KR20160101947A - 태그된 키메라 이펙터 분자 및 그의 리셉터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 숙주세포를 유전적으로 조작하기 위한 태그된 키메라 이펙터 (tagged chimeric effector) 분자 및 그의 리셉터 분자에 관한 것으로, 여기서 재조합 숙주세포는 태그를 사용하여 동정, 단리, 소팅(sorting), 증식을 위한 유도, 트래킹(tracking), 제거될 수 있다. 예시적인 리셉터 분자는 표적에 대한 결합 도메인, 힌지 영역 및 태그 카세트를 포함하는 세포외 도메인, 막관통 도메인으로서 소수성 부분 및 이펙터 도메인을 가지는 세포내 부분을 갖는 키메라 항원 리셉터(CAR)이다. 예시적인 표적은 CD19이고, 예시적인 태그는 Step-태그이다. 이러한 분자의 발현을 위해 재조합적으로 조작된 T 세포는 양자면역요법에 사용될 수 있다.

Description

태그된 키메라 이펙터 분자 및 그의 리셉터{TAGGED CHIMERIC EFFECTOR MOLECULES AND RECEPTORS THEREOF}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 2013년 12월 20일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/919,201호에 대해 미국 특허법 35 U.S.C. §119(e) 하에 우선권을 주장하며, 이 출원은 참조로 본원에 그 전체가 인용되었다.
정부지원에 대한 진술
본 발명은 미국 국립보건원이 수여한 보조금 제공/계약 번호 CA136551 하의 정부 지원으로 만들어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 갖는다.
서열목록과 관련한 진술
본원과 관련된 서열목록은 서면 대신 텍스트 포맷으로 제공되었으며, 참조로 명세서 내에 인용되었다. 서열목록을 함유하는 텍스트 파일명은 360056_426WO_ SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 32.3 KB이며, 2014년 12월 22일에 작성되었고, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되었다.
기술분야
본 발명은 태그 카세트를 함유하는 융합 단백질에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 태그된 키메라 이펙터 (tagged chimeric effector) 분자 (Key-ChEMs) 및 태그된 키메라 항원 리셉터 분자(T-ChARMs), 및 이러한 융합 단백질을 생산하는 재조합 숙주세포에 관한 것으로, 여기서 재조합 숙주세포는 (예를 들어, 입양면역요법(adoptive immunotherapy)의)치료제로서 동정, 단리, 소팅(sorting), 증식을 위한 유도, 트래킹(tracking), 제거, 및/또는 사용될 수 있다.
관련기술의 설명
T 세포를 기초로 하는 면역요법은 종양 반응성 T 세포를 종양 침윤성 림프구(TILs)의 집단(population)에서 발견했을 때 개발되기 시작하였다(Clark et al., 암 Res. 29:705, 1969). 입양 T 세포 이식(transfer)이라고 알려진 한가지 전략은 종양 반응성에 대해 사전 선택된 종양 침윤성 림프구의 단리, IL-2의 존재하에 항-CD3와 항-CD28 항체로 유도된 종양 반응성 T 세포의 클로날 증식, 및 최종적으로 증식된 세포 집단을 다시 종양이 있는 환자에게 주입하는 것을 포함한다(화학요법 및 IL-2의 반복 투여 병행)(Dudley et al., Science 298:850, 2002). 이러한 종양 침윤성 림프구를 사용한 입양 T 세포 요법 형태는 기술적으로 복잡하고 흑색종 환자의 일부에서만 완전한 차도를 유도하고 다른 암에서는 거의 효과가 없다 (Besser et al., Clin . 암 Res. 16:2646, 2010).
종양 반응성 T 세포 클론의 단리는 다른 면역치료 방법의 개발 - 특정 항원에 특이적인 재조합 T 세포 리셉터(TCR)의 생성을 이끌었으며, 이것은 종양 세포에서 발현된 MHC 분자에 의해 제공된 종양관련 펩티드에 특이성을 제공하는 벡터 전달 시스템을 사용하여 T 세포 내에 도입된다. 유사한 방법에서는 항원 결합 도메인을 함유하는 키메라 항원 리셉터(CAR)라고 지칭되는 합성 리셉터가 소개되었으며, 이것은 예를 들어, 항종양요법의 내용에서 TCR 같은 이펙터 도메인 및/또는 공동자극 시그널링 도메인을 포함하는 하나 이상의 세포내 성분에 결합된, 종양 특이적 또는 관련 항원에 결합할 수 있다. TIL과는 달리, TCR 또는 CAR T 세포 면역요법의 기본과정은 사람 T 세포를 종양 표적화 모이어티(moiety)를 코딩하는 전이유전자 (transgene)로 유전적으로 변성하고, 재조합 T 세포의 생체외 증식하여 증식된 재조합 T 세포를 환자에게 다시 주입하는 것이다. CAR T 세포를 사용한 입양요법의 경우에, 합성 CAR 구조의 조성뿐만 아니라 유전자 조작된 T 세포의 품질과 순도가 생체 내에서 종양에 대한 치료효능을 결정하게 된다. 그러나, 재조합 세포 집단을 증식하고 선택하는 것뿐만 아니라 세포가 심각한 자가면역 부작용을 회피하도록 생체 내에서 충분히 효과적이고 특이적이게 하는데 어려움이 있다.
현재, 면역요법 분야에서는 조작된 세포, 예컨대 조작된 면역세포(예를 들어, T 세포)를 동정, 효과적 단리/소팅, 선택적 증식, 생체 내 트래킹(tracking) 및 조절 또는 제거하는 조성물과 방법이 여전히 필요하다.
특정한 측면에서, 본 발명은 소수성 부분으로 연결된 세포외 성분과 세포내 성분을 포함하는 단일사슬 융합 단백질에 관한 것으로, 여기서 세포외 성분은 표적, 태그 카세트, 및 힌지를 포함하는 커넥터 영역과 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하고, 세포내 성분은 이펙터 도메인을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 (a) 세포외 결합 도메인의 아미노 말단에 위치하거나, (b) 세포외 결합 도메인 내에 내재하거나, (c) 세포외 결합 도메인과 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분 사이에 위치하여 이를 연결하는 하나 이상의 세포외 태그 카세트를 갖는 융합 단백질을 포함하는 키메라 항원 리셉터 분자에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 세포외 성분과 세포내 성분 사이에 위치하여 이를 연결하는 소수성 부분을 포함하는 단일사슬 융합 단백질에 관한 것으로, 여기서 세포외 성분은 태그 카세트와 힌지를 포함하는 커넥터 영역을 포함하고, 세포내 성분은 이펙터 도메인을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 세포를 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포, 예컨대 T 세포(예를 들어, 비천연(non-natural) T 세포)를 활성화하는 방법에 관한 것으로, 여기서 세포는 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인은 고체 표면에 부착된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 세포(예를 들어, 비천연 T 세포)를 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인과 성장인자 사이토카인과 세포가 성장하는데 충분한 시간 동안 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 증식, 예컨대 T 세포 증식을 증진하는 방법에 관한 것으로, 여기서 세포는 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인은 고체 표면에 부착된다.
특정한 다른 측면에서, 본 발명은 세포, 예컨대 T 세포(예를 들어, 비천연 T 세포)를 포함하는 샘플을 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인과 접촉시키고 샘플 내에서 융합 단백질을 발현하는 세포의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 세포, 예컨대 T 세포를 동정하는 방법에 관한 것으로, 여기서 세포는 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인은 검출가능한 모이어티를 포함한다.
특정한 다른 측면에서, 본 발명은 비천연 T 세포를 포함하는 샘플을 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인과 접촉시키고 샘플 내에서 융합 단백질을 발현하지 않는 다른 세포로부터 융합 단백질을 발현하는 비천연 T 세포를 소팅하는 것을 포함하는, T 세포를 동정하는 방법에 관한 것으로, 여기서 비천연 T 세포는 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인은 검출가능한 모이어티를 포함한다.
특정한 측면에서, 본 발명은 비천연 T 세포를 포함하는 샘플을 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인과 접촉시키고 샘플에서 융합 단백질을 발현하지 않는 다른 세포와 별개의 융합 단백질을 발현하는 비천연 T 세포를 강화 또는 단리하는 것을 포함하는 T 세포를 강화 또는 단리하는 방법에 관한 것으로, 여기서 비천연 T 세포는 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인은 검출가능한 모이어티를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 비천연 T 세포를 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인과 접촉시키는 것을 포함하는 특정 T 세포를 고갈(depleting)하는 방법에 관한 것으로, 여기서 비천연 T 세포는 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인의 결합은 융합 단백질을 발현하는 T 세포의 세포 사멸을 유도한다.
본 발명의 이러한 측면과 다른 측면은 이하의 상세한 설명과 첨부된 도면과 관련하여 명백해질 것이다. 본원에 기술된 모든 참고문헌은 각각 개별적으로 인용된 바와 같이 그 전체가 참조로 여기에 인용되었다.
도 1A - 1H는 하나 이상의 친화 태그 카세트(A-D, 본원에서는 Key-ChEM이라 함), 및 임의로 하나 이상의 특이적 결합 도메인(E-G, 본원에서는 T-ChARM이라 함)을 함유하는 다양한 단일사슬 키메릭 이펙터 분자의 예시를 나타낸 것이다. 단일사슬 ChEM과 ChARM은 세포내 도메인을 함유한다. 태그 카세트는 임의 유형의 친화성 태그(tag), 예컨대 Strep 태그® II (서열번호 1), Myc 태그 (서열번호 7), V5 태그 (서열번호 8), Flag® 태그 (서열번호 3), His 태그, 또는 다른 펩티드 또는 분자일 수 있으며, 이들은 비내인성(non-endogenous) 동족 결합 파트너(예를 들어, 리셉터, 단백질, 항체)에 의해 인식된다. 보이는 바와 같이, Key-ChEM은 (A, B) 1 태그 카세트, (C) 2 태그 카세트 (Key-ChEM2), (D) 3 태그 카세트 (Key-ChEM3), 또는 그 이상을 함유할 수 있다. 또한, 키메릭 분자는 다수의 이펙터 도메인(예를 들어, A와 C-G의 분자는 두 개를 가지는 반면, B에 나타낸 분자는 3개의 이펙터 도메인을 갖는다)을 가질 수 있으며, 태그 카세트들은 Key-ChEM 또는 T-ChARM 분자의 다양한 서로 다른 영역에 배치될 수 있다. 이러한 특정한 예에서, T-ChARM은 2개의 상이한 태그 - 결합 도메인의 C-터미널 하나와 결합 도메인의 N-터미널 하나를 갖는, 특이적 결합 도메인 (G)(예를 들어, scFv의 VH와 VL 사이의 플렉시블 링커 내에 위치) 내에 통합된, 특이적 결합 도메인 (F)의 말단부(예를 들어, 아미노 말단)에서 특이적 결합 도메인과 이펙터 도메인 (E) 사이에 위치한 하나의 태그 카세트를 갖는다. T-ChARM은 또한 Key-ChEM에 대해 나타낸 바와 같이 2, 3 또는 그 이상의 태그 카세트를 가질 수 있다. 이러한 예시에서 알 수 있는 바와 같이, 캐그 카세트는 다른 Key-ChEM 또는 T-ChARM 성분 또는 다른 태그에 링커 모듈(예를 들어, 플렉시블 (GlyxSer)n 링커 모듈)에 의해 연결될 수 있다. 링커 길이는 더 길게 또는 더 짧게 조절되어 특이적 결합 도메인과 표적 리간드 또는 항원의 최고 상호작용을 얻고 ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 세포와 표적 세포 간의 최고 상호작용을 얻을 수 있다.
도 2A - 2D는 CD19 또는 ROR1 (대조용)을 발현하기 위해 형질감염된 K562 백혈병 세포, CD19+/ROR1+ Raji 림프종 세포 및 모든 이펙터 T 세포를 활성화하기 위해 멤브레인 결합 항-CD3 mAb 단일사슬 항체 (OKT3 scFv)를 발현하는 EBV 형질전환 B 세포에 대해 다양한 종류의 항-CD19 T-ChARM 및 일반적 항-C19 CARs (태그 카세트가 없고 짧은 길이, 중간 길이, 및 긴 길이의 스페이스 도메인 포함)을 발현하는 사람 이펙터 T 세포의 세포용해 활성을 나타낸 것이다.
도 3A - 3F는 다양한 항-CD19 T-ChARM (A-C)과 일반적 항-C19 CAR (D-F)을 발현하는 T 세포를 CD19 (A 및 D) 또는 ROR1 (음성 대조군; B 및 E)을 발현하는 K562 세포, 및 PMA/이노마이신 (양성 대조군; C 및 F)과 동시배양한 24시간 후에 얻어진 상청액의 멀티플렉스 사이토카인 어세이(Luminex®) 결과를 나타낸 것이다.
도 4A와 4B는 다양한 항-CD19 T-ChARM (A) 및 CD19 CAR (B)을 발현하는 T 세포를 CD19+ Raji 세포와 동시배양한 24시간 후에 얻어진 상청액의 멀티플렉스 사이토카인 어세이(Luminex®) 결과를 나타낸 것이다.
도 5A - 5D는 T 세포 증식 어세이의 결과를 나타낸 것으로, 여기서 카복시플루오로세인(carboxyfluoroscein) 염료 희석은 T-ChARM (1, 2 또는 3 태그 카세트 함유) 또는 일반적 CAR (CD19 (Long))을 발현하는 항-CD19 CD8+ T 세포는 CD19를 발현하는 종양 세포에 반응하여 증식(청색)하는 반면, ROR1을 발현하는 종양 세포의 존재하에 증식하지 않는 것(적색)을 나타낸다.
도 6A - 6E는 T-ChARM (1, 2 또는 3 태그 카세트 함유) 또는 일반적 CAR(단길이 또는 중간길이 커넥터 영역 함유)을 발현하는 항-CD19 인간 T 세포가 NSG 마우스에서 설정된 Raji 종양을 근절할 수 있는 것을 나타낸 것이다. 이 실험에서, Raji 세포는 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 발현하도록 형질감염되었고, 종양 성장은 마우스에 루시페린을 주입하고 생체발광 이미징으로 측정되었다.
도 7은 항-CD19 CAR 및 T-ChARM 발현 인간 T 세포가 Raji 림프종이 접종된 NSG 마우스에 입양전이 후 혈액에서 지속될 수 있는 것을 나타내고 있다. 인간 T 세포는 인간 CD8 및 CD45 세포 표면 분자에 특이적인 모노클로날 항체로 스테이닝하여 식별된다.
도 8A - 8D는 T-ChARM 발현 T 세포를 태그 특이적 결합제를 사용하는 유동세포계수법에 의해 동정할 수 있는 것을 나타낸다. 이 예에서, 정제된 T-ChARM T 세포는 발현마커 tEGFR (A)에 의해, 또는 항-strep 태그 II (STII) (B)에 의해, 또는 StrepTactin APC (C, D)로 검출될 수 있다.
도 9는 T-ChARM 발현 T 세포가 유동세포계수법에 의해 저순도(본 예에서 15%)에서 고순도(본 예에서 99%)까지 형광색소와 결합된 태그 특이적 결합제를 사용하여 소팅될 수 있는 것을 나타낸다. 본 에에서, 태그는 StrepTag II이고 태그 특이적 결합제는 형광색소와 결합된 항 STII mAb이다.
도 10은 다양한 크기의 Strep-Tactin® 비즈를 사용하여 T-ChARM 발현 T 세포(3 Strep-tag 태그 카세트 함유)의 직접 강화를 나타낸 것이다. 좌측 패널은 강화된 분획의 스테이닝을 나타내는 것이고, 우측 패널은 탈리액을 나타낸다(비강화 분획).
도 11은 태그 서열에서 결합 리간드(Strep-Tactin®)에 연결된 비즈 (beads)와 동시배양된 T-ChARM (1, 2 또는 3 태그 카세트 함유) 또는 일반적 항-CD19 CAR 발현 T 세포(CD19 장길이)의 라이트 마이크로사진을 나타낸 것이다. 마이크로사진은 T-ChARM T 세포의 선택적 클러스터링과 증식을 입증한다.
도 12는 T-ChARM 발현 T 세포 (1, 2 또는 3 태그 카세트 함유)를 Strep-Tactin® 마이크로비즈와 10일 동안 배양한 성장곡선을 나타낸 것이다.
도 13A와 13B는 Streptactin 마이크로비즈(마이크로비즈), 나노비즈 또는 항-StrepTag II mAb 단독 또는 항-CD28 mAb와 조합하여 태그 카세트의 결합 후 CD25와 CD69의 상향조절로 측정된 T-ChARM 발현 T 세포의 활성화를 나타낸 것이다. 데이터는 자극 24시간 후와 48시간 후에 나타냈다.
도 14A와 14B는 T-ChARM 발현 T 세포의 선택적 증식을 나타낸 것이다. 소팅되지 않은 T-ChARM1/4-1BB 및 T-ChARM1/CD28 형질도입 T 세포(CD8+ 및 CD4+)는 항-Strep 태그/항-CD28-MB와 9일 동안 배양하였다. T-ChARM 세포의 비율을 (A) 배양 전후에 T 세포 상의 Strep 태그 발현의 유동 검출로 평가하였다. 항-CD3/항-CD28-MB 단독으로 처리된 배양 세포를 대조군으로 사용하였다. (B) FACS는 CD19+ 불멸화 B 세포주 (TM-LCL) 증식 후 EGFR+ 항-CD19 ChARM T 세포를 소팅하였다. 항-EGFR (상부 열)과 항-Streptag II (하부 열) 항체, 각각으로 스테이닝.
도 15는 다양한 양의 Strep-Tactin® 비즈로 자극한 7일 후 Ki-67 단백질의 농도로 측정된 항-CD19 T-ChARM 발현 T 세포 (1, 2 또는 3 태그 카세트)의 증식을 나타낸 것이다. 하부 패널에, T-ChARM과 CD19+ EBV-LCL (TM-LCL)의 항-CD19 결합 성분에 의한 자극 후 T-ChARM 발현 T 세포에서 Ki-67의 발현을 나타냈다.
도 16은 상이한 종류의 Streptactin, 항-Streptag II 또는 항CD3/항-CD28 컨쥬게이트 비즈에서 배양된 T-ChARM 발현 T 세포의 성장곡선을 나타낸 것이다.
도 17A와 17B는 Strep-Tactin 비즈 (A)에서 항-CD19 T-ChARM 발현 T 세포의 선택적 증식을 나타낸 것이다. 항-CD19 T-ChARM 발현 T 세포는 이어서 항-CD19 키메라 리셉터와 CD19+ LCL (B)에 의한 자극으로 증식될 수 있다.
도 18A - 18D는 항-CD3/항-CD28 비즈를 사용한 사전 활성화 없이 IL-7과 IL-15 존재하의 배양 후 두 종류의 T-ChARM (4-1BB/CD3ζ(A 및 B), 또는 CD28/CD3ζ(C 및 D)의 이펙터 도메인)으로 T 세포를 형질도입할 수 있는 것을 나타낸 것이다. 형질도입된 T-ChARM 발현 T 세포는 항-Strep 태그 II 비즈를 배양물에 첨가하여 (항-CD3/항-CD28 비드 자극이 없는 경우에도)선택적으로 증식 및 강화될 수 있지만(B와 D), 항-Strep 태그 II 비즈를 배양물에 첨가하지 않을 경우 증식되지 않는다(A와 C).
도 19A - 19D는 Strep-Tactin® 마이크로비즈를 사용한 자극으로 증식된 항-CD19 T-ChARM1 T 세포가 대조용 T 세포로서 항-CD19 CAR(단길이) (CD19-S)를 발현하는 CD19 양성 종양 세포로 재자극시(A. K562/CD19; B- Raji) 사이토카인(GM-CSF, 인터페론-γ, IL-2, 및 TNF-α)을 생산하는 필적할 만한 또는 우수한 능력을 보유하는 것을 나타내고 있다. K562 세포 (C)와 PMA-이노마이신 (D)은 각각 음성 및 양성 대조군으로 작용하였다.
도 20은 T-ChARM 발현 T 세포를 유도하여 클러스터를 형성하고 항-Strep 태그 비즈 단독 또는 항-Strep 태그 및 항-CD27 항체를 함유하는 비즈 또는 항-Strep 태그 및 항-CD28 항체를 함유하는 비즈로 증식할 수 있는 것을 나타낸 것이다.
도 21은 CD19+ 불멸화 B 세포주 (TM-LCL) 증식 후 FACS 소팅 EGFR+ 항-CD19 ChARM T 세포의 유동세포계수법 분석 (MFI)을 나타낸 것이다. 항-EGFR (상부 열)과 항-Streptag II (하부 열) 항체 각각으로 스테이닝하였다,
도 22는 CD19 (K562/CD19), 또는 ROR1 (K562/ROR1) 또는 CD19+ Raji 종양 세포 (표적)로 형질도입된 K562 세포에 대한 다양한 항-CD19 ChARM 형질도입 T 세포 (이펙터)의 세포용해 효과를 실험하는 크롬 방출 어세이 결과를 나타낸 것이다. E/T = 이펙터/표적 비율.
도 23A와 23B는 (A) CD28/CD3ζ 이펙터 도메인을 갖는 항-CD19 단길이, T-ChARM1, T-ChARM2, T-ChARM3를 발현하는 T 세포와, (B) 41BB/CD3ζ 이펙터 도메인을 갖는 항-RORl R12 단길이 및 T-ChARM1을 가진 T 세포의 세포용해 활성을 나타낸 것이다. 세포는 CD19 (K562/CD19), 또는 ROR1 (K562/ROR1) 또는 CD19+ Raji 종양 세포 (표적)로 형질도입된 K562 세포에 대한 세포용해 활성을 시험하였다. E/T = 이펙터/표적 비율.
도 24는 CD19 (K562/CD19), 또는 ROR1 (K562/ROR1) 또는 CD19+ Raji 종양 세포 (표적)로 형질도입된 K562 세포에 대한 다양한 항-CD19 T-ChARM 형질도입 T 세포(이펙터)의 IL2/IFN-γ 생산을 나타낸 것이다.
도 25A-25C는 24h 후에 CD19+ Raji 세포(1:4 비율)를 갖는 ChARM 형질도입 T 세포의 트리플리케이트 동시배양 상청액의 루미넥스(luminex) 멀티플렉스 사이토카인 분석을 나타낸 것이다. 데이터는 상이한 공여체로부터 유래한 T 세포를 사용하는 3종의 독립적 실험으로부터 얻어졌으며, 모든 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. 스튜던트 t 테스트를 수행하였다. * P<0.01. (A) 장길이(CH3-CH2-힌지), 중간길이 (CH3-힌지), 및 단길이(힌지 단독) 스페이서를 갖는 항-CD19 CAR를 발현하는 CD8+ T 세포에 의한 사이토카인 생산의 비교. 3개의 독립적 실험의 멀티플렉스 사이토카인 데이터를 정규화하였다(CD19-CAR 'long/41BB'에 의한 사이토카인 방출 = 1); (B) 4-1BB/CD3ζ 이펙터 도메인을 갖는 항-CD19 CAR-단길이와 비교했을 때, 4-1BB/CD3ζ 이펙터 도메인을 갖는 항-CD19 T-ChARM1(1ST), T-ChARM2(2ST), T-ChARM3(3ST)를 발현하는 CD8+ T 세포에 의한 사이토킨 생산의 비교. 3개의 독립적 실험의 멀티플렉스 사이토카인 데이터를 정규화하였다(CD19-CAR-단길이에 의한 사이토카인 방출: Hi/4-1BB = 1); (C) CD28/CD3ζ 이펙터 도메인을 갖는 항-CD19 CAR-단길이와 비교하여 CD28/CD3ζ 이펙터 도메인을 갖는 항-CD19 T-ChARM1(1ST), T-ChARM2(2ST), T-ChARM3(3ST)를 발현하는 CD8+ T 세포에 의한 사이토킨 생산의 비교. 3개의 독립적 실험의 멀티플렉스 사이토카인 데이터를 정규화하였다(CD19-CAR-단길이에 의한 사이토카인 방출: Hi/CD28 = 1).
도 26은 CD19+ Raji 종양 세포로 자극한 5일 후 항-CD19 4-1BB 또는 CD28 ChARM 발현 T 세포의 증식(순회색) 또는 외인성 사이토카인을 첨가하지 않은 배지 만(회색선)을 측정하는데 사용된 CFSE 염료 희석을 나타낸 것이다.
도 27A-27D는 FACS 소팅된 EGFR+ 항-CD19 ChARM (A) CD8+ T 세포 (CD19-Hi/4-1BB, ST-CD19/4-1BB, CD19(VH-ST-VL)/4-1BB; CD19-1ST/4-1BB, CD19-2ST/4-1BB, CD19-3ST/4-IBB CAR); (B) CD4+T 세포(CD19-Hi/4-1BB, ST-CD19/4-1BB, CD19(VH-ST-VL)/4-1BB; CD19-1ST/4-1BB, CD19-2ST/4-1BB, CD19-3 ST/4-1BB CAR); (C) 항-CD19 ChARM CD8+ T 세포 (CD19-Hi/CD28, CD19-1ST/CD28, CD19-2ST/CD28, CD19-3ST/CD28 CAR); 및 (D) 항-ROR1 R12 ChARM T 세포 (R12-Hi/4-1BB, R12-1ST/4-1BB)를 나타낸 것으로, 이들은 IL2를 갖는 배지 중의 StrepTactin 코팅된 마이크로비즈 (StrepTactin-MB), 항-Streptag 항체 또는 항-Streptag/항-CD28 항체 코팅된 마이크로비즈 (αStrep 태그-MB 및 αStrep 태그/CD28-MB)로 자극되었다. 48시간의 자극 후에 세포를 수확하고 T 세포 활성화 마커 CD25를 유동세포계수법으로 평가하였다. 처리되지 않은 세포(배지)를 대조군으로 사용하였다.
도 28은 IL-2의 존재하에 StrepTactin-MB, αStrep 태그-MB 및 αStrep 태그/CD28-MB로 자극된 FACS 소팅 EGFR+ 항-CD19 4-1BB ChARM T 세포 (CD8+)의 대표적인 현미경 이미지를 나타낸 것이다. 미처리 세포(배지)를 대조군으로 사용하였다. 현미경 이미지는 48h의 자극 후에 촬영되었다.
도 29A와 29B는 ChARM T 세포의 성장곡선을 나타낸 것이다. FACS 소팅 EGFR+ 항-CD19 ChARM (A) CD8+ 및 (B) CD4+ T 세포를 StrepTactin-MB, αStrep 태그-MB 및 αStrep 태그/CD28-MB를 갖는 CTL 배지에서 IL2의 존재하에 배양하였다.
도 30A-30F는 항-CD19-1ST/4-1BB 또는 CD19-1ST/CD28 CAR로 형질도입된 항-CD3/항-CD28 마이크로비드 자극 CD8+ T 세포를 나타낸 것으로, EGFR 스테이닝 및 소팅 후에, 순수한 CAR T 세포를 TM-LCL 또는 αStrep 태그-MB 또는 αStrep 태그/CD28-MB와 8일 동안 증식하였다. 시험관내 작용성 시험을 수행하여 증식 전(αCD3/CD28-MB) 또는 증식 후(TM-LCL 또는 αStrep 태그-MB 또는 αStreptag/CD28-MB) CAR T 세포를 평가하였다. (A) 크롬 방출 어세이를 수행하여 표적 세포 (K562/CD19) 또는 대조용 세포 (K562/ROR1)에 대한 ChARM T 세포의 세포용해 효과를 시험하였다. E/T: 이펙터/표적 비율; (B) 사이토카인 생산을 ELISA로 측정하여 5 x 104 항-CD19 ChARM T 세포와 표적 세포 (K562/CD19), 또는 대조용 세포 (K562/ROR1)의 동시배양으로부터 24시간 후에 얻어진 상청액 중의 IFN-γ와 IL2를 평가하였다. PMA/이노마이신 자극 T 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. (n=3; * P<0.05); (C) 외인성 사이토카인의 첨가 없이 표적 세포 (K562/CD19) (순회색), 또는 대조용 세포 (K562/ROR1) (회색선)로 자극한 5일 후 ChARM T 세포의 CFSE 증식 어세이. 분석을 위해, 트리플리케이트 웰을 합하여 살아있는 (PI-), EGFR-양성 CAR T 세포의 증식을 분석하였다; (D) 증식 전(αCD3/CD28-MB) 또는 증식 후(TM-LCL 또는 αStrep 태그-MB 또는 αStrep 태그/CD28-MB) ChARM T 세포에서 CD45RO, CD62L, CD28 및 CD27 발현의 유동 검출; (E) 마우스 집단을 제1일에 꼬리 정맥주사로 Raji-ffluc를 접종한 다음, CD19+ B LCL 또는 αStrep 태그/CD28-MB에서 증식된 5 x 106 CD8+ ChARM T 세포 (CD19-Hi/4-1BB 및 CD19-1 ST/4-1BB)를 종양 생착 7일 후에 투여하였다. 종양 진행과 분포를 루시페린 기질을 주사한 후 시리얼 생체발광 이미지에 의해 평가하였다; (F) NSG/Raji 마우스에 입양전이 후 항-CD19 ChARM T 세포의 지속성(persistence). T 세포 인퓨전 후에 상이한 시점에서 다양한 ChARM 형질도입 T 세포로 처리된 마우스 집단의 말초혈액(눈 출혈) 중 ChARM T 세포의 유동 세포계수 분석. CD8+ tEGFR+ 및 ChARM+ T 세포의 빈도는 살아있는 말초혈액 세포의 백분율로 사용하였다.
