CN110951690A - 抗原特异性t细胞受体和t细胞表位 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于提供抗原特异性淋巴样细胞的有效方法。这些淋巴样细胞可以用于提供具有确定的MHC限制性的抗原特异性T细胞受体和用于鉴定免疫相关T细胞表位。此外，本发明涉及抗原特异性T细胞受体和T细胞表位以及它们在免疫治疗中的用途。

Description

抗原特异性T细胞受体和T细胞表位
本申请是申请日为2011年9月19日、申请号为“201510647177.5”、发明名称为“抗原特异性T细胞受体和T细胞表位”的中国专利申请的分案申请，该母案申请是申请日为2011年9月19日、申请号为“201180045314.8”、发明名称为“抗原特异性T细胞受体和T细胞表位”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/EP2011/004674的中国国家阶段申请。
技术领域
本发明涉及可用于免疫治疗的T细胞受体和T细胞表位的提供。
背景技术
免疫系统的进化使得脊椎动物处于基于两种类型的防御(先天和获得性免疫)的高效网络中。
与依赖于不变受体(其识别与病原体相关的常见分子模式)的在进化上古老的先天免疫系统相比，获得性免疫基于B细胞(B淋巴细胞)和T细胞(T淋巴细胞)上的高度特异性抗原受体以及克隆选择。
B细胞通过分泌抗体引起体液免疫应答，而T细胞介导导致所识别细胞被破坏的细胞免疫应答。
T细胞在人和动物的细胞介导免疫中发挥核心作用。在T细胞表面上表达的T细胞受体(TCR)介导特定抗原的识别和结合。
T细胞的T细胞受体(TCR)能够与结合于主要组织相容性复合体(MHC)分子并且在靶细胞表面上呈递的免疫原性肽(表位)相互作用。TCR的特异性结合触发T细胞内的信号级联，导致增殖和分化成成熟的效应T细胞。为了能够靶向大量的多种抗原，T细胞受体需要具备极大的多样性。
通过编码TCR不同结构区域之基因的不同不连续区段的基因重排获得该多样性。TCR由一条α-链和一条β-链或者一条γ-链和一条δ链构成。TCRα/β链由参与抗原识别的N端高多态性可变区和不变的恒定区构成。在基因水平上，这些链被分成几个区，可变(V)区，多样(D)区(仅β-和δ-链)，结合(J)区和恒定(C)区。人β-链基因包含超过60个可变(V)，2个多样(D)，超过10个结合(J)区段和2个恒定区区段(C)。人α-链基因包含超过50个V区段，以及超过60个J区段但是没有D区段，以及一个C区段。鼠β-链基因包含超过30个可变(V)，2个多样(D)，超过10个结合(J)区段和2个恒定区区段(C)。鼠α-链基因包含几乎100个V区段，60个J区段，没有D区段，但有一个C区段。在T细胞分化过程中，通过重排一个V，一个D(仅β-和δ-链)，一个J和一个C区基因产生特异性T细胞受体基因。通过不精确的V-(D)-J重排进一步扩大TCR的多样性，在所述重排中随机核苷酸在重排位点被引入和/或缺失。由于TCR基因座重排发生在T细胞成熟过程中的基因组中，所以每个成熟T细胞仅表达一种特定的α/βTCR或γ/δTCR。
MHC和抗原结合是通过TCR的互补决定区1，2和3(CDR1，CDR2，CDR3)介导的。通过重排的TCRβ-链基因的V-D-J连结编码对于抗原识别和结合最关键的β-链CDR3。
TCR是复杂的信号转导装置的一部分，其包括TCRα-和β-链的异源二聚体复合物，辅助受体CD4或CD8以及CD3信号转导模块(CD3 signal transduction modul)(图1)。CD3链转移细胞内激活信号，而TCRα/β异源二聚体仅负责抗原识别。因此，TCRα/β链的转移为T细胞向任何的目的抗原重定向提供了机会。
免疫治疗
抗原特异性免疫治疗旨在提高或诱导患者体内的特异性免疫应答以控制感染性或恶性疾病。越来越多的病原体和肿瘤相关抗原(TAA)的鉴定产生了一大批用于免疫治疗的合适靶标。可通过主动或被动的免疫策略特异性靶向呈递源自这些抗原的免疫原性肽(表位)的细胞。
主动免疫倾向于诱导患者的抗原特异性T细胞并使其扩增，所述T细胞能够特异性识别和杀死病变细胞。相反，被动免疫依赖于T细胞的过继转移，其在体外被扩增并任选地进行遗传改造(过继T细胞治疗)。
疫苗接种
肿瘤疫苗旨在通过主动免疫诱导内源性肿瘤特异性免疫应答。可以用于肿瘤疫苗接种的不同抗原形式包括全癌细胞、蛋白质、肽或免疫载体(如RNA、DNA或病毒载体)，其可在体内直接施用或在体外通过致敏DC随后转移入患者。
鉴于免疫策略和抗原特异性免疫应答检测方法的改进，可鉴定治疗诱导之免疫应答的临床研究的数目正在稳定增长(Connerotte，T.等.(2008).Cancer Res.68，3931-3940；Schmitt，M.等.(2008)Blood 111，1357-1365；Speiser，D.E.等.(2008)Proc.Nail.Acad.Sci.U.S.A 105，3849-3854；Adams，S.等.(2008)J，Immunol.181，776-784)。
然而，在大多数情况下，检测到的免疫应答不完全与临床结果相关(Curigliano，G.等.(2006)Ann.Oncol.17，750-762；Rosenberg，S.A.等.(2004)Nat.Med.10，909-915)。
因此来自肿瘤抗原的肽表位的准确确定可有助于提高疫苗接种策略和免疫监测方法的特异性和效力。
过继细胞转移(Adoptive cell transfer，ACT)
基于ACT的免疫治疗可以被广义地定义为用先前致敏的T细胞进行的被动免疫形式，所述T细胞从低前体频次离体扩增至临床相关的细胞数后被转移至未免疫接受者或自体宿主。已被用于ACT实验的细胞类型是淋巴因子激活的杀伤(lymphokine-activatedkiller，LAK)细胞(Mule，J.J.et al.(1984)Science 225，1487-1489；Rosenberg，S.A.etal.(1985)N.Engl.J.Med.313，1485-1492)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocyte，TIL)(Rosenberg，S.A.et al.(1994)J.Nail.Cancer Inst.86，1159-1166)、造血干细胞移植(HSCT)后的供体淋巴细胞以及肿瘤特异性T细胞系或克隆(Dudley，M.E.etal.(2001)J.Immunother.24，363-373；Ye；C.et al.(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A 99，16168-16173)。
证明过继T细胞转移对人的病毒感染(如CMV)具有治疗活性。虽然健康个体的免疫系统控制CMV感染和内源潜伏病毒的再活化，但在免疫受损的个体(如移植接受者或AIDS患者)中导致显著的发病率和死亡率。Riddell和他的同事证明在转移来自HLA匹配的CMV血清阳性移植供体的CD8+CMV特异性T细胞克隆之后，在免疫抑制患者中通过过继T细胞治疗重建病毒免疫(Riddell，S.R.(1992)Science 257，238-241)。
作为一种替代方法，多克隆供体来源的CMV或EBV特异性T细胞类群被转移到移植接受者，导致转移T细胞的持久性的增加(Rooney，C.M.et al.(1998)Blood 92，1549-1555；Peggs，K.S.et al.(2003)Lancet 362，1375-1377)。
对于黑色素瘤的过继免疫治疗，Rosenberg和他的同事建立了一种ACT方法，其依赖于输注分离自切除肿瘤的体外扩增的自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)与非清髓性淋巴细胞删除性化学疗法和高剂量IL-2的组合。最近发表的临床研究的结果是治疗的转移性黑色素瘤患者有约50％的客观反应率(Dudley，M.E.et al.(2005)J.Chin.Oncol.23：2346-2357)。
然而，患者必须满足几个前提以适于ACT免疫治疗。他们必须具有可切除的肿瘤。肿瘤必须在细胞培养条件下生成有活力的TIL。TIL必须针对肿瘤抗原有反应性，并且必须在体外扩增至足够的数量。特别是在除黑色素瘤外的其他癌症中，难以获得这样的肿瘤反应性TIL。此外，正常人T淋巴细胞的反复体外刺激和克隆扩增导致端粒酶活性逐渐减少和端粒缩短，从而导致复制性衰老和转移T细胞持久能力的下降(Shen，X.et al.(2007)J.Immunother.30：123-129)。
克服ACT局限性的一种方法是自体T细胞的过继转移，所述T细胞在短时间的离体培养中被重新编程以表达具有确定特异性的肿瘤反应性TCR，然后回输到患者体内。这种策略使ACT适用于多种常见的恶性肿瘤，即使在患者体内缺乏肿瘤反应性T细胞时也适用。由于T细胞的抗原特异性完全依靠TCRα-和β-链的异源二聚体复合物，克隆的TCR基因向T细胞的转移提供了将它们重定向为任何目的抗原的潜力。因此，TCR基因治疗提供了具有吸引力的策略以开发用自体淋巴细胞作为治疗选择的抗原特异性免疫治疗。TCR基因转移的主要优点是在几天之内产生治疗量的抗原特异性T细胞，以及可以引入在患者的所有内源性TCR中不存在的特异性。
几个小组证实，TCR基因转移是重定向原发T细胞的抗原特异性的有吸引力的策略(Morgan，R.A.et al.(2003)J.Immunol.171，3287-3295；Cooper，L.J.et al.(2000)J.Virol.74，8207-8212；Fujio，K.et al.(2000)J.Immunol.165，528-532；Kessels，H.W.etal.(2001)Nat.Immunol.2，957-961；Dembic，Z.et al.(1986)Nature 320，232-238)。
Rosenberg和他的小组最近在恶性黑色素瘤治疗的临床试验证实了在人中进行TCR基因治疗的可行性。用黑色素瘤/黑色素细胞抗原特异性TCR进行逆转录病毒转导的自体淋巴细胞的过继转移导致在高达30％的所治疗黑色素瘤患者中癌症消退(Morgan，R.A.et al.(2006)Science 314，126-129；Johnson，L.A.etal.(2009)Blood 114，535-546)。
抗原特异性免疫治疗的靶结构
多个肿瘤相关抗原(TAA)的发现为抗原特异性免疫疗法的概念提供了基础(Novellino，L.et al.(2005)Cancer Immunol.Immunother.54，187-207)。由于遗传不稳定性，TAA是在肿瘤细胞上表达的不常见蛋白质，其在正常细胞中没有或有有限的表达。这些的TAA可以导致免疫系统特异性识别恶性细胞。
通过使用自体肿瘤特异性T细胞(van der Bruggen，P.et al.(1991)Science254，1643-1647)或循环抗体(Sabin，U.et al.(1995)Proc.Natl.Mad.Sci.U.S.A 92，11810-11813)筛选肿瘤衍生的cDNA表达文库进行TAA分子克隆、反向免疫学方法、生物化学方法(Hunt，D.F.et al.(1992)Science 256，1817-1820)、基因表达分析或用计算机进行的克隆策略(Heiftenbein，G.et al.(2008)Gene 414，76-84)产生了用于免疫治疗策略的显著数量的靶候选物。TAA分为几个类别，包括分化抗原，过表达的抗原，肿瘤特异性的剪接变体，突变基因的产物，病毒抗原和所谓的癌睾丸抗原(CTA)。由于其表达限于睾丸和多种不同的肿瘤实体，癌症睾丸家族是非常有前途的TAA类别(Scanlan，M.J.et al.(2002)Immunol.Rev，188，22-32)。至今为止，已经描述了超过50种CT基因(Scanlan，M.J.et al.(2004)Cancer Inimun.4，1)并且其中一些已在临床研究中使用(Adams，S.et al.(2008)J.Immunol.181，776-784；Atanackovic，D.et al.(2004)J.Immunol.172，3289-3296；Chen，Q.et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A 101，9363-9368；Connerotte，T.et al.(2008).Cancer Res.68，3931-3940；Davis，I.D.et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A101，10697-10702；Jager，E.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97，12198-12203；Marchand，M.et at.(1999)hit.J.Cancer 80，219-230；Schuler-Thurner，B.et al.(2000)J.Immunol.165，3492-3496)。
尽管用于免疫治疗方法的有吸引力的靶结构越来越多，但仅对于它们中的几个存在确定HLA限制性的T细胞克隆或系(Chaux，P.et al.(1999)J.Immunol.163，2928-2936；Zhang，Y.at al.(2002)Tissue Antigens 60，365-371；Zhao，Y.et al.(2005)J.Immunol.174，4415-4423)。对于大多数的CTA(包括TPTE)，即便连存在特异性T细胞应答的迹象都不存在。
发明内容
发明概述
免疫治疗策略是治疗感染性疾病和癌症的有前景选择。越来越多的病原体和肿瘤相关抗原的鉴定产生了用于免疫治疗的大量合适靶标。
通过过继转移经改造以表达确定抗原特异性T细胞受体(TCR)的T细胞，这些抗原可以被特异性靶向，从而导致所靶向的恶性或受感染细胞的选择性破坏。由于TCR特异性由高度多态性的MHC分子限制，过继TCR转移的广泛应用依赖于“现成(off the shelf)”使用的多种TCR试剂(覆盖宽范围的抗原和MHC限制性)的产生。然而，至今为止仅鉴定了有限数量的合适TCR候选物。这主要是由于用于TCR基因分离的T细胞克隆的建立费力。
本发明涉及用于提供抗原特异性淋巴样细胞的有效方法。这些淋巴样细胞可以用于提供具有确定的MHC限制性的抗原特异性T细胞受体，以及用于鉴定免疫相关T细胞表位。
一方面，本发明涉及用于提供抗原特异性淋巴样细胞的方法，其包括以下步骤：
(a)提供来自包含T细胞之样品的单一抗原反应性T细胞，其中所述样品从之前暴露于所述抗原的对象中获得；
(b)提供编码T细胞受体的核酸，所述T细胞受体具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性；以及
(c)将所述核酸引入淋巴样细胞以提供所述抗原特异性淋巴样细胞。
在一个实施方案中，该方法还包括确定所述抗原特异性淋巴样细胞的表位特异性的步骤和/或确定所述抗原特异性淋巴样细胞的MHC限制性的步骤。
另一方面，本发明涉及用于提供具有确定的MHC限制性的抗原特异性T细胞受体的方法，其包括以下步骤：
(a)提供来自包含T细胞之样品的单一抗原反应性T细胞，其中所述样品从之前暴露于所述抗原的对象中获得；
(b)提供编码T细胞受体的核酸，所述T细胞受体具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性；
(c)将所述核酸引入淋巴样细胞以提供抗原特异性淋巴样细胞；以及
(d)确定所述抗原特异性淋巴样细胞的MHC限制性。
在一个实施方案中，该方法还包括确定所述抗原特异性淋巴样细胞的表位特异性的步骤。
另一方面，本发明涉及用于鉴定抗原中的T细胞表位的方法，其包括以下步骤：
(a)提供来自包含T细胞之样品的单一抗原反应性T细胞，其中所述样品从之前暴露于所述抗原的对象中获得；
(b)提供编码T细胞受体的核酸，所述T细胞受体具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性；
(c)将所述核酸引入淋巴样细胞以提供抗原特异性淋巴样细胞；以及
(d)确定所述抗原特异性淋巴样细胞的表位特异性。
在一个实施方案中，该方法还包括确定所述抗原特异性淋巴样细胞的MHC限制性的步骤。
在一个优选的实施方案中，所述单一抗原反应性T细胞和所述编码T细胞受体(其具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性)的核酸对施用给对象的抗原有反应性。在一个优选的实施方案中，所述单一抗原反应性T细胞通过分离提供。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述表位是MHC呈递的肽。在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述确定所述抗原特异性淋巴样细胞的表位特异性的步骤包括：确定所述抗原特异性淋巴样细胞对MHC分子的反应性，所述MHC分子暴露于(优选致敏(pulse)，即装载)来自所述抗原的肽。优选地，所述MHC分子是在对象中表达的MHC分子。优选地，所述MHC分子存在于靶细胞上。所述肽可以是源于所述抗原的肽文库的一部分，并且肽文库可以包含来自所述抗原的一组重叠肽。优选地，所述重叠肽的组覆盖该抗原的完整序列。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，确定所述抗原特异性淋巴细胞的MHC限制性的步骤包括：确定所述抗原特异性淋巴样细胞对选定MHC分子的反应性。优选地，所述选定MHC分子存在于靶细胞上。优选地，所述选定MHC分子是在对象中表达的MHC分子。优选地，所述选定MHC分子存在于表达所述抗原或其一部分的靶细胞上。优选地，所述抗原特异性淋巴样细胞或其T细胞受体受在对象中表达的MHC分子的限制。
优选地，确定抗原特异性淋巴样细胞的反应性包括确定淋巴样细胞的细胞因子分泌，其中所述细胞因子可以是干扰素-γ(IFNγ)。可以使用的另一些活化标志物是例如CD154和/或CD137。
在根据上述所有方面的方法的一个特别优选实施方案中，所述编码T细胞受体(其具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性)的核酸是RNA(优选体外转录的RNA)。优选地，所述淋巴样细胞缺乏内源性TCR的表面表达或者对不相关抗原特异。在一个实施方案中，淋巴样细胞是淋巴细胞，优选T细胞。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述提供编码T细胞受体(其具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性)的核酸的步骤包括提供编码这样的T细胞受体的核酸，其包含所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的至少CDR序列、优选至少可变区。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述提供编码T细胞受体(其具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性)的核酸的步骤包括从所述单一抗原反应性T细胞或其克隆群中分离RNA(优选多聚A+-RNA)，并且优选还包括从所述RNA获得cDNA。在一个实施方案中，所述提供编码T细胞受体(其具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性)的核酸的步骤还包括扩增cDNA的至少一部分，所述部分包含编码至少CDR序列(优选至少所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的可变区)的核酸序列。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述对象对所述抗原或包含所述抗原的物质(agent)呈血清学阳性。对象的血清学阳性可通过测定对抗原或物质或其组分的免疫应答来确定。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，在提供单一抗原反应性T细胞之前对所述T细胞进行抗原特异性扩增和再攻击(rechallenge)，其中抗原特异性扩增和再攻击可以通过将T细胞暴露于优选呈递抗原之自体抗原呈递细胞来实现。在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述单一抗原反应性T细胞为活化标志物(如IFNγ或CD137和CD8或CD4)阳性。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述单一抗原反应性T细胞使用流式细胞术从包含T细胞的样品中分离。分选优选根据对于活化标志物(尤其IFNγ或CD137，和CD8或CD4)呈阳性而进行。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述T细胞受体包含T细胞受体α-和β-链。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述编码T细胞受体(其具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性)的核酸包含编码至少CDR序列(优选至少所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的可变区)的核酸序列。
在根据上述所有方面的方法的一个实施方案中，所述对象是哺乳动物，优选人。优选地，所述对象具有涉及表达抗原的细胞的疾病，优选T细胞相关疾病。所述疾病可以选自免疫系统疾病、感染和恶性疾病。
此外，本发明涉及对病毒抗原CMV-pp65或肿瘤相关抗原NY-ESO-1、TPTE或PLAC1(尤其是在呈递于细胞如病变细胞或抗原呈递细胞表面上时)特异的T细胞受体，以及包含被这些T细胞受体识别的表位的肽。
一方面，本发明涉及包含以下氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：108至139，172，173，175，178至187和196或者所述氨基酸序列的变体。
在一个实施方案中，所述肽是MHC I类或II类呈递肽，优选MHC I类呈递肽，或者，如果存在于细胞内，所述肽可以被加工产生其加工产物，所述加工产物是MHC I类或II类呈递肽，优选MHC I类呈递肽。优选地，所述MHC I类或II类呈递肽具有基本上对应于给定氨基酸序列(即选自SEQ ID NO：108至139，172，173，175，178至187和196或者所述氨基酸序列变体的氨基酸序列)的序列。优选地，本发明所述的肽能够刺激针对这样的疾病的细胞应答，所述疾病涉及特征为呈递肽所源自的抗原(即具有MHC I类的CMV-pp65、NY-ESO-1、TPTE或PLAC1)的细胞。
另一方面，本发明涉及编码本发明肽的核酸以及包含该核酸的细胞。该核酸可以存在于质粒或表达载体中并且可以与启动子功能性连接。优选地，所述细胞表达所述肽。所述细胞可以是重组细胞并且可分泌编码的肽或其加工产物，可在表面表达它并且优选地可以额外表达MHC分子，该MHC分子结合所述肽或其加工产物并且优选地在细胞表面上呈递所述肽或其加工产物。在一个实施方案中，所述细胞内源性表达MHC分子。在另一个实施方案中，所述细胞以重组方式表达MHC分子和/或所述肽。所述细胞优选是非增殖性的。在一个优选的实施方案中，所述细胞是抗原呈递细胞，尤其是树突细胞，单核细胞或巨噬细胞。
另一方面，本发明涉及呈递本发明肽或其加工产物的细胞，其中该加工产物优选是具有给定氨基酸序列(即选自SEQ ID NO：108至139，172，173，175，178至187和196或者所述氨基酸序列变体的氨基酸序列)的肽。该细胞可通过其表面的MHC分子呈递所述肽或其加工产物。在一个实施方案中，所述细胞内源性表达MHC分子。在另一个实施方案中，所述细胞重组表达MHC分子。在一个实施方案中，通过向细胞添加肽使细胞的MHC分子加载(致敏)所述肽。所述细胞可以重组表达所述肽并且在细胞表面呈递所述肽或其加工产物。所述细胞优选是非增殖性的。在一个优选的实施方案中，所述细胞是抗原呈递细胞，例如树突细胞，单核细胞或巨噬细胞。
另一方面，本发明涉及对本发明的肽有反应性的免疫反应性细胞，尤其是当所述肽在细胞表面上呈递时。所述免疫反应性细胞可以是已在体外致敏以识别所述肽的细胞。所述免疫反应性细胞可以是T细胞，优选细胞毒性T细胞。优选地，所述免疫反应性细胞结合基本对应于给定氨基酸序列(即选自SEQ ID NO：108至139，172，173，175，178至187和196或者所述氨基酸序列的变体的氨基酸序列)的肽中的序列。
另一方面，本发明涉及对本发明的肽或其多肽链有反应性的T细胞受体。
另一方面，本发明涉及T细胞受体α-链或包含所述T细胞受体α-链的T细胞受体，所述T细胞受体α-链包含选自SEQ ID NO：4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，176，188，190，192和194或其变体的T细胞受体α-链的至少一个、优选两个、更优选全部三个CDR序列。CDR序列在本文给出的上述T细胞受体α-链序列中用下划线显示。
另一方面，本发明涉及T细胞受体α-链或包含所述T细胞受体α-链的T细胞受体，其中所述T细胞受体α-链序列选自SEQ ID NO：4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，176，188，190，192和194或其变体。
另一方面，本发明涉及T细胞受体β-链或包含所述T细胞受体β-链的T细胞受体，所述T细胞受体β-链包含选自SEQ ID NO：5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，163，165，167，169，171，177，189，191，193，和195或其变体的T细胞受体β-链的至少一个、优选两个、更优选全部三个CDR序列。CDR序列在本文给出的上述T细胞受体β-链序列中用下划线显示。
另一方面，本发明涉及T细胞受体β-链或包含所述T细胞受体β-链的T细胞受体，所述T细胞受体β-链序列选自SEQ ID NO：5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，163，165，167，169，171，177，189，191，193和195或其变体。
另一方面，本发明涉及T细胞受体，其包含：
(i)T细胞受体α-链，其包含SEQ ID NO：x或其变体的T细胞受体α-链的至少一个、优选两个、更优选全部三个CDR序列，和
(ii)T细胞受体β-链，其包含SEQ ID NO：X+1或其变体的T细胞受体β-链的至少一个、优选两个、更优选全部三个CDR序列；其中X选自4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，3040，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，176，188，190，192和194。
另一方面，本发明涉及T细胞受体，其包含：
(i)T细胞受体α-链，其包含SEQ ID NO：x或其变体的T细胞受体α-链序列，以及
(ii)T细胞受体β-链，其包含SEQ ID NO：X+1或其变体的T细胞受体β-链序列；
