CN110945019A - 用于靶向治疗免疫调节的MHC Ib类分子和肽的组合 - Google Patents

Abstract

本发明涉及非经典主要组织相容性复合体(MHC)，也称为MHC Ib类分子结合限定肽的治疗用途。本发明更具体地涉及限定肽结合蛋白质或结合分子的靶向免疫调节效应，所述蛋白质包含非经典MHC Ib类分子的一个或多个结构域，所述分子干扰MHC Ib类分子及其受体的相互作用。本发明还涉及生产此类蛋白质的方法、包含该蛋白质的药物组合物，以及它们在治疗疾病中的应用，抗原特异性免疫反应对所述疾病是有益的，所述疾病包括癌症和传染病，或有害的，包括自身免疫性疾病、器官/组织排斥、对药物化合物的免疫反应或生殖障碍。此外，由于本发明揭示了MHC Ib类分子在抗原特异性耐受诱导过程中的一种新的作用模式，本发明还涉及在需要诱导抗原特异性免疫耐受，但该诱导在生理上受该机制阻碍的情况下干扰该机制的方法。

Description

用于靶向治疗免疫调节的MHC Ib类分子和肽的组合

技术领域

本发明涉及非经典人类主要组织相容性复合体(MHC)分子(也称为MHC Ib类分子)结合肽抗原的治疗用途。本发明更具体地涉及结合蛋白质或结合分子的肽抗原，所述蛋白质包含非经典MHC Ib类分子的一个或多个结构域，所述分子阻碍非经典MHC Ib类分子与其受体的结合。本发明还涉及生产此类蛋白质的方法、包含该蛋白质的药物组合物，以及用于治疗受益于抗原特异性免疫反应的病况，所述病况包括癌症和传染病，或有害疾病，包括自身免疫性疾病、器官/组织排斥、对药物化合物的免疫反应或生殖障碍。

背景技术

已知主要组织相容性复合体(MHC)抗原的三大类，即I类抗原(HLA-A、B、C、E、F、G)、II类抗原(HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR)和III类抗原。I类抗原包括常规的/经典的MHC Ia抗原、HLA-A、HLA-B和HLA-C，以及非经典的MHC Ib抗原HLA-E、HLA-F和HLA-G。I类抗原包含三个球状结构域(α1、α2和α3)。MHC I复合体还包含β2-微球蛋白和结合于肽结合槽中的被递呈的肽，该肽结合槽包括α1和α2结构域。因此，肽负载(peptide-loaded)的常规的经典MHCIa类分子可启动肽特异性的、T细胞介导的免疫反应，这可能导致递呈细胞的裂解。这种机制对于疫苗接种策略至关重要，该策略可能包括较短或较长的肽(Slingluff,CancerJ.2011 Sep；17(5):343–350)、编码抗原的核酸(Restifo et al.,Gene Ther.2000 Jan；7(2):89–92)、蛋白质或减毒生物常常被开发或临床用于诱导对特定抗原的免疫反应。抗原可包括病毒、细菌或肿瘤相关抗原。

与在大多数人体组织中表达的常规的经典MHC Ia类分子不同，非经典MHC Ib抗原(如HLA-G)只表现出非常有限的组织表达。在生理上，正常人类胎盘的绒毛外滋胚层表达高水平的HLA-G，它们可能起免疫调节剂的作用，保护胎儿免受母体免疫系统影响(无母体排斥)。根据这个假设，先前的研究表明HLA-G蛋白能够抑制同种异体反应，如增殖性T淋巴细胞细胞反应、细胞毒性T淋巴细胞介导的细胞溶解和NK细胞介导的细胞溶解(Rouas-FreissN.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,1997,94,5249-5254；Semin Cancer Biol 1999,vol 9,p.3)。

已经描述了HLA-G基因的序列(例如，Geraghty et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84,9145-9149；Ellis et al.,J.Immunol.,1990,144,731-735)，该HLA-G基因的序列包含4396个碱基对。该基因由8个外显子、7个内含子和1个3'非翻译末端组成，其分别对应于以下结构域：外显子1：信号序列，外显子2：α1胞外结构域，外显子3：α2胞外结构域，外显子4：α3胞外结构域，外显子5：跨膜区，外显子6：胞质结构域I，外显子7：胞质结构域II(不翻译的)，外显子8：胞质结构域III(不翻译的)和3'非翻译区。已鉴定了HLA-G的7种异构体，其中4种是膜结合的(HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3和HLA-G4)，其中3种是可溶的(HLA-G5、HLA-G6和HLA-G7)(参见例如，Carosella et al.,Blood 2008,vol.111,p 4862)。成熟的HLA-G1蛋白质异构体包含三个外部结构域(α1-α3)、跨膜区和胞质结构域，成熟的HLA-G5蛋白质异构体包含三个外部结构域(α1-α3)和由内含子4编码的短序列，但缺乏跨膜和胞内结构域。所有可溶的HLA-G异构体都缺乏跨膜和胞质结构域，且也可由膜结合的异构体裂解产生。

HLA-G以不依赖肽的方式与特异性受体，如Kir2DL4，ILT2(LILRB1)和ILT4(LILRB2,Clements et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2005 Mar 1；102(9)：3360-5)相互作用。HLA-G对T细胞最显著的免疫抑制作用是由ILT2和ILT4介导的。由于这些受体与HLA-G以及其他MHC Ib类分子，例如HLA-F(Lepin et al.,Eur.J.Immunol.2000.30:3552–3561)中所含的α-3结构域相互作用，对于代表性的MHC Ib类分子HLA-G，所观察到的α3结构域依赖性效应也可由其他的MHC Ib类分子诱导。

进一步已知地，MHC Ib类分子通过其α1和α2结构域递呈肽。这些肽通常由8-10个氨基酸组成，并包含某些锚定残基(Diehl et al.Curr Biol.1996 Mar 1；6(3)：305-14，Lee et al.Immunity.1995Nov；3(5)：591-600.)。然而，据发明人所知，尚未研究人类MHCIb类分子与同源T细胞受体的肽特异性相互作用。同样，也没有动物模型的明确数据。Swanson等指出鼠类MHC Ib分子可能诱导肽特异性免疫反应(Swanson et al.,An MHCclass Ib-restricted CD8 T cell response confers antiviral immunity,JEM 2008)，而Wang等描述了鼠类Qa2分子对肽特异性免疫反应的抑制。(Wang et al,Sci.Rep.36064,31.Oct.2016)。然而，人类和鼠类MHC Ib分子有很大差异(Pratheek et al.,Indian J HumGenet.2014 Apr-Jun；20(2):129–141)。因为根据在UniProtKB上使用proteinblast参考序列Q5RJ85(Q5RJ85_HUMAN)和P79568(P79568_MOUSE)分析得出HLA-G和Qa-2仅具有67％的序列同一性，所以必须谨慎对待由Qa-2得出的结论，而且无法预测那些结论是否也适用于人类HLA-G。最近一篇综述文章概述了在定义小鼠模型上的巨大困难，该定义小鼠模型适合于在基础科学和临床前研究中研究HLA-G功能(Nguyen-Lefebvre et al.,2016)。

基于已经可获得的数据，已经提出了HLA-G蛋白可用于治疗同种异体或异种器官/组织移植中的移植排斥。还提出了HLA-G蛋白可用于治疗血液系统恶性肿瘤(EP1 054688)、炎性疾病(EP1 189 627)，以及更普遍的免疫相关疾病。此外，HLA-G经常在人类肿瘤中表达(Carosella et al.Trends Immunol.2008 Mar；29(3):125-32)，据悉它的功能类似于免疫抑制性免疫检查点分子，其在肿瘤微环境中非特异性地抑制免疫反应(CarosellaED et al.,Adv Immunol.2015；127:33-144)。然而，这些研究都没有分析HLA-G上递呈的肽。因此，甚至还没有提出过递呈的肽是否可以指示(direct)观察到的MHC Ib类介导的作用这一问题。

考虑到所有小鼠模型在研究人类MHC Ib类分子中存在固有的局限性，必须在体外探索人类MHC Ib类分子对人类T细胞的作用，以便获得机制上的理解，从而可以预测在体内依赖于MHC Ib类的功能。在抗原特异性免疫反应的背景下，细胞毒性和耐受性T细胞的调节至关重要。尽管细胞毒性CD8⁺效应T细胞(细胞毒性T淋巴细胞，CTL)和调节性T细胞(Treg)都能够检测MHC分子上递呈的抗原肽，但CTL能够破坏表达其同源抗原的细胞，而调节性T细胞，特别是当它们的同源抗原通过各自的组织递呈时，具有组织保护作用(Wright et al.,2009 PNAS vol.106no.45,19078–83)。重要的是，如果抗原特异性调节性T细胞被靶组织中的同源抗原激活，它们还可发挥旁观者效应(bystander effect)并抑制针对其他抗原的免疫反应。因此，CTL对癌症患者可能有益(Gajewski et al.,Nat.Immunol.14,1014–1022,2013)，但对自身免疫性疾病有害。抑制免疫反应的Treg细胞起相反的作用。Treg的活性或功能不足会导致小鼠发生严重的自身免疫疾病，也可能与人类自身免疫疾病有关(Bluestone et al.,J Clin Invest.2015；125(6):2250–2260)。因此，需要用于抑制(或去抑制)细胞毒性T细胞和诱导(或抑制)Treg的策略。

在当前的临床实践中，不论靶向抗原如何，通常用抑制免疫反应的疗法治疗由病理性免疫反应引起的疾病(例如自身免疫性疾病)，这种疗法都可能引起严重的且通常剂量限制的副作用，并增加机会性感染的风险。因此，需要改进治疗这类疾病的方法和用途。因此，在本领域中需要通过更靶向的和抗原特异性的方法来改进治疗性调节免疫系统的方法和用途。

反之，还需要改进治疗对特定抗原的免疫应答的疾病(包括癌症)的方法和用途。例如，由于癌症的免疫抑制机制，已记载的许多用于癌症免疫治疗的疫苗接种方法已被证明是无效的。因此，还需要改进治疗包括癌症在内的这类疾病的方法和用途。

发明内容

发明人惊奇地发现，人类MHC Ib类分子例如HLA-G能够诱导对递呈的肽抗原的抗原特异性耐受性。因此，尽管其结构和序列与诱导抗原肽特异性免疫反应的经典人类MHC I类分子相似，但根据本发明，MHC Ib类分子可有利地以抗原特异性方式用于抑制免疫反应。可以通过消除抗原特异性细胞毒性T细胞或诱导抗原特异性调节性T细胞诱导对特定抗原的免疫应答的抗原特异性抑制，所述抗原特异性调节性T细胞识别在组织中表达的自身抗原或易受自身免疫攻击的另一种靶抗原。根据以上内容，本发明人已经表明，可以使用示例性的人类MHC Ib类分子以抗原肽特异性方式消除细胞毒性效应T细胞(如图1所示)和诱导致耐受性调节T细胞(如图7所示)。在非限制性实施方案中，这些作用可以通过将特异性的肽抗原与膜结合的或可溶性的MHC Ib类分子结合来实现。反之，在需要诱导抗原特异性免疫反应的情况下，需要破坏MHC Ib类相关的免疫耐受性。发明人发现，这可以通过阻断人类MHC Ib分子与其受体结合的药剂来实现。

根据本发明，结合MHC Ib类分子的肽可以有利地用于以抗原特异性或组织特异性方式抑制免疫应答。与许多传统的治疗方法相比，这是一个显著的优势，许多传统的治疗方法抑制免疫反应，而不管目标抗原是什么，因为其特异性的缺乏产生严重的和剂量限制的副作用，并增加机会性感染的风险。

此外，发明人还惊奇地发现，除了天然存在的MHC Ib类分子外的其他分子，特别是只包含MHC Ib类分子的至少一个结构域的多肽，优选地MHC Ib类分子的至少一个α3结构域可用于如本发明的抑制免疫应答：如图7和图8所示，各种经典Ia类分子的α1和α2结构域可以与人类MHC Ib类分子的α3结构域有效地结合，以抑制这些抗原所递呈的肽的免疫应答。

