CN112941030B - 一种抗原特异性Treg及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于生物技术领域，提供了一种抗原特异性Treg的制备方法和应用，该制备方法包括以下步骤：制备受体tolDC；制备含有供体MHC‑I分子mRNA的全部CDS区序列的带有T7启动子的质粒，然后应用体外转录技术制备供体MHC‑I分子的ivt‑mRNA；将ivt‑mRNA转染至上述受体tolDC中，获得表达递呈供体MHC‑I分子抗原的受体tolDC；将表达递呈供体MHC‑I分子抗原的受体tolDC，与受体nTreg细胞在含有IL‑2的条件下进行共培养，以获得供体MHC‑I分子抗原特异性Treg。该制备方法可制备得到具有恰当TCR‑MHC抗原复合体亲和力的供体MHC‑I抗原特异性的受体Treg细胞。

Description

一种抗原特异性Treg及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种抗原特异性Treg及其制备方法和应用。
背景技术
随着器官保存方法的完善，外科技术的发展以及免疫抑制药物的不断研发，器官移植已成为救治终末期器官衰竭患者的有效手段。然而，在同种异体器官移植中，受体与供体主要组织相容性复合物I（MHC-I）的不匹配会引起免疫排斥反应，导致移植器官功能受损，甚至衰竭。虽然免疫抑制药物的使用可以降低急性排斥反应的发生率，但其并不能有效防止慢性排斥反应的发生与发展，由此所致的移植器官功能损伤大大缩短了移植器官的存活时间，且长期服用免疫抑制药物会增加患者感染及罹患癌症的风险，并导致肝肾损伤与心血管疾病。移植免疫耐受是指受体免疫系统对移植物的特异性无应答，但对其它抗原保持正常的免疫应答。诱导器官移植免疫耐受，不但可以规避长期使用免疫抑制药物引起的副作用，还能防止器官移植后的免疫排斥反应，大大延长移植物的存活时间。因此，开发安全有效的新型器官移植免疫耐受诱导方法，诱导受体建立针对移植物的特异性免疫耐受，具有重要的研究和临床实用意义。
调节性T细胞（Treg）是一类具有免疫抑制功能的T细胞亚群。应用Treg过继治疗诱导移植后免疫耐受或者辅助免疫抑制药物减量在临床评估中已经取得了重要进展。然而，临床评估中常用的Treg多为体外扩增的非特异性多克隆天然型Treg（nTreg），其所需细胞数量巨大，且制备成本高昂。同时，将大量多克隆nTreg回输到受者体内后，其倾向于在短时间内大量迁移至外周循环，具有引起患者全身性免疫抑制的风险，甚至诱发病毒感染或恶性肿瘤。与多克隆nTreg相比，应用抗原特异性Treg诱导免疫耐受所需细胞数量更少，效率更高，且其在过继回输后更倾向于驻留在靶器官内诱导抗原特异性免疫抑制，不易引起全身性免疫抑制，具有更高的安全性。因此，应用抗原特异性Treg诱导器官移植免疫耐受具有更大的临床应用潜力。
抗原特异性Treg在诱导移植免疫耐受中具有巨大潜力，其制备方法的开发已成为移植免疫领域研究的热点。目前，体外制备抗原特异性Treg的方法主要有以下几种：
(1) 利用基因工程方法体外改造受体nTreg，使其携带能够特异性识别供体抗原的嵌合抗原受体（CAR），从而通过“抗原-抗原受体识别”赋予CAR-Treg诱导供体器官免疫耐受的功能。CAR-Treg对于供体抗原具有较高的亲和力，可诱导高效免疫耐受。然而，这种高亲和力可能会导致细胞耗竭，影响其高效抑制功能的发挥。同时，由于CAR-Treg表面修饰有外源性抗体片段，机体可产生针对CAR的抗体，导致其在体内被迅速清除。此外，CAR-Treg是否会引起“细胞因子风暴”等副作用还有待进一步研究确认。
(2) 将供体抗原递呈细胞（APC）与受体Treg前体细胞共培养制备供体抗原特异性Treg。这种方法制备的抗原特异性Treg具有较低的免疫原性以及恰当的T细胞抗原受体（TCR）-MHC抗原复合体亲和力，可在体内长期存活并发挥功能。然而，供体APC通过直接抗原递呈模式诱导的抗原特异性Treg只能调节急性排斥反应，对慢性排斥反应没有显著调节作用，无法诱导长期免疫耐受。
