CN104487587A - Cd3结合多肽 - Google Patents

Cd3结合多肽 Download PDF

Info

Publication number
CN104487587A
CN104487587A CN201380027109.8A CN201380027109A CN104487587A CN 104487587 A CN104487587 A CN 104487587A CN 201380027109 A CN201380027109 A CN 201380027109A CN 104487587 A CN104487587 A CN 104487587A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
binding
territory
cell
binding domain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380027109.8A
Other languages
English (en)
Inventor
P·H·坦
S·K·纳塔拉詹
C·J·麦克马汉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aptevo Research and Development LLC
Original Assignee
Emergent Product Development Seattle LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Emergent Product Development Seattle LLC filed Critical Emergent Product Development Seattle LLC
Publication of CN104487587A publication Critical patent/CN104487587A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及与CD3特异性结合或相互作用的单特异性和多特异性多肽。这些多肽可以是，但不限于：抗体、其片段、scFv、Fab、双scFv单域抗体、双链抗体、双可变域结合蛋白和含有抗体或抗体片段的多肽。在一个实施方案中，多特异性多肽结合T细胞上的T细胞受体复合物和肿瘤抗原以诱导靶依赖性T细胞细胞毒性、活化和增殖。

Description

CD3结合多肽
相关申请
本发明涉及2012年4月20日提交的标题为“Prostate-SpecificMembrane Antigen Binding Proteins And Related Compositions AndMethods”的PCT申请PCT/US12/034575，所述PCT申请要求2011年4月22日提交的美国临时专利申请61/478,449的优先权，且还涉及美国申请号61/636,557，该三个文献全部以全文引用的方式并入。
发明领域
本发明涉及结合CD3或与其相互作用的单特异性和多特异性蛋白治疗剂。这包括抗体、其片段、scFv、Fab、双scFv单域抗体和含有抗体或抗体片段的多肽。
随附序列表
与本文一起以电子形式提交的文本文件(名称：“2479_113PC03_SequenceListing_ascii.txt”，大小：459,722字节；创建日期：2013年4月16日)的内容以全文引用的方式并入本文中。
背景
用抗CD3单克隆抗体靶向人T细胞上的TCR复合物已经用于或提议用于治疗自体免疫疾病和相关病症，诸如用于治疗器官同种异体移植排斥。对人CD3特异性的小鼠单克隆抗体，诸如OKT3(Kung等(1979)Science 206:347-9)是所述治疗的第一代。尽管OKT3具有强免疫抑制效能，但与其免疫原性和促有丝分裂潜力相关的严重副作用妨碍了其临床使用(Chatenoud(2003)Nature Reviews 3:123-132)。它诱导抗球蛋白反应，从而促进其自身快速清除和中和(Chatenoud等(1982)Eur.J.Immunol.137:830-8)。另外，OKT3在体外诱导T细胞增殖和细胞因子产生，且在体内导致细胞因子的大规模释放(Hirsch等(1989)J.Immunol 142:737-43,1989)。细胞因子释放(也称为“细胞因子风暴”又导致以发烧、寒战、头疼、恶心、呕吐、腹泻、呼吸窘迫、无菌性脑膜炎和血压过低为特征的“流感样”综合征(Chatenoud,2003)。所述严重副作用限制了OKT3更广泛地用于移植中以及将其用途扩展到其它临床领域，诸如自体免疫性(同上)。
为了减少第一代抗CD3单克隆抗体的副作用，已经不仅通过鼠类抗CD3单克隆抗体的将互补性决定区(CDR)移植到人IgG序列中，而且通过将非FcR结合突变引入到Fc中以减少细胞因子风暴的发生而开发出了第二代经基因工程改造的抗CD3单克隆抗体(Cole等(1999)Transplantation 68:563；Cole等(1997)J.Immunol.159:3613)。还参见PCT公布号WO2010/042904，该文献以全文引用的方式并入本文中。
除了靶向CD3的单特异性治疗剂以外，选择性地结合T细胞和肿瘤细胞的多特异性多肽也能提供重定向T细胞细胞毒性以针对肿瘤细胞和治疗癌症的机制。然而，设计双特异性或多特异性T细胞募集抗体的一个问题在于维持特异性而同时通过多个调整路径而越过T细胞活化规则。
仍然需要改良的抗CD3单特异性和多特异性分子。尽管先前已经对CD3靶向分子的Fc部分进行了改良以降低细胞因子风暴的可能性，但仍需要与现有技术分子相比具有增加的半衰期、可以有效地制造、展现改良的T细胞结合和/或改良的重定向T细胞细胞毒性(在设计用于治疗癌症的多特异性分子的情况下)的抗CD3治疗剂。
发明概述
在一个方面，本发明包括一种CD3结合多肽，其包含与具有氨基酸序列SEQ ID NO:41的结合域相比具有降低的等电点的CD3结合域。在某些实施方案中，所述CD3结合域包含VH和VL区，VH和VL区各自含有构架区。为了降低所述结合域和/或多肽的等电点(pI)，可以通过用中性氨基酸取代带正电的氨基酸和/或用带负电的氨基酸取代中性氨基酸来修饰构架区中的两个或更多个氨基酸。举例来说，可以用S取代R和T，可以用E取代Q，可以用F取代Y，且可以用V取代T。在一个实施方案中，例如，为了降低免疫原性的风险，取代到序列中的氨基酸是人生殖细胞系IgG序列中普遍存在的或包含在人生殖细胞系序列中的相同或邻近的位置，例如在对应的人生殖细胞系IgG序列中。在一些实施方案中，所述人生殖细胞系IgG序列包含SEQ ID NO:43或44。
在本发明的另一个实施方案中，所述CD3结合多肽在前铰链区(prehinge region)中包含能降低所述前铰链区或整个多肽的pI的修饰。所述前铰链区处于所述结合域与铰链区之间的接合处。举例来说，可以用序列SSS置换具有序列RRT的三氨基酸前铰链区以降低等电点。在一些实施方案中，前铰链区与具有RRT前铰链区的CD3结合多肽相比具有降低的等电点。
可以设计CD3结合多肽以便例如通过使VH和/或VL区和/或前铰链区的构架区突变来降低等电点。等电点可以降低0.5到2.5或更多个单位。
在本发明的一个实施方案中，所述CD3结合多肽是抗体，例如人源化抗体。在另一个实施方案中，它是一种小模块式免疫药物蛋白(SMIP)。在一些实施方案中，CD3结合多肽包含单链可变片段(scFv)。
在另一个实施方案中，它是多特异性或双特异性多肽。举例来说，所述CD3结合多肽可以包含CD3结合域和肿瘤抗原结合域。在一个实施方案中，所述双特异性或多特异性分子重定向T细胞细胞毒性以针对肿瘤细胞。
在本发明的另一个实施方案中，所述CD3多肽作为同源二聚体或异源二聚体存在。
附图简述
图1是描绘先前产生的人源化Cris-7SMIP多肽的理论pI与约200种其它SMIP多肽的理论pI相比较的图。
图2A和2B说明了包含比本发明的CD3多肽高的pI的CD3结合SMIP多肽的剪接。图2A是能定量经过纯化的蛋白质的低分子量剪接段含量的SDS毛细管电泳。图2B含有剪接型CD3SMIP分子的说明。图2B中所示的序列对应于SEQ ID NO:4的氨基酸252-260、SEQ ID NO:4的243-252和SEQ ID NO:240的251-260。
图3是Cris-7小鼠VH与衍生的人源化VH序列的氨基酸序列比对。Cris7VH小鼠、H1、H2、H3、H4、H5、H6和共有序列分别对应于SEQ ID NO:45、22、24、26、28、30、32和229。
图4是Cris-7小鼠VL与衍生的人源化VL序列的氨基酸序列比对。Cris7VL小鼠、L1、L2、L3、L4和共有序列分别对应于SEQ IDNO:46、34、36、38、40和230。
图5是H3与生殖细胞系序列IGHV1-69*01和IGHV3-30*01的氨基酸序列比对。H3、IGHV1-69*01、IGHV3-30*01和共有序列分别对应于SEQ ID NO:26、43、44和331。
图6是生殖细胞系序列的VL区的Jκ区IGKV1-5*01与L1的氨基酸序列比对。所述VL区的Jκ区(IGKVI-5*01)、L1链和共有序列分别对应于SEQ ID NO:232、34和233。所列出的IGKJ1*01、IGKJ2*01、IGKJ3*01、IGKJ4*01和IGKJ5*01序列分别对应于SEQ IDNO:234-238。
图7A和7B描绘了与DRA209相比具有降低的理论pI的各种CD3结合多肽SMIP分子的氨基酸序列比对。针对DRA209、DRA219、DRA222、DRA221、DRA223、DRA224、DRA225和共有序列所列出的序列分别对应于SEQ ID NO:4的氨基酸1-423、SEQ ID NO:6的氨基酸1-423、SEQ ID NO:8的氨基酸1-423、SEQ ID NO:10的氨基酸1-423、SEQ ID NO:12的氨基酸1-423、SEQ ID NO:14的氨基酸1-426、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:239的氨基酸1-426。
图8是pI变体DRA233和DRA234与DRA161相比的氨基酸序列比对。针对DRA161、DRA233、DRA234和共有序列所列出的序列分别对应于SEQ ID NO:240、18、20和241。
图9是如何确定经验pI值的说明。
图10是显示DRA209SMIP和scFv的经验pI的图。
图11是显示DRA161SMIP与pI变体DRA233和DRA234相比的经验pI的图。
图12是显示用与DRA209和DRA161相同(DRA227除外)的方式结合T细胞的SMIP pI变体的图。DRA227SMIP用作对照且它不含CD3或T细胞结合域。各分子名称之后的字母“a”指示特定分子是在CHO细胞中产生且四位数是批次编号。
图13描绘了非还原型SDS-PAGE的图像，显示CD3结合SMIP构建体DRA233和DRA234与SMIP DRA161(它与DRA209共享相同的VH和VL)相比不那么倾向于破碎。
图14描绘了还原型SDS-PAGE的图像，显示CD3结合SMIP构建体DRA233和DRA234与SMIP DRA161(它与DRA209共享相同的VH和VL)相比不那么倾向于破碎。
图15是显示pI变体DRA233和DRA234主要是完整表达(例如，不进行剪接)的图和表。
图16是显示DRA161(经过纯化)的非还原型CE-SDS的图像。
图17显示了DRA234和DRA233的PK研究的数据。
图18提供了来自于如实施例14中所描述的DRA233和DRA234的WinNonLin分析的数据。
图19是DRA233和DRA234的PK估计值的表格。
图20是DRA161与DRA233(存在和不存在504小时时间点)和DRA234相比的PK参数的表格。
图21描绘了得自于使用不同的靶向CD19的同源二聚体双特异性多肽分子的靶依赖性T细胞增殖测定的结果。图21A和21B分别示出了如实施例10中所描述的CD4+T细胞增殖和CD8+T细胞增殖的结果。
图22描绘了得自于使用不同的靶向CD19的异源二聚体双特异性多肽分子的靶依赖性T细胞增殖测定的结果。图22A和22B分别示出了如实施例10中所描述的CD8+T细胞增殖和CD4+T细胞增殖的结果。
图23描绘了得自于使用不同的靶向CD19的多肽异源二聚体和同源二聚体的重定向T细胞细胞毒性测定的结果。图23A示出了同源二聚双特异性多肽TSC129a、TSC233和TSC234的结果。图23B示出了异源二聚双特异性多肽TSC127、TSC227和TSC228的结果。
图24描绘了得自于使用靶向RON的不同的双特异性多肽同源二聚体TSC275、TSC277、TSC278和TSC279的重定向T细胞细胞毒性测定的结果。
图25描绘了双特异性多肽异源二聚体和同源二聚体的T细胞结合的结果。图25A和25B示出了双特异性分子TSC228(异源二聚体)和TSC249(同源二聚体)与Jurkat细胞的剂量依赖性结合。
图26描绘了靶向PSMA的多肽同源二聚体的靶依赖性T细胞增殖的结果。图26A示出了在用TSC249处理后表达靶PSMA抗原的C4-2B细胞的结果。图26B示出了在用TSC249处理后不表达靶PSMA抗原的DU-145细胞的结果。图26C示出了当用TSC249处理经分离的T细胞时的结果。
图27描绘了得自于使用靶向PSMA的同源二聚双特异性多肽TSC194和TSC249的重定向T细胞细胞毒性测定的结果。
发明详述
本发明提供了与现有技术CD3结合多肽相比具有改良的特征的CD3结合多肽。已经通过修饰重链和/或轻链框架区和/或前铰链前铰链区中的氨基酸以降低分子的等电点而设计了本发明的分子以展现降低的等电点。在一个实施方案中，修饰是在VL区的Jκ区中进行。在一些实施方案中，修饰是通过用具有中性电荷的氨基酸取代具有正电荷的氨基酸和/或用具有负电荷的氨基酸取代具有中性电荷的氨基酸来进行。
在一些实施方案中，本发明的CD3结合多肽的理论pI比抗CD3DRA209SMIP(SEQ ID NO:4)低约0.5到2.5个单位。举例来说，DRA209的理论pI是9，而pI变体DRA219(SEQ ID NO:6)的理论pI是8.4，DRA221(SEQ ID NO:10)的理论pI是8.2，DRA222(SEQ IDNO:8)的理论pI是7.5，DRA223(SEQ ID NO:12)的理论pI是7.2，且DRA224(SEQ ID NO:14)的理论pI是6.8。在一些实施方案中，CD3结合多肽的经验等电点比多肽SEQ ID NO:4低至少1个pI单位。
令人惊讶的是，pI变体展现了改良的半衰期且在CHO细胞中表达得比DRA209更好，例如，参见以下实施例4，所述实施例描述了用于测量半衰期的方法。此外，与具有诸如DRA209结合域等其它抗CD3结合域的类似构建体相比，包含DRA222scFv的多特异性构建体展现了改良的性质(参见相关PCT公布号WO2012/145714)。
本文中所使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被视为限制所描述的主题。本文中所引用的所有文献或文献的部分，包括但不限于专利、专利申请、论文、书籍和专著，都以全文引用的方式明确并入在此以用于任何目的。在所并入的文献或文献的部分中的一者或多者的术语定义与本申请中的术语定义相矛盾的情况下，以本申请中出现的定义为准。
除非另外指出，否则在本发明描述中，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围都应理解为包括所述范围内的任何整数值，且当适当时，包括其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。除非另外指出，否则如本文中所使用，“约”意指所指示范围、值或结构的±20％。应理解，除非另外指出，否则如本文中所使用的术语“一个”和“一种”是指所枚举的组分中的“一个(种)或多个(种)”。使用代替性用词(例如“或”)应理解为意指代替物之一、两者或其任何组合。如本文中所使用，术语“包括”和“包含”以同义使用。另外，应理解，本申请对包含本文中所描述的组分(例如域或区)和取代基的各种组合的多肽的公开程度就如同个别地阐述各多肽。因而，个别多肽的特定组分的选择在本公开的范围内。
如本文中所使用，术语“结合域”或“结合区”是指能够特异性识别和结合诸如抗原、配体、受体、底物或抑制剂(例如CD3或肿瘤相关抗原，诸如RON、CD19、CD37或PSMA)等靶分子的蛋白质、多肽、寡肽或肽的域、区、部分或位点。示例性结合域包括单链抗体可变区(例如域抗体、sFv、scFv和scFab)、受体胞外域和配体(例如细胞因子、趋化因子)。在某些实施方案中，结合域包含以下各项或由以下各项组成：抗原结合位点(例如包含来自于置于交替构架区(FR)(例如任选地包含一个或多个氨基酸取代的人FR)中的抗体的可变重链序列和可变轻链序列或三个轻链互补决定区(CDR)和三个重链CDR)。已知多种用于鉴别本公开的特异性结合特定靶的结合域的测定，包括Western印迹、ELISA、噬菌体展示文库筛选和互相作用分析。如本文中所使用，CD3结合多肽可以具有“CD3结合域”和任选地存在的“第二结合域”。CD3结合域可以位于氨基或羧基末端。在某些实施方案中，CD3结合域包含来源于小鼠单克隆抗体(例如Cris-7或HuM291)的人源化scFv。举例来说，CD3结合域可以由源自于小鼠单克隆抗体的VH区和VL区构成，其中用诸如(Gly4Ser)3(SEQ IDNO:76)连接子等连接子接合VH区与VL区。在其它实施方案中，CD3结合域实质上由或由源自于小鼠单克隆抗体的人源化scFv组成。在一些实施方案中，本发明的CD3结合域包含鼠类Cris-7抗体或HuM291的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。
如果结合域以等于或大于105M-1的亲和力或Ka(即，特定结合相互作用的平衡缔合常数，单位是1/M)结合靶标而不显著结合测试样品中存在的其它组分，则它“特异性结合”靶标。结合域可以分类为“高亲和力”结合域和“低亲和力”结合域。“高亲和力”结合域是指具有至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1或至少1013M-1的Ka的那些结合域。“低亲和力”结合域是指具有最多107M-1、最多106M-1、最多105M-1的Ka的那些结合域。或者，亲和力可以定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)，单位为M(例如10-5M到10-13M)。根据本公开的结合域多肽和单链多肽的亲和力可以使用常规技术容易地测定(参见例如Scatchard等(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660；和美国专利号5,283,173、5,468,614或等效物)。
本领域中已知“CD3”为六个链的多蛋白复合物(参见例如Abbas和Lichtman,2003；Janeway等,第172和178页,1999)，所述六个链是T细胞受体复合物的亚单元。在哺乳动物中，T-细胞受体复合物的CD3亚单元是CD3γ链、CD3δ链、两个CD3ε链和CD3ζ链同源二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是含有单个免疫球蛋白域的免疫球蛋白超家族的高度相关细胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区带负电，这是允许这些链与带正电的T细胞受体链缔合的特征。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的细胞内尾部各自含有称为基于免疫受体酪氨酸的活化基元或ITAM的单个保守基元，而各CD3ζ链具有三个。相信ITAM对于TCR复合物的信号传导能力是重要的。如本公开中所使用的CD3可以来自于不同的动物物种，包括人、猴子、小鼠、大鼠或其它哺乳动物。
如本文中所使用，“保守取代”在本领域中被公认为一个氨基酸取代具有相似性质的另一个氨基酸。示例性保守取代在本领域中是众所周知的(参见例如1997年3月13日公开的WO97/09433，第10页；Lehninger,Biochemistry,第二版；Worth Publishers,Inc.NY:NY(1975),第71-77页；Lewin,Genes IV,Oxford University Press,NY and CellPress,Cambridge,MA(1990),第8页)。在某些实施方案中，保守取代包括亮氨酸对丝氨酸取代。
如本文中所使用，术语“衍生物”是指在存在或不存在酶的情况下通过化学或生物学手段，例如通过糖基化、烷基化、酰化、酯形成或酰胺形成对肽的一个或多个氨基酸残基的修饰。
如本文中所使用，“源自于”指定多肽或蛋白质的多肽或氨基酸序列是指多肽的来源。在一个实施方案中，源自于特定序列的多肽或氨基酸序列具有实质上与该序列或其一部分同一的氨基酸序列，其中所述部分由至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸或至少30-50个氨基酸或至少50-150个氨基酸组成；或本领域技术人员可用其它方式鉴别它，因为在序列中具有其来源。在一个实施方案中，人源化或嵌合结合域源自于由另一个动物产生的抗体的VH和/或VL。举例来说，人源化结合域或嵌合结合域可能源自于鼠类抗体的VH和/或VL区。举例来说，可以通过用本领域中已知的方法修饰构架区来进行鼠类抗体的人源化。
源自于另一个多肽的多肽相对于起始多肽可能具有一个或多个突变，例如其一个或多个氨基酸残基经另一个氨基酸残基取代或其具有一个或多个氨基酸残基插入或缺失。多肽可能包含非天然存在的氨基酸序列。所述变体与起始多肽必然具有小于100％的序列同一性或相似性。在一个实施方案中，变体的氨基酸序列与起始多肽的氨基酸序列将具有约60％到小于100％的氨基酸序列同一性或相似性。在另一个实施方案中，变体的氨基酸序列与起始多肽的氨基酸序列将具有约75％到小于100％、约80％到小于100％、约85％到小于100％、约90％到小于100％、约95％到小于100％的氨基酸序列同一性或相似性。
如本文中所使用，除非另外规定，否则氨基酸残基在免疫球蛋白分子的可变区中的位置是根据Kabat编号规定(Kabat,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,Bethesda,MD:PublicHealth Service,National Institutes of Health(1991))进行编号，且氨基酸残基在免疫球蛋白分子的恒定区中的位置是根据EU命名法(Ward等,1995Therap.Immunol.2:77-94)进行编号。
如本文中所使用，术语“二聚体”是指由经由一种或多种形式的分子内力(包括共价键，例如二硫键；和其它相互作用，例如静电相互作用、盐桥、氢键合和疏水性相互作用)彼此缔合的两个亚单元组成且在适当条件(例如，在生理条件下，在适合表达、纯化和/或存储重组蛋白质的水溶液中，或在用于非变性和/或非还原电泳的条件下)下稳定的生物学实体。如本文中所使用的“异源二聚体”或“异源二聚体蛋白”是指由两个不同的多肽形成的二聚体。异源二聚体不包括由四个多肽(即，两个轻链和两个重链)形成的抗体。在本发明的一个实施方案中，使用包含异源二聚域的Emergent的Interceptor平台产生异源二聚体。如本文中所使用的“同源二聚体”或“同源二聚体蛋白”是指由两个同一的多肽形成的二聚体。在本发明的某些实施方案中，使用Emergent的SMIP、PIMS或Scorpion平台产生同源二聚体。
如本文中所使用，“铰链区”或“铰链”是指源自于以下的多肽：(a)跨膜蛋白(例如I型跨膜蛋白)的域间区；或(b)II型C-凝集素的茎部区(stalk region)。举例来说，铰链区可以源自于免疫球蛋白超家族成员的域间区；这个特定类别内的合适的铰链区包括(i)免疫球蛋白铰链区(举例来说，由上部区和核心区组成)或其功能变体，包括野生型和改变的免疫球蛋白铰链；和(ii)连接免疫球蛋白V样或免疫球蛋白C样结构域的区域(或其功能变体)。
“野生型免疫球蛋白铰链区”是指在抗体重链中发现的插入在CH1与CH2域之间且连接CH1与CH2域(对于IgG、IgA和IgD来说)或插入在CH1与CH3域之间且连接CH1与CH3域(对于IgE和IgM来说)的天然存在的上部和中间铰链氨基酸序列。在某些实施方案中，野生型免疫球蛋白铰链区序列是人的，且可以包含人IgG铰链区。
“改变的野生型免疫球蛋白铰链区”或“改变的免疫球蛋白铰链区”是指(a)具有最多30％氨基酸变化(例如，最多25％、20％、15％、10％或5％氨基酸取代或缺失)的野生型免疫球蛋白铰链区，或(b)野生型免疫球蛋白铰链区中长度为约5个氨基酸(例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸)到最多约120个氨基酸(例如，长度为约10到约40个氨基酸或约15到约30个氨基酸或约15到约20个氨基酸或约20到约25个氨基酸)，具有最多约30％氨基酸变化(例如，最多约25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％氨基酸取代或缺失或其组合)且具有如PCT公布WO2011/090762和WO2011/090754中所公开的IgG核心铰链区的部分。
如本文中所使用，术语“人源化”是指通过使用基因工程技术使抗体或免疫球蛋白结合蛋白和源自于非人物种(例如小鼠或大鼠)的多肽对人具有较弱免疫原性，同时仍保留原始抗体的抗原结合性质的过程。在一些实施方案中，将抗体或免疫球蛋白结合蛋白和多肽(例如，轻链和重链可变区、Fab、scFv)的结合域人源化。可以使用称为CDR移植的技术及其变型将非人结合域人源化(Jones等,Nature 321:522(1986))，所述变型包括“改型”(Verhoeyen等,1988Science239:1534-1536；Riechmann等,1988Nature 332:323-337；Tempest等,Bio/Technol 19919:266-271)、“高嵌合”(Queen等,1989Proc Natl AcadSci USA 86:10029-10033；Co等,1991Proc Natl Acad Sci USA88:2869-2873；Co等,1992J Immunol 148:1149-1154)和“饰面”(Mark等,"Derivation of therapeutically active humanized and veneeredanti-CD18antibodies."Metcalf BW,Dalton BJ编,Cellular adhesion:molecular definition to therapeutic potential.New York:Plenum Press,1994:291-312)。如果源自于非人来源，则抗体或免疫球蛋白结合蛋白和多肽的其它区，诸如铰链区和恒定区结构域，也可以进行人源化。
“免疫球蛋白恒定区”或“恒定区”是本文中定义的术语，它是指对应于或源自于部分或所有的一个或多个恒定区结构域的肽或多肽序列。在一个实施方案中，恒定区含有源抗体的所有恒定区结构域。在一个实施方案中，恒定区包含IgG CH2和CH3域，例如IgG1CH2和CH3域。在一些实施方案中，恒定区不包含CH1域。在某些实施方案中，组成恒定亚区的恒定区结构域是人的。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白的恒定区结构域缺乏或具有极少抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体活化和补足依赖性细胞毒性(CDC)的效应因子功能，而保留结合一些Fc受体(诸如FcRn，即新生儿Fc受体)的能力且在体内保留相对较长的半衰期。
在其它变化方案中，本公开的融合蛋白包括保留ADCC和CDC之一或两者的所述效应因子功能的恒定域。在某些实施方案中，本公开的结合域与人IgG恒定区(例如IgG1)融合，其中所述恒定区具有一个或多个以下突变的氨基酸：位置234上的亮氨酸(L234)、位置235上的亮氨酸(L235)、位置237上的甘氨酸(G237)、位置318上的谷氨酸酯(E318)、位置320上的赖氨酸(K320)、位置322上的赖氨酸(K322)或其任何组合(根据EU进行编号)。举例来说，可以将这些氨基酸中的任何一个或多个变成丙氨酸。在另一个实施方案中，IgG Fc域(诸如IgG1)中的L234、L235、G237、E318、K320和K322(根据EU编号)各自突变成例如丙氨酸(即，分别为L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A)和任选地存在的N297A突变(即，实质上消除CH2域的糖基化)。
如这里所使用，术语“小模块式免疫药物蛋白”或“SMIP”用于指总体上如例如美国专利申请公布号2003/0133939、2003/0118592和2005/0136049中所公开的蛋白质支架，所述文献以全文引用的方式并入本文中。在本文中，实施例和公开内容全文中所描述的“SMIP分子”应理解为包含SMIP支架，例如按照从氨基到羧基末端的顺序包含第一结合域、铰链区和免疫球蛋白恒定区的结合蛋白。“CD3特异性SMIP分子”应理解为包含SMIP支架的CD3结合蛋白。
如这里所使用，术语“PIMS”用于指总体上如例如美国专利申请公布号2009/0148447中所公开的蛋白质支架，所述文献以全文引用的方式并入本文中。在本文中，实施例和公开内容全文中所描述的“PIMS分子”应理解为包含PIMS支架，例如按照从氨基到羧基末端的顺序包含免疫球蛋白恒定区、铰链区和第一结合域的结合蛋白。“CD3特异性PIMS分子”应理解为包含PIMS支架的CD3结合蛋白。
“Fc区”或“Fc域”是指对应于或源自于源抗体中负责结合细胞上的抗体受体和补体上的C1q组分的部分的多肽序列。Fc代表“结晶片段”，即容易形成蛋白质晶体的抗体片段。最初通过蛋白水解消化描述的独特蛋白质片段可以定义免疫球蛋白的总体通用结构。如文献中最初所定义，Fc片段由二硫化物连接的重链铰链区、CH2和CH3域组成。然而，近来该术语已被应用于由CH3、CH2和足以与第二个这样的链形成二硫化物连接的二聚体的铰链的至少一部分组成的单链。关于免疫球蛋白结构和功能的回顾，参见Putnam,The PlasmaProteins,第V卷(Academic Press,Inc.,1987),第49-140页；和Padlan,Mol.Immunol.31:169-217,1994。如本文中所使用，术语Fc包括天然存在的序列的变体。
如本文中所使用，“等电点”或pI是净电荷为零时的pH值。
如本文中所使用，术语“Interceptor”是用于指总体上如PCT公布WO2011/090762和WO2011/090754中所公开的单特异性或多特异性异源二聚蛋白质支架。本文中所描述的Interceptor分子应理解为包含两个非同一多肽链的CD3结合蛋白，各多肽链包含免疫球蛋白异源二聚域。界面免疫球蛋白异源二聚域是不同的。在一个实施方案中，免疫球蛋白异源二聚域包含CH1域或其衍生物。在另一个实施方案中，免疫球蛋白异源二聚域包含CL域或其衍生物。在一个实施方案中，CL域是Cκ或Cλ同种型或其衍生物。
