JP2019517790A - ＴＧＦβＲＩＩのフレームシフト変異体を認識するＴ細胞受容体 - Google Patents

ＴＧＦβＲＩＩのフレームシフト変異体を認識するＴ細胞受容体 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒトＴＧＦβＲＩＩにおける癌関連「−１Ａ」フレームシフト変異の結果として産生されるネオペプチドを認識するＴＣＲ分子に関する。ＴＣＲ分子は、配列番号１のペプチドがクラスＩＭＨＣによって提示されると該ペプチドに結合することができ、α鎖ドメイン及びβ鎖ドメインを含み、各鎖ドメインは３つのＣＤＲ配列を含み、ａ）α鎖ドメインのＣＤＲ１、２及び３はそれぞれ配列番号２、３及び４の配列を有し、ｂ）β鎖ドメインのＣＤＲ１、２及び３はそれぞれ配列番号５、６及び７の配列を有し、前記ＣＤＲ配列の１つ以上は、場合によっては、１又は２個のアミノ酸の置換、付加又は欠失によって改変され得る。こうしたＴＣＲをコードする核酸分子が提供され、これらのＣＤＲ配列を有する可溶性ＴＣＲ分子も提供される。本発明の核酸分子を使用して、免疫エフェクター細胞を改変して、本明細書に定義されたＴＣＲを発現することができ、こうした改変免疫エフェクター細胞は、癌の治療に有用であり、上で定義された可溶性ＴＣＲも同様である。

Description

本発明は、形質転換増殖因子β受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩ）のフレームシフト変異体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に関する。これらのＴＣＲは、癌、特にＴＧＦβＲＩＩの特定のフレームシフト変異を含む癌の処置に使用される。本発明は、ＴＣＲ分子、こうしたＴＣＲをコードする核酸分子、及びこれらの核酸分子を含むベクターを提供する。提供される核酸分子及びベクターを使用して、ＴＣＲを発現するように、特にＴ細胞を含めて、免疫エフェクター細胞を改変することができる。核酸分子及びベクターを使用して、ＴＣＲを産生するように産生宿主細胞を改変することもできる。こうした改変免疫エフェクター細胞は養子細胞移入治療に使用することができる。特に、本発明のＴＣＲは、本明細書ではＲａｄｉｕｍ−１として識別される特定のＴＣＲに基づき、又は由来し、Ｒａｄｉｕｍ−１は、ＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドで免疫された臨床反応患者から単離された細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）クローン中で同定され、フレームシフトペプチドネオエピトープ配列ＲＬＳＳＣＶＰＶＡ（配列番号１）を認識する。
世界的に、結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、男性で３番目に多い癌であり、女性では２番目に多い癌であり、ＣＲＣの最も高い割合は西洋で見られる。リンチ症候群、すなわち遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ：ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｎｏｎ−ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）は、ＤＮＡミスマッチ修復が障害されて、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を生ずる遺伝性疾患である。リンチ症候群の患者は、ＣＲＣを含めて種々の癌を発症するリスクが高い。結腸直腸癌及び胃癌を含めた散発性癌（すなわち非遺伝性癌）のサブセットもＭＳＩを示す。
ＭＳＩは、短い反復ＤＮＡ配列における単一又はジヌクレオチドの挿入又は欠失をもたらす。こうした変異がタンパク質をコードする遺伝子に生じると、それらは、遺伝子のリーディングフレームのシフトを生じる（すなわち、それらはフレームシフト変異である）。こうした変異は、一般に、切断された非機能性タンパク質の生成を招く。
形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）タンパク質は、細胞表面のＴＧＦβＲＩＩ受容体タンパク質に結合し、シグナル伝達経路を活性化して、細胞周期停止を招く。ＴＧＦβＲＩＩの変異は、この経路を不活性化して、発癌の一因となり得る。ＴＧＦβＲＩＩを不活性化するフレームシフト変異は、マイクロサテライト不安定（ＭＳＩ＋）結腸癌の約９０％、マイクロサテライト安定（ＭＳＳ、非ＭＳＩ＋又はＭＳＩ−）結腸癌の約１５％で起こる。これらの変異は、主として、ＴＧＦβＲＩＩのエキソン３における変異しやすいポリアデニン鎖で起こる。
ＭＳＩ＋結腸癌は、それらの転写配列のコード領域内にマイクロサテライト反復を含む遺伝子におけるフレームシフト変異によって生成されるネオペプチド（すなわち、個体中に天然に見られない配列を有し、したがって免疫系によって「非自己」として認識されるペプチド）の産生のために、ＭＳＳ癌よりも免疫原性が高いと考えられる。リンチ症候群患者及び散発性結腸癌のＭＳＩ＋サブタイプの患者は、他の散発性結腸癌患者に比べて予後が改善される。ＭＳＩ＋結腸癌におけるあるフレームシフト変異の数及び存在は、これらの癌を特徴づける腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ：ｔｕｍｏｕｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）の密度増加と相関する。ＭＳＩ＋結腸直腸癌におけるＴＩＬの密度増加と非ＭＳＩ＋結腸直腸癌に比べた生存の改善との相関も十分に証明されている。高められた宿主免疫応答は、これらの癌の予後の改善を少なくともある程度説明することができる。これらの観察は、一部のＭＳＩ＋ＣＲＣ患者が、ＴＧＦβＲＩＩなどの遺伝子におけるフレームシフト変異の産物を標的にした免疫療法の恩恵を受け得ることを示唆している。
Ｔ細胞エピトープは、これらのフレームシフト変異に由来するネオペプチド内で確認された。１個のアデニン残基がＴＧＦβＲＩＩのエキソン３中の上記ポリアデニン鎖から失われたＴＧＦβＲＩＩ「−１Ａ」変異は、ＣＤ４+Ｔ細胞エピトープとＣＤ８+Ｔ細胞エピトープの両方を含めたＴ細胞エピトープを含むネオペプチドの産生をもたらす変異の一例である。
Ｔ細胞エピトープは、Ｔ細胞の細胞膜から突出するタンパク質複合体であるＴＣＲによって認識される。大部分のＴＣＲはα及びβ鎖を含み、その両方が可変領域及び定常領域からなる。可変領域は、鎖のＮ末端に位置し、全体的に細胞外である。定常領域は鎖のＣ末端に位置し、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び短い細胞質ドメインからなる。ＴＣＲ鎖は、Ｎ末端シグナル（又はリーダー）配列を有する未熟型でコードされ、合成される。この配列は、合成されたときにα又はβＴＣＲ鎖の可変領域のＮ末端を形成する。ＴＣＲ鎖の合成後、シグナル配列は切断され、細胞表面に位置する成熟ＴＣＲには存在しない。最近、天然ＴＣＲ中に存在するα及びβ鎖の可変領域及び定常領域の細胞外ドメインを含むが、定常領域の膜貫通及び細胞質ドメインがない可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）が開発された。可溶性ＴＣＲは、任意の細胞が発現することができ、分泌される。
α又はβ鎖の可変領域は、３つの超可変、相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を含む。これらのＣＤＲは、ＴＣＲの特異性を決定し、ＣＤＲ３（すなわち、Ｎ末端から３番目のＣＤＲ）は、ＴＣＲ特異性を決定するのに最も重要なＣＤＲである。ＴＣＲ鎖の可変領域のＣＤＲを形成しない部分は、フレームワーク領域として知られる。ＴＣＲ可変領域は、４つのこうしたフレームワーク領域を含む。フレームワーク領域１はＮ末端からＣＤＲ１までであり、フレームワーク領域２はＣＤＲ１とＣＤＲ２を連結し、フレームワーク領域３はＣＤＲ２とＣＤＲ３を連結し、フレームワーク領域３はＣＤＲ３をＴＣＲ鎖の定常領域に連結する。これらのフレームワーク領域は、ＣＤＲよりもはるかに変わりにくく、ＣＤＲの足場を形成する。フレームワーク領域の配列は、ＴＣＲ鎖の可変領域の全体構造を決定するので、ＴＣＲ機能に重要である。この構造は、ＣＤＲを正しい配向で保持し、それらが標的抗原に結合する相対位置を保持しなければならない。
したがって、ＴＣＲの可変領域は標的抗原に結合し、ＴＣＲ抗原はタンパク質である。ＴＣＲが結合する抗原の特定の部分は、Ｔ細胞エピトープである。Ｔ細胞エピトープは、短い抗原断片であり、一般に８〜１７アミノ酸長のペプチドである。関連する抗原断片は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ：Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ）によってＴＣＲに提示される。抗原に結合すると、ＴＣＲは、シグナル伝達経路を活性化し、それによってＴ細胞を活性化して、免疫応答を惹起する。
クラスＩ及びクラスＩＩの２つのクラスのＭＨＣが存在する。クラスＩＭＨＣは、すべての有核細胞によって発現され、クラスＩＩＭＨＣは、樹状細胞などの専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）によってのみ発現される。すべてのＭＨＣの機能は、Ｔ細胞による認識のために短いペプチドセグメントを提示することである。クラスＩＭＨＣは、それが発現される細胞内からのペプチド断片を提示し、ＣＤ８+Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞）によって認識される。ＣＤ８+Ｔ細胞がクラスＩＭＨＣによって提示されたペプチドを抗原として認識すると、Ｔ細胞は、そのクラスＩＭＨＣが発現される細胞のアポトーシスを誘発する。クラスＩＩＭＨＣは、それが発現されるＡＰＣによってエンドサイトーシスされたタンパク質からのペプチド断片を提示し、ＣＤ４+Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）によって認識される。ナイーブＣＤ４+Ｔ細胞は、クラスＩＩＭＨＣによって提示されたペプチドを抗原として認識すると増殖する。次いで、その娘細胞がエフェクター、メモリー及び制御性Ｔ細胞に分化し、免疫系の別の成分による免疫応答を一緒に媒介し、感染に対して長期の免疫を提供する。したがって、クラスＩＭＨＣは、一般に、ウイルス感染細胞又は異常タンパク質を産生する原因となる変異を含む細胞（癌細胞、前癌細胞など）に対して免疫応答を惹起するのに重要であり、クラスＩＩＭＨＣは、一般に、細胞外病原体に対して免疫応答を惹起するのに重要である。
ヒトにおいては、ＭＨＣは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ：Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）として知られるタンパク質からなる。どのヒトも、３つの主要なクラスＩＭＨＣ ＨＬＡ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ）及び６つの主要なクラスＩＩＭＨＣ ＨＬＡ遺伝子（ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１）を有する。ＴＣＲがＭＨＣ−抗原複合体に結合すると、抗原とＭＨＣタンパク質の両方にＴＣＲが接触する。これは、ＴＣＲが、単に抗原ではなく、特定のＭＨＣ−抗原複合体を認識することを意味する。ＴＣＲとＭＨＣのこの相互作用はＣＤＲ２を介すると考えられ、ＴＣＲが、特定のＨＬＡタンパク質と複合化したときにのみ抗原を認識することを意味する。これは、ＭＨＣ拘束として知られる特徴である。ＨＬＡ遺伝子は多形性が高く、これは、異なる個体が異なるＨＬＡ対立遺伝子を有する傾向があることを意味し、特定のＴＣＲがすべての個体で機能するわけではないことを意味する（ＴＣＲが拘束される適切なＨＬＡ対立遺伝子を有する個体のみ）。
腫瘍抗原を認識するＴＣＲは、癌治療、特に養子Ｔ細胞移入治療に使用することができる（非特許文献１）。Ｔ細胞は、腫瘍抗原を認識するＴＣＲをコードする遺伝子の移入によって腫瘍細胞に対して再標的化することができる。これらの再標的Ｔ細胞を、関連抗原を産生する癌に罹患した癌患者に導入することができる。これらのＴ細胞は、次いで、癌細胞に対する免疫応答を開始し、それらを死滅させるはずである。これは、標的腫瘍のサイズを縮小し、その結果、患者を治癒させ、又は少なくとも延命させることができると期待される。
しかし、最近の臨床試験によれば、癌生殖系列抗原を標的にしたＴＣＲリダイレクトＴ細胞の養子移入は、重度の毒性に関連する可能性があり、抗原の選択を慎重に考慮する必要性が強調されている。一研究においては、抗ＭＡＧＥ−Ａ３ＴＣＲ改変自己Ｔ細胞（ＭＡＧＥ−Ａ３は、黒色腫を含めた癌に関連するが正常細胞中にも存在する機能不明なタンパク質である、黒色腫関連抗原３である）で処置された９名の癌患者のうち３名は、ＴＣＲの交差反応性のために重度の神経毒性を経験した（２つの症例では致命的であった）（非特許文献２）。ＨＬＡ−Ａ*０１拘束性ＴＣＲを有する骨髄腫及び黒色腫患者におけるＭＡＧＥ−Ａ３を標的にした第２の研究は、心筋損傷との致死的交差反応性を示した（非特許文献３、４）。したがって、真性腫瘍特異性ネオ抗原は、ＴＣＲ治療の理想的な標的かも知れず、正常組織破壊の非存在下で腫瘍を選択的に標的にする。しかし、これは、こうしたネオ抗原の大部分が患者間で共有されない独特の変異によるので、問題となり得る。Ｔ細胞を用いた養子細胞移入治療の更なる課題は、ＴＣＲが、上述したように、ＭＨＣ限定的であることである。したがって、個々のＴＣＲは、それが限定されるＨＬＡ対立遺伝子又は関連アイソフォームを有する個体においてのみ機能する。
本願の発明者らは、養子Ｔ細胞移入治療に使用されるＴＣＲを単離した。このＴＣＲは、ＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドを接種したＭＳＩ＋結腸癌患者から単離されたＨＬＡ−Ａ２拘束性ＴＧＦβＲＩＩフレームシフト変異特異的ＴＣＲである。Ｒａｄｉｕｍ−１として知られるこのＴＣＲは、フレームシフト変異を有する癌細胞を認識するＴ細胞をリダイレクトし、動物モデルにおける癌増殖を抑制するのに特に有効であることが示された。Ｒａｄｉｕｍ−１は、医学分野での使用を特に有用にする性質を有する著しく有効なＴＣＲである。Ｒａｄｉｕｍ−１は、その同種抗原／ＭＨＣ複合体に対して極めて高い親和性を有する。同種抗原／ＭＨＣ複合体に対するその親和性は、ＭＡＲＴ−１特異的ＴＣＲ ＤＭＦ５のその同種抗原／ＭＨＣ複合体に対する親和性よりも高い。ＤＭＦ５は、黒色腫の処置に臨床的に成功裏に使用された。抗原に対する高い親和性は、臨床用ＴＣＲの必須の特性であり、その標的に対するＲａｄｉｕｍ−１のこの高い親和性は、動物モデルにおいて非常に成功した腫瘍の処置と合わせて、臨床用途へのその大きな可能性を示すものである。Ｒａｄｉｕｍ−１は、ＣＤ４及びＣＤ８共受容体に依存しないまれな性質も有する。大部分のＴＣＲは、共受容体ＣＤ８又はＣＤ４と標的細胞上のＭＨＣ複合体との間の標的細胞死滅を媒介する相互作用を必要とするが、これはＲａｄｉｕｍ−１には当てはまらず、すなわち、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の両方がＲａｄｉｕｍ−１を機能的に発現することができ、標的細胞死滅を直接媒介し得ることが示された。
Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲは、配列番号４９（ＳＬＶＲＬＳＳＣＶＰＶＡＬＭＳＡＭＴＴＳＳＳＱ）のペプチドを接種した患者から単離された。癌に対するヒトの接種におけるこうしたペプチドの使用は、特許文献１に記載されている。Ｒａｄｉｕｍ−１は、特許文献１に記載の研究と同様に接種された患者から得られたＴ細胞クローンから単離された。しかし、Ｒａｄｉｕｍ−１が由来する特定の患者は、その特別な研究の一部ではなく、２００１年に行われたもっと後の臨床試験の一部である。Ｒａｄｉｕｍ−１は、配列番号１の配列（ＲＬＳＳＣＶＰＶＡ）を有するエピトープを認識する。これは、それ自体が養子Ｔ細胞移入治療の最適な標的であるＴＧＦβＲＩＩの上記−１Ａフレームシフト変異に起因するネオペプチドであり、その配列は正常なヒトプロテオームには見られず、ＴＣＲ毒性が最小であるはずであることを意味する。配列番号１などの頻繁に起こるフレームシフト変異から得られるネオ抗原は、養子Ｔ細胞移入治療の理想的標的である。
さらに、Ｒａｄｉｕｍ−１は、ＨＬＡ−Ａ２拘束性である（ＨＬＡ−Ａ２は、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子である）。Ｒａｄｉｕｍ−１は、ＨＬＡ−Ａ２のＨＬＡ−Ａ*０２：０１アイソフォームに関連して抗原を認識することが示されたが、別のＨＬＡ−Ａ２アイソフォームを認識することができる。ＨＬＡ−Ａ２は、最も一般的なＨＬＡ対立遺伝子の１種であり、ＨＬＡ−Ａ*０２：０１は、コーカサスアメリカ人及びヨーロッパ人の約４０〜５０％が保有する（非特許文献５）。ＴＣＲは、したがって、かなりの割合の欧米人において機能すると予想される。Ｒａｄｉｕｍ−１でリダイレクトされたＴ細胞、又は本発明の関連ＴＣＲは、したがって、癌治療に使用される。特に、それらは、例えばＴ細胞を用いた、養子細胞移入治療に使用される。こうしたリダイレクトＴ細胞、又は別の免疫エフェクター細胞は、リンチ症候群患者でしばしば見られるものなどのＭＳＩ＋ＣＲＣを含めて、−１Ａ ＴＧＦβＲＩＩフレームシフト変異を含む任意の癌の治療に特に使用される。
ＴＧＦβＲＩＩの−１Ａフレームシフト変異に起因するネオペプチドは、癌免疫療法の可能な標的として記述された（例えば、特許文献１、非特許文献６〜８を参照されたい）。しかし、単に関連抗原配列の知識から標的抗原に結合する機能的ＴＣＲを設計することは不可能である。特定のＨＬＡタンパク質対立遺伝子に関連して特定の抗原に結合するために、ＴＣＲが必要とするであろうタンパク質配列を予測することは不可能である。したがって、一般的なＨＬＡ対立遺伝子に関連してＴＧＦβＲＩＩフレームシフト変異から得られるネオ抗原に結合するＴＣＲが有用であるかもしれないという認識にもかかわらず、現在利用可能なツールを用いて熟練者がこうしたＴＣＲを設計することができないので、有効なこうしたＴＣＲを利用できないこと、特にこうしたＴＣＲのための公知の配列がないことは問題であった。フレームシフトネオ抗原ペプチドを認識するすべてのＴＣＲが該ペプチドを発現する癌細胞に対して細胞応答を刺激するのに実際に有効であり得るわけではないことに留意することが重要である。本明細書に開示され、まさにこうしたＴＣＲである、Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲの単離及び特性分析は、この問題に解決策を提供するものである。
Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲはこれまで公的に入手できなかったが、Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲのα及びβ鎖のＣＤＲ３配列が、非特許文献９に開示された。しかし、ＣＤＲ３配列を把握しても、機能的ＴＣＲは各鎖で２つの更なるＣＤＲ配列も必要とするので、全ＴＣＲ鎖の機能的配列を予測することは依然不可能である。本発明は、今回、Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲ、特にＲａｄｉｕｍ−１のＣＤＲ１及び２のための全配列情報を提供する。
国際公開第１９９９／０５８５５２号
Ｊｕｎｅ，Ｃ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００７ Ｊｕｎ １；１１７（６）：１４６６〜１４７６ Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら（２０１３）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、３６（２）：１３３〜１５１ Ｌｉｎｅｔｔｅ，Ｇ．Ｐ．ら（２０１３）、Ｂｌｏｏｄ １２２（６）：８６３〜８７１ Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｂ．Ｊ．ら（２０１３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５（１９７）：１９７ｒａ１０３ ｗｗｗ．ａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ．ｎｅｔ Ｓｅｔｅｒｄａｌ、Ｉ．ら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９８、ｐｐ．１３２５５〜１３２６０ Ｓｅｔｅｒｄａｌ、Ｉ．ら、２００１、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０（９）：４６９〜４７６ Ｌｉｎｎｅｂａｃｈｅｒ、Ｍ．ら、２００１、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｕ ｃａｎｃｅｒ ９３（１）：６〜１１ Ｅｌｓｅ Ｍａｒｉｔ Ｉｎｄｅｒｂｅｒｇ Ｓｕｓｏ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｓｌｏ、２０１１年ＰｈＤ学位論文「Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ； Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ」
したがって、本発明は、まず、配列番号１の配列を含む変異ＴＧＦβＲＩＩタンパク質に対するＴＣＲ分子をコードする核酸分子であって、前記ＴＣＲ分子は、配列番号１のペプチドがクラスＩＭＨＣによって提示されると前記ペプチドに結合することができ、前記ＴＣＲ分子はα鎖ドメイン及び／又はβ鎖ドメインを含み、各鎖ドメインは３つのＣＤＲ配列を含み、
ａ）α鎖ドメインのＣＤＲ１、２及び３はそれぞれ配列番号２、３及び４の配列を有し、
ｂ）β鎖ドメインのＣＤＲ１、２及び３はそれぞれ配列番号５、６及び７の配列を有し、
前記ＣＤＲ配列の１つ以上、より具体的な一実施形態においては前記ＣＤＲ１又はＣＤＲ２配列の１つ以上は、場合によっては、１又は２個のアミノ酸の置換、付加又は欠失によって改変されてもよい、
核酸分子を提供する。
Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２及び配列番号３で示され、以前に開示されたＲａｄｉｕｍ−１α鎖のＣＤＲ３の配列は配列番号４で示される。Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５及び配列番号６で示され、以前に開示されたＲａｄｉｕｍ−１β鎖のＣＤＲ３の配列は配列番号７で示される。
α鎖のＣＤＲ配列は、Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖の可変領域のＣＤＲ配列であり、又はそれに対応する。Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖の可変領域の配列は、配列番号８で示される。β鎖のＣＤＲ配列は、Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖の可変領域のＣＤＲ配列であり、又はそれに対応する。Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖の可変領域の配列は、配列番号１３で示される。Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖のＣＤＲ１、２及び３にそれぞれ対応する配列番号２、３及び４は、それぞれ配列番号８の位置４７〜５１、６９〜７３及び１０７〜１１７に位置する。Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖のＣＤＲ１、２及び３にそれぞれ対応する配列番号５、６及び７は、それぞれ配列番号１３の位置４６〜５０、６８〜７３及び１１０〜１２２に位置する。
ＴＣＲ鎖のＣＤＲ１又はＣＤＲ２の配列の変更は、ＴＣＲの特異性を変える可能性が低く、ＴＣＲとその標的抗原の結合親和性を向上させ得る。したがって、好ましい一実施形態においては、ＣＤＲ３は無改変であり、更に好ましい一実施形態においては、ＣＤＲのすべてが改変されていない。
本発明の核酸分子は、変異ＴＧＦβＲＩＩ受容体を発現する、又はより具体的には配列番号１のフレームシフトペプチドを提示する、細胞に対する免疫エフェクター細胞（より具体的には、改変免疫エフェクター細胞）を調製するのに使用することができる。こうした（改変）免疫エフェクター細胞は、その細胞表面にＴＣＲを発現し、配列番号１のペプチドを提示する標的細胞、例えば癌細胞を認識することができ、又はそれに結合することができる。したがって、核酸分子は、前記ＴＣＲ（すなわち、核酸分子によってコードされるＴＣＲ）を発現する免疫エフェクター細胞が、配列番号１のフレームシフトペプチドを提示する標的細胞に対するエフェクター活性（例えば、細胞傷害活性）能力（例えば、死滅）があるようなものとすることができる。換言すれば、核酸分子は、免疫エフェクター細胞の表面で発現されたときに配列番号１のペプチドがクラスＩＭＨＣによって提示されると前記ペプチドに結合することができるＴＣＲ分子をコードする。したがって、改変免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変又は操作された免疫エフェクター細胞であり、又は言い換えれば本発明の核酸分子が導入された免疫エフェクター細胞である。
したがって、一実施形態においては、本発明は、配列番号１の配列を含む変異ＴＧＦβＲＩＩタンパク質に対するＴＣＲ分子をコードする核酸分子であって、前記ＴＣＲ分子は、免疫エフェクター細胞の表面に発現されたときに、配列番号１のペプチドがクラスＩＭＨＣによって提示されると前記ペプチドに結合することができ、前記ＴＣＲ分子はα鎖ドメイン及び／又はβ鎖ドメインを含み、各鎖ドメインは３つのＣＤＲ配列を含み、
ａ）α鎖ドメインのＣＤＲ１、２及び３はそれぞれ配列番号２、３及び４の配列を有し、
ｂ）β鎖ドメインのＣＤＲ１、２及び３はそれぞれ配列番号５、６及び７の配列を有し、
前記ＣＤＲ配列の１つ以上、より具体的な一実施形態においては前記ＣＤＲ１又はＣＤＲ２配列の１つ以上は、場合によっては、１又は２個のアミノ酸の置換、付加又は欠失によって改変されてもよい、
核酸分子を提供することがわかる。
あるいは、本発明の核酸分子は、可溶性ＴＣＲ分子の宿主細胞による発現に使用することができる。本発明の可溶性ＴＣＲ分子は、配列番号１のペプチドがクラスＩＭＨＣによって提示されると前記ペプチドに結合することができ、特に、標的細胞を死滅させるために、配列番号１のフレームシフトペプチドを提示する標的細胞に毒素を送達するのに使用することができる。したがって、本発明の核酸分子は、免疫エフェクター細胞によって発現されると細胞表面に局在するＴＣＲをコードすることができ、あるいは、本発明の核酸分子は、可溶性ＴＣＲをコードすることができる。
したがって、別の一実施形態においては、本発明は、配列番号１の配列を含む変異ＴＧＦβＲＩＩタンパク質に対する可溶性ＴＣＲ分子をコードする核酸分子であって、前記ＴＣＲ分子は、宿主細胞によって発現されるときに、分泌され、配列番号１のペプチドがクラスＩＭＨＣによって提示されると前記ペプチドに結合することができ、前記ＴＣＲ分子はα鎖ドメイン及び／又はβ鎖ドメインを含み、各鎖ドメインは３つのＣＤＲ配列を含み、
ａ）α鎖ドメインのＣＤＲ１、２及び３はそれぞれ配列番号２、３及び４の配列を有し、
ｂ）β鎖ドメインのＣＤＲ１、２及び３はそれぞれ配列番号５、６及び７の配列を有し、
前記ＣＤＲ配列の１つ以上、より具体的な一実施形態においては前記ＣＤＲ１又はＣＤＲ２配列の１つ以上は、場合によっては、１又は２個のアミノ酸の置換、付加又は欠失によって改変されてもよい、
核酸分子を提供することがわかる。
本発明の核酸分子は、細胞における発現のためのｍＲＮＡ又はＤＮＡとして、細胞、特にＴ細胞などの免疫エフェクター細胞又は産生宿主細胞に導入することができる。ベクターを使用して、核酸分子を細胞に移入し、又は移入用核酸を産生する（例えば、移入用ｍＲＮＡを産生する、又は細胞に移入するための発現ベクターの調製のために核酸分子を産生する）ことができる。
したがって、本発明の更なる一態様は、本明細書に定義した本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。
ベクターは、例えばｍＲＮＡ発現ベクター、クローニングベクター、又は免疫細胞若しくは産生宿主細胞に移入するための発現ベクター、例えばウイルスベクターとすることができる。ベクターがウイルスベクターである場合、それは、例えば、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターとすることができる。
本発明の別の一態様は、本明細書に定義した本発明の核酸分子又はベクターを含む免疫エフェクター細胞を提供する。好ましい実施形態においては、免疫エフェクター細胞をＴ細胞又はＮＫ細胞とすることができる。
免疫エフェクター細胞がＴ細胞（又はより具体的には、ＣＤ８+Ｔ細胞又はヒトＣＤ８+Ｔ細胞）である特定の一実施形態においては、ＴＣＲ又はより具体的には核酸分子は、Ｔ細胞に天然のものではなく、すなわち、核酸分子はＴ細胞に内在するものではなく、Ｔ細胞に導入されるものである。換言すれば、Ｔ細胞は、核酸分子又はベクターで改変され、すなわち、ＴＣＲを発現するように改変され、天然、すなわち自然起源のＴ細胞ではない。
本発明は、本明細書に定義した本発明の核酸分子又はベクターを含む産生宿主細胞も提供する。好ましい実施形態においては、産生宿主は、哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３Ｔ又はＣＨＯ細胞である。
配列番号１のＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドを特異的に認識する免疫エフェクター細胞を製造する方法であって、本発明の核酸分子又はベクターを免疫エフェクター細胞に導入することを含む方法も提供する。
こうした方法は、細胞を刺激すること、及び核酸分子又はベクターを導入する前及び／又は後に増殖するように細胞を誘導することを含むことができる。
本発明は、本明細書に定義したＴＣＲ分子、特に本明細書に定義した可溶性ＴＣＲ分子も提供する。上述したように、また、更に後述するように、可溶性ＴＣＲは治療に有用である。
上述したように、本発明の可溶性ＴＣＲ及び免疫エフェクター細胞は治療に有用である。したがって、本発明の更なる態様としては、
本明細書に定義した本発明の可溶性ＴＣＲ又は免疫エフェクター細胞及び少なくとも１種の生理的に許容される担体又は賦形剤を含む組成物、特に治療又は医薬組成物、
治療、特に養子細胞移入治療に使用される、本明細書に定義した本発明の可溶性ＴＣＲ、免疫エフェクター細胞又は組成物、
癌の処置、特にＨＮＰＣＣに起因する結腸直腸癌の処置に使用される、本明細書に定義した本発明の可溶性ＴＣＲ、免疫エフェクター細胞又は組成物、
癌、特に結腸直腸癌を処置する方法であって、それを必要とする対象に本明細書に定義した本発明の可溶性ＴＣＲ、免疫エフェクター細胞又は組成物、特に有効量の前記細胞又は組成物を投与することを含む、方法、並びに
癌治療に使用される、特に結腸直腸癌の処置のための、医薬品（又は組成物）の製造への本明細書に定義した本発明の可溶性ＴＣＲ又は免疫エフェクター細胞の使用
が挙げられる。
本発明の改変免疫エフェクター細胞を製造する方法においては、本発明の核酸分子の導入によって改変される免疫エフェクター細胞を処置対象（例えば、結腸直腸癌などの癌を有する対象）から得ることができる。免疫エフェクター細胞の改変、及び場合によってはそのインビトロで増大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）させた後、ＴＣＲを発現する改変免疫エフェクター細胞を対象に再導入する（すなわち、投与する）ことができる。したがって、自己免疫エフェクター細胞を本発明の治療方法及び使用に使用することができる。あるいは、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）（すなわち、ドナー若しくは同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）、又は同系（ｓｙｎｇｅｎｉｃ）若しくは異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ））免疫エフェクター細胞を使用することができる。
免疫エフェクター細胞は、配列番号１のペプチドを提示する標的細胞に対して免疫応答可能な任意の免疫細胞とすることができる。より具体的には、免疫エフェクター細胞は、標的細胞を抑制、損傷又は除去する、すなわち標的細胞の生存能を低下させる、又は阻害する、好ましくは標的細胞を死滅させる（換言すれば、標的細胞の生存能を低下させる、又は標的細胞を生存不能にする）ことができる。免疫エフェクター細胞は、したがって、好ましくは細胞傷害性免疫エフェクター細胞である。
「細胞傷害性」という用語は、「細胞溶解性」と同義であり、本明細書では、標的細胞における溶解又はアポトーシスによって細胞死を誘導可能な細胞を指すのに使用される。
本明細書では「免疫エフェクター細胞」という用語は、成熟又は完全分化免疫エフェクター細胞だけでなく、幹細胞（より具体的には、造血幹細胞、ＨＳＣ：ｈａｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、又はＨＳＣから誘導される細胞を含めて、その前駆体（又は前駆）細胞を含む。免疫エフェクター細胞は、したがって、対象に投与すると成熟免疫エフェクター細胞に分化する、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、マクロファージ、又は造血組織、例えば骨髄、臍帯血若しくは血液、例えば動員末梢血に由来する細胞のＣＤ３４＋集団に含まれるＨＳＣに由来する細胞とすることができる。以下でより詳細に記述するように、好ましい実施形態においては、免疫エフェクター細胞はＴ細胞又はＮＫ細胞である。初代細胞、例えば、処置対象又はドナー対象から単離された細胞は、場合によっては（例えば、細胞を増大させる）介在細胞培養ステップ又は別の培養細胞若しくは細胞株（例えば、ＮＫ９２細胞株などのＮＫ細胞株）と一緒に、用いることができる。
「配列番号１のペプチドに対する」という用語は、「配列番号１のペプチドに特異的」と同義であり、すなわち、ＴＣＲがペプチドに特異的に結合できることを単に意味する。特に、ＴＣＲの抗原結合ドメインは、（より具体的には、ＴＣＲが免疫エフェクター細胞の表面で発現されると）ペプチドに特異的に結合することができる。特異的結合は、非標的抗原（この場合、配列番号１のペプチド以外のペプチド）との非特異的結合とは区別することができる。したがって、本発明に係るＴＣＲを発現する免疫エフェクター細胞は、配列番号１のペプチドを提示する標的細胞に特異的に結合し、それに対して細胞傷害性を示す（例えば、死滅させる）ようにリダイレクトされる。言い換えれば、免疫エフェクター細胞は、ペプチドを提示する、又はペプチドを含む変異ＴＧＦβＲＩＩ受容体を発現する、標的細胞に向かって細胞傷害性をリダイレクトするように改変される。
ＴＣＲの抗原結合ドメインの標的細胞表面のペプチドへの結合は、ＴＣＲ含有細胞に活性化刺激を送り、その結果、エフェクター細胞シグナル伝達経路を誘導する。標的ペプチドに結合することによって、増殖、サイトカイン産生、食作用、溶解活性、及び／又は標的細胞の細胞死をＭＨＣに無関係に媒介することができる分子の産生を誘発することができる。
本発明の可溶性ＴＣＲは、任意の適切な産生宿主細胞によって産生することができる。こうした細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞又は齧歯類細胞である。ＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３Ｔ及びＣＨＯ細胞を含めて、任意の適切な細胞株を用いることができる。本発明の可溶性ＴＣＲの標的細胞表面のペプチドへの結合は、ＭＨＣクラスＩ抗原−ＴＣＲ複合体の内部移行をもたらす。可溶性ＴＣＲは、したがって、毒素を標的細胞に特異的に送達して、標的細胞死をもたらすのに用いることができる。
本発明のＴＣＲ分子は、本発明のα鎖ドメイン及び本発明のβ鎖ドメインを含むことができる。あるいは、ＴＣＲ分子は、本発明のα鎖ドメインを含むことができるが、本発明のβ鎖ドメインを含まなくてもよく、又はＴＣＲ分子は、本発明のβ鎖ドメインを含むことができるが、本発明のα鎖ドメインを含まなくてもよい。換言すれば、本発明のＴＣＲ分子は、本発明のα鎖ドメイン及び／又は本発明のβ鎖ドメインを含む。しかし、好ましくは、本発明のＴＣＲ分子は、本明細書に定義したα鎖ドメインと本明細書に定義したβ鎖ドメインの両方を含む。
本発明のＴＣＲ分子が本発明のα鎖ドメイン（以下「α鎖ドメイン」）と本発明のβ鎖ドメイン（以下「β鎖ドメイン」）の両方を含むこの好ましい実施形態においては、α鎖ドメインとβ鎖ドメインは別々にコードされる（すなわち、それらは、別々の遺伝子によって、より具体的には別々の核酸分子又は核酸分子の（別々に制御される部分という意味の）別々の部分若しくはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ：ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）によってコードされ、別々のタンパク質として合成される）。あるいは、それらは、単一遺伝子（すなわち、単一核酸分子、単一ＯＲＦなど）によって一緒にコードすることができ、この場合、それらは単一タンパク質として合成される。α鎖ドメインとβ鎖ドメインが単一タンパク質としてコードされる場合、このタンパク質は単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）として知られる。ｓｃＴＣＲは、β鎖ドメインに結合したα鎖ドメインを含む。本明細書では「α鎖ドメイン」という用語は、個々のタンパク質を構成する、又はタンパク質の一部、特にｓｃＴＣＲの一部を形成する、ＴＣＲα鎖を指す。本明細書では「β鎖ドメイン」という用語は、個々のタンパク質を構成する、又はタンパク質の一部、特にｓｃＴＣＲの一部を形成する、ＴＣＲβ鎖を指す。単一ｓｃＴＣＲ分子におけるα及びβ鎖ドメインの発現によって、２つの鎖ドメインが同時に類似レベルで確実に発現される。本発明の好ましい一実施形態においては、本発明のＴＣＲ分子は、ｓｃＴＣＲとしてコードされる。
本発明のＴＣＲ分子がｓｃＴＣＲとしてコードされる場合、α鎖ドメインとβ鎖ドメインをリンカーによって連結することができる。このリンカーは、α鎖ドメインとβ鎖ドメインの間のアミノ酸配列からなる。好ましくは、α鎖ドメインはｓｃＴＣＲのＮ末端であり、リンカーが続き、ｓｃＴＣＲのＣ末端のβ鎖ドメインが続く。しかしながら、β鎖ドメインは、代わりに、ｓｃＴＣＲのＮ末端に位置し、α鎖ドメインがＣ末端に、その間にリンカーが位置することができる。
リンカーのアミノ酸配列は、任意の適切な長さとすることができる。リンカー配列は、１〜３０アミノ酸長、又はより好ましくは１〜２５若しくは１〜２０アミノ酸長とすることができる。しかし、リンカーは、好ましくは、２本のＴＣＲ鎖を分離することができるように切断可能であるべきであり、それらが分離できない限り、２本の鎖は、正しい配座をとることができず、適切に相互作用することができず、ＴＣＲが機能しない可能性がある。
好ましい一実施形態においては、リンカーは自己スプライシングである。自己スプライシングリンカーは、リンカーの位置においてｓｃＴＣＲ分子の切断を触媒し、α鎖ドメインとβ鎖ドメインを分離することができる。このスプライシング反応が起こるのに刺激も誘導も不要であり、スプライシング反応は、理想的には、α及びβ鎖ドメインを細胞表面に輸送する前に起こる。切断反応はリンカーをＴＣＲ分子から完全に切除することができ、あるいはリンカー又はリンカーの一部を、得られる別々のＴＣＲ鎖の一方又は両方に結合したままにすることができる。リンカーによって触媒されるスプライシング反応は、翻訳後に（すなわち、それは自己触媒的タンパク質分解反応であり得る）又は同時翻訳的に起こり得る。同時翻訳スプライシングは、リンカー内又はリンカーとその両側の鎖ドメインの一方との間のペプチド結合の形成を防止することによって生じることがある。
好ましい自己スプライシングリンカーは、ピコルナウイルス自己切断２Ａペプチドに由来するものである。２Ａペプチドは、約２０〜２５アミノ酸長であり、保存配列モチーフＡｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号５２）で終結する。２Ａペプチドは、保存グリシン残基と最終プロリン残基の間のペプチド結合の形成を防止し、これら２種のアミノ酸間のタンパク質の切断を効果的にもたらすことによって、同時翻訳自己スプライシングを起こす。切断後、２Ａペプチド（Ｃ末端プロリンを除く）は、上流タンパク質のＣ末端に結合したままであり、最終プロリン残基は、下流タンパク質のＮ末端に結合したままである。２Ａペプチド由来のリンカーの特に好ましい一配列は、配列番号１８で示される。しかし、保存Ｃ末端２Ａ配列モチーフ（配列番号５２）の上流のペプチドの配列は、自己スプライシング活性をさほど失わずに変えることができる。したがって、リンカーは、上記保存配列モチーフで終結し、自己スプライシング活性を保持する限り、配列番号１８の配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％配列相同である配列を有することもできる。特に、配列番号１８の自己スプライシング変異体は、配列番号１８のペプチドの自己スプライシング活性の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％を保持することができる。
α鎖ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号２、３及び４に由来し、β鎖ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号５、６及び７に由来する。すなわち、α鎖ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２、３及び４の配列を有し、又は１若しくは２個のアミノ酸の置換、付加若しくは欠失によって改変されたこれらの配列の変異体を有する。β鎖ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ配列番号５、６及び７の配列を有し、又は１若しくは２個のアミノ酸の置換、付加若しくは欠失によって改変されたこれらの配列の変異体を有する。変異体ＣＤＲは、そのそれぞれの対応する天然、無改変ＣＤＲと機能的に等価である。機能的に等価とは、タンパク質又はアミノ酸配列（ここでは、ＣＤＲ）が、それが由来する、又は基づく（すなわち、対応する）、タンパク質又はアミノ酸配列（ここでは、ＣＤＲ）の機能又は活性を保持又は実質的に保持することを意味する。特に、機能的に等価な変異体は、対応する（無改変）タンパク質又はアミノ酸配列の活性又は機能の少なくとも７０％、又はより具体的には少なくとも７５、８０、８５、９０若しくは９５％を保持することができる。実際には、これは、変異ＣＤＲが、（天然若しくは無改変ＴＣＲに比べて、又はＣＤＲ領域が改変されていないＴＣＲに比べて）それが存在するＴＣＲの機能、活性若しくは性質に負の影響を及ぼさない、又は実質的に負の影響を及ぼさないことを意味する。主に、これは、変異ＣＤＲがＴＣＲの結合特異性に影響を及ぼさない、すなわち、ＴＣＲが、標的細胞上で適切に提示されたときに配列番号１のペプチドに特異的に結合する能力を保持することを意味する。さらに、ＴＣＲの結合親和性は、天然若しくは無改変ＴＣＲ、又は無改変ＣＤＲ領域を有するＴＣＲに比べて、実質的に低下しない。しかし、ＴＣＲの結合親和性は、ＣＤＲ領域、特にＣＤＲ１及び／又は２の改変によって改善することができる。
したがって、上述したように改変（又は変異）されたＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列は、それらの結合特異性を失わずに、それらの標的抗原との結合親和性を改善することができる。こうした変異配列は、したがって、配列番号１のネオペプチドが産生される癌の処置に有用であり得る。これらの有用な改変ＴＣＲ配列は、それらのＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域に無作為に生成した変異を有するＴＣＲクローンのライブラリのスクリーニングによって同定することができる。それらの標的抗原との結合親和性が改善された可溶性ＴＣＲクローンは、例えば、表面プラズモン共鳴又は熱変動アッセイによって同定することができる。それらの標的抗原との結合親和性が改善された非可溶性ＴＣＲクローンは、例えば、サイトカイン放出を分析して、ＴＣＲを介する免疫エフェクター細胞活性化をモニターする機能分析によって同定することができる。しかし、好ましい一実施形態においては、α鎖ドメインとβ鎖ドメインの両方のＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列は、すべて無改変である（すなわち、α鎖ドメインのＣＤＲ１及び２はそれぞれ配列番号２及び３の配列を有し、β鎖ドメインのＣＤＲ１及び２はそれぞれ配列番号５及び６の配列を有する）。α及びβ鎖ドメインのＣＤＲ３配列は、好ましくは、それぞれ配列番号４及び７の配列を有し、これらは、好ましくは、変更も改変もされない。
本発明の完全長ＴＣＲ（すなわち、免疫エフェクター細胞によって発現されると細胞表面に局在する非可溶性ＴＣＲ）は、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞の表面で発現されると、それが発現された細胞を、配列番号１のネオ抗原がクラスＩＭＨＣによって提示されたときに細胞がそれを認識するようにリダイレクトすることができる。換言すれば、本発明のこうしたＴＣＲは、免疫エフェクター細胞を活性化して、その効果又は機能、例えばその細胞傷害活性を、ＴＧＦβＲＩＩの−１Ａフレームシフト変異、又は実際には、配列番号１のネオ抗原の生成を招く任意の類似の変異を受けた標的細胞に向ける。その表面で本発明の完全長ＴＣＲが発現される免疫エフェクター細胞は、上述した、また、更に後述する任意の免疫エフェクター細胞とすることができるが、好ましい一実施形態においては、それは、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、又は任意の別のタイプのＴ細胞である。
本発明の可溶性ＴＣＲは、配列番号１のネオ抗原がクラスＩＭＨＣによって提示されたときにそれを認識する、すなわちそれに結合することができ、したがって標的細胞によって選択的に内部に取り込まれる。本発明の可溶性ＴＣＲの選択的内部移行は、当該技術分野で公知の任意の方法によって確認することができる。例えば、可溶性ＴＣＲを蛍光団（例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質）と結合させることができ、したがってＴＣＲの内部移行を蛍光の内部移行によって確認することができる。可溶性ＴＣＲが、配列番号１のネオ抗原を発現する細胞によって内部に取り込まれるが、配列番号１を発現しない細胞によっては内部に取り込まれない（又はより低い程度に内部に取り込まれる）場合、可溶性ＴＣＲは、標的細胞によって選択的に内部に取り込まれると言うことができる。上述したように、可溶性ＴＣＲはα鎖とβ鎖の両方を含むが、各鎖は、定常領域の膜貫通及び細胞内ドメインの欠失によってそのＣ末端において切断される。したがって、可溶性ＴＣＲの鎖は、Ｎ末端リーダー配列（それがポリペプチドの成熟中に切断されるまで）、可変領域、及び定常領域のＮ末端（すなわち、細胞外ドメイン）を含む。したがって、可溶性ＴＣＲは、切断されたα及びβ鎖を有する切断型ＴＣＲであると言うことができ、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞の表面で発現される不溶性ＴＣＲ（野生型ＴＣＲなど）は、完全長α及びβ鎖を有する完全長ＴＣＲであると言うことができる。
配列番号１のネオ抗原を本発明のＴＣＲ（溶液に関連したＴＣＲ、すなわち可溶性ＴＣＲ、又は本発明の完全長ＴＣＲを発現するＴ細胞）に提示するクラスＩＭＨＣは、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ２を含むことができる。より具体的には、クラスＩＭＨＣは、ＨＬＡ−Ａ２のＨＬＡ−Ａ*０２：０１アイソフォームを含むことができる。しかし、クラスＩＭＨＣは、ＨＬＡ−Ａ*０２：０１を含むもの、又は実際にはＨＬＡ Ａ２に限定されず、ＴＣＲが認識できる任意のＨＬＡタンパク質を含むことができる。特に、それは、ＨＬＡ−Ａ*０２：０１以外のＨＬＡ−Ａ２アイソフォームを含むことができる。換言すれば、それは、ＨＬＡ−Ａ２の任意のアイソフォームを含むことができる。
上述したように、ＴＣＲα又はβ鎖のＣＤＲは、鎖の可変領域内にある。各可変領域は、４つのフレームワーク配列の骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）中に３つのＣＤＲ配列を含む。単にＣＤＲ配列から、機能的ＴＣＲにおいてＣＤＲ配列を一緒に保持するであろうフレームワーク領域配列を予測することは不可能であろう。上述したように、Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲのα及びβ鎖の可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号８及び１３で示される。しかし、天然フレームワーク配列の何らかの改変は、一般に、ＴＣＲの機能に悪影響を及ぼさずに行うことができる。したがって、本発明のＴＣＲにおいては、α及び／又はβ鎖ドメインの可変領域のフレームワーク領域は、天然Ｒａｄｉｕｍ−１受容体（すなわち、それが単離された、又は天然に見られるように）のフレームワーク領域と同じにすることができるが、そうでなくてもよい。したがって、Ｒａｄｉｕｍ−１受容体の可変領域のフレームワーク領域は、（例えば、アミノ酸置換、付加、挿入又は欠失によって）改変することができ、これは、それらが例えばマウス、又はマウス化フレームワーク領域で置換され得る（したがって、フレームワーク領域のアミノ酸配列が改変及び／又は置換され得る）ことを含む。
本発明の一実施形態においては、ＴＣＲのα鎖ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％配列相同であるアミノ酸配列を有する、又は含む、又はからなる、可変領域を含む。ＴＣＲのα鎖ドメインが、配列番号８の変異体である配列を含む（すなわち、それが、配列番号８と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％配列相同であるが、それと同一ではない配列である）場合、α鎖ドメインのＣＤＲ配列は、上で定義した本発明のものである。
本発明の別の一実施形態においては、ＴＣＲのβ鎖ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％配列相同であるアミノ酸配列を有する、又は含む、又はからなる、可変領域を含む。ＴＣＲのβ鎖ドメインが、配列番号１３の変異体である配列を含む（すなわち、それが、配列番号１３と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％配列相同であるが、それと同一ではない配列である）場合、β鎖ドメインのＣＤＲ配列は、上で定義した本発明のものである。
上記から天然Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲの可変領域を改変できることがわかる。ＣＤＲ改変の考察に関連して上述したように、本発明は、したがって、Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲの機能的に等価な変異体を含む。Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲ（又はその鎖ドメイン若しくは領域）の天然アミノ酸配列が改変された、ＴＣＲ、又はα及び／又はβ鎖ドメイン、又はその可変及び／又は定常領域のこうした機能的に等価な変異体は、上述したように、ＴＣＲ又はその鎖ドメイン若しくは領域の活性、性質又は機能を保持又は実質的に保持する。特に、こうした改変された機能的に等価なＴＣＲ分子、又は改変された機能的に等価な、ＴＣＲ分子に関連したその鎖ドメイン若しくは領域は、ＴＣＲ受容体の活性を保持又は実質的に保持し、例えば、上述したように、少なくとも７０％又はそれ以上の活性を保持し、例えば、標的細胞（例えば、癌細胞）を認識する、及び／又は標的細胞に対して細胞傷害効果を発揮する、ＴＣＲの活性を保持する。
上述したように、養子細胞移入治療は、患者に安全性リスクを提起する可能性がある。フェイルセイフ機構として、完全長ＴＣＲを発現する細胞を標的にして死滅させることができるタグを本発明のＴＣＲ内でコードすることができる。患者が治療に対して否定的な反応を受ける場合、こうした標的死滅を行うことができる。標的細胞死滅は、導入されたタグを認識する抗体を用いて行うことができる。こうした機構は、Ｋｉｅｂａｃｋ，Ｅ．ら、２００７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．１０５、ｐｐ．６２３〜６２８に記載されている。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲは、一般的なタグ配列を含む。こうしたタグの例は、当該技術分野で周知であり、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ＨＡタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓタグ及びＭｙｃタグが挙げられる。好ましい一実施形態においては、本発明のＴＣＲは、Ｍｙｃタグを含む。タグ配列の複数（すなわち、２以上、例えば、２〜１０、２〜８又は２〜６）の、好ましくは隣接する、コピーがＴＣＲ中に存在してもよい。特に好ましい一実施形態においては、ＴＣＲは、ダブルＭｙｃタグを含む。こうしたダブルＭｙｃタグは、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する。
タグは、ＴＣＲのどちらかの鎖に位置することができる。最適な抗体がタグに接近できるようにするために、それは、好ましくは、ＴＣＲ鎖のＮ末端に位置する。一実施形態においては、α鎖ドメインは可変領域を含み、可変領域は、配列番号１９のアミノ酸配列を有するダブルＭｙｃタグを更に含む。別の一実施形態においては、β鎖ドメインは可変領域を含み、可変領域は、配列番号１９のアミノ酸配列を有するダブルＭｙｃタグを更に含む。更なる一実施形態においては、α鎖ドメインとβ鎖ドメインの両方は、ダブルＭｙｃタグを含む可変領域を含む。
上述したように、合成されたＴＣＲ鎖のＮ末端は、シグナルペプチドを構成する。こうしたシグナルペプチドは、一般に約１５〜約３０アミノ酸長である。Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖のシグナルペプチドは、配列番号５０で表される、配列番号８の最初の２０個のアミノ酸からなると予測される。Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖のシグナルペプチドは、配列番号５１で表される、配列番号１３の最初の１６個のアミノ酸からなると予測される。上述したように、これらのリーダー配列は、成熟ＴＣＲには存在しない。
タグが成熟ＴＣＲ鎖のＮ末端に位置するために、タグ配列をリーダー配列直後のＴＣＲ鎖ドメインの可変領域に挿入することができる。タグはα鎖ドメイン又はβ鎖ドメインに挿入することができる。好ましい一実施形態においては、配列番号１９のダブルＭｙｃタグを配列番号５０のリーダー配列のＣ末端直近の配列番号８のα鎖ドメイン可変領域に挿入する。この実施形態においては、本発明のＴＣＲのα鎖ドメインの可変領域は、配列番号２０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％配列相同であるアミノ酸配列を有する、又は含む、又はからなる。本発明のα鎖ドメインの可変領域が配列番号２０の変異体である配列（すなわち、それと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％配列相同であるが、それと同一ではないもの）を有する、又は含む、又はからなる場合、ＣＤＲ配列は、上で定義した本発明のα鎖ドメインのそれであり、ダブルＭｙｃタグの配列は配列番号１９の配列から不変である。
上述したように、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有する可変領域を含むα鎖ドメインを有するＴＣＲは、機能的なままであるが、配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する可変領域を含むα鎖ドメインを有するＴＣＲに比べて活性が少し低下し得る。それは、治療用に好ましい。というのは、ＴＣＲをその表面で発現する細胞は、必要に応じて（患者が処置に対して激しい否定的な反応を受ける場合）、αＭｙｃタグ抗体の注入によって死滅させることができるからである。
本発明の完全長ＴＣＲと切断型（可溶性）ＴＣＲのどちらも、上述したように、可変領域を有するα及び／又はβ鎖ドメインを含むことができる。
上述したように、αＴＣＲ鎖とβＴＣＲ鎖のどちらも可変及び定常領域を含む。Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲのα鎖の定常領域の配列は配列番号９で示され、Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲのβ鎖の定常領域の配列は配列番号１４で示される。すべての完全長ＴＣＲ鎖定常領域と同様に、これらは、細胞外ドメイン、膜貫通ヘリックス及び短い細胞内ドメインを含む（上述したように、可溶性ＴＣＲの切断型ＴＣＲ鎖の定常領域は、対応する完全長配列の細胞外ドメインのみを含む）。
本発明の完全長ＴＣＲのα鎖ドメインの定常領域は、Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖の定常領域の配列を有する、又は含む、又はからなることができる。換言すれば、α鎖ドメインは、配列番号９の配列を有する、すなわち含む又はからなる、定常領域を含むことができる。あるいは、α鎖ドメインは、配列番号９の配列と類似の配列を有する定常領域を含むことができる。具体的には、本発明のＴＣＲのα鎖ドメインは、配列番号９の配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％配列相同である配列を有する、すなわち含む又はからなる、定常領域を含むことができる。したがって、上述したように、本発明は、Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖の定常領域の配列改変された機能的に等価な変異体を含む。
本発明の完全長ＴＣＲのα鎖ドメインは、更なる一実施形態においては、Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖の定常領域と等価なマウスの配列を有する、又は含む、又はからなる、定常領域を含む。すなわち、α鎖ドメインは、配列番号９のマウス化バージョンである配列を有する定常領域を含むことができる。こうしたα鎖ドメインは、そのヒト定常領域をマウス定常領域と交換したことがわかる。
配列番号９で示されるＲａｄｉｕｍ−１ＴＣＲα鎖定常ドメインの配列と等価であるマウスＴＣＲα鎖定常ドメインの配列は、配列番号２３の配列である。α鎖ドメインの定常領域がマウス化された特定の一実施形態においては、マウス化定常領域は、配列番号２３のアミノ酸配列を有する、又は含む、又はからなる。別の一実施形態においては、マウス化定常領域は、配列番号２３の配列と少なくとも９５％配列相同である配列を有する、又は含む、又はからなる。
本発明の完全長ＴＣＲのβ鎖ドメインの定常領域は、Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖の定常領域の配列を有する、又は含む、又はからなることができる。換言すれば、β鎖ドメインは、配列番号１４の配列を有する、すなわち含む又はからなる、定常領域を含むことができる。あるいは、β鎖ドメインは、配列番号１４の配列と類似の配列を有する定常領域を含むことができる。具体的には、本発明のＴＣＲのβ鎖ドメインは、配列番号１４の配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％配列相同である配列を有する、すなわち含む又はからなる、定常領域を含むことができる。したがって、上述したように、本発明は、Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖の定常領域の配列改変された機能的に等価な変異体を含む。
本発明の完全長ＴＣＲのβ鎖ドメインは、更なる一実施形態においては、Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖の定常領域と等価なマウスの配列を有する、又は含む、又はからなる、定常領域を含む。すなわち、β鎖ドメインは、配列番号１４のマウス化バージョンである配列を有する定常領域を含むことができる。こうしたβ鎖ドメインは、そのヒト定常領域をマウス定常領域と交換したことがわかる。
配列番号１４で示されるＲａｄｉｕｍ−１ ＴＣＲβ鎖定常ドメインの配列と等価であるマウスＴＣＲβ鎖定常ドメインの配列は、配列番号２９の配列である。β鎖ドメインの定常領域がマウス化された特定の一実施形態においては、マウス化定常領域は、配列番号２９のアミノ酸配列を有する、又は含む、又はからなる。別の一実施形態においては、マウス化定常領域は、配列番号２９の配列と少なくとも９５％配列相同である配列を有する、又は含む、又はからなる。
本発明のＴＣＲにおいては、α及びβ鎖を単一ポリペプチド鎖として（すなわち、ｓｃＴＣＲとして）コードすることができるが、それらの成熟型においては、それらは別々の鎖を形成する。α及びβ鎖は、別々のポリペプチドとしてコードされ、又はｓｃＴＣＲとしてコードされ、後者の場合、それらはリンカーによって連結され、リンカーはそれらの成熟及び細胞膜への輸送の前に切断される。これは、本発明の成熟ＴＣＲにおいては、α及びβ鎖が別々のポリペプチド鎖を形成し、すなわち、もはやペプチド結合によって連結されないことを意味する。
すべての成熟αβＴＣＲにおいては、α鎖とβ鎖は、各鎖の定常領域に位置するシステイン残基間で形成される鎖間ジスルフィド結合によって共有結合的に連結される。鎖間ジスルフィド結合は、ＴＣＲが形成されると２本のＴＣＲ鎖が確実に密接な結合のままであるようにし、これはＴＣＲの機能性に不可欠である。ＴＣＲがＴ細胞において外因的に発現されると、外因的にコードされたＴＣＲ鎖が内因的にコードされたＴＣＲ鎖と複合体を形成し、その結果、外因的にコードされたα鎖及び内因的にコードされたβ鎖又はその逆を含む混合ＴＣＲが形成されるリスクがある。本発明の状況においては、これは、本発明のα鎖（Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖など）が、それが発現されるＴ細胞によってコードされるＴＣＲβ鎖とＴＣＲ複合体を形成し得ること、又はその逆を意味する。こうした状況においては、本発明のＴＣＲ（Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲなど）の活性は、本発明のＴＣＲ鎖が互いとのみ複合体を形成する状況に比べて低下し得る。
余分なシステイン残基を本発明のＴＣＲのα及びβ鎖ドメインの定常領域に導入することによって、α鎖とβ鎖の優先的な対形成を促進可能であることが見いだされた。これは、一部のＴ細胞においてＴＣＲの発現及び機能を高めることが判明した。したがって、α鎖ドメインの定常領域及び／又はβ鎖ドメインの定常領域をシステイン残基の導入によって改変することができる。好ましくは、α鎖ドメインとβ鎖ドメインの両方の定常領域をシステイン残基の導入によって改変する。余分なシステイン残基は、挿入によって（すなわち、余分なアミノ酸残基をα又はβ鎖ドメインの定常領域に挿入することによって）又は置換によって（すなわち、α又はβ鎖ドメインの定常領域に既に存在する非システインアミノ酸をシステインで置換することによって）導入することができる。システイン残基がα鎖ドメインとβ鎖ドメインの両方の定常領域に導入される場合、異なるシステイン導入方法を各鎖ドメインに使用することができる。余分なシステインが導入された本発明のＴＣＲ鎖又は鎖ドメインを「システイン改変」と称することができる。
本発明の好ましい一実施形態においては、完全長ＴＣＲのα鎖の定常領域は、Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖のシステイン改変定常領域の配列を有する。特に好ましい一実施形態においては、Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖の定常領域は、Ｔ４８Ｃ置換によって改変される。換言すれば、配列番号９のスレオニン４８をシステインで置換する。Ｔ４８Ｃ置換を有する配列番号９からなるα鎖ドメイン定常領域の配列は、配列番号１０で与えられ、その結果、特に好ましい一実施形態においては、α鎖ドメインは、配列番号１０の配列を有する、すなわち含む又はからなる、定常領域を含む。あるいは、α鎖ドメインは、位置４８（又は配列番号１０の位置４８に対応する位置）のシステイン残基が不変である限り、配列番号１０と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％配列相同であるアミノ酸配列を有する、すなわち含む又はからなる、定常領域を含むことができる。
本発明の別の好ましい一実施形態においては、完全長ＴＣＲのβ鎖の定常領域は、Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖のシステイン改変定常領域の配列を有する。特に好ましい一実施形態においては、Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖の定常領域は、Ｓ５７Ｃ置換によって改変される。換言すれば、配列番号１４のセリン５７をシステインで置換する。Ｓ５７Ｃ置換を有する配列番号１４からなるβ鎖ドメイン定常領域の配列は、配列番号１５で与えられ、その結果、特に好ましい一実施形態においては、β鎖ドメインは、配列番号１５の配列を有する、すなわち含む又はからなる、定常領域を含む。あるいは、β鎖ドメインは、位置５７（又は配列番号１５の位置５７に対応する位置）のシステイン残基が不変である限り、配列番号１５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％配列相同であるアミノ酸配列を有する、すなわち含む又はからなる、定常領域を含むことができる。
ＴＣＲ鎖ドメインの一方又は両方がマウス化定常領域を含む実施形態においては、マウス化定常領域をシステイン改変することができる。本発明の完全長ＴＣＲのα鎖ドメインのシステイン改変マウス化定常領域の好ましい一配列は、配列番号２４で示される。配列番号２４は、配列番号２３のシステイン改変バージョンである。配列番号２４は、ヒト配列番号９のスレオニン４８と等価であるマウス配列番号２３中の残基をシステイン残基で置換することによって得られる。したがって、α鎖ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列、又は位置４７（又は配列番号２４の位置４７に対応する位置）のシステイン残基が不変である、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列相同であるアミノ酸配列を有する、すなわち含む又はからなる、システイン改変マウス化定常領域を含むことができる。
本発明の完全長ＴＣＲのβ鎖ドメインのシステイン改変マウス化定常領域の好ましい一配列は、配列番号３０で示される。配列番号３０は、配列番号２９のシステイン改変バージョンである。配列番号３０は、ヒト配列番号１４のセリン５７と等価であるマウス配列番号２９中の残基をシステイン残基で置換することによって得られる。したがって、β鎖ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列、又は位置番号５６（又は配列番号３０の位置５６に対応する位置）のシステイン残基が不変であり、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列相同であるアミノ酸配列を有する、すなわち含む又はからなる、システイン改変マウス化定常領域を含むことができる。
本明細書に記述するように、本発明の完全長ＴＣＲのα及びβ鎖ドメインは各々、上で定義及び記述された可変及び定常領域配列を有する可変領域及び定常領域を含む、又はからなることができる。種々の可変及び定常領域配列を任意の可能な組合せで組み合わせることができるが、α鎖可変領域配列をα鎖定常領域配列と組み合わせ、β鎖可変領域配列をβ鎖定常領域配列と組み合わせることが最も好ましい。
本発明の完全長ＴＣＲの一実施形態においては、α鎖ドメインは、Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲのα鎖の可変及び定常領域のそれぞれの配列を有する可変領域及び定常領域を含む。この実施形態においては、本発明のα鎖ドメインは、配列番号１１で示されるＲａｄｉｕｍ−１ＴＣＲのα鎖の配列を有することができる。したがって、本発明の一実施形態においては、α鎖ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を有する、又は含む、又はからなる。
上で詳述したように、α鎖ドメインは、タグをその可変ドメインに含むことができる。こうしたタグは、好ましくは、α鎖ドメインリーダー配列のＣ末端直近に位置し、成熟鎖ドメインの最Ｎ末端を形成する。好ましいタグは、ダブルＭｙｃタグである。ダブルＭｙｃタグがリーダー配列のＣ末端直近に挿入されたＲａｄｉｕｍ−１ＴＣＲのα鎖は、配列番号２１の配列を有する。したがって、本発明の別の一実施形態においては、完全長ＴＣＲのα鎖ドメインは、配列番号２１の配列を有する、又は含む、又はからなる。あるいは、完全長ＴＣＲのα鎖ドメインは、ＣＤＲ配列（及びダブルＭｙｃタグ配列が存在する場所）が上で定義された通りである限り、配列番号１１又は配列番号２１のどちらかと少なくとも９０％又は９５％配列相同であるアミノ酸配列を有する、又は含む、又はからなることができる。
上述したように、本発明のα鎖ドメインの定常領域は、あるいはマウス由来とすることができ、特に配列番号９のマウス（又はマウス化）バージョンとすることができるが、任意の他のマウスＴＣＲα鎖定常領域でもよい。α鎖ドメインの定常領域がマウス化される場合、可変領域をマウス化することもできる（特に、可変ドメインのフレームワーク領域をマウス化することができる）が、これは必ずしも必要ではない。本発明の好ましい一実施形態においては、α鎖ドメインの定常領域がマウス化されるときには、可変領域はヒトである。本発明の好ましい実施形態においては、完全長ＴＣＲα鎖ドメインの定常領域がマウス由来であるときには、それは配列番号２３の配列を有するが、可変領域はＲａｄｉｕｍ−１α鎖のものである。Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖の可変領域と配列番号２３の配列を有する定常領域とを有する完全長ＴＣＲα鎖の配列は、配列番号２５で示される。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲのα鎖ドメインは、マウス化定常領域及びヒト可変領域を含み、かつ、配列番号２５の配列を有する、又は含む、又はからなる。
別の一実施形態においては、完全長α鎖ドメインは、マウス定常領域、及び好ましくはリーダー配列のＣ末端直近に、タグ、好ましくはダブルＭｙｃタグを含む可変領域を含む。この実施形態においては、定常ドメインは、好ましくは、配列番号２３の配列及び配列番号２０（リーダー配列のＣ末端直近に挿入されたダブルＭｙｃタグを有するＲａｄｉｕｍ−１α鎖可変領域である配列番号２０）の可変ドメイン配列を有する。配列番号２３のマウス定常領域及び配列番号２０の可変鎖からなるα鎖ドメインの配列は、配列番号２７で示される。したがって、本発明の完全長ＴＣＲのα鎖ドメインは、配列番号２７の配列を有する、又は含む、又はからなることができる。あるいは、完全長ＴＣＲのα鎖ドメインは、ＣＤＲ配列（及びダブルＭｙｃタグ配列が存在する場所）が上で定義された通りである限り、配列番号２５又は配列番号２７のどちらかと少なくとも９５％配列相同であるアミノ酸配列を有する、又は含む、又はからなることができる。
上述したように、α及びβ鎖ドメインの定常領域は、本発明のＴＣＲのα鎖とβ鎖の相互作用の特異性を向上させるためにシステイン改変することができる。こうした改変定常領域は、本発明の任意の可変領域と対にすることができ、例えば、システイン改変定常ドメインをダブルＭｙｃタグを含む可変領域と対にすることができるが、これは必ずしも必要ではない。α鎖ドメインは、したがって、システイン改変を有する定常領域を含むことができる。α鎖ドメインの好ましいシステイン改変定常領域を上述した。完全長システイン改変Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖定常ドメインは配列番号１０の配列を有し、配列番号１０のシステイン改変マウス化等価物は配列番号２４で示される。
本発明の好ましい実施形態においては、完全長α鎖ドメインは、配列番号８のＲａｄｉｕｍ−１α鎖可変ドメイン、及び配列番号１０のシステイン改変Ｒａｄｉｕｍ−１定常ドメイン、又は配列番号２４のシステイン改変マウス化定常ドメインを含む。配列番号８の可変ドメイン及び配列番号１０の定常ドメインからなるα鎖ドメインは配列番号１２の配列を有し、配列番号８の可変ドメイン及び配列番号２４の定常ドメインからなるα鎖ドメインは配列番号２６の配列を有する。したがって、本発明の好ましい一実施形態においては、完全長α鎖ドメインは配列番号１２のアミノ酸配列を有し、若しくは含み、若しくはからなり、又はα鎖ドメインは、ＣＤＲ配列及びシステイン改変が上で定義された通りである限り、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％又は９５％配列相同であるアミノ酸配列を有する、若しくは含む、若しくはからなることができる。本発明の別の好ましい一実施形態においては、α鎖ドメインは配列番号２６の配列を有し、若しくは含み、若しくはからなり、又はα鎖ドメインは、ＣＤＲ配列及びシステイン改変が上で定義された通りである限り、配列番号２６の配列と少なくとも９５％配列相同であるアミノ酸配列を有する、若しくは含む、若しくはからなることができる。
本発明のより好ましい実施形態においては、完全長α鎖ドメインは、配列番号２０などで示される、タグ、好ましくはダブルＭｙｃタグの挿入によって改変されたＲａｄｉｕｍ−１α鎖可変ドメインを含む。本発明の最も好ましい実施形態においては、α鎖ドメインは、配列番号２０の配列を有する可変領域、及び配列番号１０のシステイン改変Ｒａｄｉｕｍ−１定常ドメイン、又は配列番号２４のシステイン改変マウス化定常ドメインを含む。配列番号２０の可変ドメイン及び配列番号１０の定常ドメインからなるα鎖ドメインは配列番号２２の配列を有し、配列番号２０の可変ドメイン及び配列番号２４の定常ドメインからなるα鎖ドメインは配列番号２８の配列を有する。
したがって、本発明の最も好ましい一実施形態においては、完全長α鎖ドメインは配列番号２２の配列を有し、若しくは含み、若しくはからなり、又はα鎖ドメインは、ＣＤＲ配列、ダブルＭｙｃタグ配列及びシステイン改変が上で定義された通りである限り、配列番号２２の配列と少なくとも９０％又は９５％配列相同であるアミノ酸配列を有する、若しくは含む、若しくはからなることができる。本発明の別の最も好ましい一実施形態においては、α鎖ドメインは配列番号２８の配列を有し、若しくは含み、若しくはからなり、又はα鎖ドメインは、ＣＤＲ配列、ダブルＭｙｃタグ配列及びシステイン改変が上で定義された通りである限り、配列番号２８の配列と少なくとも９５％配列相同であるアミノ酸配列を有する、若しくは含む、若しくはからなることができる。
α鎖ドメインと同様に、本発明の一実施形態においては、完全長β鎖ドメインは、Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲのβ鎖の可変及び定常領域のそれぞれの配列を有する可変領域及び定常領域を含む。この実施形態においては、本発明のβ鎖ドメインは、配列番号１６で示されるＲａｄｉｕｍ−１ＴＣＲのβ鎖の配列を有することができる。したがって、本発明の一実施形態においては、β鎖ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、又は含む、又はからなる。あるいは、β鎖ドメインは、ＣＤＲ配列が上で定義された通りである限り、配列番号１６と少なくとも９０％又は９５％配列相同であるアミノ酸配列を有する、又は含む、又はからなることができる。
α鎖ドメインに関しては、本発明の完全長β鎖ドメインの定常領域は、あるいはマウス由来とすることができ、特に配列番号１４のマウス（又はマウス化）バージョンとすることができるが、任意の他のマウスＴＣＲβ鎖定常領域でもよい。β鎖ドメインの定常領域がマウス化される場合、可変領域をマウス化することもできる（特に、可変ドメインのフレームワーク領域をマウス化することができる）が、これは必ずしも必要ではない。本発明の好ましい一実施形態においては、β鎖ドメインの定常領域がマウス化されるときには、可変領域はヒトである。本発明の好ましい実施形態においては、完全長ＴＣＲβ鎖ドメインの定常領域がマウス由来であるときには、それは配列番号２９の配列を有するが、可変領域はＲａｄｉｕｍ−１β鎖のものである。Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖の可変領域と配列番号２９の配列を有する定常領域とを有するＴＣＲβ鎖の配列は、配列番号３１で示される。本発明の一実施形態においては、ＴＣＲのβ鎖ドメインは、マウス化定常領域及びヒト可変領域を含み、かつ、配列番号３１の配列を有する、又は含む、又はからなる。あるいは、β鎖ドメインは、ＣＤＲ配列が上で定義された通りである限り、配列番号３１と少なくとも９５％配列相同であるアミノ酸配列を有する、又は含む、又はからなることができる。
α鎖ドメインに関しては、完全長β鎖ドメインは、システイン改変された定常領域を含むことができる。β鎖ドメインの好ましいシステイン改変定常領域を上述した。システイン改変Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖定常ドメインは配列番号１５の配列を有し、配列番号１５のシステイン改変マウス化等価物は配列番号３０で示される。
本発明の好ましい実施形態においては、完全長β鎖ドメインは、配列番号１３のＲａｄｉｕｍ−１β鎖可変ドメイン、及び配列番号１５のシステイン改変Ｒａｄｉｕｍ−１定常ドメイン、又は配列番号３０のシステイン改変マウス化定常ドメインを含む。配列番号１３の可変ドメイン及び配列番号１５の定常ドメインからなるβ鎖ドメインは配列番号１７の配列を有し、配列番号１３の可変ドメイン及び配列番号３０の定常ドメインからなるβ鎖ドメインは配列番号３２の配列を有する。したがって、本発明の好ましい一実施形態においては、完全長β鎖ドメインは配列番号１７の配列を有し、若しくは含み、若しくはからなり、又はβ鎖ドメインは、ＣＤＲ配列及びシステイン改変が上で定義された通りである限り、それと少なくとも９０％又は９５％配列相同であるアミノ酸配列を有する、若しくは含む、若しくはからなることができる。本発明の別の好ましい一実施形態においては、β鎖ドメインは配列番号３２の配列を有し、若しくは含み、若しくはからなり、又はβ鎖ドメインは、ＣＤＲ配列及びシステイン改変が上で定義された通りである限り、配列番号３２の配列と少なくとも９５％配列相同であるアミノ酸配列を有する、若しくは含む、若しくはからなることができる。
上で詳述したように、β鎖ドメインは、タグをその可変ドメインに含むことができる。こうしたタグは、好ましくは、β鎖ドメインリーダー配列のＣ末端直近に位置し、成熟鎖ドメインの最Ｎ末端を形成する。好ましいこうしたタグは、ダブルＭｙｃタグである。
本発明の可溶性ＴＣＲにおいては、α及びβ鎖ドメインの定常領域は、上記完全長定常領域の切断型バージョンに対応することができる。本発明の特定の一実施形態においては、α鎖ドメインの切断型定常領域は、Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖の定常領域のアミノ酸１〜９５（すなわち、配列番号９のアミノ酸１〜９５）に対応する。この配列は、配列番号６０で示される。本発明の可溶性ＴＣＲは、配列番号６０で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、又はからなる、定常領域を含むα鎖ドメインを含むことができる。本発明の別の一実施形態においては、β鎖ドメインの切断型定常領域は、Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖の定常領域のアミノ酸１〜１３１（すなわち、配列番号１４のアミノ酸１〜１３１）に対応する。この配列は、配列番号６２で示される。本発明の可溶性ＴＣＲは、配列番号６２で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、又はからなる、定常領域を含むβ鎖ドメインを含むことができる。
成熟ＴＣＲのα鎖とβ鎖が連結されることは可溶性ＴＣＲの本質的な一態様である。それらが連結されない場合、鎖は溶液中で離散し、ＴＣＲは、機能するとしても、不十分である。鎖は、共有結合的又は非共有結合的に連結することができる。α鎖とβ鎖を共有結合的に連結することができる好ましい一方法は、１個以上のジスルフィド結合によるものである。これらは、天然ＴＣＲ鎖配列中に存在するシステイン残基間で形成され得るが、好ましい一実施形態においては、１個以上のシステイン残基が各鎖の定常領域に導入され、その間でジスルフィド結合が形成され得る。完全長ＴＣＲに関しては、本発明の好ましい一実施形態においては、可溶性ＴＣＲのα及びβ鎖ドメインの定常領域は、システイン改変される。完全長ＴＣＲ鎖に関しては、各鎖は、システイン残基の挿入又は天然残基のシステイン残基による置換によって改変することができる。
特に好ましい一実施形態においては、Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖の切断型定常領域（すなわち、配列番号６０）は、Ｔ４８Ｃ置換によって改変される。こうしたシステイン改変切断型α鎖ドメイン定常領域の配列は、配列番号６１で示される（また、完全長Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖定常領域のシステイン改変配列を示す配列番号１０のアミノ酸１〜９５に対応する）。したがって、好ましい一実施形態においては、本発明の可溶性ＴＣＲは、配列番号６１で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、又はからなる、定常領域を含むα鎖ドメインを含む。α鎖ドメインが配列番号６１の変異体である（すなわち、それが配列番号６１と少なくとも６０％、ただし１００％未満の配列相同である配列を有する）場合、位置４８（又は配列番号６１の位置４８に対応する位置）のアミノ酸はシステインである。
別の好ましい一実施形態においては、Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖の切断型定常領域（すなわち、配列番号６２）はＳ５７Ｃ置換によって改変される。こうしたシステイン改変切断型β鎖ドメイン定常領域の配列は、配列番号６３で示される（また、完全長Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖定常領域のシステイン改変配列を示す配列番号１５のアミノ酸１〜１３１に対応する）。したがって、好ましい一実施形態においては、本発明の可溶性ＴＣＲは、配列番号６３で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０若しくは９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、又はからなる、定常領域を含むβ鎖ドメインを含む。α鎖ドメインが配列番号６３の変異体である（すなわち、それが配列番号６３と少なくとも６０％、ただし１００％未満の配列相同である配列を有する）場合、位置４８（又は配列番号６３の位置４８に対応する位置）のアミノ酸はシステインである。
可溶性ＴＣＲのα鎖とβ鎖を連結することができる一別法は、非共有結合性相互作用によるものである。特定の一実施形態においては、ロイシンジッパーを使用して、鎖を非共有結合的に連結する。この実施形態においては、α鎖とβ鎖の両方は、それらの切断型定常領域のＣ末端にロイシンジッパードメインを含む（すなわち、α鎖はロイシンジッパードメインをそのＣ末端に含み、β鎖はロイシンジッパードメインをそのＣ末端に含む）。ロイシンジッパー及びその配列は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｂｕｓｃｈ＆Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ（１９９０）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ６：３６〜４０に概説されている。一部の実施形態においては、共有結合方法と非共有結合方法の両方を可溶性ＴＣＲのα鎖とβ鎖を連結するのに使用することができ、例えば、α鎖とβ鎖はどちらもシステイン改変することができ、ロイシンジッパードメインを含む。
本発明の可溶性ＴＣＲは、したがって、Ｃ末端４６アミノ酸がないＲａｄｉｕｍ−１の切断型α鎖に対応するα鎖ドメインを含むことができる。こうした切断型α鎖は、配列番号６４で示される配列（配列番号１１の残基１〜２２２に対応する）を有する。定常領域が上述したようにシステイン改変されている（すなわち、定常領域が、野生型配列に比べてＴｈｒ→Ｃｙｓ置換を含み、配列番号６４におけるＴ１７５Ｃ置換に対応する）場合、切断型α鎖は、配列番号６５で示される配列を有する。好ましい一実施形態においては、可溶性ＴＣＲのα鎖ドメインは、配列番号６４若しくは配列番号６５で示される配列又はそれと少なくとも９０若しくは９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、又はからなる。α鎖が配列番号６４又は６５の変異体を含む、又はからなるときには、ＣＤＲ配列は上で定義した通りであり、配列番号６５の変異体の場合には、位置１７５（又は配列番号６５の位置１７５に対応する位置）の残基はシステインである。
本発明の可溶性ＴＣＲのβ鎖ドメインは、Ｃ末端４８アミノ酸がないＲａｄｉｕｍ−１の切断型β鎖に対応し得る。こうした切断型β鎖は、配列番号６６で示される配列（配列番号１６の残基１〜２６２に対応する）を有する。定常領域が上述したようにシステイン改変されている（すなわち、定常領域が、野生型配列に比べてＳｅｒ→Ｃｙｓ置換を含み、配列番号６６におけるＳ１８８Ｃ置換に対応する）場合、切断型β鎖は、配列番号６７で示される配列を有する。好ましい一実施形態においては、可溶性ＴＣＲのβ鎖ドメインは、配列番号６６若しくは配列番号６７で示される配列又はそれと少なくとも９０若しくは９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、又はからなる。α鎖が配列番号６６又は６７の変異体を含む、又はからなるときには、ＣＤＲ配列は上で定義した通りであり、配列番号６７の変異体の場合には、位置１８８（又は配列番号６７の位置１８８に対応する位置）の残基はシステインである。
ある実施形態においては、上述した精製タグは、α又はβ鎖ドメインのＣ末端においてコードされる。好ましいタグは、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ−）タグである。こうしたタグは、短いリンカーＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙなどのリンカーによってα又はβ鎖のＣ末端に連結することができる。
本発明の一部の実施形態においては、ＴＣＲは、上記α及びβ鎖ドメインの一方のみを含む。例えば、それは、本発明のα鎖ドメインを含み、本発明の範囲外であるβ鎖ドメインを含まなくてもよいし、本発明のβ鎖ドメインを含み、本発明の範囲外であるα鎖ドメインを含まなくてもよい。あるいは、本発明のＴＣＲ分子は、本発明のα鎖ドメインのみ、又は本発明のβ鎖ドメインのみを含むことができる。しかし、ＴＣＲ分子は、本発明のα鎖ドメインと本発明のβ鎖ドメインの両方を含むことが好ましい。
本発明のＴＣＲが本発明のα鎖ドメインと本発明のβ鎖ドメインの両方を含むときには、それは、本発明の上記α鎖ドメインとβ鎖ドメインの任意の組合せを含むことができる。例えば、ヒト定常領域を含むα鎖ドメインは、マウス定常領域を含むβ鎖と対にすることができ、その逆も同様である。しかし、一般に、同類を同類と対にすべきことが好ましく、例えば、ヒト定常領域を含むα鎖ドメインをヒト定常領域を含むβ鎖ドメインと対にし、その逆も同様であり、マウス定常領域を含むα鎖ドメインをマウス定常領域を含むβ鎖ドメインと対にし、その逆も同様であり、又はシステイン改変された定常領域を含むα鎖ドメインをシステイン改変された定常領域を含むβ鎖ドメインと対にし、その逆も同様である。
上述したように、本発明の好ましい実施形態においては、ＴＣＲはｓｃＴＣＲとしてコードされ、α鎖ドメインのＣ末端はβ鎖ドメインのＮ末端とリンカーによって連結される。リンカーは切断可能であるべきであり、好ましくは、それは、ピコルナウイルス２Ａペプチドに由来するリンカーなどの自己スプライシングリンカーである。最も好ましくは、それは、配列番号１８の配列又はその変異体である。
本発明の完全長ＴＣＲは、ｓｃＴＣＲとしてコードすることができる。こうした一実施形態においては、ｓｃＴＣＲは、配列番号１８のリンカーによって連結された、Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖の配列を有するα鎖ドメインとＲａｄｉｕｍ−１β鎖の配列を有するβ鎖ドメインを含む。こうしたｓｃＴＣＲは、配列番号３３のアミノ酸配列を有する。
本発明の好ましい実施形態においては、配列番号３３のｓｃＴＣＲのα鎖ドメインとβ鎖ドメインの両方の定常領域がシステイン改変されている。上述したように、システイン改変Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖ドメインの好ましい配列は配列番号１２の配列を有し、システイン改変Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖ドメインの好ましい配列は配列番号１７の配列を有する。配列番号１８のリンカーによって連結された、配列番号１２の配列を有するシステイン改変Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖ドメインと配列番号１７の配列を有するシステイン改変Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖ドメインを含むｓｃＴＣＲは、配列番号３４のアミノ酸配列を有する。
特に本発明の完全長ＴＣＲの、別の好ましい一実施形態においては、本発明のＴＣＲのα及び／又はβ鎖ドメインの可変領域は、タグ、好ましくはダブルＭｙｃタグの配列を含む。好ましくは、α鎖ドメイン又はβ鎖ドメインの一方のみの可変領域、最も好ましくはα鎖ドメインの可変領域は、タグの配列を含む。上述したように、本発明の好ましい完全長α鎖ドメインは、配列番号２１で示されるように、ダブルＭｙｃタグがそのリーダー配列のＣ末端直近に挿入されたＲａｄｉｕｍ−１α鎖の配列を有するものである。配列番号２１のダブルＭｙｃタグ付きα鎖ドメインは、好ましくは、（配列番号１６の配列を有する）完全長Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖ドメインと組み合わせることができる。配列番号１８のリンカーで連結された、配列番号２１を有するダブルＭｙｃタグ付きα鎖ドメインと配列番号１６のＲａｄｉｕｍ−１β鎖ドメインを含むｓｃＴＣＲは、配列番号３５のアミノ酸配列を有する。
特に本発明の完全長ＴＣＲの、別の好ましい一実施形態においては、α鎖ドメインの可変領域はダブルＭｙｃタグを含み、α鎖ドメインとβ鎖ドメインの両方の定常領域はシステイン改変されている。上述したように、ダブルＭｙｃタグを含む可変領域及びシステイン改変定常領域を有する完全長α鎖ドメインの好ましい配列は、配列番号２２のアミノ酸配列を有する。配列番号２２のダブルＭｙｃタグ付きシステイン改変α鎖ドメインは、好ましくは、配列番号１７の完全長システイン改変β鎖ドメインと組み合わせることができる。配列番号１８のリンカーで連結された、配列番号２２のダブルＭｙｃタグ付きシステイン改変α鎖ドメインと配列番号１７のシステイン改変β鎖ドメインを含むｓｃＴＣＲは、配列番号３６のアミノ酸配列を有する。
したがって、本発明の一実施形態においては、ＴＣＲ分子は、配列番号３３のアミノ酸配列を有するｓｃＴＣＲであり、又はｓｃＴＣＲは、ＣＤＲ配列が上で定義された通りである限り、配列番号３３と少なくとも９０％又は９５％配列相同であるアミノ酸配列を有することができ、２Ａ由来のリンカーは、その自己スプライシング活性を保持する。
本発明の好ましい一実施形態においては、ＴＣＲ分子は、配列番号３４のアミノ酸配列を有するｓｃＴＣＲであり、又はｓｃＴＣＲは、ＣＤＲ配列及びシステイン改変が上で定義された通りである限り、配列番号３４と少なくとも９０％又は９５％配列相同であるアミノ酸配列を有することができ、２Ａ由来のリンカーは、その自己スプライシング活性を保持する。
本発明の別の好ましい一実施形態においては、ＴＣＲ分子は、配列番号３５のアミノ酸配列を有するｓｃＴＣＲであり、又はｓｃＴＣＲは、ＣＤＲ配列及びダブルＭｙｃタグ配列が上で定義された通りである限り、配列番号３５と少なくとも９０％又は９５％配列相同であるアミノ酸配列を有することができ、２Ａ由来のリンカーは、その自己スプライシング活性を保持する。
本発明の別の好ましい一実施形態においては、ＴＣＲ分子は、配列番号３６のアミノ酸配列を有するｓｃＴＣＲであり、又はｓｃＴＣＲは、ＣＤＲ配列、システイン改変及びダブルＭｙｃタグ配列が上で定義された通りである限り、配列番号３６と少なくとも９０％又は９５％配列相同であるアミノ酸配列を有することができ、２Ａ由来のリンカーは、その自己スプライシング活性を保持する。
上述したように、本発明のα及び／又はβ鎖ドメインの定常領域はマウス化することができる。マウス定常領域を有する好ましい完全長α鎖ドメインは配列番号２５の配列を有し、マウス定常領域を有する好ましい完全長β鎖ドメインは配列番号３１の配列を有する。配列番号１８のリンカーによって連結された、配列番号２５の配列を有するα鎖ドメインと配列番号３１のβ鎖ドメインを含むｓｃＴＣＲは、配列番号３７の配列を有する。
上述したように、好ましい一実施形態においては、α鎖ドメインとβ鎖ドメインの両方の定常領域はシステイン改変されている。システイン改変されたマウス化定常領域を含む完全長α鎖ドメインの好ましい配列は配列番号２６で示され、システイン改変されたマウス化定常領域を含む完全長β鎖ドメインの好ましい配列は配列番号３２で示される。配列番号１８のリンカーによって連結された配列番号２６の配列を有するα鎖ドメインと配列番号３２のβ鎖ドメインを含むｓｃＴＣＲは、配列番号３８の配列を有する。
上述したように、別の好ましい一実施形態においては、α鎖ドメインの可変領域は、ダブルＭｙｃタグを含む。ダブルＭｙｃタグを含む可変領域とマウス化定常領域とを含む完全長α鎖ドメインの好ましい配列は、配列番号２７で示される。ダブルＭｙｃタグを含む可変領域と配列番号２７のマウス化定常領域とを含むα鎖ドメインは、好ましくは、配列番号３１のマウス化定常領域を含む完全長β鎖ドメインと組み合わせることができる。配列番号１８のリンカーによって連結された、配列番号２７の配列を有するα鎖ドメインと配列番号３１の配列を有するβ鎖ドメインを含むｓｃＴＣＲは、配列番号３９の配列を有する。
別の好ましい一実施形態においては、α鎖ドメインはダブルＭｙｃタグを含む可変領域を含み、α鎖ドメインとβ鎖ドメインの両方の定常領域はシステイン改変されている。ダブルＭｙｃタグを含む可変領域とシステイン改変されたマウス化定常領域とを含む好ましい完全長α鎖ドメインは、配列番号２８の配列を有する。ダブルＭｙｃタグを含む可変領域と配列番号２８の配列を有するシステイン改変されたマウス化定常領域とを含むα鎖ドメインは、好ましくは、配列番号３２の配列を有するシステイン改変されたマウス化定常領域を含む完全長β鎖ドメインと組み合わせることができる。配列番号１８のリンカーによって連結された、配列番号２８の配列を有するα鎖ドメインと配列番号３２の配列を有するβ鎖ドメインを含むｓｃＴＣＲは、配列番号４０の配列を有する。
したがって、本発明の特定の実施形態においては、ＴＣＲ分子は、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９又は配列番号４０のアミノ酸配列を有するｓｃＴＣＲである。あるいは、ｓｃＴＣＲは、ＣＤＲ配列、及びダブルＭｙｃタグ及び／又はシステイン改変の存在場所が上で定義された通りである限り、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９又は配列番号４０の１つと少なくとも９０％又は９５％配列相同であるアミノ酸配列を有することができ、２Ａ由来のリンカーはその自己スプライシング活性を保持する。
配列番号３３〜４０のｓｃＴＣＲポリペプチドは、それぞれ配列番号４１〜４８のヌクレオチド配列によってコードされる。本発明の核酸分子は、本発明のＴＣＲ分子をコードするものである。本発明の核酸分子は、したがって、上で定義した本発明の任意のＴＣＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。ヒト定常領域を含むα及びβ鎖ドメインを有するｓｃＴＣＲをコードする本発明の核酸分子は、特に、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３又は配列番号４４のいずれか一つのヌクレオチド配列を含むことができる。マウス定常領域を含むα及びβ鎖ドメインを有するｓｃＴＣＲをコードする本発明の核酸分子は、特に、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７又は配列番号４８のいずれか一つのヌクレオチド配列を含むことができる。
したがって、本発明の核酸分子は、配列番号４１〜４４又は４５〜４８のいずれか一つのヌクレオチド配列を含むことができる。あるいは、本発明の核酸分子は、配列番号４１〜４４若しくは４５〜４８のいずれか一つと少なくとも９０％若しくは９５％配列相同であるか、又は配列番号４１〜４４若しくは４５〜４８のいずれか一つのヌクレオチド配列に縮重するヌクレオチド配列を含むことができる。本発明の上記核酸分子のいずれかの逆相補体である配列を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子も本発明の範囲内である。
本発明の可溶性ＴＣＲは、ｓｃＴＣＲとしてコードすることができる。可溶性ＴＣＲの好ましいｓｃＴＣＲは、対応する切断型α及びβ鎖ドメインを用いて、完全長ＴＣＲについて上述したものに対応する。本発明の完全長ＴＣＲに関しては、ｓｃＴＣＲがα鎖ドメインのＮ末端に、β鎖ドメインのＣ末端にコードされ、上で定義したように、２つのドメインがリンカー、好ましくは配列番号１８で示される配列を有するピコルナウイルス２Ａペプチド又はその誘導体によって分離されることが好ましい。
一実施形態においては、可溶性ｓｃＴＣＲは、配列番号６５で示されるアミノ酸配列を有するα鎖ドメイン（又はその変異体）及び配列番号６７で示されるアミノ酸配列を有するβ鎖ドメイン（又はその変異体）を含み、２本の鎖は２Ａ由来のリンカーによって分離されている。特定の一実施形態においては、このｓｃＴＣＲは、配列番号６８で示される配列又はそれと少なくとも９０若しくは９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、又はからなる。ｓｃＴＣＲが配列番号６８の変異体を含む、又はからなる場合、ＣＤＲ配列は上で定義した通りであり、位置１７５及び４３６（又は配列番号６８の位置１７５及び４３６に対応する位置）の残基はシステインである（これらの位置は、それぞれα及びβ鎖ドメインの位置１７５及び１８８に対応する）。
別の一実施形態においては、Ｈｉｓタグは、配列番号６８のｓｃＴＣＲのＣ末端に位置し（β鎖のＣ末端に対応するｓｃＴＣＲのＣ末端）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙリンカーによってβ鎖から分離されている。こうしたｓｃＴＣＲは、配列番号６９で示される配列を有する。別の好ましい一実施形態においては、本発明は、配列番号６９で示される配列又はそれと少なくとも９０又は９５％であるアミノ酸配列を含む、又はからなる、ｓｃＴＣＲを提供する。ｓｃＴＣＲが配列番号６９の変異体を含む、又はからなる場合、ＣＤＲ配列は上で定義した通りであり、位置１７５及び４３６（又は配列番号６９の位置１７５及び４３６に対応する位置）の残基はシステインである（これらの位置は、それぞれα及びβ鎖ドメインの位置１７５及び１８８に対応する）。
配列番号６８及び６９のアミノ酸配列は、配列番号７０及び７１で示されるヌクレオチド配列によってコードされる。本発明の核酸分子は、完全長ＴＣＲをコードする核酸分子及び可溶性ＴＣＲをコードする核酸分子を含めて、本発明のＴＣＲをコードする核酸分子である。本発明の核酸分子は、ある実施形態においては、配列番号７０若しくは配列番号７１で示されるヌクレオチド配列又は配列番号７０若しくは配列番号７１と少なくとも９０若しくは９５％配列相同であるヌクレオチド配列を含む、又はからなる核酸分子である。配列番号７０、配列番号７１又はそれと少なくとも９０若しくは９５％配列相同であるヌクレオチド配列の逆相補体を含む、又はからなる、核酸分子も本発明の範囲内である。
上述したように、本発明のある実施形態は、特定の定義された配列（参照配列）とあるレベルの配列相同性を有するポリペプチド又はポリヌクレオチドに言及する。％配列相同性を特定の参照配列に対して本明細書で示す場合、％配列相同性は、参照配列の全長にわたって求められる。ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を比較するときには、最大一致で整列したときに２つの配列のヌクレオチド配列が同じである場合、２つの配列は「同一」であると言う。配列相同性を求める方法は当該技術分野で周知であり、任意の好都合又は利用可能な方法を使用することができる。
比較配列の最適アラインメントは、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ Ｓｕｉｔｅ中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、マディソン、ＷＩ）を使用して初期設定パラメータを用いて行うことができる。あるいは、比較配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ ２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似度検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は検査によって、実施することができる。
同様に、変異配列中のアミノ酸位置が参照配列中の特定のアミノ酸位置に「対応する」と定義された場合、対応する位置は上で詳述した配列アラインメントによって確認することができる。変異配列を参照配列と整列させるときには、任意の特定の位置で整列するアミノ酸を本明細書では「対応する」と定義する。例えば、配列番号１０の変異体を配列番号１０と整列させる場合、配列番号１０の位置４８に対応する変異配列の位置は、配列番号１０のアミノ酸４８と整列するアミノ酸である。参照配列中の位置に対応する変異配列の位置は、参照配列中と同じ場所にすることができ、例えば、配列番号１０の位置４８は、配列番号１０の変異体の位置４８に対応し得る。しかしながら、対応する位置を異なる場所にすることもできる。例えば、単一のアミノ酸が配列番号１０の変異体のＮ末端から除去される（かつ他の変異がない）場合、配列番号１０の位置４８は変異配列の位置４７に対応することになる。
遺伝暗号の縮重の結果、本明細書に記載の個々のＴＣＲ分子をコードし得る多数のヌクレオチド配列が存在することを当業者は理解されたい。
本発明の核酸分子は、単離核酸分子とすることができ、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡ、又は放射性同位体若しくは蛍光団、発色団、ビオチン（「標識」）などの化学付加体を有する分子を含めたＤＮＡ若しくはＲＮＡの化学誘導体を含むことができる。したがって、核酸は、改変ヌクレオチドを含むことができる。前記改変としては、ブロモウリジンなどの塩基改変、アラビノシド、２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース改変、及びホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホルアニラダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）及びホスホロアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）などのヌクレオチド間結合改変が挙げられる。「核酸分子」という用語は、具体的にはＤＮＡ及びＲＮＡの一本鎖及び二本鎖体を含む。
ヌクレオチド配列を改変して種々のＴＣＲ領域のアミノ酸配列に変化を導入する方法は当該技術分野でよく知られており、例えば、部位特異的変異誘発などの変異誘発の方法を採用することができる。ＴＣＲ分子をコードする核酸分子を調製する方法もよく知られており、例えば、従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）クローニング技術を使用して核酸分子を構築することができる。
例えば、核酸分子をｐＥＮＴＲ（Ｇａｔｅｗａｙ）、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．製ｐＣＲ ＴＯＰＯ（登録商標）などの汎用クローニングベクターにクローン化することができる。次いで、ＴＣＲをコードする核酸分子を有する、得られた核酸構築物（組換えベクター）を、例えば哺乳動物細胞中でタンパク質を発現させるための発現ベクター又はウイルスベクター中にサブクローニングすることができる。これは、ＴＣＲタンパク質の調製用、又は免疫エフェクター細胞、例えば、ヒトＴ細胞若しくは細胞株又は他のヒト免疫エフェクター細胞での発現用とすることができる。さらに、ＴＣＲをコードするｍＲＮＡの産生のために核酸をｍＲＮＡ発現ベクターに導入することができる。次いで、ｍＲＮＡを免疫エフェクター細胞に移入することができる。したがって、本発明の別の一態様は、本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。
あるいは、ｍＲＮＡ発現ベクターは、インビトロで転写されて、ＴＣＲをコードするｍＲＮＡを産生することができる。インビトロ転写（ＩＶＴ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）では、テンプレートが最初に得られる。これは、直線状ｍＲＮＡ発現ベクターとすることができる。ベクターは、例えば制限酵素を用いて、直線状にすることができる。あるいは、テンプレートは、発現カセットのＰＣＲ増幅によって、又は当業者に周知の任意の他の方法で、得ることができる。次いで、テンプレートを精製し、転写する。転写は、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）キット、ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（商標）キットなどのＩＶＴキットを用いて行うことができる。次いで、鋳型ＤＮＡを試料のＤＮａｓｅ消化によって除去し、続いてｍＲＮＡを精製することができる。ＩＶＴの方法は当業者によく知られている。
本発明の核酸分子は、ベクター中で、又は単離核酸分子若しくは組換え構築物として、細胞に導入することができる。異種遺伝子発現の方法は、構築物／ベクター調製の点と核酸分子（ベクター又は構築物）を細胞に導入する点の両方で当該技術分野で公知である。すなわち、哺乳動物細胞、特にＴ細胞及び適切なベクター（例えば、ウイルスベクター）と一緒に使用するのに適切なプロモーター及び／又は他の発現制御配列は、当該技術分野でよく知られている。
したがって、核酸分子をベクターに導入又は挿入することができる。本明細書では「ベクター」という用語は、ＴＣＲタンパク質若しくはｍＲＮＡの発現、及び／又は核酸分子のクローニングを引き起こすように核酸分子を導入する（例えば、共有結合的に挿入する）ことができるビヒクルを指す。ベクターは、したがって、クローニングベクター又は発現ベクターとすることができる。
核酸分子は、当該技術分野で公知の任意の適切な方法によってベクターに挿入することができ、例えば、それらに限定されないが、ベクターを適切な制限酵素を用いて消化し、次いで一致する制限末端を有する核酸分子と連結することができる。
発現ベクターは、種々の制御配列を含むことができる。制御配列とは、特定の宿主細胞における作用を可能に結合したコード配列の転写及び場合によっては翻訳に必要な核酸配列を指す。転写及び翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターは、例えば、複製における機能、選択マーカーとしての機能などを含めて、別の機能を果たす追加の核酸配列を含むことができる。
発現ベクターは、プロモーター配列などのそのそれぞれの宿主細胞における効率的遺伝子転写及び翻訳のために必要な５’上流及び３’下流調節エレメントを有するべきであり、その例としては、ＣＭＶ、ＰＧＫ及びＥＦ１ａプロモーター、リボソーム認識及び結合のためのＴＡＴＡボックス、並びに３’ＵＴＲ ＡＡＴＡＡＡ（配列番号５３）転写終結配列が挙げられる。他の適切なプロモーターとしては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０：ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）の構成的「初期プロモーター」、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ：ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）末端反復配列（ＬＴＲ：ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ：Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ：ａｖｉａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）前初期プロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ：Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）プロモーターが挙げられる。アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーターを含めて、ただしそれらに限定されない、ヒト遺伝子プロモーターを使用することもできる。ある実施形態においては、誘導性プロモーターもＴＣＲを発現するベクターの一部として企図される。これは、核酸分子の発現をオンオフ可能な分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター又はテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。
さらに、発現ベクターは、エンハンサー配列として機能し得る５’及び３’非翻訳制御配列、及び／又は核酸分子の効率的転写を促進又は増強し得る転写終結配列を含むことができる。
ベクターの例としては、プラスミド、自己複製配列及び転移因子が挙げられる。追加の例示的ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ：ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ：ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ：Ｐ１−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）などの人工染色体、ラムダファージ、Ｍ１３ファージなどのバクテリオファージ、及び動物ウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。ベクターとして有用である動物ウイルスのカテゴリの例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス及びパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、それらに限定されない。発現ベクターの例は、哺乳動物細胞における発現のためのｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、並びに哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子移入及び発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）及びｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）である。
ある実施形態においては、ウイルスベクターが好ましい。ウイルスベクターは、レトロウイルス、特にレンチウイルス又はスプーマウイルス／泡沫状ウイルスから誘導することができる。本明細書では「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１個のエレメントを含み、ウイルスベクター粒子中にパッケージされる能力を有する、核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりに本発明の核酸分子を含むことができる。ベクター及び／又は粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は他の核酸を細胞中にインビトロ又はエクスビボで移入する目的で利用することができる。
したがって、本発明の更なる一態様は、本明細書に定義及び記載された核酸分子を含むウイルス粒子、又はこうしたウイルス粒子を含む調製物若しくは組成物を含む。こうした組成物は、少なくとも１種の生理的に許容される担体を含むこともできる。
多数の形態のウイルスベクターが当該技術分野で公知である。ある実施形態においては、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。ベクターは、Ｕ３領域として知られる３’ＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域が、１回目のウイルス複製以降はウイルス転写しないように（例えば、欠失又は置換によって）改変された自己不活性型ベクターとすることができる。その結果、ベクターは、感染し、次いで宿主ゲノムと１回だけ統合することができるが、更に増えることはできない。
ここで使用されるレトロウイルスベクターは、任意の公知のレトロウイルス、例えば、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍ−ＭＳＶ：Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（Ｈａ−ＭｕＳＶ：Ｈａｒｖｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ：ｇｉｂｂｏｎ ａｐｅ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ：ｆｅｌｉｎｅ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、スプーマウイルス、フレンドウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ：ｍｕｒｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｖｉｒｕｓ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などのＣ型レトロウイルス；ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２などのヒトＴ細胞白血病ウイルス；並びにヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ：ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ：ｆｅｌｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ウマ免疫不全ウイルス（ＥＩＶ：ｅｑｕｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）などのレトロウイルスのレンチウイルス科、別のクラスのレトロウイルスに由来してもよい。
レンチウイルスベクターは、徐々に進行する疾患を生じるレトロウイルスの一グループ（又は属）であるレンチウイルスに由来してもよい。このグループに含まれるウイルスとしては、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２型を含めたヒト免疫不全ウイルス）が挙げられる。
レトロウイルスパッケージング細胞株（一般に、哺乳動物細胞株）は、ウイルス粒子の産生に使用することができ、ウイルス粒子は、次いで、Ｔ細胞の形質導入に使用することができる。説明のためのウイルスベクターは、国際公開第２００２０８７３４１号、国際公開第２００２０８３０８０号、国際公開第２００２０８２９０８号、国際公開第２００４０００２２０号及び国際公開第２００４０５４５１２号に記載されている。例示的レトロウイルスベクターは、Ｗａｅｌｃｈｌｉら、２０１１年に記載のｐＭＰ７１である。別の適切なベクターとしては、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＺＬ、ｐＭＣｓ−ＣＡＧ、ｐＭＸｓ−ＣＭＶ、ｐＭＸｓ−ＥＦ１α、ｐＭＸｓ−ＩＲＥＳ、ｐＭＸｓ−ＳＲα及びｐＭＹｓ−ＩＲＥＳが挙げられる。
本発明のベクター又は構築物を有する免疫エフェクター細胞をインビボでネガティブ選択されやすくする遺伝子セグメントを含むことは本発明の範囲内である。「ネガティブ選択」とは、融合細胞を個体のインビボ条件の変化の結果として除去できることを意味する。ネガティブ選択可能な表現型は、投与薬剤、例えば化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入に起因し得る。ネガティブ選択可能な遺伝子は、当該技術分野で公知であり、とりわけ、以下、すなわち、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＩＴＫ：Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１（１）：２２３〜２３２、１９７７）；細胞のヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅｐｈｏｓｐｈｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞のアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子及び細菌のシトシンデアミナーゼ（Ｍｕｌｌｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：３３〜３７（１９９２））が挙げられる。本発明のベクター又は構築物は、したがって、こうした遺伝子を含むことができる。
一部の実施形態においては、本発明のベクター又は構築物において、インビトロでのネガティブ選択可能な表現型の細胞の選択、例えば、遺伝子改変免疫エフェクター細胞の選択を可能にするポジティブマーカーを含むことが有用であり得る。ポジティブ選択マーカーは、宿主細胞に導入されると、その遺伝子を有する細胞のポジティブ選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子とすることができる。このタイプの遺伝子は、当該技術分野で公知であり、とりわけ、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ又はａｐｈ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）及び多剤耐性（ＭＤＲ：ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）遺伝子が挙げられる。
好ましくは、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択エレメントは、ネガティブ選択エレメントの減少がポジティブ選択マーカーの減少も必然的に伴うように関連づけられる。更により好ましくは、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーが融合されて、一方の減少が不可避的に他方の減少を招く。上記所望のポジティブ選択機能とネガティブ選択機能の両方を付与するポリペプチドを発現産物として生成する融合ポリヌクレオチドの一例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ−チミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、インビトロでのポジティブ選択に対するハイグロマイシンＢ耐性及びインビボでのネガティブ選択に対するガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドをもたらす。（Ｌｕｐｔｏｎ Ｓ．Ｄ．ら、Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：３３７４〜３３７８、１９９１参照）。
核酸分子のクローニングの場合、ベクターを宿主細胞（例えば、単離宿主細胞）に導入することができ、本発明のクローニングベクターを含むこうした「クローニング宿主細胞」は、本発明の更なる一態様を形成する。適切なクローニング宿主細胞としては、原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、又は哺乳動物細胞などのより高等な真核細胞が挙げられるが、それらに限定されない。この目的のための適切な原核細胞としては、グラム陰性菌、グラム陽性菌などの真正細菌、例えば、エシェリキアなどの腸内細菌科、例えば、大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えば、サルモネラチフィムリウム、セラチア、例えば、セラチアマルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、及びシゲラ、並びにバチルスサブチリス、バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）などのバチルス、Ｐ．エルジノーサなどのシュードモナス、及びストレプトミセスが挙げられるが、それらに限定されない。あるいは、クローニング宿主細胞は、核酸分子を含むｍＲＮＡ発現ベクターを含むことができる。
核酸分子又はベクターは、当該技術分野で公知の形質移入及び／又は形質導入技術を用いて宿主細胞（例えば、クローニング宿主細胞、産生宿主細胞又はＴ細胞）に導入される。本明細書では「形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」及び「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」という用語は、外来核酸配列が宿主細胞に導入されるプロセスを指す。核酸は、宿主細胞ＤＮＡと統合することができ、又は染色体外で維持することができる。核酸は、一時的に維持することができ、又は持続性とすることができる。形質移入は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、ポリブレン媒介形質移入、電気穿孔、微量注入、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染及び微粒子銃を含めて、ただしそれらに限定されない当該技術分野で公知の種々の手段によって行うことができる。形質導入とは、形質移入ではなく、ウイルス感染による、ウイルス又はレトロウイルスベクターを用いた遺伝子（単数又は複数）の送達を指す。ある実施形態においては、レトロウイルスベクターは、細胞との接触前に、ベクターをウイルス粒子、すなわちビリオン中にパッケージすることによって導入される。
本発明は、本発明の核酸分子又はベクターを含む宿主細胞も提供する。こうした宿主細胞は、クローニング宿主、産生宿主又は免疫エフェクター細胞を含めて、任意の適切な宿主とすることができる。宿主細胞は、その機能に応じて、任意の種、実際には任意のドメインに由来してもよい。
一実施形態においては、本発明は、本発明の完全長ＴＣＲをコードする本発明の核酸分子又はベクターを含む免疫エフェクター細胞を提供する。「免疫エフェクター細胞」は、１つ以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞死滅活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞である。したがって、代表的免疫エフェクター細胞としては、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）及びヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ：ｈｅｌｐｅｒ Ｔ−ｃｅｌｌ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）が挙げられる。Ｔ細胞の別の集団、例えば、ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞もここでは有用である。他の免疫エフェクター細胞としては、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球及びマクロファージが挙げられる。上述したように、免疫エフェクター細胞は、エフェクター細胞の前駆体も含み、こうした前駆細胞は、インビボ又はインビトロで免疫エフェクター細胞に分化するように誘導することができる。Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、本発明に係る好ましい免疫エフェクター細胞である。
本発明のＴ細胞は、任意のＴ細胞とすることができる。それは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８+Ｔ細胞）、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４+Ｔ細胞）、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞又は任意の別のタイプのＴ細胞とすることができる。好ましくは、Ｔ細胞はＣＤ８+Ｔ細胞である。本明細書に定義したように、本発明のＴ細胞は、ＣＤ４-／ＣＤ８-細胞、ＣＤ４+／ＣＤ８+細胞などの未熟Ｔ細胞、又はＴ細胞の前駆体とすることもできる。
「ＮＫ細胞」という用語は、抗原特異的受容体（例えば、Ｔ細胞受容体又はＢ細胞受容体）を天然に含まないリンパ球系共通前駆細胞由来の細胞傷害性リンパ球である、大型顆粒リンパ球を指す。ＮＫ細胞は、そのＣＤ３-、ＣＤ５６+表現型によって区別することができる。したがって、本明細書ではこの用語は、任意の公知のＮＫ細胞、任意のＮＫ様細胞、又はＮＫ細胞の特性を有する任意の細胞を含む。したがって、初代ＮＫ細胞を使用することができ、又は別の一実施形態においては、以前に単離及び培養された当該技術分野で公知のＮＫ細胞を使用することができる。したがって、ＮＫ細胞株を使用することができる。幾つかの異なるＮＫ細胞が公知であり、文献に報告され、これらのいずれかを使用することができ、又は細胞株を初代ＮＫ細胞から、例えばウイルス形質転換によって、調製することができる（Ｖｏｇｅｌら、２０１４、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２８：１９２〜１９５）。適切なＮＫ細胞としては（決してそれらに限定されないが）、ＮＫ−９２に加えて、ＮＫ−ＹＳ、ＮＫ−ＹＴ、ＭＯＴＮ−１、ＮＫＬ、ＫＨＹＧ−１、ＨＡＮＫ−１又はＮＫＧ細胞株が挙げられる。好ましい一実施形態においては、細胞は、ＮＫ−９２細胞（Ｇｏｎｇら、１９９４、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８：６５２〜６５８）又はその変異体である。非免疫原性であるＮＫ−９２変異体を含めて、元のＮＫ−９２細胞の幾つかの異なる変異体が調製され、記述され、又は入手可能である。任意のこうした変異体が使用可能であり、「ＮＫ−９２」という用語に含まれる。別の細胞株の変異体を使用することもできる。
本発明の免疫エフェクター細胞は、好ましくはヒトである。こうした免疫エフェクター細胞は、任意のヒト個体に由来することができる。好ましくは、免疫エフェクター細胞が治療用であるときには、それは自己免疫エフェクター細胞であり、すなわち、処置される患者に由来し、それによって組織適合性及び非免疫原性が確保される。これは、遺伝子改変後、それが患者からの免疫応答を誘導しないことを意味する。免疫エフェクター細胞が治療用非自己細胞である（すなわち、それが、患者以外の個体から得られたドナー細胞である）場合、それは、非免疫原性であり、対象に投与したときに、治療における細胞の使用に影響する、使用を妨害する、又は阻止する、免疫応答を生じないことが好ましい。本発明の免疫エフェクター細胞は、したがって、エクスビボ細胞とすることができる。あるいは、又はさらに、それはインビトロ細胞とすることができる。
非自己免疫エフェクター細胞は、患者に対してＨＬＡ適合である、すなわち同じＨＬＡ対立遺伝子を発現する場合、当然、非免疫原性であり得る。患者に対してＨＬＡ適合でない、したがって免疫原性であるもの、及び患者に対してＨＬＡ適合であり、免疫原性でないかもしれないものを含めて、非自己免疫エフェクター細胞は、ＭＨＣ分子の発現を無くすように、又はＭＨＣ分子をその表面で弱くしか発現しないように改変することができる。あるいは、こうした細胞は、非機能性ＭＨＣ分子を発現するように改変することができる。
機能性ＭＨＣ分子の発現が破壊される任意の手段が包含される。したがって、これは、ＭＨＣ複合体の分子をノックアウト若しくはノックダウンすることを含むことができ、及び／又はそれは、細胞表面への適切な輸送、及び／又は細胞表面におけるＭＨＣ分子若しくは複合体全体の正しい発現を防止する改変を含むことができる。
特に、本発明の免疫エフェクター細胞の表面における１種以上の機能性ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現を破壊することができる。一実施形態においては、免疫エフェクター細胞は、１個以上のＨＬＡ分子、例えば、ＨＬＡクラスＩＭＨＣ複合体の分子の発現が破壊（例えば、ノックアウト）される細胞などのＨＬＡ陰性であるヒト細胞とすることができる。
好ましい一実施形態においては、クラスＩＭＨＣ発現の破壊は、成熟クラスＩＭＨＣ複合体の一成分であるβ2ミクログロブリン（β2−ｍ）をコードする遺伝子をノックアウトすることによって実施することができる。β2−ｍの発現は、β2−ｍ遺伝子の標的破壊によって、例えば、（プロモーターを不活性化する）β2−ｍプロモーターの部位特異的変異誘発によって、又はβ2−ｍタンパク質をコードする遺伝子内で、β2−ｍタンパク質の発現を阻止する不活性化変異、例えば、フレームシフト変異若しくは遺伝子内の未熟「終止」コドンを導入することによって、無くすことができる。あるいは、部位特異的変異誘発を使用して、活性ＭＨＣタンパク質を細胞表面で形成できない非機能性β2−ｍタンパク質を産生することができる。このようにして、β2−ｍタンパク質又はＭＨＣを細胞内に保持することができ、又は細胞表面に存在し得るが、非機能性とすることができる。
あるいは、対象に投与する前に免疫エフェクター細胞へ照射することができる。理論に拘泥するものではないが、細胞への照射は、細胞が対象において単に一時的に存在する結果になり、したがって対象の免疫系が細胞に対して免疫応答を開始するのに利用可能な時間を短縮すると考えられる。こうした細胞は、その細胞表面で機能性ＭＨＣ分子を発現することができるが、非免疫原性であると考えることもできる。照射は、任意のα、β若しくはγ照射源からすることができ、又はＸ線照射若しくは紫外線とすることができる。５〜１０Ｇｙの放射線量は、増殖を抑制するのに十分であり得るが、他の適切な放射線量は、１〜１０、２〜１０、３〜１０、４〜１０、６〜１０、７〜１０、８〜１０若しくは９〜１０Ｇｙ、又は１１、１２、１３、１４、１５、２０Ｇｙなどのより高い線量とすることができる。あるいは、細胞を「自殺遺伝子」を発現するように改変することができ、それによって細胞を誘導的に死滅させ、又は外部刺激に反応して複製するのを防止することができる。
したがって、本発明に係る免疫エフェクター細胞は、増殖するその性能又は能力を低下させることによって、すなわちその増殖能力を低下させることによって、非免疫原性になるように改変することができる。
本発明の改変免疫エフェクター細胞は、別の方法で改変を受けやすくすることもでき、例えば、細胞機能若しくは挙動の別の側面を変更若しくは改変しやすくすることもでき、及び／又は別のタンパク質を発現しやすくすることもできる。例えば、体内の特定の組織若しくは場所に細胞を向けるように、又は該組織若しくは場所への局在を向上させるように作用するホーミング受容体又は局在受容体を発現するように細胞を改変することができる。
本発明は、本明細書に記載のＴＣＲを発現する免疫エフェクター細胞を製造する方法も提供する。一実施形態においては、該方法は、Ｔ細胞が本明細書に記載の１種以上のＴＣＲを発現するように、（患者又はドナーであり得る）対象から単離されたＴ細胞を移入又は導入することを含む。ある実施形態においては、Ｔ細胞は、対象から単離され、インビトロでの更なる操作なしに、核酸分子の導入によって改変される。次いで、こうした細胞を対象に直接再投与することができる。更なる実施形態においては、ＴＣＲを発現するように改変する前に、Ｔ細胞をまず活性化し、刺激して、インビトロで増殖させる（増殖のこうした活性化及び刺激を増大と称することができる）。なお、Ｔ細胞は、遺伝子改変する（すなわち、本明細書に記載のＴＣＲを発現するように形質導入又は形質移入する）前又は後に培養することができる。
Ｔ細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含めて、幾つかの供給源から得ることができる。ある実施形態においては、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの当業者に既知の任意の数の技術を用いて対象から回収された１単位の血液から得ることができる。一実施形態においては、対象の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス生成物は、一般に、Ｔ細胞を含めたリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含む。一実施形態においては、アフェレーシスによって回収される細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、後続処理のために細胞を適切な緩衝剤又は媒体に入れることができる。本発明の一実施形態においては、細胞をＰＢＳで洗浄する。別の一実施形態においては、洗浄溶液は、カルシウム及び／又はマグネシウムを含まず、又は全部ではないが多数の二価カチオンを含まない可能性がある。当業者には理解されるように、洗浄ステップは、半自動流通遠心分離機の使用など、当業者に既知の方法によって行うことができる。例えば、Ｃｏｂｅ２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅなどである。洗浄後、細胞を種々の生体適合性緩衝剤、又は緩衝剤を含む、若しくは含まない他の食塩水に再懸濁させることができる。ある実施形態においては、アフェレーシス試料の望ましくない成分を細胞直接再懸濁培地において除去することができる。
ある実施形態においては、Ｔ細胞はＰＢＭＣから単離される。ＰＢＭＣは、全血の密度勾配遠心分離、例えば、ＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（商標）勾配、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配又はＦＩＣＯＬＬ（商標）勾配遠心分離によって得られるバフィーコートから単離することができる。Ｔ細胞は、単球の枯渇によって、例えばＣＤ１４ ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）の使用によって、ＰＢＭＣから単離することができる。一部の実施形態においては、赤血球は、密度勾配遠心分離の前に溶解させることができる。
ＣＤ２８+、ＣＤ４+、ＣＤ８+、ＣＤ４５ＲＡ+、ＣＤ４５ＲＯ+Ｔ細胞などのＴ細胞の特定の亜集団は、所望であれば、ポジティブ又はネガティブ選択技術によって更に単離することができる。例えば、ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組合せを用いて行うことができる。本明細書で使用される一方法は、ネガティブ選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを用いた陰性磁気免疫付着（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｒｅｎｃｅ）又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び／又は選択である。例えば、ＣＤ４+細胞をネガティブ選択によって濃縮するには、モノクローナル抗体カクテルは、一般に、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８に対する抗体を含む。フローサイトメトリー及び細胞選別を使用して、本発明に使用される目的の細胞集団を単離することもできる。
ある実施形態においては、細胞傷害性Ｔ細胞とヘルパーＴ細胞の両方を、遺伝子改変及び／又は増大の前又は後に、ナイーブ、メモリー及びエフェクターＴ細胞亜集団に選別することができる。ＣＤ８+Ｔ細胞は、上述したように標準方法を用いることによって得ることができる。一部の実施形態においては、ＣＤ８+Ｔ細胞は、それらのタイプのＣＤ８+Ｔ細胞の各々に関連する細胞表面抗原を同定することによって、ナイーブ、セントラルメモリー及びエフェクター細胞に更に選別される。メモリーＴ細胞は、ＣＤ８+末梢血Ｔ細胞のＣＤ６２Ｌ+サブセットとＣＤ６２Ｌ-サブセットの両方に存在し得る。Ｔ細胞は、抗ＣＤ８及び抗ＣＤ６２Ｌ抗体染色後にＣＤ６２Ｌ-／ＣＤ８+及びＣＤ６２Ｌ+／ＣＤ８+画分に選別される。セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の表現型マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３及びＣＤ１２７の発現、並びにグランザイムＢの発現の欠如を含むことができる。ＴＣＭは、ＣＤ４５ＲＯ+／ＣＤ６２Ｌ+／ＣＤ８+Ｔ細胞とすることができる。エフェクターＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８及びＣＤ１２７発現に対して陰性であり、グランザイムＢ及びパーフォリン発現に対して陽性であり得る。ナイーブＣＤ８+Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７及びＣＤ４５ＲＡを含めたナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けることができる。
単離免疫エフェクター細胞は、単離後に改変することができ、又は改変前にインビトロで活性化及び増大（又は前駆体の場合には分化）させることができる。一実施形態においては、細胞を本発明の核酸分子の導入によって改変し、次いでインビトロで活性化及び増大させる。別の一実施形態においては、細胞をインビトロで活性化及び増大させ、次いで本発明の核酸分子の導入によって改変する。Ｔ細胞を活性化及び増大させる方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６９０５８７４号、同６８６７０４１号、同６７９７５１４号及び国際公開第２０１２０７９０００号に記載されている。一般に、こうした方法は、ＩＬ−２などの適切なサイトカインを補充した培地中で、一般に（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８ ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）の形で）ビーズ又は別の表面に付着した抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８抗体などの刺激剤及び共刺激剤とＰＢＭＣ又は単離Ｔ細胞を接触させることを含む。抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体の両方が付着したビーズは、代理抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）として働く。別の実施形態においては、米国特許第６０４０１７７号、同５８２７６４２号及び国際公開第２０１２１２９５１４号に記載のものなどの方法を用いて、Ｔ細胞を活性化及び刺激して、支持細胞及び適切な抗体及びサイトカインと一緒に増殖させることができる。
一実施形態においては、Ｔ細胞に本発明に係る核酸分子を導入又は移入する。導入及び移入方法については上述した。本発明の核酸分子は、本発明の核酸分子を含むベクター（すなわち、本発明のＴＣＲ分子をコードするもの）とすることができる。あるいは、それは、本発明のＴＣＲ分子をコードするｍＲＮＡ分子とすることができる。
別の一実施形態においては、ＣＤ３４+細胞に本発明に係る核酸分子を導入又は移入する。ある実施形態においては、改変（例えば、形質移入又は形質導入）ＣＤ３４+細胞は、対象、一般には細胞が最初に単離された対象に投与後、成熟免疫エフェクター細胞にインビボで分化する。別の一実施形態においては、ＣＤ３４+細胞を以下のサイトカイン、すなわち、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、幹細胞因子（ＳＦ）、巨核球増殖分化因子（ＴＰＯ）、ＩＬ−３及びＩＬ−６の１種以上を用いて、当該技術分野で公知の方法に従って、核酸分子の導入前又は後にインビトロで刺激することができる。
別の一実施形態においては、本発明は、本発明の可溶性ＴＣＲをコードする本発明の核酸分子又はベクターを含む産生宿主細胞を提供する。産生宿主細胞は、可溶性ＴＣＲの発現及び産生に適している。産生宿主細胞は、タンパク質産生に適切な任意の細胞とすることができる。例えば、産生宿主細胞は、原核細胞、特にグラム陰性細菌細胞（例えば、大腸菌）、グラム陽性細菌細胞（例えば、バチルスサブチリス）などの細菌細胞とすることができる。しかしながら、産生宿主細胞は、好ましくは真核細胞である。本発明の真核生物産生宿主細胞は、酵母、真菌細胞などの単純な真核細胞とすることができる。好ましくは、真核生物産生宿主細胞は、動物細胞である。動物細胞は、昆虫細胞又は任意の他の動物細胞とすることができるが、好ましくは、哺乳動物細胞である。例えば、哺乳動物産生宿主細胞は、霊長類細胞、特にヒト細胞、又は齧歯類細胞とすることができ、例えば、ＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）又はＣＨＯ細胞とすることができる。哺乳動物産生宿主細胞、特にヒト産生宿主細胞が好ましく、可溶性ＴＣＲがヒト細胞中で発現されるときには、翻訳後改変が適宜なされる。当業者は、適切な産生宿主細胞を容易に選択することができる。
本発明は、本明細書に定義したＴＣＲ分子、特に本明細書に定義した可溶性ＴＣＲ分子も提供する。本発明の可溶性ＴＣＲは、上で定義したように、切断型α鎖ドメイン及び切断型β鎖ドメインを含むタンパク質又はタンパク質複合体である。可溶性ＴＣＲは、Ｗａｌｓｅｎｇら（２０１５）、ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（４）：ｅ０１１９５５９に詳述されている。
本発明の可溶性ＴＣＲは、好ましくは、単鎖としてコードされる。単鎖可溶性ＴＣＲについては上述しており、詳細には、こうしたｓｃＴＣＲは、好ましくは、α鎖ドメインとβ鎖ドメインの間に自己切断リンカー配列を含み、したがって別々のα及びβ鎖を生成する。
したがって、本発明の可溶性ＴＣＲは、好ましくは、別々のポリペプチド鎖を構成するα鎖及びβ鎖を含むＴＣＲ複合体である。本発明の可溶性ＴＣＲは、上で定義した本発明の核酸分子によってコードされるＴＣＲである。上述したように、α及びβ鎖の可変領域は、挿入のために、又は可溶性ＴＣＲの場合には分泌のために、鎖を膜に誘導するリーダー配列と一緒にコード及び合成される。これらのリーダー配列は、分泌されると切断される。リーダー配列を含むＴＣＲ鎖は、未熟として知られ、そのリーダーが切断されたものは成熟として知られる。本発明の可溶性ＴＣＲは、好ましくは、α及びβ鎖のリーダー配列が存在しない成熟可溶性ＴＣＲである。
本発明の可溶性ＴＣＲは、上で定義した核酸分子によってコードされる。したがって、好ましい一実施形態においては、可溶性ＴＣＲα鎖は、配列番号８で示される配列を有する可変領域と一緒にコードされる。上述したように、Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖のリーダー配列は、配列番号８のアミノ酸１〜２０に対応する配列番号５０で示される。Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖の可変領域の成熟型（すなわち、リーダー配列のない可変領域）は、配列番号７２で示される配列を有する。好ましくは、本発明の可溶性ＴＣＲは、配列番号７２で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０若しくは９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、又はからなる、可変領域を含むα鎖を含む。配列番号７２の変異体の場合には、ＣＤＲ配列は、上で定義した通りである。
可溶性ＴＣＲα鎖の切断型定常領域は、好ましくは、上述したように、配列番号６０又は配列番号６１の配列を有する。したがって、本発明の可溶性ＴＣＲのα鎖は、好ましくは、配列番号７２の配列を有する可変領域、及び配列番号６０又は配列番号６１の配列を有する定常領域を有する。これらのα鎖配列は、それぞれ配列番号７３及び７４で示される。したがって、本発明の可溶性ＴＣＲは、好ましくは、配列番号７３若しくは配列番号７４で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０若しくは９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、又はからなる、α鎖を含む。配列番号７３又は７４の変異体の場合には、ＣＤＲ配列は上で定義した通りであり、配列番号７４の変異体の場合には、位置１５５（又は配列番号７４の位置１５５に対応する位置）のアミノ酸はシステインである。配列番号７４の位置１５５は、配列番号６５で示される、未熟システイン改変切断型α鎖配列の位置１７５に対応する。
別の好ましい一実施形態においては、可溶性ＴＣＲβ鎖は、配列番号１３で示される配列を有する可変領域と一緒にコードされる。やはり上述したように、Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖のリーダー配列は、配列番号１３のアミノ酸１〜１６に対応する配列番号５１で示される。Ｒａｄｉｕｍ−１β鎖の可変領域の成熟型（すなわち、リーダー配列のない可変領域）は、配列番号７５で示される配列を有する。好ましくは、本発明の可溶性ＴＣＲは、配列番号７５で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０若しくは９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、又はからなる、可変領域を含むβ鎖を含む。配列番号７５の変異体の場合には、ＣＤＲ配列は、上で定義した通りである。
可溶性ＴＣＲβ鎖の切断型定常領域は、好ましくは、上述したように、配列番号６２又は配列番号６３の配列を有する。したがって、本発明の可溶性ＴＣＲのβ鎖は、好ましくは、配列番号７５の配列を有する可変領域、及び配列番号６２又は配列番号６３の配列を有する定常領域を有する。これらのβ鎖配列は、それぞれ配列番号７６及び７７で示される。したがって、本発明の可溶性ＴＣＲは、好ましくは、配列番号７６若しくは配列番号７７で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０若しくは９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、又はからなる、α鎖を含む。配列番号７６又は７７の変異体の場合には、ＣＤＲ配列は上で定義した通りであり、配列番号７７の変異体の場合には、位置１７２（又は配列番号７７の位置１７２に対応する位置）のアミノ酸はシステインである。配列番号７７の位置１７２は、配列番号６６で示される、未熟システイン改変切断型α鎖配列の位置１８８に対応する。
別の好ましい一実施形態においては、上述したように、可溶性ＴＣＲのα及びβ鎖は各々ロイシンジッパー配列をＣ末端に含む。
別の好ましい一実施形態においては、可溶性ＴＣＲの少なくとも１本の鎖は、精製タグと一緒にコードされる。こうしたタグは、当業者に既知の任意の適切なタグ、例えば、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓタグ、又はＭｙｃタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などとすることができる。タグは、好ましくはα又はβ鎖、最も好ましくはβ鎖のＣ末端に位置する。したがって、本発明の可溶性ＴＣＲは、精製タグをそのα及び／又はβ鎖、好ましくは鎖（単数又は複数）のＣ末端に含むことができる。ＴＣＲ鎖は、主鎖配列（すなわち、可変ドメイン及び存在する定常ドメインのセグメント、並びに存在する場合、ロイシンジッパードメイン）と精製タグの間のリンカー及び／又はプロテアーゼ切断部位と一緒にコードすることができる。適切なプロテアーゼ切断部位は、当業者によく知られており、トロンビン、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）３Ｃ、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ：ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ）切断部位などが挙げられる。特定の一実施形態においては、本発明の可溶性ＴＣＲのβ鎖は、鎖にＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙリンカーを介して連結されたＨｉｓタグを含む。
ＨｉｓタグがそのＣ末端にＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙリンカーを介して連結された配列番号７４のα鎖の配列は配列番号７８で示され、ＨｉｓタグがそのＣ末端にＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙリンカーを介して連結された配列番号７７のβ鎖の配列は配列番号７９で示される。本発明の好ましい実施形態においては、可溶性ＴＣＲα鎖は、配列番号７８のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０若しくは９５％配列相同であるアミノ酸配列を含み、又はからなり、及び／又は可溶性ＴＣＲβ鎖は、配列番号７９のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０若しくは９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、又はからなる。配列番号７８の変異体の場合には、ＣＤＲ配列は上で定義した通りであり、位置１５８（又は配列番号７８の位置１５８に対応する位置）のアミノ酸はシステインであり、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグは不変である。配列番号７９の変異体の場合には、ＣＤＲ配列は上で定義した通りであり、位置１７２（又は配列番号７９の位置１７２に対応する位置）のアミノ酸はシステインであり、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグは不変である。
上で詳述したように、本発明の好ましい一実施形態においては、可溶性ＴＣＲは、２Ａリンカーによって分離されたα及びβ鎖ドメインを有するｓｃＴＣＲとしてコードされる。２Ａリンカーについては上述しており、上で詳述したように、これらの配列は、それらの最終プロリン残基と最後から２番目のグリシン残基との間で同時翻訳切断を起こす。２Ａリンカーの末端プロリンは、したがって、下流ポリペプチドのＮ末端残基を形成し、２Ａリンカーの他の残基はすべて上流ポリペプチドのＣ末端を形成する。本発明の好ましいｓｃＴＣＲにおいては、α鎖ドメインは上流ポリペプチドを形成し、β鎖ドメインは下流ポリペプチドを形成する。上で詳述したように、ＴＣＲの各鎖のＮ末端は、ポリペプチドの成熟中に切断されるリーダー配列である。本発明のｓｃＴＣＲにおいては、２Ａリンカーの末端プロリン残基は、β鎖のＮ末端残基を形成し、鎖からリーダー配列と一緒に切断される。該残基は、したがって、成熟β鎖には存在しない。しかし、２Ａリンカーの他の残基は、α鎖のＣ末端を形成し、成熟α鎖中に存在する。
したがって、本発明の特定の一実施形態においては、可溶性ＴＣＲは、Ｃ末端が２Ａペプチドの最終残基を除くすべてから形成されるα鎖を含む。特に、α鎖のＣ末端（すなわち、最終２５残基）は、配列番号１８で示される２Ａ配列のアミノ酸１〜２５とすることができる。この実施形態においては、可溶性ＴＣＲα鎖は、特に、配列番号８１で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０若しくは９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、又はからなることができる。配列番号８１で示されるアミノ酸配列は、配列番号１８の残基１〜２５のＣ末端付加を有する配列番号７３（成熟切断型Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖）のアミノ酸配列である。別の一実施形態においては、可溶性ＴＣＲは、配列番号８２で示されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０若しくは９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、又はからなる。配列番号８２で示されるアミノ酸配列は、配列番号１８の残基１〜２５のＣ末端付加を有する配列番号７４（成熟切断型システイン改変Ｒａｄｉｕｍ−１α鎖）のアミノ酸配列である。α鎖が配列番号８１又は８２の変異体である場合には、ＣＤＲ配列は上で定義した通りであり、α鎖が配列番号８２の変異体の場合には、位置１５５（又は配列番号８２の位置１５５に対応する位置）のアミノ酸はシステインである。
上述したように、可溶性ＴＣＲのα鎖とβ鎖は互いに連結されているが、さもないと複合体は溶液中で分離するので、これは必要である。上述したように、α鎖とβ鎖は、例えばジスルフィド結合を介して、共有結合的に連結することができ、又は鎖のＣ末端に位置するロイシンジッパードメインによって非共有結合的に連結することができる。
上で詳述したように，すべてのα及びβＴＣＲ鎖は、挿入／分泌のためにポリペプチド鎖を膜に誘導するＮ末端リーダー配列と一緒に発現される。本発明の可溶性ＴＣＲのα鎖は、こうした配列と一緒にコードされ、本発明の可溶性ＴＣＲにおいては、Ｎ末端リーダー配列を含むことができ、又はこうした配列を含まなくてもよい。同じことであるが、本発明の可溶性ＴＣＲのβ鎖は、こうした配列と一緒にコードされ、本発明の可溶性ＴＣＲにおいては、Ｎ末端リーダー配列を含むことができ、又はこうした配列を含まなくてもよい。こうしたα及びβ鎖並びにそれらのリーダー配列については上述した。
本発明の可溶性ＴＣＲは、当該技術分野で公知の任意の方法によって、特に上で定義した宿主産生細胞によって、生成することができる。可溶性ＴＣＲは、標準タンパク質発現技術を用いて標準条件下で発現することができる。α及びβ鎖のリーダー配列は、それらが発現される細胞（例えば、産生宿主細胞）からの搬出のための鎖をターゲットにする。α及びβ鎖は、したがって、産生宿主細胞から細胞外環境に搬出され、そこで鎖は、例えばジスルフィド結合又はロイシンジッパードメインの二量体化を介して、複合体を形成する。可溶性ＴＣＲ複合体は、次いで精製することができ、まず、細胞培養物を遠心分離し、上清を分離することができる。次いで、可溶性ＴＣＲ複合体を上清からアフィニティクロマトグラフィによって、α及び／又はβ鎖のＣ末端の精製タグを用いて、精製することができる。プロテアーゼ切断部位が精製タグに対してＮ末端に存在する場合、タグを鎖から適切なプロテアーゼを用いて切断することができる。
所望であれば、可溶性ＴＣＲを多量化して、可溶性ＴＣＲ多量体を形成することができる。こうした多量体は、本発明の一態様を形成する。例えば、多量体化は、ＴＣＲ分子とナノビーズ、例えば磁気ナノビーズの複合化によって行うことができる。こうした結合の方法は当該技術分野でよく知られている。別の一実施形態においては、可溶性ＴＣＲ複合体をビオチン化し、ストレプトアビジンと複合化させて、四量体可溶性ＴＣＲ複合体を生成することができる。可溶性ＴＣＲ複合体をビオチン化するために、ＴＣＲ鎖の１本は、そのＣ末端におけるＢｉｒＡ配列（配列番号５９）と一緒に発現されるべきである。次いで、ＢｉｒＡ配列におけるＴＣＲ複合体のビオチン化を大腸菌ＢｉｒＡ（ビオチンリガーゼ）を用いて行うことができる。ビオチン化されると、可溶性ＴＣＲ複合体をストレプトアビジンと一緒にインキュベートして、可溶性ＴＣＲ四量体を生成することができる。
本発明の特に好ましい一実施形態においては、可溶性ＴＣＲを毒素と複合化する。選択される毒素は、単独でヒト細胞に入ることができず、ヒト細胞を死滅させることができず、ヒト細胞を破壊することができないが、ヒト細胞に複合分子を介して取り込まれるとその毒性作用を発揮することができる毒素である。こうした毒素は、したがって、可溶性ＴＣＲがその中に取り込まれる、本発明の可溶性ＴＣＲが結合した細胞によってのみ取り込まれ、該細胞に対してその標的効果を発揮する。毒素は、任意の公知の適切な細胞傷害性種とすることができ、すなわち、任意の適切な細胞毒とすることができる。本明細書では「細胞毒」とは、細胞の増殖及び／又は生存能を阻害する任意の毒素を意味する。増殖は、標的細胞（すなわち、毒素が入る細胞）の分裂を含む。毒素は、したがって、細胞の生存能若しくは残存を低下させる、又は生存能若しくは残存に悪影響を有する任意の毒素とすることができ、特に標的細胞の死を誘導する任意の毒素を含み、例えば、毒素は、標的細胞のアポトーシス又はネクローシスを誘導することができる。
こうした毒素は、標的ドメインを欠くペプチド毒素とすることができる。例えば、それは、標的ドメインを天然に欠くペプチド毒素、又はその標的ドメインを除去するようにその天然型に対して改変されたペプチド毒素とすることができる。こうした毒素の例としては、サポリン及びゲロニンが挙げられ、これらは、例えばリシンと同じ科のリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ：ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）であるが、細胞の細胞膜を通過することができない。同様に、細菌細胞毒の酵素ドメイン、例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素Ａ又はクロストリジウム細胞毒、例えばクロストリジウム ソルデリのＴｃｓＬの酵素ドメインなどの病原体の細胞毒の酵素ドメイン（すなわち、触媒ドメイン）を使用することができる。
本発明の可溶性ＴＣＲは融合タンパク質としてコードすることができ、毒素はα又はβ鎖のＣ末端に位置する。あるいは、当該技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて、毒素を可溶性ＴＣＲと複合化することができる。例えば、可溶性ＴＣＲ分子をそのα又はβ鎖上でビオチン化し、ストレプトアビジン複合毒素と複合化することができる（又はその逆も同様である）。別の適切な方法も当業者に知られている。
本発明は、癌の処置に使用される改変免疫エフェクター細胞、本明細書に開示されたＴＣＲを発現する改変免疫エフェクター細胞を提供する。例えば、改変免疫エフェクター細胞は、ＭＳＩ＋結腸直腸癌と診断された患者から得られるＰＢＭＣから調製することができる。改変免疫エフェクター細胞、及び／又はヒト若しくは別の対象に使用される調製物の貯蔵、例えば凍結保存に標準手順を使用することができる。
本発明のＴＣＲを発現する改変免疫エフェクター細胞を、公知技術に従って養子細胞移入免疫療法のための方法及び組成物に利用することができる。一部の実施形態においては、細胞は、まず、それらをそれらの培地から回収し、次いで投与に適した媒体及び容器システム（「薬学的に許容される」担体）中で治療有効量で洗浄及び濃縮することによって処方される。適切な注入媒体は、任意の等張性媒体調合物、一般に生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）又はＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）とすることができるが、５％デキストロース水溶液又は乳酸リンゲル液を利用することもできる。注入媒体は、ヒト血清アルブミンを補充することができる。
組成物中の治療有効量の細胞は、少なくとも２個の細胞（例えば、少なくとも１個のＣＤ８+セントラルメモリーＴ細胞と少なくとも１個のＣＤ４+ヘルパーＴ細胞のサブセット）であり、又はより典型的には１０2細胞を超え、１０6まで、１０8若しくは１０9細胞以下であり、１０10細胞以上とすることができる。細胞数は、組成物が意図される最終用途に依存し、その中に含まれる細胞のタイプに依存する。本明細書で示される用途では、細胞は、一般に、１リットル以下、５００ｍｌ以下、更には２５０ｍｌ又は１００ｍｌ以下の体積である。したがって、所望細胞の密度は、典型的には１０6細胞／ｍｌを超え、一般に１０7細胞／ｍｌを超え、一般に１０8細胞／ｍｌ以上である。免疫細胞の臨床的に妥当な数を累積１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11又は１０12細胞以上の複数の注入剤に配分することができる。例えば、２、３、４、５、６又はそれ以上の別々の注入剤を２４若しくは４８時間、又は３、４、５、６若しくは７日ごとの間隔で患者に投与することができる。注入剤を毎週、隔週若しくは毎月の間隔で、又は６週間、２、３、４、５若しくは６か月の間隔であけることもできる。毎年注入剤を投与することも可能である。本発明の一部の態様においては、すべての注入細胞が特定の標的抗原（すなわち、配列番号１の配列を有するＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチド）にリダイレクトされるので、１０6／キログラム（１０6〜１０8／患者）の範囲のより少ない細胞を投与することができる。細胞組成物は、これらの範囲内の投与量で複数回投与することができる。所望であれば、処置は、免疫応答の誘導を増強するために、マイトジェン（例えば、ＰＨＡ）若しくはリンホカイン、サイトカイン、及び／又はケモカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１８、及びＴＮＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭΓＰＴαなど）の投与を含むこともできる。
本発明のＴＣＲ分子を発現する本発明の免疫エフェクター細胞は、単独で、又は希釈剤及び／又はＩＬ−２、別のサイトカイン若しくは細胞集団などの他の成分と組み合わせて医薬組成物として、投与することができる。手短に述べると、本発明の医薬組成物は、１種以上の薬学的又は生理的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載のＴＣＲ発現免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞、集団を含む。こうした組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのポリペプチド又はアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ、グルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含むことができる。本発明の組成物は、好ましくは静脈内投与用に処方される。
ＴＣＲをコードするベクターに使用されるインビボ選択マーカーに関して他で述べられているように、細胞が本発明の核酸分子で改変される前に、後に又は同時に、ＴＣＲを発現する免疫エフェクター細胞に誘導性カスパーゼ９、チミジンキナーゼなどの自殺遺伝子を導入することによって、有害事象を最小限にすることができる。あるいは、本発明のＴＣＲに関して述べるように、ＴＣＲは、使用タグを認識する抗体（抗Ｍｙｃ抗体など）を用いた本発明のＴ細胞の標的死滅を可能にするタグ、特にダブルＭｙｃタグを含むことができる。
本発明は、治療に使用される、特に癌の処置に使用される、本明細書に定義された可溶性ＴＣＲ、及びこうした可溶性ＴＣＲを含む組成物も提供する。
液体医薬組成物は、溶液であろうと、懸濁液であろうと、又は別の同様の形態であろうと、以下の一つ以上を含むことができる：水、食塩水（好ましくは生理食塩水）、リンゲル液、等張性塩化ナトリウムなどの無菌希釈剤、（溶媒又は懸濁媒体として働き得る）合成モノ又はジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、他の溶媒などの不揮発性油；ベンジルアルコール、メチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウム、デキストロースなどの浸透圧調節剤。非経口調製物は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は複数回投与バイアルに封入することができる。注射用医薬組成物は好ましくは無菌である。
本発明の医薬組成物は、処置（又は予防）する疾患に適切な様式で投与することができる。投与の量及び回数は、患者の状態、患者の疾患のタイプ及び重症度などの要因によって決定されるが、適切な投与量は、臨床試験によって決定することができる。
本明細書に記載のように、本発明のＴＣＲを発現する免疫エフェクター細胞を投与することによって対象において誘導される免疫応答は、標的細胞（すなわち、配列番号１のＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドを発現する腫瘍細胞）を死滅させることができる細胞傷害性Ｔ細胞又はＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞によって媒介される細胞性免疫応答を含むことができる。Ｂ細胞を活性化し、したがって抗体応答を生じることができるヘルパーＴ細胞によって主に媒介される液性免疫応答を誘導することもできる。
本明細書に記載のように、毒素を有する可溶性ＴＣＲを対象に投与すると、ＴＣＲ／毒素複合体が標的細胞によって取り込まれて、標的細胞が毒素によって直接、選択的に死滅させられる。
「有効量」を示すときには、投与される組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、悪性度及び全身状態の個体差を考慮して医師が決定することができる。特定の患者の最適な投与量及び処置計画は、対象の疾患の徴候を監視し、それに応じて処置を調整することによって、医薬の当業者が容易に決定することができる。
したがって、本発明は、ＴＧＦβＲＩＩのフレームシフト変異体を発現する癌と診断された、又は有する疑いのある、又は発症リスクのある対象の処置を提供する。前記フレームシフト変異体は、その配列内に配列番号１のネオペプチドを含む。こうした癌は、ＭＳＩ＋癌である可能性があるが、非ＭＳＩ＋かもしれない。癌は、配列番号１のネオペプチドを発現する任意の癌である可能性がある。特定の非限定的実施形態においては、癌は、結腸直腸癌、胃癌、肝癌、膨大部癌、子宮体癌、膵癌又は白血病である。癌は、特に、リンチ症候群／ＨＮＰＣＣ患者におけるものである可能性がある。特定の一実施形態においては、本発明は、ＨＮＰＣＣ対象における結腸直腸癌の処置を提供する。
本発明の免疫エフェクター細胞及び／又は可溶性ＴＣＲは、放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学的治療などの任意の他の公知の癌処置を含むことができる、１種以上の他の治療薬と組み合わせて投与することができる。本発明の免疫エフェクター細胞と可溶性ＴＣＲは、一緒に投与することができる。組成物は、抗生物質又は他の治療薬、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５及びＩＬ−１７）、増殖因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症薬、鎮痛薬、化学療法剤（例えば、モノメチルオーリスタチンＥ、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メトトレキサート、Ｔａｘｏｌ、Ｔａｘｏｔｅｒｅ、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソ尿素、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルバジン、エトポシド、テニポシド、カンプトセシン（ｃａｍｐａｔｈｅｃｉｎｓ）、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、Ｌ−アスパラギナーゼ及び５−フルオロウラシル）、放射線療法薬、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、トレメリムマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、ＭＫ−３４７５、ウレルマブ、バビツキシマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ及びＭＥＤＩ４７３６）、小分子阻害剤又は別の活性及び補助剤と組み合わせて投与することもできる。
本発明の免疫エフェクター細胞、可溶性ＴＣＲ及び組成物は、したがって、治療に使用され、又は治療、特に癌治療、より具体的にはＭＳＩ＋癌若しくは結腸直腸癌を処置するための療法に使用される医薬品の製造に使用することができる。本発明の免疫エフェクター細胞（及びそれを含む組成物）は、本明細書に記載のように、特に養子細胞移入治療（養子細胞治療としても知られる）に使用することができる。
「標的細胞」という用語は、本発明の改変免疫エフェクター細胞又は可溶性ＴＣＲによって死滅又は抑制される任意の細胞を指す。上述したように、それは、一般に、ＴＧＦβＲＩＩのフレームシフト変異体を発現する癌（又は選択的に発現される、腫瘍）細胞であり、前記フレームシフト変異体は、その配列内に配列番号１のネオペプチドを含む。標的細胞は、ある実施形態においては、ＭＳＩ＋癌細胞、又は結腸直腸若しくは胃癌細胞、又は実際には上記癌のいずれかからの癌細胞とすることができる。
癌は、悪性であろうと、前癌性であろうと、又は非悪性であろうと、任意の腫瘍状態を含むように本明細書では広範に定義される。しかし、一般に、それは悪性状態であり得る。固形腫瘍と非固形腫瘍の両方が含まれ、「癌細胞」という用語は「腫瘍細胞」と同義に解釈することができる。
本発明の一実施形態においては、本発明の細胞、可溶性ＴＣＲ及び／又は組成物を対象に静脈内投与することができる。別の一実施形態においては、細胞、可溶性ＴＣＲ及び／又は組成物を腫瘍内注入によって腫瘍に直接投与することができる。
本発明の方法及び細胞を用いて処置される対象は、任意の種の哺乳動物とすることができる。例えば、対象は、マウス、ラット、スナネズミ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ネコ、イヌなどの任意の種の家庭内ペット、又はヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマなどの家畜とすることができる。本発明の更に好ましい一実施形態においては、対象は、サル、テナガザル、ゴリラ、オランウータン、チンパンジー、ボノボなどの霊長類とすることができる。しかし、本発明の好ましい一実施形態においては、対象はヒトである。本発明に使用される免疫エフェクター細胞は、任意の種の哺乳動物から得ることができると予想されるが、好ましい一実施形態においては、免疫エフェクター細胞は、処置対象と同じ種の哺乳動物に由来する。
本発明は、下記非限定的実施例から、また、図面を参照して、より十分に理解することができる。
最初に単離されたＴ細胞クローンがＴＧＦβＲＩＩフレームシフト変異特異的ＣＤ８-／ＣＤ４-／ＣＤ５６+であり、標的細胞を用量依存的に死滅させることを示す図である。元のＴ細胞クローンがＣＤ８-ＣＤ４-及びＣＤ５６+であることを示す。 最初に単離されたＴ細胞クローンがＴＧＦβＲＩＩフレームシフト変異特異的ＣＤ８-／ＣＤ４-／ＣＤ５６+であり、標的細胞を用量依存的に死滅させることを示す図である。（配列番号１の配列を有する）１μＭ ｐ５７３ペプチド又は（配列番号５４の配列を有する）対照ペプチドＩ５４０を、示したように様々なエフェクター／標的（Ｅ：Ｔ）比で添加した結腸癌細胞株のＴ細胞クローン２６による特異的溶解を示す51Ｃｒ放出アッセイの結果を示す。 最初に単離されたＴ細胞クローンがＴＧＦβＲＩＩフレームシフト変異特異的ＣＤ８-／ＣＤ４-／ＣＤ５６+であり、標的細胞を用量依存的に死滅させることを示す図である。滴定濃度のｐ５７３ペプチドを添加した、自己ＥＢＶ−ＬＣＬ（エプスタインバーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株）のＴ細胞クローン又はＴ２細胞による特異的溶解を示す51Ｃｒ放出アッセイの結果を示す。抗ＨＬＡクラスＩによる最高ペプチド濃度でのブロッキングも示す。Ｅ：Ｔ比は２５：１であった。示した結果は、３つの独立した実験の代表である。 形質移入インビトロ増大Ｔ細胞におけるＴＧＦβＲＩＩ −１Ａフレームシフト変異（ＴＧＦβＲＩＩmut）特異的ＴＣＲ発現を示す図である。ＴＧＦβＲＩＩmut特異的ＴＣＲ発現は、Ｖβ３+（Ｖβ３＝ＴＣＲβ鎖可変ドメインＴＲＢＶ２８）であるＴ細胞に対応する。ｍｏｃｋ移入Ｔ細胞、ＴＣＲ ｍＲＮＡ移入Ｔ細胞、及び元のＴ細胞クローンをすべて試験した。 ＴＣＲ移入ＣＤ４+Ｔ細胞とＴＣＲ移入ＣＤ８+Ｔ細胞の両方がＴＧＦβＲＩＩ −１Ａフレームシフト変異を有する結腸癌細胞株に反応してＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを産生することを示す図である。Ｔ細胞にＴＣＲ ｍＲＮＡを移入し、変異ＴＧＦβＲＩＩを発現する結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ及びＳＷ４８０との共インキュベーション前に終夜放置した。ＬＳ１７４ＴはＨＬＡクラスＩ陰性であるのに対して、ＳＷ４８０はＨＬＡ−Ａ２を発現する。ＳＷ４８０細胞にＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドｐ５７３を添加し（＋）、又は添加しなかった（−）。終夜刺激後、細胞をサイトカイン産生について細胞内染色した。プロットは、示したようにＣＤ４又はＣＤ８でゲーティングしたＴ細胞を示す。示した結果は、３つの独立した実験の代表である。 ＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ移入ＣＤ８+Ｔ細胞が、ペプチドｐ５７３を添加した結腸癌細胞株に反応して、元のＴ細胞クローンよりも多量のＩＦＮ−γを産生し、より効率的に脱顆粒することを示す図である。ＴＣＲ移入ＣＤ８+Ｔ細胞及び元のＴ細胞クローンを、ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γの染色を行う前に、結腸癌細胞株と一緒に６時間インキュベートした。結腸癌細胞株はすべてＴＧＦβＲＩＩ −１Ａフレームシフト変異を有する。ＨＣＴ１１６とＳＷ４８０はどちらもＨＬＡ−Ａ２+であるのに対して、結腸癌細胞株ＬＳ１７４ＴはＨＬＡ−Ａ２-である。プロットは、ＣＤ８でゲーティングしたＴ細胞である。示した結果は、３つの独立した実験の代表である。 ＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ移入Ｔ細胞が、ＴＧＦβＲＩＩ−１Ａフレームシフト変異を有する標的細胞を、元のＴ細胞クローンと類似した効率で死滅させることを示す図である。結腸癌細胞株ＬＳ１７４及びＨＣＴ１１６に51Ｃｒを添加した。ＨＣＴ１１６細胞の半分にＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドｐ５７３を添加した。元の患者Ｔ細胞クローン、ＴＣＲ移入ＣＤ８+Ｔ細胞及びｍｏｃｋ移入ＣＤ８+Ｔ細胞を、示したＥ：Ｔ比で添加した。51Ｃｒ放出を測定する前に、細胞を６時間共インキュベートした。示した結果は、２つの独立した実験の代表である。 ＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ導入Ｔ細胞がインビトロとインビボの両方で有効であることを示す図である。ドナーＴ細胞にＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ又は負の対照としてＤＭＦ５（ＭＡＲＴ−１特異的）ＴＣＲを導入した。Ｔ細胞を抗Ｖβ３抗体（ＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ）又はＭＡＲＴ−１デキストラマー（ＤＭＦ５）で染色したときに、導入効率がＴＣＲの各々で約６０％であることが判明したことを示す。 ＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ導入Ｔ細胞がインビトロとインビボの両方で有効であることを示す図である。ドナーＴ細胞にＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ又は負の対照としてＤＭＦ５（ＭＡＲＴ−１特異的）ＴＣＲを導入した。注入前に同種抗原に対する反応性について形質導入Ｔ細胞を試験した。ＣＤ８+Ｔ細胞エピトープを覆う長鎖ＴＧＦβＲＩＩ −１Ａフレームシフト変異ペプチド（ｐ６２１、配列番号５５）、又は天然ＭＡＲＴ−１ ２６〜３５ペプチド（配列番号５６）をＨＬＡ−Ａ２+ＥＢＶ−ＬＣＬに添加した。形質導入Ｔ細胞をＥＢＶ−ＬＣＬと５時間、Ｅ：Ｔ比１：３で共インキュベートし、脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）及びＴＮＦ−αについて染色した。 ＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ導入Ｔ細胞がインビトロとインビボの両方で有効であることを示す図である。ドナーＴ細胞にＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ又は負の対照としてＤＭＦ５（ＭＡＲＴ−１特異的）ＴＣＲを導入した。８×１０6個のＴＣＲ導入Ｔ細胞の腹腔内注射（それぞれ０日目及び２日目に注射）の２日前に、ＮＳＧマウス（ＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ、ｎ＝１０；ＭＡＲＴ−１ ＴＣＲ、ｎ＝１０）にホタル−ルシフェラーゼを発現する１０6個のＨＣＴ１１６細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。５日目及び１０日目に２×１０7個のＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ+Ｔ細胞を用いて処置を繰り返した。腫瘍量を生物発光イメージングによって２、９、１６、２４及び３０日目に評価した。 ＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ導入Ｔ細胞がインビトロとインビボの両方で有効であることを示す図である。ドナーＴ細胞にＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ又は負の対照としてＤＭＦ５（ＭＡＲＴ−１特異的）ＴＣＲを導入した。すべてのマウスの生物発光シグナル（光子／秒）を散布図に平均（＋／−ＳＤ）と一緒に示した。 ＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ導入Ｔ細胞がインビトロとインビボの両方で有効であることを示す図である。ドナーＴ細胞にＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ又は負の対照としてＤＭＦ５（ＭＡＲＴ−１特異的）ＴＣＲを導入した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ分析によれば、ＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ+Ｔ細胞で処置したマウスは、対照マウスに比べて生存が有意に延長された（ｐ＝０．０３８；独立ｔ検定）。インビボ実験を３回繰り返し、１つの代表的な実験を示す。 ＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ導入Ｔ細胞がインビトロとインビボの両方で有効であることを示す図である。ドナーＴ細胞にＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ又は負の対照としてＤＭＦ５（ＭＡＲＴ−１特異的）ＴＣＲを導入した。腫瘍を安楽死マウスから切り離し、単細胞懸濁液を作製し、形質導入Ｔ細胞の存在について抗ＣＤ３及び抗Ｖβ３抗体（ＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲ）又はＭＡＲＴ−１デキストラマー（ＤＭＦ５）を用いて染色した。対照群腫瘍におけるＭＡＲＴ−１特異的Ｔ細胞の割合は、ＴＧＦβＲＩＩmut特異的ＴＣＲで処置したマウスの腫瘍におけるＴＧＦβＲＩＩmut特異的Ｔ細胞の割合よりも有意に低かった（ｐ＝０．００３８）。 ＴＣＲ移入ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ発現が、ＣＤ８に結合できないペプチド添加ＨＬＡ−Ａ２+ＨＥＫ細胞による刺激後にわずかに減少することを示す図である。ＨＥＫ２９３細胞に、ＣＤ８に結合できない、ＨＬＡ−Ａ２ｗｔ又は変異ＨＬＡ−Ａ２をコードするｍＲＮＡを移入した。ＨＥＫ２９３細胞にペプチドｐ５７３を添加し、それを用いてＴＧＦβＲＩＩmut特異的ＴＣＲが移入されたＣＤ８+Ｔ細胞を５時間刺激した。 結腸癌細胞ＨＣＴ１１６がＴＲＡＩＬ受容体４（ＣＤ２６１）を発現することを示す図である。左のパネルは、アイソタイプ対照によるＨＣＴ１１６細胞の染色を示し、右のパネルは、ＨＣＴ１１６細胞上のＣＤ２６１及びＣＣＲ６の染色を示す。 Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲでリダイレクトされたＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が、同種抗原を提示する標的細胞を直接死滅させることを示す図である。Ｒａｄｉｕｍ−１ ｍＲＮＡを電気穿孔導入した精製ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）又は精製ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）は、特異的ＴＧＦβＲＩＩフレームシフト変異とＨＬＡ−Ａ２（ＨＣＴ１１６、結腸癌細胞）（「ペプチドなし」）の両方を有する標的細胞を死滅させることができた。（配列ｐ５７３としても知られる）配列番号１を含む外来長鎖ＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドｐ６２１（配列番号５５）の添加は、細胞死滅を増加させた。精製ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｃ）又は精製ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｄ）も外来ペプチドｐ６２１を添加したＨＬＡ−Ａ２陽性細胞株（Ｇｒａｎｔａ；Ｂ細胞リンパ腫細胞株、ＴＧＦｂＲＩＩフレームシフト陰性）を死滅させることができた。全データは、少なくとも２つの独立した実験の代表である。 Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲ ｍＲＮＡを電気穿孔導入したＴ細胞がマウスにおいて複数回の注入後にインビボで腫瘍増殖を減少させることを示す図である。（Ａ）は実験スケジュールを示し、（Ｂ）は、生物発光によって測定した種々のマウス群（各群ｎ＝１０）の腫瘍量を示す。生物発光シグナルを全光束（光子／秒）として示す。すべてのマウスの平均を上のプロットで示す。エラーバーは標準偏差を示す。 Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲ発現ＣＤ８−Ｔ細胞のＥＣ50をＤＭＦ５ ＴＣＲ発現ＣＤ８−Ｔ細胞のＥＣ50と比較した図である。各々それらの同種抗原を認識する。全データは、２つの独立した実験の代表である。 可溶性Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲとの結合を特定するＳｕｐＴ１細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。可溶性ＴＣＲは、ＨＬＡ−Ａ２陰性細胞（Ａ）にも非特異的ペプチドを提示するＨＬＡ−Ａ２陽性細胞（Ｂ）にも結合しない。しかし、可溶性ＴＣＲは、ＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドｐ５７３（配列番号１）が提示されるＨＬＡ−Ａ２陽性細胞に結合することが示された。
実施例１
材料及び方法：
細胞株、培地及び試薬
ＴＧＦβＲＩＩフレームシフト変異反応性ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）クローンをＭＳＩ＋結腸癌患者の血液から単離し、限界希釈によってクローン化した。患者に２３量体ＴＧＦβＲＩＩ（−１Ａ）フレームシフトペプチド（配列番号４９を有するペプチド）を接種した。臨床試験は、ｔｈｅ Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ， ｔｈｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ， Ｒｅｇｉｏｎ Ｓｏｕｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって認可された。世界医師会ヘルシンキ宣言に従って処置を行った。インフォームドコンセントを患者から得た。自己エプスタインバーウイルス形質転換リンパ芽球様細胞株（ＥＢＶ−ＬＣＬ）をドナー由来のＢ細胞の形質転換によって生成した。抗原プロセシング欠損Ｔ２細胞株をＴ細胞標的としてフローサイトメトリー及び細胞毒性試験に使用した。結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０及びＬＳ１７４Ｔ並びにヒト胎児腎臓（ＨＥＫ：Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ）２９３細胞をＡＴＣＣ（ロックビル、ＭＤ、ＵＳＡ）から得た。Ｈｅｋ−Ｐｈｏｅｎｉｘ（Ｈｅｋ−Ｐ、発明者らのコレクション）を、１０％ＨｙＣｌｏｎｅ ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ローガン、ＵＴ、ＵＳＡ）及び１％抗生物質−抗真菌剤（ａｎｔｉｍｉｃｏｔｉｃ）（ペニシリン／ストレプトマイシン、ｐ／ｓ、ＰＡＡ）を補充したＤＭＥＭ（ＰＡＡ、Ｐａｓｃｈｕｎｇ、オーストリア）中で増殖させた。
何も示さない場合、ゲンタマイシン、１０％熱失活ＦＣＳ（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、オーストリア）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、オーストリア）中で細胞を培養した。標的細胞として使用する前に結腸癌細胞株を５００Ｕ／ｍｌ ＩＦＮ−γ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ロッキーヒル、ＮＪ、ＵＳＡ）で終夜処理した。
別段の記載がない限り、以下で完全培地と記述する、５％熱失活ヒト血清（Ｔｒｉｎａ Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｅｓ ＡＧ、Ｎａｅｎｉｋｏｎ、スイス）、１０ｍＭ Ｎ−アセチルシステイン（Ｍｕｃｏｍｙｓｔ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＡＳ、ロンドン、ＵＫ）、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ノルウェー）及び０．０５ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｇａｒａｍｙｃｉｎ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｅｕｒｏｐｅ、ベルギー）を補充したＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、フライブルク、ドイツ）中ですべてのＴ細胞を増殖させた。
ＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドに特異的なＴ細胞株及びクローンの生成
接種前後に回収したＰＢＭＣを分析に利用することができた。ＰＢＭＣを既報の通りに単離し、凍結した（Ｂｒｕｎｓｖｉｇ，ＰＦら（２００６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５５（１２）：１５５３〜１５６４）。解凍ＰＢＭＣを１回インビトロでペプチドを用いて１０〜１２日間刺激し、次いでＴ細胞増殖アッセイ（３Ｈ−チミジン）において自己ＰＢＭＣをＡＰＣとして用いて３つ組で試験した。様々な時点のＰＢＭＣをＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドで刺激した。これには、ペプチド５７３（ｐ５７３、配列番号１）、及びＴＧＦＢＲＩＩの塩基番号７０９〜７１８由来のアデノシン鎖（Ａ１０）中の１ｂｐ欠失（−１Ａ）に起因するＴＧＦβＲＩＩフレームシフトタンパク質由来のペプチド６２１（ｐ６２１、配列番号５５）が含まれる。（野生型ヒトＴＧＦＢＲＩＩのＧｅｎＢａｎｋ配列はＮＭ００３２４２である。）ｈＴＥＲＴペプチドＩ５４０（配列番号５４）をネガティブコントロールとして使用した。どちらのペプチドもＮｏｒｓｋ Ｈｙｄｒｏ、ＡＳＡ、Ｐｏｒｓｇｒｕｎｎ、ノルウェーによって提供された。
配列番号５６（天然ＭＡＲＴ−１のアミノ酸２６〜３５）を有するＭＡＲＴ−１ペプチドは、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ Ｌｔｄ、ＵＫによって製造された。次いで、刺激されたＴ細胞をペプチド添加ＡＰＣ、自己ＰＢＭＣ又はＥＢＶ−ＬＣＬに対する増殖アッセイにおいて試験した。刺激指数（ＳＩ：Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）をペプチドなしの増殖で除算されたペプチドありの増殖として定義し、ＳＩ≧２を陽性応答とみなした。応答Ｔ細胞株由来のＴ細胞クローンを既報の通りに生成した（Ｓａｅｔｅｒｄａｌ，Ｉら（２００１）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０（９）：４６９〜４７６）。
ＴＣＲ及びＨＬＡ−Ａ２クローニング
フレームシフト特異的Ｔ細胞クローン（２６及び３０）を増殖させ、全ＲＮＡを調製した。クローニングを改変５’−ＲＡＣＥ法によって行った。手短に述べると、ｃＤＮＡをオリゴｄＴプライマーを用いて合成し、５’末端に一続きのシトシンを連結した。定常ドメイン特異的プライマーと一緒にポリグアノシンプライマーを使用して、ＴＣＲ鎖を増幅した。アンプリコンをクローン化し、配列を決定した。ＴＣＲα及びβ鎖を別々に特異的プライマーを用いて増幅することによって発現構築物を調製し、第２のＰＣＲを行って、ＴＣＲ鎖をＴＣＲ−２Ａ構築物として融合した。ＴＣＲ−２ＡリーディングフレームをｐＥＮＴＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化し、続いて別の発現ベクター中に組み換えた。
ＲＮＡ合成では、挿入断片をｐＣＩｐＡ102のＧａｔｅｗａｙ改変バージョン中にサブクローニングした（Ｓａｅｂｏｅ−Ｌａｒｓｓｅｎ，Ｓら（２００２）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５９（１−２）：１９１〜２０３）。詳細な方法及びプライマー配列は、（Ｗａｅｌｃｈｌｉ，Ｓら（２０１１）、ＰｌｏＳ ｏｎｅ ６（１１）：ｅ２７９３０）に見られる。レトロウイルス導入の場合、挿入断片をｐＭ７１ベクター中にサブクローニングした。ＨＬＡ−Ａ*０２０１−ｐＣＩｐＡ102構築物を既報の通りにクローン化した（Ｓｔｒｏｎｅｎ，Ｅら（２００９）、Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６９（４）：３１９〜３２８）。（Ｘｕ，ＸＮら（２００１）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４（５）：５９１〜６０２）に記載のように、この構築物をテンプレートとして使用して、残基Ｄ２２７及びＴ２２８を標的にして、それらをそれぞれＫ及びＡで置換することによって、ＣＤ８結合欠損変異体を生成した。標準部位特異的変異誘発を以下のプライマー、すなわち、５’−ＧＡＧＧＡＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＧＡＧＡＣ−３’（配列番号５７）及び５’−ＧＴＣＴＣＣＡＣＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＣ−３’（配列番号５８）を用いて行った。これらの構築物をＦｕＧＥＮＥ−６（Ｒｏｃｈｅ、スイス）を用いて製造者の手順に従ってＨＥＫ２９３細胞に移入した。
インビトロｍＲＮＡ転写
インビトロｍＲＮＡ合成を本質的に既報の通りに行った（Ａｌｍａｓｂａｋ，Ｈら（２０１１）、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １３（５）：６２９〜６４０）。Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＲＮＡをキャップした。ｍＲＮＡをアガロースゲル電気泳動及びＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）によって評価した。
ヒトＴ細胞のインビトロ増大
健康なドナー由来のＴ細胞を本質的に既報の通りにＤｙｎａｂｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８を使用したＴ細胞のＧＭＰ製造用手順によって増大させた（Ａｌｍａｓｂａｋ，Ｈら（２０１１）、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １３（５）：６２９〜６４０）。手短に述べると、ＰＢＭＣをバフィーコートから密度勾配遠心分離によって単離し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オスロ、ノルウェーの好意によって提供されたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣｌｉｎＥｘＶｉｖｏ（商標）ＣＤ３／ＣＤ２８）を用いて３：１比で完全ＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地中で１００Ｕ／ｍＬ組換えヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）と一緒に１０日間培養した。細胞を凍結し、一定分量を解凍し、移入前に完全培地中で休ませた。
増大されたＴ細胞の電気穿孔
増大されたＴ細胞を２回洗浄し、ＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＧｍｂＨ）中に再懸濁させ、７×１０7細胞／ｍＬに再懸濁させた。ｍＲＮＡを細胞懸濁液と１００μｇ／ｍＬで混合し、４ｍｍギャップキュベット中で５００Ｖ及び時定数２ｍｓでＢＴＸ８３０ Ｓｑｕａｒｅ Ｗａｖｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（ＢＴＸ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、ホーソーン、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて電気穿孔した。移入直後、Ｔ細胞を完全培地に３７℃で５％ＣＯ2中で終夜移して、ＴＣＲ発現させた。
抗体及びフローサイトメトリー
２０分間室温で染色する前に、０．１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）からなる染色緩衝剤（ＳＢ：ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）でＴ細胞を洗浄した。次いで、細胞をＳＢで洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを含むＳＢ中で固定した。細胞内染色のために、ｐ５７３を添加した、又は添加しない、ＡＰＣを用いて、Ｔ細胞と標的の比２：１で、１／１０００希釈のＢＤ ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ及びＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐの存在下でＴ細胞を６時間又は終夜刺激した。細胞をＰｅｒＦｉｘ−ｎｃキットを用いて製造者の指示に従って（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ、ＵＳＡ）細胞外と細胞内の両方を染色した。以下の抗体を使用した：Ｖβ３−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ ＳＡＳ、フランス）、ＣＤ３−ｅＦｌｕｏｒ ４５０、ＣＤ４−ｅＦｌｕｏｒ ４５０、ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ８−ＡＰＣ、ＣＤ８−ｅＦｌｕｏｒ ４５０、ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ５．５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）及びＣＤ１０７ａ−ＰＥ−Ｃｙ５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）、ＣＸＣＲ２−ＰＥ、ＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣ、ＩＬ−２−ＡＰＣ、ＴＮＦ−α−ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）、ＣＤ２６１／ＴＲＡＩＬ−Ｒ４−ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）。ＭＡＲＴ−１（ａａ２６〜３５）特異的ＴＣＲをデキストラマー染色（Ｉｍｍｕｄｅｘ、デンマーク）によって製造者の推奨に従って検出した。特に記述した場合を除いて、すべての抗体をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡから購入した。細胞をＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメータ上で取得し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ Ｉｎｃ．、アシュランド、ＯＲ、ＵＳＡ）によって分析した。
51Ｃｒ放出アッセイ
０．５ｍｌ ＦＣＳ中でＮａ2 51ＣｒＯ4（７．５ＭＢｑ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて１５分ごとに静かに混合しながら１時間、２×１０6個の標的細胞を標識化することによって、51Ｃｒ放出細胞毒性試験を行った。細胞を冷ＲＰＭＩ−１６４０で３回洗浄し、９６ウェル、Ｕ底マイクロタイタープレートに２×１０3標的細胞で播種した。自己ＥＢＶ−ＬＣＬ、Ｔ２標的細胞又は結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０及びＬＳ１７４Ｔは１０μＭ ｐ５７３又はｐＩ５４０で１時間３７℃でパルスした。元のＴ細胞クローン、ＴＣＲ移入Ｔ細胞又はｍｏｃｋ移入Ｔ細胞を、示したエフェクター／標的（Ｅ：Ｔ）比で添加し、プレートを４時間３７℃で示したように放置した。標的細胞の最大及び自然51Ｃｒ放出をそれぞれ５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、オスロ、ノルウェー）又は培地と一緒のインキュベーション後に測定した。上清をＬｕｍａ Ｐｌａｔｅｓ（Ｐａｃｋａｒｄ、メリデン、ＣＴ）に回収し、溶解細胞から放出された51ＣｒをＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、メリデン、ＵＳＡ）を用いて測定した。特異的クロム放出の割合を式：［（実験放出−自然放出）／（最大放出自然放出）］×１００によって計算した。
レトロウイルス導入
健康なドナーから単離されたＰＢＭＣを、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）及び抗ＣＤ２８抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）をプレコートした２４ウェルプレート中で５％ヒト血清（ＨＳ：ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ）及び１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を補充したＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＧｍｂＨ、ドイツ）中で４８時間培養し、活性化した。２日間の培養後、ＰＢＭＣを回収し、レトロウイルス上清を２回導入した。ＰＢＭＣのスピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）を１体積のレトロウイルス上清と一緒に、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（２０μｇ／ｍＬ、タカラバイオ（株）、滋賀、日本）をプレコートした１２ウェル培養無処理プレート（Ｎｕｎｃ Ａ／Ｓ、ロスキレ、デンマーク）中で行った。２日後、細胞をＰＢＳ−ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）を用いて回収した。形質導入Ｔ細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて上述したように更に増大させた。
マウス異種移植研究
ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃscidＩｌ２ｒｇtm1Wjl／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスを、認可された施設動物愛護手順で所内で飼育し、無菌条件下で維持した。６〜８週齢マウスに１〜１．５×１０6個のＨＣＴ１１６腫瘍細胞をｉ．ｐ．注射した。ＨＣＴ１１６細胞をレトロウイルスベクター（Ｄｒ．Ｒａｉｎｅｒ Ｌｏｅｗ、ＥＵＦＥＴＳ ＡＧ、Ｉｄａｒ−Ｏｂｅｒｓｔｅｉｎ、ドイツによって提供された）で操作して、ホタルルシフェラーゼ及びＥＧＦＰを発現させた。腫瘍増殖を生物発光イメージングによってＸｅｎｏｇｅｎ Ｓｐｅｃｔｒｕｍシステム及びＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｖ３．２ソフトウェアを用いてした。麻酔下のマウスに１５０ｍｇ／ｋｇ体重のＤ−ルシフェリン（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ホプキントン、ＭＡ）をｉ．ｐ．注射した。動物をルシフェリン注射の１０分後に画像化した。
統計解析
連続データを中央値、平均及び範囲で記述した。マンホイットニー検定を腫瘍量の分析に使用し、生存をカプランマイヤー法によって計算し、独立ｔ検定を群間の生存の比較に使用した。示したすべてのｐ値は両側値である。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。すべての統計解析をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を用いて行った。
結果
ＴＧＦβＲＩＩフレームシフト変異特異的Ｔ細胞クローンの単離
ＴＧＦβＲＩＩフレームシフト変異反応性、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬをＭＳＩ＋結腸癌患者の血液から単離した。患者に配列番号４９の２３量体ＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドを接種した。ＣＴＬクローンはＣＤ８-ＣＤ４-であることが判明し、細胞の約５０％がＣＤ５６を発現した（図１ａ）。ＣＴＬクローンは、ＴＣＲ Ｖβ３（又はＴＲＢＶ２８、ＩＭＧＴ命名法）を発現することが示されたので、モノクローナルであることが以前に疑われた（Ｋｙｔｅ，ＪＡ（２００９）、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ １８（５）：６８７〜６９４）。分子クローニングによれば、それらは、実際には同じ対のＴＣＲ鎖を有する姉妹クローンであった。外因的に添加されるペプチドの非存在下で結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６及びＳＷ４８０の特異的溶解が認められた。しかし、内在性ペプチドを有する細胞株の溶解に必要なＥ：Ｔ比は、細胞株にＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチド（ｐ５７３、配列番号１）を外因的に添加した場合よりも高い。対照として、ＨＬＡ−Ａ２陰性であるが、ＴＧＦβＲＩＩ変異を発現する別の結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔは死滅しなかった（図１ｂ）。重要なことには、Ｔ細胞クローン上のＣＤ５６の発現にもかかわらず（図１ａ）、ＨＬＡ−Ａ２陰性ＬＳ１７４Ｔ細胞株は死滅せず、死滅がナチュラルキラー（ＮＫ：ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ）細胞様活性によって媒介されないが、ペプチドが添加されたＭＨＣ分子の特異的認識によって媒介されることを示している。
Ｔ細胞クローンの相対結合活性を試験するために、ＴＡＰ欠損Ｔ２細胞に滴定量のペプチド（０．０１〜１．０μＭ）を添加した。本発明者らは、死滅活性がペプチド濃度に従うことを認めた（図１ｃ）。ＨＬＡ特異的阻止抗体の添加は死滅を減少させ（図１ｃ）、ＴＣＲのＨＬＡクラスＩ拘束を裏付けた。自己ＥＢＶ−ＬＣＬをＡＰＣとして使用したときにも同様の観察がなされた。総合すると、データの示すところによれば、ＴＧＦβＲＩＩmut特異的Ｔ細胞は、共受容体陰性、ペプチド特異的及びＨＬＡクラスＩ拘束性であった。
ＴＧＦβＲＩＩmut−ＴＣＲは、ｍＲＮＡ電気穿孔後にＣＤ４+Ｔ細胞とＣＤ８+Ｔ細胞の両方で発現され、活性である
ＴＧＦβＲＩＩmut反応性Ｔ細胞姉妹クローン由来のＴＣＲα及びβ鎖が同定され、以下Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲと称した。本発明者らは、２本の鎖をｍＲＮＡ発現ベクターにクローン化し（「材料及び方法」参照）、それらの標的を認識するそれらの能力を評価するために、１０日間インビトロで増大させたＴ細胞を電気穿孔した。Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲ発現をＣＤ４+Ｔ細胞とＣＤ８+Ｔ細胞の両方で抗Ｖβ３（ＴＲＢＶ２８）抗体を用いた表面染色によって測定した（図２ａ）。形質移入Ｔ細胞の約７０％がＶβ３鎖を発現し、これらのＴ細胞の４２％がＣＤ８陽性であり、Ｔ細胞の３２％がＣＤ４を発現したのに対して、細胞の５％未満しかＶβ３を天然に発現しなかった。
本発明者らは、次いで、結腸癌細胞株ＳＷ４８０及びＬＳ１７４Ｔと共インキュベートした後の細胞内サイトカイン染色によって、Ｒａｄｉｕｍ−１移入Ｔ細胞の活性をモニターした。結腸癌細胞株ＳＷ４８０は、外因的に添加されたペプチドの非存在下及び存在下でＣＤ８+Ｔ細胞とＣＤ４+Ｔ細胞の両方によって認識された。Ｔ細胞は、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γを産生した（図３）。予想どおりに、結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔは認識されなかった。これらのデータによって、Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲのＨＬＡペプチド拘束、及びＣＤ４+Ｔ細胞とＣＤ８+Ｔ細胞の両方を効率的にリダイレクトするその能力が確認された。
Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲ移入ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γ産生
結腸癌細胞株に対するＴＣＲ移入ＣＤ８+Ｔ細胞の細胞傷害のポテンシャルを判定するために、ｍＲＮＡ電気穿孔Ｔ細胞を結腸癌細胞株と６時間共インキュベートし、脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γに対する抗体で染色した（図４）。極低レベルのＩＦＮ−γ産生及びＣＤ１０７ａ発現が外因的に添加されたペプチドの非存在下で検出された。ペプチドｐ５７３（配列番号１）の添加によって、Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲ移入Ｔ細胞と元のＴ細胞クローンの両方が強く活性化された。興味深いことに、ＴＣＲ移入Ｔ細胞は、元のＴ細胞クローンよりも効率的なＩＦＮ−γ産生体であり、より高レベルの脱顆粒も示したが、ｍｏｃｋ移入Ｔ細胞は活性化されなかった。ＴＣＲの共受容体非依存性を試験するために、ＨＥＫ２９３細胞に野生型（ｗｔ：ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ＨＬＡ−Ａ２又はＣＤ８に結合できない変異ＨＬＡ−Ａ２を移入し、ｐ５７３を添加し、それを使用してＴＣＲ移入ＣＤ８+Ｔ細胞を刺激した。ＣＤ１０７ａを発現するＴ細胞の数は３６％（ｗｔ ＨＬＡ−Ａ２）及び２６％（変異ＨＬＡ−Ａ２）であり、このＴＣＲが少なくとも部分的に共受容体非依存性であることを示した（図７）。
Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲ移入Ｔ細胞は、特異的腫瘍細胞溶解を媒介可能である
サイトカイン産生に加えて、養子移入リダイレクトＴ細胞に必要な主な機能は、腫瘍細胞を特異的に死滅させることである。ＴＣＲ移入Ｔ細胞が標的細胞溶解可能であるかどうか調べるために、それらを結腸癌細胞株に対して６時間クロム放出アッセイで試験した（図５）。ＴＣＲ移入Ｔ細胞は、ＨＣＴ１１６細胞を元の患者クローンに類似したレベルで溶解した。予想どおりに、溶解は、外来ｐ５７３（配列番号１）を添加したときに更に増加した。ＨＬＡ−Ａ２陰性細胞株ＬＳ１７４Ｔの溶解は、ｍｏｃｋ移入Ｔ細胞と同様であり、恐らくは標的細胞上のＴＲＡＩＬ−Ｒ発現による、ＨＣＴ１１６の低いバックグラウンド溶解を示している（図８）。この細胞株は、ＴＲＡＩＬ媒介性溶解に敏感であることが他で報告されている（Ｔａｎｇ，Ｗら（２００９）、Ｆｅｂｓ Ｊ ２７６（２）：５８１〜５９３）。
Ｒａｄｉｕｍ−１−ＴＣＲ導入Ｔ細胞は、インビトロ及びインビボで有効である
本発明者らは、ＨＣＴ１１６細胞の腹腔内注射による結腸癌の異種移植マウスモデルを確立した（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｈら（２００９）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６（３４）：１４５１４〜１４５１７）。Ｔ細胞にＴＣＲをレトロウイルスによって導入し、発現を試験した。発現は、Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲと対照として使用されたＭＡＲＴ−１特異的ＴＣＲ（ＤＭＦ５）の両方で約６０％であった（図６ａ）。長鎖ＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチド（ｐ６２１、配列番号５５）又は低親和性（ｗｔ）ＭＡＲＴ−１ペプチド（配列番号５６）を添加したＨＬＡ−Ａ２+ＥＢＶ−ＬＣＬに対して、注射前に、Ｔ細胞を機能的に試験した（図６ｂ）。Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲを発現するＴ細胞はすべて、長鎖ＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドを添加したＥＢＶ−ＬＣＬに対して応答し、一方、ＭＡＲＴ−１ ＴＣＲ発現細胞の約半分が低親和性ＭＡＲＴ−１ペプチドに対して応答した。ＮＳＧマウスに１０6個のＨＣＴ１１６細胞を０日目にｉ．ｐ．注射し、ｄ２、ｄ５及びｄ１０にマウスに８×１０6（ｄ２）及び２×１０7（ｄ５＆ｄ１０）個のＴ細胞を注射した（図６ｃ）。対照マウスをＭＡＲＴ−１特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞で処置した。
マウスのインビボライブイメージングによれば、腫瘍量は、ＭＡＲＴ１特異的対照Ｔ細胞に比べて、ＴＧＦβＲＩＩmut特異的Ｔ細胞処置を受けたマウスで有意に低下した（ｐ＝０．０３８）（図６ｄ）。ＴＧＦβＲＩＩmut特異的Ｔ細胞を受けたマウスは、対照マウスに比べて生存も高められた（ｐ＝０．０３８、図６ｅ）。高腫瘍量のために安楽死させなければならなかったマウスから腫瘍を切り離した。腫瘍の単細胞懸濁液を作製し、抗ヒトＣＤ３及び抗Ｖβ３又はＭＡＲＴ−１デキストラマーで染色した。腫瘍中のＴＣＲ発現Ｔ細胞の割合は、２つのＴ細胞集団の導入効率が極めて類似しているにもかかわらず、ＴＧＦβＲＩＩmut特異的Ｔ細胞処置を受けたマウスの方が有意に高いことが判明し（ｐ＝０．００３８、図６ｆ）、ＴＧＦβＲＩＩmut特異的Ｔ細胞がより効率的に腫瘍に補充された、又はそれらが抗原刺激によりインビボで増殖することを示している。総合すると、これらのデータは、Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲの前臨床での効力をインビボで示している。
実施例２
Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲを導入したＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞による標的細胞死滅を調べるために、ルシフェラーゼを発現するように標的細胞を安定に形質導入した。２セットの標的細胞を使用した：ＨＣＴ１１６細胞株及びＧｒａｎｔａ細胞株である。ＨＣＴ１１６細胞については上述した。Ｇｒａｎｔａ細胞株は、ヒトＢ細胞リンパ腫細胞株である。生物発光変化を利用して、Ｔ細胞による標的細胞の死滅を表す、Ｒａｄｉｕｍ−１導入Ｔ細胞と一緒の培養中の標的細胞数変化を測定した。
ルシフェラーゼ導入標的細胞をエフェクターＴ細胞とエフェクター／標的（Ｅ：Ｔ）比３０：１で共培養し、生物発光を測定した。細胞を２４時間共培養し、生物発光を１、２、３、４、５、８、１１、２０、２１、２２、２３及び２４時間目に測定した。配列番号１の配列を含む外来ペプチドｐ６２１（配列番号５５）の有無の両方でエフェクターＴ細胞をＧｒａｎｔａ細胞と共培養した。
Ｒａｄｉｕｍ−１ ｍＲＮＡを導入した精製ＣＤ４＋Ｔ細胞及び精製ＣＤ８＋Ｔ細胞はどちらもＨＣＴ１１６細胞とＧｒａｎｔａ細胞の両方を死滅させることが判明した（図９）。ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方によるＧｒａｎｔａ細胞の死滅は、ｐ６２１の存在下（「＋ＴＧＦβＲＩＩペプチド」）がその非存在下（「ペプチドなし」）よりもかなり高かった。これは、Ｒａｄｉｕｍ−１導入ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞との相互作用なしで標的細胞を死滅させ得ることを示している。
Ｒａｄｉｕｍ−１を一時的に導入したＴ細胞のインビボ死滅活性をマウスにおいて更に検討した。ルシフェラーゼを発現するように安定に形質導入された１０6個のＨＣＴ１１６細胞をＮＳＧマウスにｉ．ｐ．注射した。２日後（すなわち、２日目）、マウスに８〜１０×１０6個のＲａｄｉｕｍ−１移入Ｔ細胞をｉ．ｐ．又はｉ．ｖ．（静脈内）注射した。Ｒａｄｉｕｍ−１移入Ｔ細胞の更なる注射を５、７、１０、１３、１５及び２１日目に行い、腫瘍量を生物発光イメージングによって２、７、１７、２９、４５、５３及び６０日目に評価した（図１０Ａ参照；最終イメージングは示されていない）。
Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲ移入Ｔ細胞で処置したマウスは、ｍｏｃｋ移入Ｔ細胞処置マウスよりも腫瘍量が有意に低下した（図１０Ｂ）（*ｐ＝０．０１、ウィルコクソンマンホイットニー検定）。Ｔ細胞アロ反応性のために、ｍｏｃｋ移入Ｔ細胞は、示したように、複数回の注射後に腫瘍増殖に対して何らかの効果を示した。しかし、この効果は一時的にすぎなかった。ＴＣＲ発現はこの場合一過性であったので、静脈内（ｉ．ｖ．）注射されたＴ細胞は、腫瘍増殖に対して効果を示さなかった。
Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲの有効性を公知の高親和性ＴＣＲとインビトロで比較した。ＭＡＲＴ−１特異的ＴＣＲ ＤＭＦ５を比較のために選択した。ＤＭＦ５は黒色腫の処置に臨床的に使用されてきた（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ａ．ら（２００６）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７（９）：６５４８〜６５５９）。
ＣＤ８−Ｔ細胞にＲａｄｉｕｍ−１及びＭＡＲＴ−１を導入し、選別した。ＴＣＲ＋Ｔ細胞を、ＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドｐ５７３（配列番号１）及びＭＡＲＴ−１ ２６〜３５ペプチドアナログＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号８０）を添加したＨＬＡ−Ａ２＋Ｔ２細胞（Ｔ２は、クラスＩＩＭＨＣ分子を発現しないヒトリンパ芽球細胞株である）と一緒に５時間インキュベートした後、死滅能力のマーカーとしての脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａに対して染色し、続いてフローサイトメトリー分析した。配列番号８０のＭＡＲＴ−１ ２６〜３５ペプチドアナログは、配列番号５６の野生型ペプチドに比べて単一アミノ酸置換を有し、すなわち、配列番号５６の位置２のアラニンがロイシンで置換されている。得られるアナログペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２に対する親和性が増大し、野生型ペプチドに比べてＨＬＡ−Ａ２含有クラスＩＭＨＣ分子によるペプチドの提示が増大する点で、有利な性質を有する。
Ｒａｄｉｕｍ−１の場合のｐ５７３のＥＣ50は、ＤＭＦ５を有する配列番号５６のＭＡＲＴ−１ペプチドの場合の７ｎｍの値と比較して、２ｎＭであることが示された（図１１）。これは、Ｒａｄｉｕｍ−１がその同種抗原／ＭＨＣ複合体に対して極めて高い親和性を有し、ＣＤ８に無関係であることを示している。さらに、Ｒａｄｉｕｍ−１は、臨床的に有効であることが知られているＤＭＦ５ ＴＣＲよりもその同種抗原／ＭＨＣ複合体に対する親和性が高いことが示された。
実施例３
配列番号６９のｓｃＴＣＲによってコードされる可溶性、Ｈｉｓタグ付きＲａｄｉｕｍ−１ＴＣＲがＨＥＫ細胞中で発現された。発現ＨＥＫ細胞の上清を分離した。ＳｕｐＴ１細胞（ＨＬＡ−Ａ２陰性細胞株）をＨＬＡ−Ａ２を発現するように形質導入し、Ｒａｄｉｕｍ−１によって認識されない非特異的な無関係なペプチド、又はＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドと融合させた。形質導入細胞を可溶性Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲと一緒に３０分間室温でインキュベートし、非形質導入細胞も更なる負の対照として可溶性ＴＣＲと一緒にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、次いでアロフィコシアニン（ＡＰＣ）で染色して、可溶性ＴＣＲ結合を同定した。染色を一次マウス抗Ｈｉｓ抗体、続いて二次ＡＰＣ複合抗マウスＩｇＧ抗体を用いて行った。次いで、染色細胞をフローサイトメトリーによって分析した（図１２）。
図１２Ａ及び１２Ｂに示すように、ネガティブコントロールの染色は本質的に見られず、可溶性Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲが、ＨＬＡ−Ａ２を発現しない細胞、又はＨＬＡ−Ａ２を発現するがＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドを提示しない細胞に結合しないことを示している。図１２Ｃによれば、ＨＬＡ−Ａ２を発現し、ＴＧＦβＲＩＩフレームシフトペプチドを提示する細胞は、可溶性Ｒａｄｉｕｍ−１ＴＣＲによって認識され、それが予想される特異性を有することを示している。

Claims (76)

  1. 配列番号１の配列を含む変異ＴＧＦβＲＩＩタンパク質に対するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子をコードする核酸分子であって、前記ＴＣＲ分子は、配列番号１のペプチドがクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によって提示されると前記ペプチドに結合することができ、前記ＴＣＲ分子はα鎖ドメイン及び／又はβ鎖ドメインを含み、各鎖ドメインは３つのＣＤＲ配列を含み、
    ａ）前記α鎖ドメインのＣＤＲ１、２及び３はそれぞれ配列番号２、３及び４の配列を有し、
    ｂ）前記β鎖ドメインのＣＤＲ１、２及び３はそれぞれ配列番号５、６及び７の配列を有し、
    前記ＣＤＲ配列の１つ以上、好ましくは前記ＣＤＲ１又はＣＤＲ２配列の１つ以上は、場合によっては、１又は２個のアミノ酸の置換、付加又は欠失によって改変されてもよい、
    核酸分子。
  2. 前記クラス１ＭＨＣがＨＬＡ−Ａ２を含む、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 前記ＴＣＲ分子が、β鎖ドメインに結合したα鎖ドメインを含む単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）としてコードされる、請求項１又は請求項２に記載の核酸分子。
  4. 前記ＣＤＲのうちのすべてのアミノ酸配列が無改変である、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  5. 前記α鎖ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  6. 前記α鎖ドメインが、配列番号１９のアミノ酸配列を有するダブルＭｙｃタグを更に含む可変領域を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  7. 前記可変領域が、配列番号２０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の核酸分子。
  8. 前記β鎖ドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  9. 前記ＴＣＲが、免疫エフェクター細胞によって発現されると、前記細胞の表面に位置する、請求項５から８のいずれか一項に記載の核酸分子。
  10. 前記α鎖ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％配列相同であるアミノ酸配列を含む定常領域を含む、請求項９に記載の核酸分子。
  11. 前記定常領域がマウス化された、請求項１０に記載の核酸分子。
  12. 前記マウス化定常領域が、配列番号２３のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の核酸分子。
  13. 前記定常領域がシステイン残基の挿入又は置換によって改変された、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の核酸分子。
  14. 前記改変定常領域が、配列番号１０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の核酸分子。
  15. 前記改変マウス化定常領域が、配列番号２４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の核酸分子。
  16. 前記α鎖ドメインが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２１若しくは配列番号２２のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項９から１０又は１３から１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  17. 前記α鎖ドメインが、配列番号２５から２８のいずれか一つのアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項９から１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  18. 前記β鎖ドメインが、配列番号１４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％配列相同であるアミノ酸配列を含む定常領域を含む、請求項９から１７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  19. 前記定常領域がマウス化された、請求項１８に記載の核酸分子。
  20. 前記マウス化定常領域が、配列番号２９のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の核酸分子。
  21. 前記定常領域がシステイン残基の挿入又は置換によって改変された、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
  22. 前記改変定常領域が、配列番号１５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の核酸分子。
  23. 前記改変マウス化定常領域が、配列番号３０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の核酸分子。
  24. 前記β鎖ドメインが、配列番号１６若しくは配列番号１７のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項９から１８又は２１から２２のいずれか一項に記載の核酸分子。
  25. 前記β鎖ドメインが、配列番号３１若しくは配列番号３２のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項９から２４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  26. 前記ＴＣＲが可溶性である、請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子。
  27. 前記α鎖ドメインが、配列番号６０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％配列相同であるアミノ酸配列を含む定常領域を含む、請求項２６に記載の核酸分子。
  28. 前記定常領域がシステイン残基の挿入又は置換によって改変された、請求項２７に記載の核酸分子。
  29. 前記定常領域が、配列番号６１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の核酸分子。
  30. 前記α鎖ドメインが、配列番号６４若しくは配列番号６５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  31. 前記β鎖ドメインが、配列番号６２のアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％配列相同であるアミノ酸配列を含む定常領域を含む、請求項２６に記載の核酸分子。
  32. 前記定常領域がシステイン残基の挿入又は置換によって改変された、請求項３１に記載の核酸分子。
  33. 前記定常領域が、配列番号６３のアミノ酸配列又はそれと少なくとも６０％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の核酸分子。
  34. 前記β鎖ドメインが、配列番号６６若しくは配列番号６７のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の核酸分子。
  35. 前記ｓｃＴＣＲの前記α鎖ドメインと前記β鎖ドメインがリンカーによって連結された、請求項３に記載の核酸分子。
  36. 前記リンカーが自己スプライシングである、請求項３５に記載の核酸分子。
  37. 前記リンカーが、２Ａペプチドであり、配列番号１８のアミノ酸配列又はそれと少なくとも４０％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項３５又は３６に記載の核酸分子。
  38. 前記ｓｃＴＣＲが（ｉ）前記α鎖ドメイン、（ｉｉ）前記リンカー及び（ｉｉｉ）前記β鎖ドメインをこの順で含む、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  39. 前記ｓｃＴＣＲが、配列番号３３から３６のいずれか一つのアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載の核酸分子。
  40. 前記ｓｃＴＣＲがマウス化され、配列番号３７から４０のいずれか一つのアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載の核酸分子。
  41. 前記核酸分子が、配列番号４１から４４のいずれか一つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるヌクレオチド配列を含む、請求項３９に記載の核酸分子。
  42. 前記核酸分子が、配列番号４５から４８のいずれか一つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるヌクレオチド配列を含む、請求項４０に記載の核酸分子。
  43. 前記ｓｃＴＣＲが、配列番号６８若しくは配列番号６９のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載の核酸分子。
  44. 前記核酸分子が、配列番号７０若しくは配列番号７１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるヌクレオチド配列を含む、請求項４３に記載の核酸分子。
  45. 前記核酸がＲＮＡである、請求項１から４４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  46. 請求項１から４５のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
  47. 前記ベクターが発現ベクター又はクローニングベクターである、請求項４６に記載のベクター。
  48. 前記ベクターがｍＲＮＡ発現ベクター又はウイルスベクターである、請求項４６又は請求項４７に記載のベクター。
  49. 前記ベクターがレトロウイルス又はレンチウイルスベクターである、請求項４６から４８のいずれか一項に記載のベクター。
  50. 前記ＴＣＲが可溶性である、請求項１、２又は４のいずれか一項に記載のＴＣＲ分子。
  51. 前記ＴＣＲ分子が請求項５から８、２６から３４又は４３のいずれか一項に記載された、請求項５０に記載のＴＣＲ分子。
  52. 前記α鎖ドメインが、配列番号７２で示される配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、請求項５０に記載のＴＣＲ分子。
  53. 前記α鎖ドメインが、配列番号６０で示される配列を有する定常領域を含む、請求項５０又は５２に記載のＴＣＲ分子。
  54. 前記定常領域がシステイン残基の挿入又は置換によって改変され、好ましくは前記定常領域が配列番号６１で示される配列を含む、請求項５３に記載のＴＣＲ分子。
  55. 前記α鎖が、配列番号７３若しくは７４で示される配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項５２から５４のいずれか一項に記載のＴＣＲ分子。
  56. 前記α鎖が、配列番号７８、８１若しくは８２の配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載のＴＣＲ分子。
  57. 前記β鎖ドメインが、配列番号７５で示される配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む、請求項５０又は５２から５６のいずれか一項に記載のＴＣＲ分子。
  58. 前記β鎖ドメインが、配列番号６２で示される配列を有する定常領域を含む、請求項５０又は５２から５７のいずれか一項に記載のＴＣＲ分子。
  59. 前記定常領域がシステイン残基の挿入又は置換によって改変され、好ましくは前記定常領域が配列番号６３で示される配列を含む、請求項５８に記載のＴＣＲ分子。
  60. 前記β鎖ドメインが、配列番号７６、７７若しくは７９で示される配列又はそれと少なくとも９０％配列相同であるアミノ酸配列を含む、請求項５７から５９のいずれか一項に記載のＴＣＲ分子。
  61. 請求項１から４５のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項４６から４９のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
  62. 前記宿主細胞が免疫エフェクター細胞であり、前記核酸分子が請求項９から２５のいずれか一項に記載された、又は前記ベクターが請求項９から２５のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、請求項６１に記載の宿主細胞。
  63. 前記細胞がＴ細胞又はＮＫ細胞、好ましくはＴ細胞である、請求項６２に記載の免疫エフェクター細胞。
  64. 前記宿主細胞が、請求項２６から３４、４３又は４４のいずれか一項に記載の核酸分子を含む産生宿主細胞である、請求項６１に記載の宿主細胞。
  65. 前記産生宿主細胞がヒト細胞である、請求項６４に記載の産生宿主細胞。
  66. 請求項５０から６０のいずれか一項に記載のＴＣＲ分子、又は請求項６２若しくは６３に記載の免疫エフェクター細胞、及び少なくとも１種の生理的に許容される担体又は賦形剤を含む、組成物。
  67. 治療に使用される、請求項５０から６０のいずれか一項に記載のＴＣＲ分子、請求項６２若しくは６３に記載の免疫エフェクター細胞、又は請求項６６に記載の組成物。
  68. 癌の処置に使用される、請求項５０から６０のいずれか一項に記載のＴＣＲ分子、請求項６２若しくは６３に記載の免疫エフェクター細胞、又は請求項６６に記載の組成物。
  69. 前記組成物が請求項６２又は６３に記載の免疫エフェクター細胞を含み、前記治療が養子細胞移入治療、好ましくは養子Ｔ細胞移入治療である、請求項６７又は６８に記載の使用のための免疫エフェクター細胞又は組成物。
  70. 前記癌が結腸直腸癌、胃癌、肝癌、膨大部癌、子宮体癌、膵癌又は白血病である、請求項６８に記載の使用のためのＴＣＲ分子、免疫エフェクター細胞又は組成物。
  71. 前記結腸直腸癌が遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ）患者におけるものである、請求項７０に記載の使用のためのＴＣＲ分子、免疫エフェクター細胞又は組成物。
  72. 癌、特に結腸直腸癌を処置する方法であって、それを必要とする対象に請求項６６に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  73. ＴＧＦβＲＩＩフレームシフト変異体特異的免疫エフェクター細胞を生成する方法であって、請求項９から２５のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項４６から４９のいずれか一項に記載のベクターを免疫エフェクター細胞に導入することを含み、前記ベクターが請求項９から２５のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、方法。
  74. 前記方法が、前記核酸分子又はベクターを導入する前及び／又は後に、前記細胞を刺激すること、及びそれらの増殖を誘導することを更に含む、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記細胞がＴ細胞又はＮＫ細胞、好ましくはＴ細胞である、請求項７３又は７４に記載の方法。
  76. 癌治療に使用される、特に結腸直腸癌の処置のための、請求項５０から６０のいずれか一項に記載のＴＣＲ分子又は請求項６２若しくは６３に記載の免疫エフェクター細胞の医薬品の製造への使用。
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