(3) 将供体抗原、受体APC和Treg前体细胞在含正向免疫共刺激分子拮抗剂和/或抗炎性细胞因子的条件下共培养，制备抗原特异性Treg。相比于以上两种方法，这种受体APC通过间接抗原递呈模式诱导的抗原特异性Treg，同样具有较低的免疫原性以及恰当的TCR-MHC抗原复合体亲和力，同时可以有效调节急性与慢性免疫排斥反应，诱导长期免疫耐受。然而，该制备方法多是将经辐射后的供体淋巴细胞作为抗原，其中同种异体抗原种类多，而引起排斥反应的主要抗原的数量有限，相比大量的单一抗原，其诱导生成具有高效免疫耐受诱导功能的抗原特异性Treg的效率较低。因此，很多研究者倾向于使用基因工程方法制备的供体MHC-I抗原肽，即引起同种异体器官移植免疫排斥反应的主要抗原，代替供体淋巴细胞，制备具有高效免疫耐受诱导功能的供体MHC-I抗原特异性Treg。然而，基因工程抗原肽的制备过程复杂，周期长，产量低，生产成本较高，并不适用于大规模临床应用。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种抗原特异性Treg的制备方法，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种抗原特异性Treg的制备方法，其包括以下步骤：
以受体外周血中的单核细胞为前体细胞，制备受体tolDC；
以供体外周血单个核细胞的全RNA为模板，利用RT-PCR技术与质粒连接、转化技术制备含有供体MHC-I分子mRNA的全部CDS区序列的带有T7启动子的质粒，然后应用体外转录技术制备供体MHC-I分子的ivt-mRNA；
将ivt-mRNA转染至上述受体tolDC中，获得表达递呈供体MHC-I分子抗原的受体tolDC；
将上述表达递呈供体MHC-I分子抗原的受体tolDC，与受体nTreg细胞在含有IL-2的条件下进行共培养，以获得供体MHC-I分子抗原特异性Treg。
作为本发明实施例的一种优选方案，所述以受体外周血中的单核细胞为前体细胞，制备受体tolDC的步骤，具体包括：
取受体外周血中的单核细胞进行培养后，移除培养基，去掉未贴壁细胞或分选出单核细胞，加入含有GM-CSF与IL-4的新鲜培养基中进行培养，得到第一培养上清；
向第一培养上清中加入TGF-β1与IL-10进行培养，得到第二培养上清；
向第二培养上清中加入tolDC细胞因子鸡尾酒进行培养，诱导tolDC成熟，得到受体tolDC。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述新鲜培养基中GM-CSF的浓度为80~120ng/mL，IL-4的浓度为15~25ng/mL。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述第一培养上清中加入的TGF-β1的浓度为0.5~1.5ng/mL，加入的IL-10的浓度为15~25ng/mL。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述tolDC细胞因子鸡尾酒包括以下按照质量浓度计的组分：GM-CSF 80~120ng/mL、IL-4 15~25ng/mL、TGF-β1 0.5~1.5ng/mL、IL-1015~25ng/mL、IL-1β 8~12ng/mL、TNF-α 8~12ng/mL、PGE2230~270ng/mL、IL-6 10~20ng/mL。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述以供体外周血单个核细胞的全RNA为模板，利用RT-PCR技术与质粒连接、转化技术制备含有供体MHC-I分子mRNA的全部CDS区序列的带有T7启动子的质粒，然后应用体外转录技术制备供体MHC-I分子的ivt-mRNA的步骤，具体包括：
提取供体外周血单个核细胞的全RNA，应用供体MHC-I分子抗原cDNA的编码区特异性引物对供体MHC-I分子抗原cDNA的编码区进行RT-PCR扩增，得到PCR产物；
将所得PCR产物连接到带有T7启动子的质粒上，通过连接、转化技术将质粒导入大肠杆菌感受态细胞中进行培养后，再提取质粒，利用限制性内切酶通将质粒线性化，获得供体MHC-I分子ivt-mRNA制备模板；
将供体MHC-I分子 ivt-mRNA制备模板，转录成具有5’端帽子结构和3’端polyA结构的供体MHC-I分子 ivt-mRNA，纯化收集所得产物。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述供体MHC-I分子抗原cDNA的编码区特异性引物包括核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1~2所示的上、下游引物。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述步骤中，共培养的条件中，IL-2的浓度为200~1000U/mL。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述制备方法制得的抗原特异性Treg。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的抗原特异性Treg在制备用于诱导移植免疫耐受的药物中的应用。