其中X选自4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，176，188，190，192和194。
上述T细胞受体优选对病毒抗原CMV-pp65或肿瘤相关抗原NY-ESO-1、TPTE或PLAC1(尤其当它们呈递于细胞(如病变细胞或抗原呈递细胞)表面时)具有特异性。
另一方面，本发明涉及编码根据上述任一方面的T细胞受体链或T细胞受体的核酸。
另一方面，本发明涉及包含根据上述任一方面的T细胞受体链或T细胞受体或者编码根据上述任一方面之T细胞受体链或T细胞受体的核酸的细胞。所述细胞可以是效应细胞或干细胞，优选是免疫反应性细胞。所述免疫反应性细胞可以是T细胞，优选是细胞毒性T细胞。优选地，所述免疫反应性细胞与病毒抗原CMV-pp65或肿瘤相关抗原NY-ESO-1、TPTE或PLAC1(尤其是当它们呈递在细胞(如病变细胞或抗原呈递细胞)表面上存在时)有反应性，特别是对本发明的肽有反应性并且优选与基本上对应于给定氨基酸序列(即选自SEQ IDNO：108至139，172，173，175，178至187和196的氨基酸序列或者所述氨基酸序列的变体)的肽中的序列结合。
另外，本发明一般地包括通过靶向病变细胞治疗疾病。所述方法提供了对呈递抗原(即病毒抗原CMV-pp65或肿瘤相关抗原NY-ESO-1、TPTE或PLAC1)的细胞的选择性消除，从而将对不呈递所述抗原的正常细胞的不良影响降到最低。因此，治疗的优选疾病是表达和呈递本文所述抗原之一的疾病，例如病毒感染性疾病或恶性疾病，特别是病毒疾病和癌症疾病，例如在本文中描述的那些。
一方面，本发明涉及药物组合物，其包含以下一种或更多种：
(i)上述的肽；
(ii)上述编码肽的核酸或编码T细胞受体链或T细胞受体的核酸；
(iii)上述包含编码肽的核酸的细胞，上述呈递肽或其加工产物的细胞，或者上述包含T细胞受体链或T细胞受体或核酸的细胞；
(iv)上述T细胞受体；或者
(v)上述免疫反应性细胞。
本发明的药物组合物可以包含可药用载体并且可任选地包含一种或更多种佐剂，稳定剂等。该药物组合物可以为治疗或预防性疫苗的形式。在一个实施方案中，所述药物组合物用于治疗或预防本文所述的病毒疾病(如hCMV感染)或恶性疾病。
施用上述药物组合物可提供MHC II类呈递表位，其能够引发针对本文所述抗原的CD4+辅助T细胞应答和/或CD8+ T细胞应答。作为替代的或另外的，施用如上所述的药物组合物可提供MHC I类呈递表位，其能够引发针对本文所述的肿瘤抗原的CD8+ T细胞应答。
在一个实施方案中，相关的抗原是hCMV-pp65，并且本发明的药物组合物可用于治疗和/或预防hCMV感染。
在一个实施方案中，相关的抗原是NY-ESO-1、TPTE或PLAC1，并且本发明的药物组合物可用于治疗和/或预防恶性疾病。
另一方面涉及在对象中诱导免疫应答的方法，其包括向所述对象施用本发明的药物组合物。
另一方面涉及用于刺激，引发(priming)和/或扩增T细胞的方法，其包括将T细胞与以下的一种或更多种接触
(i)上述肽；
(ii)上述编码肽的核酸；以及
(iii)上述包含编码肽的核酸的细胞或者上述呈递肽或其加工产物的细胞。
在这方面，本发明可涉及用于制备抗原特异性T细胞的方法。所述T细胞可以在体外或体内被刺激，引发和/或扩增。优选地，所述T细胞存在于从对象获得的样品中。被刺激，引发和/或扩增的T细胞可以向对象施用并且对于对象可以是自体(autologous)、异体(allogeneic)、同基因(syngeneic)的。
用于在对象中诱导免疫应答的方法或者用于刺激，引发和/或扩增T细胞的方法的本发明上述方面可以涉及用于治疗对象的hCMV感染或恶性疾病的方法。
在一个实施方案中，相关抗原是hCMV-pp65并且所述治疗是对hCMV感染的治疗或预防性治疗。
在一个实施方案中，相关抗原是NY-ESO-1、TPTE或PLAC1并且所述治疗是对恶性疾病的治疗或预防性治疗。在治疗恶性疾病的情况下，本文所述的物质(agent)和组合物优选这样的方式施用，其使得治疗活性物质不或基本上不被递送到这样的组织或器官，其中的细胞在所述组织或器官(尤其是睾丸组织)没有恶性疾病时表达本文所述的肿瘤相关抗原。为此，本文所描述的物质和组合物可以局部施用。
本文所述的组合物和物质优选能够诱导或促进针对以下疾病的细胞应答(优选细胞毒性T细胞活性)，所述疾病的特征为以MHC I类呈递本文所述的抗原，例如病毒性疾病或恶性疾病。
一方面，本发明提供了用于本文所述治疗方法的本文所述的物质和组合物。
本文所述的恶性疾病的治疗可与手术切除和/或放射和/或传统的化学治疗相联合。
另一方面，本发明涉及确定对象中免疫应答的方法，其包括在从所述对象分离的生物样品中测定T细胞与上述肽或者上述呈递肽或加工产物之细胞的反应性。所述方法可包括以下步骤：
(a)用以下的一种或更多种孵育包含分离自对象之T细胞的样品：
(i)上述肽；
(ii)上述编码肽的核酸；以及
(iii)上述包含编码肽的核酸的细胞或上述呈递肽或加工产物的细胞；以及
(b)检测所述T细胞的特异性活化，由此确定所述对象中免疫应答的存在或不存在。
用于确定对象中免疫应答的方法的本发明上述方面可以涉及用于在对象中诊断hCMV感染或恶性疾病的方法。
在一个实施方案中，相关抗原是hCMV-pp65并且诊断是对hCMV感染的诊断。
在一个实施方案中，相关抗原是NY-ESO-1、TPTE或PLAC1并且诊断是对恶性疾病的诊断。
在所述诊断方法的一个实施方案中，所述生物样品来自这样的组织或器官，其中的细胞在组织或器官没有疾病时基本上不表达所述相关抗原。
通常，将生物样品中的T细胞水平与参照水平进行比较，其中与所述参照水平的偏离指示对象中疾病的存在和/或阶段。所述参照水平可以是在对照样品(例如，来自正常的组织或对象)中确定的水平或者可以是来自正常对象的中值水平。与所述参照水平的“偏离”表示任何显著的变化，例如增加至少10％，20％或30％，优选至少40％或50％，或者甚至更高。优选地，所述生物样品中T细胞的存在或与参照水平相比所述生物样品中T细胞的量升高指示疾病的存在。
T细胞可以从患者的外周血，淋巴结，组织样品(如来自活检和切除)或其他来源中分离。反应性测定可在原代T细胞或其他适当的衍生物上进行。例如，可以融合T细胞以产生杂交瘤。用于测量T细胞应答性的测定在本领域中是已知的，并且包括增殖测定和细胞因子释放测定。
用于检测反应性T细胞的测定和指标包括但不限于使用IFNγELISPOT和IFNγ细胞内细胞因子染色。用于确定T细胞克隆是否应答于特定肽的多种其他方法在本领域中是已知的。通常，将肽添加到T细胞悬液中一到三天的时间。可以通过增殖(例如经标记胸苷的摄取)来衡量T细胞的应答，或通过细胞因子的释放，例如IL-2。可获得检测所释放细胞因子的存在的多种测定。T细胞细胞毒性测定可用于检测具有抗原特异性的细胞毒性T细胞。在一个实施方案中，测试细胞毒性T细胞杀伤用MHC I类分子呈递抗原之靶细胞的能力。可以标记呈递抗原的靶细胞，并将其加入到来自患者样品的T细胞悬液中。可以通过对从裂解细胞释放的标记物进行定量来测量细胞毒性。在该测定中可包括对自发释放和总释放的对照。
另一方面，本发明提供了非放射性测定以监测和量化杀伤靶细胞的活性(例如通过细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导)。该测定可以提供对细胞毒性效应细胞活性的测量，并可以可靠地检测靶细胞的抗原特异性CTL杀伤。该测定为最常用于量化CTL应答的标准51Cr-释放测定提供了更安全的替代方式。该测定可用于研究不同细胞品系的原代宿主靶细胞的CTL介导杀伤，并为新疫苗和免疫疗法的开发提供有价值的工具。
本发明涉及用于测定细胞毒活性的方法，其包括如下步骤：
(i)提供包含产生报告酶之靶细胞的样品；
(ii)使所述靶细胞经受待测定其细胞毒活性的物质；以及
(iii)对所述样品进行检测测定以建立所述样品的有活力细胞中包含的报告酶水平。
优选地，所述细胞毒活性是细胞介导的细胞毒活性，并且待测定其细胞毒活性的物质是细胞毒性效应细胞，例如选自细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞的细胞，优选细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在一个实施方案中，所述报告酶是ATP依赖的。在一个实施方案中，所述报告酶是发光酶，如产生光的酶。优选地，所述报告酶是萤光素酶。在一个实施方案中，编码所述报告酶的RNA被引入所述靶细胞。所述方法还可以包括这样的步骤：向样品中添加ATP降解酶(如ATP酶)以基本上降解样品中的任何细胞外ATP。该方法还可以包括添加至少可部分渗透有活力细胞的底物的步骤。所述底物可以是发光分子并且可以是萤光素衍生物。在这个实施方案中，该方法可以包括检测样品的发光，由此检测样品中有活力细胞的数目或存在。
本发明的另一些特征和优点通过下面的详细描述和权利要求将显而易见。
发明详述
虽然在下面详细描述本发明，但是应当理解的是，本发明并不限于本文所描述的特定方法，方案和物质，因为它们可会有所变化。还应当理解的是，本文使用的术语仅以描述特定实施方案为目的，并不是为了限制本发明的范围，其仅由所附权利要求限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。
在下文中，将描述本发明的要素。这些要素是通过特定的实施方案列出的，然而应当理解的是它们可以以任何方式和任何数目组合以创建另外的实施方案。不同描述的实施例和优选的实施方案不应该被解释为仅将本发明限制到明确描述的实施方案。此描述应被理解为支持和包括结合了具有任何数量公开和/或优选元素的明确描述的实施方式的实施方案。此外，除非文中另有说明，否则应当认为任何在本申请中所有描述的元素的排列和组合是本申请说明书所披露的。
优选地，本文使用的术语如A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel，and H.
Figure BSA0000192479990000161
编，(1995)Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland.所描述的进行定义。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域文献(参见例如MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版，J.Sambrook等编，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor 1989)中所解释的生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”应当理解为意指包括所述的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或者成员、整数或步骤的组，虽然在一些实施方案中，这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组可被排除，即该主题由所述的成员、整数或步骤或成员、整数或步骤的组组成。除非本文另有指明或者与上下文明显相矛盾，否则描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)不使用数量词修饰时解释为包括单数和复数。本文列举的数值的范围仅意在充当单独指代落入该范围内的每个独立数值的快捷方法。除非本文另有指明，每个单独的值均如同在在本文中被单独涉及一样而被并入本说明书中。
提及SEQ ID NO：108-139时应当理解为单独指SEQ ID NO：108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138和139中的每一个。
类似地，提及SEQ ID NO：178-187时应当理解为单独指SEQ ID NO：178，179，180，181，182，183，184，185，186和187中的每一个。
除非本文另有说明或由上下文明显矛盾，否则本文所描述的所有方法均可以以任何适当的顺序执行。本文所提供的任何和所有实施例，或示例性语言(例如，“例如”)的使用，其目的仅是为了更好地说明本发明，并不构成本发明范围的限制(由权利要求限制)。在本说明书中没有语言应当解释为表示任何未要求权利的元素对本发明的实现是必须的。
本说明书的整个文件中引用了几篇文献。本文引用的每篇文献(包括所有专利，专利申请，科学出版物，制造商说明，说明书，等等)(无论上文或下文)均通过整体引用并入本文。本文中任何信息均不应解释为承认本发明无权通过在先发明而早于这些公开。
本发明上下文中的术语“重组”是指“通过基因改造”。优选地，“重组物质”(如本发明上下文中的重组细胞)不是天然的。
本文使用的术语“天然”指的是物质可以在自然界被发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从天然来源中分离且没有在实验室中被人有意改造的肽或核酸是天然的。
术语“免疫应答”指的是对抗原的综合身体应答，优选指细胞免疫应答或细胞和体液免疫应答。免疫应答可以是保护性/防止性/预防性和/或治疗性的。
“诱导免疫应答”可指在诱导前对特定抗原没有免疫应答，但它也可指在诱导前针对特定抗原有一定水平的免疫应答，并且在诱导后所述免疫应答得到增强。因此，“诱导免疫应答”也包括“增强免疫应答”。优选地，在对象中诱导免疫应答之后，所述对象被保护免于发生疾病(如感染性疾病，尤其是如本文公开的病毒病，或者恶性疾病)或者通过诱导免疫应答使疾病状态得到改善。例如，对病毒抗原(如hCMV-pp65)的免疫应答可以在患有病毒性疾病的患者中或者在具有发生病毒性疾病风险的对象中被诱导。例如，对肿瘤相关性抗原(如NY-ESO-1、TPTE或PLAC1)的免疫应答可以在患有恶性疾病的患者中或者在具有发生恶性疾病风险的对象中被诱导。在这种情况下，诱导免疫应答可意味着对象的疾病状态得到改善，对象没有发生转移，或者具有发生恶性疾病风险的对象没有发生恶性疾病。
“细胞免疫应答”、“细胞应答”、“针对抗原的细胞应答”或者类似的术语意于包括与特征为用I类或II类MHC呈递抗原的细胞有关的细胞应答。细胞应答涉及称为T细胞或T-淋巴细胞的细胞，其作为‘辅助者’或‘杀伤者’。辅助T细胞(也被称为CD4+ T细胞)通过调节免疫应答发挥核心作用，杀伤细胞(也被称为细胞毒性T细胞，细胞裂解性T细胞，CD8+T细胞或CTL)杀伤病变细胞(如感染细胞或恶性细胞)，防止产生更多的病变细胞。
术语“抗原”涉及包含针对其产生免疫应答的表位的物质。优选地，本发明上下文中的抗原是分子，该分子任选地在加工后诱导优选对该抗原为特异性的免疫反应。术语“抗原”特别包括蛋白质，肽，多糖，核酸(尤其是RNA和DNA)以及核苷酸。
优选地，抗原是对应于或来自于天然的抗原的产物。该天然抗原可包括或者可来自于过敏原、病毒、细菌、真菌、寄生虫和其它感染性物质和病原体，或者抗原也可以是肿瘤相关抗原。根据本发明，抗原可以对应天然产物，例如，病毒蛋白或其一部分。
术语“包含抗原的物质(agent)”涉及包含抗原的实体(如包含病毒性抗原的病毒)。一个实例是包含hCMV-pp65的hCMV。
在一个优选的实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原，即可以来自细胞质、细胞表面和细胞核的恶性细胞成分，尤其是在细胞内或作为表面抗原在恶性细胞上生成(优选大量的)的抗原。
特别地，抗原或其肽应可被T细胞受体识别。优选地，如果T细胞受体识别抗原或肽，则在适当的共刺激信号存在的情况下，其能够诱导携带特异性识别所述抗原或肽之T细胞受体的T细胞的克隆扩增。在本发明一些实施方案的上下文中，抗原优选在MHC分子的环境下由细胞(优选通过抗原呈递细胞和/或病变细胞)呈递，其导致针对该抗原的免疫反应。
在本发明的上下文中，术语“肿瘤相关抗原”或“肿瘤抗原”涉及这样的蛋白质，其在正常条件下在有限数量的组织和/或器官中特异性表达或在特定的发育阶段表达特异表达(例如，肿瘤相关抗原可在正常条件下在胃组织中(优选在胃粘膜中)、在生殖器官中(例如，在睾丸中)、在滋养层组织(例如，在胎盘)或在生殖系细胞中特异性表达)，并且在一种或更多种肿瘤或癌组织中表达或异常表达。在此上下文中，“有限数量”优选是指不超过3，更优选不超过2。本发明的上下文中的肿瘤相关抗原包括，例如，分化抗原，优选细胞类型特异性分化抗原，即在正常条件下在一定分化阶段的某些细胞类型中特异性表达的蛋白质；癌症/睾丸抗原，即在正常情况下在睾丸以及有时在胎盘中特异性表达的蛋白质；和生殖系特异性抗原。在本发明的上下文中，该肿瘤相关抗原优选与恶性细胞的细胞表面相关联，并且优选在正常组织中没有或只有极少的表达。优选地，肿瘤相关抗原或肿瘤相关抗原的异常表达鉴定恶性细胞。在本发明的上下文中，对象的恶性细胞表达的肿瘤相关抗原(例如，患有恶性疾病的患者)优选是所述对象的自身蛋白质。在一些优选的实施方案中，本发明上下文中的肿瘤相关抗原在正常条件下在非必需的组织或器官中(即当被免疫系统损伤时不导致对象死亡的组织或器官，或者免疫系统不可及或难以触及的身体器官或结构)特异性表达。优选地，在正常组织中表达的肿瘤相关抗原与在恶性组织中表达的肿瘤相关抗原之间，肿瘤相关抗原的氨基酸序列是相同的。优选地，肿瘤相关抗原由表达该抗原的恶性细胞呈递。
在一些优选的实施方案中，抗原是病毒抗原(如hCMV-pp65)并且本发明涉及针对表达该病毒抗原(且优选用I类MHC呈递该病毒抗原)之感染细胞的CTL应答的刺激。
巨细胞病毒属于疱疹病毒组的疱疹病毒属。在人中，它通常被称为hCMV或人疱疹病毒5(HHV-5)。所有疱疹病毒都具有在体内保持长时间潜伏的特征性能力。
虽然它们可在整个身体中被发现，但hCMV感染经常与唾液腺相关。hCMV感染对于免疫缺陷患者也可危及生命(如，艾滋病患者，器官移植接受者，或新生儿)。其他CMV病毒在一些哺乳动物物种中被发现，但是从动物中分离的类型在基因组结构方面与hCMV不同，并且尚没有引起人疾病的报道。
hCMV在所有地理位置和社会经济群体中被发现，并且如大量一般人群中抗体的存在所指示的，其在美国感染50％至80％的成年人(全球40％)。hCMV也是最频繁传递到发育中胎儿的病毒。hCMV感染在发展中国家和社会经济地位较低的社区更为广泛，并且在工业化国家代表引起出生缺陷的最重要病毒。
磷蛋白65(pp65；CMV-pp65)和立即早期蛋白-1(IE-1)这两种CMV蛋白是细胞免疫应答的主要靶标。
术语“hCMV-pp65”优选涉及包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列或者所述氨基酸序列的变体的蛋白质。
根据本发明的多个方面涉及hCMV-pp65(尤其是SEQ ID NO：1)，hCMV-pp65的表位序列(尤其是SEQ ID NO：108-110)或者对hCMV-pp65特异的T细胞受体序列(尤其是SEQ IDNO：4-29)时，目的优选是诱导或确定针对hCMV或被hCMV感染且优选特征为呈递hCMV-PP65的靶细胞的免疫应答，以及诊断、治疗或预防hCMV感染。优选地，所述免疫应答包括刺激针对表达hCMV-PP65并优选用I类MHC呈递hCMV-PP65之感染细胞的抗hCMV-PP65CTL应答。
在一些优选的实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原(如NY-ESO-1、TPTE或PLAC1)并且本发明包括刺激针对表达该肿瘤相关抗原且优选用I类MHC呈递该肿瘤相关抗原之恶性细胞的抗肿瘤CTL应答。
NY-ESO-1是仅在正常成年人的睾丸生殖细胞的正常成体组织中以及多种癌症中表达的癌症/睾丸抗原。其在具有表达NY-ESO-1之癌症的患者中诱导特异性体液和细胞免疫。
术语“NY-ESO-1”优选涉及人NY-ESO-1，并且尤其涉及包含根据序列表SEQ ID NO：2的氨基酸序列或者所述氨基酸序列的变体的蛋白质。
根据本发明的多个方面涉及NY-ESO-1(特别是SEQ ID NO：2)，NY-ESO-1的表位序列(特别是SEQ ID NO：111-117和175)或对NY-ESO-1特异的T细胞受体序列(特别是SEQ IDNO：30-47，140-151，176和177)时，目的优选是诱导或确定针对表达NY-ESO-1且优选特征为呈递NY-ESO-1的恶性细胞的免疫应答，诊断、治疗或预防涉及表达NY-ESO-1的细胞的恶性疾病。优选地，所述免疫应答包括刺激针对表达NY-ESO-1且优选用I类MHC呈递NY-ESO-1之恶性细胞的抗NY-ESO-1CTL应答。
术语“TPTE”涉及“具有张力蛋白同源性的跨膜磷酸酶(″transmembranephosphatase with tensin homology)”。术语“TPTE”优选涉及人TPTE，并且特别涉及包含根据序列表SEQ ID NO：3的氨基酸序列或者所述氨基酸序列的变体的蛋白质。
TPTE在健康组织中的表达仅限于睾丸并且在所有其它正常组织标本中转录量在检测限以下。相反，在不同癌症类型(包括恶性黑色素瘤，乳癌，肺癌，前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌，肾细胞癌和宫颈癌)中发现TPTE的表达。
TPTE的转录在癌症相关的DNA低甲基化的恶性转化过程中启动。此外，TPTE促进癌症发展和癌细胞的转移性扩散。特别地，TPTE对于有效的趋化至关重要，所述趋化是参与癌症发展的多个方面(包括癌症侵袭和转移)的过程并且对癌症细胞的归巢和转移目的地有影响。原发肿瘤中TPTE的表达与显著更高的转移性疾病发病率相关。
根据本发明的多个方面涉及TPTE(特别是SEQ ID NO：3)，TPTE的表位序列(特别是SEQ ID NO：118-139和178-187)或对TPTE特异的T细胞受体序列(特别是SEQ ID NO：48-107和188-193)时，目的优选是诱导或确定针对表达TPTE且优选特征为呈递TPTE的恶性细胞的免疫应答，以及诊断、治疗或预防涉及表达TPTE的细胞的恶性疾病。优选地，所述免疫应答包括刺激针对表达TPTE且优选用I类MHC呈递TPTE之恶性细胞的抗TPTE CTL应答。
术语“PLAC1”涉及“胎盘特异性蛋白1”。术语“PLAC1”优选涉及人PLAC1，并且特别涉及包含根据序列表SEQ ID NO：174的氨基酸序列或者所述氨基酸序列的变体的蛋白质。
PLAC1是胎盘特异性基因，其经常在多种肿瘤类型中异常活化和高表达。PLAC1表达已在例如乳癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，前列腺癌，胰脏癌，肾细胞癌，肝癌，肉瘤，甲状腺癌以及头颈癌中发现。PLAC1在82％的乳癌患者中表达。关于肺癌和胃癌，PLAC1分别在42％和58％的病例中表达。
在MCF-7和BT-549乳癌细胞中进行的RNAi介导的PLAC1沉默显著削弱运动、迁移和侵袭并且诱导几乎完全消除增殖的G1/S细胞周期阻滞。敲低PLAC1与细胞周期蛋白D1的表达减少以及AKT激酶磷酸化的降低有关。PLAC1不仅参与细胞增殖，而且参与细胞运动，迁移和侵袭。
根据本发明的多个方面涉及PLAC1(特别是SEQ ID NO：174)，PLAC1的表位序列(特别是SEQ ID NO：172，173和196)，或对PLAC1特异的T细胞受体序列(特别是SEQ ID NO：152-171，194和195)时，目的优选是诱导或确定针对表达PLAC1且优选特征为呈递PLAC1的恶性细胞的免疫应答，以及诊断、治疗或预防涉及表达PLAC1的细胞的恶性疾病。优选地，所述免疫应答包括刺激针对表达PLAC1且优选用I类MHC呈递PLAC1之恶性细胞的抗PLAC1 CTL应答。
上述抗原序列包括所述序列的任何变体，特别是突变体，剪接变体，构象，同工型，等位基因变异体，物种变体和物种同源物，特别是天然的那些。等位基因变体涉及基因正常序列中的改变，其重要性通常是不清楚的。完整基因测序经常鉴定出给定基因的多个等位基因变体。物种同源物是与给定的核酸或氨基酸序列有不同来源物种的核酸或氨基酸序列。术语“CMV-pp65”，“NY-ESO-1”，“TPTE”和“PLAC1”应涵盖(i)剪接变体，(ii)翻译后修饰变体，特别是包括具有不同糖基化的变体，如N-糖基化状态，(iii)构象变体，以及(iv)疾病相关的和非疾病相关变体。优选地，“CMV-pp65”，“NY-ESO-1”，“TPTE”或“PLAC1”以其天然构象存在。
“靶细胞”是指作为免疫应答(如细胞免疫应答)靶标的细胞。靶细胞包括存在抗原或抗原表位(即源于抗原的肽片段)的细胞，并且包括任何不期望的细胞如如上所述的病毒感染细胞或恶性细胞。在一些优选的实施方案中，靶细胞是表达本文所述抗原并优选用I类MHC呈递所述抗原的细胞。
术语“之前暴露于抗原的对象”是指对象(例如人)预先与抗原接触，并优选对抗原和/或包含该抗原的物质呈血清阳性。这种血清阳性可通过在对象中测定针对抗原或包含该抗原的物质或抗原以外的所述物质的成分(例如另一抗原)的免疫应答来确定。所述免疫应答的确定优选包括确定抗体应答，例如lgG应答。
术语“表位”是指在分子(如抗原)中的抗原决定簇，即，是指免疫系统识别(例如由T细胞识别，特别是在MHC分子的环境中呈递时)的分子的一部分或片段。蛋白质(例如肿瘤相关抗原或病毒抗原)的表位优选包含所述蛋白质的连续或不连续部分，且优选长度为5至100，优选5至50，更优选8至30，最优选10至25个氨基酸，例如，所述表位的长度可优选为9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或25个氨基酸。特别优选地，本发明上下文中的表位是T细胞表位。
术语“表位”，“抗原片段”，“抗原肽”和“肽”在本文中可互换使用，并优选涉及抗原的不完整呈现，其优选能够引发针对抗原或者表达或包含且优选呈递抗原的细胞的免疫应答。优选地，该术语涉及抗原的免疫原性部分。优选地，它是被T细胞受体识别(即，特异性结合)的抗原的一部分(特别是如果在MHC分子的环境中呈递)。某些优选的免疫原性部分结合至MHC I类或II类分子。如本文所使用的，如果使用本领域中已知的任何测定可检测到结合，则认为免疫原性部分“结合”到MHC I或II类分子。
优选地，包含选自SEQ ID NO：108至139，172，173，175，178至187和196或所述氨基酸序列的变体的本文公开的抗原肽能够刺激免疫应答，优选针对其所源自的抗原或特征为表达该抗原以及优选特征为呈递该抗原的细胞的细胞应答。优选地，抗原肽能够刺激针对特征为用I类MHC呈递抗原之细胞的细胞应答，并且优选能够刺激抗原响应性CTL。优选地，根据本发明的抗原肽是MHCI类和/或II类呈递的肽或可以被加工以产生MHC I类和/或II类呈递的肽。优选地，结合MHC分子的序列选自SEQ ID NO：108至139，172，173，175，178至187和196。
如果抗原肽被直接呈递(即未经加工，特别是未经切割)，它具有适合于结合MHC分子(特别是I类MHC分子)的长度，优选长度是7-20个氨基酸，更优选长度是7-12个氨基酸，更优选长度是8-11个氨基酸，特别是长度为9或10个氨基酸。优选地，待直接呈递的抗原肽的序列基本上对应选自SEQ ID NO：108至139，172，173，175，178至187和196的序列并且优选与其完全一致。