도 31은 외인성 사이토카인의 첨가 없이 CD19(K562/CD19), ROR1(K562/ROR1), 배지 단독, 또는 CD19+ Raji 종양 세포로 자극한 5일 후 4-1BB T 세포를 갖는 항-CD19 CAR-단길이, T-ChARM1, T-ChARM3, 및 Myc-ChARM의 증식을 측정하기 위해 사용된 CFSE 염료 희석을 나타낸 것이다.
도 32는 표적 세포 (K562/CD19) 또는 대조용 세포 (K562/ROR1)에 대한 4-1BB T 세포를 갖는 항-CD19 CAR-단길이, T-ChARM1, T-ChARM3, 및 Myc-ChARM의 세포용해 효과를 시험하기 위해 수행된 크롬 방출 어세이를 나타낸 것이다. E/T: 이펙터/표적 비율
본 발명은 다양한 생물학적 경로에 접근하고 조작(즉, 작동 또는 중지 또는 조절)하는 "열쇠"처럼 작용하는 키메릭 이펙터 분자(ChEMs)인 하나 이상의 친화성 태그 카세트를 함유하는 다양한 융합 단백질을 생성하는 조성물 및 방법을 제공한다. 이러한 키메릭 이펙터 분자는 본원에서 Key-ChEM이라 지칭한다. 이러한 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 특정한 세포 반응, 예컨대 증식 또는 사멸이 유도 또는 조절, 또는 유도 및 조절되는 변성된 숙주세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정한 종류의 전구세포를 대상에서 얻고, 변성하여 태그 카세트를 포함하는 융합 단백질을 발현하고, 증식을 유도한 다음, 특정한 치료 효과(예를 들어, 대상의 감퇴된 면역 시스템을 재구성)를 위해 대상에 다시 인퓨전할 수 있다. 경우에 따라, 태그를 함유하는 이러한 융합 단백질은 특정 표적(예를 들어, 종양 항원)에 특이적인 결합 도메인을 추가로 가질 수 있다. 이 같은 예에서, 융합 단백질은 특정한 세포에 도입되어 변성 세포를 동정, 소팅, 활성화 또는 증식하는데 사용될 수 있는 태그된 키메릭 항원 리셉터 분자(T-ChARMs)이다. 특정 구체예에서, 이러한 태그된 키메릭 분자는 세포, 예컨대 면역 세포 (예를 들어, T 세포) 내로 형질도입되어 발현된다.
특정 측면에서, 본 발명은 또한 하나 이상의 태그 카세트 (Key-ChEMs 또는 T-ChARMs)를 갖는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 세포(예를 들어, T 세포)를 선택적으로 활성화하거나, 증식을 증진하거나, 동정하거나, 소팅하거나, 강화하거나, 단리하거나, 트래킹하거나 감퇴(depleting)하는 방법을 제공한다. 추가적으로, 본 발명은 Key-ChEM 또는 T-ChARM뿐만 아니라, 다양한 치료적 적용, 예를 들어 대상의 질환 치료(예를 들어, 암, 감염 질환, 염증 질환, 면역 질환, 노화관련질환)에서 본 발명의 Key-ChEM 또는 T-ChARM를 사용하는 세포, 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명을 보다 상세히 기재하기에 앞서, 본원에서 사용될 특정 용어의 정의를 제공하는 것이 본원의 이해에 유용할 수 있다. 추가 정의는 본 명세서 전체에 걸쳐 기재되어 있다
본 명세서에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 달리 표시되지 않는 한 기재된 범위 내의 임의의 정수값과, 적절하다면 그의 분수(예컨대, 정수의 10분의 1과 100분의 1)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 물리적 특성, 예컨대 폴리머 서브유닛, 크기 또는 두께와 관련하여 본원에 기재된 수치 범위는, 달리 표시되지 않는 한, 기재된 범위 내의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 "약"이란 용어는, 달리 표시되지 않는 한, 표시된 범위, 값 또는 구조의 ±20%를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "하나" ("a", "an")란 용어는 열거된 성분의 "하나 또는 그 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 그의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함한다", "갖는다" 및 "구성하다"는 동의적으로 사용되고, 이의 용어 및 변형태는 비제한적인 것으로 해석되는 것을 의도한다.
또한, 개별 화합물, 또는 화합물의 군은 본원에 기술된 구조물과 치환체의 다양한 조합으로부터 유도되며 본원에 의해 각각의 화합물 또는 화합물의 군이 개별적으로 열거된 것과 동일한 범위로 기술된 것을 이해하여야 한다. 따라서, 특정 구조물 또는 특정 치환체의 선택은 본 발명의 범위 내에 있다.
용어 "기본적으로 이루어지는"이란 특정된 재료 또는 단계, 또는 청구된 발명의 기본 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들에 청구범위를 제한한다. 예를 들어, 단백질 도메인, 영역, 모듈 또는 카세트(예를 들어, 결합 도메인, 힌지 영역, 링커 모듈, 태그 카세트) 또는 (하나 이상의 도메인들, 영역들, 모듈들 또는 카세트들을 가질 수 있는)단백질은 도메인, 영역, 모듈, 카세트 또는 단백질의 아미노산 서열이 조합해서 도메인, 영역, 모듈, 카세트 또는 단백질 길이의 최대 최대 20% (예를 들어, 최대 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%), 2% 또는 1%)에 기여하고 도메인(들), 영역(들), 모듈(들), 카세트(들) 또는 단백질의 활성 (예를 들어, 결합 단백질 또는 태그 카세트의 표적 결합 친화성)에 실질적으로 영향을 미치지 않는(즉, 50%를 초과하여 활성을 감소하지 않는, 예컨대 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하) 연장, 결실, 돌연변이, 또는 그의 조합 (예를 들어, 아미노- 또는 카복시-말단 또는 도메인 사이의 아미노산)을 포함할 경우 특정한 아미노산 서열로 "기본적으로 이루어진다".
본원에서 사용된 "결합 도메인"("결합영역" 또는 "결합 모이어티"라고도 칭함)은 표적 분자(예를 들어, CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린(mesothelin), PD-L1, PD-L2, PSMA)와 특이적이고 비공유적으로 연합하거나 통합하거나 조합하는 능력을 갖는 분자, 예컨대 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 결합 도메인은 관심 있는 생물학적 분자 또는 다른 표적에 대한 자연발생, 합성, 반합성 또는 재조합 생산된 결합 파트너를 포함한다. 일부 구체예에서, 결합 도메인은 항원-결합 도메인, 예컨대 항체 또는 T 세포 리셉터 (TCR) 또는 그의 작용성 결합 도메인 또는 항원-결합 단편이다. 예시적인 결합 도메인은 단일사슬 항체 가변영역 (예를 들어, 도메인 항체, sFv, scFv, Fab), 리셉터 엑토도메인(ecto도메인)(예를 들어, TNF-α), 리간드 (예를 들어, 사이토카인, 케모카인), T 세포 리셉터의 항원-결합영역(TCRs), 예컨대 단일사슬 TCR (scTCR), 또는 생물학적 분자와 결합하는 특이적 능력으로 선택된 합성 폴리펩티드를 포함한다.
본 원에서 사용된 "특이적으로 결합하는"이란 결합 도메인의 연합(association) 또는 통합(union), 또는 그의 융합 단백질, 친화도 또는 Ka (즉, 1/M을 단위로 하는 특정 결합 상호작용의 연합상수)가 105 M-1, 보다 크거나 같지만 샘플 내 다른 분자 또는 성분과 의미있게 연합하거나 통합하지 않는 표적 분자를 지칭한다. 결합 도메인 (또는 그의 융합 단백질)은 "고친화도" 결합 도메인 (또는 그의 융합 단백질) 또는 "저친화도" 결합 도메인 (또는 그의 융합 단백질)으로 분류할 수 있다. "고친화도" 결합 도메인이란 적어도 107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 1012 M-1, 또는 적어도 1013 M-1의 Ka를 갖는 결합 도메인을 지칭한다. "저친화도" 결합 도메인이란 최대 107 M-1, 최대 106 M-1, 최대 105 M-1의 Ka를 갖는 결합 도메인을 지칭한다. 경우에 따라, 친화도는 M을 단위로 하는 특정 결합 상호작용의 평형해리상수(Kd)로 정의될 수 있다(예를 들어, 10-5 M 내지 10-13 M). 특정 구체예에서, 결합 도메인은 "강화된 친화도"를 가질 수 있으며, 이것은 야생형(또는 친본형(parent)) 결합 도메인보다 표적 항원에 더 강한 결합을 갖는 선택 또는 조작된 결합 도메인을 지칭한다. 예를 들어, 강화된 친화도는 야생형 결합 도메인보다 더 높은 표적 항원에 대한 Ka (평형연합상수), 또는 야생형 결합 도메인보다 더 낮은 표적 항원에 대한 Kd (해리상수), 또는 야생형 결합 도메인의 오프율(off-rate)(Koff)보다 낮은 표적 항원에 대한 오프율 때문일 수 있다. 결합 도메인 또는 융합 단백질 친화도를 결정하는 것 뿐만 아니라 특이적으로 특정 표적을 결합하는 본 발명의 결합 도메인을 동정하는 다양한 어세이들, 예컨대 웨스턴 블롯, ELISA, 및 Biacore® 분석이 알려져 있다(예를 들어, Scatchard et al., Ann. N. Y. Acad . Sci . 51:660, 1949; 및 미국 특허 제5,283,173호, 제5,468,614호, 등 참조).
본원에서 사용된 "이종" 또는 "비내인성(non-endogenous)" 또는 "외인성"이란 숙주세포 또는 대상에 고유하지 않은 유전자, 단백질, 화합물, 분자 또는 활성을 지칭하거나, 숙주 또는 숙주세포에 고유하지만 구조, 활성 또는 둘다 원래 분자와 돌연변이된 분자 간에 서로 다를 정도로 변경되거나 돌연변이된 유전자, 단백질, 화합물, 분자 또는 활성이다. 특정 구체예에서, 이종, 비내인성 또는 외인성 분자(예를 들어, 리셉터, 리간드)는 숙주세포 또는 대상에 대해 내인성이 아닐 수 있으나, 이러한 분자들을 코딩하는 핵산 대신 컨쥬게이션, 형질전환, 형질감염, 전기천공 등에 의해 숙주세포에 첨가될 수 있고, 여기서 첨가된 핵산 분자는 숙주세포 게놈 내에 통합되거나 염색체외 유전물질(예를 들어, 플라스미드 또는 다른 자기복제 벡터)로서 존재할 수 있다. 용어 "상동성" 또는 "동족체"는 숙주세포, 종 또는 균주에서 발견되거나 유도된 분자 또는 활성을 지칭한다. 예를 들어, 이종 또는 외인성 분자 또는 이 분자를 코딩하는 유전자는 고유 숙주 또는 숙주세포 분자 또는 이 분자를 코딩하는 유전자 각각에 상동성일 수 있으나, 변성된 구조, 서열, 발현수준 또는 그의 조합을 가질 수 있다. 비내인성 분자는 동일한 종, 상이한 종 또는 그의 조합에서 유래할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "내인성" 또는 "고유한"이란 숙주 또는 숙주세포에 정상적으로 존재하는 유전자, 단백질, 화합물, 분자 또는 활성을 지칭한다.
본원에서 사용된 "태그 카세트"란 관심 있는 단백질의 일부이거나, 여기에 부착되거나 융합된 독특한 펩티드 서열을 지칭하며, 여기서 이종 또는 비내인성 동원(cognate) 결합분자(예를 들어, 리셉터, 리간드, 항체, 또는 다른 결합 파트너)는 결합 특성을 사용하여 태그된 단백질 또는 태그된 단백질을 발현하는 세포를 검출, 동정, 단리 또는 정제, 트래팅, 강화 또는 표적화할 수 있고, 특히 태그된 단백질이 단백질 또는 다른 물질의 이종 집단의 일부일 때, 또는 태그된 단백질을 발현하는 세포가 세포의 이종 집단의 일부일 때(예를 들어, 말초혈액 같은 생물학적 샘플) 특별하게 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, 태그된 단백질을 발현하는 세포는 이종 또는 비내인성 동원 결합 분자와 접촉하여 생물학적 반응, 예컨대 세포 활성화 증진, 세포 증식 또는 세포 사멸을 유도할 수 있다. 제공된 융합 단백질에서, 태그 카세트(들)를 동원 결합 분자(들)로 특이적으로 결합하는 능력은 결합 도메인(들)을 표적 분자(들)에 특이적으로 결합하는 능력과 별개이거나 부가된다. 태그 카세트는 일반적으로 항원 결합 분자가 아니며, 예를 들어 항체 또는 TCR 또는 그의 항원 결합 부분이 아니다.
본원에서 사용된 "힌지 영역" 또는 "힌지"란 (a) (예를 들어, 상위 및 코어 영역으로 구성된)면역글로불린 힌지 서열 또는 그의 작용성 단편 또는 변이체, (b) 타입 II C-렉틴 도메인간(스토크(stalk)) 영역 또는 그의 작용성 단편 또는 변이체, 또는 (c) 분자 스토크 영역 분화 클러스터(CD) 또는 그의 작용성 변이체를 지칭한다. 본원에서 사용된 "야생형 면역글로불린 힌지 영역"이란 항체의 중쇄에서 발견되는 CH1 및 CH3 도메인 (IgE 및 IgM의 경우) 사이에 위치하여 연결하거나 CH1과 CH2 도메인 (IgG, IgA, 및 IgD의 경우) 사이에 위치하여 연결하는 자연적으로 발생한 상위 및 중간 힌지 아미노산 서열을 지칭한다. 특정 구체예에서, 힌지 영역은 인간이고, 특정 구체예에서는 인간 IgG 힌지 영역을 포함한다.
본원에서 사용된 "커넥터 영역"은 융합 단백질에서 2 이상의 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 펩티드, 도메인, 영역, 모듈, 카세트, 모티프 또는 이들의 조합을 연결하는 하나 이상의 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 펩티드, 도메인, 영역, 모듈, 카세트, 모티프 또는 이들의 조합을 지칭한다. 예를 들어, 커넥터 영역은 2개의 단일사슬 융합 단백질의 상호작용 또는 하나 이상의 결합 도메인의 위치결정을 용이하게 하는 스페이서 작용을 제공하여 생성된 폴리펩티드 구조가 표적 분자에 대한 특이적 결합 친화도를 유지하거나 시그널링 활성(예를 들어, 이펙터 도메인 활성)을 유지하거나 둘 다 가능하다. 특정 구체예에서, 커넥터 영역은 약 2 내지 최대 약 500 아미노산을 갖는 아미노산 서열인 "링커 모듈"을 포함하고, 이것은 링커로 연결된 2개 영역, 도메인, 모티프, 카세트 또는 모듈 사이의 구조적 이동의 융통성과 공간을 제공할 수 있다. 예시적인 링커 모듈은 GlyxSery의 1 내지 약 10 반복물(여기서 x와 y는 독립적으로 0 내지 10의 정수이나, 단 x와 y는 둘 다 0은 아니다)을 갖는 것을 포함한다(예를 들어, (Gly4Ser)2 (서열번호 67), (Gly3Ser)2 (서열번호 68), Gly2Ser, 또는 이들의 조합, 예컨대 (Gly3Ser)2Gly2Ser)(서열번호 69). 특정한 다른 구체예에서, 커넥터 영역은 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 불변영역, 예컨대 CH3 단독 또는 CH2CH3를 포함하는 링커 모듈을 가질 수 있다. 다른 구체예에서, 커넥터 영역은 힌지 영역 또는 태그 카세트를 포함할 수 있다. 이러한 커넥터 성분 각각은 상호 배타적이지 않다. 예를 들어, 커넥터 영역은 힌지 및 하나 이상의 링커 모듈을 포함하거나, 커넥터 영역은 힌지, 하나 이상의 링커 모듈, 및 하나 이상의 태그 카세트를 포함할 수 있다. 예시적인 커넥터 영역은 길이로, 예를 들어 약 5 내지 약 500 아미노산, 또는 약 10 내지 약 350 아미노산, 또는 약 15 내지 약 100 아미노산, 또는 약 20 내지 약 75 아미노산, 또는 약 25 내지 약 35 아미노산까지 변화할 수 있다.
본원에서 사용된 "소수성 부분"은 세포막에서 열역학적으로 안정하고 일반적으로 길이가 약 15 아미노산 내지 약 30 아미노산 범위인 3차원 구조의 아미노산 서열을 의미한다. 소수성 도메인의 구조는 알파 나선(helix), 베타 통형(barrel), 베타 시트, 베타 나선, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 "이펙터 도메인"은 적절한 시그널을 수용할 때 세포 내의 생물학적 또는 생리학적 반응을 직접 또는 간접적으로 증진할 수 있는 리셉터 또는 융합 단백질의 세포내 부분이다. 특정 구체예에서, 이펙터 도메인은 결합할 때 시그널을 수용하는 단백질 또는 단백질 복합체의 일부이거나, 표적 분자에 직접 결합하며, 이것은 이펙터 도메인으로부터 시그널을 촉발한다. 이펙터 도메인이 하나 이상의 시그널링 도메인 또는 모티프, 예컨대 면역리셉터 티로신 포함 활성화 모티프 (ITAM)를 함유하는 경우 이펙터 도메인은 세포반응을 직접 증진한다. 다른 구체예에서, 이펙터 도메인은 직접적으로 세포반응을 증진하는 하나 이상의 다른 단백질과 연합하여 세포반응을 간접적으로 증진할 것이다.
"가변영역 링커"는 구체적으로 중쇄 면역글로불린 가변영역을 경쇄 면역글로불린 가변영역에 연결하거나, T 세포 리셉터 Vα /β 및 Cα /β 사슬 (예를 들어, Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ)을 연결하거나 Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ 쌍 각각을 힌지 또는 소수성 도메인에 연결하는 5 내지 약 35 아미노산 서열을 지칭하며, 이것은 생성된 단일사슬 폴리펩티드가 항체 또는 T 세포 리셉터와 같은 표적 분자에 대해 특이적 결합 친화도를 보유하도록 2개 서브-결합 도메인의 상호작용에 충분한 스페이서 작용과 유연성을 제공한다. 특정 구체예에서, 가변영역 링커는 약 10 내지 약 30 아미노산 또는 약 15 내지 약 25 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서, 가변영역 링커 펩티드는 GlyxSery의 1 내지 10 반복물(여기서 x와 y는 독립적으로 0 내지 10의 정수이나, 단 x와 y는 둘 다 0은 아니다)을 포함하고(예를 들어, Gly4Ser (서열번호 10), Gly3Ser (서열번호 71), Gly2Ser, 또는 (Gly3Ser)n(Gly4Ser)1 (서열번호 72), (Gly3Ser)n(Gly2Ser)n, (서열번호 73) (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n (서열번호 72), 또는 (Gly4Ser)n (서열번호 10), 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 정수이다), 연결된 가변영역은 작용성 면역글로불린 유사 결합 도메인을 형성한다(예를 들어, scFv, scTCR). 예시적인 가변영역 링커는 서열번호 44, 65-69, 및 71-73에 기재된 아미노산 서열, 및 서열번호 57에 기재된 아미노산 서열을 갖는 T-ChARM에서 확인되는 (Gly4Ser)n (서열번호 10)을 포함한다.
"접합(junction) 아미노산" 또는 "접합 아미노산 잔기"는 폴리펩티드의 2개의 인접한 모티프, 영역 또는 도메인 사이, 예컨대 결합 도메인과 인접 링커 영역 사이 또는 소수성 도메인과 2개의 모티프, 영역 또는 도메인을 연결하는 링커 영역의 하나의 말단 또는 양 말단의 인접 이펙터 도메인 사이(예를 들어, 링커와 인접 결합 도메인 사이 및/또는 링커와 인접 힌지 사이)의 하나 이상(예를 들어, 약 2-20)의 아미노산 잔기를 지칭한다. 접합 아미노산은 융합 단백질 (예를 들어, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 구성 동안 제한효소 부위를 사용하여 얻어지는 아미노산 잔기)의 구조 디자인으로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 단일 접합 아미노산, 아스파라긴은 분비 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열(서열번호 63)과 서열번호 58에 기재된 핵산 서열로 코딩되는 T-ChARM 내의 태그 카세트(서열번호 38)를 코딩하는 서열 사이에서 발견되는 ATT 코돈에 의해 코딩된다. 마찬가지로, 아스파라긴 (N) 접합 아미노산은 GGSGSG의 가요성 링커 아미노산 서열(서열번호 65)과 서열번호 54에 기재된 아미노산 서열을 갖는 T-ChARM에서 발견된 아미노산 태그 서열 WSHPQFEK (서열번호 1) 사이에서 발견된다.
본원에서 달리 표현하여 정의되지 않는 한, 항체 기술 분야의 사람들이 알고 있는 용어는 당 분야에서 알려진 의미가 제공된다. 용어 "항체"란 디설파이드 결합으로 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 경쇄(L)을 포함하는 온전한 항체, 및 표적 분자와 결합하는 능력을 갖거나 유지하는 온전한 항체의 항원 결합 부위를 지칭한다. 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위는 비인간, 키메라, 인간화되거나, 인간, 바람직하게 인간화 또는 인간일 수 있다. 면역글로불린 구조 및 작용은, 예를 들어 Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988)에서 참조할 수 있다.
예를 들어, 용어 "VL" 및 "VH"는 항체 경쇄 및 중쇄 각각에서 유래한 가변 결합영역을 지칭한다. 가변 결합영역은 "상보성 결정 영역"(CDR) 및 "프레임워크 영역"(FR)으로 알려진 별개의, 잘 규정된 서브영역으로 구성된다. 용어 "CL"은 "면역글로불린 경쇄 불변영역" 또는 "경쇄 불변영역", 즉 항체 경쇄로부터의 불변영역을 지칭한다. 용어 "CH"는 "면역글로불린 중쇄 불변영역" 또는 "중쇄 불변영역"을 지칭하며, 이것은 항체 이소타입에 따라 CH1, CH2, 및 CH3 (IgA, IgD, IgG), 또는 CH1, CH2, CH3, 및 CH4 도메인 (IgE, IgM)으로 다시 나눌 수 있다. "Fab" (단편 항원 결합)는 항원에 결합하는 항체 일부이고, 가변영역 및, 사슬간 디설파이드 결합에 의해 경쇄와 연결된 중쇄의 CH1을 포함한다.
본원에서 사용된 "Fc 영역 부분"은 항체에서 유래한 Fc 단편의 중쇄 불변영역 세그먼트("분획 결정화가능" 영역 또는 Fc 영역)를 지칭하고, 이것은 하나 이상의 불변 도메인, 예컨대 CH2, CH3, CH4, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, Fc 영역 부분은 IgG, IgA, 또는 IgD 항체 또는 이들의 조합의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 IgM 또는 IgE 항체 및 이들의 조합의 CH3 및 CH4 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, CH2CH3 또는 CH3CH4 구조물은 동일한 항체 이소타입으로부터의 서브영역 도메인을 갖고, 인간, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM (예를 들어, 인간 IgG1 유래의 CH2CH3)이다. 이 경우, Fc 영역은 면역글로불린의 이펙터 작용, 예컨대 ADCC (항체-의존성 세포-매개 세포독성), CDC (보체-의존성 세포독성) 및 보체 고정, Fc 리셉터(예를 들어, CD16, CD32, FcRn)와의 결합, Fc 영역이 없는 폴리펩티드보다 더 큰 생체 내 반감기, 단백질 A 결합, 및 태반 통과(placental transfer)까지 담당한다(Capon et al., Nature 337:525, 1989 참조). 특정 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질에서 발견된 Fc 영역 부분은 하나 이상의 이러한 이펙터 작용을 매개할 수 있거나, 예를 들어 종래기술에서 알려진 하나 이상의 돌연변이에 의해 이러한 활성의 하나 이상 또는 전부가 없다.
또한, 항체는 (힌지의 하부 섹션이 Fc 영역의 아미노 터미널 부분을 포함할 수 있으나)Fab와 Fc 영역 사이에 전형적으로 위치한 힌지 서열을 갖는다. 이 경우, 면역글로불린 힌지는 가요성 스페이서로 작용하여 Fab 부분이 공간 내에서 자유롭게 움직일 수 있다. 불변영역에 비하여, 힌지는 구조적으로 다양하여 면역글로불린 부류 사이와 서브클래스 중에서도 서열과 길이가 다르다. 예를 들어, 인간 IgG1 힌지 영역은 자유롭게 휘기 쉬워서, Fab 단편이 그의 대칭축 주위를 회전하고 2개 중쇄간 디설파이드 가교의 처음 중심 영역 내에서 움직일 수 있다. 그에 비해, 인간 IgG2 힌지는 상대적으로 짧고 4개의 중쇄간 디설파이드 가교에 의해 안정화된 견고한 폴리프롤린 이중나선을 함유하여 가요성을 제한한다. 인간 IgG3 힌지는 그의 독특한 연장된 힌지 영역(IgG1 힌지보다 4배 길이)에 의해 다른 서브클래스와는 구별되며, 62 아미노산을 함유하고(21 프롤린과 11 시스테인 함유), 비가요성 폴리프롤린 이중나선을 형성하고 Fab 단편이 비교적 Fc 단편과 멀리 떨어져 있기 때문에 더 큰 가요성을 제공한다. 인간 IgG4 힌지는 IgG1보다는 짧지만 IgG2dhk 같은 길이를 가지며, 그의 가요성은 IgG1과 IgG2의 중간이다.
"T 세포 리셉터(TCR)"는 CD3와 관련하여 일반적으로 주요 조직적합성 (histocompatibility) 복합체(MHC) 분자와 결합된 항원 인식을 담당하는 T 세포(또는 T 림프구)의 표면에서 발견된 분자를 지칭한다. TCR은 대부분의 T 세포에서 고도의 가변성 α 및 β 사슬(또한 각각 TCRα와 TCRβ로 알려짐)의 디설파이드 결합 이종다이머를 갖는다. T 세포의 작은 서브세트에서, TCR은 가변성 γ 및 δ 사슬(또한 각각 TCRγ와 TCRδ로 알려짐)의 이종다이머로 구성된다. TCR의 각 사슬은 면역글로불린 상과(상과)의 멤버이고, 하나의 N-터미널 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역, 및 C-터미널 말단의 짧은 세포질 꼬리를 갖는다(Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health 및 Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). 본 발명에서 사용된 TCR은 다양한 동물종, 예를 들어 인간, 마우스, 래트, 고양이, 개, 염소, 말 또는 다른 포유동물에서 유래할 수 있다. TCR은 세포 결합(즉, 막관통 영역 또는 도메인을 갖는다) 또는 가용성 형태일 수 있다.
"주조직적합성 복합체 분자(MHC 분자)"는 세포 표면에 펩티드 항원을 전달하는 당단백질을 지칭한다. MHC 클래스 I 분자는 (3개의 α 도메인을 갖는) 사슬을 스패닝(spanning)하는 막과 비공유적으로 결합된 β2 마이크로글로불린으로 이루어진 이종다이머이다. MHC 클래스 II 분자는 2개의 막관통 당단백질 α와 β로 구성되고, 둘 다 막을 가로지른다. 각각의 사슬은 2개의 도메인을 갖는다. MHC 클래스 I 분자는 사이토졸에서 유래하는 펩티드를 세포 표면에 전달하고, 여기서 펩티드:MHC 복합체는 CD8+ T 세포에 의해 인식된다. MHC 클래스 II 분자는 소포 시스템 (vesicular system)에서 유래하는 펩티드를 세포 표면에 전달하고, 이들은 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. MHC 분자는 다양한 동물종, 예를 들어 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유동물에서 유래할 수 있다.
"벡터"는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자이다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 또는 파지일 수 있다. "발현벡터"는 적절한 환경 내에 존재하는 경우 벡터가 운반하는 하나 이상의 유전자로 코딩된 단백질의 발현을 지정할 수 있는 벡터이다.
"레트로바이러스"는 RNA 게놈을 갖는 바이러스이다. "감마레트로바이러스"는 레트로비리다에 부류의 속을 지칭한다. 예시적 감마레트로바이러스는 마우스 줄기 세포 바이러스, 마우스 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 육종 바이러스 및 조류 세망내피증 바이러스를 포함한다.
"렌티바이러스"는 분화 및 미분화 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스의 속을 지칭한다. 렌티바이러스의 몇몇 예는 HIV(인간 면역결핍 바이러스: HIV 유형 1 및 HIV 유형 2 포함); 말 감염성 빈혈 바이러스; 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역 결핍 바이러스(BIV) 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함한다.
"조혈전구세포(hematopoietic 전구세포)"는 성숙 세포 유형으로 추가로 분화할 수 있는 조혈줄기세포 또는 태아 조직으로부터 유래하는 세포(예를 들어, T 세포 계통의 세포)이다. 특정 구체예에서, CD24lo Lin- CD117+ 조혈전구세포가 유용하다. 본 원에서 정의된 바와 같이, 조혈전구세포는 배아줄기세포를 포함할 수 있고, 이는 T 세포 계통의 세포로 추가로 분화할 수 있다. 조혈전구세포는 다양한 동물 종, 예를 들어 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유동물에서 유래할 수 있다. "흉선세포전구세포" 또는 "흉선세포"는 가슴샘 내에 존재하는 조혈전구세포이다.