在本发明中，Treg细胞是具有免疫抑制功能的T细胞亚群，具有诱导移植后免疫耐受的功能。tolDC是一群具有诱导Treg生成功能的DC。抗原特异性是指只对某种特定的抗原产生的免疫反应，而对其它抗原无反应。免疫耐受是指针对某种抗原的免疫应答反应降低甚至无应答状态。T细胞产生的免疫反应类型为抗原特异性免疫应答，由其所携带的TCR的抗原特异性决定。体外制备抗原肽技术涉及到质粒构建、蛋白表达、蛋白纯化等技术，对硬件要求极高，对技术人员的技术水平要求极高，因此技术门槛也相对较高。相比之下，体外制备抗原的ivtRNA相对简单易行，对硬件要求低，并且通过简单的RT-PCR扩增可以获得大量模板，因此具有省钱、省时、技术门槛低等优点，适合临床转化。
本发明实施例提供的一种抗原特异性Treg的制备方法，通过独创的细胞因子鸡尾酒方法快速制备受体tolDC，并将制备的供体MHC-I 分子的ivt-mRNA转染至上述tolDC，使其在tolDC中表达并递呈，进而用该tolDC诱导产生供体MHC-I分子抗原特异性Treg；该制备方法可制备得到具有恰当TCR-MHC抗原复合体亲和力的供体MHC-I抗原特异性的受体Treg细胞，其具有过程简单、周期短、抗原可再生、生成成本低的优点。
综上，本发明相比于现有技术具有以下优点：
1. 应用本方法制备的供体MHC-I抗原特异性Treg的制备时间比传统制备该种细胞的时间短。
2. 应用本方法制备的供体MHC-I抗原特异性Treg的操作简单，无需制备MHC-I抗原肽，节约大量的人力成本与制备成本。
3. 应用本方法制备的供体MHC-I抗原特异性Treg具有恰当的TCR-MHC复合物亲和力，不易引起过强的免疫抑制效果以及细胞因子风暴。
4. 应用本方法制备的供体MHC-I抗原特异性Treg具有诱导长期免疫耐受的功能。
5. 应用本方法制备供体MHC-I抗原特异性Treg，原料取材简单易得，只需要供体、受体的术前外周血。
附图说明
图1为tolDC与non-tolDC的细胞表型鉴定图。
图2为tolDC与non-tolDC的细胞因子分泌情况图。
图3~4为受体DC加载供体MHC-I抗原扩增Treg的抗原特异性抑制功能检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种抗原特异性Treg的制备方法，其包括以下步骤：
S1、第0天，取受体外周血中的单核细胞，37℃培养1h，移除培养基，去掉未贴壁细胞或借助磁珠分选与流式细胞分选等技术分选出单核细胞，加入含有浓度为100ng/mL的GM-CSF与浓度为20ng/mL的IL-4的新鲜培养基中进行培养24h，得到第一培养上清；
第1天，向上述第一培养上清中加入1ng/mL的TGF-β1与20ng/mL的IL-10进行培养24h，得到第二培养上清；
第2天，向第二培养上清中加入tolDC细胞因子鸡尾酒进行培养24h，诱导tolDC成熟，得到受体tolDC。其中，tolDC细胞因子鸡尾酒包括以下组分：GM-CSF 100ng/mL、IL-420ng/mL、TGF-β1 1ng/mL、IL-10 20ng/mL、IL-1β 10ng/mL、TNF-α 10ng/mL、PGE2250ng/mL、IL-6 15ng/mL。
S2、提取供体外周血单个核细胞的全RNA，应用HLA-A抗原cDNA的编码区特异性引物对供体HLA-A抗原cDNA的编码区进行PCR扩增，得到PCR产物；其中，HLA-A抗原cDNA的编码区特异性引物包括核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1~2所示的上、下游引物，具体为：5’-atggccgtcatggcgccc和3’-tcacactttacaagctgtgagagacacatcag；
接着，将所得PCR产物连接到带有T7启动子的pGEM质粒上，通过连接、转化技术将质粒导入大肠杆菌感受态细胞中进行培养10h后，再提取质粒，利用SpeI限制性内切酶通将质粒线性化，获得供体HLA-A ivt-mRNA制备模板；
然后，应用mMESSAGE mMachine T7 Ultra Kit将供体HLA-A ivt-mRNA制备模板转录成具有5’端帽子结构和3’端polyA结构的供体HLA-A ivt-mRNA，纯化收集所得产物。