如果抗原肽经过加工(特别是经过切割)后呈递，通过加工产生的所述肽具有适合于结合MHC分子(特别是I类MHC分子)的长度，优选长度是7-20个氨基酸，更优选长度是7-12个氨基酸，更优选长度是8-11个氨基酸，特别是长度为9或10个氨基酸。优选地，待经过加工后呈递肽的序列基本上对应选自SEQ ID NO：108至139，172，173，175，178至187和196的序列并优选与其完全一致。因此，在一个实施方案中根据本发明的抗原肽包含选自SEQ IDNO：108至139，172，173，175，178至187和196的序列，并且在加工后，所述抗原肽构成选自SEQ ID NO：108至139，172，173，175，178至187和196的序列。
具有基本上对应于由MHC分子呈递之肽序列的氨基酸序列的肽可在一个或更多个残基上不同，所述残基对于作为由MHC呈递的肽的TCR识别或者肽与MHC的结合不是必要的。这样基本上对应的肽优选也能够刺激抗原特异性细胞应答(如抗原特异性CTL)。具有在不影响TCR识别但改善与MHC结合之稳定性的残基上与呈递肽不同的氨基酸序列的肽可改善抗原肽的免疫原性，并可在本文中被称为“优化的肽”。利用这些残基哪些更有可影响与MHC或TCR结合的现有知识，可以使用设计基本上对应的肽的合理方法。所得的功能性肽考虑作为抗原肽。如上文所讨论的序列包含在本文所用的术语“变体”范围内。
抗原肽可与MHC分子(如细胞表面上的MHC分子)结合，并且因此可以是“MHC结合肽”。术语“MHC结合肽”涉及结合到MHC I类和/或MHC II类分子的肽。在I类MHC/肽复合物的情况下，虽然更长或更短的肽可以是有效的，但结合肽通常长度是8-10个氨基酸。在II类MHC/肽复合物的情况下，尽管更长或更短的肽可以是有效的，但结合肽通常长度是10-25个氨基酸，特别是13-18个氨基酸。
术语“部分”是指段(fraction)。对于特定的结构如氨基酸序列或蛋白质，其术语“部分”可指所述结构的连续或不连续段。优选地，氨基酸序列的部分包含至少1％，至少为5％，至少10％，至少20％，至少30％，优选至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选为至少80％，并且最优选至少90％的所述氨基酸序列的氨基酸。优选地，如果该部分是不连续段，所述不连续段由2，3，4，5，6，7，8或更多个结构的部分构成，每部分是所述结构的连续元件。例如，氨基酸序列的不连续段可由2，3，4，5，6，7，8或更多(优选不超过4)的所述氨基酸序列的部分构成，其中每个部分优选包含所述氨基酸序列的至少5个连续氨基酸，至少10个连续氨基酸，优选至少20个连续氨基酸，优选至少30个连续氨基酸。
术语“部分”和“片段”在本文中可互换使用，是指连续的元件。例如，结构(如氨基酸序列或蛋白质)的一部分是指所述结构的连续元件。结构的份，部分或片段优选包含一个或更多个所述结构的功能特性。例如，表位、肽或蛋白质的份，部分或片段优选与其源自的表位、肽或蛋白质是免疫学等价的。在本发明的上下文中，结构(例如氨基酸序列)的一“部分”优选包含至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少94％，至少96％，至少98％，至少99％的整个结构或氨基酸序列，优选由其组成。如上文所讨论的份、部分或片段包含在本文使用的术语“变体”的范围内。
“抗原加工”是指抗原到为所述抗原之片段的加工产物的降解(如，蛋白质到肽的降解)以及这些片段中的一个或更多个与MHC分子的相关联(例如，通过结合)来被细胞呈递(优选抗原呈递细胞呈递到特异性T细胞)。
抗原呈递细胞(APC)是在其表面在主要组织相容性复合体(MHC)的环境中展示抗原的细胞。T细胞可用它们的T细胞受体(TCR)识别该复合体。抗原呈递细胞加工抗原并呈递它们到T细胞。
专门的抗原呈递细胞在内化抗原(通过吞噬作用或通过受体介导的内吞作用)然后在它们的膜上显示抗原片段(与II类MHC分子结合)方面是非常有效的。T细胞识别抗原呈递细胞膜上的抗原-II类MHC分子复合物并与其相互作用。然后抗原呈递细胞产生额外的共刺激信号，导致T细胞的活化。共刺激分子的表达是专门的抗原呈递细胞的限定性特征。
专门的抗原呈递细胞的主要类型是树突细胞(其具有最广范围的抗原呈递并且可是最重要的抗原呈递细胞)，巨噬细胞，B-细胞，和某些活化的上皮细胞。
非专门的抗原呈递细胞不组成型表达与幼稚T细胞相互作用所需的MHC II类蛋白质；这些仅在某些细胞因子(如IFNγ)刺激非专门抗原呈递细胞时才表达。
树突细胞(DC)是白细胞类群，其通过MHC II类和I类抗原呈递途径呈递在外周组织中捕获的抗原给T细胞。公知树突细胞是强免疫应答的诱导物，并且这些细胞的活化是抗肿瘤免疫的诱导的关键步骤。
树突细胞和祖细胞可以从外周血，骨髓，肿瘤浸润细胞，瘤周组织浸润细胞，淋巴结，脾，皮肤，脐带血或任何其它合适的组织或流体中获得。例如，树突细胞可以通过向从外周血获得的单核细胞培养物添加细胞因子组合(如GM-CSF，IL-4，IL-13和/或TNFα)进行离体分化。或者，从外周血、脐带血液或骨髓中收集的CD34阳性细胞可以通过向培养基中加入诱导树突细胞分化、成熟和增殖的GM-CSF，IL-3，TNFα，CD40配体，LPS，flt3配体和/或其他化合物的组合而分化成树突细胞。
树突细胞通常归类为“未成熟”和“成熟”的细胞，这可以用作区分两个良好表征的表型的简单方式。但是，此术语不应该被解释为排除分化的所有可中间阶段。
未成熟树突细胞的特征为具有高的抗原摄取和加工能力的抗原呈递细胞，其与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型通常特征为这些标志物的较低表达而负责T细胞活化(如I类和II类MHC，粘附分子(如CD54和CD11)和共刺激分子(如CD40，CD80，CD86和4-1BB)的细胞表面分子的高表达。
树突细胞成熟指的是该抗原呈递树突细胞导致T细胞引发的树突细胞活化状态，而由未成熟树突细胞进行的呈递导致耐受。树突细胞成熟主要由以下引起：被先天受体检测到的具有微生物特征的生物分子(细菌DNA，病毒RNA，内毒素等)，促炎性细胞因子(TNF，IL-1，IFN)，通过CD40L在树突细胞表面上CD40的结合，以及从正在经历应激细胞死亡的细胞中释放的物质。树突细胞可以通过用细胞因子(如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子α)体外培养骨髓细胞而衍生。
可以通过用肽暴露(即致敏)细胞或用核酸(编码包含待呈递之肽的肽或蛋白质)(优选RNA)转导细胞来使细胞(如抗原呈递细胞或靶细胞)装载MHC I类呈递肽。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含装载抗原肽的抗原呈递细胞。在这方面，方案可依赖于树突细胞的体外培养/分化，改造所述树突细胞以使它们人工呈递抗原肽。遗传改造的树突细胞的生产可涉及将编码抗原或抗原肽的核酸引入树突细胞。使用mRNA转染树突细胞是很有前景的刺激强烈抗肿瘤免疫的抗原装载技术。这样的转染可离体发生，包含该转染细胞的药物组合物随后可用于治疗目的。或者，可将靶向树突状或其他抗原呈递细胞的基因递送载体施用给患者，导致在体内发生转染。体内和离体转染树突细胞的例如通常可使用本领域中已知的任何方法进行，如WO97/24447中描述的那些，或由Mahvi等人，Immunology and cell Biology 75：456-460，1997描述的基因枪方法。树突细胞的抗原负载可通过用抗原，DNA(裸或在质粒载体内)或RNA；或抗原表达重组细菌或病毒(如牛痘病毒，鸡痘病毒(fowipox)，腺病毒或慢病毒载体)孵育树突细胞或祖细胞来实现。
术语“免疫原性”涉及抗原诱导免疫反应的相对效率。
本发明的上下文中的术语“免疫反应性细胞”涉及在免疫反应过程中显示效应子功能的细胞。“免疫反应性细胞”优选能够结合抗原或特征为呈递抗原或来自抗原的抗原肽的细胞，以及介导免疫应答。例如，这样的细胞分泌细胞因子和/或趋化因子，杀灭微生物，分泌抗体，识别感染的或癌细胞并且任选地消除这样的细胞。例如，免疫反应性细胞包括T细胞(细胞毒性T细胞，辅助T细胞，肿瘤浸润T细胞)，B细胞，自然杀伤细胞，嗜中性粒细胞，巨噬细胞和树突细胞。优选地，在本发明的上下文中，“免疫反应性细胞”是T细胞，优选CD4+和/或CD8+ T细胞。
优选地，“免疫反应性细胞”以某种程度的特异性识别抗原或来自抗原的抗原肽(特别是如果其在MHC分子的环境下呈递，例如在抗原呈递细胞或病变细胞(如恶性细胞或病毒感染细胞)的表面上)。优选地，所述识别能够使识别抗原或来自该抗原的抗原肽的细胞具有响应性或反应性。如果该细胞是在II类MHC分子的环境下带有识别抗原或来自抗原之抗原肽的受体的辅助T细胞(CD4+ T细胞)，这样的响应性或反应性可涉及细胞因子的释放和/或CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞的激活。如果该细胞是CTL，这样的响应性或反应性可涉及在I类MHC分子的环境下呈递的细胞(即细胞的特征为用I类MHC呈递抗原，例如通过凋亡或穿孔蛋白(perforin)介导的细胞裂解)的消除。根据本发明，CTL响应性可包括持续的钙通量，细胞分裂，细胞因子(如IFN-γ和TNF-α)的产生，活化标志物(例如CD44和CD69)的上调，以及表达抗原的靶细胞的特异性细胞裂解性杀伤。CTL响应性也可以使用准确指示CTL响应性的人工报告子来确定。这种识别抗原或来自抗原并且具有响应性或反应性的CTL在本文中也被称为“抗原响应性CTL”。如果该细胞是B细胞，这种响应性可涉及免疫球蛋白的释放。
根据本发明，术语“免疫反应性细胞”也包括可以通过合适的刺激成熟为免疫细胞(如T细胞，特别是辅助T细胞，或细胞裂解性T细胞)的细胞。免疫反应性细胞包括CD34+造血干细胞，未成熟和成熟T细胞以及未成熟和成熟B细胞。如果期望产生识别抗原的细胞裂解性或T辅助细胞，使免疫反应性细胞与呈递的抗原或抗原肽的细胞在有利于生成，分化和/或选择细胞裂解性T细胞和T辅助细胞的条件下接触。当暴露于抗原时，T细胞前体向细胞裂解性T细胞的分化与免疫系统的克隆选择相类似。
“淋巴样细胞”是任选地在合适的修饰后(如T细胞受体转移后)能够产生免疫应答(如细胞免疫应答)的细胞，或者是该细胞的前体细胞，并且包括淋巴细胞优选T淋巴细胞，淋巴母细胞和浆细胞。淋巴样细胞可以是如本文所述的免疫反应性细胞。优选的淋巴样细胞是缺乏T细胞受体的内源性表达且可以进行修饰以在细胞表面上表达该T细胞受体的T细胞。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中互换使用并且包括辅助T细胞(CD4+ T细胞)和包括细胞裂解性T细胞的细胞毒性T细胞(CTL，CD8+T细胞)。
T细胞属于被称为淋巴细胞的白血细胞，并在细胞介导的免疫中发挥核心作用。通过它们细胞表面称为T细胞受体(TCR)的特殊受体的存在，可以将它们区别于其他的淋巴细胞类型(如B细胞和自然杀伤细胞)。胸腺是负责T细胞的T细胞成熟的主要器官。已经发现几种不同的T细胞亚群，每一个都具有不同的功能。
T辅助细胞在免疫过程中协助其他白血细胞，包括B细胞到浆细胞的成熟以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化等功能。这些细胞也被称为CD4+ T细胞，因为它们在其表面表达CD4蛋白。当它们由II类MHC分子(在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达)呈递肽抗原时，辅助T细胞被激活。一旦被激活，它们将迅速分裂并分泌调节或协助活性免疫应答的称为细胞因子的小蛋白。
细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也参与移植排斥。由于它们在其表面上表达CD8糖蛋白，这些细胞也被称为CD8+T细胞。这些细胞通过结合与I类MHC(存在于身体几乎每个细胞表面上)相关联的抗原来识别其靶标。
大多数T细胞具有作为几种蛋白质的复合物存在的T细胞受体(TCR)。实际的T细胞受体由两个单独的肽链构成，它们由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生并被称为α-和β-TCR链。γδT细胞代表在其表面具有独特的T细胞受体(TCR)的T细胞的小亚型。然而，在γδT细胞中，TCR由一个γ-链和一个δ链构成。这组T细胞较αβT细胞更为不常见(总T细胞的2％)。
T细胞受体的结构与免疫球蛋白的Fab片段非常相似，Fab片段被定义为抗体臂轻链和重链的组合的区域。TCR的每个链都是免疫球蛋白超家族的成员，并且具有一个N末端的免疫球蛋白(Ig)可变(V)结构域，一个Ig-恒定(C)结构域，跨膜/细胞跨膜区和在C末端的短胞浆尾。
根据本发明，术语“T细胞受体的可变区”涉及TCR链的可变结构域。
TCRα-链和β-链的可变结构域都具有三个高变或互补决定区(CDR)，而β-链的可变区具有额外的高变(HV4)区，其通常不接触抗原因此不被认为是CDR。CDR3是负责识别所加工抗原的主要CDR，虽然α-链的CDR1也被表明与抗原肽的N-末端部分相互作用，而β-链的CDR1与肽的C-末端部分相互作用。认为CDR2识别MHC。不认为β-链的CDR4参与抗原的识别，但已表明其与超抗原(superantigen)相互作用。
根据本发明，术语“至少一个CDR序列”优选是指至少CDR3序列。术语“T细胞受体链的CDR序列”优选涉及T细胞受体α-链或β-链的CDR1，CDR2和CDR3。
TCR结构域的恒定结构域由短的连接序列组成，其中半胱氨酸残基形成二硫键，这形成这两条链之间的连接。
所有T细胞源自骨髓的造血干细胞。源自造血干细胞的造血祖细胞存在于胸腺并通过细胞分裂扩增以产生不成熟胸腺细胞的大类群。最早的胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，并因此归类为双阴性(CD4-CD8-)细胞。随着它们通过发育而进展，它们成为双阳性的胸腺细胞(CD4+CD8+)，并最终成熟为单阳性(CD4+CD8-或CD4-CD8+)胸腺细胞，然后从胸腺释放到外周组织。
通过T细胞受体与另一细胞上的主要组织相容性复合体(MHC)呈递的短肽的结合提供T细胞激活的第一个信号。这确保了只有具有对该肽特异的TCR的T细胞被激活。伴侣细胞通常是专门的抗原呈递细胞(APC)，在幼稚应答(
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response)的情况下通常是树突细胞，虽然B细胞和巨噬细胞可以是重要的APC。由I类MHC分子呈递到CD8+T细胞的肽长度为8-10个氨基酸；由于II类MHC分子的结合裂缝(binding cleft)的末端打开，由II类MHC分子呈递到CD4+T细胞的肽更长。
通常可使用标准程序在体外或离体制备T细胞。例如，使用市售的细胞分离系统，T细胞可存在于(或分离于)哺乳动物(如患者)的骨髓，外周血或骨髓或外周血级分。或者，T细胞可以衍生自相关或不相关的人，非人的动物，细胞系或培养物。“包含T细胞的样品”可以例如是外周血单核细胞(PBMC)。
T细胞可通过抗原、肽、核酸和/或表达抗原的抗原呈递细胞(APC)被刺激。这样的刺激在足以允许产生对抗原、肽和/或呈递抗原或肽的细胞特异的T细胞的条件和时间下进行。
CD4+或CD8+ T细胞的特异性活化可以以多种不同的方式检测。用于检测特异性T细胞活化的方法包括检测T细胞增殖，细胞因子的产生(例如，淋巴因子)，或细胞裂解活性的产生。对于CD4+ T细胞，一个优选的检测特异性T细胞活化的方法是T细胞增殖的检测。对于CD8+ T细胞，一个优选的检测特异性T细胞活化的方法是检测细胞裂解活性的产生。
为了产生的CD8+ T细胞系，可以将转染有产生抗原之核酸的抗原呈递细胞(优选自体抗原呈递细胞)用作刺激细胞。
核酸(如编码T细胞受体(ICR)链的RNA)可以被引入到淋巴样细胞(如T细胞或其他具有裂解能力的细胞)。在一个合适的实施方案中，TCRα-和β-链从抗原特异性T细胞系中克隆出来，并被用于过继T细胞治疗。本发明提供了对本文所公开的抗原或抗原肽特异的T细胞受体。一般情况下，本发明的这个方面涉及识别或结合MHC环境中呈递的抗原肽的T细胞受体。编码T细胞受体(如根据本发明提供的T细胞受体)α-和β-链的核酸可以包含于单独的核酸分子(如表达载体)中或者，包含于单个核酸分子中。因此，术语“编码T细胞受体的核酸”涉及在相同或优选不同的核酸分子上编码T细胞受体链的核酸分子。
术语“与肽有反应性的免疫反应性细胞”涉及这样的免疫反应性细胞，当它识别肽(特别是如果在MHC分子的环境中呈递(如在抗原呈递细胞或诸如恶性细胞或病毒感染细胞的病变细胞的表面上))时，发挥如上所述的免疫反应性细胞的效应子功能。
术语“与肽有反应性的T细胞受体”涉及这样的T细胞受体，当存在于识别肽的免疫反应性细胞上时，特别是如果在MHC分子的环境中呈递(如在抗原呈递细胞或诸如恶性细胞或病毒感染细胞的病变细胞的表面上)时，使得免疫反应性细胞发挥如上所述的免疫反应性细胞的效应子功能。
术语“抗原反应性T细胞”涉及这样的T细胞，如果抗原在MHC分子的环境中呈递(如在抗原呈递细胞或诸如恶性细胞或病毒感染细胞的病变细胞的表面上)则识别抗原，并发挥如上所述的T细胞效应子功能。
术语“抗原特异性淋巴样细胞”涉及这样的淋巴样细胞，特别是当提供抗原特异性T细胞受体时，如果抗原在MHC分子的环境中呈递(如在抗原呈递细胞或诸如恶性细胞或病毒感染细胞的病变细胞的表面上)则识别抗原，并优选发挥如上所述的T细胞效应子功能。如果T细胞和其他淋巴样细胞杀伤表达抗原和/或呈递抗原肽的靶细胞，该细胞被认为对抗原是特异性的。T细胞特异性可使用多种标准技术中的任一种进行评价，例如，使用铬释放测定或增殖测定。或者，可以测量淋巴因子(如干扰素-γ)的合成。
术语“主要组织相容性复合体”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子，并涉及存在于所有脊椎动物的基因的复合体。MHC蛋白或分子在免疫反应中对于淋巴细胞和抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号转导很重要，其中MHC蛋白或分子结合肽并且呈递它们以通过T细胞受体进行识别。由MHC编码的蛋白质在细胞的表面上表达，并向T细胞显示自体抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自体抗原(例如，入侵微生物的片段)。
MHC区域分为3个亚类，I类，II类和III类。MHC I类蛋白包含α-链和β2-微球蛋白(不是由15号染色体编码的MHC的部分)。它们呈递抗原片段给细胞毒性T细胞。在大多数免疫系统细胞中，特别是在抗原呈递细胞中，MHC II类蛋白包含α-和β-链，并且它们呈递抗原片段给T辅助细胞。MHC III类区编码其他的免疫成分，如补体成分并且一些编码细胞因子。
在人中，编码细胞表面上的抗原呈递蛋白的MHC区基因被称为人白细胞抗原(HLA)基因。然而，缩写MHC经常用于指HLA基因产物。HLA基因包括9个所谓的经典MHC基因：HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DPA1，HLA-DPB1，HLA-DQA1，HLA-DQB1，HLA-DRA和HLA-DRB1。
在本发明所有方面的一个优选的实施方案中，MHC分子是HLA分子。
所谓“特征为呈递抗原的细胞”，“呈递抗原的细胞”，“由细胞呈递的抗原”，“呈递的抗原”或类似表述是指在MHC分子的环境中(特别是MHC I类分子)呈递其表达的抗原或源自该抗原的片段(例如通过加工抗原)的细胞，例如患病细胞(如病毒感染细胞或恶性细胞)或抗原呈递细胞。类似地，术语“特征为呈递抗原的疾病”表示这样的疾病，其涉及特征为呈递抗原(特别是通过I类MHC)的细胞。通过细胞的抗原呈递可以通过使用核酸(如编码抗原的RNA)转染细胞而实现。
所谓“呈递的抗原的片段”或类似表述是指该片段可由MHC I类或II类(优选MHC I类)呈递，例如，当直接加入到抗原呈递细胞中时。在一个实施方案中，该片段是表达抗原的细胞自然呈递的片段。
一些治疗方法基于患者免疫系统的反应，这导致病变细胞裂解用I类MHC呈递抗原。在这一点上，例如对抗原肽和MHC分子的复合体特异的自体细胞毒性T淋巴细胞可以给具有疾病的患者施用。这样的细胞毒性T淋巴细胞在体外的生成是已知的。分化T细胞方法的一个例子可以在WO-A-9633265中找到。一般来说，包含细胞(如血细胞)的样品取自患者，并且将该细胞与呈递该复合体并可导致细胞毒性T淋巴细胞(例如树突细胞)增殖的细胞接触。靶细胞可以是转染的细胞(如COS细胞)。这些转染的细胞在其表面上呈递期望的复合物，并且当与细胞毒性T淋巴细胞接触时，刺激后者的增殖。克隆增殖的自体细胞毒性T淋巴细胞随后向患者施用。
选择细胞毒性T淋巴细胞的另一方法中，MHC I类分子/肽复合物的产荧光四聚体用于获得细胞毒性T淋巴细胞的特异性克隆(Altman等人(1996)，Science 274：94-96；Dunba等人(1998)，Curr.Biol.8：413-416，1998)。
此外，呈递期望复合物的细胞(例如树突细胞)可与健康个体或其他物种(例如，小鼠)的细胞毒性T淋巴细胞组合，这可导致具有高亲和力的特异性细胞毒性T淋巴细胞的增殖。这些增殖的特异性T淋巴细胞的高亲和力T细胞受体可以被克隆并且任选地人源化至不同程度，并且由此得到的T细胞受体然后通过基因转移(例如，使用逆转录病毒载体)转导进入患者的T细胞。然后可以使用这些基因改变的T淋巴细胞进行过继转移(Stanislawski等人(2001)，Nat Immunol.2：962-70；Kessels等人(2001)，Nat Immunol.2：957-61)。
细胞毒性T淋巴细胞也可以以本身已知的方式在体内产生。一种方法使用表达MHCI类/肽复合体的非增殖性细胞。这里所使用的细胞是通常表达复合体的细胞，例如，经照射的肿瘤细胞或用一个或两个呈递复合体所需的基因(即抗原肽和呈递MHC分子)转染的细胞。另一种优选的形式是以重组RNA的形式引入抗原，例如其可通过脂质体转移或通过电穿孔被引入到细胞中。由此产生的细胞呈递目标复合体并且被自体细胞毒性T淋巴细胞识别然后增殖。
可以通过将抗原或抗原肽与佐剂的组合实现类似的效果以使在体内并入抗原呈递细胞可行。抗原或抗原肽可以被表现为蛋白质，DNA(例如，在载体内)或RNA。抗原可以被加工以产生MHC分子的肽伴侣，而其片段可以不需要进一步加工而被呈递。如果这些可以结合MHC分子，后者是特别的情况。优选的是这样的施用形式，其中完整的抗原通过树突细胞在体内加工，因为这也可产生有效的免疫应答所需的T辅助细胞应答(Ossendorp等人，Immunol Len.(2000)，74：75-9；Ossendorp等人(1998)，J.Exp.Med.187：693-702)。在一般情况下，例如，可以通过皮内注射给患者施用有效量的肿瘤相关抗原。但是，注射也可通过结内途径进入淋巴结来进行(Maloy等人(2001)，Proc NatI Acad Sci USA98：3299-303)。
根据本发明，“参照”(如参照样品或参照生物体)可用于关联和比较来自测试样品或测试生物体的本发明方法中得到结果。通常情况下，参照生物体是健康生物体，特别是未患病(例如恶性疾病或病毒性疾病)的生物体。“参照值”或“参照水平”可以通过测量足够大量的参照凭经验从参照中确定。优选地，该参照值通过测量至少2个，优选至少3个，优选至少5个，优选至少为8个，优选至少12个，优选至少20个，优选至少30个，优选至少50个或优选为至少100个参照而确定。
术语“免疫球蛋白”涉及免疫球蛋白超家族的蛋白，优选抗原受体，如抗体或B细胞受体(BCR)。免疫球蛋白的特征为具有特征性免疫球蛋白(Ig)折叠的结构域，即，免疫球蛋白结构域。该术语包括膜结合免疫球蛋白以及可溶性免疫球蛋白。膜结合免疫球蛋白也被称为表面免疫球蛋白或膜免疫球蛋白，其一般是BCR的一部分。可溶性免疫球蛋白一般被称为抗体。免疫球蛋白通常包括几个链，通常为通过二硫键相连的两个相同的重链和两个相同的轻链。这些链主要由免疫球蛋白结构域(如VL(可变轻链)结构域，CL(恒定轻链)结构域，以及CH(恒定重链)结构域CH1，CH2，CH3和CH4构成。有五种类型的哺乳动物免疫球蛋白重链，即，α，δ，ε，γ和μ，其对应不同类别抗体，即，IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。与可溶性免疫球蛋白的重链相反，膜或表面免疫球蛋白的重链包括跨膜域和在其羧基末端的短胞质结构域。在哺乳动物中，有两种类型的轻链，即λ和κ。
免疫球蛋白链包含可变区和恒定区。恒定区基本上在免疫球蛋白的不同的同型内保守，其中，可变部分是高度差异且负责抗原识别。
术语“抗体”是指包括通过二硫键在内部连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白，并包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体和其片段或衍生物，包括但不限于人单克隆抗体，人源化单克隆抗体，嵌合单克隆抗体，单链抗体，例如，scFV’s和抗原结合抗体片段(如Fab和Fab’片段)，并且还包括抗体的所有重组形式，例如，在原核生物中表达的抗体，非糖基化抗体，以及任何抗原结合抗体片段和衍生物。每一个重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。每一个轻链由轻链可变区(本文缩写作为VL)和轻链恒定区组成。VH和VL区可以被进一步细分成高变区，称为互补性决定区(CDR)，其穿插在较保守的区域(称为框架区(FR))中。每个VH和VL由3个CDR和4个FR构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白和宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。
根据本发明，如果T细胞受体或抗体对于预定的靶标具有显著的亲和力并在标准测定中结合到所述预定的靶标，则其能够结合至该预定的靶标。“亲和力”或“结合亲和力”往往通过平衡解离常数(KD)测量。如果T细胞受体或抗体对靶标没有显著的亲和力并且在标准测定中不结合到该靶标，则其(基本上)不能结合到所述靶标，。
T细胞受体或抗体优选能够特异性结合至预定的靶标。如果T细胞受体或抗体能够结合到预定靶标而其(基本上)不能结合其他靶标(即对其他靶标没有显著的亲和性并且在标准测定中对其他靶标没有显著亲和力)，则其对于所述预定的靶标是特异的。
术语“免疫学上等同”是指免疫学上等同的分子，例如，显示出相同或基本相同的免疫学性质和/或发挥相同的或基本上相同的免疫效果的免疫学上等同的氨基酸序列，例如，关于免疫效果的类型，例如诱导体液和/或细胞免疫应答，诱导免疫反应的强度和/或持续时间，或诱导免疫反应的特异性。在本发明的上下文中，术语“免疫学上等同的”优选用于免疫所用的肽或肽变体的免疫效果或性质。例如，如果当暴露于对象的免疫系统时，氨基酸序列诱导具有与参照氨基酸序列反应的特异性的免疫应答，则所述氨基酸序列与参照氨基酸序列免疫学上等同。