因此，根据本发明，例如MHC Ib类分子的免疫抑制性α3结构域与例如，由MHC I类分子的α1和α2结构域递呈的靶向抗原结合使用将会对许多自身免疫性疾病有益。

反之，发明人新的令人惊奇的发现也表明MHC Ib类分子引起的抗原特异性免疫反应的抑制可以通过干扰MHC Ib类分子与其受体结合的药剂逆转。因此，根据本发明，这种阻断剂，例如MHC Ib类分子的抗体(如图2)或其受体包括ILT2和ILT4(如图1)可以有利地用于治疗疾病，在治疗疾病时，针对特异性抗原的免疫反应是必需的。这些疾病包括癌症，例如胃癌、胃肠道间质瘤、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、子宫颈癌、阴道癌、尿道癌、睾丸癌、结肠癌和肠癌、胰腺癌、皮肤癌和肉瘤(参见例如http://medicalgenome.kribb.re.kr/GENT/search/view_result.php)，和传染病，包括但不限于锥虫病(参见例如Gineau et al.,Clin Infect Dis.2016 Nov 1；63(9):1189-1197)、巨细胞病毒感染(参见例如Cosman et al.,Immunity.1997 Aug；7(2):273-82)、HTLV-1感染(参见例如

Alves et al.,J Gen Virol.2016 Oct；97(10):2742-2752.)、丙型肝炎感染(参见例如Ding et al.,Med Sci Monit.2016 Apr 26；22:1398-402.)或疟疾恶性疟原虫感染(参见例如Garcia et al.,Infect Genet Evol.2013 Jun；16:263-9)。

在首先需要诱导针对所选抗原的特异性免疫应答的情况下，本领域通常使用包含肽或蛋白质或减毒病原体或编码蛋白质的DNA或RNA的疫苗。但是，这类疫苗接种可能无法引起应答，或甚至引起不想要的耐受性(Slingluff,Cancer J.2011 Sep；17(5):343–350)。由于肿瘤细胞(Carosella et al.Trends Immunol.2008 Mar；29(3):125-32)和病毒感染的细胞(Rizzo et al.,Front Immunol.2014；5:592)表达MHC Ib类分子，例如HLA-G在MHCIb类分子上的抗原递呈，可能是造成此类失败的原因。因此，根据本发明，特异性地阻断MHCIb类分子与其受体结合的药剂可用于提高使用特异性抗原蛋白或肽诱导肽特异性或蛋白特异性免疫应答的疗法的功效。这些疗法包括基于外部疫苗的疗法，但也可以扩展到垂死肿瘤细胞释放的抗原物质可诱导抗原特异性T细胞反应的疗法，例如放射疗法或化学疗法(这类疗法参见，例如Zitvogel et al.,Nature Reviews Immunology 8,59-73,January2008)。反之，通过添加基于MHC Ib类的构建体可以抵消通过用生物制剂或基因疗法治疗引起的不想要的疫苗接种作用，以防止出现抗药物抗体。

因此，本发明涉及以下优选的实施方案：

1.一种药物组合物，其包含：

a)人类非经典MHC I类分子，或能将肽抗原递呈给T细胞的多肽，其中所述多肽包含人类非经典MHC I类分子的α3结构域或人类非经典MHC I类分子的α3结构域的衍生物，所述衍生物能结合ILT2或ILT4，以及

b)肽抗原，所述肽抗原通过根据a)所述的非经典MHC I类分子或多肽被递呈。

2.根据第1项所述的药物组合物，其中所述组合物包含根据a)所述的能递呈肽抗原的多肽，所述多肽包含，优选地以N端至C端序，经典MHC I类分子的α1和α2结构域，所述经典MHC I类分子后紧跟所述α3结构域或所述衍生物。

3.根据第1或2项所述的药物组合物，其中所述非经典MHC I类分子或多肽所包含的所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或具有与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相比，至少80％氨基酸序列同一性，优选地至少90％氨基酸序列同一性。

4.根据第3项所述的药物组合物，其中所述非经典MHC I类分子或多肽所包含的所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或具有与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相比，至少92％氨基酸序列同一性。

5.根据第3项所述的药物组合物，其中所述非经典MHC I类分子或多肽所包含的所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或具有与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相比，至少94％氨基酸序列同一性。

6.根据第3项所述的药物组合物，其中所述非经典MHC I类分子或多肽所包含的所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或具有与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相比，至少96％氨基酸序列同一性。

7.根据第3项所述的药物组合物，其中所述非经典MHC I类分子或多肽所包含的所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或具有与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相比，至少98％氨基酸序列同一性。

8.根据第3项所述的药物组合物，其中所述非经典MHC I类分子或多肽所包含的所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或具有与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相比，至少99％氨基酸序列同一性。

9.根据第3项所述的药物组合物，其中所述非经典MHC I类分子或多肽所包含的所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同。

10.根据以上任一项所述的药物组合物，其中根据a)所述的非经典MHC I类分子或根据a)所述的能递呈肽抗原的多肽能结合ILT2或ILT4，所述结合通过表面等离子体共振光谱测量得出的亲和力常数K_d小于40μM。

11.根据以上任一项所述的药物组合物，其中根据a)所述的非经典MHC I类分子或根据a)所述的能递呈肽抗原的多肽能结合ILT2或ILT4，所述结合通过表面等离子体共振光谱测量得出的亲和力常数K_d小于20μM。

12.根据以上任一项所述的药物组合物，其中根据a)所述的非经典MHC I类分子或根据a)所述的能递呈肽抗原的多肽能结合ILT2或ILT4，所述结合通过表面等离子体共振光谱测量得出的亲和力常数K_d小于10μM。

13.根据以上任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含多肽结构域，所述多肽结构域包含如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列，或至少90％与如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列相同的序列，优选地至少95％与如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列相同的序列，更优选地至少98％与如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列相同的序列，所述多肽结构域优选地被根据a)所述的能递呈肽抗原的多肽所包含。

14.根据以上任一项所述的药物组合物，其中根据a)所述的非经典MHC I类分子或根据a)所述的能递呈肽抗原的多肽还包含一个或多个接头序列，优选为(GGGGS)n接头序列。

15.根据以上任一项所述的药物组合物，其中根据a)所述的非经典MHC I类分子或根据a)所述的能递呈肽抗原的多肽为二聚体或多聚体。

16.根据以上任一项所述的药物组合物，其中所述肽抗原的长度为7～11个氨基酸，优选为8～10个氨基酸。

17.根据第1和3～16项所述的药物组合物，其中所述组合物包含根据a)所述的非经典MHC I类分子，所述非经典MHC I类分子为HLA-E、HLA-F或HLA-G。

18.根据第17项所述的药物组合物，其中所述非经典MHC I类分子为HLA-G。

19.根据第17或18项所述的药物组合物，其中所述非经典MHC I类分子为人类非经典MHC I类分子。

20.根据以上任一项所述的药物组合物，其中根据b)所述的肽抗原与根据a)所述的非经典MHC I类分子或多肽共价结合。

21.根据第20项所述的药物组合物，其中根据b)所述的肽抗原通过肽键与根据a)所述的非经典MHC I类分子或多肽共价结合，并且所述肽抗原是单条多肽链的一部分。

22.一种能递呈肽抗原的重组多肽，所述重组多肽包含，以N端至C端序，

i)肽抗原，所述肽抗原通过所述重组多肽被递呈；

ii)可选地，第一接头序列；

iii)可选地，人类多肽结构域的序列，所述人类多肽结构域的序列包含人类β2微球蛋白的序列，或至少90％与如SEQ ID No:6所示的人类β2微球蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列；

iv)可选地，第二接头序列；

v)可选地，MHC分子的α1结构域；

vi)可选地，MHC分子的α2结构域；

vii)MHC Ib分子的α3结构域或非经典MHC I类分子的α3结构域的衍生物，所述衍生物能结合ILT2或ILT4；

viii)可选地，蛋白酶酶切位点，以及

ix)可选地，亲和标记。

23.根据第22项所述的重组多肽，其中，

v)所述α1结构域和vi)所述α2结构域来自经典MHC I类分子。

24.根据第22或23项所述的重组多肽，其中所述α3结构域或衍生物与如SEQ IDNo:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或具有与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相比，至少80％氨基酸序列同一性，优选地至少90％氨基酸序列同一性。

25.根据第24项所述的重组多肽，其中所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或具有与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相比，至少92％氨基酸序列同一性。

26.根据第24项所述的重组多肽，其中所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或具有与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相比，至少94％氨基酸序列同一性。

27.根据第24项所述的重组多肽，其中所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或具有与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相比，至少96％氨基酸序列同一性。

28.根据第24项所述的重组多肽，其中所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或具有与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相比，至少98％氨基酸序列同一性。

29.根据第24项所述的重组多肽，其中所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或具有与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相比，至少99％氨基酸序列同一性。

30.根据第24项所述的重组多肽，其中所述α3结构域与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同。

31.根据以上任一项所述的重组多肽，其中所述多肽能结合ILT2或ILT4，所述结合通过表面等离子体共振测量得出的亲和力常数K_d小于40μM。

32.根据以上任一项所述的重组多肽，其中所述多肽能结合ILT2或ILT4，所述结合通过表面等离子体共振测量得出的亲和力常数K_d小于20μM。

33.根据以上任一项所述的重组多肽，其中所述多肽能结合ILT2或ILT4，所述结合通过表面等离子体共振测量得出的亲和力常数K_d小于10μM。

34.根据以上任一项所述的重组多肽，其中所述多肽为二聚体或多聚体。

35.根据以上任一项所述的重组多肽，其中根据i)所述肽抗原序列的长度为7～11个氨基酸，优选为8～10个氨基酸。

36.根据以上任一项所述的重组多肽，其中所述重组多肽包含i)至vii)所有组成部分，但优选地不包含viii)至ix)组成部分。

37.根据第22～35项中任一项所述的重组多肽，其中所述重组多肽包含i)至ix)所有组成部分。

38.根据以上任一项所述的重组多肽，其还包含N端分泌信号肽序列。

39.用于医学用途的根据第1～21项中任一项所述的药物组合物，或根据第22～38项中任一项所述的重组多肽。

40.用于在受试者中肽抗原特异性免疫调节方法的用途的根据第1～21项中任一项所述的药物组合物，或根据第22～38项中任一项所述的重组多肽，所述免疫调节对所述药物组合物或重组多肽所包含的肽抗原具有特异性。

41.用于根据第40项所述用途的根据第40项所述的药物组合物或重组多肽，其中所述免疫调节方法用于诱导对所述药物组合物或重组多肽所包含的肽抗原的免疫耐受。

42.用于根据第40～41项中任一项所述用途的根据第40～41项任一项所述的药物组合物或重组多肽，其中所述免疫调节方法为抑制免疫性自身免疫性疾病，用于抑制过敏反应，用于抑制对生物治疗药物的免疫反应，用于抑制对胚胎抗原的免疫反应，或用于抑制对移植的细胞、组织或器官的免疫反应的方法。

43.用于根据第42项所述用途的根据第42项所述的药物组合物或重组多肽，其中所述免疫调节方法为诱导免疫耐受的方法，所述自身免疫性疾病影响多个器官，产生激素的器官、神经、关节、皮肤、胃肠系统、眼睛、血液成分或血管。

44.用于根据第41项所述用途的根据第41项所述的药物组合物或重组多肽，其中所述方法为抑制克罗恩病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症、类风湿性关节炎、牛皮癣、硬皮病、视神经脊髓炎或1型糖尿病的免疫反应的方法。

45.一种编码根据第22～38项中任一项所述的多肽的核酸或根据第1～21项中任一项所述的多肽或非经典MHC I类分子。

46.根据第45项所述的核酸，其中所述核酸为载体。

47.一种包含根据第45或46项所述的核酸的药物组合物。

48.一种包含根据第45或46项所述的核酸分子或载体的重组宿主细胞。

49.一种生产根据第22～38项中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括在表达所述核酸分子的条件下培养第48项的重组宿主细胞，并回收产生的多肽。

50.一种组合物，其包含：

a1)抗原蛋白或肽抗原，或编码所述抗原蛋白或肽抗原的核酸，或包含所述抗原蛋白或肽抗原的减毒生物，或a2)递呈根据a1)所述肽抗原的细胞；

和b)能够阻断非经典MHC I类分子与其受体结合的药剂；

其用于在受试者中诱导对所述抗原蛋白或肽抗原的免疫反应的方法的用途。

51.用于根据第50项所述用途的组合物，其中所述药剂能够结合所述人类非经典MHC I类分子与/或其受体。

52.用于根据以上任一项所述用途的组合物，其中所述药剂能集合HLA-G。

53.用于根据第50～52项所述用途的组合物，其中所述药剂为抗体，优选地为单克隆抗体，所述抗体能够结合HLA-G。

54.用于根据以上任一项所述用途的组合物，其中所述药剂能够结合ILT2或ILT4。

55.用于根据以上任一项所述用途的组合物，其中所述药剂为抗体，优选地为单克隆抗体，所述抗体能够结合ILT2或ILT4。

56.用于根据以上任一项所述用途的组合物，其中所述药剂包含抗体或其片段的Fc结构域。

57.用于根据以上任一项所述用途的组合物，其中所述药剂包含非经典MHC I类分子的α3结构域。

58.用于根据以上任一项所述用途的组合物，其中所述药剂包含ILT2或ILT4受体的一个或多个胞外结构域，优选地至少ILT2或ILT4受体的两个N端胞外结构域。

59.用于根据以上任一项所述用途的组合物，其中所述药剂可在施用所述抗原蛋白或肽抗原或编码所述抗原蛋白或肽抗原的所述核酸或包含所述抗原蛋白或肽抗原的所述减毒生物的同时、之前或之后施用。

