KR20200021475A - 타겟화된 치료학적 면역조절을 위한 mhc 클래스 ib 분자와 펩타이드의 조합 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 지정된 펩타이드와 조합된, MHC 클래스 Ib 분자로도 알려진 비-고전적인 인간 주 조직적합성 복합체 (MHC)의 치료학적 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 비-고전적인 MHC 클래스 Ib 분자의 하나 이상의 도메인을 포함하는 단백질과 조합된, 또는 MHC 클래스 Ib 분자와 이의 수용체의 결합을 간섭하는 분자와 조합된, 지정된 펩타이드의 타겟화된 면역조절 효과에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 단백질의 제조 방법, 이를 포함하는 약학적 조성물뿐 아니라 암 및 감염성 질환을 비롯하여 항원-특이적인 면역 반응이 유익하거나, 또는 자가면역 질환, 장기/조직 거부 반응, 약학적 화합물에 대한 면역 반응 또는 생식 장애를 비롯하여 유해한 의학적인 상태를 치료하기 위한 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항원-특이적인 관용 유도시 MHC 클래스 Ib 분자의 새로운 작용 방식을 밝힌 바, 본 발명은 또한 항원-특이적인 면역 관용의 유도가 요망되나 생리학적으로 상기한 기전에 의해 방지되는 경우에 상기한 기전을 간섭하는 방법에 관한 것이다.

Description

타겟화된 치료학적 면역조절을 위한 MHC 클래스 IB 분자와 펩타이드의 조합
본 발명은 비-고전적인 인간 주 조직적합성 복합체 (MHC) 분자 (MHC 클래스 Ib 분자로 언급됨)와 펩타이드 항원 조합의, 치료학적 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 비-고전적인 MHC 클래스 Ib 분자의 하나 이상의 도메인을 포함하는 단백질과 조합된 또는 MHC 클래스 Ib 분자가 이의 수용체에 결합하는 것을 저해하는 분자와 조합된, 펩타이드 항원에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 단백질의 제조 방법, 이를 포함하는 약학적 조성물뿐 아니라 암 및 감염성 질환을 포함하여 항원-특이적인 면역 반응이 유익하거나, 또는 자가면역 질환, 장기/조직 거부 반응, 약학적 화합물에 대한 면역 반응 또는 생식 장애 등의 유해한 의학적인 상태를 치료하기 위한 용도에 관한 것이다.
주 조직적합성 복합체 (MHC) 항원은 3가지 주요 클래스, 즉 클래스 I 항원 (HLA-A, B, C, E, F, G), 클래스 II 항원 (HLA-DP, HLA-DQ 및 HLA-DR) 및 클래스 III 항원이 알려져 있다. 클래스 I 항원은 통상적인/고전적인 MHC Ia 항원, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C뿐 아니라 비-고전적인 MHC Ib 항원 HLA-E, HLA-F 및 HLA-G를 포함한다. 클래스 I 항원은 3개의 구형 도메인 (globular domain) ([α]1, [α]2 및 [α]3)을 포함한다. MHC I 복합체는 β-2-마이크로글로불린과 [α]1 및 [α]2를 포함하는 펩타이드 결합성 클래프트 (cleft)에 결합되는 제시된 펩타이드를 추가로 포함한다. 즉, 펩타이드-로딩 (loading)된 통상적인 MHC Ia 분자는 펩타이드-특이적인, T 세포 매개성 면역 반응을 개시할 수 있으며, 이는 제시 세포의 세포용해로 이어질 수 있다. 이 기전은, 더 짧거나 또는 긴 펩타이드 (Slingluff, Cancer J. 2011 Sep; 17(5): 343-350), 항원을 코딩하는 핵산 (Restifo et al., Gene Ther. 2000 Jan; 7(2): 89-92), 단백질 또는 종종 약독화된 유기체를 포함할 수 있는 백신화 전략에 핵심이며, 특이 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 개발되거나 또는 임상적으로 사용된다. 항원은 바이러스, 박테리아 또는 종양 관련 항원을 포함할 수 있다.
대부분의 인간 조직에서 발현되는 통상적인 MHC Ia 분자와 달리, HLA-G와 같은 비-고전적인 MHC Ib 항원은 매우 제한적인 조직 발현성을 보인다. 생리학적으로, HLA-G는 정상적인 인간 태반의 융모막외 세포영양막에 의해 높은 수준으로 발현되며, HLA-G는 태아를 모계 면역 시스템으로부터 보호하는 면역조절제로서 기능 (모체에 의한 거부반응이 없음)할 가능성이 높다. 이러한 가설에 맞게, HLA-G 단백질이 증식성 T 림프구 세포 반응, 세포독성 T 림프구 매개 세포용해 및 NK 세포 매개 세포용해와 같은 동종이계 반응을 저해할 수 있는 것으로, 실험을 통해 입증되었다 (Rouas-Freiss N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 5249-5254; Semin Cancer Biol 1999, vol 9, p. 3).
HLA-G의 유전자 서열은 개시되어 있으며 (예, Geraghty et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 9145-9149; Ellis; et al., J. Immunol., 1990, 144, 731-735), 4396 bp를 포함한다. 이 유전자는 다음과 같은 도메인에 각각 대응되는, 엑손 8개, 인트론 7개 및 3' 비-번역 말단으로 구성된다: 엑손 1: 신호 서열, 엑손 2: [α]1 세포외 도메인, 엑손 3: [α]2 세포외 도메인, 엑손 4: [α]3 세포외 도메인, 엑손 5: 막관통 영역, 엑손 6: 세포질 도메인 I, 엑손 7: 세포질 도메인 II (비-번역됨), 엑손 8: 세포질 도메인 III (비-번역됨) 및 3' 비-번역된 영역. HLA-G에 대한 이소형 7종이 동정되었으며, 이중 4종은 막 결합형 (HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3 및 HLA-G4)이고, 3종은 용해형 (HLA-G5, HLA-G6 및 HLA-G7)이다 (예, Carosella et al., Blood 2008, vol. 111, p 4862). 성숙한 HLA-G1 단백질 이소형은 3개의 외부 도메인 (α1-α3), 막관통 영역 및 세포질 도메인을 포함하고, 성숙한 HLA-G5 단백질 이소형은 3개의 외부 도메인 (α1-α3)과 인트론 4에 의해 코딩된 짧은 서열을 포함하지만, 막관통 도메인과 세포내 도메인은 없다. 용해성 HLA-G 이소형들 모두 막관통 도메인과 세포질 도메인이 없으며, 또한 막 결합된 이소형의 절단에 의해 생성될 수 있다.
HLA-G는 Kir2DL4, ILT2 (LILRB1) 및 ILT4 (LILRB2)와 같은 특이 수용체와 펩타이드-독립적인 방식으로 상호작용한다 (Clements et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Mar 1;102(9):3360-5). T 세포에 대한 HLA-G의 가장 우세한 면역억제 효과는 ILT2 및 ILT4에 의해 매개된다. 이들 수용체는 HLA-G에 포함된 [α]-3 도메인과 상호작용하므로, HLA-F와 같은 다른 MHC 클래스 Ib 분자 (Lepin et al., Eur. J. Immunol. 2000. 30: 3552-3561)에서, 대표적인 MHC 클래스 Ib 분자 HLA-G에서 관찰되는 [α]-3 도메인-의존적인 효과 역시 얼터너티브 MHC 클래스 Ib 분자에 의해 유도될 수 있다.
MHC 클래스 Ib 분자는 자신의 [α]1 및 [α]2 도메인을 통해 펩타이드를 제시하는 것으로 또한 알려져 있다. 이러한 펩타이드는 전형적으로 아미노산 8-10개로 구성되며, 특정한 앵커 잔기를 포함한다 (Diehl et al. Curr Biol. 1996 Mar 1;6(3):305-14, Lee et al. Immunity. 1995 Nov;3(5):591-600). 그러나, 본 발명자가 인지하는 한, 인간 MHC 클래스 Ib 분자와 동족 (cognate) T 세포 수용체의 펩타이드-특이적인 상호작용은 아직까지 조사된 바 없다. 마찬가지로, 동물 모델에서 명확한 데이터도 없다. Swanson 등은, 뮤라인 MHC Ib 분자가 펩타이드-특이적인 면역 반응을 유도할 수 있음을 시사하였고 (Swanson et al., An MHC class Ib-restricted CD8 T cell response confers antiviral immunity, JEM 2008), Wang 등은 뮤라인 Qa2 분자에 의한 펩타이드-특이적인 면역 반응의 억제를 언급하였다 (Wang et al., Sci. Rep. 36064, 31. Oct. 2016). 그러나, 인간 MHC Ib 분자와 뮤라인 MHC Ib 분자는 매우 다르다 (Pratheek et al., Indian J Hum Genet. 2014 Apr-Jun; 20(2): 129-141). HLA-G와 Qa-2는, UniProtKB 참조 서열 Q5RJ85 (Q5RJ85_HUMAN) 및 P79568 (P79568_MOUSE)에 대한 proteinblast를 사용해 분석한 바에 따르면, 단 67%의 서열 동일성을 공유하므로, Qa-2로부터 도출된 결론은 매우 조심스럽게 다루어야 하며, 인간 HLA-G에도 적용되는지의 여부는 예측할 수 없다. 기초 과학 및 전임상 연구에서 HLA-G 기능 연구에 적합한 마우스 모델을 정의하기 매우 어렵다는 것이 최근 리뷰 논문에서 개괄적으로 개시된 바 있다 (Nguyen-Lefebvre et al., 2016).
이미 이용가능한 데이터를 기반으로, HLA-G 단백질이 동종이계 또는 이종 장기/조직 이식에서 이식편 거부 반응을 치료하기 위해 사용될 수 있는 것으로, 제안되어 있다. 또한, HLA-G 단백질이 혈액암 (EP1 054 688), 염증성 장애 (EP1 189 627) 및 보다 일반적으로는 면역 관련 질환을 치료하기 위한 용도로 제시되어 있다. 또한, HLA-G는 인간 종양에서 빈번하게 발현되는데 (Carosella et al. Trends Immunol. 2008 Mar;29(3):125-32), 이는 종양 미세환경에서 면역 반응을 비-특이적으로 억제하는 면역억제 면역 체크포인트 분자처럼 기능하는 것으로 생각된다 (Carosella ED et al., Adv Immunol. 2015;127:33-144). 그러나, 이들 연구들 중 어느 것에도 HLA-G에 제시된 펩타이드를 분석한 바 없다. 결론적으로, 제시된 펩타이드가 관찰된 MHC 클래스 Ib 매개 효과를 지시할 수 있는지의 의문은 심지어 생기지도 않았다.
인간 MHC 클래스 Ib 분자를 연구하기 위한 모든 마우스 모델에서 본질적인 한계를 감안하면, 인간 T 세포에 대한 상기한 분자의 효과는, 기전 이해 (mechanistic understanding)를 달성하기 위해 시험관내에서 조사되어야 하며, 이로써 MHC 클래스 Ib-의존적인 기능을 생체내에서 예측할 수 있다. 항원-특이적인 면역 반응 측면에서, 세포독성의 조절과 면역허용성 T 세포가 핵심적이다. 세포독성 CD8+ 작동자 T 세포 (세포독성 T 림프구, CTL) 및 조절성 T 세포 (Treg) 둘다 MHC 분자 상에 제시된 항원성 펩타이드를 검출할 수 있지만, CTL은 이의 동족 항원을 발현하는 세포를 파괴할 수 있는 반면, 조절성 T 세포는 특히 이의 동족 항원이 해당 조직에 의해 제시되었을 때 조직-보호적이다 (Wright et al., 2009 PNAS vol. 106 no. 45, 19078-83). 중요한 점은, 항원-특이적인 조절성 T 세포가 타겟 조직에서 동족 항원에 의해 활성화된다면, 방관자 효과 (bystander effect)를 발휘하고, 다른 항원에 대한 면역 반응을 억제할 수 있다는 것이다. 따라서, CTL은 암 환자에게 유익할 수 있지만 (Gajewski et al., Nat. Immunol. 14, 1014-1022, 2013), 자가면역 질환에는 해롭다. 면역 반응을 억제하는 Treg 세포는 반대 역할을 수행한다. Treg의 불충분한 활성 또는 기능은 마우스에 중증의 자가면역 질환을 야기하며, 이는 또한 인간 자가면역 질환과 연관될 수 있다 (Bluestone et al., J Clin Invest. 2015;125(6):2250-2260). 따라서, 세포독성 T 세포의 저해 (또는 탈-저해) 및 Treg의 유도 (또는 저해) 전략이 필요하다.
현재 임상 실무에서, 병리학적 면역 반응에 의해 유발되는 질환 (예, 자가면역 질환)은 일반적으로 타겟화된 항원과 관계없이 면역 반응을 억제하는 치료제로 치료하는데, 이는 중증의, 종종 용량 제한적인 부작용을 유발할 수 있으며, 기회 감염 위험성을 높일 수 있다. 따라서, 이러한 질환을 치료하기 위한 개선된 수단 및 용도가 요구된다. 이에, 보다 타겟화되고 항원-특이적인 수단에 의해 면역 시스템를 치료학적으로 조절하기 위한 개선된 수단 및 용도가 당해 기술 분야에 요구되고 있다.
역설적으로, 암을 포함하여 특정 항원에 대한 면역 반응이 요망되는 질환을 치료하기 위한 개선된 수단 및 용도도 또한 요구된다. 예를 들어, 암 면역요법에서 개시된 다수의 백신화 방식들이 암에 의해 발생되는 면역억제 기전으로 인해 효과적이지 못한 것으로 입증되었다. 따라서, 암을 비롯한 질환을 치료하기 위한 개선된 수단 및 용도 역시 요구된다.
본 발명자들은, HLA-G와 같은 인간 MHC 클래스 Ib 분자가 제시된 펩타이드 항원에 대한 항원-특이적인 허용성을 유도하는 능력을 가진다는 것을, 놀랍게도 알게 되었다. 이에, MHC 클래스 Ib 분자는, 항원 펩타이드-특이적인 면역 반응을 유도하는 고전적인 인간 MHC 클래스 Ia 분자와 유사한 구조 및 서열을 가짐에도 불구하고, 항원-특이적인 방식으로 면역 반응을 억제하기 위해 본 발명에 따라 유익하게 사용될 수 있다. 지정된 항원에 대한 면역 반응의 항원-의존적인 억제는, 항원-특이적인 세포독성 T 세포를 제거하거나, 또는 각각의 자가항원 또는 자가면역 공격을 받기 쉬운 조직에서 발현된 다른 타겟 항원을 인지하는 항원-특이적인 조절성 T 세포를 유도함으로써 유도될 수 있다. 전술한 바에 따라, 본 발명자들은, 예시적인 인간 MHC 클래스 Ib 분자를 이용해 항원 펩타이드-특이적인 방식으로, 세포독성 작동자 T 세포는 (도 1에서 예시된 바와 같이) 제거하고, 면역허용성 조절성 T 세포는 (도 7에서 예시된 바와 같이) 유도할 수 있음을, 입증하였다. 비-제한적인 구현예에서, 이러한 효과는 특이적인 펩타이드 항원을 막-결합형 또는 용해성 MHC 클래스 Ib 분자와 조합함으로써 달성될 수 있다. 역으로, 항원-특이적인 면역 반응의 유도를 원하는 상황에서는, MHC 클래스 Ib 관련 면역 관용 (immune tolerance)이 깨져야 한다. 본 발명자들은, 이를 인간 MHC Ib 분자가 이의 수용체에 결합하는 것을 차단하는 물질을 통해 달성할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 펩타이드는 MHC 클래스 Ib 분자와 조합하여, 항원-특이적인 또는 조직-특이적인 방식으로 면역 반응을 억제하는데 유익하게 사용할 수 있다. 이의 특이성 결핍은 중증의 용량-제한적인 부작용을 유발하고 기회 감염 위험성을 높이므로, 타겟화된 항원과 무관하게 면역 반응을 억제하는 수많은 통상적인 치료제와 비교해, 상당한 이점을 가진다.