在本发明的上下文中的术语“免疫效应子功能”包括任何通过免疫系统的组分介导的导致以下结果的功能，所述结果例如，病毒感染细胞或肿瘤细胞的杀伤，或肿瘤生长的抑制和/或肿瘤发生的抑制，包括肿瘤传播和转移的抑制。优选地，本发明上下文中的免疫效应子功能是T细胞介导的效应子功能。这样的功能就辅助T细胞(CD4+ T细胞)来说，包括由T细胞受体的MHC II类分子环境下的抗原或来自抗原的抗原肽的识别，细胞因子的释放和/或CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B-细胞的活化，并且就CTL来说，包括由T细胞受体在MHC I类分子环境下的抗原或来自抗原的抗原肽的识别，在MHC I类分子的环境下进行呈递的细胞(即，特征为用I类MHC呈递抗原的细胞)的消除(例如，通过凋亡或穿孔蛋白介导的细胞裂解)，细胞因子(如IFN-γ和TNF-α)的生成，以及表达抗原的靶细胞的特异性细胞裂解性杀伤。
术语“具有另一T细胞受体特异性的T细胞受体”是指两个T细胞受体(特别是当呈递在免疫反应性细胞时)识别相同的表位(特别是当其呈递在MHC分子的环境中例如在抗原呈递细胞或患病细胞(如病毒感染细胞或恶性细胞)的表面上)并且优选提供具有上面所公开的效应子功能的免疫反应性细胞。优选地，T细胞受体的结合特异性和/或结合亲和力是相似或相同的。在一个优选的实施方案中，“具有另一T细胞受体特异性的T细胞受体”涉及包含另一T细胞受体的至少CDR区(优选至少可变区)的T细胞受体。在一个实施方案中，两个T细胞受体是基本相同或相同的。
根据本发明的核酸优选是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，更优选为RNA，最优选体外转录的RNA(IVT RNA)。根据本发明的核酸包括基因组DNA，cDNA，mRNA，重组制备的和化学合成的分子。根据本发明的核酸可以是分子的形式，其是单链或双链并且直链或共价封闭以形成环。可以采用核酸引入(即转染)细胞，例如，可以通过体外从DNA模板转录制备的RNA的形式。RNA还可以在应用之前通过稳定序列、加帽和聚腺苷酸化进行修饰。
本文所描述的核酸可以包含在载体中。本文所用的术语“载体”包括任何本领域技术人员已知的载体，包括质粒载体、粘粒载体，噬菌体载体(如λ噬菌体)，病毒载体(如腺病毒或杆状病毒载体)或人工染色体(如细菌人工染色体(BAC)，酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC)。所述载体包括表达和克隆载体。表达载体包括质粒和病毒载体，并通常含有期望的编码序列和在特定宿主生物体(例如，细菌，酵母，植物，昆虫或哺乳动物)或在体外表达系统中表达有效连接的编码序列所需的合适DNA序列。克隆载体一般用于改造和扩增某些期望的DNA片段，并且可缺乏表达所述期望DNA片段所需的功能序列。
作为用于T细胞受体表达的载体，可以使用以下两种载体类型中的任意种：其中T细胞受体链存在于不同载体，或者其中T细胞受体链存在于同一载体。
在本发明的MHC分子呈递抗原或抗原肽的这些情况下，核酸还可以包含编码该MHC分子的核酸序列。编码MHC分子的核酸序列可以存在于编码抗原或抗原肽的同一核酸序列上，或两个核酸序列可以存在于不同的核酸分子。在后者的情况下，两个核酸分子可以共转染到细胞中。如果宿主细胞既不表达抗原或抗原肽，也不表达MHC分子，两个编码核酸序列从而可在相同的核酸分子或者不同核酸分子上被转染进细胞内。如果细胞已经表达MHC分子，则只有编码抗原或抗原肽的核酸序列可以转染到细胞中。
本文所使用的术语“RNA”指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D-核-呋喃糖部分的2′-位置具有羟基基团的核苷酸。该术语包括双链RNA，单链RNA，分离的RNA(例如部分纯化的RNA)，基本上纯的RNA，合成RNA，重组产生的RNA以及改变的RNA，其通过一个或更多个核苷酸的添加、删除、替换和/或改变而区别于天然RNA。这样的改变可包括向RNA的末端或内部(例如，在RNA的一个或更多个核苷酸)添加非核苷酸材料。RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，例如非天然核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可称为类似物或天然RNA的类似物。
根据本发明，术语“RNA”包括并优选涉及“mRNA”，其是指“信使RNA”并涉及可使用DNA作为模板生成并且编码肽或蛋白质的“转录物”。mRNA一般包括5′非翻译区，蛋白质或肽编码区和3′非翻译区。mRNA在细胞内和体外具有有限的半衰期。优选地，使用DNA模板通过体外转录产生mRNA。在本发明的一个实施方案中，被引入细胞的RNA通过适当DNA模板的体外转录获得。
本发明的上下文中，术语“转录”涉及这样的过程，其中DNA序列中的遗传密码被转录成RNA。随后，RNA可以被翻译成蛋白质。根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中该术语“体外转录”涉及这样的过程，其中RNA(特别是mRNA)是在无细胞系统中体外合成的，优选使用适当的细胞提取物进行。优选地，克隆载体用于转录物的生成。这些克隆载体一般是被指定作为转录载体，并且根据本发明包含在术语“载体”中。根据本发明，RNA可以通过适当的DNA模板的体外转录获得。控制转录的启动子可以是用于任何RNA聚合酶任何启动子。RNA聚合酶的具体例子是T7，T3和SP6 RNA聚合酶。可以通过核酸(特别是cDNA)克隆获得用于体外转录的DNA模板，并将其引入到用于体外转录的合适的载体。cDNA可以通过RNA的逆转录获得。优选地，克隆载体用于制造通常为指定的转录载体的转录本。
包含载体模板的cDNA可以包括承载不同的cDNA插入物的载体，其在转录后产生不同RNA分子的类群，其任选地能够表达不同因子；或者也可包括仅承载一种cDNA插入物的载体，其转录后仅产生一种RNA类群，其仅能够表达一种因子。因此，可以产生能够仅仅表达单一因子或产生不同RNA的组合物。
根据本发明描述的核酸已优选地是分离的。根据本发明，术语“分离的核酸”意为所述核酸为(i)体外扩增的，例如通过聚合酶链反应(PCR)，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过切割和凝胶电泳分级，或(iv)合成的，例如通过化学合成。分离的核酸是可通过重组DNA技术操作的核酸。
根据本发明，核酸可以单独存在或与其他核酸联合存在，其可以是同源或异源的。在一些优选的实施方案中，核酸与表达控制序列功能性地连接，所述表达控制序列与所述核酸可以是同源或异源的。术语“同源”意为所述核酸也天然地功能性连接，并且术语“异源的”意为所述核酸不是天然地功能性连接。
如果核酸和表达控制序列以所述核酸的表达和转录在所述表达控制序列的控制或影响下的方式相互共价连接，则它们是“功能性的”互相连接。如果核酸待被翻译成功能性蛋白，则当表达控制序列功能性连接到编码序列时，诱导该表达控制序列导致该核酸的转录，而不会引起该编码序列的移码(frame shift)或者该编码序列不能够被翻译成期望的蛋白质或肽。
根据本发明，术语“表达控制序列”或“表达控制元件”包括启动子、核糖体结合位点、增强子和其它调节基因转录或mRNA翻译的控制元件。在本发明的一些具体的实施方案中，可调节所述表达控制序列。表达控制序列的确切结构可根据物种或细胞类型而不同，但通常包含5′-非转录的和5′-和3′-非翻译序列，其分别参与转录和翻译的起始，例如TATA盒，加帽序列，CAAT序列等。更具体地，5′-非转录表达控制序列包括启动子区，其包含用于对功能性连接的核酸进行转录控制的启动子序列。表达控制序列还可以包括增强子序列或上游激活子序列。
根据本发明，术语“启动子”或“启动子区”表示这样的核酸序列，其位于被表达核酸序列上游(5′)，并且通过提供RNA聚合酶的识别及结合位点而控制序列的表达。“启动子区”还可包含参与基因转录调节之其他因子的识别和结合位点。启动子可控制原核或真核基因的转录。此外，启动子可以是“诱导型”并且可响应于诱导剂而起始转录，或者如果转录不受诱导剂控制，所述启动子可以是“组成型”。如果不存在诱导剂，在诱导型启动子控制下的基因不表达或仅少量表达。在诱导剂存在下，所述基因被开启或者转录水平升高。这在一般情况下通过特异性转录因子的结合所介导。
根据本发明优选的启动子包括SP6、T3和T7聚合酶的启动子，人U6 RNA启动子，CMV启动子及其人工的杂合启动子(例如，CMV)，其一个或更多个部分与其他细胞蛋白(例如，人GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶))的基因启动子的一个或更多个部分融合，并且包含或不包含额外的内含子。
本文中以最广的意义使用术语“表达”，并包括产生RNA或产生RNA和蛋白质或肽。对于RNA，术语“表达”或“翻译”特别涉及肽或蛋白质的生成。表达可以是瞬时或稳定的。根据本发明，所述术语还包括“异常表达”或“不正常表达”。
根据本发明，“异常表达”或“不正常表达”意为与参照(例如未患与某种蛋白质(例如，肿瘤相关抗原)异常或不正常表达相关疾病的对象的状态)相比表达改变(优选升高)。表达的升高是指升高至少10％，尤其是至少20％，至少50％或至少100％，或更多。在一个实施方案中，表达仅见于病变组织中，而在健康组织中的表达受到抑制。
术语“特异性表达”是指蛋白基本上仅在特定的组织或器官中表达。例如，肿瘤相关抗原特异性地在胃粘膜上表达，这意味着该蛋白主要在胃粘膜上表达，在其他组织中不表达或在其他组织或器官未表达到显著程度。因此，仅在胃粘膜细胞表达并以显著较低的程度在任何其他组织(如睾丸)表达的蛋白在胃粘膜细胞中特异性表达。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原也可在正常条件下在多于一个的组织类型或器官中(如2个或3个组织类型或器官中)特异性表达，但优选不超过3个不同的组织或器官类型。在这种情况下，则肿瘤相关抗原在这些器官特异性表达。例如，如果在正常条件下肿瘤相关抗原在肺和胃中以优选大致相等的程度表达，该肿瘤相关抗原在肺和胃中特异性表达。
根据本发明的术语“翻译”涉及在细胞核糖体内的过程，通过该过程，信使RNA的链指导氨基酸序列组装以制造蛋白质或肽。
根据本发明，术语“核酸编码”指的是核酸(如果存在于适当的环境中，优选在细胞内)可以被表达以产生其编码的蛋白质或肽。
根据本发明，导入细胞内的RNA的稳定性和翻译效率可以根据需要进行调节。例如，RNA可以通过具有稳定效果和/或增加RNA翻译效率的一个或更多个修饰而稳定化和增加其翻译。这样的修饰例如在通过引用并入本文的PCT/EP2006/009448中描述。
例如，具有未屏蔽的多聚A序列的RNA比具有屏蔽的多聚A序列的RNA能更有效地翻译。术语“多聚A序列”或“多聚A+”涉及腺嘌呤(A)残基的序列，其通常位于RNA分子的3′-末端，并且“未屏蔽的多聚A序列”是指RNA分子3’端的多聚-A序列以多聚-A序列的A结尾而其后没有除位于多聚-A序列3’端(即下游)的A以外的核苷酸。此外，约120个碱基对的长多聚A序列导致RNA的最佳转录稳定性和翻译效率。
因此，为了增加本发明所使用的RNA的稳定性和/或表达，其可被修饰以便以与多聚A序列结合存在，多聚A序列优选具有10至500，更优选为30至300，甚至更优选为65至200，并且特别是100至150个腺苷残基的长度。在一个特别优选的实施方案中，多聚A序列具有大约120个腺苷残基的长度。为了进一步提高根据本发明所使用的RNA的稳定性和/或表达，多聚A序列可以被取消屏蔽。
此外，引入3′-非翻译区(UTR)到RNA分子的3′-非翻译区可以导致翻译效率的增强。可通过引入两个或更多个这样的3′-非翻译区实现协同效应。3′-非翻译区对于它们引入到其中的RNA可以是自体或异源。在一个特定的实施方案中，3′-非翻译区来自人β-球蛋白基因。
上述修饰的组合(即多聚A序列，未屏蔽的多聚A序列的引入以及一个或更多个3′-非翻译区的引入)对RNA的稳定性和翻译效率的增加具有协同的影响。
为了增加根据本发明使用的RNA的表达，其可在编码区域内被修饰(即编码所表达的因子的序列，优选不改变所表达因子的序列)以便增加GC含量并且因此加强在细胞中的翻译。
在本发明另一些实施方案中，待引入到细胞中的RNA在其5′-末端具有帽结构或调节序列，其促进了宿主细胞中的翻译。优选地，RNA由任选地修饰的7-甲基鸟苷在其5′-末端加帽，该7-甲基鸟嘌呤核苷通过5′-5′桥连接在mRNA链的第一个转录核苷酸上。优选地，该RNA的5′-末端包括具有下述通式的帽结构
Figure BSA0000192479990000401
其中，R1和R2独立地为羟基或甲氧基，并且W-，X-和Y-独立地是氧或硫。在一个优选的实施方案中，R1和R2是羟基并且W-，X-和Y-为氧。在另一个优选的实施方案中，R1和R2之一优选R1是羟基，另一个是甲氧基并且W-，X-和Y-是氧。在另一个优选的实施方案中，R1和R2是羟基且W-，X-和Y-之一优选X-是硫而其他是氧。在另一个优选的实施方案中，R1和R2之一优选R2是羟基，而另一个是甲氧基，以及W-，X-和Y-之一优选X-是硫而其他是氧。在所有的上述实施方案中，特别是在X-定义是硫的实施方案中，X-可作为替代地为是硼或硒。
在上式中，右手边的核苷酸通过其3′-基团与RNA链连接。
其中W-，X-和Y-中的至少一个为硫(即其具有硫代磷酸酯部分)的这些帽状结构以全部包含在本文中的不同非对映异构体形式存在。此外，本发明包括上式所有的互变异构体和立体异构体。
当然，如果根据本发明，希望降低RNA的稳定性和/或翻译效率，则可以修饰RNA以干扰如上述增加RNA的稳定性和/或翻译效率的元件的功能。
根据本发明，可以使用任何将核酸引入到细胞有用的技术(即转移或转染)。优选地，RNA通过标准技术转染到细胞中。这些技术包括电穿孔法，脂质转染法和显微注射。在本发明一个特别优选的实施方案中，RNA通过电穿孔引入细胞。
电穿孔或电渗透涉及由外部施加的电场引起的细胞质膜的电导率和渗透率的显著增加。其通常作为向细胞中引入一些物质的方式用在分子生物学中。
电穿孔通常是用电穿孔器完成，使用它在细胞溶液中产生电磁场。细胞悬液被吸入到在其侧具有两个铝电极的玻璃或塑料池中。对于电穿孔，通常使用约50微升的细胞悬液。在电穿孔之前，将其与待转染的核酸混合。该混合物移入池中，设定电压和电容，并且将池插入到电穿孔器。优选地，液体介质在电穿孔后立即加入(在池或ependorf管中)，并且该管在细胞的最适温度孵育一个小时或更长时间以使细胞恢复以及任选地表达抗生素抗性。
根据本发明优选的是，编码蛋白质或肽的核酸向细胞的引入导致该蛋白质或肽的表达。
术语“肽”包括寡肽和多肽，是指包含通过肽健共价连接的两个或更多个、优选3个或更多个、优选4个或更多个、优选6个或更多个、优选8个或更多个、优选9个或更多个、优选10个或更多个、优选13个或更多个、优选16个或更多个、优选21个或.更多个以及高达优选8、10、20、30、40或50个(尤其是100个)氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大的肽，优选指超过100个氨基酸残基的肽，但一般来说，术语“肽”和“蛋白质”是同义词，并可在本文中互换使用。
优选地，根据本发明所述的蛋白质和肽已被分离。术语“分离的蛋白质”或“分离的肽”意指所述蛋白质或肽已从其天然环境中被分离出来。分离的蛋白质或肽可为基本上纯化的状态。术语“基本上纯化的”意指所述蛋白质或肽基本上不含与其在自然界中或在体内相关联的其它物质。
本文给出的与特定氨基酸序列(例如在序列表中显示的)相关的教导应被解释为也涉及产生与所述特定序列功能上等同之序列的所述特定序列的修饰(即变体)，例如，氨基酸序列表现出与所述特定氨基酸序列相同或相似的特性。一个重要的特性是保持肽与MHC分子和/或T细胞受体或者T细胞受体与其靶标的结合，或者维持T细胞的效应子功能。优选地，当在T细胞受体中用相对于所述特定序列经修饰的序列替换特定序列时，其保持所述T细胞受体与靶标的结合，并且优选保持本文中描述的所述T细胞受体或承载所述T细胞受体的T细胞的功能。
本领域的技术人员应该理解，可修饰尤其是CDR的序列(高变区和可变区)而不失去与靶标结合的能力。例如，CDR序列与本文指定的CDR序列相同或高度同源。
肽的“变体”可保持给定肽的免疫原性(例如，相对于给定的肽，变体与T细胞系或克隆反应的能力未大幅度降低)。换言之，相对于给定的肽，变体与T细胞系或克隆反应的能力可增强或不变，或相对于给定的肽可被降低小于50％，并且优选小于20％。
可通过评估与MHC分子结合的能力来鉴定变体。在一个优选的实施方案中，变体肽具有修饰以使变体肽与MHC分子结合的能力相对于给定的肽增加。变体肽与MHC分子的结合的能力与给定肽相比可增加至至少2倍，优选至少3倍，4倍，或5倍。因此，在某些优选实施方案中，肽包含这样的变体，其中免疫原性部分的1-3个氨基酸残基被替换以使与T细胞系或克隆反应的能力与未修饰的肽相比显著提高。这样的替换优选位于所述肽的MHC结合位点内。优选的替换允许增加与MHC I类或II类分子的结合。某些变体含有保守替换。
对于“高度同源”，考虑可进行1至5(优选1至4，例如1至3或1或2)个替换。
根据本发明，术语“变体”还包括突变体，剪接变体，构象、同工型、等位基因变体，物种变体和物种同源物，尤其是天然存在的那些。等位基因变体涉及在基因正常序列中的改变，其重要性通常不清楚。全基因测序通常鉴定给定基因的大量等位基因变体。物种同源物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同物种来源的核酸或氨基酸序列。
对于本发明的目的而言，氨基酸序列的“变体”包含氨基酸插入变体，氨基酸添加变体，氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。在蛋白质N-末端和/或C-末端包含缺失的氨基酸缺失变体也称为N-末端和/或C-末端截短变体。
氨基酸插入变体包含在特定氨基酸序列中的一个或两个或更多个氨基酸插入。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，向氨基酸序列特定的位点中插入一个或更多个氨基酸残基，但也可以随机插入并对所产生的产物进行合适的筛选。
氨基酸添加变体包含氨基和/或羧基末端融合一个或更多个氨基酸，例如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。
氨基酸缺失变体的特征为从序列中去除一个或更多个氨基酸(例如去除1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸)。所述缺失可以在蛋白质的任何位置上。
氨基酸替换变体的特征为序列中至少一个残基被除去并在其位置中插入另一残基。优选在氨基酸序列中同源蛋白质或肽之间非保守的位置处修饰和/或将氨基酸置换为其他具有相似特性的氨基酸。优选地，蛋白质变体中的氨基酸改变是保守性氨基酸改变，即替换为带有类似电荷的或不带电荷的氨基酸。保守性氨基酸改变涉及替换为其侧链相关的氨基酸家族中的一个。天然氨基酸通常分为四个家族：酸性的(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性的(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性的(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性的(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同分类为芳族氨基酸。
优选地，给定氨基酸序列与为所述给定氨基酸的变体的氨基酸序列的相似性(优选同一性)为至少约60％，65％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。优选地，相似性或同一性程度对这样的氨基酸区域给出，其为参照氨基酸序列全长的至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60的％，至少约70％，至少约80％，至少约90％或约100％。例如，如果参照氨基酸序列由200个氨基酸组成，优选地对于至少约20个，至少约40个，至少约60个，至少约80个，至少约100个，至少约120个，至少约140个，至少约160个，至少约180个，或约200个氨基酸给出的相似性或同一性程度，优选为连续的氨基酸。在一些优选的实施方案中，相似性或同一性程度在参照氨基酸序列的整个长度上给出。可用本领域已知的工具进行确定序列相似性(优选序列同一性)的比对，优选使用最优序列比对，例如使用Align，使用标准设置，优选EMBOSS：：needle，Matrix：Blosum62，缺口达开10.0，缺口延伸0.5。
“序列相似性”表示相同氨基酸或做为保守性氨基酸替换之氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同氨基酸或核苷酸的百分比。
术语“同一性百分比”旨在表示待比较的两个序列之间是相同的氨基酸残基的百分比，其在最优比对后获得，该百分比是纯粹的统计学意义上的，两个序列之间的差异随机分布并且在其整个长度上分布。两个氨基酸序列之间的序列比较通常在对它们进行最优比对之后通过比较这些序列来进行，所述比较通过分段(segment)或通过“比较窗口”来进行，以鉴定和比较局部区域的序列相似性。用于比较的序列最优比对除手动外可通过如下方法得到：Smith和Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源性算法，Neddleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源性算法，Pearson和Lipman，1988，Proc.NatiAcad.Sci.USA 85，2444的相似性检索法，或者通过使用这些算法的计算机程序(在Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wis中的GAP，BESTFIT，FASTA，BLAST P，BLASTN和TFASTA)。
同一性百分比通过确定要比较的两个序列之间相同位置的数目计算，将该数目除以所比较的位置数目，并将得到的结果乘以100，从而获得这两个序列之间的同一性百分比。
根据本发明的同源氨基酸序列显示出至少40％，特别是至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，优选至少95％，至少98或至少99％的氨基酸残基同一性。
本文所描述的氨基酸序列变体可以容易地由本领域技术人员来制备，例如，通过重组DNA操作。用于制备具有替换，添加，插入或缺失的蛋白质和肽的DNA序列操作法例如在Sambrook等人(1989)中详细描述。此外，本文描述的肽和氨基酸变体可借助于已知的肽合成技术(例如，如通过固相合成法和类似的方法)容易地制备。
本发明包括由术语“肽”和“蛋白质”涵盖的本文描述的肽或蛋白质的衍生物。根据本发明，蛋白质和肽的“衍生物”是蛋白质和肽的修饰形式。所述修饰包括任何化学修饰并且包括单个或多个替换、缺失和/或添加与蛋白质或肽相关的任何分子(例如碳水化合物，脂类和/或蛋白质或肽)。在一个实施方案中，蛋白质或肽的“衍生物”包括产生于以下的经修饰类似物：糖基化，酰化，磷酸化，酰胺化，棕榈酰化，肉豆蔻酰化，异戊二烯化，脂质化，烷基化，衍生化，保护/封端基团的引入，蛋白水解切割或结合到抗体或另一细胞配体。术语“衍生物”还延伸到所述蛋白质和肽的所有功能性化学等同物。优选地，经修饰肽具有提高的稳定性和/或增加的免疫原性。
还包括肽的模拟物。这些模拟物可以包含与一个或更多个氨基酸模拟物相连接的氨基酸(即，肽内的一个或更多个氨基酸可用氨基酸模拟物替换)，或者可以是完全非肽的模拟物。氨基酸模拟物是与氨基酸构象相似的化合物，例如，以使得它可以替换氨基酸而不显著降低与T细胞系或克隆的反应能力。非肽模拟物是不包含氨基酸并具有与肽相似的总体构象的化合物，例如，以使得相对于给定的肽的能力，模拟物与T细胞系或克隆的反应能力没有显著降低。
根据本发明，氨基酸序列、肽或蛋白质的变体、衍生物、修饰形式、片段、份或部分优选地分别具有其所来源的氨基酸序列，肽或蛋白质的功能特性，即其是功能上等效的。在一个实施方案中，氨基酸序列，肽或蛋白质的变体、衍生物、经修饰形式、片段、份或部分在免疫原性上分别等同于其所来源的氨基酸序列、肽或蛋白质。在一个实施方案中，功能特性是免疫原性。
一个具体的特性是与MHC分子形成复合物的能力以及适当时产生免疫应答的能力(优选地通过刺激细胞毒T细胞或T辅助细胞来实现)。
根据本发明，术语“源自”是指特定的实体(尤其是特定的序列)存在于其来源的对象中，特别是生物体或分子。在氨基酸序列的情况下(尤其是特定的序列区域)，“源自”特别是指相关氨基酸序列源自其存在的氨基酸序列。
术语“细胞”或“宿主细胞”优选地是完整细胞，即具有未释放其正常的胞内成分(例如酶，细胞器，或遗传物质)的完整膜的细胞。完整细胞优选是有活力细胞(viablecell)，即能够进行其正常的代谢功能的活细胞(living cell)。根据本发明，所述术语优选表示可用通过外源性核酸转化或转染的任何细胞。根据本发明，术语“细胞”包括原核细胞(例如，大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如，树突细胞，B细胞，CHO细胞，COS细胞，K562细胞，HEK293细胞，HELA细胞，酵母细胞和昆虫细胞)。所述外源性核酸可见于细胞内部(i)本身自由分散，(ii)并入重排载体中，或(iii)整合进入宿主细胞基因组或线粒体DNA中。尤其优选哺乳动物细胞，例如来自人，小鼠，仓鼠，猪，山羊，灵长类动物的细胞。所述细胞可以源自大量组织类型，并包括原代细胞和细胞系。具体的实例包括角质化细胞，外周血白细胞，骨髓干细胞及胚胎干细胞。在另一些实施方案中，所述细胞是抗原呈递细胞，特别是树突细胞，单核细胞或巨噬细胞。
包含核酸分子的细胞优选表达由所述核酸编码的肽或蛋白质。
细胞可以是重组细胞并可分泌所编码的肽或蛋白质，可将其表达在细胞表面上并优选可额外表达MHC分子，所述MHC分子结合所述肽或蛋白质或其加工产物。在一个实施方案中，所述细胞内源性地表达MHC分子。在另一实施方案中，所述细胞以重组的方式表达MHC分子和/或肽或蛋白质或其加工产物。所述细胞优选是非增殖性的。在一个优选的实施方案中，所述细胞是抗原呈递细胞，尤其是树突细胞，单核细胞或巨噬细胞。
术语“克隆扩增”是指其中特定的实体被扩增的方法。在本发明的上下文中，该术语优选用于免疫学应答的上下文中，其中淋巴细胞通过抗原被刺激，增殖，识别该抗原的特异性淋巴细胞被扩增。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞的分化。
与抗原表达相关的疾病可基于与生物样品中的肽特异性反应的T细胞的存在被检测。在某些方法中，将从患者分离的、包含CD4+和/或CD8+T细胞的生物样品与本发明的肽，编码该肽的核酸和/或表达和/或呈递至少该肽的免疫原性部分的抗原呈递细胞一起孵育，然后检测T细胞的特异性激活的存在或不存在。合适的生物样品包括(但不限于)分离的T细胞。例如，T细胞可以从患者中通过常规技术(如通过外周血淋巴细胞的Ficoll/Hypaque密度梯度离心)进行分离。对于CD4+ T细胞，活化优选通过评估T细胞的增殖进行检测。对于CD8+ T细胞，活化优选通过评估细胞裂解活性进行检测。增殖水平至少为未患病对象的两倍和/或细胞裂解活性高于未患病对象20％表明对象中与抗原表达相关的疾病的存在。