60.用于根据以上任一项所述用途的组合物，其中所述组合物为a)抗原蛋白或肽抗原和b)能够阻断所述非经典MHC I类分子与其受体结合的药剂的组合物。

61.用于根据第50～59项中任一项所述用途的组合物，其中所述组合物为a)编码抗原蛋白或肽抗原的核酸和b)能够阻断所述非经典MHC I类分子与其受体结合的药剂的组合物。

62.用于根据第50～59项中任一项所述用途的组合物，其中所述组合物为a)包含抗原蛋白或肽抗原的减毒生物和b)能够阻断所述非经典MHC I类分子与其受体结合的药剂的组合物。

63.用于根据第62项所述用途的组合物，其中包含所述抗原蛋白或肽抗原的所述减毒生物为减毒病毒。

64.用于根据第50～62项中任一项所述用途的组合物，其中根据a)所述的抗原蛋白或肽抗原为肿瘤抗原或与所述肿瘤抗原至少77％相同的抗原，并且能够诱导对所述抗原的交叉保护。

65.用于根据以上任一项所述用途的组合物，其中所述方法为基于T细胞的免疫疗法的方法。

66.用于根据第50～63项和第65项中任一项所述用途的组合物，其中在病原微生物或病毒中可检测到所述抗原蛋白或肽抗原。

67.用于根据以上任一项所述用途的组合物，其中所述方法为用于治疗或预防传染性或恶性疾病的方法。

68.用于根据第67项所述用途的组合物，其中所述疾病为癌症，所述肽抗原为肿瘤抗原。

69.用于根据第68项所述用途的组合物，其中所述癌症选自黑色素瘤、肾癌、卵巢癌、大肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺导管腺癌、前列腺癌、B和T细胞淋巴瘤和肺癌。

70.用于根据以上任一项所述用途的组合物，其中所述组合物存在于一药物组合物中。

71.用于根据以上任一项所述用途的组合物，其中对所述抗原蛋白或肽抗原的所述免疫应答对所述抗原蛋白或肽抗原是特异性的。

72.一种用于在人类受试者中治疗癌症的方法的能够阻断根据第50～62项中任一项所述的非经典MHC I类分子和其受体结合的药剂，所述方法包括导致从所述癌症的细胞释放癌抗原的疗法。

73.用于根据第72项所述用途的药剂，其中导致癌抗原释放的所述疗法为化学疗法或放射疗法。

74.用于根据第41项所述用途的根据第41项所述的药物组合物或重组多肽，其中诱导对肽抗原免疫耐受的所述方法还包括肽类药物治疗，所述肽抗原1)与所述肽类药物相同或2)为所述肽类药物的片段或3)为能够诱导对所述肽类药物免疫耐受的所述肽类药物的片段的衍生物。

75.用于根据第41项所述用途的根据第41项所述的药物组合物或重组多肽，其中诱导对肽抗原免疫耐受的所述方法还包括蛋白质类药物治疗，所述肽抗原为1)所述蛋白质类药物的片段或2)能诱导对所述蛋白质类药物免疫耐受的所述蛋白质类药物的片段的衍生物。

76.用于根据第74项所述用途的根据第74项所述的药物组合物或重组多肽，其中所述肽类药物可以肽类药物本身的形式给药。

77.用于根据第75项所述用途的根据第75项所述的药物组合物或重组多肽，其中所述蛋白质类药物可以蛋白质类药物本身的形式给药。

78.用于根据第74项所述用途的根据第74项所述的药物组合物或重组多肽，其中所述肽类药物可通过基因疗法的方式给药，所述基因疗法为包含编码所述肽类药物的基因的基因疗法。

79.用于根据第75项所述用途的根据第75项所述的药物组合物或重组多肽，其中所述蛋白质类药物可通过基因疗法的方式给药，所述基因疗法为包含编码所述蛋白质类药物的基因的基因疗法。

本发明可用于任何哺乳动物受试者，优选地用于人类受试者。

优选地，应当如上述将针对免疫刺激性T细胞定向治疗与针对MHC Ib类或ILT2/4的阻断剂结合使用的适应症(indication)包括病毒感染和肿瘤，在肿瘤中，HLA-G或其他MHC Ib类分子的升高水平可在肿瘤积液、血液样本、活体检视中通过诸如聚合酶链反应、ELISA、免疫印迹法、荧光免疫检验法、免疫组织化学法以及其他方法检测(如Paul et al.,Hum Immunol.2000 Nov；61(11):1177-95中所描述)或者通过其他方式在恶性肿瘤细胞或非恶性肿瘤细胞上检测。由于HLA-G在许多组织中不表达，然而即使少量的HLA-G也很有效，因此根据本发明，在原本HLA-G缺乏的组织中表达可检测到的水平或在显示基础HLA-G表达的组织中50％以上的生理水平上增加被认为是优选的升高水平。

附图说明

图1：表达负载有限定肽的非经典MHC I类分子的细胞选择性排除对递呈肽具有特异性的CTL

A，B)当在肿瘤细胞系JEG-3上递呈它们的同源肽时，识别模式抗原STEAP1(CD8st)的HLA-A2限制性CD8⁺效应T细胞可被选择性地排除。所述肿瘤细胞系JEG-3显示MHC Ib分子HLA-G的高表达而经典MHC I类分子几乎未能检测到。注意，在本发明中STEAP1通常也被称为“STEAP”、“steap”或简称为“st”。这些术语是同义词，可以互换。对抗原PRAME(CD8pr)具有特异性的共培养CD8⁺效应T细胞不受影响。(C)尽管负载了STEAP1特异性T细胞的同源肽，但在此过程中并未排除表达HLA-G的JEG-3肿瘤细胞。这表明由肿瘤或受感染细胞表达的MHC Ib分子可使这些细胞对抗原特异性T细胞的靶向具有抗性，抗原特异性T细胞通常是基于肽的疫苗接种策略的主要效应器。(D)通过针对在T细胞上表达的HLA-G相互作用伴侣(interaction partner)ILT-2的中和抗体，可以大大地减弱HLA-G上递呈的STEAP1肽诱导的STEAP1特异性T细胞凋亡。

图2：负载限定肽的MHC Ib分子以依赖抗原和HLA-G的方式削弱同源CTL的细胞毒性潜能。

将分别对STEAP1或PRAME具有特异性的HLA-A2限制性T细胞克隆混合，并用对照(+)或负载STEAP1-肽(st)的JEG-3细胞进行预处理。如指示，以10μg/ml加入中和抗人类HLA-G抗体(克隆87G)。16小时后，STEAP1特异性T细胞对表达荧光素酶的初始(灰条)或负载STEAP1肽(黑条)的HLA-A2⁺UACC-257黑色素瘤细胞的细胞毒性潜能以2:1的比例进行测试。8小时后，加入D-荧光素，并利用生物光子活力测定法在冷光仪中测定靶细胞的存活率(Brown et al.,J Immunol Methods.2005 Feb；297(1-2):39-52)。在载有STEAP1肽时，表达HLA-G的JEG-3细胞使STEAP1特异性CTL的溶解潜能(lytic potential)降低了90％以上，而初始JEG-3细胞没有引起显著的抑制。由于这种效应可以通过部分地中和HLA-G抗体的存在而显著减弱，因此可以得出结论，负载肽的HLA-G可用于抑制T细胞介导的针对选定抗原的免疫反应。根据本发明，这种效果可以扩展到其他的MHC Ib类分子。相反，根据本发明的抗原特异性T细胞介导的免疫反应的诱导可以通过阻断MHC Ib的药剂来实现。

图3：结合限定肽的MHC Ib分子抑制同源CTL，而对其他抗原的免疫反应基本上不受影响

将分别对STEAP1或PRAME具有特异性的HLA-A2限制性T细胞克隆与对HLA-A2-STEAP1和HLA-A2-PRAME具有特异性的T细胞克隆混合，并不经处理(ctrl)或用对照(JEG-3)或负载STEAP1肽(JEG-3st)的JEG-3细胞进行预处理。8小时后，两个T细胞克隆对负载表达荧光素酶的PRAME肽(深灰色条)或STEAP1肽(浅灰色条)的HLA-A2⁺UACC-257黑色素瘤细胞的细胞毒性潜能以1:1的比例进行测试。使用负载STEAP1肽的JEG-3细胞的预处理抑制了约50％所述STEAP1肽特异性T细胞介导的免疫反应，而PRAME特异性免疫反应基本上不被初始或负载STEAP1-肽的JEG-3细胞改变。

图4：适合于实现治疗性抗原特异性免疫调节的负载肽的可溶性MHC Ib分子的描述。

在虚线球体中描绘的递呈肽抗原，HLA-G α1-3结构域以浅灰色绘制，β2微球蛋白结构域以深灰色显示。连接抗原肽和β2微球蛋白分子的可选接头以灰色杆状样式显示，且可选的二硫键捕获以黑色球体显示。此图是使用Pymol生成的并根据Clements et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2005 Mar 1；102(9):3360-5和Hansen et al.,TrendsImmunol.2010 Oct；31(10):363-9修改。

图5：编码适合于治疗性肽特异性免疫调节的单链MHC Ib分子的基于载体的构建体的实施例

HLA-G1和HLA-G5分别由3个α结构域(这里用黑色表示)、1个非共价关联的β2微球蛋白亚单元(这里用深灰色表示)和HLA-G上递呈的抗原肽(短黑箭头)组成。HLA-G1还包含跨膜结构域和短胞内链(这里未显示)。如图所示，α-3结构域能够在免疫细胞上与受体ILT2(参见Shiroishi et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2003July 22；100(15):8856-8861)和ILT4(参见Shiroishi et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2006Oct 31；103(44):16412-7)结合。在生理上，这些序列形成非共价连接MHC 1类复合体。为了简化复合MHC Ib分子的纯化，引入两个蛋白质标记(myc和His(6×))，以便通过Xa因子裂解使其后续被去除。此外，抗原肽、β2-微球蛋白和MHC Ibα链可以连接，以提高稳定性。载体图谱使用Snapgene Viewer软件生成。

图6：结合树突状细胞(DC-10)的可溶性肽HLA-G/肽-MHC Ib复合体可选择性地清除识别递呈靶抗原的CD8⁺效应T细胞。

在含可溶性肽MHC Ib构建体的细胞培养上清液加入之前，在GM-CSF、IL4和IL10(DC-10)存在的条件下，树突状细胞经4小时从单核细胞中生成。使用包含递呈的Melan-A/MART1(dtGmelA)或STEAP1(dtGsteap)肽的二硫键捕获固定的单链HLA-G5构建体。这些构建体与DC-10细胞的结合先前已经得到证实。然后，洗涤加入的DC-10细胞并与对照CTL(PRAME特异性的，CD8pr)或靶标CTL(STEAP1特异性的，CD8st)以1:1比例共培养48小时。这些数据表明，载有可溶性MHC Ib-肽构建体的树突状细胞几乎可以完全耗尽同源T细胞克隆，而非同源CTL不受影响。

图7：负载肽的MHC Ib复合体诱导人类抗原特异性调节T细胞识别递呈的肽

A)从不同健康供体中取得外周血单核细胞(PBMC)，并在含有5％hAB血清、5ng/mlTGFβ1、含经放射处理的JEG-3细胞的20ng/ml IL2(Treg培养基)的RPMI1640培养基中共培养14天，所述JEG-3细胞载有Melan-A/MART1(MART1)或STEAP1(STEAP)肽。在第7天，PBMC被转移到新鲜的培养基中，并再次加入经放射处理的负载肽的JEG-3细胞。使用来自MiltenyiBiotec(抗CD3、抗CD28和抗CD2)的Treg扩增珠作为阳性对照。所得细胞使用抗人CD4和CD25的抗体、HLA-A2STEAP1肽多聚体(STEAP1dex)进行染色，并通过流式细胞术进行分析。当载有STEAP1的JEG-3细胞存在时，观察到STEAP1特异性细胞在CD4⁺CD25^highTreg群体中显著富集。