"조혈줄기세포"는 생체내에서 자기복제하거나, 생체외에서 본질적 비제한 증식할 수 있고, T 세포 계통의 세포를 포함하는 다른 세포 유형으로 분화할 수 있는 미분화 조혈 세포를 지칭한다. 조혈줄기세포는, 예를 들어 비제한적으로 태아 간, 골수 및 제대혈로부터 단리할 수 있다.
"배아줄기세포" 또는 "ES 세포" 또는 "ESC"는 발생 배의 생식 세포로 통합되어 이의 일부로 되는 능력을 갖는 미분화 배아줄기세포를 지칭한다. 배아줄기세포는 조혈전구세포, 및 임의의 조직 또는 기관으로 분화할 수 있다. 본원에서 사용하기에 적합한 배아줄기세포는 J1 ES 세포주, 129J ES 세포주, 마우스 줄기 세포주 D3(American Type Culture Collection), 129/Sv 마우스로부터 유래하는 R1 또는 E14K 세포주, Balb/c 및 C57Bl/6 마우스로부터 유래하는 세포주 및 인간 배아줄기세포[예를 들어, WiCell Research Institute, WI; 또는 ES cell International, 멜버른, 오스트레일리아]로부터의 세포를 포함한다.
"T 세포 계통의 세포"는 다른 림프구 세포로부터의 세포, 및 적혈구 또는 골수 계통의 세포를 구별하는 T 세포 또는 그의 전구체 또는 선조체(progenitor)의 적어도 하나의 표현형 특성을 나타내는 세포를 지칭한다. 이러한 표현형 특징은 T 세포 (예를 들어, CD3+, CD4+, CD8+)에 특이적인 하나 이상의 단백질의 발현, 또는 T 세포에 특이적인 생리학적, 형태학적, 작용학적 또는 면역학적 특성을 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포 계통의 세포는 T 세포 계통에 위탁된 선조체 또는 전구체 세포; CD25+ 미성숙 및 불활성화된 T 세포; CD4 또는 CD8 계통 위탁을 받은 세포; CD4+CD8+ 이중 양성인 흉선전구세포; 단일 양성 CD4+ 또는 CD8+; TCRαβ 또는 TCRγδ; 또는 성숙 및 작용성 또는 활성화된 T 세포일 수 있다.
"핵산 분자" 또는 폴리뉴클레오티드는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있다. 핵산 분자는 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있고, 단일가닥이면 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스 가닥) 가닥일 수 있다. 코딩 분자는 당 분야에서 공지된 코딩 서열과 동일한 코딩 서열을 가지거나 상이한 코딩 서열을 가질 수 있고, 이는 유전자 코드의 중복 또는 축퇴의 결과로서 또는 스플라이싱에 의해 동일한 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
"치료하다" 또는 "처치" 또는 "개선하다"는 대상(예를 들어, 인간 또는 비인간 포유동물, 예컨대 영장류, 말, 개, 마우스, 래트)의 질환, 장애 또는 증상의 의학적 관리를 지칭한다. 일반적으로, 본 발명의 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 숙주세포, 및 경우에 따라 보조제를 포함하는 적절한 용량 또는 치료 섭생은 치료학적 또는 예방학적 이점을 유도하는데 충분한 양으로 투여한다. 치료학적 또는 예방학적/방지 이점은 개선된 임상적 결과; 질환과 관련된 증상의 경감 또는 완화; 증상의 재발 감소; 개선된 삶의 질; 장기 무병 상태; 질환 정도의 약화, 질환 상태의 안정화; 질환 진행의 지연; 진정; 생존; 생존 연장 또는 이들의 조합을 포함한다.
융합 단백질 또는 본 발명의 융합 단백질(예를 들어, Key-ChEM, T-ChARM)을 발현하는 세포의 "치료학적 유효량" 또는 "유효량"이란 통계적으로 유의한 방식으로 치료되는 질환의 하나 이상의 증상을 완화를 유발하는데 충분한 화합물 또는 세포의 양을 지칭한다. 단독으로 투여되는, 단일 활성성분을 발현하는 세포 또는 개별 활성성분을 지칭할 때, 치료적으로 유효한 용량은 그 성분 또는 그 성분 단독을 발현하는 세포의 효과를 지칭한다. 조합을 지칭할 때, 치료학적으로 유효한 용량은 연속 또는 동시투여 여부와 상관없이 활성성분 또는 조합된 보조 활성성분과 치료효과를 유발하는 활성성분을 발현하는 세포의 조합된 양을 지칭한다. 또다른 조합은 하나를 초과하는 활성성분, 예컨대 2개의 상이한 T-ChARM, T-ChARM과 TCR, T-ChARM과 CAR, 또는 그의 조합을 발현하는 세포일 수 있다.
추가적인 정의는 본 명세서 전체에 제공하였다.
Kev - ChEM 및 T- ChARM
특정 측면에서, 본 발명은 Key-ChEM로 지칭된 단일사슬 융합 단백질을 제공하며, 이것은 소수성 부분으로 연결된 세포외 성분과 세포내 성분을 포함하고, 여기서 세포외 성분은 태그 카세트와 힌지를 포함하는 커넥터 영역을 포함하고, 세포내 성분은 이펙터 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 커넥터 영역은 링커 모듈을 추가로 포함하거나, 하나 이상의 태그 카세트가 커넥터 영역 내에 위치한다. 다른 특정 구체예에서, 하나 이상의 태그 카세트는 커넥터 영역에 링커 모듈에 의해 연결된다.
추가적인 Key-ChEM 구체예에서, 융합 단백질은 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 태그 카세트, 힌지를 포함하는 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함한다(예를 들어, 도 1A 및 1B 참조). 다른 추가적인 Key-ChEM 구체예에서, 융합 단백질은 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 제1 커넥터 영역, 태그 카세트, 힌지를 포함하는 제2 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함한다. 또다른 추가적인 Key-ChEM 구체예에서, 융합 단백질은 comprises 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 제1 태그 카세트, 제1 커넥터 영역, 제2 태그 카세트, 힌지를 포함하는 제2 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함한다(예를 들어, 도 1C 참조). 다른 추가적인 Key-ChEM 구체예에서, 융합 단백질은 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 제1 태그 카세트, 제1 커넥터 영역, 제2 태그 카세트, 제2 커넥터 영역, 제3 태그 카세트, 힌지를 포함하는 제3 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함한다 (예를 들어, 도 1D 참조).
특정한 다른 Key-ChEM 구체예에서, 융합 단백질은 비공유적으로 연합된 결합 도메인, 예컨대 태그 카세트와 연합된 결합 도메인을 추가로 포함한다(즉, 다중사슬 T-ChARM). 또다른 Key-ChEM 구체예에서, 비공유적으로 연합된 결합 도메인은 이중특이적이고, 여기서 제1 결합 말단은 태그 카세트에 특이적이고 제2 결합 말단은 태그 카세트 이외의 표적에 대해 특이적이거나, 제1 및 제2 결합 말단은 둘 다 태그 카세트에 특이적이다. 또다른 Key-ChEM 구체예에서, 비공유적으로 연합된 결합 도메인은 다중특이적이고, 여기서 제1 말단은 태그 카세트에 결합하고 제2 말단은 태그 카세트 이외의 하나 이상의 표적에 특이적이다. 이러한 구체예에서, Key-ChEM은 멀티머 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 하나 이상의 비공유적으로 연합된 결합 도메인을 포함하는 Key-ChEM은 헤테로멀티머(heteromultimer)를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 T-ChARM으로 지칭되는 단일사슬 융합 단백질을 제공하며, 이것은 소수성 부분으로 연결된 세포외 성분과 세포내 성분을 포함하고, 여기서 세포외 성분은 표적과 특이적으로 결합하는 결합 도메인, 태그 카세트, 및 힌지를 포함하는 커넥터 영역을 포함하고, 세포내 성분은 이펙터 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, T-ChARM 결합 도메인은 scFv, scTCR, 리셉터 엑토도메인, 또는 리간드이다.
추가적인 T-ChARM 구체예에서, 융합 단백질은 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 세포외 결합 도메인, 태그 카세트, 힌지를 포함하는 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함한다(예를 들어, 도 1E 참조). 다른 추가적인 T-ChARM 구체예에서, 융합 단백질은 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 세포외 결합 도메인, 제1 커넥터 영역, 태그 카세트, 힌지를 포함하는 제2 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함한다. 또다른 추가적인 T-ChARM 구체예에서, 융합 단백질은 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 세포외 결합 도메인, 제1 태그 카세트, 제1 커넥터 영역, 제2 태그 카세트, 힌지를 포함하는 제2 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함한다. 또다른 추가적인 T-ChARM 구체예에서, 융합 단백질은 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 세포외 결합 도메인, 제1 태그 카세트, 제1 커넥터 영역, 제2 태그 카세트, 제2 커넥터 영역, 제3 태그 카세트, 힌지를 포함하는 제3 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함한다.
특정한 다른 T-ChARM 구체예에서, 융합 단백질은 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 태그 카세트, 세포외 결합 도메인, 힌지를 포함하는 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함한다(예를 들어, 도 1F 참조). 또다른 T- ChARM 구체예에서, 융합 단백질은 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 가변영역 사이에 위치(예를 들어, 가변영역 링커의 N-터미널 말단 또는 그에 인접하거나, 가변영역 링커의 C-터미널 말단 또는 그에 인접하거나, 가변영역 링커의 중앙에 인접하여 내포)한 태그 카세트를 함유하는 가변영역 링커를 포함하는 세포외 scFv 또는 scTCR 결합 도메인, 힌지를 포함하는 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함한다. 가변영역 링커에 내포된 예시적인 태그 카세트는 GGSGSG(X)nWSHPQFEKGSGSG (서열번호 45)를 포함하며, 여기서 X는 선택적이고 임의의 아미노산일 수 있고, n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다. 서열번호 54에서 이러한 내포된 태그를 가지는 가변영역 링커가 존재하며, 여기서 n은 1이고 X는 아스파라긴(N)이다.
Key-ChEM 또는 T-ChARM은 세포와 결합되거나(예를 들어, 세포 표면에서 발현) 가용성 형태로 존재할 수 있다. 특정 구체예에서, Key-ChEM 또는 T-ChARM 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 코돈 최적화되어, 특정한 종류의 세포, 예컨대 T 세포의 발현을 강화하거나 최대화할 수 있다(Scholten et al., Clin . Immunol. 77M35, 2006).
다른 구체예에서, Key-ChEM 또는 T-ChARM은 세포독성 성분(예를 들어, 화학치료제, 예컨대 항-유사분열제(예를 들어, 빈데신), 엽산길항제(antifolates), 알킬화제(예를 들어, 테모졸로미드), 박테리아 독소, 리신 (ricin), 항-바이러스제, 방사성 동위원소, 라디오메탈)을 추가로 포함할 수 있으며, 이것은 암 세포, 감염 세포 또는 다른 질환 세포를 특이적 사멸 또는 불능화하는데 유용하다. 추가 구체예에서, Key-ChEM 또는 T-ChARM은 암 세포, 감염 세포, 또는 다른 조직(예를 들어, 자가면역 공격 하의 조직)를 트래킹 또는 이미지화하는데 유용한 검출성분(예를 들어, 비오틴, 형광 모이어티, 라디오뉴클리드)을 추가로 포함할 수 있다. 다른 추가 구체예에서, Key-ChEM 또는 T-ChARM은 작용성 성분(예를 들어, 면역자극 모이어티, 사이토카인, 면역 조절제, 면역글로불린 단백질 등)을 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 융합 단백질의 성분 부분을 더욱 상세히 설명하였다.
태그 카세트
본 발명에 따른 단일사슬 융합 단백질에 함유된 태그 카세트(예를 들어, Key-ChEM 또는 T-ChARM)는 고친화성 또는 결합활성을 갖는 결합 파트너(예를 들어, 항체) 또는 동원성 리셉터에 특이적으로 결합할 수 있는 세포외 성분이 되며, 동원성 리셉터 또는 결합 파트너는 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 숙주 또는 세포에 이종성이거나 비내인성이다. 단일사슬 융합 단백질 구조 내에서, 태그 카세트는 (a) 커넥터 영역에 대한 아미노-터미널에 직접, (b) 링커 모듈 사이에 위치하여 이를 연결하거나, (c) 결합 도메인에 대한 카복시-터미널에 직접, (d) 결합 도메인 (예를 들어, scFv)과 이펙터 도메인 사이에 위치하여 이들을 연결하거나, (e) 결합 도메인의 서브유닛 사이에 위치하여 이를 연결하거나, (f) 본 발명의 단일사슬 융합 단백질의 아미노-터미널에 위치할 수 있다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 접합 아미노산은 태그 카세트와 소수성 부분 사이에 위치하여 이들을 연결하거나, 태그 카세트와 커넥터 영역 사이에 위치하여 이들을 연결하거나, 태크 카세트와 링커 모둘 사이에 위치하여 이들을 연결하거나, 태그 카세트와 결합 도메인 사이에 위치하여 이들을 연결할 수 있다.
예시적인 태그 카세트는 Strep 태그 (원래의 Strep® 태그, Strep® 태그 II, 또는 그의 변형체를 지칭함; 예를 들어, 미국특허 제7,981,632호 참조, Strep 태그는 본 원에 참조로 인용됨), His 태그, Flag 태그(서열번호 3), Xpress 태그(서열번호 4), Avi 태그(서열번호 5), 칼모듈린(Calmodulin) 태그(서열번호 19), 폴리글루타메이트(Polyglutamate) 태그, HA 태그 (서열번호 6), Myc 태그 (서열번호 7), Nus 태그, S 태그, SBP 태그, Softag 1 (서열번호 9), Softag 3 (서열번호 32), V5 태그 (서열번호 8), CREB-결합 단백질 (CBP), 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스 결합 단백질 (MBP), 녹색 형광 단백질 (GFP), 티오레독신(Thioredoxin) 태그, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 태그 카세트는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열번호 1) 또는 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 Strep 태그이다. 다른 구체예에서, 태그 카세트는 유전적으로 조작된 친화성 부위, 예컨대 최소 킬레이트화 부위 (예를 들어, HGGHHG, 서열번호 33)일 수 있다.
태그 카세트는 본 발명의 융합 단백질에서 다수의 카피로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질은 1, 2, 3, 4 또는 5 태그 카세트(예를 들어, Strep 태그)를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, Key-ChEM 또는 T-ChARM의 커넥터 영역은 1 태그 카세트, 2 태그 카세트, 3 태그 카세트, 4 태그 카세트, 또는 5 태그 카세트를 포함한다. 복수의 태그 카세트 각각은 같거나 다를 수 있다. 예시적인 구체예는 Strep 태그 및 Strep 태그 카세트, 또는 His 태그 및 Strep 태그 카세트, 또는 HA 태그 및 Strep 태그 카세트, 또는 Myc 태그 및 Strep 태그 카세트를 갖는 Key-ChEM 또는 T-ChARM이다. 경우에 따라, Key-ChEM 또는 T-ChARM은 동일한 종류 또는 동일한 아미노산 서열의 다수 태그 카세트, 예컨대 2, 3, 4 또는 5 태그 카세트 (예를 들어, Strep 태그 II)를 가지게 된다.
예를 들어, Key-ChEM 또는 T-ChARM은 적어도 2의 상이한 태그 카세트를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 태그 카세트는 자극 시그널을 제공할 수 있고, 별개의 제2 태그 카세트는 검출시료와 연합하거나 항체-독소 컨쥬게이트 또는 항체-이미지화제 컨쥬게이트와 연합하는데 사용할 수 있다. 추가 구체예에서, 2 이상의 제1 태그 카세트는 Key-ChEM 또는 T-ChARM의 서로 다른 영역에 위치할 수 있다. 특정 구체예에서, 제1 태그 카세트는 커넥터 영역에 위치하고, 제2 태그 카세트는 Key-ChEM 또는 T-ChARM의 아미노-터미널 또는 카복시-터미널 또는 둘 다에 위치한다(예를 들어, 도 1H 참조).
특정 구체예에서, 태그 카세트는 약 5 내지 약 500 아미노산, 또는 약 6 내지 약 100 아미노산, 또는 약 7 내지 약 50 아미노산, 또는 약 8 내지 약 20 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서, 태그 카세트 7 내지 10 아미노산을 가진다. 바람직하게, 태그 카세트는 비면역원성이거나 최소 면역원성이다. 본질적으로 태그 카세트는 핸들 또는 비콘(beacon)으로 작용하여 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 세포의 동정, 강화, 단리, 증식 증진, 활성화, 트래킹, 또는 제거할 수 있다.
특정 구체예에서, 태그 카세트는 본 발명의 융합 단백질의 커넥터 영역 내에 위치한다. 예를 들어, 커넥터 영역은 태그 카세트에 인접한 링커 모듈을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 태그 카세트를 갖는 링커 모듈은 다음의 아미노산 서열을 갖는다: (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열번호 20), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(서열번호 21), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열번호 22), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (서열번호 23), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열번호 24), 또는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (서열번호 25).
본원에 기술된 하나 이상의 태그 카세트를 포함하는 단일사슬 융합 단백질은 동원성 결합 파트너와 연합할 수 있고, 여기서 동원성 결합 파트너는 본원에 기술된 태그 카세트를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 숙주 또는 세포와 이종성이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 단일사슬 Key-ChEM 또는 T-ChARM 내에 존재하는 태그 카세트는 Strep 태그이고, 이것은 스트렙타비딘, 스트렙탁틴(streptactin) 또는 둘 다를 동원성 결합 파트너로 갖거나 Strep 태그에 특이적인 항체에 의해 인식된다. 특정 구체예에서, 동원성 결합 파트너(예를 들어, 리셉터, 단백질, 항체)는 가용성이거나 매트릭스 조성물의 일부이거나 고형 표면(예를 들어, 플레이트, 비드)에 컨쥬게이트될 수 있다. 예시적인 고형 표면은 비즈와 입자(예를 들어, 마이크로 및 나노), 예컨대 자성 비즈 및 입자를 포함한다.
단일사슬 T-ChARM 융합 단백질 구체예에서, 단백질 복합체는 융합 단백질과 동원성 태그 카세트 결합 파트너 사이에서 형성될 수 있고, 이것은 태그 카세트와 결합 파트너 사이의 결합의 결과이다. 특정 구체예에서, T-ChARM은 scFv 또는 scTCR 결합 도메인을 포함하고, 여기서 태그 카세트는 가변영역 링커 내(결합 도메인 서브유닛들 사이)에 위치한다. 다른 구체예에서, T-ChARM은 결합 도메인의 아미노-터미널에 위치한 태그 카세트를 갖는다. 이러한 단백질 복합체 또는 융합 단백질 구조에 있어서, T-ChARM 결합 도메인은 그의 표적 특이성 또는 그의 특이적 표적 결합 친화성을 보유할 수 있다.
커넥터 영역 및 힌지
본 발명에 따른 단일사슬 융합 단백질 내에서 힌지를 포함하는 커넥터 영역은 (a) 소수성 부분에 대한 아미노-터미널에 바로 위치하거나, (b) 태그 카세트 (예를 들어, Strep 태그) 사이에 위치하여 이를 연결하거나, (c) 결합 도메인에 대한 카복시-터미널에 바로 위치하거나, (d) 링커 모듈과 이펙터 도메인 사이에 위치하여 이들을 연결한다. 본원에 기술된 힌지를 갖는 커넥터 영역을 포함하는 단일사슬 융합 단백질은 다이머(예를 들어, 호모다이머 또는 헤테로다이커)를 형성하기 위해 다른 단일사슬 융합 단백질과 연합할 수 있고, 여기서 Key-ChEM 또는 T-ChARM 다이머는 동원성 결합 파트너와 결합할 수 있는 하나 이상의 태그 카세트를 함유하게 되고, T-ChARM 다이머는 그의 표적 특이성과 그의 특이적 표적 결합 친화도를 보유하는 결합 도메인을 추가로 포함하게 된다.
커넥터 영역은 힌지만, 링커 모듈만, 힌지와 링커 모듈, 또는 힌지, 하나 이상의 링커 모듈 및 하나 이상의 태그 카세트로 이루어질 수 있다. 특정 구체예에서, 링커 모듈은 가요성 구조를 형성하는 약 2 내지 약 20 아미노산을 포함한다. 예시적인 링커 모듈은 면역글로불린 CH2CH3, 면역글로불린 CH3, 또는 하나 이상의 GlyxSery(여기서 x와 y는 독립적으로 0 내지 10의 정수이나, x와 y는 둘 다 0은 아니다)(예를 들어, (Gly4Ser)2 (서열번호 67), (Gly3Ser)2 (서열번호 68), Gly2Ser, 또는 그의 조합, 예컨대 (Gly3Ser)2Gly2Ser (서열번호 69))를 포함한다. 추가 구체예에서, 커넥터 영역은 태그 카세트를 포함한다. 예를 들어, 커넥터 영역은 1 내지 5의 태그 카세트를 함유하며, 여기서 각 태그 카세트는 (GlyxSery)n을 포함하는 1 또는 2의 링커 모듈에 연결되고, 여기서 n은 1 내지 10의 정수이고, x와 y는 독립적으로 0 내지 10의 정수이나, x와 y는 둘 다 0은 아니다. 예시적인 링커 모듈은 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열번호 10), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (서열번호 11), (Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser (서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖고, 이것은 커넥터 영역 내에서 임의의 조합으로 존재할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 단일사슬 Key-ChEM 또는 T-ChARM 내에 존재하는 힌지는 면역글로불린 힌지 영역, 예컨대 야생형 면역글로불린 힌지 영역 또는 그의 변경된 면역글로불린 힌지 영역일 수 있다. 특정 구체예에서, 힌지는 야생형 인간 면역글로불린 힌지 영역이다. 다른 특정한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기를 야생형 면역글로불린 힌지 영역의 아미노- 또는 카복시-터미널에 융합 단백질 구조물 디자인의 일부로서 부가할 수 있다. 예를 들어, 1, 2 또는 3 추가 접합 아미노산 잔기가 힌지 아미노-터미널 또는 카복시-터미널에 존재하거나 힌지가 터미널 또는 내부 결실을 함유할 수 있고, 1, 2 또는 3 추가 접합 아미노산 잔기를 다시 첨가한다.
특정 구체예에서, 힌지는 변경된 면역글로불린 힌지이고, 여기서 야생형 면역글로불린 힌지 영역 내의 하나 이상의 시스테인 잔기는 하나 이상의 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 예시적인 변경된 면역글로불린 힌지는 1, 2 또는 3의 상이한 아미노산 잔기(예를 들어, 세린 또는 알라닌)로 치환된 야생형 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 힌지에서 발견된 1, 2 또는 3 시스테인 잔기를 갖는 면역글로불린 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 힌지 영역을 포함한다. 특정 구체예에서, 힌지 폴리펩티드는 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 야생형 면역글로불린 힌지 영역, 예컨대 야생형 인간 IgG1 힌지, 야생형 인간 IgG2 힌지, 또는 야생형 인간 IgG4 힌지와 일치하는 서열이거나 이 서열을 포함한다.
추가 구체예에서, 본 발명의 단일사슬 Key-ChEM 또는 T-ChARM에 존재하는 힌지는 면역글로불린 힌지에 기초하거나 그로부터 유도되지 않은 힌지일 수 있다(즉, 야생형 면역글로불린 힌지 또는 변경된 면역글로불린 힌지가 아니다). 이러한 힌지의 예는 약 5 내지 약 150 아미노산의 타입 II C-렉틴 또는 CD 분자의 스토크(stalk) 영역의 펩티드, 예를 들어 약 8 내지 25 아미노산의 펩티드 또는 약 7 내지 약 18 아미노산의 펩티드, 또는 그의 변이체를 포함한다.
타입 II C-렉틴 또는 CD 분자의 "스토크(stalk) 영역"이란 C-타입 렉틴-유사 도메인 (CTLD; 예를 들어, 천연 킬러 세포 리셉터의 CTLD와 유사)과 소수성 부분 (막관통 도메인) 사이에 위치한 타입 II C-렉틴 또는 CD 분자의 세포외 도메인의 일부를 지칭한다, 예를 들어, 인간 CD94의 세포외 도메인(GenBank 기탁번호 AAC50291.1)은 아미노산 잔기 34-179에 해당하지만, CTLD는 아미노산 잔기 61-176에 해당하며, 따라서 인간 CD94 분자의 스토크 영역은 아미노산 잔기 34-60을 포함하고, 이것은 소수성 부분(막관통 도메인)과 CTLD 사이에 위치한다(Boyington et al., Immunity 10:15, 1999 참조; 다른 스토크 영역의 설명에 대해서는, 또한 Beavil et al, Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 89:153, 1992; 및 Figdor et al., Nat. Rev. Immunol . 2:11, 2002 참조). 이러한 타입 II C-렉틴 또는 CD 분자는 또한 스토크 영역과 막관통 영역 또는 CTLD 사이에 접합 아미노산을 가질 수 있다. 다른 예에서, 233 아미노산 인간 NKG2A 단백질 (GenBank 기탁번호. P26715.1)은 아미노산 71-93 범위의 소수성 부분(막관통 도메인) 및 아미노산 94-233 범위의 세포외 도메인을 갖는다. CTLD는 아미노산 119-231을 포함하고 스토크 영역은 아미노산 99-116을 포함하며, 이것은 추가적인 접합 아미노산에 의해 플랭킹될 수 있다. 다른 타입 II C-렉틴 또는 CD 분자뿐만 아니라 그의 세포외 리간드 결합 도메인, 스토크 영역, 및 CTLD도 당분야에 공지되어 있다(예를 들어, GenBank 기탁번호 NP 001993.2; AAH07037.1; NP 001773.1; AAL65234.1; CAA04925.1 참조; 인간 CD23, CD69, CD72, NKG2A 및 NKG2D의 서열 및 이들의 기술(descriptions) 각각의 경우).
타입 II C-렉틴 또는 CD 분자의 스토크 영역 힌지의 "유도체", 또는 그의 단편은 약 8 내지 약 150 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 야생형 타입 II C-렉틴 또는 CD 분자의 스토크 영역의 1, 2 또는 3 아미노산은 결실, 삽입, 치환, 또는 이들의 조합을 갖는다. 예를 들어, 유도체는 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 아미노산 결실을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 스토크 영역의 유도체는 야생형 스토크 영역 서열, 예컨대 NKG2A, NKG2D, CD23, CD64, CD72, 또는 CD94의 약 8 내지 약 20 아미노산으로부터 유도된 것들과 비교하여 단백질가수분해성 분해에 대해 더 잘 견딘다.
특정 구체예에서, 스토크 영역 힌지는 약 7 내지 약 18 아미노산을 포함할 수 있고, α-헬리칼 이중나선(coiled coil) 구조를 형성할 수 있다. 특정 구체예에서, 스토크 영역 힌지는 0, 1, 2, 3, 또는 4 시스테인을 함유한다. 예시적인 스토크 영역 힌지는 스토크 영역의 단편, 예컨대 CD69, CD72, CD94, NKG2A 및 NKG2D의 스토크 영역으로부터 약 10 내지 약 150 아미노산을 포함하는 그 일부를 포함한다.
본 발명의 단일사슬 Key-ChEM 또는 T-ChARM에서 사용될 수 있는 대체 힌지는 면역글로불린 V-유사 또는 면역글로불린 C-유사 도메인을 연결하는 세포 표면 리셉터(도메인간 영역)의 일부로부터 유래한다. 세포 표면 리셉터가 다중 Ig V-유사 도메인을 탠덤(tandem)으로 함유하는 Ig V-유사 도메인 사이와 세포 표면 리셉터가 다중 탠덤 Ig C-유사 영역을 함유하는 Ig C-유사 도메인 사이의 영역 또한 본 발명의 단일사슬 Key-ChEM 또는 T-ChARM에 유용한 힌지로서 고려된다. 특정 구체예에서, 세포 표면 리셉터 도메인간(inter도메인) 영역으로 이루어진 힌지 서열은 자연 발생 또는 부가된 모티프, 예컨대 하나 이상의 디설파이드 결합을 제공하기 위해 IgG 코어 힌지 서열을 추가로 함유하여 Key-ChEM 또는 T-ChARM 다이머 형성을 안정화할 수 있다. 힌지의 예는 CD2, CD4, CD22, CD33, CD48, CD58, CD66, CD80, CD86, CD150, CD 166, 또는 CD244의 Ig V-유사 및 Ig C-유사 영역 사이의 도메인간 영역을 포함한다.
특정 구체예에서, 힌지 서열은 약 5 내지 약 150 아미노산, 약 5 내지 약 10 아미노산, 약 10 내지 약 20 아미노산, 약 20 내지 약 30 아미노산, 약 30 내지 약 40 아미노산, 약 40 내지 약 50 아미노산, 약 50 내지 약 60 아미노산, 약 5 내지 약 60 아미노산, 약 5 내지 약 40 아미노산, 예를 들어 약 8 내지 약 20 아미노산 또는 약 10 내지 약 15 아미노산을 갖는다. 힌지는 주로 유연할 수 있지만, 또한 더 강성 특성을 제공하거나 최소한의 β-시트 구조를 갖는 주로 α-나선형 구조를 함유할 수 있다.