如本文中所使用，II型C-凝集素的“茎部区”是指II型C-凝集素的细胞外域中位于C-型凝集素样结构域(CTLD；例如，类似于自然杀伤细胞受体的CTLD)与跨膜域之间的部分。举例来说，在人CD94分子(GenBank登录号AAC50291.1，PRI，1995年11月30日)中，细胞外域对应于氨基酸残基34-179，而CTLD对应于氨基酸残基61-176。因此，人CD94分子的茎部区包括氨基酸残基34-60，据发现它处在膜和CTLD之间(参见Boyington等,Immunity 10:75,1999；关于其它茎部区的描述，也参见Beavil等,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA89:753,1992；和Figdor等,Nature Rev.Immunol.2:77,2002)。这些II型C-凝集素还可以在茎部区与跨膜区或CTLD之间具有6到10个接合氨基酸。在另一个实施例中，233个氨基酸的人NKG2A蛋白(GenBank登录号P26715.1，PRI，2010年6月15日)具有在氨基酸71-93范围内的跨膜区和在氨基酸94-233范围内的细胞外域。CTLD由氨基酸119-231构成，且茎部区包含氨基酸99-116，两侧由五个和两个氨基酸连接。其它II型C-凝集素以及其细胞外配体结合域、域间或茎部区，和CTLD在本领域中是已知的(关于人CD23、CD69、CD72、NKG2A和NKG2D和其描述，分别参见例如GenBank登录号NP_001993.2；AAH07037.1，PRI，2006年7月15日；NP_001773.1，PRI，2010年6月20日；AAL65234.1，PRI，2002年1月17日；和CAA04925.1，PRI，2006年11月14日)。
如本文中所使用，跨膜蛋白(例如I型跨膜蛋白)的“域间区”是指跨膜蛋白的细胞外域中位于两个相邻结构域之间的部分。域间区的实例包括连接免疫球蛋白超家族成员的相邻Ig域的区域(例如，来自于IgG、IgA、IgD或IgE的免疫球蛋白铰链区；连接CD2的IgV域与IgC2域的区域；或连接CD80或CD86的IgV域与IgC域的区域)。域间区的另一个例子是连接CD22(一种结合I型唾液酸的Ig样凝集素)的非Ig域与IgC2域的区域。
“源自于”II型C-凝集素茎部区或“源自于”跨膜蛋白域间区(例如，免疫球蛋白铰链区)的多肽区是指约5到约150个氨基酸序列，其整体或一部分包括(i)野生型茎部区或域间区序列；(ii)野生型茎部区或域间区序列的片段；(iii)与(i)或(ii)具有至少80％、85％、90％或95％氨基酸序列同一性的多肽；或(iv)其中一、二、三、四或五个氨基酸具有缺失、插入、取代或其任何组合的(i)或(ii)，例如一个或多个变化是取代，或一个或多个突变仅包括一个缺失。在一些实施方案中，与野生型茎部区序列，诸如源自于NKG2A、NKG2D、CD23、CD64、CD72或CD94的约8到约20、约10到约25或约15到约25个氨基酸的那些序列相比，茎部区衍生物对蛋白水解裂解更具抗性。
如本文中所使用，术语“接合氨基酸”或“接合氨基酸残基”是指多肽的两个相邻区域或结构域之间，诸如铰链与相邻免疫球蛋白恒定亚区之间，或铰链与相邻结合域之间，或连接两个免疫球蛋白可变域的肽连接子与相邻免疫球蛋白可变域之间的一个或多个(例如约2-10个)氨基酸残基。接合氨基酸可以由多肽构建体设计产生(例如，由在构建编码多肽的核酸分子期间使用限制酶位点产生的氨基酸残基)。结合域与铰链区之间的接合氨基酸在本文中称为前铰链区，例如，可由添加限制性位点到编码核苷酸序列中而产生。在一个实施方案中，前铰链区由约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或15个氨基酸组成。DRA209和DRA161的前铰链区序列不是鼠类Cris-7或人免疫球蛋白生殖细胞系序列的一部分。DRA209和DRA161的前铰链区是氨基酸序列RRT，而对于DRA219、DRA221、DRA222、DRA223、DRA224、DRA225、DRA228、DRA229、DRA233、DRA234、TSC249、TSC250、TSC251、TSC252、TSC295、TSC296、TSC301和TSC302，它是SSS。本发明的结合分子可能包括或可能不包括前铰链区。
如本文中所使用，短语“CH3与CH1或CL之间的连接子”是指CH3域(例如野生型CH3或突变型CH3)的C末端与CH1域或CL域(例如Ck)的N末端之间的一个或多个(例如约2-12个)氨基酸残基。
如本文中所使用，术语“有需要的患者”是指有风险罹患或正罹患能用本文中所提供的CD3结合蛋白或多肽或其组合物治疗或改善的疾病、病症或病状的患者。
如本文中所使用，术语“肽连接子”是指连接重链可变区与轻链可变区且提供与两个亚结合域的相互作用相容的间隔物功能以使得所得多肽保留对作为包含相同轻链和重链可变区的抗体的相同靶分子的特异性结合亲和力的氨基酸序列。在某些实施方案中，连接子由5到约35个氨基酸，例如约15到约25个氨基酸构成。
如本文中所使用，术语“药学上可接受的”是指当使用本领域中众所周知的途径施用时分子实体和组成在大多数受试者中不会产生过敏性或其它严重有害反应。联邦或州政府的管理机构批准的或美国药典或其它一般公认的药典中登记的供动物且更确切地说供人使用的分子实体和组成被视为是“药学上可接受的”。
如本文中所使用，术语“启动子”是指涉及结合RNA聚合酶以起始转录的DNA区域。
如本文中所使用，术语“核酸”、“核酸分子”或“聚核苷酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物。除非有具体限制，否则该术语涵盖与参考核酸具有相似结合性质且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢的含有天然核苷酸类似物的核酸。除非另外指出，否则特定核酸序列还暗含其经保守修饰(例如简并密码子取代)的变体和互补序列以及明确指示的序列。具体地说，简并密码子取代可以通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三位置经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等(1991)Nucleic Acid Res.19:5081；Ohtsuka等(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；Cassol等(1992)；Rossolini等(1994)Mol.Cell.Probes8:91-98)。术语核酸与基因、cDNA和由基因编码的mRNA可互换使用。如本文中所使用，术语“核酸”、“核酸分子”或“聚核苷酸”意在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物和其衍生物、片段和同源物。
术语“表达”是指由核酸编码的产物的生物合成。举例来说，在编码相关多肽的核酸区段的情况下，表达涉及将核酸区段转录到mRNA中和将mRNA翻译成一种或多种多肽。
术语“表达单元”和“表达盒”在本文中可互换使用，且表示编码相关多肽且能够在宿主细胞中表达核酸区段的核酸区段。表达单元典型地包含转录启动子、编码相关多肽的开放阅读框和转录终止子，全部呈可操作的构型。除转录启动子和终止子以外，表达单元可以进一步包括其它核酸区段，诸如增强子或聚腺苷酸化信号。
如本文中所使用，术语“表达载体”是指线性或环形核酸分子，其包含一个或多个表达单元。除一个或多个表达单元以外，表达载体还可以包括其它核酸区段，诸如一个或多个复制起点或一个或多个可选标记物。表达载体一般源自于质粒或病毒DNA，或可以含有两者的元件。
如本文中所使用，Scorpion是用于指多特异性结合蛋白支架的术语。举例来说，PCT申请公布号WO 2007/146968、美国专利申请公布号2006/0051844、PCT申请公布号WO 2010/040105、PCT申请公布号WO2010/003108和美国专利号7,166,707中公开了多特异性结合蛋白和多肽。Scorpion多肽包含两个结合域(所述结构域可以设计用于特异性结合相同或不同的靶标)、两个连接子和一个免疫球蛋白恒定亚区。PCT申请公布号WO2010/003108中描述了用于Scorpion分子的连接子。在一些实施方案中，连接子序列为约2-45个氨基酸或2-38个氨基酸或5-45个氨基酸。在一些实施方案中，连接子是抗体铰链区(例如来自于IgG)或C-凝集素茎部区。Scorpion蛋白是包含两个同一的由二硫化物键合的Scorpion多肽的同源二聚蛋白。
如本文中所使用，术语“序列同一性”是指两个或更多个聚核苷酸序列之间或者两个或更多个多肽序列之间的关系。当一个序列中的位置被比较序列的对应位置上的相同核酸碱基或氨基酸残基占据时，将所述序列称为在那个位置上“同一”。“序列同一性”百分比是通过确定两个序列中存在同一的核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生“同一的”位置数来计算。然后将“同一的”位置数除以比较窗中的总位置数并乘以100，以产生“序列同一性”百分比。通过在比较窗上比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性”百分比。核酸序列的比较窗的长度可以是例如至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个或更多个核酸。多肽序列的比较窗的长度可以是例如至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300个或更多个氨基酸。为了最佳比对序列以供比较，比较窗中的聚核苷酸或多肽序列部分可以包含称为空位的添加或缺失，而参考序列保持恒定。最佳比对是即使有空位的情况下也能在参考序列与比较序列之间产生最大的可能“同一的”位置数的比对。两个序列之间的“序列同一性”百分比可以使用程序版本“BLAST 2Sequences”确定，该程序版本可得自国家生物技术信息中心(截止到2004年9月1日)，该程序并入了程序BLASTN(用于核苷酸序列比较)和BLASTP(用于多肽序列比较)，这两个程序是基于Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(12):5873-5877,1993)的算法。当利用“BLAST 2Sequences”时，参数(即，截止到2004年9月1日的缺省参数)可以用于字长(3)、开放空位罚分(11)、延伸空位罚分(1)、空位下降(50)、期望值(10)和任何其它所需参数，包括但不限于基质选项。如果两个核苷酸或氨基酸序列相对于彼此具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，则该两个序列被视为具有“基本上相似的序列同一性”或“基本的序列同一性”。
如本文中所使用，“多肽”或“多肽链”是共价连接的氨基酸的单一线性和连续排列。它不包括以非线性方式，诸如经由链间二硫键连接在一起的两个多肽链(例如，轻链与重链经由二硫键连接的半免疫球蛋白分子)。多肽可以具有或形成一个或多个链内二硫键。关于如本文中所描述的多肽，提到对应于由SEQ ID NO说明的那些氨基酸残基的氨基酸残基包括所述残基的翻译后修饰。
“蛋白质”是包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质还可以包含非肽组分，诸如碳水化合物基团。碳水化合物和其它非肽取代基可以由产生蛋白质的细胞添加到蛋白质，并且将随细胞类型而变化。蛋白质在本文中是依据其氨基酸主链结构进行定义；一般不说明诸如碳水化合物基团等取代基，但仍然可能存在。
术语“氨基末端”(N末端)和“羧基末端”(C末端)在本文中用于表示多肽内的位置。在上下文允许的情况下，这些术语是参考特定序列或多肽部分使用以表示邻近或相对位置。举例来说，多肽内相对于参考序列位于羧基末端的某些序列位于参考序列的羧基末端附近，但未必在完整多肽的羧基末端上。
“T细胞受体”(TCR)是在T细胞表面上发现的分子，一般与CD3一起负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。在大部分T细胞中，它由高度可变α和β链的二硫化物连接的异源二聚体组成。在其它T细胞中，表达由可变γ和δ链组成的代替受体。TCR的各链是免疫球蛋白超家族的成员，并且拥有一个N末端免疫球蛋白可变域、一个免疫球蛋白恒定域、跨膜区和C末端的短胞质尾(参见Abbas和Lichtman,Cellular and Molecular Immunology(第5版),编者:Saunders,Philadelphia,2003；Janeway等,Immunobiology:TheImmune System in Health and Disease,第4版,Current BiologyPublications,第148、149和172页,1999)。如本公开中所使用的TCR可以来自于各种动物物种，包括人、小鼠、大鼠或其它哺乳动物。
如本文中所使用的“TCR复合物”是指由CD3链与其它TCR链缔合形成的复合物。举例来说，TCR复合物可以由CD3γ链、CD3δ链、两个CD3ε链、CD3ζ链的同源二聚体、TCRα链和TCRβ链构成。或者，TCR复合物可以由CD3γ链、CD3δ链、两个CD3ε链、CD3ζ链的同源二聚体、TCRγ链和TCRδ链构成。
如本文中所使用的“TCR复合物的组分”是指TCR链(例如TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ)、CD3链(例如CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ)或由两个或更多个TCR链或CD3链形成的复合物(例如TCRα与TCRβ的复合物、TCRγ与TCRδ的复合物、CD3ε与CD3δ的复合物、CD3γ与CD3ε的复合物，或TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ和两个CD3ε链的亚TCR复合物)。
如本文中所使用的“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的过程，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞(例如，单核细胞，诸如自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体(或能够结合FcγR的其它蛋白质)且随后导致靶细胞溶解。原则上，具有活化FcγR的任何效应细胞都可能被触发而介导ADCC。介导ADCC的原代细胞是NK细胞，其仅表达FcγRIII，而单核细胞取决于它们的活化状态、定位或分化可以表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。关于造血细胞上的FcγR表达的回顾，参见例如Ravetch等,1991,Annu.Rev.Immunol.,9:457-92。
如本文中在提到多肽或蛋白质时使用的术语“具有ADCC活性”意指多肽或蛋白质(例如，包含具有CH2和CH3域的免疫球蛋白铰链区和免疫球蛋白恒定亚区，诸如源自于IgG的多肽或蛋白质(例如IgG1))能够通过结合表达Fc受体的细胞溶解型免疫效应细胞(例如NK细胞)上的细胞溶解型Fc受体(例如FcγRIII)来介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
如本文中所使用的“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”是指正常血清中的组分(“补体”)与抗体或与靶抗原结合的其它C1q补体结合蛋白一起展现表达靶抗原的靶细胞的溶解的过程。补体由一组协同作用且有序排列以发挥其作用的血清蛋白组成。
如本文中所使用的术语“经典补体路径”和“经典补体系统”是同义的，并且是指活化补体的特定路径。经典路径需要抗原-抗体复合物以便以有序方式起始和参与九种主要蛋白质组分(指定为C1到C9)的活化。对于活化过程中的若干个步骤，产物是能催化后续步骤的酶。这一级联用相对较小的起始信号扩增并活化了大量补体。
如本文中关于多肽或蛋白质使用的术语“具有CDC活性”意指所述多肽或蛋白质(例如，包含具有CH2和CH3域的免疫球蛋白铰链区和免疫球蛋白恒定亚区，诸如源自于IgG的多肽或蛋白质(例如IgG1))能够通过结合C1q补体蛋白和活化经典补体系统来介导补体依赖性细胞毒性(CDC)。
如本文中所使用的“重定向T细胞细胞毒性”和“RTCC”是指T细胞介导的过程，其中使用能够特异性结合细胞毒性T细胞和靶细胞两者，且借此引发针对靶细胞的靶依赖性细胞毒性T细胞反应的多特异性蛋白将细胞毒性T细胞募集到靶细胞。
如本文中所使用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“缓解”是指治疗性治疗或防范性/预防性治疗。若接受治疗的个体中的至少一种疾病症状有改善或治疗可以延迟个体中的进行性疾病的恶化或防止其它相关疾病发作，则治疗为治疗性的。
如本文中所使用，术语“转化”、“转染”和“转导”是指将核酸(例如核苷酸聚合物)转移到细胞中。如本文中所使用，术语“遗传转化”是指将DNA，尤其是重组DNA转移和并入到细胞中。转移的核酸可以经由表达载体而引入到细胞中。
如本文中所使用，术语“变体”是指不同于参考核酸或多肽，但保留其基本性质的核酸或多肽。一般来说，变体总体上密切类似于参考核酸或多肽且在许多区域中与参考核酸或多肽是同一的。举例来说，与活性部分或全长参考核酸或多肽相比，变体可以展现至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。
术语“轻链可变区”(也称为“轻链可变域”或“VL”)和“重链可变区”(也称为“重链可变域”或“VH”)分别是指来自于抗体轻链和重链的可变结合区。可变结合区由称为“互补性决定区”(CDR)和“构架区”(FR)的离散的定义明确的亚区组成。在一个实施方案中，FR被人源化。术语“CL”是指“免疫球蛋白轻链恒定区”或“轻链恒定区”，即，来自于抗体轻链的恒定区。术语“CH”是指“免疫球蛋白重链恒定区”或“重链恒定区”，取决于抗体同种型，它还可以进一步分为CH1、CH2和CH3(IgA、IgD、IgG)或CH1、CH2、CH3和CH4域(IgE、IgM)。“Fab”(抗原结合片段)是抗体中结合抗原的部分且包括重链中经由链内二硫键与轻链连接的可变区和CH1域。
本公开尤其提供了包含结合域，确切地说，包含特异性结合CD3的第一结合域的多肽和蛋白质。本公开的包含结合域的多肽和蛋白质可以包含以下各项中的一个或多个：免疫球蛋白恒定亚区、连接肽、铰链区、免疫球蛋白异源二聚域、免疫球蛋白二聚域、一个或多个接合氨基酸、标签等等。本文中进一步详细描述所公开的多肽和蛋白质的这些组分。
另外，本文中公开的CD3结合多肽和蛋白质可以呈多种不同形式中任一种的抗体或融合蛋白的形式(例如，融合蛋白可以呈SMIP蛋白、PIMS蛋白、Scorpion蛋白或Interceptor蛋白形式)。
在一些实施方案中，CD3结合多肽包含第二结合域。在一些实施方案中，CD3结合多肽从氨基到羧基末端包含CD3结合域、铰链区、恒定区和第二结合域。在其它实施方案中，CD3结合多肽从氨基到羧基末端包含第二结合域、铰链区、恒定区和CD3结合域。
根据本发明的CD3结合蛋白一般包括(a)至少一个包含如本文中所述的CD3结合域的CD3结合多肽链。在某些变化方案中，CD3结合多肽还包括(b)羧基末端连接到CD3结合域的铰链区和(c)免疫球蛋白恒定区(例如SMIP多肽)。在其它变化方案中，CD3结合多肽还包括(d)羧基末端连接到免疫球蛋白恒定亚区的第二铰链区，和(e)羧基末端连接到第二铰链区的第二结合域(例如Scorpion多肽)。在一些实施方案中，CD3结合多肽包含具有构架区、前铰链区和铰链区的CD3结合域。
在一些实施方案中，CD3结合多肽包含三个或更多个与SEQ IDNO:42相比经修饰的氨基酸，举例来说，所述修饰是用中性氨基酸取代带正电的氨基酸和/或用带负电的氨基酸取代中性氨基酸，例如在构架区和/或前铰链区中。在一些实施方案中，通过用中性氨基酸取代带正电的氨基酸和/或用带负电的氨基酸取代中性氨基酸在VH和/或VL的构架区中对至少2个、至少3个、至少4个、3-5个或3-10个氨基酸进行修饰。
在本发明的一些实施方案中，CD3结合多肽在前铰链区中包含例如能降低前铰链区或整个多肽的pI的修饰。前铰链区处于结合域与铰链区之间的接合处。举例来说，可以用序列SSS或SST置换具有序列RRT的三个氨基酸的前铰链区以降低等电点。在一些实施方案中，前铰链区与具有RRT前铰链区的CD3结合多肽相比具有降低的等电点。
在一个实施方案中，为了降低免疫原性的风险，将人生殖细胞系IgG序列中普遍存在的或人生殖细胞系序列中相同或邻近的位置上，例如在对应的人生殖细胞系IgG序列中含有的氨基酸取代到序列中。在一些实施方案中，所述人生殖细胞系IgG序列包含SEQ ID NO:43或44。
在一些实施方案中，与Cris-7VL Jκ(Jk)区小鼠序列LQIT(SEQID NO:252)相比，至少一个氨基酸修饰在VL区的Jk区内。在一些实施方案中，Jk区包含氨基酸序列VEIK(SEQ ID NO:253)，例如代替LQIT(SEQ ID NO:252)。
在一些实施方案中，CD3结合多肽包含铰链区和恒定区，举例来说，CD3结合多肽可以包含(a)氨基末端连接到CD3结合域的铰链区，和(b)氨基末端连接到铰链区的免疫球蛋白恒定区(例如，PIMS多肽)。在一些实施方案中，CD3结合多肽从氨基到羧基末端包含CD3结合域、铰链区和恒定区。在一些实施方案中，CD3结合多肽从氨基到羧基末端包含恒定区、铰链区和CD3结合域。
典型地，上述形式的CD3结合多肽(SMIP、Scorpion或PIMS)能够进行同源二聚，典型地通过二硫键，经由免疫球蛋白恒定区和/或铰链区(例如，经由包含IgG CH2和CH3域的免疫球蛋白恒定区和IgG铰链区)。因而，在本发明的某些方面，两个同一的CD3结合多肽进行同源二聚，以形成二聚CD3结合蛋白。
在其它实施方案中，CD3结合多肽还包括能够与第二非同一多肽链中的不同的异源二聚域进行异源二聚的异源二聚域。在某些变化方案中，用于异源二聚的第二多肽链包括第二结合域。因此，在本发明的某些方面，两个非同一多肽链(一个包含CD3结合域且第二个任选地包含第二结合域)二聚以形成具有1到4个结合域的异源二聚蛋白质。在一些实施方案中，CD3结合多肽从氨基到羧基末端包含CD3结合域、铰链区、恒定区、异源二聚域和任选地存在的第二结合域。
在一些实施方案中，第二结合域结合靶分子或与其相互作用，且CD3结合多肽诱导T细胞细胞毒性。这可以呈非二聚体、异源二聚体或同源二聚体形式。在一些实施方案中，第二结合域结合肿瘤相关抗原或与其相互作用。在一些实施方案中，CD3结合多肽在肿瘤附近诱导T细胞溶解肿瘤细胞和/或诱导多克隆T细胞活化和扩增。
包含本发明的抗CD3结合域的多肽可以是或者包含抗体或包括有保留结合特异性的功能抗体片段或片段衍生物的抗体衍生物。在一些实施方案中，本发明包括含有可变重链域和/或轻链域的融合蛋白和其它多肽。
在本发明的一些实施方案中，CD3结合多肽包含了包含有选自SEQ ID NO:28、30、32、38和40的VH区序列或VL区序列的CD3结合域。在一些实施方案中，CD3结合域包含选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30和32的VH区和选自SEQ ID NO:38和40的VL区。在一些实施方案中，CD3结合域包含选自SEQ ID NO:28、30和32的VH区和选自SEQ ID NO:34、36、38和40的VL区。在一些实施方案中，VH区包含SEQ ID NO:28且VL区包含SEQ ID NO:34；VH区包含SEQ ID NO:28且VL区包含SEQ ID NO:38；VH区包含SEQID NO:26且VL区包含SEQ ID NO:38；或VH区包含SEQ ID NO:26且VL区包含SEQ ID NO:34。在一些实施方案中，CD3结合多肽包含有包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，且其中重链CDR3包含SEQ ID NO:51的CD3结合域。在一些实施方案中，CD3结合多肽包括有包含SEQ ID NO:49的重链CDR1、包含SEQ ID NO:50的CDR2和包含SEQ ID NO:51的CDR3，以及包含SEQ ID NO:52的轻链CDR1、包含SEQ ID NO:53的CDR2和包含SEQ ID NO:54的CDR3。
在一些实施方案中，CD3结合多肽包含选自SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18和20的氨基酸序列。
本发明包括有包含二聚的单链多肽的多特异性结合蛋白，各单链多肽从氨基到羧基末端包含第一结合域、N末端连接子、免疫球蛋白恒定区、C末端连接子和本发明的CD3结合域。同样，本发明包括有包含二聚的单链多肽的多特异性结合蛋白，各单链多肽从氨基到羧基末端包含本发明的CD3结合域、N末端连接子、免疫球蛋白恒定区、C末端连接子和第一结合域。在一些实施方案中，N末端连接子可以包含免疫球蛋白铰链区或可能实质上由其组成。
在本发明的另一个方面，多特异性结合蛋白包含单链多肽，所述单链多肽从氨基到羧基末端包含第一结合域、N末端连接子、免疫球蛋白恒定区、C末端连接子和CD3结合域。同样，本发明包括多特异性结合蛋白，其从氨基到羧基末端包含CD3结合域、N末端连接子、免疫球蛋白恒定区、C末端连接子和第一结合域。
本发明包括多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白包含经由连接子域与第二结合域连接的第一结合域(例如，经由连接子与另一个scFv连接的scFv)。举例来说，本发明包括多特异性结合蛋白，其包含经由肽连接子域与CD3结合域(呈VH-连接子-VL或VL-连接子-VH取向)连接的第一结合域(呈VH-连接子-VL或VL-连接子-VH取向)。在一些实施方案中，呈scFv-连接子-scFv形式的双特异性蛋白质可以包含源自于针对T细胞抗原(诸如CD3)的抗体的可变重域和可变轻域，包括但不限于本文中所公开的可变域。隔开scFv域的连接子可以包含((Gly4)Ser)n，其中n＝1-5(SEQ ID NO:74-78)。在一个实施方案中，连接子是((Gly4)Ser)3(SEQ ID NO:76)。连接子还可以包含约8-12个氨基酸。在一些实施方案中，呈这种形式(“双特异性单链抗体”)的本发明蛋白质不包含Fc区，且因此不具有Fc相关的效应功能。
本发明实质上包括任何类型的含有如本文中所描述的结合域的多肽。这包括抗体、其片段、scFv、Fab、双scFv单域抗体、双链抗体、双可变域结合蛋白和含有抗体或抗体片段的多肽。本文中描述了本发明中所包括的其它类型多肽。
在一些实施方案中，VH和VL域被用作scFv，且以允许scFv和VH/VL结合靶标的方式与其它多肽或氨基酸序列连接/融合。在一些实施方案中，如本文中所描述的VH和VL域用于抗体或其片段中。举例来说，将所述VH和VL域并入到VH和VL域在抗体中的天然位置。在一些实施方案中，本发明的CD3结合多肽是抗体，例如具有如本文中所描述的VL链和VH链。
在本发明的一个实施方案中，多特异性蛋白质是scFv二聚体或双链抗体，而不是完整抗体。双链抗体和scFv二聚体可以仅使用可变域构建而不具有Fc区。双链抗体是二价双特异性抗体，其中VH和VL域被表达在单一多肽链上，但所使用的肽连接子过短而无法允许同一链上的两个结构域配对，从而迫使所述结构域与另一个链的互补域配对且产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger,P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.等(1994)Structure 2:1121-1123)。所述抗体结合部分在本领域中是已知的(Kontermann和Dubel编,Antibody Engineering(2001)Springer-Verlag.New York.790pp.(ISBN 3-540-41354-5)。
在本发明的一个实施方案中，多特异性蛋白质是经二硫化物稳定的双链抗体。举例来说，多特异性抗体可以包含两个独特的多肽，它们共表达以产生对2个特异性中的每一个都具有一个结合位点的共价连接的异源二聚复合物。在这个实施方案中，各Fv是通过呈VLA-VHB(第一链)和VLB-VHA(第二链)构型的一个链上的VL伴侣与第二个链上的VH伴侣缔合而形成。这可以通过两个代替羧基末端异源二聚域中的任一个加以稳定：一个链上的VEPKSC(SEQ ID NO:254)与另一个链上的FNRGEC(SEQ ID NO:255)配对，或带相反电荷的卷曲螺旋域的配对。参见例如Moore等,2011,Blood.117:4542-4551。在这个实施方案中，多特异性结合蛋白可以包含具有与第一结合域VL连接的CD3结合域VH的第一链，且第二链包含与第一结合域VH连接的CD3结合域VL，并且两个链经由二硫键在C末端连接。可以使用源自于已知抗体的可变重链和轻链，包括例如本文中所公开的可变重链和轻链来设计经二硫化物稳定的双链抗体。
在另一个实施方案中，多特异性结合蛋白是能够特异性结合第一结合位点(例如肿瘤抗原)和TCR复合物的双可变域结合蛋白。在这个实施方案中，重组蛋白包含多肽链，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C--(X2)n，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，C是恒定域，X1是连接子(例如，约10到20个氨基酸长的多肽连接子)，X2代表Fc区且n是0或1。参见例如美国专利号8,258,268。
在本发明的一个实施方案中，多特异性结合蛋白包含一个、两个、三个或更多个多肽链。举例来说，本发明包括多特异性蛋白质，其具有包含VH1-VL2的第一链，包含CH2-CH3-VL1-VH2的第二链和包含CH2-CH3的第三链。在这个实施方案中，VH1和VL1可以对应于第一结合域的可变域，而VH2和VL2可以对应于抗CD3可变域。或者，VH1和VL1可以对应于抗CD3可变域，而VH2和VL2可以对应于第一结合域的可变域。
在其它实施方案中，多特异性结合蛋白由包含不同的单链多肽的二聚单链多肽链(异源二聚体)构成。在这种形式(“多特异性异源二聚体”)中，各多肽链包含结合域、N末端连接子、恒定区、C末端连接子和任选地存在的另一个结合域且还包括异源二聚域。在某些变化方案中，用于异源二聚的第二多肽链包括其它结合域。因此，在本发明的某些实施方案中，异源二聚重组蛋白可以含有两个、三个或四个不同的结合域。关于一些例子和相关方法，参见PCT公布号WO2011/090762。