아울러, 본 발명자들은, 본 발명에 따라 면역 반응을 억제하기 위해, 천연적으로 생기는 MHC 클래스 Ib 분자 이외의 분자, 특히 오직 MHC 클래스 Ib 분자의 하나 이상의 도메인, 바람직하게는 MHC 클래스 Ib 분자의 적어도 [α]3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 사용할 수 있다는 것을, 놀랍게도 발견하였다: 도 7 및 8에 예시된 바와 같이, 항원에 의해 제시된 펩타이드에 대한 면역 반응을 억제하기 위해, 가변성 클래스 I 분자의 [α]1 및 [α]2 도메인을 인간 MHC 클래스 Ib 분자의 [α]3 도메인과 생산적으로 조합할 수 있다.
따라서, 본 발명에서, 예를 들어, MHC 클래스 Ib 분자의 면역억제 [α]3 도메인을, 예를 들어, MHC 클래스 I [α] 1 & 2 도메인에 의해 제시된 타겟팅 항원과 조합 사용하는 것이, 많은 자가면역 질환들에서 유익할 것이다.
반대로, 본 발명자들의 새로운 놀라운 발견 사실은, 또한, MHC 클래스 Ib 분자에 의해 유발된 항원-특이적인 면역 반응의 억제가 MHC 클래스 Ib 분자가 이의 수용체에 결합하는 것을 방해하는 물질에 의해 복원될 수 있음을, 의미한다. 따라서, 본 발명에 따르면, (도 2에 예시된 바와 같이) MHC 클래스 Ib 분자 또는 (도 1에 예시된 바와 같이) ILT2 및 ILt4 등의 이의 수용체에 대한 항체와 같이, 상기한 차단 물질은, 특정 항원에 대해 인가된 면역 반응이 바람직한 질환의 치료에 유익하게 사용될 수 있다. 이러한 것으로는, 위, 위장 기질 (gastro-intestinal stromal), 두경부, 신장, 간, 폐, 유방, 자궁, 난소, 경부, 외음부, 질, 요로상피, 고환, 결장 및 장, 췌장, 피부암 및 육종과 같은 암 (예, http://medicalgenome.kribb.re.kr/GENT/search/view_result.php), 및 감염성 질환, 비-제한적인 예로, 파동편모충증 (trypanosomiasis) (예, Gineau et al., Clin Infect Dis. 2016 Nov 1;63(9):1189-1197), 사이토메갈로바이러스 감염 (예, Cosman et al., Immunity. 1997 Aug;7(2):273-82), HTLV-1 감염 (예, Ciliγo Alves et al., J Gen Virol. 2016 Oct;97(10):2742-2752), 간염 C 감염 (예, Ding et al., Med Sci Monit. 2016 Apr 26;22:1398-402) 또는 열대열 말라리아 (malaria falciparum) 감염 (예, Garcia et al., Infect Genet Evol. 2013 Jun;16:263-9) 등이 있다.
선택 항원에 대한 특이적인 면역 반응이 먼저 유도되어야 하는 경우, 당해 기술 분야에서는 전형적으로 펩타이드 또는 단백질 또는 약독화된 병원체 또는 단백질-코딩 DNA 또는 RNA를 포함하는 백신을 사용한다. 그러나, 이러한 백신화는 반응을 유발하거나 또는 심지어 원치않은 허용성을 유발하는데에는 실패할 수 있다 (Slingluff, Cancer J. 2011 Sep; 17(5): 343-350). 종양 세포 (Carosella et al. Trends Immunol. 2008 Mar;29(3):125-32) 및 바이러스 감염 세포 (Rizzo et al, Front Immunol. 2014; 5: 592)는 HLA-G 항원과 같은 MHC 클래스 Ib 분자를 발현하기 때문에, MHC 클래스 Ib 분자 상의 제시가 이러한 실패의 원인일 수 있다. 따라서, 본 발명에서, MHC 클래스 Ib 분자가 이의 수용체에 결합하는 결합성을 특이적으로 차단하는 물질을 이용해, 특이 항원성 단백질 또는 펩타이드를 사용해 펩타이드-특이적인 또는 단백질-특이적인 면역 반응을 유도하는 치료 효능을 높일 수 있다. 이는 외부에서 제공된 백신을 기반으로 하는 테라피를 포함하며, 또한 방사선 요법 또는 화학 요법과 같이, 죽어가는 종양 세포로부터 방출된 항원성 물질이 항원-특이적인 T 세포 반응을 유발할 수 있는 기간의 테라피로 연장될 수 있다 (예, 이러한 테라피에 대해 Zitvogel et al., Nature Reviews Immunology 8, 59-73, January 2008을 참조함). 반대로, 생물제제의 처리에 의해 또는 유전자 테라피에 의해 유발되는 원치않은 백신화 효과는 항-약물 항체의 발생을 방지하기 위해 MHC 클래스 Ib 기반한 구조체의 첨가에 의해 상쇄시킬 수 있다.
이에, 본 발명은 다음과 같은 바람직한 구현예에 관한 것이다:
1. 하기 a) 및 b)를 포함하는 약학적 조성물:
a) 인간 MHC 클래스 Ib 분자, 또는 T 세포에 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 인간 MHC 클래스 Ib 분자의 [α]3 도메인 또는 인간 MHC 클래스 Ib 분자의 [α]3 도메인의 유도체를 포함하고, 상기 유도체는 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는 것인, 인간 MHC 클래스 Ib 분자 또는 T 세포에 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드, 및
b) a)에 따른 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 의해 제시되는, 펩타이드 항원.
2. 제1 항목에 따른 약학적 조성물로서, 상기 조성물이 a)에 따른 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 폴리펩타이드가 바람직하게는 N-말단에서 C-말단 순서로 MHC 클래스 Ia의 [α]1 및 [α]2 도메인을 포함하고, 그 다음으로 [α]3 도메인 또는 상기 유도체가 오는, 약학적 조성물.
3. 제1 또는 제2 항목에 따른 약학적 조성물로서, 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 의해 포함되는 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 약학적 조성물.
4. 제3 항목에 따른 약학적 조성물로서, 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 의해 포함되는 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 92% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 약학적 조성물.
5. 제3 항목에 따른 약학적 조성물로서, 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 의해 포함되는 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 94% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 약학적 조성물.
6. 제3 항목에 따른 약학적 조성물로서, 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 의해 포함되는 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 96% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 약학적 조성물.
7. 제3 항목에 따른 약학적 조성물로서, 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 의해 포함되는 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 98% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 약학적 조성물.
8. 제3 항목에 따른 약학적 조성물로서, 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 의해 포함되는 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 약학적 조성물.
9. 제3 항목에 따른 약학적 조성물로서, 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 의해 포함되는 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일한, 약학적 조성물.
10. 선행 항목들 중 어느 한 항목에 따른 약학적 조성물로서, a)에 따른 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 a)에 따른 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드가 표면 플라스몬 공명 분광학에 의한 측정시 친화성 상수 K d 40 μM 미만으로 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는, 약학적 조성물.
11. 선행 항목들 중 어느 한 항목에 따른 약학적 조성물로서, a)에 따른 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 a)에 따른 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드가 표면 플라스몬 공명 분광학에 의한 측정시 친화성 상수 K d 20 μM 미만으로 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는, 약학적 조성물.
12. 선행 항목들 중 어느 한 항목에 따른 약학적 조성물로서, a)에 따른 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 a)에 따른 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드가 표면 플라스몬 공명 분광학에 의한 측정시 친화성 상수 K d 10 μM 미만으로 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는, 약학적 조성물.
13. 선행 항목들 중 어느 한 항목에 따른 약학적 조성물로서, 상기 약학적 조성물이 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한, 바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한, 더 바람직하게 서열번호 6의 아미노산 서열과 98% 이상 동일한 서열을 포함하는 폴리펩타이드 도메인을 더 포함하고, 상기 폴리펩타이드 도메인이 바람직하게는 a)에 따른 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드에 의해 포함되는, 약학적 조성물.
14. 선행 항목들 중 어느 한 항목에 따른 약학적 조성물로서, a)에 따른 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 a)에 따른 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드가 하나 이상의 링커 서열, 바람직하게는 (GGGGS)n 링커 서열을 더 포함하는, 약학적 조성물.
15. 선행 항목들 중 어느 한 항목에 따른 약학적 조성물로서, a)에 따른 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 a)에 따른 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드가 다이머 또는 멀티머인, 약학적 조성물.
16. 선행 항목들 중 어느 한 항목에 따른 약학적 조성물로서, 상기 펩타이드 항원이 아미노산 7-11개 길이, 바람직하게는 아미노산 8-10개 길이인, 약학적 조성물.
17. 제1 및 제3 내지 제16항 항목들 중 어느 한 항목에 따른 약학적 조성물로서, 상기 조성물이 a)에 따른 MHC 클래스 Ib 분자를 포함하고, 상기 MHC 클래스 Ib 분자가 HLA-E, HLA-F 또는 HLA-G인, 약학적 조성물.
18. 제17 항목에 따른 약학적 조성물로서, 상기 MHC 클래스 Ib 분자가 HLA-G인, 약학적 조성물.
19. 제17 또는 제18 항목에 따른 약학적 조성물로서, 상기 MHC 클래스 Ib 분자가 인간 MHC 클래스 Ib 분자인, 약학적 조성물.
20. 선행 항목들 중 어느 한 항목에 따른 약학적 조성물로서, 상기 b)에 따른 펩타이드 항원이 a)에 따른 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 공유적으로 결합되는, 약학적 조성물.
21. 제20 항목에 따른 약학적 조성물로서, b)에 따른 펩타이드 항원 및 a)에 따른 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드가 펩타이드 결합을 통해 공유적으로 결합되고, 폴리펩타이드 단쇄의 일부인, 약학적 조성물.
22. 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 재조합 폴리펩타이드가, N-말단에서 C-말단 순서로,
i) 상기 재조합 폴리펩타이드에 의해 제시되는 펩타이드 항원;
ii) 선택적으로, 제1 링커 서열;
iii) 선택적으로, 인간 β2 마이크로글로불린 서열을 포함하는 인간 폴리펩타이드 도메인의 서열, 또는 서열번호 6으로 표시되는 인간 β2 마이크로글로불린의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열;
iv) 선택적으로, 제2 링커 서열;
v) 선택적으로, MHC 분자의 [α] 1 도메인;
vi) 선택적으로, MHC 분자의 [α] 2 도메인;
vii) MHC Ib 분자의 [α] 3 도메인 또는 MHC 클래스 Ib 분자의 [α] 3 도메인의 유도체로서, ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는 유도체;
viii) 선택적으로, 프로테아제 절단부; 및
ix) 선택적으로, 친화성 태그
를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
23. 제22 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, v) 상기 [α]1 도메인 및 vi) 상기 [α]2 도메인이 MHC 클래스 Ia 분자로부터 유래되는, 재조합 폴리펩타이드.
24. 제22 또는 제23 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 80% 이상의 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 재조합 폴리펩타이드.
25. 제24 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 92% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 재조합 폴리펩타이드.
26. 제24 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 94% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 재조합 폴리펩타이드.
27. 제24 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 96% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 재조합 폴리펩타이드.
28. 제24 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 98% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 재조합 폴리펩타이드.
29. 제24 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 재조합 폴리펩타이드.
30. 제24 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 [α]3 도메인이 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일한, 재조합 폴리펩타이드.
31. 선행 항목들 중 어느 한 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 표면 플라스몬 공명 분광학에 의한 측정시 친화성 상수 K d 40 μM 미만으로 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는, 재조합 폴리펩타이드.
32. 선행 항목들 중 어느 한 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 표면 플라스몬 공명 분광학에 의한 측정시 친화성 상수 K d 20 μM 미만으로 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는, 재조합 폴리펩타이드.
33. 선행 항목들 중 어느 한 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 표면 플라스몬 공명 분광학에 의한 측정시 친화성 상수 K d 10 μM 미만으로 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는, 재조합 폴리펩타이드.
34. 선행 항목들 중 어느 한 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 다이머 또는 멀티머인, 재조합 폴리펩타이드.
35. 선행 항목들 중 어느 한 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, i)에 따른 상기 펩타이드 항원 서열이 아미노산 7-11개 길이, 바람직하게는 아미노산 8-10개 길이인, 재조합 폴리펩타이드.
36. 선행 항목들 중 어느 한 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 i) 내지 vii)의 구성성분들을 모두 포함하나, 바람직하게는 viii) 내지 ix)의 구성성분을 포함하지 않는, 재조합 폴리펩타이드.
37. 제22 내지 제25 항목들 중 어느 한 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 i) 내지 ix)의 구성성분들 모두 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
38. 선행 항목들 중 어느 한 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, N 말단에 분비 신호 펩타이드 서열을 더 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
39. 제1 내지 제21 항목 중 임의 항목에 따른 약학적 조성물 또는 제22 내지 제38 항목 중 임의 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, 의약제로 사용하기 위한 것인, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
40. 제1 내지 제21 항목 중 임의 항목에 따른 약학적 조성물 또는 제22 내지 제38 항목 중 임의 항목에 따른 재조합 폴리펩타이드로서, 개체에서 펩타이드 항원-특이적인 면역조절 방법에 사용하기 위한 것이고, 상기 면역조절이 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드에 포함된 펩타이드 항원에 특이적인, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
41. 제40 항목에 따른 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 면역조절 방법이 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드에 포함된 펩타이드 항원에 대한 면역 관용을 유발하기 위한 것인, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
42. 제40 또는 제41항목에 따른 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 면역조절 방법이 자가면역 질환의 억제 방법, 알레르기 억제 방법, 생물치료 약물에 대한 면역 반응 억제 방법, 배아 항원 (embryonic antigen)에 대한 면역 반응 억제 방법 또는 이식된 세포, 조직 또는 장기에 대한 면역 반응 억제 방법인, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
43. 제42 항목에 따른 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 면역조절 방법이 면역 관용을 유도하는 방법이고, 상기 자가면역 질환이 복수의 장기, 호르몬 생산 장기, 신경, 관절, 피부, 위장 시스템, 눈, 혈액 성분 또는 혈관에 발생하는 것인, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
44. 제41 항목에 따른 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 방법이 크론병, 궤양성 대장염, 전신성 홍반성 루프스 (SLE), 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선, 경피증, 시신경 척수염 또는 1형 당뇨병에서 면역 반응을 억제하기 위한 방법인, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
45. 제22 내지 제38 항목 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드 또는 제1 내지 제21 항목 중 어느 하나에 따른 MHC 클래스 Ib 분자를 코딩하는 핵산.
