CN107365387B - 一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107365387B
CN107365387B CN201610316117.XA CN201610316117A CN107365387B CN 107365387 B CN107365387 B CN 107365387B CN 201610316117 A CN201610316117 A CN 201610316117A CN 107365387 B CN107365387 B CN 107365387B
Authority
CN
China
Prior art keywords
construct
antigen
cells
cell
slit2d2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610316117.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN107365387A (zh
Inventor
李华顺
任宝永
樊向梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asco (suzhou) Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Asclepius Suzhou Technology Company Group Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asclepius Suzhou Technology Company Group Co Ltd filed Critical Asclepius Suzhou Technology Company Group Co Ltd
Priority to CN201610316117.XA priority Critical patent/CN107365387B/zh
Priority to US16/300,650 priority patent/US11339225B2/en
Priority to PCT/CN2017/083961 priority patent/WO2017193956A1/zh
Publication of CN107365387A publication Critical patent/CN107365387A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107365387B publication Critical patent/CN107365387B/zh
Priority to US17/711,121 priority patent/US11680106B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用，所述的构建体包括第一抗原结合单元和第二抗原结合单元，所述的第一抗原结合单元为特异性结合免疫细胞表面抗原的单链可变区抗体片段ScFV，所述的第二抗原结合单元为特异性结合肿瘤细胞表面抗原Robo1的Slit2D2蛋白片段。即所述的构建体能够同时结合免疫细胞表面抗原和肿瘤细胞表面Robo1分子，从而拉近肿瘤细胞和免疫细胞间的距离，有效激活静止的免疫细胞，起到杀伤肿瘤的效果，且具有分子量小、组织穿透性好等优点，对高表达Robo1肿瘤细胞具有显著的杀伤效果，可用于抗肿瘤药物的开发。