如上文所指出，本公开的CD3结合多肽包含特异性结合CD3的结合域。在一些变化方案中，CD3结合域能够竞争结合氨基酸序列如SEQ ID NO:41中所示的具有单链Fv(scFv)的CD3。在特定的实施方案中，CD3结合域包含(i)包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3的免疫球蛋白重链可变区(VH)，和(ii)包含CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3的免疫球蛋白轻链可变区(VL)。合适的CD3结合域包括具有源自于鼠类单克隆抗体Cris-7的VL和VH区的CD3结合域(Reinherz,E.L.等(编),Leukocyte typing II.,Springer Verlag,New York,(1986)。在一些这样的实施方案中，LCDR3具有SEQ ID NO:54中所述的氨基酸序列和/或HCDR3具有SEQ ID NO:51中所述的氨基酸序列；且LCDR1和LCDR2分别任选地具有如SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53中所述的氨基酸序列，且HCDR1和HCDR2分别任选地具有如SEQID NO:49和SEQ ID NO:50中所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，举例来说，LCDR1、LCDR2和LCDR3具有分别如SEQ ID NO:52、53和54中所示的氨基酸序列；和/或HCDR1、HCDR2和HCDR3具有分别如SEQ ID NO:49、50和51中所示的氨基酸序列。
可以得到本公开的结合域的示例性抗CD3抗体包括Cris-7单克隆抗体(Reinherz,E.L.等(编),Leukocyte typing II.,Springer Verlag,New York,(1986)
(VL＝QVVLTQSPAIMSAFPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDSSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMETEDAATYYCQQWSRNPPTFGGGTKLQITR(SEQ ID NO:46)且
VH＝QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRSTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSSAYTNYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCASPQVHYDYNGFPYWGQGTLVTVSA(SEQID NO:45))；HuM291(Chau等(2001)Transplantation 71:941-950(VL＝DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:72)且
VH＝QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPRSGYTHYNQKLKDKATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSAYYDYDGFAYWGQGTLVTVSS(SEQID O:73)；BC3单克隆抗体(Anasetti等(1990)J.Exp.Med.172:1691)；OKT3单克隆抗体(Ortho muliicenier Transplant Study Group(1985)N.Engl.J.Med.313:337)及其衍生物，诸如OKT3ala-ala(也称为OKT3AA-FL或OKT3FL)，即在位置234和235上具有丙氨酸取代的人源化Fc变体(Herold等(2003)J.Clin.Invest.11:409)；维西珠单抗(Carpenter等(2002)Blood 99:2712)；G19-4单克隆抗体(Ledbetter等,1986,J.Immunol.136:3945)和145-2C11单克隆抗体(Hirsch等(1988)J.Immunol.140:3766)。示例性抗TCR抗体是BMA031单克隆抗体(Borst等(1990)Human Immunology 29:175-188)。
在一些实施方案中，结合域是包含相关靶特异性VH和VL区的单链Fv片段(scFv)。在某些实施方案中，VH和VL区是人的。
在本发明的一个实施方案中，CD3结合多肽的经验和/或理论pI比DRA209SMIP的小至少0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2、2.5或更多个单位。在一些实施方案中，本发明的CD3结合多肽的经验和/或理论pI比DRA209SMIP的小约0.25到约2.5个、0.5到约2.5个、约0.5到约2.0个、约0.5到约1.5个、约0.5到约1.25个、约0.5到约1.0个、约0.5到约0.75个、约0.75到约1.0个、约0.75到约1.25个、约0.75到约1.5个、约0.75到约2.0个、约1.0到约1.5个、约1.0到约2.0个或约1.0到约2.5个单位。在一些实施方案中，本发明的CD3多肽的经验或理论pI小于约8.9、8.8、8.7、8.6、8.5、8.4、8.3、8.2、8.1、8、7.5、7.25、7.0或6.75。在一些实施方案中，本发明的CD3多肽的经验或理论pI为约8.9、8.8、8.7、8.6、8.5、8.4、8.3、8.2、8.1、8、7.5、7.25、7.27.0、6.8或6.75。在一些实施方案中，本发明的CD3多肽的经验或理论pI为约7.9到约8.7、7.9到约8.6、8.0到约8.6、8.0到约8.5、8.0到约8.4、8.0到约8.3、8.0到约8.2、8.0到约8.1、约8.1到约8.6、约8.2到约8.6、约8.3到约8.6、约8.4到约8.6、约8.5到约8.6、约8.5到约8.3、约8.4到约8.2或约8.3到约8.1。
在某些实施方案中，CD3结合域包含或是与SEQ ID NO:41的scFv相比pI(经验和/或理论)降低至少约0.25、0.5、1、1.25、1.5、2、2.5或更多个单位的scFv。在一些实施方案中，CD3结合域包含或是pI(经验和/或理论)比SEQ ID NO:41的降低约0.25到约2.5、0.5到约2.5、约0.5到约2.0、约0.5到约1.5、约0.5到约1.25、约0.5到约1.0、约0.5到约0.75、约0.75到约1.0、约0.75到约1.25、约0.75到约1.5、约0.75到约2.0、约1.0到约1.5、约1.0到约2.0或约1.0到约2.5个单位的scFv。这样的scFv包括SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18和20内所含的scFv，或与SEQ ID NO:6、8、10、12、14、16、18和20内所含的scFv的氨基酸序列具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或100％同一性的scFv。
在一些实施方案中，本发明的CD3结合域与SEQ ID NO:41具有约80％到约99％、约82％到约99％、约84％到约99％、约86％到约99％、约88％到约99％、约90％到约99％、约92％到约99％、约94％到约99％、约96％到约99％、约97％到约99％、约98％到约99％、约80％到约85％、约85％到约90％、约85％到约95％、约90％到约97％、约90％到约95％、约90％到约93％、约90％到约91％、约95％到约96％、约96％到约97％、约97％到约98％、约96％到约97％或约96％到约98％的同一性。
在一些实施方案中，本发明的CD3结合域是SEQ ID NO:41的变体，其中已经使氨基酸序列中的一个或多个氨基酸突变以降低结合域的pI。突变包括用一个氨基酸取代另一个氨基酸以降低结合域的pI、插入氨基酸以降低结合分子的pI和/或缺失氨基酸以降低结合域的pI。在一个实施方案中，突变是取代。在一些实施方案中，突变在可变链的构架区中。在一些实施方案中，变体中有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸突变。
在一个实施方案中，CD3结合域包含或是包含选自SEQ ID NO:28、30、32、38和40的重链或轻链的scFv。在另一个实施方案中，CD3结合域包含选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30和32的VH区和选自SEQ ID NO:38和40的VL区。在另一个实施方案中，CD3结合域包含选自SEQ ID NO:28、30和32的VH区和选自SEQ ID NO:34、36、38和40的VL区。在另一个实施方案中，CD3结合域包含SEQ ID NO:28和34。在另一个实施方案中，CD3结合域包含SEQ IDNO:28和38。在另一个实施方案中，CD3结合域包含SEQ ID NO:26和38。在另一个实施方案中，CD3结合域包含SEQ ID NO:26和34。在一些实施方案中，CD3结合域包含选自SEQ ID NO:38和40的VL区和选自SEQ ID NO:22、24、26、28、30和32的VH区。在其它实施方案中，与来自于特异性结合相关靶标的单克隆抗体或其片段或衍生物(例如CD3)的CDR相比，各CDR包含不超过一个、两个或三个取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，CD3结合域结合T细胞上的T细胞受体复合物的CD3ε亚单位或与其相互作用。在一些实施方案中，CD3结合域与Cris-7或HuM291单克隆抗体竞争结合CD3ε。
在一些实施方案中，CD3结合多肽诱导T细胞受体复合物内在化。
在一些变化方案中，结合域是包含由肽连接子接合的免疫球蛋白VL区和VH区的单链Fv(scFv)。用于接合VL区和VH区的肽连接子的使用在本领域中是众所周知的，且这一特定领域内存在许多公布。一种广泛使用的肽连接子是由3个重复的Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ IDNO:74)氨基酸序列(Gly4Ser)3(EQ ID NO:76)组成的15聚体。在一些实施方案中，肽连接子包含SEQ ID NO:74-78中的任一个或由其组成。已经使用了其它连接子，且已经使用噬菌体展示技术以及选择性感染性噬菌体技术使连接子序列多样化和选择适当的连接子序列(Tang等,J.Biol.Chem.271,15682-15686,1996；Hennecke等,ProteinEng.11,405-410,1998)。在某些实施方案中，VH区和VL区是通过具有包含式(Gly4Ser)n的氨基酸序列的肽连接子相连，其中n＝1-5(分别是SEQ ID NO:74-78)。可以通过随机突变发生优化简单连接子(例如(Gly4Ser)n)来获得其它合适的连接子。
在特定的实施方案中，结合域包含人源化免疫球蛋白VL和/或VH区。用于使免疫球蛋白VL区和VH区人源化的技术在本领域中是已知的，且论述于例如美国专利申请公布号2006/0153837中。
期望“人源化”产生免疫原性较弱、完全保留原始分子的抗原结合性质的抗体。为了保留原始抗体的所有抗原结合性质，将再产生其抗原结合位点结构的“人源化”型式。这可以通过在保留或不保留重要构架残基的情况下仅将非人CDR移植到人可变构架域和恒定区上(Jones等,Nature 321:522(1986)；Verhoeyen等,Science 239:1539(1988))或通过重组整个非人可变域(以保留配体结合性质)但通过审慎地置换暴露的残基用人样表面将其“掩蔽”(以降低抗原性)(Padlan,Molec.Immunol.28:489(1991))来实现。
实质上，通过CDR移植进行人源化涉及仅将非人抗体的CDR重组到人可变区构架和人恒定区上。理论上，这将显著降低或消除免疫原性(除非存在同种异型或个体基因型差异)。然而，已经报告也可能需要保留原始抗体的一些构架残基(Reichmann等,Nature,332:323(1988)；Queen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10,029(1989))。
需要保留的构架残基适于通过计算机模拟来鉴别。或者，可以通过比较已知的抗原结合位点结构来潜在地鉴别重要的构架残基(Padlan,Molec.Immunol.,31(3):169-217(1994)，以引用的方式并入本文中)。
潜在地影响抗原结合的残基分为若干组。第一组包含具有抗原位点表面的连续残基，它们因此可以与抗原直接接触。这些残基包括氨基末端残基和与CDR相邻的残基。第二组包括可能通过接触抗体中的CDR或另一个肽链而改变CDR的结构或相对排列的残基。第三组包含具有可能影响可变域的结构完整性的隐藏侧链的氨基酸。这些组中的残基通常是在相同的位置上发现的(Padlan,1994,同上)，但取决于编号系统，它们在鉴别时的位置可能不同(参见Kabat等,"Sequencesof proteins of immunological interest,第5版,发行号91-3242,U.S.Dept.Health&Human Services,NIH,Bethesda,Md.,1991)。
尽管本文中描述的一些例子涉及scFv、SMIP、Scorpion和Interceptor分子而不是抗体的人源化，但本领域中关于人源化抗体的知识适用于根据本发明的多肽。
在某些实施方案中，铰链是野生型人免疫球蛋白铰链区。在某些其它实施方案中，可以在野生型免疫球蛋白铰链区的氨基或羧基末端上添加一个或多个氨基酸残基作为融合蛋白构建体设计的一部分。举例来说，铰链氨基末端的其它接合氨基酸残基可以是“RT”、“RSS”、“TG”或“T”，或在铰链羧基末端可以是“SG”，或可将铰链缺失与添加组合，诸如在羧基末端添加具有“SG”的ΔΡ。
在某些实施方案中，铰链是改变的免疫球蛋白铰链，其中野生型免疫球蛋白铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基经一个或多个其它氨基酸残基(例如丝氨酸或丙氨酸)取代。
示例性改变的免疫球蛋白铰链包括但不限于存在野生型人IgG1铰链中发现的一个、两个或三个半胱氨酸残基被一个、两个或三个不同的氨基酸残基(例如丝氨酸或丙氨酸)取代的免疫球蛋白人IgG1铰链区。改变的免疫球蛋白铰链可能另外存在脯氨酸被另一个氨基酸(例如丝氨酸或丙氨酸)取代。举例来说，上述改变的人IgG1铰链可以另外存在位于羧基末端的连接到野生型人IgG1铰链区的三个半胱氨酸的脯氨酸被另一个氨基酸残基(例如丝氨酸、丙氨酸)取代。在一个实施方案中，核心铰链区的脯氨酸未经取代。
在某些实施方案中，铰链多肽包含或者是与诸如野生型人IgG1铰链、野生型人IgG2铰链或野生型人IgG4铰链等野生型免疫球蛋白铰链区具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在其它实施方案中，CD3结合多肽中存在的铰链可以是并非基于或源自于免疫球蛋白铰链的铰链(即，非野生型免疫球蛋白铰链或改变的免疫球蛋白铰链)。这样的铰链的例子包括源自于跨膜蛋白的域间区或II型C-凝集素的茎部区的具有约5到约150个氨基酸的肽，例如具有约8到25个氨基酸的肽和具有约7到18个氨基酸的肽。
在某些实施方案中，域间区或茎部区铰链具有7到18个氨基酸，且可以形成α-螺旋卷曲螺旋结构。在某些实施方案中，域间区或茎部区铰链含有0、1、2、3或4个半胱氨酸。示例性域间区或茎部区铰链是域间区或茎部区的肽片段，诸如来自于CD69、CD72、CD94、NKG2A和NKG2D的茎部区的10到150个氨基酸的片段。
在某些实施方案中，铰链序列具有约5到150个氨基酸、5到10个氨基酸、10到20个氨基酸、20到30个氨基酸、30到40个氨基酸、40到50个氨基酸、50到60个氨基酸、5到60个氨基酸、5到40个氨基酸、8到20个氨基酸或10到15个氨基酸。铰链可以主要地是挠性的，但也可以提供较多刚性特征，或可以主要含有α-螺旋结构与极少β-片状结构。铰链的长度或序列可能影响铰链直接或间接(经由另一个区或域，诸如异源二聚域)连接的结合域的结合亲和力以及铰链直接或间接连接的Fc区部分的一种或多种活性。
在某些实施方案中，铰链序列在血浆和血清中是稳定的且能抵抗蛋白水解裂解。可以使IgG1上铰链区中的第一赖氨酸突变以将蛋白水解裂解减到最少，举例来说，赖氨酸可以经甲硫氨酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代或缺失。
在本发明的一些实施方案中，CD3结合多肽能够与第二多肽链形成异源二聚体且包含如下铰链区：(a)氨基末端紧邻免疫球蛋白恒定区(例如，氨基末端连接到CH2域，其中免疫球蛋白恒定区包括CH2和CH3域，或氨基末端连接到CH3域，其中免疫球蛋白区包括CH3和CH4域)；(b)插入在结合域(例如scFv)与免疫球蛋白异源二聚域之间且连接结合域与免疫球蛋白异源二聚域；(c)插入在免疫球蛋白异源二聚域与免疫球蛋白恒定区(例如，其中免疫球蛋白恒定区包括CH2和CH3域或CH3和CH4域)之间且连接免疫球蛋白异源二聚域与免疫球蛋白恒定区；(d)插入在免疫球蛋白恒定区与结合域之间且连接免疫球蛋白恒定区与结合域；(e)在多肽链的氨基末端；或(f)在多肽链的羧基末端。包含如本文中所描述的铰链区的多肽链能够与不同的多肽链缔合以形成本文中所提供的同源二聚或异源二聚蛋白，且所形成的二聚体将含有保留了其靶特异性和/或其特异性靶结合亲和力的结合域。
在某些实施方案中，能与另一个多肽链形成异源二聚体的多肽中存在的铰链可以是免疫球蛋白铰链，诸如野生型免疫球蛋白铰链区或其改变的免疫球蛋白铰链区。在某些实施方案中，异源二聚蛋白的一个多肽链的铰链与所述异源二聚体的另一个多肽链的对应铰链同一。在某些其它实施方案中，一个链的铰链不同于另一个链的铰链(例如，在其长度和/或序列方面)。不同的链中的不同的铰链允许对铰链所连接的结合域的结合亲和力进行不同的控制，使得异源二聚体能够结合一个结合域的靶标而略过另一个结合域的靶标。举例来说，在某些实施方案中，异源二聚蛋白在一个链中具有CD3结合域或TCR结合域，且在另一个链中具有第二结合域(诸如肿瘤抗原结合域)。在两个链中具有两个不同的铰链可以允许异源二聚体首先结合肿瘤抗原，然后结合CD3或其它TCR组分。因而，异源二聚体可以将CD3+T细胞募集到表达肿瘤抗原的细胞(例如，表达PSMA的肿瘤细胞)，这又可以破坏或毁坏表达肿瘤抗原的细胞。
适合根据本发明使用的示例性铰链区示于以下表1和2中。
表1：示例性铰链区
表2：示例性铰链区(得自于H7铰链，II型C-凝集素的茎部区，或I型跨膜蛋白的域间区)
在某些实施方案中，本发明的CD3结合多肽或蛋白质可以包含“免疫球蛋白二聚域”或“免疫球蛋白异源二聚域”。
如本文中所使用的“免疫球蛋白二聚域”或“免疫球蛋白异源二聚域”是指与第二多肽链的第二免疫球蛋白域相互作用或缔合的多肽链的免疫球蛋白域，其中第一和第二免疫球蛋白异源二聚域的相互作用基本上有助于或能有效促进第一和第二多肽链的异源二聚(即，在两个不同的多肽链之间形成二聚体，这也称为“异源二聚体”或“异源二聚蛋白”)。如果在不存在第一多肽链的免疫球蛋白异源二聚域和/或第二多肽链的免疫球蛋白异源二聚域的情况下，第一和第二多肽链的二聚存在统计上显著的减少，则免疫球蛋白异源二聚域之间的相互作用“基本上有助于或能有效促进”第一和第二多肽链的异源二聚。在某些实施方案中，当第一和第二多肽链共表达时，至少60％、至少约60％到约70％、至少约70％到约80％、至少80％到约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的第一和第二多肽链与彼此形成异源二聚体。代表性免疫球蛋白异源二聚域包括免疫球蛋白CH1域、免疫球蛋白CL域(例如，Cκ或Cλ同种型)或其衍生物，包括野生型免疫球蛋白CH1和CL域和改变(或突变)的免疫球蛋白CH1和CL域，诸如本文中所提供的。
在需要由两个非同一的多肽链形成异源二聚体的情况下可以使用二聚/异源二聚域，其中一个或两个多肽链包含结合域。在某些实施方案中，本文中所描述的某些异源二聚体的一个多肽链成员不含结合域。如上文所指出，本公开的异源二聚蛋白在各多肽链中包含免疫球蛋白异源二聚域。异源二聚体的多肽链中的免疫球蛋白异源二聚域彼此不同，且因而可以差异性地进行修饰以促进两个链的异源二聚和将任一个链的同源二聚减到最少。如PCT公布号WO2011/090762中所示，本文中所提供的免疫球蛋白异源二聚域允许不同的多肽之间发生有效的异源二聚且促进所得异源二聚蛋白的纯化。
如本文中所提供，可用于促进根据本公开的两个不同的单链多肽(例如，一个短一个长)发生异源二聚的免疫球蛋白异源二聚域包括免疫球蛋白CH1和CL域，例如人CH1和CL域。在某些实施方案中，免疫球蛋白异源二聚域是野生型CH1域，诸如野生型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM CH1域。在其它实施方案中，免疫球蛋白异源二聚域是分别如PCT公布No.WO2011/090762的SEQ ID NO:114、186-192和194(所述序列以引用的方式并入本文中)中所述的野生型人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM CH1域。在某些实施方案中，免疫球蛋白异源二聚域是如WO2011/090762的SEQ ID NO:114(所述序列以引用的方式并入本文中)中所述的野生型人IgG1CH1域，所述序列与本申请的SEQ IDNO:80相同。
在其它实施方案中，免疫球蛋白异源二聚域是改变的免疫球蛋白CH1域，诸如改变的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM CH1域。在某些实施方案中，免疫球蛋白异源二聚域是改变的人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM CH1域。在其它实施方案中，在改变的免疫球蛋白CH1域中，与野生型免疫球蛋白CL域(例如人CL)一起参与形成二硫键的野生型CH1域(例如人CH1)的半胱氨酸残基缺失或被取代，使得改变的CH1域与野生型CL域之间不形成二硫键。
在某些实施方案中，免疫球蛋白异源二聚域是野生型CL域，诸如野生型Cκ域或野生型Cλ域。在特定的实施方案中，免疫球蛋白异源二聚域是分别如WO2011/090762的SEQ ID NO:112和113(所述序列以引用的方式并入本文中)中所述的野生型人Cκ或人Cλ域，所述序列分别与本申请的SEQ ID NO:81和82相同。在其它实施方案中，免疫球蛋白异源二聚域是改变的免疫球蛋白CL域，诸如改变的Cκ或Cλ域，例如，改变的人Cκ或人Cλ域。
在某些实施方案中，在改变的免疫球蛋白CL域中，与野生型免疫球蛋白CH1域(例如人CH1)一起参与形成二硫键的野生型CL域(例如人CL)的半胱氨酸残基缺失或被取代。所述改变的CL域还可以在其氨基末端包含氨基酸缺失。示例性Cκ域阐述于WO2011/090762的SEQ ID NO:141(所述序列以引用的方式并入本文中，它是本申请的SEQ ID NO:83)中，其中野生型人Cκ域的第一个精氨酸和最后一个半胱氨酸都缺失。在某些实施方案中，在改变的Ck域中，仅野生型人Ck域的最后一个半胱氨酸缺失，这是因为第一个精氨酸从野生型人Ck域中缺失可以由羧基末端具有精氨酸且连接改变的Ck域的氨基末端与另一个结构域(例如，免疫球蛋白亚区，诸如包含免疫球蛋白CH2和CH3域的亚区)的连接子提供。示例性Cλ域阐述于WO2011/090762的SEQ ID NO:140(所述序列以引用的方式并入本文中，它是本申请的SEQ ID NO:84)中，其中野生型人Cλ域的第一个精氨酸缺失且与CH1域中的半胱氨酸一起参与形成二硫键的半胱氨酸被丝氨酸取代。
在其它实施方案中，免疫球蛋白异源二聚域是与野生型Cκ域相比在Cκ-Cκ界面上可能参与形成链间氢键网络的位置上含有一个或多个氨基酸取代的改变的Cκ域。举例来说，在某些实施方案中，免疫球蛋白异源二聚域是在位置N29、N30、Q52、V55、T56、S68或T70上有一个或多个氨基酸被不同的氨基酸取代的改变的人Cκ域。氨基酸的编号是基于其在如WO2011/090762的SEQ ID NO:141(所述序列以引用的方式并入本文中，它是本申请的SEQ ID NO:83)中所述的改变的人Cκ序列中的位置。在某些实施方案中，免疫球蛋白异源二聚域是在位置N29、N30、V55或T70上有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的改变的人Cκ域。用作上述位置上的取代物的氨基酸可以是丙氨酸或具有本体侧链部分的氨基酸残基，诸如精氨酸、色氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸。可用于取代野生型人Ck序列中在上述位置(例如N30)上的氨基酸残基的其它氨基酸残基包括天冬氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸和苯丙氨酸。示例性改变的人Cκ域阐述于WO2011/090762的SEQ ID NO:142-178中(所述序列以引用的方式并入本文中)。改变的人Cκ域是促进与CH1域进行异源二聚，但将与另一个Cκ域的同源二聚减到最少的Cκ域。代表性改变的人Cκ域阐述于WO2011/090762的SEQ ID NO:160(N29W V55A T70A)、161(N29Y V55A T70A)、202(T70E N29A N30A V55A)、167(N30RV55A T70A)、168(N30K V55A T70A)、170(N30E V55A T70A)、172(V55R N29A N30A)、175(N29W N30Y V55A T70E)、176(N29Y N30YV55A T70E)、177(N30E V55A T70E)、178(N30Y V55A T70E)、838(N30D V55A T70E)、839(N30M V55A T70E)、840(N30S V55A T70E)和841(N30F V55A T70E)中(所述序列以引用的方式并入本文中)。
在某些实施方案中，除本文中所描述的Ck域中的突变以外或作为其代替物，多肽异源二聚体的免疫球蛋白异源二聚域(例如免疫球蛋白CH1和CL域)具有突变，使得所得免疫球蛋白异源二聚域在突变位点上的氨基酸残基之间形成盐桥(即，离子相互作用)。举例来说，多肽异源二聚体的免疫球蛋白异源二聚域可以是突变的CH1域与突变的Ck域的组合。在突变的CH1域中，野生型人CH1域的位置68上的缬氨酸(V68)被具有负电荷的氨基酸残基(例如天冬氨酸或谷氨酸)取代，而第一个精氨酸和最后一个半胱氨酸缺失的突变的人Ck域的位置29上的亮氨酸(L29)被具有正电荷的氨基酸残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代。所得突变CH1域中具有负电荷的氨基酸残基与所得突变Ck域中具有正电荷的氨基酸残基之间的电荷-电荷相互作用形成盐桥，所述盐桥能使突变的CH1和Ck域之间的异源二聚界面稳定。或者，野生型CH1的V68可以被具有正电荷的氨基酸残基取代，而第一个精氨酸和最后一个半胱氨酸缺失的突变人Ck域的L29可以被具有负电荷的氨基酸残基取代。V68被具有正电荷或负电荷的氨基酸取代的示例性突变CH1序列阐述于WO2011/090762的SEQ IDNO:844和845中(所述序列以引用的方式并入本文中)。L29被具有正电荷或负电荷的氨基酸取代的示例性突变Ck序列阐述于WO2011/090762的SEQ ID NO:842和843中(所述序列以引用的方式并入本文中)。
除CH1域的V68和Ck域的L29中的突变以外或作为其代替方案，除人CH1域的V68和人Ck域的L29以外的位置也可以被具有相反电荷的氨基酸取代以便在氨基酸之间产生离子相互作用。所述位置可以通过任何合适的方法来鉴别，包括随机突变发生；分析CH1-Ck配对的晶体结构，这是用于鉴别CH1-Ck界面上的氨基酸残基且使用一组标准(例如，参与离子相互作用的倾向性、与潜在伴侣残基的邻近程度等等)在CH1-Ck界面上的氨基酸残基中进一步鉴别合适的位置。
在某些实施方案中，本公开的多肽异源二聚体仅含有一对免疫球蛋白异源二聚域。举例来说，多肽异源二聚体的第一个链可以包含CH1域作为免疫球蛋白异源二聚域，而第二个链可以包含CL域(例如Cκ或Cλ)作为免疫球蛋白异源二聚域。或者，第一个链可以包含CL域(例如Cκ或Cλ)作为免疫球蛋白异源二聚域，而第二个链可以包含CH1域作为免疫球蛋白异源二聚域。如本文中所述，第一个和第二个链的免疫球蛋白异源二聚域能够缔合以形成本公开的异源二聚蛋白。
在某些其它实施方案中，本公开的异源二聚蛋白可以具有两对免疫球蛋白异源二聚域。举例来说，异源二聚体的第一个链可以包含两个CH1域，而第二个链可以具有两个CL域，该两个CL域与第一个链的两个CH1域缔合。或者，第一个链可以包含两个CL域，而第二个链可以具有两个CH1域，该两个CH1域与第一个链的两个CL域缔合。在某些实施方案中，第一个多肽链包含CH1域和CL域，而第二个多肽链包含CL域和CH1域。该CL域和CH1域分别与第一个多肽链的CH1域和CL域缔合。
在异源二聚蛋白仅包含一个异源二聚配对(例如，各链中有一个免疫球蛋白异源二聚域)的实施方案中，各链的免疫球蛋白异源二聚域可以位于该链的免疫球蛋白恒定亚区的氨基末端。或者，各链中的免疫球蛋白异源二聚域可以位于该链的免疫球蛋白恒定亚区的羧基末端。
在异源二聚蛋白包含两个异源二聚配对(例如，各链中有两个免疫球蛋白异源二聚域)的实施方案中，各链中的两个免疫球蛋白异源二聚域都可以位于该链的免疫球蛋白恒定亚区的氨基末端。或者，各链中的两个免疫球蛋白异源二聚域可以都位于该链的免疫球蛋白恒定亚区的羧基末端。在其它实施方案中，各链中的一个免疫球蛋白异源二聚域可以位于该链的免疫球蛋白恒定亚区的氨基末端，而另一个免疫球蛋白异源二聚域可以位于该链的免疫球蛋白恒定亚区的羧基末端。换句话说，在那些实施方案中，免疫球蛋白恒定亚区是插入在各链的两个免疫球蛋白异源二聚域之间。
如本文中所指示，在某些实施方案中，本公开的CD3结合多肽(例如小模块式免疫药物蛋白)(SMIP)、同源二聚体双特异性治疗剂(例如，Scorpion)、异源二聚体单特异性和多特异性治疗剂(例如，Interceptor)在各多肽链中包含免疫球蛋白恒定区。术语“恒定区”与恒定亚区和免疫球蛋白恒定区在本文中可互换使用。包括免疫球蛋白恒定区可以减缓由两个CD3结合多肽链形成的同源二聚和异源二聚蛋白在施用到受试者之后从循环中清除。
通过突变或其它改变，免疫球蛋白恒定区还使得能够相对容易地调节二聚多肽效应功能(例如，ADCC、ADCP、CDC、补体固定和Fc受体结合)，如本领域中已知和本文中所描述，所述二聚多肽效应功能可以取决于所治疗的疾病而增加或降低。
在某些实施方案中，本公开的多肽同源二聚体和异源二聚体的多肽链之一或两者的免疫球蛋白恒定区应能够介导这些效应功能中的一种或多种。
在其它实施方案中，与对应的野生型免疫球蛋白恒定区相比，在本公开的多肽同源二聚体和异源二聚体的多肽链之一或两者的免疫球蛋白恒定区中，这些效应功能中的一种或多种被降低或缺乏。举例来说，单特异性CD3结合多肽以及包含第二结合域(例如，设计用于引发重定向T细胞毒性(RTCC))的CD3结合多肽的免疫球蛋白恒定区相对于对应的野生型免疫球蛋白恒定区具有降低的效应功能或无效应功能是特别有用的。在一个实施方案中，恒定区经修饰以便不固定补体。恒定区还可以经修饰以便不结合一种或多种Fcγ受体，诸如CD16、CD32和CD64。
