CN101415827A - 产生抗原特异性效应t细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用RNA、特别是编码T细胞受体和/或FoxP3的RNA瞬时转染的T细胞和通过电穿孔用RNA转染T细胞的方法。本发明的组合物包括用编码抗原特异性T细胞受体(TCR)的RNA瞬时转染的效应T细胞，其中该T细胞表现出对以MHC分子复合体形式呈递该抗原的细胞特异性的效应子功能。本发明还提供包含编码FoxP3的外源RNA的Treg细胞。转染的T细胞可用于免疫治疗，特别是肿瘤、病原体感染、自体免疫疾病、移植排异和移植物抗宿主病的治疗。

Description

产生抗原特异性效应T细胞的方法
技术领域
本发明涉及用RNA-特别是编码T细胞受体和/或FoxP3的RNA-瞬时转染的T细胞和通过电穿孔用RNA转染T细胞的方法。该转染的T细胞可用于免疫治疗，特别是肿瘤、病原体感染、自体免疫疾病、移植排异和移植物抗宿主病的治疗。
背景技术
细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在控制肿瘤方面起到主要作用，因此在癌症免疫治疗的细胞方案中具有很大的重要性[19]。早先过继转移肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的尝试并不令人满意，因为转移的细胞经常是非特异性的且不能持续较长时间，最有可能是由于这种TIL可能具有无反应性表型(anergic phenotype)或不能够自引导到肿瘤位点[10，11]。体外扩增的自体肿瘤特异性CTL的过继转移表明在转移性黑色素瘤病人的治疗中是有效的[9，13，18，20，31]。不幸的是，不是所有的病人显示出可检测的对其肿瘤的体内细胞毒性T细胞反应。事实上，细胞溶解性肿瘤特异性T细胞的分离和/或扩增仅在一小部分病人中是可能的，最有可能是由于以下事实：尤其在肿瘤病人中，外周T细胞库通常由于胸腺选择[28]或其它耐受机制[30]而缺乏高亲和性的肿瘤特异性CTL。另外，这些细胞和体外产生的肿瘤特异性T细胞仅具有有限的寿命，且这些T细胞的扩增对于治疗剂量来说通常是不足的[2，3，30]。
可选择地，由于CTL特异性完全由T细胞受体(TCR)决定，用肿瘤特异性TCR逆转录病毒转导的自体T细胞被用于过继转移。具有肿瘤特异性的T细胞通过逆转录病毒转导已经在体外显示出对几种抗原的重编程，例如MART-1[7]、MAGE-1[29]、MDM2[27]、gp100[16，24]和酪氨酸酶[21]。这些自体T细胞很容易扩增到治疗剂量。但是，逆转录病毒转导具有对自体细胞的不可逆基因操作的危险，因为原病毒可能随机地整合到转导细胞的基因组中。因此，它也可能整合到涉及细胞周期控制的基因中，随后可能扰乱细胞生长(即插入诱变)。对几名严重复合免疫缺陷(SCID)病人进行了基因治疗临床试验，其中自体造血干细胞用包含编码SCID病人缺乏的公共γ链的基因的载体逆转录病毒转导，试验数据表明原病毒整合到了LMO-2癌基因中，引起了白血病样症状[6，12，15]。另外，逆转录病毒转导不能用于静息的、不分裂的T细胞[30]，而需要在转录之前对T细胞进行几天的刺激。
因此，存在着长期未能满足的对于向T细胞高效转移抗原特异性TCR功能的需求，其不需要逆转录病毒载体或其它形式的可能导致主体基因组改变的转染。本发明满足了这一需求并且还提供了额外的优点。
发明内容
本发明公开了改进的RNA电穿孔进入到T细胞-特别是纯化的CD8+或CD4+-中的方法。该改进的方法使通过RNA电穿孔将TCR功能性转移到分离的T细胞中及使得随后的低温保藏(cryoconservation)成为可能。本发明的方法避免了逆转录病毒转导的缺点，并形成了新的癌症、病原体感染、自体免疫、移植和移植物抗宿主病的免疫治疗的方案。
在一个方面中，本发明提供了一种组合物，其包含以编码抗原特异性T细胞受体(TCR)的RNA瞬时转染的效应T细胞，其中该T细胞表现出对以MHC分子复合体形式呈递该抗原的细胞具有特异性的效应子功能。在优选的实施方式中，该效应子功能是细胞毒性。本发明的效应T细胞组合物可以被用于制备免疫治疗药物。
在另一个方面中，本发明提供了一种赋予T细胞新的抗原特异性的方法，包括用编码抗原特异性TCR受体的RNA电穿孔包含纯化CD8+或纯化CD4+T细胞的组合物。
在再另一个方面中，本发明提供了一种赋予T细胞新的抗原特异性的方法，包括：用编码抗原特异性TCR的RNA对静息T细胞进行电穿孔。
在另一个方面中，本发明提供了一种瞬时转染T细胞的方法，包括利用方波脉冲在100V/mm-150V/mm的场强下用RNA对T细胞进行2-10ms的电穿孔，其中所述T细胞在电穿孔之前未使用PHA或OKT3进行体外刺激。
在再一个方面中，本发明提供了一种赋予受试者抗原特异性T细胞效应子功能的方法，包括施用用编码抗原特异性TCR的RNA瞬时转染的T细胞，其中所述T细胞表现出对以MHC分子复合体形式呈递该抗原的细胞的效应子功能。
在另一个方面中，本发明提供了包含编码FoxP3的外源RNA的Treg细胞。本发明提供了产生Treg细胞的方法，包括用编码FoxP3的核酸转染CD4+T细胞。FoxP3转染的T细胞可以用于制备免疫治疗药物，且有效的剂量可以被施用于病人。
附图简要说明
为更完整地理解本发明的特征和优点，现在参照附图对本发明进行详细的说明。附图中：
图1显示了RNA转染的CD8+T细胞的EGFP表达，a)用EGFPRNA对CD8+T细胞进行电穿孔，且这些细胞中的EGFP表达在电穿孔后4h用FACS分析测定(黑色柱图)。没有进行RNA电穿孔的CD8+T细胞用作阴性对照(灰色柱图)，b)用TCRα和β链RNA(TCRRNA)对CD8+T细胞进行电穿孔，且这些细胞上的TCR Vβ 14表面表达在电穿孔(EP)后4h和24h用FACS分析测定。没有进行RNA电穿孔的CD8+T细胞用作阴性对照(模拟)，c)电穿孔和TCR表达对T细胞表型的影响在电穿孔后24h通过CCR7和CD45RA染色检查。T细胞表型的指定如下：溶解效应(lytic effectors，LE)：CD45RA+/CCR7-，效应记忆(EM)：CD45RA-/CCR7-，中枢记忆(CM)：CD45RA-/CCR7+，原态(N)：CD45RA+/CCR7+。所有数据代表三个标准化的独立实验。
图2显示了TCR RNA转染的T细胞在用负载有肽的靶细胞刺激后特异性地产生INFγ。CD8+T细胞用EGFP RNA(EGFP)或编码TCRα和β链的RNA(TCR)电穿孔，并在IFNγ产生分析中用作效应细胞，电穿孔(EP)后4h、24h和48h。负载对照肽(白色棒)或者负载gp100280-288肽(YLE-肽，黑色棒)的辐照T2细胞用作刺激细胞，且IFNγ的产生在ELISA的上清中测定并以pg/ml表示。显示为三个数据的平均值+SD。效应细胞与刺激细胞的比率为1：1。(三个供体中的)一个代表性T细胞供体的数据被显示。
图3显示了TCR RNA转染的T细胞可以被低温保藏而不丧失IFNγ产生能力。CD8+T细胞用EGFP RNA(EGFP)或编码TCRα和β链的RNA(TCR)电穿孔，并在电穿孔后4h低温保藏。这些T细胞在IFNγ产生分析中用作效应细胞，解冻后0h(a和b)、24h(a)和48h(a)。负载对照肽(白色棒)或者负载gp100280-288肽(YLE-肽，黑色棒)的辐照T2细胞(a和b)，以及模拟电穿孔的DC(模拟，灰色棒)或用gp100 RNA电穿孔的DC(GP100，斜纹棒)(b)用作刺激细胞，且IFNγ的产生在ELISA的上清中测定并以pg/ml表示。显示为三个数据的平均值+SD。效应细胞与刺激细胞的比率为1：1。(三个供体中的)一个代表性T细胞供体的数据被显示。
图4显示了TCR RNA转染的T细胞特异性溶解负载有肽的靶细胞。CD8+T细胞用EGFP RNA(EGFP，方块)或编码TCRα和β链的RNA(TCR，三角)电穿孔，并在标准的4h细胞毒性分析中用作效应细胞，电穿孔(EP)后24h、48h和72h。负载对照肽(实心符号)或者负载gp100280-288肽(YLE-肽，空心符号)的T2细胞用作靶细胞，并计算溶解百分率(参见材料和方法部分的详细描述)。靶细胞与效应细胞的比率为1:60、1:20、1:6和1:2(a，显示48h时间点)，或1:20(b，显示时间过程)。显示为三个数据的平均值+SD。(三个供体中的)一个代表性T细胞供体的数据被显示。
图5显示了TCR RNA转染的T细胞特异性溶解黑色素瘤细胞株。3个供体的CD8+T细胞用EGFP RNA(EGFP，空心符号)或编码TCRα和β链的RNA(TCR，实心符号)电穿孔，并在电穿孔后24h标准的4h细胞毒性分析中用作效应细胞。黑色素瘤细胞株SK-MEL526(HLA-A2+/gp100+)、NEMA(HLA-A2+/gp100-)和Colo829(HLA-A1+/A2-/gp100+)用作靶细胞，并计算溶解百分率。显示为三个数据的平均值+SD。靶细胞与效应细胞的比率为1:60、1:20、1:6和1:2。
图6显示了TCR RNA转染的T细胞具有与逆转录病毒转导的T细胞相似的溶解细胞能力，其接近亲本CTL克隆的溶解细胞效率。CD8+T细胞用EGFP RNA(Neg)或编码TCRα和β链的RNA电穿孔，并在电穿孔后24h的细胞毒性分析中用作效应细胞。负载有不同浓度的gp100280-288肽(如图中显示)的T2细胞用作靶细胞，并计算溶解百分率。靶细胞与效应细胞的比率为1:15。用于量度细胞溶解效率的与50％最大溶解对应的肽浓度(ED50)以点线表示。显示为三个数据的平均值+SD。(五个供体中的)一个代表性T细胞供体的数据被显示。
图7显示了采用BD微球检测方法一次对6种不同细胞因子的检测。每个云团各代表一种细胞因子。越朝右边(FL2信号增加)细胞因子浓度超高。A：对照DC上的TCR转染的CD4+细胞的上清液。B：用相应的肽冲击加载的DC上的TCR转染的CD4+细胞的上清液。注意：IL-6是由DC产生的，而不是T细胞。为确定准确的浓度，制出了标准曲线。
图8显示了RNA转染的CD4+细胞电穿孔后24h的FACS分析的结果。A：CD4+细胞用GFP-RNA转染(黑色柱图)。这里TCR-RNA转染的细胞用作阴性对照(灰色柱图)。B：细胞的FSC/SSC用于显示细胞状态，超过95％的细胞在“命门(life gate)”中(R1)。
图9显示了CD4+T细胞用GFP-RNA(A)或编码Mage3-DP4特异性TCR的RNA(B)转染的结果。作为阴性对照靶，使用了未负载的自体DC。作为特异性靶，Mage3-DP4肽被负载在DC上。20h后上清中的细胞因子浓度通过CBA测定。仅测定微球的MFI，这使得能够对浓度进行半定量比较(但非常接近于比例)。请注意IL-6是由DC产生的，而不是T细胞。
图10：CD4+细胞用GFP-RNA或编码Mage3-DP4特异性TCR的RNA转染。作为阴性对照靶，使用了未负载的自体DC。作为特异性靶，Mage3-DP4肽被负载在DC上。44h后上清中的细胞因子浓度通过CBA测定(A)。由于IFNγ浓度超出了刻度(*)，微球的MFI也被显示(B)。
图11：CD4+T细胞用GFP-RNA(A)或编码gp100-A2特异性TCR的RNA(B)转染。作为阴性对照靶，使用了未负载的T2细胞。作为特异性靶，gp100-A2肽被负载在T2细胞上。20h后上清中的细胞因子浓度通过CBA测定。仅测定微球的MFI，这使得能够对浓度进行半定量比较(但非常接近于比例)。
图12：CD4+细胞用GFP-RNA或编码Mage3-DP4特异性TCR的RNA转染。作为阴性对照靶，使用了未负载的自体DC。作为特异性靶，Mage3-DP4肽被负载在DC上。44h后上清中的细胞因子浓度通过CBA测定(A)。由于在一种情况下IFNγ和IL-2浓度超出了刻度(*)，微球的MFI也被显示(B)。
具体实施方式
尽管下面详细说明了本发明的各种实施方式的制造和使用，但应当理解本发明提供了许多可以在很多种特定环境中实施的有利的发明概念。这里说明的特定的实施方式仅举例说明完成和使用本发明的特定的途径，而不限制本发明的范围。
为有助于对本发明的理解，这里定义的术语具有与本发明相关领域中的技术人员通常理解的含义。如“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”的词语不是特指仅单个个体，而是包括特定实施例可能用于说明的概括的类。这里的术语用于描述本发明的特定的实施方式，但它们的使用并不限制本发明，除非在说明书中说明。例如，术语“一细胞(a cell)”包括多个细胞，包括其混合物。也应当理解，虽然并不总是明白地说明，这里描述的试剂仅是示范性的，而这些试剂的等同物在现有技术中是已知的。