本文中使用的“降低”或“抑制”意指引起总体水平降低优选5％或更高，10％或更高，20％或更高，更优选为50％或更高并且最优选75％或更高的能力。术语“抑制”或类似的词语包括完全或基本完全的抑制，即降低到零或基本上降低到零。
术语如“升高”或“增强”优选地表示升高或增强约至少10％，优选至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选为至少80％，并且最优选至少为100％。
本文所描述的物质，组合物和方法可用于治疗患病(例如，以存在表达抗原和呈递抗原肽的病变细胞为特征的疾病)的对象。可以治疗和/或预防的疾病的实例包括表达本文所描述的抗原之一的所有疾病。特别优选的疾病是病毒性疾病(例如hCMV感染)和恶性疾病。
本文所描述的物质，组合物和方法也可用于免疫或疫苗接种，以预防本文描述的疾病。
根据本发明，术语“疾病”是指任何病理状态，包括病毒感染和恶性疾病，尤其是本文所描述的那些形式的病毒感染和恶性疾病。
术语“正常组织”或“正常状况”指的是健康组织或健康对象中的状况，即非病理状况，其中“健康”优选意指未被病毒感染的或非癌性的。
根据本发明“涉及表达抗原之细胞的疾病”是指与健康组织或器官的状态相比，病变组织或器官细胞中所述抗原的表达优选地增加。增加是指增加至少10％，特别是至少20％，至少50％，至少100％，至少200％，至少500％，至少1000％，至少10000％或者甚至更多。在一个实施方案中，表达仅在病变组织中发现，而在健康组织中的表达受到抑制。根据本发明，涉及表达抗原的细胞或与其相关的疾病包括病毒感染和恶性疾病，尤其是本文所描述的那些形式的病毒感染和恶性疾病。
恶性化(malignancy)是医疗状况尤其是肿瘤日趋恶化并可导致死亡的倾向。其以退行性病变，侵袭和转移特性为特征。恶性是用来描述严重且逐步恶化的疾病的相应形容词医学术语。本文所用的术语“恶性疾病”优选涉及癌症或肿瘤疾病。类似地，本文所用的术语“恶性细胞”优选涉及癌症细胞或肿瘤细胞。恶性肿瘤与非癌良性肿瘤的区别可在于恶性肿瘤对其成长不是自限性的，能够侵入到相邻的组织，并且可传播到远端组织(转移)，而良性肿瘤有没有这些属性。恶性肿瘤(malignant tumor)基本上与癌症同义。恶性化，恶性瘤(malignant neoplasm)，恶性肿瘤基本上是与癌症同义。
根据本发明，术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”是指由细胞的异常生长所形成的肿胀或损害(称为赘生细胞或肿瘤细胞)。“肿瘤细胞”意指这样的不正常细胞，其以快速、不受控的细胞增殖生长并且在引发新生长的刺激终止后仍继续增长。肿瘤表现出部分或完全缺乏组织结构性以及与正常组织的功能协调性，并且通常形成单独的组织块，该组织块可以是良性，前恶性或恶性的。
良性肿瘤是缺乏癌症的所有三个恶性性质的肿瘤。因此，通过定义，良性肿瘤不以无限的，攻击性的方式生长，不侵入周围组织，并不会扩散到非临近组织(转移)。良性肿瘤常见的例子包括痣和子宫肌瘤。
术语“良性”意思是轻度和非进展性疾病，事实上，许多良性肿瘤对健康是无害的。然而，一些赘生物由于缺少癌症的侵入特性被确定为“良性肿瘤”，仍可产生负面的健康影响。其实例包括产生“肿块效应”的肿瘤(重要器官的压迫，例如血管)，或内分泌组织的“功能性”肿瘤，其可过度生产某些激素(实例包括甲状腺瘤、肾上腺皮质腺瘤和垂体腺瘤)。
良性肿瘤通常由外表面包围，其抑制良性肿瘤的恶性方式行为能力。在一些情况中，某些“良性”肿瘤可于之后引起恶性癌症，这是由肿瘤成瘤细胞亚群中额外的遗传改变导致的。这种现象的显著实例是管状腺癌，其是作为结肠癌的重要前体的结肠息肉的常见类型。管状腺癌中的细胞和大多数常常进展为癌症的肿瘤一样，显示一定的细胞成熟和外观的异常(统称为发育异常)。这些细胞的异常不见于很少或从不转变为癌性的良性肿瘤中，但见于其它不形成分离肿块的癌前组织异常中，例如宫颈的癌前病变。一些权威倾向于将发育异常肿瘤做为“前恶性”，并保留术语“良性”用于很少或从不引起癌症的肿瘤。
赘生物(neoplasm)是瘤形成导致的异常组织块。瘤形成(希腊语中的新的生长)是细胞的异常增殖。细胞的生长超过并不协调于其周围的正常组织的细胞生长。即使刺激停止后，生长以相同的过度方式持续。这通常会导致肿块或肿瘤。赘生物可以是良性、前恶性或恶性的。
根据本发明的“肿瘤的生长”或“肿瘤生长”是指肿瘤大小增加的趋势和/或肿瘤细胞增殖的趋势。
优选地，根据本发明的“恶性疾病”是癌疾病或肿瘤疾病，并且恶性细胞是癌细胞或肿瘤细胞。优选地，“恶性疾病”以表达肿瘤相关抗原(例如NY-ESO-1、TPTE或PLAC1)为特征。
癌症(医学术语为恶性瘤)是一种疾病，其中的一组细胞不受控制地生长(分裂超出了正常限制)，侵入(侵入和破坏邻近的组织)和有时转移(通过淋巴或血液扩散到身体中的其它位置)。这三个癌症的恶性特点将其与良性肿瘤区分开来，良性肿瘤是自限的，不侵入或转移。大多数癌症形成肿瘤，但是一些(像白血病)不是这样。
通过类似肿瘤的细胞的类型对癌进行分类，从而组织被假定为肿瘤的来源。这些分别是组织学和位置。
根据本发明的术语“癌症”包括白血病、精原细胞瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血液癌症、皮肤癌、脑癌、子宫颈癌、肠道癌(intestinal cancer)、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌(intestinecancer)、头颈癌、胃肠癌、淋巴结癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌(breast cancer)、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌及其转移。其实例有肺癌(lungcarcinomas)、乳癌(mamma carcinomas)、前列腺癌(prostate carcinomas)、结肠癌(coloncarcinomas)、肾细胞癌(renal cell carcinomas)、子宫颈癌(cervical carcinomas)或上述癌类型或肿瘤的转移。根据本发明的术语“癌症”还包括癌转移。
肺癌的主要类型有小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。非小细胞肺癌有三种主要的亚型：鳞状细胞肺癌、腺癌和大细胞肺癌。腺癌占肺癌的约10％。与倾向于位于中心位置的小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌相反，腺癌常见于肺的外周。
皮肤癌是皮肤上的恶性生长。最常见的皮肤癌是基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤。恶性黑色素瘤是皮肤癌的严重类型。它是由色素细胞(称为黑色素细胞)的失控生长所造成的。
根据本发明，“上皮癌(carcinomas)”来源于上皮细胞的恶性肿瘤。该类代表最常见的癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌的常见形式。
“支气管癌”是肺的上皮癌，被认为源自终末细支气管的上皮，其中赘生组织沿肺泡壁延伸，并在肺泡中长成小团块。在一些细胞中和在肺泡物质中(也包括裸露的细胞(denuded cell))，可出现粘蛋白(mucin)。
“腺癌”是源自腺组织的癌。该组织也是称为上皮组织的更大组织分类中的一部分。上皮组织包括皮肤、腺体以及身体的腔和器官内壁的多种其它组织。上皮从胚胎学上源自外胚层、内胚层和中胚层。分类为腺癌的细胞不一定是腺体的一部分，只要它们具有分泌特性即可。这种类型的癌可在一些高等哺乳动物(包括人)中发生。分化良好的腺癌倾向于与它们来源的腺组织类似，而分化差的则不。通过对来自活检的细胞染色，病理学医师将确定肿瘤是否为腺癌或一些其它种类的癌。由于体内腺体广泛分布的特性，因此腺癌可在身体的多种组织中发生。尽管每种腺体可不分泌相同的物质，但只要细胞具有外分泌功能，就可以认为是腺性的并且其恶性形式因此被称为腺癌。恶性腺癌侵袭其它组织，并且在时间充足的情况下常常发生转移。卵巢腺癌是最常见的卵巢癌类型。它包括浆液性和粘液性腺癌、明细胞腺癌和子宫内膜样腺癌。
肾细胞癌也称为肾细胞腺癌，是源自近曲小管内壁的肾癌，所述近曲小管是肾中过滤血液并除去废物的非常小的管。迄今，肾细胞癌目前已成为成年人中最常见的肾癌类型和所有泌尿生殖系统肿瘤中致死最多的。肾细胞癌的独有亚型是明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌。明细胞肾细胞癌是最常见的肾细胞癌类型。当在显微镜下观察时，构成明细胞肾细胞癌的细胞显得很苍白或透明。乳头状肾细胞癌是第二常见的亚型。在一些(如果不是大多数的话)肿瘤中，这些癌形成小的手指样突起物(称为乳头)。
淋巴瘤和白血病是来源于造血(血液形成)细胞的恶性肿瘤。
胚肿瘤或胚细胞瘤是类似于不成熟或胚胎组织的肿瘤(通常为恶性)。许多这些肿瘤最常见于儿童。
“转移”意指癌细胞从其原发位置扩散到身体的另一部分。转移的形成是非常复杂的过程，其依赖于恶性细胞从原发肿瘤脱离、对细胞外基质的侵袭、穿透内皮基底膜进入体腔和血管、以及之后经血液转运后浸润靶器官。最后，新肿瘤(即，继发肿瘤或转移性肿瘤)在靶部位的生长有赖于血管生成。即使移除原发肿瘤之后，肿瘤转移也常会发生，这是因为肿瘤细胞或组分可保留并发展出转移能力。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”是指“远端转移”，其是指远离原发肿瘤和局部淋巴结系统的转移。
继发性或转移性肿瘤的细胞与原发肿瘤中的类似。这意味着，例如如果卵巢癌转移到肝，则继发性肿瘤由异常的卵巢细胞(而非异常的肝细胞)构成。此时，肝中的肿瘤被称为转移性卵巢癌，而非肝癌。
在卵巢癌中，转移可以以如下方式发生：通过直接接触或延展，其可侵入位于卵巢附近或周围的邻近组织或器官，例如输卵管、子宫、膀胱、直肠等；通过疫苗接种(seeding)或脱落进入腹腔，这是卵巢癌扩散的最常见方式。癌细胞脱离卵巢肿块的表面并“落入”腹部的其它结构(例如，肝、胃、结肠或膈膜)中；通过从卵巢肿块中松动，侵入淋巴管，并随后运送到身体的其它区域或远端器官(例如肺或肝)；通过从卵巢肿块中松动，侵入血液系统，并运送到身体的其它区域或远端器官。
根据本发明，转移性卵巢癌包括输卵管中的癌、在腹部器官中的癌(例如，肠道中的癌、子宫中的癌、膀胱中的癌、直肠中的癌、肝中的癌、胃中的癌、结肠中的癌、隔膜中的癌、肺中的癌、腹或骨盆内壁(腹膜)中的癌和脑中的癌)。类似地，转移性肺癌是指从肺扩散到身体的远端和/或多个部位的癌，包括肝中的癌、肾上腺中的癌、骨中的癌和脑中的癌。
当人再次被先前所患病症所影响时，则发生复发或重现。例如，如果患者已患有肿瘤疾病，并已接受所述疾病的成功治疗，而再次发生所述疾病，则所述新发疾病可被认为是复发或重现。然而，根据本发明，肿瘤疾病的复发或重现可以(但不是必须地)发生在原发肿瘤疾病的部位。因此，例如，如果患者已患有卵巢肿瘤，并已接受成功的治疗，则复发或重现可以是发生卵巢肿瘤或发生非卵巢部位的肿瘤。肿瘤的复发或重现还包括肿瘤发生在不同于最初的肿瘤部位的部位以及发生在最初的肿瘤部位的情况。优选地，最初的肿瘤(患者已针对其接受了治疗)是原发肿瘤，而部位不同于最初的肿瘤部位的肿瘤是继发性或转移性肿瘤。
“治疗”意为向对象施用本文中描述的化合物或组合物以预防或清除疾病，包括使对象中的肿瘤的大小或肿瘤的数目降低；阻滞或减缓对象中的疾病；抑制或减缓对象中新疾病的发生；降低目前患有或之前曾患有疾病之对象中的症状和/或复发的频率或严重程度；和/或延长(即，提高)所述对象的寿命。
尤其是，术语“疾病的治疗”包括疾病或其症状的治愈、缩短时程、改善、预防、减缓或抑制进展或恶化，或者预防或延缓发生。
“有风险”意为鉴定为与一般群体相比具有高于正常发病(尤其是癌症)机会的对象(即，患者)。此外，已患有或目前患有疾病(尤其是癌症)的对象是具有升高的发病风险的对象，因为这样的对象可继续发病。目前已患有或曾患有癌症的对象还具有升高的癌转移风险。
术语“免疫治疗”表示与特异性免疫反应相关的治疗。在本发明的情况下，术语例如“保护”、“预防”、“预防性(prophylactic)”、“防止性(preventive)”或“保护性的(protective)”表示在对象中预防或治疗(或二者兼有)疾病的发生和/或传播，并且尤其是使对象发生疾病的机会降到最低或延迟疾病发展。例如，如上所述有患肿瘤的风险的人将是预防肿瘤治疗的候选人。
预防性施用免疫治疗(例如，预防性施用本发明的组合物)优选地对接受者进行保护以避免发生疾病。治疗性施用免疫治疗(例如，治疗性施用本发明的组合物)可导致抑制疾病的进展/生长。这包括使疾病的进展/生长减速(尤其是破坏疾病的进展)，这优选地导致疾病的清除。
免疫治疗可以使用多种技术中的任意种进行，其中本文提供的物质发挥功能以从患者中去除表达抗原的细胞。这种去除可由于患者中对抗原或表达抗原之细胞特异的免疫应答的增强或诱导而发生。
在某些实施方案中，免疫治疗可以是主动免疫治疗，其中治疗有赖于施用免疫应答修饰剂(例如本文提供的肽和核苷酸)在体内刺激内源宿主免疫系统针对患病细胞的反应。
在另一些实施方案中，免疫治疗可以是被动免疫治疗，其中治疗包括递送具有确定的肿瘤免疫反应性(例如效应细胞)、可以直接或间接介导抗肿瘤效果、并且不一定依赖于完整宿主免疫系统的物质。效应细胞的实例包括T淋巴细胞(例如CD8+细胞毒T淋巴细胞和CD4+T辅助淋巴细胞)和抗原呈递细胞(例如树突细胞和巨噬细跑)。本文所述的肽特异性T细胞受体可以被克隆、表达并转移到其它效应细胞中用于过继免疫治疗。
如上文所指出的那样，本文提供的免疫反应性肽可用于迅速扩增抗原特异性T细胞培养物，以产生足够数目的细胞用于免疫治疗。特别是，抗原呈递细胞如树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和/或B细胞可由免疫反应性肽致敏，或者利用本领域公知的标准技术由一种或更多种核酸转染。用于治疗的培养的效应细胞必须能够在体内生长且广泛分布，并长期存活。研究表明，通过用补充有IL-2的抗原重复刺激，培养的效应细胞可以被诱导以在体内生长，并以大量数目长期存活(参见如Cheever等，Immunological Reviews157：177，1997)。
或者，表达本文所述的肽的核酸可被引入到取自患者的抗原呈递细胞中，并离体克隆繁殖，用于移植回到同一患者中。
可以用本领域周知的任何方法将转染细胞重新导入患者中，优选地以无菌形式通过静脉内、腔内、腹膜内或瘤内施用。
本文披露的方法可包括应答于肽或肽表达抗原呈递细胞而激活的自体T细胞的施用。此类T细胞可以是CD4+和/或CD8+，并且可以如上文所述增殖。可以向对象施用对抑制疾病发生有效量的T细胞。
本文提供的物质和组合物可单独使用或与常规治疗方案联合使用，例如外科手术、照射、化学治疗和/或骨髓移植(自体，同基因，异体或不相关)。
术语“免疫”或“疫苗接种”描述以诱导用于治疗性或预防性原因的免疫应答为目的治疗对象的过程。
术语“体内”表示对象中的状况。
可互换地使用术语“对象”、“个体”、“生物体”或“患者”，其表示脊椎动物，优选哺乳动物。例如，在本发明的情况中，哺乳动物是人、非人灵长类、家养的动物(例如，犬、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等)、实验动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠等)以及圈养的动物(例如，动物园中的动物)。本文中使用的术语“动物”还包括人。术语“对象”还可包括患者，即，患有疾病(优选本文描述的疾病)的动物(优选人)。
术语“自体”用于描述来源于相同对象的任意物质。例如，“自体移植”是指来源于相同对象的组织或器官的移植。这样的过程是有利的，因为它们克服了免疫屏障，否则会导致排斥。
术语“异体”用于描述由多种不同元素组成的某种物质。作为示例，一个个体的骨髓转移到不同个体中构成了异体移植。异体基因是来源于非所述对象的来源的基因。
作为用于免疫或疫苗接种的组合物的一部分，优选将本文所述的一种或更多种物质与一种或更多种佐剂一起使用，用于诱导免疫应答或用于提高免疫应答。术语“佐剂”表示延长或增强或加速免疫应答的化合物。本发明的组合物优选地无需添加佐剂而发挥其作用。尽管如此，本申请的组合物可包含任何已知的佐剂。佐剂包含异质化合物的组，例如油乳剂(例如，弗氏佐剂)、无机化合物(例如，明矾)、细菌产物(例如，百日咳毒素杆菌(Bordetella pertussis)毒素)、脂质体和免疫刺激复合物。佐剂的实例是单磷酰基-脂质-A(MPL SmithKline Beecham)，皂苷例如QS21(SmithKline Beecham)、DQS21(SmithKlineBeecham；WO96/33739)、QS7、QS17、QS18和QS-L1(So et al.，1997，Mol.Cells 7：178-186)，不完全弗氏佐剂，完全弗氏佐剂，维生素E，montanid，明矾，CpG寡核苷酸(Krieg et al.，1995，Nature 374：546-549)和多种以生物可降解的油(例如，角鲨烯和/或生育酚)制备的油包水型乳剂。
根据本发明，“样品”可以是任何根据本发明可使用的样品，尤其是生物样品，例如组织样品(包括体液)和/或细胞样品，并且可以以常规方式获得，例如通过组织活检(包括穿扎活检)以及通过取血、支气管吸出物、痰、尿、粪便或其他体液。根据本发明，术语“样品”还包括处理过的样品，例如生物样品的级分或分离物，例如核酸和肽/蛋白的分离物。
也可施用刺激患者免疫应答的其它物质。例如，因为细胞因子对淋巴细胞的调节特性，可在疫苗接种中使用细胞因子。这样的细胞因子包括例如白介素-12(IL-12，证明其提高疫苗的保护性作用)(参见Science 268：1432-1434，1995)、GM-CSF和IL-18。
有很多增强免疫应答的化合物，因此其可用于疫苗接种。所述化合物包括以蛋白质或核酸形式提供的共刺激分子，例如B7-1和B7-2(分别为CD80和CD86)。
本文描述的治疗活性物质可通过任意常规的途径施用，包括通过注射或输注施用。所述施用可例如通过口服、静脉内、腹膜内、肌内、皮下或透皮来进行。
以有效量施用这里描述的物质。“有效量”是指单独地或与其它施用一起地实现期望反应或期望作用的量。在治疗特定疾病或特定病症时，期望的反应优选涉及疾病进程的抑制。这包括减缓疾病进展，尤其是干扰或逆转疾病进程。在疾病或病症的治疗中，期望的反应也可以是推迟或防止所述疾病或所述病症的发病。
本文描述的物质的有效量将取决于所要治疗的病症、疾病的严重程度、患者的个体参数(包括年龄、生理状况、体型和体重、治疗时程、伴随治疗的类型(如果有的话)、施用的特定途径以及类似因素。因此，所施用的本文描述的物质的剂量可取决于多种这样的参数。当初始剂量引起的患者反应不够时，可使用更高剂量(或通过不同的、更局部的施用途径实现有效的更高的剂量)。
本发明的药物组合物优选是无菌的并包含有效量的治疗活性物质，以产生期望的反应或期望的作用。
本发明的药物组合物一般以药学相容性的量和药学相容性的制剂来施用。术语“药学相容性”是指无毒材料，其不与药物组合物的活性组分的作用发生相互作用。这类制剂通常可包含盐、缓冲物质、防腐剂、载剂、补充的免疫增强物质(例如佐剂(如CpG寡核苷酸、细胞因子、趋化因子、皂苷、GM-CSF和/或RNA))以及适当地其它治疗活性化合物。当用于药物时，所述盐应为药学相容性盐。然而，药学不相容的盐可用于制备药学相容性盐，并且包括在本发明中。此类药理学和药学相容性盐非限制性地包含由以下的酸所制备的盐：氢氨酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、醋酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。药学相容性盐也可制备成碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。
本发明的药物组合物可包含药学相容性载剂。术语“载剂”是指天然或合成性质的有机或无机组分，其与活性组分联用从而有利于应用。根据本发明，术语“药学相容性载剂”包括一种或更多种相容性固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质，所述载剂适于施用给患者。本发明药物组合物的组分一般不发生显著损害期望药物疗效的相互作用。
本发明的药物组合物可包含合适的缓冲物质，例如盐中的醋酸、盐中的柠檬酸、盐中的硼酸和盐中的磷酸。
所述药物组合物还可酌情包含合适的防腐剂，例如苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基本甲酸酯(paraben)和硫柳汞。
通常以均一剂型提供所述药物组合物，并可通过本身已知的方式制备。本发明的药物组合物可采用例如胶囊、片剂、锭剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、酏剂的形式，或是乳剂的形式。
适于肠胃外施用的组合物通常包括活性化合物的无菌的、水性或非水性的制剂，所述制剂优选与接受者的血液等渗。相容性载剂和溶剂的实例有林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，通常无菌的不挥发油被用作溶液或混悬液介质。
通过如下的附图和实施例对本发明进行详细地描述，所述附图和实施例仅用作举例说明，而不旨在限制。基于以下描述和实施例，本领域技术人员可获得同样包括于本发明中的其它实施方案。
附图说明
图1：TCR-CD3复合物意图。胞浆内CD3免疫受体基于酪氨酸的激活基序(ITAM)表示为的圆柱状体(改编自“The T cell receptor facts book”，MP Lefranc，G Lefranc，2001年)。
图2：TCR分离/确认的技术平台。该方法集成了从分离抗原特异性T细胞(上)到TCR克隆(中)和TCR确认(下)的所有步骤。通过CrELISA(粗裂解物酶联免疫吸附测定)筛选患者对目标抗原的自身抗体应答。来自血清学阳性供体的抗原特异性T细胞用肽或加载RNA的自体DC刺激，并且通过流式细胞术分离分泌的IFNγCD8+或CD4+ T细胞(上)。从多孔板中收集单细胞，进行第一链cDNA合成和通过全局PCR扩增步骤进行富集。将TCRα/β可变区克隆到含有恒定区盒用于体外转录(IVT)的载体中(中)。TCRα/β链RNA转移到CD4+或CD8+ T细胞，与表达适当的抗原和HLA分子的APC共培养，并且测试经改造T细胞的功能性重编程(下)。
图3：来自CMV血清学阳性供体的pp65-特异性CD8+ T细胞在扩增一个星期后的流式细胞术分选。分泌IFNg的CD8+ T细胞在用自体pp65RNA转染的iDC再攻击之后被分离出来。对照：用eGFP RNA转染的iDC。
图4：由流式细胞术分析TCR转染的SupT1细胞上的TCR表面表达的验证。用TCRα/β链RNA电穿孔的SupT1细胞用panTCR抗体染色，并用流式细胞术分析。未用RNA电穿孔的SupTl细胞作为阴性对照。
图5：通过IFNγ-ELISPOT在体外扩增后从CMV血清学阳性供体的CMV-pp65-特异性CD8+ T细胞中获得的TCR的特异性检测。在加载抗原的自体iDC和K562-A＊0201细胞中测试TCR改造的IVSB细胞对pp65肽合并物，pp65495-503或pp65 IVT RNA的特异性识别。来自TPTE的部分重叠的肽作为对照肽合并物，并且SSX-2241-249用作单一肽对照。酪氨酸酶衍生的Tyr368-376表位用作阳性对照。对照TCR：从CMV血清阴性的供体中克隆的TCR。
图6：通过IFNγ-ELISPOT测定TCRCD8-CMV#1的HLA限制性和肽特异性。分析TCR-转基因IVSB细胞对K562细胞的识别，该K562细胞表达用pp65重叠肽或不用抗原(作为对照)致敏的供体的选定HLA I类等位基因。K562-B＊3501细胞随后用于分析来自CMV-pp65的单个15-mer肽的TCRCD8-CMV#1介导的识别。
图7：通过IFNγ-ELISPOT对从离体分离的CMV血清学阳性供体的CMV-pp65特异性CD8+ T细胞中克隆的TCR的特异性测定。IVSB细胞用TCRα/β链RNAs转染并用以pp65495-503致敏的K562-A＊0201刺激。无关肽SSX-2241-249和从CMV阴性供体克隆的TCR作为阴性对照，酪氨酸酶衍生的Tyr368-376表位作为阳性对照。
图8：通过萤光素酶细胞毒性测定分析TCR转染T细胞对靶细胞的特异性杀伤。表达适当的HLA等位类型的肽致敏K562靶细胞作为用CMV-pp65特异性TCR改造的IVSB细胞的靶标。作为参照，对由内源性受体介导的Tyr363-376-致敏靶细胞的杀伤进行了分析。从CMV血清阴性的供体中得到的TCR作为对照以排除非特异性裂解。E：T：效应子-靶标的比例。
图9：通过IFNγ-ELISPOT特异性检测从NY-ESO-1-特异性CD8+T细胞中分离的TCR。将TCRCD8-NY#2和-#5转移到IVSB细胞中并测试对装载NY-ESO-1 RNA的自体iDC或肽合并物的识别。阴性对照：用TPTE肽合并物致敏的iDC；从健康供体中分离的对照TCR。阳性对照：Tyr368-376致敏的K562-A＊0201。
图10：通过IFNγ-ELISPOT鉴定NY-ESO-1-特异性TCR的HLA限制元件。通过IFNγ-ELISPOT分析TCR改造的IVSB细胞对K562细胞的识别，该K562细胞用供体的单个HLA I类等位基因转染并用NY-ESO-1肽合并物致敏。阴性对照：HIV-gag肽合并物；无HLA RNA电穿孔的K562(模拟)。阳性对照：Tyr368-376肽。
图11：通过IFNγ-ELISPOT鉴定由NY-ESO-1-特异性TCR识别的15mer肽。分析TCR-转染的IVSB T细胞对K562细胞的识别，该K562细胞表达合适的HLA I类等位基因并用来自NY-ESO-1的单个部分重叠的15mer肽致敏。
图12：通过IFNγ-ELISPOT为NY-ESO-1-特异性TCR进行表位作图。分析用TCRCD8-NY#5，#6，#8或#15转染的IVSB细胞对K562-B＊3508细胞的识别，该细胞用覆盖NY-ESO-1蛋白的氨基酸77-107的单个九聚肽致敏。
图13：通过萤光素酶细胞毒性测定分析由TCRCD8-NY#2介导的靶细胞的特异性杀伤。用不同的效应子-靶标比例(E∶T)分析TCRCD8-NY#2-转染的IVSB细胞对用NY-ESO-1肽合并物致敏的K562-A＊6801细胞的特异性裂解。对照：用TPTE肽合并物致敏的靶细胞。
图14：通过IFNγ-ELISPOT测定从CD4+ T细胞中获得的NY-ESO-1-特异性TCR的HLA限制元件。分析TCR转染的CD4+ T细胞对K562的识别，所述K562表达用NY-ESO-1或HIV-gag(作为阴性对照)肽合并物致敏的患者的单个HLAII类等位基因。
图15：通过IFNγ-ELISPOT为TCRCD4-NY#5进行表位作图。测定TCR改造的CD4+ T细胞对K562细胞的识别，该K562细胞表达合适的HLAII类等位基因并用代表NY-ESO-1蛋白质的部分重叠15mer肽致敏。
图16：通过IFNγ-ELISPOT测定TCRCD8-TPT#3的HLA限制性和肽特异性。分析TCR转染的IVSB细胞对K562细胞的识别，该K562细胞表达用TPTE肽合并物致敏的患者的HLA I类分子(上)。代表整个抗原的单个15mer肽致敏的K562-B＊3501细胞(中)和覆盖TPTE的氨基酸521-535的9mer肽(下)用于确定通过TCRCD8-TPT#3识别的表位。用于结合到HLAB＊3501的识别表位的锚定氨基酸以粗体显示。