本公开的CD3结合多肽中存在的免疫球蛋白恒定亚区可以由以下各项构成或源自于以下各项的一部分或全部：CH2域、CH3域、CH4域或其任何组合。举例来说，免疫球蛋白恒定亚区可以包含CH2域、CH3域、CH2域和CH3域两者、CH3域和CH4域两者、两个CH3域、CH4域、两个CH4域和CH2域及CH3域的一部分。在一些实施方案中，恒定区包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD或其任何组合的CH2和CH3域；IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM或其任何组合的免疫球蛋白CH3域；或IgE、IgM或其组合的免疫球蛋白CH3和CH4域。在一些实施方案中，恒定区实质上由CH2域和CH3域组成。
可以形成本公开的CD3结合多肽的免疫球蛋白恒定区的CH2域可以是来自于某些免疫球蛋白类别或子类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD)和来自于各种的物种(包括人、小鼠、大鼠和其它哺乳动物)的野生型免疫球蛋白CH2域或其改变的免疫球蛋白CH2域。在一些实施方案中，恒定区经修饰以降低或消除效应功能、减少或不固定补体和/或减少结合或不结合Fcγ受体。在一些实施方案中，Fcγ受体选自CD16、CD32和CD64。
在某些实施方案中，CH2域是野生型人免疫球蛋白CH2域，诸如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD的野生型CH2域，分别如PCT公布WO2011/090762的SEQ ID NO:115、199-201和195-197(所述序列以引用的方式并入本文中)中所述。在某些实施方案中，CH2域是如WO2011/090762的SEQ ID NO:115中所述的野生型人IgG1CH2域(所述序列以引用的方式并入本文中，它是本申请的SEQ ID NO:85)。在一些实施方案中，恒定区包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列或由其组成。
在某些实施方案中，CH2域是在位置297的天冬酰胺上包含氨基酸取代(例如，天冬酰胺变成丙氨酸)的改变的免疫球蛋白CH2区(例如，改变的人IgG1CH2域)。这样的氨基酸取代减少或消除这个位点上的糖基化且取消FcγR与C1q的有效Fc结合。在位置297上具有Asn变成Ala取代的改变的人IgG1CH2域的序列阐述于WO2011/090762的SEQ ID NO:324中(所述序列以引用的方式并入本文中，它是本申请的SEQ ID NO:86)。
在某些实施方案中，CH2域是在位置234到238上包含至少一个取代或缺失的改变的免疫球蛋白CH2区(例如，改变的人IgG1CH2域)。举例来说，免疫球蛋白CH2区可以在位置234、235、236、237或238、位置234和235、位置234和236、位置234和237、位置234和238、位置234-236、位置234、235和237、位置234、236和238、位置234、235、237和238、位置236-238上或位置234-238上的两个、三个、四个或五个氨基酸的任何其它组合包含取代。另外或作为代替方案，改变的CH2区可以在位置234-238上，例如在位置236或位置237之一上包含一个或多个(例如两个、三个、四个或五个)氨基酸缺失，而在另一个位置上经取代。上述突变能降低或消除包含改变的CH2域的多肽异源二聚体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性或Fc受体结合能力。在某些实施方案中，已经用一个或多个丙氨酸残基置换位置234-238中的一个或多个上的氨基酸残基。在其它实施方案中，位置234-238上的氨基酸残基中仅一个缺失，而位置234-238上的其余氨基酸中的一个或多个可以经另一个氨基酸(例如丙氨酸或丝氨酸)取代。
在某些其它实施方案中，CH2域是在位置253、310、318、320、322和331上包含一个或多个氨基酸取代的改变的免疫球蛋白CH2区(例如，改变的人IgG1CH2域)。举例来说，免疫球蛋白CH2区可以在位置253、310、318、320、322或331、位置318和320、位置318和322、位置318、320和322上或位置253、310、318、320、322和331上的两个、三个、四个、五个或六个氨基酸的任何其它组合包含取代。上述突变能降低或消除包含改变的CH2域的多肽异源二聚体的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在某些其它实施方案中，除位置297上的氨基酸取代以外，改变的CH2区(例如，改变的人IgG1CH2域)还可以在位置234-238上包含一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)其它取代。举例来说，免疫球蛋白CH2区可以在位置234和297、位置234、235和297、位置234、236和297、位置234-236和297、位置234、235、237和297、位置234、236、238和297、位置234、235、237、238和297、位置236-238和297或除位置297以外的位置234-238上的两个、三个、四个或五个氨基酸的任何组合包含取代。另外或作为代替方案，改变的CH2区可以在位置234-238上，诸如在位置236或位置237上包含一个或多个(例如两个、三个、四个或五个)氨基酸缺失。其它突变能降低或消除包含改变的CH2域的多肽异源二聚体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性或Fc受体结合能力。在某些实施方案中，已经用一个或多个丙氨酸残基置换位置234-238中的一个或多个上的氨基酸残基。在其它实施方案中，位置234-238上的氨基酸残基中仅一个缺失，而位置234-238上的其余氨基酸中的一个或多个可以经另一个氨基酸(例如丙氨酸或丝氨酸)取代。
在某些实施方案中，除位置234-238上的一个或多个(例如，2、3、4或5个)氨基酸取代以外，本公开的融合蛋白中的突变的CH2区(例如，改变的人IgG1CH2域)可以在一个或多个参与补体固定的位置上(例如，在位置I253、H310、E318、K320、K322或P331上)含有一个或多个(例如，2、3、4、5或6个)其它氨基酸取代(例如经丙氨酸取代)。突变的免疫球蛋白CH2区的例子包括在位置234、235、237(如果存在)、318、320和322上具有丙氨酸取代的人IgG1、IgG2、IgG4和小鼠IgG2a CH2区。示例性突变的免疫球蛋白CH2区是在L234、L235、G237、E318、K320和K322上具有丙氨酸取代的小鼠IGHG2c CH2区。
在其它实施方案中，除位置297上的氨基酸取代和位置234-238上的其它缺失或取代以外，改变的CH2区(例如，改变的人IgG1CH2域)还可以在位置253、310、318、320、322和331上包含一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)其它取代。举例来说，免疫球蛋白CH2区可以包含(1)位置297上的取代，(2)位置234-238上的一个或多个取代或缺失或其组合，和位置I253、H310、E318、K320、K322和P331上的一个或多个(例如，2、3、4、5或6个)氨基酸取代，诸如位置E318、K320和K322上的一个、两个、三个取代。上述位置上的氨基酸可以被丙氨酸或丝氨酸取代。
在某些实施方案中，免疫球蛋白CH2区多肽包含：(i)位置297的天冬酰胺上的氨基酸取代和位置234、235、236或237上的一个氨基酸取代；(ii)位置297的天冬酰胺上的氨基酸取代和位置234-237中的两个上的氨基酸取代；(iii)位置297的天冬酰胺上的氨基酸取代和位置234-237中的三个上的氨基酸取代；(iv)位置297的天冬酰胺上的氨基酸取代、位置234、235和237上的氨基酸取代和位置236上的氨基酸缺失；(v)位置234-237中的三个上的氨基酸取代和位置318、320和322上的氨基酸取代；或(vi)位置234-237中的三个上的氨基酸取代、位置236上的氨基酸缺失和位置318、320和322上的氨基酸取代。
在位置297的天冬酰胺上具有氨基酸取代的示例性改变的免疫球蛋白CH2区包括：在L234、L235、G237和N297上具有丙氨酸取代和在G236上具有缺失的人IgG1CH2区(WO2011/090762的SEQ IDNO:325，所述序列以引用的方式并入本文中)、在V234、G236和N297上具有丙氨酸取代的人IgG2CH2区(WO2011/090762的SEQ IDNO:326，所述序列以引用的方式并入本文中)、在F234、L235、G237和N297上具有丙氨酸取代和在G236上具有缺失的人IgG4CH2区(WO2011/090762的SEQ ID NO:322，所述序列以引用的方式并入本文中)、在F234和N297上具有丙氨酸取代的人IgG4CH2区(WO2011/090762的SEQ ID NO:343，所述序列以引用的方式并入本文中)、在L235和N297上具有丙氨酸取代的人IgG4CH2区(WO2011/090762的SEQ ID NO:344，所述序列以引用的方式并入本文中)、在G236和N297上具有丙氨酸取代的人IgG4CH2区(WO2011/090762的SEQ ID NO:345，所述序列以引用的方式并入本文中)、和在G237和N297上具有丙氨酸取代的人IgG4CH2区(WO2011/090762的SEQ ID NO:346，所述序列以引用的方式并入本文中)。
在某些实施方案中，除上述氨基酸取代以外，改变的CH2区(例如，改变的人IgG1CH2域)可能在除上述位置以外的一个或多个位置上含有一个或多个其它氨基酸取代。所述氨基酸取代可以是保守或非保守氨基酸取代。举例来说，在某些实施方案中，在改变的IgG2CH2区中，P233可以变成E233(参见例如WO2011/090762的SEQ IDNO:326，所述序列以引用的方式并入本文中)。另外或作为代替方案，在某些实施方案中，改变的CH2区可以含有一个或多个氨基酸插入、缺失或两者。插入、缺失或取代可以位于免疫球蛋白CH2区中的任何地方，诸如在野生型免疫球蛋白CH2区的N或C末端，从而经由铰链连接CH2区与另一个区(例如，结合域或免疫球蛋白异源二聚域)。
在某些实施方案中，本公开的多肽中的改变的CH2区包含或者是与野生型免疫球蛋白CH2区，诸如野生型人IgG1、IgG2或IgG4或小鼠IgG2a(例如，IGHG2c)的CH2区具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。
本公开的CD3结合多肽中的改变的免疫球蛋白CH2区可以源自于各种物种(包括人、小鼠、大鼠和其它哺乳动物)的各种免疫球蛋白同种型，诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2和IgD的CH2区。在某些实施方案中，本公开的融合蛋白中的改变的免疫球蛋白CH2区可以源自于人IgG1、IgG2或IgG4或小鼠IgG2a(例如IGHG2c)的CH2区，它们的序列阐述于WO2011/090762的SEQ ID NO:115、199、201和320中(所述序列以引用的方式并入本文中)。
在某些实施方案中，改变的CH2域是在位置235、318、320和322上具有丙氨酸取代(即，具有L235A、E318A、K320A和K322A取代的人IgG1CH2域)(WO2011/090762的SEQ ID NO:595，所述序列以引用的方式并入本文中)和任选地存在的N297突变(例如突变成丙氨酸)的人IgG1CH2域。在某些其它实施方案中，改变的CH2域是在位置234、235、237、318、320和322上具有丙氨酸取代(即，具有L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A取代的人IgG1CH2域)(WO2011/090762的SEQ ID NO:596，所述序列以引用的方式并入本文中)和任选地存在的N297突变(例如突变成丙氨酸)的人IgG1CH2域。
在某些实施方案中，改变的CH2域是具有本领域中已知的能增强诸如ADCC、ADCP、CDC、补体固定、Fc受体结合或其任何组合等免疫学活性的突变的改变的人IgG1CH2域。
可以形成本公开的CD3结合多肽的免疫球蛋白恒定区的CH3域可以是来自于各种物种(包括人、小鼠、大鼠和其它哺乳动物)的某些免疫球蛋白类别或子类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM)的野生型免疫球蛋白CH3域或其改变的免疫球蛋白CH3域。在某些实施方案中，CH3域是野生型人免疫球蛋白CH3域，诸如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM的野生型CH3域，分别如WO2011/090762的SEQ ID NO:116、208-210、204-207和212中所述(所述序列以引用的方式并入本文中)。在某些实施方案中，CH3域是如WO2011/090762的SEQ ID NO:116(所述序列以引用的方式并入本文中)中所述的野生型人IgG1CH3域。在某些实施方案中，CH3域是改变的人免疫球蛋白CH3域，诸如基于或源自于人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体的野生型CH3域的改变的CH3域。举例来说，改变的CH3域可以是在位置H433和N434上具有一个或两个突变的人IgG1CH3域(位置是根据EU编号法进行编号)。所述位置上的突变可能参与补体固定。在某些其它实施方案中，改变的CH3域可以是人IgG1CH3域，但在位置F405或Y407上具有一个或两个氨基酸取代。所述位置上的氨基酸参与了与另一个CH3域的相互作用。在某些实施方案中，改变的CH3域可以是最后一个赖氨酸缺失的改变的人IgG1CH3域。这种改变的CH3域的序列阐述于WO2011/090762的SEQ IDNO:761中(所述序列以引用的方式并入本文中)。
在某些实施方案中，形成多肽异源二聚体的CD3结合多肽包含一个CH3对，其包含所谓的“钮入孔”突变(参见Marvin和Zhu,ActaPharmacologica Sinica 26:649-58,2005；Ridgway等,Protein Engineering 9:617-21,1966)。更具体地说，突变可以引入到各多肽链的两个CH3域的每一个中，使得CH3/CH3缔合所需的空间互补性强制这两个CH3域与彼此配对。举例来说，多肽异源二聚体的一个单链多肽中的CH3域可以含有T366W突变(“钮”突变，其用较大的氨基酸取代小氨基酸)，且多肽异源二聚体的另一个单链多肽中的CH3域可以含有Y407A突变(“孔”突变，其用较小的氨基酸取代大氨基酸)。其它示例性钮入孔突变包括(1)一个CH3域中的T366Y突变和另一个CH3域中的Y407T，和(2)一个CH3域中的T366W突变和另一个CH3域中的T366S、L368A和Y407V突变。
可以形成本公开的CD3结合多肽的免疫球蛋白恒定区的CH4域可以是来自于IgE或IgM分子的野生型免疫球蛋白CH4域或其改变的免疫球蛋白CH4域。在某些实施方案中，CH4域是野生型人免疫球蛋白CH4域，诸如分别如WO2011/090762的SEQ ID NO:213和214(所述序列以引用的方式并入本文中)中所述的人IgE和IgM分子的野生型CH4域。在某些实施方案中，CH4域是改变的人免疫球蛋白CH4域，诸如基于或源自于人IgE或IgM分子的CH4域的改变的CH4域，所述分子具有能增加或降低已知与IgE或IgM Fc区相关的免疫活性的突变。
在某些实施方案中，本公开的CD3结合多肽的免疫球蛋白恒定区包含CH2、CH3或CH4域的组合(即，一个以上选自CH2、CH3和CH4的恒定区域)。举例来说，免疫球蛋白恒定亚区可以包含CH2和CH3域或CH3和CH4域。在某些其它实施方案中，免疫球蛋白恒定区可以包含两个CH3域且不包含CH2或CH4域(即，仅两个或更多个CH3)。形成免疫球蛋白恒定亚区的多个恒定区结构域可以基于或源自于相同的免疫球蛋白分子，或者相同类别或子类的免疫球蛋白分子。在某些实施方案中，免疫球蛋白恒定亚区是IgG CH2CH3(例如IgG1CH2CH3、IgG2CH2CH3和IgG4CH2CH3)，且可以是人(例如，人IgG1、IgG2和IgG4)CH2CH3。举例来说，在某些实施方案中，免疫球蛋白恒定亚区包含(1)野生型人IgG1CH2和CH3域、(2)具有N297A取代的人IgG1CH2(即，CH2(N297A))和野生型人IgG1CH3，或(3)人IgG1CH2(N297A)和最后一个赖氨酸缺失的改变的人IgG1CH3。
或者，多个恒定区结构域可以基于或源自于不同的免疫球蛋白分子或者不同类别或子类的免疫球蛋白分子。举例来说，在某些实施方案中，免疫球蛋白恒定亚区包含人IgM CH3域和人IgG1CH3域。形成免疫球蛋白恒定亚区的多个恒定区结构域可以直接连接在一起，或可以经由一个或多个(例如约2-10个)氨基酸彼此连接。
示例性免疫球蛋白恒定亚区阐述于WO2011/090762的SEQ IDNO:305-309、321、323、341、342和762中(所述序列以引用的方式并入本文中)。
在某些实施方案中，同源二聚体或异源二聚体的两个CD3结合多肽链的免疫球蛋白恒定区彼此同一。在某些其它实施方案中，异源二聚蛋白的一个多肽链的免疫球蛋白恒定亚区与所述异源二聚体的另一个多肽链的免疫球蛋白恒定亚区不同。举例来说，异源二聚蛋白的一个免疫球蛋白恒定亚区可以含有具有“钮”突变的CH3域，而所述异源二聚蛋白的另一个免疫球蛋白恒定亚区可以含有具有“孔”突变的CH3域。
本发明的一些实施方案涉及使用如下的双特异性或多特异性结合分子：(i)靶向人T细胞上的TCR复合物(例如CD3)和(ii)细胞表面蛋白，例如以重定向T细胞细胞毒性针对具有所述细胞表面蛋白的细胞，例如针对表达肿瘤抗原的肿瘤细胞以便治疗癌症。
在某些实施方案中，CD3结合蛋白可以包含一个或多个结合除CD3以外的靶标的其它结合域(例如第二结合域)。这些其它靶分子可以包含例如肿瘤相关抗原。在本发明的一个实施方案中，一个或多个其它结合域结合一个或多个以下肿瘤抗原或与其相互作用：RON、c-Met、CEACAM-6、PSMA、EpCAM、CEA、PCTA-1、STEAP-1、STEAP-2、PSCA、PSA、PAP、ALCAM(CD166)、PECAM-1、EphA2、CD151、CA-125/MUC16、MUC-1、MAGE-1、TROP2、IGF1R、TGFBR2、GHRHR、GHR、IL-6R、gp130、TNFR2、OSMRβ、Patched-1、Frizzled、Robo1、LTβR、CD19、CD25、CD26、CD27、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD63、CD80、CD81、CD86、CD100、CD151、CXCR4、CCR5、HER-2/ErbB1、HER-3/ErbB3、HER-4/ErbB4、EGFR/ErbB1、EGFRvIII同种型、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5b、MUC7、βhCG、Lewis-Y、神经节苷脂GD3、9-O-乙酰基-GD3、GM2、GloboH、岩藻糖酰GM1、Poly SA、GD2、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、音猬因子(Sonic Hedgehog)(Shh)、Wue-1、浆细胞抗原、(膜结合)IgE、黑色素瘤硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、CCR8、TNF-α前体、间皮素、A33抗原、Ly-6；桥粒核心糖蛋白4、E-钙粘附蛋白新表位、胎儿乙酰胆碱受体、CA19-9标记物、苗勒氏抑制物质(MIS)受体II型、sTn(唾液酸化Tn抗原；TAG-72)、FAP(成纤维细胞活化抗原)、内皮唾液酸蛋白、LG、SAS、BCMA、TWEAKR/Fn14、FGFR4、VEGFR1、VEGFR2、SSX1和SSX2。
在某些实施方案中，CD3结合域结合TCR结合域以便将T细胞募集到表达肿瘤抗原的靶细胞。在某些实施方案中，CD3结合多肽可以包含特异性结合TCR复合物或其组分(例如TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ和CD3ε)的CD3结合域和特异性结合肿瘤相关抗原的另一个结合域。
PSMA是一种高度受限的前列腺癌相关细胞膜抗原。在前列腺癌细胞中，PSMA的表达是正常前列腺上皮细胞上的1000倍(Su等,Cancer Res.199544:1441-1443)。PSMA的表达随着前列腺癌进展而增加，并且典型地在转移性疾病、激素难治性病例和较高等级病变中最高(Israeli等,Cancer Res.1994,54:1807-1811；Wright等,UrologicOncology:Seminars and Original Investigations 19951:18-28；Wright等,Urology 199648:326-332；Sweat等,Urology 199852:637-640)。另外，PSMA丰富地表达于多种其它实性肿瘤(包括膀胱癌、胰腺癌、黑素瘤、肺癌和肾癌)的新生血管上而不是正常的新生血管上(Chang等,Urology 200157:801-805；Divgi等,Clin.Cancer Res.19984:2729-3279)。靶向PSMA的结合域包括但不限于PCT公布号WO2012/145714中所描述的那些，该文献以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，PSMA结合域包含与选自以下的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列：(i)SEQ IDNO:212的氨基酸1-107和124-243；(ii)SEQ ID NO:226的氨基酸1-107和124-243；或(iii)SEQ ID NO:216的氨基酸1-107和124-243。在一些实施方案中，本发明的蛋白质或分子包含选自SEQ ID NO:212、214、216和226的氨基酸序列。可根据本发明使用的PSMA结合域还描述于PCT公布号WO2012/145714中，包括了包含WO2012/145714的氨基酸序列SEQ ID NO:19、21、30、31、34或35的PSMA结合域，或包含有包含选自WO2012/145714的SEQ ID NO:5和23的氨基酸序列的VL链和包含选自WO2012/145714的SEQ IDNO:2、25和27的氨基酸序列的VH链。
RON(受体酪氨酸激酶，也称为MST1R)是胚胎发育所必需的受体型蛋白酪氨酸激酶且在发炎反应中也起着重要作用(Camp等,Ann.Surg.Oncol.12:273-281(2005))。RON主要表达于上皮衍生的细胞类型中，并且已经提出，RON如同许多其它受体型酪氨酸激酶一样可能在恶性上皮癌进展中起作用(Wang等,Carcinogenesis 23:1291-1297(2003))。RON的活化引发牵涉到诸如细胞增殖、细胞凋亡抑制和细胞运动性等肿瘤发生活性的下游信号传导路径。尤其是，RON由于其信号传导性质和/或RON在结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中的过表达而代表了上皮癌的治疗靶标。
用于靶向RON的结合域包括但不限于实施例部分中所描述的那些和PCT公布WO2011/090761中所描述的那些，该文献以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，抗RON结合域包含(a)VL域，其包含i.CDR1氨基酸序列SEQ ID NO:87、CDR2氨基酸序列SEQ ID NO:88和CDR3氨基酸序列SEQ ID NO:89；或ii.CDR1氨基酸序列SEQ ID NO:90、CDR2氨基酸序列SEQ ID NO:91和CDR3氨基酸序列SEQ ID NO:92；或(b)VH域，其包含i.CDR1氨基酸序列SEQ ID NO:93、CDR2氨基酸序列SEQ ID NO:94和CDR3氨基酸序列SEQ ID NO:95；或ii.CDR1氨基酸序列SEQ ID NO:96、CDR2氨基酸序列SEQ ID NO:97和CDR3氨基酸序列SEQ ID NO:98；或(c)(a)的VL和(b)的VH。在一个实施方案中，VL域包含SEQ ID NO:99或100中任一者的氨基酸序列，且VH域包含SEQ ID NO:101、102和103中任一者的氨基酸序列。在另一个实施方案中，VL和VH域被人源化。在某些实施方案中，人源化VL包含SEQ ID NO:104、105和106中任一者的氨基酸序列，且人源化VH域包含SEQ IDNO:107-111中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗RON结合域包含有包含SEQ ID NO:99和100中任一者的氨基酸序列的VL域，和包含SEQ ID NO:101、102和103中任一者的氨基酸序列的VH域。在一些实施方案中，抗RON结合域包含有包含SEQ ID NO:104、105和106中任一者的氨基酸序列的VL域，和包含SEQ IDNO:107-111中任一者的氨基酸序列的VH域。
在一些实施方案中，RON结合域包含与SEQ ID NO:187具有至少90％、92％、94％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列和/或包含与SEQ ID NO:188具有至少90％、92％、94％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，RON结合域包含(i)SEQ ID NO:187，其中氨基酸43(丙氨酸)经另一个氨基酸取代，例如经赖氨酸(A43K)或苏氨酸(A43T)取代；(ii)SEQID NO:188，其中氨基酸38(谷氨酰胺)和/或113(谷氨酰胺)经另一个氨基酸取代，例如经谷氨酸和/或精氨酸取代，诸如Q38R和/或Q113E；或(iii)其任何组合。在一些实施方案中，抗RON/抗CD3双特异性分子包含与SEQ ID NO:186、190、192或194中的任一者具有至少90％、92％、94％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，本发明提供了一种编码抗RON/抗CD3双特异性分子的核酸，其中所述核酸包含与SEQ ID NO:185、189、191或193中的任一者具有至少90％、92％、94％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
CD19是在B细胞，包括大部分恶性B细胞的表面上发现的。靶向CD19可用于抑制和治疗B细胞相关疾病、白血病和淋巴瘤。
在一些实施方案中，CD19结合域包含与SEQ ID NO:196的氨基酸1-111具有至少90％、92％、94％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列和/或包含与SEQ ID NO:196的氨基酸128-251具有至少90％、92％、94％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD19/抗CD3双特异性分子包含与SEQ ID NO:196、198、200、202、204或206中任一者具有至少90％、92％、94％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，本发明提供了一种编码抗CD19/抗CD3双特异性分子的核酸，其中所述核酸包含与SEQ IDNO:195、197、199、201、203或206中的任一者具有至少90％、92％、94％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
HER2也称为人ErbB2。在乳腺癌、卵巢癌和其它癌瘤(包括胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌和膀胱癌)中也观察到了HER2的过表达(往往但不总是由于基因扩增)。靶向HER2的结合域包括但不限于PCT公布WO2009/055074中所描述的那些，该文献以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，CD3结合多肽包含与SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、186、190、192、194、196、198、200、202、204或206具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD3结合多肽是异源二聚体的一部分。在一些实施方案中，异源二聚体包含一对单链多肽，其中所述单链对包含与选自以下的配对具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:210和247、SEQ ID NO:210和218、SEQ ID NO:210和220、SEQ ID NO:208和249、SEQ ID NO:208和222或SEQ IDNO:208和224、SEQ ID NO:212和218、SEQ ID NO:216和222、SEQID NO:228和226或SEQ ID NO:214和218。
本发明还包括编码如本文中所描述的CD3结合多肽，或如本文中所描述的二聚或异源二聚CD3结合蛋白的一个或多个多肽链的核酸(例如DNA或RNA)。本发明的核酸包括具有与如SEQ ID NO:5、7、9、11、13、15、17、19、27、29、31、37和39中所提供的聚核苷酸基本上同一的区域的核酸或包含编码相同或相似多肽的编码区的核酸。在某些实施方案中，根据本发明的核酸与如SEQ ID NO:5、7、9、11、13、15、17、19、27、29、31、37和39中所提供的多肽编码聚核苷酸具有至少80％、典型地至少约90％且更典型地至少约95％或至少约98％同一性。本发明的核酸还包括互补核酸。在一些情况下，序列在比对时将完全互补(无错配)。在其它情形下，序列中可能存在最多约20％错配。在本发明的一些实施方案中提供了编码本发明的异源二聚CD3结合蛋白的第一和第二多肽链两者的核酸。本文中所提供的核酸序列可以使用密码子优化、简并序列、沉默突变和其它DNA技术加以利用以优化在特定宿主中的表达，且本发明涵盖所述序列修饰。
通过将所述分子放在载体中对包含所要聚核苷酸序列的聚核苷酸分子进行增殖。本发明还包括含有本发明核酸和/或表达本发明多肽的表达载体。使用病毒和非病毒载体，包括质粒。质粒的选择将取决于需要增殖的细胞类型和增殖目的。某些载体适用于扩增和制造大量的所需DNA序列。其它载体适合于在培养中的细胞中进行表达。其它载体适合于在整个动物或人的细胞中进行转移和表达。适当载体的选择完全在本领域技术人员的掌控之内。许多这样的载体可以得自市面。典型地借助于DNA连接酶连接到载体中裂解的限制酶位点来将部分或全长聚核苷酸插入载体中。或者，可以通过体内同源重组来插入所要的核苷酸序列。典型地，这伴随有将同源性区域连接到载体中所要核苷酸序列的两侧上。举例来说，通过寡核苷酸连接或通过聚合酶链反应，使用包含同源性区域和所要核苷酸序列的一部分的引物加入同源性区域。