T细胞的活化状态定义了T细胞是否是“静息的”(即在细胞周期的Go期)或“活化的”以在适宜的刺激(如其特定抗原的识别)后或者通过用OKT3抗体、PHA或PMA等刺激增殖。T细胞的“表型”(如，原态、中枢记忆、溶解效应、辅助效应(TH1和TH2细胞)和调节效应)描述了细胞激活时发挥的功能。健康的供体具有所有这些表型的T细胞，并且它们主要处于静息状态。原态T细胞将在激活时增殖，然后分化成记忆T细胞或效应T细胞。然后它可能再次呈现静息状态直到下次再被激活而发挥其新的功能，或者可能再次改变其表型。效应T细胞将在激活时分裂，形成抗原特异性效应子功能。
术语“抗原”在现有技术中是公知的，并包括任何可与抗体结合的分子，以及表位、可与MHC分子结合的抗原的肽片段和免疫原。应当理解任何抗原的使用对于本发明中的应用是可以预见的，因此抗原包括，但不限于自体抗原(不管是正常的还是与疾病相关的)、肿瘤抗原、病原体抗原(如，微生物抗原、病毒抗原等)或某些其它的外源性抗原(如食物成分、花粉等)。T细胞受体结合到抗原或与MHC分子结合的抗原肽片段。如这里所使用的，对抗原特异性的TCR受体包括对抗原的肽片段特异性的T细胞受体。
术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”指的是与肿瘤相关的抗原。公知的TAA的例子包括生存蛋白、gp100、MART、MAGE-1和MAGE-3。与MHC分子结合的某些TAA肽片段的序列包括MAGE1九肽(EADPTGHSY)、MART-APL肽(LAGIGILTV)或原态肽(naive peptide)(AAGIGILTV)及PSA-1肽(FLTPKKLQCV)。另外的肿瘤相关肽和抗原的序列是本领域技术人员已知的。
术语“抗原呈递细胞(APC)”指的是一类能够呈递一种或多种可被免疫系统的特定效应细胞识别的肽-MHC复合体形式的抗原、因而能够诱发对抗所呈递的一种或多种抗原的有效的细胞免疫应答的细胞。APC可以是完整的整体细胞如巨噬细胞、B细胞、内皮细胞、激活的T细胞和树突细胞，或者天然产生或合成的其它分子如纯化的与β2-微球蛋白复合的MHC-I类分子。尽管许多类型的细胞可能为了T细胞识别而能够在其细胞表面上呈递抗原，但仅树突细胞具有以有效的量呈递抗原以激活原态T细胞用于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的能力。
癌症或肿瘤意思是呈现出相对自动生长的细胞的非正常存在，以致癌症细胞表现出以细胞增殖控制的显著丧失为特征的异常生长表现。癌性细胞可以是良性或恶性的。在各种实施方式中，癌症影响膀胱、血液、脑、乳房、结肠、消化道、肺、卵巢、胰腺、前列腺或皮肤细胞。这里所用的癌症或肿瘤细胞的定义不仅包括原发癌细胞，也包括源自原发癌细胞的任何细胞。这包括转移的癌细胞及源自癌细胞的体外培养物和细胞株。癌症和肿瘤包括，但不限于，实体肿瘤、流体肿瘤、血液系统癌症、肾细胞癌症、黑色素瘤、乳癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、肝细胞瘤、腺瘤、肉瘤、肿瘤(carcinomas)、母细胞瘤等。
“共刺激分子”参与在抗原呈递细胞和T细胞的表面上表达的受体-配体对之间的相互作用。累计过去几年的研究令人信服地表明，静息T细胞需要至少两种信号以诱导细胞因子基因表达和增殖(Schwartz，R.H.(1990)Science 248：1349-1356和Jenkins，M.K.(1992)Immunol.Today 13：69-73)。第一种信号，赋予特异性的信号，可以通过TCR/CD3复合体与适当的MHC/肽复合体的相互作用产生。第二种信号不是抗原特异性的且被称为“共刺激”信号。这一信号原先定义为由源自骨髓的佐细胞如巨噬细胞和树突细胞(所谓的“专业”APC)提供的活性。几种分子已经显示出增强共刺激活性。它们是耐热抗原(HAS)(Liu，Y.等(1992)3.Exp.Med.175：437-445)、硫酸软骨素修饰的MHC不变链(li-CS)(Naujokas，M.F.等(1993)Cell 74：257-268)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)(Van Seventer，G.A.(1990).Immunol.144：4579-4586)、B7-1和B7-2/B70(Schwartz，R.H.(1992)Cell71：1065-1068)。这些分子各通过与其T细胞上的相关配体(cognateligand)的相互作用表现为辅助共刺激。共刺激分子在正常生理条件下介导必要的共刺激信号以达到原态T细胞的完全激活。一种典型的受体-配体对是APC表面上的共刺激分子的B7家族和其相对的T细胞上的受体CD28或CTLA-4(Freeman等(1993)Science 262：909-911；Young等(1992).Clin.Invest.90：229和Nabavi等(1992)Nature360：266-268)。其它重要的共刺激分子为CD40和CD54。术语“共刺激分子”涵盖任何在与T细胞表面上的TCR结合的MHC/肽复合体一起作用时提供达到与肽结合的T细胞激活的共刺激效应的单个分子或多个分子的组合。因此该术语涵盖B7或抗原呈递基质如APC、其片段(单独、与另一分子复合或作为融合蛋白的部分)上的其它共刺激分子，其与MHC复合体一起结合到相关配体，并在T细胞表面上的TCR特异性地与肽结合时导致T细胞的激活。虽然并不总是明确地说明，具有与野生型或纯化的共刺激分子(如重组产生或其突变蛋白质)类似的生物活性的分子可以在本发明的精神和范围内使用。
术语“培养”指的是细胞在合适的介质中体外维持、分化和/或繁殖。“富集的”意思是组合物包含的细胞占总细胞的百分比大于其所存在的生物体的组织中的百分比。
这里所用的术语“细胞因子”指的是对细胞发挥各种各样的效应(包括生长和增殖)的众多因子中的任何一种。在本发明的实践中可单独或结合使用的细胞因子的非限制性的例子包括白介素-2(IL-2)、干细胞因子(SCF)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)、G-CSF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-1α(IL-1α)、白介素-1L(IL-11)、MIP-11、白血病抑制因子(LIF)、c-kit配体、血小板生成素(TPO)和flt3配体。细胞因子可以从几个销售商处购得，如Genzyme(弗雷明汉，MA)、Genentech(南旧金山，CA)、Amgen(橡木城，CA)、R&D Systems(明尼阿波利斯，MN)和Immunex(西雅图，WA)。虽然并不总是明确地说明，具有与野生型或纯化的细胞因子(如重组产生或其突变蛋白质)类似的生物活性的分子可以在本发明的精神和范围内使用。
术语“树突细胞(DC)”指的是在各种淋巴和非淋巴组织中发现的形态学相似的细胞类型的多样化细胞群体(Steinman(1991)Ann.Rev.Immunol.9：271-296)。树突细胞构成生物体中最有效和优选的APC。尽管树突细胞可以从单核细胞分化，它们具有完全不同的表型。例如，特殊的分化标记CD14抗原未在树突细胞中发现但为单核细胞所拥有。而且，成熟树突细胞不是吞噬细胞，而单核细胞是强吞噬细胞。已经表明成熟DC可以提供T细胞激活和增殖必需的所有信号。
“有效量”是足以实现有利的或想要的结果的量，如对医学状态(疾病、感染等)的增强的免疫应答、治疗、预防或改善。有效量可以通过一次或多次给药、敷用或剂量施用。合适的剂量根据体重、年龄、健康情况、疾病或要治疗的状态及给药途径变化。
这里所用的“表达”指的是体外转录(IVT)的mRNA在转染细胞中被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。表达所需要的调节因素包括核糖体结合、翻译起始的序列和核糖体分离的终止密码子。用于体外转录的载体可以从商业上获得或通过现有技术已知的方法中描述的序列组装。
术语“遗传改变”意思是包含和/或表达外源基因或核酸序列，其随之改变细胞及其后代的基因型或表型。换句话说，它指的是任何对细胞的内源核苷酸的添加、缺失或破坏。例如，逆转录病毒转导导致细胞基因组的遗传改变。相反，mRNA的瞬时转染不导致遗传改变。
这里所用的术语“效应T细胞”指的是可以特异性地结合抗原和介导免疫应答(效应子功能)而不需要进一步分化的T细胞。效应T细胞的例子包括CTL、TH1细胞、TH2细胞和调节T细胞(Tregs)。与效应T细胞相反，原态T细胞未遇到它们的特异性抗原：MHC复合体，也未通过增殖和分化成效应T细胞对它进行应答。效应T细胞可以是静息的(处于细胞周期的Go期)或激活的(进行增殖)。“免疫应答”宽泛地指淋巴细胞对外源或自身物质的抗原特异性应答。任何可以引起免疫应答的物质被称作“免疫原性的”且被称为“免疫原”。所有免疫原都是抗原，但不是所有的抗原都是免疫原性的。免疫应答包括体液应答(通过抗体活动)和细胞介导应答(通过T细胞激活)。
术语“分离的”意思是从细胞等等的成分分离，其中多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段天然情况下是与这些成分正常结合的。例如，对于多核苷酸，分离的多核苷酸是与所述多核苷酸在染色体中正常结合的5’和3’序列分离的。本领域技术人员很清楚，非天然产生的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”以与其天然产生的对应物区分开。另外，“浓缩的”、“分开的(separated)”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段由于每体积的分子浓度或数目与其天然产生的对应物的每体积的分子浓度或数目相比高于“浓缩的”或低于“分离的”，而可与其天然产生的对应物区分开。在一级序列上或例如通过其糖基化模式与天然产生的对应物不同的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要以其分离的形式存在，因为它可通过其一级序列或者可选择地通过另一特征如其糖基化模式与其天然产生的对应物区分开。如果哺乳动物细胞(如T细胞)从生物体中发现的解剖位置移除，该细胞被分离(isolated)。
术语“主要组织相容性复合体”或“MHC”指的是编码T细胞抗原呈递和快速移植物排斥需要细胞表面分子的基因复合体。在人体中，MHC也称作“人白细胞抗原”或“HLA”复合体。MHC编码的蛋白质被称作“MHC分子”且被分成I类和II类MHC分子。I类MHC分子包括由在与β2-微球蛋白共价连接的MHC中编码的α链构成的膜异质二聚体蛋白质。I类MHC分子由几乎所有有核细胞表达且已经表明在抗原呈递上对CD8+T细胞发挥功能。I类分子包括人类的HLA-A、B和C。II类MHC分子还包括由共价结合的α和β链构成的膜异质二聚体蛋白质。II类MHC分子已知在CD4+T细胞中发挥功能且在人体中包括HLA-DP、-DQ和-DR。
这里所用的“病原体”指的是任何引起疾病的生物体或病毒，也指其减毒的衍生物。术语病原体指的是任何涉及疾病的病因的病毒或生物体，也指其减毒的衍生物。这种病原体包括，但不限于细菌、原生动物、真菌和病毒病原体如螺杆菌(例如幽门螺旋杆菌)、沙门氏菌、志贺氏杆菌、肠杆菌、弯曲杆菌、各种分枝杆菌(如麻疯分枝杆菌、结核杆菌)、炭疽杆菌、鼠疫耶氏菌、土拉热杆菌、布鲁氏菌种、肾脏钩端螺旋体、葡萄球菌如金黄色酿脓葡萄球菌、链球菌、厌氧芽胞梭菌、白色念珠菌、变形体、利什曼虫、锥虫属、人类免疫缺陷性病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类乳头瘤病毒(HPV)、巨细胞病毒(CMV)、HTLV、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、冠状病毒、水痘带状疱疹病毒和爱波斯坦-巴尔病毒)、乳头瘤病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒和风疹病毒。
术语“肽”采用其最宽泛的理解以指两个或多个亚单元氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物(peptidomimetics)的化合物。亚单元可以通过肽键连接。在另一实施方式中，亚单元可以通过其它键连接，如酯、醚等。这里所用的术语“氨基酸”指的是天然和/或非天然的氨基酸或者合成氨基酸(包括甘氨酸扩D和L两种光学异构体)、氨基酸类似物和肽模拟物。三个以上氨基酸的肽如果肽链短则通常称为寡肽。如果肽链长则通常称为多肽或蛋白质。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互换使用以指任何长度的核苷酸聚合体形式。多核苷酸可以包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物。核苷酸可以具有任何三维结构，且可以执行已知或未知的功能。术语“多核苷酸”包括，例如，单链、双链和三螺旋分子、基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。除了天然核酸分子外，本发明的核酸分子还可以包括修饰的核酸分子。