특정 구체예에서, 힌지 서열은 혈장 및 혈청에서 안정하고 단백질가수분해성 분해에 잘 견딘다. 예를 들어, IgG1 상부 힌지 영역 내의 제1 리신을 돌연변이하거나 결실하여 단백질가수분해성 분해를 최소화할 수 있고, 힌지는 접합 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 힌지 서열은 자연적으로 발생 또는 부가된 모티프, 예컨대 다이머 형성을 안정화하는 다수 디설파이드 결합 또는 하나의 디설파이드 결합을 형성하는 능력을 제공하는 면역글로불린 힌지 코어 구조 CPPCP (서열번호 26)를 함유할 수 있다.
소수성 부분
본 발명의 단일사슬 융합 단백질(예를 들어, Key-ChEM 또는 T-ChARM)에 함유된 소수성 부분은 본 발명의 융합 단백질이 세포막과 연합할 수 있게 하여 융합 단백질의 부분이 세포외에 위치하고(예를 들어, 태그 카세트, 커넥터 도메인, 결합 도메인) 일부가 세포내 위치(예를 들어, 이펙터 도메인)하도록 한다. 소수성 부분은 일반적으로 세포막 인지질 이중층 내에 위치하게 된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 접합 아미노산은 이펙터 도메인을 갖는 소수성 부분 사이에 위치하여 이를 연결하거나, 커넥터 영역을 갖는 소수성 부분 사이에 위치하여 이를 연결하거나, 태그 카세트를 갖는 소수성 부분 사이에 위치하여 이를 연결할 수 있다.
특정 구체예에서, 소수성 도메인은 막관통 도메인, 예컨대 막내재성(integral membrane) 단백질에서 유도된 것(예를 들어, 리셉터, 분화클러스터(CD) 분자, 효소, 운반체(transporter), 세포부착분자 등)이다. 특정 구체예에서, 소수성 부분은 CD4, CD8, CD27, 또는 CD28로부터의 막관통 도메인이다. 특정 구체예에서, 막관통 도메인은 서열번호 16에 기재된 아미노산을 갖는 CD28 막관통 도메인이다.
이펙터 도메인
본 발명의 단일사슬 융합 단백질(예를 들어, Key-ChEM 또는 T-ChARM)에 함유된 이펙터 도메인은 세포내 성분이고, 세포에 작용성 시그널을 전달할 수 있게 된다. 특정 구체예에서, 단일사슬 Key-ChEM 또는 T-ChARM은 제2 단일사슬 Key-ChEM 또는 T-ChARM 각각으로 다이머화되며, 여기서 다이머화는 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분이 아주 근접하도록 하여 적절한 시그널에 노출될 때 시그널 전달을 증진할 수 있다. 이러한 다이머 단백질 복합체를 형성하는 것 이외에도, 이펙터 도메인은 다른 시그널링 인자, 예컨대 동시자극인자와 추가로 연합하여 세포내 시그널을 생성하는 멀티단백질 복합체를 형성한다. 특정 구체예에서, 이펙터 도메인은 세포 반응을 직접적으로 증진하는 하나 이상의 다른 단백질과 연합하여 세포 반응을 간접적으로 증진하게 된다. 이펙터 도메인은 1, 2, 3 이상의 리셉터 시그널링 도메인, 동시자극 도메인, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 다양한 시그널링 분자(예를 들어, 시그널 형질도입 리셉터)로부터의 이펙터 도메인, 동시자극 도메인 또는 둘 다를 포함하는 세포내 성분을 본 발명의 융합 단백질에서 사용할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질에서 유용한 이펙터 도메인은 다음에서 유래하는 것일 수 있다: Wnt 시그널링 경로 (예를 들어, LRP, Ryk, ROR2), NOTCH 시그널링 경로 (예를 들어, NOTCH1, NTOCH2, NOTCH3, NOTCH4), Hedgehog 시그널링 경로 (예를 들어, PTCH, SMO)의 단백질, 리셉터 티로신 키나제 (RTK) (예를 들어, 상피세포성장인자(EGF) 리셉터 부류, 섬유아세포성장인자 (FGF) 리셉터 부류, 간세포성장인자 (HGF) 리셉터 부류, 인슐린 리셉터 (IR) 부류, 혈소판 유도성 성장인자 (PDGF) 리셉터 부류, 혈관표피성장인자(VEGF) 리셉터 부류, 트로포마이신(tropomycin) 리셉터 키나제 (Trk) 리셉터 부류, 에프린 (Eph) 리셉터 부류, AXL 리셉터 부류, 백혈구 티로신 키나제 (LTK) 리셉터 부류, 면역글로불린-유사 및 EGF-유사 도메인 1 (TIE) 리셉터 부류를 갖는 티로신 키나제, 리셉터 티로신 키나제-유사 오펀(orphan) (ROR) 리셉터 부류, 디스코이딘 도메인 (DDR) 리셉터 부류, 형질감염에서 재정렬된 (RET) 리셉터 부류, 티로신-단백질 키나제-유사 (PTK7) 리셉터 부류, 리셉터 티로신 키나제 (RYK) 리셉터 부류와 관련, 근육 특이적 키나제 (MuSK) 리셉터 부류); G-단백질-결합 리셉터, GPCR (Frizzled, Smoothened); 세린/트레오닌 키나제 리셉터 (BMPR, TGFR); 또는 사이토카인 리셉터 (IL1R, IL2R, IL7R, IL15R).
특정 구체예에서, 이펙터 도메인은 림프구 리셉터 시그널링 도메인을 포함하거나 하나 또는 다수의 면역리셉터 티로신계 활성화 모티프(ITAM)를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 추가 구체예에서, 이펙터 도메인은 세포질 시그널링 단백질과 연합하는 세포질 부분을 포함하고, 여기서 세포질 시그널링 단백질은 림프구 리셉터 또는 그의 시그널링 도메인, 다수의 ITAM을 포함하는 단백질, 동시자극인자, 또는 이들의 조합이다.
예시적인 이펙터 도메인은 4-1BB (예를 들어, 서열번호 17), CD3ε, CD3δ, CD3ζ(예를 들어, 서열번호 18), CD27, CD28 (예를 들어, 서열번호 35), CD79A, CD79B, CARD11, DAP 10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NOTCH1, Wnt, NKG2D, OX40, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2, 또는 이들의 조합에서 유래한 것들을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 Key-ChEM 또는 T-ChARM의 이펙터 도메인은 CD3ζ와 CD28이고, CD3ζ와 4-1BB이거나, CD3ζ, CD28 및 4-1BB이다.
결합 도메인
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 T-ChARM 단일사슬 융합 단백질은 특이적으로 표적과 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 결합 도메인에 의한 표적의 결합은 표적(예를 들어, 리셉터 또는 리간드)과 다른 분자간 상호작용을 차단할 수 있고, 예를 들어 표적의 특정 작용(예를 들어, 시그널 형질도입)을 방해, 감소 또는 제거하거나, 표적의 결합이 특정 생물학적 경로를 유도하거나 제거용 표적을 동정할 수 있다.
결합 도메인은 관심있는 표적을 특이적으로 결합하는 펩티드일 수 있다. 결합 도메인의 공급원은 다양한 종, 예를 들어 인간, 설치류, 조류, 또는 양의 항체 가변영역을 포함한다(이것은 항체, sFvs, scFvs, Fabs, scFv-기반 그라바바디(grababody), 또는 가용성 VH 도메인 또는 도메인 항체의 형태로 존재할 수 있다). 결합 도메인의 다른 공급원은 다른 종, 예컨대 카멜리드 (낙타, 단봉 낙타 또는 라마 유래; Ghahroudi et al., FEBSLett . 414:521, 1997; Vincke et al., J. Biol. Chem . 284:3273, 2009; Hamers-Casterman et al., Nature 363:446, 1993 및 Nguyen et al., J. Mol . Biol . 275:413, 1998), 널스 샤크(nurse shark) (Roux et al, Proc . Natl Acad . Sci . (USA) 95:11804, 1998), 스팟티드 래트피쉬 (Nguyen et al., Immunogen . 54:39, 2002), 또는 칠성장어(Herrin et al., Proc . Natl Acad . Sci. (USA) 105:2040, 2008 및 Alder et al. Nat. Immunol . 9:319, 2008) 유래의 항체 가변영역을 포함한다. 이러한 항체는 중쇄 가변영역만을 사용하는 항원-결합영역을 형성할 수 있으며, 즉 이러한 작용성 항체는 중쇄만의 호모다이머("중쇄 항체"라 칭함)이다(Jespers et al., Nat. Biotechnol . 22:1161, 2004; Cortez-Retamozo et al, Cancer Res. 64:2853, 2004; Baral et al, Nature Med . 12:580, 2006; 및 Barthelemy et al, J. Biol . Chem . 283:3639, 2008).
본 발명의 결합 도메인의 대체 공급원은 랜덤 펩티드 라이브러리를 코딩하는 서열 또는 대체 비-항체 스캐폴드의 루프 영역에서 아미노산의 설계된 다양성을 코딩하는 서열을 포함하며, 예컨대 scTCR (예를 들어, Lake et al, Int . Immunol . 11:745, 1999; Maynard et al, J. Immunol . Methods 306:51, 2005; 미국특허 제8,361,794호 참조), 피브리노겐 도메인(예를 들어, Weisel et al., Science 230:1388, 1985 참조), Kunitz 도메인 (예를 들어, 미국특허 제6,423,498호 참조), 디자인된 안키린(ankyrin) 반복(repeat) 단백질(DARPins) (Binz et al, J. Mol . Biol . 552:489, 2003 및 Binz et al, Nat. Biotechnol . 22:515, 2004), 피브로넥틴 결합 도메인 (애드넥틴(adnectins) 또는 모노바디) (Richards et al, J. Mol . Biol . 326:1475, 2003; Parker et al, Protein Eng . Des. Selec . 18:435, 2005 및 Hackel et al. (2008) J. Mol . Biol . 381:1238-1252), 시스테인-노트 미니단백질 (Vita et al. (1995) Proc . Nat'l . Acad . Sci . (USA) 92:6404-6408; Martin et al. (2002) Nat. Biotechnol. 21:71, 2002 및 Huang et al. (2005) Structure 13:155, 2005), 테트라트리코펩티드 반복 도메인 (Main et al, Structure 11:491, 2003 및 Cortajarena et al, ACS Chem . Biol . 3:161, 2008), 루신이 많은 반복 도메인 (Stumpp et al., J. Mol . Biol . 332:471, 2003), 리포칼린 도메인 (예를 들어, WO 2006/095164, Beste et al, Proc . Nat'l . Acad . Sci . (USA) 96: 1898, 1999 및 Schoenfeld et al, Proc . Nat'l . Acad . Sci . (USA) 106:8198, 2009 참조), V-유사 도메인 (예를 들어, 미국 특허출원 공개 2007/0065431 참조), C-타입 렉틴 도메인 (Zelensky 및 Gready, FEBS J. 272:6179, 2005; Beavil et al, Proc . Nat'l . Acad . Sci . (USA) 89:153, 1992 및 Sato et al, Proc . Nat'l . Acad . Sci . (USA) 100:7779, 2003), mAb2 또는 Fcab™ (예를 들어, PCT 특허출원 공개 WO 2007/098934; WO 2006/072620 참조), 아마딜로 반복 단백질 (예를 들어, Madhurantakam et al, Protein Sci . 21: 1015, 2012; PCT 특허출원 공개 WO 2009/040338 참조), 아필린(affilin) (Ebersbach et al, J. Mol . Biol . 372:172, 2007), 아피바디, 아비머(avimer), 노틴스(knottins), 파이노머(fynomers), 아트리머, 세포독성 T-림프구 관련 단백질-4 (Weidle et al, Cancer Gen. Proteo . 10:155, 2013) 등 (Nord et al, Protein Eng . 8:601, 1995; Nord et al, Nat. Biotechnol . 15:772, 1997; Nord et al, Euro. J. Biochem. 268:4269, 2001; Binz et al, Nat. Biotechnol . 23:1257, 2005; Boersma 및 Plueckthun, Curr . Opin . Biotechnol. 22:849, 2011)이 있다.
본 발명의 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같이 또는 당분야에서 공지된 다양한 방법(예를 들어, 미국특허 제 6,291,161호 및 제6,291,158호 참조)에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합 도메인은 목적하는 표적에 특이적으로 결합하는 Fab 단편에 대해 Fab 파지 라이브러리를 스크리닝하여 동정할 수 있다(Hoet et al., Nat. Biotechnol . 23:344, 2005 참조). 추가적으로, 관심있는 표적을 면역원으로 간편 시스템(예를 들어, 마우스, HuMAb 마우스®, TC 마우스™, KM-마우스®, 라마, 닭, 래트, 햄스터, 토끼 등)을 사용하는 하이브리도마 발생용 전통적 전략을 사용하여 본 발명의 결합 도메인을 발생할 수 있다.
일부 구체예에서, 결합 도메인은 관심있는 표적에 특이적인 VH 및 VL 영역을 포함하는 단일사슬 Fv 단편 (scFv)이다. 특정 구체예에서, VH 및 VL 영역은 인간이다. 예시적인 VH 및 VL 영역은 항-CD19 특이적 모노클로날 항체 FMC63의 세그먼트 (예를 들어, 서열번호: 51 및 52 각각 참조)를 포함한다.
특정 구체예에서, 결합 도메인은 경쇄 가변영역 (VL)의 아미노산 서열(예를 들어, FMC63으로부터, 서열번호 52; R12로부터, 서열번호 56) 또는 중쇄 가변영역 (VH) (예를 들어, FMC63으로부터, 서열번호 51; R12로부터, 서열번호 55), 또는 둘 다에 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열이거나 이를 포함하고, 여기서 각 CDR은 관심있는 표적(예를 들어, CD19, ROR1)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 단편 또는 유도체로부터 0개의 변경 또는 최대 1개, 2개 또는 3개의 변화를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 결합 도메인 VH 영역은 공지된 모노클로날 항체의 VH로부터 유도되거나 기초할 수 있고, 공지된 모노클로날 항체의 VH와 비교하여 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 삽입, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 결실, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 아미노산 치환 (예를 들어, 보존성 아미노산 치환 또는 비보존성 아미노산 치환), 또는 상기한 변경의 조합을 함유한다. 삽입, 결실 또는 치환은 이 영역의 아미노- 또는 카복시-터미널 또는 양 말단을 포함하는 VH 영역 어디에서나 가능하나, 단 각각의 CDR은 0개의 변경 또는 최대 1개, 2개, 또는 3개의 변경을 포함하고, 변성된 VH 영역을 함유하는 결합 도메인도 야생형 결합 도메인과 유사한 친화도로 그의 표적과 특이적으로 결합할 수 있다.
추가 구체예에서, 본 발명의 결합 도메인 VL 영역은 공지된 모노클로날 항체의 VL로부터 유도되거나 기초할 수 있고, 공지된 모노클로날 항체의 VL과 비교하여 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 삽입, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 결실, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 아미노산 치환 (예를 들어, 보존성 아미노산 치환), 또는 상기한 변경의 조합을 함유한다. 삽입, 결실 또는 치환은 이 영역의 아미노- 또는 카복시-터미널 또는 양 말단을 포함하는 VL 영역 어디에서나 가능하나, 단 각각의 CDR은 0개의 변경 또는 최대 1개, 2개, 또는 3개의 변경을 포함하고, 변성된 VL 영역을 함유하는 결합 도메인도 야생형 결합 도메인과 유사한 친화도로 그의 표적과 특이적으로 결합할 수 있다.
VH 및 VL 도메인은 양 방향(즉, 아미노-터미널에서 카복실 터미널로, VH-VL 또는 VL-VH)으로 배열될 수 있고, 스페이서 작용을 제공할 수 있는 (예를 들어, 약 5 내지 약 35 아미노산의 길이를 갖는)아미노산 서열에 의해 결합되어 두 서브-결합 도메인이 상호작용하여 작용성 결합 도메인을 형성할 수 있다. 특정 구체예에서, VH 및 VL 도메인을 연결하는 가변영역 링커는 (GlynSer) 부류에 속하는 것들, 예컨대 (Gly3Ser)n(Gly4Ser)1 (서열번호 72), (Gly3Ser)1(Gly4Ser)n (서열번호 72), (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n (서열번호 72), 또는 (Gly4Ser)n (서열번호 10)을 포함한다(여기서, n은 1 내지 5의 정수이다). 특정 구체예에서, 링커는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (서열번호 13) 또는 Gly-Gly-Gly-Ser)4 (서열번호 14)이다. 특정 구체예에서, 이러한 (GlynSer)-기반 링커를 사용하여 결합 도메인 내에서 VH 및 VL 도메인을 연결하고, 이러한 링커들은 또한 결합 도메인을 커넥터 영역에 또는 태그 카세트에 연결하거나 태그 카세트를 이펙터 도메인에 연결하기 위해 사용할 수 있다. 다른 특정한 구체예에서, 태그 카세트는 결합 도메인의 VH 및 VL 도메인을 연결하기 위해 사용된 (GlynSer)-기반 링커의 일부이거나 그 안에 위치한다. 또다른 추가 구체예에서, (GlynSer)-기반 링커는 하나 이상의 태그 카세트를 T-ChARM 결합 도메인의 N-터미널 말단에 연결하는데 사용할 수 있다.
일부 구체예에서, 결합 도메인은 Vα /β 및 Cα /β 사슬(예를 들어, Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ) 또는 관심있는 표적에 특이적인 Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ 쌍(예를 들어, 펩티드-MHC 복합체)을 포함하는 단일사슬 T 세포 리셉터(scTCR)이다.
특정 구체예에서, 결합 도메인은 TCR Vα, Vβ, Cα, 또는 Cβ의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열이거나 이를 포함하고, 여기서 각각의 CDR은 관심있는 표적과 특이적으로 결합하는 TCR 또는 그의 단편 또는 유도체로부터 0개의 변경, 또는 최대 1개, 2개 또는 3개의 변경을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 결합 도메인 Vα, Vβ, Cα, 또는 Cβ 영역은 공지된 TCR(예를 들어, 고친화도 TCR)의 Vα, Vβ, Cα, 또는 Cβ로부터 유도되거나 기초할 수 있고, 공지된 TCR의 Vα, Vβ, Cα, 또는 Cβ와 비교하여 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 삽입, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 결실, 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 아미노산 치환 (예를 들어, 보존성 아미노산 치환 또는 비보존성 아미노산 치환), 또는 상기한 변경의 조합을 함유한다. 삽입, 결실 또는 치환은 이 영역의 아미노- 또는 카복시-터미널 또는 양 말단을 포함하여 Vα, Vβ, Cα, 또는 Cβ 영역 어디에서나 가능하나, 단 각각의 CDR은 0개의 변경 또는 최대 1개, 2개, 또는 3개의 변경을 포함하고, 변성된 Vα, Vβ, Cα, 또는 Cβ 영역을 함유하는 결합 도메인도 야생형 결합 도메인과 유사한 친화도로 그의 표적과 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 T-ChARM 단일사슬 융합 단백질에 함유된 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합된 표적 분자는 관심있는 세포("표적 세포")에서 또는 그와의 연합에서 발견할 수 있다. 예시적인 표적 세포는 암 세포, 자가면역 질환 또는 장애 또는 염증 질환 또는 장애와 연관된 세포(예를 들어, 박테리아, 바이러스, 바이러스 감염 세포)를 포함한다. 감염성 유기체의 세포, 예컨대 포유동물 기생출 또한 표적 세포로서 고려된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 T-ChARM 단일사슬 융합 단백질의 결합 도메인은 다음에서 선택된 표적을 인식한다: 종양 항원, B-세포 표적, TNF 리셉터 상과(superfamily) 멤버, Hedgehog 부류 멤버, 리셉터 티로신 키나제, 프로테오글리칸 관련 분자, TGF-β 상과 멤버, Wnt-관련 분자, T-세포 표적, 수지상 세포 표적, NK 세포 표적, 단핵구/대식세포 세포 표적, 또는 혈관신생(angiogenesis) 표적. 추가 구체예에서, 본 발명의 T-ChARM 단일사슬 융합 단백질의 결합 도메인은 리셉터 단백질, 예컨대 리셉터 단백질, 예컨대 말초 세포막 리셉터 단백질 또는 막관통 리셉터 단백질을 결합한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 T-ChARM 단일사슬 융합 단백질은 다음과 같은 표적과 특이적으로 결합한다: 예컨대 CD3, CEACAM6, c-Met, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EphA2, IGF1R, GD2, O-아세틸 GD2, O-아세틸 GD3, GHRHR, GHR, FLT1, KDR, FLT4, CD44v6, CD151, CA125, CEA, CTLA-4, GITR, BTLA, TGFBR2, TGFBR1, IL6R, gpl30, Lewis A, Lewis Y, TNFR1, TNFR2, PD1, PD-L1, PD-L2, HVEM, MAGE-A, 메소텔린(mesothelin), NY-ESO-1, PSMA, RANK, ROR1, TNFRSF4, CD40, CD137, TWEAK-R, HLA, HLA에 결합된 종양 또는 병원체 유도성 펩티드 (예컨대 hTERT로부터, 티로시나제, 또는 WT-1), LTβR, LIFRβ, LRP5, MUC1, OSMRβ, TCRα, TCRβ, CD19, CD20, CD22, CD25, CD28, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, CD81, CD86, CD123, CD171, CD276, B7H4, TLR7, TLR9, PTCH1, PTCH1, Robol, α-페토프로테인 (AFP), Frizzled, OX40 (CD134라고도 칭함) 또는 CD79b. 특정 구체예에서, 본 발명의 T-ChARM 단일사슬 융합 단백질은 감염 세포에서 발현된 병원체 특이적 분자, 예컨대 아데노바이러스, 분야바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 엡슈타인 바(Epstein Barr) 바이러스, 사이토메갈로바이러스), 파포바바이러스, 파필로마바이러스(예를 들어, 인간 파필로마 바이러스, HPV), 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 라브도바이러스(예: 광견병), 오르토믹소바이러스(예: 인플루엔자), 폭스바이러스(예: 백시니아), 레오바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스(예를 들어, 인간면역결핍 바이러스, HIV), 플라비바이러스(예를 들어, C형 간염 바이러스, HCV; B형 간염 바이러스, HBV)로부터의 분자를 결합한다.
숙주세포 및 핵산
특정 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 핵산 분자는 관심있는 숙주세포(예를 들어, 조혈기원세포, T 세포) 내 도입을 위한 적절한 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 비바이러스 플라스미드 벡터) 내로 삽입될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "재조합" 또는 "비자연적"이란 적어도 하나의 유전자 변경(alteration)을 포함하거나 외인성 핵산 분자의 도입으로 변성된 유기체, 미생물, 세포, 핵산 분자 또는 벡터를 지칭하며, 여기서 이러한 변경 또는 변성은 유전자 조작에 의해 도입된다. 유전자 변경은, 예를 들어 단백질, 융합 단백질 또는 효소를 코딩하는 발현가능한 핵산 분자를 도입하는 변성, 또는 세포의 유전물질의 다른 핵산 분자 첨가, 결실 치환 또는 다른 작용 파괴를 포함한다. 다른 변성은, 예를 들어 변성이 유전자 또는 오페론의 발현을 변경하는 비코딩 조절 영역을 포함한다. 특정 구체예에서, 세포, 예컨대 대상에서 얻어진 T 세포는 본원에 기술된 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 코딩하는 핵산을 삽입하여 세포가 세포 표면에 있는 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하여 비자연적 또는 재조합 세포(예를 들어, 비자연적 또는 재조합 T 세포)로 전환될 수 있다.
코어 바이러스를 코딩하는 벡터는 본원에서 "바이러스 벡터"로 지칭하였다. 인간 유전자 치료 적용을 위해 동정된 것들을 포함하여 본 발명의 조성물과 함께 사용하는데 적합한 수많은 이용가능한 바이러스 벡터들이 있다(Pfeifer 및 Verma, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177, 2001 참조). 적합한 바이러스 벡터는 RNA 바이러스에 기초한 벡터, 예컨대 레트로바이러스 유도 벡터, 예를 들어 몰로니 (Moloney) 설치류 백혈병 바이러스(MLV) 유도 벡터를 포함하고, 더 복잡한 레트로바이러스 유도 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 유도 벡터를 포함한다. HIV-1-유도 벡터는 이 카테고리에 속한다. 다른 예는 HIV-2, FIV, 말 전염성 빈혈 바이러스, SIV 및, 메디-비스나(Maedi-Visna) 바이러스(양 렌티바이러스)로부터 유도된 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 바이러스성 벡터를 사용하고 키메릭 항원 리셉터 전이유전자를 함유하는 바이러스 입자로 포유동물 숙주세포를 형질도입하는 세포를 패키징하는 방법은 당분야에 알려져 있으며, 예를 들어 다음 문헌에서 이전에 기술되었다: 미국특허 제8,119,772호; Walchli et al, PLoS One 6:327930, 2011; Zhao et al, J. Immunol . 174:4415, 2005; Engels et al., Hum. Gene Ther . 14: 1155, 2003; Frecha et al., Mol . Ther . 18:1748, 2010; Verhoeyen et al, Methods Mol . Biol . 506:91, 2009. 레트로바이러스성 및 렌티바이러스성 벡터 구조물과 발현 시스템은 또한 상업적으로 입수할 수 있다.
특정 구체예에서는 바이러스 벡터를 사용하여 표적에 특이적인 T-ChARM을 코딩하는 비내인성 핵산 서열 또는 Key-ChEM을 코딩하는 비내인성 핵산 서열을 도입한다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 형질도입을 위한 마커를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수도 있다. 바이러스 벡터를 위한 형질도입 마커가 당 분야에 알려져 있으며, 약물 내성을 부여할 수 있는 선택 마커, 또는 검출가능한 마커, 예컨대 형광 마커, 또는 유동세포계수법 같은 방법에 의해 검출할 수 있는 세포 표면 단백질을 포함한다. 특별한 구체예에서, 바이러스 벡터는 녹색 형광 단백질, 인간 CD2의 세포외 도메인 또는 트렁케이트(truncated) 인간 EGFR (huEGFRt; Wang et al., Blood 118:1255, 2011)을 포함하는 형질도입을 위한 유전자 마커를 추가로 포함한다. 바이러스 벡터 게놈이 별도 전사물로서 숙주세포에서 발현될 다수의 핵산 서열을 포함하는 경우, 바이러스 벡터는 또한 바이시스트론(bicistron) 또는 멀티시스트론 발현을 허용하는 2개(또는 그 이상) 전사물 사이에 추가의 서열을 또한 포함할 수 있다. 바이러스 벡터에 사용된 이러한 서열의 예는 내부 리보솜 도입 부위(IRES), 퓨린 절단 부위, 바이러스 2A 펩티드 또는 이들의 조합을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드 전달에 다른 벡터, 예를 들어 아데노바이러스-기반 벡터 및 아데노-관련 바이러스(AAV)-기반 벡터를 포함하는 DNA 바이러스 벡터; 앰플리콘 벡터, 복제-결함 HSV 및 약독화된 HSV를 포함하는 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)로부터 유래된 벡터를 사용할 수 있다(Krisky et al., Gene Ther. 5:1517-1998).
유전자 치료요법을 위해 최근 개발된 다른 벡터들 또한 본 발명의 조성물과 방법에 사용할 수 있다. 이러한 벡터는 바큘로바이러스와 α-바이러스(Jolly, D J. 1999. Emerging Viral Vectors. pp 209-40 in Friedmann T. ed. The Development of Human Gene Therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab) 또는 플라스미드 벡터 (예컨대 슬리핑 뷰티 또는 다른 전이인자(transposon) 벡터)로부터 유도된 것들을 포함한다. 일부 구체예에서, 바이러스 또는 플라스미드 벡터는 형질도입을 위한 유전자 마커(예를 들어, 녹색 형광 단백질, huEGFRt)를 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 조혈기원세포 또는 배아줄기세포는 변성되어 본 발명의 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 코딩하는 비내인성 핵산 분자를 포함한다. 조혈기원세포는 흉선세포 기원세포 또는 유도된 만능줄기세포를 포함할 수 있고, 이것은 태아 간 조직, 골수, 제대혈 또는 말초혈액으로부터 유도되거나 기원할 수 있다. 조혈기원세포는 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유동물에서 유래할 수 있다. 특별한 구체예에서, CD24loLin-CD117+ 흉선세포 기원세포가 사용된다.
특정 구체예에서, 배양 조건은 본 발명의 융합 단백질을 발현하는 조혈기원세포를 증식 또는 분화를 유도하기 위한 충분한 시간동안 배양하는 것을 포함한다. 세포는 배양에서 일반적으로 약 3 일 내지 약 5 일, 또는 약 4 내지 약 10 일, 또는 약 5 내지 약 20 일 동안 유지된다. 세포는 목적하는 결과, 즉 목적하는 세포 조성 또는 증식의 정도를 얻는데 필요한 적절한 시간동안 유지될 수 있다. 예를 들어, 주로 미성숙 및 불활성화 T 세포를 포함하는 세포 조성물을 생성하기 위해서는 세포를 배양에서 약 5 내지 약 20일 동안 유지할 수 있다. 주로 성숙 T 세포를 포함하는 세포 조성물을 생성하기 위해서는 세포를 배양에서 약 20 내지 약 30일 동안 유지할 수 있다. 비부착 세포는 또한 배양으로부터 다양한 시점, 예컨대 약 수 일 내지 약 25 일까지 수집할 수 있다. 특정 구체예에서, 조혈줄기세포는 스트로마(stromal) 세포주에서 동시배양된다(미국특허 제7,575,925호; Schmitt et al., Nat. Immunol. 5:410, 2004; Schmitt et al., Immunity 17:749, 2002).