Description

一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，具体涉及一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用。
背景技术
Robo是一次跨膜的受体蛋白，在哺乳动物中，已经克隆到4个Robo基因。从物种进化的角度看，Robo1,2,3的胞外部分非常保守，从果蝇到人类都是由5个Ig样功能区和3个FibronectinIII型重复序列组成。Robos有很短的跨膜区域和一个较长的胞内区；按照序列的保守性，胞内区被划分为4个更小的区域，分别命名为：CC0,CC1,CC2,CC3。Robos胞外的IgG domains被认为是与配体Slit结合所必需的，较长的胞内区域则和一些重要的信号分子相互作用，参与Slit/Robo下游的信号转导，从而完成刺激信号由细胞外部到内部骨架的传递。目前，已完成slit2与Robo相互作用区域蛋白质的机构解析，发现slit2的第二个结构域D2与Robo1的Ig1结合，进而启动信号传导。
组织病理学检测显示Robo1在多种癌症中过表达，如肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤等。有研究显示Robo1在肝癌中大量表达，而在正常组织中只有少量表达，且84.7％的肝癌组织样本为阳性表达；80％的结肠癌患者的癌组织高度表达Robo1mRNA，45％的患者是正常组织的4倍，15％的患者是正常组织的12倍，因此Robo1可以作为一种新的肿瘤相关抗原，是一种潜在的治疗和诊断靶标。
分化簇3(CD3)分子仅存在于T细胞表面，常与T细胞受体(T cell receptor，TCR)紧密结合形成TCR-CD3复合体，具有T细胞活化信号转导，稳定TCR结构的功能。
本发明通过提供一种具有分别可结合CD3和Robo1的抗原结合部位的双特异性抗原结合构建体，可有效地激活静止的T细胞，达到杀伤病变细胞的目的。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种双特异性抗原结合构建体，所述的构建体包括第一抗原结合单元单元和第二抗原结合单元，所述的第一抗原结合单元为特异性结合免疫细胞表面抗原的单链可变区抗体片段(single-chain variable fragment，ScFV，又称为单链抗体)；所述的第二抗原结合单元为特异性结合肿瘤细胞表面抗原Robo1的Slit2D2片段，其具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
优选的，所述的免疫细胞选自：T细胞、NKT细胞和CIK细胞；更优选为T细胞；
优选的，所述的第一抗原结合单元特异性结合免疫细胞表面抗原CD3；
优选的，所述的ScFV包括重链可变区结构域(heavy chain variable region，VH)和轻链可变区结构域(light chain variable region，VL)；所述的ScFV中，VH通过C末端与VL的N末端连接，或VH通过N末端与VL的C末端连接；所述的连接可为直接连接，无任何连接肽，即仅通过形成肽键实现连接；也可通过连接肽实现；优选的，所述的连接通过连接肽实现，所述的连接肽为含1-20个氨基酸的多肽，更优选为10-16个氨基酸，进一步优选为14个氨基酸；
所述的VH具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
所述的VL具有与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
优选的，所述的ScFV具有与选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
优选的，所述的构建体中，Slit2D2通过C末端与ScFV的N末端连接，或Slit2D2通过N末端与ScFV的C末端连接；所述的连接可为直接连接，无任何连接肽，即仅通过形成肽键实现连接；也可通过连接肽实现；优选的，所述的连接通过连接肽实现，所述的连接肽为含1-10个氨基酸的寡肽，更优选为3-7个氨基酸，进一步优选为5个氨基酸；
在本发明的一个实施例中，所述的构建体的构建方式包括：VH-VL-Slit2D2、VL-VH-Slit2D2、Slit2D2-VH-VL、Slit2D2-VL-VH，“-”表示连接键或连接肽。
在本发明的一个优选实施例中，所述的构建体具有与选自SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
本发明还提供一种编码上述构建体蛋白的基因。
本发明还提供一种上述构建体相关的生物材料，包括含有上述编码构建体蛋白的基因的重组载体、重组细胞、重组菌株、重组病毒。
本发明所述的构建体可人工合成，也可先合成其编码基因，再通过生物表达得到。
本发明还提供一种上述构建体的制备方法，其具体步骤包括：
(1)重组载体的构建；
(2)转化体的制备和发酵；
(3)构建体蛋白的分离和纯化；
任选的，(4)构建体蛋白的鉴定。
所述的步骤(1)包括以下具体步骤：
通过全基因合成得到编码构建体蛋白的基因片段，以其为模板，通过PCR扩增得到PCR产物，纯化回收上述产物，将其克隆至载体质粒中，将得到的重组载体转化到第一宿主细胞后转种到含有氨苄青霉素(AMP)的固体培养基中进行繁殖、筛选阳性克隆、通过测序确认载体构建成功并保种；
所述的载体质粒为pCDNA质粒，优选为pCDNA4.3；
所述的第一宿主细胞包括但不限于大肠杆菌菌株，优选为TOP10菌株；
所述的步骤(2)包括以下具体步骤：
在第一宿主细胞中提取重组载体；