46. 제45 항목에 따른 핵산으로서, 상기 핵산이 벡터인, 핵산.
47. 제45 또는 제46 항목에 따른 핵산을 포함하는 약학적 조성물.
48. 제45 또는 제46 항목에 따른 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
49. 제22 내지 38 항목 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서, 제48 항목에 따른 재조합 숙주 세포를 핵산 분자의 발현을 허용하는 조건에서 배양하고, 생산된 폴리펩타이드를 회수하는 것을 포함하는, 방법.
50. 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원에 대한 면역 반응을 인간 개체에서 유도하는 방법에 사용하기 위한 조합물로서,
a1) 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원, 또는 상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원을 코딩하는 핵산, 또는 상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원를 포함하는 약독화된 유기체, 또는 a2) a1)에 따른 펩타이드 항원을 제시하는 세포; 및
b) MHC 클래스 Ib 분자와 이의 수용체 간의 결합을 차단할 수 있는 물질을 포함하는, 조합물.
51. 제50 항목에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 물질이 상기 인간 MHC 클래스 Ib 분자 및/또는 이의 수용체에 결합할 수 있는, 조합물.
52. 선행 항목 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 물질이 HLA-G에 결합할 수 있는, 조합물.
53. 제50 내지 제52 항목 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 물질이 HLA-G에 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는 단일클론 항체인, 조합물.
54. 선행 항목들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 물질이 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는, 조합물.
55. 선행 항목들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 물질이 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는 단일클론 항체인, 조합물.
56. 선행 항목들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 물질이 항체의 Fc 도메인 또는 이의 단편을 포함하는, 조합물.
57. 선행 항목들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 물질이 MHC 클래스 Ib 분자의 [α]3 도메인을 포함하는, 조합물.
58. 선행 항목들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 물질이 ILT2 또는 ILT4 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인, 바람직하게는 ILT2 또는 ILT4 수용체의 2 이상의 N-말단 세포외 도메인을 포함하고, 상기 물질이 용해성 ILT2 또는 ILT4 수용체를 더 포함하는, 조합물.
59. 선행 항목들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 물질이, 상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원 또는 상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원을 코딩하는 상기 핵산 또는 상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원을 포함하는 상기 약독화된 유기체의 투여와 동시에, 투여 전 또는 투여 후, 투여되는, 조합물.
60. 선행 항목들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 조합물이 a) 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원; 및 b) MHC 클래스 Ib 분자와 이의 수용체 간의 결합을 차단할 수 있는 물질의 조합인, 조합물.
61. 제50 내지 제59 항목 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 조합물이 a) 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원을 코딩하는 핵산; 및 b) MHC 클래스 Ib 분자와 이의 수용체 간의 결합을 차단할 수 있는 물질의 조합인, 조합물.
62. 제50 내지 제59 항목 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 조합물이 a) 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원을 포함하는 약독화된 유기체; 및 b) MHC 클래스 Ib 분자와 이의 수용체 간의 결합을 차단할 수 있는 물질의 조합인, 조합물.
63. 제62 항목에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원을 포함하는 약독화된 유기체가 약독화된 바이러스인, 조합물.
64. 제50 내지 제62 항목 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, a)에 따른 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원이 종양 항원 또는 상기 항원에 대해 교차-예방을 유도할 수 있는 종양 항원과 77% 이상 동일한 항원인, 조합물.
65. 선행 항목들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 방법이 T 세포 기반의 면역요법을 위한 방법인, 조합물.
66. 제50 내지 제63 및 제65 항목 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원이 병원성 미생물 또는 바이러스에서 검출가능한, 조합물.
67. 선행 항목들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 방법이 감염성 질환 또는 악성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법인, 조합물.
68. 제67 항목에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 질환이 암이고, 상기 펩타이드 항원이 종양 항원인, 조합물.
69. 제68 항목에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 암이 흑색종, 신장암, 난소 암종, 결장직장암, 유방암, 위암, 췌관 선암종, 전립선암, B 및 T 세포 림프종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조합물.
70. 선행 항목들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 조합물이 하나의 약학적 조성물에 존재하는, 조합물.
71. 선행 항목들 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 조합물로서, 상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원에 대한 면역 반응이 상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원에 특이적인, 조합물.
72. 인간 개체에서 암 치료 방법에 사용하기 위한, 제50 내지 제62 항목 중 어느 하나에 따라 정의되는 MHC 클래스 Ib 분자와 이의 수용체 간의 결합을 차단할 수 있는 물질로서, 상기 방법이 암의 세포로부터 암 항원의 방출을 유발할 수 있는 테라피를 포함하는, 물질.
73. 제72 항목에 따라 사용하기 위한 물질로서, 상기 암 항원의 방출을 유발할 수 있는 테라피가 화학요법 또는 방사선요법인, 물질.
74. 제41 항목에 따른 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드로서, 펩타이드 항원에 대한 면역 관용을 유도하는 방법이 펩타이드 약물 치료를 더 포함하고, 상기 펩타이드 항원이 1) 펩타이드 약물과 동일하거나, 또는 2) 상기 펩타이드 약물의 단편이거나, 또는 3) 상기 펩타이드 약물에 대해 면역 관용을 유도할 수 있는 상기 펩타이드 약물의 단편의 유도체인, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
75. 제41 항목에 따른 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드로서, 펩타이드 항원에 대한 면역 관용을 유도하는 방법이 단백질 약물 치료를 더 포함하고, 펩타이드 항원이 1) 단백질 약물의 단편이거나 또는 2) 상기 단백질 약물에 대해 면역 관용을 유도할 수 있는 상기 단백질 약물의 단편의 유도체인, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
76. 제74 항목에 따른 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 펩타이드 약물이 펩타이드 약물 자체의 형태로 투여되는, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
77. 제75 항목에 따른 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 단백질 약물이 단백질 약물 자체의 형태로 투여되는, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
78. 제74 항목에 따른 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 펩타이드 약물이 유전자 테라피에 의해 투여되고, 상기 유전자 테라피가 상기 펩타이드 약물을 코딩하는 유전자를 이용한 유전자 테라피인, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
79. 제75 항목에 따른 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 단백질 약물이 유전자 테라피에 의해 투여되고, 상기 유전자 테라피가 상기 단백질 약물을 코딩하는 유전자를 이용한 유전자 테라피인, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
본 발명은 임의의 포유류 개체, 바람직하게는 인간 개체에 사용될 수 있다.
바람직하게는, 면역-자극성 T 세포-특이 치료와 MHC 클래스 Ib 또는 ILT2/4에 대한 차단제로 된 전술한 조합이 사용될 적응증은, 상승된 수준의 HLA-G 또는 기타 MHC 클래스 Ib 분자를 중합효소 연쇄 반응, ELISA, 웨스턴 블롯팅, 면역형광, 면역조직화학 및 기타 방법 등의 방법에 의해 종양 유출물, 혈액 샘플, 생검 또는 악성 세포 또는 비-악성 세포의 그외 수단 (Paul et al., Hum Immunol. 2000 Nov;61(11):1177-95)에서 검출가능한, 바이러스 감염 및 종양을 포함한다. HLA-G는 다수 조직들에서 발현되진 않지만, 심지어 적은 양으로도 매우 강력하기 때문에, HLA-G 결핍 조직에서 검출가능한 수준의 발현 또는 기저 HLA-G 발현을 나타내는 조직에서 생리학적 수준 대비 50% 증가는 본 발명에 따른 바람직한 증가된 수준으로 간주된다.
도 1: 지정된 펩타이드가 로딩된 MHC Ib 분자를 발현하는 세포는 제시된 펩타이드에 특이적인 CTL을 선택적으로 제거한다
A, B) 모델 항원 STEAP1 (CD8st)을 인지하는 HLA-A2 제한된 (restricted) CD8+ 작동자 T 세포는, 비-고전적인 MHC 클래스 Ib 분자 HLA-G를 다량 발현하는 반면 고전적인 MHC 클래스 Ia 분자는 거의 검출할 수 없는 종양 세포주 JEG-3에, 이의 동족 펩타이드가 제시되었을 때, 선택적으로 제거될 수 있다. STEAP1은 일반적으로 본원에서 "STEAP", "steap" 또는 약어로 "st"로도 언급됨에 유념한다. 이들 용어는 동의어로 사용되며, 상호 호환적이다. 항원 PRAME (CD8pr)에 특이적인 공동-배양된 CD8+ 작동자 T 세포는 영향을 받지 않는다. (C) STEAP1-특이적인 T 세포에 대한 동족 펩타이드의 로딩에도 불구하고, HLA-G 발현성 JEG-3 종양 세포는 이러한 과정에서 제거되지 않는다. 종양 또는 감염된 세포에 의해 발현된 MHC Ib 분자는 이들 세포를 정상적으로 펩타이드-기반의 백신화 전략의 주 작동자인 항원-특이적인 T 세포에 의한 타겟팅에 내성이 되도록 만들 수 있는 것으로 보인다. (D) STEAP1-특이적인 T 세포에서, HLA-G 상에 제시된 STEAP1 펩타이드에 의한 세포자살 유도는, T 세포 상에 발현된 HLA-G 상호작용 파트너에 대한 중화 항체에 의해 상당히 약화될 수 있다.
도 2: 지정된 펩타이드가 로딩된 MHC Ib 분자는 항원에서 HLA -G 의존적인 방식으로 동족 CTL의 세포독성 잠재성을 손상시킨다.
STEAP1에 특이적인 HLA-A2-제한된 T 세포 클론 또는 각각 PRAME를 혼합하였으며, 대조군 (+) 또는 STEAP1-펩타이드 로딩된 (st) JEG-3 세포로 전처리하였다. 항-인간 HLA-G 중화 항체 (클론 87G)를 지정된 곳에 10 ㎍/ml으로 첨가하였다. 16시간 후, 루시퍼라제-발현성 나이브 (회색 막대) 또는 STEAP1-펩타이드 로딩된 (검정색 막대) HLA-A2+ UACC-257 흑색종 세포에 대한 STEAP1 특이적인 T 세포의 세포독성 잠재성을 2:1 비율로 테스트하였다. 8시간 후, D-루시퍼라제를 첨가하였으며, 타겟 세포의 생존율을 생체광자 생존성 분석 (biophotonic viability assay)을 이용하여 루미노미터에서 측정하였다 (Brown et al., J Immunol Methods. 2005 Feb;297(1-2):39-52.). HLA-G 발현성 JEG-3 세포는, STEAP1-특이적인 CTL의 세포용해 가능성이, STEAP1 펩타이드 로딩시 90% 이상으로 감소되었지만, 나이브 JEG-3 세포의 경우에는 유의한 저해를 나타나지 않았다. 이 효과는 부분적인 중화성 HLA-G 항체의 존재에 의해 상당히 약화될 수 있지만, 펩타이드-로딩된 HLA-G를 사용해 선택 항원에 대한 T 세포 매개의 면역 반응을 억제할 수 있는 것으로 결론내릴 수 있다. 본 발명에 따르면, 이런 효과는 추가적인 MHC 클래스 Ib 분자로까지 연장될 수 있다. 반대로, 본 발명에 따른 항원-특이적인 T 세포 매개의 면역 반응의 유도는 MHC Ib를 차단하는 물질에 의해 달성될 수 있다.
도 3: 지정된 펩타이드와 조합된 MHC Ib 분자는 동족 CTL을 저해하지만, 다른 항원에 대한 면역 반응은 거의 영향없이 유지된다.
STEAP1에 특이적인 HLA-A2-제한된 T 세포 클론 또는 각각 HLA-A2-STEAP1 및 HLA-A2-PRAME에 특이적인 PRAME T 세포 클론을 혼합하고, 처리하지 않고 두거나 (대조군) 또는 대조군 (JEG-3) 또는 STEAP1-펩타이드 로딩된 (JEG-3st) JEG-3 세포로 전처리하였다. 8시간 후, 루시퍼라제-발현성 PRAME-펩타이드 (진회색 막대) 또는 STEAP1-펩타이드 로딩된 (연회색 막대) 루시퍼라제 발현성 HLA-A2+ UACC-257 흑색종 세포에 대한 양쪽 T 세포 클론의 펩타이드-특이적인 세포독성 잠재성을 1:1 비율에서 테스트하였다. STEAP1-펩타이드 로딩된 JEG-3 세포로 전처리시, STEAP1 펩타이드 특이적인 T 세포 매개 면역 반응이 약 50%까지 억제되었지만, PRAME 특이적인 면역 반응은 나이브 또는 STEAP1-펩타이드 로딩된 JEG-3 세포에 의해 거의 변화없이 유지되었다.
도 4: 치료학적 항원-특이적인 면역조절을 달성하는데 적합한 펩타이드 - 로딩된 용해성 MHC Ib 분자의 도시.
제시된 펩타이드 항원은 점상 구형으로 묘사되고, HLA-G α1-3 도메인은 연회색으로 묘사되고, β2마이크로글로불린 도메인은 진회색으로 표시된다. 항원성 펩타이드를 β2마이크로글로불린 분자와 연결하는 최적의 링커는 회색 스틱 스타일로 묘사되고, 선택적인 다이설파이드 트랩은 검정색 구로 묘사된다. 이 도면은 Pymol을 사용해 작성하였으며, Clements et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Mar 1;102(9):3360-5 및 Hansen et al., Trends Immunol. 2010 Oct;31(10):363-9에 공개된 구조에서 수정하였다.
도 5: 치료학적 펩타이드 -특이적인 면역조절에 적합한 단쇄 MHC Ib 분자를 코딩하는 벡터-기반의 구조체의 예.
HLA-G1 및 HLA-G5는 각각 [α] 도메인 3개 (검정색), 비-공유적으로 결합된 β2마이크로글로불린 서브유닛 (진회색) 및 HLA-G에 제시된 항원성 펩타이드 (짧은 검정색 화살표)로 구성된다. HLA-G1은 막관통 도메인과 짧은 세포내 체인을 추가로 포함한다 (도시 안됨). 본원에 나타낸 바와 같이, [α]-3 도메인은 면역 세포 상의 수용체 ILT2 (Shiroishi et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 July 22;100(15):8856-8861) 및 ILT4 (Shiroishi et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Oct 31;103(44):16412-7)에 결합할 수 있다. 생리학적으로, 이들 서열은 비-공유적으로 결합된 MHC 클래스 I 클래스를 형성한다. 복합체 MHC Ib 분자의 정제를 단순화하기 위해, 단백질 태그 2개 (myc 및 His(6x))를 Factor Xa 절단을 통해 이후 제거가능한 방식으로 도입하였다. 또한, 안정성을 높이기 위해 항원성 펩타이드, β 2-마이크로글로불린 및 MHC Ib [α] 체인을 연결하였다. 벡터 지도를 Snapgene Viewer 소프트웨어를 사용해 작성하였다.
도 6: 수지상 세포 (DC- 10)와 조합된 용해성 펩타이드 HLA -G/ 펩타이드 - MHC Ib 복합체는 제시된 타겟 항원을 인지하는 CD8 + 작동자 T 세포를 선택적으로 제거할 수 있다.