术语“RNA”指的是任何长度的核糖核苷酸聚合体形式，其中核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物通过磷酸二酯键连接在一起。术语“RNA”包括，例如，单链、双链和三螺旋分子、初始转录产物、、mRNA、tRNA、rRNA、体外转录产物、体外合成的RNA、支链多核苷酸、分离的任何序列的RNA等等。mRNA指的是可以在细胞中翻译的RNA。这种mRNA典型地具有帽结构并具有核糖体结合位点(Kozak序列)和翻译启始密码子。例如，在一个方面中，本发明涉及用能够在转染的T细胞中翻译的mRNA对T细胞进行转染。
“药物组合物”意图包括活性物质与惰性或活性载体的组合，以产生适用于体外、体内或离体诊断或治疗应用的组合物。
这里所用的术语“药物可接受的载体”涵盖任何与T细胞相容的药物载体，如磷酸盐缓冲盐水、蛋白质赋形剂(包括血清白蛋白如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等等)。对于载体、稳定剂和佐剂的例子，可以参见Martin REMINGTON＇S PHARM.SCI.，18th Ed.(Mack Publ.Co.，Easton(1995))和“PHYSICIAN＇S DESKREFERENCE”，58nd Ed.，Medical Economics，Montvale，N.J.(2004)。术语载体可以包括缓冲剂或pH调节剂，通常缓冲剂是由有机酸或碱制备的盐。代表性的缓冲剂包括有机酸盐如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或苯二甲酸的盐、Tris、盐酸氨基丁三醇或磷酸缓冲液。其它的载体包括聚合物赋形剂/添加剂如聚乙烯吡咯烷酮、菲科尔(一种聚蔗糖)、糊精(例如，环糊精如2-羟丙基-.正交.-环糊精)、聚乙二醇、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯如“TWEEN 20”和“TWEEN 80”)、类脂(如磷脂、脂肪酸)、类固醇(如胆固醇)和螯合剂(如EDTA)。可以包括防止或减少冰形成的物质。
T细胞中TCR功能的有效转移先前仅可能通过采用编码TCR的逆转录病毒载体进行稳定的转导来实现。但是，逆转录病毒转导具有对自体细胞产生不可逆遗传操作的危险。我们发展了对T细胞进行瞬时RNA转染的最优条件。采用EGFP-RNA和最优条件的转染效率大于90％。从血液中分离的原代T细胞用TCR编码RNA进行电穿孔导致具有与亲代CTL克隆相同的HLA-A2/gp100特异性的功能性CTL(在效应：靶比率为20：1时杀伤率>60％)。TCR转染的T细胞在IFNγ分泌实验中特异性地识别肽冲击T2细胞或用gp100编码RNA进行电穿孔的树突细胞并且甚至在低温保藏后保持该能力超过3天。重要的是，这是第一次用TCR RNA进行电穿孔的CD8+T细胞表现出细胞毒性并在至少72h的时间内特异性地溶解肽冲击的T2细胞和HLA-A2+/gp100+黑色素瘤细胞。就我们所知，这是对通过TCR-RNA转染到T细胞中转移细胞溶解能力的首次报道。肽滴定研究表明RNA转染的T细胞的溶解效率与逆转录病毒转导的T细胞相似，且接近于亲代CTL克隆的溶解效率。低温保藏的TCR RNA电穿孔CD8+T细胞产生IFNγ并发挥细胞毒性的能力对于生产大批量的用于免疫治疗的临床上可行和有效的转染T细胞是必要的。
由于这一方案克服了逆转录病毒转导的缺陷(如可能的插入诱变)，它提供了一种新的和更好的产生用于癌症、病原体感染的免疫治疗和自身免疫疾病如移植排斥的治疗的抗原特异性T淋巴细胞的途径。在RNA被电穿孔进入细胞时，可能产生插入诱变的问题完全没有了，且对于仅需要特定分子的短暂表达的应用，RNA电穿孔是一种很好的替代方式。由于RNA仅短暂存在于转染细胞中而不整合到基因组中，这一过程不能划分为基因疗法。因此，我们的T细胞TCR RNA转染比TCR基因逆转录病毒转导到T细胞中要安全得多。另一个重要的方面是，由于RNA转染的安全性和简单性(从技术和管理控制两个角度来看)，快速筛选用于治疗应用的候选TCR是可能的。除了这些TCR RNA转染的T细胞在过继转移的应用中超过逆转录病毒转导T细胞的优势外，TCR RNA转染的T细胞可以被用作“试剂”和据报告不稳定的人T细胞克隆的替代以检测和监测体外APC和靶细胞上的特异性MHC/肽复合体。低温保藏一种制剂的几个批次的可能性使得能够在长期试验中提供稳定的质量。
尽管对大量T细胞进行电穿孔是可能的，但这在瞬时转染的T细胞注射到肿瘤时是不必要的。少量T细胞可以引起部分肿瘤的破坏，这随后可能通过抗原呈递细胞的有效抗原呈递引起表位扩展。还可能采用联合疗法，首先注射TCR转染的T细胞以诱导表位扩展，然后注射未负载的或者用抗原预先负载的树突细胞。在这些情况中，许多T细胞和/或特定TCR的长期表达是不需要的。另外，TCR转染的CD4+可以提供对于肿瘤排斥的辅助T细胞。
编码全长TCRα和β(或γ和δ)链的RNA的电穿孔可以用作克服由逆转录病毒转导和内源性TCR链的配对引起的长期自身反应性问题的替代。尽管这种替代配对发生在瞬时转染方案中，但可能产生的自身反应性T细胞在一段时间之后将放松这一自身反应性，因为引入的TCRα和β链只是短暂表达的。当引入的TCRα和β链的表达减少时，仅留下正常的自体T细胞。这与全长TCR链通过稳定的逆转录病毒转导引入的情况不同，在逆转录病毒转导引入全长TCR链的情况中，从不放松引入的TCR链，引起病人不断地存在自身反应性。
在用绿色荧光蛋白质(GFP)对T细胞进行电穿孔方面先前已经有一些成功的报道。但是，GFP RNA和蛋白质两者都是高稳定性的，采用其它RNA观察到的转染效率通常低于采用GFP RNA获得的转染效率。在本发明之前，没有人想到用编码膜蛋白质-特别是异质二聚体膜蛋白质-的RNA转染T细胞可以达到足够高的效率，从而获得功能表达。本发明提供用RNA对T细胞进行电穿孔的优化方法，这使得能够在瞬时转染的T细胞中实现TCR RNA和其它RNA的功能表达。这里公开的方法可以用于以RNA转染任何类型的T细胞。在优选的实施方式中，该RNA编码TCR。T细胞中TCR RNA的表达导致响应于TCR与抗原：MHC复合体的连接的抗原特异性效应子功能。
因此，本发明提供一种包括用编码抗原特异性T细胞受体(TCR)的RNA瞬时转染的效应T细胞的组合物，其中该T细胞具有对以MHC分子复合体形式呈递该抗原的细胞特异的效应子功能。
“T细胞”指的是T淋巴细胞，并包括，但不限于γ：δ+T细胞、NK T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T细胞包括TH0、TH1和TH2细胞以及调节T细胞(Treg)。具有至少三种调节T细胞：CD4+CD25+Treg、CD25-TH3Treg和CD25-TR1Treg。“细胞毒性T细胞”指的是能够杀死另一细胞的T细胞。大多数细胞毒性T细胞是CD8+MHC-I类限制型T细胞，但某些细胞毒性T细胞是CD4+。任何类型的T细胞都可以采用这里的方法进行转染。在优选的实施方式中，T细胞为CD4+或CD8+。在一种实施方式中，T细胞是Treg细胞。
大多数T细胞受体(TCR)识别与MHC分子结合的肽抗原(或抗原的肽片段)的复合体(MHC：抗原复合体)。TCR负责各T细胞的抗原特异性以及由MHC-I类分子还是MHC-II类分子呈现的抗原识别的限制。CD4+T细胞中产生的TCR是MHC-II类限制的，意味着源自CD4+T细胞的TCR只识别由MHC-II类分子呈现的抗原。源自CD8+的TCR是MHC-I类限制的，且只识别由MHC-I类分子呈现的抗原。在一种实施方式中，CD8+细胞用编码一种或多种MHC-I类限制性TCR的RNA转染。在另一实施方式中，CD4+T细胞用编码一种或多种MHC-II类限制性TCR的RNA转染。
令人惊异的是，本发明的发明人发现可以通过用编码MHC-I类特异性TCR的核酸进行转染将MHC-I类特异性识别赋予CD4+T细胞。类似地，可以通过用编码MHC-II类特异性TCR的核酸进行转染将MHC-II类特异性识别赋予CD8+T细胞。如这里所用的，如果携带某TCR的T细胞在用某特定抗原(与MHC分子复合)刺激时发挥的免疫功能(如释放细胞因子、溶解刺激细胞等)明显好于(P<0.05)用非相关的抗原刺激时，则该TCR被认为对该抗原是“特异性的”。因此，在一种实施方式中，CD8+T细胞用编码一种或多种MHC-II类限制性TCR的核酸-优选RNA-转染。在另一个实施方式中，CD4+T细胞用编码一种或多种MHC-I类限制性TCR的核酸-优选RNA-转染。另外，CD8+T细胞可以同时用编码MHC-I类和MHC-II类限制性TCR的核酸-优选RNA-转染。类似地，CD4+T细胞可以同时用编码MHC-I类和MHC-II类限制性TCR的核酸-优选RNA-转染。可用于本发明的TCR还包括嵌合的非MHC限制性TCR，其能够识别抗原而不论抗原是否与MHC分子复合。如果携带某非MHC限制性TCR的T细胞在用某特定抗原(无论是否与MHC分子复合)刺激时发挥的免疫功能(如释放细胞因子、溶解刺激细胞等)明显好于(P<0.05)用非相关的抗原刺激时，则该非MHC限制性TCR被认为对该抗原是“特异性的”。因此，CD4+T细胞和CD8+T细胞都可以用编码非MHC限制性TCR的核酸-优选RNA(单独或与MHC限制性TCR组合)转染。
天然产生的TCR是由两个多肽链(α和β链(TCRα和TCRβ)或者γ和δ链(TCRγ和TCRδ))构成的异质二聚体糖蛋白。α：βTCR是在CD8+T细胞和CD4+T细胞中天然表达的，而γ：δTCR是在称为γ：δ+T细胞的T细胞亚群中天然表达的。TCR多样性是通过T细胞在胸腺中发育的过程中可变区域基因片段的一系列重排产生的。各链具有胞外可变区、胞外恒定区、具有用于形成两条链间的二硫键的半胱氨酸残基的铰链区、跨膜区和胞质尾区。异质二聚体的两个可变区形成单抗原结合位点。α和βTCR链的可变区的互补性决定区(CDR)与肽相互作用。α和βTCR链的可变区的CDR1和2区域与MHC分子相互作用。
本发明提供用编码抗原特异性T细胞受体的RNA瞬时转染的T细胞。该TCR可以是MHC-I类限制的、MHC-II类限制的和非MHC限制的(MHC无关的)。这些类型TCR中的各种是本领域技术人员已知的。非MHC限制的嵌合受体的例子在Bolhuis等Adv Exp Med Biol.1998；451：547-55；Weijtens等Gene Ther.1998Sep；5(9)：1195-203；Weijtens等Int J Cancer.1998 Jul 17；77(2)：181-7；Eshhar等JImmunol Methods.2001 Feb1；248(1-2)：67-76；Hombach等Int JCancer.2000 Oct1；88(1)：115-20和Daly等Cancer Gene Ther.2000Feb；7(2)：284-91中公开，其内容通过引用并入本文。CD4+T细胞和CD8+T细胞两者都可以用任何类型的TCR转染。另外，T细胞也可以用另外的编码其它多肽(如细胞因子、转录调节子如FoxP3、共刺激分子等)的RNA共转染。但是，如这里所用的，用编码T细胞受体的RNA进行的转染不包括用T细胞或T细胞衍生物(如T细胞肿瘤)的总RNA或总mRNA进行转染，除非编码TCR的RNA的比例相对于其在总RNA或总mRNA中的正常表现是富集的。
“编码T细胞受体的RNA”意思是一种或多种编码功能性T细胞受体的RNA，以使在抗原与该TCR所识别类型MHC分子复合(或者如果该TCR是非MHC限制性TCR，不存在与MHC分子的复合)时，所表达的T细胞受体可以特异性地结合其正常识别的抗原。在大多数情况下，该RNA将包括编码TCR的α链的RNA和编码TCR的相应β链的RNA(或者可选择地，编码TCR的δ链的RNA和编码TCR的相应γ链的RNA)。可选择地，可以使用嵌合受体，其将避免错配且可避开HLA限制。嵌合TCR多肽可以通过将来自不同蛋白质的结构域融合在一起而产生。例如，胞内域通常包括TCR复合体的胞内信号域如CD3　ζ链，或在类似情形中发挥功能的信号域如Fc受体的信号域。胞外域可选择能够在MHC环境中特异性地与抗原结合的胞外域如TCRα和β链的胞外域，或者能够独立于MHC结合抗原的胞外域如抗原特异性scFv。跨膜域可以从已经采用其胞内域或者胞外域的蛋白质提取或获得，或者从其它跨膜蛋白质提取或获得。