B)每孔4×10⁵个DC-10细胞中加入递呈如图6所述的Melan-A(dtGmelA)或STEAP1(dtGsteap)肽的二硫键捕获型单链HLA-G构建体。然后，加入源自同一供体的4x10⁶PBL，细胞在Treg培养基中培养7天。然后，将4×10⁵相同载入的DC-10添加到每孔。总共14天后，通过流式细胞术定量分析生成Melan A特异性IL-10的Treg细胞。与对照分子(STEAP1)或不经处理的PBL相比，在PBL与载有单链Melan AHLA-G分子的DC-10共培养的条件下，Melan A特异性Treg的数量极大地增加了。

图8：包含结合DC的人类MHC Ib α3结构域的单链肽MHC构建体诱导对递呈肽特异性的鼠类Treg细胞。

鼠类DC(mDCs)是通过在完全RPMI-1640中培养7天骨髓衍生细胞而生成的，在所述完全RPMI-1640中补加入含转染了鼠类GM-CSF基因的Ag8653骨髓瘤细胞上清液的10％GM-CSF。mDCs中加入对照CHO上清液(CHO/ctrl)或质粒转染的CHO细胞的上清液，所述质粒编码含人类HLA-Gα3结构域以及鼠类H-2Kbα1和2结构域递呈的卵清蛋白肽的单链肽MHC分子。对照包括包含人类HLA-A2α1和2结构域(A2G)而非鼠类H-2Kbα1和2结构域的类似的构建体。A和B：仅表达一识别H-2Kb递呈的OVA肽(SIINFEKL)的转基因T细胞受体的OT1小鼠脾细胞在Treg-允许培养基(完全RPMI，5ng/ml IL-2，5ng/ml TGF-β1)中以2.5:1比例加入mDCs培养14天。

发明详述

定义与一般技术

除非下文另有说明，本发明中使用的术语应按照本领域技术人员所知道的共同含义来理解。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式全部并入本文。

根据本发明的所有蛋白质，包括根据本发明的多肽和MHC分子，都可以通过本领域已知的方法生产。这些方法包括生产重组蛋白的方法。可以理解地，根据本发明的蛋白质，包括根据本发明的多肽和MHC分子，应可选地包含分泌信号肽序列。同样地，根据本发明的蛋白质还应可选地包含亲和标签，例如为了便于纯化，以及有利于标记与蛋白质之间的可选蛋白酶酶切位点，例如为了通过蛋白酶酶切有利于去除标签。

同样地，可以理解的是，根据本发明的蛋白质，包括根据本发明的多肽和MHC分子应包含各自的前肽。

还可以理解的是，根据本发明的多肽和MHC分子可以以其可溶形式或膜结合形式存在。

根据本发明，MHC分子优选为人类MHC分子。

包括根据本发明使用的MHC分子、本发明的多肽和根据本发明的抗体的本发明的蛋白质和多肽优选为分离的。

包括根据本发明使用的MHC分子、本发明的多肽和根据本发明的抗体的本发明的蛋白质和多肽优选为重组的。

可以理解的是，如何制备根据本发明能够结合和递呈肽抗原的多肽。例如，肽抗原结合结构域，如α1和α2结构域是众所周知的，人们可以对这些结构域进行修饰。根据本发明，肽抗原与多肽和MHC分子结合的能力可以通过本领域已知的技术来确定，包括但不限于探索性的方法，例如MHC肽洗脱、然后在硅中进行质谱分析和生物信息预测，以及确证性的方法，例如MHC肽多聚体结合法和刺激试验。

可以理解的是，与本发明中使用的肽抗原有关，本文所指的这些肽抗原的任何长度(例如“7至11个氨基酸的长度”)均指肽抗原本身的长度。因此，本文所指的肽抗原的长度不包括不属于肽抗原的附加氨基酸(如可能的接头序列中的附加氨基酸等)所赋予的长度。

术语“自身免疫性疾病”在本文中根据本领域技术人员所知道的共同的含义使用，其并不限于特定的自身免疫性疾病。根据本发明的所有实施方案，自身免疫性疾病优选为涉及对肽自身抗原的自身免疫反应的自身免疫性疾病。

根据本发明，“包含”一词的每次出现都可选地用“由……组成”代替。

方法和技术

一般地，除非本文另有说明，在本发明中使用的方法(例如克隆法或与抗体有关的方法)根据本领域已知的步骤进行，例如在Sambrook et al.(“Molecular Cloning:ALaboratory Manual.”,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York 1989)，Ausubel et al.(“Current Protocols in MolecularBiology.”Greene Publishing Associates and Wiley Interscience；New York 1992)，和Harlow and Lane(“Antibodies:A Laboratory Manual”Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York 1988)中描述的步骤，其均以引用的方式并入本文。

蛋白质-蛋白质结合，例如抗体与其各自的靶蛋白的结合，可以通过本领域已知的方法来评估。蛋白质-蛋白质结合，例如抗体与其各自的靶蛋白的结合，优选地通过表面等离子体共振光谱测量来评估。

例如，根据本发明的MHC Ib类分子或多肽与其受体，包括ILT2和ILT4的结合，优选地通过表面等离子体共振光谱测量来评估。更优选地，根据本发明的MHC Ib类分子或多肽与其受体的结合在25℃下通过表面等离子体共振测量来评估。Shiroishi等描述了这种表面等离子体共振测量的适当条件(Shiroishi et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2003July 22；100(15):8856-8861.)。

根据本发明的序列比对是使用BLAST算法进行的(参见Altschul et al.(1990)“Basic local alignment search tool.”Journal of Molecular Biology 215.p.403-410.；Altschul et al.:(1997)Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation ofprotein database search programs.Nucleic Acids Res.25:3389-3402.)。本领域已知，适用于使用BLAST算法的短肽的序列比对的合适参数，其适用于根据本发明的肽抗原。大多数的使用BLAST算法的软件工具自动调整短输入序列的序列比对的参数。在一个实施方案中，使用以下参数：Max target sequences 10；Word size 3；BLOSUM 62 matrix；gapcosts:existence 11,extension 1；conditional compositional score matrixadjustment。因此，当使用与序列有关的术语，例如“同一性”或“相同的”优选地指代使用BLAST算法得出的同一性值。

本发明组合物的制备

根据本发明的组合物根据已知的药物组合物的制备标准制备。

例如，所述组合物按照其可适当地保存和施用的方式制备，如使用药学上可接受的组分如载体、赋形剂和/或稳定剂。

当在患者上施用所述药物组合物时，这些药学上可接受的组分在使用药量上是无毒的。添加到药物组合物中的药学上可接受的组分可取决于组合物中存在的活性成分的化学性质，药物组合物的特定用途和给药途径。

通常地，根据本领域可知的知识使用与本发明相关的药学上可接受的组分，例如参见Remington's Pharmaceutical Sciences,Ed.AR Gennaro,20th edition,2000,Williams&Wilkins,PA,USA。

根据本发明的肽抗原

能够根据本发明进行使用的肽抗原，包括如上文所定义的肽抗原，除了其能在MHC分子上被递呈之外，没有特别的限制。如本领域已知的，可以生产能够在MHC分子上递呈的肽(参见例如，Rammensee,Bachmann,Emmerich,Bachor,

SYFPEITHI:databasefor MHC ligands and peptide motifs.Immunogenetics.1999Nov；50(3-4):213-9；Pearson et al.MHC class I-associated peptides derive from selective regionsof the human genome.J Clin Invest.2016 Dec 1；126(12):4690-4701；以及Rock,Reits,Neefjes.Present Yourself！By MHC Class I and MHC Class IIMolecules.Trends Immunol.2016 Nov；37(11):724-737)。

肽抗原是本领域公知的。通常地，根据本发明的肽抗原能够结合MHC I类蛋白。本领域技术人员会理解，对于每个根据本发明能够递呈肽的MHC Ib类分子或多肽，将优选地使用能够与所述MHC Ib类分子或多肽结合的肽抗原。可以基于本领域已知的方法选择这些肽抗原。

可以通过本领域已知的方法进行评估肽抗原与根据本发明的MHC Ib类分子或能够与肽抗原结合的多肽的结合，例如为：

Rammensee,Bachmann,Emmerich,Bachor,

SYFPEITHI:database forMHC ligands and peptide motifs.Immunogenetics.1999 Nov；50(3-4):213-9；

Pearson et al.MHC class I-associated peptides derive from selectiveregions of the human genome.J Clin Invest.2016 Dec 1；126(12):4690-4701；和

Rock,Reits,Neefjes.Present Yourself！By MHC Class I and MHC Class IIMolecules.Trends Immunol.2016 Nov；37(11):724-737的方法。

这些方法包括实验方法和用于预测肽抗原结合的方法。

用于将肽抗原锚定在MHC I类分子上并确保肽抗原与MHC I类分子结合的锚定残基是本领域已知的。

在根据本发明所有实施方案的一个优选实施方案中，根据本发明使用的肽抗原包含任意在对MHC I类分子预测的位置上锚定的或优选的氨基酸残基。

优选地，此类预测按照以下任一出版物中的描述进行：

-Rammensee et al,SYFPEITHI:database for MHC ligands and peptidemotifs.Immunogenetics(1999)50:213-219

-Nielsen et al,Protein Sci(2003)12:1007-1017

-Neefjes et al.Nat Rev Immunol.2011 Nov 11；11(12):823-36

-Diehl et al.Curr Biol.1996 Mar 1；6(3):305-14,

-Lee et al.Immunity.1995 Nov；3(5):591-600.

-Desai&Kulkarni-Kale,T-cell epitope prediction methods:anoverview.Methods Mol Biol.2014；1184:333-64.。

在根据本发明所有实施方案的一个优选实施方案中，所述肽抗原源自人类蛋白质。

或者，本发明的肽抗原的非锚定氨基酸残基可与源自人类蛋白质的肽抗原相应的氨基酸残基相同，或者与源自人类蛋白质的肽抗原相应的氨基酸残基具有至少50％的序列同一性，优选地至少60％的序列同一性，更优选地至少70％的序列同一性，进一步更优选地至少80％的序列同一性，进一步更优选地至少90％的序列同一性。或者，与源自人类蛋白质的肽抗原相应的氨基酸残基相比，本发明的肽抗原的非锚定氨基酸残基可包含保守取代，优选地不超过两处保守取代，更优选地一处保守取代。在优选的实施方案中，所述人类蛋白质是在受病理性免疫反应影响的组织或细胞中表达的蛋白质。

根据本发明的肽抗原可以是天然存在的肽或非天然存在的肽。根据本发明的肽抗原优选地由天然存在的氨基酸组成。但是，也可以使用非天然存在的氨基酸，例如经修饰的氨基酸。例如，在一个实施方案中，根据本发明使用的肽抗原可以是拟肽。

合成肽抗原的方法，包括合成根据本发明的肽抗原的方法是本领域众所周知的。

序列

本申请中提及的优选的氨基酸序列可独立地选自以下序列。序列以N端至C端的顺序表示；并且它们以一个字母的氨基酸代码表示。

前导肽：例如，MSRSVALAVLALLSLSGLEA(SEQ ID No:1)

肽抗原：任意对应MHC I类α1&2结构域的MHC I类肽，例如，MLAVFLPIV(STEAP1)(SEQ ID No:2)或SIINFEKL(Ova)(SEQ ID No:3)

接头1(二硫键捕获固定的)(disulfide trap stabilized):例如GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No:4)或GCGASGGGGSGGGGS(SEQ ID No:5)

源自人类或其他物种的β2微球蛋白,例如：

IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM(SEQ ID No:6,人β3微球蛋白)

接头2，例如

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No:7)

衍生自人类HLA-G或其他适合于递呈所选抗原肽的MHC I类α1&2结构域的α1&2结构域，在DT变体中Y84可以是C

GSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRA(SEQ ID No:8)

例如:鼠类H2Kbα1&2结构域(Y84C)

GPHSLRYFVTAVSRPGLGEPRYMEVGYVDDTEFVRFDSDAENPRYEPRARWMEQEGPEYWERETQKAKGNEQSFRVDLRTLLGCYNQSKGGSHTIQVISGCEVGSDGRLLRGYQQYAYDGCDYIALNEDLKTWTAADMAALITKHKWEQAGEAERLRAYLEGTCVEWLRRYLKNGNATLLRT(SEQ ID No:9)

或者：人类HLA-A2α1&2结构域

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRT(SEQ ID No:10)

人类HLA-Gα3结构域(或任意MHC Ib类α3结构域，例如HLA-F,其还与ILT2和ILT4受体相互作用)，例如：

DPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDL(SEQ ID No:11；HLA-Gα3的序列)。注意：该序列的以下加下划线的氨基酸与ILT2或ILT4受体的相互作用有关：

DPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDL

Xa因子限制性位点(Factor Xa restriction site)：IEGRTGTKLGP(SEQ ID No:12)

Myc标签(Myc tag)：EQKLISEEDL(SEQ ID No:13)

附加序列：NSAVD

His标签(His tag)：HHHHHH*(SEQ ID No:14)