용해성 펩타이드 MHC Ib 구조체를 포함하는 세포 배양물 상층액을 4시간 첨가하기 전에, GM-CSF, IL4 및 IL10 (DC-10)의 존재 하에 단핵 세포로부터 수지상 세포를 구축하였다. 제시된 Melan-A/MART1 (dtGmelA) 또는 STEAP1 (dtGsteap) 펩타이드를 포함하는 다이설파이드-트랩 안정화된 단쇄 HLA-G5 구조체를 사용하였다. 이들 구조체가 DC-10 세포에 결합함은 이전에 검증된 바 있다. 로딩된 DC-10 세포를 헹구고, 대조군 CTL (PRAME 특이적, CD8pr) 또는 타겟 CTL (STEAP1 특이적, CD8st)과 1:1 비율로 48시간 동안 공동 배양하였다. 이 데이터는, 용해성 MHC Ib-펩타이드 구조체가 로딩된 수지상 세포는 동족 T 세포 클론을 거의 완전히 고갈시킬 수 있지만, 비-동족 CTL은 영향을 받지 않는다는 것을, 시사해준다.
도 7: 펩타이드 -로딩된 MHC Ib 복합체는 제시된 펩타이드를 인지하는 인간 항원-특이적인 조절성 T 세포를 유도한다.
A) 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 다양한 건강한 공여자로부터 채혈하고, Melan-A/MART1 (MART1) 또는 STEAP1 (STEAP) 펩타이드가 로딩된 방사선 처리된 JEG-3 세포와 함께, 5% hAB 혈청, 5 ng/ml TGF８1, 20 ng/ml IL2 (Treg medium)가 첨가된 RPMI1640 배지에서 14일간 공동 배양하였다. 7일째에, PBMC를 신선한 배지로 옮기고, 방사선 처리된 펩타이드-로딩된 JEG-3 세포를 다시 첨가하였다. Miltenyi Biotec 사의 Treg expansion 비드 (antiCD3, antiCD28 및 antiCD2)를 양성 대조군으로 사용하였다. 수득된 세포를 인간 CD4 및 CD25에 대한 항체, HLA-A2 STEAP1 펩타이드 dextramer (STEAP1 dex)로 염색하고, 유세포 측정에 의해 분석하였다. STEAP1-로딩된 JEG-3 세포를 제시하였을 때, CD4+CD25high Treg 집단에서 STEAP1 특이적인 세포의 유의한 농화가 관찰되었다.
B) 도 6에 기술된 바와 같이 Melan-A (dtGmelA) 또는 STEAP1 (dtGsteap) 펩타이드를 제시하는 다이설파이드 트랩 단쇄 HLA-G 구조체로 DC-10 세포를 4x105 세포/웰로 로딩하였다. 그런 후, 동일한 공여자의 4x106 PBL을 첨가하여, 세포를 7일간 Treg 매질에서 배양하였다. 이후, 동일하게 로딩된 DC-10 4x105개를 각 웰에 첨가하였다. 총 14일 후, Melan A 특이적인 IL-10 생산성 Treg 세포를 유세포 측정으로 정량하였다. Melan A 특이적인 Treg의 수는, PBL을 단쇄 Melan A HLA-G가 로딩된 DC-10와 공동 배양하는 조건에서, 대조군 분자 (STEAP1) 또는 비처리된 PBL과 비교해 크게 증가하였다.
도 8: DC와 조합하여 인간 MHC Ib alpha3 도메인을 포함하는 단쇄 펩타이드 MHC 구조체는 제시된 펩타이드에 특이적인 뮤라인 Treg 세포를 유도한다.
뮤라인 GM-CSF 유전자로 형질감염된 Ag8653 골수종 세포의 상층액과 10% GM-CSF가 첨가된 RPMI-1640 완전 배지에서, 7일간 골수 유래 세포를 배양하여, 뮤라인 DC (mDC)를 구축하였다. mDC에, 뮤라인 H-2Kb alpha 1 및 2 도메인 (H2Kb)에 의해 제시된 오발부민 펩타이드 + 인간 HLA-G alpha3 도메인을 함유한 단쇄 펩타이드 MHC 분자를 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 CHO 세포의 상층액 또는 대조군 CHO 상층액 (CHO/ctrl)을, 로딩하였다. 뮤라인 H-2Kb alpha 1 및 2 도메인 대신, 인간 HLA-A2 alpha 1 및 2 도메인 (A2G)을 포함하는 비슷한 구조체를 대조군으로 포함시켰다. 구조체의 발현은 상층액에 대한 웨스턴 블롯팅으로 검증하였다. A & B: H-2Kb 제시된 OVA 펩타이드 (SIINFEKL)를 인지하는 형질전환성 T 세포 수용체만 발현하는 OT1 마우스 유래 비장세포를 Treg-허용성 배지 (permissive medium) (RPMI 완전 배지, 5 ng/ml IL-2, 5 ng/ml TGF-베타1)에서 로딩된 mDC와 2.5:1 비율로 14일간 배양하였다.
정의 및 일반 기법
하기에서 달리 정의되지 않은 한, 본원에 사용된 용어들은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 일반적인 의미로 이해될 것이다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적으로 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 MHC 분자를 포함하여 본 발명에 따른 모든 단백질은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 이러한 방법은 재조합 단백질 제조 방법을 포함한다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 MHC 분자를 포함하여 본 발명에 따른 모든 단백질은 선택적으로 분비 신호 펩타이드 서열을 포함하는 것으로 의도되는 것으로 이해될 것이다. 마찬가지로, 본 발명에 따른 단백질은, 선택적으로, 예를 들어, 정제를 용이하게 하기 위해 친화성 태그와, 예를 들어 프로테아제 절단에 의한 태그의 제거를 용이하게 하기 위해 태그와 단백질 사이에 선택적인 프로테아제 절단부를 포함하는 것으로 의도된다.
마찬가지로, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 MHC 분자를 포함하여 본 발명에 따른 단백질은 각각의 프로-펩타이드 (pro-peptide)를 포괄하는 것으로 이해될 것이다.
또한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 MHC 분자는 이의 용해성 형태 또는 이의 막-결합형 형태일 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본 발명에서, MHC 분자는 바람직하게는 인간 MHC 분자이다.
본 발명에 따라 사용되는 MHC 분자, 본 발명의 폴리펩타이드 및 본 발명에 따른 항체를 포함하여, 본 발명의 단백질 및 폴리펩타이드는 바람직하게는 단리된 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 MHC 분자, 본 발명의 폴리펩타이드 및 본 발명에 따른 항체를 포함하여, 본 발명의 단백질 및 폴리펩타이드는 바람직하게는 재조합된 것이다.
본 발명에 따른 펩타이드 항원에 결합하여 이를 제시할 수 있는 폴리펩타이드의 제조 방법은 이해될 것이다. 예를 들어, [α]1 및 [α]2 도메인과 같은 펩타이드 항원-결합성 도메인들이 잘 알려져 있으며, 이들 도메인에 대한 변형을 만들 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 MHC 분자에 펩타이드 항원이 결합하는 능력은, 비-제한적으로, MHC 펩타이드 용출 및 후속적인 질량 분광분석 및 인 실리코 생물정보 예측과 같은 탐구적 방법, 및 MHC 펩타이드 멀티머 결합 방법 및 자극 분석과 같은 검증 방법을 포함하여, 당해 기술 분야에 공지된 기법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 사용되는 펩타이드 항원과 관련하여, 본원에 언급된 이들 펩타이드 항원의 임의 길이 (예, "아미노산 7-11개 길이")는 펩타이드 항원 자체의 길이를 의미한다. 즉, 본원에 언급된 펩타이드 항원의 길이는 가능한 링커 서열 등으로부터 유래된 부가적인 아미노산과 같이 펩타이드 항원 파트가 아닌 부가적인 아미노산에 의해 부가된 길이는 포함하지 않는다.
본원에서, 용어 "자가면역 질환"은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 일반적인 의미에 따라 사용되며, 특별한 자가면역 질환으로 한정되지 않는다. 본 발명의 모든 구현예에서, 자가면역 질환은 바람직하게는 펩타이드 자기 항원에 대해 자가면역 반응을 수반하는 자가면역 질환이다.
본 발명에서, 용어 "포함하는"은 각각 용어 "로 구성되는"으로 선택적으로 대체될 수 있다.
방법 및 기법
일반적으로, 본원에서 달리 정의되지 않은 한, 본 발명에 사용되는 방법 (예, 클로닝 방법 또는 항체 관련 방법)은 당해 기술 분야에 공지된 절차, 예를 들어, Sambrook et al. ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual.", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989), Ausubel et al. ("Current Protocols in Molecular Biology." Greene Publishing Associates and Wiley Interscience; New York 1992), 및 Harlow and Lane ("Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1988)에 기술된 절차에 따라 수행되며, 이들 문헌들 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
항체가 이의 해당 타겟 단백질에 결합하는 것과 같은 단백질-단백질 결합은 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 평가할 수 있다. 항체가 이의 해당 타겟 단백질에 결합하는 것과 같은 단백질-단백질 결합은 바람직하게는 표면 플라스몬 공명 분광 (plasmon resonance spectroscopy) 측정에 의해 평가한다.
예를 들어, 본 발명에 따른 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드의, ILT2 및 ILT4 등의 이의 수용체에 대한 결합은, 바람직하게는 표면 플라스몬 공명 분광 측정에 의해 평가한다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드의 이의 수용체에 대한 결합은 25℃에서 표면 플라스몬 공명 측정에 의해 평가한다. 이러한 표면 플라스몬 공명 측정에 적절한 조건은 Shiroishi et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 July 22;100(15):8856-8861에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 서열들의 서열 정렬은 BLAST 알고리즘을 사용해 수행된다 (Altschul et al.(1990) "Basic local alignment search tool." Journal of Molecular Biology 215. p. 403-410.; Altschul et al.: (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 참조). 본 발명에 따른 펩타이드 항원에 적합한, BLAST 알고리즘에 의한 짧은 펩타이드의 서열 정렬에 적절한 파라미터는, 당해 기술 분야에 공지되어 있다. BLAST 알고리즘을 사용하는 대부분의 소프트웨어 툴들은 짧은 입력 서열에 대해 서열 정렬 파라미터를 자동 설정한다. 일 구현예에서, 다음과 같은 파라미터가 사용된다: 최대 타겟 서열 10; 문자 크기 3; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 코스트: 이그지스턴스 (existence) 11, 연장 (extension) 1; 조건부 구성 점수 행렬 조정 (conditional compositional score matrix adjustment). 따라서, 서열과 관련하여 사용되는 경우, "동일성" 또는 "동일한"과 같은 용어들은 바람직하게는 BLAST 알고리즘을 사용해 수득되는 동일성 값을 의미한다.
본 발명의 조성물의 제조
본 발명에 따른 조성물은 약학적 조성물를 제조하는 공지된 표준 방법에 따라 제조된다.
예를 들어, 조성물은, 예를 들어, 담체, 부형제 및/또는 안정화제와 같은 약제학적으로 허용가능한 성분을 이용함으로써 적절하게 보관 및 투여될 수 있는 방식으로, 제조된다.
상기한 약제학적으로 허용가능한 성분은, 약학적 조성물을 환자에게 투여하였을 때 사용되는 양에서는 유해하지 않다. 약학적 조성물에 첨가되는 약제학적으로 허용가능한 성분은 조성물에 존재하는 활성 성분의 화학적 특성, 약학적 조성물의 구체적인 사용 용도 및 투여 경로에 따라 결정될 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 따라 사용되는 약제학적으로 허용가능한 성분은 당해 기술 분야에서 이용가능한 지식에 따라, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro, 20th edition, 2000, Williams & Wilkins, PA, USA에 따라 사용된다.
본 발명에 따른 펩타이드 항원
전술한 펩타이드 항원을 포함하여, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 펩타이드 항원은, MHC 분자 상에 제시될 수 있는 능력 이외의 다른 측면에서는 특별히 제한되지 않는다. MHC 분자 상에 제시될 수 있는 펩타이드는 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 제조할 수 있다 (예, Rammensee, Bachmann, Emmerich, Bachor, Stevanovic. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999 Nov;50(3-4):213-9; Pearson et al. MHC class I-associated peptides derive from selective regions of the human genome. J Clin Invest. 2016 Dec 1;126(12):4690-4701; 및 Rock, Reits, Neefjes. Present Yourself! By MHC class I and MHC class II Molecules. Trends Immunol. 2016 Nov;37(11):724-737).
펩타이드 항원은 일반적으로 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 펩타이드 항원은 MHC 클래스 I 단백질에 결합할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명에서 펩타이드를 제시할 수 있는 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드 각각에 대해, 이들 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 펩타이드 항원이 바람직하게는 사용됨을 이해할 것이다. 이들 펩타이드 항원은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 기초하여 선택될 수 있다.
본 발명에 있어 펩타이드 항원에 결합할 수 있는 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 대한 펩타이드 항원의 결합은 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 하기 문헌의 방법으로 평가할 수 있다:
Rammensee, Bachmann, Emmerich, Bachor, Stevanovic. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999 Nov;50(3-4):213-9;
Pearson et al. MHC Class I-associated peptides derive from selective regions of the human genome. J Clin Invest. 2016 Dec 1;126(12):4690-4701; and
Rock, Reits, Neefjes. Present Yourself! By MHC Class I and MHC Class II Molecules. Trends Immunol. 2016 Nov;37(11):724-737.
이러한 방법들은 펩타이드 항원의 결합 예측 방법 및 실험 방법을 포함한다.
MHC 클래스 I 분자 상에 펩타이드 항원을 고정하기 위해, 그리고 펩타이드 항원의 MHC 클래스 I 분자에의 결합을 보장하기 위한, 앵커 서열들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 모든 구현예들에 따른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 사용되는 펩타이드 항원은 MHC 클래스 I 분자에 대해 예측되는 위치에서 앵커 또는 바람직한 아미노산 잔기 중 어느 것을 포함한다.
이러한 예측은 바람직하게는 하기 간행물들 중 어느 하나에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다:
- Rammensee et al, SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics (1999) 50: 213-219
- Nielsen et al, Protein Sci (2003) 12:1007-1017
- Neefjes et al. Nat Rev Immunol. 2011 Nov 11;11(12):823-36
- Diehl et al. Curr Biol. 1996 Mar 1;6(3):305-14,
- Lee et al. Immunity. 1995 Nov;3(5):591-600.
- Desai & Kulkarni-Kale, T-cell epitope prediction methods: an overview. Methods Mol Biol. 2014;1184:333-64.
본 발명에 따른 전체 구현예에 따른 바람직한 구현예에서, 펩타이드 항원은 인간 단백질로부터 유래된다.