조혈기원세포의 발생상 제한(commitment) 또는 분화를 증진하는 하나 이상의 사이토카인을 배양에 첨가할 수 있다. 사이토카인은 인간 또는 비인간일 수 있다. 사용가능한 사이토카인의 대표적인 예는 FGF 부류의 모든 멤버, 예를 들어 FGF-4 및 FGF-2; Flt-3-리간드, 줄기세포인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), 및 IL-7을 포함한다. 사이토카인은 글리코사미노글리칸, 예컨대 헤파린 설페이트와 조합하여 사용할 수 있다.
일부 구체예에서, 세포 표면상에서 본 발명의 융합 단백질을 발현할 수 있는 세포는 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유동물로부터 유래하는 일차 세포 또는 세포주를 포함하는 T 세포이다. 포유동물로부터 수득되는 경우, T 세포는 혈액, 골수, 림프절, 흉선 또는 기타 조직 또는 체액를 포함하는 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. T 세포는 강화되거나 정제될 수 있다. T 세포주는 당분야에서 공지되어 있고, 이들 중 일부는 문헌, Sandberg et al., Leukemia 21:230, 2000에 기재되어 있다. 특정 구체예에서는, TCRα 및 β 사슬의 내인성 발현이 결여된 T 세포가 사용된다. 이러한 T 세포는 TCRα 및 β 사슬의 내인성 발현을 자연적으로 결여하거나, 발현(예를 들어, TCRα 및 β 사슬를 발현하지 않는 형질전환 마우스로부터의 T 세포, 또는 TCRα 및 β 사슬의 발현을 억제하기 위해 조작된 세포)을 차단하거나 TCRα 사슬, TCRβ 사슬, 또는 양 유전자를 넉아웃(knockout)하기 위해 변성될 수 있다. 특정 구체예에서, 세포 표면상에서 본 발명의 융합 단백질을 발현할 수 있는 세포는 T 세포 또는 T 세포 계통의 세포가 아니라, 기원세포(전구세포)인 세포, 줄기 세포 또는 세포 표면 항-CD3를 발현하기 위해 변성된 세포이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하기 위해 형질감염된 숙주 T 세포는 기능성 T 세포, 예컨대 바이러스 특이적 T 세포, 종양 항원 특이적 세포독성 T 세포, 나이브(naive) T 세포, 기억 줄기 T 세포, 중추 또는 이펙터 메모리 T 세포, 또는 CD4+ CD25+ 조절 T 세포이다.
본 발명의 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 T 세포의 증식을 증진하는 하나 이상의 성장인자 사이토카인을 배양에 첨가할 수 있다. 사이토카인은 인간 또는 비인간일 수 있다. T 세포 증식을 증진하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 성장인자 사이토카인은 IL2, IL15 등을 포함한다.
사용
본 발명에 기술된 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 세포로 치료될 수 있는 질환은 암, 감염 질환 (바이러스, 박테리아, 원생동물 감염), 면역 질환 (예를 들어, 자가면역), 또는 노화 관련 질환 (예를 들어, 노쇠)을 포함한다. 입양면역과 유전자 요법은 다양한 유형의 암(Morgan et al., Science 314:126, 2006; Schmitt et al., Hum. Gene Ther . 20:1240, 2009; June, J. Clin . Invest. 117:1466, 2007) 및 감염 질환 (Kitchen et al., PLoS One 4:38208, 2009; Rossi et al., Nat. Biotechnol. 25:1444, 2007; Zhang et al., PLoS Pathog . 6:e1001018, 2010; Luo et al., J. Mol. Med. 89:903, 2011)에 대한 유망한 치료방법이다.
고형 종양 및 백혈병을 포함하는 광범위한 암은 본원에 기재된 조성물과 방법으로 처리할 수 있다. 치료될 수 있는 암의 종류는 유방, 전립선 및 결장의 선암; 폐의 기관지원성 암의 모든 형태; 골수종; 흑색종; 간장암; 신경아세포종; 유두종; 아푸도마; 분리종; 새열종; 악성 카르시노이드 증후군; 카르시노이드 심장 질환; 및 암종(예를 들면, 워커, 기저 세포, 기저편평성, 브라운-피어스, 도관, 에를리히 종양, 크렙 2, 메르켈 세포, 점액소, 비-소세포 폐, 구리 세포, 유두, 경섬유질, 세기관지, 기관지원성, 편평 세포 및 이행 세포)을 포함한다. 치료될 수 있는 추가 유형의 암은 조직구 장애; 백혈병; 악성 조직구증가; 호지킨 질환; 면역증식성 소장; 비-호지킨 림프종; 형질세포종, 세망내피종; 흑색종; 연골아세포종; 연골종; 연골육종; 섬유종; 섬유육종; 거대세포 종양; 조직구종; 지방종, 지방육종; 중피종; 점액종; 점액육종; 골종; 골육종; 척색종, 두개인두종; 미분화세포종; 과오종; 간엽종; 중신종; 근육종; 에나멜상피종; 백악질종; 치아종; 기형종; 흉선종; 융모 상피종을 포함한다. 추가로, 다음과 같은 종류의 암이 또한 치료로 처리할 수 있는 것으로 고려된다: 선종; 담관암; 진주종; 원주종; 낭종암; 낭선종; 과립막 세포 종양; 음양모세포종; 간암; 한선종; 섬 세포 종양; 라이디히(Leydig) 세포 종양; 유두종; 세르톨리 세포 종양; 난모막 세포 종양; 자궁근종; 자궁육종; 근아세포종; 근종; 근육종; 횡문근종; 횡문육종; 상의세포종; 신경절세포종; 신경교종; 수모세포종; 뇌수막종; 신경집종; 신경아세포종; 신경상피종; 신경섬유종; 신경종; 부신경절종; 부신경절종 비-크로마핀. 치료될 수 있는 암의 유형은 또한 피각혈관종; 호산구 증가증을 갖는 혈관림프양 증식; 혈관 경화증; 혈관종; 사구맥관종; 혈관내피종; 혈관종; 혈관주위세포종; 혈관육종; 림프관종; 림프관근종; 림프관육종; 송과체종; 암육종; 연골육종; 엽상 낭육종; 섬유육종; 혈관육종; 평활근육종; 백혈육종; 지방육종; 림프관육종; 근육종; 점액육종; 난소 암종; 횡문근육종; 육종; 신생물; 신경섬유종증 및 자궁경부 이형상피증을 포함한다.
Key-ChEM 또는 T-ChARM 요법으로 처리될 수 있는 다양한 과증식성 장애의 예는 B 세포 림프종을 포함하는 B-세포 암(예를 들어, 다양한 형태의 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종(NHL) 또는 중추신경계 림프종), 백혈병(예를 들면, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발 세포 백혈병 및 만성 근아세포 백혈병) 및 골수종(예를 들어, 다발성 골수종)이다. 추가의 B 세포 암은 작은 림프구성 림프종, B 세포 프로림프구성 백혈병, 림프구형질세포 림프종, 비장 대역 림프종, 형질 세포성 골수종, 골의 고립성 형질세포종, 골외 형질세포종, 점막-관련(MALT) 림프 조직의 외절성 대역 B-세포 림프종, 결절성 대역 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 외피 세포 림프종, 분산 거대 B-세포 림프종, 종격(흉선) 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, 원발성 삼출액 림프종, 버킷 림프종/백혈병, 불확실 악성 가능성의 B-세포 증식, 림파선 육아종증 및 이식후 림프증식성 장애를 포함한다.
염증 및 자가면역 질환은 관절염, 류마티스성 관절염, 청소년 류마티스성 관절염, 골관절염, 다발연골염, 건선성 관절염, 건선, 피부염, 다발성근염/피부근염, 봉입체 근염, 염증성 근육염, 독성 표피 괴사증, 전신성 경피증 및 경화증, CREST 증후군, 염증성 장 질환과 관련된 반응, 크론병, 궤양성 대장염, 호흡 곤란 증후군, 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS), 수막염, 뇌염, 포도막염, 대장염, 사구체신염, 알레르기 증상, 습진, 천식, T 세포 및 만성 염증 반응의 침윤을 수반하는 증상, 아테롬성 동맥경화증, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 아급성 피부 홍반성 낭창, 원반상 루푸스, 낭창성 척추염, 루푸스 뇌염, 청소년 발병 당뇨병, 다발성 경화증, 알레르기성 뇌척수염, 시신경 척수염, 류마티스 열, 시드남 무도병, 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연된 과민증과 관련된 면역 반응, 결핵, 유육종증, 베게너 육아종증 및 처르그-스트라우스 질환을 포함하는 유육종증, 무과립구증, 혈관염(과민성 혈관염/혈관염, ANCA 및 류마티스성 혈관염을 포함), 재생불량성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA)을 포함하는 면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 적아구 무형성(PRCA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소, 백혈구 누출을 수반하는 질환, 중추신경계(CNS) 염증성 질환, 다장기 손상 증후군, 중증 근무력증, 항원-항체 복합체 매개된 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트병, 캐슬 증후군, 굿페스쳐 증후군, 랩버트-이튼 근무력 증후군, 르노(Reynaud) 증후군, 소그렌 증후군, 스티븐-존슨 증후군, 고형 기관 이식 거부, 이식편 대 숙주병(GVHD), 수포성류천포창, 천포창, 자가면역 다발성 내분비병증, 혈청반응 음성 척추 관절증, 라이터병, 스티프-맨 증후군, 거대 세포 동맥염, 면역 복합체 신염, IgA 신장병, IgM 다발성신경병 또는 IgM 매개된 신경병, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병(TTP), 헤노호-쉰라인 자반병, 자가면역 혈소판감소증, 자가면역 고환염 및 난소염을 포함하는 고환 및 난소의 자가면역 질환, 원발성 갑상선 기능저하증; 자가면역 갑상선염, 만성 갑상선염(하시모토 갑상선염), 아급성 갑상선염, 특발성 갑상선 기능저하증, 애디슨 질환, 그레이브 질환, 자가면역 다선성 증후군(또는 다선성 내분비 증후군), 인슐린 의존성 진성 당뇨병(IDDM)으로 또한 지칭되는 유형 I 당뇨병 및 쉬한 증후군을 포함하는 자가면역 내분비 질환; 자가면역 간염, 림프 간질성 폐렴(HIV), 기관지 폐색증(비-이식) 대 NSIP, 길랑-바레 증후군, 거대 혈관 혈관염(류마티스성 다발성근육통 및 거대 세포(다카야수) 관절염 포함), 중간 혈관염(가와사키 질환 및 결절성 동맥염 포함), 결절성 다발성 동맥염(PAN) 강직성 척추염, 버제 질환(IgA 신장병), 급속 진행성 사구체 신염, 원발성 담즙성 간경변, 복강 스프루(글루텐 장병증), 한랭글로불린혈증, 간염과 관련된 한랭글로불린혈증, 근위축성 측색 경화증(ALS), 관상 동맥 질환, 가족성 지중해 열, 현미경 다발혈관염, 코간 증후군, 위스코트-알드리흐 증후군 및 폐색성혈전 혈관염을 포함한다.
특별한 구체예에서, 본원에 기술된 Key-ChEM 또는 T-ChARM으로 대상을 치료하는 방법은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병을 포함한다.
감염 질환은 감염성 인자와 연관된 것들을 포함하고, 임의의 다양한 박테리아(예를 들어, 병원성 이. 콜라이(E. coli), 에스 티피무리움(S. typhimurium), 피. 아에루기노사(P. aeruginosa), 비. 안트라시스(B. anthracis), 씨. 보툴리눔(C. botulinum), 씨. 디피실(C. difficile), 씨. 퍼프린겐스(C. perfringens), 에이치. 필로리(H. pylori), 브이. 콜레라에(V. cholerae), 리스테리아 종(Listeria spp .), 리케차 종(Rickettsia spp .), 클라미디아 종(Chlamydia spp .) 등), 마이코박테리아 및 기생충(원생동물의 공지된 기생 멤버를 포함)을 포함한다. 감염성 바이러스는 진핵생물 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 분야바이러스, 헤르페스바이러스, 파포바바이러스, 파필로마바이러스(예를 들어, HPV), 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 라브도바이러스(예: 광견병), 오르토믹소바이러스(예: 인플루엔자), 폭스바이러스(예: 백시니아), 레오바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스(예: HIV), 플라비바이러스(예: HCV, HBV) 등을 포함한다. 특정 구체예에서, 항원이 MHC 부류 I 분자로 처리되어 표시되는 시토졸 병원체에 의한 감염은 본 발명의 Key-ChEM 또는 T-ChARM으로 치료된다.
본 발명의 Key-ChEM 또는 T-ChARM은 세포 결합된 형태로 대상에 투여될 수 있다(예를 들어, 표적 세포 집단(성숙 T 세포(예: CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포) 또는 T 세포 계통의 기타 세포)). 특별한 구체예에서, 대상에 투여된 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 T 세포 계통의 세포는 동계(syngeneic), 동종이계(allogeneic), 또는 자기유래 세포이다. 다른 구체예에서, Key-ChEM 또는 T-ChARM은 가용성 형태로 대상에게 투여될 수 있다. 가용성 TCR은 당분야에 공지되어 있다(예를 들어, Molloy et al., Curr . Opin . Pharmacol . 5:438, 2005; 미국특허 제6,759,243호 참조).
본 발명의 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 포함하는 약학 조성물은 의약 분야에 숙련된 사람들에 의해 결정된 치료(또는 예방)될 질환 또는 상태에 적절한 방법으로 투여할 수 있다. 조성물의 적절한 용량, 적합한 지속기간 및 투여빈도는 환자의 증상, 질환의 크기, 종류 및 중증도, 활성성분의 특정 형태 및 투여방법 등의 인자에 의해 결정될 것이다. 본 발명은 본원에 기술된 Key-ChEM 또는 T-ChARM를 발현하는 세포와 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 적합한 부형제는 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 등 및 그의 조합을 포함한다.
본 발명의 이점은 환자에게 투여된 Key-ChEM 또는 T-ChARM를 발현하는 세포가 태그 카세트에 대한 동원성 결합 파트너를 사용하여 격감될 수 있다는 것이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 태그 카세트에 특이적인 항체를 사용하거나, 태그 카세트에 특이적인 동원성 결합 파트너를 사용하거나 CAR을 발현하고 태그 카세트에 대해 특이성을 갖는 제2 T 세포를 사용하여 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 T 세포를 감쇠하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 태그 카세트는 본 발명의 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 T 세포의 면역제거(immunodepletion)를 가능하게 한다. 조작된 T 세포는 태그 카세트에 특이적인 감쇠제를 사용하여 제거할 수 있다. 예를 들어, Strep 태그가 사용되는 경우, 이후 세포 독성시약(예컨대 독소, 라디오메탈)에 각각 융합되거나 컨쥬게이트된 항-Strep 태그 항체, 항-Strep 태그 scFv, 또는 스트렙탁틴이 사용되거나 항-Strep 태그 /항-CD3 이중특이적 scFv, 또는 항-Strep 태그 CAR T 세포가 사용될 수 있다.
다른 특정 구체예에서, 본 발명의 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 세포를 태그 카세트에 대해 특이성을 갖는 항체(예를 들어, 항-태그 항체)에 결합하거나, 태그 카세트와 특이적으로 결합하는 다른 단백질(예를 들어, Strep 태그에 결합하는 스트렙탁틴)에 의해 동정, 소팅, 강화 또는 단리할 수 있으며, 이것은 비즈, 세포 배양 플레이트, 아가로스 또는 다른 고체 표면 매트릭스에 컨쥬게이트된다. 특정 구체예에서, 이러한 세포는 친화성 컬럼을 사용하여 소팅, 강화 또는 단리된다.
특정 구체예에서, 본 발명은 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 비자연적 또는 재조합 T 세포를 태그 카세트에 특이적이고 고형 표면에 부착되거나 생체적합성 매트릭스(예를 들어, 알기네이트, 기저막 매트릭스(Matrigel®), 생체폴리머)의 일부인 결합 도메인과 접촉시켜서 T 세포를 선택적으로 활성화하는 방법을 제공한다. 재조합 T 세포는 본 발명의 Key-ChEM 또는 T-ChARM 융합 단백질을 코딩하는 외인성 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 T 세포는 태그 카세트에 특이적인 동원성 결합 파트너(예를 들어, 항체)로 코팅되거나 컨쥬게이트된 비즈로 활성화될 수 있다. 예를 들어, 태그 카세트가 Strep 태그이면, 이후 스트렙탁틴 코팅 비즈 또는 항-Strep 태그 항체 컨쥬게이트 비즈를 사용하여 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. 특정 구체예에서, 방법은 본 발명의 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 생체 외 재조합 T 세포를 활성화하는 것을 포함하고, 경우에 따라 추가로 키메릭 항원 리셉터 (CAR)를 발현하는 것이다. 이러한 활성화된 T 세포는 본원에 기술된 질환 치료방법에서 유용하다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 Key-ChEM 또는 T-ChARM를 발현하는 재조합 T 세포의 증식을 선택적으로 증진하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 방법은 태그 결합 파트너, 예컨대 항체를 사용하여 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 T 세포의 선택적 생체외 증식을 포함한다. 추가 구체예에서, 방법은 태그 결합 파트너, 예컨대 항체로 기능성 T 세포(예를 들어, 바이러스-특이적, TAA (종양-관련 항원) 특이적 CTL, 또는 특이적 T 세포 서브세트, 예컨대 나이브 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 중추 또는 이펙터 메모리 T 세포, CD4+ CD25+ 조절 T 세포)를 증식하는 것을 포함하며, 이것은 임의로 동시자극 분자 결합 파트너(예컨대, 항-CD27 또는 항CD28 항체) 존재하에 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 항-태그 결합 파트너는 Key-ChEM (예를 들어, Wnt 또는 Notch Key-ChEM) 형질도입 조혈줄기세포, 배아줄기세포, 또는 조직줄기세포(예를 들어, 신경줄기세포)를 활성화하기 위해 사용되어 치료 용도를 위한 하나 이상의 목적하는 표현형으로 자가분열, 증식 또는 분화할 수 있다.
다른 추가 구체예에서, 임의의 Key-ChEM 또는 T-ChARM은 본 발명의 Key-ChEM 또는 T-ChARM를 발현할 때 생체내 T 세포 증식의 선택적 증진을 가능하게 한다. 특정 구체예에서, 태그 카세트를 포함하는 CAR을 발현하는 T 세포는 리간드(예를 들어, T 세포 억제자 세포 리간드 PD-L1, PD-L2 포함)를 발현하는 세포를 접촉할 때 생체내에서 CAR T 세포의 증폭(expansion)을 가능하게 한다. 이렇게 증폭된 T 세포는 본원에 기술된 질환 치료방법에서 유용하다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 세포의 증식 또는 증폭은 생체내에서 유도되며, 이것은 태그 카세트 결합 파트너(예컨대 항-태그 항체) 및 경우에 따라 동시자극 분자 결합 파트너(예컨대, 항-CD27 또는 항CD28 항체)로 유도될 수 있다.
특정한 추가 구체예에서, 본원에 기술된 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 세포는 생체내, 예컨대 종양 부위에서 활성화된다. 예를 들어, 태그 카세트 결합 파트너(예컨대 항-태그 항체) 및 동시자극 분자 결합 파트너(예컨대, 항-CD27 또는 항CD28 항체)를 포함하는 조성물(예를 들어, 알기네이트, 기저막 매트릭스 (Matrigel®), 생체폴리머, 또는 다른 매트릭스) 또는 담체(예를 들어, 마이크로비드, 나노입자, 또는 다른 고체 표면)는 종양 부위(예를 들어, 고형 종양)에서 본원에 기술된 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 T 세포를 국소적으로 활성화하는데 사용할 수 있다.
특정 구체예에서, Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 재조합 세포는 태그 카세트에 대한 특이성으로 결합하는 항체(예를 들어, 항-태그 항체)를 사용하거나 태그 카세트 서열과 특이적으로 결합하는 다른 동원성 결합 단백질에 의해 생체 내에서 검출 또는 트래킹될 수 있으며, 태그 카세트의 결합 파트너는 형광염료, 방사능 트레이서, 산화철 나노입자 또는, X-선, CT-스캔, MRI-스캔, PET-스캔, 초음파, 유동세포분석법, 근적외선 이미지화 시스템, 또는 다른 이미지화 방법에 의한 검출 분야에서 알려진 다른 이미지화제와 컨쥬게이트된다(예를 들어, Yu et al., Theranostics 2:3, 2012 참조).
추가 구체예에서, 본 발명의 Key-ChEM 또는 T-ChARM을 발현하는 세포는 진단방법 또는 이미지화 방법, 예를 들어 본원에 기재된 징후 또는 증상과 관련하여 사용된 방법에 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1
KEY-키메릭 이펙터 분자 (Key-ChEM)와 태그된 키메릭 항원 리셉터 분자 (T-ChARMS), 및 그의 유도체
하나 이상의 친화성 태그 카세트를 함유하는 예시적인 키메릭 융합 단백질을 도 1에 나타내었다. 태그 카세트는 일반적으로 작고(즉, 최소 면역원성 또는 비면역원성) 숙주 또는 숙주세포에 내인성인 어떤 분자와도 연합 또는 결합하지 않는다. 태그는 특히 이종 동원성 리셉터 (예를 들어, 리간드, 항체, 또는 다른 결합 파트너)와 결합하는데, 이런 결합은 키메릭 이펙터 분자(ChEMs)가, 다양한 세포 경로 중 어떤 것이나 접근 및 조작(즉, 활성화 또는 비활성화 또는 조절)하는 상황에서 "key"(여기에서 Key-ChEMs라고 명명되는)로서 사용될 수 있다. 이처럼 태그된 키메릭 융합 단백질들은 나아가 특정한 표적(예를 들어, 종양 항원)에 대해서 특이적인 결합 도메인을 구성할 수 있다. 예를 들어, 태그된 키메릭 융합 단백질들(여기에서 T-ChARMs라고 명명되는)은 키메릭 항원 리셉터 분자를 포함한다.
Key-ChEM (도 1 A)을 코딩하는 예시적인 핵산 분자는 이하의 요소(5'에서 3'로), 즉 Strep tag® II(서열번호 1에 기재된 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys 펩티드를 코딩하는 서열번호 38), 링커 모듈(서열번호 11에 기재된 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 펩티드를 코딩하는 서열번호 42)을 포함하는 커넥터 부분과 변형된 IgG4 힌지(서열번호 15에 기재된 Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro를 코딩하는 서열번호 27), CD28 막관통 도메인 (서열 번호 16에 기재된 펩티드를 코딩하는 서열번호 27), 및 4-1BB 부분(서열 번호 17에 기재된 펩티드를 코딩하는 서열번호 29) 및 CD3ξ (서열번호 18에 기재된 펩티드를 코딩하는 서열번호 30; Kowolik et al, Cancer Res.66: 10995, 2006) 부분을 을 포함하는 세포 내 성분 이펙터 도메인을 포함한다. 이 핵산 분자를 코딩하는 Key-ChEM (싱글 태그)는 Yam et al. (Mol. Ther. 5:479, 2002) 및 Wang et al. (Blood 118: 1255, 2011)에서 설명되었듯이 렌티바이러스 벡터 내로 복제되었다.
epHIV7 렌티바이러스 벡터는 pHIV7 벡터에서 pHIV7의 시토메갈로바이러스의 프로모터를 EF-1 프로모터(Wang et al., 20\ \; Yam et al., 2002)로 치환함에 따라 유도되었다. 렌티바이러스 벡터는 또한 세포 외 N-터미널 리간드 결합 도메인 및 세포 내 리셉터 티로신 키나제 활성은 전혀 없고 원래부터 존재한(native) 아미노산 서열, 제 I 타입 막관통 세포 표면의 부위(localization) 및 항-EGFR 모노클로날 항체, 세툭시맙 (Wang et al., 2011)에 대한 형태적으로 온전한 결합 에피토프를 보유하는, 축약된 인간 EGFR 폴리펩티드(huEGFRt)를 코딩하기도 한다. 렌티바이러스 벡터는 Key-ChEM 및 자가 절단 T2A 서열(Szymczak et al., Nat. Biotechnol. 22:589, 2004)를 사용하여 분리된 huEGFRt를 대등하게(coordinately) 발현하는데, 이 때의 huEGFRt는 면역 자기성 마이크로비즈를 사용하여 항-바이오틴과 함께 접합되어 있는 바이오티닐화된 세툭시맙의 대체적인 선택 에피토프(alternative selection epitope)로서의 역할을 한다.
T-ChARM (도 IE)를 코딩하는 예시적인 핵산 분자는 이하의 요소들: CD19-specific FMC63 모노클로날 항체의 VH 및 VL 유전자 단편을 포함하는 scFv (서열번호 36; Wang et al, 2011), Strep tag® II (서열번호 1에 기재된 펩티드 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys를 코딩하는 서열번호 38), 링커 모듈을 포함하는 커넥터 영역 (서열번호 11에 기재된 펩티드(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2를 코딩하는 서열번호 39, 40, 또는 41) 및 IgG4 힌지 (서열번호27), CD28 막관통성 도메인 (서열번호 28), 및 4-1BB 부분(portion)을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 세포 내 성분 (서열번호29) 및 CD3ξ 영역(서열번호30)을 포함한다. 예시적인 두 개의 태그(T-ChARM2)를 포함하는 T-ChARM은 첫 번째 및 두 번째 Strep 태그 사이의 두 번째 링커 모듈(서열번호 12에 기재된 펩티드 (Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser를 코딩하는)이 포함됨에 따라 단일 태그 T-ChARM (T-ChARM1)과의 차이가 있다. 세 개의 태그(T-ChARM3)를 포함하는 예시적인 T-ChARM은 두 번째와 세 번째 Strep 태그 사이에 세 번째 링커 모듈 (서열번호 11에 기재된 펩티드(Gly-Gly-Gly-Gly- Ser)2를 코딩하는)이 포함됨에 따라 이중 태그 T-ChARM과의 차이가 있다. 특정 구체예에서, scFv는 VH 및 VL 영역(regions) of the ROR1 -specific R12 모노클로날 항체 (Yang et al., PLoS One 6:e21018, 2011) 서열번호 57에 기재된) 및 서열번호 13에 기재된, 가변적인 도메인 링커를 포함한다. 추가적으로, 항-CD19 및 항-RORl T-ChARMs 둘 다는 4-1BB 부분(portion)의 자리에서 CD28 부분 (서열번호 35)를 포함하는 세포 내 성분 이펙터 도메인으로 (서열번호 35) 대체되어 구성되었다.
특정 구체예에서, 이하에서 묘사된 어떤 융합 단백질이든, 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지, 세포 외 scFv 또는 scTCR 결합 도메인, 태그 카세트, IgG 힌지를 포함하는 커넥터 영역, 막관통성 도메인, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포 내 성분을 포함한다. 일부 구체예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB 및 CD3ζ, CD27 및 CD3ξ, CD28 및 CD3ξ, OX40 및 CD3ξ, OX40, 4-1BB 및 CD3ζ, 또는 CD28, OX40 및 CD3ζ 쌍을 포함한다. 본원에 정의된 바와 같이, 이러한 분자 중 어떤 것의 이펙터 도메인이든지, 전체 세포 내 부분(portion) 또는 선택된 분자의 이펙터 부분(portion)을 포함할 수 있다.
T-ChARM(N1ChARM; 도 IF; 서열번호 58)을 코딩하는, N-터미널 태그를 보유하는 예시적인 핵산 분자는 이하의 요소들, 즉 분비 신호 서열(분비 신호 서열)(단백질로부터 분리된 서열번호 47에 기재된 펩티드 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP를 코딩하는 서열번호 63), 아스파라긴 접합 아미노산, Strep tag® II (서열번호 1에 기재된 펩티드 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys를 코딩하는 서열번호 38), 링커 모듈(서열번호 1에 기재된 펩티드 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2를 코딩하는 서열번호 11), CD19-특이성 FMC63 모노클로날 항체 (서열번호 36; Wang et al, 2011)의 VH 및 VL 유전자 조각의 scFv, IgG4 힌지 (서열번호 27), CD28 막관통 도메인 (서열번호 28), 및 4-1BB 부분(서열번호 29) 및 CD3ξ 부분(서열번호 30)을 포함하는 세포 내 성분 이펙터 도메인을 포함한다.
T-ChARM을 코딩하고 가변영역 링커에 박힌 태그를 가지는 예시적인 핵산 분자(Ct1ARM; 도 1G; 서열번호59)는 이하의 요소들, 즉 분비 신호 서열(secretory signal sequence) (단백질로부터 분리된 서열번호 47에 기재된 펩티드 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP를 코딩하는 서열번호 63), CD19-특이성 FMC63 모노클로날 항체(아미노산 서열를 서열번호 51에 기재된 코딩하는)의 VH 유전자 조각, 제1 링커 모듈 (서열번호 65에 기재된 펩티드 Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly를 코딩하는), 아스파라긴 접합 아미노산, Strep tag® II (서열번호 1에 기재된 펩티드 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys를 코딩하는 서열번호 38), 두 번째 링커 모듈 (서열번호 66에 기재된 펩티드 Gly-Ser-Gly-Ser-Gly를 코딩하는), CD19-특이성 FMC63 모노클로날 항체 (서열번호 52에 기재된 아미노산 서열를 코딩하는)의 VL 유전자 조각, IgG4 힌지 (서열번호 27), CD28 막관통 도메인 (서열번호 28), 및 4-1BB 부분(서열번호29) 및 CD3ξ 부분 (서열번호30)을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 세포 내 성분 등을 포함한다.
예시적인 T-ChARM(예를 들어, 단독, 이중 또는 삼중 태그된, N-터미널에 태그된, 태그가 박혀있는, 제시된 scFvs) 각각을 코딩하는 핵산 분자는, Yam et al. (Mol. Ther. 5:479, 2002)에서도 묘사되어 있듯이, 개별적으로 epHIV7 렌티바이러스 벡터에 복제되어, 이 예시에서 묘사된 대로 이 T 세포를 형질변환하는 데에 사용되었다. 특정 구체예에서, 즉각적인 노출 부분(disclosure)의 Key-ChARMS을 암호화하는 핵산 분자는 epHIV7 렌티바이러스 벡터 내에서 복제되기 전에 코돈에 최적화(codon optimized)되었다. T-ChARM-암호화 렌티바이러스 상청액은, 293T 세포에서 Calphos 트렌스펙션 시약(Clontech, Mountain View, CA)을 사용하여 각각의 렌티바이러스 벡터 플라즈마와 pCHGP-2, pCMV-Rev2 및 pCMV-G 패키징 벡터와 함께 트랜스펙트되어서 생성되었다. 배지은 트렌스펙션 16시간 후에 바꿔 주었고, 렌티바이러스는 24, 48, 및 72시간 후에 수집되었다.
실시예 2
재조합 T 세포의 생성 및 T-CHARMS의 발현
CD8+ 및 CD4+는 CD8+/CD4+ T 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 정상적인 기증자의 PBMC에서 분리되어, 제조사의 지시사항에 따라서 항-CD3/CD28 비즈 (Life Technologies)로 활성화되어, 32°C에서 45분간 2,100 rpm으로 원심 분리되어 활성화된 3일 차 이후에 0.8 μg/mL 폴리브렌 (Millipore, Bedford, MA)이 보충된 렌티바이러스의 상청액(각각의 예시에 나와있듯이) (MOI = 3)으로 보충되었다. T 세포는 RPMI에서, 매 48시간 마다 재조합 인간 (rh) IL-2 로 보충되어 최종 농도를 50 U/mL로 맞춘 10% 인간 세럼, 2 mM L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (CTL 배지)로 확장되었다. 확장 이후에는, 각자 형질변환 된 T 세포주의 분취액이 바이오틴-컨쥬게이트된 항-EGFR 항체 및 스트렙타비딘-PE (Miltenyi, Auburn,CA)로 염색되었다. tEGFR+ T 세포는 F ACS- Aria 세포 분리기(Becton Dickinson)를 이용해서 분리되었다. tEGFR+ T 세포의 부분 집합은 그 이후에 세포:LCL 비율을 1:7로 하는, 조사된 (8,000 rad) CD19+ B-LCL을 사용하여 자극되었고 이는 CTL 배지에서 매 48시간 마다 50 U/mL rh IL-2를 첨가하거나, R12 T-ChARMs를 위한 급격한 확장 프로토콜을 사용하는 (Riddell and Greenberg, J. Immunol. Methods 725: 189, 1990) 방법으로 8일 간 확장되었다.
이하의 컨쥬게이트된 항체: CD4, CD8, CD25, CD137, CD45, 아넥신 V, CD62L, CD27, CD28 (BD Biosciences), 항-Streptag II 항체 (Genscript), EGFR 항체 (ImClone Systems Incorporated, Branchburg, NX); 스트렙타비딘-PE (BD Biosciences, San Jose, CA)가 유동계수 혈구 계산 표현형 및 분석을 위해서 사용되었다. 프로피듐 오요다이드 (PI, BD Biosciences)를 사용한 염색을 생/사 세포를 구분하기 위해 제조자에 의해 지시된 것처럼 수행하였다. 유동 분석은 FACS Canto II로 실시되었고, 소팅-정제는 FACS Ariall (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)로 실시되었으며, 자료의 분석은 Flow Jo software (Treestar, Ashland, OR)를 사용하여 이루어졌다.
T-ChARMs의 세포 표면 발현을 조사하기 위해서, 형질변환된 T 세포가 EGFRt 발현을 위해서 소팅되었고, 형광색소로 라벨링된 항-Streptag mAb를 사용하여 염색되었다. EGFR 염색의 평균 형광색소 농도(MFI)는 각각의 T-ChARMS와 CD19-짧은 CAR로 형질전환된 T 세포의 경우에서와 유사한 정도로 나타났고, 이는 CAR에 태그를 접하게 하는 것이 전이 유전자의 발현을 간섭하지 않음을 의미한다(도 21). 항-Streptag mAbfp 특이 염색된, 다양한 T-ChARMs로 형질전환된 T 세포는, 각 ChARM에서의 위치나 태그 서열의 숫자와 독립적이다. 항-Streptag 염색의 MFI는 T-ChARM1의 경우보다 T-ChARM2 및 T-ChARM3로 형질전환된 T 세포의 경우에 더 높았고, 각각의 T-ChARM2 및 T-ChARM3가 항체-형광 색소 컨쥬게이트와 결합할 수 있는 자리가 더 많기 때문일 것이다(도 21).
실시예 3
T-CHARMS를 발현하는 T 세포의 세포용해 활성
CD8+ 벌크 T 세포의, 항-CD19 (scFv) T-ChARM1, T-ChARM2, 또는 T-ChARM3를 발현시키도록 조작되는 생체 내 이펙터 기능은, 크롬 방출 분석에서 각기 다른 길이의 커넥터 영역 - 각각 IgG4 힌지(단길이)만, IgG4 CH3 및 힌지 (중간 길이), 및 IgG4 CH2CH3 및 힌지(장 길이)- 을 포함하는 항-CD19 CARs를 발현하기 위해서 조작되는 이펙터 기능과 비교된다. 간단하게 말하면, 표적 세포는 51Cr (PerkinElmer, Norwalk, CT)로 밤새 라벨링되었고, 세척되었고, 삼중으로 1-2 x 103 세포 수/웰 이펙터 T 세포와 함께 다양한 이펙터 대 표적 비율 (E:T)로 배양되었다. 4 시간 동안 배양한 후에 γ-계수를 위해서 상청액이 획득되었고, 특이적 세포 용해를 계산하기 위해 기준이 되는 형식을 사용했다. 사용된 표적 세포는 Raji/RORl(자연적으로 CD19+, 관련 없는 항원 ROR1을 발현하기 위해서 형질변환된) 및 K562/CD19 (CD19를 발현하기 위해 형질변환된 것)으로, 음성 대조군으로서 K562/ROR1 (자연적으로 CD19+, 관련 없는 항원 ROR1을 발현하기 위해서 형질변환된)이 사용되었고, LCL-OKT3 세포(항-CD3 세포 표면을 발현하도록 형질전환된)이 양성 대조군으로 사용되었다. 막 결합된 항-CD3 scFv (LCL-OKT3)를 발현하기 위해서 조작되는 림프구 모양 세포주 (LCL)는, T 세포주의 최대한의 잠재적인 활성의 기준 표준으로 사용되었는데, 이는 이렇게 OKT3를 발현하는 세포가 CD3 복합체와 결합함으로써 T 세포를 활성화하기 때문이다.
각기 다른 항-CD19 T-ChARM 및 CAR 구성물을 발현하는 T 세포는 K562/ROR1 세포(도 2C)에 세포 독성이 있는 것은 아니었지만, LCL/OKT3 세포 (도 2D)를 발현하는 항-CD3가 존재하는 경우에는 세포 용해되도록 활성화되었다. 이와 더불어, T-ChARM 및 CAR 발현 T 세포가 CD19+, Raji 세포 (도 2B) 및 K562/CD19 (도 2A)에 대해서 특이적인 세포 용해 활성을 수여하였다. 태그가 T-ChARM (N1 ChARM)의 아미노-말단에 위치하거나 scFv (VH-tag-VL; ChJARM)에 박혀있는 경우에도 유사한 결과가 나왔다(도 22 참조). 또한, 세포 용해의 효율성은 이펙터 도메인 (4-1BB가 아닌 CD28; 도 23A 참조), 결합 도메인 (항-CD19가 아닌 항-RORl; 도 23B 참조), 사용된 태그(도 32는 Myc이 ChARM를 태그한 경우의 세포 용해를 보여준다)에 의해서 영향을 받지 않았다. T-ChARM 발현 세포는 짧은, 중간 및 긴 IgG4 Fc 스페이서를 포함하는 CARs과 마찬가지로, 종양 세포를 효율적으로 죽였다.
실시예 4
K562 세포와 함께 배양된 T-CHARMS을 발현하는 T 세포에 의한 사이토카인 방출
사이토카인 분비에 대한 분석을 위해서, 이펙터 (E) 세포 (항-CD19 T-ChARMs 및 CARs를 발현하는 T 세포) 및 표적 (T) 세포 (K562/CD19 및 K562/ROR1, 음성 대조군) 4:1의 E:T 비율하에 삼중으로 함께 24 시간 동안 배양한 후, GM-CSF, IFN-γ,IL-2 및 TNF-α의 농도를 알아내기 위해서 상청액을 다중 사이토카인 면역 분석(Luminex®)을 사용하여 측정했다.
이러한 결과(도 3)는 짧은 커넥터 영역과 함께 항-CD19 CAR을 발현하는 세포들은 표적 세포와 접할 후에, 중간 수준 또는 긴 커넥터 영역을 가지는 항-CD19 CAR을 발현하는 T 세포의 경우보다 훨씬 더 많은 양의 사이토카인을 생성함을 나타낸다. 항-CD19 T-ChARM 발현 세포에서 비슷한 패턴이 관찰되었는데, 각각 두 개, 혹은 세 개의 태그를 가지는 T-ChARM2 또는 T-ChARM3 세포보다, 더 짧은 링커 또는 하나의 태그를 가지는 T-ChARM (도 3A)가 표적 세포와 접한 후에 더 많은 양의 사이토카인을 방출하였다. 생성된 사이토카인의 농도는 항-CD19 T-ChARM 및 항-CD19 CAR 세포에서와 비슷한 수준이었으나, CAR을 발현하는 세포보다 T-ChARM을 발현하는 세포들이 확연히 더 높은 농도의 IFN-γ 생성을 유도했다. 도 3B 및 3E는 CD19를 발현하지 않는 K562 세포에서는 사이토카인 생성이 유도되지 않았음을 나타낸다. 도 3C 및 3F는 양성 대조군, 즉 PMA / 이노마이신 자극에 따라 도출되는 결과를 나타낸다. N1ChARM 및 Ch1ARM 구성의 경우에도 유사한 결과가 관찰되었다(도 24 참조) 추가적으로, 항-CD19 ChARM로 형질변환된 사이토카인 생성과 T 세포의 증식의 계층(hierchy)은 ChARM(도 25)에서 사용된 동시에 자극되는 도메인(4-1BB 또는 CD28)과 독립적이다.
실시예 5
RAJI B 세포 림프종 세포와 함께 배양된(co-cultured), T-CHARM 분자를 발현하는 T 세포에 의한 사이토카인 방출
다양한 항-CD19 T-ChARMs 또는 CARs을 발현하는 T 세포는 CD19+ Raji 세포와 24시간 동안 함께 배양되었고, 이 상청액이 다중 사이토카인 분석기(Luminex®)로 분석되었다. 사이토카인 분비를 분석하기 위해서, 이펙터 (E) 세포 (항-CD19 T-ChARMs 및 CARs를 발현하는 T 세포) 및 표적 (T) 세포 (Raji)가 삼중으로 E:T 비율을 2:1로 하여 함께 24시간 동안 배양되었고, 그 상청액이 GM-CSF, IFN-γ, IL-2, 및 TNF-α의 농도에 대해 다중 사이토카인 면역 분석기(Luminex®)를 사용하여 분석되었다.
결과에 따르면 1, 2 또는 3 태그 카세트와 함께 항-CD19 T-ChARMs를 발현하는 T 세포는, 종래 항-CD19 CARs (도 4B) 중 하나를 발현하는 T 세포와 비교하였을 때, Raji 세포 (도 4A)와 함께 배양되었을 때 훨씬 더 높은 농도의 IFN-γ 및 GM-CSF를 생성하였음을 나타낸다.
실시예 6
T-CHARM 분자를 발현하는 T 세포의 증식
세포 증식의 분석을 위해, 항-CD19 T-ChARMs 또는 CARs를 발현하는 T 세포는 0.2 μΜ 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE, Invitrogen)로 라벨링되었는데, 이는 세포 내 단백질과 결합하고 FITC 채널에서 유동세포계수법에 따라 세포들이 보일 수 있도록 한다. 라벨링 된 후에, CTL 배지에서 외인성의 사이토카인없이, 세포는 세척되고, 자극제(stimulator) 세포 비율을 4:1(K562/CD19 또는 K562/ROR1, 음성 대조군)로 하여 삼중으로 플레이팅되었다. 72시간의 배양 후에, 세포는 PI로 라벨링되었는데, 이는 분석할 때 죽은 세포를 포함하지 않기 위함이다. 샘플은 유동세포계수법과 생 CD3+ T 세포 분열로 분석되었고, 이는 CFSE 희석(예를 들어, 염색 희석은 증식의 지표가 되는데, 이는 각 세포 분열 마다 라벨링의 정도가 반절로 줄어들기 때문이다.)의 정도로 평가되었다.
분석을 위해서 3중 웰(well)을 준비하고, 생 CD8+ T 세포의 증식을 측정했다. 가장 왼쪽의 칼럼은 전체 세포 수의 전방 산란/측면 산란 플롯이고, 중간 칼럼은 CD8+ T 세포가 포함된(gated) 플롯이며, 가장 오른쪽 칼럼은 CD8+ T 세포 부분 집단에 대한 CFSE 희석 히스토그램(왼쪽으로 이동할수록 더 희석된)을 나타낸다. 가장 오른쪽 칼럼의 빨간색 피크는 세포 분열이 없었다는 것을 의미하고, 파란 피크는 ≥3, 2, 또는 1개의 세포 분열을 의미하는 척도가 되거나 각각의 히스토그램 중에서 CFSE를 희석시킨 세포의 퍼센트나, 각각 3, 2, 또는 1 보다 더 많은 세포 분열을 거친 경우를 의미한다. 히스토그램에 따르면 T-ChARM 및 CAR 발현 T 세포는 K562/CD19 세포(파란색)과 같이 배양되고 자극되기 시작한 지 72시간 내에 급격히 증식했고, 이는 음성 대조군 K562/ROR1(빨간색)에서는 나타나지 않았다(도 5). 세포 분열의 평균 숫자는 T-ChARM3 또는 ChA (장 길이) 발현 T 세포의 것과 비교했을 때 T-ChARM1 및 T-ChARM2 발현 T 세포에서 더 높았다. 이와 유사하게, 증식의 정도는 hARM (도 26)에서 사용되는 함께 자극되는 도메인 (4-1BB 또는 CD28)와 독립적으로 나타나고, ChARM (도 26)에서 이용된 태그와 독립적으로 나타난다(도 31는 Myc 태그가 이용된 경우에 같은 정도의 증식을 나타낸다).
실시예 7
분자를 발현하는 T 세포의 생체 내 양자 이송(ADOPTIVE TRANSFER)
6주에서 8주령의 암컷 NOD.CB17-Prkdcscid/J (NOD/SCID) 또는 NOD.Cg-PrkdcscidI12rg/tmlWjl/SzJ (NSG) 마우스가 Jackson Laboratory에서 획득되거나 내부에서 양육되었다. 마우스들은 정맥주사를 통해, 꼬리 정맥에 반딧불이의 루시페라아제(Raji-ffluc)로 감염된 0.5xl06 Raji 림프종 종양 세포를 투여받았고 종양의 접목은 6 일간 지속이 가능하였다. 7일 차에 마우스는 한 번의 정맥 주사(i.v.)를 맞게 되었는데, 이는 항-CD19 (scFv) T-ChARM1, T-ChARM2, T-ChARM3, CAR (단길이), CAR (중간 길이), 및 CAR (장 길이) 인간 T 세포 중 하나로 형질전환된 5 x 106의 T 세포였다. 종양의 접목을 확인하기 위해서, 생체 발광 이미징이 실행되었고, 이는 Raji-ffluc 접종 이후 6일 차(도 6A)에 행해졌다. 입양 T 세포 치료의 항-종양 활성을 지켜보기 위해서, T 세포 투약 후 7일 차(도 6B), 11일 차(도 6C), 18일 차(도 6D)와 26일 차(도 6E)에 생체 발광 이미징이 실시되었다.
종양 세포의 생체 발광 이미징을 위해서, 마우스는 재현탁된(resuspended) PBS에 따라 (체중 당 15 μg/g) 루시페린 기질(luciferin substrate (CaliperLife Sciences, Hopkinton, MA))을 복강 내 주사(i.p.)로 투여받았다. 마우스는 인덕션 챔버에서 이소플루란으로 마취되었고, 루시페린을 투여받고 10, 12, 14분이 지난 후 Xenogen IVIS In Vivo Imaging System (Caliper Life Sciences)를 사용하여 수집 시간을 1 초 - 1 분으로 하여 small binning mode에서 충분히 포화되지 않은 이미지를 얻고자 했다. 루시페라제 활성화의 분석을 위해서 Living Image Software (Caliper Life Sciences)가 사용되었고, 광자 유동(photon flux) 역시 각 개별 마우스의 전체 몸체를 통틀어 부분 별로 주목하는 방법으로 관찰되었다.
생체 발광 이미지는 항-CD19, T-ChARM1, T-ChAPvM2, 또는 T-ChARM3를 발현하는 T 세포는 항-CD19 CAR (단길이) 또는 CAR (중간 길이)을 발현하는 T 세포 만큼이나 종양을 효율적으로 제거한다는 것과, 한편으로 CAR (장 길이)를 발현하는 T 세포의 경우는 특정한 구성물 및/또는 표적을 위해서 그렇게 효율적이지는 않았다는 점을 보여준다(도 6).
실시예 8
T-CHARM 분자를 발현하는 T 세포의 생체 내에서의 지속성
Raji 종양을 가지고 있는 NSG 마우스 집단은 5 x 106 항-CD19 CAR/huEGFRt 또는 T-ChARM/huEGFRt를 발현하는 인간 T 세포로 처리되었고, 3 주 후에 말초 혈액 (눈 출혈)이 항-huEGFR, 항-인간 CD8, 및 항-인간 CD45 모노클로날 항체를 이용하여 유동세포계수법으로 분석되었다. CD8+ huEGFRt+ (Wang et al., 2011)의 주기는 T 세포가 도 7에서 살아있는 혈액 세포의 퍼센트로 나타냈다. 검출가능한 huEGFRt의 농도는 T-ChARM 발현 T 세포의 수준과 높은 연관성이 있다.
항-CD19 CAR 발현 T 세포 (장 길이)이 3주간 지속적으로 눈에 띄이지 않았지만, 다른 항-CD19 CAR 및 T-ChARM 발현 T 세포는 NSG 마우스의 말초 혈액에서 양자 이송(adoptive transfer) 및 종양 제거 이후 적어도 3주 동안은 쉽게 관찰할 수 있었다. 이런 결과는 항-CD19 CAR과 T-ChARM 발현 T 세포가 연장된 주기 동안 생체 내에서 지속될 수 있으며, 항 종양 활성을 연결해준다는 것을 뜻한다.
실시예 9
T-CHARM 분자를 발현하는 T 세포의 확인
항-CD19 T-ChARM/huEFRt 발현 T 세포는 EGFR Ab-비오틴/스트렙타비딘-PE, 항-Strep 태그 II-FITC, Strep-Tactin®-APC (알로피코시아닌)을 사용하여 염색했고, 그 이후에는 유동세포계수법을 사용하여 분석했다. 항-CD19 CAR(단길이) 형질변환된 T 세포가 대조군으로서 사용되었다. 형질전환된 T-ChARM 및 항-CD19 CAR (단길이) T 세포 전부는 항-EGFR mAb를 사용하여 양성으로 염색되었으며, 이는 이 세포들이 형질전환되었고 huEGFRT (도 8A)을 발현함을 보여주는 바이다.
이 결과는 태그 서열를 염색한 시약을 통해서 T-ChARM2 및 T-ChARM3 형질변환된 T 세포가 T ChARM 세포 (도 8B, C)에서 발현된 형질변환되지 않는 세포와 쉽게 구분될 수 있다는 점을 나타낸다. T-ChARM1, T-ChARM2 및 T-ChARM3는 T 세포를 형질변환하지만, 항-Strep 태그 II-FITC 항체를 사용하여 양성으로 염색된 항-CD19 CAR (단길이)는 그렇지 않다(도 8B). 더 많은 수의 복사본을 가지는 태그 서열는 증가된 염색 시그널을 보유하고 있다. Streptactin APC를 사용하여 염색된 T-ChARM 세포는, Strep 태그의 경우 T 세포를 확인하는 데에 한가지 이상의 염색 시약이 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 10
T-CHARM 분자를 발현하는 T 세포 분자 소팅
T-ChARM2 형질전환된 T 세포는 항-Strep 태그-FITC로 라벨링된 항체를 사용하여 염색되었고, 그 이후에 벤치탑 FACS 세포 소팅기(BD FACSAria II 세포 분류기, BD Biosciences, San Jose, CA)를 이용하여 소팅되었다. 도 9 는 소팅하기 전의 세포 밀도(윗줄) 및 소팅 후의 세포 밀도(아랫줄)을 나타낸다. 가장 오른쪽에 있는 패널(소팅 후)는 T-ChARM2 발현 T 세포가 15.8% 의 세포 밀도에서 99% 이상의 T-ChARM2 T 세포 밀도로 강화되었음을 나타낸다.
실시예 11
면역자기 선택법을 통한 T-CHARM 분자를 발현하는 T 세포의 강화(Enrichment)
세포는 Streptactin-마이크로비즈 또는 나노비즈와 함께 배양(IBA, Goettingen, Germany)되었고, 그 이후에는 자기 분리 장치의 MACS 칼럼(Miltenyi Biotec)으로 로딩되었다. 이 칼럼은 3 ml MACS 완충제로 3번 세척되었다. 그 이후 칼럼은 분리 장치에서 이동되어, strep 태그를 발현하는 T 세포와 Streptactin® 자성 비즈가 확실하게 플런저를 밀어내는 방식으로 확실하게 씻겨졌다. 대조 T 세포와 혼합된 T-ChARM3로 형질전환된 T 세포는 다음과 같은 종류의 비즈, 즉 Strep-Tactin 마이크로비즈 1# (일반적으로 단백질 정제를 위해서 사용되며, 크기 약 0.5 내지 1.5 ㎛); Strep-Tactin 마이크로비즈 2# (일반적으로 Fab Streptamers®와 함께 세포분리를 할 때 사용되며 [Strep-tagged Fab fragment], 사이즈 약 0.5 ㎛); Strep-Tactin 나노비즈 3# (일반적으로 MHC I Streptamers와 함께 세포분리를 할 때 사용되며 [Strep-tagged MHCI 모노머], 사이즈 약 100 nm); 중 하나를 사용하여 MACS® 칼럼(Miltenyi)에 로딩되고, 자기 분리 장치에 삽입되었다. 직접적인 유출물과 남아있는 조각들은 개별적으로 항-Strep 태그-FITC 로 라벨링된 항체를 사용하여 염색되었고, 유동세포계수법을 이용해서 분석되었다.
도 10의 첫째 줄은, Strep-Tactin 비즈 칼럼에 적용되기 전의 세포 밀도를 나타내며, 도 10의 두 번째, 세 번째 및 네 번째 줄은 각각 비즈 칼럼 1#, 2#, 및 3#를 통과한 이후 샘플의 세포 밀도를 나타낸다. 두 번째 줄에서는 일부 세포가 손실되었음을 나타내는데, 이는 아마도 Strep-Tactin 마이크로비즈 1# 의 사이즈가 일부 세포로 하여금 칼럼을 내려갈 수 없게 했기 때문일 것이라는 예측이 가능하다. 전반적으로, 자료에 따르면, Strep-Tactin의 어떤 타입에 따르는지에 상관 없이, 직접적으로 T-ChARM 발현 T 세포를 강화하는데에 유용하다는 점을 알 수 있다.
실시예 12
태그 결합 시약으로 세포 표면 T-CHARMS를 발현하는 T 세포의 활성화
T 세포의 활성과 및 증식은 T 세포 항원-특이적 리셉터(TCR)와 동시에 자극되는 두 가지 시그널을 필요로 하는데, 대부분 전형적으로 CD28와 CD80 및 CD86 (Ledbetter et al, Blood 75: 1531, 1990)의 결합인 경우이다. 이에 따르면, 항-CD3/CD28 mAb 코팅된 마이크로비즈는 요구되는 시그널을 발생시키기 위해서 개발되었고, 특이적이지 않게 활성화되었거나 확장된 T 세포는 임상학적 적용을 위해서 개발되었다(Riddell and Greenberg, 1990). T 세포의 항 CD3/CD28 자극은 또한 CARs를 암호화하는 레트로 바이러스 또는 렌티바이러스 벡터의 형질전환을 가능하게 하지만 선택적으로 형질변환된 T 세포를 확장하지는 않는다.
항-CD19 T-ChARM3로 형질전환된 T 세포는 CTL 배지로 아무런 처치가 없는 상태(음성 대조군)로, 또는 이하; (a) Strep-Tactin® 마이크로비즈 1#; (b) Strep-Tactin 마이크로비즈 2#; (c) Strep-Tactin 나노비즈 3#; (d) 항-Strep 태그 항체가 컨쥬게이트된 단백질 G 비즈 (약 2 μιη크기) (e) 항-Strep 태그 항체 /항-CD28 항체가 이중으로 컨쥬게이트된 단백질 G 비즈, 또는 (f) 조사되어 TM-LCL 세포와 함께 50 U/ml IL2에서 함께 배양되는 경우 (양성 대조군) 중에서 한 가지로 처리되어 48시간 동안 배양되었다. 24시간 및 48시간 동안 배양된 이후에 세포가 활성화되었는지를 확인하기 위해서, CD25/CD69가 면역 형광 염색과 유동세포계수법을 사용하여 확인되었다. T 세포는 T 세포 표면 리셉터를 통해서, 또는 CD3ζ를 발현하는 CAR을 이용하여 시그널링하는 방법으로 CD69 및 CD25를 포함하는 데노보(de novo) 활성화 분자를 발현한다. CD69는 활성 마커들 중에서 가장 초반의 것이기도 하며, 이는 진행되는 활성화 단계와 연관될 수도 있다. CD25 합성(IL2 리셉터 α 사슬)은, IL2 그 자체와 함께 항원을 접하는 초반부터 T 세포 활성화에 의해서 유도된다.
예상하지 못했지만, 이러한 자료에 따르면 Strep-Tactin 또는 항-Strep 태그 항체로 코팅된 비즈를 통한 T-ChARM 발현 T 세포의 Strep 태그 결합이 이러한 T 세포를 확연하게 활성화시켰으며, 비즈의 사이즈 역시 T 세포의 활성화에 영향을 미칠 수 있다는 점을 보여주었다(도 13).
추가적인 구성이 더해진 이 이상의 실험에서는, Strep-Tactin 마이크로비즈가 ChARM2 및 ChARM3를 발현한 CD8+ (도 27A) 및 CD4+ (도 27B) T 세포에서 CD25의 상향조절을 유도하였고, ChARM1 또는 태그가 없는 CARs T 세포에서는 유도하지 않았는데, 이는 Strep-Tactin 마이크로비즈와 결합하는 ChARM1 친화도가 T 세포 활성화에서 차선임을 의미한다. 그러나, Strep-Tactin (KD = ~luM) 보다 100배 더 높은 Strep 태그 (KD = ~10nm) 결합 친화도가 있는 항-Strep 태그 항체-코팅된 마이크로비즈는, ChARM (도 27 A 및 B)에서 태그의 카피수 또는 위치와 상관없이 다양한 ChARM T 세포를 활성화시켰다. 주목할 만한 점은, Strep-태그에 결합으로서 연결된 활성화는 4-1BB 및 CD28 ChARM T 세포 (도 27C) 둘 다에서 찾을 수 있다는 점이다.