本发明的成熟全长蛋白质的实施例：

二硫键捕获_Ova_接头1_人β2微球蛋白_接头2_H2Kbα1&2_HLA-Gα3_Xa位点_myc&his标签

(disulfide trap_Ova_Linker1_humanbeta2microglobulin_Linker2_H2Kbalpha1&2_HLA-Galpha3_XaSite_myc&hisTAG)

(dtH2Gova)

SIINFEKLGCGASGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGPHSLRYFVTAVSRPGLGEPRYMEVGYVDDTEFVRFDSDAENPRYEPRARWMEQEGPEYWERETQKAKGNEQSFRVDLRTLLGCYNQSKGGSHTIQVISGCEVGSDGRLLRGYQQYAYDGCDYIALNEDLKTWTAADMAALITKHKWEQAGEAERLRAYLEGTCVEWLRRYLKNGNATLLRTDPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDLIEGRTGTKLGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH*(SEQ ID No:15)

注意，上述全长蛋白质的肽抗原(此处为：SIINFEKL)的序列可以被根据本发明的任意肽抗原序列取代。

二硫键捕获_STEAP1_接头1_人β2微球蛋白_接头2_HLA-A2α1&2_HLA-Gα3_Xa位点_myc&his标签

(disulfidetrap_STEAP1_Linker1_humanbeta2microglobulin_Linker2_HLA-A2alpha1&2_HLA-Galpha3_XaSite_myc&hisTAG)

(dtGsteap)

MLAVFLPIVGCGASGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGCYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDLIEGRTGTKLGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH*(SEQ ID No:16)

注意，根据本发明，上述全长蛋白质的肽抗原(此处为：MLAVFLPIV)的序列可以被根据本发明的任意肽抗原序列取代。

受体ILT2(也称为LILRB1)和ILT4(也称为LILRB2)是本领域已知的。根据本发明这些受体的优选序列如下：

ILT2:

MTPILTVLICLGLSLGPRTHVQAGHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYREKKTALWITRIPQELVKKGQFPIPSITWEHAGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGAYIKPTLSAQPSPVVNSGGNVILQCDSQVAFDGFSLCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLGVSKKPSLSVQPGPIVAPEETLTLQCGSDAGYNRFVLYKDGERDFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSEWSAPSDPLDILIAGQFYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPWRLRSTYQSQKYQAEFPMGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH(SEQ ID No:17)

ILT4:

MTPIVTVLICLGLSLGPRTHVQTGTIPKPTLWAEPDSVITQGSPVTLSCQGSLEAQEYRLYREKKSASWITRIRPELVKNGQFHIPSITWEHTGRYGCQYYSRARWSELSDPLVLVMTGAYPKPTLSAQPSPVVTSGGRVTLQCESQVAFGGFILCKEGEEEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPNRRWSHRCYGYDLNSPYVWSSPSDLLELLVPGVSKKPSLSVQPGPVVAPGESLTLQCVSDVGYDRFVLYKEGERDLRQLPGRQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSECSAPSDPLDILITGQIRGTPFISVQPGPTVASGENVTLLCQSWRQFHTFLLTKAGAADAPLRLRSIHEYPKYQAEFPMSPVTSAHAGTYRCYGSLNSDPYLLSHPSEPLELVVSGPSMGSSPPPTGPISTPAGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVVLLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKDTQPEDGVEMDTRAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRRKATEPPPSQEREPPAEPSIYATLAIH(SEQ ID No:18)

通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。

实施例

一般注意事项

所有步骤均在无菌条件下进行；仅在层流罩(laminar flow hoods)下打开保护性容器。除非另有说明，细胞始终在350×g下离心5分钟。将所有活细胞保存在37℃，5％CO₂和>95％湿度的培养箱中。使用设定为37℃的水浴预热培养基、PBS或其他添加到细胞中的溶液。Neubauer室(Neubauer chamber)用于细胞计数。使用Student’s T检验进行统计分析，p值低于0.05时视为显著。

实施例1：表达负载限定肽的MHC Ib分子的细胞选择性地清除对递呈肽具有特异性的CTL

材料和方法：JEG-3是高水平表达HLA-G且几乎不表达任何经典的MHC I类分子的人绒毛膜癌细胞系(Rinke de Wit et.al.,J Immunol.1990Feb 1；144(3):1080-7)。将JEG-3细胞在含10％胎牛血清、0.5％丙酮酸钠溶液(100mM)和1％青霉素(10kU/ml)和链霉素(10mg/ml)溶液的完全RPMI1640培养基中培养(“完全RPMI”)中。将3×10⁵JEG-3细胞接种在置于12孔板的1ml完全RPMI1640中。

如指明，加入1μl含STEAP1(292.2L-9mer，MLAVFLPIV)或PRAME(435-9mer，NLTHVLYPV)肽(5μg/μl)的储备液。第二天，用PBS洗涤JEG-3细胞3次，然后在每孔中加入300μl补充的CellGro DC培养基(5％人类血清型AB血清，25-50U/ml IL-2，5ng/ml IL-15)。

根据

et al,Nat Protoc.2014 Apr；9(4):950-66，生产克隆HLA-A*02(HLA-A2)限制性的STEAP1(st)或PRAME(pr)肽特异性CD8⁺T细胞(STEAP1-/PRAME“特异性”)。STEAP1特异性CD8⁺T细胞用Cell Proliferation Dye

670根据制造商的说明进行染色，然后将其重悬于上述的完全RPMI1640培养基中。将300μl培养基的1.5×10⁵细胞与负载肽的JEG-3一起加入每孔。以相同的方式，未染色的PRAME特异性CD8⁺T细胞被颗粒化，重悬并加入至每孔。在如D所示的实验中，加入抗ILT-2抗体(克隆HP-F1)或同种型对照抗体，使其最终浓度达到10μg/ml。

16小时后，收集细胞，并根据制造商的说明用5μM CellEvent Caspase-3/7Green(Life Technologies)进行染色。然后收集非贴壁细胞，并在抗人CD8(PE/Cy7，克隆RPA-T8)和抗人CD4(PE/Dye647，克隆MEM-241)抗体的1:100稀释液中于冰上染色30分钟，然后通过流式细胞术进行分析。由于CTL是CD8⁺CD4^-，因此CD4染色能排除可能的CD4⁺/CD8⁺双阳性细胞和自体荧光细胞。总细胞数是根据每微升的细胞数确定的。贴壁JEG-3细胞的存活率(survival)通过结晶紫测定法定量分析。

结果：A)在没有用JEG-3细胞或用HLA-G⁺DMSO处理两个对照条件下的凋亡率小于5％的对照JEG-3细胞，均检测到Caspase 3/7⁺eFluor670^-PRAME特异性或eFluor670⁺STEAP1特异性CD8⁺T细胞。相比之下，与负载STEAP1的JEG-3细胞共培养后，超过90％的STEAP1特异性CD8⁺T细胞被清除或凋亡，然而并未观察到对PRAME特异性T细胞有显著影响。由于明亮的eFluor 670染色，STEAP1特异性CD8⁺T细胞容易区别于PRAME特异性T细胞。此点状图是三个实验之一的代表性结果。B)对三个独立实验的统计分析表明，这些效果非常显著，并且可选择性地清除与负载同源肽的HLA-G⁺JEG-3细胞共培养的STEAP1特异性T细胞。C)由于载有共培养T细胞识别的肽，JEG-3细胞的存活率不会降低。D)在相同条件下，加入阻断HLA-G受体ILT2的抗体部分地抑制了STEAP1特异性T细胞的靶向清除。

结论：该实验表明，如果肽特异性CD8⁺T细胞与人类MHC Ib⁺细胞，例如与递呈其同源抗原的JEG-3细胞接触，则可以选择性地清除它们。这是令人惊讶的，因为向活化的CD8⁺T细胞递呈同源肽的MHC Ia⁺靶细胞通常在T细胞存活时被消除。与MHC Ia⁺靶标相比，JEG-3细胞的肽负载未引起存活率降低，这表明MHC Ib类分子可能具有与MHC Ia类分子相反的效果。此外，MHC Ib类分子与其受体ILT2协同作用以达到通过抑制它们的相互作用的药剂来实现的抑制效果，例如ILT2阻断抗体。因此，根据本发明，在MHC Ib类分子存在的情况下，这种阻断剂可用于促进肽特异性免疫应答的诱导。

实施例2：负载限定肽的MHC Ib类分子可用于以抗原特异性的方式抑制细胞毒性潜能。

材料和方法：1×10⁶JEG-3细胞未经处理或在6孔板的1ml完全RPMI1640中加入STEAP1肽(“st”，参见实施例1)。将5×10⁵STEAP1特异性CD8⁺T细胞与5×10⁵PRAME特异性CD8⁺T细胞(效应器)混合，且未经处理或与这些JEG-3共培养16h。如指明，加入10μg/ml中和抗人HLA-G抗体(克隆87G，BioLegend，德国)。第二天，使用Accutase溶液(PAA，德国)使表达萤火虫荧光素酶的HLA-A2⁺UACC-257黑色素瘤细胞(靶标)脱落，洗涤并加入STEAP1肽(5μg/ml，“st loaded”)或等量的DMSO(“unloaded”)在37℃振荡器上振荡4小时。然后在白色圆底96孔板中每孔接种1×10⁴个UACC细胞。然后收集非贴壁的混合T细胞，并加入等量4×10⁴个初始T细胞(每个2×10⁴个)和萤火虫D-荧光素(PJK德国，终浓度140μg/ml)。8小时后在发光检测仪(luminometer)中确定靶细胞存活率(具体方法Brown et al.,J ImmunolMethods.2005 Feb；297(1-2):39-52.)。

结果：在HLA-G⁺JEG-3细胞上递呈肽抗原会损害以依赖MHC-Ib类的方式识别该特异性肽抗原的CD8⁺T细胞克隆的细胞毒性能力。在所述的环境下，STEAP1特异性对照CTL或用HLA-G⁺JEG-3细胞预处理的CTL溶解了约90％所有载有所述同源肽的靶细胞，而未清除初始靶细胞。相比之下，用JEG-3细胞和所述同源肽进行的预处理几乎完全保护了抗原递呈靶细胞。可部分阻断HLA-G依赖性作用的抗体(87G)部分地恢复了这种肽特异性免疫抑制作用。这意味着在临床环境中，负载肽的MHC Ib类分子还可抑制针对所递呈抗原的有害细胞毒性(自身)免疫反应。

此外，与肽有关(例如通过放射、化学疗法或肽疫苗接种方案)的MHC Ib类阳性肿瘤细胞可以特异性地抑制CD8⁺T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。但是，这种作用可以通过阻断MHC Ib类分子与其受体的相互作用的药剂来消除。

实施例3：与限定肽结合的MHC Ib类分子抑制同源CTL，而针对其他抗原的免疫反应在很大程度上不受影响。

材料和方法：在如图3所示的实验中，将HLA-A2STEAP1特异性(CD8st)和PRAME特异性CD8⁺T细胞(CD8pr)混合，不经处理或与负载或不负载STEAP1肽的JEG-3细胞共培养8h(方法见图2)。然后收集悬浮液中的T细胞，并与负载表达荧光素酶的PRAME肽(深灰色条)或负载STEAP1肽(浅灰色条)的HLA-A2⁺UACC-257黑色素瘤细胞结合(T细胞在预处理后不计数，初始效应器:靶点比1:1)。

结果：

在MHC Ib类阳性细胞系的环境中，将混合的CD8T细胞克隆预暴露于所述同源肽之一中使所述同源T细胞的细胞毒性潜能降低至约50％，而另一个T细胞克隆的细胞毒性活性保持在约90％，这与单独的HLA-G⁺JEG-3细胞的不依赖于肽的免疫抑制作用相当。因此，该方法表明可以诱导针对特异性(自身)免疫相关的靶抗原的耐受性，而不会同时破坏针对不同抗原(例如病毒)的有益的免疫应答。基于JEG-3细胞呈现的MHC图谱以及上述显示的关于中和抗体的实验，人们可以理解，这些肽特异性作用是通过HLA-G介导的。该实验表明在MHCIb类分子上递呈抗原肽会损害同源CD8⁺T细胞的细胞溶解能力。

实施例4：治疗剂的构建计划：包含抗原肽、基于MHC I类的α1和α2结构域、衍生自HLA-G(或其他MHC Ib类分子)的α3结构域和β2-微球蛋白的可溶性单链构建体

MHC Ib类肽复合体的设计

MHC Ib类分子，例如HLA-G，其天然地由一个复合体中的三个多肽分子组成。如图4所示，这类分子可通过接头连接以提高稳定性。

或者，如图5所示，所有组分都可以线性方式呈现。

具体实施方案中使用的序列如下所列。

编码序列的组分：

前导肽：例如诱导前导肽的分泌(secretion)，如MSRSVALAVLALLSLSGLEA(SEQ IDNo:1)

递呈的肽抗原：任意具有锚定残基的长度为8～12个氨基酸的肽，所述锚定残基使得通过MHC I类α1和α2结构域递呈，例如MLAVFLPIV(STEAP1)(SEQ ID No:2)或SIINFEKL(Ova)(SEQ ID No:3)

接头1(二硫键捕获固定的):GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No:4)或GCGASGGGGSGGGGS(SEQ ID No:5)

源自人类或其他物种的β2微球蛋白

IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM(SEQ ID No:6)

接头2

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No:7)

衍生自人类HLA-G或其他任何适合于递呈所选抗原肽的MHC I类α1&2结构域的α1&2结构域，在DT变体中Y84可以是C

GSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRA(SEQ ID No:8)

例如：鼠类H2Kbα1&2结构域(Y84C)

GPHSLRYFVTAVSRPGLGEPRYMEVGYVDDTEFVRFDSDAENPRYEPRARWMEQEGPEYWERETQKAKGNEQSFRVDLRTLLGCYNQSKGGSHTIQVISGCEVGSDGRLLRGYQQYAYDGCDYIALNEDLKTWTAADMAALITKHKWEQAGEAERLRAYLEGTCVEWLRRYLKNGNATLLRT(SEQ ID No:9)

或者：人类HLA-A2α1&2结构域

GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRT(SEQ ID No:10)

人类HLA-Gα3结构域(或任意MHC Ib类α3结构域，例如HLA-F，其还与ILT2和ILT4受体相互作用，加下划线的氨基酸与ILT2或ILT4的相互作用有关)，例如：

DPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDL(SEQ ID No:11)

Xa因子的限制性位点：IEGRTGTKLGP(SEQ ID No:12)

Myc标签：EQKLISEEDL(SEQ ID No:13)

附加序列：NSAVD

His标签：HHHHHH*(SEQ ID No:14)

成熟全长蛋白质的实施例：

二硫键捕获_Ova_接头1_人β微球蛋白_接头2_H2Kb-A22KH*(SEQ ID No位点_myc&his标签(Disulfide trap_Ova_Linker1_humanbeta2microglobulin_Linker2_H2Kbalpha1&2_HLA-Galpha3_XaSite_myc&hisTAG)

(dtH2KbGova)

SIINFEKLGCGASGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGPHSLRYFVTAVSRPGLGEPRYMEVGYVDDTEFVRFDSDAENPRYEPRARWMEQEGPEYWERETQKAKGNEQSFRVDLRTLLGCYNQSKGGSHTIQVISGCEVGSDGRLLRGYQQYAYDGCDYIALNEDLKTWTAADMAALITKHKWEQAGEAERLRAYLEGTCVEWLRRYLKNGNATLLRTDPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDLIEGRTGTKLGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH*(SEQ ID No:15)

二硫键捕获_STEAP1_接头1_人β2微球蛋白_接头2_HLA-A2α1&2_HLA-Gα3_Xa位点_myc&his标签

(disulfidetrap_STEAP1_Linker1_humanbeta2microglobulin_Linker2_HLA-A2alpha1&2_HLA-Galpha3_XaSite_myc&hisTAG)

(dtGsteap)

MLAVFLPIVGCGASGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGCYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDLIEGRTGTKLGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH*(SEQ ID No:16)

实施例5：结合树突状细胞(DC-10)的可溶性肽-MHC Ib类复合体可选择性地清除识别递呈靶抗原的CD8⁺效应T细胞

材料和方法：为了研究可溶性肽MHC Ib类构建体是否可以以依赖抗原的方式清除效应T细胞，将这些构建体载入存在IL-4，GM-CSF和IL-10(DC-10)的情况下扩增的树突细胞上。通过在DC-10-培养基(完全RPMI1640培养基、10ng/ml IL-4、10ng/ml IL-10、100ng/mlGM-CSF)中培养源自健康供体的每毫升5×10⁶MACS(CD14beans，Miltenyi，德国)的纯化CD14⁺细胞7天来生成DC-10。第3和第5天加入新培养基。获得的DC-10细胞不粘附于细胞培养皿。然后将每毫升4×10⁵DC-10细胞与等量的第5天的CHO细胞(1×10⁶/ml)的培养上清液结合，所述CHO细胞通过脂质粒转染法用pCDNA3.1表达载体瞬时转染4小时，所述pCDNA3.1表达载体用于包含STEAP1肽(dtGsteap，序列参见实施例4)或Melan A/MART-1肽(ELAGIGILTV,dtGmelA)或对照的单链二硫键捕获型(single chain disulfide trapped)HLA-G构建体。然后将DC-10用PBS洗涤3次，并重悬于含5hAB血清+IL-2(106DC-10/ml)的50μl RPMI 1640培养基中。然后将载有5×10⁴肽-MHC Ib类的DC-10细胞与识别STEAP1(CD8st)或PRAME(CD8pr)的HLA-A2限制性抗原特异性CD8⁺T细胞以1:1比例结合16小时。然后根据制造商的说明，将细胞用CellEvent Caspase-3/7Green(5μM，Life Technologies)并对人CD4(克隆EDU-2)和CD8(克隆RPA-T8)特异性的抗体(请参见示例2)进行染色。通过流式细胞术对CD8⁺CD4^-caspase3/7^-细胞进行定量分析。

结果：如图6所示，在两个独立实验中，在16小时内几乎全部清除了与载有递呈所述同源肽的单链MHC Ib类构建体的DC-10细胞结合的STEAP1特异性T细胞。同样的条件并未对对照肽(CD8pr)特异性的T细胞的存活率产生消极影响。包含对照肽(dtGmelA)的构建体仅略微降低了STEAP1特异性CD8⁺T细胞的存活率。这还表明结合特异性肽的可溶性MHC Ib类分子可用于选择性地清除对所递呈的肽具有特异性的效应T细胞，从而选择性地调节对限定抗原的免疫反应。

实施例6：负载肽的MHC Ib类复合体诱导识别递呈肽的人类抗原特异性调节T细胞

在如图7A所示的实验中，从两个独立的健康供体中取出5×10⁶个外周血单核细胞(PBMC)，并在载有Melan-A或STEAP1肽(如上述载入)的1×10⁶经放射处理的JEG-3细胞存在的情况下，于含有5％人类血清型AB血清、5ng/ml TGF-β1、20ng/ml IL-2(Treg培养基)的2ml RPMI1640培养基中共培养14天。在第3天，加入新鲜培养基。在第7天，更换培养基，并将PBMC转移到1×10⁶刚放射处理的并载有肽的JEG-3细胞上。根据制造商的方案，使用Treg扩增珠(Treg Expansion Beads)(Miltenyi Biotec，抗CD3/CD28)作为阳性对照。将所得细胞在冰上用抗人CD4(克隆EDU-2，Immunotools)和CD25(Miltenyi 120-001-311)的抗体以及HLA-A2STEAP1多聚体(dextramers)(STEAP1dex，Immudex Denmark，所有稀释液1:100)染色30分钟。通过流式细胞术定量分析CD4⁺CD25^high Treg细胞中的STEAP1特异性T细胞的发生率(Shevach et al.,2002,Nat.Rev.Immunol.2:389)。当单独培养PBMC(ctrl)或在存在对照肽(melA)的情况下，未检测到STEAP1特异性CD4⁺CD25^high Treg细胞，而当PBMC与递呈所述同源抗原的JEG-3细胞在较低程度阳性对照环境下(aCD3/28)共培养时，重复观测到大量群体。

在如图7B所示的实验中，每孔4×10⁵DC-10细胞加入二硫键捕获型(disulfidetrap)单链HLA-G构建体，所述构建体包含如图6所示的递呈的MELAN-A(dtGmelA)或STEAP1(dtGsteap)肽。然后，加入4×10⁶源自同一供体的PBL，细胞在12孔板2ml Treg培养基中培养7天，第3天更换1ml培养基。在第7天，每孔加入4×10⁵新鲜且相同载入的DC-10，在第10天再次更换培养基。在第14天，收集细胞，洗涤并使用荧光标记的抗CD4(克隆MEM-241)、CD8(克隆RPA-T8)抗体和HLA-A2-Melan A肽多聚体(Immudex)染色。使用胞内染色试剂盒(eBiosciences)对IL-10(克隆JES3-9D7)进行胞内染色。与对照分子(dtGsteap)或未经处理的PBL相比，在将PBL与载有单链MelanA HLA-G分子(dtGmelA)的DC-10共培养的条件下，Melan A特异性IL-10⁺Treg的数量极大地增加了。

实施例7：包含结合DC的人类MHC Ib类α3结构域的单链肽MHC构建体诱导对递呈肽特异性的鼠类Treg细胞(图8)

鼠类DC(mDC)是通过在完全RPMI-1640中培养7天野生型C57BL/6小鼠的骨髓细胞而生成的，在所述完全RPMI-1640中补加入转染了鼠类GM-CSF基因的Ag8653骨髓瘤细胞系的10％GM-CSF上清液(详细方案：Lutz et al.,J Immunol Methods 1999,223(1):77-92)。将在500μl完全RPMI中的4×10⁵mDC与500μl源自模拟转染细胞(CHO)或用编码单链卵清蛋白肽(SIINFEKL)、鼠类H-2Kbα1和2结构域(A2G)和人类HLA-Gα3结构域(H2Kb，序列实施例4dtH2KbGova)或人类HLA-A2α1和2结构域(A2G)的pCDNA3.1载体转染的CHO细胞的“第5天CHO上清液”结合4小时。通过Western印迹法确认上清液中各个构建体的存在。初步结果表明，用纯化的构建体也可能产生诱导。在这里，使用结合构建体的cOmplete His-标记纯化树脂(Sigma Aldrich)纯化负载肽的MHC构建体，然后用PBS洗涤(3次)，用Xa因子蛋白酶消化(1U/100μl，在20℃下6h，Qiagen)以释放所述构建体。然后可使用Xa因子去除树脂去除Xa因子(Qiagen,所有均按照制造商的方案)。序列在实施例4中列出。然后用PBS洗涤mDC。

C57BL/6RAG^-/^-OT1小鼠几乎只表达与H-2Kb递呈的ova肽相互作用的T细胞受体。将这些小鼠的2×10⁶脾细胞在含有(mDC A2G/CHO/H2Kb OT1)或不含(OT1ctrl)4×10⁵如上所述加入的mDC的Treg诱导培养基(完全RPMI，5ng/ml IL-2、5ng/ml TGF-β1)中培养14天。然后将细胞用荧光标记的对鼠类CD3(克隆KT3，Serotec)、Foxp3(3G3，Miltenyi Biotec)和IL10(JES5-16E3)特异性的抗体染色，并通过流式细胞术进行定量分析(参见适用于小鼠的实验方案Hünig et al.,Brain.2008 Sep；131(Pt 9)：2353-65)。在T细胞与MHC Ib类分子的同源肽/MHCα1和2结构域以及免疫抑制的α3结构域结合的条件下，均观察到了抗原特异性Treg的极显著地增加。用纯化构建体的中度诱导可以解释为在纯化过程中蛋白质的损失。

这些实验表明，在MHC Ib类分子上的肽递呈促进同源Treg的扩增。这种Treg将优选地通过其存在抗原的组织中的T细胞受体而被激活，因此，只要有合适的组织特异性抗原，就应该能够靶向组织特异性抑制自身免疫反应。应当指出，由于抗原特异性Treg的旁观者抑制能力，所选择的组织特异性“Treg激活抗原”不必与驱动病理性免疫应答的自身抗原相同。

工业适用性

本发明的组合物、多肽、核酸、细胞、组合和方法可在工业上应用。例如，它们可以用于制造药品或用作药品。

SEQUENCE LISTING

<110> 尤利乌斯·马克西米利安维尔茨堡大学

瓦伦汀·布鲁塔尔

<120> 用于靶向治疗免疫调节的MHC I类分子和肽的组合

<130> P19114536WP

<150> EP 17172444.6

<151> 2017-05-23

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 前导肽

<400> 1

Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Glu Ala

20

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 肽抗原: STEAP1

<400> 2

Met Leu Ala Val Phe Leu Pro Ile Val

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 肽抗原: Ova

<400> 3

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 接头1 (二硫化物阱固定的)

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 接头1 (二硫化物阱固定的)

<400> 5

Gly Cys Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 6

<211> 99

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人类 beta 3 微球蛋白

<400> 6

Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu

1 5 10 15

Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro

20 25 30

Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys

35 40 45

Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu

50 55 60

Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys

65 70 75 80

Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp

85 90 95

Arg Asp Met

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 接头2

<400> 7

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 8

<211> 182

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> [Alpha] 1 & 2 结构域

<400> 8

Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly

1 5 10 15

Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln

20 25 30

Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg

35 40 45

Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr

50 55 60

Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr

65 70 75 80

Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln

85 90 95

Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly

100 105 110

Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu

115 120 125

Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys

130 135 140

Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Glu Met Leu Gln Arg Ala

180

<210> 9

<211> 182

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 鼠类 H2Kb [alpha]1 & 2 结构域 (Y84C)

<400> 9

Gly Pro His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly

1 5 10 15

Leu Gly Glu Pro Arg Tyr Met Glu Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu

20 25 30

Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Tyr Glu Pro Arg

35 40 45

Ala Arg Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Arg Glu Thr

50 55 60

Gln Lys Ala Lys Gly Asn Glu Gln Ser Phe Arg Val Asp Leu Arg Thr

65 70 75 80

Leu Leu Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Ile Gln

85 90 95

Val Ile Ser Gly Cys Glu Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly

100 105 110

Tyr Gln Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Cys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu

115 120 125

Asp Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Leu Ile Thr Lys

130 135 140

His Lys Trp Glu Gln Ala Gly Glu Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Asn Gly Asn

165 170 175

Ala Thr Leu Leu Arg Thr

180

<210> 10

<211> 182

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人类HLA-A2 [alpha]1 & 2 结构域

<400> 10

Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly

1 5 10 15

Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln

20 25 30

Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg

35 40 45

Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr

50 55 60

Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr

65 70 75 80

Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln

85 90 95

Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly

100 105 110

Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu

115 120 125

Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys

130 135 140

His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Glu Thr Leu Gln Arg Thr

180

<210> 11

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HLA-G [alpha]3序列

<400> 11

Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Val Phe Asp Tyr Glu

1 5 10 15

Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Ile

20 25 30

Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Val Glu Leu

35 40 45

Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala

50 55 60

Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln

65 70 75 80

His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp Ser Lys Glu Gly

85 90 95

Asp Gly Gly Ile Met Ser Val Arg Glu Ser Arg Ser Leu Ser Glu Asp

100 105 110

Leu

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Xa因子限制性位点

<400> 12

Ile Glu Gly Arg Thr Gly Thr Lys Leu Gly Pro

1 5 10

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Myc标记

<400> 13

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> His标记

<400> 14

His His His His His His

1 5

<210> 15

<211> 469

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> dtH2Gova

<400> 15

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Gly Cys Gly Ala Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val

20 25 30

Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys

35 40 45

Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys

50 55 60

Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser

65 70 75 80

Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr

85 90 95

Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln

100 105 110

Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro

130 135 140

His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu Gly

145 150 155 160

Glu Pro Arg Tyr Met Glu Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu Phe Val

165 170 175

Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Tyr Glu Pro Arg Ala Arg

180 185 190

Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Arg Glu Thr Gln Lys

195 200 205

Ala Lys Gly Asn Glu Gln Ser Phe Arg Val Asp Leu Arg Thr Leu Leu

210 215 220

Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Ile Gln Val Ile

225 230 235 240

Ser Gly Cys Glu Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Gln

245 250 255

Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Cys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu

260 265 270

Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Leu Ile Thr Lys His Lys

275 280 285

Trp Glu Gln Ala Gly Glu Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly

290 295 300

Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Asn Gly Asn Ala Thr

305 310 315 320

Leu Leu Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Val

325 330 335

Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro

340 345 350

Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln

355 360 365

Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln

370 375 380

Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr

385 390 395 400

Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp

405 410 415

Ser Lys Glu Gly Asp Gly Gly Ile Met Ser Val Arg Glu Ser Arg Ser

420 425 430

Leu Ser Glu Asp Leu Ile Glu Gly Arg Thr Gly Thr Lys Leu Gly Pro

435 440 445

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His

450 455 460

His His His His His

465

<210> 16

<211> 470

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> dtGsteap

<400> 16

Met Leu Ala Val Phe Leu Pro Ile Val Gly Cys Gly Ala Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln

20 25 30

Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn

35 40 45

Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu

50 55 60

Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe

65 70 75 80

Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro

85 90 95

Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser

100 105 110

Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg

145 150 155 160

Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe

165 170 175

Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala

180 185 190

Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg

195 200 205

Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu

210 215 220

Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln Trp

225 230 235 240

Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr

245 250 255

Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp

260 265 270

Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg

275 280 285

Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu

290 295 300

Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro

325 330 335

Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr

340 345 350

Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr

355 360 365

Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe

370 375 380

Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr

385 390 395 400

Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg

405 410 415

Trp Ser Lys Glu Gly Asp Gly Gly Ile Met Ser Val Arg Glu Ser Arg

420 425 430

Ser Leu Ser Glu Asp Leu Ile Glu Gly Arg Thr Gly Thr Lys Leu Gly

435 440 445

Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp

450 455 460

His His His His His His

465 470

<210> 17

<211> 650

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ILT2

<400> 17

Met Thr Pro Ile Leu Thr Val Leu Ile Cys Leu Gly Leu Ser Leu Gly

1 5 10 15

Pro Arg Thr His Val Gln Ala Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp

20 25 30

Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg

35 40 45

Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys

50 55 60

Lys Thr Ala Leu Trp Ile Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys

65 70 75 80

Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr

85 90 95

Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp

100 105 110

Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser

115 120 125

Ala Gln Pro Ser Pro Val Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Ile Leu Gln

130 135 140

Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe Asp Gly Phe Ser Leu Cys Lys Glu Gly

145 150 155 160

Glu Asp Glu His Pro Gln Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly

165 170 175

Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg

180 185 190

Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp

195 200 205

Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Leu Gly Val Ser Lys

210 215 220

Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Ile Val Ala Pro Glu Glu

225 230 235 240

Thr Leu Thr Leu Gln Cys Gly Ser Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Phe Val

245 250 255

Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Arg Asp Phe Leu Gln Leu Ala Gly Ala Gln

260 265 270

Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser

275 280 285

Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser

290 295 300

Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly

305 310 315 320

Gln Phe Tyr Asp Arg Val Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val

325 330 335

Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Gln Gly Trp Met

340 345 350

Gln Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Trp Arg

355 360 365

Leu Arg Ser Thr Tyr Gln Ser Gln Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met

370 375 380

Gly Pro Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser

385 390 395 400

Gln Ser Ser Lys Pro Tyr Leu Leu Thr His Pro Ser Asp Pro Leu Glu

405 410 415

Leu Val Val Ser Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ser Ser Pro Thr Thr Gly

420 425 430

Pro Thr Ser Thr Ser Gly Pro Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly

435 440 445

Ser Asp Pro Gln Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Val Val Ile Gly

450 455 460

Ile Leu Val Ala Val Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe

465 470 475 480

Leu Ile Leu Arg His Arg Arg Gln Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gln

485 490 495

Arg Lys Ala Asp Phe Gln His Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Glu Pro

500 505 510

Thr Asp Arg Gly Leu Gln Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln

515 520 525

Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Val Lys His Thr Gln Pro Glu Asp Gly

530 535 540

Val Glu Met Asp Thr Arg Ser Pro His Asp Glu Asp Pro Gln Ala Val

545 550 555 560

Thr Tyr Ala Glu Val Lys His Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala Ser

565 570 575

Pro Pro Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg Gln

580 585 590

Ala Glu Glu Asp Arg Gln Met Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser Glu Ala

595 600 605

Pro Gln Asp Val Thr Tyr Ala Gln Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg

610 615 620

Glu Ala Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu Gly Pro Ser Pro Ala Val

625 630 635 640

Pro Ser Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His

645 650

<210> 18

<211> 598

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ILT4

<400> 18

Met Thr Pro Ile Val Thr Val Leu Ile Cys Leu Gly Leu Ser Leu Gly

1 5 10 15

Pro Arg Thr His Val Gln Thr Gly Thr Ile Pro Lys Pro Thr Leu Trp

20 25 30

Ala Glu Pro Asp Ser Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Ser

35 40 45

Cys Gln Gly Ser Leu Glu Ala Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys

50 55 60

Lys Ser Ala Ser Trp Ile Thr Arg Ile Arg Pro Glu Leu Val Lys Asn

65 70 75 80

Gly Gln Phe His Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Thr Gly Arg Tyr

85 90 95

Gly Cys Gln Tyr Tyr Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp Pro

100 105 110

Leu Val Leu Val Met Thr Gly Ala Tyr Pro Lys Pro Thr Leu Ser Ala

115 120 125

Gln Pro Ser Pro Val Val Thr Ser Gly Gly Arg Val Thr Leu Gln Cys

130 135 140

Glu Ser Gln Val Ala Phe Gly Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu

145 150 155 160

Glu Glu His Pro Gln Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser

165 170 175

Ser Arg Ala Ile Phe Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Asn Arg Arg Trp

180 185 190

Ser His Arg Cys Tyr Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Val Trp Ser

195 200 205

Ser Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Pro Gly Val Ser Lys Lys

210 215 220

Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Val Val Ala Pro Gly Glu Ser

225 230 235 240

Leu Thr Leu Gln Cys Val Ser Asp Val Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu

245 250 255

Tyr Lys Glu Gly Glu Arg Asp Leu Arg Gln Leu Pro Gly Arg Gln Pro

260 265 270

Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg

275 280 285

Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser

290 295 300

Glu Cys Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gln

305 310 315 320

Ile Arg Gly Thr Pro Phe Ile Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala

325 330 335

Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Trp Arg Gln Phe His

340 345 350

Thr Phe Leu Leu Thr Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg Leu

355 360 365

Arg Ser Ile His Glu Tyr Pro Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser

370 375 380

Pro Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Leu

385 390 395 400

Asn Ser Asp Pro Tyr Leu Leu Ser His Pro Ser Glu Pro Leu Glu Leu

405 410 415

Val Val Ser Gly Pro Ser Met Gly Ser Ser Pro Pro Pro Thr Gly Pro

420 425 430

Ile Ser Thr Pro Ala Gly Pro Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly

435 440 445

Ser Asp Pro Gln Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Val Val Ile Gly

450 455 460

Ile Leu Val Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe

465 470 475 480

Leu Ile Leu Arg His Arg Arg Gln Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gln

485 490 495

Arg Lys Ala Asp Phe Gln His Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Glu Pro

500 505 510

Thr Asp Arg Gly Leu Gln Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln

515 520 525

Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Val Lys Asp Thr Gln Pro Glu Asp Gly

530 535 540

Val Glu Met Asp Thr Arg Ala Ala Ala Ser Glu Ala Pro Gln Asp Val

545 550 555 560

Thr Tyr Ala Gln Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg Lys Ala Thr Glu

565 570 575

Pro Pro Pro Ser Gln Glu Arg Glu Pro Pro Ala Glu Pro Ser Ile Tyr

580 585 590

Ala Thr Leu Ala Ile His

595

Claims (79)

1.一种药物组合物，其包含：

a)人类MHC Ib类分子，或能将肽抗原递呈给T细胞的多肽，其中所述多肽包含人类MHCIb类分子的α3结构域或人类MHC Ib类分子的α3结构域的衍生物，所述衍生物能结合ILT2或ILT4，以及

b)肽抗原，所述肽抗原通过根据a)所述的MHC Ib类分子或多肽被递呈。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述组合物包含根据a)所述的能递呈肽抗原的多肽，所述多肽包含，优选地按照从N端至C端的顺序，MHC Ia类分子的α1和α2结构域，所述MHC Ia类分子后为所述α3结构域或所述衍生物。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述MHC Ib类分子或多肽所包含的所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或与如SEQ IDNo:11所示的α3结构域的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性，优选地至少90％氨基酸序列同一性。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述MHC Ib类分子或多肽所包含的所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列具有至少92％氨基酸序列同一性。

5.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述MHC Ib类分子或多肽所包含的所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列具有至少94％氨基酸序列同一性。

6.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述MHC Ib类分子或多肽所包含的所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列具有至少96％氨基酸序列同一性。

7.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述MHC Ib类分子或多肽所包含的所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列具有至少98％氨基酸序列同一性。

8.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述MHC Ib类分子或多肽所包含的所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列具有至少99％氨基酸序列同一性。

9.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述MHC Ib类分子或多肽所包含的所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同。

10.根据以上任一项权利要求所述的药物组合物，其中根据a)所述的MHC Ib类分子或根据a)所述的能递呈肽抗原的多肽能以小于40μM的亲和力常数K_d结合ILT2或ILT4，所述的亲和力常数K_d通过表面等离子体共振光谱测得。

11.根据以上任一项权利要求所述的药物组合物，其中根据a)所述的MHC Ib类分子或根据a)所述的能递呈肽抗原的多肽能以小于20μM的亲和力常数K_d结合ILT2或ILT4，所述的亲和力常数K_d通过表面等离子体共振光谱测得。