对于表达来说，可以采用表达盒或系统。为了表达编码本文中所公开的多肽的核酸，将编码所述多肽的核酸分子引入到宿主细胞中，所述核酸分子可操作地连接到能控制在表达载体中的转录表达的调节序列。本发明包括了包含本发明的核酸和/或表达载体，例如编码本发明多肽的核酸的宿主细胞。除诸如启动子和增强子等转录调节序列以外，表达载体可以包括翻译调节序列和适合于选择携带表达载体的细胞的标记基因。本发明聚核苷酸所编码的基因产物表达于任何适宜的表达系统中，包括例如细菌、酵母、昆虫、两栖动物和哺乳动物系统。在表达载体中，在适当时将多肽编码聚核苷酸连接到调节序列以获得所要的表达性质。这些可以包括启动子、增强子、终止子、操纵子、抑制子和诱导物。启动子可以是调节性的(例如来自于类固醇诱导性pIND载体(Invitrogen)的启动子)或组成性的(例如来自于CMV、SV40、延伸因子或LTR序列的启动子)。使用如上文关于连接到载体所述的技术将这些连接到所要的核苷酸序列。可以使用本领域中已知的任何技术。因此，表达载体一般将提供转录和翻译起始区，它可以是诱导性的或组成性的，其中在转录起始区及转录和翻译结束区的转录控制下可操作地连接编码区。
可以将表达盒(“表达单元”)引入到多种载体中，例如质粒、BAC、YAC、噬菌体(诸如λ、P1、M13等)、植物或动物病毒载体(例如，基于逆转录病毒的载体、腺病毒载体)等等，其中载体正常以选择包含表达载体的细胞的能力为特征。载体可以提供染色体外维持，特别是作为质粒或病毒，或用于整合到宿主染色体中。在需要染色体外维持的情况下，提供起点序列以便复制质粒，它可以是低或高拷贝数。多种标记物可用于选择，确切地说防止毒素，更确切的说是防止抗生素的那些标记物。根据宿主的性质来选择所选的特定标记物，其中在一些情况下，可以用营养缺陷型宿主进行补充。DNA构建体的引入可以使用任何适宜的方法，包括例如结合、细菌转化、钙沉淀的DNA、电穿孔、融合、转染、用病毒载体感染、生物弹法等等。
因此，本发明内使用的蛋白质可以根据常规技术在经基因工程改造的宿主细胞中产生。合适的宿主细胞为可以用外源性DNA转化或转染且在培养基中生长的细胞类型，并且包括细菌、真菌细胞和培养的高级真核细胞(包括多细胞生物体的培养细胞)，特别是培养的哺乳动物细胞。以下文献公开了用于操控克隆的DNA分子和将外源性DNA引入到多种宿主细胞中的技术：Sambrook和Russell,MolecularCloning:A Laboratory Manual(第3版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY,2001)；和Ausubel等,Short Protocols inMolecular Biology(第4版,John Wiley&Sons,1999)。
举例来说，为了重组表达包含两个同一的如本文中所描述的CD3结合多肽链的同源二聚CD3结合蛋白，表达载体一般将包括可操作地连接到启动子的编码CD3结合多肽的核酸区段。为了重组表达包含不同的第一和第二多肽链的异源二聚CD3结合蛋白，第一和第二多肽链可以由宿主细胞中单独的载体共表达以便表达整个异源二聚蛋白。或者，为了表达异源二聚CD3结合蛋白，第一和第二多肽链可以由宿主细胞中的同一载体中单独的表达单元共表达以便表达整个异源二聚蛋白。通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞，然后通过常规技术培养经过转染的细胞以产生编码多肽，从而产生对应的CD3结合蛋白。
为了将重组蛋白引导到宿主细胞的分泌路径中，在表达载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列)。分泌信号序列可以是重组蛋白的天然形式的分泌信号序列，或可以源自于另一个分泌蛋白或重新合成。将分泌信号序列可操作地连接到编码多肽的DNA序列，即，将两个序列在正确的阅读框中接合且进行定位以便将新合成的多肽引导到宿主细胞的分泌路径中。分泌信号序列通常相对于编码相关多肽的DNA序列位于5'，但某些信号序列可以位于相关DNA序列中的其它地方(参见例如Welch等,美国专利号5,037,743；Holland等,美国专利号5,143,830)。在特定变化方案中，根据本发明使用的分泌信号序列具有氨基酸序列MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ IDNO:79)。
培养的哺乳动物细胞是适合于产生在本发明内使用的重组蛋白的宿主。用于将外源性DNA引入到哺乳动物宿主细胞中的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等,Cell 14:725,1978；Corsaro和Pearson,Somatic Cell Genetics 7:603,1981；Graham和Van der Eb,Virology52:456,1973)、电穿孔(Neumann等,EMBO J.1:841-845,1982)、DEAE右旋糖酐介导的转染(Ausubel等,同上)和脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等,Focus 15:73,1993；Ciccarone等,Focus 15:80,1993)。举例来说，以下文献中公开了在培养的哺乳动物细胞中产生重组多肽：Levinson等,美国专利号4,713,339；Hagen等,美国专利号4,784,950；Palmiter等,美国专利号4,579,821；和Ringold,美国专利号4,656,134。合适的哺乳动物宿主细胞的例子包括非洲绿猴肾细胞(Vero；ATCC CRL 1587)、人胚肾细胞(293-HEK；ATCC CRL 1573)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21、BHK-570；ATCC CRL 8544、ATCC CRL10314)、犬肾细胞(MDCK；ATCC CCL 34)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCC CCL61；CHO DG44；CHO DXB11(Hyclone，Logan，UT)；也参见例如Chasin等,Som.Cell.Molec.Genet.12:555,1986))、大鼠垂体细胞(GH1；ATCC CCL82)、HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝细胞癌细胞(H-4-II-E；ATCC CRL 1548)、经SV40转化的猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL 1650)和鼠胚细胞(NIH-3T3；ATCC CRL1658)。其它合适的细胞系在本领域中是已知的，并且可得自诸如弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心等公共保藏中心。可以使用强转录启动子，诸如得自于SV-40或巨细胞病毒的启动子。参见例如美国专利号4,956,288。其它合适的启动子包括来自于金属硫蛋白基因的启动子(美国专利号4,579,821和4,601,978)和腺病毒主要晚期启动子。
药物选择一般用于选择出其中已插入外来DNA的培养的哺乳动物细胞。所述细胞通常称为“转基因细胞”。在选择剂存在下培养且能够将相关基因传递给其后代的细胞称为“稳定转基因细胞”。示例性选择标记物包括对抗生素新霉素具有抗性的编码基因，它允许在诸如G-418等新霉素类型药物存在下进行选择；针对黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的gpt基因，它允许宿主细胞在霉酚酸/黄嘌呤存在下生长；和提供针对博来霉素、争光霉素、灭瘟素和潮霉素的抗性的标记物(参见例如Gatignol等,Mol.Gen.Genet.207:342,1987；Drocourt等,Nucl.Acids Res.18:4009,1990)。选择系统还可以用于增加相关基因的表达水平，这一过程称为“扩增”。通过在低水平选择剂存在下培养转基因细胞，然后增加选择剂的量直到选择出能产生所引入基因的高水平产物的细胞来进行扩增。示例性可扩增选择标记物是二氢叶酸还原酶，它能赋予针对氨甲蝶呤的抗性。还可以使用其它抗药性基因(例如潮霉素抗性、多药物抗性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。
还可以使用其它高级真核细胞作为宿主，包括昆虫细胞、植物细胞和禽类细胞。Sinkar等,J.Biosci.(Bangalore)11:47-58,1987已经回顾了使用发根农杆菌作为在植物细胞中表达基因的载体。以下文献中公开了转化昆虫细胞和在其中产生外来多肽：Guarino等,美国专利号5,162,222；和WIPO公布WO 94/06463。
可以用通常源自于苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)的重组杆状病毒感染昆虫细胞。参见King和Possee,The BaculovirusExpression System:A Laboratory Guide(Chapman&Hall,London)；O'Reilly等,Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory Manual(Oxford University Press.,New York 1994)；和Baculovirus ExpressionProtocols.Methods in Molecular Biology(Richardson编,Humana Press,Totowa,NJ,1995)。还可以通过使用Luckow等(J.Virol.67:4566-4579,1993)描述的基于转座子的系统来产生重组杆状病毒。这个系统利用转移载体，可以呈试剂盒形式得自市面(BAC-TO-BAC试剂盒；LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)。转移载体(例如PFASTBAC1；LifeTechnologies)含有用于将编码相关蛋白质的DNA移动到呈大质粒(称为“杆粒”)形式维持于大肠杆菌中的杆状病毒基因组中的Tn7转座子。参见Hill-Perkins和Possee,J.Gen.Virol.71:971-976,1990；Bonning等,J.Gen.Virol.75:1551-1556,1994；和Chazenbalk和Rapoport,J.Biol.Chem.270:1543-1549,1995。另外，转移载体可以包括如上文所公开与编码多肽延伸或亲和力标签的DNA进行框内融合。使用本领域中已知的技术，将含有蛋白质编码DNA序列的转移载体转化到大肠杆菌宿主细胞中，且针对含有指示重组杆状病毒的中断lacZ基因的杆粒筛选所述细胞。使用常用技术分离含有重组杆状病毒基因组的杆粒DNA，且用于转染草地贪夜蛾细胞，诸如Sf9细胞。随后产生表达相关蛋白质的重组病毒。通过本领域中通常使用的方法制造重组病毒储备液。
对于蛋白质产生来说，使用重组病毒感染宿主细胞，典型地为源自于草地粘虫、草地贪夜蛾(例如Sf9或Sf21细胞)或粉纹夜蛾(例如HIGH FIVE细胞；Invitrogen，Carlsbad，CA)的细胞系。一般参见Glick和Pasternak,Molecular Biotechnology,Principles&Applications ofRecombinant DNA(ASM Press,Washington,D.C.,1994)。还参见美国专利号5,300,435。使用无血清培养基来生长和维持所述细胞。合适的培养基制剂在本领域中是已知的且可以获自市面上的供应商。使所述细胞从大约2-5×105个细胞的接种密度生长到1-2×106个细胞的密度，此时加入感染复数(MOI)为0.1到10，更典型地为接近3的重组病毒储备液。所使用的程序一般描述于可用的实验室手册中(参见例如King和Possee,同上；O'Reilly等,同上；Richardson,同上)。
本发明内也可以使用真菌细胞，包括酵母细胞。在这方面特别相关的酵母种类包括酿酒酵母、巴斯德毕赤氏酵母和甲醇毕赤酵母。举例来说，以下文献公开了用外源性DNA转化酿酒酵母细胞和由其产生重组多肽的方法：Kawasaki,美国专利号4,599,311；Kawasaki等,美国专利号4,931,373；Brake,美国专利号4,870,008；Welch等,美国专利号5,037,743；和Murray等,美国专利号4,845,075。通过由通常具有抗药性或能够在不存在特定营养(例如亮氨酸)的情况下生长的选择标记物确定的表型来选择经过转化的细胞。用于酿酒酵母的示例性载体系统是Kawasaki等(美国专利号4,931,373)所公开的POT1载体系统，它允许通过在含葡萄糖的培养基中生长来选择经转化的细胞。用于酵母的合适的启动子和终止子包括来自于糖解酶基因(参见例如Kawasaki,美国专利号4,599,311；Kingsman等,美国专利号4,615,974；和Bitter,美国专利号4,977,092)和醇脱氢酶基因的那些。还参见美国专利号4,990,446、5,063,154、5,139,936和4,661,454。用于其它酵母，包括多形汉逊酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、玉米黑粉菌、巴斯德毕赤氏酵母、甲醇毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母和麦芽糖假丝酵母的转化系统在本领域中是已知的。参见例如Gleeson等,J.Gen.Microbiol.132:3459-3465,1986；Cregg,美国专利号4,882,279；和Raymond等,Yeast 14:11-23,1998。可以根据McKnight等,美国专利号4,935,349的方法利用曲霉细胞。Sumino等,美国专利号5,162,228公开了用于转化产黄头孢的方法。Lambowitz,美国专利号4,486,533公开了用于转化脉孢菌的方法。美国专利号5,716,808、5,736,383、5,854,039和5,888,768中公开了在甲醇毕赤酵母中产生重组蛋白。
原核宿主细胞，包括细菌大肠杆菌、牙胞杆菌属和其它菌属的菌株，也是本发明内可用的宿主细胞。用于转化这些宿主和表达克隆于其中的外来DNA序列的技术在本领域中是众所周知的(参见例如Sambrook和Russell,同上)。当在诸如大肠杆菌等细菌中表达重组蛋白时，蛋白可以保留在细胞质中，典型地呈不溶性颗粒形式，或可以被细菌分泌序列引导到壁膜间隙。在前一种情况下，细胞被溶解，且颗粒被回收并且使用例如异硫氰酸胍或尿素使其变性。然后，变性蛋白可以再折叠且通过稀释变性剂来进行二聚，诸如通过针对尿素溶液及还原型和氧化型谷胱甘肽的组合进行透析，随后针对缓冲生理盐水溶液进行透析。在替代方案中，蛋白质可以呈溶解形式从细胞质中回收且在不使用变性剂的情况下分离。蛋白质是在例如磷酸盐缓冲生理盐水中呈水性提取物形式从细胞中回收。为了俘获相关蛋白质，将提取物直接应用于色谱介质，诸如固定的抗体或肝素-琼脂糖凝胶柱。可以通过破坏细胞(例如，通过超声处理或渗透性冲击)以释放壁膜间隙的内含物且回收蛋白质，从而避免对变性和再折叠的需要而从壁膜间隙回收呈可溶解和功能形式的分泌蛋白。可以根据已知的方法在细菌宿主细胞中产生抗体，包括单链抗体。参见例如Bird等,Science242:423-428,1988；Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988；和Pantoliano等,Biochem.30:10117-10125,1991。
根据常规程序在含有营养和所选宿主细胞生长所需的其它组分的培养基中培养经过转化或转染的宿主细胞。多种合适的培养基，包括确定成分培养基和复合型培养基，是本领域中已知的，且一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。培养基还可以视需要含有诸如生长因子或血清等组分。一般将通过例如药物选择或必需营养素缺乏来选择用于含有外源添加DNA的细胞的生长培养基，所述必需营养素是通过表达载体上携带的或共同转染到宿主细胞中的选择标记物来补充。
可以利用常规蛋白质纯化方法，典型地通过色谱技术的组合来纯化CD3结合蛋白。一般参见Affinity Chromatography:Principles&Methods(Pharmacia LKB Biotechnology,Uppsala,Sweden,1988)；Scopes,Protein Purification:Principles and Practice(Springer-Verlag,New York 1994)。可以通过在固定的蛋白A或蛋白G上进行亲和色谱法来纯化包含免疫球蛋白Fc区的蛋白质。可以使用诸如凝胶过滤等其它纯化步骤来获得所要的纯度水平或进行脱盐、缓冲液交换等等。
本发明还包括了包含本发明的CD3结合多肽和药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂的组合物。
在本发明的一个实施方案中，将单特异性CD3结合多肽施用到罹患诸如变形性关节炎等自体免疫疾病的患者。在本发明的另一个实施方案中，将本发明的单特异性CD3结合多肽施用到将要进行器官移植的受试者。
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗诸如癌症等以肿瘤抗原过表达为特征的病症的方法。一般来说，所述方法包括向需要所述治疗的受试者施用治疗有效量的如本文中所描述的包含能结合肿瘤抗原的第二结合域的CD3结合蛋白。在一些实施方案中，CD3结合蛋白诱导重定向T细胞细胞毒性(RTCC)针对受试者中表达肿瘤抗原的细胞。
在所述方法的某些变化方案中，所述病症是癌症。在其它变化方案中，所述病症是自体免疫疾病。本发明还提供了用于治疗癌症或自体免疫病症的方法，包括向有需要的患者施用治疗有效量的本文中所描述的组合物或CD3结合多肽。
在本文中所描述的治疗方法的各实施方案中，以符合与寻求治疗的疾病或病症的处置相关的常规方法的方式递送CD3结合蛋白。根据本文中的公开内容，将有效量的CD3结合蛋白施用给需要该治疗的受试者持续足以预防或治疗所述疾病或病症的时间或在足以预防或治疗所述疾病或病症的条件下施用。
为了施用，将CD3结合蛋白配制为药物组合物。包含CD3结合蛋白的药物组合物可以根据已知的方法来配制以制备药学上有用的组合物，其中组合治疗分子，呈与药学上可接受的载剂的混合物的形式。如果组合物的施用能被受体患者耐受，则将其称为“药学上可接受的载剂”。无菌磷酸盐缓冲生理盐水是药学上可接受的载剂的一个例子。其它合适的载剂对于本领域技术人员是众所周知的。(参见例如Gennaro(编),Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack PublishingCompany,第19版,1995)。)制剂还可以包括一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、白蛋白，以防止小瓶表面上的蛋白质损失等。
将包含CD3结合蛋白的药物组合物以治疗有效量施用给受试者。根据本发明的方法，CD3结合蛋白可以通过多种施用模式施用给受试者，包括例如通过肌肉内、皮下、静脉内、心房内、关节内、肠胃外、鼻内、肺内、经皮、胸膜内、鞘内和口服施用途径。出于预防和治疗目的，施用给受试者可以例如以单次快速推注递送方式、经由延长时间段内的连续递送(例如连续经皮递送)或以重复施用方案(例如，以每小时、每日或每周计)。
分子或组合物的“治疗有效量(或剂量)”或“有效量(或剂量)”是能在缓解病症的一种或多种症状方面产生统计上显著的效果(诸如统计上显著地减缓疾病进展或统计上显著地改良器官功能)的量。确切剂量将由临床医师根据公认标准，考虑欲治疗的病状的性质和严重程度、患者特性等来确定。剂量的确定在本领域技术人员的水平内。当提到组合时，治疗有效剂量是指产生治疗效果的活性成分的组合量，无论是依次施用还是同时施用(例如，在同一制剂中或在单独的制剂中同时施用)。
有效剂量的决定在本文中典型地是基于动物模型研究和随后的人临床试验，且通过确定能在模型受试者中显著减少受试者病症的发生或严重程度的有效剂量和施用方案加以指导。本发明组合物的有效剂量取决于许多不同的因素而变化，包括施用手段、目标部位、患者生理状态、患者是人还是动物、施用的其它药物处理、治疗是预防性的还是治疗性的，以及组合物本身的特定活性和其在个体中引出所要反应的能力。通常，患者是人，但在一些疾病中，患者可以是非人哺乳动物。典型地，调节给药方案以提供最佳治疗反应，例如，以优化安全性和功效。
实施例
实施例1：设计和构建理论pI降低的抗CD3SMIP分子
L1、L2、H1、H2和H3(参见图3和4)是先前构建的人源化Cris-7的重链和轻链，并且针对结合和活性进行分析。使用H3L1制造SMIPDRA209(SEQ ID NO:3和4；IgG4AA ADCC-CDC null Fc)和SMIPDRA161(IgG4AA N297A Fc)。虽然这些构建体与OKT3和现有技术中的其它抗CD3治疗剂相比展现了改良的特征，但当表达于CHO细胞中(参见图2A和2B)时，与其它SMIP分子相比，所述构建体展现出显著较短的半衰期、较高的理论pI(参见图1)和处于结合域或前铰链区的“剪接”。
设计抗CD3pI变体以降低结合域和/或前铰链区的pI。为了制造抗CD3pI变体，通过Blue Heron对新的重链和轻链(L3、L4、H4、H5和H6)进行排序和合成。参见表3及图3和4。
表3：CD3可变重链和轻链
H4与H3相比具有2个点突变。一个突变置换了正电荷残基(K变成Q)，而另一个突变引入了负电荷(Q变成E)。两种变化都意在降低蛋白质的pI(或是通过去除正电荷，或是通过引入负电荷)。在构架序列上进行突变以避免损失亲和力，且所引入的新残基经验证存在于生殖细胞系序列中可避免免疫原性风险的位置。通过使用生殖细胞系序列作为引导序列以降低已经人源化的结合域的pI，可以进行氨基酸取代以添加生殖细胞系序列中普遍存在的氨基酸。这些氨基酸可以在生殖细胞系序列中的同一位置或邻近位置。参见图5。
通过以产生比DRA209和DRA161低的pI的方式对重链序列进行“再人源化”(与DRA209和DRA161相比)来设计H5。这是通过设计与IGHV1-3*01重链生殖细胞系序列的VH1构架相当的重链来进行。
通过以产生比DRA209和DRA161低的pI的方式对重链序列进行“再人源化”(与DRA209和DRA161相比)来设计H6。换句话说，用于设计H6的起始序列是生殖细胞系序列而不是先前人源化的序列。具体地说，这是通过使用IGHV3-21*01重链序列的VH3构架设计重链来进行。
与L1相比，L3具有6个点突变，其中使RW突变(即，置换正电荷残基，R变成L)成LL(使用LL是因为LL在生殖细胞系序列中比LW更常见)，且用Jk4序列(VEIK；SEQ ID NO:253)置换Jκ(Jk)区的一部分(LQIT；SEQ ID NO:252)。Jk4是基于Cris-7H_CDR3序列的更佳匹配的Jk区。参见图6。再次说明，仅在构架区中进行突变，且所引入的新残基经验证存在于生殖细胞系序列中可避免免疫原性风险的位置。
通过以产生比DRA209和DRA161低的pI的方式对轻链序列进行“再人源化”(与DRA209和DRA161相比)来设计L4。使用IGKV3-11*01轻链序列的Vk3的构架作为引导序列对L4进行再人源化。
基于理论计算，预期所有新的轻链和重链都具有较低pI。使用载体NTI(Invitrogen)帮助将这些序列放在一起(连接这些序列)。生殖细胞系序列是获自NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)。
构建以其他方式与DRA209和DRA161同一的SMIP分子的前铰链区中包含经取代的氨基酸的变体。前铰链区是连接结合域与铰链区的短氨基酸序列，例如，可以由添加限制性位点到编码核苷酸序列中而产生。
所制造的一种变体涉及通过PCR突变发生用SSS置换DRA209的前铰链区中的RRT序列。有意这样做以去除两个带正电的残基(精氨酸)。实验显示，这个变化被翻译为蛋白质的pI降低。这个构建体仍具有H3L1组合且给予其新名称DRA219。除了去除带正电的残基(两个精氨酸)以外，这种SSS突变还引入了允许简单组装较新的pI变体构建体的Xhol限制位点。
使用标准分子生物学技术，使用相同的Fc尾部作为DRA209，使用H与L的以下组合来构建SMIP构建体：a)H4L1(具有IgG4AAADCC-CDC null FC；在本文中也称为DRA222；SEQ ID NO:7和8)、b)H4L3(具有IgG4AA ADCC-CDC null Fc；在本文中也称为DRA221；SEQ ID NO:9和10)、c)H3L3(具有IgG4AA ADCC-CDCnull Fc；在本文中也称为DRA223；SEQ ID NO:11和12)、d)H5L4(具有IgG4AA ADCC-CDC null Fc；在本文中也称为DRA224；SEQ IDNO:13和14)和e)H6L4(具有IgG4AA ADCC-CDC null Fc；在本文中也称为DRA225；SEQ ID NO:15和16)。参见图7A和7B。
将所有这些构建体转染到HEK细胞中以产生蛋白质以便用于体外结合研究。所有构建体都表达所要蛋白质，除了DRA225构建体，它不具有明显表达。发现所有其它构建体都(i)以不同程度结合CD3(DRA222在一定程度上具有最佳结合)和(ii)具有比母体分子DRA209低的pI。测量pI可在表4中获得。
表4：测量pI
构建体 测量pl
DRA209 9.0
DRA219 8.4
DRA221 8.2
DRA222 7.5
DRA223 7.2
DRA224 6.8
DRA219、DRA221、DRA222、DRA223和DRA224都抑制人混合的淋巴细胞反应(MLR；数据未示出)，且抑制的量与所测量的其CD3结合能力相关。
DRA219(H3L1IgG4AA ADCC-CDC null FC；SEQ ID NO：5和6)和DRA222(SEQ ID NO：7和8)都保持结合CD3且具有较低的测量pI，且将其进一步克隆到编码不同的Fc尾部的pEE12.4载体(IgG4AAN297A)中以便再产生两个构建体，分别是DRA233(H3L1；SEQ IDNO：17和18)和DRA234(H4L1；SEQ ID NO：19和20)。此外，将DRA219和DRA222克隆到pEE12.4载体中以便在CHO中表达，且分别命名为DRA228和DRA229。实质上，DRA219等效于DRA228且DRA222等效于DRA229。随后将所有构建体(DRA228、DRA229、DRA233和DRA234)都转染到CHO细胞中以产生蛋白质用于结合研究、蛋白质表征和PK研究。参见图8。
通过蛋白A亲和色谱法，使用AKTA纯化器HPLC系统从细胞上清液中纯化出蛋白质。将预填装POROS A柱(Life Technologies)用于体外制剂，且将预填装MabSuRe蛋白A柱(GE Healthcare)用于体内材料。在PBS存在下装载样品且用柠檬酸盐缓冲液洗提。用TRIS缓冲液中和洗提液。
在Beckman PA 800仪器上进行毛细管等电聚焦且用于测定纯化蛋白质的等电点(pI)。根据标准Beckman cIEF方案进行分析。在3M尿素于clEF凝胶(Beckman)中的溶液中制备样品，该溶液补充有Pharmalyte 3-10两性电解质(GE Healthcare)、阴极和阳极稳定剂及合成肽pI标记物(Beckman)。将样品引入到中性毛细管(Beckman)中，然后通过将毛细管入口浸没在阳极电解液中、出口浸没在阴极电解液中且对毛细管应用25kV电位持续15分钟进行聚焦。在聚焦之后，通过化学手段使样品流通以使所有分离的组分都通过测量280nm下的吸收率的固定波长检测器。根据由合成肽pI标记物的结果构建的标准曲线计算所有样品的等电点(pI)。参见图9-11。构建体具有以下测量pI：DRA228＝8.4；DRA229＝7.5；DRA233＝8.6；DRA234＝8.0，而DRA161＝9.2且DRA209＝8.8。因此，表达的所有pI变体都具有比其对应的母体构建体DRA161或DRA209低的pI。
实施例2：抗CD3 SMIP分子结合T细胞
使用标准密度梯度离心从新鲜全血中分离人周围血液单核细胞(PBMC)，且在含0.2％BSA的PBS中洗涤三次。将细胞以200,000个PBMC/孔接种在96孔U形底板中且在冰上用50ul抗体以如图12中所指示的nM浓度标记30分钟。将板洗涤三次且用含有最佳浓度的抗CD5-APC加F(ab')2山羊抗hu IgG Fc-PE的50ul抗体混合液标记30分钟。将板洗涤三次且在120ul含1％聚甲醛的PBS中在4C下固定过夜。所有抗体孵育和洗涤都是在冰上用冷PBS、0.2％BSA、2nM EDTA进行。通过流式细胞术，使用BD LSRII分析器分析样品。从各孔中收集60微升。使用Flowjo软件，通过闸选T细胞(FCS对SSC，CD5+细胞)来分析所收集的样品。PE通道上的平均荧光强度(MFI)示于图中。DRA227SMIP仅用作对照且不含CD3或T细胞结合域，并且未进行用于降低pI的修饰。参见图12。结合CD3的所有测试pI变体及DRA228和DRA229都保留结合活性，非常类似于它们的母构建体。
实施例3：具有降低的pI的抗CD3 SMIP分子在CHO细胞中表 达得更好
尺寸排除色谱法：使用尺寸排除色谱法评估经纯化蛋白质的高分子量聚集物含量。HPLC系统是装备有四元泵、溶剂脱气器、DAD和温度控制自动取样器的Agilent 1200系列。使用在200mM磷酸钾和250mM氯化钾的运作缓冲液(pH 7.2)中平衡的Tosoh TSKgelG3000SWxl柱进行色谱分离。溶剂流速是1mL/分钟且样品注入质量是50μg。用Agilent DAD检测器在280nm波长下监测柱流出物。
SDS-PAGE：使用变性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来评估经纯化蛋白质的完整性。用Novex样品缓冲液(Invitrogen)制备样品，且在装载到4-20％Novex Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen)中之前，在85℃下加热3分钟以确保完全变性。在加热步骤之前，任选地通过添加Novex还原剂还原样品。通过在填充有Tris-甘氨酸缓冲液(Invitrogen，来自于10X储备液)的电泳室中在凝胶剂上应用125V持续110分钟来使蛋白质流通并加以分离。通过用SimplyBlue Safe Stain(Invitrogen)染色来观察蛋白质谱带。参见图13-14。测试pI变体显示与其母体分子DRA161相比有所减少的剪接。
CE-SDS：在Beckman PA 800仪器上进行在SDS中的毛细管电泳，且用来对经纯化蛋白质的低分子量剪接含量进行定量。在50％SDS样品缓冲液(Beckman)中制备1mg/mL浓度的样品，且在分析之前，在85℃下加热3分钟以确保完全变性。将样品电动(10kV，20s)注入到填充有SDS凝胶缓冲液(Beckman)的裸熔融二氧化硅毛细管中，且通过在毛细管(反极性)上应用15kV电压持续30分钟进行分离。在检测器窗上测量220nm和280nm下的吸收率。参见图15-16。这显示pI变体蛋白质的品质优于母体分子，例如，由于较低表观蛋白水解，在本文中有时称为“剪接”。