培养第二宿主细胞，当细胞密度达到2.5×106细胞/毫升时转染已提取的重组载体，成功转染目标基因的第二宿主细胞为转化体，筛选转化体，进行转化体的发酵，5天后收集上清；
所述的第二宿主细胞包括但不限于ExpiCHO细胞。
所述的步骤(3)包括以下具体步骤：
取步骤(2)收集的培养液上清，高速离心，分离并纯化构建体蛋白；
所述的纯化包括但不限于离子交换层析纯化蛋白。
所述的步骤(4)包括以下具体步骤：
鉴定融合蛋白的分子量和纯度。
所述的融合蛋白的分子量鉴定可以通过一般的蛋白生化手段检测，包括但不限于：SDS-PAGE、Western blotting、质谱MS等。
所述融合蛋白的纯度通过SEC-HPLC检测蛋白。
本发明还提供一种药物组合物，包括上述双特异性抗原结合构建体，以及药学上可接受的辅料。
本发明所述的药物组合物可以为片剂(包括糖衣片剂，膜包衣片剂，舌下片剂，口腔崩解片，口腔片剂等等)，丸剂，粉剂，颗粒剂，胶囊剂(包括软胶囊，微胶囊)，锭剂，糖浆剂，液体，乳剂，混悬剂，控制释放制剂(例如，瞬时释放制剂，缓释制剂，缓释微囊)，气雾剂，膜剂(例如，口服崩解膜剂，口腔粘膜-粘附膜剂)，注射剂(例如，皮下注射，静脉注射，肌内注射，腹膜内注射)，静脉滴注剂，透皮吸收制剂，软膏剂，洗剂，粘附制剂，栓剂(例如，直肠栓剂，阴道栓剂)，小药丸，鼻制剂，肺制剂(吸入剂)，眼睛滴剂等等，口服或胃肠外制剂(例如，静脉内，肌内，皮下，器官内，鼻内，皮内，滴注，脑内，直肠内等给药形式，给药至肿瘤的附近和直接给药至病变处)。优选的，所述的药物组合物为注射剂。
本发明所述的药学上可接受的辅料优选为药学上可接受的注射剂辅料，例如等渗的无菌盐溶液(磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等，或上述盐的混合物)，或干燥的例如是冷冻干燥的组合物，其适当地通过加入无菌水或生理盐水形成可注射溶质。
本发明还提供一种上述双特异性抗原结合构建体在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供一种上述双特异性抗原结合构建体在抗肿瘤药物的筛选和药效评价中的应用。
优选的，所述的肿瘤为高表达Robo1的肿瘤及相关疾病，此处所述的高表达指肿瘤细胞中Robo1的表达水平高于正常细胞中其表达水平。
本发明中术语“结构域”是指是生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，例如Slit2蛋白D2结构域是指Slit2蛋白中4个富含亮氨酸的重复序列中的第二结构域。
本发明提供的双特异性抗原结合构建体，能够同时结合免疫细胞表面抗原和肿瘤细胞表面Robo1分子，尤其是免疫细胞表面CD3分子和肿瘤细胞表面Robo1分子，从而拉近肿瘤细胞和免疫细胞间的距离，有效激活静止的免疫细胞，尤其是T细胞，起到杀伤肿瘤的效果，与传统抗体相比，具有分子量小、组织穿透性好等优点，对高表达Robo1肿瘤细胞具有显著的杀伤效果，可用于抗肿瘤药物的开发。实验表明，本发明的双特异性抗原结合构建体VH-VL-Slit2D2、LV-VH-Slit2D2、Slit2D2-VL-VH、Slit2D2-VH-VL对乳腺癌细胞MDA-MB-231、肝癌细胞SMCC7721均具有较高的杀伤活性。
附图说明
图1为本发明的双特异性抗原结合构建体的构建示意图。
图2为本发明的双特异性抗原结合构建体表达载体图谱。
图3为实施例1中双特异性抗原结合构建体蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中M为标志物泳道，6和7为双特异性抗原结合构建体蛋白泳道。
图4为实施例2中检测药物活性的肿瘤杀伤实验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：双特异性抗原结合构建体Slit2D2-ScFV的制备
本实施例制备的双特异性抗原结合构建体为Slit2D2-VH-VL，其构建示意图如图1所示。
1.蛋白表达
1.1实验材料：
细胞株：ExpiCHO-STMcells(Gibco Catalog No.A29127)
转染试剂盒：ExpiFectamineTMCHO Transfection Kit(Gibco CatalogNo.A29129)OptiPROTMSFM(Gibco Catalog No.12309-050)
培养基：ExpiCHOTMExpression Medium(Gibco Catalog No.A29100-01)
pCDNA3.4质粒载体(Invitron)
1.2实验过程：
依据设计的Slit2D2-ScFV的基因序列(如SEQ ID NO：8所示)，通过全基因合成得到Slit2D2-VH-VL基因片段，并以其为模板通过PCR扩增得到PCR产物，用胶回收试剂盒纯化回收上述产物。根据T-A克隆原理，将其克隆至pCDNA3.4载体中，重组质粒图谱如图2所示，然后转化至大肠杆菌TOP10中，氨苄青霉素筛选并挑取阳性克隆，并通过测序确认载体构建成功。用无内毒素DNA提取试剂盒提取质粒DNA，用于转染ExpiCHO-STM细胞。培养ExpiCHO-STM细胞，培养条件为：37℃、含8％CO2的培养箱，摇床培养，当密度达到2.5×106细胞/毫升时进行转染。在ExpiCHOTMExpression Medium中培养转染后的ExpiCHO-STM细胞，转染5天后收集培养液上清，高速离心，保留上清，用于后续纯化。
2.蛋白纯化
2.1实验仪器和材料：
AKTA蛋白纯化系统；
Binding Buffer：20mM磷酸盐、0.5M NaCl、20mM咪唑，调pH至7.4；
Elution Buffer：20mM磷酸盐、0.5M NaCl、500mM咪唑，调pH至7.4；
去离子水；