다른 예로, 본 발명의 펩타이드 항원의 비-앵커 아미노산 잔기는 인간 단백질로부터 유래된 펩타이드 항원의 대응되는 아미노산 잔기와 동일하거나, 또는 이는 인간 단백질로부터 유래된 펩타이드 항원의 대응되는 아미노산 잔기들에 대해 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더 바람직하게는 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 다른 구현예로, 본 발명의 펩타이드 항원의 비-앵커 아미노산 잔기는, 인간 단백질로부터 유래된 펩타이드 항원의 대응되는 아미노산 잔기들에 대해, 보존적인 치환을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 2개 이하의 보존적인 치환을 포함할 수 있으며, 더 바람직하게는 하나의 보존적인 치환을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이러한 인간 단백질은 병리학적 면역 반응에 의해 영향을 받은 조직 또는 세포에서 발현되는 단백질이다.
본 발명에 따른 펩타이드 항원은 천연성 펩타이드 또는 비-천연성 펩타이드이다. 본 발명에 따른 펩타이드 항원은 바람직하게는 천연성 아미노산들로 구성된다. 그러나, 변형된 아미노산과 같은 비-천연성 아미노산도 이용될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용되는 펩타이드 항원은 펩타이드 모방체 (peptidomimetics)일 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드 항원을 비롯한 펩타이드 항원을 합성하는 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다.
서열
본 출원에 언급되는 바람직한 아미노산 서열은 하기 서열들로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 서열은 N-말단에서 C-말단 방향으로 표시되며; 단문자 아미노산 코드로 표시된다.
리더 펩타이드: 예, MSRSVALAVLALLSLSGLEA (서열번호 1)
펩타이드 항원: MHC 클래스 I [α] 1&2 도메인에 대응되는 임의의 MHC 클래스 I 펩타이드, 예, MLAVFLPIV (STEAP1) (서열번호 2) 또는 SIINFEKL (Ova) (서열번호 3)
링커 1 (다이설파이드 트랩 안정화됨): 예를 들어, GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 4) 또는 GCGASGGGGSGGGGS (서열번호 5)
인간 또는 기타 종으로부터 유래된 β 2 마이크로글로불린, 예를 들어:
IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM (서열번호 6, 인간 β 3 마이크로글로불린)
Linker2, 예를 들어
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 7)
인간 HLA-G로부터 또는 선택된 항원성 펩타이드를 제시하는데 적합한 임의의 다른 MHC 클래스 I [α]1&2 도메인으로부터 유래된, [α] 1 & 2 도메인, Y84는 DT 변이체에서 C일 수 있음
GSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRA (서열번호 8)
예: 뮤라인 H2Kb [α]1 & 2 도메인 (Y84C)
GPHSLRYFVTAVSRPGLGEPRYMEVGYVDDTEFVRFDSDAENPRYEPRARWMEQEGPEYWERETQKAKGNEQSFRVDLRTLLGCYNQSKGGSHTIQVISGCEVGSDGRLLRGYQQYAYDGCDYIALNEDLKTWTAADMAALITKHKWEQAGEAERLRAYLEGTCVEWLRRYLKNGNATLLRT (서열번호 9)
또는: 인간 HLA-A2 [α]1 & 2 도메인
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRT (서열번호 10)
인간 HLA-G [α]3 도메인 (또는 임의의 MHC Ib [α]3 도메인, 예, HLA-F, 이는 또한 ILT2 및 ILT4 수용체와 상호작용함), 예를 들어: DPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDL (서열번호 11; HLA-G [α]3의 서열). 주의: 아래 서열에서 밑줄 친 아미노산은 ILT2 또는 ILT4 수용체 상호작용관 관련있음 :
DPPKTHVTHH PVFDYE ATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQD V ELVETRPAGDGTFQKWAAV V VPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDL
Factor Xa 제한효소 부위: IEGRTGTKLGP (서열번호 12)
Myc 태그: EQKLISEEDL (서열번호 13)
부가적인 서열: NSAVD
His 태그: HHHHHH* (서열번호 14)
본 발명의 성숙한 전장 단백질의 예들:
다이설파이드 트랩_Ova_링커 1_인간 β2 마이크로글로불린_링커 2_H2Kbalpha1&2_HLA-Galpha3_XaSite_myc&hisTAG
(dtH2Gova)
SIINFEKLGCGASGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGPHSLRYFVTAVSRPGLGEPRYMEVGYVDDTEFVRFDSDAENPRYEPRARWMEQEGPEYWERETQKAKGNEQSFRVDLRTLLGCYNQSKGGSHTIQVISGCEVGSDGRLLRGYQQYAYDGCDYIALNEDLKTWTAADMAALITKHKWEQAGEAERLRAYLEGTCVEWLRRYLKNGNATLLRTDPPKTHVTHH PVFDYE ATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQD V ELVETRPAGDGTFQKWAAV V VPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDLIEGRTGTKLGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH* (서열번호 15)
상기 전장 단백질의 펩타이드 항원의 서열 (이 경우, SIINFEKL)은 본 발명에 따른 임의의 펩타이드 항원으로 치환될 수 있음에 유념한다.
다이설파이드 트랩_STEAP1_링커 1_인간 β2 마이크로글로불린_링커 2_HLA-A2alpha1&2_HLA-Galpha3_XaSite_myc&hisTAG
(dtGsteap)
MLAVFLPIVGCGASGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGCYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHH PVFDYE ATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQD V ELVETRPAGDGTFQKWAAV V VPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDLIEGRTGTKLGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH* (서열번호 16)
상기 전장 단백질의 펩타이드 항원의 서열 (이 경우, MLAVFLPIV)은 본 발명에 따른 임의의 펩타이드 항원으로 치환될 수 있음에 유념한다.
수용체 ILT2 (LILRB1이라고도 함) 및 ILT4 (LILRB2라고도 함)는 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 본 발명에 따른 이들 수용체의 바람직한 서열은 다음과 같다:
ILT2:
MTPILTVLICLGLSLGPRTHVQAGHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRL YREKKTALWITRIPQELVKKGQFPIPSITWEHAGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTG AYIKPTLSAQPSPVVNSGGNVILQCDSQVAFDGFSLCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRA IFSVGPVSPSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLGVSKKPSLSVQPGPIVAPEE TLTLQCGSDAGYNRFVLYKDGERDFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGA HNLSSEWSAPSDPLDILIAGQFYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKE GAADDPWRLRSTYQSQKYQAEFPMGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVS GPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLF LILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQ PEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMD
TEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (서열번호 17)
ILT4:
MTPIVTVLICLGLSLGPRTHVQTGTIPKPTLWAEPDSVITQGSPVTLSCQGSLEAQEYRL YREKKSASWITRIRPELVKNGQFHIPSITWEHTGRYGCQYYSRARWSELSDPLVLVMTGA YPKPTLSAQPSPVVTSGGRVTLQCESQVAFGGFILCKEGEEEHPQCLNSQPHARGSSRAI FSVGPVSPNRRWSHRCYGYDLNSPYVWSSPSDLLELLVPGVSKKPSLSVQPGPVVAPGES LTLQCVSDVGYDRFVLYKEGERDLRQLPGRQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAH NLSSECSAPSDPLDILITGQIRGTPFISVQPGPTVASGENVTLLCQSWRQFHTFLLTKAG AADAPLRLRSIHEYPKYQAEFPMSPVTSAHAGTYRCYGSLNSDPYLLSHPSEPLELVVSG PSMGSSPPPTGPISTPAGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVVLLLLLLLLLF LILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKDTQ PEDGVEMDTRAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRRKATEPPPSQEREPPAEPSIYATLAIH (서열번호 18)
본 발명은 하기 비-제한적인 실시예들을 들어 추가적으로 설명된다:
실시예
일반적인 사항
모든 단계들은 무균 조건 하에 수행하였다; 보호 용기는 층류 후드 하에서만 열었다. 세포는 달리 언급되지 않은 한 항상 350 xg로 5분간 원심분리하였다. 모든 살아있는 세포는 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2 및 습도 >95%에서 유지시켰다. 37℃로 설정된 수조를 사용해 세포에 첨가되는 배지, PBS 또는 기타 용액을 예열하였다. 뉴바우어 챔버 (Neubauer chamber)를 세포 카운팅에 사용하였다. 스튜던트의 T 검정을 통계학적 분석에 사용하였으며, p < 0.05을 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1: 지정된 펩타이드가 로딩된 MHC Ib 분자를 발현하는 세포는 선택적으로 제시된 펩타이드에 특이적인 CTL을 제거한다.
재료 및 방법: JEG-3는 HLA-G를 높은 수준으로 발현하고 임의의 고전적인 MHC 클래스 I 분자는 거의 발현하지 않는 인간 융모암 세포주이다 (Rinke de Wit et. al., J Immunol. 1990 Feb 1;144(3):1080-7). JEG-3 세포는 10% 소 태아 혈청, 0.5% 소듐 피루베이트 용액 (100 mM) 및 1% 페니실린 (10 kU/ml) 및 스트렙토마이신 (10 mg/ml) 용액이 첨가된 RPMI1640 완전 배지 ("RPMI 완전")에서 배양하였다. 3x105 JEG-3 세포를 12웰 플레이트에서 RPMI1640 완전 배지 1 ml에 접종하였다.
표시된 경우, STEAP1 (292.2L-9mer, MLAVFLPIV) 또는 PRAME (435-9mer, NLTHVLYPV) 펩타이드 스톡 용액 (5 ㎍/㎕) 1 ㎕를 첨가하였다. 다음날, JEG-3 세포를 PBS로 3번 헹군 다음 보충된 CellGro DC 배지 (5% 인간 혈청형 AB 혈청, 25-50 U/ml IL-2, 5 ng/ml IL-15) 300 ㎕를 각 웰에 첨가하였다.
Clonal HLA-A*02 (HLA-A2) 제한된, STEAP1 (st) 또는 PRAME (pr) 펩타이드-특이적인 CD8+ T 세포 (STEAP1-/PRAME "특이적")를 Wolfl et al, Nat Protoc. 2014 Apr;9(4):950-66에 따라 구축하였다. STEAP1-특이적인 CD8+ T 세포를 제조사의 설명서에 따라 Cell Proliferation Dye eFluor® 670로 염색하고, 상기에 언급된 RPMI1640 완전 배지에 재현탁하였다. 배지 300 ㎕ 중의 세포 1.5x105개를 펩타이드-로딩된 JEG-3와 함께 각 웰에 첨가하였다. 동일한 방식으로, 비-염색된 PRAME-특이적인 CD8+ T 세포를 펠릿화하고, 재현탁한 다음 각각의 웰에 첨가하였다. D에 나타낸 실험에서, 항-ILT-2 항체 (클론 HP-F1) 또는 이소형 대조군 항체를 최종 농도 10 ㎍/ml로 첨가하였다.
16시간 후, 세포를 수집하고, 제조사의 설명서에 따라 5 μM CellEvent Caspase-3/7 Green (Life Technologies)으로 염색하였다. 비-부착성 세포를 이후 수집하고, 항-인간 CD8 (PE/Cy7, clone RPA-T8) 및 항-인간 CD4 (PE/Dye647, clone MEM-241) 항체의 1:100 희석물 내에서 30분간 얼음 위에서 염색한 다음 유세포 측정에 의해 분석하였다. CTL는 CD8+CD4-이므로, CD4 염색은 가능성있는 CD4+/CD8+ 더블-양성 세포 및 자가형광 세포를 제외시킬 수 있다. 전체 세포의 수를 ㎕ 당 세포 카운트를 기반으로 결정하였다. 부착성 JEG-3 세포의 생존성을 크리스탈 바이올렛 분석에 의해 정량하였다.
결과: A) JEG-3 세포 비-첨가 대조군 또는 HLA-G+ DMSO 처리된 대조군 JEG-3 세포가 첨가된 대조군 조건 둘다에서, 세포자살 5% 미만의, 카스파제 3/7+ eFluor670- PRAME-특이적인 또는 eFluor670+ STEAP1-특이적인 CD8+ T 세포가 검출되었다. 반면, STEAP1-로딩된 JEG-3 세포와의 공동 배양 후, STEAP1-특이적인 CD8+ T 세포의 90% 이상이 없어지거나 또는 세포자살성이었으며, PRAME-특이적인 T 세포에서는 유의한 효과가 관찰되지 않았다. STEAP1-특이적인 CD8+ T 세포는 bright eFluor 670 염색으로 인해 PRAME-특이적인 T 세포로부터 쉽게 구별할 수 있었다. 이 점 도표 (dotplot)는 3번의 실험 중 하나의 실험의 대표적인 결과이다. B) 3번의 독립 실험들에 대한 통계학적 분석 결과, 이들 효과가 매우 유의한 것으로 확인되며, STEAP1-특이적인 T 세포는 동족 펩타이드가 로딩된 HLA-G+ JEG-3 세포와의 공동 배양시 선택적으로 제거될 수 있는 것으로 나타났다. C) JEG-3 세포 생존은 공동 배양된 T 세포에 의해 인지되는 펩타이드의 로딩로 인해 감소되지 않았다. D) 동일 조건에서, HLA-G 수용체 ILT2를 차단하는 항체를 첨가하면, STEAP1-특이적인 T 세포의 타겟화된 제거가 부분적으로 억제되었다.
결론: 본 실험은, 펩타이드-특이적인 CD8+ T 세포가, 이의 동족 항원을 제시하는 JEG-3 세포와 같은 인간 MHC Ib+ 세포와의 접촉시, 선택적으로 제거될 수 있음을 보여준다. 활성화된 CD8+ T 세포에 동족 펩타이드를 제시하는 MHC Ia+ 타겟 세포가 통상적으로 제거되고 T 세포는 생존하기 때문에, 이러한 결과는 놀라운 발견이다. MHC Ia+ 타겟과 대조적으로, JEG-3 세포의 펩타이드-로딩은 생존성 감소를 유발하지 않았는데, 이는 MHC Ib 분자가 MHC Ia 분자와 비교해 반대되는 효과를 가질 수 있다는 것을 의미한다. 아울러, MHC Ib 분자 및 이의 수용체 ILT2는, 이들의 상호작용을 차단하는 물질, 예를 들어, ILT2 차단 항체에 의해 달성된 이러한 효과 억제에 의해 입증된 바와 같이, 공동 작용하여 상기한 효과를 달성한다. 따라서, 본 발명에 따르면, 이러한 차단 물질을 사용해, MHC Ib 분자의 존재 하에 펩타이드-특이적인 면역 반응의 유도를 촉진할 수 있다.
실시예 2 : 지정된 펩타이드가 로딩된 MHC Ib 분자를 사용해 항원-특이적인 방식으로 동족 CTL의 세포독성 잠재성을 억제할 수 있다.