图17：通过IFNγ-ELISPOT测定从CD4+ T细胞中分离的TPTE特异性TCR的HLA限制性元件。分析TCR转染的CD4+ T细胞对K562细胞的识别，该K562细胞用患者的HLA II类等位基因转染并用与TPTE或HIV-gag(作为对照)对应的重叠肽致敏。
图18：通过IFNγ-ELISPOT为从CD4+ T细胞分离的TPTE特异性TCR进行表位作图。使用TCR转染的CD4+ T细胞与K562细胞组合测定TCR的表位定位，该K562细胞用合适的HLAII类抗原转染并用覆盖TPTE蛋白的单个部分重叠15mer肽致敏。
图19：从免疫小鼠中获得的PLAC1特异性CD8+ T细胞的流式细胞术分选。用与PLAC1或对照抗原(WT1)相对应的重叠肽致敏PLAC1免疫的HLA A＊0201-转基因小鼠(A2.1/DR1小鼠)的脾细胞。24h后收集细胞，用荧光缀合抗体染色，分离CD3+/CD8+/CD137+细胞。直方图为门控的CD3+/CD8+细胞。M1-5：PLAC1-免疫小鼠；Con1-3：对照小鼠。
图20：通过IFNγ-ELISPOT特异性检测从PLAC1-免疫小鼠的CD8+T细胞中克隆的TCR。检测TCR改造的IVSB细胞对K562-A＊0201细胞的识别，该细胞用与PLAC1或NY-ESO-1(作为对照抗原)相对应的重叠肽致敏。作为阳性对照，分析了响应Tyr368-376-致敏的抗体细胞的IFNγ分泌。
图21：通过IFNγ-ELISPOT测定TCRCD8-P1#8的肽特异性。检测TCR-转染的CD8+ T细胞对K562-A＊0201细胞的特异性识别，该细胞用覆盖PLAC1蛋白的单个部分重叠15-mer肽致敏。
图22：通过IFNγ-ELISPOT确定由PLAC1-特异性TCR识别的A＊0201-限制的免疫显性表位。分析TCR-转染的IVSB细胞对K562-A＊0201细胞的识别，该细胞用覆盖PLAC1的氨基酸25-43的单个9mer肽致敏，以确定通过TCRCD8-P1#11识别的表位。识别的肽以粗体显示。阳性对照：PLAC1 15mer肽7。
具体实施方式
本文使用的技术和方法在本文中描述或者以本身已知的方式以及例如在Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989年)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y中描述的进行。除非特别说明，所有方法(包括试剂盒和试剂的使用)根据制造商的信息进行。
实施例1：材料和方法
血清分型
根据之前描述的方案，使用基于表达全长NY-ESO-1或TPTE的N-末端(氨基酸1-51)的细菌粗裂解物的ELISA(CrELISA或Crude Lysate Enzyme-Linked ImmunoSorbentAssay)测定IgG自身抗体(Tureci，O.等，(2004)，J.Immunol.Methods 289，191-199)。
通过检测多克隆CMV特异性IgG应答的标准ELISA分析CMV血清学阳性。
细胞系和试剂
在标准条件下培养人淋巴瘤细胞系SupT1(ATCC no.CRL-1942)或Jurkat76(Heemskerk，M.H.等.(2003)，Blood，102，3530-3540)(两者均缺乏内源性TCR的表面表达)，小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3(DSMZ no.ACC 59)和人慢性粒细胞白血病细胞系K562(Lozzio，C.B.和Lozzio，B.B(1975)，Blood，45，321-334)。用HLA等位类型瞬时或稳定转染K562细胞(Britten，CM等，(2002年)，J.lmmunol.Methods，259，95-110)(指例如，K562-A＊0201)用于验证实验。根据制造商的指示培养原代人新生包皮成纤维细胞系CCD-1079Sk(ATCC号：CRL-2097)。单特异性CTL细胞系IVSB(特异于HLA A＊0201限制性酪氨酸酶衍生表位Tyr368-376)(Wolfel，T.等.(1993)，Int.J.Cancer 55，237-244；Wolfel，T.等.(1994)Eur.J.Immunol.24，759-764)在AIM-V培养基(Invitrogen，Karlsruhe，德国)里进行培养，其含有10％人AB血清(Lonza，Basel，瑞士)，350IU/ml IL-2(Richter-Helm BioLogics，Hamburg，德国)，5ng/mL IL-7(PeproTech，德国法兰克福)和10ng/ml IL-15(R&D Systems，Wiesbaden-Nordenstadt，德国)，并用受照射的SK29-Mel和AK-EBV细胞进行每周刺激。
外周血单核细胞(PBMC)，单核细胞和树突细胞(DC)
通过Ficoll-Hypaque(Amersham Biosciences公司，乌普萨拉，瑞典)密度梯度离心从白细胞层(buffy coat)或从血液样品中分离PBMC。HLA等位类型通过PCR标准方法进行测定。单核细胞用抗CD14微球(Miltenyi Biotech公司，贝吉施-格拉德巴赫，德国)富集。未成熟的DC(iDC)通过在补充细胞因子的培养基中分化单核细胞5天获得，如在Kreiter等.(2007)Cancer Immunol.Immunother.，CII，56，1577-87里描述的那样。肽和刺激细胞的肽致敏
通过标准固相化学(JPT GmbH，Berlin，Germany)合成与序列CMV-pp65，HIV-gag，TPTE，NY-ESO-I或PLAC1相对应的具有11个氨基酸重叠的N-和C-末端游离15-mer肽合并物(称为抗原肽合并物)，并溶于DMSO中至最终浓度为0.5mg/ml。九聚肽在10％DMSO的PBS溶液中重构。对于致敏，在使用不同肽浓度的培养基中在37℃下孵育刺激细胞1小时。
用于RNA体外转录(IVT)的载体
所有构建提是先前所述的pST1-sec-insert-2βgUTR-A(120)-Sap1质粒(Holtkamp，S.等.(2006)，Blood 108，4009-4017)的变体。为获得编码人TCR链的质粒，编码TCR-α或TCR-β1和TCR-β2恒定区的cDNA从人的CD8+ T细胞中进行扩增，并克隆到该主链。为产生编码鼠TCR链的质粒，编码TCR-α，-β1和-β2恒定区的cDNA定购自商品供应商并进行同源(analogously)克隆(GenBank登录号分别为M14506，M64239和X67127)。特异性V(D)J PCR产物被引入到这些盒从而得到全长TCR链(称为pSTI-人/鼠的TCRαβ-2βgUTR-A(120))。
将同源克隆自供体的PBMC的单个HLA I类和II类等位基因和源自人DC的β-2-微球蛋白(B2M)的cDNA插入这个主链(称为pST1-HLA class I/II-2βgUTR-A(120)和pST1-B2M-2βgUTR-A(120))。
先前描述了编码连接于分泌信号(sec)以及MHC I类运输信号(MITD)的CMV(pST1-sec-pp65-MITD-2βgUTR-A(120))和NY-ESO-I(pST1-sec-NY-ESO-1-MITD-2βgUTR-A(120))的pp65抗原的质粒(Kreiter，S.等.(2008)，J.Immunol.180，309-318)。PLAC1编码质粒pST1-sec-PLACI-MITD-2βgUTR-A(120)通过将从商品供应商(Genbank登录号NM_021796)获得的cDNA克隆入所述的Kreiter et al主链生成。TPTE编码质粒pST1-αgUTR-TPTE-2βgUTR-A(120)和pST1-αgUTR-TPTE-MITD-2βgUTR-A(120)通过将从商品供应商(Genbank登录号AF007118)获得的cDNA克隆入所述的Holtkamp et al载体变体生成，所述载体设有额外的α-珠蛋白的5′端非翻译区。
引物购自Operon Biotechnologies公司，科隆，德国。
产生体外转录(IVT)RNA以及转入细胞
IVT RNA的产生按先前所述的进行(Holtkamp，S.et al.(2006)，Blood 108，4009-4017)，并加入到悬浮于在预冷却的4毫米间隙的无菌电穿孔池(Bio-Rad LaboratoriesGmbH，Munich，Germany)里的X-VIVO 15培养基(Lonza，Basel，Switzerland)中的细胞。电穿孔采用Gene-Pulser-II装置进行(Bio-Rad Laboratories GmbH，Munich，Germany)(T细胞：450V/250μF；IVSB T细胞：350V/200μF；SupT1(ATCC No.CRL-1942)：300V/200μF；人DC：300V/150μF；K562：200V/300μF)。
抗原特异性的T细胞的体外扩增
以2.5×106个PBMC/孔接种24孔培养板，用肽合并物致敏，并在添加5％AB血清，10U/ml IL-2和5ng/ml IL-7的完全培养基中培养一周。对于某些实验，CD8+或CD4+ T细胞通过正磁性细胞分选(Miltenyi Biotech，Bergisch-Gladbach，Germany)从PBMC中纯化，并随后通过共培养2×106个效应子与3×105个自体DC(采用编码抗原的RNA电穿孔或用重叠肽合并物的致敏一周)在添加5％AB血清，10U/ml IL-2和5ng/ml IL-7的完全培养基中扩增。
IFNγ分泌测定后抗原特异性CD8+或CD4+ T细胞的单细胞分选
单一抗原特异性的CD8+或CD4+ T细胞的流式细胞术分选直接离体从新鲜分离的T细胞或PBMC进行，或在抗原特异性扩增一周后进行。2×106个T细胞或PBMC用3×105个自体DC(所述DC载有肽合并物，或用编码相应抗原或对照抗原的IVT RNA转染)刺激4-15小时(取决于刺激模式)。收集细胞，根据IFNγ分泌测定试剂盒(Miltenyi Biotech，Bergisch-Gladbach，Germany)，用藻红蛋白(PE)缀合的抗IFNγ抗体，异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗-CD8和别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗CD4抗体进行处理。分选在BD FACS Aria流式细胞仪(BD Biosciences，Heidelberg，Germany)上进行。分选IFNγ和CD8或CD4双阳性细胞，并以每孔一个细胞收集在96孔V-底板(Greiner Bio-One GmbH，Solingen，Germany)，96孔V-底板包含NIH3T3小鼠成纤维细胞作为饲养层细胞，4℃离心并立即在-80℃保存。
通过用IVT RNA结内免疫HLA A2.1/DR1小鼠体内引发T细胞
通过采用编码抗原的IVT RNA通过重复结内免疫针对目的抗原体内引发A2.1/DR1小鼠的T细胞(Pajot A.et al.(2004)，Eur.J.Immunol.34，3060-69)(Kreiter S.et al.(2010)，Cancer Research 70，9031-40)。对于结内免疫，采用甲苯噻嗪/氯胺酮麻醉小鼠。通过外科手术暴露腹股沟淋巴结，10μl RNA(20μg)稀释于林格氏溶液和无RNA酶的水中，采用一次性0.3ml注射器和超细针头(31G，BD Biosciences)缓慢注射，并缝合伤口。六个免疫周期后，处死小鼠并分离脾细胞。
收集脾细胞
在无菌条件下进行解剖后，脾脏转移到含PBS的falcon管中。脾脏以镊子机械破碎并用细胞过滤网(40μm)得到细胞悬液。脾细胞用PBS清洗，离心，并再悬浮于用于红细胞裂解的低渗缓冲液中。在室温(RT)下孵育5分钟后，通过加入20-30ml培养基或PBS停止反应。离心脾细胞并用PBS清洗两次。
CD137染色后抗原特异性CD8+T细胞的单细胞分选
对于抗原特异性的再刺激，将免疫的A2.1/DR1小鼠的2.5×106个/孔脾细胞接种在24孔板上并用编码目标或对照抗原的重叠肽合并物致敏。孵育24小时后收集细胞，用FITC缀合的抗CD3抗体，PE缀合的抗CD4抗体，PerCP-Cy5.5缀合的抗CD8抗体和Dylight-649缀合的抗CD137抗体染色。分选在BD FACS Aria流式细胞仪(BD Biosciences)上进行。分选CD137，CD3和CD8或CD4阳性细胞，以每孔一个细胞收集到包含人CCD-1079Sk细胞作为饲养细胞的96孔V型底板(Greiner Bio-One)，4℃离心并立即在-80℃保存。
RNA提取，基于SMART的cDNA合成和自分选细胞的非特异性扩增
根据供应商的说明，采用RNeasy Micro试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)提取源自分选T细胞的RNA。将改进的BD SMART方案用于cDNA合成：BD PowerScript逆转录酶(BDClontech，Mountain View，CA)与寡聚(dT)-T-长引物(引发第一链的合成反应)和TS-short(Eurogentec S.A.，Seraing，Belgium)(引入寡(riboG)序列，以通过逆转录酶末端转移酶活性产生延伸的模板和模板转换(Matz，M.et al.(1999)Nucleic Acids Res.27，1558-1560))组合。根据制造商的说明在200μM的dNTP的存在下，用5U PfuUltra Hotstart High-Fidelity DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)和0.48μM引物TS-PCR引物经历21个扩增循环(循环条件：95℃ 2分钟，94℃ 30秒，65℃ 30秒，72℃ 1分钟，72℃ 6分钟的最终延伸)合成的第一链cDNA。用人或鼠TCR-β恒定区特异性引物对照TCR基因的成功扩增，连续的克隆型特异性人或鼠
Figure BSA0000192479990000631
仅在检测到强条带的条件下进行。
用于扩增HLA I类或II类序列的第一链cDNA由SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)和寡聚(dT)引物以及1-5μg提取自患者的PBMC的RNA合成。
用于TCR和HLA扩增的PCR引物的设计
对于人的TCR通用引物的设计，在ImMunoGeneTics(IMGT)数据库(http：//www.imgt.org)列出的所有67个TCR-Vβ和54个TCR-Vα基因(开放阅读框和假基因)连同其相应的前导序列用BioEdit序列比对编辑器(例如http：//www.bio-soft.net)进行比对。长度为24-27个碱基对(bp)的正向引物至多包含3个简并碱基，鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的含量在40-60％之间，并且在3′端的鸟嘌呤或胞嘧啶设计为对尽可能多地与前导序列退火并配备了15个碱基对的5′延伸端，其设有稀有的限制性酶切位点和Kozak序列。反向引物设计为对恒定区基因的第一外显子退火，其中引物TRACex1_as结合对应于Cα的7-16氨基酸序列，TRBCex1_as对应Cβ1和Cβ2中的8-16氨基酸(aa)。两个寡核苷酸都合成有5′磷酸。引物合并在具有相同的退火温度的2-5个正向寡核苷酸的合并物中。
复制这种策略用于鼠TCR通用引物的设计，比对列出的129个TCR-Vα和列出的35个TCR-Vβ基因。反向引物mTRACexl_as和mTRBCexI_as分别与对应于24-31和8-15氨基酸的序列是同源的。
通过比对在安东尼诺兰研究院网址(www.anthonynolan.com)列出的所有HLA I类和II类序列，采用BioEdit序列比对编辑器设计HLA通用引物。长度为23-27个碱基对的正向引物至多包含3个简并但维持代码的碱基，其与尽可能多的一个基因座的HLA序列退火，其配有5′磷酸和Kozak序列延伸。反向引物的设计类似，但没有摆动碱基的引入，并配有14个碱基对的编码AsiSI限制性内切酶位点的5′延伸。
PCR扩增以及V(D)J和HLA序列的克隆
分离自T细胞的3-6μl预扩增的cDNA在0.6μM
Figure BSA0000192479990000641
特异性寡核苷酸合并物，0.6μM
Figure BSA0000192479990000642
或
Figure BSA0000192479990000643
寡核苷酸，200μM的dNTP和5U Pfu聚合酶的存在下经历40个PCR循环(循环条件：95℃ 2分钟，94℃ 30秒，退火温度30秒，72℃ 1分钟，72℃最终延伸6分钟)。采用Qiagen毛细管电泳系统分析PCR产物。400-500个碱基对条带的样品在琼脂糖凝胶上按大小分级，使用凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)剪切并纯化条带。进行序列分析，以揭示V(D)J结构域和β恒定区两者的序列，分别作为TRBCex1_as与mTRBCex1_as引物，分别匹配在人和小鼠中的TCR恒定区基因β1和β2。消化DNA，并克隆到含有对于完整的TCR-α/β链适当的主链的IVT载体中。
使用特异性的HLA I或II类的正义和反义引物，根据制造商的说明，从供体的特异性cDNA用2，5U Pfu聚合酶对HLA序列进行扩增。由于DRB3基因的转录至少低于DRB1基因的转录五倍(Berdoz，J.et al.(1987)J.Immunol.139，1336-1341)，采用巢式PCR方法分两步对DRB3基因进行扩增。纯化PCR片段，经AsiS1消化并克隆入EcoRV-和AsiS1消化的IVT载体。使用QuikChange定点突变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)，对插入物中的EciI-或SapI位点进行突变。
流式细胞分析
使用PE缀合的抗TCR抗体(针对适当的TCRβ链的可变区家族或恒定区)(BeckmanCoulter Inc.，Fullerton，USA)和FITC-/APC-标记的抗-CD8/-CD4抗体(BD Biosciences)，通过流式细胞术分析转染的TCR基因的细胞表面表达。HLA抗原通过用FITC标记的HLA II类特异性抗体(Beckman Coulter Inc.，Fullerton，USA)和PE标记的HLA I类特异性抗体(BDBiosciences)染色进行检测。流式细胞分析采用Cellquest-Pro软件(BD Biosciences)，在FACS Calibur分析型流式细胞仪上实施。
萤光素酶细胞毒性测定
对于细胞介导的细胞毒性的测定，建立基于生物发光的分析作为对51Cr释放的替代和优化。与标准的铬释放分析相比，该分析通过计算共孵育后表达萤光素酶的有活力靶细胞数来计算效应细胞的裂解活性。目标细胞稳定地或短暂地用萤光素酶基因转染，萤光素酶基因编码来自萤火虫Photinus pyralis(EC 1.13.12.7)的萤火虫萤光素酶。萤光素酶是催化萤光素氧化的酶。该反应是ATP依赖的，并且以两个步骤发生：
萤光素+ATP-萤光素腺苷酸(luciferyl adenylate)+PPi
萤光素腺苷酸+O2-氧化荧光素+AMP+光
目标细胞以104个细胞每孔的浓度铺入白色96孔板(Nunc，Wiesbaden，Germany)，并与不同数量的TCR转染T细胞共培育，终体积为100μl。3小时后，将50μl包含D-Luciferin(BD Biosciences)的反应混合物(Luciferin(Iμg/μl)，HEPES-buffer(50mM，pH)，Adenosine5′-triphosphatase(ATPase，0.4mU/μl，Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)加入到细胞中。通过加入ATP酶到反应发光混合物，使从死亡细胞释放的萤光素酶导致的发光减少。
在总共孵育4小时后，有活力细胞散发的生物荧光使用Tecan Infinite 200读数器(Tecan，Crailsheim，Germany)进行测量。计算细胞致死活性，关于通过加入2％Triton-X100诱导的完全细胞裂解后获得的荧光值，并与靶细胞单独散发的荧光相关联。输出的数据以每秒计数，并且特异性裂解百分比计算如下：(1-(CPSexp-CPSmin)/(CPSmax-CPSmin)))＊100。
在孵育的没有效应子的靶细胞后评估最大荧光值(每秒计数的最大值，CPSmax)，并且在用于完全裂解的去垢剂Triton-X-100处理靶标后评估最小荧光值(CPSmin)。
ELISPOT(酶联免疫斑点检测技术)
微量滴定板(Millipore，Bedford，MA，USA)在室温下用抗IFNγ抗体1-Dlk(Mabtech，Stockholm，Sweden)包被过夜，并用2％人血白蛋白(CSL Behring，Marburg，Germany)阻止。电穿孔24小时后，提供抗原呈递刺激器细胞以2-5×104/孔连同TCR转染的CD4+或CD8+效应子细胞以0.3-3×105个/孔重复三次铺板。孵育平板过夜(37℃，5％CO2)，用含有0.05％吐温20的PBS清洗，并用抗-IFNγ生物素酰化的mAB 7-B6-1(Mabtech)以终浓度1μg/ml在37℃孵育2小时。抗生物素蛋白结合辣根过氧化物酶H(Vectastain Elite试剂盒；Vector Laboratories，Burlingame，USA)加入孔中，室温孵育1小时并用3-氨基-9乙基咔唑显影(Sigma，Deisenhofen，Germany)。
实施例2：对病毒抗原CMV-pp65特异的TCR的分离
使用人的巨细胞病毒(CMV)-磷蛋白65(CMV-pp65，pp65，低于基质磷蛋白65kDa，UL83)作为模型抗原建立TCR分离/确认方法(图2)，众所周知，这会在健康供体的外周血中诱导高频率的抗原特异性T细胞。
CMV是普遍存在的通过体液(例如血液或唾液)来感染寄主的β-疱疹病毒。在健康的个体中，原发性CMV感染和内源性潜伏病毒的再活化受免疫系统控制，而在免疫功能低下的个体中(例如移植接受者或艾滋病患者)，其会导致显著的发病率和死亡率。
病毒被膜蛋白pp65是CMV特异性细胞毒T淋巴细胞的主要靶标，其高频率存在于非免疫功能低下血清阳性的个体中(Kern，F.et al.(1999)，J.Virol.73，8179-8184；Wills，M.R.et al.(1996)，J.Virol.70，7569-7579；Laughlin-Taylor，B.et al.(1994)，J.Med.Virol.43，103-110)。
来自血清阳性的健康供体的CMV-pp65-特异性的IFNγ分泌CD8+ T细胞，在抗原特异性扩增1周并采用转染编码整个pp65抗原的IVT RNA的自体DC再攻击后，通过流式细胞术分离(图2上，图3)。
TCR α/β可变区采用一组序列特异性的并部分简并的寡核苷酸，从单一T细胞扩增。扩增产物位点定向克隆入载体，载体包含提供体外即时转录全长模板的TCR α/β恒定区(图2中)。
对于细胞表面表达的检验，TCR α/βRNA被转入SupT1细胞(否则缺乏内源性TCR链的表达)，并通过流式细胞术进行分析(图4)。
对于克隆的TCR的功能性确认，识别酪氨酸酶衍生表位Tyr365-376(Wolfel T.etal.(1994)，But J.Immunol 24，759-64)的单特异性T细胞系IVSB用TCR RNA转染，并通过IFNγ-ELISPOT分析响应pp65抗原的特异性细胞因子分泌(图2下，图5)。由于TCR通过整个抗原刺激生成，其用于评估自体DC介导的特异性识别，其用pp65肽合并物或编码IVT RNA的pp65两者之一进行致敏。不相关的TPTE肽合并物用作对照。与分离自CMV血清阴性供体的对照TCR相比，TCRCD8-CMV#1和TCRCD8-CMV#4均特异性识别pp65表达的靶细胞。
为确定HLA限制性元件，用TCRCD8-CMV#1转染的IVSB细胞在与表达所述患者选择的HLA等位基因的肽致敏K562细胞共培养后，用于分析特异性IFNγ分泌(图6上)。HLA B＊350l被确认为限制元件。pp65肽合并物的单个15mer肽分析揭示了肽P30，P31和P32的识别，反应性逐渐下降(图6下)。这使通过TCRCD8-CMV#1识别的表位局限在pp65的氨基酸117-131区域内，暗示与先前报道的以及高免疫原性HLA B＊350l限制表位CMV-pp65123-131(Seq.IPSINVHHY)(Gavin，M.A.等.(1993)，J.ImmunoL 151，3971-3980)一致。
在成功地从体外扩增到高频数的pp65特异性的CD8+ T细胞分离TCR后，TCR分离方法应用于离体分选呈递较低频数的T细胞。
磁性纯化自HLAA＊0201阳性供体的PBMCs的CD8+ T细胞，用自体靶细胞刺激，自体靶细胞用免疫显性的HLA A＊0201限制表位PP65495-503致敏，并且激活的IFNγ分泌T细胞通过流式细胞术分选。
自CD8+ T细胞离体获得的TCR的特异性，在与pp65495-503预敏化后，通过IFNγ-ELTSPOT分析法分析。如图7所示，与对照肽相比，六分之四的TCR能更改IVSB细胞以识别用pp65495-503致敏的K562-A＊0201细胞。相比之下，分离自CMV血清阴性供体的配备对照TCR的IVSB细胞，在与用pp65495-503致敏的K562-A＊0201细胞培养时就不分泌IFNγ。
为证明克隆的pp65特异的TCR也能介导细胞裂解的效应子功能，基于萤光素酶细胞毒性测定使用转染TCRCD8-CMV#1或TCRCD8-CMV#14的IVSB细胞进行。
将适当的靶细胞特异性杀伤(分别用pp65117-131致敏的K562_B＊3501细胞和用pp65495-503致敏的K562_A＊0201细胞)与用Tyr368-376-致敏的、通过IVSB效应子内源性的TCR介导的K562A＊0201细胞的杀伤进行对比(图8)。
效应子与靶标(E∶T)的比率的滴定证明用适当的pp65肽致敏的靶细胞通过TCR转染的IVSB细胞特异性裂解。高达85％的靶细胞通过分别用转染TCRCD8-CMV#1和TCRCD8-CMV#14转染的IVSB细胞杀伤。显著地，作为天然的TCR，重组TCR在E∶T比率的宽范围内介导了相同效率的裂解。
总之，如表1所列出的，13hCMV-pp65-特异的TCR从CD4+和CD8+ T细胞中分离，CD4+和CD8+ T细胞从离体或抗原特异性扩增后的4位不同的CMV血清阳性的供体中获得。
实施例3：对肿瘤抗原NY-ESO-1特异的TCR的分离
经过概念研究的证明，使用CMV-pp65作为病毒模型抗原，其引发抗原特异性T细胞的高频率，我们评价了我们从低丰度的抗原特异性T细胞群中克隆TCR的方法的能力。预成T细胞抗肿瘤相关自蛋白的频率总体上大幅低于持久病毒引发T细胞的频率。对于我们方法的应用于肿瘤环境，我们采用高免疫原性的肿瘤抗原NY-ESO-1.