20％的乙醇溶液；
2.2实验过程：
(1)启动AKTA设备，将His柱与AKTA连接；
(2)使用3-5个柱体积的去离子水清洗His柱；
(3)使用5个柱体积的Binding Buffer平衡His柱；
(4)取出过滤的细胞上清液，依次流过His柱；
(5)使用Binding Buffer清洗杂蛋白，直至UV280处吸光值趋近于0；
(6)使用Elution Buffer洗脱目的蛋白，当UV280>400的时候开始收集洗脱液；
(7)PBS于4℃透析收集的蛋白洗脱液，透析后的蛋白保存于-80℃；
(8)蛋白收集结束后，使用10个柱体积的Binding Buffer冲洗His柱；
(9)使用10个柱体积的去离子水清洗His柱；
(10)使用10个柱体积的20％的乙醇清洗His柱，并将His柱保存于20％的乙醇中，4℃存放；
(11)透析袋透析去除盐离子，置换为PBS溶液保存蛋白。
注：a.纯化过程中所使用的试剂均需用0.45um滤膜过滤。
b.纯化过程中禁止空气进入His柱。
c.整个过程应在冰上操作，以防蛋白失活。
2.3实验结果
利用上述纯化过程获得目的蛋白，其SDS-PAGE电泳图如图3所示。由图3可知，目的蛋白分子量约为55KD，且纯度非常高，未检测到杂蛋白，表明已成功构建Slit2D2-VH-VL的重组表达载体，并实现其在宿主细胞中的表达。
实施例2肿瘤杀伤实验检测药物活性
采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase；LDH)释放法测定药物对肿瘤细胞的杀伤活性。
1.1实验材料：
检测试剂盒：CytoTox
Figure BDA0000988586450000071
Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit(promega)；
试剂盒成分：5vials Substrate Mix、60ml Assay Buffer、25μl LDH PositiveControl、5ml Lysis Solution(10X)、65ml Stop Solution；
靶细胞：乳腺癌细胞MDA-MB-231、肝癌细胞SMCC7721、PBMC；
药物：双特异性抗原结合构建体蛋白Slit2D2-VH-VL(实施例1制备纯化得到)；
培养基：DMEM(10％FBS，5％双抗)(Gibco)、T细胞培养基(Gibco)；
试剂准备：Assay Buffer在37℃下孵育，取12ml Assay Buffer加入SubstrateMix瓶中配制成CytoTox
Figure BDA0000988586450000081
Reagent。
1.2实验过程
(1)取靶细胞(MDA-MB-231/SMCC7721)，按100μl/4×103/孔加入96孔板；
取效应细胞PBMC，按100ul/2×105/孔加入96孔板(即效靶比50:1)；
药物设为3个梯度：1.2ug/ml、0.12ug/ml、0.012ug/ml；
LDH释放对照组的设计(每组均设6个复孔)：
(a)培养液对照组：单纯无血清1640培养液；
(b)LDH低释放组：靶细胞4×103/孔；
(c)LDH高释放组：靶细胞4×103/孔(培养结束后处理)；
(d)效应细胞对照组：PBMC 2×105/孔；
(2)将已加入细胞的96孔板置于37℃、体积分数5％CO2的培养箱中培养过夜(18-24小时)；
(3)培养结束后，在LDH高释放组中加入细胞裂解液(Lysis Solution10X)，10μl/孔，37℃孵育45-60min；
(4)将每孔细胞分别转移到EP管中，1000rpm离心5min；
(5)取50ul上述离心所得的上清液，加入酶标板中，于每孔中加入50ul CytoTox
Figure BDA0000988586450000082
Reagent，室温孵育30min；
(6)于每孔中加入50ul终止液(Stop Solution)终止反应；
(7)利用酶标仪检测步骤(6)得到的样品在492nm处的吸光度数值。
1.3实验结果：
对肿瘤细胞的杀伤活性的计算公式为：
Figure BDA0000988586450000083
实验结果如图4所示，由图4可知，药物(实施例1制备纯化的双特异性抗原结合构建体蛋白Slit2D2-VH-VL)对肝癌细胞SMCC-7721和乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞均具有显著的杀伤活性，且其杀伤活性随药物浓度升高而增强。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0000988586520000011
Figure IDA0000988586520000021
Figure IDA0000988586520000031
Figure IDA0000988586520000041
Figure IDA0000988586520000051
Figure IDA0000988586520000061
Figure IDA0000988586520000071
Figure IDA0000988586520000081
Figure IDA0000988586520000091
Figure IDA0000988586520000101
Figure IDA0000988586520000111
Figure IDA0000988586520000121
Figure IDA0000988586520000131
Figure IDA0000988586520000141
Figure IDA0000988586520000151
Figure IDA0000988586520000161

