir, são mostradas as sequências do receptor de células T obtidas. As sequências sublinhadas são as sequências de CDR, em que a primeira sequência em cada cadeia de receptor de células T é CDR1, seguido de CDR2 e CDR3.

1. Receptores de células T hCMV pp65-específicos TCRCD8-CMV#1:

[0417] SEQ ID NO: 4; > Vα1.2 J24_2 C (V -> A) MWGAFLLYVSMKMGGTTGQNIDQPTEMTATEGAIVQINCTYQTSGFNGLFWYQQ HAGEAPTFLSYNVLDGLEEKGRFSSFLSRSKGYSYLLLKELQMKDSASYLCAVADSWGK LQFGAGTQVVVTPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITD KTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFE TDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0418] SEQ ID NO: 5; > Vβ3.1 D2 J2.1 C2 (C -> T) MGTRLLCCVVFCLLQAGPLDTAVSQTPKYLVTQMGNDKSIKCEQNLGHDTMYWY KQDSKKFLKIMFSYNNKELIINETVPNRFSPKSPDKAHLNLHINSLELGDSAVYFCASS QEGLAGASNNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGF YPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFR CQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLG KATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD8-CMV#4:

[0419] SEQ ID NO: 6; > Vα3 J43 C MASAPISMLAMLFTLSGLRAQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFW YVQYPNRGLQFLLKYITGDNLVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVS ASNDMRFGAGTRLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDV YITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVE KSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0420] SEQ ID NO: 7; > Vβ6.5 D1 J1.2 C1 (S -> R) MRIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWY RQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASS PQTGASFNYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFF PDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRC QVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGK ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD8-CMV#8:

[0421] SEQ ID NO: 8; > Vα22 J58 C MKRILGALLGLLSAQVCCVRGIQVEQSPPDLILQEGANSTLRCNFSDSVNNLQW FHQNPWGQLINLFYIPSGTKQNGRLSATTVATERYSLLYISSSQTTDSGVYFCAVVRWE TSGSRLTFGEGTQLTVNPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSD VYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLV EKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0422] SEQ ID NO: 9; > Vβ10.1 D J1.4 C1 MGTRLFFYVAICLLWAGHRDAEITQSPRHKITETGRQVTLACHQTWNHNNMFWY RQDLGHGLRLIHYSYGVQDTNKGEVSDGYSVSRSNTEDLPLTLESAASSQTSVYFCASS DPTEEKLFFGSGTQLSVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHV ELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQF YGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLY AVLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD8-CMV#9:

[0423] SEQ ID NO: 10; > Vα19 J26 C MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYL FWYKQPPSGELVFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCA LSEGGSYGQNFVFGPGTRLSVLPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQ SKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSC DVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0424] SEQ ID NO: 11; > Vβ13 D2 J2.1 C2 (MLSLPDSAWN -> MG) MGTRLLCRVMLCLLGAGSVAAGVIQSPRHLIKEKRE TATLKCYPIPRHDTVYWY QQGPGQDPQFLISFYEKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYHSELNMSSLELGDSALYFCASS LRDEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVEL SWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYG LSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAV LVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD8-CMV#10:

[0425] SEQ ID NO: 12; > Vα24 J49 C MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYA LHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCA RNTGNQFYFGTGTSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDS DVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKL VEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0426] SEQ ID NO: 13; > Vβ6.5 D1 J1.2 C1 MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWY RQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCATQ LATGTNYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKAT LYAVLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD8-CMV#11:

[0427] SEQ ID NO: 14; > Vα16 J36 C MKPTLISVLVIIFILRGTRAQRVTQPEKLLSVFKGAPVELKCNYSYSGSPELFW YVQYSRQRLQLLLRHISRESIKGFTADLNKGETSFHLKKPFAQEEDSAMYYCALGWANN LFFGTGTRLTVIPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITD KTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFE TDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0428] SEQ ID NO: 15; > Vβ25.1 D1 J2.2 C2 (T -> G; M -> G) MGTRLLCYGGFYFLGAGLMEADIYQTPRYLVIGTGKKITLECSQTMGHDKMYWY QQDPGMELHLIHYSYGVNSTEKGDLSSESTVSRIRTEHFPLTLESARPSHTSQYLCAST EGTGHTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKAT LYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD8-CMV#12:

[0429] SEQ ID NO: 16; > Vα39 J58 C MKKLLAMILWLQLDRLSGELKVEQNPLFLSMQEGKNYTIYCNYSTTSDRLYWYR QDPGKSLESLFVLLSNGAVKQEGRLMASLDTKARLSTLHITAAVHDLSATYFCAVDIET SGSRLTFGEGTQLTVNPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDV YITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVE KSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0430] SEQ ID NO: 17; > Vβ9 D2 J2.2 C2 (F -> T) MGTRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWY QQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASS ALGGAGTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYP DHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKA TLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD8-CMV#14:

[0431] SEQ ID NO: 18; > Vα24 J21 C MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYA LHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCA FINFNKFYFGSGTKLNVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDS DVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKL VEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0432] SEQ ID NO: 19; > Vβ3.1 D2 J2.2 C2 (C -> T) MGTRLLCCVVFCLLQAGPLDTAVSQTPKYLVTQMGNDKSIKCEQNLGHDTMYWY KQDSKKFLKIMFSYNNKELIINETVPNRFSPKSPDKAHLNLHINSLELGDSAVYFCASS QVLGPGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDH VELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATL YAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD8-CMV#15:

[0433] SEQ ID NO: 20; > Vα12.3 J43 C MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQY FMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAM VNNNNDMRFGAGTRLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDS DVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKL VEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0434] SEQ ID NO: 21; > Vβ12.4 D1 J1.4 C1 MDSWTLCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWY RQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCAS SYGTYEKLFFGSGTQLSVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDH VELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATL YAVLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD8-CMV#16:

[0435] SEQ ID NO: 22; > Vα13.1_2 J50 C MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPW YKQELGKRPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAATY DKVIFGPGTSLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYI TDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKS FETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0436] SEQ ID NO: 23; > Vβ25.1 J1.3 C1 (TI -> GT) MGTRLLCYMGFYFLGAGLMEADIYQTPRYLVIGTGKKITLECSQTMGHDKMYWY QQDPGMELHLIHYSYGVNSTEKGDLSSESTVSRIRTEHFPLTLESARPSHTSQYLCASS ETSFSGNTIYFGEGSWLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKAT LYAVLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-CMV#1:

[0437] SEQ ID NO: 24; > Vα21 J43 C METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQW FRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVKD NDMRFGAGTRLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYI TDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKS FETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0438] SEQ ID NO: 25; > Vβ3.1 D1 J1.1 C1 (C -> T) MGTRLLCCVVFCLLQAGPLDTAVSQTPKYLVTQMGNDKSIKCEQNLGHDTMYWY KQDSKKFLKIMFSYNNKELIINETVPNRFSPKSPDKAHLNLHINSLELGDSAVYFCASS QEKRGAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVE LSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYA VLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-CMV#3:

[0439] SEQ ID NO: 26; > Vα8.6_2 J37_2 C MLLLLVPAFQVIFTLGGTRAQSVTQLDSQVPVFEEAPVELRCNYSSSVSVYLFW YVQYPNQGLQLLLKYLSGSTLVKGINGFEAEFNKSQTSFHLRKPSVHISDTAEYFCAVS SYGSSNTGKLIFGQGTTLQVKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS KDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCD VKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0440] SEQ ID NO: 27; > Vβ6.1 D1 J1.2 C1 (I -> L) MSLGLLCCVAFSLLWASPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHNSMYWY RQDPGMGLRLIYYSASEGTTDKGEVPNGYNVSRLNKREFSLRLESAAPSQTSVYFCASS TAGGRNYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKAT LYAVLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-CMV#5:

[0441] SEQ ID NO: 28; > Vα22 J49 C MKRILGALLGLLSAQVCCVRGIQVEQSPPDLILQEGANSTLRCNFSDSVNNLQW FHQNPWGQLINLFYIPSGTKQNGRLSATTVATERYSLLYISSSQTTDSGVYFCAAGSNT GNQFYFGTGTSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVY ITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEK SFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0442] SEQ ID NO: 29; > Vβ6.2 D2 J2.3 C2 (G -> A) MSLGLLCCAAFSLLWAGPVNAGVTQTPKFRVLKTGQSMTLLCAQDMNHEYMYWY RQDPGMGLRLIHYSVGEGTTAKGEVPDGYNVSRLKKQNFLLGLESAAPSQTSVYFCASS SRGYGTDTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKAT LYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

2. Receptores de células T NY-ESO-I-específicos TCRCD8-NY#2:

[0443] SEQ ID NO: 30; > Vα3 J28 C MASAPISMLAMLFTLSGLRAQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFW YVQYPNRGLQFLLKYITGDNLVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVR PLYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQ SKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSC DVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0444] SEQ ID NO: 31; > Vβ20.1_2 J2,3 C2 MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSRVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFP KQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSARNL PLTDTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVE LSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYA VLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD8-NY#5:

[0445] SEQ ID NO: 32; > Vα24 J3 C MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYA LHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCA STSYSSASKIIFGSGTRLSIRPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS KDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCD VKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0446] SEQ ID NO: 33; > Vβ7.6 D2 J2.2 C2 (S -> R) MGTRLLCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVTKRGQDVALRCDPISGHVSLYWY RQALGQGPEFLTYFNYEAQQDKSGLPNDRFSAERPEGSISTLTIQRTEQRDSAMYRCAS SHSSGGAGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYP DHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKA TLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD8-NY#6:

[0447] SEQ ID NO: 34; > Vα17 J47_2 C METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQW YRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDE YGNKLVFGAGTILRVKSYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDV YITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVE KSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0448] SEQ ID NO: 35; > Vβ12.3 D2 J2.1 C2 (F -> L) MDSWTLCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWY RQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCAS SYPGFNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDH VELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATL YAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD8-NY#8:

[0449] SEQ ID NO: 36; > Vα8.6_2 J9 C (A -> V) MLLLLVPVFQVIFTLGGTRAQSVTQLDSQVPVFEEAPVELRCNYSSSVSVYLFW YVQYPNQGLQLLLKYLSGSTLVKGINGFEAEFNKSQTSFHLRKPSVHISDTAEYFCAVS DQGTGGFKTIFGAGTRLFVKANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSK DSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDV KLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0450] SEQ ID NO: 37; > Vβ28.1 D1 J1.1 C1 MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWY RQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASR GTVTSSLMNTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGF FPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFR CQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLG KATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD8-NY#12:

[0451] SEQ ID NO: 38; > Vα1.1 J23 C MWGAFLLYVSMKMGGTAGQSLEQPSEVTAVEGAIVQINCTYQTSGFYGLSWYQQ HDGGAPTFLSYNALDGLEETGRFSSFLSRSDSYGYLLLQELQMKDSASYFCAVRDKQGG KLIFGQGTELSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYIT DKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0452] SEQ ID NO: 39; > Vβ4.1 D2 J2.1 C2 (C -> S) MGSRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWY KQKAKKPPELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASM GKRGGNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDH VELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATL YAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD8-NY#13:

[0453] SEQ ID NO: 40; > Vα5 J33 C MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLY WYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAER GQDSNYQLIWGAGTKLIIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKD SDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVK LVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0454] SEQ ID NO: 41; > Vβ5.5_2 D1 J2.5 C2 (PG -> TR; C -> F) MGTRLLFWVLLCLLGAGPVDAGVTQSPTHLIKTRGQHVTLRCSPISGHKSVSWY QQVLGQGPQFIFQYYEKEERGRGNFPDRFSARQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASS GWTGRS FGGGAQYFGPGTRLLVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGF YPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFR CQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLG KATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD8-NY#15:

[0455] SEQ ID NO: 42; > Vα12.2_2 J53 C (K -> I) MISLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSF FWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVP YYWSSGGSNYKLTFGKGTLLTVNPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVS QSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS CDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0456] SEQ ID NO: 43; > Vβ4.1 D2 J2.5 C2 (C -> S) MGSRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWY KQKAKKPPELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASS QSGLEETQYFGPGTRLLVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDH VELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATL YAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-NY#1:

[0457] SEQ ID NO: 44; > Vα22 J20 C (Doador SNP N -> K) MKRILGALLGLLSAQVCCVRGIQVEQSPPDLILQEGANSTLRCNFSDSVNNLQW FHQNPWGQLINLFYIPSGTKQNGRLSATTVATERYSLLYISSSQTTDSGVYFCAVNDYK LSFGAGTTVTVRANIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITD KTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFE TDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0458] SEQ ID NO: 45; > Vβ9 D1 J1.1 C1 (F -> T) MGTRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWY QQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASS PGVSGTTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKAT LYAVLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-NY#3:

[0459] SEQ ID NO: 46; > Vα12.3 J54 C MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQY FMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAM SKGAQKLVFGQGTRLTINPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDS DVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKL VEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0460] SEQ ID NO: 47; > Vβ11.2 D2 J2.2 C2 MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWY QQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCAS SLGDSNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYP DHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKA TLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-NY#5:

[0461] SEQ ID NO: 140; > Vα8.4_3 J48 C MLLLLVPVLEVIFTLGGTRAQSVTQLGSHVSVSEGALVLLRCNYSSSVPPYLFW YVQYPNQGLQLLLKYTTGATLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKPSAHMSDAAEYFCAVS RANFGNEKLTFGTGTRLTIIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSK DSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDV KLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0462] SEQ ID NO: 141; > Vβ4.1 D1 J1.5 C1 (GCKL -> SNQV) MSNQVLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWY KQKAKKPPELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASS QDPRGGPQHFGDGTRLSILEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDH VELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATL YAVLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-NY#7:

[0463] SEQ ID NO: 142; > Vα8.6_2 J13_2 C MLLLLVPAFQVIFTLGGTRAQSVTQLDSQVPVFEEAPVELRCNYSSSVSVYLFW YVQYPNQGLQLLLKYLSGSTLVKGINGFEAEFNKSQTSFHLRKPSVHISDTAEYFCAVS KSGGYQKVTFGTGTKLQVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKD SDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVK LVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0464] SEQ ID NO: 143; > Vβ20.1 D2 J2.5 C2 MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSWVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFP KQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSAAPG LAGGQGGSQYFGPGTRLLVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKAT LYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-NY#10:

[0465] SEQ ID NO: 144; > Vα9.2_3 J42 C MNYSPGLVSLILLLLGRTRGDSVTQMEGPVTLSEEAFLTINCTYTATGYPSLFW YVQYPGEGLQLLLKATKADDKGSNKGFEATYRKETTSFHLEKGSVQVSDSAVYFCARAV NYGGSQGNLIFGKGTKLSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSK DSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDV KLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0466] SEQ ID NO: 145; > Vβ7.9_3 D2 J2.7 C2 (S -> R) MGTRLLCWMALCLLGADHADTGVSQDPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWY RQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCAS SLGHEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVE LSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYA VLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-NY11:

[0467] SEQ ID NO: 146; > Vα8.1 J23 C MLLLLIPVLGMIFALRDARAQSVSQHNHHVILSEAASLELGCNYSYGGTVNLFW YVQYPGQHLQLLLKYFSGDPLVKGIKGFEAEFIKSKFSFNLRKPSVQWSDTAEYFCAVN RRTGNQGGKLIFGQGTELSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS KDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCD VKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0468] SEQ ID NO: 147; > Vβ11.2 D1 J1.2 C1 MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWY QQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCAS SLGPYIDGAGCTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFF PDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRC QVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGK ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-NY#13:

[0469] SEQ ID NO: 148; > Vα21_2 J24_2 C METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQW FRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVPT DSWGKLQFGAGTQVVVTPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSD VYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLV EKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0470] SEQ ID NO: 149; > Vβ7.9_3 D1 J2.3 C2 (S -> R) MGTRLLCWMALCLLGADHADTGVSQDPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWY RQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCAS SSKLTGIPEGTDTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLAT GFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNH FRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEIL LGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-NY#16:

[0471] SEQ ID NO: 150; > Vα8.4_3 J10 C MLLLLVPVLEVIFTLGGTRAQSVTQLGSHVSVSEGALVLLRCNYSSSVPPYLFW YVQYPNQGLQLLLKYTTGATLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKPSAHMSDAAEYFCAVK KGGGNKLTFGTGTQLKVELNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDS DVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKL VEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0472] SEQ ID NO: 151; > Vβ20.1 D1 J1.5 C1 MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSWVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFP KQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSATGP SEHQPQHFGDGTRLSILEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVE LSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYA VLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-NY#14:

[0473] SEQ ID NO: 176; > Vα8.4_3 J37_2 C MLLLLVPVLEVIFTLGGTRAQSVTQLGSHVSVSEGALVLLRCNYSSSVPPYLFWYVQYP NQGLQLLLKYTTGATLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKPSAHMSDAAEYFCAVSKGSSN TGKLIFGQGTTLQVKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVY ITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEK SFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0474] SEQ ID NO: 177; > Vβ3.1 D2 J1.3 C1 MGTRLLCCVVFCLLQAGPLDTAVSQTPKYLVTQMGNDKSIKCEQNLGHDTMYWY KQDSKKFLKIMFSYNNKELIINETVPNRFSPKSPDKAHLNLHINSLELGDSAVYFCASS QDPGGAGNTIYFGEGSWLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFP DHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKA TLYAVLVSALVLMAMVKRKDF*

3. Receptores de células T TPTE-específicos TCRCD8-TPT#3:

[0475] SEQ ID NO: 48; > Vα27 J16 C MVLKFSVSILWIQLAWVSTQLLEQSPQFLSIQEGENLTVYCNSSSVFSSLQWYR QEPGEGPVLLVTVVTGGEVKKLKRLTFQFGDARKDSSLHITAAQPGDTGLYLCAGAQGQ KLLFARGTMLKVDLNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYIT DKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0476] SEQ ID NO: 49; > Vβ7.9 D2 J2.2 C2 MGTRLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWY RQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCAS SHLAGGNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFY PDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRC QVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGK ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD8-TPT#35:

[0477] SEQ ID NO: 50; > Vα19 J17 C MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYL FWYKQPPSGELVFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCA LIEAAAGNKLTFGGGTRVLVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS KDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCD VKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0478] SEQ ID NO: 51; > Vβ12.4 D2 J2.7 C2 (L -> F) MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWY RQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCAG SLRLAGAAEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYP DHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKA TLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#4:

[0479] SEQ ID NO: 52; > Vα14/DV4 J48 C MSLSSLLKVVTASLWLGPGIAQKITQTQPGMFVQEKEAVTLDCTYDTSDPSYGL FWYKQPSSGEMIFLIYQGSYDQQNATEGRYSLNFQKARKSANLVISASQLGDSAMYFCA TASNFGNEKLTFGTGTRLTIIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS KDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCD VKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0480] SEQ ID NO: 53; > Vβ29.1 D1 J1.2 C1 MLSLLLLLLGLGSVFSAVISQKPSRDICQRGTSLTIQCQVDSQVTMMFWYRQQP GQSLTLIATANQGSEATYESGFVIDKFPISRPNLTFSTLTVSNMSPEDSSIYLCSVDRD REDGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVEL SWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYG LSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAV LVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-TPT#5:

[0481] SEQ ID NO: 54; > Vα38.2/DV8 J40 C MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYL FWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCA YSRTSGTYKYIFGTGTRLKVLANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS KDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCD VKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0482] SEQ ID NO: 55; > Vβ4.2 D2 J2.7 C2 (GCRL -> SNQV) MSNQVLCCAVLCLLGAVPMETGVTQTPRHLVMGMTNKKSLKCEQHLGHNAMYWY KQSAKKPLELMFVYNFKEQTENNSVPSRFSPECPNSSHLFLHLHTLQPEDSALYLCASS QEISGSSYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYP DHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKA TLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#6:

[0483] SEQ ID NO: 56; > Vα12.3 J35 C MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQY FMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAM SAVSFGNVLHCGSGTQVIVLPHIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSK DSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDV KLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0484] SEQ ID NO: 57; > Vβ5.4 D1 J1.3 C1 (PG -> TR) MGTRLLCWVLLCLLGAGSVETGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSSQSGHNTVSWY QQALGQGPQFIFQYYREEENGRGNFPPRFSGLQFPNYSSELNVNALELDDSALYLCASS FGENTIYFGEGSWLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVE LSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYA VLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-TPT#8:

[0485] SEQ ID NO: 58; > Vα38.1 J45 C MTRVSLLWAVVVSTCLESGMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSENNYYL FWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDTAMYFCA FMKHPSGGGADGLTFGKGTHLIIQPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNV SQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPES SCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0486] SEQ ID NO: 59; > Vβ3.1 D1 J2.7 C2 (C -> T) MGTRLLCCVVFCLLQAGPLDTAVSQTPKYLVTQMGNDKSIKCEQNLGHDTMYWY KQDSKKFLKIMFSYNNKELIINETVPNRFSPKSPDKAHLNLHINSLELGDSAVYFCASS HERGGAYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKAT LYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#11:

[0487] SEQ ID NO: 60; > Vα17 J27 C METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQW YRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCAGYN TNAGKSTFGDGTTLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSD VYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLV EKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0488] SEQ ID NO: 61; > Vβ6.6_2 D1 J2.3 C2 (IS -> LG) MSLGLLCCAAFPLLWAGPVNAGVTQTPKFRILKIGQSMTLQCAQDMNHNYMYWY RQDPGMGLKLIYYSVGAGITDKGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLELAAPSQTSVYFCASS FGQVWADTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKAT LYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#13:

[0489] SEQ ID NO: 62; > Vα20_2 J29 C MEKMLECAFIVLWLQLGWLSGEDQVTQSPEALRLQEGESSSLNCSYTVSGLRGL FWYRQHPGKGPEFLFTLYSAGEEKEKERLKATLTKKESFLHITAPKPEDSATYLCAVQA SNSGNTPLVFGKGTRLSVIANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKD SDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVK LVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0490] SEQ ID NO: 63; > Vβ19 D2 J2.1 C2 MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWY RQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS APHQRGTNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYP DHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKA TLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#17:

[0491] SEQ ID NO: 64; > Vα29/DV5 J49 C MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNS MFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAV YFCAASPNTGNQFYFGTGTSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNV SQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPES SCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0492] SEQ ID NO: 65; > Vβ7.2 D1 J2.7 C2 MGTRLLFWVAFCLLGADHTGAGVSQSPSNKVTEKGKDVELRCDPISGHTALYWY RQSLGQGLEFLIYFQGNSAPDKSGLPSDRFSAERTGGSVSTLTIQRTQQEDSAVYLCAS SLTGGPYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKAT LYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#27:

[0493] SEQ ID NO: 66; > Vα13.1_2 J45 C (Doador SNP N -> K) MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPW YKQELGKRPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAALY SGGGADGLTFGKGTHLIIQPYIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKD SDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVK LVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0494] SEQ ID NO: 67; > Vβ19 D1 J1.1 C1 MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWY RQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS IGGGVNTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKAT LYAVLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-TPT#33:

[0495] SEQ ID NO: 68; > Vα29/DV5 J42 C (Doador SNP N -> K) MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNS MFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAV YFCAARSYGGSQGNLIFGKGTKLSVKPNIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQT NVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSP ESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0496] SEQ ID NO: 69; > Vβ24.1 D2 J2.1 C2 MASLLFFCGAFHLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWY RQDPGLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATS DTGTSRNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKAT LYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#38:

[0497] SEQ ID NO: 70; > Vα39 J18 C (Doador SNP N -> K) MKKLLAMILWLQLDRLSGELKVEQNPLFLSMQEGKNYTIYCNYSTTSDRLYWYR QDPGKSLESLFVLLSNGAVKQEGRLMASLDTKARLSTLHITAAVHDLSATYFCAVGFRG STLGRLYFGRGTQLTVWPDIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSD VYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLV EKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0498] SEQ ID NO: 71; > Vβ5.5_2 D1 J1.4 C1 (PG -> TR) MGTRLLCWVLLCLLGAGPVDAGVTQSPTHLIKTRGQHVTLRCSPISGHKSVSWY QQVLGQGPQFIFQYYEKEERGRGNFPDRFSARQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASS WGQGNEKLFFGSGTQLSVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDH VELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATL YAVLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-TPT#42:

[0499] SEQ ID NO: 72; > Vα25 J10 C MLLITSMLVLWMQLSQVNGQQVMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSSTTLSNIQWYK QRPGGHPVFLIQLVKSGEVKKQKRLTFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTYFCAGSTGG GNKLTFGTGTQLKVELNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVY ITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEK SFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0500] SEQ ID NO: 73; > Vβ7.8 D2 J2.7 C2 (GTR -> DIW; L -> V) MDIWLVCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVAKRGQDVALRCDPISGHVSLFWY QQALGQGPEFLTYFQNEAQLDKSGLPSDRFFAERPEGSVSTLKIQRTQQEDSAVYLCAS SDFYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVE LSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYA VLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#45:

[0501] SEQ ID NO: 74; > Vα13.2 J23 C MAGIRALFMYLWLQLDWVSRGESVGLHLPTLSVQEGDNSIINCAYSNSASDYFI WYKQESGKGPQFIIDIRSNMDKRQGQRVTVLLNKTVKHLSLQIAATQPGDSAVYFCAET RQGGKLIFGQGTELSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSD VYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLV EKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0502] SEQ ID NO: 75; > Vβ20.1 D1 J1.2 C1 (ISLLLPGSLAG faltando o GPG seguinte) MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSWVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFP KQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSAPPG VTVRAYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDH VELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATL YAVLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-TPT#48:

[0503] SEQ ID NO: 76; > Vα38.2/DV8 J42 C MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYL FWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCA YRNYGGSQGNLIFGKGTKLSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQ SKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSC DVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0504] SEQ ID NO: 77; > Vβ28 D1 J1.1 C1 MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWY RQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASN RLNTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVE LSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYA VLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-TPT#49:

[0505] SEQ ID NO: 78; > Vα38.1 J49 C MTRVSLLWAVVVSTCLESGMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSENNYYL FWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDTAMYFCA FMKNTGNQFYFGTGTSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSK DSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDV KLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0506] SEQ ID NO: 79; > Vβ19 D2 J2.2 C2 MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWY RQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASR RLDGLGIGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYP DHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKA TLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#51:

[0507] SEQ ID NO: 80; > Vα13.1_2 J53 C MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPW YKQELGKRPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAALS GGSNYKLTFGKGTLLTVNPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDS DVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKL VEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0508] SEQ ID NO: 81; > Vβ14 D1 J1.1 C1 MVSRLLSLVSLCLLGAKHIEAGVTQFPSHSVIEKGQTVTLRCDPISGHDNLYWY RRVMGKEIKFLLHFVKESKQDESGMPNNRFLAERTGGTYSTLKVQPAELEDSGVYFCAS SQQENTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDH VELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATL YAVLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-TPT#52:

[0509] SEQ ID NO: 82; > Vα8.3 J54 C (MA Adicional) MAMLLELIPLLGIHFVLRTARAQSVTQPDIHITVSEGASLELRCNYSYGATPYL FWYVQSPGQGLQLLLKYFSGDTLVQGIKGFEAEFKRSQSSFNLRKPSVHWSDAAEYFCA VGAQGAQKLVFGQGTRLTINPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSK DSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDV KLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0510] SEQ ID NO: 83; > Vβ6.1 D2 J2.7 C2 (I -> L) MSLGLLCCVAFSLLWASPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHNSMYWY RQDPGMGLRLIYYSASEGTTDKGEVPNGYNVSRLNKREFSLRLESAAPSQTSVYFCASS EAGGSS FEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKAT LYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#54:

[0511] SEQ ID NO: 84; > Vα9.2 J23 C MNYSPGLVSLILLLLGRTRGNSVTQMEGPVTLSEEAFLTINCTYTATGYPSLFW YVQYPGEGLQLLLKATKADDKGSNKGFEATYRKETTSFHLEKGSVQVSDSAVYFCALGR GKLIFGQGTELSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYI TDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKS FETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0512] SEQ ID NO: 85; > Vβ20.1 D1 J1.1 C1 (ISLLLPGSLAG faltando o GPG seguinte) MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSWVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFP KQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSAVDS DLEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELS WWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGL SENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVL VSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-TPT#55:

[0513] SEQ ID NO: 86; > Vα38.2/DV8 J34 C MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYL FWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCA YRSAVYNTDKLIFGTGTRLQVFPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQ SKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSC DVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0514] SEQ ID NO: 87; > Vβ5.1 J2.1 C2 MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWY QQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASS FSSYNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHV ELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQF YGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLY AVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#57:

[0515] SEQ ID NO: 88; > Vα8.1 J27 C MLLLLIPVLGMIFALRDARAQSVSQHNHHVILSEAASLELGCNYSYGGTVNLFW YVQYPGQHLQLLLKYFSGDPLVKGIKGFEAEFIKSKFSFNLRKPSVQWSDTAEYFCAVN ARDNAGKSTFGDGTTLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKD SDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVK LVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0516] SEQ ID NO: 89; > Vβ5.1 D2 J2.7 C2 MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSySWY QQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASR GEPSSYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDH VELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATL YAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#59:

[0517] SEQ ID NO: 90; > Vα39 J49 C MKKLLAMILWLQLDRLSGELKVEQNPLFLSMQEGKNYTIYCNYSTTSDRLYWYR QDPGKSLESLFVLLSNGAVKQEGRLMASLDTKARLSTLHITAAVHDLSATYFCAVDNEF YFGTGTSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDK TVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFET DTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0518] SEQ ID NO: 91; > Vβ7.9_3 D2 J2.4 C2 (S -> R) MGTRLLCWMALCLLGADHADTGVSQDPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWY RQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCAS SLLGAGNIQYFGAGTRLSVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKAT LYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#67:

[0519] SEQ ID NO: 92; > Vα12.3 J9 C MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQY FMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAL YTGGFKTIFGAGTRLFVKANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDS DVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKL VEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0520] SEQ ID NO: 93; > Vβ5.1 D2 J2.7 C2 MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSySWY QQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASS FMGTEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVE LSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYA VLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#76:

[0521] SEQ ID NO: 94; > Vα8.3 J57 C MLLELIPLLGIHFVLRTARAQSVTQPDIHITVSEGASLELRCNYSYGATPYLFW YVQSPGQGLQLLLKYFSGDTLVQGIKGFEAEFKRSQSSFNLRKPSVHWSDAAEYFCAVG AFTRGGSEKLVFGKGMKLTVNPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS KDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCD VKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0522] SEQ ID NO: 95; > V19 D2_2 J2.7 C2 MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWY RQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCATG SYVGYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHV ELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQF YGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLY AVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#77:

[0523] SEQ ID NO: 96; > Vα14/DV4_3 J50 C MSLSSLLKVVTASLWLGPGIAQKITQTQPGMFVQEKEAVTLDCTYDTSDPSYGL FWYKQPSSGEMIFLIYQGSYDQQNATEGRYSLNFQKARKSANLVISASQLGDSAMYFCA MREGLAKTSYDKVIFGPGTSLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNV SQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPES SCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0524] SEQ ID NO: 97; > Vβ20.1 D2 J2.2 C2 (ISLLLPGSLAG faltando o GPG seguinte) MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSWVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFP KQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSAPGT GHSAGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHV ELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQF YGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLY AVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#78:

[0525] SEQ ID NO: 98; > Vα8.6_2 J21 C MLLLLVPAFQVIFTLGGTRAQSVTQLDSQVPVFEEAPVELRCNYSSSVSVYLFW YVQYPNQGLQLLLKYLSGSTLVKGINGFEAEFNKSQTSFHLRKPSVHISDTAEYFCAVG PNNFNKFYFGSGTKLNVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDS DVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKL VEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0526] SEQ ID NO: 99; > Vβ2 D1 J1.6_2 C1 (L -> I) MDIWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQTPSHQVTQMGQEVILRCVPISNHLYFYWY RQILGQKVEFLVSFYNNEISEKSEIFDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLEDSAMYFCAS SPVGGYNSPLHFGNGTRLTVTEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFP DHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKA TLYAVLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-TPT#79:

[0527] SEQ ID NO: 100; > Vα38.2/DV8 J39 C MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYL FWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCA YRSYNAGNMLTFGGGTRLMVKPHIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS KDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCD VKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0528] SEQ ID NO: 101; > Vβ5.1 D2 J2.1 C2 MGSRLLCLVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWY QQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASS DTSGGGGEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKAT LYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#82:

[0529] SEQ ID NO: 102; > Vα38.2/DV8 J39 C MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYL FWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCA YRSAGLLLTFGGGTRLMVKPHIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKD SDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVK LVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0530] SEQ ID NO: 103; > Vβ 19 D1 J2.7 C2 MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWY RQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASS KAPGQGNTQGWEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATG FYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHF RCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILL GKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#87:

[0531] SEQ ID NO: 104; > Vα39 J31 C MKKLLAMILWLQLDRLSGELKVEQNPLFLSMQEGKNYTIYCNYSTTSDRLYWYR QDPGKSLESLFVLLSNGAVKQEGRLMASLDTKARLSTLHITAAVHDLSATYFCAVDMWN NNARLMFGDGTQLVVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDV YITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVE KSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0532] SEQ ID NO: 105; > Vβ5.1 J2.6 C2 MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSySWY QQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASS LAQSGANVLTFGAGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKAT LYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD4-TPT#91:

[0533] SEQ ID NO: 106; > Vα20_2 J53 C MEKMLECAFIVLWLQLGWLSGEDQVTQSPEALRLQEGESSSLNCSYTVSGLRGL FWYRQDPGKGPEFLFTLYSAGEEKEKERLKATLTKKESFLHITAPKPEDSATYLCAVLG GSNYKLTFGKGTLLTVNPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSD VYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLV EKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0534] SEQ ID NO: 107; > Vβ6.1 D1 J2.7 C2 (I -> L) MSLGLLCCVAFSLLWASPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHNSMYWY RQDPGMGLRLIYYSASEGTTDKGEVPNGYNVSRLNKREFSLRLESAAPSQTSVYFCAIS RDSYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVE LSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYA VLVSALVLMAMVKRKDSRG*

TCRCD8-TPT#35/2:

[0535] SEQ ID NO: 188; > Vα19 J17 C MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYL FWYKQPPSGELVFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCA LIEAAAGNKLTFGGGTRVLVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS KDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCD VKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0536] SEQ ID NO: 189; > Vβ6.2 oder Vβ6.3 D1 J1.2 C1 (A -> V) MSLGLLCCGVFSLLWAGPVNAGVTQTPKFRVLKTGQSMTLLCAQDMNHEYMYWY RQDPGMGLRLIHYSVGEGTTAKGEVPDGYNVSRLKKQNFLLGLESAAPSQTSVYFCASS DGYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVEL SWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYG LSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAV LVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-TPT#9:

[0537] SEQ ID NO: 190; > Vα23/DV6 J49 C MDKILGASFLVLWLQLCWVSGQQKEKSDQQQVKQSPQSLIVQKGGISIINCAYE NTAFDYFPWYQQFPGKGPALLIAIRPDVSEKKEGRFTISFNKSAKQFSLHIMDSQPGDS ATYFCAASFYTGNQFYFGTGTSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQT NVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSP ESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0538] SEQ ID NO: 191; > Vβ3.1 D1 J1.2 C1 (C -> T) MGTRLLCCVVFCLLQAGPLDTAVSQTPKYLVTQMGNDKSIKCEQNLGHDTMYWY KQDSKKFLKIMFSYNNKELIINETVPNRFSPKSPDKAHLNLHINSLELGDSAVYFCASS QEALGGGYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFP DHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQ VQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKA TLYAVLVSALVLMAMVKRKDF*

TCRCD4-TPT#48/2:

[0539] SEQ ID NO: 192; > Vα8.3 J43 C (E -> V) MLLVLIPLLGIHFVLRTARAQSVTQPDIHITVSEGASLELRCNYSYGATPYLFW YVQSPGQGLQLLLKYFSGDTLVQGIKGFEAEFKRSQSSFNLRKPSVHWSDAAEYFCAVG AYDMRFGAGTRLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVY ITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEK SFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0540] SEQ ID NO: 193; > Vβ28 D1 J1.1 C1 MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWY RQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASN RLNTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVE LSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYA VLVSALVLMAMVKRKDF*

4. Receptores de células T PLACl-específicos TCRCD8-mPL#2:

[0541] SEQ ID NO: 152; > Vα6D.6_5 J33 C (DFS oder DSS -> NSF) MNSFPGFVAVILLILGRTHGDSVTQTEGQVTVSESKSLIINCTYSATSIGYPNL FWYVRYPGEGLQLLLKVITAGQKGSSRGFEATYNKEATSFHLQKASVQESDSAVYYCAL SDSNYQLIWGSGTKLIIKPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMES GTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKS FETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0542] SEQ ID NO: 153; > Vβ2 D1 J1.3 C1 MGSIFLSCLAVCLLVAGPVDPKIIQKPKYLVAVTGSEKILICEQYLGHNAMYWY RQSAKKPLEFMFSYSYQKLMDNQTASSRFQPQSSKKNHLDLQITALKPDDSATYFCASS PDNSGNTLYFGEGSRLIVVEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDH VELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGL SEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVL VSTLVVMAMVKRKNS*

TCRCD8-mPL#8:

[0543] SEQ ID NO: 154; > Vα9D.1_1 ou V9D.1_2 J12 C (L -> F) MLLVFISFLGIHFFLDVQTQTVSQSDAHVTVFEGDSVELRCNYSYGGSIYLSWY IQHHGRGLQFLLKYYSGNPVVQGVNGFKAEFSKSDSSFHLRKASVHWSDSAVYFCAVSA GGYKVVFGSGTRLLVSPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGT FITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFE TDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0544] SEQ ID NO: 155; > Vβ5 D2 J2.1 C2 MSCRLLLYVSLCLVETALMNTKITQSPRYLILGRANKSLECEQHLGHNAMYWYK QSAEKPPELMFLYNLKQLIRNETVPSRFIPECPDSSKLLLHISAVDPEDSAVYFCASSP GGAEQFFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVEL SWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEE DKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSG LVLMAMVKKKNS*

TCRCD8-mPL#9:

[0545] SEQ ID NO: 156; > Vα4D.4_2 J44 C (Q -> E) MERNLGAVLGILWVQICWVRGDQVEQSPSALSLHEGTGSALRCNFTTTMRAVQW FQQNSRGSLINLFYLASGTKENGRLKSTFNSKESYSTLHIRDAQLEDSGTYFCAAPFVT GSGGKLTLGAGTRLQVNLDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESG TFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSF ETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0546] SEQ ID NO: 157; > Vβ2 D2 J2.7 C2 MGSIFLSCLAVCLLVAGPVDPKIIQKPKYLVAVTGSEKILICEQYLGHNAMYWY RQSAKKPLEFMFSYSYQKLMDNQTASSRFQPQSSKKNHLDLQITALKPDDSATYFCASS QDGWGYEQYFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDH VELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGL SEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVL VSGLVLMAMVKKKNS*

TCRCD8-mPL#11:

[0547] SEQ ID NO: 158; > Vα6D.6_2 J9_2 C (DF -> NS) MNSSPGFVAVILLILGRTHGDSVTQTEGPVTVSESESLIINCTYSATSIAYPNL FWYVRYPGEGLQLLLKVITAGQKGSSRGFEATYNKETTSFHLQKASVQESDSAVYYCAL GLGYKLTFGTGTSLLVDPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESG TFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSF ETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0548] SEQ ID NO: 159; > Vβ2 D1 J1.3 C1 MGSIFLSCLAVCLLVAGPVDPKIIQKPKYLVAVTGSEKILICEQYLGHNAMYWY RQSAKKPLEFMFSYSYQKLMDNQTASSRFQPQSSKKNHLDLQITALKPDDSATYFCASS GDNSGNTLYFGEGSRLIVVEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDH VELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGL SEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVL VSTLVVMAMVKRKNS*

TCRCD8-mPL#12:

[0549] SEQ ID NO: 160; > Vα4D.4_2 J27 C (Q -> E) MERNLGAVLGILWVQICWVRGDQVEQSPSALSLHEGTGSALRCNFTTTMRAVQW FQQNSRGSLINLFYLASGTKENGRLKSTFNSKESYSTLHIRDAQLEDSGTYFCAAVNTN TGKLTFGDGTVLTVKPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTF ITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFET DMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0550] SEQ ID NO: 161; > Vβ30 D1 J2.2 C2 MWTFLLLLWSQGSVFSVLLYQKPNRDICQSGTSLKIQCVADSQVVSMFWYQQFQ EQSLMLMATANEGSEATYESGFTKDKFPISRPNLTFSTLTVNNARPGDSSIYFCSSRTP NTGQLYFGEGSKLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVEL SWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEE DKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSG LVLMAMVKKKNS*

TCRCD8-mPL#14:

[0551] SEQ ID NO: 162; > Vα9D.1_2 J12 C MLLVLISFLGIHFFLDVQTQTVSQSDAHVTVFEGDSVELRCNYSYGGSIYLSWY IQHHGHGLQFLLKYYSGNPVVQGVNGFEAEFSKSDSSFHLRKASVHWSDSAVYFCAVSS GGYKVVFGSGTRLLVSPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGT FITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFE TDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0552] SEQ ID NO: 163; > Vβ5 D1 J1.1 C1 MSCRLLLYVSLCLVETALMNTKITQSPRYLILGRANKSLECEQHLGHNAMYWYK QSAEKPPELMFLYNLKQLIRNETVPSRFIPECPDSSKLLLHISAVDPEDSAVYFCASSQ GGTEVFFGKGTRLTVVEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVEL SWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEE DKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVST LVVMAMVKRKNS*

TCRCD8-mPL#17:

[0553] SEQ ID NO: 164; > Vα14.1 J31_1 oder _2 C MDKILTATFLLLGLHLAGVNGQQQEKRDQQQVRQSPQSLTVWEGETAILNCSYE DSTFNYFPWYQQFPGEGPALLISIRSVSDKKEDGRFTIFFNKREKKLSLHITDSQPGDS ATYFCAPNNRIFFGDGTQLVVKPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPK TMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATL TEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0554] SEQ ID NO: 165; > Vβ13.2 D2 J2.1 C2 MGSRLFFVLSSLLCSKHMEAAVTQSPRNKVAVTGGKVTLSCNQTNNHNNMYWYR QDTGHGLRLIHYSYGAGSTEKGDIPDGYKASRPSQENFSLILELATPSQTSVYFCASLG YNYAEQFFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVE LSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSE EDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVS GLVLMAMVKKKNS*

TCRCD8-mPL#19:

[0555] SEQ ID NO: 166; > Vα6D.3 J22 C MNNSPALVTVMLFILGRTHGDSVIQMQGQVTLSENDFLFINCTYSTTGYPTLFW YVQYSGEGPQLLLQVTTANNKGSSRGFEATYDKGTTSFHLQKTSVQEIDSAVYYCAMSD ASGSWQLIFGSGTQLTVMPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMES GTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKS FETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0556] SEQ ID NO: 167; > Vβ13.3 D1 J1.6 C1 MGSRLFFVVLILLCAKHMEAAVTQSPRSKVAVTGGKVTLSCHQTNNHDYMYWYR QDTGHGLRLIHYSYVADSTEKGDIPDGYKASRPSQENFSLILELASLSQTAVYFCASSP DRPSYNSPLYFAAGTRLTVTEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPD HVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHG LSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAV LVSTLVVMAMVKRKNS*

TCRCD8-mPL#20:

[0557] SEQ ID NO: 168; > Vα12.3_3 J38 C MRPGTCSVLVLLLMLRRSNGDGDSVTQKEGLVTLTEGLPVMLNCTYQTIYSNAF LFWYVHYLNESPRLLLKSSTDNKRTEHQGFHATLHKSSSSFHLQKSSAQLSDSALYYCA LNNVGDNSKLIWGLGTSLVVNPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKT MESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLT EKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0558] SEQ ID NO: 169; > Vβ5 D2 J1.1 C1 MSCRLLLYVSLCLVETALMNTKITQSPRYLILGRANKSLECEQHLGHNAMYWYK QSAEKPPELMFLYNLKQLIRNETVPSRFIPECPDSSKLLLHISAVDPEDSAVYFCASSQ YGGANTEVFFGKGTRLTVVEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDH VELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGL SEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVL VSTLVVMAMVKRKNS*

TCRCD8-mPL#22:

[0559] SEQ ID NO: 170; > Vα 13D.2 J34_2 C (V -> L) MKRLLCSLLGLLCTQVCWVKGQQVQQSPASLVLQEGENAELQCNFSSTATRLQW FYQHPGGRLVSLFYNPSGTKHTGRLTSTTVTNERRSSLHISSSQTTDSGTYFCAAASNT NKVVFGTGTRLQVLPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFI TDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETD MNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0560] SEQ ID NO: 171; > Vβ20 D1 J2.1 C2 MLLLLLLLGPGCGLGALVYQYPRRTICKSGTSMRMECQAVGFQATSVAWYRQSP QKTFELIALSTVNSAIKYEQNFTQEKFPISHPNLSFSSMTVLNAYLEDRGLYLCGVDRA NYAEQFFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVEL SWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEE DKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSG LVLMAMVKKKNS*

TCRCD8-mPL#25:

[0561] SEQ ID NO: 194; > Vα8.1_3 J21 C MHSLLGLLLWLQLTRVNSQLAEENSWALSVHEGESVTVNCSYKTSITALQWYRQ KSGKGPAQLILIRSNEREKRNGRLRATLDTSSQSSSLSITATRCEDTAVYFCATDNVLY FGSGTKLTVEPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKT VLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLN FQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*

[0562] SEQ ID NO: 195; > Vβ31 D2 J2.1 C2 MLYSLLAFLLGMFLGVSAQTIHQWPVAEIKAVGSPLSLGCTIKGKSSPNLYWYW QATGGTLQQLFYSITVGQVESVVQLNLSASRPKDDQFILSTEKLLLSHSGFYLCAWKLG NYAEQFFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVEL SWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEE DKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSG LVLMAMVKKKNS*

Claims

1. Receptor de células T com especificidade para NY- ESO-1 caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma cadeia α do receptor de células T que compreende uma região hiper variável que compreende pelo menos a sequência de CDR3 da cadeia α do receptor de célula T de SEQ ID NO: 44, e (ii) uma cadeia β do receptor de células T que compreende uma região hiper variável que compreende pelo a sequência de CDR3 da cadeia β do receptor de células T de SEQ ID NO: 45, em que a região hiper variável compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 de um receptor de células T.

2. Receptor de células T, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de células T compreende: (i) uma cadeia α do receptor de células T que compreende a sequência da cadeia α do receptor de células T de SEQ ID NO: 44, e (ii) uma cadeia β do receptor de células T que compreende a sequência da cadeia β do receptor de células T de SEQ ID NO: 45.

3. Célula microbiana caracterizada pelo fato de que compreende a cadeia do receptor de células T ou o receptor de células T, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 2.

4. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais dos seguintes: (1) a célula, conforme definida na reivindicação 3; e (111) o receptor de células T, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 2.

5. Uso do receptor de células T conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, da célula conforme definida na reivindicação 3 ou da composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 4, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratamento de câncer que tem como característica a expressão de uma proteína que compreende a SEQ ID NO: 117.