NY-ESO-1是癌症/睾丸抗原，其在正常成人组织中的睾丸精子细胞里表达。NY-ESO-1(同义词：CTG.CTAG， CTAG1，ESO1，LAGE-2，LAGE2，LAGE2A，LAGE213，OTTHUMP00000026025，OTTHUMP00000026042)是通过SEREX确认的最好的表征癌症睾丸的抗原之一(Chen，Y.T.等.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94，1914-1918)，其在各种恶性肿瘤中表达，包括黑色素瘤，食道癌，乳腺癌，前列腺癌，尿道癌，卵巢癌和肺癌(Chen，Y.T.等.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94，1914-1918；Jungbluth，A.A.等.(2001)mt.J.Cancer 92，856-860；Schultz-Thater，E.等.(2000)Br.J.Cancer 83，204-208)。由于它的天然免疫原性，促成其作为肿瘤疫苗疫苗接种策略的模型抗原。NY-ESO-1常常引发患有NY-ESO-1表达肿瘤患者中的高效价抗体应答，并且表明抗NY-ESO-1的自身抗体应答经常与抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞的存在相关(Zeng，G.等.(2001)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98，3964-3969；Jager，E.等.(1998)，J.Exp.Med.187，265-270；Gnjatic，S.等.(2003)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 100，8862-8867；Valmori，D.等.(2007)，Clin.Immunol.122，163-172)。
我们选择罹患非小细胞肺癌(NSCLC)的患者，以其抗NY-ESO-1自身抗体反应为依据，用NY-ESO-1肽合并物致敏患者的大量PBMCs并扩增1周。在暴露于自身NY-ESO-1RNA转染的DC后，分选IFNγ分泌的CD8+ T细胞并从单一细胞克隆TCR。通过IFNγ-ELISPOT分析TCR对表达靶细胞NY-ESO-1识别的鉴定的确认，导致从患者中得7个NYESO-1特异性的TCR。如图9所示，无论用NY-ESO-1肽合并物致敏还是用NY-ESO-1 RNA染，TCR均识别DCs，后者证实了自然加工表位的识别。
通过IFNγ-ELISPOT测定NY-ESO-1特异性的TCR的HLA限制性，使用TCR-转染的IVSB效应子与表达单个HLA I类等位基因的K562细胞共培养，并用NY-ESO-1肽合并物致敏。代表性的结果在图10中显示。
对于表位定位，IVSB T细胞用NY-ESO-1特异的TCR转染，并与表达适当的HLA抗原的K562细胞共培养，用贯穿NY-ESO-1蛋白的单个重叠的15mer肽致敏。TCR转染的T细胞抗NY-ESO-1肽的反应通过IFNγ-ELISPOT分析进行分析(图11)。
显著地，所有7种TCR的表位定位于NY-ESO-1蛋白的氨基酸85-111位(图11，12)。此区域由于疏水性序列经过有效蛋白体裂解是已知的，并经处理进入有不同HLA限制性的多重表位(Valmori，D.et al.(2007)，din.linmunol.122，163-172)。通过筛选系列九聚物，我们缩窄了TCRCD8-NY#5，#6，#8和#15到NY-ESO-192-100(seq.LAMPFATPM)的HLA-B＊3508限制表位(图12)。
为表明分离自CD8+ T细胞的NY-ESO-1特异的TCR可以介导细胞裂解的效应器功能，分析了TCR转基因的IVSB细胞对肽致敏的K562-A＊6801细胞的特异性杀伤。如图13所示，IVSB效应子通过TCRCD8-NY#2重编程，以在不同的E∶T比率下特异性地溶解靶细胞。
分离自两位其他NSCLC血清阳性患者的CD4+ T细胞的TCR的确认导致9个对立的功能性NY-ESO-1特异的TCR的克隆。限制元件的测定(图14)和表位定位的限制(图15)显示这些TCR中的7个识别在上文中的不同的HLA II类等位基因的包含氨基酸117-147的肽伸展中的表位，提示存在一个对T辅助细胞表位的热点(表5)。
到目前为止，16种NY-ESO-1特异的TCR从取自3位不同的NSCLC患者的CD4+和CD8+克隆，并具有关于HLA限制性和肽特异性的特征(表2)。
实施例4：对肿瘤抗原TPTE特异的TCR的分离
TPTE(张力蛋白同源性的跨膜磷酸酶；同义词：CT44，PTEN2，EC3.1.3.48，OTTHUMP00000082790)是精子细胞特异的脂质磷酸酶，其在众多人癌症中异常转录(Chen，H.等.(1999)，Hum.Genet.105，399-409；Dong，X.Y.等.(2003)，Br.J.Cancer 89，291-297；Singh，A.P.等.(2008)，Cancer Left.259，28-38)，但关于其免疫原性知之甚少并且T细胞应答至今没有报导。
为了分离TPTE特异的TCR，选择在预筛选CrELISA中显现显著吸光度的3名NSCLC患者用于抗原特异性扩增，并且流式细胞术分选TPTE特异性的CD8+和CD4+ T细胞。
确认分离自CD8+ T细胞的TCR用于识别表达TPTE的靶细胞，并具有关于HLA限制性和表位特异性的特征，如图16中示范性所示的TCRCD8TPT#3。此TCR表明特异识别K562细胞的重新编程的IVSB细胞呈递在HLA B＊3501上的TPTE肽(图16上)。HLA B＊3501限制的表位可定位于TPTE 15mer肽P130，P131和P132，其对表现TPTE的氨基酸521-535的肽P131有高反应性(图16中)。通过分析覆盖此区域的系列九聚物，新的表位TPTE527-535(序列YPSDFAVEI)可以确定，其依从结合B＊3501的基序的必要条件，以脯氨酸在位置2做为锚残基，天冬氨酸做为荷电的残基在位置4和异白氨酸做为疏水氨基酸在位置9(Falk，K.等.(1993)，Immunogenetics 38，161-162)(图16下)。
类似地，分离自CD4+ T细胞的TCR用于确认特异性识别表达TPTE和供体的单个HLAII类等位基因的K562细胞(图17)。HLA限制性测定后，TPTE特异的TCR用于分析识别TPTE15mer肽以便定位识别的表位(图18)。
至今，总共鉴别了31种功能性TPTE反应活性的TCR，其中，2种来源于3名不同NSCLC患者的CD8+细胞，并且29种来源于3名不同NSCLC患者的CD4+细胞(表3)。使用单肽致敏的HLA等位基因表达的K562靶细胞对表位的精确定位，揭示表位分布于整个TPTE蛋白序列(表5)。
实施例5：从免疫的A2.1/DR1小鼠的T细胞分离高亲和性PLAC1特异的TCR
滋养层特异基因PLAC1(PLACenta-specific 1，同义词：OTTHUMP00000024066；cancer/testis antigen 92)是癌症相关的胎盘基因的新成员(Koslowski M.等.(2007)，Cancer Research 67，9528-34)。PLAC1在人恶性肿瘤中广泛异位表达，在乳癌中最为常见，并且其基本上参与癌细胞增殖，转移，和侵袭。
为获得特异于PLAC1的TCR，我们改变了抗原特异性T细胞的来源。由于分离自癌症患者天然组成成分的TCR由于中枢耐受机制通常具有低亲和性，我们施用替代方法绕过耐受以产生高亲和性特异于PLAC1的T细胞。HLAA2.1/DR1转基因小鼠的T细胞(Pajot A.等.(2004)，Fur.J.Immunol.34，3060-69)通过使用PLAC1编码IVT RNA重复结内免疫体内接触人PLAC1抗原而引发(Kreiter S.等.(2010)，Cancer Research 70，9031-40)。从这些小鼠获得的脾细胞采用PLAC1重叠肽进行再攻击，随后根据它们激活诱导的CD137上调，检测和分离抗原特异性T细胞(图19)。显著地，在所有5只小鼠中，PLAC1特异性T细胞的显著的百分比(CD8+细胞的16-48％)可以通过使用PLAC1 IVT RNA的结内免疫建立。
对于克隆自小鼠CD8+ T细胞的TCR的确认，通过IFNγ-ELISPOT，TCR设计的IVSB细胞用于分析响应于PLAC1肽致敏的K562A＊0201细胞的特异性细胞因子分泌(图20)。相较于对照抗原，总共11种TCR显示出介导用来源于PLAC1的肽致敏的K562A＊0201细胞的特异性识别。显著地，通过PLAC1特异性TCR介导的IFNγ的分泌与那些通过内源性的IVSB效应子的TCR介导的相比甚至更高。通过使用单肽致敏的HLA等位基因表达的K562靶细胞的表位定位，揭示所有鉴定的PLAC1特异的TCR识别15mer肽7和8，其代表PLAC1的氨基酸25-43(图21)。通过筛选覆盖此区的系列九聚物，我们鉴定了两个HLA-A＊0201限制表位：PLAC1氨基酸28-36和氨基酸30-41，对氨基酸31-39的最佳识别(图22，表5)。尤其是，获自4只不同小鼠的所有PLAC1特异的TCR均表明识别这两个表位，这表明这些PLAC1肽的优先加工以及有效结合并呈递在HLA A＊0201上。与氨基酸28-26相比，所有TCR介导响应于氨基酸31-39的升高的IFNγ分泌。后者仅被TCR中的一些专属识别。
通过克隆11种PLAC1特异的TCR(表4)和呈递免疫显性的PLAC1表位的两个HLA A＊0201的确认(表5)，我们能够表明通过用编码抗原的IVT RNA结内免疫A2/DR1小鼠体内引发的T细胞为TCR分离的可利用来源。
结论
我们能够建立通用平台技术，其用于有效克隆和快速鉴定自小抗原特异性T细胞的免疫学相关TCR，不需要T细胞的克隆或系的生成以及限制元件或T细胞表位的现有知识。
我们的对于病毒和肿瘤抗原的TCR分离/确认方法的使用，导致70种以上抗原特异性TCR的发现(表1，2，3，4)，其中远超过一半直接对抗新的HLA呈递表位(表5)。
尤其是，来自单一供体的一些来源于CD8+以及CD4+ T淋巴细胞的TCR特异性并行克隆，并表明重编程T细胞效应子用于各自抗原的识别。
这种方法使得以对于“现成的”用途及时的方式生成了TCR的大型库，填充了在癌症，自身免疫和感染性疾病的领域中，用于抗原特异性治疗方法的大量靶结构的实用性和小量的合适的候选TCR之间的空白。
表
表1：hCMV pp65特异性TCR
Figure BSA0000192479990000721
表2：NY-ESO-1特异性TCR
Figure BSA0000192479990000722
表3：TPTE-特异性TCR
Figure BSA0000192479990000731
Figure BSA0000192479990000732
表4：PLAC1-特异性TCR
Figure BSA0000192479990000741
a根据IMGT命名法命名TCR V(D)J基因；实施例：Vβ7.9是Vβ基因亚组7中的第9基因，而Vβ7.9_3是亚组7的基因9的第三个等位基因。如果他们与等位基因1不同，则等位基因仅用下划线具体指定。
b命名以HLA-和基因座名称开头的HLA等位基因，然后*和一些数字指定等位基因。前两个数字指定等位基因 第三到第四个数字指定同义的等位基因。数字五到六表示在该基因编码′内的任何同义的突变。第七和第八个数字区分编码区域以外的突变。
c TCR β基因是V12.4_1或V12.4_2
d TCR β基因是V6.2或V6.3
e TCR α基因是V9D.1_1或V9D.1_2
f TCR α基因是J31_1或J31_2
g不规则的TCR-识别一个以上的表位
aa＝氨基酸
表5：来自抗原hCMVpp65，NY-ESO-I，TPTE，PLAC1的T细胞表位
Figure BSA0000192479990000751
Figure BSA0000192479990000761
以下显示了获得的T细胞受体序列。下划线表示的序列是CDR序列，其中各T细胞受体链中的第一序列是CDR1，之后是CDR2和CDR3。
1.hCMV pp65特异性T细胞受体
TCRCD8-CMV#1：
SEQ ID NO：4；＞Vα1.2 J24_2 C(V-＞A)
Figure BSA0000192479990000771
SEQ ID NO：5；＞Vβ3.1 D2 J2.1 C2(C-＞T)
Figure BSA0000192479990000772
TCRCD8-CMV#4：
SEQ ID NO：6；＞Vα3 J43 C
Figure BSA0000192479990000773
SEQ ID NO：7；＞Vβ6.5 D1 J1.2 C1(S-＞R)
Figure BSA0000192479990000774
TCRCD8-CMV#8：
SEQ ID NO：8；＞Vα22 J58 C
Figure BSA0000192479990000775
SEQ ID NO：9；＞Vβ10.1 D J1.4 C1
Figure BSA0000192479990000776
TCRCD8-CMV#9：
SEQ ID NO：10；＞Vα19 J26 C
Figure BSA0000192479990000781
SEQ ID NO：11；＞Vβ13 D2 J2.1 C2(MLSLPDSAWN-＞MG)
Figure BSA0000192479990000782
TCRCD8-CMV#10：
SEQ ID NO：12；＞Vα24 J49 C
Figure BSA0000192479990000783
SEQ ID NO：13；＞Vβ6.5 D1 J1.2 C1
Figure BSA0000192479990000784
TCRCD8-CMV#11：
SEQ ID NO：14；＞Vα16 J36 C
Figure BSA0000192479990000785
SEQ ID NO：15；＞Vβ25.1 D1 J2.2 C2(T-＞G；M-＞G)
Figure BSA0000192479990000786
TCRCD8-CMV#12：
SEQ ID NO：16；＞Vα39 J58 C
Figure BSA0000192479990000787
Figure BSA0000192479990000791
SEQ ID NO：17；＞Vβ9 D2 J2.2 C2(F-＞T)
Figure BSA0000192479990000792
TCRCD8-CMV#14：
SEQ ID NO：18；＞Vα24 J21 C
Figure BSA0000192479990000793
SEQ ID NO：19；＞Vβ3.1 D2 J2.2 C2(C-＞T)
Figure BSA0000192479990000794
TCRCD8-CMV#15：
SEQ ID NO：20；＞Vα12.3 J43 C
Figure BSA0000192479990000795
SEQ ID NO：21；＞Vβ12.4 D1 J1.4 C1
Figure BSA0000192479990000796
TCRCD8-CMV#16：
SEQ ID NO：22；＞Vα13.1_2 J50 C
Figure BSA0000192479990000797
SEQ ID NO：23；＞Vβ25.1 J1.3 C1(TI-＞GT)
Figure BSA0000192479990000798
Figure BSA0000192479990000801
TCRCD4-CMV#1：
SEQ ID NO：24；＞Vα21 J43 C
Figure BSA0000192479990000802
SEQ ID NO：25；＞Vβ3.1 D1 J1.1 C1(C-＞T)
Figure BSA0000192479990000803
TCRCD4-CMV#3：
SEQ ID NO：26；＞Vα8.6_2 J37_2 C
Figure BSA0000192479990000804
SEQ ID NO：27；＞Vβ6.1 D1 J1.2 C1(I-＞L)
Figure BSA0000192479990000805
TCRCD4-CMV#5：
SEQ ID NO：28；＞Vα22 J49 C
Figure BSA0000192479990000806
SEQ ID NO：29；＞Vβ6.2 D2 J2.3 C2(G-＞A)
Figure BSA0000192479990000807
2.NY-ESO-I-特异性T细胞受体
TCRCD8-NY#2：
SEQ ID NO：30；＞Vα3 J28 C
Figure BSA0000192479990000811
SEQ ID NO：31；＞Vβ20.1_2 J2.3 C2
Figure BSA0000192479990000812
TCRCD8-NY#5：
SEQ ID NO：32；＞Vα24 J3 C
Figure BSA0000192479990000813
SEQ ID NO：33；＞Vβ7.6 D2 J2.2 C2(S-＞R)
Figure BSA0000192479990000814
TCRCD8-NY#6：
SEQ ID NO：34；＞Vα17 J47_2 C
Figure BSA0000192479990000815
SEQ ID NO：35；＞Vβ12.3 D2 J2.1 C2(F-＞L)
Figure BSA0000192479990000816
TCRCD8-NY#8：
SEQ ID NO：36；＞Vα8.6_2 J9 C(A-＞V)
Figure BSA0000192479990000817
Figure BSA0000192479990000821
SEQ ID NO：37；＞Vβ28.1 D1 J1.1 C1
Figure BSA0000192479990000822
TCRCD8-NY#12：
SEQ ID NO：38；＞Vα1.1 J23 C
Figure BSA0000192479990000823
SEQ ID NO：39；＞Vβ4.1 D2 J2.1 C2(C-＞S)
Figure BSA0000192479990000824
TCRCD8-NY#13：
SEQ ID NO：40；＞Vα5 J33 C
Figure BSA0000192479990000825
SEQ ID NO：41；＞Vβ5.5_2 D1 J2.5 C2(PG-＞TR；C-＞F)
Figure BSA0000192479990000826
TCRCD8-NY#15：
SEQ ID NO：42；＞Vα12.2_2 J53 C(K-＞I)
Figure BSA0000192479990000827
SEQ ID NO：43；＞Vβ4.1 D2 J2.5 C2(C-＞S)
Figure BSA0000192479990000828
Figure BSA0000192479990000831
TCRCD4-NY#1：
SEQ ID NO：44；＞Vα22 J20 C(Donor SNP N-＞K)
Figure BSA0000192479990000832
SEQ ID NO：45；＞Vβ9 D1 J1.1 C1(F-＞T)
Figure BSA0000192479990000833
TCRCD4-NY#3：
SEQ ID NO：46；＞Vα12.3 J54 C
Figure BSA0000192479990000834
SEQ ID NO：47；＞Vβ11.2 D2 J2.2 C2
Figure BSA0000192479990000835
TCRCD4-NY#5：
SEQ ID NO：140；＞Vα8.4_3 J48 C
Figure BSA0000192479990000836
SEQ ID NO：141；＞Vβ4.1 D1 J1.5 C1(GCKL→SNQV)
Figure BSA0000192479990000837
TCRCD4-NY#7：
SEQ ID NO：142；＞Vα8.6_2 J13_2 C
Figure BSA0000192479990000841
SEQ ID NO：143；＞Vβ20.1 D2 J2.5 C2
Figure BSA0000192479990000842
TCRCD4-NY#10：
SEQ ID NO：144；＞Vα9.2_3 J42 C
Figure BSA0000192479990000843
SEQ ID NO：145；＞Vβ7.9_3 D2 J2.7 C2(S→R)
Figure BSA0000192479990000844
TCRCD4-NY11：
SEQ ID NO：146；＞Vα8.1 J23 C
Figure BSA0000192479990000845
SEQ ID NO：147；＞Vβ11.2 D1 J1.2 C1
Figure BSA0000192479990000846
TCRCD4-NY#13：
SEQ ID NO：148；＞Vα21_2 J24_2 C
Figure BSA0000192479990000847
Figure BSA0000192479990000851
SEQ ID NO：149；＞Vβ7.9_3 D1 J2.3 C2(S→R)
Figure BSA0000192479990000852
TCRCD4-NY#16：
SEQ ID NO：150；＞Vα8.4_3 J10 C
Figure BSA0000192479990000853
SEQ ID NO：151；＞Vβ20.1 D1 J1.5 C1
Figure BSA0000192479990000854
TCRCD4-NY#14：
SEQ ID NO：176；＞Vα8.4_3 J37_2 C
Figure BSA0000192479990000855
SEQ ID NO：177；＞Vβ3.1 D2 J1.3 C1
Figure BSA0000192479990000856
3.TPTE特异性T细胞受体：
TCRCD8-TPT#3：
SEQ ID NO：48；＞Vα27 J16 C
Figure BSA0000192479990000861
SEQ ID NO：49；＞Vβ7.9 D2 J2.2 C2
Figure BSA0000192479990000862
TCRCD8-TPT#35：
SEQ ID NO：50；＞Vα19 J17 C
Figure BSA0000192479990000863
SEQ ID NO：51；＞Vβ12.4 D2 J2.7 C2(L-＞F)
Figure BSA0000192479990000864
TCRCD4-TPT#4：
SEQ ID NO：52；＞Vα14/DV4 J48 C
Figure BSA0000192479990000865
SEQ ID NO：53；＞Vβ29.1 D1 J1.2 C1
Figure BSA0000192479990000866
TCRCD4-TPT#5：
SEQ ID NO：54；＞Vα38.2/DV8 J40 C
Figure BSA0000192479990000867
Figure BSA0000192479990000871
SEQ ID NO：55；＞Vβ4.2 D2 J2.7 C2(GCRL-＞SNQV)
Figure BSA0000192479990000872
TCRCD4-TPT#6：
SEQ ID NO：56；＞Vα12.3 J35 C
Figure BSA0000192479990000873
SEQ ID NO：57；＞Vβ5.4 D1 J1.3 C1(PG-＞TR)
Figure BSA0000192479990000874
TCRCD4-TPT#8：
SEQ ID NO：58；＞Vα38.1 J45 C
Figure BSA0000192479990000875
SEQ ID NO：59；＞Vβ3.1 D1 J2.7 C2(C-＞T)
Figure BSA0000192479990000876
TCRCD4-TPT#11：
SEQ ID NO：60；＞Vα17 J27 C
Figure BSA0000192479990000877
SEQ ID NO：61；＞Vβ6.6_2 D1 J2.3 C2(IS-＞LG)
Figure BSA0000192479990000878
Figure BSA0000192479990000881
TCRCD4-TPT#13：
SEQ ID NO：62；＞Vα20_2 J29 C
Figure BSA0000192479990000882
SEQ ID NO：63；＞Vβ19 D2 J2.1 C2
Figure BSA0000192479990000883
TCRCD4-TPT#17：
SEQ ID NO：64；＞Vα29/DV5 J49 C
Figure BSA0000192479990000884
SEQ ID NO：65；＞Vβ7.2 D1 J2.7 C2
Figure BSA0000192479990000885
TCRCD4-TPT#27：
SEQ ID NO：66；＞Vα13.1_2 J45 C(Donor SNP N-＞K)
Figure BSA0000192479990000886
SEQ ID NO：67；＞Vβ19 D1 J1.1 C1
Figure BSA0000192479990000887
TCRCD4-TPT#33：
SEQ ID NO：68；＞Vα29/DV5 J42 C(Donor SNP N-＞K)
Figure BSA0000192479990000891
SEQ ID NO：69；＞Vβ24.1 D2 J2.1 C2
Figure BSA0000192479990000892
TCRCD4-TPT#38：
SEQ ID NO：70；＞Vα39 J18 C(Donor SNP N-＞K)
Figure BSA0000192479990000893
SEQ ID NO：71；＞Vβ5.5_2 D1 J1.4 C1(PG-＞TR)
Figure BSA0000192479990000894
TCRCD4-TPT#42：
SEQ ID NO：72；＞Vα25 J10 C
Figure BSA0000192479990000895
SEQ ID NO：73；＞Vβ7.8 D2 J2.7 C2(GTR-＞DIW；L-＞V)
Figure BSA0000192479990000896
TCRCD4-TPT#45：
SEQ ID NO：74；＞Vα13.2 J23 C
Figure BSA0000192479990000897
Figure BSA0000192479990000901
SEQ ID NO：75；＞Vβ20.1 D1 J1.2 C1(ISLLLPGSLAG missing following GPG)
Figure BSA0000192479990000902
TCRCD4-TPT#48：
SEQ ID NO：76；＞Vα38.2/DV8 J42 C
Figure BSA0000192479990000903
SEQ ID NO：77；＞Vβ28 D1 J1.1 C1
Figure BSA0000192479990000904
TCRCD4-TPT#49：
SEQ ID NO：78；＞Vα38.1 J49 C
Figure BSA0000192479990000905
SEQ ID NO：79；＞Vβ19 D2 J2.2 C2
Figure BSA0000192479990000906
TCRCD4-TPT#51：
SEQ ID NO：80；＞Vα13.1_2 J53 C
Figure BSA0000192479990000907
SEQ ID NO：81；＞Vβ14 D1 J1.1 C1
Figure BSA0000192479990000908
Figure BSA0000192479990000911
TCRCD4-TPT#52：
SEQ ID NO：82；＞Vα8.3 J54 C(Additional MA)
Figure BSA0000192479990000912
SEQ ID NO：83；＞Vβ6.1 D2 J2.7 C2(I-＞L)
Figure BSA0000192479990000913
TCRCD4-TPT#54：
SEQ ID NO：84；＞Vα9.2 J23 C
Figure BSA0000192479990000914