实施例4：抗CD3SMIP pI变体分子展现增加的半衰期
在时间0点对雌性BALB/c小鼠经静脉内(IV)注射含有200μgDRA234或DRA233的200μL PBS。在各时间点对每组三只小鼠进行注射。在注射之后，在所指示的时间点经由心脏穿刺对麻醉的小鼠进行抽血，且如下文所描述收集血清。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测定DRA234和DRA233的血清浓度。通过非区隔分析，使用WinNonlinTM专业软件(v5.3)且应用针对IV快速推注施用和稀疏取样的预编译模型201来估计各蛋白质的药物动力学配置参数。
在时间0点，对小鼠经静脉内注射含有200μg(约10mg/kg)DRA233或DRA234的200μL PBS。在各时间点对每组三只小鼠进行注射。经由心脏穿刺对麻醉的小鼠进行抽血，且在注射之后在t＝15分钟和2、6、24、48、72、96、168、336和504小时收集血清。使用特异性夹心ELISA测定各蛋白质的血清浓度。结果表达为随时间变化平均血清浓度(μg/mL)±SD。以线性(A)和对数(B)形式显示数据。参见图17。
使用夹心ELISA检测抗药物抗体(ADA)，其中将DRA161(DRA233和DRA234的原始形式)涂布在板上以俘获ADA，且抗小鼠IgG(H&L)HRP用于检测结合的ADA。使用过氧化物酶底物测量结合的复合物，在荧光板读数器上读取结果。结果表达为平均荧光单位(FU)相对于血清稀释度。对于DRA233，504小时处的ADA水平清楚可见，而可能的低水平起始于336小时；然而在任何DRA234样品中都未出现ADA。(数据未示出)。
在有和无504小时的数据的情况下对所有DRA233PK时间点绘制平均血清浓度相对于时间的曲线。DRA234的血清浓度相对于时间的曲线在图18C中可见。结果表达为观测数据集，且通过WinNonLinTM软件计算预计值。Rsq值和Rsq调节值是调节估计HL_Lambda z所使用的点数前后的最终消除阶段的拟合优度统计量。仅使用无可检测水平的抗药物抗体的时间点时，DRA233的近似半衰期是95小时，且DRA234的是84小时。参见图18。
来自于WinNonLin程序的PK估计值(呈表格形式)：通过使用WinNonlinTM专业软件(v5.3)，应用非区隔分析，使用针对IV快速推注施用的预编译模型201(均匀加权)来进行药物动力学分析。使用线性梯形法则，利用线性/对数内插计算法来估计时间0点到最后一个可测量浓度(T最后)的血清浓度-时间曲线下面积(AUC)。估计以下药物动力学配置参数：最大观测血清浓度(Cmax)、最后可测量浓度(C最后)下的浓度、达到最大观测血清浓度的时间(Tmax)、表观最终消除半衰期(HLλz)、从给药时间到最后一个可测量浓度的AUC(AUC总)、从给药时间开始随时间推移到无穷大的AUC(AUCINF_obs)、血清清除率(Cl_obs)、基于最终阶段的分布体积(Vz_obs)和平均滞留时间(MRT)。参见图19和20。本实施例显示，测试pI变体在小鼠中与母体分子DRA161相比具有较长体内血清半衰期和较慢清除率。
实施例5：双特异性同源二聚体分子-抗CD3和抗PSMA
使用标准技术构建结合CD3和PSMA的双特异性同源二聚体。这些构建体，即TSC249、TSC250、TSC251、TSC252、TSC295、TSC296、TSC301和TSC302描述于表5中。通过用限制酶HindIII和Xhol或Agel和Xhol消化母体模板和scFv插入物来实现插入N末端scFv结合域，鉴别所要的片段，且通过琼脂糖凝胶纯化进行分离，并且连接。通过用限制酶EcoRI和Notl消化母体模板和scFv插入物来实现插入C末端scFv结合域，鉴别所要的片段，且通过琼脂糖凝胶纯化进行分离，并且连接。
表5：结合多肽序列和组分
实施例6：双特异性同源二聚体分子-抗CD3和抗RON
使用标准技术构建具有结合CD3和RON两者的同源二聚体的双特异性分子。这些构建体，即TSC275、TSC277、TSC278和TSC279，描述于表6中。TSC275含有hu4C04的VL和VH链，分别为SEQ IDNO:187和188，这些链是RON结合域的一部分。除了如表6中所指示的突变/取代以外，TSC277、TSC278和TSC279与TSC275相同。
表6：结合多肽序列和互补序列
实施例7：双特异性同源二聚体分子-抗CD3和抗CD19
使用标准技术构建具有结合CD3和CD19两者的同源二聚体的双特异性分子，例如，参见PCT公布号WO2007/146968。这些构建体，即TSC233、TSC234、TSC235、TSC240、TSC241和TSC242，描述于表7中。TSC233含有HD37链的VL(SEQ ID NO:196的氨基酸1-111)和VH(SEQ ID NO:196的氨基酸128-251)，这些链是CD19结合域的一部分。
表7：结合多肽序列和组分
实施例8：双特异性异源二聚体分子-抗CD3和抗CD19
以类似于如PCT公布WO2011/090762中所描述的方式，通过对编码如表8中所指示的氨基酸序列的核酸进行共同转染来构建包含CD19结合域和CD3结合域的不同的异源二聚双特异性分子。通过共表达两个不同的多肽链来制造异源二聚体，一个多肽链包含免疫球蛋白CH1异源二聚域且另一个多肽链包含免疫球蛋白CL异源二聚域。
表8：用于抗CD3和抗CD19异源二聚体构建的共同转染
*SEQ ID NO:10的氨基酸1-244
**SEQ ID NO:8的氨基酸1-244
***SEQ ID NO:14的氨基酸1-247
TSC049从它的氨基末端到羧基末端包含：HD37(抗CD19)scFv、人IgG1SCC-P铰链、人IgG1CH2、人IgG1CH3和人CH1。TSC096从它的氨基末端到羧基末端包含：HD37(抗CD19)scFv、人IgG1SCC-P铰链、人IgG1CH2、人IgG1CH3和人Cκ(YAE)。TSC125从它的氨基末端到羧基末端包含：Cris7(抗CD3)scFv、人IgG1SCC-P铰链、人IgG1CH2、人IgG1CH3和人CH1。TSC218从它的氨基末端到羧基末端包含：DRA221(抗CD3)scFv、人IgG1SCC-P铰链、人IgG1CH2、人IgG1CH3和人CH1。TSC219从它的氨基末端到羧基末端包含：DRA222(抗CD3)scFv、人IgG1SCC-P铰链、人IgG1CH2、人IgG1CH3和人CH1。TSC220从它的氨基末端到羧基末端包含：DRA224(抗CD3)scFv、人IgG1SCC-P铰链、人IgG1CH2、人IgG1CH3和人CH1。TSC221从它的氨基末端到羧基末端包含：DRA221(抗CD3)scFv、人IgG1SCC-P铰链、人IgG1CH2、人IgG1CH3和人Cκ(YAE)。TSC222从它的氨基末端到羧基末端包含：DRA222(抗CD3)scFv、人IgG1SCC-P铰链、人IgG1CH2、人IgG1CH3和人Cκ(YAE)。TSC223从它的氨基末端到羧基末端包含：DRA224(抗CD3)scFv、人IgG1SCC-P铰链、人IgG1CH2、人IgG1CH3和人Cκ(YAE)。
实施例9：双特异性异源二聚体分子-抗CD3和抗PSMA
以类似于如PCT公布WO2011/090762中所描述的方式，通过对编码如表9中所指示的氨基酸序列的核酸进行共同转染来构建包含PSMA结合域和CD3结合域的不同的异源二聚双特异性分子。通过共表达两个不同的多肽链来制造异源二聚体，一个多肽链包含免疫球蛋白CH1异源二聚域且另一个多肽链包含免疫球蛋白CL异源二聚域。PCT公布号WO2011/090761中描述了一些PSMA结合域。
表9：用于抗CD3和抗PSMA异源二聚体构建的共转染
*SEQ ID NO:8的氨基酸1-244
**SEQ ID NO:216的氨基酸1-243
***SEQ ID NO:226的氨基酸1-243
“人源化107-1A4VL-VH#_2scFv”和“人源化107-1A4VL-VH#_1scFv”是基于抗人PSMA 107-1A4单克隆抗体的人源化scFv，并且也描述于PCT公布号WO2011/090761中。“人源化107-1A4VL-VH#2scFv”和“人源化107-1A4VL-VH#1scFv”分别对应于SEQ ID NO:216和226的氨基酸1-243。
TSC192从它的氨基末端到羧基末端包含：人源化107-1A4(抗PSMA)VL-VH#2scFv、人IgG1SCC-P铰链、人IgG1CH2、人IgG1CH3和人Cκ(YAE)。TSC195从它的氨基末端到羧基末端包含：人源化107-1A4(抗PSMA)VL-VH#2scFv、人IgG1SCC-P铰链、人IgG1CH2、人IgG1CH3和人CH1。TSC193从它的氨基末端到羧基末端包含：人源化107-1A4(抗PSMA)VL-VH#1scFv、人IgG1SCC-P铰链、人IgG1CH2、人IgG1CH3和人Cκ(YAE)。
TSC219从它的氨基末端到羧基末端包含：DRA222(抗CD3)scFv、人IgG1SCC-P铰链、人IgG1CH2、人IgG1CH3和人CH1。TSC222从它的氨基末端到羧基末端包含：DRA222(抗CD3)scFv、人IgG1SCC-P铰链、人IgG1CH2、人IgG1CH3和人Cκ(YAE)。TSC254从它的氨基末端到羧基末端包含：人源化107-1A4(抗PSMA)VL-VH#1scFv、人IgG1SCC-P铰链、人IgG1CH2、人IgG1CH3、连接子和人CH1。TSC258从它的氨基末端到羧基末端包含：DRA222(抗CD3)scFv、人IgG1SCC-P铰链、人IgG1CH2、人IgG1CH3、连接子和人Cκ(YAE)。
实施例10：靶向CD19的多肽异源二聚体和同源二聚体所致的靶 依赖性T细胞增殖
为了比较不同的双特异性多肽异源二聚体分子在诱导靶依赖性T细胞活化和增殖方面的效力，比较了三种不同的同源二聚双特异性分子(TSC129a、TSC233和TSC234(分别是SEQ ID NO:245、196和198))，它们具有共同的抗CD19结合域(HD37)和三个不同的抗CD3结合域(TSC129a的是Cris7，TSC233的是来自于DRA221的scFv结合域(SEQ ID NO:10的氨基酸1-244，TSC234的是来自于DRA222的scFv结合域(SEQ ID NO:8的氨基酸1-244))。另外，比较了三种不同的异源二聚双特异性分子(TSC127、TSC227、TSC228)，它们具有三个不同的抗CD3结合域(TSC127的是Cris7，TSC227的是来自于DRA221的scFv结合域(SEQ ID NO:10的氨基酸1-244)，且TSC228的是来自于DRA222的scFv结合域(SEQ ID NO:8的氨基酸1-244))。
从ATCC(Manassas，VA)获得Daudi伯基特氏淋巴瘤细胞(CD19+)且根据所提供的方案进行培养。使用标准聚蔗糖梯度从人血液分离周围血液单核细胞(PBMC)。在生理盐水缓冲液中洗涤分离的细胞。另外使用得自于Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach，Germany)的淘选T细胞分离试剂盒II，使用制造商方案从这些PBMC中分离T细胞。
通过用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记分离的T细胞群体来评估增殖。将经CFSE标记的T细胞以100,000个T细胞/孔与33,000个肿瘤细胞/孔接种在U形底96孔板中，以实现T细胞对肿瘤细胞比率为大约3:1。将浓度在1nM到5fM范围内的测试分子加入到总共200uL/孔补充有10％人或牛血清、丙酮酸钠和非必需氨基酸的RPMI 1640培养基中的细胞混合物中。在湿润孵育器中在37℃、5％CO2下对板进行孵育。3天之后，用抗体标记细胞以便进行流式细胞术分析。标记细胞且在其原板中洗涤以便将转移期间的细胞损失最小化，且在含0.2％牛血清白蛋白的生理盐水缓冲液中进行所有标记。首先，在室温下将细胞与100ug/ml人IgG一起预孵育15分钟。随后，将细胞与经以下染料标记的抗体的混合物(总体积50ul)一起孵育：CD5-PE、CD4-APC、CD8-太平洋蓝、CD25-PE-Cy7，以及7-氨基放线菌素D(此后为7AAD)，持续40分钟。将板洗涤两次，再悬浮于80到120ul体积中且立即在BD LSRII流式细胞仪上运作以获取各孔的80％内含物。使用FlowJo软件分析样品文件以便根据其CFSE曲线通过按顺序闸选活化的活CD4+或CD8+T细胞(分别是7AAD-、CD5+CD25+CD4+或7AAD-CD5+CD25+CD8+)来计算进行了至少一次细胞分裂的细胞的百分比和数目。使用Microsoft Excel软件计算平均值和标准偏差。使用Microsoft Excel或Graphpad Prism绘制曲线图。
对来自于经完整T细胞处理的Daudi细胞的活CD4+和CD8+群体的分析显示，在展示靶CD19抗原的Daudi细胞存在下，细胞总数和增殖细胞百分比都显著增加(图21和22)。
对于同源二聚双特异性多肽(TSC129a、TSC233、TSC234)，在CD4+和CD8+细胞之间的增殖相当(图21)。TSC129a和TSC234诱导的增殖在CD4+和CD8+细胞之间相当(图21)，表明来自于DRA222的pI变体抗CD3scFv结合域与母体Cris7结合域具有实质上等效的活性。TSC233诱导的T细胞增殖曲线与TSC129a和TSC234稍微不同，其中诱导的CD4+增殖减少(图21A)而诱导的CD8+增殖稍微增加(图21B)。这表明来自于DRA221的pI变体抗CD3scFv结合域在活性方面与母体Cris7结合域不完全等效。
对于异源二聚双特异性多肽(TSC127、TSC227、TSC228)，在Daudi细胞存在下，CD8+T细胞的增殖高于CD4+T细胞(图22)。TSC127和TSC228诱导的增殖在CD4+和CD8+细胞之间相当(图22)，表明来自于DRA222的pI变体抗CD3scFv结合域与母体Cris7结合域具有实质上等效的活性。TSC227诱导的T细胞增殖曲线与TSC127和TSC228稍微不同，其中诱导的CD4+增殖减少而诱导的CD8+增殖相当。再次，这表明来自于DRA221的pI变体抗CD3scFv结合域在活性方面与母体Cris7结合域不完全等效。
实施例11：靶向CD19的多肽异源二聚体和同源二聚体所致的重 定向T细胞细胞毒性
为了比较不同的双特异性多肽异源二聚体分子在诱导靶依赖性T细胞细胞毒性方面的效力，比较了三种不同的同源二聚双特异性分子(TSC129a、TSC233和TSC234(分别是SEQ ID NO:245、196和198))，它们具有共同的抗CD19结合域(HD37)和三个不同的抗CD3结合域(TSC129a的是Cris7，TSC233的是来自于DRA221的scFv结合域(SEQ ID NO:10的氨基酸1-244，TSC234的是来自于DRA222的scFv结合域(SEQ ID NO:8的氨基酸1-244))。另外，比较了三种不同的异源二聚双特异性分子(TSC127、TSC227、TSC228)，它们具有三个不同的抗CD3结合域(TSC127的是Cris7，TSC227的是来自于DRA221的scFv结合域(SEQ ID NO:10的氨基酸1-244)，且TSC228的是来自于DRA222的scFv结合域(SEQ ID NO:8的氨基酸1-244))。
从ATCC(Manassas，VA)获得Daudi伯基特氏淋巴瘤细胞(CD19+)且根据所提供的方案进行培养。使用标准聚蔗糖梯度从人血液中分离周围血液单核细胞(PBMC)且在生理盐水缓冲液中洗涤。另外使用得自于Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach，Germany)的淘选T细胞分离试剂盒II，使用制造商方案从PBMC中分离T细胞。
通过51Cr释放测定评估细胞毒性。用0.3mCi 51Cr处理大约5×106个Daudi细胞，且在37℃下孵育75分钟。在75分钟之后，用培养基(RPMI+10％FBS)将细胞洗涤3次，且再悬浮于11.5mL培养基中。由这一悬浮液以每孔50μL分配到96孔U形底板中(大约20,000个细胞/孔)。将浓度在500pM到0.1pM范围内的双特异性分子加入Daudi细胞，使总体积达到100μL/孔。在室温下将靶细胞孵育15分钟。然后加入100μL分离的T细胞(大约200,000个)以使T细胞对靶细胞比率达到10:1。将50μL 0.8％NP-40加入含有靶细胞的对照孔，静置15分钟，然后加入100μL培养基以提供完全溶解对照。
将板孵育4小时，然后以1500rpm旋转3分钟，且从各孔转移25μL上清液到96孔Luma样品板的对应孔中。允许样品板在化学安全罩中风干18小时，然后在Topcount闪烁计数器上使用标准方案读取放射性。
对细胞毒性数据的分析示出了在T细胞和抗CD19定向双特异性分子存在下用Daudi细胞得到的T细胞定向细胞毒性(图23)。
对于同源二聚双特异性多肽(TSC129a、TSC233、TSC234)，TSC129a与TSC234之间的观测细胞毒性是相当的(图23A)，表明该DRA222pI变体与母体Cris7结合域具有等效活性。在TSC233存在下观测到细胞毒性稍微下降，表明该DRA221pI变体的活性低于母体Cris7结合域。
对于异源二聚双特异性多肽(TSC127、TSC227、TSC228)，TSC127与TSC228之间的观测细胞毒性是相当的(图23B)，表明该DRA222scFv结合域pI变体与母体Cris7结合域具有等效活性。在TSC227存在下观测到细胞毒性稍微下降，表明该DRA221scFv结合域pI变体的活性低于母体Cris7结合域。
实施例12：靶向RON的多肽同源二聚体所致的重定向T细胞细 胞毒性
为了比较不同的双特异性多肽异源二聚体分子在诱导靶依赖性T细胞细胞毒性方面的效力，比较了四种不同的同源二聚双特异性分子(TSC275、TSC277、TSC278和TSC279)，它们具有共同的抗CD3结合域(来自于DRA222的scFv结合域(SEQ ID NO:8的氨基酸1-244))和同一抗RON结合域的四个变体(TSC275的是hu4C04scFv，TSC277的是hu4C04scFv(A43K/Q240E)，TSC278的是hu4C04scFv(A43T)，且TSC279的是hu4C04scFv(Q165R))。
从ATCC(Manassas，VA)获得MDA-MB-453乳腺癌细胞(RON+)且根据ATCC所提供的方案进行培养。使用标准聚蔗糖梯度从人血液中分离周围血液单核细胞(PBMC)且在生理盐水缓冲液中洗涤。另外使用得自于Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach，Germany)的淘选T细胞分离试剂盒II，使用制造商方案从PBMC中分离T细胞。
通过51Cr释放测定评估细胞毒性。用0.3mCi 51Cr处理大约5×106个Daudi细胞，且在37℃下孵育75分钟。在75分钟之后，用培养基(RPMI+10％FBS)将细胞洗涤3次，且再悬浮于11.5mL培养基中。由这一悬浮液以每孔50μL分配到96孔U形底板中(大约20,000个细胞/孔)。将浓度在10nM到0.005fM范围内的双特异性分子加入Daudi细胞，使总体积达到100μL/孔。在室温下将靶细胞孵育15分钟。然后加入100μL分离的T细胞(大约100,000个)以使T细胞对靶细胞比率达到5:1。将50μL 0.8％NP-40加入含有靶细胞的对照孔，静置15分钟，然后加入100μL培养基以提供完全溶解对照。
将板孵育24小时，然后以1500rpm旋转3分钟，且从各孔转移25μL上清液到96孔Luma样品板的对应孔中。允许样品板在化学安全罩中风干18小时，然后在Topcount闪烁计数器上使用标准方案读取放射性。
对细胞毒性数据的分析示出了在T细胞和抗RON定向双特异性分子存在下用MDA-MB-453细胞得到的T细胞定向细胞毒性(图24)。
对于同源二聚双特异性多肽(TSC275、TSC277、TSC278和TSC279)，观测细胞毒性一般相当(图24)，表明ORN196结合域内的突变不显著影响总体活性。然而，针对TSC278观测到的最大溶解稍微低于其它三种变体(图24)。在10pM与10nM的浓度之间观测到了最大溶解。
实施例13：双特异性多肽异源二聚体和同源二聚体的T细胞结 合
为了比较以pI变体CD3结合域(DRA222中发现的scFv(SEQ IDNO:8的氨基酸1-244))为特征的双特异性多肽分子在结合T细胞方面的效力，在两个独立的实验中比较了抗CD19×抗CD3双特异性多肽异源二聚体TSC228(如实施例8，表8中所描述)的细胞上结合特征与抗PSMA×抗CD3双特异性多肽同源二聚体TSC249(如实施例5，表5中所描述)的细胞上结合特征。
从ATCC(Manassas，VA)获得Jurkat(CD3+)T细胞白血病细胞且根据ATCC提供的方案进行培养。通过在4℃下将5×105个Jurkat细胞与连续稀释的双特异性分子TSC228或TSC249一起以250nM到0.125nM(TSC249)或125nM到1pM(TSC228)的浓度孵育30分钟来评估结合。将细胞洗涤三次，然后与山羊抗人IgG-FITC(1:200稀释度)一起在4℃下再孵育30分钟。然后将细胞再洗涤三次，在1％聚甲醛中固定且在FACS-Calibur仪器上读数。
在FlowJo v7.5(Tree Star,Inc.，Ashland，OR)中对高FSC、高SSC子集进行的分析显示了双特异性分子TSC228和TSC249与Jurkat细胞的剂量依赖性结合(分别是图25A和B)。仅拥有一个抗CD3结合域的TSC228双特异性多肽异源二聚体在结合时的表观亲和力(EC50＝24.5nM)低于拥有两个抗CD3结合域的TSC249双特异性多肽同源二聚体(EC50＝1.9nM)。这表明TSC249双特异性多肽异源二聚体具有一定的结合亲合力。
实施例14：靶向PSMA的双特异性多肽同源二聚体所致的靶依 赖性T细胞增殖
为了测定不同的双特异性多肽异源二聚体分子在诱导靶依赖性T细胞活化和增殖方面的效力，在不存在靶细胞的情况下，在表达PSMA的前列腺癌细胞系、不表达PSMA的前列腺癌细胞系和T细胞上测试具有抗PSMA结合域(hu107-1A4)和抗CD3结合域(来自于DRA222的scFv(SEQ ID NO:8的氨基酸1-244))的同源二聚双特异性分子(TSC249，参见实施例5，表5)。
从马里兰安德森癌症中心(Houston，TX)获得C4-2B前列腺癌细胞(PSMA+)且根据所提供的方案进行培养。从ATCC(Manassas，VA)获得DU-145前列腺癌细胞(PSMA-)且根据所提供的方案进行培养。使用标准聚蔗糖梯度从人血液中分离周围血液单核细胞(PBMC)且进一步在生理盐水缓冲液中洗涤。然后使用得自于Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach，Germany)的淘选T细胞分离试剂盒II，使用制造商方案从这些PBMC中分离T细胞。
通过用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记分离的T细胞群体来评估增殖。同时建立三个单独的实验。将经CFSE标记的T细胞仅与TSC249分子混合；将经CFSE标记的T细胞与DU-145细胞和TSC249分子混合；和将经CFSE标记的T细胞与C4-2B细胞和TSC249分子混合。将经CFSE标记的T细胞以100,000个细胞/孔与33,000个肿瘤细胞/孔接种在U形底96孔板中，以实现T细胞对肿瘤细胞比率大约为3:1。将浓度在20nM到5fM范围内的测试分子加入到总共200uL/孔的补充有10％人或牛血清、丙酮酸钠和非必需氨基酸的RPMI 1640培养基中的细胞混合物中。在湿润孵育器中在37℃、5％CO2下对板进行孵育。3天之后，用抗体标记细胞以便进行流式细胞术分析。标记细胞且在其原板中洗涤以便将转移期间的细胞损失最小化，且在含0.2％牛血清白蛋白的生理盐水缓冲液中进行所有标记。首先，在室温下将细胞与100ug/ml人IgG一起预孵育15分钟。随后，将细胞与经以下染料标记的抗体的混合物(总体积50ul)一起孵育：CD5-PE、CD4-APC、CD8-太平洋蓝、CD25-PE-Cy7，以及7-氨基放线菌素D(此后为7AAD)，持续40分钟。将板洗涤两次，再悬浮于80到120ul体积中且立即在BD LSRII流式细胞仪上运作以获取各孔的80％内含物。使用FlowJo软件分析样品文件以便根据其CFSE曲线通过按顺序闸选活化的活CD4+或CD8+T细胞(分别是7AAD-、CD5+CD25+CD4+或7AAD-CD5+CD25+CD8+)来计算进行了至少一次细胞分裂的细胞的百分比和数目。使用Microsoft Excel软件计算平均值和标准偏差。使用Microsoft Excel或Graphpad Prism绘制曲线图。
对来自于经完整T细胞处理的C4-2B细胞的活CD4+和CD8+群体的分析显示，在用TSC249处理后表达靶PSMA抗原的C4-2B细胞存在下，细胞总数显著增加(图26A)。在用TSC249处理之后不表达靶PSMA抗原的DU-145细胞存在下未见到这种增加(图26B)。最后，当用TSC249处理分离的T细胞时也未见到这种增加(图26C)。这证实了TSC249在表达靶抗原的肿瘤细胞存在下诱导的T细胞增殖的靶依赖性。
实施例15：体内测试CD3和PSMA的双特异性靶向
为了证实抗CD3和抗PSMA双特异性分子在体内抑制肿瘤生长方面的效力，可以使用以下任何一者或多者来评估PSMA定向分子。
对皮下肿瘤的肿瘤移植的预防性处理或预防：将所培养的表达PSMA的肿瘤细胞系(诸如LNCaP、LNCaP C4-2、LNCaP C4-2B、VCaP、CWR22Rv1、LAPC4、MDA-PCa-2b、LuCaP 23.1、LuCaP 58、LuCaP 70、LuCaP 77)与人淋巴细胞(人周围血液单核细胞或纯化的T细胞)混合，且经皮下注射到免疫缺陷小鼠(诸如SCID、NOD/SCID等)中。在注射当天和随后的若干天经静脉内注射抗PSMA双特异性分子。如通过肿瘤体积所评估，对肿瘤长出的剂量依赖性抑制指示对应的分子对体内表达PSMA的肿瘤具有功效。
对先前确定的皮下肿瘤的治疗性治疗或消退：将所培养的表达PSMA的肿瘤细胞系(诸如LNCaP、LNCaP C4-2、LNCaP C4-2B、VCaP、CWR22Rv1、LAPC4、MDA-PCa-2b、LuCaP 23.1AI、LuCaP 58、LuCaP 70、LuCaP 77)经皮下注射到免疫缺陷小鼠(诸如SCID、NOD/SCID等)中。监测肿瘤生长，且当肿瘤显示明确生长(典型地，体积为约200mm3)的迹象时开始研究。在注射当天，经静脉内注射人淋巴细胞(人周围血液单核细胞或纯化的T细胞)以及抗PSMA双特异性分子。随后的若干天注射抗PSMA双特异性分子。如通过肿瘤体积所评估，对肿瘤生长的剂量依赖性抑制指示对应的分子对体内表达PSMA的肿瘤具有功效。
对胫骨内肿瘤的肿瘤移植的预防性治疗或预防：将所培养的表达PSMA的肿瘤细胞系(诸如LNCaP C4-2、LNCaP C4-2B、VCaP、CWR22Rv1、LAPC4、MDA-PCa-2b、LuCaP 23.1、LuCaP 58、LuCaP70、LuCaP 77)与人淋巴细胞(人周围血液单核细胞或纯化的T细胞)混合，且经胫骨内注入免疫缺陷小鼠(诸如SCID、NOD/SCID等)中。在注射当天和随后的若干天经静脉内注射抗PSMA双特异性分子。如通过血清生物标记物、射线照相术、荧光成像、体重损失和肿瘤体积的其它委托测量值所评估，对肿瘤生长的剂量依赖性抑制指示对应的分子对体内表达PSMA的肿瘤具有功效。
对先前确定的胫骨内肿瘤的治疗性治疗或消退：将所培养的表达PSMA的肿瘤细胞系(诸如LNCaP C4-2、LNCaP C4-2B、VCaP、CWR22Rv1、LAPC4、MDA-PCa-2b、LuCaP 23.1AI、LuCaP 58、LuCaP70、和LuCaP 77)经胫骨内注射到免疫缺陷小鼠(诸如SCID、NOD/SCID等)中。监测肿瘤生长，且当肿瘤显示明确生长(典型地，体积为约200mm3)的迹象时开始研究。在注射当天，经静脉内注射人淋巴细胞(人周围血液单核细胞或纯化的T细胞)以及抗PSMA双特异性分子。随后的若干天注射抗PSMA双特异性分子。如通过血清生物标记物、射线照相术、荧光成像、体重损失和肿瘤体积的其它委托测量值所评估，对肿瘤生长的剂量依赖性抑制指示对应的分子对体内表达PSMA的肿瘤具有功效。
实施例16：靶向PSMA的多肽异源二聚体和同源二聚体所致的 重定向T细胞细胞毒性
为了比较不同的双特异性多肽异源二聚体分子在诱导靶依赖性T细胞细胞毒性方面的效力，比较了两种不同的同源二聚双特异性分子(TSC194、TSC249)，它们具有共同的抗PSMA结合域(hu107-1A4)和两个不同的抗CD3结合域(TSC194的是Cris7scFV，TSC249的是来自于DRA222的scFv)。TSC194是同源二聚双特异性的(huVL-VH#2107-1A4scFv-Fc-Cris7scFv)(SEQ ID NO:250和251)。
从马里兰安德森获得C4-2B细胞(PSMA+)且根据公开的培养条件在RPMI-1640培养基(Life Technologies，Carlsbad，CA)加10％FBS中进行培养。使用标准聚蔗糖梯度从人血液中分离周围血液单核细胞(PBMC)且在生理盐水缓冲液中洗涤。另外使用得自于Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach，Germany)的淘选T细胞分离试剂盒II，使用制造商方案从PBMC中分离T细胞。
通过51Cr释放测定评估细胞毒性。用0.3mCi 51Cr处理大约5×106个C4-2细胞，且在37℃下孵育75分钟。在75分钟之后，用培养基(RPMI+10％FBS)将细胞洗涤3次，且再悬浮于11.5mL培养基中。由这一悬浮液以每孔50μL分配到96孔U形底板中(大约20,000个细胞/孔)。将浓度在500pM到0.2pM范围内的双特异性分子加入C4-2细胞，使总体积达到100μL/孔。在室温下将靶细胞孵育15分钟。然后加入100μL分离的T细胞(大约200,000个)以使T细胞对靶细胞比率达到10:1。将50μL 0.8％NP-40加入含有靶细胞的对照孔，静置15分钟，然后加入100μL培养基以提供完全溶解对照。
将板孵育4小时，然后以1500rpm旋转3分钟，且从各孔转移25μL上清液到96孔Luma样品板的对应孔中。允许样品板在化学安全罩中风干18小时，然后再Topcount闪烁计数器上使用标准方案读取放射性。
对细胞毒性数据的分析示出了在T细胞和抗PSMA定向双特异性分子存在下用C4-2细胞得到的T细胞定向细胞毒性(图27)。对于同源二聚双特异性多肽(TSC194、TSC249)，TSC194与TSC249之间的观测细胞毒性是相当的(表10)，表明该DRA222抗CD3scFv结合域pI变体与母体Cris7结合域具有等效活性。
表10：观测到的细胞毒性
RTCC的EC50
TSC194 2.8±0.6pM
TSC249 2.9±1.0pM

Claims (67)

1.一种CD3结合多肽，其包含与具有氨基酸序列SEQ ID NO:41的结合域相比具有降低的等电点的CD3结合域。
2.如权利要求1所述的CD3结合多肽，其中所述结合域包含VH区和VL区，且其中所述VH区和所述VL区包含构架区。
3.如权利要求2所述的CD3结合多肽，其中可以通过用中性氨基酸取代带正电的氨基酸和/或用带负电的氨基酸取代中性氨基酸在VH和/或VL的构架区中对两个或更多个氨基酸进行修饰。
4.如权利要求3所述的CD3结合多肽，其中所述构架区的经修饰氨基酸被经对应的人生殖细胞系IgG序列内所含的氨基酸取代。
5.如权利要求4所述的CD3结合多肽，其中所述人生殖细胞系IgG序列包括SEQ ID NO:43
6.如权利要求4所述的CD3结合多肽，其中所述人生殖细胞系IgG序列包括SEQ ID NO:44
7.如权利要求1到3所述的CD3结合多肽，还包括前铰链区。
8.如权利要求7所述的CD3结合多肽，其中所述前铰链区与具有RRT前铰链区的CD3结合多肽相比具有降低的等电点。
9.一种CD3结合多肽，其包含具有构架区、前铰链区和铰链区的CD3结合域，
其中所述CD3结合多肽与SEQ ID NO:42相比具有三个或更多个经修饰的氨基酸，所述修饰是在所述构架区和/或前铰链区中用中性氨基酸取代带正电的氨基酸和/或用带负电的氨基酸取代中性氨基酸。
10.如权利要求9所述的CD3结合多肽，其中可以通过用中性氨基酸取代带正电的氨基酸和/或用带负电的氨基酸取代中性氨基酸而在VH和/或VL的构架区中对至少两个或更多个氨基酸进行修饰。
11.如权利要求3和9所述的CD3结合多肽，其中可以通过用中性氨基酸取代带正电的氨基酸和/或用带负电的氨基酸取代中性氨基酸而在VH和/或VL的构架区中对至少四个或更多个氨基酸进行修饰。
12.如权利要求3和9所述的CD3结合多肽，其中可以通过用中性氨基酸取代带正电的氨基酸和/或用带负电的氨基酸取代中性氨基酸而在VH和/或VL的构架区中对三到五个氨基酸进行修饰。
13.如权利要求3和9所述的CD3结合多肽，其中可以通过用中性氨基酸取代带正电的氨基酸和/或用带负电的氨基酸取代中性氨基酸而在VH和/或VL的构架区中对三到十个氨基酸进行修饰。
14.如权利要求8到9所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽前铰链区包含氨基酸序列SSS或SST。
15.如权利要求1到8所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽还包括铰链区和恒定区。
16.如权利要求1到15所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽具有比多肽SEQ ID NO:4小至少1个pI单位的经验等电点。
17.如权利要求1所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽是人源化抗体、单链Fv(scFv)或SMIP。
18.如权利要求15所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽从氨基末端到羧基末端包含CD3结合域、铰链区和恒定区。
19.如权利要求15所述的CD3结合多肽，其中所述结合多肽从氨基末端到羧基末端包含恒定区、铰链区和CD3结合域。
20.如权利要求15所述的CD3结合多肽，其中所述结合多肽还包含第二结合域。
21.如权利要求20所述的CD3结合多肽，其中所述结合多肽从氨基末端到羧基末端包含CD3结合域、铰链区、恒定区和第二结合域。
22.如权利要求20所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽从氨基末端到羧基末端包含第二结合域、铰链区、恒定区和CD3结合域。
23.如权利要求15所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽还包含异源二聚域。
24.如权利要求23所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽从氨基末端到羧基末端包含CD3结合域、铰链区、恒定区和异源二聚域。
25.如权利要求1到24所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽还包含第二结合域。
26.如权利要求25所述的CD3结合多肽，其中所述第二结合域结合靶分子或与其相互作用，且所述CD3结合多肽诱导T细胞细胞毒性。
27.如权利要求26所述的CD3结合多肽，其中所述第二结合域结合肿瘤相关抗原或与其相互作用。
28.如权利要求27所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽诱导T细胞溶解肿瘤细胞。
29.如权利要求27所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽在肿瘤附近诱导多克隆T细胞活化和扩增。
30.如权利要求27到29所述的CD3结合多肽，其中所述肿瘤相关抗原选自RON、c-Met、CEACAM-6、PSMA、EpCAM、CEA、PCTA-1、STEAP-1、STEAP-2、PSCA、PSA、PAP、ALCAM(CD166)、PECAM-1、EphA2、CD151、CA-125/MUC16、MUC-1、MAGE-1、TROP2、IGF1R、TGFBR2、GHRHR、GHR、IL-6R、gp130、TNFR2、OSMRβ、Patched-1、Frizzled、Robo1、LTβR、CD25、CD26、CD27、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD63、CD80、CD81、CD86、CD100、CD151、CXCR4、CCR5、HER-2/ErbB1、HER-3/ErbB3、HER-4/ErbB4、EGFR/ErbB1、EGFRvIII同种型、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5b、MUC7、βhCG、Lewis-Y、神经节苷脂GD3、9-O-乙酰基-GD3、GM2、Globo H、岩藻糖酰GM1、Poly SA、GD2、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、音猬因子(Shh)、Wue-1、浆细胞抗原、(膜结合)IgE、黑色素瘤硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、CCR8、TNF-α前体、间皮素、A33抗原、Ly-6；桥粒核心糖蛋白4、E-钙粘附蛋白新表位、胎儿乙酰胆碱受体、CA19-9标记物、苗勒氏抑制物质(MIS)受体II型、sTn(唾液酸化Tn抗原；TAG-72)、FAP(成纤维细胞活化抗原)、内皮唾液酸蛋白、LG、SAS、BCMA、TWEAKR/Fn14、FGFR4、VEGFR1、VEGFR2、SSX1和SSX2。
31.如权利要求1到30所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合域结合T细胞上的T细胞受体复合物的CD3ε亚单位或与其相互作用。
32.如权利要求1到31所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽诱导T细胞受体复合物内在化。
33.如权利要求1到32所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合域是来源于鼠类Cris-7单克隆抗体或HuM291的人源化CD3结合域。
34.如权利要求33所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合域包含鼠类Cris-7抗体或HuM291的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。
35.如权利要求1所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合域包含选自SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:38和SEQ ID NO:40的VH区序列或VL区序列。
36.如权利要求1所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合域包含选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO32的VH区和选自SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:40的VL区。
37.如权利要求1所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合域包含选自SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的VH区和选自SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38和SEQ IDNO:40的VL区。
38.如权利要求2所述的CD3结合多肽，其中所述VH区包含SEQ ID NO:28且所述VL区包含SEQ ID NO:34。
39.如权利要求2所述的CD3结合多肽，其中所述VH区包含SEQ ID NO:28且所述VL区包含SEQ ID NO:38。
40.如权利要求2所述的CD3结合多肽，其中所述VH区包含SEQ ID NO:26且所述VL区包含SEQ ID NO:38。
41.如权利要求9和14所述的CD3结合多肽，其中所述VH区包含SEQ ID NO:26且所述VL区包含SEQ ID NO:34。
42.如权利要求1所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽包含选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18和SEQ IDNO20的氨基酸序列。
43.如权利要求1所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合域包含重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，且其中所述重链CDR3包含SEQ ID NO:51。
44.如权利要求43所述的CD3结合多肽，其中重链CDR1包含SEQ ID NO:49，CDR2包含SEQ ID NO:50且CDR3包含SEQ IDNO:51，并且轻链CDR1包含SEQ ID NO:52，CDR2包含SEQ IDNO:53，且CDR3包含SEQ ID NO:54。
45.如权利要求15所述的CD3结合多肽，其中恒定区包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD或其任何组合的CH2和CH3域；IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM或其任何组合的免疫球蛋白CH3域；或IgE、IgM或其组合的免疫球蛋白CH3和CH4域。
46.如权利要求15所述的CD3结合多肽，其中所述恒定区包含CH2和CH3。
47.如权利要求15所述的CD3结合多肽，其中所述恒定区实质上由CH2域和CH3域组成。
48.如权利要求45到47所述的CD3结合多肽，其中所述恒定区经修饰以减少或消除效应因子功能。
49.如权利要求45到47所述的CD3结合多肽，其中所述恒定区经修饰以便不固定补体。
50.如权利要求45到47所述的CD3结合多肽，其中所述恒定区经修饰以便不结合Fcγ受体。
51.如权利要求50所述的CD3结合多肽，其中所述Fcγ受体选自CD16、CD32和CD64。
52.如权利要求15所述的CD3结合多肽，其中所述恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO:55。
53.一种核酸，其编码任一种如权利要求1到52所述的多肽。
54.一种分离的核酸，包括选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:37的核酸。
55.一种表达载体，包含如权利要求53或54所述的核酸。
56.一种重组宿主细胞，包含如权利要求32所述的表达载体。
57.一种组合物，包含如权利要求1到52中任一项所述的CD3结合多肽和药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
58.一种用于治疗癌症或自体免疫病症的方法，包括向有需要的患者施用治疗有效量的如权利要求57所述的组合物或如权利要求1到52所述的CD3结合多肽。
59.如权利要求1到52所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽形成二聚体。
60.如权利要求59所述的CD3结合多肽，其中所述二聚体是同源二聚体或异源二聚体。
61.如权利要求3所述的CD3结合多肽，其中与Cris-7VL Jκ(Jk)区小鼠序列LQIT(SEQ ID NO:252)相比，至少一个氨基酸修饰是在VL区的Jk区中。
62.如权利要求61所述的CD3结合多肽，其中所述Jk区包含氨基酸序列VEIK(SEQ ID NO:253)。
63.如权利要求25所述的CD3结合多肽，其中所述第二结合域包含与选自以下的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:212的氨基酸1-107和124-243；SEQ IDNO:226的氨基酸1-107和124-243；SEQ ID NO:216的氨基酸1-107和124-243；和SEQ ID NO:196的1-111和128-251。
64.如权利要求1所述的CD3结合多肽，其中所述结合多肽包含与SEQ ID NO:57、59、61、63、65、67、69、71、186、190、192、194、196、198、200、202、204或206具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
65.如权利要求1所述的CD3结合多肽，其中所述多肽是异源二聚体的一部分。
66.如权利要求65所述的CD3结合多肽，其中所述异源二聚体包含一对单链多肽，其中所述单链对包含与选自以下的配对具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:210和247、SEQ ID NO:210和218、SEQ ID NO:210和220、SEQ ID NO:208和249、SEQ ID NO:208和222、或SEQ ID NO:208和224、SEQ ID NO:212和218、SEQ ID NO:216和222、SEQ ID NO:228和226，或SEQ IDNO:214和218。
67.如权利要求1所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合域与SEQ ID NO:41具有约90％到约99％同一性。
CN201380027109.8A 2012-04-20 2013-04-18 Cd3结合多肽 Pending CN104487587A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261636557P 2012-04-20 2012-04-20
US61/636,557 2012-04-20
US201261718635P 2012-10-25 2012-10-25
US61/718,635 2012-10-25
US201361799849P 2013-03-15 2013-03-15
US61/799,849 2013-03-15
PCT/US2013/037135 WO2013158856A2 (en) 2012-04-20 2013-04-18 Cd3 binding polypeptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104487587A true CN104487587A (zh) 2015-04-01