在大多数TCR基因被逆转录病毒转导到T细胞中的研究中，全长TCRα和β链被用于对这些T细胞进行重新定靶(retarget)。但是，在使用全长TCR链基因具有潜在的危险，因为理论上，引入的链可与内源的TCR链配对[8，30，32]。这种替代配对(alternative pairing)可能导致不可预料的特异性，其可能是自身反应性的。这种自身反应性TCR的形成是基因治疗管理委员会公认的关注点。替代配对的发生在对gp100或MDM-2特异性的全长TCR链逆转录病毒转移到T细胞的研究中出现。仅一部分表达引入的TCRβ链的T细胞(即分别50-60％和30-50％)能够结合相应的MHC/肽四聚体[24，27]。
对于替代配对问题的一种解决办法是引入单链或双链的被修饰的TCR基受体，其结构上与全长TCR不同，造成引入的TCR链之间的独占配对[8]。构建单链TCR(scTCR)的方法在Lake等(1999)IntImmunol　11：745-751和Nitta等(1990)Science　249：672中公开，其内容通过引用并入本文。这种对几种黑色素瘤抗原如MAGE-1[29]、gp100[23]具有特异性的受体已经通过逆转录病毒转导功能性引入到T细胞中。但是，对OVA肽特异性的全长与修饰的单链TCR的仔细对比表明，单链TCR转导的T细胞在对以OVA肽冲击的靶细胞和自然表达的靶细胞进行刺激的应答中，与全长TCR转导的T细胞相比效率较低[32]。因此，为产生最有效的T细胞，优选使用全长TCR链进行TCR转移。
优选地，TCR链来自于哺乳动物，更优选来自于灵长类动物，且最优选来自于人类。在优选的实施方式中，TCR特异性地识别肿瘤或病原体的抗原或者自体抗原。优选地，抗原是肿瘤特异性或病原体特异性抗原。优选的肿瘤特异性抗原包括来自以下类型的肿瘤的抗原：肾细胞癌、黑色素瘤、慢性淋巴细胞性白血病、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌或结肠癌。肿瘤特异性抗原的例子包括，但不限于，MART-1、MAGE-1、MAGE-3、gp75、MDM2、酪氨酸酶、端粒末端转移酶、gp100、生存蛋白、α-1甲胎蛋白、G250和NY-ESO-1。优选的病原体特异性抗原包括来自HIV和HCV的抗原。
众多的α、β、γ和δ TCR链的序列是现有技术中已知的(参见，例如Arden等(1995)Immunogenetics 42：455-500，其内容通过引用并入本文)。GenBank目前包含了超过12000条各种脊椎动物物种的T细胞受体序列。建立和筛选TCR文库的方法在美国专利公开2003/0082719中公开，其内容通过引用并入本文。克隆另外的TCR链的方法是本领域技术人员已知的，例如，TCR链可以通过鉴别表达具有所需要的特异性的TCR的T细胞并反向转录其RNA为DNA进行克隆。TCRα和β链的亚型然后可以通过PCR确定。亚型的鉴别使得能够选择可以扩增两条链的全长编码序列的特定引物。应用PCR确定TCRα和β链的亚型和选择TCR链的RT-PCR扩增引物的方法在Lake等(1999)Int Immunol 11：745-751和Nitta等(1990)Science249：672中公开，其内容通过引用并入本文。通过RT-PCR克隆TCRγ和δ的方法和引物在Kapp等(2004)Immunology 111：155-164；Weber-Arden等J Immunol Methods.1996 197(1-2)：187-92和Olive(1995)Neuroimmunol 62：1-7中公开，其内容通过引用并入本文。一种替代上述以TCRα和β链的亚型鉴别开始的方法的可选择的方法，改为利用杂交到TCR RNA的保守区的反转录引物反向转录TCR RNA的cDNA副本，然后附加规定的序列到cDNA的3＇末端(如，通过末端转移酶或通过改良的帽转换(capswitch)技术，参见WO2005/052128，其内容通过引用并入本文)。从任何细胞(如T细胞)提取的RNA的RT-PCR和体外转录的方法在审查中的申请WO2005/052128和PCT/US05/32710中公开，其内容通过引用并入本文。
TCR RNA的cDNA副本可以插入用于体外转录的表达盒。可选择地，TCR cDNA可以使用适用于体外转录以及用于在电穿孔的T细胞内翻译体外转录(IVT)的RNA的包含转录和翻译信号的引物进行扩增。为确保在T细胞中的最佳翻译，编码TCR链的IVT RNA优选是加帽的和多腺苷酸化的。另外，mRNA的稳定性和/或翻译效率可以通过电穿孔额外的非编码序列(如5’和3’UTR)而提高。
体外转录的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如，美国2003/0194759，其内容通过引用并入本文)。在典型的体外转录反应中，DNA模板利用噬菌体RNA聚合酶在所有四种核糖核苷三磷酸和帽二核苷酸(如m7G(5＇)ppp(5＇)G)或帽类似物(如ARCA)存在下进行转录。这种方法是现有技术中的常规操作且在下面的公开出版物中公开：Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd edition(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(Ausubel等eds.(1987))；丛书METHODS INENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)；PCR：APR A CTICALAPPROACH(M.MacPherson等IRL Press at Oxford University Press(1991))和PCR2：A PRACTICAL APPROACH(MacPherson，Hames和Taylor eds.(1995))。
T细胞以TCR IVT mRNA瞬时转染导致RNA的翻译和TCR异质二聚体(或嵌合TCR)在细胞膜上的定位。这种TCR与MHC分子复合的抗原的结合导致通过激活的T细胞的效应子功能。瞬时转染意思是转染到细胞中的RNA不整合到宿主基因组中或在细胞中独立地复制。相反，逆转录病毒转导依赖逆转录病毒载体整合到宿主染色体中。
在优选的实施方式中，静息细胞(优选静息的效应T细胞)用RNA(优选编码TCR的RNA和/或FoxP3 RNA)进行电穿孔。胸腺细胞在胸腺中分化成成熟T细胞并且带着原始表型和处于静息状态迁移到血流和外周。当它们与本身被激活的共刺激信号一起遇到其特异的抗原：MHC复合体时，它们开始分裂并获得新的表型，例如，效应T细胞或中枢记忆T细胞的表型。如果抗原被除去，它们可以再次进入静息期。当再次遇到该抗原：MHC复合体时，不再需要共刺激，而T细胞被再次快速激活。它将再次分裂，且记忆T细胞可以进一步分化成效应T细胞。但即使如此，它还可以变成静息状态。来自健康供体的外周T细胞通常包含原态、记忆和效应T细胞的混合物，其大多数是处于静息期。这些静息T细胞很少分裂，且一般是具有凝聚染色质和很少细胞质的小细胞。在激活时，它们快速增殖并且尺寸增大。静息T细胞也可以在体外，典型地在IL-2存在的情况下，通过用PHA、PMA或OKT3进行刺激而激活。令人惊异的是，本发明的发明人发现用TCR RNA对静息T细胞进行电穿孔赋予其对转染的TCR具有特异性的效应子功能，而不需要用PHA、PMA或OKT3 Ab进行刺激。
静息的CD4+和CD8 T细胞典型地是CD25-HLA DR-和L-选择蛋白+(L-selectin+)，并且不分裂或表达细胞因子。激活的T细胞典型地是L-选择蛋白-、CD25+、HLA DR+，快速分裂并产生各种的细胞因子，包括IL2、IFNγ和TNF。从外周血分离T细胞的方法是本领域技术人员已知的，也在此进行说明。
T细胞效应子功能可以包括，但不限于，IL-2分泌、肿瘤坏死因子(TNF-α)分泌、干扰素-γ(INFγ)分泌、细胞毒性、辅助功能(如巨噬细胞的激活和/或B细胞的激活)和调节功能中的一种或多种。效应子功能依赖于被转染的T细胞的类型。激活的CD8+T细胞的效应子功能包括细胞毒性和INFγ分泌。激活的CD4+TH1细胞的效应子功能包括巨噬细胞的激活。激活的CD4+TH2细胞的效应子功能包括激活B细胞以增殖和产生抗体。调节性效应子功能包括，但不限于IL-10分泌和TGF-β分泌。检测和测量效应子功能的方法是本领域技术人员已知的。
T细胞的效应子功能是通过它们应答其TCR与靶细胞上抗原：MHC复合体的特异性结合时释放的效应分子确定的。储存在可由细胞毒性CD8+T细胞释放的裂解性颗粒中的细胞毒性效应分子包括穿孔素、颗粒酶、颗粒溶素和Fas配体。穿孔素在靶细胞中形成跨膜孔。颗粒酶是可以引发细胞凋亡的丝氨酸蛋白酶。颗粒溶素在靶细胞中诱导细胞凋亡。Fas配体也可以在靶细胞中诱导细胞凋亡。其它的可由细胞毒性T细胞释放的效应分子包括IFN-γ、TNF-β和TNF-α。IFN-γ抑制病毒复制并激活巨噬细胞。TNF-β和TNF-α可参与巨噬细胞激活和杀死某些靶细胞。CD8+T细胞以源自CD8+T细胞的TCRRNA转染导致MHC-I类限制的抗原特异性细胞毒性(即对于呈现抗原：MHC-I类复合体的靶细胞的细胞毒性)。相反，CD8+T细胞以源自CD4+T细胞的TCR RNA转染导致MHC-II类限制的抗原特异性细胞毒性(即对于呈现抗原：MHC-II类复合体的靶细胞的细胞毒性)。来自细胞内病原体(如分枝杆菌，结核病和麻疯病的病原体)的抗原典型地在MHC-II类分子上呈现。由此，CD8+T细胞用编码对分枝杆菌抗原特异性的TCR的RNA进行转染可以产生对支原体感染细胞的MHC-II类限制性抗原特异性细胞毒性。
可由CD4+TH1细胞分泌的巨噬细胞激活效应分子包括IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、CD40配体(CD154)和Fas配体。CD4+TH1细胞亚群也可以在B细胞激活中辅助IFN-γ和CD40配体激活巨噬细胞以摧毁吞噬的细胞。其它可由TH1细胞释放的效应分子包括IL-3、TNF-β(其抑制B细胞)、IL-2、CXCL2和GROβ。Fas配体和TNF-β可杀死被细胞内细菌长期感染的细胞。IL-2诱导T细胞增殖。IL-3和GM-CSF诱导巨噬细胞分化。CCL2诱导巨噬细胞的趋化性。CD4+TH1细胞以源自CD4+T细胞的TCR RNA转染导致MHC-II类限制的效应子功能(即应答呈现抗原：MHC-II类复合体的靶细胞的抗原特异性结合而激活巨噬细胞)。相反，CD4+TH1细胞以源自CD8+T细胞的TCR RNA转染导致MHC-I类限制的效应子功能(即高IL-2、TNF和IFN分泌、应答呈现抗原：MHC-I类复合体的靶细胞的抗原特异性结合而激活巨噬细胞)。
可由CD4+TH2细胞分泌的B细胞激活效应分子包括IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-15和CD40配体。其它可由CD4+TH2细胞释放的效应分子包括IL-3、GM-CSF、IL-10(其抑制巨噬细胞激活)、TGF-β、IL-2、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)和CCL17(TARC)。激活的TH2细胞(和一些TH1细胞)在它们识别特定的由B细胞呈现的抗原：MHC-II类复合体时刺激B细胞增殖和分化。CD4+TH2细胞以源自CD4+T细胞的TCR RNA转染导致MHC-II类限制的效应子功能(即应答呈现抗原：MHC-II类复合体的靶细胞的抗原特异性结合的B细胞激活)。相反，CD4+TH1细胞以源自CD8+T细胞的TCR RNA转染导致MHC-I类限制的效应子功能(即应答呈现抗原：MHC-I类复合体的靶细胞的抗原特异性结合的B细胞激活)。
CD4+调节T细胞向下调节免疫应答。TR1调节T细胞分泌免疫抑制效应分子，如IL-10和TGF-β。IL-10通过减少T细胞产生的IL-2、TNF-α和IL-5而下调T细胞的应答。TGF-β降低T细胞增殖、杀伤作用和细胞因子表达。TH3调节T细胞通过分泌免疫抑制效应分子TGF-β下调免疫应答。CD4+CD25+调节T细胞是免疫抑制的，且通过抗原与其TCR特异性结合而激活。一旦激活，CD4+CD25+调节T细胞以不依赖于抗原的方式显示免疫抑制效应子功能。