SEQ ID NO：85；＞Vβ20.1 D1 J1.1 C1(ISLLLPGSLAG missing flolowing GPG)
Figure BSA0000192479990000915
TCRCD4-TPT#55：
SEQ ID NO：86；＞Vα38.2/DV8 J34 C
Figure BSA0000192479990000916
SEQ ID NO：87；＞Vβ5.1 J2.1 C2
Figure BSA0000192479990000917
TCRCD4-TPT#57：
SEQ ID NO：88；＞Vα8.1 J27 C
Figure BSA0000192479990000921
SEQ ID NO：89；＞Vβ5.1 D2 J2.7 C2
Figure BSA0000192479990000922
TCRCD4-TPT#59：
SEQ ID NO：90；＞Vα39 J49 C
Figure BSA0000192479990000923
SEQ ID NO：91；＞Vβ7.9_3 D2 J2.4 C2(S-＞R)
Figure BSA0000192479990000924
TCRCD4-TPT#67：
SEQ ID NO：92；＞Vα12.3 J9 C
Figure BSA0000192479990000925
SEQ ID NO：93；＞Vβ5.1 D2 J2.7 C2
Figure BSA0000192479990000926
TCRCD4-TPT#76：
SEQ ID NO：94；＞Vα8.3 J57 C
Figure BSA0000192479990000927
Figure BSA0000192479990000931
SEQ ID NO：95；＞V19 D2_2 J2.7 C2
Figure BSA0000192479990000932
TCRCD4-TPT#77：
SEQ ID NO：96；＞Vα14/DV4_3 J50 C
Figure BSA0000192479990000933
SEQ ID NO：97；＞Vβ20.1 D2 J2.2 C2(ISLLLPGSLAG is missing followingGPG)
Figure BSA0000192479990000934
TCRCD4-TPT#78：
SEQ ID NO：98；＞Vα8.6_2 J21 C
Figure BSA0000192479990000935
SEQ ID NO：99；＞Vβ1 D1 J1.6_2 C1(L-＞I)
Figure BSA0000192479990000936
TCRCD4-TPT#79：
SEQ ID NO：100；＞Vα38.2/DV8 J39 C
Figure BSA0000192479990000937
SEQ ID NO：101；＞Vβ5.1 D2 J2.1 C2
Figure BSA0000192479990000938
Figure BSA0000192479990000941
TCRCD4-TPT#82：
SEQ ID NO：102；＞Vα38.2/DV8 J39 C
Figure BSA0000192479990000942
SEQ ID NO：103；＞Vβ19 D1 J2.7 C2
Figure BSA0000192479990000943
TCRCD4-TPT#87：
SEQ ID NO：104；＞Vα39 J31 C
Figure BSA0000192479990000944
SEQ ID NO：105；＞Vβ5.1 J2.6 C2
Figure BSA0000192479990000945
TCRCD4-TPT#91：
SEQ ID NO：106；＞Vα20_2 J53 C
Figure BSA0000192479990000946
SEQ ID NO：107；＞Vβ6.1 D1 J2.7 C2(I-＞L)
Figure BSA0000192479990000947
TCRCD8-TPT#35/2：
SEQ ID NO：188；＞Vα19 J17 C
Figure BSA0000192479990000951
SEQ ID NO：189；＞Vβ6.2 oder Vβ6.3 D1 J1.2 C1(A→V)
Figure BSA0000192479990000952
TCRCD4-TPT#9：
SEQ ID NO：190；＞Vα23/DV6 J49 C
Figure BSA0000192479990000953
SEQ ID NO：191；＞Vβ3.1 D1 J1.2 C1(C→T)
Figure BSA0000192479990000954
TCRCD4-TPT#48/2：
SEQ ID NO：192；＞Vα8.3 J43 C(E→V)
Figure BSA0000192479990000955
SEQ ID NO：193；＞Vβ28 D1 J1.1 C1
Figure BSA0000192479990000956
4.PLAC1特异性T细胞受体
TCRCD8-mPL#2：
SEQ ID NO：152；＞Vα6D.6_5 J33 C(DFS oder DSS→NSF)
Figure BSA0000192479990000961
SEQ ID NO：153；＞Vβ2 D1 J1.3 C1
Figure BSA0000192479990000962
TCRCD8-mPL#8：
SEQ ID NO：154；＞Vα9D.1_1 or V9D.1_2 J12 C(L→F)
Figure BSA0000192479990000963
SEQ ID NO：155；＞Vβ5 D2 J2.1 C2
Figure BSA0000192479990000964
TCRCD8-mPL#9：
SEQ ID NO：156；＞Vα4D.4_2 J44 C(Q→E)
Figure BSA0000192479990000965
SEQ ID NO：157；＞Vβ2 D2 J2.7 C2
Figure BSA0000192479990000966
TCRCD8-mPL#11：
SEQ ID NO：158；＞Vα6D.6_2 J9_2 C(DF→NS)
Figure BSA0000192479990000967
Figure BSA0000192479990000971
SEQ ID NO：159；＞Vβ2 D1 J1.3 C1
Figure BSA0000192479990000972
TCRCD8-mPL#12：
SEQ ID NO：160；＞Vα4D.4_2 J27 C(Q→E)
Figure BSA0000192479990000973
SEQ ID NO：161；＞Vβ30 D1 J2.2 C2
Figure BSA0000192479990000974
TCRCD8-mPL#14：
SEQ ID NO：162；＞Vα9D.1_2 J12 C
Figure BSA0000192479990000975
SEQ ID NO：163；＞Vβ5 D1 J1.1 C1
Figure BSA0000192479990000976
TCRCD8-mPL#17：
SEQ ID NO：164；＞Vα14.1 J31_1 oder_2 C
Figure BSA0000192479990000977
SEQ ID NO：165；＞Vβ13.2 D2 J2.1 C2
Figure BSA0000192479990000978
Figure BSA0000192479990000981
TCRCD8-mPL#19：
SEQ ID NO：166；＞Vα6D.3 J22 C
Figure BSA0000192479990000982
SEQ ID NO：167；＞Vβ13.3 D1 J1.6 C1
Figure BSA0000192479990000983
TCRCD8-mPL#20：
SEQ ID NO：168；＞Vα12.3_3 J38 C
Figure BSA0000192479990000984
SEQ ID NO：169；＞Vβ5 D2 J1.1 C1
Figure BSA0000192479990000985
TCRCD8-mPL#22：
SEQ ID NO：170；＞Vα 13D.2 J34_2 C(V→L)
Figure BSA0000192479990000986
SEQ ID NO：171；＞Vβ20 D1 J2.1 C2
Figure BSA0000192479990000987
TCRCD8-mPL#25：
SEQ ID NO：194；＞Vα8.1_3 J21 C
Figure BSA0000192479990000991
SEQ ID NO：195；＞Vβ31 D2 J2.1 C2
Figure BSA0000192479990000992
以下实施方案对应于原申请的权利要求书：
1.用于提供抗原特异性淋巴样细胞的方法，其包括以下步骤：
(a)提供来自包含T细胞之样品的单一抗原反应性T细胞，其中所述样品从之前暴露于所述抗原的对象中获得；
(b)提供编码T细胞受体的核酸，所述T细胞受体具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性；以及
(c)将所述核酸引入淋巴样细胞中以提供所述抗原特异性淋巴样细胞。
2.用于提供具有确定的MHC限制性的抗原特异性T细胞受体的方法，其包括以下步骤：
(a)提供来自包含T细胞之样品的单一抗原反应性T细胞，其中所述样品从之前暴露于所述抗原的对象中获得；
(b)提供编码T细胞受体的核酸，所述T细胞受体具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性；
(c)将所述核酸引入淋巴样细胞中以提供抗原特异性淋巴样细胞；以及
(d)确定所述抗原特异性淋巴样细胞的MHC限制性。
3.用于鉴定抗原中的T细胞表位的方法，其包括以下步骤：
(a)提供来自包含T细胞之样品的单一抗原反应性T细胞，其中所述样品从之前暴露于所述抗原的对象中获得；
(b)提供编码T细胞受体的核酸，所述T细胞受体具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性；
(c)将所述核酸引入淋巴样细胞以提供抗原特异性淋巴样细胞；以及
(d)确定所述抗原特异性淋巴样细胞的表位特异性。
4.实施方案1至3中任一项所述的方法，其中所述核酸是RNA。
5.实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述提供编码具有所述单一抗原反应性T细胞之T细胞受体的特异性的T细胞受体的核酸的步骤包括提供编码这样的T细胞受体的核酸，其包含所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的至少CDR序列，优选至少可变区。
6.实施方案1至5中任一项所述的方法，其中所述对象对所述抗原或包含所述抗原的物质为血清阳性。
7.实施方案1至6中任一项所述的方法，其中所述单一抗原反应性T细胞使用流式细胞术从包含T细胞的样品中分离。
8.肽，其包含选自SEQ ID NO：108至139、172、173、175、178至187和196的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体。
9.编码实施方案8所述肽的核酸或者包含所述核酸的细胞。
10.呈递实施方案8所述肽或其加工产物的细胞。
11.对实施方案8所述肽有反应性的免疫反应性细胞或T细胞受体，或者所述T细胞受体的多肽链。
12.T细胞受体α-链或包含所述T细胞受体α-链的T细胞受体，其中所述T细胞受体α-链选自：
(i)包含选自SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、176、188、190、192和194或其变体的T细胞受体α-链的至少一个、优选两个、更优选全部三个CDR序列的T细胞受体α-链，和
(ii)包含选自SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、176、188、190、192和194或其变体的T细胞受体α-链序列的T细胞受体α-链。
13.T细胞受体β-链或包含所述T细胞受体β-链的T细胞受体，其中所述T细胞受体β-链选自：
(i)包含选自SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、177、189、191、193和195或其变体的T细胞受体β-链的至少一个、优选两个、更优选全部三个CDR序列的T细胞受体β-链，和
(ii)包含选自SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、177、189、191、193和195或其变体的T细胞受体β-链序列的T细胞受体β-链。
14.T细胞受体，其选自：
(I)包含以下的T细胞受体：
(i)包含SEQ ID NO：x或其变体的T细胞受体α-链的至少一个、优选两个、更优选全部三个CDR序列的T细胞受体α-链，和
(ii)包含SEQ ID NO：X+1或其变体的T细胞受体β-链的至少一个、优选两个、更优选全部三个CDR序列的T细胞受体β-链；
其中X选自4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、176、188、190、192和194，
以及
(II)包含以下的T细胞受体：
(i)包含SEQ ID NO：x或其变体的T细胞受体α-链序列的T细胞受体α-链，和
(ii)包含SEQ ID NO：X+1或其变体的T细胞受体β-链序列的T细胞受体β-链；
其中X选自4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、176、188、190、192和194。
15.编码实施方案11至14中任一项所述T细胞受体链或T细胞受体的核酸，或者包含实施方案11至14中任一项所述T细胞受体链或T细胞受体或所述核酸的细胞。
16.药物组合物，其包含以下的一种或更多种：
(i)实施方案8所述的肽；
(ii)实施方案9或15所述的核酸；
(iii)实施方案9、10和15中任一项所述的细胞；
(iv)实施方案11所述的免疫反应性细胞；以及
(v)实施方案11至14中任一项所述的T细胞受体。
17.在对象中诱导免疫应答的方法，其包括向所述对象施用实施方案16的药物组合物。
18.刺激、引发和/或扩增T细胞的方法，其包括将T细胞与以下的一种或更多种接触：
(i)实施方案8所述的肽；
(ii)实施方案9所述的核酸；和
(iii)实施方案9或10所述的细胞。
19.测定对象中的免疫应答的方法，其包括测定从所述对象分离的生物样品中与实施方案8所述肽或实施方案10所述细胞有反应性的T细胞。
20.测定细胞毒活性的方法，其包括以下步骤：
(i)提供包含产生报告酶之靶细胞的样品；
(ii)使所述靶细胞接触待测定其细胞毒活性的物质；以及
ii)对所述样品进行检测测定以建立所述样品的有活力细胞中包含的报告酶水平。
Figure ISA0000192497010000011
Figure ISA0000192497010000021
Figure ISA0000192497010000031
Figure ISA0000192497010000041
Figure ISA0000192497010000051
Figure ISA0000192497010000061
Figure ISA0000192497010000071
Figure ISA0000192497010000081
Figure ISA0000192497010000091
Figure ISA0000192497010000101
Figure ISA0000192497010000111
Figure ISA0000192497010000121
Figure ISA0000192497010000131
Figure ISA0000192497010000141
Figure ISA0000192497010000151
Figure ISA0000192497010000161
Figure ISA0000192497010000171
Figure ISA0000192497010000181
Figure ISA0000192497010000191
Figure ISA0000192497010000201
Figure ISA0000192497010000211
Figure ISA0000192497010000221
Figure ISA0000192497010000231
Figure ISA0000192497010000241
Figure ISA0000192497010000251
Figure ISA0000192497010000261
Figure ISA0000192497010000271
Figure ISA0000192497010000281
Figure ISA0000192497010000291
Figure ISA0000192497010000301
Figure ISA0000192497010000311
Figure ISA0000192497010000321
Figure ISA0000192497010000331
Figure ISA0000192497010000341
Figure ISA0000192497010000351
Figure ISA0000192497010000361
Figure ISA0000192497010000371
Figure ISA0000192497010000381
Figure ISA0000192497010000391
Figure ISA0000192497010000401
Figure ISA0000192497010000411
Figure ISA0000192497010000421
Figure ISA0000192497010000431
Figure ISA0000192497010000441
Figure ISA0000192497010000451
Figure ISA0000192497010000461
Figure ISA0000192497010000471
Figure ISA0000192497010000481
Figure ISA0000192497010000491
Figure ISA0000192497010000501
Figure ISA0000192497010000511
Figure ISA0000192497010000521
Figure ISA0000192497010000531
Figure ISA0000192497010000541
Figure ISA0000192497010000551
Figure ISA0000192497010000561
Figure ISA0000192497010000571
Figure ISA0000192497010000581
Figure ISA0000192497010000591
Figure ISA0000192497010000601
Figure ISA0000192497010000611
Figure ISA0000192497010000621
Figure ISA0000192497010000631
Figure ISA0000192497010000641
Figure ISA0000192497010000651
Figure ISA0000192497010000661
Figure ISA0000192497010000671
Figure ISA0000192497010000681
Figure ISA0000192497010000691
Figure ISA0000192497010000701
Figure ISA0000192497010000711
Figure ISA0000192497010000721
Figure ISA0000192497010000731
Figure ISA0000192497010000741
Figure ISA0000192497010000751
Figure ISA0000192497010000761
Figure ISA0000192497010000771
Figure ISA0000192497010000781
Figure ISA0000192497010000791
Figure ISA0000192497010000801
Figure ISA0000192497010000811
Figure ISA0000192497010000821
Figure ISA0000192497010000831
Figure ISA0000192497010000841
Figure ISA0000192497010000851
Figure ISA0000192497010000861
Figure ISA0000192497010000871
Figure ISA0000192497010000881
Figure ISA0000192497010000891
Figure ISA0000192497010000901
Figure ISA0000192497010000911
Figure ISA0000192497010000921
Figure ISA0000192497010000931
Figure ISA0000192497010000941
Figure ISA0000192497010000951
Figure ISA0000192497010000961
Figure ISA0000192497010000971
Figure ISA0000192497010000981
Figure ISA0000192497010000991
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Claims (20)

1.用于提供抗原特异性淋巴样细胞的方法，其包括以下步骤：
(a)提供来自包含T细胞之样品的单一抗原反应性T细胞，其中所述样品从之前暴露于所述抗原的对象中获得；
(b)提供编码T细胞受体的核酸，所述T细胞受体具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性；以及
(c)将所述核酸引入淋巴样细胞中以提供所述抗原特异性淋巴样细胞。
2.用于提供具有确定的MHC限制性的抗原特异性T细胞受体的方法，其包括以下步骤：
(a)提供来自包含T细胞之样品的单一抗原反应性T细胞，其中所述样品从之前暴露于所述抗原的对象中获得；
(b)提供编码T细胞受体的核酸，所述T细胞受体具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性；
(c)将所述核酸引入淋巴样细胞中以提供抗原特异性淋巴样细胞；以及
(d)确定所述抗原特异性淋巴样细胞的MHC限制性。
3.用于鉴定抗原中的T细胞表位的方法，其包括以下步骤：
(a)提供来自包含T细胞之样品的单一抗原反应性T细胞，其中所述样品从之前暴露于所述抗原的对象中获得；
(b)提供编码T细胞受体的核酸，所述T细胞受体具有所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的特异性；
(c)将所述核酸引入淋巴样细胞以提供抗原特异性淋巴样细胞；以及
(d)确定所述抗原特异性淋巴样细胞的表位特异性。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述核酸是RNA。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述提供编码具有所述单一抗原反应性T细胞之T细胞受体的特异性的T细胞受体的核酸的步骤包括提供编码这样的T细胞受体的核酸，其包含所述单一抗原反应性T细胞的T细胞受体的至少CDR序列，优选至少可变区。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述对象对所述抗原或包含所述抗原的物质为血清阳性。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述单一抗原反应性T细胞使用流式细胞术从包含T细胞的样品中分离。
8.肽，其包含选自SEQ ID NO：108至139、172、173、175、178至187和196的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体。
9.编码权利要求8所述肽的核酸或者包含所述核酸的细胞。
10.呈递权利要求8所述肽或其加工产物的细胞。
11.对权利要求8所述肽有反应性的免疫反应性细胞或T细胞受体，或者所述T细胞受体的多肽链。
12.T细胞受体α-链或包含所述T细胞受体α-链的T细胞受体，其中所述T细胞受体α-链选自：
(i)包含选自SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、176、188、190、192和194或其变体的T细胞受体α-链的至少一个、优选两个、更优选全部三个CDR序列的T细胞受体α-链，和
(ii)包含选自SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、176、188、190、192和194或其变体的T细胞受体α-链序列的T细胞受体α-链。
13.T细胞受体β-链或包含所述T细胞受体β-链的T细胞受体，其中所述T细胞受体β-链选自：
(i)包含选自SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、177、189、191、193和195或其变体的T细胞受体β-链的至少一个、优选两个、更优选全部三个CDR序列的T细胞受体β-链，和
(ii)包含选自SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、177、189、191、193和195或其变体的T细胞受体β-链序列的T细胞受体β-链。
14.T细胞受体，其选自：
(I)包含以下的T细胞受体：
(i)包含SEQ ID NO：x或其变体的T细胞受体α-链的至少一个、优选两个、更优选全部三个CDR序列的T细胞受体α-链，和
(ii)包含SEQ ID NO：X+1或其变体的T细胞受体β-链的至少一个、优选两个、更优选全部三个CDR序列的T细胞受体β-链；
其中X选自4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、176、188、190、192和194，
以及
(H)包含以下的T细胞受体：
(i)包含SEQ ID NO：x或其变体的T细胞受体α-链序列的T细胞受体α-链，和
(ii)包含SEQ ID NO：X+1或其变体的T细胞受体β-链序列的T细胞受体β-链；
其中X选自4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、176、188、190、192和194。
15.编码权利要求11至14中任一项所述T细胞受体链或T细胞受体的核酸，或者包含权利要求11至14中任一项所述T细胞受体链或T细胞受体或所述核酸的细胞。
16.药物组合物，其包含以下的一种或更多种：
(i)权利要求8所述的肽；
(ii)权利要求9或15所述的核酸；
(iii)权利要求9、10和15中任一项所述的细胞；
(iv)权利要求11所述的免疫反应性细胞；以及
(v)权利要求11至14中任一项所述的T细胞受体。
17.在对象中诱导免疫应答的方法，其包括向所述对象施用权利要求16的药物组合物。
18.刺激、引发和/或扩增T细胞的方法，其包括将T细胞与以下的一种或更多种接触：
(i)权利要求8所述的肽；
(ii)权利要求9所述的核酸；和
(iii)权利要求9或10所述的细胞。
19.测定对象中的免疫应答的方法，其包括测定从所述对象分离的生物样品中与权利要求8所述肽或权利要求10所述细胞有反应性的T细胞。
20.测定细胞毒活性的方法，其包括以下步骤：
(i)提供包含产生报告酶之靶细胞的样品；
(ii)使所述靶细胞接触待测定其细胞毒活性的物质；以及
ii)对所述样品进行检测测定以建立所述样品的有活力细胞中包含的报告酶水平。
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