실시예 13
태그 결합 시약으로 세포 표면 T-CHARMS를 발현하는 T 세포의 증식
항-CD19 T-ChARM1, T-ChARM2, T-ChARM3 및 CAR (장 길이) (음성 대조군)은 CTL 배지에서 Strep-Tactin® 마이크로비즈 및 50 U/ml IL2와 함께 개별적으로 배양된 T 세포를 형질전환했다. 5일 차의 현미경 이미징에 따르면 T-ChARM2 및 T-ChARM3 발현 T 세포가 비즈 주변에서 놀랄 정도로 크게 뭉쳐있는 것을 보여주며, Strep-Tactin 비즈에서의 직접적인 세포 증식 역시 관찰되는데, 이는 항-CD19 CAR (장 길이) 발현 T 세포 (도 11)에서는 명확하게 나타나지 않았던 것이다. T-ChARM1 발현 T 세포는 세포가 덜 뭉치는 것으로 나타났지만, 최소한 음성 대조군과 비교했을 때 플레이트에 더 많은 세포가 관찰된 것으로 보아 확실히 더 많은 세포 확장이 있었다는 점은 나타났다. 이후의 실험에서는, 다양한 종류의 ChARMT 발현 세포는 마이크로비즈 또는 항-Streptag 항체 마이크로비즈(도 28)로 자극된 경우, 단 48 시간 내에 증식 덩어리들을 나타난다. 종래의 짧은 스페이서 CAR T 세포 (CD19-Hi)가 음성 대조군으로서 사용되었다.
Strep-Tactin® 마이크로비즈에서 배양된 T-ChARM 발현 T 세포의 성장 곡선이 확인되었다(도 12 및 29 참조). 총 약 1 x 106개의 항-CD19 T-ChARM1, T-ChARM2, 및 T-ChARM3 형질변환 T 세포가 Strep-Tactin 마이크로비즈, 항-Strep 태그 mAb, 또는 항- Strep tag/항-CD28 mAb 코팅된 마이크로비즈(도 28) 와 함께 CTL 배지에 각각 플레이팅 되었고, 50 U/ml IL2 및 5ng/ml IL15와 함께 10 일 동안 배양되었다. 3일 차와 6일 차에 각 웰의 세포 수를 세었다. 이 자료는 Strep-Tactin 비즈로 자극되었을 때 T-ChARM3 형질변환된 T 세포가 9일 이상에서 가장 큰 성장 비율을 나타냈다는 점을 보여준다. Strep-Tactin 비즈 자극과 함께, CD8+ 또는 CD4+ 항-CD19 ChARM-T 세포는 약 20 배 내지 100 배로 확장되었고, 이 때 가장 큰 확장이 ChARM3 T 세포 (도 29A 및 B)에서 관찰되었다. 항-Strep 태그 및 항-Strep 태그 /항-CD28 mAb로 코팅된 비즈는, 총 ChARM T 세포 수에서 이보다도 더 큰 확장 (100배 내지 250배)을 보였고, StrepTactin 비즈 자극과는 다르게 ChARM1을 발현하는 CD8+ 및 CD4+ T 세포는 ChARM2 또는 ChARM3를 발현하는T 세포보다 더 크게 확장하는 경향을 보였다. CD28 ChARM 또는 항-RORl ChARM를 발현하는 T 세포는 또한 항-Strep tag/항-CD28 비즈와 함께인 경우에도 효과적으로 확장되었으며, 이는 각각 다른 동시 자극되는 도메인과 각각 다른 종양 표적(자료없음)에 대해 특이적으로 ChARM T 세포를 확장시킬 수 있는 적용 가능성을 보여주었다.
또 다른 성장 곡선 검토에서, 총 약 5 x 105개의 항-CD19 T-ChARM3 형진변환된 T 세포가 50 U/ml IL2과 함께 CTL 배지에서 플레이팅 되었고; 이 중 하나의 비즈는: (a) Strep-Tactin 마이크로비즈 1#, (b) Strep-Tactin 마이크로비즈 2#, (c) Strep-Tactin 나노비즈 3#, (d) 단백질 G 비즈에 컨쥬게이트된 항-Strep 태그 항체, (e) 항-Strep 태그 항체 / 항-CD28 항체 이중 컨쥬게이트 단백질 G 비즈, 또는 (f) 항-CD3 / 항-CD28 이중 항체 비즈 (양성 대조군);로 7일간 배양되었다. 각 3일 차, 4일 차, 7일 차에 각각의 웰의 세포 수를 세었다. 자료는 항-Strep 태그 항체/항-CD28 항체가 이중으로 컨쥬게이트 단백질 G 비즈가 5일 차에 최대의 세포 증식을 촉진했다는 것을 나타냈고, 이는 확연히 항-CD3/항-CD28 양성 대조군 (도 16)보다 월등했다. Strep-Tactin 마이크로비즈 2# 이외에 Strep 태그와 관련된 시약의 경우, 세포 발현 T-ChARM의 증식을 항-CD3/항-CD28 양성 대조군과 거의 같은 수준으로 촉진했다.
T-ChARM 발현 T 세포의 증식을 더욱 명확히 확인하기 위해서, Ki-67 단백질의 정도는 증식의 대리 측정(surrogate measure)으로 이루어졌다. Ki-67은 세포 증식과 관련이 있고 필요할 여지가 있는 핵산 단백질이다. 항-CD19 T-ChARM3로 형질변환된 T 세포는, 이하 중의 한 가지가 존재하는 경우 CTL 배지에서 5일 간 배양되었다: (a) Strep-Tactin® 마이크로비즈 1#; (b)Strep-Tactin 마이크로비즈 2#; (c) Strep-Tactin 나노비즈 3#; (d) 단백질 G 비즈에 컨쥬게이트된 항-Strep 태그 항체; (e) 항-Strep 태그 항체 /항-CD28 항체 이중 컨쥬게이트 단백질 G 비즈, 또는 (f) 항-CD3/항-CD28 이중 항체 비즈 (양성 대조군). 5일 간 배양된 후에, 세포가 고정, 투과, 항-Ki-67-FITC 컨쥬게이트 항체로 염색되어 유동세포계수법으로 분석되었다.
이 자료는 Strep-Tactin 비즈 또는 항-Strep 태그 비즈가 선택적인 세포 증식을 촉진할 수 있다는 것과, Ki-67 염색을 통해서 측정된 증식은 항-CD3/항-CD28 양성 대조군(도 14)보다 월등하다는 것을 나타낸다.
그 이상의 Ki-67 단백질 농도는 항-CD19 T-ChARM1, T-ChARM2, 또는 T-ChARM3로 형질변환된 T 세포에서 수행되어 CTL 배지에서 7일간: (a) 처리 없음; (b) 1 x 106 세포 당 15μg, 50μg, 또는 150μg 용량의 Strep-Tactin® 마이크로비즈 1# ; 또는 (c) 조사된(irradiated) TM-LCL 세포 + 50 U/ml의 IL2 (양성 대조군)와 함께 배양되었다. 7일 간 배양된 후에, 세포가 고정, 투과, 항-Ki-67-FITC 컨쥬게이트 항체로 염색되어 유동세포계수법으로 분석되었다. 이러한 결과는, 얼만큼의 비즈가 사용되었는지에 상관없이 Strep-Tactin 비즈가 T 세포 발현하는 T-ChARM의 증식을, 특별히 T-ChARM2 및 T-ChARM3 세포의 경우 촉진할 수 있다는 것을 나타낸다(도 15). 또한 각각의 T-ChARM 발현 T 세포는 Strep-Tactin 비즈가 있는 경우의 증식이 TM-LCL 양성 대조군의 자극과 같거나 월등하다는 점을 나타낸다.
실시예 14
T-CHARM 분자를 발현하는 T 세포의 선택적 확장
총 약 5 x 105개의 인간 CD8+ T 세포가 항-CD3/항-CD28 비즈를 이용해서 자극되었다. 2일 차에, 처리된 세포는 항-CD19 T-ChAR1/huEGFRt를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스에 의해서 형질이 변환되었다. 5일 차에, 항-CD3/항-CD28 비즈가 제거되었다. 이 지점에서, 처리된 세포는 두 그룹으로 나뉘어졌는데, 한 그룹은 다른 처리가 전혀 더해지지 않은 반면, 다른 그룹은 Strep-Tactin® 마이크로비즈 (약 0.5 μm 내지 약 1.5 μm)로 처리되었다. 10일 차에, 각 그룹에서 세포를 획득했고, 이는 면역 형광 염료의 항-Strep 태그 항체로 염색되어 유동세포계수법에 따라 분석되었다. 성장곡선은, 항-CD3/항-CD28 비즈를 제거한 이후에 Strep-Tactin 마이크로비즈를 추가하면 T 세포 증식(도 17A)이 확연하게 지속적으로 촉진된다. 유동세포계수법 분석은 증식하는 세포들은 사실 T-ChARM을 발현하는 T-세포였음을 나타내는데, 이는 대조집단(위쪽 패널)(도 17B)과 비교해보았을 때 Strep-Tactin 마이크로비즈로 처리된 그룹(바닥 패널)에서 확연하게 높은 퍼센트의 (huEGFRt 염색에 의해서 측정되는) T-ChARM 발현 T 세포가 존재했기 때문이다. 각 그룹에서의 세포는 huEGFRt 마커를 이용하여 더 소팅되었고, 그 이후에는 5.0 x 105 세포가 CD19+ TM-LCL에 의해서 자극되어 확장되었다. StrepTactin 마이크로비즈로 처리되었던 세포는 눈에 띄게 빠른 증식을 거치게 되었는데, 이는 7일 동안 8.0 x 107개의 세포 수준으로서, 대조군에서는 단지 4.0 x 106 개의 세포만이 있던 것과 비교되는 바이다. 이는 T-ChARM의 태그 서열을 통하면, Strep-Tactin 마이크로 비즈를 통한 자극 이후에는, 항-CD19 scFv 요소를 통한 차후의 재자극이 굉장히 효과적이라는 점을 보여주는 결과이다.
항-CD3/항-CD28 비즈 자극이 처음부터 T-ChARM 발현 T 세포의 확장을 위해서 필요했던 것인지 확인하기 위해서, T 세포가 사이토카인 자극 하나만으로도 T-ChARM를 발현시키도록 형질변환될 수 있는지, 또한 선택적으로 항-Strep 태그 비즈의 처리만을 통해서도 확장될 수 있는지 여부를 검토했다. 총 약 5 x 105개의 인간 CD8+ T 세포가 24시간 동안 5ng/mL IL-7 및 10 ng/mL IL-15로 배양되었고, 같은 적정 농도의 두 종류의 항-CD19 T-ChARM3 (4IBB 또는 CD28 이펙터 도메인)를 암호화하는 바이러스로서 형질변환되었다. 2일 차에 형질변환된 세포들은 단백질 G 비즈에 컨쥬게이트된 항-Strep 태그 항체로 처리되었고 7일 차에 획득되어 면역 형광 항-Strep 태그 II 항체로 염색되어 유동세포계수법으로 분석되었다.
데이터에 따르면, 항-CD3/항-CD28 비즈 자극이 없는 상태에서, 단백질 G 비즈에 컨쥬게이트된 항-Strep 태그 항체가 배양 중인 세포(도 18B 및 18D)의 60% 이상으로 T-ChARM 발현 T 세포 증식을 촉진한다. 형질변환된 세포가 항-Strep 태그 항체 비즈에 노출되지 않았을 때에는, 1% 이하의 형질변환된 세포가 증식하였다(도 18A 및 18C).
항-Strep 태그 단독에서, 또는 항-Strep tag/항-CD28 mAb 코팅된 마이크로비즈에서의 확장 이후에, ChARM을 통한 자극이 시험관 내 또는 생체 내에서 종양을 발견하는 데에 해로운 영향을 미치는지에 관해 ChARM T 세포의 기능성이 테스트되었다. 디자인에서 같이 자극되는 도메인과 독립적으로, 항-Strep 태그 마이크로비즈에서 확장된 ChARM T 세포는, 항원 자극 중에서 확장 전 또는 항원에 의한 확장 이후(TM-LCL) 잠재적인 세포 융합 활성과 효율적인 사이토카인을 방출, 그리고 광범위한 증식 가능성을 보유함(도 30A-30C)이 나타났다. 선택적인 확장 이후, ChARM T 세포는 높은 생존 능력 (>90%)을 보유하고 있었으며, 이 중 높은 비율로 같이 자극되는 리셉터(CD27/CD28)가 발현되었고 중심 기억 T 세포 마커 CD45RO 및 CD62L (도 30D)는 NSG 마우스 (도 30E)에서 Raji 종양을 제거할 수 있었으며, CD19+ B 세포 (도 30F)와의 자극을 통해서 확장된 CAR T 세포와 마찬가지로 지속될 수 있었다.
실시예 15
T-CHARMS를 발현하는 T 세포에 의한 사이토카인 방출에 태그 결합 시약을 투입한 효과
(TM-LCL 자극에 의해 확장된) 항-CD19 CAR (단길이) 또는 (TM-LCL 또는 StrepTactin 마이크로비즈 자극에 의해 확장된) T-ChARM1 발현 T 세포는 Raji 세포 (도 19C) 또는 CD19 (도 19 A) 또는 ROR1 (음성 대조군)를 발현하는 K562 세포 (도 19B)와 24시간 동안 같이 배양되었다. PMA / 이노마이신이 양성 대조군 (도 19D)으로 사용되었다. 상청액을 확보해서 다중 사이토카인 분석기(Luminex®)를 이용해서 분석했다. Strep-Tactin 마이크로비즈에서 배양된, 항-CD19 T-ChARM1을 발현하는 T-세포에 따른 사이토카인 방출의 수준(IFN-γ를 제외한 경우)은 TM-LCL 세포 (도 19A, C, 및 D)에 의해 자극된 T-ChARM1을 발현하는 T 세포보다 높은 수준으로 관찰되었다. 조건과 무관하게, K562/ROR1 세포와 같이 배양한 그룹 (음성 대조군)에서는 검출할 수 있는 사이토카인(도 19B)이 전혀 발생하지 않았다. 흥미로운 사실은, TM-LCL에 의해 자극된 그룹과 비교했을 때, Strep-Tactin 비드가 유도된 배양의 경우(10배 이상 증가)에서 확연하게 높은 수준의 IL2 생성이 확인되었다는 점이다.
실시예 16
항-CD27 또는 항-CD28 항체와 결합한 항-STREP 태그 항체로 증대된 증식
정제된 항-CD19 T-ChARM3 발현 T 세포(5 x 105)는 0일 차에 CTL를 배지로 하여 50U/ml IL2에 놓여 있었고, 그리고 2 μg G 단백질 자성 비즈 (NEB), 항-Strep 태그 II (0.5μg)/ 항-CD27 항체 (0.5μg) 컨쥬게이트 G 단백질 비즈, 또는 항-Strep 태그 II (0.5μg)/ 항-CD28 항체 (0.5μg) 컨쥬게이트 G 단백질 비즈가 세포 배양에 더해졌다. 배지에 있는 세포는 단지 음성 대조군으로서만 사용되었다. 5일 차에, 이러한 세포가 현미경에 의해서 관찰되었다.
도 20은 항-Strep 태그 II 항체 컨쥬게이트 단백질 G 비즈가 T-ChARM을 발현하는 T 세포의 확장을 촉진한다는 것과, 항- Strep 태그 II를 항-CD28 또는 항-CD27 항체 중 하나와 결합하면 T-ChARM을 발현하는 T 세포의 확장이 더욱 더 효과적으로 촉진된다는 것을 나타낸다.
상기한 다양한 구체예를 조합하여 추가 구체예를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 언급되거나/되고 출원 데이터 시트에 열거된 미국 특허, 미국 특허출원 공개, 미국 특허출원, 외국 특허, 외국 특허출원 및 비-특허 공개물 모두는 그의 전문이 본원에서 참조로 인용되었다. 구체예의 측면은, 필요에 따라 각종 특허, 출원 및 공개의 개념을 사용하도록 변형되어 추가의 구체예를 제공할 수 있다.
상기한 상세한 설명에 비추어 구체예에 대한 이러한 및 다른 변경이 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 특허청구범위에서, 사용된 용어들이 특허청구범위를 명세서 및 특허청구범위에 기재된 특정 실시형태로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하고, 이러한 특허청구범위의 등가물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 구체예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 특허청구범위는 상기 개시에 의해 제한되지 않는다.
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Liu, Lingfeng <120> TAGGED CHIMERIC EFFECTOR MOLECULES AND RECEPTORS THEREOF <130> 360056.426WO <140> PCT <141> 2014-12-22 <150> US 61/919,201 <151> 2013-12-20 <160> 73 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Strep-tag II <400> 1 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Strep-tag <400> 2 Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flag Tag <400> 3 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xpress tag <400> 4 Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Avi tag <400> 5 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA tag <400> 6 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial 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atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 atccccaatt ggagccaccc gcagttcgaa aaaggaggtg gaggttcagg tggtggaggc 120 tctgacatcc agatgaccca gaccacctcc agcctgagcg ccagcctggg cgaccgggtg 180 accatcagct gccgggccag ccaggacatc agcaagtacc tgaactggta tcagcagaag 240 cccgacggca ccgtcaagct gctgatctac cacaccagcc ggctgcacag cggcgtgccc 300 agccggttta gcggcagcgg ctccggcacc gactacagcc tgaccatctc caacctggaa 360 caggaagata tcgccaccta cttttgccag cagggcaaca cactgcccta cacctttggc 420 ggcggaacaa agctggaaat caccggcagc acctccggca gcggcaagcc tggcagcggc 480 gagggcagca ccaagggcga ggtgaagctg caggaaagcg gccctggcct ggtggccccc 540 agccagagcc tgagcgtgac ctgcaccgtg agcggcgtga gcctgcccga ctacggcgtg 600 agctggatca ggcagccccc caggaagggc ctggaatggc tgggcgtgat ctggggcagc 660 gagaccacct actacaacag cgccctgaag agccggctga ccatcatcaa ggacaacagc 720 aagagccagg tgttcctgaa gatgaacagc ctgcagaccg acgacaccgc catctactac 780 tgcgccaagc actactacta cggcggcagc tacgccatgg actactgggg ccagggcacc 840 agcgtgaccg tgagcagc 858 <210> 59 <211> 807 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal peptide-[anti-CD19 scFv (VH-Tag-VL)] <400> 59 atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120 gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180 aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240 cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300 gaacaggaag atatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360 ggcggcggaa caaagctgga aatcaccgga ggttcaggat ctggcaattg gagccacccg 420 cagttcgaaa aaggctctgg atcaggtgag gtgaagctgc aggaaagcgg ccctggcctg 480 gtggccccca gccagagcct gagcgtgacc tgcaccgtga gcggcgtgag cctgcccgac 540 tacggcgtga gctggatcag gcagcccccc aggaagggcc tggaatggct gggcgtgatc 600 tggggcagcg agaccaccta ctacaacagc gccctgaaga gccggctgac catcatcaag 660 gacaacagca agagccaggt gttcctgaag atgaacagcc tgcagaccga cgacaccgcc 720 atctactact gcgccaagca ctactactac ggcggcagct acgccatgga ctactggggc 780 cagggcacca gcgtgaccgt gagcagc 807 <210> 60 <211> 807 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal peptide-anti-ROR1 scFv (VH-VL) <400> 60 atgctgctgc tggtgacaag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 atcccccagg aacagctcgt cgaaagcggc ggcagactgg tgacacctgg cggcagcctg 120 accctgagct gcaaggccag cggcttcgac ttcagcgcct actacatgag ctgggtccgc 180 caggcccctg gcaagggact ggaatggatc gccaccatct accccagcag cggcaagacc 240 tactacgcca cctgggtgaa cggacggttc accatctcca gcgacaacgc ccagaacacc 300 gtggacctgc agatgaacag cctgacagcc gccgaccggg ccacctactt ttgcgccaga 360 gacagctacg ccgacgacgg cgccctgttc aacatctggg gccctggcac cctggtgaca 420 atctctagcg gcggaggcgg atctggtggc ggaggaagtg gcggcggagg atctgagctg 480 gtgctgaccc agagcccctc tgtgtctgct gccctgggaa gccctgccaa gatcacctgt 540 accctgagca gcgcccacaa gaccgacacc atcgactggt atcagcagct gcagggcgag 600 gcccccagat acctgatgca ggtgcagagc gacggcagct acaccaagag gccaggcgtg 660 cccgaccggt tcagcggatc tagctctggc gccgaccgct acctgatcat ccccagcgtg 720 caggccgatg acgaggccga ttactactgt ggcgccgact acatcggcgg ctacgtgttc 780 ggcggaggca cccagctgac cgtgacc 807 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (G4S)2 <400> 61 ggaggtggag gttcaggtgg tggaggctct 30 <210> 62 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (G4S)3 <400> 62 ggcggaggcg gatctggtgg cggaggaagt ggcggcggag gatct 45 <210> 63 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal peptide <400> 63 atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 atcccc 66 <210> 64 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal peptide <400> 64 atgctgctgc tggtgacaag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 atcccc 66 <210> 65 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 65 Gly Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 66 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 67 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 68 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 69 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 69 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 70 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified CD28 transmembrane domain <400> 70 Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser 1 5 10 15 Gly Gly Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 71 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 71 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 72 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 73 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5

Claims (177)

  1. 소수성 부분으로 연결된 세포외 성분과 세포내 성분을 포함하고, 여기서 세포외 성분은 타겟과 특이적으로 결합하는 결합 도메인, 태그(tag) 카세트 및 힌지를 포함하는 커넥터 영역을 포함하고 세포내 성분은 이펙터 도메인을 포함하는, 단일사슬 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 결합 도메인이 scFv, scTCR, 리셉터 엑토도메인(ectodomain), 또는 리간드인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 타겟이 CD3, CEACAM6, c-Met, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EphA2, IGF1R, GD2, O-아세틸 GD2, O-아세틸 GD3, GHRHR, GHR, FLT1, KDR, FLT4, CD44v6, CD151, CA125, CEA, CTLA-4, GITR, BTLA, TGFBR2, TGFBR1, IL6R, gpl30, 루이스(Lewis) A, 루이스 Y, TNFR1, TNFR2, PD1, PD-L1, PD-L2, HVEM, MAGE-A, 메소텔린(mesothelin), NY-ESO-1, PSMA, RANK, RORl, TNFRSF4, CD40, CD137, TWEAK-R, HLA, HLA에 결합된 종양 또는 병원균 관련 펩티드, HULA에 결합된 hTERT 펩티드, HLA에 결합된 티로시나제 펩티드, HLA에 결합된 WT-1 펩티드, LTβR, LIFRβ, LRP5, MUC1, OSMRβ, TCRα, TCRβ, CD19, CD20, CD22, CD25, CD28, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, CD81, CD86, CD123, CD171, CD276, B7H4, TLR7, TLR9, PTCH1, WT-1, Robol, α-페토프로테인(fetoprotein) (AFP), 프리즐드(Frizzled), OX40, 또는 CD79b를 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 커넥터 영역이 링커 모듈을 추가로 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 링커 모듈이 (GlyxSery)n이고, 여기서 n은 1 내지 10의 정수이며, x와 y는 독립적으로 0 내지 10의 정수이나, 단 x와 y는 둘 다 0은 아닌 것인 단일사슬 융합 단백질.
  6. 제4항에 있어서, 링커 모듈이 CH2CH3 또는 CH3인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 커넥터 영역이 하나 이상의 태그 카세트를 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 커넥터 영역이 1 내지 5의 태그 카세트를 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 커넥터 영역이 1 내지 5의 태그 카세트를 포함하고, 각각의 태그 카세트는 (GlyxSery)n(여기서 n은 1 내지 10의 정수이고, x와 y는 독립적으로 0 내지 10의 정수이나, 단 x와 y가 둘 다 0은 아니다)을 포함하는 1 또는 2의 링커 모듈로 연결된 것인 단일사슬 융합 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 링커 모듈이 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열번호 10), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (서열번호 11), (Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser (서열번호 12), 또는 그의 조합의 아미노산 서열을 갖는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 결합 도메인이 하나 이상의 태그 카세트를 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 태그 카세트가 결합 도메인에 대해 아미노 터미널, 결합 도메인에 대해 카복시 터미널, 또는 둘 다에 위치하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  13. 제11항에 있어서, 결합 도메인이 가변영역 링커를 포함하는 scFv 또는 scTCR이고, 여기서 가변영역 링커는 하나 이상의 태크 카세트를 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 태크 카세트가 Strep 태그, His 태그, Flag 태그, Xpress 태그, Avi 태그, 칼모듈린(Calmodulin) 태그, 폴리글루타메이트(Polyglutamate) 태그, HA 태그, Myc 태그, Nus 태그, S 태그, X 태그, SBP 태그, Softag, V5 태그, CBP, GST, MBP, GFP, 티오레독신(Thioredoxin) 태그, 또는 그의 조합이거나, 이들을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 태크 카세트가 아미노산 서열 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열번호 1) 또는 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (서열번호 2)을 갖는 Strep 태그이거나 이를 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 커넥터 영역이 하나 이상의 태크 카세트에 인접한 링커 모듈을 추가로 포함하고, 여기서 링커 모듈 및 인접 태크 카세트가 전체적으로 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열번호 20), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (서열번호 21), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열번호 22), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (서열번호 23), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열번호 24), 또는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (서열번호 25)의 아미노산 서열을 갖는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 소수성 부분이 막관통 도메인인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 막관통 도메인이 CD4, CD8, CD28 또는 CD27 막관통 도메인인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이펙터 도메인 또는 그의 이펙터 부분이 4-1BB (CD137), CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, OX40 (CD 134), ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2, 또는 그의 조합인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이펙터 도메인 또는 그의 이펙터 부분이 CD3ζ 및 하나 이상의 4-1BB (CD137), CD27, CD28, 및 OX40 (CD134)을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노 터미널에서 카복시 터미널까지: 세포외 결합 도메인, 태크 카세트, 힌지를 포함하는 커넥터 영역, 소수성 부분 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노 터미널에서 카복시 터미널까지: 세포외 결합 도메인, 제1 커넥터 영역, 태크 카세트, 힌지를 포함하는 제2 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노 터미널에서 카복시 터미널까지: 세포외 결합 도메인, 제1 태크 카세트, 제1 커넥터 영역, 제2 태크 카세트, 힌지를 포함하는 제2 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  24. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노 터미널에서 카복시 터미널까지: 세포외 결합 도메인, 제1 태크 카세트, 제1 커넥터 영역, 제2 태크 카세트, 제2 커넥터 영역, 제3 태그 카세트, 힌지를 포함하는 제3 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  25. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노 터미널에서 카복시 터미널까지: 태그 카세트, 세포외 결합 도메인, 힌지를 포함하는 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  26. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노 터미널에서 카복시 터미널까지: 세포외 결합 도메인, 2 내지 5의 태그 카세트, 힌지를 포함하는 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  27. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노 터미널에서 카복시 터미널까지: 가변영역 사이에 위치한 가변영역 링커를 포함하고 태크 카세트를 함유하는 세포외 scFv 또는 scTCR 결합 도메인, 힌지를 포함하는 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  28. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노 터미널에서 카복시 터미널까지: 세포외 scFv 또는 scTCR 결합 도메인, 태크 카세트, IgG 힌지를 포함하는 커넥터 영역, 막관통 도메인 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함하고, 여기서 이펙터 도메인이 4-1BB 및 CD3ζ, CD27 및 CD3ζ, CD28 및 CD3ζ, OX40 및 CD3ζ, CD28, 4-1BB 및 CD3ζ, OX40, 4-1BB 및 CD3ζ, 또는 CD28, OX40 및 CO3ζ를 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  29. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노 터미널에서 카복시 터미널까지: 리셉터 엑토도메인을 포함하는 세포외 결합 도메인, 태그 카세트, 힌지를 포함하는 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함하고, 여기서 이펙터 도메인은 4-1BB, CD27, CD28, 또는 OX40 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  30. 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 도메인 사이에 위치하여 이를 연결하는 하나 이상의 세포외 태그 카세트와 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 갖는 융합 단백질을 포함하는 키메릭 항원 리셉터 분자.