瞬时转染的效应T细胞可用于治疗肿瘤、病原体感染、自身免疫疾病、移植物抗宿主病(GVHD)和防止移植排斥。在本发明的优选实施方式中，TCR是对肿瘤抗原、病原体抗原或自体抗原特异性的。优选地，抗原是肿瘤抗原或病原体抗原。抗原可以来自任何类型的肿瘤，包括，但不限于肾细胞癌、黑色素瘤、慢性淋巴细胞性白血病、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌或结肠癌。优选的黑色素瘤抗原包括MART-1、MAGE-1、MART-1和gp100。其它优选的肿瘤抗原包括gp75、MDM2、酪氨酸酶、端粒末端转移酶、生存蛋白、α-1甲胎蛋白、CA125、CA15-3、CA19-9、PSA、G250或NY-ESO-1。另外的肿瘤相关抗原以及肿瘤相关抗原(TAA)的鉴定方法在Nicolette和Miller(2003)Drug Discovery Today 8：31-38；Kawakami和Rosenberg(1997)Immunol Res 16：313和Slingluff等(1994)Curr OpinImmunol 6：733中公开，其内容通过引用并入本文。优选的病原体抗原为HIV和HCV抗原。在癌症治疗中，肿瘤特异性TCR的一个来源是肿瘤浸润性淋巴细胞。虽然是无反应性的，但它们表达功能性TCR。另一种可能性是对来源于患者的T细胞进行体外刺激。在调节机制不存在的情况下，TAA特异性T细胞可被扩增。一旦产生了一系列TCR，就可以针对各个病人就肿瘤的MHC类型和抗原表达从中个别地挑选特定的种类。在HIV治疗中，某些免疫原性肽被很好地鉴定了。但是，大多数病人的免疫系统已经太弱而不能发动对病毒的有效的免疫应答。TCR可以从表现出有效的免疫应答的HIV感染病人(如在早期或长期非发展者的后期)产生，或者在参与接种实验的健康供体中产生。
如上所述，编码MHC-I类限制性TCR、MHC-II类限制性TCR和/或非MHC限制性TCR中任一种的RNA可以通过电穿孔转染到任何类型的T细胞中。在一种实施方式中，T细胞是调节T细胞(Treg)。优选地，Treg是CD4+CD25+。用自体抗原特异性的TCR RNA转染的调节T细胞可用于治疗自身免疫疾病。用移植体抗原特异性的TCRRNA转染的调节T细胞可用于防止移植排斥和治疗或预防移植物抗宿主病(GVHD)。
FoxP3是参与到CD4+T细胞分化成调节T细胞过程的转录因子。FoxP3的逆转录病毒表达足以将CD4+T细胞转化成调节T细胞(Sakaguchi等(2003)Science 299：1057-61)。因此，在一种实施方式中，本发明提供包含编码FoxP3的外源RNA的Treg细胞。人的Foxp3氨基酸序列和cDNA序列在GenBank中以登录号NM_014009公开(版本NMJH4009.2GI：31982942)。外源RNA意思是直接通过RNA转染或通过外源表达盒的转录引入的RNA。由此，CD4+T细胞可以用编码FoxP3的RNA转染，或者利用FoxP3的表达盒转染。在优选的实施方式中，T细胞用编码FoxP3的RNA瞬时转染。另外，T细胞可以利用FoxP3RNA和TCR RNA进行共转染。
本发明的发明人已经优化了用RNA电穿孔T细胞的方法。优选地，纯化的CD8+T细胞或纯化的CD4+T细胞被电穿孔。用编码TCR的RNA对T细胞进行电穿孔赋予转染的T细胞新的抗原特异性。因此，在一个方面中，本发明提供一种赋予T细胞新的抗原特异性的方法，包括用编码抗原特异性TCR受体的RNA对包含纯化的CD8+或纯化的CD4+T细胞的组合物进行电穿孔。
纯化的CD8+T细胞意思是纯化的CD8+T细胞组合物中CD8+T细胞：CD8-T细胞的比率与外周血中的CD8+T细胞：CD8-T细胞的比率相比得到提高。类似地，纯化的CD4+T细胞意思是纯化的CD4+T细胞组合物中CD4+T细胞：CD4-T细胞的比率与外周血中的CD8+T细胞：CD8-T细胞的比率相比得到提高。优选地，纯化的T细胞(CD8+或CD4+)占存在于组合物中的所有T细胞的至少75％，更优选至少90％，最优选至少95％和更进一步至少99％。纯化CD4+或CD8+T细胞的方法是本领域技术人员已知的。在优选的实施方式中，T细胞通过磁珠分选进行纯化。在一种实施方式中，Treg与CD8+T细胞或CD4+T辅助细胞分离或从CD8+T细胞或CD4+T辅助细胞中清除。
在电穿孔之前，T细胞可以是未刺激的(和主要静息的)或体外刺激的(如通过OKT3Ab、PHA、PMA等刺激)。优选地，纯化的CD8+T细胞或CD4+在电穿孔之前未通过植物血凝素(PHA)或OKT3进行体外刺激。因此，在另一个方面中，本发明提供一种赋予T细胞新的抗原特异性的方法，包括用编码抗原特异性TCR的RNA对静息T细胞进行电穿孔。
但是，在需要在电穿孔之前扩增T细胞数目的情况中，T细胞可以(例如通过与PHA、PMA和/或OKT3一起培养，优选在IL-2存在下)进行刺激而增殖，然后用RNA进行电穿孔。
本发明的发明人发现对静息的或者刺激的T细胞进行电穿孔的最佳条件是采用方波脉冲以100-150伏特/mm间隙宽度(如4mm的间隙上400-600V)的场强持续2-10毫秒(ms)。优选地，场强为110-140V/mm，更优选为120-130V/mm，且最优选为约125V/mm。例如，在采用2mm小池(cuvette)的实施方式中，最优选的电压将是250V。优选电压施加3-7ms，更优选4-6ms和最优选5ms。在优选的实施方式中，细胞在OptiMEM培养基中或者在室温下具有类似电导率的培养基中进行电穿孔。
在一种实施方式中，本发明提供一种瞬时转染T细胞的方法，包括用方波脉冲在100-150V/mm的场强下用RNA对T细胞进行2-10ms的电穿孔，其中所述T细胞在电穿孔之前未使用PHA或OKT3进行体外刺激。优选T细胞在电穿孔之前进行纯化(如纯化的CD8+T细胞、纯化的CD4+T细胞或纯化的调节T细胞)。在另一种实施方式中，T细胞在电穿孔之后进行纯化。
用TCR RNA瞬时转染的T细胞可用于肿瘤、病原体感染、自身免疫疾病、移植排斥和GVHD的治疗。因此在一种实施方式中，本发明提供按照本发明的方法制备的T细胞在制备免疫治疗的药物中的用途。在另一个方面，本发明包括向受试者提供抗原特异性T细胞效应子功能的方法，包括施用用编码抗原特异性TCR的RNA瞬时转染的T细胞，其中该T细胞表现出对以MHC分子复合体形式呈递该抗原的细胞的效应子功能。优选地，该效应子功能是细胞毒性，该抗原是肿瘤特异性的或病原体特异性的。在优选的实施方式中，该T细胞是受试者自体的。
本发明的T细胞组合物可以与其它的治疗药物和细胞毒性剂共同施用，无论是否与它们结合或以同一次剂量施用。它们可以与这类药剂同时地(如以单一组合物的形式或分别地)共同施用，或者可以在施用这类药剂之前或之后施用。这类药剂可以包括如IL-2的免疫刺激细胞因子、如抗癌药(cytostatica)的化疗药物、抗病毒药物、疫苗或任何其它种类的帮助或改善这一治疗的治疗药物。
生成体外转录RNA的方法
本发明的特定实施方式需要制备和使用体外转录(IVT)RNA。IVT RNA可以使用现有技术中已知的任何方法产生。在优选的实施方式中表达盒包含适于体外转录的启动子，如T7启动子或SP6启动子。优选地，体外转录mRNA针对稳定性和翻译的效率进行优化。例如，mRNA稳定性和/或翻译效率可以通过在mRNA中包括3＇UTR和/或5＇UTR而提高。3＇UTR的优选实例包括来自人β-肌动蛋白(Qin和Gunning(1997)Journal of Biochemical and Biophysical Methods 36　pp.63-72)和轮状病毒基因6(Yang等，2004 Archives of Virology149：303-321)的那些。5＇UTR的优选实例包括Hsp 70(Vivinus等，2001European Journal of Biochemistry 268：1908-1917)、VEGF(Stein等，1998 Molecular and Cellular Biology 18：3112-3119)、脾坏死病毒RU5(Roberts和Boris-Lawrie 2000 Journal of Virology 74：8111-8118)和烟草蚀纹病毒(Gallie等.(1995)Gene 165：233-238；Niepel和Gallie(1999)Journal of Virology 73：9080-9088.Gallie，Journal of Virology(2001)75：12141-12152)的5＇UTR中的翻译增强子。
T细胞的分离和扩增
T细胞，包括静息T细胞和激活T细胞，可以通过本领域技术人员已知的方法从哺乳动物分离。在非限制性的一种方法中，菲可尔-希帕克二氏(Ficoll-Hypaque)密度梯度离心被用于按照既定的程序从红血球和嗜中性粒细胞分离PBMC。细胞用补充有1％胎牛血清(FBS)的改良AIM-V(其由AIM-V(GIBCO)加上2mM谷氨酰胺、10μg/ml硫酸庆大霉素、50μg/ml链霉素组成)清洗。T细胞通过采用与柱或磁性微球偶联的合适的单克隆抗体按照标准技术的阴性或阳性选择进行富集。一部分细胞针对细胞表面表型(包括CD4、CD8、CD3和CD14)进行分析。仅为了说明的目的，细胞被清洗并以约5X105细胞/ml的浓度重悬于如上改良的并包含5％FBS和100U/ml重组IL-2(rIL-2)的AIM-V(补充的AIM-V)中。在细胞从HIV+病人分离的情况下，25nM CD4-PE40(由连接到绿脓杆菌外毒素A的转运和ADP-核糖基化结构域的HIV-1-结合性CD4域构成的重组蛋白质)或其它与HIV选择性杂交的类似重组细胞毒性分子被加入细胞扩增剩余的细胞培养物中，以从培养物中选择性地去除HIV感染的细胞。CD4-PE40已被证明抑制HIV感染细胞的培养中p24的产生并选择性杀死HIV-1-感染的细胞。优选的分离、培养和扩增T细胞的方法在实验部分中公开。
为刺激增殖，OKT3单克隆抗体(Ortho Diagnostics)可以添加达到10ng/ml的浓度，且细胞以0.5ml/孔平板接种在24孔板上。细胞在5％CO2的加湿培养箱中在约37℃的温度下培养48小时。从细胞吸出培养基，1ml含载体上清(下面描述)补充有5μl/ml鱼精蛋白硫酸盐、100U/ml rIL-2、100U/ml青霉素、0.25μg/ml两性霉素B/ml和另外的100μg/ml链霉素(可以添加25nM CD4-PE40)。用PHA刺激T细胞增殖的方法在实验部分中公开。
细胞分离和鉴定
在另一个方面，细胞表面标记可用于分离或鉴定实现本发明的方法所需要的细胞。例如，人干细胞典型地表达CD34抗原，而DC表达MHC分子和共刺激分子(如B7-1和B7-2)，缺乏粒细胞、NK细胞、B细胞和T细胞特有的标记。表面标记的表达有助于这些细胞的鉴别和纯化。鉴别和分离的这些方法包括FACS、柱层析、磁性微球淘洗、蛋白质印迹、射线显影术、电泳、毛细管电泳、高效液相(HPLC)、薄层层析(TLC)、超扩散层析(hyperdiffusion chromatography)等等，以及各种免疫学方法如液体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、荧光免疫分析等等。对于一般免疫学和免疫分析程序的回顾，可以参见Stites和Terr(eds.)1991 Basic and Clinical Immunology(7th ed.)及Paul(同上)。对于如何生成对所选择抗原的抗体的讨论可以参见Harlow and Lane(1989)(同上)。
在细胞纯化过程中，细胞分离和用于细胞检测的免疫分析可以几种形式中的任一种进行，如在Maggio(ed.)(1980)EnzymeImmunoassay CRC Press，Boca Raton，Fla.；Tijan(1985)＂Practice andTheory of Enzyme Immunoassays，＂Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam；Harlow和Lane，supra；Chan(ed.)(1987)Immunoassay：APractical Guide Academic Press，Orlando，Fla.；Price和Newman(eds.)(1991)Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press，NY及Ngo(ed.)(1988)Non-isotopic Immunoassays Plenum Press，NY中总结的那些。
细胞可以通过流式细胞分析方法(如FACS分析)分离和鉴定。已知有多样的流式细胞分析方法。对于荧光激活流式细胞术的一般回顾，可以参见，例如，Abbas等.(1991)Cellular and Molecularimmunology W.B.Saunders Company，特别是第3章和Kuby(1992)Immunology W.H.Freeman and Company，特别是第6章。FACS仪是现有的，例如从Becton Dickinson得到。
可用于标记细胞抗原的标记物包括，但不限于，单克隆抗体、多克隆抗体、蛋白质或其它聚合物如亲和性基质、碳水化合物或类脂。检测通过任何已知的方法进行，如免疫印迹法、蛋白质印迹分析、放射或生物荧光标记的示踪、毛细管电泳或其它基于大小、电荷或亲和性追踪分子的方法。
治疗用途
瞬时转染的CD8+T细胞可以被引入哺乳动物中，它们对携带有相应抗原性肽的靶细胞具有细胞毒性，所述T细胞经操作通过引入的TCR在MHC-I类分子上对这些相应的抗原肽进行识别。用编码MHC-II类分子限制性TCR的RNA对CD8+T细胞进行转染使得能够抗原特异性地识别抗原：MHC-II类复合体。类似地，CD4+辅助T细胞在MHC-II类的条件下识别抗原肽，但也可以在用编码MHC-I类限制性TCR的RNA转染时识别肽：MHC-I类复合体。辅助T细胞也刺激对靶细胞的免疫应答。靶细胞通常是癌细胞或病原体感染细胞。
T细胞可以从待施用激活的T细胞的哺乳动物分离。可选择地，细胞可以是由供体提供的或细胞库(如血液库)中储存的异源细胞。
通过本发明的方法制备的细胞可以直接施用于受试者以产生对选择的抗原具有活性的T细胞。施用可以通过现有技术中已知的方法进行以成功地递送细胞而达到与最适当的组织接触。细胞以任何合适的方式施用，通常带有药物上可接受的载体。
在本发明的条件下对受试者施用细胞的合适的方法是现有的，而且虽然有多种途径用于施用特定的细胞组合物，但一种特定的途径通常可能提供比另一种途径更直接和更有效的反应。优选的施用途径包括，但不限于皮内、静脉施用、淋巴结施用和肿瘤内施用。在一种实施方式中，T细胞用编码趋化因子受体或其它引导细胞到达需要免疫治疗的部位(例如转移的部位，如肠、肝、肺等，自身免疫疾病的受侵袭组织等)的自导引分子的RNA共转染(对于趋化因子受体和自导引分子的回顾可以参见Salmi等.Immunol Rev.2005 206：100-13；Kim，Curr Opin Hematol.2005 Jul；12(4)：298-304；Kucia等.Stem Cells.2005Aug；23(7)：879-94；Ebert等.Mol Immunol.2005 May；42(7)：799-809；Cambi等.Cell Microbiol.2005 Apr；7(4)：481-8；Uhlig等.NovartisFound Symp.2004；263：179-88；讨论188-92，211-8；Kim等.CurrDrug Targets Immune Endocr Metabol Disord.2004 Dec；4(4)：343-61：Zocchi等.Leuk Lymphoma.2004 Nov；45(11)：2205-13；Sackstein JInvestig Dermatol Symp Proc.2004 Sep；9(3)：215-23；Morris等.CurrMol Med.2004 Jun；4(4)：431-8；Marhaba等J Mol Histol.2004 Mar；35(3)：211-31；Campbell等.Semin Immunol.2003 Oct；15(5)：277-86；Cyster等.Immunol Rev.2003 Aug；194：48-60；Ley Trends Mol Med.2003Jun；9(6)：263-8；Ono等.J Allergy Clin Immunol.2003 Jun；111(6)：1185-99，其内容通过引用并入本文)。
药物上可接受的载体部分地由要施用的特定组合物以及用于施用组合物的特定的方法确定。因而，有许多种适合于本发明的药物组合物的配方。最典型地，进行质量控制(微生物学、克隆源性实验、存活力测试)，并在施用苯海拉明和氢化可的松之后将细胞重新注入受试者体内。参见，例如，Korbling等.(1986)Blood 67：529-532和Haas等.(1990)Exp.Hematol.18：94-98。
适用于肠胃外施用(例如，举例来说通过肿瘤内、关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、淋巴结内和皮下途径)的配方和载体包括水性等渗无菌注射液(其可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和赋予该配方以预定的接受者的血液的等渗性的溶质)及水性和非水性的无菌悬浮液(其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。皮内和静脉内施用是本发明的T细胞的优选的施用方法。
施用于受试者的细胞(如激活的T细胞或树突细胞)的剂量是有效地随着时间在受试者内获得想要的有利治疗应答、或者抑制癌细胞的生长或者抑制感染的有效量。
仅为了说明的目的，该方法可以通过在注入之前从受试者取得和保存血液样品以用于随后的分析和对比。通常至少104至106、典型地1×108到1×1010之间的细胞在大致60-120分钟的时间通过静脉内或腹膜内注入70kg的病人体内。在一个方面中，施用是通过肿瘤内注射进行。密切监测生命体征和用脉搏血氧饱和仪监测氧饱合度。在注入后5分钟和1小时获取血液样本用于分析。细胞重注入大致每月重复一次，在一年的时间内进行总共10-12次治疗。在第一次治疗后，注入可以由临床医生决定作为门诊治疗进行。如果对门诊病人进行重注入治疗，参与者在治疗后需监测至少4小时。
对于施用，本发明的细胞可以按照通过有效剂量、细胞类型的LD-50(或其它毒性量度)和在各种浓度下细胞类型的副作用以及受试者的体重和整体健康状况确定的速率施用。施用可以通过单次给药或分次给药完成。本发明的T细胞可以补充通过已知传统疗法(包括细胞毒性物质、核苷酸类似物和生物应答调节剂)对病症的治疗。类似地，生物应答调节剂任选加入本发明的激活T细胞的治疗中。例如，细胞任选与辅助剂或细胞因子如GM-CSF、IL-12或IL-2一起施用。
确定免疫原性的方法
由本发明的方法制备的T细胞的免疫原性可以通过公知的方法确定，包括但不限于下面的方法：
51 Cr-释放溶解分析。可以比较通过抗原特异性T细胞产生的肽冲击靶细胞的溶解。“更活跃”的组合物将随着时间显示出更高的靶细胞溶解率。溶解的动力学以及在固定的时间点(如4小时)的整体靶细胞溶解率可用于性能评价。另外，靶细胞上杀死细胞需要的抗原密度显示了T细胞的亲和力。Ware等.(1983)3.Immunol.131：1312。
细胞因子释放分析。T细胞在接触修饰的APC时分泌的细胞因子的类型和数量可以是功能活性的量度。测定细胞因子的方法包括ELISA或ELISPOT分析以确定细胞因子产生的速率和总量。Fujihashi等，(1993)J.Immunol.Meth.160：181；Tanquay和Killion(1994)Lymphokine Cytokine Res.13：259。
增殖分析。T细胞对反应性组合物作出应答进行增殖。增殖可以通过测量例如3H-胸腺嘧啶的摄取进行定量监测。Caruso等(1997)Cytometry 27：71。
转基因动物模型。免疫原性可以通过用本发明的组合物免疫HLA转基因小鼠并确定诱发的免疫应答的特性和强度而进行体内评定。可选择地，hu-PBL-SCID小鼠模型使得能够通过人PBL的过继转移在小鼠体内重建人免疫系统。这些动物可以用组合物免疫并按照前面在Shirai等(1995)J.Immunol.154：2733；Mosier等.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2443中提到的方法分析免疫应答。
灵长类动物模型。非人类灵长动物(黑猩猩)模型系统可用于体内监测HLA-限制性配体的免疫原性。已经表明，黑猩猩共有与人MHC分子的交叉MHC-配体特异性，因此使得能够测试HLA限制性配体的相关体内免疫原性。Bertoni等.(1998)Immunol.161：4447。
监测TCR信号转导事件。几类细胞内信号转导事件(如磷酸化)与MHC-配体复合体成功接合TCR相关联。这些事件的定性和定量分析与组合物通过TCR接合激活效应细胞的相对能力相关。Salazar等.(2000)Tnt.J.Cancer 85：829；Isakov等.(1995)J.Exp.Med.181：375)。
与上述说明一样，下面的实施例用于举例说明，而不限制本发明的各项范围。
实验
材料与方法
细胞和试剂
PBMC通过采用Lymphoprep(Axis-Shield，奥斯陆，挪威)的密度离心从健康供体的全血(在获得知情同意和设施内伦理委员会批准后取得)制备。为产生树突细胞(DC)和非粘附性部分(NAF)，PBMC重悬于由包含1％热灭活的自体血浆、2mM L-谷氨酰胺(Bio Whittaker)、20mg/L庆大霉素(Sigma-Aldrich)的RPMI 1640(Cambrex)组成的自体培养基中，并以30×106细胞/皿的量转移到组织培养皿(BD Falcon)中。细胞在37℃孵育1-2h以使其附着，非粘附性部分被除去且如前所述[22]成熟的DC由粘附细胞产生。CD8+T细胞采用抗CD8 MACS微球(Miltenyi，Bergisch Gladbach，德国)按照生产商的说明进行分离。T细胞在由RPMI 1640、10％人血清、2mM L-谷氨酰胺、20mg/L庆大霉素、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠(Sigma-Aldrich)、1％MEM非必需氨基酸(100x)组成、补充有20U/mlI L-7的MLPC培养基中。20IU/ml IL-2和20U/ml IL-7在第2天和第4天加入。为产生植物血凝素(PHA)刺激的T细胞培养物，2×106/ml NAF在补充有10％人血清、1μg/ml PHA(Sigma)、20U/ml IL-7和20IU/ml IL-2的AIM-V培养基(Invitrogen)中于T25培养瓶中培养。IL-2和IL-7每两天添加。
黑色素瘤细胞株SK-MEL 526(HLA-A2+/gp100+)、Colo 829(HLA-A1+/A2-/gp100+)和NEMA(HLA-A2+/gp100-)及T2细胞(TAP缺陷TxB细胞杂交T2-A1(HLA-A1+/A2+；ATCC#CRL-1992))在由RPMI1640、2mM L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素、10％胎牛血清、2mM HEPES和2βME的R10培养基中培养。黑色素瘤细胞株的gp100表达通过用小鼠抗gp100mAb HMB45(DAKO，Glostrup，丹麦)和猴抗小鼠-PE(RDI，康科德，MA，美国)的细胞内染色确认。具体地说，细胞用Cytofix/Cytoperm溶液(BD Biosciences，海德堡，德国)进行可渗透化处理，并用初级和二级Ab按照生产商的说明进行染色。
TCR转染的T细胞采用PE-偶联抗TCRVβ 14mAb或PE-标记gp100/HLA-A2四聚体(Proimmune，牛津，英国)通过流式细胞仪分析TCR表达。
本研究中所使用的肽为：HLA-A2-结合性gp100209-217类似物IMDQVPFSV和gp100280-288YLEPGPVTA。
TCR基因的克隆
gp100特异性296TCR基因在逆转录病毒pBullet载体中的克隆如前所述[24]。TCR 296α链的编码序列通过同时用NcoI和XhoI消化从逆转录病毒pBullet载体(由Dr.R.Debets(ErasmusMC，鹿特丹)提供)重克隆(re-clone)至pGEM4Z-5＇UTR-sig-MAGE-A3-DC.LAMP-3＇UTR载体[4](由Dr.K.Thielemans(VUB，布鲁塞尔)提供)中。pGEM4Z-5＇UTR-sig-MAGE-A3-DC.LAMP-3＇UTR载体包含爪蟾(Xenopus laevis)β-球蛋白基因的5＇和3＇非翻译区和多聚腺苷酸尾。在多聚腺苷酸尾的3＇端，存在唯一的NotI和SpeI位点从而使得体外转录之前质粒能够线性化。噬菌体T7启动子使得能够体外产生mRNA。TCR β 296链的编码序列首先通过PCR利用下列引物扩增：
-TCRB296BamHI
5＇-CTC TGG ATC C BamHI AT GGG CCC CCA GCT CCT TGG CTA TG-3＇-HCB
5＇-CTC TCT CGA G XhoI GG ATC GCT AGC CTC TGG AAT CCT TTCTC-3＇
PCR产物用BamHI和XhoI消化并克隆到pGEM4Z-5＇UTR-sig-MAGE-A3-DC.LAMP-3＇UTR载体中，该载体用BglII和XhoI消化。
TCR RNA的体外转录
pGEM4Z-gp100-64A载体通过克隆gp100基因到pGEM4Z-64A载体中[1]和通过定点诱变删除SphI位点(替代的起始密码子)而产生。对于体外转录，pGEM4Z-增强的GFP载体、pGEM4Z-TCRα 296、pGEM4Z-TCRβ 296和pGEM4Z-gp100用SpeI酶线性化，通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀纯化，并用作DNA模板[14]。体外转录用T7RNA聚合酶(mMES SAGE mMACHINE T7 Ultra kit；Ambion)按照生产商的说明进行。体外转录(IVT)的RNA在DNasel(Ambion)消化后在RNeasy柱(Qiagen)上按照生产商的说明回收。RNA质量通过琼脂糖凝胶电泳检验。RNA浓度通过分光光度法测量，且RNA分成小份储存于-80℃。
T淋巴细胞的RNA电穿孔
CD8+T细胞从培养皿收获，并用纯RPMI 1640清洗一次和用没有苯酚红的OptiMEM(Invitrogen Life Technologies)清洗一次(全部在室温下进行)。细胞以8×107/ml的浓度重悬于OptiMEM中。IVT RNA被转移到4mm小池(Peqlab)(150μg/ml终浓度)。加入100-600μl体积的细胞悬液并在用Genepulser Xcell(Bio-Rad)冲击之前孵育3min。冲击条件为方波脉冲，500V，5ms。紧接着电穿孔之后，细胞转移到补充有前面提到的浓度的IL-7和IL-2的MLPC培养基中。
T细胞的低温保藏
低温保藏如下进行：细胞以20-50×106细胞/ml的浓度容纳于20％HSA(Pharmacia & Upjohn)中，并在冰上保存10min。等体积的低温保藏培养基，即55％ HSA(20％)、20％ DMSO(Sigma-Aldrich)和25％葡萄糖(Glucosteril40；Fresenius)，加入到细胞悬液中。然后细胞以-1℃/min的速度在低温冷冻容器(Nalgene)中冷冻到-80℃。解冻通过保持冷冻管在37℃水浴进行，直到见到细胞的脱离。然后将细胞倾入10mlRPMI 1640中，清洗，并加入到包含有20U IL-7/ml的预加温MLPC培养基的培养皿中。细胞在另外的实验之前在37℃培养箱中静置0.5h。
TCR-转染的T淋巴细胞的流式细胞分析
为了用抗TCRVβ mAb进行表面染色，清洗T细胞，随后1×105细胞悬浮于100μl包含0.1％叠氮化钠(Sigma-Aldrich)和0.2％ HSA(Octapharma)的冷FACS溶液(Dulbecco＇sPBS；BioWhittaker)中并与mAb一起孵育30min。然后细胞被清洗并重悬于100μl冷FACS溶液中。染色的细胞用FACStar细胞分析仪(BD Biosciences)分析两色免疫荧光。细胞碎片采用正向门(gate on forward)和侧向光散射从分析中排除。各个样本分析至少104个细胞。结果采用CellQuest软件(BDBiosciences)进行分析。
对于四聚体染色，总共106T细胞重悬于90μl补充有5％混合血清、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠、1％MEM非必需氨基酸(100x)、2mM L-谷氨酰胺和20mg/L庆大霉素的RPMI 1640中。加入500纳克四聚体。采用抗CCR7 FITC和抗CD45RA ECD(phycoerythrin-TexasRed)通过流式细胞仪分析T细胞表型。细胞在37℃5％CO2中孵育20min，然后冷却到4℃。清洗细胞并在CYTOMICS FC500上由Beckman Coulter进行分析。
TCR-转染的T淋巴细胞产生IFN-γ的诱导和测定
用TCR RNA电穿孔的T细胞与负载有不相关肽(gp100/A2209-217类似物IMDQVPFSV)或由TCR识别的肽(gp100/A2280-288YLEPGPVTA)(两者都为10μM)的辐照(0.005J/cm2)T2细胞在37℃共培养1h。15000个T细胞与15000个T2细胞在100μl体积的补充有10％混合血浆(来自健康供体的热灭活和无菌过滤的血浆)、10mM HEPES(Sigma-Aldrich)、1mM丙酮酸钠(Sigma-Aldrich)、1％MEM非必需氨基酸100x(Sigma-Aldrich)、2mM L-谷氨酰胺(Cambrex)、20mg/L庆大霉素(Sigma-Aldrich)和20 IU/ml IL-2的RPMI 1640(Cambrex)中共培养。在16h后收获上清液并利用商购的ELISA试剂盒按照生产商的方法(DPC Biermann)测定IFN-γ的产生。
细胞毒性分析
细胞毒性在标准的4-6h51Cr释放分析中检验。简言之，T2靶细胞用100μCi的Na2 51CrO4/106细胞在37℃/5％CO2条件下标记1h，清洗，在37℃/5％CO2条件下进行1h肽负载，并在与效应T细胞共培养前再次清洗。肽以10μM的浓度进行负载，或者按照指示。作为替代的靶细胞，可以使用gp100RNA-转染的HLA-A2+DC或黑色素瘤细胞株SK-MEL562、Colo829和NEMA。靶细胞以1000细胞/孔的量加入到96孔板中。效应细胞(即TCR转染的T细胞)以60:1、20:1、7:1和3:1的E:T比例加入。细胞溶解百分比，即51Cr释放，按照下式计算：
[(测量的释放量-背景释放量)]/[(最大释放量-背景释放量)]×100％
结果
T细胞被有效地RNA转染
CD8+T细胞的优化的和可重复的转染采用EGFP RNA作为模型通过电穿孔方案的逐步发展而获得。几个供体的CD8+T细胞按照该优化的方案用编码EGFP或TCR的α和β链的RNA进行转染，该TCR源自对HLA-A2-呈递的gp100肽具有特异性的CTL克隆(296CTL clone)。EGFP和TCR链的表达水平通过流式细胞分析确定。大约93％的电穿孔T细胞在电穿孔4h后表达了EGFP(图1)(MFI＝135)，显示了非常高的T细胞转染效率。
低的、但明显的gp100特异性TCR的TCR β链的表达在电穿孔4h(p＝0.0027)和24h(p＝0.0025)后利用抗TCRV β 14 mAb在细胞膜上检测到(图1b)。但是在TCR转染的T细胞被染色时没有观察到HLA-A2/gp100280-288四聚体的结合(数据未显示)，即使在相同条件下EGFP RNA的转染效率为>90％(图1a和b)。虽然如此，非激活的TCR-RNA-电穿孔CD8+T细胞在IFNγ释放和细胞毒性分析两方面是有功能的。未检测到四聚体的结合可能是由于我们的TCR-RNA-电穿孔T细胞上的低受体密度，因为四聚体需要同时被几个TCR结合以牢固地粘附到T细胞膜上。如果TCR分子隔得太远，仅可能产生四聚体的单价结合，这导致低的亲和力[17]。尽管如此，瞬时转染的T细胞中的TCR表达足以启动它们以溶解靶细胞和产生IFNγ。
模拟(mock)转染T细胞不显示任何EGFP表达，仅有TCRβ链的内源性表达(图1a和b)。另外，非电穿孔、模拟电穿孔和TCR RNA-电穿孔T细胞的T细胞表型通过对CCR7和CD45RA的FACS染色确定。如图1c中所示，与非电穿孔的T细胞相比，电穿孔对大量电穿孔的T细胞的表型没有影响。
抗原阳性靶细胞特异性刺激TCR转染的T细胞以产生IFNγ
虽然测得的TCR表达是低的，用TCR RNA转染的CD8+T细胞在电穿孔后4h、24h和48h测试其应答负载有gp100280-288肽的靶细胞的细胞因子产生能力。如图2中所示，仅用编码gp100/A2特异性TCR的RNA转染的T细胞通过IFNγ产生对负载有gp100280-288肽的T2细胞作出应答，而用EGFP RNA电穿孔的T细胞不能产生IFNγ。另外，负载有对照肽(即gp100209-217类似物)的T2细胞不能通过RNA转染的T细胞诱导产生IFNγ(图2)。即使在电穿孔后48h，用编码gp100/A2特异性TCR的RNA转染的T细胞仍存在明显的特异性IFNγ产生(图2)。接下来，我们检测是否TCR转染的T细胞可以低温保藏而不丧失IFNγ产生能力。图3a显示，在用编码gp100/A2特异性TCR的RNA转染后4h冷冻的T细胞在解冻后用gp100280-288肽负载的T2细胞直接刺激时仍产生IFNγ。此外，TCR转染的T细胞的IFNγ产生在与RNA电穿孔DC一起孵育后测定。仅用gp100 RNA电穿孔的DC，而不是被电穿孔的模拟电穿孔DC，能够刺激TCR转染的T细胞产生IFNγ(图3b)。
负载肽的靶和黑色素瘤细胞被TCR转染的T细胞特异性地溶解
用TCR RNA转染的CD8+T细胞在电穿孔后24h、48h和72h在负载gp100280-288肽的靶细胞上测试其细胞溶解能力。如图4a中所示(在48h时间点的代表性图)，仅负载gp100280-288肽的T2细胞被TCRRNA转染的T细胞溶解。负载对照肽的T2细胞不被溶解，且用EGFPRNA转染的T细胞不溶解任何靶细胞(图4a)。RNA转染的T细胞的细胞溶解的时间过程被显示(图4b)。如按照细胞毒性时间过程测量的，在所有的靶细胞：效应细胞比例下T细胞在电穿孔3天后仍具有非常高的细胞溶解能力。在1:20的靶细胞：效应细胞比例下负载gp100280-288肽的T2细胞的特异性溶解在所有时间点观察到(图4b)。在所有其它的经测量的靶细胞：效应细胞比例下，观察到特异性溶解(数据未显示)。另外，在最高的靶细胞：效应细胞比例(即1:60)下，在T细胞电穿孔一周后仍观察到特异性细胞溶解。靶细胞的特异性溶解稳定数天的事实对于TCR转染的CD8+T细胞在癌症的免疫治疗中是极其重要的。在IFNγ分泌和细胞毒性分析中利用PHA/IL-2/IL-7-刺激的T细胞获得了相似的结果，其中T细胞在刺激3天后对CD8进行磁性选择，然后进行RNA电穿孔。PHA/IL-2/IL-7刺激导致T细胞增殖并可用于产生大量的癌症免疫治疗的TCR RNA电穿孔的T细胞。
此外，TCR RNA电穿孔的T细胞的细胞溶解能力在低温保藏后得到保持，且在电穿孔前进行PHA-刺激和扩增的T细胞能够在对负载肽的靶细胞应答时产生IFNγ，也溶解这些细胞(数据未显示)。TCRRNA电穿孔的T细胞在低温保藏后的细胞溶解能力的稳定性使其有可能为了对一个病人重复施用而在单个过程中(或由单次白细胞去除)产生多剂量的T疫苗。
重要的是，TCR RNA电穿孔的T细胞(电穿孔后4h)还能够特异性识别和溶解表型为gp100+和HLA-A2+的肿瘤细胞(图5，SK-MEL526)。为gp100-但HLA-A2+的肿瘤细胞株(NEMA)或gp100+但HLA-A2-的肿瘤细胞株(Colo829)未被TCR RNA电穿孔的T细胞识别(图5)。EGFP RNA电穿孔的T细胞不溶解任何靶细胞(图5)。
TCR RNA转染的T细胞的细胞溶解效率类似于逆转录病毒转导T细胞且接近于亲本CTL克隆
从以前公开的工作中，我们已知亲本296CTL克隆的细胞溶解效率在逆转录病毒转导TCR基因到T细胞中后得到保持[24]。为测试TCR RNA转染的T细胞的亲和力，我们进行了细胞毒性分析(电穿孔后24h)，其中在T2靶细胞上滴定gp100280-288肽(图6)。对应于TCRRNA转染的T细胞的最大溶解的50％的肽浓度(即ED50)在三个独立的实验中在300-1000pM之间变化(图6)。这在逆转录病毒转导的T细胞的细胞溶解效率的同一范围(ED50＝300pM)内。两者都接近于亲本296CTL克隆的细胞溶解效率，其具有50pM的ED50[24]。EGFPRNA转染的T细胞不溶解负载gp100280-288肽的T2细胞(10μM)(图6)，且不负载肽的T2细胞不被TCR RNA转染的T细胞溶解(数据未显示)。合起来看，TCR RNA转染的T细胞以类似于逆转录病毒转导的T细胞的高亲和力溶解靶细胞。高细胞溶解效率使得TCR RNA转染的CD8+T细胞成为过继转移扩增肿瘤特异性CTL(TIL)克隆的一种可行的替代。
这里的结果表明，用编码TCRα和β链的RNA电穿孔的源自HLA-A2/gp100280-288特异性CTL克隆的CD8+T细胞获得了细胞溶解效应子功能。这些TCR转染的T细胞的功能性按几条线进行测试：1)电穿孔后4h、24h和48h应答负载肽靶细胞刺激的特异性IFNγ产生(图2)，2)低温保藏后(即解冻后0h、24h和48h)应答负载肽靶细胞刺激的特异性IFNγ产生(图3a)，3)应答于gp100-RNA-电穿孔树突细胞刺激的特异性IFNγ产生(图3b)，4)电穿孔后24h、48h、72h(图4)和一周(数据未显示)负载肽的靶细胞的特异性细胞溶解，5)HLA-A2+/gp100+黑色素瘤细胞株的特异性细胞溶解(图5)，和6)利用负载肽的靶细胞的细胞溶解效率(图6)。这是首次对通过TCR编码RNA转染T细胞转移细胞溶解功能的描述。
用编码TCR的RNA对CD4+T细胞进行电穿孔获得了该TCR的特异性
所描述实验的目的是显示用编码TCR的RNA电穿孔的CD4T细胞获得了该TCR的特异性。CD4+T细胞用编码两种不同TCR之一的RNA进行电穿孔。如上所述，第一TCR是对源自睾丸癌抗原Mage3(M3-DP4)的MHC-II类DP4限制性肽特异性的，克隆自CD4+T细胞克隆。第二TCR是对源自黑色素瘤抗原gp100(gp100-A2)的MHC-I类A2限制性肽特异性的，克隆自CD8+T细胞克隆。对于第一TCR，自体的成熟DC用作靶细胞，而对于第二TCR，T2细胞用作靶细胞。两种靶细胞负载有相应的肽。M3-DP4 TCR转染的T细胞特异性地产生IFN-γ、TNF和IL-2、一些IL-4和少量的IL-10。gp100TCR转染的T细胞产生大量的IFN-γ、TNF和IL-2，但也有一些IL-4和IL-10，这表明，用编码TCR的RNA对纯化的CD4 T细胞进行电穿孔产生了特异性识别TCR的靶的T细胞。这使得T细胞操作在治疗和研究中能够有效和方便地实施。
作为读出装置，选择了BD的流式细胞微球阵列(Cytometric BeadArray，CBA)，其使得能够一次测量6种不同的细胞因子(图7)。我们选择了IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF和IFN-γ。实验中使用了两种不同的TCR：第一，MHC-II类DP4限制性肽特异性的TCR，源自睾丸癌抗原Mage3(M3-DP4)，其克隆自CD4+T细胞克隆。第二，对源自黑色素瘤抗原gp100(gp100-A2)的MHC-I类A2限制性肽具有特异性的高亲和力的TCR，其由CD8+T细胞克隆产生并已成功用于CD8+细胞中。
另外，由相同的方法制备的第三批T细胞是用EGFP转染，用于确定转染效率并作为细胞因子释放的阴性对照。作为M3-DP4 TCR电穿孔T细胞的靶细胞，使用自体的成熟(鸡尾酒)DC，而T2细胞用于gp100-A2。效应细胞和靶细胞被共培养，且在20h和44h后提取上清样本并测试细胞因子含量。在20h时间点，没有制出标准曲线，因为这是我们完成的第一个CD4+实验，且我们仅想要看看是否会发生一些事情。在44h小时时间点，制出了标准曲线。但是，某些细胞因子如此高效地产出，以致它们超出了曲线的范围。
转染效率通过电穿孔GFP-RNA并在24h后进行FACS分析进行测定(图8)。转染效率为86％，且平均荧光度为127。由细胞的FSC SSC判断，存活率也非常高，95％在命门中。
用Mage3 DP4特异性TCR电穿孔的CD4+T细胞与负载相应的Mage3 DP4肽的自体成熟DC一起共培养。作为对照，使用了未负载的相同的DC。另外，用EGFP转染的CD4+T细胞用作阴性对照。在20h和44h后提取样本并通过CBM进行分析。对于20h时间点未制出标准曲线，所以提供的数据仅是半定量的，因为它们仅是细胞因子结合的微球的MFI值。尽管如此，数据非常清楚地显示TCR-RNA电穿孔的CD4+细胞特异性地识别其靶细胞，但不识别对照靶细胞，而对照效应细胞什么也不识别(图9)。CD4+细胞产生大量的IFNγ、TNF和IL-2，但也有一些IL-4(注意刻度是对数的)。值得注意的是，DC本身分泌一些IL-6。这不是T细胞的非特异性反应，因为没有T细胞的DC有同样的现象(未显示)。
在44h后从上清提取另一样本并再次通过CBI进行分析。这一时间制出了标准曲线以得到理想的绝对数值。上清液这次按1:2稀释。因为IFNγ在最高标准值以上，MFI也被显示(图10)。数据表明，仍可以观察到特异性的反应，但是数值不如20h后的好。可能出现某些非特异性反应而导致特异性IL-2释放的丧失，且某些细胞因子可能也开始退化。
用gp100特异性TCR电穿孔的CD4+T细胞与T2细胞(表达HLAA2但不呈递或呈递很少的内源性肽且可以用内源性肽高效地负载的细胞株)共培养。这些细胞用gp100-A2肽负载。作为对照，使用没有肽的T2细胞。另外，用EGFP转染的CD4+T细胞用作额外的阴性对照。在20h和44h后提取样本并通过CBM进行分析。20h时间点的数据也仅是半定量的。尽管如此，数据非常清楚地显示TCR-RNA电穿孔的CD4+细胞特异性地识别其靶细胞，但不识别对照靶细胞，而对照效应细胞同样什么也不识别(图11)。CD4+细胞产生比M3-DP4TCR更大量的IFNγ、TNF和IL-2，但也有一些IL-4和IL-10(注意刻度是对数的)。
在44h后从上清提取另一样本并再次通过CBI进行分析。这一时间制出了标准曲线以得到绝对数值的概念。上清液这次也按1:2稀释。因为在其特异性靶细胞上对于gp100-A2 TCR转染的CD4+细胞IFNγ和IL-2在最高标准值以上，MFI也被显示(图12)。数据表明，仍可以观察到强的和清楚的特异性反应，其与20h时间点没有实质不同。没有非特异性反应发生，可能是因为T2细胞不表达共刺激分子。
总之，这些数据第一次表明，纯化的CD4+T细胞可以高效地进行RNA电穿孔，和更重要的是，HLAI类和II类限制性TCR可以使用RNA电穿孔的方法在这些细胞中功能性表达。这揭示了有助于在免疫治疗以及研究和开发中提供和操作T细胞的新的可能性。
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序列表
TCRα链
Figure A200680051094D00511
Figure A200680051094D00521
TCRβ链
Figure A200680051094D00522
Figure A200680051094D00531
序列表
<110>ARGOS THERAPEUTICS，INC.
     SCHULER，Gerold
<120>产生抗原特异性效应T细胞的方法
<160>10
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>844
<212>DNA
<213>人
<400>1
Figure A200680051094Q00541
<210>2
<211>280
<212>PRT
<213>人
<400>2
Figure A200680051094Q00542
Figure A200680051094Q00551
<210>3
<211>949
<212>DNA
<213>人
<400>3
Figure A200680051094Q00552
<210>4
<211>315
<212>PRT
<213>人
<400>4
Figure A200680051094Q00562
Figure A200680051094Q00571
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>5
Figure A200680051094Q00572
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>6
Figure A200680051094Q00573
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>7
Figure A200680051094Q00574
<210>8
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>8
Figure A200680051094Q00575
<210>9
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>9
Figure A200680051094Q00581
<210>10
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>10
Figure A200680051094Q00582

Claims (20)

1、一种组合物，其包含用编码抗原特异性T细胞受体(TCR)的RNA瞬时转染的效应T细胞，其中该T细胞表现出对以MHC分子复合体形式呈递该抗原的细胞特异性的效应子功能。
2、如权利要求1所述的组合物，其中所述抗原是肿瘤抗原、病原体抗原或自体抗原。
3、如权利要求2所述的组合物，其中
(i)所述抗原是肿瘤抗原，优选所述肿瘤为肾细胞癌、黑色素瘤、慢性淋巴细胞性白血病、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌或结肠癌，和/或所述抗原是MART-1、MAGE-1、MAGE-3 gp75、MDM2、酪氨酸酶、端粒末端转移酶、gp100、生存蛋白、α-1甲胎蛋白、G250或NY-ESO-1；
(ii)所述抗原是病原体抗原，优选所述病原体为HIV或HCV。
4、如权利要求1所述的组合物，其中
(i)所述效应子功能为选自IL-2分泌、INF α分泌、TNF β分泌、干扰素-γ(INF γ)分泌、细胞毒性和调节性效应子功能；或者
(ii)所述T细胞为CD8+，优选所述TCR为MHC-I类限制的，或所述TCR为MHC-II类限制的，或者所述效应子功能为细胞毒性；或者
(iii)所述T细胞为CD4+，优选所述TCR为MHC-I类限制的，或所述TCR为MHC-II类限制的，或者所述效应子功能为巨噬细胞的激活和/或B细胞的激活，或者所述T细胞被编码FoxP3的RNA瞬时转染；或者
(iv)所述T细胞在电穿孔后低温保藏。
5、如权利要求4所述的组合物，其中所述CD4+T细胞为
(i)调节性T细胞(Treg)，优选所述效应子功能为调节性效应子功能，最优选所述调节性功能为IL-10分泌和/或TGF-β分泌，或所述Treg为CD4+CD25+，或者所述T细胞为FoxP3，或者所述TCR是对自体抗原特异性的；或者
(ii)TH1细胞；
(iii)TH2细胞。
6、权利要求1-5中任一项所述的组合物在制备免疫治疗药物中的用途。
7、赋予T细胞新的抗原特异性的方法，包括用编码抗原特异性TCR受体的RNA对包含纯化的CD8+或纯化的CD4+T细胞的组合物进行电穿孔。
8、如权利要求7所述的方法，其中
(i)所述T细胞通过磁分选进行纯化；或者
(ii)所述纯化的T细胞占存在于组合物中的所有T细胞的至少75％，优选占存在于组合物中的所有T细胞的至少90％；或者
(iii)所述纯化的T细胞在电穿孔之前未使用植物血凝素(PHA)或OKT3进行体外刺激；或者
(iv)所述纯化的T细胞在电穿孔之前被刺激增殖，优选纯化的T细胞使用PHA或OKT3进行刺激；或者
(v)所述T细胞通过与调节性T细胞分离进行纯化；或者
(vi)所述T细胞利用方波脉冲以100V/mm-150V/mm的场强进行2-10ms的电穿孔。
9、赋予T细胞新的抗原特异性的方法，包括用编码抗原特异性TCR的RNA对静息T细胞进行电穿孔。
10、如权利要求9所述的方法，其中
(i)所述静息T细胞是纯化的CD8+T细胞，或者是纯化的CD4+T细胞；或者
(ii)所述细胞是通过磁珠细胞分选纯化的；或者
(iii)所述T细胞利用方波脉冲以100V/mm-150V/mm的场强进行2-10ms的电穿孔。
11、瞬时转染T细胞的方法，包括利用方波脉冲在100V/mm-150V/mm的场强下用RNA对T细胞进行2-10ms的电穿孔，其中所述T细胞在电穿孔之前未使用PHA或OKT3进行体外刺激。
12、如权利要求11所述的方法，其中
(i)所述T细胞为纯化的CD8+T细胞；或者
(ii)所述T细胞为纯化的CD4+T细胞，优选所述T细胞为纯化的调节性T细胞；或者
(iii)所述RNA编码FoxP3。
13、通过权利要求9-12中任一项所述的方法制备的T细胞。
14、权利要求13所述的T细胞在制备免疫治疗药物中的用途。
15、向受试者提供抗原特异性T细胞效应子功能的方法，包括施用用编码抗原特异性TCR的RNA瞬时转染的T细胞，其中所述T细胞表现出对以MHC分子复合体的形式呈递该抗原的细胞的效应子功能。
16、如权利要求15所述的方法，其中
(i)所述效应子功能是细胞毒性；或者
(ii)所述抗原是肿瘤特异性的，优选施用是通过瘤内注射进行；或者
(iii)所述抗原是病原体特异性的；或者
(iv)所述T细胞是受试者自体的。
17、产生Treg细胞的方法，包括用编码FoxP3的核酸转染CD4+T细胞。
18、如权利要求17所述的方法，其中所述核酸为mRNA。
19、包含编码FoxP3的外源RNA和/或通过权利要求17或18的方法制备的Treg细胞。
20、权利要求19所述的Treg细胞在制备免疫治疗药物中的用途。
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