S3、应用Lipofectamine™ MessengerMAX™ Reagent将1μg的供体HLA-A ivt-mRNA转染至受体tolDC（2×105个）中，培养12h后，得到表达递呈供体HLA-A抗原的受体tolDC，用于后续实验。
S4、取受体外周血单个核细胞，借助免疫磁珠法或流式细胞分选仪分选CD4+CD25+CD127-/low细胞（受体nTreg细胞），然后将上述表达递呈供体HLA-A抗原的受体tolDC与受体nTreg细胞在含有浓度为500U/mL的IL-2的条件下进行共培养21天，以获得供体HLA-A分子抗原特异性Treg。
实施例2
该实施例提供了一种抗原特异性Treg的制备方法，其包括以下步骤：
S1、第0天，取受体外周血中的单核细胞，37℃培养1h，移除培养基，去掉未贴壁细胞或借助磁珠分选与流式细胞分选等技术分选出单核细胞，加入含有浓度为80ng/mL的GM-CSF与浓度为15ng/mL的IL-4的新鲜培养基中进行培养24h，得到第一培养上清；
第1天，向上述第一培养上清中加入0.5ng/mL的TGF-β1与15ng/mL的IL-10进行培养24h，得到第二培养上清；
第2天，向第二培养上清中加入tolDC细胞因子鸡尾酒进行培养24h，诱导tolDC成熟，得到受体tolDC。其中，tolDC细胞因子鸡尾酒包括以下组分：GM-CSF 80ng/mL、IL-415ng/mL、TGF-β1 0.5ng/mL、IL-10 15ng/mL、IL-1β 8ng/mL、TNF-α 8ng/mL、PGE2230ng/mL、IL-6 10ng/mL。
S2、提取供体外周血单个核细胞的全RNA，应用HLA-A抗原cDNA的编码区特异性引物对供体HLA-A抗原cDNA的编码区进行PCR扩增，得到PCR产物；其中，HLA-A抗原cDNA的编码区特异性引物包括核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1~2所示的上、下游引物，具体为：5’-atggccgtcatggcgccc和3’-tcacactttacaagctgtgagagacacatcag；
接着，将所得PCR产物连接到带有T7启动子的pGEM质粒上，通过连接、转化技术将质粒导入大肠杆菌感受态细胞中进行培养10h后，再提取质粒，利用SpeI限制性内切酶通将质粒线性化，获得供体HLA-A ivt-mRNA制备模板；
然后，应用mMESSAGE mMachine T7 Ultra Kit将供体HLA-A ivt-mRNA制备模板转录成具有5’端帽子结构和3’端polyA结构的供体HLA-A ivt-mRNA，纯化收集所得产物。
S3、应用Lipofectamine™ MessengerMAX™ Reagent将1μg的供体HLA-A ivt-mRNA转染至受体tolDC（2×105个）中，培养12h后，得到表达递呈供体HLA-A抗原的受体tolDC，用于后续实验。
S4、取受体外周血单个核细胞，借助免疫磁珠法或流式细胞分选仪分选CD4+CD25+CD127-/low细胞（受体nTreg细胞），然后将上述表达递呈供体HLA-A抗原的受体tolDC与受体nTreg细胞在含有浓度为200U/mL的IL-2的条件下进行共培养21天，以获得供体HLA-A分子抗原特异性Treg。
实施例3
该实施例提供了一种抗原特异性Treg的制备方法，其包括以下步骤：
S1、第0天，取受体外周血中的单核细胞，37℃培养1h，移除培养基，去掉未贴壁细胞或借助磁珠分选与流式细胞分选等技术分选出单核细胞，加入含有浓度为120ng/mL的GM-CSF与浓度为25ng/mL的IL-4的新鲜培养基中进行培养24h，得到第一培养上清；
第1天，向上述第一培养上清中加入1.5ng/mL的TGF-β1与25ng/mL的IL-10进行培养24h，得到第二培养上清；
第2天，向第二培养上清中加入tolDC细胞因子鸡尾酒进行培养24h，诱导tolDC成熟，得到受体tolDC。其中，tolDC细胞因子鸡尾酒包括以下组分：GM-CSF 120ng/mL、IL-425ng/mL、TGF-β1 1.5ng/mL、IL-10 25ng/mL、IL-1β 12ng/mL、TNF-α 12ng/mL、PGE2270ng/mL、IL-6 20ng/mL。
S2、提取供体外周血单个核细胞的全RNA，应用供体HLA-A抗原cDNA的编码区特异性引物对HLA-A抗原cDNA的编码区进行PCR扩增，得到PCR产物；其中，HLA-A抗原cDNA的编码区特异性引物包括核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1~2所示的上、下游引物，具体为：5’-atggccgtcatggcgccc和3’-tcacactttacaagctgtgagagacacatcag；
接着，将所得PCR产物连接到带有T7启动子的pGEM质粒上，通过连接、转化技术将质粒导入大肠杆菌感受态细胞中进行培养10h后，再提取质粒，利用SpeI限制性内切酶通将质粒线性化，获得供体HLA-A ivt-mRNA制备模板；
然后，应用mMESSAGE mMachine T7 Ultra Kit将供体HLA-A ivt-mRNA制备模板转录成具有5’端帽子结构和3’端polyA结构的供体HLA-A ivt-mRNA，纯化收集所得产物。
S3、应用Lipofectamine™ MessengerMAX™ Reagent将1μg的供体HLA-A ivt-mRNA转染至受体tolDC（2×105个）中，培养12h后，得到表达递呈HLA-A抗原的受体tolDC，用于后续实验。
S4、取受体外周血单个核细胞，借助免疫磁珠法或流式细胞分选仪分选CD4+CD25+CD127-/low细胞（受体nTreg细胞），然后将上述表达递呈供体HLA-A抗原的受体tolDC与受体nTreg细胞在含有浓度为1000U/mL的IL-2的条件下进行共培养21天，以获得供体MHC-I分子抗原特异性Treg。
实施例4
利用实施例1提供的3天tolDC制备方法，制备受体tolDC。为表征tolDC的免疫抑制表型，同时制备了受体non-tolDC作为对照。如图1所示，与non-tolDC相比，该tolDC呈半成熟细胞表型：低表达MHC-II与CD83，低表达正向免疫共刺激分子CD40、CD80、CD86，高表达负向免疫共刺激分子PD-L1、PD-L2，与non-tolDC表达相当水平的CD11c与CCR7。收集两者的培养上清，以无细胞培养上清为对照，用ELISA方法检测其中IL-10，TGF-β以及IL-12p70的水平。如图2所示，结果表明，与non-tolDC相比，该tolDC分泌大量的IL-10（a）与TGF-β（b），不分泌IL-12p70（c）。
实施例5
提取供体外周血单个核细胞全RNA，利用RT-PCR技术，利用引物5’:atggccgtcatggcgccc，3’: tcacactttacaagctgtgagagacacatcag对HLA-A2抗原（本实例中供体为HLA-A2）cDNA的编码区（CDS）进行PCR扩增。将所得PCR产物经纯化后连接至pGEM质粒上。连接序列经北京六合华大基因科技有限公司测序，与供体MHC class Igene (Homosapiens HLA-A2 gene)， mRNA complete CDS（ U02935.2）的同源性达100%。具体的，HLA-A2抗原cDNA的编码区的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，测序序列如下所示：ATGGCCGCGGGATTATGGCCGTCATGGCGCCCCGAACCCTCGTCCTGCTACTCTCGGGGGCTCTGGCCCTGACCCAGACCTGGGCGGGCTCTCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGTCCGGAGTATTGGGACGGGGAGACACGGAAAGTGAAGGCCCACTCACAGACTCACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGGTTCTCACACCGTCCAGAGGATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACTGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCACCAGTACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAAAGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGGCAGCTCAGACCACCAAGCACAAGTGGGAGGCGGCCCATGTGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGAGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCGGGATGGGGAGGACCAGACCCAGGACACGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCGGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGACAGGAGCAGAGATACACCTGCCATGTGCAGCATGAGGGTTTGCCCAAGCCCCTCACCCTGAGATGGGAGCCGTCTTCCCAGCCCACCATCCCCATCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCTCTTTGGAGCTGTGATCACTGGAGCTGTGGTCGCTGCTGTGATGTGGAGGAGGAAGAGCTCAGATAGAAAAGGAGGGAGCTACTCTCAGGCTGCAAGCAGTGACAGTGCCCAGGGCTCTGATGTGTCTCTCACAGCTTGTAAAGTGTGAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTC。
实施例6
将以上质粒经SpeI限制性内切酶通将质粒线性化，获得HLA-A2 ivt-mRNA制备模板。应用mMESSAGE mMachine T7 Ultra Kit，将其转录成具有5’端帽子结构和3’端polyA结构的HLA-A2ivt-mRNA，纯化收集所得产物。应用Lipofectamine™ MessengerMAX™Reagent将1μg的HLA-A2 ivt-mRNA转染至受体tolDC（2×105个）中（本实例中受体为非HLA-A2），培养12 h。然后，应用磁珠分选出受体nTreg细胞，将该tolDC与受体nTreg细胞，在含500 U/mL的IL-2的条件下共孵育21天，获得供体HLA-A2分子抗原特异性Treg。
为验证应用本方法制备的供体HLA-A2分子抗原特异性Treg（即受体DC加载供体MHC-I抗原扩增Treg）的抗原特异性，同时应用相同方法制备了供体tolDC，用其与受体nTreg共培养后获得供体DC扩增Treg，以及多克隆nTreg作为对照。
以受体non-tolDC加载供体MHC-I抗原作为刺激细胞模拟慢性排斥反应中的间接抗原提呈机制，设供体non-tolDC为对照刺激细胞模拟急性排斥反应中的直接抗原提呈机制，以受体外周血CD4与CD8 T细胞为反应细胞，进行Treg抑制功能测试，以明确受体DC加载供体MHC-I抗原扩增Treg的抗原特异性抑制功能。结果如附图3~4所示，从中可见用本方法生成的Treg具有强烈的抑制由受体non-tolDC加载供体MHC-I抗原以及由供体non-tolDC为对照刺激细胞所致的受体CD4与CD8 T细胞增殖的功能，因此说明其可以有效抑制急性与慢性排斥反应。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种抗原特异性Treg及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccgtca tggcgccc 18
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcacacttta caagctgtga gagacacatc ag 32
<210> 3
<211> 1109
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggccgcgg gattatggcc gtcatggcgc cccgaaccct cgtcctgcta ctctcggggg 60
ctctggccct gacccagacc tgggcgggct ctcactccat gaggtatttc ttcacatccg 120
tgtcccggcc cggccgcggg gagccccgct tcatcgcagt gggctacgtg gacgacacgc 180
agttcgtgcg gttcgacagc gacgccgcga gccagaggat ggagccgcgg gcgccgtgga 240
tagagcagga gggtccggag tattgggacg gggagacacg gaaagtgaag gcccactcac 300
agactcaccg agtggacctg gggaccctgc gcggctacta caaccagagc gaggccggtt 360
ctcacaccgt ccagaggatg tatggctgcg acgtggggtc ggactggcgc ttcctccgcg 420
ggtaccacca gtacgcctac gacggcaagg attacatcgc cctgaaagag gacctgcgct 480
cttggaccgc ggcggacatg gcagctcaga ccaccaagca caagtgggag gcggcccatg 540
tggcggagca gttgagagcc tacctggagg gcacgtgcgt ggagtggctc cgcagatacc 600
tggagaacgg gaaggagacg ctgcagcgca cggccaccct gaggtgctgg gccctgagct 660
tctaccctgc ggagatcaca ctgacctggc agcgggatgg ggaggaccag acccaggaca 720
cggagctcgt ggagaccagg cctgcagggg atggaacctt ccagaagtgg gcggctgtgg 780
tggtgccttc tggacaggag cagagataca cctgccatgt gcagcatgag ggtttgccca 840
agcccctcac cctgagatgg gagccgtctt cccagcccac catccccatc gtgggcatca 900
ttgctggcct ggttctcttt ggagctgtga tcactggagc tgtggtcgct gctgtgatgt 960
ggaggaggaa gagctcagat agaaaaggag ggagctactc tcaggctgca agcagtgaca 1020
gtgcccaggg ctctgatgtg tctctcacag cttgtaaagt gtgaaatcac tagtgcggcc 1080
gcctgcaggt cgaccatatg ggagagctc 1109

Claims (2)

1.一种抗原特异性Treg在制备用于诱导移植免疫耐受的药物中的应用，其特征在于，所述抗原特异性Treg的制备方法包括以下步骤：
取受体外周血中的单核细胞进行培养后，移除培养基，去掉未贴壁细胞或分选出单核细胞，加入含有GM-CSF与IL-4的新鲜培养基中进行培养，得到第一培养上清；
向第一培养上清中加入TGF-β1与IL-10进行培养，得到第二培养上清；
向第二培养上清中加入tolDC细胞因子鸡尾酒进行培养，诱导tolDC成熟，得到受体tolDC；
提取供体外周血单个核细胞的全RNA，应用供体MHC-I分子抗原cDNA的编码区特异性引物对供体MHC-I分子抗原cDNA的编码区进行PCR扩增，得到PCR产物；
将所得PCR产物连接到带有T7启动子的质粒上，通过连接、转化技术将质粒导入大肠杆菌感受态细胞中进行培养后，再提取质粒，利用限制性内切酶通将质粒线性化，获得供体MHC-I分子 ivt-mRNA制备模板；
将供体MHC-I分子 ivt-mRNA制备模板，转录成具有5’端帽子结构和3’端polyA结构的供体MHC-I分子 ivt-mRNA，纯化收集所得产物；
将ivt-mRNA转染至上述受体tolDC中，获得表达递呈供体MHC-I分子抗原的受体tolDC；
将上述表达递呈供体MHC-I分子抗原的受体tolDC，与受体nTreg细胞在含有IL-2的条件下进行共培养，以获得供体MHC-I分子抗原特异性Treg；
其中，所述新鲜培养基中GM-CSF的浓度为80~120ng/mL，IL-4的浓度为15~25ng/mL；
所述第一培养上清中加入的TGF-β1的浓度为0.5~1.5ng/mL，加入的IL-10的浓度为15~25ng/mL；
所述tolDC细胞因子鸡尾酒包括以下按照质量浓度计的组分：GM-CSF 80~120ng/mL、IL-4 15~25ng/mL、TGF-β1 0.5~1.5ng/mL、IL-10 15~25ng/mL、IL-1β 8~12ng/mL、TNF-α 8~12ng/mL、PGE2 230~270ng/mL、IL-6 10~20ng/mL；
所述供体MHC-I分子抗原cDNA的编码区特异性引物包括核苷酸序列分别如序列表SEQID NO:1~2所示的上、下游引物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤中，共培养的条件中，IL-2的浓度为200~1000U/mL。
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