  31. 제30항에 있어서, 하나 이상의 태그 카세트가 하나의 태그 카세트를 포함하는 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  32. 제30항에 있어서, 하나 이상의 태그 카세트가 2 내지 5 태그 카세트를 포함하는 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, (GlyxSery)n(여기서 n은 1 내지 10의 정수이고, x와 y는 독립적으로 0 내지 10의 정수이나, 단 x와 y가 둘 다 0은 아니다)을 포함하는 하나 이상의 링커 모듈을 추가로 포함하는 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  34. 제30항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 융합 단백질이 결합 도메인과 하나 이상의 태그 카세트 사이에 위치한 (GlyxSery)n(여기서 x는 2 내지 4의 정수이고, n은 1 내지 3의 정수이다) 링커 모듈을 추가로 포함하는 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  35. 제30항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 융합 단백질이 하나 이상의 태그 카세트와 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분 사이에 위치한 세포외 (GlyxSer)n 링커 모듈을 포함하고, 여기서 x는 2 내지 4의 정수이고, n은 1 내지 3의 정수인 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  36. 제30항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 융합 단백질이 2의 세포외 (GlyxSer)n 링커 모듈을 추가로 포함하고, 여기서 x는 2 내지 4의 정수이고, n은 1 내지 3의 정수이며, 제1 링커 모듈이 적어도 하나의 1 이상의 태그 카세트에 대해 아미노-터미널이고 제2 링커 모듈은 적어도 하나의 1 이상의 태그 카세트에 대해 카복시-터미널인 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  37. 제30항에 있어서, 하나 이상의 태그 카세트가 2 태그 카세트를 포함하고, 분자가 2의 세포외 (GlyxSer)n 링커 모듈을 추가로 포함하고, 여기서 x는 2 내지 4의 정수이고, n은 1 내지 3의 정수이며, 제1 태그 카세트가 결합 도메인과 제1 링커 모듈 사이에 배치되고, 제2 태그 카세트가 제1 및 제2 링커 모듈 사이에 배치되며, 제2 링커 모듈이 제2 태그 카세트와 이펙터 도메인 사이에 배치된 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  38. 제37항에 있어서, 융합 단백질이 제3 태그 카세트와 제3 세포외 (GlyxSer)n 링커 모듈을 추가로 포함하고, 여기서 제3 태그 카세트는 제2 링커 모듈과 제3 링커 모듈 사이에 배치되고, 제3 링커 모듈은 제3 태그 카세트와 이펙터 도메인 사이에 배치된 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  39. 제30항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, 융합 단백질이 세포외 힌지와 세포외 CH2CH3 링커 모듈을 추가로 포함하고, 여기서 힌지는 결합 도메인에 인접하고, CH2CH3 링커 모듈은 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분에 인접하고 적어도 하나의 하나 이상의 태그 카세트는 힌지와 CH2CH3 링커 모듈 사이에 배치된 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  40. 제30항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, 융합 단백질이 세포외 힌지와 세포외 CH3 링커 모듈을 추가로 포함하고, 여기서 힌지는 결합 도메인에 인접하고, CH3 링커 모듈은 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분에 인접하고 적어도 하나의 및/또는 각각의 하나 이상의 태그 카세트는 힌지와 CH3 링커 모듈 사이에 배치된 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  41. 제30항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 1 이상의 태그 카세트가 Strep 태그, His 태그, Flag® 태그, Xpress® 태그, Avi 태그, 칼모듈린 태그, 폴리글루타메이트 태그, HA 태그, Myc 태그, Nus 태그, S 태그, X 태그, SBP 태그, Softag, V5 태그, CBP, GST, MBP, GFP, 티오레독신 태그, 또는 그의 조합이거나 이를 포함하는 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  42. 제41항에 있어서, 적어도 하나의 1 이상의 태그 카세트가 아미노산 서열 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열번호 1) 또는 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (서열번호 2)를 갖는 Strep 태그이거나 이를 포함하는 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  43. 제30항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 있어서, 결합 도메인이 scFv, scTCR, 리셉터 엑토도메인, 또는 리간드인 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  44. 제30항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원이 CD3, CEACAM6, c-Met, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EphA2, IGF1R, GD2, O-아세틸 GD2, O-아세틸 GD3, GHRHR, GHR, FLT1, KDR, FLT4, CD44v6, CD151, CA125, CEA, CTLA-4, GITR, BTLA, TGFBR2, TGFBR1, IL6R, gpl30, Lewis A, Lewis Y, TNFR1, TNFR2, PD1, PD-L1, PD-L2, HVEM, MAGE-A, 메소텔린, NY-ESO-1, PSMA, RANK, ROR1, TNFRSF4, CD40, CD137, TWEAK-R, HLA, HLA에 결합된 종양 또는 병원체 관련 펩티드, HLA에 결합된 hTERT 펩티드, HLA에 결합된 티로시나제 펩티드, HLA에 결합된 WT-1 펩티드, LTβR, LIFRβ, LRP5, MUCl, OSMRβ, TCRα, TCRβ, CD19, CD20, CD22, CD25, CD28, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, CD81, CD86, CD123, CD171, CD276, B7H4, TLR7, TLR9, PTCH1, WT-1, Robol, α-페토프로테인(fetoprotein) (AFP), Frizzled, OX40, 또는 CD79b이거나 이를 포함하는 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  45. 제30항 내지 제44항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이펙터 도메인이 4-1BB, CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, NKG2D, OX40, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2, 또는 이들의 조합인 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  46. 제30항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이펙터 도메인이 CD3ζ와 하나 이상의 4-1BB, CD27, CD28, 및 OX40을 포함하는 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  47. 제30항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이펙터 도메인이 4-1BB와 CD3ζ, CD27과 CD3ζ, CD28과 CD3ζ, 또는 CD28, 4-1BB 및 CD3ζ를 포함하는 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  48. 제30항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 결합 도메인이 리셉터 엑토도메인(ectodomain)을 포함하고 이펙터 도메인은 4-1BB, CD27, CD28 또는 OX40을 포함하는 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  49. 제48항에 있어서, 태그 카세트가 리셉터 엑토도메인에 대해 카복시-터미널에 위치하는 것인 키메릭 항원 리셉터 분자.
  50. 세포외 성분과 세포내 성분 사이에 배치된 소수성 부분을 포함하고, 세포외 성분이 태그 카세트와 힌지를 포함하는 커넥터 영역을 포함하고, 세포내 성분이 이펙터 도메인을 포함하는 단일사슬 융합 단백질.
  51. 제50항에 있어서, 커넥터 영역이 링커 모듈을 추가로 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  52. 제51항에 있어서, 링커 모듈이 (GlyxSer)n이고, 여기서 x는 1 내지 5의 정수이고 n은 1 내지 10의 정수인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  53. 제51항에 있어서, 링커 모듈이 CH2CH3 또는 CH3인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 태그 카세트가 커넥터 영역에 대해 아미노 터미널인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  55. 제50항 내지 제54항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1 내지 5 태그 카세트를 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  56. 제55항에 있어서, 각각의 태그 카세트가 (GlyxSery)n을 포함하는 1 또는 2의 링커 모듈에 연결되고, 여기서 n은 1 내지 10의 정수이고, x와 y는 독립적으로 0 내지 10의 정수이나, 단 x와 y가 둘 다 0은 아닌 것인 단일사슬 융합 단백질.
  57. 제56항에 있어서, 링커 모듈이 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열번호 10), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (서열번호 11), (Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser (서열번호 12) 또는 이들의 조합의 아미노산 서열을 갖는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  58. 제50항 내지 제57항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 태그 카세트가 커넥터 영역에 링커 모듈에 의해 연결된 것인 단일사슬 융합 단백질.
  59. 제58항에 있어서, 링커 모듈이 (GlyxSer)n(여기서 x는 1 내지 5의 정수이고 n은 1 내지 10의 정수이다)이거나 이를 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  60. 제58항에 있어서, 링커 모듈이 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (서열번호 11)이거나 이를 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  61. 제50항 내지 제60항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 태그 카세트가 Strep 태그, His 태그, Flag® 태그, Xpress® 태그, Avi 태그, 칼모듈린(Calmodulin) 태그, 폴리글루타메이트(Polyglutamate) 태그, HA 태그, Myc 태그, Nus 태그, S 태그, X 태그, SBP 태그, Softag, V5 태그, CBP, GST, MBP, GFP, 티오레독신(Thioredoxin) 태그, 또는 이들의 조합이거나 이를 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  62. 제61항에 있어서, 하나 이상의 태그 카세트가 아미노산 서열 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열번호 1) 또는 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (서열번호 2)를 갖는 Strep 태그이거나 이를 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  63. 제50항 내지 제62항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 태그 카세트에 인접한 링커 모듈을 추가로 포함하고, 여기서 링커 모듈과 인접 태그 카세트가 이하의 아미노산 서열을 갖는 것인 단일사슬 융합 단백질: (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열번호 20), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(서열번호 21), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열번호 22), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (서열번호 23), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열번호 24), 또는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (서열번호 25).
  64. 제50항 내지 제63항 중 어느 하나의 항에 있어서, 소수성 부분이 막관통 도메인인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  65. 제64항에 있어서, 막관통 도메인이 CD4, CD8, CD28 또는 CD27 막관통 도메인인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  66. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이펙터 도메인이 CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CD134, CD137, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2, 또는 이들의 조합인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  67. 제50항 내지 제66항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이펙터 도메인이 CD3ζ와 하나 이상의 4-1BB(CD137), CD27, CD28, 및 OX40(CD134)을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  68. 제50항 내지 제66항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이펙터 도메인이 LRP, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, ROR2, 또는 Ryk를 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  69. 제50항 내지 제68항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 태그 카세트, 힌지를 포함하는 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  70. 제50항 내지 제68항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 제1 커넥터 영역, 태그 카세트, 힌지를 포함하는 제2 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  71. 제50항 내지 제68항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 제1 태그 카세트, 제1 커넥터 영역, 제2 태그 카세트, 힌지를 포함하는 제2 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  72. 제50항 내지 제68항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 제1 태그 카세트, 제1 커넥터 영역, 제2 태그 카세트, 제2 커넥터 영역, 제3 태그 카세트, 힌지를 포함하는 제3 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  73. 제50항 내지 제68항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 2 내지 5 태그 카세트, 힌지를 포함하는 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  74. 제50항 내지 제68항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 태그 카세트, IgG 힌지를 포함하는 커넥터 영역, 막관통 도메인, 및 4-1BB와 CD3ζ, CD27과 CD3ζ, CD28과 CD3ζ, 또는 CD28, 4-1BB 및 CD3ζ를 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  75. 제50항 내지 제68항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노-터미널에서 카복시-터미널까지: 태그 카세트, 힌지를 포함하는 커넥터 영역, 소수성 부분, 및 LRP, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, ROR2, 또는 Ryk를 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 세포내 성분을 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  76. 제50항 내지 제75항 중 어느 하나의 항에 있어서, 비공유적으로 연합(associate)된 결합 도메인을 추가로 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  77. 제76항에 있어서, 비공유적으로 연합된 결합 도메인이 태그 카세트와 연합하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 비공유적으로 연합된 결합 도메인이 scFv, scTCR, 리셉터 엑토도메인 또는 리간드인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 하나의 항에 있어서, 비공유적으로 연합된 결합 도메인이 이중특이적이고, 여기서 제1 결합 말단은 태그 카세트에 특이적이고 제2 결합 말단은 태그 카세트 이외의 표적에 특이적인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  80. 제79항에 있어서, 비공유적으로 연합된 결합 도메인이 CD3, CEACAM6, c-Met, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EphA2, IGF1R, GD2, O-아세틸 GD2, O-아세틸 GD3, GHRHR, GHR, FLT1, KDR, FLT4, CD44v6, CD151, CA125, CEA, CTLA-4, GITR, BTLA, TGFBR2, TGFBR1, IL6R, gpl30, Lewis A, Lewis Y, TNFR1, TNFR2, PD1, PD-L1, PD-L2, HVEM, MAGE-A, 메소텔린(mesothelin), NY-ESO-1, PSMA, RANK, ROR1, TNFRSF4, CD40, CD137, TWEAK-R, HLA, HLA에 결합된 종양 또는 병원체 관련 펩티드, HLA에 결합된 hTERT 펩티드, HLA에 결합된 티로시나제 펩티드, HLA에 결합된 WT-1 펩티드, LTβR, LIFRβ, LRP5, MUC1, OSMRβ, TCRα, TCRβ, CD19, CD20, CD22, CD25, CD28, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, CD81, CD86, CD123, CD171, CD276, B7H4, TLR7, TLR9, PTCH1, PTCH1, Robol, α-페토프로테인 (AFP), Frizzled, OX40 또는 CD79b에 특이적인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  81. 제76항 내지 제78항 중 어느 하나의 항에 있어서, 결합 도메인이 이중특이적이고, 여기서 제1 및 제2 결합 말단이 태그 카세트에 특이적인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  82. 제76항 내지 제78항 중 어느 하나의 항에 있어서, 결합 도메인이 다중특이적이고, 여기서 제1 말단은 태그 카세트에 결합하고 제2 말단은 태그 카세트 이외의 하나 이상의 표적에 특이적인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  83. 제82항에 있어서, 적어도 하나의 결합 도메인이 CD3, CEACAM6, c-Met, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EphA2, IGF1R, GD2, O-아세틸 GD2, O-아세틸 GD3, GHRHR, GHR, FLT1, KDR, FLT4, CD44v6, CD151, CA125, CEA, CTLA-4, GITR, BTLA, TGFBR2, TGFBR1, IL6R, gpl30, Lewis A, Lewis Y, TNFR1, TNFR2, PD1, PD-L1, PD-L2, HVEM, MAGE-A, 메소텔린(mesothelin), NY-ESO-1, PSMA, RANK, ROR1, TNFRSF4, CD40, CD137, TWEAK-R, HLA, HLA에 결합된 종양 또는 병원체 관련 펩티드, HLA에 결합된 hTERT 펩티드, HLA에 결합된 티로시나제 펩티드, HLA에 결합된 WT-1 펩티드, LTβR, LIFRβ, LRP5, MUC1, OSMRβ, TCRα, TCRβ, CD19, CD20, CD22, CD25, CD28, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, CD81, CD86, CD123, CD171, CD276, B7H4, TLR7, TLR9, PTCH1, PTCH1, Robol, α-페토프로테인 (AFP), Frizzled, OX40 또는 CD79b에 특이적인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  84. 제76항에 있어서, 결합 도메인이 항체인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  85. 제76항에 있어서, 태그 카세트가 아미노산 서열 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열번호 1) 또는 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (서열번호 2)를 갖는 Strep 태그인 것인 단일사슬 융합 단백질.
  86. 제76항 내지 제85항 중 어느 하나의 항에 있어서, 결합 도메인이 세포독성, 방사성 동위원소, 라디오메탈 또는 검출시약을 추가로 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  87. 제1항 내지 제85항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포독성, 방사성 동위원소, 라디오메탈 또는 검출시약을 추가로 포함하는 것인 단일사슬 융합 단백질.
  88. 제1항 내지 제85항 및 제50항 내지 제87항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제30항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 키메릭 항원 리셉터를 코딩하는 핵산 분자.
  89. 제88항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  90. 제89항에 있어서, 바이러스 벡터인 것인 벡터.
  91. 제90항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인 것인 벡터.
  92. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또는 키메릭 항원 리셉터를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주세포.
  93. 제92항에 있어서, T 세포인 것인 숙주세포.
  94. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또는 키메릭 항원 리셉터 및/또는 제88항의 핵산 분자를 포함하는 세포를 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인과 접촉하는 것을 포함하는 세포의 활성화 방법.
  95. 제94항에 있어서, 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인이 고형 표면에 부착되거나/되고 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인이 동원성(cognate) 리셉터, 항-태그 항체, 및/또는 항-태그 scFv인 것인 방법.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 태그 카세트가 아미노산 서열 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열번호 1) 또는 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (서열번호 2)를 갖는 Strep 태그인 것인 방법.
  97. 제94항 내지 제96항 중 어느 하나의 항에 있어서, 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인이 비오틴 결합 단백질 또는 항-Strep 항체인 것인 방법.
  98. 제94항 내지 제97항 중 어느 하나의 항에 있어서, 결합 도메인이 평면, 아가로스, 수지, 3D 패브릭 매트릭스, 또는 비드(bead)에 부착되는 것인 방법.
  99. 제94항 내지 제98항 중 어느 하나의 항에 있어서, 결합 도메인이 마이크로비드 또는 나노비드에 부착되는 것인 방법.
  100. 제94항 내지 제99항 중 어느 하나의 항에 있어서, 활성화가 생체내 또는 생체외에서 수행되는 것인 방법.
  101. 제94항 내지 제100항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포가 T 세포 및/또는 인간 T 세포인 것인 방법.
  102. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 키메릭 항원 리셉터 및/또는 제88항의 핵산 분자를 포함하는 비자연적 세포를 태그 카세트 및 성장인자 사이토카인에 특이적인 결합 도메인과 세포 성장에 충분한 시간 동안 접촉시키는 것을 포함하는 세포 증식을 촉진하는 방법.
  103. 제102항에 있어서, 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인이 고형 표면에 부착되거나/되고 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인이 동원성 리셉터, 항-태그 항체 또는 항-태그 scFv인 것인 방법.
  104. 제102항 또는 제103항에 있어서, 태그 카세트가 아미노산 서열 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열번호 1) 또는 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (서열번호 2)를 갖는 Strep 태그인 것인 방법.
  105. 제102항 내지 제104항 중 어느 하나의 항에 있어서, 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인이 비오틴 결합 단백질 또는 항-Strep 태그 항체인 것인 방법.
  106. 제102항 내지 제105항 중 어느 하나의 항에 있어서, 결합 도메인이 평면, 아가로스, 수지, 3D 패브릭 매트릭스, 또는 비드에 부착되는 것인 방법.
  107. 제102항 내지 제106항 중 어느 하나의 항에 있어서, 결합 도메인이 마이크로비드 또는 나노비드에 부착되는 것인 방법.
  108. 제102항 내지 제107항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성장인자 사이토카인이 IL2, IL15, 또는 둘 다인 것인 방법.
  109. 제102항 내지 제108항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포를 항-CD27 결합 도메인, 항-CD28 결합 도메인, 항-CD137 결합 도메인, 항-OX40 결합 도메인 또는 그의 조합과 인큐베이션하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 결합 도메인이 고형 표면에 부착되는 것인 방법.
  110. 제109항에 있어서, 항-CD27, 항-CD28, 항-CD137 결합 도메인, 항-OX40 결합 도메인 또는 그의 조합이 평면, 아가로스, 수지, 3D 패브릭 매트릭스, 또는 비드에 부착되는 것인 방법.
  111. 제102항 내지 제110항 중 어느 하나의 항에 있어서, 증식이 생체내 또는 생체외에서 유도되는 것인 방법.
  112. 제102항 내지 제111항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포가 T 세포이거나/이고 인간 T 세포인 것인 방법.
  113. 제112항에 있어서, T 세포가 기능성 T 세포인 것인 방법.
  114. 제113항에 있어서, 기능성 T 세포가 바이러스 특이적 T 세포, 종양 항원 특이적 세포독성 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 중추 기억 T 세포, 또는 CD4+ CD25+ 조절 T 세포인 것인 방법.
  115. 제102항 내지 제114항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 키메릭 항원 리셉터의 결합 도메인이 표적 세포 리간드와 결합할 때 증식이 생체내에서 유도되는 것인 방법.
  116. 제115항에 있어서, 표적 세포 리간드가 T 세포 억제자 세포 리간드인 것인 방법.
  117. 제116항에 있어서, T 세포 억제자 세포 리간드가 PD-L1 또는 PD-L2인 것인 방법.
  118. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 키메릭 항원 리셉터 및/또는 제88항의 핵산 분자를 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인과 접촉시키고(여기서, 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인은 검출가능한 모이어티를 포함한다),
    샘플 중 세포의 존재를 검출하는 것을 포함하는,
    세포의 동정방법.
  119. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 키메릭 항원 리셉터 및/또는 제88항의 핵산 분자를 포함하는 T 세포를 포함하는 샘플을 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인과 접촉시키고,
    결합 도메인에 의해 특이적으로 결합된 세포(들)를 기타 세포들로부터 선택 또는 소팅하여, 세포 또는 세포 집단을 기타 세포들로부터 선택 또는 소팅하는 것을 포함하는, 세포 또는 세포 집단을 소팅 또는 선별하는 방법.
  120. 제118항 또는 제119항에 있어서, 결합 도메인이 검출가능한 모이어티를 포함하고, 이 모이어티가 형광 마커인 것인 방법.
  121. 제118항 내지 제120항 중 어느 하나의 항에 있어서, 결합 도메인이 검출가능한 모이어티를 포함하고, 이것이 APC 또는 FITC인 것인 방법.
  122. 제118항 내지 제121항 중 어느 하나의 항에 있어서, 샘플이 혈액인 것인 방법.
  123. 제118항 내지 제122항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포가 유동세포계수법을 사용하여 검출되거나 소팅되는 것인 방법.
  124. 제118항 내지 제123항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포가 비자연적 세포, T 세포, 및/또는 인간 T 세포인 것인 방법.
  125. 제88항의 핵산 분자 및/또는 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항의 단백질 또는 리셉터를 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인과 접촉시키고, 샘플 중에서 융합 단백질 또는 리셉터를 발현하지 않는 기타 세포들로부터 세포를 강화 또는 단리하는 것을 포함하는, 세포 또는 그의 집단을 강화 또는 단리하는 방법.
  126. 제125항에 있어서, 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인이 동원성 리셉터, 항-태그 항체, 또는 항-태그 scFv인 것인 방법.
  127. 제125항 또는 제126항에 있어서, 태그 카세트가 아미노산 서열 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열번호 1) 또는 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (서열번호 2)를 갖는 Strep 태그인 것인 방법.
  128. 제125항 내지 제127항 중 어느 하나의 항에 있어서, 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인이 비오틴 결합 단백질 또는 항-Strep 태그 항체인 것인 방법.
  129. 제125항 내지 제128항 중 어느 하나의 항에 있어서, 결합 도메인이 평면, 아가로스, 수지, 3D 패브릭 매트릭스, 또는 비드에 부착되는 것인 방법.
  130. 제125항 내지 제129항 중 어느 하나의 항에 있어서, 결합 도메인이 마이크로비드 또는 나노비드에 부착되는 것인 방법.
  131. 제125항 내지 제130항 중 어느 하나의 항에 있어서, 활성화가 생체외에서 수행되는 것인 방법.
  132. 제125항 내지 제131항 중 어느 하나의 항에 있어서, 강화 또는 단리 전에 제102항 내지 제117항 중 어느 하나의 항에 따른 샘플에서 세포 집단을 확장하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  133. 제125항 내지 제132항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포가 비자연적 세포, T 세포, 및/또는 인간 T 세포인 것인 방법.
  134. 제125항 내지 제132항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포가 자기 컬럼 크로마토그래피에 의해 샘플의 다른 성분들로부터 단리되거나, 강화되는 것인 방법.
  135. 제125항 내지 제134항 중 어느 하나의 항에 있어서, 강화 또는 단리된 세포 또는 세포 집단을 동정하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 동정 단계는 세포를 태그 카세트에 특이적이고 검출가능한 모이어티를 포함하는 결합 도메인과 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  136. 제135항에 있어서, 검출가능한 모이어티가 형광 마커인 것인 방법.
  137. 제135항 또는 제136항에 있어서, 검출가능한 모이어티가 APC, PE, 퍼시픽 블루, 알렉스 플루오르(Alex fluor), 또는 FITC인 것인 방법.
  138. 제135항 내지 제137항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 또는 집단을 유동세포계수법을 사용하여 검출하는 것인 방법.
  139. 제125항 내지 제138항 중 어느 하나의 항에 있어서, 샘플이 혈액이거나 혈액 유래 샘플인 것인 방법.
  140. 제88항의 핵산 분자 또는 제1항 내지 제85항 중 어느 하나의 항에 따른 단백질 또는 리셉터를 포함하는 세포를 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인의 결합은 융합 단백질 또는 키메릭 리셉터를 발현하는 세포의 세포 사멸을 유도하는 것인, 세포의 고갈(depleting) 방법.
  141. 제140항에 있어서, 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인이 동족 리셉터, 항-태그 항체, 항-태그 scFv, 또는 그의 세포 표면 상에 항-태그 결합 도메인을 가진 세포인 것인 방법.
  142. 제140항 또는 제141항에 있어서, 태그 카세트가 아미노산 서열 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열번호 l) 또는 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (서열번호2)를 가지는 Strep 태그인 것인 방법.
  143. 제140항 내지 제142항 중 어느 하나의 항에 있어서, 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인이 비오틴 결합 단백질, 항-Strep 태그 항체, 또는 그의 세포 표면 상에서 항-Strep 태그 결합 도메인을 발현하는 세포인 것인 방법.
  144. 제140항 내지 제143항 중 어느 하나의 항에 있어서, 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인이 이중특이적 결합 도메인이고, 여기서 제1 결합 도메인은 태그 카세트에 특이적이고 제2 결합 도메인은 CD3에 특이적인 것인 방법.
  145. 제140항 내지 제143항 중 어느 하나의 항에 있어서, 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인이 세포독성, 방사성 동위원소, 라디오메탈 또는 검출시약을 추가로 포함하는 것인 방법.
  146. 제145항에 있어서, 생체내에서 비천연 T 세포를 트래킹하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인은 검출시약을 포함하는 것인 방법.
  147. 제140항 내지 제146항 중 어느 하나의 항에 있어서, 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인이 대상체에 투여되는 것인 방법.
  148. 제147항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  149. 제147항 또는 제148항에 있어서, 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인의 투여 후 대상체에서 사이토카인 수준을 모니터링하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  150. 제147항 내지 제149항 중 어느 하나의 항에 있어서, 대상체에서 세포를 트래킹하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  151. 제150항에 있어서, 생체내 트래킹이 자성 입자, 초상자성 산화철 (SPIO), 플루오로데옥시글루코스 (18F), 형광 화합물, 또는 그의 조합에 접합된 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인의 사용을 포함하는 방법.
  152. 제150항 또는 제151항에 있어서, 생체내 트래킹이 MRI, PET, 또는 근적외선의 사용을 포함하는 방법.
  153. 비천연 전구세포를 포함하는 샘플을 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인 및 성장인자와 세포 성장 및 분화가 일어나는데 충분한 시간 동안 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 비천연 전구세포는 제50항 내지 제85항 중 어느 하나의 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 태그 카세트에 특이적인 결합 도메인은 고체 표면에 부착되는 것인, 소정 세포 집단의 발생 방법.
  154. 제153항에 있어서, 전구세포가 줄기세포인 것인 방법.
  155. 제153항에 있어서, 확장된 전구세포 집단이 제125항 내지 제139항 중 어느 하나의 항에 따른 방법을 사용하여 추가로 단리 또는 강화되는 것인 방법.
  156. 대상체에 제92항 또는 제93항에 따른 숙주세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법.
  157. 제156항에 있어서, 질환이 바이러스, 박테리아, 암, 염증성, 면역 또는 연령-관련 질환인 것인 방법.
  158. 제156항 또는 제157항에 있어서, 대상체가 인간인 것인 방법.
  159. 제156항 내지 제158항 중 어느 하나의 항에 있어서, 숙주세포가 T 세포 또는 자가 T 세포인 것인 방법.
  160. 제159항에 있어서, T 세포가 조절 T 세포인 것인 방법.
  161. 제159항에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포인 것인 방법.
  162. 제156항 내지 제158항 중 어느 하나의 항에 있어서, 숙주세포가 줄기세포인 것인 방법.
  163. 대상체에 태그 카세트에 대한 결합 도메인 및 공-자극 분자에 대한 결합 도메인을 포함하는 매트릭스를 투여하고, 제92항에 따른 숙주세포를 투여하고, 여기서 숙주세포와 매트릭스 조성물 내 결합 도메인의 조합이 숙주세포를 활성화시키는 것인, 면역 세포의 생체내 국소적 활성화 방법.
  164. 매트릭스 조성물이 알기네이트, 기저막 매트릭스, 또는 바이오폴리머를 포함하는 것인 생체내 국소적 활성화 방법.
  165. 면역 세포가 T 세포인 것인 생체내 국소적 활성화 방법.
  166. 대상체에 태그 카세트에 대한 결합 도메인 및 공-자극 분자에 대한 결합 도메인을 포함하는 장치를 투여하고, 제92항에 따른 숙주세포를 투여하고, 여기서 숙주세포와 매트릭스 조성물 내 결합 도메인의 조합이 숙주세포를 활성화시키는 것인, 면역 세포의 생체내 국소적 활성화 방법.
  167. 장치가 평면, 아가로스 비드, 수지, 3D 패브릭 매트릭스, 또는 비드인 것인 생체내 국소적 활성화 방법.
  168. 면역 세포가 T 세포인 것인 생체내 국소적 활성화 방법.
  169. 대상체에 검출가능한 모이어티를 포함하는 결합 분자를 투여하는 것을 포함하거나 (여기서 상기 대상체는 제92항 또는 제93항에 따른 세포가 투여된다), 또는 대상체에 제92항 또는 제93항에 따른 세포를 투여하는 것을 추가로 포함하고 (상기 결합 분자는 융합 단백질 또는 키메릭 리셉터 내에 포함된 태그 카세트(들)에 특이적으로 결합한다), 상기 투여 후 상기 대상체에서 또는 상기 대상체로부터 얻은 샘플에서 상기 분자의 존재를 생체내 검출하여 상기 대상체 또는 그의 조직 또는 유체에서 상기 세포를 검출하는 단계를 포함하는, 세포의 트래킹 방법.
  170. 제169항에 있어서, 상기 세포의 상기 투여를 추가로 포함하고, 여기서 상기 세포 및 상기 결합 분자는 동시에 투여되는 것인 방법.
  171. 제170항에 있어서, 상기 결합 분자 및 상기 세포가 복합체로서 투여되는 것인 방법.
  172. 제150항에 있어서, 결합 분자가 자성 입자, 초상자성 산화철 (SPIO), 플루오로데옥시글루코스 (18F), 형광 화합물, 또는 그의 조합에 접합된 것인 방법.
  173. 제150항 또는 제151항에 있어서, 트래킹이 생체내에서 수행되고 MRI, PET, 또는 근적외선 이미징의 사용을 포함하는 것인 방법.
  174. 태그 카세트에 대한 결합 도메인 및 면역 세포 공-자극 분자에 대한 결합 도메인을 포함하는 매트릭스 조성물.
  175. 제174항에 있어서, 알기네이트, 기저막 매트릭스, 또는 바이오폴리머를 추가로 포함하는 매트릭스 조성물.
  176. 태그 카세트에 대한 결합 도메인 및 면역 세포 공-자극 분자에 대한 결합 도메인을 포함하는 장치.
  177. 제176항에 있어서, 결합 도메인 중 어느 하나 또는 둘 다 표면, 아가로스 비드, 수지, 3D 패브릭 매트릭스, 또는 비드 상에 배치된 것인 장치.
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