재료 및 방법: 1x106 JEG-3 세포를 6웰 플레이트에서 1 ml RPMI1640 완전 배지 내에 비-처리 상태로 두거나 또는 STEAP1 펩타이드 ("st", 실시예 1 참조)를 로딩하였다. 5x105 STEAP1-특이적인 CD8+ T 세포를 5x105 PRAME-특이적인 CD8+ T 세포 (작동자)와 혼합한 다음, 16시간 동안 상기한 JEG-3를 첨가하지 않고 두거나 또는 상기한 JEG-3를 첨가하여 공동 배양하였다. 지정된 경우에는 항-인간 HLA-G 중화 항체 (clone 87G, BioLegend, Germany) 10 ㎍/ml을 첨가하였다. 다음날, 반딧불이 루시퍼라제를 발현하는 HLA-A2+ UACC-257 흑색종 세포 (타겟)을 아큐타제 용액 (PAA, Germany)을 이용해 탈착시키고, 헹군 후 STEAP1 펩타이드 (5㎍/ml, "st 로딩") 또는 등가량의 DMSO ("비-로딩")를 로딩하여 교반기 위에서 37℃ 4시간 동안 두었다. UACC 세포를 1x104/웰로 백색의 둥근 바닥 96웰 플레이트에 접종하였다. 비-부착성 혼성 T 세포를 수집하고, 동일한 양의 초기 T 세포 4x104 (각각 2 x104) 및 반딧불이 D-루시페린 (PJK Germany, 최종 농도 140 ㎍/ml)을 첨가하였다. 타겟 세포의 생존성을 8시간 후 루미노미터에서 확인하였다 (방법의 상세 내용: Brown et al., J Immunol Methods. 2005 Feb;297(1-2):39-52.).
결과: HLA-G+ JEG-3 세포에 펩타이드 항원의 제시는 특이적인 펩타이드 항원을 MHC-Ib 의존적인 방식으로 인지하는 CD8+ T 세포 클론의 세포독성 능력을 손상킨다. 언급된 조건에서, STEAP1 특이적인 대조군 CTL 또는 HLA-G+ JEG-3 세포로 전처리된 CTL은 동족 펩타이드가 로딩된 전체 타겟 세포들 중 약 90%를 세포용해하였지만, 나이브 타겟 세포는 제거되지 않았다. 이와는 대조적으로, JEG-3 세포 및 동족 펩타이드를 이용한 전처리는 항원-제시 타겟 세포를 거의 완벽하게 보호하였다. HLA-G 의존적인 효과를 부분적으로 차단할 수 있는 항체 (87G)는 이러한 펩타이드-특이적인 면역억제 효과를 일부 회복시켰다. 이는, 펩타이드-로딩된 MHC 클래스 Ib 분자가 임상 세팅에서 제시된 항원에 대해 원치않은 세포독성의 (자가)면역 반응을 억제할 수 있음을, 암시한다.
아울러, (예, 방사선, 화학요법 또는 펩타이드-백신 용법을 통해) 펩타이드와 접촉된 MHC Ib 양성의 종양 세포는 CD8+ T 세포-매개의 항-종양 면역 반응을 특이적으로 억제할 수 있다. 그러나, 이러한 효과는 MHC Ib 분자와 이의 수용체 간의 상호작용을 차단하는 물질에 의해 상쇄될 수 있다.
실시예 3: 지정된 펩타이드가 조합된 MHC Ib 분자는 동족 CTL을 저해하지만, 다른 항원에 대한 면역 반응은 크게 영향을 받지 않고 유지된다.
재료 및 방법: 도 3에 나타낸 실험에서, HLA-A2 STEAP1-특이적인 (CD8st) 및 PRAME-특이적인 CD8+ T 세포 (CD8pr)를 혼합하고, 8시간 동안 비-처리 상태로 두거나 또는 STEAP1 펩타이드가 로딩된 또는 비-로딩된 JEG-3와 공동 배양하였다 (도 2의 방법 참조). 현탁액 내 T 세포를 수집하고, 이를 루시퍼라제를 발현하는 PRAME-펩타이드 (진회색 막대) 또는 STEAP1-펩타이드 로딩된 (연회식 막대) HLA-A2+ UACC-257 흑색종 세포와 조합하였다 (T 세포는 전처리 후 계수 안함, 초기 작동자:타겟의 비 1:1).
결과:
혼합된 CD8 세포를 MHC Ib 양성 세포주 배경에서 동족 펩타이드 하나에 사전-노출시켰을 때 동족 T 세포의 세포독성 잠재력이 약 50%로 감소하였지만, 다른 T 세포 클론의 세포독성 활성은 약 90%에서 유지되었는데 이는 HLA-G+ JEG-3 세포 단독의 펩타이드-독립적인 면역 억제 효과와 비슷하였다. 결론적으로, 이러한 방식은, 다른 (예, 바이러스) 항원에 대한 적절한 면역 반응의 동시적인 약화없이 특이적인 (자가)면역-관련 타겟 항원에 대해 허용성을 유도할 수 있는 것으로, 확인된다. JEG-3 세포에 의해 나타난 MHC 패턴과 중화 항체를 이용해 기존에 공지된 실험 결과를 토대로, 이들 펩타이드-특이적인 효과가 HLA-G를 통해 매개되는 것으로 이해될 것이다. 본 실험은, MHC Ib 분자에 항원성 펩타이드의 제시가 동족 CD8+ T 세포의 세포용해 능력을 손상시킬 수 있음을, 보여준다.
실시예 4 : 치료학적 물질에 대한 구축 (building) 계획: 항원성 펩타이드 , MHC 클래스 1-기반의 [α]1 및 [α]2 도메인, HLA -G (또는 그외 MHC 클래스 Ib 분자)-유래 [α]3 도메인 및 [β]2-마이크로글로불린을 포함하는 용해성 단쇄 구조체
MHC Ib 펩타이드 복합체의 설계
MHC 클래스 Ib 분자 유사 HLA-G는 본래 하나의 복합체 형태로 된 3개의 폴리펩타이드 분자로 구성된다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 이들 폴리펩타이드는 안정성 개선을 위해 링커에 의해 연결될 수 있다.
다른 예로, 모든 구성성분들은 도 5에 나타낸 바와 같이 선형적인 방식으로 표시될 수 있다.
특정 구현예에 사용된 서열들을 아래에 열거한다.
코딩 서열의 구성성분들:
리더 펩타이드: 예, 분비 유도성 리더 펩타이드, 예 MSRSVALAVLALLSLSGLEA (서열번호 1)
제시된 펩타이드 항원: MHC 클래스 I [α] 1&2 도메인에 의해 제시될 수 있는 앵커 잔기를 가진 아미노산 8-12개로 된 임의의 펩타이드, 예 MLAVFLPIV (STEAP1) (서열번호 2) 또는 SIINFEKL (Ova) (서열번호 3)
링커 1 (다이설파이드 트랩 안정화): GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 4) 또는 GCGASGGGGSGGGGS (서열번호 5)
인간 또는 그외 종으로부터 유래된 β 2 마이크로글로불린
IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM (서열번호 6)
링커 2
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 7)
선택된 항원성 펩타이드를 제시하기에 적합한 인간 HLA-G 또는 임의의 그되 MHC 클래스 I [α]1&2 도메인으로부터 유래된 [α] 1 & 2 도메인, Y84는 DT 변이체에서 C일 수 있다.
GSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRA (서열번호 8)
예: 뮤라인 H2Kb [α]1 & 2 도메인 (Y84C)
GPHSLRYFVTAVSRPGLGEPRYMEVGYVDDTEFVRFDSDAENPRYEPRARWMEQEGPEYWERETQKAKGNEQSFRVDLRTLLGCYNQSKGGSHTIQVISGCEVGSDGRLLRGYQQYAYDGCDYIALNEDLKTWTAADMAALITKHKWEQAGEAERLRAYLEGTCVEWLRRYLKNGNATLLRT (서열번호 9)
또는: 인간 HLA-A2 [α]1 & 2 인간
GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRT (서열번호 10)
인간 HLA-G [α]3 도메인 (또는 임의의 MHC Ib [α]3 도메인, 예, HLA-F, 이는 또한 ILT2 및 ILT4 수용체와 상호작용함, 밑줄 친 아미노산은 ILT -2 또는 ILT -4와의 상호작용과 관련있음 ), 예를 들어
DPPKTHVTHH PVFDYE ATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQD V ELVETRPAGDGTFQKWAAV V VPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDL (서열번호 11)
Factor Xa 제한효소 부위: IEGRTGTKLGP (서열번호 12)
Myc 태그: EQKLISEEDL (서열번호 13)
부가적인 서열: NSAVD
His 태그: HHHHHH* (서열번호 14)
성숙한 전장 단백질의 예들:
다이설파이드 트랩_Ova_링커 1_인간 β2 마이크로글로불린_링커 2_H2Kbalpha1&2_HLA-Galpha3_XaSite_myc&hisTAG
(dtH2KbGova)
SIINFEKLGCGASGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGPHSLRYFVTAVSRPGLGEPRYMEVGYVDDTEFVRFDSDAENPRYEPRARWMEQEGPEYWERETQKAKGNEQSFRVDLRTLLGCYNQSKGGSHTIQVISGCEVGSDGRLLRGYQQYAYDGCDYIALNEDLKTWTAADMAALITKHKWEQAGEAERLRAYLEGTCVEWLRRYLKNGNATLLRTDPPKTHVTHH PVFDYE ATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQD V ELVETRPAGDGTFQKWAAV V VPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDLIEGRTGTKLGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH* (서열번호 15)
다이설파이드 트랩_STEAP1_링커 1_인간 β2 마이크로글로불린_링커 2_HLA-A2alpha1&2_HLA-Galpha3_XaSite_myc&hisTAG
(dtGsteap)
MLAVFLPIVGCGASGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGCYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHH PVFDYE ATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQD V ELVETRPAGDGTFQKWAAV V VPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDLIEGRTGTKLGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH* (서열번호 16)
실시예 5: 수지상 세포 (DC- 10)와 조합된 용해성 펩타이드 - MHC Ib 복합체는 제시된 타겟 항원을 인지하는 CD8 + 작동자 T 세포를 선택적으로 제거할 수 있다.
재료 및 방법: 용해성 펩타이드 MHC Ib 구조체가 항원 의존적인 방식으로 작동자 T 세포를 제거할 수 있는 지를 조사하기 위해, 이들 구조체를 IL-4, GM-CSF 및 IL-10 (DC-10)의 존재 하에 증폭시킨 수지상 세포에 로딩하였다. DC-10은, 건강한 공여자로부터 유래된 MACS 정제한 (CD14 비드, Miltenyi, Germany) CD14+ 세포 5x106/ml을 DC-10-배지 (RPMI1640 완전 배지, 10 ng/ml IL-4, 10 ng/ml IL-10, 100 ng/ml GM-CSF)에서 7일간 배양하여, 구축하였다. 3일 및 5일에 새로운 배지를 첨가하였다. 수득된 DC-10 세포는 세포 배양 디쉬에 부착하지 않았다. DC-10 세포 4x105/ml을, STEAP1 펩타이드 (dtGsteap, 서열은 실시예 4 참조) 또는 Melan A/MART-1 펩타이드 (ELAGIGILTV, dtGmelA)를 포함하는 단쇄 다이설파이드 트랩된 펩타이드 HLA-G 구조체를 위한 pCDNA3.1 발현 벡터로 리포펙션에 의해 일시적으로 형질전환된 CHO 세포 (1x106/ml)의 5일 세포 배양 상층액 또는 대조군 상층액과 동량으로 조합하여, 4시간 두었다. 그런 후, DC-10을 PBS로 3번 헹구고, 5 hAB 혈청 + IL-2 (106 DC-10/ml)가 첨가된 RPMI 1640 배지 50 ㎕에 재현탁하였다. 펩타이드-MHC Ib 로딩된 DC-10 세포 5x104주를, STEAP1 (CD8st) 또는 PRAME (CD8pr)를 인지하는 HLA-A2 제한된, 항원-특이적인 CD8+ T 세포와 1:1 비율로 조합하여 16시간 두었다. 그 후, 세포를 제조사의 설명서에 따라 CellEvent Caspase-3/7 Green (5 μM, Life Technologies)과 인간 CD4 (clone EDU-2) 및 CD8 (clon RPA-T8)에 특이적인 항체로 염색하였다 (실시예 2 참조). CD8+CD4-카스파제3/7- 세포를 유세포 측정으로 정량하였다.
결과: 도 6에 나타낸 바와 같이, 2번의 독립적인 실험들에서, 동족 펩타이드를 제시하는 단쇄 MHC Ib 구조체가 로딩된 DC-10 세포와 조합된 STEAP1 특이적인 T 세포는 16시간 이내에 거의 완전히 제거되었다. 동일한 조건은 대조군 펩타이드 (CD8pr)에 특이적인 T 세포의 생존에는 부정적으로 작용하지 않았다. 대조군 펩타이드 (dtGmelA)를 포함하는 구조체는 STEAP1 특이적인 CD8+ T 세포의 생존을 단지 약간 감소시켰다. 이는, 특이적인 펩타이드가 조합된 용해성 MHC Ib 분자를 사용해 제시된 펩타이드에 특이적인 작동자 T 세포를 선택적으로 또한 제거하여, 지정된 항원에 대한 면역 반응을 선택적으로 조절할 수 있음을, 시사한다.
실시예 6 : 펩타이드 -로딩된 MHC Ib 복합체는 제시된 펩타이드를 인지하는 인간 항원-특이적인 조절성 T 세포를 유도한다.
도 7A에 나타낸 실험에서, 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 5x106주를 2명의 건강한 공여자로부터 취하여, Melan-A 또는 STEAP1 펩타이드가 로딩된 (전술한 바와 같이 로딩됨) 방사선 처리된 JEG-3 세포 1x106주의 존재 하에, 5% 인간 혈청형 AB 혈청, 5 ng/ml TGF-８1, 20 ng/ml IL-2 (Treg medium)가 첨가된 RPMI1640 배지 2 ml에서 14일간 공동 배양하였다. 3일째에, 신선한 배지를 첨가하였다. 7일째에, 배지를 교체하고, PBMC를 갓 방사선 처리된 펩타이드-로딩된 JEG-3 세포 1x106주로 이동시켰다. Treg expansion 비드 (Miltenyi Biotec, 항-CD3/CD28)를 양성 대조군으로 사용하였다. 수득된 세포를 인간 CD4 (clone EDU-2, Immunotools) 및 CD25 (Miltenyi 120-001-311)에 대한 항체, 그리고 HLA-A2 STEAP1 dextramer (STEAP1 dex, Immudex Denmark, 모두 1:100 희석)로 얼음 위에 두고 30분간 염색하였다. CD4+CD25high Treg 세포들 중에서 STEAP1 특이적인 T 세포의 빈도 (Shevach et al., 2002, Nat. Rev. Immunol. 2:389)를 유세포 측정에 의해 정량하였다. PBMC를 단독 (ctrl) 또는 대조군 펩타이드 (melA)의 존재 하에 배양하였을 때, STEAP1 특이적인 CD4+CD25high Treg 세포는 검출되지 않았지만, PBMC를 동족 항원을 제시하는 JEG-3와 공동 배양하였을 때에는 유의미한 집단이 반복적으로 관찰되었으며, 양성 대조군 세팅 (aCD3/28)에서 더 낮은 수준으로 관찰되었다.
도 7B에 나타낸 실험에서, 도 6에 나타낸 바와 같이, 제시된 Melan-A (dtGmelA) 또는 STEAP1 (dtGsteap) 펩타이드를 포함하는 다이설파이드 트랩 단쇄 HLA-G 구조체를 DC-10 4x105 세포/웰에 로딩하였다. 그런 후, 동일한 공여자의 4x106 PBL을 첨가하여, 세포를 12웰 플레이트에서 Treg 배지 2 ml 중에 7일간 배양하였으며, 3일째에 배지 1 ml을 교체하였다. 7일째, 신선한 동일하게 로딩된 DC-10 세포 4x105주를 각 웰에 첨가하고, 배지를 다시 10일째에 교체하였다. 14일째에, 세포를 수집하여 헹군 후, CD4 (clone MEM-241), CD8 (clone RPA-T8), 및 HLA-A2-Melan A 펩타이드 dextramer (Immudex)에 대한 형광단 표지된 항체로 염색하였다. IL-10 (clone JES3-9D7)에 대한 세포내 염색을 세포내 염색 키트 (eBiosciences)를 사용해 수행하였다. Melan A 특이적인 IL-10+ Treg의 수는, PBL을 단쇄 Melan A HLA-G 분자 (dtGmelA)가 로딩된 DC-10와 공동 배양한 조건에서, 대조군 분자 (STEAP1) 또는 비처리된 PBL과 비교해 크게 증가하였다.
실시예 7 : 인간 MHC Ib alpha3 도메인을 DC와 조합하여 포함하는 단쇄 펩타이드 MHC 구조체는 제시된 펩타이드에 특이적인 뮤라인 Treg 세포를 유도한다 (도 8).
뮤라인 GM-CSF 유전자로 형질감염된 Ag8653 골수종 세포주 유래 상층액을 포함하는 10% GM-CSF가 첨가된 RPMI-1640 완전 배지에서, 7일간 야생형 C57BL/6 마우스 유래의 골수 유래 세포를 배양하여, 뮤라인 DC (mDC)를 구축하였다 (상세 프로토콜: Lutz et al., J Immunol Methods 1999, 223(1):77-92). RPMI 완전 배지 500 ㎕ 중의 mDC 4x105주를, 모의 형질전환한 세포 (CHO), 또는 단쇄 오발부민 펩타이드 (SIINFEKL), 뮤라인 H-2Kb alpha 1 및 2 도메인 및 인간 HLA-G alpha3 도메인 (H2Kb, 서열은 실시예 4 dtH2KbGova) 또는 인간 HLA-A2 alpha 1 및 2 도메인 (A2G)을 코딩하는 pCDNA3.1 벡터로 형질전환된 CHO 세포로부터 수득한 "5일 CHO 상층액" 500 ㎕와 4시간 조합하였다. 상층액 내 각각의 구조체의 존재를 웨스턴 블롯팅으로 검증하였다. 예비 실험 결과, 유도는 또한 정제된 구조체로도 가능한 것으로 나타났다. 여기서, 펩타이드-로딩된 MHC 구조체들은, 구조체를 결합시킨 다음 PBS로 (3번) 헹구고, Factor Xa 프로테아제 절단 (1U/100 ㎕, 6h, 20℃, Qiagen)을 수행하여 구조체를 분리함으로써, cOmplete His-Tag 정제 수지 (Sigma Aldrich)를 사용해 정제하였다. 그런 후, Factor Xa는 factor Xa 제거 수지 (Qiagen, 모두 제조사의 프로토콜에 따름)로 제거할 수 있다. 서열들은 실시예 4에 열거되어 있다. 이후, mDC를 PBS로 헹구었다.
C57BL/6 RAG-/- OT1 마우스는 H-2Kb에 의해 제시된 ova 펩타이드와 상호작용하는 T 세포 수용체를 거의 독점적으로 발현한다. 이 마우스로부터 유래된 비장 세포 2x106주를, Treg 유도 배지 (RPMI 완전 배지, 5 ng/ml IL-2, 5 ng/ml TGF-β1)에서, 전술한 바와 같이 로딩된 (OT1 ctrl) 4x105 mDC 첨가없이 또는 첨가하여 (mDC A2G/CHO/H2Kb OT1), 14일간 배양하였다. 그런 후, 세포를 뮤라인 CD3 (clone KT3, Serotec), Foxp3 (3G3, Miltenyi Biotec) 및 IL10 (JES5-16E3)에 특이적인 형광단 표지된 항체로 염색하고, 유세포 측정에 의해 정량하였다 (마우스 및 프로토콜은 Hunig et al., Brain. 2008 Sep;131(Pt 9):2353-65 참조). T 세포를 동족 펩타이드/MHC alpha 1 & 2 도메인 및 MHC Ib 분자의 면역억제 alpha 3 도메인과 조합한 모든 조건들에서, 항원-특이적인 Treg의 매우 현저한 증가가 관찰되었다. 정제된 구조체를 이용한 경우의 중간 수준의 유도는 정제 공정 중에 단백질의 소실에 의한 것으로 설명될 수 있다.
이들 실험은, MHC 클래스 Ib 분자 상에 펩타이드 제시가 동족 Treg의 증폭을 촉진함을, 시사해준다. 이러한 Treg는 항원에 제시된 조직에서 이의 T 세포 수용체를 통해 선호적으로 활성화될 것이므로, 따라서 적절한 조직-특이적인 항원이 이용가능한 한, 자가면역 반응에 대한 타겟화된 조직-특이적인 억제가 가능할 것이다. 항원-특이적인 Treg의 방관자 저해 능력으로 인해, 선택된 조직-특이적인 "Treg 활성화 항원"은 병리학적 면역 반응을 유발하는 자가항원과 동일하지 않아야 함에 유념해야 한다.
산업적인 이용가능성
본 발명의 조성물, 폴리펩타이드, 핵산, 세포, 조합물 및 방법은 산업적으로 이용가능하며, 예를 들어, 이는 약제학적 산물로서 또는 이의 제조에 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> JULIUS-MAXIMILIANS UNIVERSITAET WUERZBURG BRUTTEL, Valentin <120> Combinations of MHC class Ib molecules and Peptides for Targeted Therapeutic Immunomodulation <130> 204713 <150> EP 17 172 444.6 <151> 2017-05-23 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader Peptide <400> 1 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala 20 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide antigen: STEAP1 <400> 2 Met Leu Ala Val Phe Leu Pro Ile Val 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide antigen: Ova <400> 3 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker1 (disulfide trap stabilized) <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker1 (disulfide trap stabilized) <400> 5 Gly Cys Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human beta 3 Microglobulin <400> 6 Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu 1 5 10 15 Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro 20 25 30 Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys 35 40 45 Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu 50 55 60 Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys 65 70 75 80 Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp 85 90 95 Arg Asp Met <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker2 <400> 7 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 8 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [Alpha] 1 & 2 domain <400> 8 Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg 35 40 45 Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr 50 55 60 Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr 65 70 75 80 Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln 85 90 95 Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu 115 120 125 Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys 130 135 140 Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Glu Met Leu Gln Arg Ala 180 <210> 9 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine H2Kb [alpha]1 & 2 domain (Y84C) <400> 9 Gly Pro His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Leu Gly Glu Pro Arg Tyr Met Glu Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Tyr Glu Pro Arg 35 40 45 Ala Arg Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Arg Glu Thr 50 55 60 Gln Lys Ala Lys Gly Asn Glu Gln Ser Phe Arg Val Asp Leu Arg Thr 65 70 75 80 Leu Leu Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Ile Gln 85 90 95 Val Ile Ser Gly Cys Glu Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr Gln Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Cys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu 115 120 125 Asp Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Leu Ile Thr Lys 130 135 140 His Lys Trp Glu Gln Ala Gly Glu Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Asn Gly Asn 165 170 175 Ala Thr Leu Leu Arg Thr 180 <210> 10 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human HLA-A2 [alpha]1 & 2 domain <400> 10 Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg 35 40 45 Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr 50 55 60 Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr 65 70 75 80 Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln 85 90 95 Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu 115 120 125 Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys 130 135 140 His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Glu Thr Leu Gln Arg Thr 180 <210> 11 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of HLA-G [alpha]3 <400> 11 Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Val Phe Asp Tyr Glu 1 5 10 15 Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Ile 20 25 30 Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Val Glu Leu 35 40 45 Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala 50 55 60 Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln 65 70 75 80 His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp Ser Lys Glu Gly 85 90 95 Asp Gly Gly Ile Met Ser Val Arg Glu Ser Arg Ser Leu Ser Glu Asp 100 105 110 Leu <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor Xa restriction site <400> 12 Ile Glu Gly Arg Thr Gly Thr Lys Leu Gly Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Myc tag <400> 13 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His tag <400> 14 His His His His His His 1 5 <210> 15 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dtH2Gova <400> 15 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Gly Cys Gly Ala Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val 20 25 30 Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys 35 40 45 Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys 50 55 60 Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser 65 70 75 80 Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr 85 90 95 Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln 100 105 110 Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro 130 135 140 His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu Gly 145 150 155 160 Glu Pro Arg Tyr Met Glu Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu Phe Val 165 170 175 Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Tyr Glu Pro Arg Ala Arg 180 185 190 Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Arg Glu Thr Gln Lys 195 200 205 Ala Lys Gly Asn Glu Gln Ser Phe Arg Val Asp Leu Arg Thr Leu Leu 210 215 220 Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Ile Gln Val Ile 225 230 235 240 Ser Gly Cys Glu Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Gln 245 250 255 Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Cys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu 260 265 270 Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Leu Ile Thr Lys His Lys 275 280 285 Trp Glu Gln Ala Gly Glu Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly 290 295 300 Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Asn Gly Asn Ala Thr 305 310 315 320 Leu Leu Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Val 325 330 335 Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro 340 345 350 Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln 355 360 365 Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln 370 375 380 Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr 385 390 395 400 Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp 405 410 415 Ser Lys Glu Gly Asp Gly Gly Ile Met Ser Val Arg Glu Ser Arg Ser 420 425 430 Leu Ser Glu Asp Leu Ile Glu Gly Arg Thr Gly Thr Lys Leu Gly Pro 435 440 445 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His 450 455 460 His His His His His 465 <210> 16 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dtGsteap <400> 16 Met Leu Ala Val Phe Leu Pro Ile Val Gly Cys Gly Ala Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln 20 25 30 Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn 35 40 45 Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu 50 55 60 Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe 65 70 75 80 Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro 85 90 95 Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser 100 105 110 Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg 145 150 155 160 Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe 165 170 175 Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala 180 185 190 Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg 195 200 205 Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu 210 215 220 Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln Trp 225 230 235 240 Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr 245 250 255 Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp 260 265 270 Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg 275 280 285 Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu 290 295 300 Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro 325 330 335 Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr 340 345 350 Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr 355 360 365 Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe 370 375 380 Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr 385 390 395 400 Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg 405 410 415 Trp Ser Lys Glu Gly Asp Gly Gly Ile Met Ser Val Arg Glu Ser Arg 420 425 430 Ser Leu Ser Glu Asp Leu Ile Glu Gly Arg Thr Gly Thr Lys Leu Gly 435 440 445 Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp 450 455 460 His His His His His His 465 470 <210> 17 <211> 650 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ILT2 <400> 17 Met Thr Pro Ile Leu Thr Val Leu Ile Cys Leu Gly Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15 Pro Arg Thr His Val Gln Ala Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp 20 25 30 Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg 35 40 45 Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys 50 55 60 Lys Thr Ala Leu Trp Ile Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys 65 70 75 80 Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr 85 90 95 Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp 100 105 110 Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser 115 120 125 Ala Gln Pro Ser Pro Val Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Ile Leu Gln 130 135 140 Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe Asp Gly Phe Ser Leu Cys Lys Glu Gly 145 150 155 160 Glu Asp Glu His Pro Gln Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly 165 170 175 Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg 180 185 190 Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp 195 200 205 Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Leu Gly Val Ser Lys 210 215 220 Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Ile Val Ala Pro Glu Glu 225 230 235 240 Thr Leu Thr Leu Gln Cys Gly Ser Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Phe Val 245 250 255 Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Arg Asp Phe Leu Gln Leu Ala Gly Ala Gln 260 265 270 Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser 275 280 285 Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser 290 295 300 Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly 305 310 315 320 Gln Phe Tyr Asp Arg Val Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val 325 330 335 Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Gln Gly Trp Met 340 345 350 Gln Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Trp Arg 355 360 365 Leu Arg Ser Thr Tyr Gln Ser Gln Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met 370 375 380 Gly Pro Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser 385 390 395 400 Gln Ser Ser Lys Pro Tyr Leu Leu Thr His Pro Ser Asp Pro Leu Glu 405 410 415 Leu Val Val Ser Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ser Ser Pro Thr Thr Gly 420 425 430 Pro Thr Ser Thr Ser Gly Pro Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly 435 440 445 Ser Asp Pro Gln Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Val Val Ile Gly 450 455 460 Ile Leu Val Ala Val Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe 465 470 475 480 Leu Ile Leu Arg His Arg Arg Gln Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gln 485 490 495 Arg Lys Ala Asp Phe Gln His Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Glu Pro 500 505 510 Thr Asp Arg Gly Leu Gln Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln 515 520 525 Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Val Lys His Thr Gln Pro Glu Asp Gly 530 535 540 Val Glu Met Asp Thr Arg Ser Pro His Asp Glu Asp Pro Gln Ala Val 545 550 555 560 Thr Tyr Ala Glu Val Lys His Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala Ser 565 570 575 Pro Pro Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg Gln 580 585 590 Ala Glu Glu Asp Arg Gln Met Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser Glu Ala 595 600 605 Pro Gln Asp Val Thr Tyr Ala Gln Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg 610 615 620 Glu Ala Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu Gly Pro Ser Pro Ala Val 625 630 635 640 Pro Ser Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His 645 650 <210> 18 <211> 598 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ILT4 <400> 18 Met Thr Pro Ile Val Thr Val Leu Ile Cys Leu Gly Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15 Pro Arg Thr His Val Gln Thr Gly Thr Ile Pro Lys Pro Thr Leu Trp 20 25 30 Ala Glu Pro Asp Ser Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Ser 35 40 45 Cys Gln Gly Ser Leu Glu Ala Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys 50 55 60 Lys Ser Ala Ser Trp Ile Thr Arg Ile Arg Pro Glu Leu Val Lys Asn 65 70 75 80 Gly Gln Phe His Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Thr Gly Arg Tyr 85 90 95 Gly Cys Gln Tyr Tyr Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp Pro 100 105 110 Leu Val Leu Val Met Thr Gly Ala Tyr Pro Lys Pro Thr Leu Ser Ala 115 120 125 Gln Pro Ser Pro Val Val Thr Ser Gly Gly Arg Val Thr Leu Gln Cys 130 135 140 Glu Ser Gln Val Ala Phe Gly Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu 145 150 155 160 Glu Glu His Pro Gln Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser 165 170 175 Ser Arg Ala Ile Phe Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Asn Arg Arg Trp 180 185 190 Ser His Arg Cys Tyr Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Val Trp Ser 195 200 205 Ser Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Pro Gly Val Ser Lys Lys 210 215 220 Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Val Val Ala Pro Gly Glu Ser 225 230 235 240 Leu Thr Leu Gln Cys Val Ser Asp Val Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu 245 250 255 Tyr Lys Glu Gly Glu Arg Asp Leu Arg Gln Leu Pro Gly Arg Gln Pro 260 265 270 Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg 275 280 285 Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser 290 295 300 Glu Cys Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gln 305 310 315 320 Ile Arg Gly Thr Pro Phe Ile Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala 325 330 335 Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Trp Arg Gln Phe His 340 345 350 Thr Phe Leu Leu Thr Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg Leu 355 360 365 Arg Ser Ile His Glu Tyr Pro Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser 370 375 380 Pro Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Leu 385 390 395 400 Asn Ser Asp Pro Tyr Leu Leu Ser His Pro Ser Glu Pro Leu Glu Leu 405 410 415 Val Val Ser Gly Pro Ser Met Gly Ser Ser Pro Pro Pro Thr Gly Pro 420 425 430 Ile Ser Thr Pro Ala Gly Pro Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly 435 440 445 Ser Asp Pro Gln Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Val Val Ile Gly 450 455 460 Ile Leu Val Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe 465 470 475 480 Leu Ile Leu Arg His Arg Arg Gln Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gln 485 490 495 Arg Lys Ala Asp Phe Gln His Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Glu Pro 500 505 510 Thr Asp Arg Gly Leu Gln Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln 515 520 525 Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Val Lys Asp Thr Gln Pro Glu Asp Gly 530 535 540 Val Glu Met Asp Thr Arg Ala Ala Ala Ser Glu Ala Pro Gln Asp Val 545 550 555 560 Thr Tyr Ala Gln Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg Lys Ala Thr Glu 565 570 575 Pro Pro Pro Ser Gln Glu Arg Glu Pro Pro Ala Glu Pro Ser Ile Tyr 580 585 590 Ala Thr Leu Ala Ile His 595

Claims (79)

  1. 하기 a) 및 b)를 포함하는 약학적 조성물:
    a) 인간 MHC 클래스 Ib 분자, 또는 T 세포에 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드로서,
    상기 폴리펩타이드는 인간 MHC 클래스 Ib 분자의 [α]3 도메인 또는 인간 MHC 클래스 Ib 분자의 [α]3 도메인의 유도체를 포함하고, 상기 유도체는 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는 것인, 인간 MHC 클래스 Ib 분자 또는 T 세포에 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드, 및
    b) a)에 따른 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 의해 제시되는 펩타이드 항원.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물이 a)에 따른 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 폴리펩타이드가 바람직하게는 N-말단에서 C-말단 순서로 MHC 클래스 Ia 분자의 [α]1 및 [α]2 도메인을 포함하고, 그 다음으로 [α]3 도메인 또는 상기 유도체가 오는, 약학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 의해 포함되는 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 의해 포함되는 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 92% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 약학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 의해 포함되는 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 94% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 약학적 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 의해 포함되는 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 96% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 약학적 조성물.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 의해 포함되는 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 98% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 약학적 조성물.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 의해 포함되는 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 약학적 조성물.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 의해 포함되는 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일한, 약학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    a)에 따른 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 a)에 따른 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드가 표면 플라스몬 공명 분광학에 의한 측정시 친화성 상수 K d 40 μM 미만으로 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는, 약학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    a)에 따른 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 a)에 따른 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드가 표면 플라스몬 공명 분광학에 의한 측정시 친화성 상수 K d 20 μM 미만으로 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는, 약학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    a)에 따른 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 a)에 따른 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드가 표면 플라스몬 공명 분광학에 의한 측정시 친화성 상수 K d 10 μM 미만으로 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는, 약학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물이, 서열번호 6의 아미노산 서열, 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한, 바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한, 더 바람직하게 서열번호 6의 아미노산 서열과 98% 이상 동일한 서열을 포함하는 폴리펩타이드 도메인을 더 포함하고, 상기 폴리펩타이드 도메인이 바람직하게는 a)에 따른 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드에 포함되는, 약학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    a)에 따른 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 a)에 따른 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드가 하나 이상의 링커 서열, 바람직하게는 (GGGGS)n 링커 서열을 더 포함하는, 약학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    a)에 따른 상기 MHC 클래스 Ib 분자 또는 a)에 따른 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 폴리펩타이드가 다이머 또는 멀티머인, 약학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드 항원이 아미노산 7-11개 길이, 바람직하게는 아미노산 8-10개 길이인, 약학적 조성물.
  17. 제1항 또는 제3항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 a)에 따른 MHC 클래스 Ib 분자를 포함하고, 상기 MHC 클래스 Ib 분자가 HLA-E, HLA-F 또는 HLA-G인, 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 MHC 클래스 Ib 분자가 HLA-G인, 약학적 조성물.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 MHC 클래스 Ib 분자가 인간 MHC 클래스 Ib 분자인, 약학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 b)에 따른 펩타이드 항원이 a)에 따른 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드에 공유적으로 결합된, 약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    b)에 따른 펩타이드 항원 및 a)에 따른 MHC 클래스 Ib 분자 또는 폴리펩타이드가 펩타이드 결합을 통해 공유적으로 결합되고, 폴리펩타이드 단쇄의 일부인, 약학적 조성물.
  22. 펩타이드 항원을 제시할 수 있는 재조합 폴리펩타이드로서,
    상기 재조합 폴리펩타이드가, N-말단에서 C-말단 순서로,
    i) 상기 재조합 폴리펩타이드에 의해 제시되는 펩타이드 항원;
    ii) 선택적으로, 제1 링커 서열;
    iii) 선택적으로, 인간 β2 마이크로글로불린 서열을 포함하는 인간 폴리펩타이드 도메인의 서열, 또는 서열번호 6으로 표시되는 인간 β2 마이크로글로불린의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열;
    iv) 선택적으로, 제2 링커 서열;
    v) 선택적으로, MHC 분자의 [α] 1 도메인;
    vi) 선택적으로, MHC 분자의 [α] 2 도메인;
    vii) MHC Ib 분자의 [α] 3 도메인 또는 MHC 클래스 Ib 분자의 [α] 3 도메인의 유도체로서, ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는 유도체;
    viii) 선택적으로, 프로테아제 절단부; 및
    ix) 선택적으로, 친화성 태그
    를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
  23. 제22항에 있어서,
    v) 상기 [α]1 도메인 및 vi) 상기 [α]2 도메인이 MHC 클래스 Ia 분자로부터 유래되는, 재조합 폴리펩타이드.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    상기 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 80% 이상의 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 재조합 폴리펩타이드.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 92% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 재조합 폴리펩타이드.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 94% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 재조합 폴리펩타이드.
  27. 제24항에 있어서,
    상기 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 96% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 재조합 폴리펩타이드.
  28. 제24항에 있어서,
    상기 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 98% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 재조합 폴리펩타이드.
  29. 제24항에 있어서,
    상기 [α]3 도메인 또는 유도체가 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일하거나, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는, 재조합 폴리펩타이드.
  30. 제24항에 있어서,
    상기 [α]3 도메인이 서열번호 11의 [α]3 도메인의 아미노산 서열과 동일한, 재조합 폴리펩타이드.
  31. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 친화성 상수 K d 40 μM 미만으로 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는, 재조합 폴리펩타이드.
  32. 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 친화성 상수 K d 20 μM 미만으로 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는, 재조합 폴리펩타이드.
  33. 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 친화성 상수 K d 10 μM 미만으로 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는, 재조합 폴리펩타이드.
  34. 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 다이머 또는 멀티머인, 재조합 폴리펩타이드.
  35. 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    i)에 따른 상기 펩타이드 항원 서열이 아미노산 7-11개 길이, 바람직하게는 아미노산 8-10개 길이인, 재조합 폴리펩타이드.
  36. 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 i) 내지 vii)의 구성성분들을 모두 포함하나, 바람직하게는 viii) 내지 ix)의 구성성분은 포함하지 않는, 재조합 폴리펩타이드.
  37. 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 i) 내지 ix)의 구성성분들을 모두 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
  38. 제22항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    N 말단에 분비 신호 펩타이드 서열을 더 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
  39. 제1항 내지 제21항 또는 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    의약제로 사용하기 위한 것인, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
  40. 제1항 내지 제21항 또는 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체에서 펩타이드 항원-특이적인 면역조절 방법에 사용하기 위한 것이고, 상기 면역조절이 상기 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드에 포함된 펩타이드 항원에 특이적인, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 면역조절 방법이 상기 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드에 포함된 펩타이드 항원에 대한 면역 관용 (immunological tolerance)을 유발하기 위한 것인, 제40항에 따라 사용하기 위한, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서,
    상기 면역조절 방법이 자가면역 질환의 억제 방법, 알레르기 억제 방법, 생물치료 약물에 대한 면역 반응 억제 방법, 배아 항원 (embryonic antigen)에 대한 면역 반응 억제 방법 또는 이식된 세포, 조직 또는 장기에 대한 면역 반응 억제 방법인, 제40항 또는 제41항에 따라 사용하기 위한, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 면역조절 방법이 면역 관용을 유도하는 방법이고, 상기 자가면역 질환이 복수의 장기, 호르몬 생산 장기, 신경, 관절, 피부, 위장 시스템, 눈, 혈액 성분 또는 혈관에 작용하는 질환인, 제42항에 따라 사용하기 위한, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
  44. 제41항에 있어서,
    상기 방법이 크론병, 궤양성 대장염, 전신성 홍반성 루프스 (SLE), 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선, 경피증, 시신경 척수염 또는 1형 당뇨병에서 면역 반응을 억제하기 위한 방법인, 제41항에 따라 사용하기 위한, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
  45. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 MHC 클래스 Ib 분자를 코딩하는 핵산.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 핵산이 벡터인, 핵산.
  47. 제45항 또는 제46항에 따른 핵산을 포함하는 약학적 조성물.
  48. 제45항 또는 제46항에 따른 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  49. 제22항 내지 38항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서,
    제48항에 따른 재조합 숙주 세포를 핵산 분자의 발현을 허용하는 조건에서 배양하고, 생산된 폴리펩타이드를 회수하는 것을 포함하는, 방법.
  50. 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원에 대한 면역 반응을 인간 개체에서 유도하는 방법에 사용하기 위한 조합물 (combination)로서,
    a1) 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원, 또는 상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원을 코딩하는 핵산, 또는 상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원를 포함하는 약독화된 유기체, 또는 a2) a1)에 따른 상기 펩타이드 항원을 제시하는 세포; 및
    b) MHC 클래스 Ib 분자와 이의 수용체 간의 결합을 차단할 수 있는 물질을 포함하는, 조합물.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 물질이 상기 인간 MHC 클래스 Ib 분자 및/또는 이의 수용체에 결합할 수 있는, 조합물.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서,
    상기 물질이 HLA-G에 결합할 수 있는, 조합물.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질이 HLA-G에 결합할 수 잇는 항체, 바람직하게는 단일클론 항체인, 조합물.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질이 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는, 조합물.
  55. 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질이 ILT2 또는 ILT4에 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는 단일클론 항체인, 조합물.
  56. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질이 항체의 Fc 도메인 또는 이의 단편을 포함하는, 조합물.
  57. 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질이 MHC 클래스 Ib 분자의 [α]3 도메인을 포함하는, 조합물.
  58. 제50항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질이 ILT2 또는 ILT4 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인, 바람직하게는 ILT2 또는 ILT4 수용체의 2 이상의 N-말단 세포외 도메인을 포함하고, 상기 물질이 용해성 ILT2 또는 ILT4 수용체를 더 포함하는, 조합물.
  59. 제50항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질이, 상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원 또는 상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원을 코딩하는 상기 핵산 또는 상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원을 포함하는 상기 약독화된 유기체의 투여와 동시에, 투여 전 또는 투여 후, 투여되는, 조합물.
  60. 제50항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조합물이 a) 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원; 및 b) MHC 클래스 Ib 분자와 이의 수용체 간의 결합을 차단할 수 있는 물질의 조합인, 조합물.
  61. 제50항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조합물이 a) 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원을 코딩하는 핵산; 및 b) MHC 클래스 Ib 분자와 이의 수용체 간의 결합을 차단할 수 있는 물질의 조합인, 조합물.
  62. 제50항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조합물이 a) 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원을 포함하는 약독화된 유기체; 및 b) MHC 클래스 Ib 분자와 이의 수용체 간의 결합을 차단할 수 있는 물질의 조합인, 조합물.
  63. 제62항에 있어서,
    상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원을 포함하는 약독화된 유기체가 약독화된 바이러스인, 조합물.
  64. 제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    a)에 따른 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원이 종양 항원 또는 상기 항원에 대해 교차-예방을 유도할 수 있는 종양 항원과 77% 이상 동일한 항원인, 조합물.
  65. 제50항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법이 T 세포 기반의 면역요법을 위한 방법인, 조합물.
  66. 제50항 내지 제63항 또는 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원이 병원성 미생물 또는 바이러스에서 검출가능한, 조합물.
  67. 제50항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법이 감염성 질환 또는 악성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법인, 조합물.
  68. 제67항에 있어서,
    상기 질환이 암이고, 상기 펩타이드 항원이 종양 항원인, 조합물.
  69. 제68항에 있어서,
    상기 암이 흑색종, 신장암, 난소 암종, 결장직장암, 유방암, 위암, 췌관 선암종, 전립선암, B 및 T 세포 림프종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조합물.
  70. 제50항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조합물이 하나의 약학적 조성물에 존재하는, 조합물.
  71. 제50항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원에 대한 면역 반응이 상기 항원성 단백질 또는 펩타이드 항원에 특이적인, 조합물.
  72. 인간 개체에서 암 치료 방법에 사용하기 위한, 제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 MHC 클래스 Ib 분자와 이의 수용체 간의 결합을 차단할 수 있는 물질로서,
    상기 방법이 상기 암의 세포로부터 암 항원의 방출을 유발하는 테라피 (therapy)를 포함하는, 물질.
  73. 제72항에 있어서,
    상기 암 항원의 방출을 유발하는 테라피가 화학요법 또는 방사선요법인, 물질.
  74. 제41항에 있어서,
    펩타이드 항원에 대한 면역 관용을 유도하는 방법이 펩타이드 약물 치료를 더 포함하고,
    상기 펩타이드 항원이 1) 펩타이드 약물과 동일하거나, 또는 2) 상기 펩타이드 약물의 단편이거나, 또는 3) 상기 펩타이드 약물에 대해 면역 관용을 유도할 수 있는 상기 펩타이드 약물의 단편의 유도체인, 제41항에 따라 사용하기 위한, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
  75. 제41항에 있어서,
    펩타이드 항원에 대한 면역 관용을 유도하는 방법이 단백질 약물 치료를 더 포함하고,
    펩타이드 항원이 1) 단백질 약물의 단편이거나, 또는 2) 상기 단백질 약물에 대해 면역 관용을 유도할 수 있는 상기 단백질 약물의 단편의 유도체인, 제41항에 따라 사용하기 위한, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
  76. 제74항에 있어서,
    상기 펩타이드 약물이 펩타이드 약물 자체의 형태로 투여되는, 제74항에 따라 사용하기 위한, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
  77. 제75항에 있어서,
    상기 단백질 약물이 단백질 약물 자체의 형태로 투여되는, 제75항에 따라 사용하기 위한, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
  78. 제74항에 있어서,
    상기 펩타이드 약물이 유전자 테라피에 의해 투여되고, 상기 유전자 테라피가 상기 펩타이드 약물을 코딩하는 유전자를 이용한 유전자 테라피인, 제74항에 따라 사용하기 위한, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
  79. 제75항에 있어서,
    상기 단백질 약물이 유전자 테라피에 의해 투여되고, 상기 유전자 테라피가 상기 단백질 약물을 코딩하는 유전자를 이용한 유전자 테라피인, 제75항에 따라 사용하기 위한, 약학적 조성물 또는 재조합 폴리펩타이드.
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