Claims (6)

1.一种双特异性抗原结合构建体，所述的构建体包括第一抗原结合单元和第二抗原结合单元，所述的第一抗原结合单元为特异性结合免疫细胞表面抗原CD3的单链可变区抗体片段ScFV；所述的第二抗原结合单元为特异性结合肿瘤细胞表面抗原Robo1的Slit2D2片段；
所述的免疫细胞选自：T细胞、NKT细胞和CIK细胞；
所述的单链可变区抗体片段ScFV包括VH和VL；
所述的构建体选自SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8和SEQIDNO：9所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述的构建体的构建方式包括：VH-VL-Slit2D2、VL-VH-Slit2D2、Slit2D2-VH-VL、Slit2D2-VL-VH。
3.一种如权利要求1或2所述的构建体的制备方法，其具体步骤包括：
（1）重组载体的构建；
（2）转化体的制备和发酵；
（3）构建体蛋白的分离和纯化；
（4）构建体蛋白的鉴定，
步骤（1）包括以下具体步骤：
通过全基因合成得到编码构建体蛋白的基因片段，以其为模板，通过PCR扩增得到PCR产物，纯化回收，将其克隆至载体质粒中，将得到的重组载体转化到第一宿主细胞后转种到含有氨苄青霉素的固体培养基中进行繁殖、筛选阳性克隆、通过测序确认载体构建成功并保种；
所述的载体质粒为pCDNA质粒；
所述的第一宿主细胞包括但不限于大肠杆菌菌株；
步骤（2）包括以下具体步骤：
在第一宿主细胞中提取重组载体；
培养第二宿主细胞，当细胞密度达到2.5×106细胞/毫升时转染已提取的重组载体，成功转染目标基因的第二宿主细胞为转化体，筛选转化体，进行转化体的发酵，5天后收集上清；所述的第二宿主细胞包括但不限于ExpiCHO细胞。
4.一种药物组合物，包括权利要求1或2所述的双特异性抗原结合构建体以及药学上可接受的辅料。
5.一种权利要求1或2所述的双特异性抗原结合构建体在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为高表达Robo1的肿瘤及相关疾病。
CN201610316117.XA 2016-05-12 2016-05-12 一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用 Active CN107365387B (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610316117.XA CN107365387B (zh) 2016-05-12 2016-05-12 一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用
US16/300,650 US11339225B2 (en) 2016-05-12 2017-05-11 Bispecific antigen-binding construct and preparation method and use thereof
PCT/CN2017/083961 WO2017193956A1 (zh) 2016-05-12 2017-05-11 一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用
US17/711,121 US11680106B2 (en) 2016-05-12 2022-04-01 Bispecific antigen-binding construct and preparation method and use thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610316117.XA CN107365387B (zh) 2016-05-12 2016-05-12 一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107365387A CN107365387A (zh) 2017-11-21
CN107365387B true CN107365387B (zh) 2022-03-15