12.根据以上任一项权利要求所述的药物组合物，其中根据a)所述的MHC Ib类分子或根据a)所述的能递呈肽抗原的多肽能以小于10μM的亲和力常数K_d结合ILT2或ILT4，所述的亲和力常数K_d通过表面等离子体共振光谱测得。

13.根据以上任一项权利要求所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含多肽结构域，所述多肽结构域包含如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，优选地与如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列具有至少95％同一性，更优选地与如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列具有至少98％同一性，所述多肽结构域优选地被根据a)所述的能递呈肽抗原的多肽所包含。

14.根据以上任一项权利要求所述的药物组合物，其中根据a)所述的MHC Ib类分子或根据a)所述的能递呈肽抗原的多肽还包含一个或多个接头序列，优选为(GGGGS)n接头序列。

15.根据以上任一项权利要求所述的药物组合物，其中根据a)所述的MHC Ib类分子或根据a)所述的能递呈肽抗原的多肽为二聚体或多聚体。

16.根据以上任一项权利要求所述的药物组合物，其中所述肽抗原的长度为7～11个氨基酸，优选8～10个氨基酸。

17.根据权利要求1和3～16任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含根据a)所述的MHC Ib类分子，所述MHC Ib类分子为HLA-E、HLA-F或HLA-G。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述MHC Ib类分子为HLA-G。

19.根据权利要求17或18所述的药物组合物，其中所述MHC Ib类分子为人类MHC Ib类分子。

20.根据以上任一项权利要求所述的药物组合物，其中根据b)所述的肽抗原与根据a)所述的MHC Ib类分子或多肽共价结合。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中根据b)所述的肽抗原通过肽键与根据a)所述的MHC Ib类分子或多肽共价结合，并且是单条多肽链的一部分。

22.一种能递呈肽抗原的重组多肽，所述重组多肽包含，按照从N端至C端的顺序，

i)肽抗原，所述肽抗原通过所述重组多肽被递呈；

ii)可选地，第一接头序列；

iii)可选地，人类多肽结构域的序列，所述人类多肽结构域的序列包含人类β2微球蛋白的序列，或与如SEQ ID No:6所示的人类β2微球蛋白的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；

iv)可选地，第二接头序列；

v)可选地，MHC分子的α1结构域；

vi)可选地，MHC分子的α2结构域；

vii)MHC Ib类分子的α3结构域或MHC Ib类分子的α3结构域的衍生物，所述衍生物能结合ILT2或ILT4；

viii)可选地，蛋白酶酶切位点，以及

ix)可选地，亲和标记。

23.根据权利要求22所述的重组多肽，其中，

v)所述α1结构域和vi)所述α2结构域来自经典MHC I类分子。

24.根据权利要求22或23所述的重组多肽，其中所述α3结构域或衍生物与如SEQ IDNo:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性，优选地至少90％氨基酸序列同一性。

25.根据权利要求24所述的重组多肽，其中所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列具有至少92％氨基酸序列同一性。

26.根据权利要求24所述的重组多肽，其中所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列具有至少94％氨基酸序列同一性。

27.根据权利要求24所述的重组多肽，其中所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列具有至少96％氨基酸序列同一性。

28.根据权利要求24所述的重组多肽，其中所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列具有至少98％氨基酸序列同一性。

29.根据权利要求24所述的重组多肽，其中所述α3结构域或衍生物与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同，或与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列具有至少99％氨基酸序列同一性。

30.根据权利要求24所述的重组多肽，其中所述α3结构域与如SEQ ID No:11所示的α3结构域的氨基酸序列相同。

31.根据以上任一项权利要求所述的重组多肽，其中所述多肽能以小于40μM的亲和力常数K_d结合ILT2或ILT4，所述的亲和力常数K_d通过表面等离子体共振测得。

32.根据以上任一项权利要求所述的重组多肽，其中所述多肽能以小于20μM的亲和力常数K_d结合ILT2或ILT4，所述的亲和力常数K_d通过表面等离子体共振测得。

33.根据以上任一项权利要求所述的重组多肽，其中所述多肽能以小于10μM的亲和力常数K_d结合ILT2或ILT4，所述的亲和力常数K_d通过表面等离子体共振测得。

34.根据以上任一项权利要求所述的重组多肽，其中所述多肽为二聚体或多聚体。

35.根据以上任一项权利要求所述的重组多肽，其中根据i)所述肽抗原序列的长度为7～11个氨基酸，优选8～10个氨基酸。

36.根据以上任一项权利要求所述的重组多肽，其中所述重组多肽包含i)至vii)所有组成部分，但优选地不包含viii)至ix)组成部分。

37.根据权利要求22～35任一项所述的重组多肽，其中所述重组多肽包含i)至ix)所有组成部分。

38.根据以上任一项权利要求所述的重组多肽，其还包含N端分泌信号肽序列。

39.用于医学用途的根据权利要求1～21任一项所述的药物组合物，或根据权利要求22～38中任一项所述的重组多肽。

40.用于在受试者中肽抗原特异性免疫调节方法的用途的根据权利要求1～21任一项所述的药物组合物，或根据权利要求22～38任一项所述的重组多肽，所述免疫调节对所述药物组合物或重组多肽所包含的肽抗原具有特异性。

41.用于根据权利要求40所述用途的根据权利要求40所述的药物组合物或重组多肽，其中所述免疫调节方法用于诱导对所述药物组合物或重组多肽所包含的肽抗原的免疫耐受。

42.用于根据权利要求40～41任一项所述用途的根据权利要求40～41任一项所述的药物组合物或重组多肽，其中所述免疫调节方法为抑制免疫性自身免疫性疾病，用于抑制过敏反应，用于抑制对生物治疗药物的免疫反应，用于抑制对胚胎抗原的免疫反应，或用于抑制对移植的细胞、组织或器官的免疫反应的方法。

43.用于根据权利要求42所述用途的根据权利要求42所述的药物组合物或重组多肽，其中所述免疫调节方法为诱导免疫耐受的方法，所述自身免疫性疾病影响多个器官，产生激素的器官、神经、关节、皮肤、胃肠系统、眼睛、血液成分或血管。

44.用于根据权利要求41所述用途的根据权利要求41所述的药物组合物或重组多肽，其中所述方法为抑制克罗恩病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症、类风湿性关节炎、牛皮癣、硬皮病、视神经脊髓炎或1型糖尿病的免疫反应的方法。

45.一种编码根据权利要求22～38任一项所述的多肽或根据权利要求1～21任一项所述的多肽或MHC Ib类分子的核酸。

46.根据权利要求45所述的核酸，其中所述核酸为载体。

47.一种包含根据权利要求45或46所述的核酸的药物组合物。

48.一种包含根据权利要求45或46所述的核酸分子或载体的重组宿主细胞。

49.一种生产根据权利要求22～38任一项所述的多肽的方法，所述方法包括在表达所述核酸分子的条件下培养权利要求48的重组宿主细胞，并回收产生的多肽。

50.一种用于在人类受试者中诱导对所述抗原蛋白或肽抗原的免疫反应的方法的用途的，a1)抗原蛋白或肽抗原，或编码所述抗原蛋白或肽抗原的核酸，或包含所述抗原蛋白或肽抗原的减毒生物，或a2)递呈根据a1)所述肽抗原的细胞与b)能够阻断MHC Ib类分子与其受体结合的药剂的组合。

51.根据权利要求50所述用于用途的组合，其中所述药剂能够结合所述人类MHC Ib类分子与/或其受体。

52.根据以上任一项权利要求所述用于用途的组合，其中所述药剂能结合HLA-G。

53.根据权利要求50～52任一项所述用于用途的组合，其中所述药剂为抗体，优选地为能够结合HLA-G的单克隆抗体。

54.根据以上任一项权利要求所述用于用途的组合，其中所述药剂能够结合ILT2或ILT4。

55.根据以上任一项权利要求所述用于用途的组合，其中所述药剂为抗体，优选地为能够结合ILT2或ILT4的单克隆抗体。

56.根据以上任一项权利要求所述用于用途的组合，其中所述药剂包含抗体或其片段的Fc结构域。

57.根据以上任一项权利要求所述用于用途的组合，其中所述药剂包含MHC Ib类分子的α3结构域。

58.根据以上任一项权利要求所述用于用途的组合，其中所述药剂包含ILT2或ILT4受体的一个或多个胞外结构域，优选地至少ILT2或ILT4受体的两个N端胞外结构域，其中所述药剂更优选包含可溶的ILT2或ILT4受体。

59.根据以上任一项权利要求所述用于用途的组合，其中所述药剂在施用所述抗原蛋白或肽抗原或编码所述抗原蛋白或肽抗原的所述核酸或包含所述抗原蛋白或肽抗原的所述减毒生物的同时、之前或之后施用。

60.根据以上任一项权利要求所述用于用途的组合，其中所述组合为a)抗原蛋白或肽抗原和b)能够阻断所述MHC Ib类分子与其受体结合的药剂的组合。

61.根据权利要求50～59任一项所述用于用途的组合，其中所述组合为a)编码抗原蛋白或肽抗原的核酸和b)能够阻断所述MHC Ib类分子与其受体结合的药剂的组合。

62.根据权利要求50～59任一项所述用于用途的组合，其中所述组合为a)包含抗原蛋白或肽抗原的减毒生物和b)能够阻断所述MHC Ib类分子与其受体结合的药剂的组合。

63.根据权利要求62所述用于用途的组合，其中包含所述抗原蛋白或肽抗原的所述减毒生物为减毒病毒。

64.根据权利要求50～62任一项所述用于用途的组合，其中根据a)所述的抗原蛋白或肽抗原为肿瘤抗原或与所述肿瘤抗原具有至少77％同一性的抗原，并且所述抗原能够诱导对所述抗原的交叉保护。

65.根据以上任一项权利要求所述用于用途的组合，其中所述方法为基于T细胞的免疫疗法的方法。

66.根据权利要求50～63和65任一项所述用于用途的组合，其中在病原微生物或病毒中能检测到所述抗原蛋白或肽抗原。

67.根据以上任一项权利要求所述用于用途的组合，其中所述方法为用于治疗或预防传染性或恶性疾病的方法。

68.根据权利要求67所述用于用途的组合，其中所述疾病为癌症，所述肽抗原为肿瘤抗原。

69.根据权利要求68所述用于用途的组合，其中所述癌症选自由黑色素瘤、肾癌、卵巢癌、大肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺导管腺癌、前列腺癌、B和T细胞淋巴瘤和肺癌构成的群组。

70.根据以上任一项权利要求所述用于用途的组合，其中所述组合存在于一药物组合物中。

71.根据以上任一项权利要求所述用于用途的组合，其中对所述抗原蛋白或肽抗原的所述免疫应答对所述抗原蛋白或肽抗原是特异性的。

72.一种用于在人类受试者中治疗癌症的方法的用途的根据权利要求50～62中任一项所述阻断所述MHC Ib类分子和其受体结合的药剂，所述方法包括导致从所述癌症的细胞释放癌抗原的疗法。

73.根据权利要求72所述用于用途的药剂，其中导致癌抗原释放的所述疗法为化学疗法或放射疗法。

74.根据权利要求41所述用于用途的根据权利要求41所述的药物组合物或重组多肽，其中诱导对所述肽抗原免疫耐受的所述方法还包括肽类药物治疗，所述肽抗原1)与所述肽类药物相同或2)为所述肽类药物的片段或3)为所述肽类药物的片段的衍生物，所述肽类药物的片段的衍生物能够诱导对所述肽类药物免疫耐受。

75.根据权利要求41所述用于用途的根据权利要求41所述的药物组合物或重组多肽，其中诱导对肽抗原免疫耐受的所述方法还包括蛋白质类药物治疗，所述肽抗原为1)所述蛋白质类药物的片段或2)所述蛋白质类药物的片段的衍生物，所述肽类药物的片段的衍生物能够诱导对所述蛋白质类药物免疫耐受。

76.根据权利要求74所述用于用途的根据权利要求74所述的药物组合物或重组多肽，其中所述肽类药物以肽类药物本身的形式给药。

77.根据权利要求75所述用于用途的根据权利要求75所述的药物组合物或重组多肽，其中所述蛋白质类药物以蛋白质类药物本身的形式给药。

78.根据权利要求74所述用于用途的根据权利要求74所述的药物组合物或重组多肽，其中所述肽类药物通过基因疗法的方式给药，所述基因疗法为使用编码所述肽类药物的基因的基因疗法。

79.根据权利要求75所述用于用途的根据权利要求75所述的药物组合物或重组多肽，其中所述蛋白质类药物通过基因疗法的方式给药，所述基因疗法为使用编码所述蛋白质类药物的基因的基因疗法。

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