Family

ID=49384230

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380027109.8A Pending CN104487587A (zh) 2012-04-20 2013-04-18 Cd3结合多肽

Country Status (16)

Country Link
US (1) US10202452B2 (zh)
EP (1) EP2839019A4 (zh)
JP (2) JP6509724B2 (zh)
KR (1) KR20150004856A (zh)
CN (1) CN104487587A (zh)
AU (2) AU2013249267A1 (zh)
BR (1) BR112014025830A8 (zh)
CA (1) CA2870545A1 (zh)
HK (2) HK1207398A1 (zh)
IL (1) IL235093B (zh)
IN (1) IN2014MN02293A (zh)
MX (1) MX366813B (zh)
RU (1) RU2673153C2 (zh)
SG (2) SG11201406346SA (zh)
UA (1) UA119227C2 (zh)
WO (1) WO2013158856A2 (zh)

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104892765A (zh) * 2015-06-29 2015-09-09 长春力太生物技术有限公司 一种抗CD3抗原和Her-2抗原的双特异性抗体
CN106084048A (zh) * 2016-06-17 2016-11-09 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106084046A (zh) * 2016-06-17 2016-11-09 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106084049A (zh) * 2016-06-17 2016-11-09 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106084047A (zh) * 2016-06-17 2016-11-09 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106117359A (zh) * 2016-06-17 2016-11-16 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106117361A (zh) * 2016-06-17 2016-11-16 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106117360A (zh) * 2016-06-17 2016-11-16 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106117358A (zh) * 2016-06-16 2016-11-16 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106146661A (zh) * 2016-06-17 2016-11-23 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106146662A (zh) * 2016-07-18 2016-11-23 中山大学 抗cd3单域抗体
WO2017193956A1 (zh) * 2016-05-12 2017-11-16 李华顺 一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用
CN108026179A (zh) * 2015-10-02 2018-05-11 豪夫迈·罗氏有限公司 结合间皮素和cd3的双特异性t细胞活化性抗原结合分子
CN108137700A (zh) * 2015-07-31 2018-06-08 瑞泽恩制药公司 抗psma抗体、结合psma及cd3的双特异性抗原结合分子及其用途
CN108367004A (zh) * 2015-09-21 2018-08-03 阿帕特夫研究和发展有限公司 Cd3结合多肽
CN112533950A (zh) * 2018-06-29 2021-03-19 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 抗CD3e抗体及其用途
CN112955471A (zh) * 2018-12-07 2021-06-11 江苏恒瑞医药股份有限公司 Cd3抗体及其药物用途
CN113005088A (zh) * 2019-12-19 2021-06-22 苏州方德门达新药开发有限公司 工程改造的t细胞、其制备及应用
US11339225B2 (en) 2016-05-12 2022-05-24 Asclepius (Suzhou) Technology Company Group, Co., Ltd. Bispecific antigen-binding construct and preparation method and use thereof
CN115029318A (zh) * 2022-05-12 2022-09-09 广州明征生物科技有限公司 携带多特异性抗体基因的间充质干细胞及其制药用途

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2603408C (en) 2005-03-31 2018-08-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
ES2892925T3 (es) 2006-03-31 2022-02-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Métodos para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
CN109160951A (zh) 2010-11-30 2019-01-08 中外制药株式会社 细胞毒诱导治疗剂
AU2012245260B2 (en) 2011-04-22 2016-09-08 Aptevo Research And Development Llc Prostate-specific membrane antigen binding proteins and related compositions and methods
CN104487587A (zh) 2012-04-20 2015-04-01 新兴产品开发西雅图有限公司 Cd3结合多肽
JP6534615B2 (ja) 2013-09-27 2019-06-26 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
RU2016134256A (ru) 2014-01-24 2018-03-05 Дзе Генри М. Джексон Фаундейшн Фор Дзе Эдвансмент Оф Милитари Медсин, Инк. Антитела против f гликопротеина вирусов хендра и нипах
SG11201609707WA (en) 2014-07-01 2017-01-27 Pfizer Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof
BR112017001579A2 (pt) 2014-07-25 2017-11-21 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd3, anticorpos anti-cd3 ativáveis, anticorpos anti-cd3 multiespecíficos, anticorpos anti-cd3 ativáveis multiespecíficos e métodos de uso dos mesmos
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
MA40764A (fr) * 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
NZ734803A (en) 2015-01-23 2023-03-31 Sanofi Sa Anti-cd3 antibodies, anti-cd123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to cd3 and/or cd123
WO2016159213A1 (ja) 2015-04-01 2016-10-06 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
AU2016248946B2 (en) 2015-04-13 2022-03-10 Pfizer Inc. Therapeutic antibodies and their uses
SG11201707089WA (en) 2015-04-13 2017-10-30 Pfizer Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
WO2016178996A1 (en) * 2015-05-01 2016-11-10 The Regents Of The University Of California Glycan-dependent immunotherapeutic molecules
CN111234027A (zh) 2015-05-21 2020-06-05 哈普恩治疗公司 三特异性结合蛋白质及使用方法
IL257696B1 (en) 2015-12-09 2024-07-01 Hoffmann La Roche Antibody against CD20 type II to reduce the formation of antibodies against drugs
SG11201807936VA (en) 2016-03-14 2018-10-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
EA201892693A1 (ru) 2016-05-20 2019-04-30 Харпун Терапьютикс, Инк. Белки, содержащие одноцепочечный вариабельный фрагмент, связывающийся с cd3
JP7101621B2 (ja) 2016-05-20 2022-07-15 ハープーン セラピューティクス，インク． 単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質
TW201902512A (zh) 2016-06-02 2019-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 治療方法
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
MX2018016364A (es) 2016-06-20 2019-11-28 Kymab Ltd Anticuerpos anti-pd-l1.
CA3029209A1 (en) 2016-06-21 2017-12-28 Teneobio, Inc. Cd3 binding antibodies
CN109843325B (zh) * 2016-09-14 2023-10-03 特尼奥生物股份有限公司 Cd3结合抗体
US11242400B2 (en) * 2016-09-21 2022-02-08 Aptevo Research And Development Llc CD123 binding proteins and related compositions and methods
JP6812551B2 (ja) 2016-11-23 2021-01-13 ハープーン セラピューティクス，インク． 前立腺特異的膜抗原結合タンパク質
CA3044729A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Harpoon Therapeutics, Inc. Psma targeting trispecific proteins and methods of use
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
MX2019009967A (es) 2017-02-24 2019-12-02 Macrogenics Inc Moleculas de union biespecificas que son capaces de unirse a cd137 y a antigenos tumorales, y usos de las mismas.
WO2018160754A2 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
US20200055948A1 (en) 2017-04-28 2020-02-20 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2018201051A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
IL300964A (en) 2017-05-12 2023-04-01 Harpoon Therapeutics Inc mesothelin binding proteins
KR20200026810A (ko) 2017-05-12 2020-03-11 하푼 테라퓨틱스, 인크. Msln 표적화 삼중 특이적 단백질 및 사용 방법
EP3409322A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment method
CA3065951A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Teneoone, Inc. Anti-bcma heavy chain-only antibodies
WO2018237037A2 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Teneobio, Inc. HEAVY CHAIN ANTIBODY ONLY ANTI-BCMA
CA3068056A1 (en) * 2017-06-22 2018-12-27 Development Center For Biotechnology Asymmetric heterodimeric fc-scfv fusion anti-globo h and anti-cd3 bispecifc antibody and uses thereof in cancer therapy
WO2019045856A1 (en) * 2017-08-28 2019-03-07 Systimmune, Inc. ANTI-CD ANTIBODIES AND METHODS OF MAKING AND USING THEM
PE20201183A1 (es) 2017-10-13 2020-11-03 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas trispecificas y metodos de uso
EA202090739A1 (ru) 2017-10-13 2020-09-07 Харпун Терапьютикс, Инк. Белки, связывающие антиген созревания в-клеток
CA3079407A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
CA3088095A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, cd19-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapies
JP2021509009A (ja) 2017-11-30 2021-03-18 ノバルティス アーゲー Ｂｃｍａターゲティングキメラ抗原受容体及びその使用
AU2018392088A1 (en) 2017-12-22 2020-08-13 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to CD22
US20200368268A1 (en) 2018-01-08 2020-11-26 Novartis Ag Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
US20210038659A1 (en) 2018-01-31 2021-02-11 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
EP3752203A1 (en) 2018-02-13 2020-12-23 Novartis AG Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
BR112020016485A2 (pt) 2018-02-15 2020-12-15 Macrogenics, Inc. Molécula de ligação, composição farmacêutica e método para o tratamento de uma doença
BR112020026724A2 (pt) 2018-07-02 2021-03-30 Amgen Inc. Proteína de ligação ao antígeno anti-steap1
CA3109959A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3844265A2 (en) 2018-08-31 2021-07-07 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
AU2019345052A1 (en) * 2018-09-19 2021-03-18 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Protein L for activation and expansion of chimeric antigen receptor-modified immune cells
BR112021005769A2 (pt) 2018-09-25 2021-07-06 Harpoon Therapeutics Inc proteínas de ligação a dll3 e métodos de uso
CA3131036A1 (en) * 2019-02-22 2020-08-27 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Cd3 antigen-binding fragment and application thereof
WO2020176397A1 (en) 2019-02-25 2020-09-03 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
US20230074800A1 (en) 2019-03-21 2023-03-09 Novartis Ag Car-t cell therapies with enhanced efficacy
EP3953455A1 (en) 2019-04-12 2022-02-16 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2020219742A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
UY38748A (es) 2019-06-14 2021-01-29 Teneobio Inc Anticuerpos multiespecíficos de cadena pesada que se unen a cd22 y cd3
BR112022010206A2 (pt) 2019-11-26 2022-11-29 Novartis Ag Receptores de antígeno quiméricos e usos dos mesmos
AU2021207632A1 (en) 2020-01-13 2022-07-07 Aptevo Research And Development Llc Methods and compositions for preventing adsorption of therapeutic proteins to drug delivery system components
BR112022013725A2 (pt) 2020-01-13 2022-10-11 Aptevo Res & Development Llc Formulações para agentes terapêuticos proteicos
IL295448A (en) 2020-02-21 2022-10-01 Harpoon Therapeutics Inc flt3 binding proteins and methods of use
EP4110376A2 (en) 2020-02-27 2023-01-04 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
JP2023515211A (ja) 2020-02-27 2023-04-12 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法
BR112022022800A2 (pt) 2020-05-11 2022-12-13 Janssen Biotech Inc Métodos para tratamento de mieloma múltiplo
EP4165169A1 (en) 2020-06-11 2023-04-19 Novartis AG Zbtb32 inhibitors and uses thereof
EP4199960A2 (en) 2020-08-21 2023-06-28 Novartis AG Compositions and methods for in vivo generation of car expressing cells
MX2023004054A (es) * 2020-10-07 2023-06-29 Dren Bio Inc Anticuerpos anti-dectina 1 y metodos de uso de los mismos.
JP2023550148A (ja) 2020-11-20 2023-11-30 シンシア・イノベーション・インコーポレイテッド がん免疫治療に用いられる武装二重ｃａｒ－ｔ組成物及び方法
AU2022267891A1 (en) 2021-04-27 2023-11-09 Novartis Ag Viral vector production system
US20240209116A1 (en) * 2021-04-28 2024-06-27 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Multimerization of binding molecules having an antibody constant region variant
MX2023012699A (es) 2021-04-30 2023-11-21 Hoffmann La Roche Dosificacion para el tratamiento con anticuerpo biespecifico anti-cd20/anti-cd3.
CN117321078A (zh) 2021-04-30 2023-12-29 豪夫迈·罗氏有限公司 针对用抗cd20/抗cd3双特异性抗体和抗cd79b抗体药物缀合物进行组合治疗的给药
US20240254241A1 (en) * 2021-05-11 2024-08-01 Janux Therapeutics, Inc. Antibodies targeting egfr and cd3 and uses thereof
KR20240024819A (ko) 2021-05-21 2024-02-26 압테보 리서치 앤드 디벨롭먼트 엘엘씨 단백질 치료제의 투약 요법
AR126838A1 (es) 2021-08-20 2023-11-22 Novartis Ag Métodos para preparar células que expresan receptores de antígeno quiméricos
AU2023238766A1 (en) 2022-03-23 2024-07-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
TW202404637A (zh) 2022-04-13 2024-02-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體之醫藥組成物及使用方法
WO2024088987A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for the treatment of cancer
WO2024089639A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Novartis Ag Lentiviral formulations

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002040545A2 (en) * 2000-11-17 2002-05-23 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Reduction of the nonspecific animal toxicity of immunotoxins by mutating the framework regions of the fv to lower the isoelectric point
WO2011090762A1 (en) * 2009-12-29 2011-07-28 Emergent Product Development Seattle, Llc Heterodimer binding proteins and uses thereof
CN102292352A (zh) * 2008-10-10 2011-12-21 新兴产品开发西雅图有限公司 Tcr复合物免疫治疗剂

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US20030108548A1 (en) 1993-06-01 2003-06-12 Bluestone Jeffrey A. Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
PT1489097E (pt) 1994-01-11 2012-01-04 Dyax Corp Inibidores de plasmina humana derivados de domínios kunitz e ácidos nucleicos codificando os mesmos
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
DE69731836T2 (de) 1996-07-23 2005-12-01 Pangenetics B.V. Induzierung von t zell toleranz unter verwendung eines löslichen moleküls, dass gleichzeitig zwei kostimulierungswege blockieren kann
WO1999037791A1 (en) 1998-01-23 1999-07-29 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Multipurpose antibody derivatives
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
RU2179862C1 (ru) 2000-12-26 2002-02-27 Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственный центр "МедБиоСпектр" Лекарственное средство для предотвращения отторжения трансплантата, моноклональное антитело к cd3-антигену т-лимфоцитов человека, гибридома и способ лечения больных, имеющих реакцию острого отторжения трансплантата после пересадки почки
IL156955A0 (en) 2001-01-17 2004-02-08 Genecraft Inc Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US20040058445A1 (en) 2001-04-26 2004-03-25 Ledbetter Jeffrey Alan Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB
US20040044182A1 (en) 2001-09-17 2004-03-04 Hunt Joan S Expression, preparation,uses, and sequence of recombinantly-derived soluble hla-g
EP2364996B1 (en) 2002-09-27 2016-11-09 Xencor Inc. Optimized FC variants and methods for their generation
US7635472B2 (en) 2003-05-31 2009-12-22 Micromet Ag Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd3, anti-cd19 antibody constructs for the treatment of b-cell related disorders
US7754209B2 (en) 2003-07-26 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals Binding constructs and methods for use thereof
WO2005077982A1 (en) 2004-02-16 2005-08-25 Micromet Ag Less immunogenic binding molecules
GB0504767D0 (en) 2005-03-08 2005-04-13 Ares Trading Sa Lipocalin protein
DK1940881T3 (en) 2005-10-11 2017-02-20 Amgen Res (Munich) Gmbh COMPOSITIONS WITH ARTICLE CROSS-SPECIFIC ANTIBODIES AND APPLICATIONS THEREOF
TW200732350A (en) 2005-10-21 2007-09-01 Amgen Inc Methods for generating monovalent IgG
ES2892925T3 (es) 2006-03-31 2022-02-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Métodos para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos
US20090258001A1 (en) 2006-06-06 2009-10-15 Paul Ponath Administration of anti-CD3 antibodies in the treatment of autoimmune diseases
SG172698A1 (en) 2006-06-12 2011-07-28 Trubion Pharmaceuticals Inc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
US20100056759A1 (en) 2006-10-19 2010-03-04 Tolerx, Inc. Methods and Compositions for Efficient Removal of Protein A from Binding Molecule Preparations
BRPI0721062A2 (pt) 2006-12-21 2019-09-24 Macrogenics Inc métodos para prevenir ou retardar o início e para prevenir a progressão de diabete autoimune latente, métodos para tratamento de diabete autoimune latente em adultos e para tratar ou prevenir diabete de tipo 1 de início na idade adulta ou para melhorar seus sintomas em um paciente sofrendo do mesmo, e, método para prevenir ou retardar requisição de insulina em um paciente.
CN101990439A (zh) 2007-07-06 2011-03-23 特鲁比昂药品公司 具有置于c末端的特异性结合结构域的结合肽
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
MX2011000071A (es) 2008-07-02 2011-05-03 Emergent Product Dev Seattle Inmunoterapeuticos de interleucina-6 (il6).
KR20110044991A (ko) 2008-07-02 2011-05-03 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 ＴＮＦ-α 길항제 다-표적 결합 단백질
JP2011526794A (ja) 2008-07-02 2011-10-20 エマージェント プロダクト デベロップメント シアトル， エルエルシー ＴＧＦ−βアンタゴニスト多重標的結合性分子
EP2321345A1 (en) 2008-07-28 2011-05-18 Emergent Product Development Seattle, LLC Multi-specific binding proteins targeting b cell disorders
BRPI0919382A2 (pt) 2008-09-26 2016-01-05 Roche Glycart Ag anticorpos bi-específicos anti-egfr/anti-igf-1r
EA024877B1 (ru) 2008-10-02 2016-10-31 Эмерджент Продакт Дивелопмент Сиэтл, Ллс Связывающие множество мишеней белки, обладающие антагонистическими свойствами по отношению к cd86
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
JP5719354B2 (ja) 2009-05-27 2015-05-20 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 三重又は四重特異性抗体
US20130052195A1 (en) 2009-12-23 2013-02-28 Emergent Product Development Seattle,LLC Compositions Comprising TNF-alpha and IL-6 Antagonists and Methods of Use Thereof
AU2012245260B2 (en) * 2011-04-22 2016-09-08 Aptevo Research And Development Llc Prostate-specific membrane antigen binding proteins and related compositions and methods
KR101308922B1 (ko) * 2012-02-15 2013-09-23 주식회사 경동나비엔 연소기기용 듀얼 벤츄리
CN104487587A (zh) 2012-04-20 2015-04-01 新兴产品开发西雅图有限公司 Cd3结合多肽

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002040545A2 (en) * 2000-11-17 2002-05-23 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Reduction of the nonspecific animal toxicity of immunotoxins by mutating the framework regions of the fv to lower the isoelectric point
CN102292352A (zh) * 2008-10-10 2011-12-21 新兴产品开发西雅图有限公司 Tcr复合物免疫治疗剂
WO2011090762A1 (en) * 2009-12-29 2011-07-28 Emergent Product Development Seattle, Llc Heterodimer binding proteins and uses thereof

Cited By (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104892765B (zh) * 2015-06-29 2018-04-10 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 一种抗CD3抗原和Her‑2抗原的双特异性抗体
CN104892765A (zh) * 2015-06-29 2015-09-09 长春力太生物技术有限公司 一种抗CD3抗原和Her-2抗原的双特异性抗体
CN108137700B (zh) * 2015-07-31 2021-11-19 瑞泽恩制药公司 抗psma抗体、结合psma及cd3的双特异性抗原结合分子及其用途
CN108137700A (zh) * 2015-07-31 2018-06-08 瑞泽恩制药公司 抗psma抗体、结合psma及cd3的双特异性抗原结合分子及其用途
CN108367004B (zh) * 2015-09-21 2022-09-13 阿帕特夫研究和发展有限公司 Cd3结合多肽
CN108367004A (zh) * 2015-09-21 2018-08-03 阿帕特夫研究和发展有限公司 Cd3结合多肽
CN108026179A (zh) * 2015-10-02 2018-05-11 豪夫迈·罗氏有限公司 结合间皮素和cd3的双特异性t细胞活化性抗原结合分子
CN107365387B (zh) * 2016-05-12 2022-03-15 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用
US11339225B2 (en) 2016-05-12 2022-05-24 Asclepius (Suzhou) Technology Company Group, Co., Ltd. Bispecific antigen-binding construct and preparation method and use thereof
US11680106B2 (en) 2016-05-12 2023-06-20 Asclepius (Suzhou) Technology Company Group Co., Ltd. Bispecific antigen-binding construct and preparation method and use thereof
WO2017193956A1 (zh) * 2016-05-12 2017-11-16 李华顺 一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用
CN107365387A (zh) * 2016-05-12 2017-11-21 李华顺 一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用
CN106117358A (zh) * 2016-06-16 2016-11-16 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106084047A (zh) * 2016-06-17 2016-11-09 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106117361A (zh) * 2016-06-17 2016-11-16 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106117359A (zh) * 2016-06-17 2016-11-16 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106084048A (zh) * 2016-06-17 2016-11-09 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106117360A (zh) * 2016-06-17 2016-11-16 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106084049A (zh) * 2016-06-17 2016-11-09 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106084046A (zh) * 2016-06-17 2016-11-09 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106146661A (zh) * 2016-06-17 2016-11-23 中山大学 抗cd3单域抗体
CN106146662A (zh) * 2016-07-18 2016-11-23 中山大学 抗cd3单域抗体
CN112533950A (zh) * 2018-06-29 2021-03-19 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 抗CD3e抗体及其用途
CN112533950B (zh) * 2018-06-29 2023-03-10 多玛医药科技(苏州)有限公司 抗CD3e抗体及其用途
CN112955471A (zh) * 2018-12-07 2021-06-11 江苏恒瑞医药股份有限公司 Cd3抗体及其药物用途
CN113005088A (zh) * 2019-12-19 2021-06-22 苏州方德门达新药开发有限公司 工程改造的t细胞、其制备及应用
CN113005088B (zh) * 2019-12-19 2024-06-04 苏州方德门达新药开发有限公司 工程改造的t细胞、其制备及应用
CN115029318A (zh) * 2022-05-12 2022-09-09 广州明征生物科技有限公司 携带多特异性抗体基因的间充质干细胞及其制药用途

Also Published As

Publication number Publication date
IN2014MN02293A (zh) 2015-08-07
BR112014025830A2 (zh) 2017-06-20
US10202452B2 (en) 2019-02-12
HK1207398A1 (zh) 2016-01-29
AU2017228643B2 (en) 2019-12-05
EP2839019A4 (en) 2016-03-30
JP6509724B2 (ja) 2019-05-08
IL235093B (en) 2019-09-26
SG10201608307WA (en) 2016-11-29
SG11201406346SA (en) 2014-11-27
MX366813B (es) 2019-07-25
CA2870545A1 (en) 2013-10-24
JP2018138039A (ja) 2018-09-06
RU2014142166A (ru) 2016-06-10
MX2014012578A (es) 2015-05-11
AU2013249267A1 (en) 2014-10-23
EP2839019A2 (en) 2015-02-25
US20150232557A1 (en) 2015-08-20
WO2013158856A2 (en) 2013-10-24
IL235093A0 (en) 2014-12-31
HK1208707A1 (zh) 2016-03-11
KR20150004856A (ko) 2015-01-13
BR112014025830A8 (pt) 2017-10-10
RU2673153C2 (ru) 2018-11-22
AU2017228643A1 (en) 2017-10-05
UA119227C2 (uk) 2019-05-27
JP2015521032A (ja) 2015-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104487587A (zh) Cd3结合多肽
US20210095046A1 (en) Prostate-specific membrane antigen binding proteins and related compositions and methods
US11603405B2 (en) Anti-CD3 antibodies and uses thereof
US20180022819A1 (en) Compositions and methods for combination therapy with prostate-specific membrane antigen binding proteins
CN108367004A (zh) Cd3结合多肽
JP2018531000A6 (ja) Ｃｄ３結合ポリペプチド
BR112019005333A2 (pt) proteínas de ligação a cd123 e composições e métodos relacionados
WO2014151438A1 (en) Multispecific anti-cd37 antibodies and related compositions and methods
JP2024116190A (ja) 抗ｃｄ３抗体及びその使用
EA045935B1 (ru) Антитела к cd3 и их применение
NZ616481B2 (en) Prostate-specific membrane antigen binding proteins and related compositions and methods

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1208707

Country of ref document: HK

CB02 Change of applicant information

Address after: Washington State

Applicant after: Apatefu research and Development Co. Ltd.

Address before: Washington State

Applicant before: Emergent Product Development Seattle LLC

COR Change of bibliographic data
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150401

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1208707

Country of ref document: HK