Family

ID=60266297

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610316117.XA Active CN107365387B (zh) 2016-05-12 2016-05-12 一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11680106B2 (zh)
CN (1) CN107365387B (zh)
WO (1) WO2017193956A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108218993B (zh) * 2018-01-05 2020-11-17 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 一种以robo1为靶点的双特异性抗体及其制备和应用
CN107987169B (zh) * 2018-01-05 2021-10-08 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 一种以ROBO1为靶点的双特异性抗体scFv及其制备和应用
KR20230031981A (ko) 2019-05-14 2023-03-07 프로벤션 바이오, 인코포레이티드 제1형 당뇨병을 예방하기 위한 방법 및 조성물
MX2022015872A (es) 2020-06-11 2023-05-16 Provention Bio Inc Metodos y composiciones para prevenir diabetes tipo 1.
CN117405884B (zh) * 2023-08-14 2024-05-17 珠海朗泰生物科技有限公司 一种羊全血布鲁氏菌检测试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1795208A (zh) * 2003-05-31 2006-06-28 麦克罗梅特股份公司 用于治疗b细胞相关疾病的包含双特异性抗cd3、抗cd19抗体构建体的药物组合物
CN104487587A (zh) * 2012-04-20 2015-04-01 新兴产品开发西雅图有限公司 Cd3结合多肽
WO2015095895A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Tagged chimeric effector molecules and receptors thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE602005022693D1 (de) * 2004-03-31 2010-09-16 Perseus Proteomics Inc Krebsdiagnose und behandlung unter verwendung eines anti-robo1-antikörpers
ME02505B (me) * 2009-12-29 2017-02-20 Aptevo Res & Development Llc Heterodimerni vezujući proteini i njihove upotrebe
KR102472862B1 (ko) * 2014-03-20 2022-12-05 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 혈청 알부민-결합 피브로넥틴 유형 iii 도메인
CA2947429A1 (en) 2014-05-02 2015-11-05 Emory University Humanized variable lymphocyte receptors (vlr) and compositions and uses related thereto
CN104774268B (zh) 2015-01-21 2018-09-28 武汉友芝友生物制药有限公司 一种双特异性抗体egfr×cd3的构建及应用
CN106589129B (zh) 2016-12-30 2021-03-05 上海近岸生物科技有限公司 一种结合cd19、cd3和cd28的三功能分子及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1795208A (zh) * 2003-05-31 2006-06-28 麦克罗梅特股份公司 用于治疗b细胞相关疾病的包含双特异性抗cd3、抗cd19抗体构建体的药物组合物
CN104487587A (zh) * 2012-04-20 2015-04-01 新兴产品开发西雅图有限公司 Cd3结合多肽
WO2015095895A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Tagged chimeric effector molecules and receptors thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Structural insights into the Slit-Robo complex;MORLOT，C.等;《PNAS》;20070918;第104卷(第38期);14923-14928 *

Also Published As

Publication number Publication date
US11680106B2 (en) 2023-06-20
US20220251238A1 (en) 2022-08-11
CN107365387A (zh) 2017-11-21
WO2017193956A1 (zh) 2017-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107365387B (zh) 一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用
CN107814845B (zh) 新的抗pd-1纳米抗体及其应用
CN107216389B (zh) 抗pd-l1纳米抗体及其编码序列和用途
US9493557B2 (en) Chemokine binding polypeptides for treating autoimmunity and inflammation
EP4028423A1 (en) Anti-pd-l1 single-domain antibody and derivatives and use thereof
US8404803B2 (en) Cancer-associated antigen analogue peptides and uses thereof
CN111925451B (zh) 一种靶向bcma的嵌合抗原受体(car)及其应用
CN107298715B (zh) Slit2D2-嵌合抗原受体及其应用
CN109897107B (zh) 纳米抗体及其制备方法
CN112574311A (zh) 双mic结合活性的抗体及其应用
CN106164090A (zh) TRAIL穿膜肽样突变体MuR6、制备方法及应用
IL295278A (en) cho cell expressing heterodimers of il-15
CN103897036A (zh) 一种pd-1蛋白胞外段亲和肽l8及其应用
WO2024056098A1 (zh) NKG2D-NKp46细胞接合器分子及其用途
CN108642070B (zh) 特异性诱导肿瘤细胞凋亡的重组人Fc抗体及其制备方法、用途
CN111793134A (zh) 一种用于癌症治疗中的药物、肿瘤疫苗及抑制剂
US11339225B2 (en) Bispecific antigen-binding construct and preparation method and use thereof
WO2022011717A1 (zh) 针对新型冠状病毒的纳米抗体及其应用
CN110615847A (zh) TCRγδ为靶点的嵌合抗原受体及其应用
CN113354715B (zh) Egfr的改造的结合蛋白及其应用
CN114380907B (zh) 靶向cmtm6的纳米抗体及其制备方法和应用
CN111153997B (zh) 抗ctla-4纳米抗体及其在肿瘤治疗中的应用
CN115124621A (zh) 靶向pd-l1的纳米抗体及其制备方法和应用
CN104628864B (zh) 一种抗肿瘤融合蛋白EL-defensin、其编码基因和用途
CN116253774A (zh) 一种tim-3亲和肽及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20181016

Address after: 215123 unit 427, building A2, 218 Xing Hu Street, Suzhou Industrial Park, Suzhou, Jiangsu.

Applicant after: ASCO (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 215123 218 Xing Hu Street, Suzhou, Jiangsu

Applicant before: Li Huashun

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant