EA045935B1

EA045935B1 - Антитела к cd3 и их применение

Info

Publication number: EA045935B1
Application number: EA202092847
Authority: EA
Inventors: Франсуа Годе; Джилл Джайлс-Комар; Бредли Хайдрих; Чичи Хуан; Коллин Кейн; Ронан Макдейд; Дженнифер Немет-Сиэй
Original assignee: Янссен Байотек, Инк.
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2019-05-21
Publication date: 2024-01-19

Description

Перечень последовательностей

Рассматриваемая в данный момент заявка содержит перечень последовательностей, представленный в электронном виде в формате ASCII и в полном объеме включенный в настоящий документ путем ссылки. Копия указанного перечня в формате ASCII, созданная 3 мая 2019 г., называется JBI5135WOPCTl_Sequence_listing.txt и имеет размер 588 килобайт.

Область техники

Изобретение, предложенное в настоящем документе, относится к антителам к кластеру дифференцировки 3 (CD3) и их антигенсвязывающим фрагментам, способным специфически связываться с человеческим и нечеловеческим CD3, и в частности к антителам к CD3 и антигенсвязывающим фрагментам, которые перекрестно реагируют с CD3 отличного от человека млекопитающего (например, яванского макака); антителам к простатспецифическому мембранному антигену (PSMA) и их антигенсвязывающим фрагментам, способным специфически связываться с человеческим и нечеловеческим PSMA; антителам к IL1RAP и их антигенсвязывающим фрагментам, способным специфически связываться с человеческим и нечеловеческим IL1RAP; антителам к CD33 и их антигенсвязывающим фрагментам, способным специфически связываться с человеческим и нечеловеческим CD33; и биспецифическим антителам, способным специфически связывать CD3; PSMA; IL1RAP; CD33; CD3 и PSMA; CD3 и IL1RAP; или CD3 и CD33. Данное изобретение также относится к применению таких антител и антигенсвязывающих фрагментов при лечении злокачественного новообразования, аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний и других патологических состояний.

Предпосылки

Биспецифические антитела и фрагменты антител исследовали как средство для рекрутинга цитолитических Т-клеток для уничтожения опухолевых клеток. Однако клиническое применение многих биспецифических антител, рекрутирующих Т-клетки, ограничено проблемами, включая неблагоприятную фармакокинетику, потенциальную иммуногенность и проблемы при производстве. Таким образом, существует значительная потребность в биспецифических антителах, рекрутирующих цитолитические Т-клетки, для уничтожения опухолевых клеток, демонстрирующих сниженную токсичность и благоприятные производственные профили.

Белковый комплекс Т-клеточный антигенный рецептор/CD3 человека состоит из шести различных цепей: CD3γ-цепи (SwissProt P09693), CD3δ-цепи (SwissProt P04234), двух CD3ε-цепей (SwissProt P07766) и одного гомодимера CD3ζ-цепи (SwissProt P20963) (ε γ: ε δ: ζζ, который связан с α- и β-цепями Т-клеточного рецептора. Этот комплекс играет важную роль в связывании распознавания антигена с несколькими внутриклеточными путями сигнальной трансдукции. Комплекс CD3 опосредует трансдукцию сигнала, что приводит к активации Т-клеток и пролиферации. CD3 необходим для иммунного ответа.

Сводная информация

В настоящем документе предложены выделенные рекомбинантные антитела к CD3 или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие тяжелую цепь, содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR), содержащую SEQ ID NO: 662; HCDR2, содержащую SEQ ID NO: 663; и HCDR3, содержащую SEQ ID NO: 664, и легкую цепь, содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR), содержащую SEQ ID NO: 671, LCDR2, содержащую SEQ ID NO: 673, и LCDR3, содержащую SEQ ID NO: 690; вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 652, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 661; тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 640, и легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 676; или содержащие: тяжелую цепь, содержащую HCDR1, содержащую SEQ ID NO: 662; HCDR2, содержащую SEQ ID NO: 663; и HCDR3, содержащую SEQ ID NO: 664, и легкую цепь, содержащую LCDR1, содержащую SEQ ID NO: 773, LCDR2, содержащую SEQ ID NO: 673, и LCDR3, содержащую SEQ ID NO: 690; вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 657, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 678; или тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 675, и легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 678.

Также предложены выделенные рекомбинантные антитела к CD3 или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают CD3d, или CD3e, или CD3e и CD3d Macaca fascicularis или человека с аффинностью связывания около 300 нМ или менее.

В некоторых вариантах осуществления выделенные рекомбинантные антитела к CD3 или их антигенсвязывающие фрагменты имеют одно, два, три или четыре из следующих свойств:

связывают CD3+ Т-лимфоциты человека и Macaca fascicularis с расчетной ЕС50 20 нМ или менее и связывают клетки HEK, экспрессирующие CD3 Macaca fascicularis, с расчетной ЕС50 40 нМ или менее, причем разница в расчетных ЕС50 между связыванием CD3+ Т-лимфоцитов и связыванием клеток HEK, экспрессирующих CD3 Macaca fascicularis, составляет менее 5 раз, и при этом расчетную ЕС50 измеряют в анализе связывания с цельными клетками при 0°С с использованием проточной цитометрии;

связывают рекомбинантный CD3d от человека (SEQ ID NO: 691) или связывают рекомбинантный

- 1 045935

CD3e от человека (SEQ ID NO: 636), или рекомбинантный CD3d от Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 692) с равновесной константой диссоциации (KD) 12 нМ или менее, причем KD измеряют с помощью анализа методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием системы ProteOn XPR36 при +25°С;

связывают остатки 1-6 Cd3e при определении с помощью рентгенокристаллографии; или активируют Т-клетки или индуцируют экспрессию CD69 в той же степени, что и cOKT3 или SP34-2 при определении с помощью анализа методом клеточной сортировки с активацией флуоресценции.

В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, содержат HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно; VH и VL с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно; или НС и LC с SEQ ID NO: 640 и 676 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, содержат HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 773, 673 и 690 соответственно; VH и VL с SEQ ID NO: 657 и 678 соответственно или НС и LC с SEQ ID NO: 675 и 677 соответственно.

Дополнительно в настоящем документе описаны биспецифические антитела, содержащие первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген, причем первый домен содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе.

Биспецифические антитела, описанные в настоящем документе, могут содержать первый домен, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 670 соответственно; и второй домен, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 697, 683, 698, 699, 792 и 686 соответственно.

Биспецифические антитела, описанные в настоящем документе, могут содержать первый домен, который содержит VH и VL с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно; и второй домен, который содержит VH и VL с SEQ ID NO: 681 и 682 соответственно.

Биспецифические антитела, описанные в настоящем документе, могут содержать первый домен, который содержит НС и LC с SEQ ID NO: 640 и 676 соответственно; и второй домен, который содержит НС и LC с SEQ ID NO: 679 и 680 соответственно.

Биспецифические антитела, описанные в настоящем документе, могут содержать первый домен, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 670 соответственно; и второй домен, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 704, 705, 706, 707, 708 и 709 соответственно.

Биспецифические антитела, описанные в настоящем документе, могут содержать первый домен, который содержит VH и VL с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно; и второй домен, который содержит VH и VL с SEQ ID NO: 702 и 703 соответственно.

Биспецифические антитела, описанные в настоящем документе, могут содержать первый домен, который содержит НС и LC с SEQ ID NO: 640 и 676 соответственно; и второй домен, который содержит НС и LC с SEQ ID NO: 700 и 701 соответственно.

В изобретении дополнительно предложены выделенные биспецифические антитела к CD3xPSMA, содержащие первый домен, который связывается с клетками, экспрессирующими рекомбинантный белок CD3d, или CD3e Macaca fascicularis или человека с аффинностью 300 нМ или менее, причем связывание с клетками измеряют методом проточной цитометрии, и второй домен, который специфически связывается с PSMA.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело к CD3xPSMA содержит первый домен, который связывает CD3+ Т-лимфоциты человека и Macaca fascicularis с расчетной ЕС50 20 нМ или менее и связывает клетки HEK, экспрессирующие CD3 Macaca fascicularis, с расчетной ЕС50 40 нМ или менее, причем разница в расчетных ЕС50 между связыванием CD3+ Т-лимфоцитов и связыванием клеток НЕК, экспрессирующих CD3 Macaca fascicularis, составляет менее 5 раз, и при этом расчетную ЕС50 измеряют в анализе связывания с цельными клетками при 0°С с использованием проточной цитометрии;

связывает рекомбинантный CD3d от человека (SEQ ID NO: 691), или связывает рекомбинантный CD3e от человека (SEQ ID NO: 636), или связывает рекомбинантный CD3d от Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 692), или связывает рекомбинантный CD3e от Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 693) с равновесной константой диссоциации (KD) 12 нМ или менее, в котором KD измеряют с помощью анализа методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием системы ProteOn XPR36 при +25°С;

демонстрирует отсутствие окисления метионина или триптофана, или отсутствие деамидирования аспарагина, или демонстрирует отсутствие изомеризации аспарагина по результатам анализа методом пептидного картирования;

связывает остатки 1-6 CD3e при определении с помощью рентгенокристаллографии; или активирует Т-клетки или индуцируют экспрессию CD69 в той же степени, что и cOKT3 или SP34-2 при определении с помощью анализа методом клеточной сортировки с активацией флуоресценции.

- 2 045935

Также описаны фармацевтические композиции, содержащие описанные в настоящем документе антитела и фармацевтически приемлемый носитель.

В изобретении дополнительно предложены способы получения антител, описанных в настоящем документе, включающие культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, в условиях, в которых антитело экспрессируется, и выделение антитела, продуцируемого клеткой-хозяином. Способы получения биспецифического антитела к CD3xPSMA могут включать объединение моноспецифического двухвалентного антитела к CD3, имеющего две идентичные HCl и две идентичные LC1, и моноспецифического двухвалентного антитела к PSMA, имеющего две идентичные НС2 и две идентичные LC2, в смеси с молярным соотношением приблизительно 1:1; введение в смесь восстанавливающего агента; инкубирование смеси в течение от приблизительно 90 мин до приблизительно 6 ч; удаление восстанавливающего агента; и очистку биспецифического антитела к CD3xPSMA, которое содержит НС1, LC1, HC2 и LC2.

Дополнительно описаны способы лечения злокачественного новообразования у субъекта, включающие введение терапевтически эффективного количества описанных выделенных антител субъекту, нуждающемуся в этом, в течение времени, достаточного для лечения злокачественного новообразования.

В изобретении также предложены наборы, содержащие антитела, описанные в настоящем документе. Наборы могут дополнительно содержать реагенты для обнаружения антител и инструкции по применению.

Краткое описание графических материалов

Изложение сущности изобретения, а также последующее подробное описание будут более понятными при рассмотрении вместе с прилагаемыми рисунками. С целью иллюстрации описанных антител и способов в графических материалах представлены примеры осуществления антител и способов; однако антитела и способы не ограничиваются конкретными раскрытыми вариантами осуществления. В графических материалах показано следующее:

На фиг. 1А и 1В показаны антитела к CD3, продуцируемые OmniRat. Последовательности VH (фиг. 1А) и VL (фиг. 1В) активных мкАт к CD3, продуцируемых у OmniRat, были выровнены с последовательностями человеческой зародышевой линии из IMGT. CDR подчеркнуты. Дивергенция последовательностей показана жирным шрифтом. На фиг. 1А описаны SEQ ID NO: 651, 653, 656, 655, 20, 654 и 717, а на фиг. 1В описаны SEQ ID NO: 658, 688, 660, 659 и 718 соответственно, все из которых представлены в порядке появления.

На фиг. 2 показан клеточный анализ связывания для оценки связывающей способности отдельных супернатантов гибридом крыс с человеческими очищенными CD3+ Т-лимфоцитами.

На фиг. 3 показан клеточный анализ связывания для оценки связывающей способности отдельных супернатантов гибридом крыс с очищенными CD3+ Т-лимфоцитами яванского макака.

На фиг. 4 показаны результаты конкурентного анализа для супернатантов гибридом, оцениваемые на их способность конкурировать с коммерческим антителом к CD3 человека SP34-2, для которого известен эпитоп, и перекрестно реагирует с CD3 яванского макака.

На фиг. 5 показаны репрезентативные кривые связывания антител к CD3 на первичных Т-клетках человека.

На фиг. 6 показаны репрезентативные кривые конкурентного связывания антител к CD3 с конъюгированным AlexaFluor 488 SP34-2 на первичных Т-клетках человека.

На фиг. 7 показано связывание мкАт BLW-2E6 со сконструированной легкой цепью (LC) с первичными Т-клетками человека.

На фиг. 8 показано связывание BLW-2E6 со сконструированной тяжелой цепью (НС) с первичными Т-клетками человека.

На фиг. 9 показано насыщение CD3 человека красителем AlexaFluor™ (AF) 488 посредством анализа методом FACS. Полученные средние значения интенсивности флуоресценции строили на графике в виде зависимости от концентрации молекулы антитела. Для каждого донора получали значения Kd и получали среднее значение. Константа насыщения связывания (KdT) для человеческих Тклеток составила 5,6±1,0 нМ (n=4) и была использована в настоящем документе для определения аффинности связывания Kd. Один донор-человек был исключен, поскольку во время анализа он не соответствовал критериям жизнеспособности, составляющим по меньшей мере 60%. Идентификаторы LS на фигурах условных обозначений относятся к отдельным донорам человеческих Т-клеток.

На фиг. 10 показаны кривые ингибирования для двухвалентных антител к CD3, CD3B376 и CD3B450, для конкуренции за связывание с антителом AlexaFluor488 SP-34 к CD3. Значения IC50 составили 29 и 60 нМ соответственно.

На фиг. 11 показаны сенсограммы связывания вариантов BLW-2E6 с hCD3s(1-27)-Tn25.

На фиг. 12А-12Е показана термостабильность антител к CD3 CD3B376 (фиг. 12А), CD3B450 (фиг. 12В), CD3B389 (фиг. 12С), CD3B467 посредством DSC (фиг. 12D) и наложение термограмм для

- 3 045935 всех кандидатов (фиг. 12Е).

На фиг. 13А, 13В показаны сравнения термостабильности антител к CD3 с наложением термограмм для CD3B376 и CD3B389 (фиг. 1зА); наложением термограмм для CD3B450 и CD3B467 (фиг. 13В).

На фиг. 14 показано связывание с клетками LNCAP подмножества биспецифических антител к PSMAxCD3 с созревшей аффинностью.

На фиг. 15 показано связывание с клетками LNCAP подмножества биспецифических антител к PSMAxCD3 с созревшей аффинностью.

На фиг. 16 показаны результаты по PSMA-отрицательному связыванию с клетками РС3 биспецифических антител к PSMAxCD3 с созревшей аффинностью.

На фиг. 17 показаны результаты биспецифических антител к PSMAxCD3 с созревшей аффинностью в функциональном анализе уничтожения клеток.

На фиг. 18 показаны взаимодействия антитело-антиген в комплексе CD3B334:CD3. Остатки CD3 находятся в эллипсах, остатки CD3B334 находятся в прямоугольниках.

На фиг. 19 показан анализ на основе первичных Т-клеток человека и яванского макака, используемый для определения способности отобранных соединений из гибридом активировать Тклетки, измеренной по активации CD69.

На фиг. 20 показана противоопухолевая эффективность PS3B79 в ксенотрансплантатах человеческих клеток предстательной железы LnCAP AR.TB у гуманизированных Т-клетками мышей NSG. Подкожные опухоли LnCAP AR.TB измеряли два раза в неделю, и результаты представляли как средний объем опухоли, выраженный в мм³±СОС (* р<0,0001).

На фиг. 21 показана противоопухолевая эффективность PS3B90 в модели ксенотрансплантатах человеческих клеток предстательной железы LnCAP AR.TB у гуманизированных Т-клетками мышей NSG. Подкожные опухоли LnCAP AR.TB измеряли два раза в неделю, и результаты представляли в виде среднего объема опухоли, выраженного в мм³±СОС (* р<0,001).

На фиг. 22A-22D показаны кривые титрования для связывания отобранных при помощи фагового пэннинга соединений к PSMA с клетками LNCaP человека. На фиг. 22А показаны кривые титрования для отобранных соединений G9-PSM М18, М25, М50, М52, М56, М57 и М59. На фиг. 22В показаны М52 и M110. На фиг. 22С показаны М85, М87 и М81. На фиг. 22D показаны М52 и М84. На фиг. 22D экспрессируемые млекопитающим супернатанты нормализовали по экспрессии Fab посредством Octet, и титровали либо к клеткам LNCAP человека, PSMG5 (HEK с PSMA яванского макака), либо к клеткам PSMG9 (HEK с PSMA шимпанзе) с помощью проточной цитометрии. Среднюю геометрическую интенсивность флуоресценции (геом. СИФ) откладывали на графике в отношении Fab с помощью GraphPad Prizm.

На фиг. 23A-23D показаны кривые титрования для связывания отобранных при помощи фагового пэннинга соединений с клетками HEK, экспрессирующими PSMA шимпанзе. (Кривые титрования Fab супернатанта млекопитающих для отобранных при помощи фагового пэннинга соединений к PSMA и HEK, экспрессирующих PSMA шимпанзе.) На фиг. 23А показаны кривые титрования для отобранных соединений G9-PSM М18, М25, М50, М52, М56, М57 и М59. На фиг. 23В показаны М52 и M110. На фиг. 23С показаны М81, М52, М85, и М87. На фиг. 23D показаны М52 и М84. На фиг. 23D экспрессируемые млекопитающим супернатанты нормализовали по экспрессии Fab посредством Octet, и титровали либо к клеткам LNCAP человека, PSMG5 (HEK с PSMA яванского макака), либо к клеткам PSMG9 (HEK с PSMA шимпанзе) с помощью проточной цитометрии. Среднюю геометрическую интенсивность флуоресценции (геом. СИФ) откладывали на графике в отношении Fab с помощью GraphPad Prizm.

На фиг. 24A-24D показаны кривые титрования для связывания отобранных при помощи фагового пэннинга соединений к PSMA с клетками HEK, экспрессирующими PSMA яванского макака. (Кривые титрования Fab супернатанта млекопитающих для отобранных при помощи фагового пэннинга соединений к PSMA по сравнению с HEK, экспрессирующими PSMA яванского макака.) На фиг. 24А показаны кривые титрования для отобранных соединений G9-PSM M18, М25, М50, М52, М56, М57 и М59. На фиг. 24В показаны М52 и M110. На фиг. 24С показаны М81, М52, М85 и М87. На фиг. 24D показаны М52 и М84. На фиг. 24D экспрессируемые млекопитающим супернатанты нормализовали по экспрессии Fab посредством Octet, и титровали либо к клеткам LNCAP человека, PSMGS (HEK с PSMA яванского макака), либо к клеткам PSMG9 (HEK с PSMA шимпанзе) с помощью проточной цитометрии. Среднюю геометрическую интенсивность флуоресценции (геом. СИФ) откладывали на графике в отношении Fab с помощью GraphPad Prizm.

На фиг. 25 показана общая структура Fab PSMM84, связанного с гомодимером ВКД человеческого PSMA.

На фиг. 26 показан вид крупным планом основных взаимодействий PSMA с легкой цепью PSMB83.

На фиг. 27 показан вид крупным планом основных взаимодействий PSMA с тяжелой цепью PSMB83.

На фиг. 28 показано сравнение остатков эпитопа PSMB83 в последовательностях PSMA человека (SEQ ID NO: 719), мыши (SEQ ID NO: 720) и яванского макака (макаки) (SEQ ID NO: 721). Остатки

- 4 045935 эпитопа заштрихованы, а дивергенция последовательностей показана подчеркиванием.

На фиг. 29 показаны остатки паратопа PSMB83. CDR подчеркнуты, а остатки паратопа заштрихованы. На фиг. 29 раскрыты SEQ ID NO: 722-727 соответственно по порядку.

На фиг. 30 представлена карта взаимодействия с прямыми контактами, установленными между PSMA и PSMM84. Ван-дер-ваальсовы взаимодействия показаны пунктирными линиями, а водородные связи представлены сплошными линиями со стрелками, указывающими на атомы остова.

На фиг. 31 показаны уровни экспрессии клонов Fab к PSMA, полученных из PSMM84, по сравнению с экспрессией исходного PSMB83. Строили график зависимости исходных значений люминесценции от логарифмической концентрации.

На фиг. 32 показано связывание с человеческим PSMA клонов Fab к PSMA, полученных из PSMB83, по сравнению со связыванием исходного PSMM84. Строили график зависимости исходных значений люминесценции от логарифмической концентрации.

На фиг. 33 показано связывание с PSMA яванского макака клонов Fab к PSMA, полученных из PSMB83, по сравнению со связыванием исходного PSMB83. Строили график зависимости исходных значений люминесценции от логарифмической концентрации.

На фиг. 34 показана цитотоксичность Т-клеток, опосредованная IC3B19 и IC3B34, ex vivo для клеток LAMA-84 20 в цельной крови через 48 ч. Концентрация IC3B19 и IC3B34 приведена в таблице в нижней части фигуры.

На фиг. 35 показана активация Т-клеток, опосредованная IC3B19 и IC3B34, ex vivo в цельной крови через 48 ч. Концентрация IC3B19 и IC3B34 приведена в таблице в нижней части фигуры.

На фиг. 36-55 показано опосредованное IC3B19 и IC3B34 вовлечение Т-клеток и IL1RAP+ линии клеток-мишеней LAMA-84 (эндогенные и добавленные экзогенно опухолевые клетки). Супернатанты оценивали в отношении 10 провоспалительных цитокинов из цельной крови (n=15 доноров) и анализировали активацию Т-клеток с добавлением экзогенной линии IL1RAP+ опухолевых клеток LAMA-84. Для этих фигур статистически значимые различия показаны жирным шрифтом.

На фиг. 36А, 36В показано высвобождение Т-клеточного ИЛ-бета, опосредованное IC3B19 и IC3B34 (фиг. 36А), и соответствующие оценки параметров 4-параметрической логистической регрессии (фиг. 36В) через 24 ч.

На фиг. 37А, 37В показано высвобождение Т-клеточного ИЛ-бета, опосредованное IC3B19 и IC3B34 (фиг. 37А), и соответствующие оценки параметров 4-параметрической логистической регрессии (фиг. 37В) через 48 ч.

На фиг. 38А, 38В показано высвобождение Т-клеточного ИЛ-2, опосредованное IC3B19 и IC3B34 (фиг. 38А), и соответствующие оценки параметров 4-параметрической логистической регрессии (фиг. 38В) через 24 ч.

На фиг. 39А, 39В показано высвобождение Т-клеточного ИЛ-2, опосредованное IC3B19 и IC3B34 (фиг. 39А), и соответствующие оценки параметров 4-параметрической логистической регрессии (фиг. 39В) через 48 ч.

На фиг. 40А, 40В показано высвобождение Т-клеточного ИЛ-4, опосредованное IC3B19 и IC3B34 (фиг. 40А), и соответствующие оценки параметров 4-параметрической логистической регрессии (фиг. 40В) через 24 ч.

На фиг. 41 показано высвобождение Т-клеточного ИЛ-4, опосредованное IC3B19 и IC3B34, через 48 ч.

На фиг. 42А, 42В показано высвобождение Т-клеточного ИЛ-6, опосредованное IC3B19 и IC3B34 (фиг. 42А), и соответствующие оценки параметров 4-параметрической логистической регрессии (фиг. 42В) через 24 ч.

На фиг. 43 показано высвобождение Т-клеточного ИЛ-6, опосредованное IC3B19 и IC3B34, через 48 ч.

На фиг. 44 показано высвобождение Т-клеточного ИЛ-8, опосредованное IC3B19 и IC3B34, через 24 ч.

На фиг. 45 показано высвобождение Т-клеточного ИЛ-8, опосредованное IC3B19 и IC3B34, через 48 ч.

На фиг. 46А, 46В показано высвобождение Т-клеточного ИЛ-10, опосредованное IC3B19 и IC3B34 (фиг. 46А), и соответствующие оценки параметров 4-параметрической логистической регрессии (фиг. 46В) через 24 ч.

На фиг. 47А, 47В показано высвобождение Т-клеточного ИЛ-10, опосредованное IC3B19 и IC3B34 (фиг. 47А), и соответствующие оценки параметров 4-параметрической логистической регрессии (фиг. 47В) через 48 ч.

На фиг. 48 показано высвобождение Т-клеточного ИЛ-12р70, опосредованное IC3B19 и IC3B34, через 24 ч.

На фиг. 49 показано высвобождение Т-клеточного ИЛ-12р70, опосредованное IC3B19 и IC3B34, через 48 ч.

На фиг. 50 показано высвобождение Т-клеточного ИЛ-13, опосредованное IC3B19 и IC3B34, через

- 5 045935

ч.

На фиг. 51А, 51В показано высвобождение Т-клеточного ИЛ-13, опосредованное IC3B19 и IC3B34 (фиг. 51А), и соответствующие оценки параметров 4-параметрической логистической регрессии (фиг. 51В) через 48 ч.

На фиг. 52А, 52В показано высвобождение Т-клеточного ИФН-гамма, опосредованное IC3B19 и IC3B34 (фиг. 52А), и соответствующие оценки параметров 4-параметрической логистической регрессии (фиг. 52В) через 24 ч.

На фиг. 53А, 53В показано высвобождение Т-клеточного ИФН-гамма, опосредованное IC3B19 и IC3B34 (фиг. 53А), и соответствующие оценки параметров 4-параметрической логистической регрессии (фиг. 53В) через 48 ч.

На фиг. 54А, 54В показано высвобождение Т-клеточного ФНО-альфа, опосредованное IC3B19 и IC3B34 (фиг. 54А), и соответствующие оценки параметров 4-параметрической логистической регрессии (фиг. 54В) через 24 ч.

На фиг. 55А, 55В показано высвобождение Т-клеточного ФНО-альфа, опосредованное IC3B19 и IC3B34 (фиг. 55А), и соответствующие оценки параметров 4-параметрической логистической регрессии (фиг. 55В) через 48 ч.

На фиг. 56 показаны IC3B19 и IC3B34, но не биспецифические антитела с нулевыми плечами (IAPB57xB23B49 или B23B39xCD3B219), индуцированные специфической к мишени цитотоксичностью в клетках NCI-H1975. В этом анализе ЕС50 цитотоксичности варьируется в пределах трех раз для IC3B19 и IC3B34, при этом значения составляют 0,018 и 0,057 нМ соответственно.

На фиг. 57 показана противоопухолевая эффективность IAPB57xCD3B376 в ксенотрансплантатах человеческих клеток NSCLC H1975 у гуманизированных Т-клетками мышей NSG. Подкожные опухоли H1975 измеряли два раза в неделю, и результаты представляли в виде среднего объема опухоли, выраженного в мм³±СОС, * р<0,0001.

На фиг. 58 показано сравнение изоэлектрических точек для различных конструктов к PSMA.

На фиг. 59 показано изменение длины волны по сравнению с контрольной молекулой CNT05825. Контрольное CNT0607 демонстрирует характерное сильное самовзаимодействие. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения от среднего значения трех повторностей.

На фиг. 60 показано сравнение времени удерживания на IgG и контрольных колонках в анализе перекрестного взаимодействия с антителом к PSMA.

На фиг. 61А, 61В показана оценка ex vivo биспецифических антител к CD33xCD3 с цитотоксичностью плеча к CD3 CD3B219 и CD3B376 в отношении бластов и активации Т-клеток в свежей цельной крови пациента с ОМЛ. На фиг. 61А показан процент общей цитотоксичности в отношении клеток ОМЛ с использованием биспецифических антител к CD33 или контролей к CD3xnull. На фиг. 61В показана активация Т-клеток, индуцированная биспецифическими антителами к CD33 или контролями к CD3xnull. При этом не было добавлено ни одного блокатора Fc.

На фиг. 62А-62С показаны анализы опосредованной CD33xCD3 Т-клетками цитотоксичности. Биспецифические антитела к CD33xCD3 с использованием плеча к CD3 CD3B219 и hhtu-CD3B376 инкубировали с человеческими пан Т-клетками и линиями клеток ОМЛ, которые были или дикого типа (KG1, фиг. 62А), или гетерозиготными (SH2, фиг. 62В), или гомозиготными (OCIAML3, фиг. 62С) по SNP-мутации CD33 rs12459419, через 48 ч при 37°С, 5% СО₂ общую цитотоксичность в отношении опухолевых клеток измеряли с помощью проточной цитометрии.

На фиг. 63А, 63В показана оценка ex vivo антител С33В904 в комбинации с CD3B219 или CD3B376 на цитотоксичность в отношении клеток MOLM-13, экзогенно добавленных к нормальной здоровой цельной крови человека (N=6 доноров): Процент цитотоксичности в отношении клеток MOLM-13 (фиг. 63А) и CD33+ CD14' моноцитов (фиг. 63В) с использованием биспецифических антител к CD33xCD3 и соответствующих контролей к nullxCD3 через 48 ч.

На фиг. 64А, 64В показана оценка ex vivo биспецифических антител к CD33xCD3 с применением плеча к CD3 CD3B219 и CD3B376 на цитотоксичность в отношении моноцитов и активацию Т-клеток в свежей цельной крови от шести нормальных доноров яванского макака. На фиг. 64А показан процент общей клеточной цитотоксичности в отношении CD33+ CD14+ моноцитов яванского макака при использовании биспецифических антител к CD33 или их контролей к CD3xnull. На фиг. 64В показана активация Т-клеток, индуцированная биспецифическими антителами к CD33 или их контролями к CD3xnull. При этом не было добавлено ни одного блокатора Fc.

На фиг. 65 показана противоопухолевая эффективность С3СВ189 в ксенотрансплантатах человеческих клеток ОМЛ MOLM-13 у гуманизированных Т-клетками мышей NSG. Диссеминированные опухоли MOLM-13 визуализировали на биолюминесценцию (BLI) дважды в неделю, а результаты представляли в виде средней интенсивности излучения (ф/с/см²/ср)±СОС (n=810/группа). * р<0,0001 для лечения по сравнению с контролем, рассчитанное с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с поправкой Бонферрони.

На фиг. 66 показана выживаемость животных, получавших в качестве лечения С3СВ189, в модели

- 6 045935 ксенотрансплантатов человеческих клеток ОМЛ MOLM-13 у гуманизированных Т-клетками мышей NSG. Выживаемость мышей, несущих MOLM-13, графически представлена с использованием кривой Каплана-Мейера и оценивается с помощью логрангового критерия (критерия Кокса-Мантеля). * р<0,0001 для групп лечения в сравнении с контрольными группами.

На фиг. 67 показана противоопухолевая эффективность С3СВ88 в ксенотрансплантатах человеческих клеток ОМЛ MOLM-13 у гуманизированных Т-клетками мышей NSG. Диссеминированные опухоли MOLM-13 визуализировали на биолюминесценцию (BLI) дважды в неделю, а результаты представляли в виде средней интенсивности излучения (ф/с/см²/ср)±СОС (n=810/группа). * р<0,0001 для лечения по сравнению с контролем, рассчитанное с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с поправкой Бонферрони.

На фиг. 68 показана выживаемость животных, получавших в качестве лечения С3СВ88, в модели ксенотрансплантатов человеческих клеток ОМЛ MOLM-13 у гуманизированных Т-клетками мышей NSG. Выживаемость мышей, несущих MOLM-13, графически представлена с использованием кривой Каплана - Мейера и оценивается с помощью логрангового критерия (критерия Кокса-Мантеля). * р< 0,05 для групп лечения в сравнении с контрольными группами.

На фиг. 69 показано выравнивание выбранных вариабельных областей тяжелой цепи (VH) антитела к TMEFF2. Области VH идентифицированы по их SEQ ID NO: в начале каждой строки.

На фиг. 70 показано выравнивание выбранных вариабельных областей легкой цепи (VL) антитела к TMEFF2. Области VH идентифицированы по их SEQ ID NO: в начале каждой строки.

На фиг. 71 показано уменьшение среднего объема опухоли у каждой мыши, получавшей 0,5 мг/кг ТМСВ132, в модели рака предстательной железы LnCaP ex vivo у самцов мышей NGS.

На фиг. 72 показана эффективность TMEB762xCD3B376 в развившихся ксенотрансплантатах LNCaP у гуманизированных Т-клетками мышей NSG.

На фиг. 73 показана активация Т-клеток в клетка рака предстательной железы LnCaP в ответ на введение ТМСВ132.

На фиг. 74 показана опосредованная Т-клетками цитотоксичность ТМСВ132.

На фиг. 75 показана противоопухолевая эффективность ТМСВ132 у гуманизированных Т-клетками мышей.

Подробное описание изобретения

Все публикации, включая без ограничений патенты и заявки на патенты, цитируемые в данном описании, включены в настоящий документ путем ссылки, как если бы они были полностью изложены в настоящем документе.

Следует понимать, что применяемые в настоящем документе термины предназначены только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не имеют ограничительного характера. Все применяемые в настоящем документе технические и научные термины, если не указано иное, имеют общепринятое значение, понятное обычному специалисту в области, к которой относится изобретение.

В настоящем документе описаны иллюстративные способы и материалы, хотя при практическом осуществлении для проверки настоящего изобретения могут быть использованы любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе. При описании и изложении формулы настоящего изобретения будут применяться следующие термины.

При использовании в этом описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают и множественное число, если содержание текста ясно не указывает на иное. Так, например, ссылка на клетку включает в себя комбинацию двух или более клеток и т.п.

Термины специфическое связывание, или специфически связывает, или связывает относятся к связыванию антитела с антигеном или эпитопом в пределах антигена с большей аффинностью, чем с другими антигенами. Как правило, антитело связывается с антигеном или эпитопом в пределах антигена с равновесной константой диссоциации (KD) около 5х10^-8 М или менее, например, около 1х 10^-9 М или менее, около 1х 10^-10М или менее, около 1 х 10^-11 М или менее или около 1 х 10^-12 М или менее, как правило, с K_D, которая по меньшей мере в сто раз ниже его K_D связывания с неспецифическим антигеном (например, БСА, казеином). Константу диссоциации можно измерять с помощью стандартных процедур. Однако антитела, которые специфически связываются с антигеном или эпитопом в пределах антигена, могут иметь перекрестную реактивность в отношении других родственных антигенов, например, в отношении такого же антигена от других биологических видов (гомологов), таких как человек или обезьяна, например, Масаса fascicularis (яванский макак, макак) или Pan troglodytes (шимпанзе). Если моноспецифическое антитело специфически связывает один антиген или один эпитоп, биспецифическое антитело специфически связывает два разных антигена или два разных эпитопа.

Антитела означает в широком смысле и включает молекулы иммуноглобулина, включая моноклональные антитела, включая мышиные, человеческие, гуманизированные и химерные моноклональные антитела, антигенсвязывающие фрагменты, биспецифические или мультиспецифические антитела, димерные, тетрамерные или мультимерные антитела, одноцепочечные антитела, доменные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы

- 7 045935 иммуноглобулина, которая содержит антигенсвязывающий сайт требуемой специфичности. Полноразмерные молекулы антител состоят из двух тяжелых цепей (НС) и двух легких цепей (LC), соединенных между собой дисульфидными связями, а также из их мультимеров (например, IgM). Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (состоящей из доменов СН1, шарнирной области, СН2 и СН3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Области VH и VL можно дополнительно поделить на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), между которыми расположены каркасные области (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех сегментов FR, расположенных в направлении от N-конца к Сконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4.

Определяющие комплементарность области (CDR) представляют собой области антитела, которые связывают антиген. CDR можно определить с помощью различных систем разграничения, например, таких как Kabat (Wu et al. (1970), J. Exp. Med., 132:211-50; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991), Chothia (Chothia et al. (1987), J. Mol. Biol., 196:901-17), IMGT (Lefranc et al. (2003), Dev. Comp. Immunol., 27:55-77) и AbM (Martin and Thornton (1996), J. Bmol. Biol., 263:800-15). Описано соответствие между различными системами разграничения и нумерациями вариабельных областей (см., например, Lefranc et al. (2003), Dev. Comp. Immunol., 27:55-77; Honegger and Pluckthun (2001), J. Mol. Biol., 309:657-70; база данных International ImMunoGeneTics (IMGT); веб-ресурсы, http://www_imgt_org). Для разметки CDR можно использовать доступные программы, такие как abYsis от UCL Business PLC. Используемые в настоящем документе термины CDR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 включают в себя CDR, определенные любым из способов, описанных выше, по Кабат, Чотиа, IMGT или AbM, если в описании явным образом не указано иное.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелой цепи иммуноглобулины могут относиться к пяти основным классам: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. IgA и IgG дополнительно подразделяются на изотипы IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкие цепи антител любых видов позвоночных в зависимости от аминокислотных последовательностей их константных доменов можно отнести к одному из двух четко отличающихся типов, а именно каппа (к) и лямбда (λ).

Термин антигенсвязывающий фрагмент относится к части молекулы иммуноглобулина, которая связывает антиген. Антигенсвязывающие фрагменты могут представлять собой синтетические, ферментативно получаемые или модифицированные методами генной инженерии полипептиды, и они включают в себя VH, VL, VH и VL, фрагменты Fab, F(ab')2, Fd и Fv, доменные антитела (dAb), состоящие из одного домена VH или одного домена VL, вариабельные домены IgNAR акулы, адаптированные к верблюду VH-домены, минимальные единицы распознавания, состоящие из аминокислотных остатков, имитирующих CDR-области антитела, например участки FR3-CDR3-FR4, HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3, а также LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3. Домены VH и VL могут быть связаны вместе посредством синтетического линкера с образованием различных типов конфигураций одноцепочечных антител, в которых домены VH/VL могут объединяться в пару внутримолекулярно или межмолекулярно в тех случаях, когда домены VH и VL экспрессируются отдельными одноцепочечными конструктами антител с образованием моновалентного антигенсвязывающего сайта, такими как одноцепочечный Fv (scFv) или диатело; они описаны, например, в международных патентных публикациях № WO 1998/44001, WO 1988/01649, WO 1994/13804 и WO 1992/01047.

Термин моноклональное антитело относится к антителу, полученному из по существу гомогенной популяции молекул антител, т.е. индивидуальных антител, составляющих популяцию, идентичных за исключением возможных хорошо известных изменений, таких как удаление С-концевого лизина из тяжелой цепи антитела или посттрансляционные модификации, такие как изомеризация или деамидирование аминокислот, окисление метионина или аспарагина или деамидирование глутамина. Моноклональные антитела обычно связывают один антигенный эпитоп. Биспецифические моноклональные антитела связываются с двумя разными антигенными эпитопами. В пределах популяции антител моноклональные антитела могут иметь гетерогенное гликозилирование. Моноклональное антитело может быть моноспецифическим или мультиспецифическим, например биспецифическим, а также моновалентным, двухвалентным или мультивалентным.

Выделенное антитело относится к антителу или фрагменту антитела, который по существу не содержит других антител, имеющих другую антигенную специфичность (например, выделенное антитело, специфически связывающее антиген, по существу не содержит антител, которые специфически связывают антигены, отличные от указанного антигена). В случае биспецифических антител к CD3 биспецифическое антитело специфически связывает как CD3, так и второй антиген. Термин выделенное антитело охватывает антитела, выделенные так, что они имеют более высокую степень чистоты, такие как антитела, являющиеся чистыми на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%.

Термин гуманизированное антитело относится к антителу, в котором по меньшей мере один CDR получен из биологического вида, отличного от человека, а по меньшей мере один каркас получен из

- 8 045935 последовательностей человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело может включать в себя замены в каркасных областях, в результате чего каркасы могут не являться точной копией экспрессированного человеческого иммуноглобулина или человеческих генных последовательностей зародышевой линии.

Термин человеческое антитело относится к антителу, которое оптимизировано для обеспечения минимального иммунного ответа при введении человеческому индивиду. Вариабельные области человеческого антитела получены из последовательностей иммуноглобулинов человека. Если антитело человека содержит константную область или часть константной области, то константная область также получена из последовательностей иммуноглобулинов человека. Антитело человека содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепи, которые получены из последовательностей человеческого происхождения, если вариабельные области антитела человека получены из системы, в которой используется иммуноглобулин человеческой зародышевой линии или реаранжированные гены иммуноглобулина. Такими примерами систем являются библиотеки генов человеческих иммуноглобулинов, отображаемые на фаге, и трансгенные животные, отличные от человека, такие как мыши или крысы, несущие локусы иммуноглобулинов человека. Антитело человека, как правило, содержит аминокислотные различия по сравнению с иммуноглобулинами, экспрессируемыми у человека, из-за различий между системами, используемыми для получения антитела человека и локусов иммуноглобулина человека, введения соматических мутаций или преднамеренного введения замен в каркасные области или CDR, или и то и другое. Как правило, антитело человека на по меньшей мере около 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентично по аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, кодируемой генами иммуноглобулина человеческой зародышевой линии или перестроенными генами иммуноглобулина. В некоторых случаях антитело человека может содержать консенсусные каркасные последовательности, полученные в результате анализов человеческих каркасных последовательностей, например, как описано в Knappik et al. (2000), J. Mol. Biol., 296:57-86, или синтетическую HCDR3, включенную в библиотеки генов иммуноглобулинов человека, отображаемых на фаге, например, как описано в публикации Shi et al. (2010), J. Mol. Biol., 397:385-96 и в международной патентной публикации № WO 2009/085462.

Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей относительно эталонной полипептидной последовательности определяется как процентная доля аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными с аминокислотными остатками в эталонной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и внесения, в случае необходимости, гэпов для достижения максимальной идентичности последовательностей, но без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может осуществляться различными способами, которые известны специалистам в данной области техники, например, с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как программные обеспечения BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей данного изобретения значения % идентичности аминокислотных последовательностей генерируются с использованием компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для выравнивания последовательностей ALIGN-2 была автоматизирована Genentech. Inc., а исходная программа была подана вместе с документацией пользователя в Бюро регистрации авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где она зарегистрирована под номером регистрации авторского права США TXU510087. Программа ALIGN 2 находится в свободном доступе от Genentech. Inc., г. Южный СанФранциско, штат Калифорния, США, или ее можно скомпилировать из исходного кода. Для применения в операционной системе UNIX, включающей цифровую версию UNIX V4.0D, программу ALIGN-2 нужно скомпилировать. Все параметры сравнения последовательностей устанавливаются программой ALIGN-2 и остаются неизменными. Если для сравнения аминокислотных последовательностей используется ALIGN-2, % идентичности данной аминокислотной последовательности А к, с, или по отношению к данной аминокислотной последовательности В (что в альтернативном варианте может быть сформулировано как данная аминокислотная последовательность А, которая имеет или содержит определенный % идентичности аминокислотной последовательности к, с или по отношению к данной аминокислотной последовательности В) рассчитывают следующим образом:

100 умножить на соотношение X/Y, где х представляет собой число аминокислотных остатков, оцененных программой выравнивания последовательностей ALIGN-2 как идентичные совпадения при программном выравнивании А и В, и

Y представляет общее количество аминокислотных остатков в В.

Следует понимать, что там, где длина аминокислотной последовательности А не равняется длине аминокислотной последовательности В, % идентичности аминокислотной последовательности А к В не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности В к А. Если специально не указано

- 9 045935 иное, все значения % идентичности аминокислотных последовательностей, которые используется в данном документе, получают, как описано в предыдущем абзаце с использованием компьютерной программы ALIGN-2.

Антитела, в которых антигенсвязывающие сайты получены из видов, отличных от человека, не подходят под определение антитела человека.

Термин рекомбинантный относится к ДНК, антителам и другим белкам, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными способами, когда сегменты из разных источников соединены с получением рекомбинантной ДНК, антител или белков.

Термин эпитоп означает часть антигена, с которым специфически связывает антитело. Как правило, эпитопы состоят из химически активных (таких как полярные, неполярные или гидрофобные) поверхностных группировок фрагментов, таких как боковые цепи аминокислот или полисахаридов, и могут иметь конкретные характеристики трехмерной структуры, а также конкретные характеристики заряда. Эпитоп может быть образован из непрерывных и/или прерывающихся аминокислот, образующих конформационное пространственное звено. В случае прерывающегося эпитопа аминокислоты из разных частей линейной последовательности антигена подходят близко друг к другу в 3-мерном пространстве посредством сворачивания молекулы белка. Эпитоп антитела зависит от методологии, применяемой для выявления эпитопа.

Термин паратоп означает часть антитела, с которой специфически связывается антиген. Паратоп может быть линейным или дискретным, образованным за счет пространственных взаимоотношений между аминокислотами антитела, не находящимися в непрерывной последовательности, в отличие от взаимодействия линейных последовательностей аминокислот. Термины паратоп легкой цепи и паратоп тяжелой цепи, или аминокислотные остатки паратопа легкой цепи и аминокислотные остатки паратопа тяжелой цепи означают остатки легкой и тяжелой цепей антитела, контактирующие, соответственно, с антигеном или в целом остатки паратопа антитела означают те аминокислоты антитела, которые контактируют с антигеном.

Термин биспецифический относится к антителу, которое специфически связывает два разных антигена или два разных эпитопа в пределах одного антигена. Биспецифическое антитело может иметь перекрестную реактивность с другими родственными антигенами, например, таким же антигеном от других видов (гомологов), таких как человек или обезьяна, например, Масаса fascicularis (яванский макак, макак) или Pan troglodytes, или может связывать эпитоп, который имеется в двух или более разных антигенах.

Термин мультиспецифический относится к антителу, которое специфически связывает два или более разных антигенов или два или более разных эпитопов в пределах одного антигена. Мультиспецифическое антитело может иметь перекрестную реактивность с другими родственными антигенами, например, таким же антигеном от других видов (гомологов), таких как человек или обезьяна, например, Масаса fascicularis (яванский макак, макак) или Pan troglodytes, или может связывать эпитоп, который имеется в двух или более разных антигенах.

Термин вариант относится к полипептиду или полинуклеотиду, который отличается от эталонного полипептида или эталонного полинуклеотида одной или более модификациями, например одной или более заменами, вставками или делециями.

Термин вектор относится к полинуклеотиду, который способен к удвоению внутри биологической системы, или может быть перемещен между такими системами. Векторные полинуклеотиды, как правило, содержат элементы, такие как точки начала репликации, промотор, сигнал полиаденилирования и селективные маркеры, способствующие дупликации или сохранению данных полинуклеотидов в биологической системе, такой как клетка, вирус, животное, растение и восстановленные биологические системы, использующие биологические компоненты, способные к удвоению вектора. Векторный полинуклеотид может представлять собой молекулу ДНК или РНК или их гибрид, одноцепочечную или двухцепочечную молекулу.

Термин экспрессионный вектор относится к вектору, который можно использовать в биологической системе или реконструированной биологической системе для управления трансляцией полипептида, кодируемого полинуклеотидной последовательностью, присутствующей в экспрессионном векторе.

Термин полинуклеотид означает молекулу, содержащую цепь нуклеотидов, ковалентно связанных через сахарофосфатную основную цепь или другую эквивалентную ковалентную химическую структуру. Двухцепочечная и одноцепочечная ДНК и РНК представляют собой типичные примеры полинуклеотидов. Термин полинуклеотид может относится к синтетической молекуле, содержащей цепь нуклеотидов, ковалентно связанных через сахарофосфатную основную цепь или другую эквивалентную ковалентную химическую структуру, кДНК является примером синтетического полинуклеотида.

Термин полипептид или белок относится к молекуле, которая содержит по меньшей мере два аминокислотных остатка, связанных пептидной связью с образованием полипептида. Малые полипептиды, содержащие менее 50 аминокислотных остатков, могут называться пептидами.

- 10 045935

Проточная цитометрия представляет собой технологию, применяемую для определения физических и химических характеристик частиц в текучей среде по мере их прохождения через по меньшей мере один лазер. Компоненты клеток флуоресцентно метят, а затем возбуждают лазером для излучения света с различными длинами волн (Adan et al., Critical Reviews in Biotechnology (2016), 1549-7801).

Антиидиотипическое (анти-Id) антитело представляет собой антитело, которое распознает антигенные детерминанты (например, паратоп или CDR) антитела. Специалистам в данной области техники по существу известен способ получения или приготовления антиидиотипического антитела. (Lathey, J. et al., Immunology, 1986, 57(1):29-35). Антиидиотипическое антитело может быть антигенблокирующим или неблокирующим. Антиген-блокирующие антиидиотипическое антитела можно использовать для обнаружения свободных антител в образце, например, CD3. Неблокирующее антиидиотипическое антитело можно использовать для обнаружения общего антитела (свободного, частично связанного с антигеном или полностью связанного с антигеном) в образце. Антиидиотипическое антитело можно получить путем иммунизации животного антителом, к которому получают антиидиотипическое антитело. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, антиидиотипическое антитело используется для обнаружения уровня терапевтических антител в образце.

Анти-Ш-антитело также можно применять в качестве иммуногена для индукции иммунного ответа у еще одного животного, получая так называемое анти-анти-Ш-антитело. Антитело к антиидиотипическому антителу может быть идентично по эпитопам первичному мкАт, которое индуцировало образование антиидиотипического антитела. Таким образом, используя антитела к идиотипическим детерминантам mAb, можно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела идентичной специфичности. Антиидиотипические антитела можно изменять (тем самым продуцируя варианты антиидиотипических антител) и/или получать производные с помощью любого подходящего способа, такого как те, которые описаны в другом месте в настоящем документе в отношении антител к CD3.

PSMA относится к простатспецифическому мембранному антигену. Аминокислотная последовательность PSMA Pan troglodytes (также называемых шимпанзе) показана в SEQ ID NO: 49. Внеклеточный домен охватывает остатки 44-750, трансмембранный домен охватывает остатки 20-43, а цитоплазматический домен охватывает остатки 1-19 в последовательности SEQ ID NO: 49. Аминокислотная последовательность PSMA Macaca fascicularis (также называемого яванским макаком, макаком или макаком-крабоедом) показана в SEQ ID NO: 50. Внеклеточный домен охватывает остатки 44-750, трансмембранный домен охватывает остатки 20-43, а цитоплазматический домен охватывает остатки 1-19 в последовательности SEQ ID NO: 50. Аминокислотная последовательность зрелого PSMA человека приведена в SEQ ID NO: 51. Внеклеточный домен охватывает остатки 44-750, трансмембранный домен охватывает остатки 20-43, а цитоплазматический домен охватывает остатки 1-19 в последовательности SEQ ID NO: 51.

В настоящем описании термины CD3-специфический или специфически связывает CD3 или антитело к CD3 относится к антителам, которые специфически связываются с полипептидом CD3-эпсилон (SEQ ID NO: 635), включая антитела, которые специфически связываются с внеклеточным доменом CD3-эпсилон (ВКД) (SEQ ID NO: 636). CD3-эпсилон, вместе с CD3-гамма, -дельта и -дзета, а также гетеродимерами Т-клеточных рецепторов альфа/бета и гамма/дельта, образуют комплекс Т-клеточный рецептор - CD3. Этот комплекс играет важную роль в связывании распознавания антигена с несколькими внутриклеточными путями сигнальной трансдукции. Комплекс CD3 опосредует трансдукцию сигнала, что приводит к активации Т-клеток и пролиферации. Для иммунного ответа необходим CD3.

SEQ ID NO: 635 (человеческий CD3-эпсилон).

MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGS EILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLR ARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQR GQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI

SEQ ID NO: 636 (внеклеточный домен человеческого CD3-эпсилон).

DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGS DEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMD

Используемые в настоящем документе термины акцессорный белок рецептора интерлейкина-1, IL1RAP и IL1-RAP конкретно включают человеческий белок IL1RAP, например, как описывается в каталоге Genbank под номером доступа ААВ84059, эталонная последовательность NCBI: NP_002173.1 и UniProtKB/учетный номер Swiss-Prot Q9NPH3-1 (см. также Huang et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94 (24), 12829-12832). В научной литературе IL1RAP также известен как IL1 R3, C3orfl3, FLJ37788, IL-1 RAcP и EG3556.

Термин CD33 относится к белку кластера дифференцировки 33. CD33 представляет собой

- 11 045935 однопроходной трансмембранный гликопротеин размером 67 килодальтон (кДа) и является членом семейства связывающих сиаловую кислоту иммуноглобулиноподобных лектинов (Siglecs). CD33 в основном считается антигеном миелоидной дифференцировки, имеющим низкий уровень экспрессии в миелоидных клетках-предшественниках, нейтрофилах и макрофагах и высокий уровень экспрессии в циркулирующих моноцитах и дендритных клетках. Внеклеточный домен CD33 человека (Uniprot P20138) (SEQ ID NO: 636) и CD33 яванского макака (ХР005590138.1) являются примерами белков для применения в получении CD33-специфических антител по настоящему описанию.

Термин TMEFF2 относится к человеческому трансмембранному белку с EGF-подобным и двумя фоллистатиноподобными доменами 2, также называемым томорегулином 2. Аминокислотная последовательность полноразмерной последовательности TMEFF2 человека приведена в SEQ ID NO: 77. Внеклеточный домен TMEFF2 приведен в SEQ ID NO: 575 и охватывает остатки 40-374 полноразмерного TMEFF2. Внеклеточный домен TMEFF2 содержит три отдельных субдомена: Kazal-подобный 1 (остатки 85-137), Kazal-подобный 2 (остатки 176-229) и EGF-домен (остатки 261-301). EGF-домен TMEFF2 приведен в SEQ ID NO: 577. Термин мембранная проксимальная область TMEFF2 относится к области TMEFF2 с SEQ ID NO: 629, которая охватывает EGF-домен и N-C-концевые линкерные области (например, остатки 230-320 полноразмерного человеческого TMEFF2 с SEQ ID NO: 77). Все ссылки на белки, полипептиды и фрагменты белка в данном документе предназначены для обозначения человеческой версии соответствующего белка, полипептида или фрагмента белка, если явно не указано, что они принадлежат к отличным от человека видам. Таким образом, TMEFF2 означает человеческий TMEFF2, если не указано что он получен от видов, отличных от человека, например, мышиный TMEFF2 или обезьяний TMEFF2 и т.д.

SEQ ID NO: 77 (полноразмерный человеческий TMEFF2).

MVLWESPRQCSSWTLCEGFCWLLLLPVMLLIVARPVKLAAFPTSLSDCQTPTGW NCSGYDDRENDLFLCDTNTCKFDGECLRIGDTVTCVCQFKCNNDYVPVCGSNGESYQN ECYLRQAACKQQSEILVVSEGSCATDAGSGSGDGVHEGSGETSQKETSTCDICQFGAEC DEDAEDVWCVCNIDCSQTNFNPLCASDGKSYDNACQIKEASCQKQEKIEVMSLGRCQD _{NTTTTTKSEDGHYARTDYAENANKLEESAREHHIpCpEHYNGFCMHGKCEHSINM}Q_EpsCRCDAGYTGQHCEKKDYSVLYVVPGPVRFQYVLIAAVIGTIQIAVICVVVLCITRKCPRS NRIHRQKQNTGHYSSDNTTRASTRLI

SEQ ID NO: 575 (внеклеточный домен человеческого TMEFF2).

FPTSLSDCQTPTGWNCSGYDDRENDLFLCDTNTCKFDGECLRIGDTVTCVCQFK CNNDYVPVCGSNGESYQNECYLRQAACKQQSEILVVSEGSCATDAGSGSGDGVHEGSG ETSQKETSTCDICQFGAECDEDAEDVWCVCNIDCSQTNFNPLCASDGKSYDNACQIKEA SCQKQEKIEVMSLGRCQDNTTTTTKSEDGHYARTDYAENANKLEESAREHHIPCPEHYN GFCMHGKCEHSINMQEPSCRCDAGYTGQHCEKKDYSVLYVVPGPVRFQYVLIAAVIGTI QIAVICVVVLCITRKCPRSNRIHRQKQNTGHYSSDNTTRASTRLI

EGF-домен TMEFF2, SEQ ID NO: 577.

HHIPCPEHYNGFCMHGKCEHSINMQEPSCRCDAGYTGQHCE

Мембранная проксимальная область TMEFF2, SEQ ID NO: 629.

NTTTTTKSEDGHYARTDYAENANKLEESAREHHIPCPEHYNGFCMHGKCEHSIN

MQEPSCRCDAGYTGQHCEKKDYSVLYVVPGPVRFQYV

Термин TMEFF2-положительное злокачественное новообразование относится к раковой ткани или раковой клетке, которая демонстрирует измеримый уровень белка TMEFF2. Уровень белка TMEFF2 может быть измерен с использованием хорошо известных анализов с использованием, например, твердофазного ИФА, иммунофлуоресценции, проточной цитометрии или радиоиммуноанализа на живых или лизированных клеток. Термины сверхэкспрессия, сверхэкспрессированный и сверхэкспрессирующий взаимозаменяемо относятся к образцу, такому как раковая клетка, злокачественная клетка или раковая ткань, которые имеют значительно более высокие уровни опухолевого антигена по сравнению с эталонным образцом. Сверхэкспрессия может быть вызвана амплификацией генов или повышенной транскрипцией или трансляцией. Экспрессию и сверхэкспрессию белка в образце можно измерять с помощью известных анализов, например, твердофазного ИФА, иммунофлуоресценции, проточной цитометрии или радиоиммунного анализа на живых или лизированных клетках. Экспрессию и сверхэкспрессию полинуклеотида в образце можно измерять, например, с помощью методик флуоресцентной гибридизации in situ, саузерн-блоттинга или ПЦР. Белок или полинуклеотид сверхэкспрессируется, когда уровень белка или полинуклеотида в образце в по меньшей мере 1,5 раза выше по сравнению с эталонным образцом. Выбор эталонного образца хорошо известен.

Термин образец относится к сбору аналогичных текучих сред, клеток или тканей, выделенных из

- 12 045935 организма пациента, а также к текучим средам, клеткам или тканям, находящимся внутри пациента. Примерами образцов являются биологические текучие среды, такие как кровь, сыворотка и серозные текучие среды, плазма, лимфа, моча, слюна, кистозная текучая среда, слезы, кал, мокрота, слизистые выделения секреторных тканей и органов, влагалищные выделения, асцитные жидкости, такие как связанные с несолидными опухолями, текучие среды в плевре, перикарде, брюшине, брюшной и других полостях тела, текучие среды, собранные посредством смыва из бронхов, жидкие растворы, контактировавшие с субъектом или биологическим источником, например, среда для культуры клеток и органов, включая кондиционированную среду клеток и органов, промывные жидкости и т.п., биоптаты тканей, аспираты, взятый тонкой иглой, или ткань опухоли после хирургической резекции.

Термин раковая клетка или опухолевая клетка относится к раковой, предраковой или трансформированной клетке, либо in vivo, ex vivo, либо в культуре тканей, которая имеет спонтанные или индуцированные фенотипические изменения. Эти изменения не обязательно затрагивают поступление нового генетического материала. Хотя преобразование может вызвать инфицирование преобразующим вирусом и встраивание новой геномной нуклеиновой кислоты или поглощение экзогенной нуклеиновой кислоты, она также может возникнуть спонтанно или после воздействия канцерогена, в результате чего происходит мутация эндогенного гена. Преобразование/злокачественное новообразование проявляется в морфологических изменениях, иммортализации клеток, нарушении контроля роста, образовании очагов, пролиферации, злокачественности, уровнях маркера, специфических для опухоли, инвазивности, росте опухоли у подходящих животных-хозяев, таких как бестимусные мыши и т.п., in vitro, in vivo и ex vivo (Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)).

Если не указано иное, любые числовые значения, такие как концентрация или диапазон концентраций, описанные в настоящем документе, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином около. Таким образом, числовое значение, как правило, включает ±10% от указанного значения. Например, концентрация 1 мг/мл включает от 0,9 до 1,1 мг/мл. Аналогичным образом диапазон концентраций от 1 до 10% (мас./об.) включает от 0,9% (мас./об.) до 11% (мас./об.). В контексте настоящего документа использование числового диапазона явным образом включает все возможные поддиапазоны, все отдельные числовые значения в пределах этого диапазона, включая целые числа в пределах таких диапазонов и дробные значения, если из контекста явно не следует иное.

Термин эффекторные антигены представляют собой антигены из клеток иммунной системы, которые могут стимулировать или инициировать цитотоксичность, фагоцитоз, презентацию антигена и/или высвобождение цитокинов. Такие эффекторные антигены получены, например, без ограничений из Т-клеток и естественных клеток-киллеров (NK). Примеры подходящих специфичностей для эффекторных антигенов включают без ограничений CD3 или субъединицы CD3, такие как CD3ε для Тклеток и CD16 для NK-клеток. Такие молекулы клеточной поверхности эффекторных клеток подходят для опосредования уничтожения клеток. Эффекторные клетки представляют собой клетки иммунной системы, которые могут стимулировать или инициировать цитотоксичность, фагоцитоз, презентацию антигена и/или высвобождение цитокинов. Такие эффекторные клетки представляют собой, например, без ограничений, Т-клетки, естественные клетки-киллеры (NK), гранулоциты, моноциты, макрофаги, дендритные клетки и антигенпрезентирующие клетки. Примеры подходящей специфичности для эффекторных клеток включают без ограничений CD2, CD3 и субъединицы CD3, такие как CD3e, CD5, CD28 и другие компоненты Т-клеточного рецептора (TCR) для Т-клеток; CD16, CD16A, CD25, CD38, CD44, CD56, CD69, CD94, CD335 (NKp46), CD336, (NKp44), CD337 (NKp30), NKp80, NKG2C и NKG2D, DNAM, NCR для NK-клеток; CD18, CD64 и CD89 для гранулоцитов; CD18, CD32, CD64, CD89 и маннозный рецептор для моноцитов и макрофагов; CD64 и маннозный рецептор для дендритных клеток; а также CD35. В некоторых вариантах осуществления изобретения эти специфичности, т.е. молекулы клеточной поверхности, эффекторных клеток подходят для опосредования уничтожения клеток при связывании биспецифических или мультиспецифических молекул с такой молекулой клеточной поверхности и, таким образом, индуцируя цитолиз или апоптоз.

Термин биспецифическое антитело к CD3 относится к молекуле, содержащей по меньшей мере один связывающий домен, специфически связывающий CD3, и по меньшей мере один связывающий домен, специфически связывающий второй антиген, например, биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген. Домены, специфически связывающие CD3 и второй антиген, как правило, представляют собой пары VH/VL. Биспецифическое антитело к CD3 может быть моновалентным с точки зрения его связывания или с CD3, или со вторым антигеном. В некоторых вариантах осуществления второй или целевой антиген представляет собой антиген клеточной поверхности, который экспрессируется на клетке-мишени, отличной от иммунной эффекторной клетки. В некоторых вариантах осуществления второй антиген представляет собой опухолеассоциированный антиген (ТАА). Иллюстративные ТАА представляют собой PSMA, CD33, IL1RAP и TMEFF2.

Термины биспецифическое антитело к PSMAxCD3, антитело к PSMA/CD3, биспецифическое

- 13 045935 антитело против PSMAxCD3 или антитело против PSMA/CD3 и т.п. относятся к молекуле, содержащей по меньшей мере один связывающий домен, специфически связывающий PSMA, и по меньшей мере один связывающий домен, специфически связывающий CD3. Домены, специфически связывающие PSMA и CD3, как правило, представляют собой пары VH/VL. Биспецифическое антитело к PSMAxCD3 может быть моновалентным с точки зрения его связывания или с PSMA, или с CD3.

Термины биспецифическое антитело к CD33xCD3, антитело к CD33/CD3, биспецифическое антитело против CD33xCD3 или антитело против CD33/CD3 и т.п. относятся к молекуле, содержащей по меньшей мере один связывающий домен, специфически связывающий CD33, и по меньшей мере один связывающий домен, специфически связывающий CD3. Домены, специфически связывающие CD33 и CD3, как правило, представляют собой пары VH/VL. Биспецифическое антитело к CD33xCD3 может быть моновалентным с точки зрения его связывания или с CD33, или с CD3.

Термины биспецифическое антитело к IL1RAPxCD3, антитело к IL1RAP/CD3, биспецифическое антитело против IL1RAPxCD3 или антитело против IL1RAP/CD3 и т.п. относятся к молекуле, содержащей по меньшей мере один связывающий домен, специфически связывающий IL1RAP, и по меньшей мере один связывающий домен, специфически связывающий CD3. Домены, специфически связывающие IL1RAP и CD3, как правило, представляют собой пары V_H/V_L. Биспецифическое антитело к IL1RAPxCD3 может быть моновалентным с точки зрения его связывания или с IL1RAP, или с CD3.

Термины биспецифическое антитело против TMEFF2/CD3, антитело к TMEFF2/CD3, антитело к TMEFF2xCD3 и т.п. относятся к антителу, которое связывается с TMEFF2 и CD3.

Термин валентный относится к наличию в молекуле установленного числа сайтов связывания, специфичных для антигена. Таким образом, термины моновалентный, двухвалентный, четырехвалентный и шестивалентный относятся к наличию в молекуле одного, двух, четырех и шести сайтов связывания соответственно, специфичных для антигена. Термин мультивалентный относится к наличию двух или более сайтов связывания, специфических для антигена в молекуле.

Термин антигенспецифическая CD4+ или CD8+ Т-клетка относится к CD4+ или CD8+ Т-клетке, активированной специфическим антигеном или его иммуностимулирующим эпитопом.

Термин пациент включает в себя любого человека или не относящееся к человеку животное. Термин отличное от человека животное включает всех позвоночных, например, млекопитающих и отличных от млекопитающих животных, таких как приматы, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, амфибии, рептилии и т.д. Если не указано иное, термины пациент или субъект применяются взаимозаменяемо.

Нумерация аминокислотных остатков в константной области антитела в тексте описания приведена в соответствии с индексом EU, как описано в публикации Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), если явно не указано иное.

В настоящем изобретении применяются стандартные одно- и трехбуквенные коды аминокислот.

- 14 045935

Таблица 1

Аминокислота	Трехбуквенный код	Однобуквенный код
Аланин	Ala	A
Аргинин	Arg	R
Аспарагин	Asn	N
Аспартат	Asp	D
Цистеин	Cys	C
Глутамат	Gin	E
Глутамин	Glu	Q
Глицин	Gly	G
Гистидин	His	H
Изолейцин	He	I
Лизин	Lys	к
Метионин	Met	M
Фенилаланин	Phe	F
Пролин	Pro	P
Серин	Ser	s
Треонин	Thr	T
Триптофан	Trp	w
Тирозин	Tyr	Y
Валин	Vai	V

Химические соединения.

В настоящем изобретении предложены антитела к CD3 и их антигенсвязывающие фрагменты, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают PSMA, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают CD33, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают IL1RAP, мультиспецифические антитела, содержащие первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген, а также мультиспецифические антитела, которые специфически связывают CD3, и один или более из PSMA, CD33, IL1RAP и TMEFF2. В настоящем изобретении предложены полипептиды и полинуклеотиды, кодирующие биспецифические антитела по изобретению, или комплементарные к ним нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и способы их получения и применения.

Общие аспекты антител, описанных в настоящем документе.

Описанные в настоящем документе антитела к CD3 или антигенсвязывающие фрагменты включают варианты, имеющие одну или более аминокислотных замен, делеций или добавления, которые сохраняют биологические свойства (например, аффинность связывания или иммунную эффекторную активность) описанных антител к CD3 или антигенсвязывающих фрагментов. В контексте настоящего изобретения, при отсутствии особых указаний, для описания мутаций используются следующие обозначения:

i) замена аминокислоты в заданном положении записывается, например, как K409R, что означает замену лизина на аргинин в положении 409; и ii) для конкретных вариантов используются конкретные трехбуквенные или однобуквенные коды, включая коды Хаа и X, для обозначения любого аминокислотного остатка. Таким образом, замена лизина на аргинин в положении 409 обозначается как K409R, а замена лизина в положении 409 на любой аминокислотный остаток обозначается как К4О9Х. Делеция лизина в положении 409 обозначается K409*. Специалист может получать варианты, содержащие одиночные или множественные замены, делеции или присоединения аминокислот.

Такие варианты могут включать в себя (а) варианты, в которых один или более аминокислотных остатков заменяются консервативными или неконсервативными аминокислотами; (b) варианты, в которых одна или более аминокислот присоединяются к полипептиду или удаляются из него; (с) варианты, в которых одна или более аминокислот включают в себя группу-заместитель; и (d) варианты, в которых полипептид сливают с другим пептидом или полипептидом, таким как партнер слияния, белковая метка или другая химическая функциональная группа, способная придавать полипептиду полезные свойства, например, эпитоп для антитела, полигистидиновая последовательность, остаток биотина и т.п. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, могут включать в себя варианты, в которых аминокислотные остатки одного вида заменены соответствующими остатками другого вида (в консервативных или неконсервативных положениях). В других вариантах

- 15 045935 осуществления аминокислотные остатки в неконсервативных положениях замещены консервативными или неконсервативными остатками. Методики получения таких вариантов, включая генетические (делеции, мутации и т.п.), химические и ферментативные, известны специалистам в данной области.

Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, могут относиться к изотипу IgM, IgD, IgG, IgA или IgE. В некоторых вариантах осуществления изотип антитела представляет собой изотип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG1. В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG2. В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG3. В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG4. Специфичность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по большей части определяется аминокислотной последовательностью и расположением CDR. Следовательно, CDR одного изотипа можно переносить на другой изотип без изменения антигенной специфичности. Соответственно такие изотипы антител входят в объем описанных антител или антигенсвязывающих фрагментов.

Класс IgG у людей делится на четыре изотипа: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Они имеют более чем 95% гомологию в аминокислотных последовательностях в областях CH1, CH2 и СН3, но демонстрируют значительные различия в аминокислотном составе и структуре шарнирной области. Fc-область опосредует эффекторные функции, например антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЗКЦ), антителозависимый клеточный фагоцитоз (АЗКФ) и комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ). При АЗКЦ Fc-область связывается с Fc-рецепторами (FcyR) на поверхности иммунных эффекторных клеток, например, естественных клеток-киллеров и макрофагов, что приводит к лизису клеток-мишеней. При КЗЦ антитела опосредуют целевое уничтожение клеток, запуская каскад комплемента на поверхности клетки. При АЗКФ антитело опосредует уничтожение покрытых антителами клеток-мишеней путем интернализации фагоцитарными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки. Описанные в данном документе антитела включают антитела с описанными свойствами вариабельных доменов в комбинации с любым из изотипов IgG, включая модифицированные версии, в которых Fc-область была модифицирована для модуляции различных эффекторных функций.

Для многих применений терапевтических антител эффекторные функции, опосредованные Fc, нежелательны, поскольку они потенциально могут представлять риск безопасности из-за истощения популяции клеток. Изменить эффекторные функции можно путем конструирования Fc-областей для уменьшения их связывания с FcyR или факторами системы комплемента. Связывание IgG с активирующими (FcyRI, FcYRIIa, FcYRIIIa и FcYRIIIb) и ингибирующими (FcYRIIb) FcyR или первым компонентом комплемента (C1q) зависит от остатков, расположенных в шарнирной области и в домене СН2. Мутации могут быть введены в IgG1, IgG2 и IgG4 для снижения или подавления опосредованных Fc эффекторных функций. Антитела, описанные в настоящем документе, могут включать в себя эти модификации.

В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3, к PSMA, к CD33 и/или к IL1RAP содержат сконструированную Fc-область, имеющую одно или более из следующих свойств: (а) сниженная эффекторная функция по сравнению с исходной Fc; (b) сниженная аффинность к FcyRI, FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIb и/или FcYRIIIa; (с) сниженная аффинность к FcyRI; (d) сниженная аффинность к FcYRIIa; (e) сниженная аффинность к FcyRIIIb; или (f) сниженная аффинность к FcYRIIIa.

В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3, к PSMA, к CD33 и/или к IL1RAP относятся к изотипам, например, IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления, в которых антитело имеет изотип IgG4, антитело содержит замены S228P, F234A и L235A в своей Fc-области по сравнению с IgG4 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, в которых антитело имеет изотип IgGl, антитело содержит замены L234A, и L235A в Fc-области. Антитела, описанные в настоящем документе, могут включать в себя эти модификации.

В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3, к PSMA, к CD33 и/или к IL1RAP представляет собой изотип IgG4, необязательно имеющий замену в тяжелой цепи S228P.

В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3, к PSMA, к CD33 и/или к IL1RAP представляют собой изотип IgG1, необязательно имеющий замены в тяжелой цепи L234A, G237A, P238S, Н268А, А330 и P331S по сравнению с IgG1 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3, к PSMA, к CD33 и/или к IL1RAP представляют собой изотип IgG2, необязательно имеющий замены в тяжелой цепи L234A, G237A, P238S, Н268А, V309L, A330S и P331S по сравнению с IgG2 дикого типа.

- 16 045935

IgG4 дикого типа

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 602)

IgG 1 дикого типа

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 601)

IgG2 дикого типа

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPV AGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 711)

В определенных вариантах осуществления предложены меченые антитела к CD3, к PSMA, к CD33 и/или к IL1RAP. Иллюстративные метки или фрагменты, которые обнаруживаются напрямую (например, флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), и метки и фрагменты (например, ферменты или лиганды), которые обнаруживаются опосредованно (например, посредством ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия). Примеры радиоактивных меток включают радиоактивные метки (например, ³²Р, ¹⁴С, ¹¹¹I, ¹²⁵I, ³Н, I), флуоресцентные метки (такие как DyLight® 649), эпитопные метки, биотин, хромофорные метки, электрохемилюминесцентные метки или ферменты. Более конкретно, описанные метки включают в себя рутений, ¹¹¹In-DOTA, ¹¹¹In-диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и бета-галактозидазу, полигистидин (HIS-метку), акридиновые красители, цианиновые красители, флуороновые красители, оксазиновые красители, фенантридиновые красители, родаминовые красители, красители Alexa Fluor® и т.п.

В дополнение к описанным антителам к CD3, к PSMA, к CD33 и/или к IL1RAP и антигенсвязывающим фрагментам также предложены полинуклеотидные последовательности, способные кодировать описанные антитела и антигенсвязывающие фрагменты. Также предложены векторы, содержащие описанные полинуклеотиды, а также клетки, экспрессирующие антитела к CD3, к PSMA, к CD33 и/или к IL1RAP или антигенсвязывающие фрагменты, предложенные в настоящем документе. Кроме того, описаны клетки, способные экспрессировать описанные векторы. Эти клетки могут представлять собой клетки млекопитающих (например, клетки 293F, клетки СНО), клетки насекомых (например, клетки Sf7), клетки дрожжей, клетки растений или бактериальные клетки (например, Е.соЕ). Описанные антитела также могут продуцироваться гибридомными клетками.

Создание моноспецифических антител

В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3, к PSMA, к CD33, к TMEFF2 и/или к IL1RAP по изобретению являются человеческими.

В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3, к PSMA, к CD33, к TMEFF2 и/или к IL1RAP по изобретению являются гуманизированными.

Описанные в настоящем документе моноспецифические антитела по изобретению (например, антитела к CD3, к PSMA, к CD33, к TMEFF2 и/или к IL1RAP ) можно получать с использованием различных технологий. Например, для получения моноклональных антител можно использовать метод гибридом Kohler and Milstein, Nature, 256:495, 1975. В методе гибридом мышь или другое животноехозяин, такое как хомяк, крыса или курица, иммунизируют PSMA, CD33, IL1RAP, TMEFF2 или CD3 человека, шимпанзе или макака или фрагментами PSMA, CD33, IL1RAP, TMEFF2 или CD3, такими как внеклеточный домен PSMA, CD33, IL1RAP, TMEFF2 или CD3, с последующим слиянием клеток селезенки от иммунизированных животных с клетками миеломы с использованием стандартных методов для получения клеток гибридомы (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, p. 59-103

- 17 045935 (Academic Press, 1986)). Колонии, возникающие из одиночных клеток иммортализованной гибридомы, подвергают скринингу на основании продукции антител с желательными свойствами, такими как специфичность связывания, перекрестная реактивность или ее отсутствие и аффинность к антигену.

Различные животные-хозяева могут быть использованы для продуцирования антител к CD3, к PSMA, к CD33, к TMEFF2 и/или к IL1RAP по изобретению, описанных в настоящем документе. Например, для получения мышиных антител к человеческому PSMA можно использовать мышей Balb/c. Антитела, полученные от мышей линии Balb/c и от других животных, отличных от человека, могут быть гуманизированы с применением разнообразных технологий для создания последовательностей, имеющих большее сходство с человеческими последовательностями.

Примеры методик гуманизации, включающих отбор человеческих акцепторных каркасов, известны и включают в себя пересадку CDR (патент США № 5225539), пересадку SDR (патент США № 6818749), изменение поверхности (Padlan (1991), Mol. Immunol., 28:489-499), изменение поверхности определяющих специфичность остатков (патентная публикация США № 2010/0261620), адаптацию человеческого каркаса (патент США № 8748356) или супергуманизацию (патент США № 7709226). В этих способах CDR исходных антител переносят на человеческие каркасы, которые можно выбирать на основании их общей гомологии с исходными каркасами, на основании сходства длины CDR или идентичности канонической структуры либо их комбинации.

Гуманизированные антитела могут быть дополнительно оптимизированы для улучшения их селективности или аффинности к требуемому антигену посредством включения измененных остатков, поддерживающих каркас, с сохранением аффинности связывания (обратных мутаций) такими методиками, которые описаны в международных патентных публикациях № WO1090/007861 и WO 1992/22653, или посредством встраивания вариации в любую из CDR, например, для улучшения аффинности антитела.

Для получения человеческих антител против белка-мишени можно применять трансгенных животных, несущих в своем геноме локусы иммуноглобулинов (Ig) человека, таких как мыши или крысы, которые описаны, например, в патенте США № 6150584, международной патентной публикации № WO 99/45962, международных патентных публикациях № WO 2002/066630, WO 2002/43478, WO 2002/043478 и WO 1990/04036; Lonberg et al. (1994), Nature, 368:856-9; Green et al. (1994), Nature Genet., 7:13-21; Green & Jakobovits (1998), Exp. Med., 188:483-95; Lonberg and Huszar (1995), Int. Rev. Immunol., 13:65-93; Bruggemann et al. (1991), Eur. J. Immunol., 21:1323-1326; Fishwild et al. (1996), Nat. Biotechnol., 14:845-851; Mendez et al. (1997), Nat. Genet., 15:146-156; Green (1999), J. Immunol. Methods, 231:11-23; Yang et al. (1999), Cancer Res., 59:1236-1243; Bruggemann and Taussig (1997), Curr. Opin. Biotechnol., 8:455-458. Эндогенные локусы иммуноглобулинов у таких животных можно разрывать или удалять, и в геном животного можно встраивать по меньшей мере один полный или частичный локус иммуноглобулина человека посредством гомологичной или негомологичной рекомбинации, с применением трансхромосом или с применением минигенов. Для получения человеческих антител, направленных против выбранного антигена, с применением описанной выше технологии можно обратиться к таким компаниям, как Regeneron (http://_www_regeneron_com), Harbour Antibodies (http://_www_harbourantibodies_com), Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (http://_www_omtinc_net), KyMab (http://_www_kymab_com), Trianni (http://_www.trianni_com) и Ablexis (http://_www_ablexis_com).

Антитела человека можно выбирать из библиотеки фагового дисплея, причем фаг сконструирован с возможностью экспрессии человеческих иммуноглобулинов или их участков, таких как Fab, одноцепочечные антитела (scFv) или неспаренные, или спаренные вариабельные области антител (Knappik et al. (2000), J. Mol. Biol., 296:57-86; Krebs et al. (2001), J. Immunol. Meth., 254:67-84; Vaughan et al. (1996), Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al. (1998), PITAS (USA), 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter (1991), J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581). Антитела по изобретению могут быть выделены, например, из библиотеки фагового дисплея, экспрессирующей вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела в виде гибридных белков с белком оболочки бактериофага pIX, как описано в публикации Shi et al. (2010), J. Mol. Biol., 397:385-96, и в международной патентной публикации № WO 09/085462). В библиотеках можно проводить скрининг на связывание фагов PSMA, CD33, IL1RAP, TMEFF2, или CD3 человека и/или яванского макака, и полученные положительные клоны могут быть дополнительно охарактеризованы; из лизатов клонов могут быть выделены Fab и экспрессированы в виде полноразмерных IgG. Такие способы использования фагового дисплея для выделения человеческих антител описаны, например, в патентах США № 5223409, 5403484, 5571698, 5427908, 5580717, 5969108, 6172197, 5885793, 6521404, 6544731, 6555313, 6582915 и 6593081.

Получение иммуногенных антигенов и продукция моноклональных антител могут быть выполнены с применением любой приемлемой методики, такой как продукция рекомбинантного белка. Иммуногенные антигены можно вводить животным в форме очищенного белка или белковых смесей, включающих целые клетки или клеточные, или тканевые экстракты, или антиген может быть заново образован в теле животного из нуклеиновых кислот, кодирующих указанный антиген или его участок.

- 18 045935

Создание и применение биспецифических и мультиспецифических антител к CD3.

В изобретении предложены биспецифические и мультиспецифические антитела, содержащие первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген. Второй антиген может представлять собой опухолеассоциированный антиген (ТАА) или антиген на патогенных клетках.

Примеры антител к CD3, которые можно использовать для получения биспецифических и мультиспецифических антител, содержащих первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген, включают антитела к CD3, содержащие последовательности VH/VL и CDR тяжелой/легкой цепи, приведенные в табл. 7А и 7В соответственно, и их сконструированные варианты, описанные в табл. 10 и 11, а также в сопроводительном тексте. Например, CDR и/или домены VH/VL антител к CD3 CD3B312, CD3B313, CD3B314, CD3B315, CD3B316, CD3B317, CD3B337, CD3B373, CD3B376, CD3B389, CD3B450 и CD3B467, описанных в настоящем документе, могут быть использованы для получения биспецифических и мультиспецифических антител, содержащих первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген.

Описанные в настоящем документе CDR и/или домены VH/VL антител к CD3 могут быть включены в биспецифические антитела, содержащие первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген.

Описанные в настоящем документе CDR и/или домены VH/VL антитела к CD3 могут быть включены в биспецифические антитела, содержащие PSMA-связывающие домены VH/VL, описанные в настоящем документе и в табл. 18. Описанные в настоящем документе CDR и/или домены VH/VL антитела к CD3 могут быть включены в биспецифические антитела, содержащие IL1RAP-связывающие домены VH/VL, описанные в настоящем документе и в табл. 25. Описанные в настоящем документе CDR и/или домены VH/VL антитела к CD3 могут быть включены в биспецифические антитела, содержащие CD33-связывающие домены VH/VL, описанные в настоящем документе и в табл. 33. Например, домены VH/VL антител к PSMA PSMB119, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB87, PSMB126, PSMB127, PSMB128, PSMB129, PSMB130, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB127, PSMB128, PSMB130, PSMB344, PSMB345, PSMB346, PSMB347, PSMB349, PSMB358, PSMB359, PSMB360, PSMB361, PSMB362, PSMB363, и PSMB365, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для получения биспецифических антител к PSMAxCD3.

Иллюстративные ТАА представляют собой PSMA, CD33, TMEFF2 и IL1RAP. Иллюстративные мультиспецифические антитела к PSMAxCD3, CD33xCD3, TMEFF2xCD3 и IL1RAPxCD3, предложенные в настоящем документе, имеют первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает PSMA, CD33, TMEFF2 или IL1RAP. Иллюстративные антитела к PSMA, которые можно использовать для получения биспецифических молекул к PSMAxCD3, представляют собой описанные в настоящем документе антитела, которые могут содержать последовательности тяжелой и легкой цепей, включая без ограничений последовательности тяжелой и легкой цепей, перечисленные в табл. 18. Иллюстративные антитела к IL1RAP, которые можно использовать для конструирования биспецифических молекул к IL1RAPxCD3, представляют собой антитела, описанные в настоящем документе, которые могут содержать последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи, включая без ограничений последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи, представленные в табл. 30. Иллюстративные антитела к CD33, которые можно использовать для конструирования биспецифических молекул к CD33xCD3, представляют собой антитела, описанные в настоящем документе, которые могут содержать последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи, включая без ограничений последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи, представленные в табл. 38. Иллюстративные антитела к TMEFF2, которые можно использовать для конструирования биспецифических молекул к TMEFF2xCD3, представляют собой антитела, описанные в настоящем документе, которые могут содержать последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи, включая без ограничений последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи, представленные в табл. 52, 59-61.

Созданные биспецифические антитела можно протестировать на их связывание с CD3 и/или вторым антигеном и/или на их желательные функциональные характеристики, такие как опосредованное Т -клетками уничтожение клеток, которые экспрессируют второй антиген.

Предложенные в данном документе биспецифические антитела включают антитела, имеющие полноразмерную структуру антитела.

Термин Fab-плечо или полумолекула означает одну пару тяжелая цепь-легкая цепь, специфически связывающуюся с антигеном.

Полноразмерные биспецифические антитела, описанные в настоящем документе, можно создать, например, путем обмена Fab-плечами (или обмена полумолекулами) между двумя моноспецифическими двухвалентными антителами, введя в поверхность взаимодействия СН3 тяжелой цепи в каждой

- 19 045935 полумолекуле замены, способствующие образованию гетеродимера из двух полумолекул антител, имеющих разную специфичность, или in vitro в бесклеточной среде, или с использованием коэкспрессии. Реакция обмена Fab-плечами является результатом реакции дисульфидной изомеризации и диссоциацииассоциации СН3-доменов. Восстанавливаются дисульфидные связи тяжелых цепей в шарнирных областях исходных моноспецифических антител. Полученные свободные цистеины одного из исходных моноспецифических антител образуют дисульфидную связь тяжелых цепей с цистеиновыми остатками второй молекулы исходного моноспецифического антитела, и одновременно СН3-домены исходных антител высвобождаются и происходит переформирование путем диссоциации-ассоциации. СН3-домены Fab-плеч можно конструировать с возможностью обеспечения гетеродимеризации, а не гомодимеризации. Полученный продукт представляет собой биспецифическое антитело, имеющее два Fab-плеча или полумолекулы, каждая из которых связывает отдельный эпитоп, то есть эпитоп на CD3 и эпитоп на втором антигене.

Термин гомодимеризация относится к взаимодействию двух тяжелых цепей, имеющих идентичные аминокислотные последовательности СН3. Термин гомодимер относится к антителу, имеющему две тяжелые цепи с идентичными аминокислотными последовательностями СН3.

Термин гетеродимеризация относится к взаимодействию двух тяжелых цепей, имеющих неидентичные аминокислотные последовательности СН3. Гетеродимер относится к антителу, имеющему две тяжелые цепи с неидентичными аминокислотными последовательностями СН3.

В некоторых вариантах осуществления биспецифические антитела включают конструкты, такие как Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech), выступы во впадины (Genentech), CrossMAb (Roche) и электростатически-спариваемые (Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed), LUZ-Y (Genentech), сконструированное посредством обмена цепей доменное антитело (SEEDbody) (EMD Serono), Biclonic (Merus) и DuoBody® Technology (Genmab A/S).

Технологию Triomab quadroma можно применять для получения полноразмерных биспецифических антител, включающих VH и VL антител к CD3 по изобретению. Технология Triomab стимулирует обмен Fab-плечами между двумя исходными химерными антителами, одним исходным mAb, имеющим IgG2a, и вторым исходным mAb, имеющим крысиные константные области IgG2b, с получением химерных биспецифических антител.

Для получения полноразмерных биспецифических антител можно применять стратегию выступ во впадину (см., например, международную публикацию № WO 2006/028936). Вкратце выбранные аминокислоты, образующие интерфейс между доменами СН3 в человеческом IgG, можно подвергать мутации в положениях, влияющих на взаимодействия доменов СН3, способствуя образованию гетеродимера. Аминокислоту с короткой боковой цепью (впадина) вводят в тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается с первым антигеном, а аминокислоту с длинной боковой цепью (выступ) вводят в тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном. После совместной экспрессии двух антител в результате предпочтительного взаимодействия тяжелой цепи с впадиной и тяжелой цепи с выступом образуется гетеродимер. Примерами пар замен в СН3, образующих выступ и впадину, являются следующие (указаны как модифицированное положение в первом домене СН3 первой тяжелой цепи/модифицированное положение во втором домене СН3 второй тяжелой цепи): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S и T366W/T366S_L368A_Y407V.

Для получения полноразмерных биспецифических антител по изобретению можно использовать технологию CrossMAb. Антитела CrossMAb дополнительно к применению стратегии обмена Fabплечами в промоторе по типу выступ во впадину имеют в одной из половин плеч обмен доменами СН1 и CL для обеспечения правильного объединения в пары легкой цепи полученного биспецифического антитела (см., например, патент США № 8242247).

Для создания полноразмерных биспецифических антител могут быть использованы другие стратегии перенаправления путем обмена вариабельного или константного или обоих доменов между тяжелой цепью и легкой цепью или в пределах тяжелой цепи биспецифических антител, либо в одном, либо в обоих плечах. Такие обмены включают в себя, например, обмены VH-CH1 с VL-CL, VH с VL, СН3 с CL и СН3 с СН1, как описано в патентных публикациях № WO 2009/080254, WO 2009/080251, WO 2009/018386 и WO 2009/080252.

Можно использовать другие стратегии, такие как стимулирование гетеродимеризации тяжелых цепей с использованием электростатических взаимодействий путем введения замен положительно заряженных остатков на одной поверхности СН3 и отрицательно заряженных остатков на другой поверхности СН3, как описано в патентной публикации США № US2010/0015133; патентной публикации США № US2009/0182127; патентной публикации США № US2010/028637 или патентной публикации США № US2011/0123532. В других стратегиях гетеродимеризацию можно стимулировать путем следующих замен (указано модифицированное положение в первом домене СН3 первой тяжелой цепи/модифицированное положение во втором домене СН3 второй тяжелой цепи): L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F или

- 20 045935

T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W, как описано в патентной публикации США № US2012/0149876 или патентной публикации США № US2013/0195849.

Для получения биспецифических антител можно использовать технологию LUZ-Y. В этой технологии к С-концам доменов СН3 присоединяют последовательность типа лейциновой застежки для контроля сборки гетеродимера из исходных мкАт, которую удаляют после очистки, как описано Wranik et al. (2012), J. Biol. Chem., 287(52):42221-9.

Для получения биспецифических антител можно использовать технологию SEEDbody. Для стимуляции гетеродимеризации антитела SEEDbody в своих константных доменах имеют замену выбранных остатков IgG остатками IgA, как описано в патенте США № US20070287170.

Биспецифические антитела, описанные в настоящем документе, можно получать in vitro в бесклеточной среде, вводя асимметричные мутации в области СН3 двух моноспецифических гомодимерных антител и образуя биспецифическое гетеродимерное антитело из двух исходных моноспецифических гомодимерных антител в восстанавливающих условиях для обеспечения изомеризации дисульфидной связи, в соответствии со способами, описанными в международной патентной публикации № WO 2011/131746). В способах первое моноспецифическое двухвалентное антитело (т.е. антитело, которое специфически связывается со вторым антигеном; например, антитело к PSMA, к CD33, к TMEFF2 или к IL1RAP) и второе моноспецифическое двухвалентное антитело (т.е. антитело к CD3) сконструированы так, чтобы иметь определенные замены в домене СН3, который способствует стабильности гетеродимера; антитела инкубируют вместе в восстановительных условиях, достаточных для обеспечения подверженности цистеинов в шарнирной области изомеризации дисульфидной связи; получая таким образом биспецифическое антитело в результате обмена плечами Fab. Условия инкубации можно вернуть к невосстанавливающим. Иллюстративные восстанавливающие агенты, которые могут применяться, представляют собой 2-меркаптоэтиламин (2-МЕА), дитиотреитол (DTT), дитиоэритритол (DTE), глутатион, трис(2-карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР), L-цистеин и бета-меркаптоэтанол. Например, можно использовать инкубирование в течение по меньшей мере 90 мин при температуре по меньшей мере 20°С в присутствии по меньшей мере 25 мМ 2-МЕА или в присутствии по меньшей мере 0,5 мМ дитиотреитола при уровне рН 5-8, например при рН 7,0 или при рН 7,4.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген, содержит по меньшей мере одну замену в константном домене СН3 антитела.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, по меньшей мере одна замена в константном домене СН3 антитела представляет собой замену K409R, F405L или F405L и R409K, где нумерация остатков соответствует индексу EU.

Домены антитела и нумерация являются хорошо известными. Термин асимметричный относится к неидентичным заменам в двух доменах СН3 в двух отдельных тяжелых цепях антитела. Область СН3 IgG1, как правило, состоит из остатков 341-446 на IgG1 (нумерация остатков соответствует каталогу EU).

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое антитело относится к изотипу IgG1 и содержит замену F405L в первой тяжелой цепи (НС1) антитела и замену K409R во второй тяжелой цепи (НС2) антитела по сравнению с IgG1 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое антитело относится к изотипу IgG1 и содержит замену K409R в первой тяжелой цепи (НС1) антитела и замену F405L во второй тяжелой цепи (НС2) антитела по сравнению с IgG1 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое антитело представляет собой изотип IgG4 и содержит замену S228P в НС1 и замены S228P, F405L и R409K в НС2 по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое антитело относится к изотипу IgG4 и содержит замены S228P, F405L и R409K в НС1 и замену S228P в НС2 по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое антитело относится к изотипу IgG4 и содержит замены S228P, F234A и L235A в заменах НС1 и S228P, F234A, L235A, F405L и R409K в НС2 по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, биспецифическое антитело относится к изотипу IgG4 и содержит замены S228P, F234A, L235A, F405L и R409K в НС1 и замены S228P, F234A и L235A в НС2 по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое антитело по изобретению содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь асимметричных замен в НС1 и НС2 в положениях остатков 350, 366, 368, 370, 399, 405, 407 или 409, если нумерация остатков соответствует индексу EU.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое антитело по изобретению содержит по меньшей мере одну, две, три или четыре асимметричных замены в НС1 и НС2 в положениях остатков 350, 370, 405 или 409, если нумерация остатков соответствует

- 21 045935 индексу EU.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое антитело по изобретению содержит по меньшей мере одну асимметричную замену в НС1 и НС2 в положениях остатков 405 или 409, если нумерация остатков соответствует индексу EU.

Как правило, замены вводят в молекулу, например, в константный домен антитела, на уровне ДНК с помощью стандартных способов.

Антитела по изобретению могут быть сконструированы в виде разнообразных известных форм антител.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело по настоящему изобретению представляет собой кросс-тело (англ.: cross-body).

В некоторых вариантах осуществления биспецифические антитела по изобретению включают рекомбинантные IgG-подобные молекулы с двойным нацеливанием, в которых каждая из двух сторон молекулы содержит Fab-фрагмент или часть Fab-фрагмента по меньшей мере двух разных антител; слитые молекулы IgG, в которых полноразмерные антитела IgG слиты с дополнительным Fabфрагментом или частями Fab-фрагмента; слитые молекулы Fc, в которых одноцепочечные молекулы Fv или стабилизированные диатела слиты с константными доменами тяжелой цепи, областями Fc или их частями; слитые молекулы Fab, в которых разные Fab-фрагменты слиты друг с другом; антитела из тяжелых цепей на основе ScFv и диател (например, доменные антитела, нанотела), в которых разные одноцепочечные молекулы Fv, или разные диатела, или разные антитела из тяжелых цепей (например, доменные антитела, нанотела) слиты друг с другом, или с другим белком, или молекулой-носителем.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные IgG-подобные молекулы с двойным нацеливанием включают молекулы (DT)-Ig с двойным нацеливанием (GSK/Domantis), антитело два в одном (Genentech) и mAb2 (F-Star).

В некоторых вариантах осуществления слитые молекулы IgG включают молекулы (DVD)-Ig с двойным вариабельным доменом (Abbott), Ts2Ab (MedImmune/AZ) и BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec) и TvAb (Roche).

В некоторых вариантах осуществления Fc-слитые молекулы включают слитые белки ScFv/Fc (Academic Institution), SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), перенацеливающиеся антитела с двойной аффинностью (Fc-DART) (MacroGenics).

В некоторых вариантах осуществления биспецифические антитела со слитыми Fab включают в себя F(ab)2 (Medarex/AMGEN), двойного действия или Bis-Fab (Genentech), Dock-and-Lock (DNL) (ImmunoMedics), двухвалентное биспецифическое антитело (Biotecnol) и Fab-Fv (UCB-Celltech). Антитела на основе ScFv, диател и доменные антитела включают биспецифический Т-клеточный активатор (BITE) (Micromet), тандемное диатело (Tandab) (Affimed), перенацеливающиеся антитела с двойной аффинностью (DART) (MacroGenics), одноцепочечное диатело (Academic), TCR-подобные антитела (AIT, ReceptorLogics), гибриды ScFv и человеческого сывороточного альбумина (Merrimack), и COMBODY (Epigen Biotech), нанотела с двойным нацеливанием (Ablynx), доменные антитела с двойным нацеливанием, имеющие только тяжелую цепь. Различные форматы биспецифических антител были описаны, например, в Chames and Baty (2009), Curr. Opin. Drug. Disc. Dev., 12:276; и в Nunez-Prado et al. (2015), Drug Discovery Today, 20(5):588-594.

В табл. 2 приведены иллюстративные описанные в данном документе моноклональные антитела, которые можно использовать для создания биспецифических антител по изобретению.

- 22 045935

Таблица 2

Иллюстративные моноклональные антитела, которые можно использовать для создания биспецифических антител по изобретению

Первый домен	Второй домен
анти-СОЗ	анти-GITR	анти-СОЗ 3	анти-ILlRAP
CD3B312	PSMB87	СЗЗВ760	IAPB3
CD3B313	PSMB119	СЗЗВ777	IAPB9
CD3B314	PSMB120	СЗЗВ778	IAPB17
CD3B315	PSMB121	СЗЗВ782	IAPB23
CD3B316	PSMB122	СЗЗВ792	IAPB25
CD3B317	PSMB123	СЗЗВ799	IAPB29
CD3B337	PSMB124	СЗЗВ806	IAPB38
CD3B373	PSMB126	C33B83O	IAPB47
CD3B376	PSMB127	C33B836	IAPB55
CD3B389	PSMB129	СЗЗВ9ОЗ	IAPB57
CD3B450	PSMB130	СЗЗВ904	IAPB61
CD3B467	PSMB344	СЗЗВ905	IAPB62
	PSMB345	СЗЗВ907	IAPB63
	PSMB346 PSMB347 PSMB349 PSMB358 PSMB359 PSMB360 PSMB361 PSMB362 PSMB363 PSMB365	СЗЗВ908	IAPB64 IAPB65

Иллюстративные антитела к TMEFF2, которые можно использовать для конструирования биспецифических молекул к TMEFF2xCD3, представляют собой антитела, описанные в настоящем документе, которые могут содержать последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи, включая без ограничений последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи, представленные в табл. 52, 59-61.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 представляет собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген. В некоторых вариантах осуществления второй или целевой антиген представляет собой антиген клеточной поверхности, который экспрессируется на клетке-мишени, отличной от иммунной эффекторной клетки. В некоторых вариантах осуществления второй антиген представляет собой ТАА. Иллюстративные ТАА представляют собой PSMA, CD33, TMEFF2 и IL1RAP.

В изобретении предложено биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно. В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно. В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит НС и LC с SEQ ID NO: 640 и 676 соответственно. В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 657 и 678 соответственно. В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит НС и LC с SEQ ID NO: 675 и 677 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 773, 673 и 690 соответственно. В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 657 и 678 соответственно. В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит НС и LC с SEQ ID NO: 675 и 677 соответственно.

В изобретении также предложено биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген.

В изобретении также предложено биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген по изобретению, для применения при лечении клеточного пролиферативного расстройства.

В изобретении также предложено биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который

- 23 045935 специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген по изобретению, для применения при лечении злокачественного новообразования.

В изобретении также предложено биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген по изобретению, для применения при лечении аутоиммунного заболевания.

В изобретении также предложено биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген по изобретению, для применения в производстве лекарственного препарата для лечения злокачественного новообразования.

В изобретении также предложено биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген по изобретению, для применения в производстве лекарственного средства для лечения аутоиммунного расстройства.

Дополнительным аспектом изобретения является способ лечения клеточного пролиферативного расстройства, или аутоиммунного расстройства у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела к CD3 по изобретению. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген по изобретению, вводят субъекту в дозе от около 0,01 мг/кг до около 10 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген по изобретению, вводят субъекту в дозе от около 0,1 мг/кг до около 10 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген по изобретению, вводят субъекту в дозе около 1 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген по изобретению, вводят подкожно, внутривенно, внутримышечно, местно, перорально, трансдермально, внутрибрюшинно, внутриорбитально, путем имплантации, путем ингаляции, интратекально, интравентрикулярно или интраназально. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген по изобретению, вводят подкожно. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген по изобретению, вводят внутривенно.

В любом из предшествующих применений или способов клеточное пролиферативное расстройство представляет собой злокачественное новообразование. В некоторых вариантах осуществления рак выбран из группы, состоящей из рака пищевода, рака желудка, рака тонкого кишечника, рака толстого кишечника, колоректального рака, рака молочной железы, немелкоклеточного рака легкого, неходжкинской лимфомы (НХЛ), В-клеточной лимфомы, В-клеточного лейкоза, множественной миеломы, рака почки, рака предстательной железы, рака печени, рака головы и шеи, меланомы, рака яичников, мезотелиомы, глиобластомы, В-клеточной карциномы, ДВКЛ из В-клеток герминативного центра (GCB), ДВКЛ из активированных В-клеток (ABC), фолликулярной лимфомы (ФЛ), мантийноклеточный лимфомы (МКЛ), острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), хронического лимфоидного лейкоза (ХЛЛ), лимфомы маргинальной зоны (ЛМЗ), мелкоклеточного лимфоцитарного лейкоза (МЛЛ), лимфоплазмоцитарной лимфомы (ЛЛ), макроглобулинемии Вальденстрема (MB), лимфомы центральной нервной системы (ХНЛ), лимфомы Беркитта (ЛБ), В-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, лимфомы из клеток маргинальной зоны, лейкоза ворсистых клеток, лимфомы/лейкоза из клеток селезенки, не поддающегося классификации, диффузной мелкоклеточной В-клеточной лимфомы красной пульпы селезенки, варианта волосатоклеточного лейкоза, макроглобулинемии Вальденстрема, заболевания тяжелых цепей, плазмоклеточной миеломы, солитарной плазмоцитомы кости, экстраоссальной плазмоцитомы, экстранодальной лимфомы из клеток маргинальной зоны из лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками (MALT-лимфомы), нодальной лимфомы из клеток маргинальной зоны, детской нодальной лимфомы из клеток маргинальной зоны, детской фолликулярной лимфомы, первичной кожной лимфомы из клеток фолликулярного центра, Т-клеточной/гистиоцитарной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, первичной ДВКЛ ЦНС, первичной кожной ДВКЛ, ножного типа, EBV-положительного ДВКЛ пожилых, ДВКЛ, ассоциированной с хроническим воспалением, лимфогранулематоза, первичной медиастинальной (тимусной) В-крупноклеточной лимфомы. Внутрисосудистой крупноклеточной В-клеточной лимфомы, ALK-позитивной крупноклеточной Вклеточной лимфомы, плазмобластной лимфомы, крупноклеточной В-клеточной лимфомы, возникающей при HHV8-ассоциированной многоочаговой болезни Кастлемана, первичной выпотной лимфомы: Вклеточной лимфомы, не поддающегося классификации, с признаками, промежуточными между

- 24 045935 диффузной В-крупноклеточной лимфомой и лимфомой Беркитта, и В-клеточной лимфомы, не поддающейся классификации, с признаками, промежуточными между диффузной В-крупноклеточной лимфомой, классической лимфомой Ходжкина, и амилоидоза легких цепей.

В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование представляет собой рак пищевода. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование представляет собой аденокарциному, например, метастатическую аденокарциному (например, колоректальную аденокарциному, аденокарциному желудка или аденокарциному поджелудочной железы).

В любом из предшествующих применений или способов аутоиммунное расстройство может быть выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, системной красной волчанки (СКВ), болезни Вегенера, воспалительного заболевания кишечника, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ИТП), тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТП), аутоиммунной тромбоцитопении, рассеянного склероза, псориаза, IgA-нефропатии, IgMполинейропатии, миастении гравис, васкулита, сахарного диабета, синдром Рейно, синдром Шегрена, гломерулонефрита, оптикомиелита (NMO), IgG -нейропатии.

В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему (а) композицию, содержащую любое из предшествующих антител к CD3 или биспецифических антител, содержащих первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген по изобретению; и (b) листок-вкладыш в упаковке, содержащий инструкции по введению композиции субъекту для лечения или задержки прогрессирования клеточного пролиферативного расстройства. Термин листок-вкладыш в упаковке используется для обозначения инструкций, которые обычно вкладывают в коммерческие упаковки терапевтических продуктов для продажи, содержащие информацию о показаниях, использовании, дозах, приеме, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, которые касаются использования таких терапевтических продуктов.

В любом из предшествующих применений или способов субъектом может представлять собой человека.

Полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева.

Также описаны выделенные полинуклеотиды, которые кодируют антитела к CD3 по изобретению или биспецифические антитела, содержащие первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген по изобретению. Выделенные полинуклеотиды, способные кодировать вариабельные домены, предложенные в настоящем документе, могут быть включены в одни и те же или разные векторы для получения антител или антигенсвязывающих фрагментов по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды по изобретению включают полинуклеотид, кодирующий лидерную последовательность. Можно использовать любую лидерную последовательность, известную в данной области. Полинуклеотид, кодирующий лидерную последовательность, может включать сайт расщепления рестрикционной эндонуклеазы или сайт инициации трансляции.

Также предложены векторы, содержащие полинуклеотиды по изобретению. Векторы могут представлять собой экспрессионные векторы. Экспрессионный вектор может содержать одну или более дополнительных последовательностей, например, без ограничений регуляторные последовательности (например, промотор, энхансер), маркер селекции и сигнал полиаденилирования. Векторы для трансформации широкого спектра клеток-хозяев широко известны, и к ним относятся без ограничений плазмиды, фагмиды, космиды, бакуловирусы, бакмиды, искусственные бактериальные хромосомы (ВАС), искусственные дрожжевые хромосомы (YAC), а также другие бактериальные, дрожжевые и вирусные векторы.

К рекомбинантным векторам экспрессии, входящим в объем описания, относятся синтетические или происходящие от кДНК фрагменты нуклеиновых кислот, которые кодируют по меньшей мере один рекомбинантный белок, который может быть функционально связан с приемлемыми регуляторными элементами. К таким регуляторным элементам могут относиться промотор транскрипции, последовательности, кодирующие приемлемые участки связывания мРНК с рибосомой, и последовательности, контролирующие терминацию транскрипции и трансляции. Экспрессионные векторы, особенно экспрессионные векторы млекопитающих, также могут включать в себя один или более нетранскрибируемых элементов, например точку начала репликации, приемлемый промотор и энхансер, связанные с экспрессируемым геном, другие 5' или 3' фланкирующие нетранскрибируемые последовательности, 5' или 3' нетранслируемые последовательности (например, необходимые участки связывания с рибосомой), сайт полиаденилирования, донорный и акцепторный сайты сплайсинга или последовательности терминации транскрипции. Кроме того, может быть встроена точка начала репликации, обеспечивающая способность к репликации в клетке-хозяине.

Последовательности контроля транскрипции и трансляции в экспрессионных векторах, предназначенных для трансформации клеток позвоночных, могут быть получены из вирусных источников. Примеры векторов, которые можно сконструировать, описаны в публикации Okayama and Berg, 3 Mol. Cell. Biol., 280 (1983).

- 25 045935

В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую антитело или антигенсвязывающий фрагмент, помещают под контроль эффективного конститутивного промотора, такого как, например, промоторы следующих генов: гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), аденозиндезаминазы, пируваткиназы, бета-актина, человеческого миозина, человеческого гемоглобина, человеческого мышечного креатина и других. Кроме того, многие вирусные промоторы функционируют конститутивно в эукариотических клетках и являются приемлемыми для применения в описанных вариантах осуществления. К таким вирусным промоторам относятся без ограничений немедленноранний промотор цитомегаловируса (CMV), ранний и поздний промоторы SV40, промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), длинные концевые повторы (LTR) вируса лейкоза Малони, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса Эпштейна-Барр (EBV), вируса саркомы Рауса (RSV) и других ретровирусов и промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса. В одном варианте осуществления кодирующую последовательность PSMA-специфического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента находится под контролем индуцибельного промотора, например, промотора металлотионеина, промотора, индуцируемого тетрациклином, промотора, индуцируемого доксициклином, промоторов, содержащих один или более интерферон-стимулируемых реагирующих элементов (ISRE), промоторов протеинкиназы R 2',5'-олигоаденилатсинтаз, генов Мх, ADAR1 и т.п.

Векторы, описанные в настоящем документе, могут содержать один или более участков внутренней посадки рибосомы (IRES). Включение последовательности IRES в слитые векторы может быть полезно для усиления экспрессии некоторых белков. В некоторых вариантах осуществления векторная система может включать в себя один или более участков полиаденилирования (например, SV40), которые могут находиться выше или ниже любой из вышеупомянутых последовательностей нуклеиновых кислот. Компоненты вектора могут быть сшиты друг с другом или расположены так, чтобы обеспечить оптимальное разнесение в пространстве для экспрессии генных продуктов (т.е. путем введения спейсерных нуклеотидов между открытыми рамками считывания (ORF)), или расположены другим способом. Регуляторные элементы, такие как мотив IRES, также могут быть расположены с возможностью обеспечения оптимального разнесения в пространстве для экспрессии.

Векторы могут содержать селективные маркеры, хорошо известные в данной области. Селективные маркеры включают в себя маркеры положительной и отрицательной селекции, гены резистентности к антибиотикам (например, ген резистентности к неомицину, ген резистентности к гигромицину, ген резистентности к канамицину, ген резистентности к тетрациклину, ген резистентности к пенициллину), гены глутаматсинтазы, HSV-TK, производные HSV-TK для ганцикловирной селекции или ген бактериальной пуриннуклеозидфосфорилазы для селекции по 6-метилпурину (Gadi et al., 7, Gene Ther., 1738-1743 (2000)). Нуклеотидная последовательность, кодирующая селективный маркер или сайт клонирования, может располагаться выше или ниже нуклеотидной последовательности, кодирующей интересующий полипептид или сайт клонирования.

Векторы, описанные в настоящем документе, можно использовать для трансформации различных клеток генами, кодирующими описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты. Например, векторы можно использовать для создания антител к CD3, к PSMA, к CD33, к TMEFF2 или к IL1RAP или клеток, продуцирующих антигенсвязывающий фрагмент. Таким образом, в изобретении также предложена клетка-хозяин, содержащая векторы по изобретению.

В данной области известны многочисленные способы внедрения в клетки чужеродных генов, и их можно использовать для конструирования рекомбинантных клеток в целях осуществления описанных способов в соответствии с различными вариантами осуществления, описанными и подтвержденными примерами в настоящем документе. Используемая методика должна обеспечивать стабильный перенос гетерологичной последовательности гена в клетку-хозяина таким образом, чтобы гетерологичная последовательность гена могла наследоваться и экспрессироваться потомством клетки, и таким образом, чтобы не нарушалось необходимое развитие и физиологические функции клеток-реципиентов. К методикам, которые можно использовать, относятся без ограничений перенос хромосом (например, слияние клеток, опосредованный хромосомами перенос генов, опосредованный микроклетками перенос генов), физические способы (например, трансфекция, слияние со сферопластом, микроинъекция, электропорация, липосомный носитель), вирусный перенос вектора (например, рекомбинантные ДНКвирусы, рекомбинантные РНК-вирусы) и т.п. (описано в публикации Cline, 29, Pharmac. Ther., 69-92 (1985)). Для трансформации клеток также можно применять кальций-фосфатную преципитацию и индуцированное полиэтиленгликолем (ПЭГ) слияние бактериальных протопластов с клетками млекопитающих.

К клеткам, подходящим для применения в экспрессии антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, предпочтительно относятся эукариотические клетки, более предпочтительно клетки, происходящие от растения, грызуна или человека, например, без ограничений, клеточные линии NSO, СНО, CHOK1, perC.6, Tk-ts13, BHK, клетки HEK 293, cOs-7, T98G, CV-1/EBNA, L-клетки, С127, 3Т3, HeLa, NS1, миеломные клетки Sp2/0, BHK и др. Кроме того, экспрессию антител можно осуществлять с применением гибридомных клеток. Способы получения гибридом хорошо известны в данной области.

- 26 045935

Клетки, трансформированные векторами экспрессии по изобретению, можно подвергнуть селекции или скринингу в отношении рекомбинантной экспрессии антител или антигенсвязывающих фрагментов по изобретению. Положительные по рекомбинации клетки размножают и проводят скрининг субклонов, проявляющих нужный фенотип, например высокий уровень экспрессии, усиленные характеристики роста или способность вырабатывать белки с нужными биохимическими свойствами, например, вследствие модификации белков или видоизмененных посттрансляционных модификаций. Эти фенотипы могут быть обусловлены внутренними свойствами данного субклона или мутацией. Мутации можно осуществлять путем применения химических агентов, УФ-света, радиации, вирусов, инсерционных мутагенов, ингибирования восстановления ошибок спаривания ДНК или комбинации таких способов.

Фармацевтические композиции/введение.

В изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие антитела по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Для терапевтического применения возможна подготовка антител по изобретению в виде фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество антитела в качестве активного ингредиента в фармацевтически приемлемом носителе. Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или несущей среде, с которыми вводят антитело настоящего изобретения. Такие несущие среды могут представлять собой жидкости, такие как вода и масла, включая масла минерального, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Например, можно применять 0,4%-ный солевой раствор и 0,3%-ный раствор глицина. Эти растворы стерильны и по существу не содержат твердых частиц. Их стерилизацию можно проводить с использованием общепринятых, хорошо известных способов стерилизации (например, фильтрации). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как регулирующие рН и буферные агенты, стабилизирующие, загущающие, увлажняющие и окрашивающие агенты и т.д. Концентрация антител по изобретению в таком фармацевтическом составе может варьировать от менее около 0,5%, обычно по меньшей мере около 1 и до 15 или 20 вес.%, и может выбираться преимущественно на основании необходимой дозы, объемов текучей среды, значений вязкости и т.д. в соответствии с конкретным выбранным способом введения. Приемлемые несущие среды и составы, включающие другие человеческие белки, например сывороточный альбумин человека, описаны, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21-е издание, под ред. Troy, D.B., Lipincott Williams and Wilkins, г. Филадельфия, штат Пенсильвания, 2006 г., часть 5, Pharmaceutical Manufacturing, с. 691-1092, см. особенно с. 958-989.

Способом введения для терапевтического применения антител по изобретению может служить любой приемлемый путь доставки антитела в организм-хозяин, такой как парентеральное введение, например, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное или подкожное, легочное, чресслизистое (пероральное, интраназальное, интравагинальное, ректальное), в виде состава в таблетке, капсуле, растворе, порошке, геле, частице; и введение антитела, содержащегося в шприце, имплантированном устройстве, осмотическом насосе, картридже, микронасосе или же с помощью других средств, которые хорошо известны в данной области и очевидны для квалифицированного специалиста. Локализованное введение можно обеспечить, например, посредством доставки в опухоль, сустав, бронхи, брюшную полость, капсулу, хрящ, полость, мозжечок, желудочек мозга, толстую кишку, шейку матки, желудок, печень, миокард, кость, таз, перикард, полость живота, плевру, предстательную железу, легкие, прямую кишку, почку, сетчатку, позвоночник, суставную сумку, грудную клетку, матку, сосуд, внутрь мочевого пузыря, поврежденную ткань, вагинально, ректально, буккально, сублингвально, интраназально или трансдермально.

Антитела по изобретению можно вводить субъекту любым подходящим путем, например, парентерально путем внутривенной (в/в) инфузии или болюсной инъекции, внутримышечно, подкожно или внутрибрюшинно. Внутривенная инфузия может продолжаться, например, 15, 30, 60, 90, 120, 180 или 240 мин или от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 ч.

Доза, вводимая субъекту, является достаточной для ослабления или, по меньшей мере, частичного торможения заболевания, лечение которого осуществляется (терапевтически эффективное количество), и может иногда составлять от 0,005 мг до около 100 мг/кг, например от около 0,05 мг до около 30 мг/кг, или от около 5 мг до около 25 мг/кг, или около 4 мг/кг, около 8 мг/кг, около 16 мг/кг или около 24 мг/кг, или, например, около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/кг, но может быть даже выше, например, около 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг.

Также можно вводить фиксированную стандартную дозу, например, 50, 100, 200, 500 или 1000 мг, или доза может быть основана на площади поверхности тела пациента, например, 500, 400, 300, 250, 200 или 100 мг/м² Для лечения пациенту обычно можно вводить от 1 до 8 доз (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8), но можно вводить и 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более доз.

Введение антител по изобретению можно повторять через одни сутки, двое суток, трое суток, четверо суток, пять суток, шесть суток, одну неделю, две недели, три недели, один месяц, пять недель,

- 27 045935 шесть недель, семь недель, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, шесть месяцев или более. Также возможны повторные курсы лечения в виде длительного введения. Повторное введение можно проводить в той же дозе или в другой дозе. Например, описанные в данном документе антитела по изобретению можно вводить в дозе 8 или 16 мг/кг с недельным интервалом в течение 8 недель с последующим введением в дозе 8 или 16 мг/кг каждые две недели в течение дополнительные 16 недель с последующим введением в дозе 8 или 16 мг/кг каждые четыре недели путем внутривенной инфузии.

Например, антитела в способах, описанных в настоящем документе, могут быть предоставлены в виде суточной дозы в количестве около 0,1-100 мг/кг, например, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг в сутки, по меньшей мере в одни из суток 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 или альтернативно по меньшей мере в одну из недель 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 после начала лечения или в любой их комбинации с применением одной или разделенных доз каждые 24, 12, 8, 6, 4 или 2 ч, или в любой их комбинации.

Антитела в способах, описанных в настоящем документе, также можно вводить профилактически, чтобы снизить риск развития злокачественного новообразования, замедлить начало развития событий при прогрессировании злокачественного новообразования и/или снизить риск рецидива в случае ремиссии злокачественного новообразования.

Предложенные в данном документе антитела могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед применением. Было показано, что эта методика эффективна для стандартных белковых препаратов и можно использовать хорошо - известные методики лиофилизации и восстановления.

Способы обнаружения CD3, PSMA, CD33, IL1RAP, TMEFF2 или целевого антигена и CD3.

В данном документе предложены способы обнаружения CD3, PSMA, CD33, TMEFF2 или IL1RAP в образце, включающие получение образца, приведение образца в контакт с антителом к CD3, к PSMA, к CD33, к TMEFF2 или к IL1RAP по изобретению и обнаружение антитела, связанного с CD3, PSMA, CD33, TMEFF2 или IL1RAP в образце.

Дополнительно предложены способы обнаружения CD3 и второго антигена (например, PSMA, CD33, TMEFF2 или IL1RAP) в образце, включающие получение образца, приведение образца в контакт с биспецифическим антителом, содержащим первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген, и обнаружение антитела, связанного с CD3 и вторым антигеном в образце.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, образец можно получать из мочи, крови, сыворотки, плазмы, слюны, асцитной жидкости, циркулирующих клеток, циркулирующих опухолевых клеток, клеток, не связанных с тканями (т.е. свободных клеток), тканей (например, хирургически иссеченной ткани опухоли, биоптатов, включая полученные с помощью тонкоигольной аспирационной биопсии), гистологических препаратов и т.п.

Антитела изобретения могут быть обнаружены с использованием известных способов. Примеры способов включают в себя прямое мечение антител с использованием флуоресцентных или хемилюминесцентных меток или радиоактивных меток или присоединение к антителам по изобретению легко обнаруживаемой функциональной группы, такой как биотин, ферменты или эпитопные метки. Примерами меток и функциональных групп являются рутений, In-DOTA, '[пдиэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA), пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и бетагалактозидаза, полигистидин (HIS-метка), акридиновые красители, цианиновые красители, флуороновые красители, оксазиновые красители, фенантридиновые красители, родаминовые красители и красители Alexafluor®.

Предложенные в настоящем документе антитела могут быть использованы в различных анализах для обнаружения CD3, PSMA, CD33, IL1RAP, TMEFF2 или CD3 и второго антигена в образце. Примерами анализов являются анализ методом вестерн-блоттинга, радиоиммунологический анализ, поверхностный плазмонный резонанс, иммунопреципитация, равновесный диализ, иммунодиффузия, электрохемилюминесцентный (ECL) иммуноанализ, иммуногистохимический анализ, сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS) или твердофазный ИФА.

Наборы антител.

В изобретении также предложен набор, содержащий одно или более из антител к CD3, к PSMA, к CD33, к TMEFF2 или к IL1RAP, или биспецифических антител, содержащих первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген по изобретению или его антигенсвязывающие фрагменты. Описанные наборы можно использовать для осуществления способов применения антител к CD3, к PSMA, к CD33, антител к TMEFF2 или к IL1RAP, или биспецифических антител, содержащих первый домен, который специфически связывается с CD3, и второй домен, который специфически связывается со вторым антигеном по изобретению, или других способов, известных специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления описанные наборы могут содержать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в

- 28 045935 настоящем документе, и реагенты, предназначенные для применения в обнаружении присутствия CD3 или второго антигена, такого как PSMA, CD33, IL1RAP, TMEFF2, в биологическом образце. Соответственно описанные наборы могут содержать одно или более антител, или его(их) антигенсвязывающий(ые) фрагмент(ы), описанный(ые) в настоящем документе, и сосуд для хранения антитела или фрагмента, когда они не применяются, инструкции по применению антитела или фрагмента, антитело или фрагмент, иммобилизованные на твердой подложке, и/или меченые с возможностью обнаружения формы антитела или фрагмента, как описано в настоящем документе.

В изобретении также предложен набор, содержащий описанное в настоящем документе антитело, которое специфически связывает PSMA. В изобретении также предложен набор, содержащий описанное в настоящем документе антитело, которое специфически связывает CD33. В изобретении также предложен набор, содержащий описанное в настоящем документе антитело, которое специфически связывает IL1RAP. В изобретении также предложен набор, содержащий описанное в настоящем документе антитело, которое специфически связывает TMEFF2.

Набор можно применять для терапевтических областей применения и в виде диагностических наборов.

Набор можно применять для обнаружения присутствия CD3, PSMA, CD33, IL1RAP, TMEFF2 и/или второго антигена в биологическом образце.

В некоторых вариантах осуществления набор содержит антитело по изобретению, описанное в настоящем документе, и реактивы для обнаружения антитела. Набор может содержать один или более из других элементов: инструкцию по применению; другие реагенты, например метку, терапевтический агент или агент, используемый для хелатирования или иного сочетания, антитело для мечения, или терапевтический агент, или радиозащитную композицию; устройства или другие материалы для подготовки антитела к введению; фармацевтически приемлемые носители и устройства или другие материалы для введения пациенту.

В некоторых вариантах осуществления набор содержит антитело по изобретению, находящееся в контейнере, и инструкции по применению набора.

В некоторых вариантах осуществления антитело в наборе является меченым.

CD3-специфичесkие антитела.

В настоящем документе описаны выделенные антитела к CD3. Антитела к CD3 по изобретению связывают CD3 человека и необязательно CD3 яванского макака. В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 по изобретению и их фрагменты связывают CD3 человека и яванского макака с аффинностями в пределах 5 раз относительно друг друга. Другими словами, кратность разницы в связывании антител равна менее 5. В этом случае антитело к CD3 по изобретению можно использовать как для доклинической оценки безопасности, активности и/или фармакокинетического профиля CD3 у приматов, так и в качестве лекарственного средства для людей. Другими словами, одна и та же CD3специфическая молекула может применяться в доклинических исследованиях на животных, а также в клинических исследованиях с участием людей. Эта перекрестная реактивность между человеком и макаком приводит к очень сопоставимым результатам и значительно более высокой прогностической способности исследований на животных по сравнению с видоспецифическими суррогатными молекулами. В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и их фрагменты по изобретению связывают эпитоп, образованный субъединицами CD3e/d. CD3-специфичесkие антитела могут быть человеческими, гуманизированными или химерными. В качестве примера в настоящем документе также приводятся человеческие антитела, полученные в OmniRat (Open Monoclonal Technologies (OMT), г. Пало-Альто, штат Калифорния, США, omniab.com).

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, антитело к CD3 или его фрагмент имеет одно, два, три, четыре или пять из следующих свойств:

a) связывает CD3+ Т-лимфоциты человека и Масаса fascicularis с расчетной ЕС50 20 нМ или менее и связывает клетки HEK, экспрессирующие CD3 Масаса fascicularis, с расчетной ЕС50 40 нМ или менее, причем разница в расчетных ЕС50 между связыванием CD3+ Т-лимфоцитов и связыванием клеток HEK, экспрессирующих CD3 Масаса fascicularis, составляет менее 5 раз, и при этом расчетную ЕС50 измеряют в анализе связывания с цельными клетками при 0°С с использованием проточной цитометрии;

b) связывает рекомбинантный CD3d от человека (SEQ ID NO: 691) или связывает рекомбинантный CD3e от человека (SEQ ID NO: 636), или связывает рекомбинантный CD3e от Масаса fascicularis (SEQ ID NO: 693) с равновесной константой диссоциации (K_D) 12 нМ или менее, причем K_D измеряют с помощью анализа методом поверхностного плазмонного резонанса использованием системы ProteOn XPR36 при +25°С;

c) демонстрирует отсутствие окисления метионина или триптофана, или отсутствие деамидирования аспарагина, или демонстрирует отсутствие изомеризации аспарагина по результатам анализа методом пептидного картирования;

d) связывает остатки 1-6 CD3e при определении с помощью рентгенокристаллографии; или

e) активирует Т-клетки или индуцируют экспрессию CD69 в той же степени, что и cOKT3 или SP34-2 при определении с помощью анализа методом клеточной сортировки с активацией

- 29 045935 флуоресценции.

Антитела к CD3 и их фрагменты по изобретению имеют аффинность связывания in vitro (Kd) с человеческими Т-клетками, экспрессирующими CD3 человека, которая составляет от около 5 нМ до около 1000 нМ, предпочтительно от около 5 нМ до около 50 нМ, от около 50 нМ до около 100 нМ, от около 100 нМ до около 200 нМ, от около 200 нМ до около 300 нМ, от около 300 нМ до около 400 нМ, от около 400 нМ до около 500 нМ, от около 500 нМ до около 600 нМ, от около 600 нМ до около 700 нМ, от около 700 нМ до около 800 нМ, от около 800 нМ до около 900 нМ и от около 900 нМ до около 1000 нМ, более предпочтительно от около 5 нМ до около 300 нМ при определении с помощью проточной цитометрии.

В некоторых аспектах антитела к CD3 и их фрагменты по изобретению представляют собой двухвалентные антитела, имеющие аффинность связывания in vitro (Kd) с человеческими Т-клетками, экспрессирующими CD3 человека, которая составляет от около 5 нМ до около 1000 нМ, предпочтительно от около 5 нМ до около 50 нМ, от около 50 нМ до около 100 нМ, от около 100 нМ до около 200 нМ, от около 200 нМ до около 300 нМ, от около 300 нМ до около 400 нМ, от около 400 нМ до около 500 нМ, от около 500 нМ до около 600 нМ, от около 600 нМ до около 700 нМ, от около 700 нМ до около 800 нМ, от около 800 нМ до около 900 нМ и от около 900 нМ до около 1000 нМ, более предпочтительно от около 5 нМ до около 300 нМ, наиболее предпочтительно около 100 нМ при определении с помощью проточной цитометрии.

В некоторых аспектах антитела к CD3 и их фрагменты по изобретению представляют собой одновалентные конструкты, имеющие аффинность связывания in vitro (K_d) с человеческими Т-клетками, экспрессирующими CD3 человека, которая составляет от около 5 нМ до около 1000 нМ, предпочтительно от около 5 нМ до около 50 нМ, от около 50 нМ до около 100 нМ, от около 100 нМ до около 200 нМ, от около 200 нМ до около 300 нМ, от около 300 нМ до около 400 нМ, от около 400 нМ до около 500 нМ, от около 500 нМ до около 600 нМ, от около 600 нМ до около 700 нМ, от около 700 нМ до около 800 нМ, от около 800 нМ до около 900 нМ и от около 900 нМ до около 1000 нМ, более предпочтительно от около 100 нМ до около 250 нМ, наиболее предпочтительно около 250 нМ при определении с помощью проточной цитометрии.

В одном аспекте антитела к CD3 и их фрагменты, описанные в настоящем документе, конкурируют с коммерческим антителом к CD3 SP34-2 (BD Biosciences 551916) за связывание с CD3, как определено с помощью анализа конкурентного связывания с использованием конъюгированного с AlexaFluor 488 антитела SP34-2 на первичных человеческих Т-клетках при измерении с помощью проточной цитометрии.

В одном аспекте антитела к CD3 и их фрагменты не демонстрируют посттрансляционной модификации, включая отсутствие окисления, отсутствие деамидирования и отсутствие изомеризации аспартата при определении методом пептидного картирования.

В одном аспекте антитела к CD3 и их фрагменты эффективны для активации Т-клеток и индуцирования экспрессии CD69 в той же степени, что и SP34-2, в Т-клетках человека и яванского макака и cOKT3 в Т-клетках человека, при определении посредством Т-клеточного анализа с использованием проточной цитометрии.

В одном аспекте антитела к CD3 и их фрагменты, описанные в настоящем документе, имеют общую энтальпию разворачивания около 400 ккал/моль или более, около 410 ккал/моль или более, около 420 ккал/моль или более, около 430 ккал/моль или более, около 440 ккал/моль или более, около ккал/моль или более, около 460 ккал/моль или более, около 470 ккал/моль или более, около

480 ккал/моль или более, около 490 ккал/моль или более, около 500 ккал/моль или более, около

510 ккал/моль или более, около 520 ккал/моль или более, около 530 ккал/моль или более, около

540 ккал/моль или более или около 550 ккал/моль или более. В определенных аспектах антитела к CD3 и их фрагменты по изобретению имеют общую энтальпию разворачивания около 418 ккал/моль, 545 ккал/моль, около 402 ккал/моль или около 406 ккал/моль, а антитела к CD3 представляют собой молекулы CD3B376 (IgG4 PAA), CD3B450 (IgG4 PAA), CD3B389 (IgG1sigma) и CD3B467 (IgGlsigma) соответственно.

Примеры таких антител включают CD3B311, CD3B312, CD3B313, CD3B314, CD3B315, CD3B316, CD3B317, CD3B334, CD3B376 CD3B389, CD3B450 и CD3B467, и CD3B376 и CD3B450, сконструированные в одновалентный формат.

Антитела к CD3 или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению могут присутствовать в различных формах, но будут содержать один или более сегментов вариабельного домена или CDR антитела, приведенных в табл. 7А, и их сконструированных вариантов, например, приведенных или описанных в табл. 9 и 10, и в сопровождающих их описаниях.

В изобретении также предложено антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее тяжелую цепь, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 любого из антител, описанных в табл. 7В. В изобретении также предложено антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее тяжелую цепь, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 любого из антител, описанных в табл. 7В, и легкую цепь, содержащую LCDR1, a LCDR2 и LCDR3 любого из антител, описанных в

- 30 045935 табл. 7В. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению конкурирует за связывание с CD3 с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 любого из антител, описанных в табл. 7В, и легкую цепь, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 любого из антител, описанных в табл. 7В.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи (VH) с SEQ ID NO: 651, 652, 653, 654, 655, 687 или 656, при этом HCDR1, HCDR2 и HCDR3 определены по Chothia, Kabat или IMGT.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащиеся в вариабельной области легкой цепи (VL) с SEQ ID NO: 658, 659, 694, 660, 688, или 661, при этом LCDR1, LCDR2 и LCDR3 определены по Chothia, Kabat или IMGT.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит

HCDR1 с SEQ ID NO: 662, 665, или 666;

HCDR2 с SEQ ID NO: 663, 689 или 695; и

HCDR3 с SEQ ID NO: 664.

LCDR1 с SEQ ID NO: 773, 710, 674 или 671;

LCDR2 с SEQ ID NO: 669 или 673; и

LCDR3 с SEQ ID NO: 670.

HCDR1 с SEQ ID NO: 662, 665 или 666;

HCDR2 с SEQ ID NO: 663, 689 или 695;

HCDR3 с SEQ ID NO: 664;

LCDR1 с SEQ ID NO: 773, 710, 674 или 671;

LCDR2 с SEQ ID NO: 669 или 673; и

LCDR3 с SEQ ID NO: 670.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с

SEQ ID NO: 662, 663 и 664 соответственно;

SEQ ID NO: 662, 695 и 664 соответственно;

SEQ ID NO: 665, 663 и 664 соответственно;

SEQ ID NO: 665, 695 и 664 соответственно;

SEQ ID NO: 662, 689 и 664 соответственно;

SEQ ID NO: 666, 663 и 664 соответственно;

SEQ ID NO: 666, 695 и 664 соответственно

SEQ ID NO: 665, 689 и 664 соответственно; или

SEQ ID NO: 666, 689, 664 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с

SEQ ID NO: 773, 669 и 670 соответственно;

SEQ ID NO: 773, 673 и 670 соответственно;

SEQ ID NO: 710, 673 и 670 соответственно;

SEQ ID NO: 674, 673 и 670 соответственно;

SEQ ID NO: 671, 673 и 690 соответственно;

SEQ ID NO: 773, 673 и 690 соответственно;

SEQ ID NO: 671, 669 и 670 соответственно; или

SEQ ID NO: 776, 673 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 773, 669 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 773, 673 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 669 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по

- 31 045935 изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 695, 664, 773, 669 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 695, 664, 773, 673 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 695, 664, 671, 669 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 695, 664, 671, 673 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 665, 663, 664, 773, 669 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 665, 663, 664, 773, 673 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 665, 663, 664, 671, 669 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 665, 663, 664, 671, 673 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 665, 695, 664, 773, 669 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 665, 695, 664, 773, 673 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 665, 695, 664, 776, 669 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 665, 695, 664, 776, 673 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 666, 663, 664, 773, 669 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 666, 663, 664, 773, 673 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 666, 663, 664, 776, 669 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 666, 663, 664, 671, 673 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 666, 695, 664, 773, 669 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 666, 695, 664, 773, 673 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 666, 695, 664, 671, 669 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 666, 695, 664, 671, 673 и 670 соответственно.

- 32 045935

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 689, 664, 671, 673 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 710, 673 и 670 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 773, 673 и 690 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит последовательность тяжелой цепи (НС) с SEQ ID NO: 709, 640, 641, 642, 643, 675 или 644 и/или последовательность легкой цепи (LC) с SEQ ID NO: 645, 716, 649, 676, 677, или 650. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит НС, имеющую полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 709, 640, 641, 642, 643, 675 или 644, и LC, имеющую полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 645, 716, 649, 676, 677 или 650. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит НС, имеющую полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 709, 640, 641, 642, 643, 675 или 644, и LC, имеющую полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 645, 716, 649, 676, 677 или 650, причем изменение последовательности не происходит в области CDR.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) с SEQ ID NO: 651, 652, 657, 653, 654, 655, 687 или 656, и/или последовательность вариабельной области легкой цепи (VL) с SEQ ID NO: 658, 659, 694, 660, 688, 678 или 661. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит VH, имеющую полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 651, 652, 657, 653, 654, 655, 687 или 656, и VL, имеющую полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична

SEQ ГО NO 658, 659, 694, 660, 688, 678 или 661. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит VH, имеющую полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 651, 652, 657, 653, 654, 655, 687, или 656, и VL, имеющую полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или более, например, на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична

SEQ ID NO: 658, 659, 694, 660, 688, 678, или 661, причем изменение последовательности не происходит в области CDR.

PSMA-специфические антитела.

Антитела и их фрагменты, которые связываются с PSMA, связываются с целевым антигеном шимпанзе. В одном варианте осуществления антитела и их фрагменты связываются с целевыми антигенами PSMA человека и макака с аффинностями в пределах 5 раз относительно друг друга. Другими словами, кратность разницы в связывании антител равна менее 5. В этом случае идентичную молекулу антитела можно использовать как для доклинической оценки безопасности, активности и/или фармакокинетического профиля PSMA у приматов, так и в качестве лекарственного средства для людей. Другими словами, одна и та же PSMA-специфическая молекула может применяться в доклинических исследованиях на животных, а также в клинических исследованиях с участием людей. Это приводит к очень сопоставимым результатам и значительно более высокой прогностической способности исследований на животных по сравнению с видоспецифическими суррогатными молекулами. Поскольку домен PSMA обладает межвидовой специфичностью, то есть реагирует с антигенами человека и макака, антитело или его фрагменты по изобретению можно использовать как для доклинической оценки безопасности, активности и/или фармакокинетического профиля этих связывающих доменов у приматов, так и (в идентичной форме) как лекарственное средство для людей.

- 33 045935

В настоящем изобретении также предложены мультиспецифические антитела, которые специфически связываются с PSMA. Согласно изобретению биспецифическое, то есть бифункциональное, антитело можно использовать для воздействия на две разные терапевтические мишени или для выполнения двух разных функций. Такие антитела можно использовать, например, для рекрутирования иммунной эффекторной клетки, например, Т-или NK-клетки, к конкретной клеткемишени. Известны и исследуются различные молекулы на основе фрагментов антител, например, для лечения злокачественного новообразования.

В настоящем изобретении также предложено биспецифическое антитело к PSMA х эффекторному антигену. В одном варианте осуществления эффекторный антиген для биспецифического антитела к PSMA х эффекторному антигену представляет собой CD3. В настоящем изобретении было обнаружено, что можно получить биспецифическое антитело к PSMAxCD3, в котором идентичная молекула может быть использована в доклинических исследования на животных, а также в клинических исследованиях и даже в терапии у людей. Это связано с идентификацией биспецифического антитела к PSMAxCD3, которое, помимо связывания с PSMA человека и CD3 человека, соответственно, также связывается с гомологами антигенов шимпанзе и макак. Биспецифическое антитело к PSMAxCD3 по изобретению можно использовать в качестве терапевтического агента против различных заболеваний, включая, но не ограничиваясь, злокачественное новообразование. Ввиду вышеизложенного отпадает необходимость в конструировании суррогатного целевого биспецифического антитела к PSMAxCD3 для тестирования на филогенетически далеких (от человека) видах. В результате идентичная молекула может использоваться в доклинических исследованиях на животных, поскольку предназначена для введения людям в клинических испытаниях, а также после регистрации и одобрения Управлением по контролю за изделиями медицинского назначения.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в данном документе, выделенное антитело или его фрагмент антитела, которое специфически связывает PSMA, имеет одно, два, три, четыре или пять из следующих свойств:

а) связывает внеклеточный домен (ВКД) PSMA Pan troglodytes с равновесной константой диссоциации (KD) 25 нМ или менее, при этом KD измеряется с использованием системы ProteOn XPR36 при +25°С;

b) связывает клетки LNCaP с расчетной ЕС50 20 нМ или менее и связывает клетки HEK, экспрессирующие PSMA Macaca fascicularis, с расчетной ЕС50 40 нМ или менее, при этом разница в расчетных ЕС50 между связыванием клеток LNCaP и связыванием клеток HEK, экспрессирующих PSMA Macaca fascicularis, составляет менее 5 раз, и при этом расчетную ЕС50 измеряют в анализе связывания с цельными клетками при 0°С с использованием проточной цитометрии;

c) связывает ВКД рекомбинантного PSMA от человека (SEQ ID NO: 55), Pan troglodytes (SEQ ID NO: 52) и Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 53) с равновесной константой диссоциации (KD) 12 нМ или менее, при этом KD измеряют с помощью анализа методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием системы ProteOn XPR36 при+25°С;

d) демонстрирует опосредованное Т-клетками уничтожение клеток LNCaP, клеток С42, клеток HEK, экспрессирующих PSMA человека, или клеток HEK, экспрессирующих PSMA Macaca fascicularis, при объединении в пару биспецифического антитела с антителом к CD3, при этом опосредованное Т-клетками уничтожение измеряется по высвобождению хрома-51 или при помощи анализа активации каспазы 3/7; или

e) распознает конформационный эпитоп, при этом эпитоп состоит из остатков I138, F235, Р237, G238, D244, Y299, Y300, Q303, K304, Е307 и К324-Р326 PSMA человека (SEQ ID NO: 51).

Примеры таких антител или их фрагментов представляют собой антитела к PSMA PSMB119, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB87, PSMB126, PSMB127, PSMB128, PSMB129,

PSMB130, PSMB120, PSMB121, PSMB122, PSMB123, PSMB127, PSMB128, PSMB130, PSMB344,

PSMB345, PSMB346, PSMB347, PSMB349, PSMB358, PSMB359, PSMB360, PSMB361, PSMB362,

PSMB363, и PSMB365, описанные в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 56, 57, 58, 59, 60 и 61 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанного в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65, 60 и 66 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанного в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70, 71 и 72 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 73, 74, 75, 76, 60 и 61 соответственно.

- 34 045935

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 78, 79, 80, 81, 82 и 83 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 84, 85, 86, 87, 60 и 88 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 89, 90, 91, 92, 93 и 94 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанного в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 95, 96, 97, 65, 60 и 66 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 84, 98, 99, 100, 82 и 101 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 89, 90, 102, 103, 104 и 105 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 89, 90, 106, 103, 104 и 105 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 107, 108, 109, 76, 60 и 88 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 78, 1, 80, 81, 82 и 83 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 78, 1, 80, 4, 82 и 686 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 78, 1, 80, 81, 792 и 686 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 78, 2, 80, 81, 82 и 83 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 78, 3, 80, 81, 82 и 5 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 78, 3, 80, 81, 82 и 83 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 78, 3, 80, 4, 82 и 686 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 78, 3, 80, 81, 792 и 686 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 78, 2, 81, 81, 82 и 5 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 78, 2, 80, 4, 792 и 686 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1,

- 35 045935

LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 78, 683, 80, 81, 792 и 686 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA, по изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) с SEQ ID NO: 6, 7, 8, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 121, 123, 125, 126, 128, 130 или 681. В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в данном документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит вариабельную область легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 9, 111, 113, 115, 117, 119, 122, 124, 127, 129, 131 или 682.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в настоящем документе, антитело, которое специфически связывает PSMA, по изобретению, содержит последовательность тяжелой цепи с SEQ ID NO: 12, 13, 132, 134, 136, 138, 140, 141, 143, 145, 146, 148, 150, 151 или 679.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в данном документе, антитело, которое специфически связывает PSMA по изобретению, содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 14, 15, 75, 133, 135, 137, 139, 142, 144, 147, 149 или 680.

CD33-специфические антитела.

CD33-специфические антитела согласно настоящему изобретению обладают одним или более желательными функциональными свойствами, включая без ограничений высокую аффинность связывания с CD33 и/или CD3, высокую специфичность к CD33 и/или CD3 и способность лечить или предотвращать злокачественное новообразование при введении отдельно или в комбинации с другими противораковыми терапевтическими средствами.

В некоторых вариантах осуществления выделенные моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связывают С2-домен CD33. В некоторых вариантах осуществления выделенные моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связывают V-домен CD33. Полноразмерный человеческий CD33 представлен компанией Uniprot P20138 (SEQ ID NO: 244).

В контексте настоящего документа антитело, которое специфически связывается с CD33, относится к антителу, которое связывается с CD33, предпочтительно с CD33 человека, предпочтительно с С2-доменом CD33, с KD 1x10^-7 М или менее, предпочтительно 1x10^-8 М или менее, более предпочтительно 5x 10^-9 М или менее, 1x 10^-9 М или менее, 5x 10^-10 М или менее или 1 х 10^-10 М или менее.

Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, могут иметь различные формы, но будут содержать одну или более CDR антитела, как показано в табл. 34 и 35.

В настоящем документе описаны рекомбинантные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с CD33. В некоторых вариантах осуществления CD33специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой человеческий IgG или его производные. Хотя CD33-специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты, приведенные в качестве примера в настоящем документе, являются человеческими, антитела или антигенсвязывающие фрагменты, приведенные в качестве примера, можно подвергнуть химеризации.

В некоторых вариантах осуществления предлагается CD33-специфическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее тяжелую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 любого одного из антител, описанных в табл. 34. В некоторых вариантах осуществления предлагается CD33специфическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее тяжелую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 любого одного из антител, описанных в табл. 34, и легкую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 любого одного из антител, описанных в табл. 35.

В некоторых вариантах осуществления предложено CD33-специфическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, приведенную в табл. 33. В некоторых вариантах осуществления предложено CD33-специфическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область легкой цепи, приведенную в табл. 33.

Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, обсуждаемых в этом разделе и приведенных в табл. 33, подходят для включения в биспецифические конструкты. Например, в некоторых вариантах осуществления биспецифических антител к CD33, эффекторное плечо представляет собой плечо к CD3. В некоторых вариантах осуществления биспецифического антитела к CD33xCD3, плечо к CD3 содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673, и 670 соответственно. В некоторых вариантах осуществления биспецифического антитела к CD33xCD3, плечо к CD3 содержит VH и VL с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно. В некоторых вариантах осуществления биспецифического антитела к CD33xCD3, плечо к CD3 содержит НС и LC с SEQ ID NO: 640 и 676 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления биспецифического антитела к CD33xCD3, плечо к CD3 содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 773, 673 и 670 соответственно. В некоторых вариантах осуществления биспецифического антитела к CD33xCD3, плечо к CD3 содержит VH и VL с SEQ ID NO: 657 и 678 соответственно. В некоторых вариантах осуществления биспецифического антитела к CD33xCD3, плечо к CD3 содержит НС и LC с SEQ ID NO: 675 и 677 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD33 или его антигенсвязывающий фрагмент

- 36 045935 содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична SEQ ID NO: 267, 260, 275, 270, 262, 258, 257, 281, 292, 291, 261, 269, 280, 259, 263, 264, 265, 266, 272, 277, 279, 284 или 285, или вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность, которая на по меньшей мере 95% идентична SEQ ID NO: 287, 314, 309, 301, 298, 297, 290, 332, 331, 302, 310, 320, 300, 304, 305, 306, 307, 317, 319, 324 или 325; и антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую полипептидную последовательность на по меньшей мере 95% идентичную SEQ ID NO: 257 или 258, или вариабельную область легкой цепи, имеющую полипептидную последовательность на по меньшей мере 95% идентичную SEQ ID NO: 298 или 299.

IL1RAP-специфические антитела.

Используемые в настоящем документе термины акцессорный белок рецептора интерлейкина-1, IL1RAP и IL1-RAP конкретно включают человеческий белок IL1RAP (SEQ ID NO: 576), например, как описывается в каталоге Genbank под номером доступа ААВ84059, эталонная последовательность NCBI: NP_002173.1 и UniProtKB/учетный номер Swiss-Prot Q9NPH3-1 (см. также Huang et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94 (24), 12829-12832). В научной литературе IL1RAP также известен как IL1 R3, СЗогИЗ, FLJ37788, IL-1 RAcP и EG3556.

Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, могут иметь различные формы, но будут включать в себя одну или более CDR антитела, как показано в табл. 24.

В настоящем документе описаны рекомбинантные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, специфически связывающиеся с IL1RAP. В некоторых вариантах осуществления IL1RAP-специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой человеческий IgG или его производные. Хотя IL1RAP-специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты, приведенные в качестве примера в настоящем документе, являются человеческими, антитела или антигенсвязывающие фрагменты, приведенные в качестве примера, можно подвергнуть химеризации.

В некоторых вариантах осуществления предлагается IL1RAP-специфическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее тяжелую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 любого одного из антител, описанных в табл. 24. В некоторых вариантах осуществления предлагается IL1RAPспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее тяжелую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 любого одного из антител, описанных в табл. 24, и легкую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 любого одного из антител, описанных в табл. 24.

В некоторых вариантах осуществления предложено IL1RAP-специфическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи любого из антител, приведенных в табл. 25. В некоторых вариантах осуществления предложено IL1RAP-специфическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область легкой цепи любого из антител, приведенных в табл. 25. В некоторых вариантах осуществления предложено IL1RAPспецифическое антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи по любому одному из антител, приведенных в табл. 25.

Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, обсуждаемых в этом разделе и приведенных в табл. 25, подходят для включения в биспецифические конструкты, в которых нацеливающее плечо представляет собой плечо к IL1RAP. Например, в некоторых вариантах осуществления биспецифических антител к IL1RAP, эффекторное плечо представляет собой плечо к CD3. В некоторых вариантах осуществления биспецифического антитела к IL1RAPxCD3, плечо к CD3 содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 670 соответственно. В некоторых вариантах осуществления биспецифического антитела к IL1RAPxCD3, плечо к CD3 содержит VH и VL с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно. В некоторых вариантах осуществления биспецифического антитела к IL1RAPxCD3, плечо к CD3 содержит НС и LC с SEQ ID NO: 640 и 676 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления биспецифического антитела к IL1RAPxCD3, плечо к CD3 содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 773, 673 и 670 соответственно. В некоторых вариантах осуществления биспецифического антитела к IL1RAPxCD3, плечо к CD3 содержит VH и VL с SEQ ID NO: 657 и 678 соответственно. В некоторых вариантах осуществления биспецифического антитела к IL1RAPxCD3, плечо к CD3 содержит НС и LC с SEQ ID NO: 675 и 677 соответственно.

TMEFF'2-специфические антитела.

В изобретении предложено выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с мембранной проксимальной областью с SEQ ID NO: 629 TMEFF2. Антитела к TMEFF2 по изобретению, которые связывают мембранную проксимальную область TMEFF2, не интернализируются клетками. Не желая связывать себя какой-либо конкретной теорией, можно ожидать, что неинтернализирующие антитела к TMEFF2 имеют повышенный онкогенный эффект, опосредованный эффекторными функциями антитела, в результате отсутствия интернализации и деградации TMEFF2 по сравнению с интернализирующими антителами к TMEFF2.

- 37 045935

Связывается с мембранной проксимальной областью означает, что 90% остатков эпитопа антитела, идентифицированных с использованием водород-дейтериевого обмена (H/D обмен), находятся в мембранной проксимальной области TMEFF2. Остатки эпитопа представляют собой те, которые защищены тестируемым антителом за счет разницы в уровнях дейтерирования в по меньшей мере 5% посредством H/D обмена. Примерами таких антител являются ТМЕВ675, ТМЕВ570, ТМЕВ674, ТМЕВ565, ТМЕВ762 и ТМЕВ757, как описано в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент связывается в пределах остатков HGKCEHSINMQEPSC (SEQ ID NO: 592) или DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 600) с мембранной проксимальной областью TMEFF2. Иллюстративное связывание антитела к TMEFF2 в пределах остатков HGKCEHSINMQEPSC (SEQ ID NO: 592) представляет собой ТМЕВ570. Иллюстративное связывание антитела к TMEFF2 в пределах остатков DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 600) представляет собой ТМЕВ675. Ожидается, что варианты TNEB675 ТМЕВ762 и ТМЕВ757 будут связываться с мембранной проксимальной областью TMEFF2 в пределах остатков DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 600).

При анализе H/D обмена ВКД рекомбинантно экспрессированного TMEFF2 инкубируют в присутствии или в отсутствие антитела в дейтерированной воде в течение предварительно заданных периодов времени, что приводит к включению дейтерия в обмениваемые атомы водорода, не защищенные антителом, с последующим расщеплением белка протеазой и анализом пептидных фрагментов с использованием методом ЖХ-МС. Анализ H/D обмена можно проводить с использованием известных протоколов. Иллюстративный протокол описан в примере 5.

В изобретении также предложено выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конкурирует за связывание с мембранной проксимальной областью TMEFF2 с эталонным антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи (VH) с SEQ ID NO: 25 и вариабельную область легкой цепи (VL) с SEQ ID NO: 28, VH с SEQ ID NO: 589 и VL с SEQ ID NO: 29, VH с SEQ ID NO: 27 и VL с SEQ ID NO: 30, VH с SEQ ID NO: 589 и VL с SEQ ID NO: 31, VH с SEQ ID NO: 604 и VL с SEQ ID NO: 607, или VH с SEQ ID NO: 612 и VL с SEQ ID NO: 613.

Конкуренцию за связывание исследуемого антитела с мембранной проксимальной областью TMEFF2 и эталонного антитела можно анализировать in vitro с использованием хорошо известных способов. Например, связывание меченного сложным эфиром NHS MSD Sulfo-Tag исследуемого антитела с мембранной проксимальной областью TMEFF2 в присутствии немеченого эталонного антитела можно оценить при помощи анализов методом твердофазного ИФА, или Bioacore или при помощи проточной цитометрии могут быть использованы для демонстрации конкуренции. Исследуемое антитело конкурирует за связывание с TMEFF2 с эталонным антителом, если исследуемое антитело ингибирует связывание эталонного антитела с проксимальной мембранной областью TMEFF2 на 85% или более, например, на 90% или более, или 95% или более.

В изобретении также предложено выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1), HCDR2, HCDR3, определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1), LCDR2 и LCDR3 с

SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 и 22 соответственно;

SEQ ID NO: 583, 585, 16, 19, 21 и 23 соответственно;

SEQ ID NO: 582, 586, 17, 18, 588 и 24 соответственно;

SEQ ID NO: 583, 585, 16, 18, 588 и 22 соответственно; или

SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 и 603 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению связывается с мембранной проксимальной областью TMEFF2 с равновесной константой диссоциации (K_D) около 0,4х 10^-9 М или менее, при этом K_D измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса в ацетатном буфере при рН 4,5-5,0 при комнатной температуре.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с мембранной проксимальной областью TMEFF2 с K_D от около 0,1х10^-10 М до около 0,4х10^-9 М.

Аффинность антитела к мембранной проксимальной области TMEFF2 может быть определена экспериментально с использованием любого подходящего способа. Иллюстративный способ включает применение оборудования ProteOn XPR36, Biacore 3000 или KinExA, твердофазный иммуносорбентный ферментный анализ (ИФА) или анализы конкурентного связывания, известные специалистам в данной области. Измеренное значение аффинности антитела к TMEFF2 может изменяться при измерении в различных условиях (например, осмолярности, рН). Таким образом, измерения аффинности и других параметров связывания (например, K_D, K_on, и K_off), как правило, выполняют в стандартизированных условиях и с применением стандартизированного буферного раствора, такого как буферный раствор, описанный в настоящем документе. Специалистам в данной области будет понятно, что внутренняя

- 38 045935 ошибка измерений аффинности, например, с применением Biacore 3000 или ProteOn (измеряемая как стандартное отклонение, СО), как правило, для измерений может находиться в пределах 5-33%, оказываясь в границах типичных пределов обнаружения. Следовательно, термин около в отношении значения KD характеризует типичное стандартное отклонение в анализе. Например, типичное СОС для KD, равной 1х 10^-9 М, составляет до ±0,33х 10^-9 М.

В изобретении также предложено выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с мембранной проксимальной областью TMEFF2, содержащей каркас области тяжелой цепи (VH), полученный из VH3_3-23 (SEQ ID NO: 53) или VH1_1-69 (SEQ ID NO: 54).

В изобретении также предложено выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с мембранной проксимальной областью TMEFF2, содержащей каркас вариабельной области легкой цепи (VL), полученный из VKI_L11 (SEQ ID NO: 55) или VKIIII_A27 (SEQ ID NO: 591).

В изобретении также предложено выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с мембранной проксимальной областью TMEFF2, содержащей каркас VH и каркас VL, полученный из VH3_3-23 с SEQ ID NO: 53 и VKI_L11 с SEQ ID NO: 55 соответственно.

В изобретении также предложено выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с мембранной проксимальной областью TMEFF2, содержащей каркас VH и каркас VL, полученный из VH1_1-69 SEQ ID NO: 54 и VKIII_A27 с SEQ ID NO: 591 соответственно.

В изобретении также предложено выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с мембранной проксимальной областью TMEFF2, содержащей каркас VH и каркас VL, полученный из VH1_1-69 SEQ ID NO: 54 и VKI_L11 с SEQ ID NO: 55 соответственно.

Антитела, содержащие вариабельные области тяжелой или легкой цепи, полученные из конкретной последовательности каркаса или зародышевой линии, относятся к антителам, полученным из системы, которая использует гены иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, например, от трансгенных мышей, крыс или кур, или из библиотек фагового дисплея, как обсуждается в данном документе. Антитело, содержащее конкретный каркас, полученную из последовательности зародышевой линии, может содержать аминокислотные различия по сравнению с последовательностью, из которой оно было получено, из-за, например, естественно возникающих соматических мутаций или намеренно введенных замен.

В изобретении также предложено выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 и 22 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH с SEQ ID NO: 25 и VL с SEQ ID NO: 28.

В некоторых вариантах осуществления VH кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 39 и VL кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 42.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС с SEQ ID NO: 32 и LC с SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах осуществления НС кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 46 и VL кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 49.

В изобретении также предложено выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 583, 585, 16, 19, 21 и 23 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH с SEQ ID NO: 589 и VL с SEQ ID NO: 29.

В некоторых вариантах осуществления VH кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 40 и VL кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 43.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС с SEQ ID NO: 33 и LC с SEQ ID NO: 36.

В некоторых вариантах осуществления НС кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 47 и LC кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 50.

В изобретении также предложено выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 582, 586, 17, 18, 588 и 24 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH с SEQ ID NO: 27 и VL SEQ ID NO: 30.

В некоторых вариантах осуществления VH кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 41 и VL кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 44.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС с SEQ ID NO: 34 и LC с SEQ ID NO: 37.

В некоторых вариантах осуществления НС кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 48, a LC кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 51.

- 39 045935

В изобретении также предложено выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 583, 585, 16, 18, 588 и 22 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH с SEQ ID NO: 589 и VL с SEQ ID NO: 31.

В некоторых вариантах осуществления VH кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 40 и VL кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 45.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС с SEQ ID NO: 33 и LC с SEQ ID NO: 38.

В некоторых вариантах осуществления НС кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 47 и LC кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 590.

В изобретении также предложено выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 и 603 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH с SEQ ID NO: 604 и VL с SEQ ID NO: 607.

В некоторых вариантах осуществления VH кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 618, a VL кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 619.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС с SEQ ID NO: 614 и LC с SEQ ID NO: 615.

В некоторых вариантах осуществления НС кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 620, a LC кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 621.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH с SEQ ID NO: 612 и VL с SEQ ID NO: 613.

В некоторых вариантах осуществления VH кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 622, a VL кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 623.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС с SEQ ID NO: 616 и LC с SEQ ID NO: 617.

В некоторых вариантах осуществления НС кодируется полинуклеотидом с SEQ ID NO: 624, a LC кодируется полинуклеотидом, содержащим полинуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 625.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой мультиспецифическое антитело.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой биспецифическое антитело.

В некоторых вариантах осуществления выделенное биспецифическое антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент связывает Т-клеточный антиген.

В некоторых вариантах осуществления выделенное биспецифическое антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент связывает CD3.

В некоторых вариантах осуществления выделенное биспецифическое антитело к TMEFF2 или его антигенсвязывающий фрагмент связывает СЭЗ-эпсилон.

Последовательности VH, VL, HCDR, LCDR, НС и LC иллюстративных антител к TMEFF2 по настоящему изобретению показаны в табл. 53-60.

Хотя варианты осуществления, проиллюстрированные в примерах, включают пары вариабельных доменов, одну из тяжелой цепи и одну из легкой цепи, специалисту в данной области техники будет понятно, что альтернативные варианты осуществления могут включать одиночные вариабельные домены тяжелой или легкой цепи. Одиночный вариабельный домен можно использовать для скрининга вариабельных доменов, способных образовывать двухдоменный специфический антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с TMEFF2. Скрининг можно проводить посредством скрининга фагового дисплея, например, с применением иерархического двойного комбинаторного подхода, раскрытого в международной патентной публикации № WO 1992/01047. Согласно этому подходу отдельную колонию, содержащую клон либо с VH-, либо с VL-цепью, применяют для инфицирования полной библиотеки клонов, кодирующих другую цепь (VL или VH), и полученный двухцепочечный специфичный антигенсвязывающий домен отбирают в соответствии с методиками фагового дисплея, применяя известные способы и способы, описанные в настоящем документе. Следовательно, отдельные полипептидные цепи VH и VL можно использовать для идентификации дополнительных антител к TMEFF2 с использованием способов, раскрытых в международной патентной заявке № WO 1992/01047.

Биспецифические антитела к TMEFF2/CD3.

В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие первый домен, который связывает TMEFF2, и второй

- 40 045935 домен, который связывает CD3, причем антитело связывается с мембранной проксимальной мембранной TMEFF2. Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, биспецифические антитела, которые связываются с мембранной проксимальной областью TMEFF2, могут быть более эффективными в опосредованном Т-клетками уничтожении опухолевых клеток.

В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее первый домен, который связывает TMEFF2, и второй домен, который связывает CD3, при этом антитело конкурирует за связывание с мембранной проксимальной областью TMEFF2 с эталонным антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи (VH) с SEQ ID NO: 25 и вариабельную область легкой цепи (VL) с SEQ ID NO: 28, VH с SEQ ID NO: 589 и VL с SEQ ID NO: 29, VH с SEQ ID NO: 27 и VL с SEQ ID NO: 30, VH с SEQ ID NO: 589 и VL с SEQ ID NO: 31, VH с SEQ ID NO: 604 и VL с SEQ ID NO: 607, или VH с SEQ ID NO: 612 и VL c SEQ ID NO: 613.

В некоторых вариантах осуществления выделенное биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент связывает мембранную проксимальную область TMEFF2 с константой диссоциации (K_D) около 0,4х10^-9 М или менее, при этом K_D измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса в ацетатном буфере при рН 4,5-5,0 при комнатной температуре.

В некоторых вариантах осуществления выделенное биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент связывает мембранную проксимальную область TMEFF2 с K_D от около 0,1х10^-10 М до около 0,4х10^-9 М.

В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, причем первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с

SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 и 22 соответственно;

SEQ ID NO: 583, 585, 16, 19, 21 и 23 соответственно;

SEQ ID NO: 582, 586, 17, 18, 588 и 24 соответственно;

SEQ ID NO: 583, 585, 16, 18, 588 и 22 соответственно; или

SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 и 603 соответственно.

В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, при этом второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно.

В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, при этом первый домен содержит

V H с SEQ ID NO: 25 и VL с SEQ ID NO: 28;

V H с SEQ ID NO: 589 и VL с SEQ ID NO: 29;

V H с SEQ ID NO: 27 и VL с SEQ ID NO: 30;

VH с SEQ ID NO: 589 и VL с SEQ ID NO: 31;

VH с SEQ ID NO: 604 и VL с SEQ ID NO: 607; или

VH с SEQ ID NO: 612 и VL с SEQ ID NO: 613.

В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, при этом второй домен содержит

VH с SEQ ID NO: 652 и VL с SEQ ID NO: 661.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 657 и VL с SEQ ID NO: 658.

В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее первый домен, который связывает TMEFF2, и второй домен, который связывает CD3, при этом первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 и 22 соответственно, а второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно;

первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 25 и VL с SEQ ID NO: 28, и второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 652 и VL с SEQ ID NO: 661;

первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 25 и VL с SEQ ID NO: 28, и второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 657 и VL с SEQ ID NO: 678;

биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС1 с SEQ ID NO: 32, LC1 с SEQ ID NO: 35, НС2 с SEQ ID NO: 640 и LC2 с SEQ ID NO: 676; и/или биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС1 с SEQ ID NO: 32, LC1 с SEQ ID NO: 35, НС2 с SEQ ID NO: 675 и LC2 с SEQ ID NO: 677.

В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее первый домен, который связывает TMEFF2, и второй домен, который связывает CD3, при этом первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 583, 585,

- 41 045935

16, 19, 21, и 23 соответственно, а второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно;

первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 589 и VL с SEQ ID NO: 29, и второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 652 и VL с SEQ ID NO: 661;

первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 589 и VL с SEQ ID NO: 29, и второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 657 и VL с SEQ ID NO: 678; и/или биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС1 с SEQ ID NO: 33, LC1 с SEQ ID NO: 36, НС2 с SEQ ID NO: 640 и LC2 с SEQ ID NO: 676;

биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС1 с SEQ ID NO: 33, LC1 с SEQ ID NO: 36, НС2 с SEQ ID NO: 675 и LC2 с SEQ ID NO: 677.

В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее первый домен, который связывает TMEFF2, и второй домен, который связывает CD3, при этом первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 582, 586, 17, 18, 588 и 24 соответственно, а второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно;

первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 27 и VL SEQ ID NO: 30, и второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 652 и VL с SEQ ID NO: 661;

первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 27 и VL SEQ ID NO: 30, и второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 657 и VL с SEQ ID NO: 678; и/или биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС1 с SEQ ID NO: 34, LC1 с SEQ ID NO: 37, НС2 с SEQ ID NO: 640 и LC2 с SEQ ID NO: 676;

биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС1 с SEQ ID NO: 34, LC1 с SEQ ID NO: 37, НС2 с SEQ ID NO: 675 и LC2 с SEQ ID NO: 677.

В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее первый домен, который связывает TMEFF2, и второй домен, который связывает CD3, при этом первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 583, 585, 16, 18, 588 и 22 соответственно, а второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно;

первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 589 и VL с SEQ ID NO: 31, и второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 652 и VL с SEQ ID NO: 661;

первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 589 и VL с SEQ ID NO: 31, и второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 657 и VL с SEQ ID NO: 678; и/или биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС1 с SEQ ID NO: 33, LC1 с SEQ ID NO: 38, НС2 с SEQ ID NO: 640 и LC2 с SEQ ID NO: 676;

биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС1 с SEQ ID NO: 33, LC1 с SEQ ID NO: 38, НС2 с SEQ ID NO: 675 и LC2 с SEQ ID NO: 677.

В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее первый домен, который связывает TMEFF2, и второй домен, который связывает CD3, при этом первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 582, 584, 587, 18, 588 и 603 соответственно, а второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно;

первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 604 и VL с SEQ ID NO: 607, и второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 652 и VL с SEQ ID NO: 661;

первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 604 и VL с SEQ ID NO: 607, и второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 657 и VL с SEQ ID NO: 678; и/или биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС1 с SEQ ID NO: 614, LC1 с SEQ ID NO: 615, НС2 с SEQ ID NO: 640 и LC2 с SEQ ID NO: 676;

биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС1 с SEQ ID NO: 614, LC1 с SEQ ID NO: 615, НС2 с SEQ ID NO: 675 и LC2 с SEQ ID NO: 677.

первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 612 и VL с SEQ ID NO: 613, и второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 652 и VL с SEQ ID NO: 661;

первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 612 и VL с SEQ ID NO: 613, и второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 657 и VL с SEQ ID NO: 678; и/или

- 42 045935 биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС1 с SEQ ID NO: 616, LC1 с SEQ ID NO: 617, НС2 с SEQ ID NO: 640 и LC2 с SEQ ID NO: 676;

биспецифическое антитело к TMEFF2/CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит НС1 с SEQ ID NO: 616, LC1 с SEQ ID NO: 617, НС2 с SEQ ID NO: 675 и LC2 с SEQ ID NO: 677.

Варианты осуществления

В данном изобретении предложены следующие не имеющие ограничительного характера варианты осуществления.

1. Выделенное рекомбинантное антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее

a) тяжелую цепь, содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR), содержащую SEQ ID NO: 662; HCDR2, содержащую SEQ ID NO: 663; и HCDR3, содержащую SEQ ID NO: 664, и легкую цепь, содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR), содержащую SEQ ID NO: 671, lCdR2, содержащую SEQ ID NO: 673, и LCDR3, содержащую SEQ ID NO: 690;

b) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 652, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 661;

c) тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 640, и легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 676;

d) тяжелую цепь, содержащую HCDR1, содержащую SEQ ID NO: 662; HCDR2, содержащую SEQ ID NO: 663; и HCDR3, содержащую SEQ ID NO: 664, и легкую цепь, содержащую LCDR1, содержащую SEQ ID NO: 773, LCDR2, содержащую SEQ ID NO: 673, и LCDR3, содержащую SEQ ID NO: 690;

e) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 657, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 678; или

f) тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 675, и легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 678.

2. Выделенное рекомбинантное антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, причем выделенное рекомбинантное антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывает CD3d, или CD3e, или CD3e и CD3d Macaca fascicularis или человека с аффинностью связывания около 300 нМ или менее.

3. Выделенное рекомбинантное антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 2, в котором аффинность связывания составляет около 100 нМ или менее.

4. Выделенное рекомбинантное антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 2 или 3, в котором аффинность связывания измеряют с помощью проточной цитометрии или анализа методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием системы ProteOn XPR36 при +25°С.

5. Выделенное рекомбинантное антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому одному из предшествующих вариантов осуществления, в котором антитело или антигенсвязывающий фрагмент имеет одно, два, три или четыре из следующих свойств:

a) связывает CD3+ Т-лимфоциты человека и Macaca fascicularis с расчетной ЕС50 300 нМ или менее и связывает клетки HEK, экспрессирующие CD3 Macaca fascicularis, с расчетной ЕС50 300 нМ или менее, причем разница в расчетных ЕС50 между связыванием CD3+ Т-лимфоцитов и связыванием клеток HEK, экспрессирующих CD3 Macaca fascicularis, составляет менее 5 раз, и при этом расчетную ЕС50 измеряют в анализе связывания с цельными клетками при 0°С с использованием проточной цитометрии;

b) связывает рекомбинантный CD3d от человека (SEQ ID NO: 691), или связывает рекомбинантный CD3e от человека (SEQ ID NO: 636), или связывает рекомбинантный CD3d от Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 692), или связывает рекомбинантный CD3e от Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 693) с равновесной константой диссоциации (K_D) 300 нМ или менее, в котором K_D измеряют с помощью анализа методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием системы ProteOn XPR36 при +25°С;

c) связывает остатки 1-6 CD3e при определении с помощью рентгенокристаллографии; или

d) активирует Т-клетки или индуцируют экспрессию CD69 в той же степени, что и cOKT3 или SP34-2 при определении с помощью анализа методом клеточной сортировки с активацией флуоресценции.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому одному из предшествующих вариантов осуществления, содержащее по меньшей мере одну замену в константном домене антитела, причем по меньшей мере одна замена включает

a) замены в тяжелой цепи K409R, F405L или F405L и R409K;

b) замены в тяжелой цепи S228P, F234A и L235A;

c) замены в тяжелой цепи L234A, G237A, P238S, Н268А, А330 и P331S, при этом антитело относится к изотипу IgG1; или

d) замену в тяжелой цепи S228P, при этом антитело относится к изотипу IgG4, в котором нумерация остатков соответствует индексу EU.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих вариантов

- 43 045935 осуществления, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих вариантов осуществления, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL) с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно.

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих вариантов осуществления, содержащие последовательность тяжелой цепи (НС) и последовательность легкой цепи (LC) с SEQ ID NO: 640 и 676 соответственно.

10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-5, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 773, 673 и 690 соответственно.

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления 1-5, содержащие VH и VL с SEQ ID NO: 657 и 678 соответственно.

12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому одному из вариантов осуществления 1-5, содержащее НС и LC с SEQ ID NO: 675 и 677 соответственно.

13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно.

14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее VH и VL с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно.

15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее НС и LC с SEQ ID NO: 640 и 676 соответственно.

16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 773, 673 и 690 соответственно.

17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее VH и VL с SEQ ID NO: 657 и 678 соответственно.

18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее НС и LC с SEQ ID NO: 675 и 677 соответственно.

19. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором антитело является человеческим или гуманизированным.

20. Антитело по варианту осуществления 19, в котором антитело относится к изотипу IgG4 или IgG1.

21. Антитело по варианту осуществления 20, содержащее одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять замен в Fc антитела.

22. Антитело по варианту осуществления 18, содержащее

a) замены в легкой цепи D43G, L49M, L50I, S62N, Q85E;

b) замены в легкой цепи D43G, V48L, L49M, L50I, S62N, Q85E, H89Y;

c) замены в тяжелой цепи R10G, R13K, V73I, R70K, T83S, L96V;

d) любую одну из замен в легкой цепи D43G, V48L, L49M, L50I, S62N, Q85E или H89Y; или

e) любую одну из замен в тяжелой цепи R10G, R13K, V73I, R79K, T83S или L96V, при этом нумерация остатков для замен в легкой цепи соответствует SEQ ID NO: 661, а для замен в тяжелой цепи соответствуют SEQ ID NO: 652.

23. Антитело по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором антитело является биспецифическим или мультиспецифическим.

24. Биспецифическое антитело, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген, причем первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно.

25. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 24, в котором первый домен и второй домен относятся к изотипу IgG4, и при этом первый или второй домен содержит замены в тяжелой цепи S228P, F234A, L235A, F405L и R409K, а другой домен из первого или второго домена содержит замену в тяжелой цепи S228P, F234A и L235A, причем нумерация остатков соответствует индексу EU.

26. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 24, в котором первый и/или второй домен содержит по меньшей мере одну замену в константном домене СН3, содержащем замену F405L или F405L и R409K, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.

27. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 24, в котором один из первого или второго доменов содержит замену в тяжелой цепи F405L, а другой из первого или второго доменов содержит замену в тяжелой цепи K409R, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.

28. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 24, в котором первый домен и второй домен относятся к изотипу IgG4, при этом один из первого или второго доменов содержит замену в тяжелой цепи S228P, а другой из первого или второго доменов содержит замены в тяжелой цепи S228P, F405L и R409K, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.

29. Биспецифическое антитело по п.24, в котором первый домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 652

- 44 045935 и 661 соответственно.

30. Биспецифическое антитело по п.24, в котором первый домен содержит НС и LC с SEQ ID NO: 640 и 676 соответственно.

31. Биспецифическое антитело по п.24, в котором первый домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 657 и 678 соответственно.

32. Биспецифическое антитело по п.24, в котором первый домен содержит НС и LC с SEQ ID NO: 675 и 677 соответственно.

33. Биспецифическое антитело по п.24, в котором второй антиген представляет собой антиген клеточной поверхности, который экспрессируется на клетке-мишени, отличной от иммунной эффекторной клетки.

34. Биспецифическое антитело по п.33, в котором антиген клеточной поверхности представляет собой опухолеассоциированный антиген.

35. Биспецифическое антитело по любому из пп.24-34, в котором второй антиген представляет собой CD33, IL1RAP, PSMA или TMEFF2.

36. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 35, в котором первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно; и в котором второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 78, 683, 80, 81, 792 и 686 соответственно.

37. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 33, в котором первый домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно; и в котором второй домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 681 и 682 соответственно.

38. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 33, в котором первый домен содержит НС и LC с SEQ ID NO: 640 и 676 соответственно; и в котором второй домен содержит НС и LC с SEQ ID NO: 679 и 680 соответственно.

39. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 33, в котором первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно; и в котором второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 78, 3, 80, 81, 792 и 686 соответственно.

40. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 33, в котором первый домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно; и в котором второй домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 8 и 682 соответственно.

41. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 33, в котором первый домен содержит НС и LC с SEQ ID NO: 640 и 676 соответственно; и в котором второй домен содержит НС и LC с SEQ ID NO: 13 и 680 соответственно.

42. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 33, в котором первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно; и в котором второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 78, 79, 80, 81, 82 и 83 соответственно.

43. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 33, в котором первый домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно; и в котором второй домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 116 и 117 соответственно.

44. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 33, в котором первый домен содержит НС и LC с SEQ ID NO: 640 и 676 соответственно; и в котором второй домен содержит НС и LC с SEQ ID NO: 138 и 139 соответственно.

45. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 31, в котором первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 670 соответственно; и в котором второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 164, 165, 166, 167, 168 и 169 соответственно.

46. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 31, в котором первый домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно; и в котором второй домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 215 и 216 соответственно.

47. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 31, в котором первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 670 соответственно; и в котором второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 349, 390, 341, 471, 513 и 555 соответственно.

48. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 31, в котором первый домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно; и в котором второй домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 267 и 306 соответственно.

49. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 31, в котором первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 670 соответственно; и в котором второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 363, 404, 445, 485, 527 и 569 соответственно.

- 45 045935

50. Биспецифическое антитело по варианту осуществления 31, в котором первый домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно; и где второй домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 281 и 320 соответственно.

51. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из предшествующих вариантов осуществления и фармацевтически приемлемый носитель.

52. Полинуклеотид, кодирующий антитело по любому из вариантов осуществления 1-50.

53. Вектор, содержащий полинуклеотид по варианту осуществления 52.

54. Клетка-хозяин, содержащая вектор по варианту осуществления 53.

55. Способ получения антитела по любому из вариантов осуществления 1-50, включающий культивирование клетки-хозяина согласно варианту осуществления 52 в условиях, в которых антитело экспрессируется, и выделение антитела, продуцируемого клеткой-хозяином.

56. Способ лечения злокачественного новообразования у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного антитела по любому из вариантов осуществления 1-50 субъекту, нуждающемуся в этом, в течение времени, достаточного для лечения злокачественного новообразования.

57. Способ согласно варианту осуществления изобретения 56, в котором злокачественное новообразование представляет собой солидную опухоль или гематологическую злокачественную опухоль.

58. Способ по варианту осуществления 57, в котором солидная опухоль представляет собой рак предстательной железы, колоректальный рак, рак желудка, светлоклеточный рак почки, рак мочевого пузыря, рак легкого, плоскоклеточный рак, глиому, рак молочной железы, рак почки, неоваскулярное нарушение, светлоклеточную почечно-клеточную карциному (СПКК), рак поджелудочной железы, рак почки, рак уротелия или аденокарциному печени.

59. Способ по варианту осуществления 58, в котором рак предстательной железы представляет собой рефрактерный рак предстательной железы, внутриэпителиальную неоплазию предстательной железы, андроген-независимый рак предстательной железы или злокачественный рак предстательной железы.

60. Способ по варианту осуществления 57, в котором гематологическая злокачественная опухоль представляет собой острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), миелодиспластический синдром (МДС), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ), диффузную В-крупноклеточную лимфому (ДВКЛ), хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) или опухоль из бластных плазмоцитоидных дендритических клеток (ОБПДК).

61. Способ по любому из пп.56-60, в котором антитело вводят в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

62. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-50 для применения в терапии.

63. Связывание антиидиотипического антитела с антителом по любому из вариантов осуществления 1-50.

Примеры

1. Создание de novo и определение функциональных характеристик мкАт к CD3.

1.1. Иммунизация OmniRat® антигенами CD3 для получения моноклональных антител к CD3.

OmniRat® иммунизировали патентованными векторами (Aldevron, г. Фарго, штат Северная Дакота, США), кодирующими CD3e человека и Cd3d человека; CD3e яванского макака и CD3d яванского макака. Животные получали чередующиеся бусты ДНК человека и яванского макака. Начиная с 6-го применения животные получали оптимизированные векторы с той же вставкой. Клетки из лимфатических узлов сливали с клеточной линией миеломы Ag8. После истощения IgM 40 миллионов клеток из гибридной BLW помещали в три 96-луночных планшета. 133 миллионов клеток из гибридной BLX помещали в девять 96-луночных планшетов без истощения IgM.

Супернатанты гибридом из гибридов BLW (с магнитными гранулами, истощающими лимфоциты) и BLX (без магнитных гранул, истощающих лимфоциты) анализировали а) с помощью клеточного ИФА (CELISA) на клетках, временно трансфицированных кДНК человека и яванского макака, клонированными в векторы для скрининга: pOPT-CD3e-hum-epsilon-TCE.OMT+pOPT-CD3d-humdeltaOMT, 1:1 (рОРТ-CD3e/d-hum-mix) и pcDNA3.1-CD3e-cyn-delta+pcDNA3.1-CD3d-cyn-delta, 1:1 (pcDNA3.1-CD3e/d-cyn-mix). Последовательности кДНК человека и яванского макака (и соответствующие аминокислотные последовательности) представлены в табл. 4. Для CELISAотрицательного контроля нетрансфицированные клетки млекопитающих инкубировали с супернатантами гибридом и детектировали с помощью вторичных антител Bethyl. Для CELISA-контроля трансфекции клетки млекопитающих, трансфицированные вышеописанными конструктами, детектировали с помощью антител к метке.

Супернатанты гибридом дополнительно анализировали методом проточной цитометрии (FACS) на CD3-положительных и CD3-отрицательных клетках Jurkat: Jurkat CD3+ (Е6-1) и Jurkat CD3- (J.RT3-T3.5). Для FACS-отрицательного контроля CD3-отрицательные клетки Jurkat (J.RT3-T3.5) инкубировали с

- 46 045935 буфером для разведения и обнаруживали с помощью конъюгированных с ПХ вторичных антител к крысиному Ig крысы от Southern и с помощью конъюгированных с ПХ вторичных антител к крысиному IgG1, 2а, 2b, 2с.

Специфичность антител в супернатантах гибридом из гибридной BLW и гибридной BLX для комплекса CD3e/d человека и яванского макака, презентируемого на временно трансфицированных клетках, или, в случае комплекса CD3e/d человека на клетках Jurkat CD3+ (Е6-1), была продемонстрирована с помощью CELISA на временно трансфицированных клетках, а также при исследовании с помощью FACS на клеточных линиях Jurkat (табл. 3). В экспериментальных образцах, которые служили в качестве отрицательных контролей, значимый сигнал не обнаруживали.

Таблица 3

Тестирование специфичности отдельных супернатантов гибридом с помощью клеточного ИФА (сверху) и проточной цитометрии (снизу)

		Клеточный ИФА (относительные единицы флуоресценции)
		Супернатанты гибридом, инкубированные с клетками,
		трансфицированными:
		рОРТ-CD3 e/d-hum-mix	pcDNA3.1-CD3e/dcyn-mix	Нетрансфицированн ые СНО в виде отрицательного контроля
		BLW: слияние с лимфоцитами из группы MR14-379 крыс 1 и 2 (применяли истощение IgM+ с использованием магнитных гранул)
Нет	Клон	ОЕФ	% положительных	ОЕ Ф	% положительны X	ОЕ Ф	% положительны X
1	BLW-2B4	689	101	230	47	30
2	BLW-2E6	231	34	121	25	20
3	BLW-3B4	867	127	320	66	24
		BLX: слияние с лимфоцитами из группы MR14-379 крыс 1 и 2 (без истощения IgM+ с использованием магнитных гранул)
Нет	Клон	ОЕФ	% положительных	ОЕ Ф	% положительны X	ОЕ Ф	% положительны X
4	BLX-1F8	689	101	230	47	30
5	BLX-2E9	867	127	320	66	24
6	BLX-3F4	896	131	371	76	17
7	BLX-3G8	759	111	340	70	22
8	BLX-4D9	1042	153	483	99	24
9	BLX-6A2	ПО	16	38	8	19
	Положительн ый контроль	682	100	488	100	-
	Отрицательны й контроль	25	4	42	9	-
		Проточная цитометрия (FACS)
		Супернатанты гибридом, инкубированные на клеточной линии Jurkat
		Jurkat CD3+ (Е6-1)	Jurkat CD3- (J.RT3.T3.5) в виде отрицательного контроля
		BLW: слияние с лимфоцитами из группы MR14-379 крыс 1 и 2 (применяли истощение IgM+ с использованием магнитных гранул)
Нет	Клон	геометрии еское среднее	% положительных	геометричес кое среднее	% положительных
1	BLW-2B4	148034	53	4012
2	BLW-2E6	7503	3	687
3	BLW-3B4	198849	72	2884

- 47 045935

		BLX: слияние с лимфоцитами из группы MR14-379 крыс 1 и 2 (без истощения IgM+ с использованием магнитных гранул)
Нет	Клон	геометрии еское среднее	% положительных	геометричес кое среднее	% положительных
4	BLX-1F8	148034	53	4012
5	BLX-2E9	198849	72	2884
6	BLX-3F4	181963	66	4613
7	BLX-3G8	214697	77	3096
8	BLX-4D9	25839	9	1471
9	BLX-6A2	3385	1	1219
	Положительн ый контроль	277338	100	2051
	Отрицательны й контроль	869	0	599

Значения CELISA отражают относительные единицы флуоресценции (ОЕФ) каждого образца. Значения FACS представляют собой геометрические средние (геом. среднее) относительных интенсивностей флуоресценции каждого образца.

Таблица 4

Последовательности CD3, используемые для иммунизации

CD3d человека	NP_000723.1 (www.uniprot.org/uniprot/P04234) (SEQ ID NO:691)
CD3e человека	(NP_000724.1 (www.uniprot.org/uniprot/P07766) (SEQ ID NO:636)
CD3d яванского макака	XP_001097302 (www.uniprot.org/uniprot/Q95LI8) (SEQ ID NO:692)
CD3e яванского макака	CD3e+TCE (www.uniprot.org/uniprot/Q95LI5) (SEQ ID NO:693)

1.2. Клонирование антител к CD3.

Антитела к CD3 человека получали в OmniRat (OMT, г. Пало-Альто, штат Калифорния, США). Последовательности вариабельной области (V-области) этих клонов экстрагировали из геномных последовательностей и анализировали. Все полученные последовательности представляли собой или тяжелую цепь, или легкую цепь лямбда человеческого IgG, а последовательности, в особенности LC, демонстрировали высокую гомологию. Выравнивание последовательностей относительно последовательностей зародышевой линии продемонстрировало некоторые мутации в каркасной области (фиг. 1). Последовательности ДНК V-области синтезировали и клонировали в векторы экспрессии млекопитающего, последовательности тяжелой цепи - в вектор человеческого IgG1, а последовательности легкой цепи - в вектор человеческой лямбда. Последовательности показаны в табл. 6 и 7. Семи мкАт были присвоены идентификаторы белка (табл. 5А).

CD3B312 выбирали в качестве наиболее репрезентативного клона, а последовательности тяжелой цепи клонировали в человеческий IgG1sigma и IgG4 PAA с мутациями S228P, F234A, L235A и назначали идентификаторы белка, как показано в табл. 5В. Их использовали для получения биспецифических антител и для демонстрации функциональности перенаправления Т-клеток посредством цитотоксичности.

Таблица 5А

ID пептида и ID белка для клонов

Ш клона	Ш пептида НС	Ш пептида LC	Ш белка
BLW-2B4	CD3H218	CD3L123	CD3B311
BLW-2E6	CD3H219	CD3L124	CD3B312
BLW-3B4	CD3H218	CD3L125	CD3B313
BLX-1F8	CD3H220	CD3L126	CD3B314
BLX-2E9	CD3H221	CD3L124	CD3B315
BLX-3F4	CD3H222	CD3L124	CD3B316
BLX-3G8	CD3H223	CD3L124	CD3B317

- 48 045935

Таблица 5В

IgGl	IgGl sigma	IgG4PAA
CD3B312	CD3B337	CD3B373

CD3B312 выбирали в качестве наиболее репрезентативного клона, а последовательности тяжелой цепи клонировали в человеческий IgG1sigma и IgG4 PAA с мутациями и назначали идентификаторы белка.

Таблица 6

Последовательности тяжелых и легких цепей 7 моноклональных антител к CD3

ID белка по а.к.	Аминокислотная последовательность тяжелой цепи	SEQ ID NO:	Аминокислотная последовательность легкой цепи	SEQ ID NO:
CD3B311	ID пептида НС: CD3H218		ID пептида LC: CD3L123
(BLW2B4)	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSL TCAISGDSVFNNNAAWTWIR QSPSRGLEWLGRTYYRSKW LYDYAVSVKSRITVNPDTSR NQFTLQLKSVTPEDTALYYC SRGYSSSFDYWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTIS К AKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYT	(637)	QSALTQPASVSGSPGQS ITISCTGTSSNIGTYKFV SWYQQHPDKAPKVLLY EVSKRPSGVSSRFSGSK SGNTASLTISGLQAEDQ ADYHCCSYAGSGTLLF GGGTKLTVLGQPKAAP SVTLFPPSSEELQANKA TLVCLISDFYPGAVTVA WKADSSPVKAGVETTT PSKQSNNKYAASSYLSL TPEQWKSHRSYSCQVT HEGSTVEKTVAPTECS	(645)

- 49 045935

	QKSLSLSPGK
CD3B312 (BLW2E6)	ID пептида НС: CD3H219 QVRLQQSGPGLVKPSQTLSL TCAISGDSVFNNNAAWSWIR QSPSRGLEWLGRTYYRSKW LYDYAVTVKSRITVNPDTSR NQFTLQLTSVTPEDTALYYC ARGYSSSFDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK	(640)	ID пептида LC: CD3L124 QSALTQPASVSGSPGQS ITISCTGTSSNIGTYKFV SWYQQHPDKAPKVLLY EVSKRPSGVSSRFSGSK SGNTASLTISGLQAEDQ ADYHCCSYAGSGTLLF GGGTKLTVLGQPKAAP SVTLFPPSSEELQANKA TLVCLISDFYPGAVTVA WKADSSPVKAGVETTT PSKQSNNKYAASSYLSL TPEQWKSHRSYSCQVT HEGSTVEKTVAPTECS	(646)
CD3B313	ID пептида НС: CD3H218		ID пептида LC: CD3L125

- 50 045935

(BLW3B4)	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSL TCAISGDSVFNNNGAWSWIR QSPSRGLEWLGRTYYRSKW LYDYAVSVKSRITVNPDTSR NQFTLQLNSVTPEDTALYYC ARGYSSSFDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK	(638)	QSALTQPASVSGSPGQS ITISCTGTSSNIGTYKFV SWYQQHPDKAPKVLLY EVSKRPSGVSSRFSGSK SGNTASLTISGLQAEDQ ADYHCCSYAGSGTLLF GGGTKLTVLGQPKAAP SVTLFPPSSEELQANKA TLVCLISDFYPGAVTVA WKADSSPVKAGVETTT PSKQSNNKYAASSYLSL TPEQWKSHRSYSCQVT HEGSTVEKTVAPTECS	(649)
CD3B314 (BLX1F8)	ID пептида НС: CD3H220 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSL TCAISGDSVFNNNAAWSWIR QSPSRGLEWLGRTYYRSKW LYDYAVSVKSRITVNPDTSR NQFTLQLKSVTPEDTALYYC SRGYSSSFDYWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTIS К AKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK	(641)	ID пептида LC: CD3L126 QSALTQPASVSGSPGQS ITISCTGTSSDIGTYKFV SWYQQHPDKAPKVLLY EVSKRPSGVSSRFSGSK SDNTASLTISGLQAEDQ ADYHCCSYAGSGTLLF GGGTKLTVLGQPKAAP SVTLFPPSSEELQANKA TLVCLISDFYPGAVTVA WKADSSPVKAGVETTT PSKQSNNKYAASSYLSL TPEQWKSHRSYSCQVT HEGSTVEKTVAPTECS	(650)
CD3B315	ID пептида НС: CD3H221		ID пептида LC: CD3L124

- 51 045935

(BLX2E9)	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSL TCAISGDSVFNNNAAWSWIR QSPSRGLEWLGRTYYRSKW LYDYAVSVKSRITVNPDTSR NQFTLQLNSVTPEDTALYYC VRGYSSSFDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGG	(642)	QSALTQPASVSGSPGQS ITISCTGTSRDIGTYKFV SWYQQHPDKAPKVLLY EVSKRPSGVSSRFSGSK SGNTASLTISGLQAEDQ ADYHCCSYAGSGTLLF GGGTKLTVLGQPKAAP	(647)
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK		SVTLFPPSSEELQANKA TLVCLISDFYPGAVTVA WKADSSPVKAGVETTT PSKQSNNKYAASSYLSL TPEQWKSHRSYSCQVT HEGSTVEKTVAPTECS
CD3B316 (BLX3F4) CD3B317	ID пептида НС: CD3H222 QVQLQQSGPRLVRPSQTLSL TCAISGDSVFNNNAAWSWIR QSPSRGLEWLGRTYYRSKW LYDYAVSVKSRITVNPDTSR NQFTLQLNSVTPEDTALYYC ARGYSSSFDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK ID пептида НС: CD3H223	(643)	ID пептида LC: CD3L124 QSALTQPASVSGSPGQS ITISCTGTSSNIGTYKFV SWYQQHPDKAPKVLLY EVSKRPSGVSSRFSGSK SGNTASLTISGLQAEDQ ADYHCCSYAGSGTLLF GGGTKLTVLGQPKAAP SVTLFPPSSEELQANKA TLVCLISDFYPGAVTVA WKADSSPVKAGVETTT PSKQSNNKYAASSYLSL TPEQWKSHRSYSCQVT HEGSTVEKTVAPTECS ID пептида LC: CD3L124	(646)

- 52 045935

(BLX3G8)

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSL TCAISGDSVFNNNAAWSWIR QSPSRGLEWLGRTYYRSKW LYDYAVSVKSRITVNPDTSR NQFTLQLNSVTPEDTALYYC VRGYSSSFDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK

(644)

QSALTQPASVSGSPGQS ITISCTGTSRDIGTYKFV SWYQQHPDKAPKVLLY EVNKRPSGVSSRFSGSK SGNTASLTISGLQAEDQ ADYHCCSYAGSGTLLF GGGTKLTVLGQPKAAP SVTLFPPSSEELQANKA TLVCLISDFYPGAVTVA WKADSSPVKAGVETTT PSKQSNNKYAASSYLSL TPEQWKSHRSYSCQVT HEGSTVEKTVAPTECS

(648)

Таблица 7А

Последовательности VH и VL с изотипом НС и LC 7 моноклональных антител к CD3 из первой панели 9, описанной выше (см. табл. 3)

ID Fab	ID пептида	VH (SEQ ID NO:)	ID пептида	VL (SEQ ID NO:)
CD3B311	CD3H218	qvqlqqsgpglvkpsqtlsltcai sgdsvfnnnaawswirqspsr glewlgrtyyr skwlydy av s v ksritvnpdtsrnqftlqlnsvtp edtalyycvrgysssfdywgqg tlvtvss (651)	CD3L123	qsaltqpasvsgspgqsitisctgtsrd igtykfvswyqqhpdkapkvllyev nkrpsgvssrfsgsksgntasltisglq aedqadyhcc s у ag sgtllfgggtklt vl (658)
CD3B312	CD3H219	qvqlqqsgprlvrpsqtlsltcai sgdsvfnnnaawswirqspsr glewlgrtyyr skwlydy av s v ksritvnpdtsrnqftlqlnsvtp edtalyycargysssfdywgqg tlvtvss (652)	CD3L124	qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssn igtykfvswyqqhpdkapkvllyev skrpsgvssrfsgsksgntasltisglq aedqadyhcc s у ag sgtllfgggtklt vl (659)
CD3B313	CD3H218	qvqlqqsgpglvkpsqtlsltcai sgdsvfnnnaawswirqspsr glewlgrtyyr skwlydy av s v ksritvnpdtsrnqftlqlnsvtp edtalyycvrgysssfdywgqg tlvtvss (687)	CD3L124	qsaltqpasvsgspgqsitisctgtsrd igtykfvswyqqhpdkapkvllyev skrpsgvssrfsgsksgntasltisglq aedqadyhcc s у ag sgtllfgggtklt vl (688)

- 53 045935

CD3B314	CD3H220	qvqlqqsgpglvkpsqtlsltcai sgdsvfnnnaawswirqspsr glewlgrtyyrskwlydyavsv ksritvnpdtsrnqftlqlksvtp edtalyyc srgy s s sfdy wgqg tlvtvss (653)	CD3L126	qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssd igtykfvswyqqhpdkapkvllyev skrpsgvssrfsgsksdntasltisglq aedqadyhccsyagsgtllfgggtklt vl (660)
CD3B315	CD3H221	qvqlqqsgpglvkpsqtlsltcai sgdsvfnnngawswirqspsr glewlgrtyyrskwlydyavsv ksritvnpdtsrnqftlqlnsvtp edtalyycargysssfdywgqg tlvtvss (654)	CD3L124	qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssn igtykfvswyqqhpdkapkvllyev skrpsgvssrfsgsksgntasltisglq aedqadyhccsyagsgtllfgggtklt vl (659)
CD3B316	CD3H222	qvrlqqsgpglvkpsqtlsltcai sgdsvfnnnaawswirqspsr glewlgrtyyrskwlydyavtv ksritvnpdtsrnqftlqltsvtpe dtalyycargysssfdywgqgtl vtvss (655)	CD3L124	qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssn igtykfvswyqqhpdkapkvllyev skrpsgvssrfsgsksgntasltisglq aedqadyhccsyagsgtllfgggtklt vl (659)
CD3B317	CD3H223	qvqlqqsgpglvkpsqtlsltcai sgdsvfnnnaawtwirqspsrg lewlgrtyyr skwlydy av s vk sritvnpdtsrnqftlqlksvtpe dtalyycsrgy s s sfdy wgqgtl vtvss (656)	CD3L124	qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssn igtykfvswyqqhpdkapkvllyev skrpsgvssrfsgsksgntasltisglq aedqadyhccsyagsgtllfgggtklt vl (659)

Все изотипы НС представляли собой hulgGI Glm(17). Все изотипы LC представляли собой huLambda 2.

Таблица 7В

Последовательности CDR с изотипом НС и LC 7 моноклональных антител к CD3 из первой панели 9, описанной выше (см. табл. 3)

		CDR (SEQ ID NO:)
ID FAB	ID пептида	CDR1	CDR2	CDR3
CD3B311	НС CD3H218	NNNAAWS (662)	RTYYRSKWLYDY AVSVKS (663)	GYSSSFDY (664)
LC CD3L123	TGTSRDIGTYKFVS (667)	EVNKRPS (669)	CSYAGSGTLL (670)
CD3B312	НС CD3H219	NNNAAWS (662)	RTYYRSKWLYDY AVSVKS (663)	GYSSSFDY (664)
LC	TGTSSNIGTYKFVS	EVSKRPS	CSYAGSGTLL

- 54 045935

	CD3L124	(671)	(673)	(670)
CD3B313	НС CD3H218	NNNAAWS (662)	RTYYRSKWLYDY AVSVKS (663)	GYSSSFDY (664)
LC CD3L124	TGTSRDIGTYKFVS (672)	EVSKRPS (673)	CSYAGSGTLL (670)
CD3B314	НС CD3H220	NNNAAWS (662)	RTYYRSKWLYDY AVSVKS (663)	GYSSSFDY (664)
LC CD3L126	TGTSSDIGTYKFVS (674)	EVSKRPS (673)	CSYAGSGTLL (670)
CD3B315	НС CD3H221	NNNGAWS (665)	RTYYRSKWLYDY AVSVKS (663)	GYSSSFDY (664)
LC CD3L124	TGTSSNIGTYKFVS (671)	EVSKRPS (673)	CSYAGSGTLL (670)
CD3B316	НС CD3H222	NNNAAWS (662)	RTYYRSKWLYDY AVTVKS (689)	GYSSSFDY (664)
LC CD3L124	TGTSSNIGTYKFVS (671)	EVSKRPS (673)	CSYAGSGTLL (670)
CD3B317	НС CD3H223	NNNAAWT (666)	RTYYRSKWLYDY AVSVKS (663)	GYSSSFDY (664)
LC CD3L124	TGTSSNIGTYKFVS (671)	EVSKRPS (673)	CSYAGSGTLL (670)

Последовательности определены по Kabat. Все изотипы НС представляли собой huIgG1_Glm(17). Все изотипы LC представляли собой huLambda 2.

1.3. Скрининг гибридом в отношении их связывания с очищенными Т-клетками человека и яванского макака.

Был разработан клеточный анализ связывания для оценки способности отдельных супернатантов гибридом крыс к CD3+ Т-лимфоцитам человека (фиг. 2) и яванского макака (фиг. 3). Т-клетки подсчитывали, разбавляли до 1 х 10⁶ клеток/мл и инкубировали с 0,5 мкл/мл Live/Dead Fixable Green Dead Cell Stain (Life Technologies, L-2301). Затем клетки разделяли на аликвоты в планшете с U-образным дном (Falcon 353077) по 100 мкл/лунка (1х10⁵ клеток/лунка). Планшеты центрифугировали при 300g в течение 5 мин для осаждения клеток и удаляли супернатант. Планшет кратковременно встряхивали для ресуспендирования клеток. Супернатанты гибридом разводили в окрашивающем буфере для FACS (BSA, BD Biosciences 554657) до концентрации 4,5 мкг/мл, а затем последовательно разбавляли 6 раз при разведениях 1:3 до самой низкой концентрации 0,006 мкг/мл. Положительный контроль мышиного антитела к CD3 (SP34-2, BD Biosciences 551916) и отрицательного изотипического контроля (мышиный IgG1, BD Biosciences 556648) также разводили до 4,5 мкг/мл. 50 мкл каждого образца добавляли к Т-клеткам и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. Клетки однократно промывали окрашивающим буфером и добавляли конъюгированные с AF647 вторичные козьи антитела к мышиному IgG (Life Technologies, A21235) или конъюгированные с AF647 козьи антитела к крысиному IgG (Life Technologies, A21247) в концентрации 10 мкг/мл в 50 мкл в соответствии с соответствующими видами (антикрысиные антитела для образцов гибридомы и антимышиные антитела для контрольных антител). Планшеты инкубировали при 4°С в течение 45 мин и дважды промывали окрашивающим буфером. Клетки ресуспендировали в 25 мкл рабочего буфера (окрашивающий буфер +1 мМ ЭДТК (Life technologies, AM9260G)+0,1% Pluronic F-68 (Life Technologies 24040-032)) и считывали на системе Intellicyt (Intellicyt Corp.). Результаты приведены на фиг. 2 и 3.

В других экспериментах очищенные человеческие Т-клетки высевали с плотностью 1,1 х10⁵клеток/лунка в планшеты с U-образным дном. Планшеты центрифугировали при 300g в течение 5 мин для осаждения клеток и удаляли супернатант. Планшет кратковременно встряхивали для ресуспендирования клеток. Супернатанты гибридом разводили в окрашивающем буфере для FACS (BSA, BD Biosciences 554657) до концентрации 30 мкг/мл, а затем последовательно разбавляли 11 раз при разведениях 1:3 до самой низкой концентрации 0,00017 мкг/мл. 50 мкл каждого образца добавляли к Т-клеткам и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. Клетки однократно промывали окрашивающим буфером и добавляли конъюгированное с Dylight 650 козье вторичное антитело к крысиному IgG (Bethyl, A110-239D5) в концентрации 10 мкг/мл в 50 мкл. Планшеты инкубировали при 4°С в течение 1 ч и дважды промывали окрашивающим буфером. Клетки ресуспендировали в 30 мкл буфера для FACS и

- 55 045935 считывали на проточном цитометре Hypercyte (Intellicyt Corp.). Репрезентативные кривые доза-эффект для клонов антитела к CD3, связывающихся с первичными человеческими Т-клетками, показаны на фиг. 5.

Репрезентативные кривые конкурентного связывания с SP34-2 (коммерческое антитело к CD3 человека, для которого известен эпитоп, и перекрестно реагирует с CD3 яванского макака) показаны на фиг. 6. Результаты начального скрининга представлены в табл. 8. Шесть клонов продемонстрировали положительное связывание, а также конкурируют с SP34-2 за связывание с первичными человеческими Т-клетками.

1.4. Конкурентный анализ с коммерческим антителом к CD3 SP34-2.

Супернатанты гибридом также оценивали на их способность конкурировать с коммерческим антителом к CD3 человека SP34-2, для которого известен эпитоп, и перекрестно реагирует с CD3 яванского макака. Сначала была построена кривая титрования концентрации флуоресцентно меченного AF488 SP34-2 (BD, 557705), для определения фиксированной концентрации SP34-2 для следующих конкурентных анализов. Вкратце очищенные Т-клетки человека разводили до 1х 10⁶ клеток/мл в PBS. Fc Block (Human TruStain Fc Block, Biolegend, 422302) добавляли к 5/100 мкл клеток и высевали по 100 мкл/лунка в планшеты с U-образным дном. AF488 SP34-2 и меченный AF488 изотипический контроль (мышиный IgG1 AF488, BD, 400129) последовательно разводили от 50 до 0,049 мкг/мл по схеме разведения 1:2. Планшеты центрифугировали при 300xg в течение 5 мин для осаждения клеток и удаляли супернатант. Планшет осторожно кратковременно встряхивали для ресуспендирования клеток. К клеткам добавляли по 50 мкл каждого разведения AF488 SP34-2 и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. Планшеты дважды промывали окрашивающим буфером и один раз промывали рабочим буфером (окрашивающим буфером+1 мМ ЭДТК (Life technologies, AM9260G)+0,1% Pluronic F-68 (Life Technologies 24040-032)). Клетки ресуспендировали в 25 мкл рабочего буфера и считывали на HTFC Screening System (IntelliCyt Corporation). На основании кривой доза-эффект для конкурентного анализа была выбрана фиксированная концентрация 2 мкг/мл SP34-2.

Семь гибридом, которые демонстрировали связывание с очищенными Т-клетками, анализировали на предмет конкуренции с SP34-2 в отношении связывания с человеческими Т-клетками (фиг. 4). Контрольные антитела были включены в конкурентный анализ. Немеченые мышиные антитела к CD3 человека, SP34-2 и мышиные антитела к CD3 человека, UCHT1 использовали в качестве положительных контролей, а крысиный IgG и мышиный изотип использовали в качестве отрицательных контролей для AF488-меченных SP34-2. Очищенные человеческие Т-клетки разбавляли до концентрации 1х10⁶клеток/мл в PBS. К клеткам добавляли Fc Block в концентрации 5/100 мкл клеток (Human TruStain Fc Block, Biolegend, 422302) и Live/Dead Fixable Far Red Dead Cell Stain в концентрации 0,5 мкл на мл клеток (Life Technologies L10120) и инкубировали в течение 15 мин при 4°С. Затем аликвоты по 10 клеток на лунку (1х 10⁵ клеток/лунку) помещали в 96-луночный планшет с U-образным дном (Falcon 353077). Планшеты центрифугировали при 300xg в течение 5 мин для осаждения клеток и удаляли супернатант. Планшет осторожно кратковременно встряхивали для ресуспендирования клеток. Супернатанты гибридом и контрольные антитела разводили в окрашивающем буфере для FACS (BSA, BD Biosciences 554657) в 2х желаемой конечной концентрации. 35 мкл 2х супернатантов гибридом и контрольных антител смешивали с 35 мкл 2х AF488 SP34-2 (4 мкг/мл) с получением желаемой концентрации 1X супернатантов гибридом, контрольных антител в концентрации 1х и 2 мкг/мл AF488 SP34-2. Супернатанты гибридом и контрольные антитела анализировали с использованием титрования по 7 точкам в диапазоне концентраций. Супернатанты гибридом анализировали от 200 мкг/мл до 0,08 мкг/мл, а контрольные антитела анализировали от 100 до 0,04 мкг/мл. 50 мкл супернатантов гибридом в концентрации 1X или контрольных антител в концентрации 1х с 2 мкг/мл AF488 SP34-2 добавляли к Тклеткам и инкубировали при 4°С в течение 2 ч. Планшеты дважды промывали окрашивающим буфером и один раз промывали рабочим буфером (окрашивающим буфером+1 мМ ЭДТК (Life technologies, AM9260G)+0,1% Pluronic F-68 (Life Technologies 24040-032)). Клетки ресуспендировали в 25 мкл рабочего буфера и считывали на HTFC Screening System (IntelliCyt Corporation). Репрезентативные кривые конкурентного связывания с SP34-2 (коммерческое антитело к CD3 человека, для которого известен эпитоп, и перекрестно реагирует с CD3 яванского макака) показаны на фиг. 4 и 6. Результаты начального скрининга представлены в табл. 8. Шесть клонов продемонстрировали положительное связывание, а также конкурировали с SP34-2 за связывание с первичными Т-клетками человека.

Как показано на фиг. 4, семь антител, которые конкурировали с SP34-2, имели аналогичные кривые. Смещение кривых вправо относительно контрольного SP34-2 указывает на более слабую аффинность связывания. Как и ожидалось, изотипический контрольный крысиный IgG не конкурировал с SP34-2.

- 56 045935

Таблица 8

Сводные данные по связыванию антитела к CD3 с первичными Т-клетками человека

Клон Ат	Связывает Т-клетки человека	Конкурирует с SP34-2
BLW-2B4	+	+
BLW-2E6	+	+
BLW-3B4	+	+
BLX-1F8	+	+
BLX-2E9	+	+
BLX-3F4	+	+
BLX-3G8	+	+
BLX-1G10	-	-
BLX-3H6	-	-
BLX-4E5	+	+
BLX-5H7	+	+
BLX-8B4	+	+
BLX-8B6	+	+
BLX-8G8	+	+
BLW-1E3	+	+
BLW-1F1	+	-
BLW-2C4	-	-
BLW-2C11	-	-
BLW-2F9	-	-
BLW-3B5	-	-
BLW-3H5	-	-

Клоны к CD3,BLX-4E5, BLX-5H7, BLX-8B4, BLX-8B6, BLX-8G8 и BLW-1E3 оказались положительными в отношении связывания с Т-клетками человека и конкурировали со связыванием SP34-2.

1.5. Скрининг отобранных соединений из гибридом в отношении Т-клеточной активации, измеренной по повышению экспрессии CD69.

Для определения способности отобранных соединений из гибридом активировать Т-клетки использовали первичный анализ на основе Т-клеток человека и яванского макака. Этого достигали путем нанесения антител на планшет для имитации перекрестного эффекта активации TCR. Известно, что при активации Т-клетки усиливают поверхностную экспрессию белка CD69. Эксперимент проводили путем нанесения 50 мкл препарата антител с концентрацией 10 мкг/мл с неизвестными образцами или контролями (положительный контроль: собственной разработки, Okt-3 BISB264.002, BD Bioscience SP34-2 №551916; отрицательный контроль: анти-CD20, разработанный самостоятельно, BISB266.004) на 96-луночный планшет (Costar № 3361). Клетки инкубировали в течение ночи при температуре 4°С. На следующий день планшеты дважды промывали PBS. Замороженные первичные Т-клетки (человеческие, полученные от компании Biological Specialties или Hemacare; яванского макака, полученные от компании Worldwide Primates), размораживали, оценивали на жизнеспособность и ресуспендировали в концентрации 2х10⁶ клеток/мл в среде RPMI 1640 (Gibco № 11875 с 10% HI FBS (Gibco №10062). 100 мкл клеток добавляли в планшет и инкубировали в течение ночи (приблизительно 16 ч) при 37°С, 5% СО₂. На следующий день планшеты центрифугировали при 1300 об/мин в течение 3 мин для осаждения клеток и отделяли супернатанты. Клетки однократно промывали в PBS и центрифугировали так же, как и ранее. В каждую лунку добавляли по 10 мкл 2,5% раствора Live/Dead Green Fixable Dye (Life Technologies, № L23101) в PBS и инкубировали при комнатной температуре и в темноте в течение 10 мин. Затем добавляли 50 мкл 1% раствора анти-CD69 AF488 (Biolegend, № 310916, партия № В125271) в буфере для FACS (BD Biosciences, № 554657) и инкубировали планшеты в течение 45 мин при 4°С. Планшеты дважды промывали путем осаждения клеток, как прежде, и удаления супернатанта, и ресуспендирования в 150 мкл буфера для FACS. После последней промывки клетки ресуспендировали в 150 мкл буфера FACS и считывали на FACS Canto. Как видно на фиг. 20, положительные контроли cOkt3 и SP34-2 индуцировали повышение экспрессии CD69 на Т-клетках человека, о чем свидетельствует измеренная средняя интенсивность флуоресценции при окрашивании анти-CD69. Только SP34-2 индуцировало экспрессию CD69 в Т-клетках яванского макака, так как оно связывается с областью последовательности CD3, которая является консервативной у обезьяны и человека. Клон антитела к CD3

- 57 045935

OKT3 не связывался с CD3 яванского макака и не индуцировал повышение экспрессии CD69. Отрицательный контроль как в Т-клетках человека, так и в Т-клетках яванского макака представлял собой антитело к CD20, который не экспрессируется на Т-клетках. Из клонов гибридом, которые были протестированы в отношении активации Т-клеток, несколько индуцировали экспрессию CD69 в той же степени, что и положительный контроль, а именно 2В4, 2Е6, 3В4, 1F8, 2Е9, 3F4, 3G8, 4Е5, 5Н7, 8В4, 8G8 и 1F1. Большинство из них также связывало и активировало Т-клетки яванского макака, за исключением 5Н7, 8В4 и 8G8.

1.6. Конструирование каркаса BLW-2E6.

Клоны продемонстрировали высокую гомологию и несли мутации каркаса относительно последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии (фиг. 1А и 1B). Клон 2Е6 был выбран для модификации стандартной последовательности каркаса. Все 6 мутаций в НС и 7 мутаций в LC подвергали обратной мутации до последовательности человеческой зародышевой линии, или по отдельности, или в комбинации (табл. 9). Мутировавшие последовательности ДНК V-области были синтезированы и клонированы в те же векторы экспрессии млекопитающих, что и их исходные конструкты. Конструкты НС и LC соединяли посредством матричного формата для получения белков, несущих отдельные или комбинаторные мутации, и тестировали активность белка. V48 на LC не может быть изменен обратно до последовательности зародышевой линии. Все другие обратные мутации не имели решающего значения, но до некоторой степени снижали активность.

Таблица 9

Варианты каркаса BLW-2E6

Обратная мутация в тяжелой цепи до человеческой зародышевой линии	Ш пептида
WT	CD3H219
R10G	CD3H225
R13K	CD3H226
V73I	CD3H227
R79K	CD3H228
T83S	CD3H229
L96V	CD3H230
R10G/R13K/V73I/R79K/T83S/L96V	CD3H231
Обратная мутация в легкой цепи до человеческой зародышевой линии	Ш пептида
WT	CD3L124
D43G	CD3L128
V48L	CD3L129
L49M	CD3L13O
L50I	CD3L131
S62N	CD3L132
Q85E	CD3L133
H89Y	CD3L134
D43G/L49M/L50ES62N/Q85E	CD3L135
D43G/L49M/L50ES62N/Q85E/H89Y	CD3L137
D43G/V48L/L49M/L50I/S62N/Q85E/H89Y	CD3L136
D43G/L49M/L50ES62N/Q85E/H89Y/C91V	CD3L197

Мутации в каркасе были выполнены для одного клона гибридомы, BLW-2E6, в результате чего получили 80 мутантных клонов, некоторые из которых указаны в табл. 10. 80 мутантных клонов анализировали на связывание с первичными Т-клетками человека (фиг. 7 и 8). Т-клетки подсчитывали, разбавляли до 1х10⁶ клеток/мл и инкубировали с 5 мкл Fc Block (Human TruStain Fc Block, Biolegend, 422302) на 100 мкл клеток и 0,5 мкл на мл Live/Dead Fixable Green Dead Cell Stain (Life Technologies, L-2301) на 100 мкл клеток. Затем клетки разделяли на аликвоты в 96-луночном планшете с U-образным дном (Falcon 353077) по 100 мкл/лунка (1 х 10⁵ клеток/лунка). Планшеты центрифугировали при 300xg в течение 5 мин для осаждения клеток и удаляли супернатант. Планшет осторожно кратковременно встряхивали для ресуспендирования клеток. Супернатанты гибридом разводили в окрашивающем буфере для FACS (BSA, BD Biosciences 554657) до концентрации 7,5, 1,5, 0,3 и 0,06 мкг/мл. 50 мкл каждого образца добавляли к Т-клеткам и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. Клетки промывали один раз окрашивающим буфером и к клеткам добавляли 50 мкл меченного AF647 вторичного козьего

- 58 045935 антитела к F(ab')2 IgG в концентрации 5 мкг/мл (Jackson ImmunoResearch, кат. 109-605-097). Планшеты инкубировали при 4°С в течение 45 мин, и дважды промывали окрашивающим буфером и один раз промывали рабочим буфером (окрашивающим буфером+1 мМ ЭДТК (Life technologies, AM9260G)+0,1% Pluronic F-68 (Life Technologies 24040-032)). Клетки ресуспендировали в 25 мкл рабочего буфера и считывали на HTFC Screening System (IntelliCyt Corporation). Результаты демонстрируют, что изменение LC в положении 48 устраняет связывание, так что мутация не переносили. Небольшое снижение связывания наблюдали в НС со всеми положениями, возвращенными до зародышевой линии (CD3H231).

1.7. Сканирование С91 LC BLW-2E6.

Клон 2Е6 и его производные экспрессировались слабо, и наблюдалась агрегация белка. Один остаток, С91 легкой цепи, предположительно имел риск посттрансляционной модификации (ПТМ) и его подвергали мутации до всех других возможных аминокислот для улучшения стабильности белка (табл. 10). Мутировавшие последовательности ДНК V-области были синтезированы и клонированы в тот же вектор экспрессии человеческой лямбда, что и их исходный конструкт. Результаты НИР продемонстрировали, что изменение валина или лейцина в положении 91 не приводило к резкому изменению аффинности связывания. Это изменение также включалось в последовательность дикого типа и адаптацию каркаса, что приводило к получению антител CD3B376 (CD3H219/CD3L150) и CD3B450 (CD3H231/CD3L197). CD3B376 и CD3B450 клонировали как IgG4PAA (IgG4 с мутациями S228P, F234A, L235A).

Информация о последовательности для CD3B376 представлена ниже.

Аминокислотная последовательность НС CD3H219 (SEQ Ш NO: 640):

QVQLQQSGPRLVRPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAAWSWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSK WLYDYAVSVKSRrrVNPDTSRNQFTLQLNSVTPEDTALYYCARGYSSSFDYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Нуклеотидная последовательность НС CD3H219 (SEQ Ш NO: 712) caggtgcagctgcagcagtctggccctagactcgtgcggccttcccagaccctgtctctgacctgtgccatctccggcgactcc gtgttcaacaacaacgccgcctggtcctggatccggcagagcccttctagaggcctggaatggctgggccggacctactaccggtccaag tggctgtacgactacgccgtgtccgtgaagtcccggatcaccgtgaaccctgacacctcccggaaccagttcaccctgcagctgaactccg tgacccctgaggacaccgccctgtactactgcgccagaggctactcctcctccttcgactattggggccagggcaccctcgtgaccgtgtcc tct

Аминокислотная последовательность LC CD3L150 (SEQ Ш NO:676):

QSALTQPASVSGSPGQSmSCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPDKAPKVLLYEVSKRPSGV SSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDQADYHCVSYAGSGTLLFGGGTKLTVLGQPKAAPSV TLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAA SSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

Нуклеотидная последовательность LC CD3L150 (SEQ Ш NO: 713) cagtctgctctgacccagcctgcctccgtgtctggctctcccggccagtccatcaccatcagctgtaccggcacctcctccaacat cggcacctacaagttcgtgtcctggtatcagcagcaccccgacaaggcccccaaagtgctgctgtacgaggtgtccaagcggccctctgg cgtgtcctccagattctccggctccaagtctggcaacaccgcctccctgaccatcagcggactgcaggctgaggaccaggccgactacca ctgtgtgtcctacgctggctctggcaccctgctgtttggcggaggcaccaagctgaccgtgctg

Аминокислотная последовательность VH CD3H219 (SEQ ID NO:652): qvqlqqsgprlvrpsqtlsltcaisgdsvfnnnaawswirqspsrglewlgrtyyrskwlydyavsvksritvnpdtsmqftlqlnsvtp edtalyycargy s ssfdy wgqgtlvtv s s

Аминокислотная последовательность VL CD3L150 (SEQ ID NO:661): qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssnigtykfvswyqqhpdkapkvllyevskrpsgvssrfsgsksgntasltisglqaedqadyhc V syagsgtllfgggtkltvl

- 59 045935

HCDR1 CD3H219 (SEQ ID NO:662): NNNAAWS

HCDR2 of CD3H219 (SEQ ID NQ:663): RTYYRSKWLYDYAVSVKS

HCDR3 of CD3H219 (SEQ ID NQ:664): GYSSSFDY

LCDR1 of CD3L15O (SEQ ID NQ:671): TGTSSNIGTYKFVS

LCDR2 of CD3L15O (SEQ ID NQ:673): EVSKRPS

LCDR3 of CD3L15O (SEQ ID NQ:690): VSYAGSGTLL

Информация о последовательности для CD3B450 представлена ниже.

Аминокислотная последовательность НС CD3H231 (SEQ Ш NQ:675):

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAAWSWIRQSPSRGLEWLGRTY YRSKWLYDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGYSSSFDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYS KLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Нуклеотидная последовательность НС CD3H231 (SEQ Ш NO: 714):

caggtgcagctgcagcagagcggccccggcctggtcaagcccagccagaccctgagcctgacctgcgccatcagcggcga cagcgtgttcaacaacaacgccgcctggtcctggatccgccagagccccagccgcggcctggagtggctgggccgcacctactaccgca gcaagtggctgtacgactacgccgtgtccgtgaagtcccgcatcaccatcaaccccgacaccagcaagaaccagttctccctgcagctga acagcgtgacccccgaggacaccgccgtgtactactgcgcccgcggctacagcagcagcttcgactactggggccagggcaccctggt caccgtgtccagc

Аминокислотная последовательность LC CD3L197 (SEQ Ш NO:677):

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPGKAPKVMIYEVSKR PSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCVSYAGSGTLLFGGGTKLTVLGQPKA APSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNN KYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

Нуклеотидная последовательность LC CD3L197 (SEQ Ш NO: 715):

Cagtctgctctgacccagcctgcctccgtgtctggctctcccggccagtccatcaccatcagctgtaccggcacctcctccaaca tcggcacctacaagttcgtgtcctggtatcagcagcaccccggcaaggcccccaaagtgatgatctacgaggtgtccaagcggccctccg gcgtgtccaacagattctccggctccaagtccggcaacaccgcctccctgacaatcagcggactgcaggccgaggacgaggccgactac tactgtgtgtcctacgccggctctggcaccctgctgtttggcggcggaacaaagctgaccgtgctg

Аминокислотная последовательность VH CD3H231 (SEQ Ш NO:657):

qvqlqqsgpglvkpsqtlsltcaisgdsvfnnnaawswirqspsrglewlgrtyyrskwlydyavsvksritinpdtsknqfs Iqlnsvtpedtavyycargysssfdywgqgtlvtvss

Аминокислотная последовательность VL CD3L197 (SEQ Ш NO:678):

QSALTQPASVSGSPGQSmSCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPGKAPKVMIYEVSKR PSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCVSYAGSGTLLFGGGTKLTVL

HCDR1 CD3H231 (SEQ ID NO:662): NNNAAWS

HCDR2 CD3H231 (SEQ ID NO:663): RTYYRSKWLYDYAVSVKS

HCDR3 CD3H231 (SEQ ID NO:664): GYSSSFDY

LCDR1 CD3L197 (SEQ ID NO:671): TGTSSNIGTYKFVS

LCDR2 CD3L197 (SEQ ID NO:673): EVSKRPS

LCDR3 CD3L197 (SEQ ID NO:69Q): VSYAGSGTLL

- 60 045935

Таблица 10

Сконструированные варианты LC BLW-2E6 путем сканирования С91

Сканирование С91	ГО пептида
CD3 2Е6 LC	CD3L124
CD3 2Е6 LC, C91S	CD3L146
CD3 2Е6 LC, C91G	CD3L147
CD3 2Е6 LC, С91Е	CD3L148
CD3 2Е6 LC, C91D	CD3L149
CD3 2Е6 LC, C91V	CD3L150
CD3 2Е6 LC, С91А	CD3L151
CD3 2Е6 LC, C91R	CD3L152
CD3 2Е6 LC, С91К	CD3L153
CD3 2Е6 LC, C91N	CD3L154
CD3 2Е6 LC, С91М	CD3L155
CD3 2Е6 LC, C91I	CD3L156
CD3 2Е6 LC, С91Т	CD3L157
CD3 2Е6 LC, C91W	CD3L158
CD3 2Е6 LC, C91Y	CD3L159
CD3 2Е6 LC, C91L	CD3L160
CD3 2Е6 LC, C91F	CD3L161
CD3 2Е6 LC, C91Q	CD3L162
CD3 2Е6 LC, С91Н	CD3L163
CD3 2Е6 LC, С91Р	CD3L164

1.8. Связывание мкАт к CD3 BLW-2E6 с конструктом hCD3ε при помощи ППР ProteOn.

Связывание мкАт к CD3 BLW-2E6 с точечными мутациями в легкой и/или тяжелой цепях с рекомбинантным пептидом CD3ε(1-27) человека с С-концевым гибридным белком Tencon25 (продукция Janssen, называемая hCD3ε(1-27)-Tn25) измеряли при помощи ППР ProteOn (Bio-Rad). Козьи антитела к человеческому Fc IgG (Jackson Immunoresearch, кат. № 109-005-098) напрямую иммобилизованы по амино-группе в концентрации 30 мкг/мл в ацетатном буфере, рН 5,0, во всех 6 вертикально ориентированных лигандных каналах на чипе GLC Sensor (Bio-Rad, кат. № 176-5011) при скорости потока 30 мкл/мин в PBS, содержащем 0,005% Tween-20. Значения плотности иммобилизации в среднем составляли около 6000 единиц ответа (RU) с менее чем 5% разбросом между разными каналами. Пять различных мкАт захватывали на поверхности антитела к человеческому Fc IgG в концентрации 1,5 мкг/мл (1000~1250 RU) в вертикальной ориентации лиганда, с отсутствием 6-го лигандного канала в качестве контроля поверхности лиганда. hCD3ε(1-27)-Tn25 при концентрации 1 мкМ в серии 3-кратных разведений из 5 концентраций применяли в качестве аналита для связывания с захваченными мкАт в горизонтальной ориентации. 6-й Образец буфера также вводили для контроля диссоциации захваченного мкАт и стабильности базовой линии. Фазу диссоциации для всех концентраций hCD3ε(1-27)-Tn25 отслеживали при скорости потока 100 мкл/мин в течение 30 мин. Поверхность связывания регенерировали для следующего цикла взаимодействия с использованием 18-секундного импульса 0,8% фосфорной кислоты для удаления антигена и связанного мкАт. Необработанные данные обрабатывали путем вычитания двух наборов эталонных данных из данных ответа: 1) сигналов между пятнами для коррекции неспецифических взаимодействий между антигеном и пустой поверхностью чипа; 2) сигналов канала буфера для коррекции смещения базовой линии из-за диссоциации со временем захваченного мкАт с поверхности. Обработанные данные для всех концентраций для каждого мкАт в целом соответствовали простой модели связывания Ленгмюра 1:1 для получения оценок констант кинетики (k_on, k_off) и аффинности (K_D). Результаты представлены на фиг. 11.

- 61 045935

Таблица 11

Сводные данные по кинетике/аффинности связывания вариантов BLW-2E6 с hCD3ε(1-27)-Tn25 (N=1)

ID белка по а.к.	Тяжелая цепь	Легкая цепь	ка (1/М*с)	kd (1/с)	KD (нМ)	Мутация(ии) в НС	Мутация(ии) в LC
C3B31 2	CD3H21 9	CD3L1 24	9.08Е+0 4	1.87Е03	20,6	Дикий тип	Дикий тип
CD3B3 76	CD3H21 9	CD3L1 50	1.02Е+0 5	2.37Е03	23,3	Дикий тип	C91V
Н/П	CD3H21 9	CD3L1 60	9.84Е+0 4	4.05Е03	41,1	Дикий тип	C91L
Н/П	CD3H21 9	CD3L1 37	6.13Е+0 4	2.02Е03	32,9	Дикий тип	D43G/L49M/L5 0ES62N/Q85E/ H89Y
CD3B3 34	CD3H23 1	CD3L1 37	6.96Е+0 4	5.54Е03	79,6	R10G/R13K/ V73ER79K/T 83S/L96V	D43G/L49M/L5 0ES62N/Q85E/ H89Y

Н/П=не присвоен.

1.9. Связывание моноклональных антител к CD3 с Т-клетками человека.

Аффинность связывания CD3B376 и CD3B450 in vitro с Т-клетками человека определяли с помощью проточной цитометрии после скрещивания с антигенспецифическим целевым плечом. Проводили предварительное исследование человеческих Т-клеток для определения константы насыщения связывания меченой молекулы к CD3 (KdT). Фиксированную концентрацию меченого соединения ([Т]) затем использовали в анализе конкурентного связывания с титрованными концентрациями исследуемых мкАт. Значение IC50 (концентрация, при которой достигается 50% ингибирования) для исследуемой молекулы использовали для определения аффинности связывания (Kd) по следующей формуле: K_d=IC50/(1+([T]/K_dT)). Для определения константы насыщения (K_dT) меченого соединения, имеющегося в продаже антитела к CD3 AlexaFluor488 SP34-2 (BioScience, № 557705), использовали пять доноров-людей (данные не показаны).

Определение константы насыщения связывания меченого соединения (K_dT) Способы. Пан-Т-клетки человека подвергали криоконсервации в азотных емкостях до применения. Т-клетки размораживали, промывали PBS, ресуспендировали в окрашивающем буфере для FACS, подсчитывали (с указанием жизнеспособности) и ресуспендировали при 0,5х10⁶ клеток/мл. Краситель Far Red Live/Dead (Life Technologies, также известный как Invitrogen № L34974) (50 мкл DMSO во флакон), добавляли по 1 мкл на 1х10⁶ клеток; и блокатор FcR (Miltenyi Biotec, №130-059-901) (1 мл разведения 1:20 на 0,5х10⁶ клеток) добавляли к клеткам в течение 10 мин каждый. Клетки высевали в количестве 50000 клеток/лунку и промывали. К Т-клеткам добавляли возрастающие концентрации антител к CD3 AlexaFluor488 SP-34 в течение 2 ч при 4°С. Клетки промывали для удаления несвязанного антитела, фиксировали в течение 15 мин, промывали и ресуспендировали в окрашивающем буфере для FACS, содержащем 1 мМ ЭДТК.

Для измерения связывания применяли проточный цитометр iQue Intellicyte. Клетки гейтировали по популяции Т-клеток, затем по синглетам клеток, затем по живым клеткам (FL4). Для каждой лунки определяли среднее геометрическое окрашивания (FL1).

Полученные средние значения интенсивности флуоресценции наносили на график в виде зависимости от концентрации молекулы антитела и анализировали с помощью программного обеспечения Prism в анализе связывания с одним сайтом (общее связывание) (фиг. 9). Программное обеспечение вычисляет соответствующее значение Kd, которое описывает связывание молекулы антитела с рецептором (CD3 на пан Т-клетках человека), которое подчиняется закону действия массы. Формула выглядит следующим образом:

Y=(B_maxXX)/(Kd+X), где B_max представляет собой максимальное связывание;

Kd представляет собой концентрацию лиганда, необходимую для достижения полумаксимального связывания.

Результаты. Для каждого донора получали значения K_d и получали среднее значение. Константа насыщения связывания (K_dT) для Т-клеток человека составила 5,6±1,0 нМ (n=4) и была использована в ранее упомянутой формуле для определения аффинности связывания Kd.

Определение аффинности связывания мкАт к CD3 с помощью конкурентного анализа.

Способы. Исследования конкурентного связывания проводили с использованием двухвалентных антител к CD3.

Двухвалентные антитела к CD3: CD3B376 и CD3B450 (фиг. 10).

Для определения аффинности связывания исследуемых мкАт использовали пан Т-клетки человека.

- 62 045935

Используемое меченое соединение представляло собой коммерчески доступное конъюгированное с AlexaFluor488 антитело к CD3 SP-34 (BioScience, № 557705), и для этого меченого вещества выше описана константа насыщения связывания.

Т-клетки подвергали криоконсервации в азотных емкостях до применения. Т-клетки размораживали, промывали PBS, ресуспендировали в окрашивающем буфере для FACS, подсчитывали с указанием жизнеспособности и ресуспендировали при 0,5х10⁶ клеток/мл. Краситель Far Red Live/Dead (Life Technologies, также известный как Invitrogen № L34974) (50 мкл DMSO во флакон), добавляли по 1 мкл на 1х 10⁶ клеток; и блокатор FcR (Miltenyi Biotec, №130-059-901) (1 мл разведения 1:20 на 0,5х10⁶клеток) добавляли к клеткам в течение 10 мин каждый. Клетки высевали в количестве 50000 клеток/лунку и промывали.

мкАт (и изотипический контроль) последовательно разводили 1:2 с начальной концентрации 1000 или 200 мкг/мл (2х) и фиксированной концентрации меченого соединения (5 мкг/мл; 2х) смешивали с получением 1х концентраций. Таким образом, конечная (1X) концентрация меченого соединения составляла 2,5 мкг/мл=16,6 нМ. Смесь добавляли к Т-клеткам в течение 2 ч при 4°С. Клетки впоследствии промывали для удаления несвязанного антитела, фиксировали в течение 15 мин, промывали и ресуспендировали в окрашивающем буфере для FACS, содержащем 1 мМ ЭДТК.

Для измерения связывания применяли проточный цитометр iQue Intellicyte. Клетки гейтировали по популяции Т-клеток, затем по синглетам клеток, затем по живым клеткам (FL4). Для каждой лунки определяли среднее геометрическое окрашивания (FL1). Полученные средние значения интенсивности флуоресценции были нанесены на график в виде зависимости логарифмической концентрации молекулы антитела (преобразованной в нМ) и проанализированы с использованием программного обеспечения Prism в отношении сигмоидальной кривой доза-ответ (переменный угловой коэффициент), из которой получены значения EC50/IC50 (в нМ). Аффинность связывания (K_d) получали с использованием следующей формулы:

K_d=IC50/(1+([T]/KdT)), где K_d представляет собой аффинность конкурента (немеченая молекула);

IC50 в нМ исследуемого соединения;

[Т] представляет собой концентрацию меченого соединения (16,6 нМ);

KdT представляет собой Kd меченого соединения, определяемого по связыванию с насыщением (5,6 нМ для человека).

Получение моноклональных и биспецифических антител.

Биспецифические антитела к CD3 по настоящему изобретения можно создавать посредством контролируемого обмена Fab-плечами (FAE), как описано в Labrijn et al., 2013, PNAS, vol. 110(13):51455150; публикации РСТ WO 2011/131746; или в Labrijn et al., 2014, Nat. Protoc., 9(10):2450-63. Вкратце в этом способе in vitro предложены два полноразмерных исходных двухвалентных антитела, каждое из которых содержит мутацию в области СН3 антитела, способствующую образованию гетеродимера, что приводит к получению биспецифических антител, содержащих полуплечо, из каждого исходного антитела. Мутации, которые могут использоваться для содействия образованию гетеродимеров, представляют собой F405L в одном исходном антителе и R409K в другом исходном антителе для антител IgG1 или F405L и K409R в одном исходном антителе при сохранении СН3 дикого типа для антител IgG4.

Моноспецифические антитела экспрессировали в клеточных линиях HEK под контролем промоторов CMV.

Исходные антитела очищали с применением колонки с белком А с элюирующим буфером с 100 мМ NaAc, рН 3,5, а также нейтрализующим буфером с 2 М Tris pH 7,5 и 150 мМ NaCl. мкАт обессоливали с использованием колонки PD10 (Sephadex G25M) и диализовали в буфере D-PBS при рН 7,2.

После очистки исходные антитела смешивали в восстанавливающих условиях в 75 мМ цистеаминHCl и инкубировали при 31°С в течение 4 ч. Реакции рекомбинации были основаны на молярных соотношениях, где заданное количество целевого исходного антитела (например, 10 мг или ~71,8 наномолей) было объединено с антителом к CD3 (например, ~67,8 наномолей), при этом целевое исходное антитело было добавлено при 6% избытке антитела к CD3. Затем продукты рекомбинации диализовали против PBS для удаления восстановителя. Реакции с биспецифическим антителом выполняли с избытком целевого исходного антитела (соотношение) для сведения к минимуму количества непрореагировавшего исходного антитела к CD3, оставшегося после рекомбинации. После частичного восстановления исходных мкАт восстановитель удаляли посредством диализа в течение ночи в PBS.

Результаты. На фиг. 10 показаны кривые ингибирования для двухвалентных и одновалентных конструктов к CD3, CD3B376 и CD3B450, конкурирующих за связывание с меченым антителом к CD3 AlexaFluor488 SP-34. Возрастающие концентрации исследуемых антител к CD3 снижали связывание меченого AlexaFluor488 антитела, таким образом снижая среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ). Были получены значения IC50, и с помощью вышеупомянутой формулы были рассчитаны аффинности Kd и сведены в табл. 12.

- 63 045935

Сайт связывания CD3B376 был плотнее, чем CD3B450 как в двухвалентной, так и в одновалентной форме.

Таблица 12

Значения IC50 и аффинности Kd для двухвалентных и одновалентных конструктов CD3B376 и CD3B450

Конструкт	анти-СОЗ	IC50 (нМ)	K_d (нМ)
Двухвалентный	CD3B376	29	7,3
CD3B450	60	15
Одновалентный конструкт	CD3B376	409	103
CD3B450	1011	254

1.10. Конформационная стабильность моноклональных антител к CD3.

Конформационная стабильность антител к CD3 CD3B376, CD3B389 (версия IgG1 от Sigma CD3B376; тяжелая цепь представляет собой SEQ ID NO: 729; легкая цепь представляет собой SEQ ID NO: 676), CD3B450 и CD3B467 (версия IgGl от Sigma CD3B450; тяжелая цепь представляет собой SEQ ID NO: 728; легкая цепь представляет собой SEQ ID NO: 677) определяли с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Среднюю точку теплового перехода, Tm, определяли по профилям тепловой денатурации каждого из АТ-кандидатов. На фиг. 12А-12Е показаны профили тепловой денатурации антител к CD3 в PBS. В табл. 13 приведена сводная информация по Tm и значениям энтальпии (АН) теплового разворачивания антител к CD3 при определении с помощью ДСК.

Результаты. ДСК демонстрируют, что все антитела к CD3 CD3B376, CD3B389, CD3B450 и CD3B467 имеют свернутые домены. На основании начала разворачивания относительная стабильность каждого антитела была следующей: CD3B389<CD3B467<CD3B376<CD3B450. Молекулы антител к CD3, протестированные с помощью ДСК, продемонстрировали некоторые различия в их термостабильности. Молекула CD3B376 (IgG4 PAA) демонстрировала три частично неразрешенных перехода при 59,7, 62,4 и 69,2°С с общей энтальпией разворачивания 417,6 ккал/моль, тогда как молекула CD3B450 (IgG4 PAA) демонстрировала два неразрешенных перехода при 62,5 и 66,3°С с общей энтальпией разворачивания 545,1 ккал/моль. Молекула CD3B389 (IgGlsigma) демонстрировала четыре перехода при 54,6, 58,2, 73,1 и 77,1°С с общей энтальпией разворачивания 401,7 ккал/моль, тогда как молекула CD3B467 (IgGlsigma) демонстрировала четыре перехода при 56,3, 59,6, 66,5 и 75,6°С с общей энтальпией разворачивания 406,2 ккал/моль.

Таблица 13

Сводные данные по тепловому переходу для антител к CD3 в PBS

CD3B376 CD3B450 CD3B389 CD3B467

НС: SEQ ID NO: НС: SEQ ID NO: НС: SEQ ID NO: HC: SEQ ID NO:

640 675 729 728

LC: SEQ ID NO: LC: SEQ ID NO: LC: SEQ ID NO: LC: SEQ ID NO:

676 677 676 677

	Средн, значени	Ошиб ка	Средн, значени	Ошибк а	Средн, значени	Ошиб ка	Средн, значени	Ошибк а
	е		е		е		е
Tml (°C)	59,7	0,1	62,5	0,9	54,6	0,1	56,3	0,1
ΔΗ1 (кал/моль)	151900,0	4200,0	158175,0	64025,0	166150,0	2450,0	98160,0	17840,0
Tm2 (°C)	62,4	0,1	66,3	0,2	58,2	0,1	59,6	0,0
ΔΗ2 (кал/моль)	202200,0	4300,0	386900,0	71000,0	62050,0	1290,0	72900,0	370,0
ТтЗ (°C)	69,2	0,0	Н/д	Н/д	73,5	0,1	66,5	0,0
ΔΗ3 (кал/моль)	63450,0	2080,0	Н/д	Н/д	101900,0	1600,0	92785,0	6785,0
Тт4 (°C)	Н/д	Н/д	Н/д	Н/д	77,1	0,0	75,6	0,1
ΔΗ3 (кал/моль)	Н/д	Н/д	Н/д	Н/д	71560,0	2500,0	142400,0	4800,0
Общее ΔΗ	601000,0	Н/д	545075,0	Н/д	401660,0	Н/д	406245,0	Н/д
Значения	представляют	собой	средние	по результатам повторных

измерений. Информация о последовательности представлена для пептидов НС и LC (SEQ ID NO в скобках).

Два антитела IgG1 демонстрируют более низкую стабильность по сравнению с соответствующими антителами IgG4 PAA (при сравнении молекул с одними и теми же вариабельными доменами) с Tm

- 64 045935 первого перехода ниже на 5-6°С (фиг. 13А и 13В и табл. 13).

1.11. Кристаллическая структура Fab CD3B334 в комплексе с N-концевым пептидом CD3e.

мкАт к CD3 CD3B334 (CD3H231/CD3L137) модифицировали для повышения индекса человечности путем замены ряда каркасных остатков в антителе остатками из человеческой зародышевой линии. В результате этой процедуры было получено антитело CD3B334 со следующими мутациями: D43G/L49M/L50I/S62N/Q85E/H89Y в VL по сравнению с исходной VL CD3L124 и R10G/R13K/V73I/R79K/T83S/L96V в VH по сравнению с исходной VH CD3H219. Меченный гистидином Fab-фрагмент CD3B334 экспрессировали в клетках HEK 293Expi и очищали с использованием аффинной и эксклюзионной хроматографии. N-концевой 9-мерный пептид человеческого CD3e синтезировали на пептиде New England (партия V1108-19/21) и смешивали с Fab в молярном соотношении 10:1 (избыток пептида). Комплекс кристаллизовали методом диффузией паров из раствора, содержащего 4 М натрий формиата в 0,1 М Трис, рН 8,5. Указанные кристаллы имеют орторомбическую пространственную группу Р212121 с размерами элементарной ячейки 66,5x69,4x100,4 А и одной молекулой комплекса в асимметричной единице. Структуру комплекса определяли с разрешением 1,8 А методом молекулярного замещения с использованием кристаллической структуры Fab в качестве поисковой модели.

CD3B334 связывал остатки 1-6 CD3e. N-концевой Gln пептида находился в форме пироглутамата и в гидрофобной среде между F107 HCDR3 и L99 LCDR3. Два остатка аргинина, R52 и R56, из HCDR2, взаимодействовали с электростатическими взаимодействиями с кислыми остатками CD3. Всего, 16 остатков образовывали паратоп CD3B334. Остатки всех CDR, за исключением LCDR2, находились в непосредственном контакте (расстояние в пределах 4 А) с пептидом CD3 (см. фиг. 18).

2. Антитела к PSMA.

2.1. Создание клеточных линий PSMA.

Векторы экспрессии, представляющие полноразмерный PSMA шимпанзе (H2Q3K5_PANTR, SEQ ID NO: 49) или полноразмерный PSMA яванского макака (EHH56646.1, SEQ ID NO: 50), были созданы для применения в качестве инструментов скрининга при оценке лидерных антител к PSMA с применением вектора экспрессии собственной разработки с промотором CMV с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Векторы временно трансфицировали в клетки HEK293F в суспензии с использованием стандартных способов. Трансфицированные суспензионные клетки 293F помещали в среду роста с сывороткой, чтобы они стали прикрепленными, и отбирали для стабильной интеграции плазмиды. Популяции отдельных клеток были отобраны путем серийных разведений, и экспрессия поверхностного рецептора PSMA была количественно определена с помощью FACS с использованием аффинно очищенного кроличьего поликолонального антитела (антитело PSMAL (Центр) (каталог № ОААВ02483, Aviva Systems Biology) в качестве первичного антитела с конъюгированным с R-PE антикроличьим вторичным антителом (каталожный № 111-116-144, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) и кроличьим поликлональным IgG (каталожный № SC-532, Santa Cruz Biotechnology) в качестве изотипического контроля).

Для отбора PSMA-положительных клеток создавали клеточные линии, экспрессирующие человеческий PSMA, с применением лентивируса (Genecopoeia, кат. № EX-G0050-Lv105-10), содержащего полноразмерный PSMA человека (FOLH1_HUMAN, SEQ ID NO: 51) и пуромицин. Клетки HEK293F (АТСС), отрицательные по PSMA, трансдуцировали лентивирусными частицами для сверхэкспрессии PSMA человека. После трансдукции клетки, положительно экспрессирующие PSMA и маркер устойчивости, отбирали обработкой объединенных клеток, выращивали в среде DMEM+10% HI FBS (Life Technologies) и дополняли различными концентрациями пуромицина (Life Technologies).

Кроме полученных с помощью HEK линий клеток, для анализов методом фагового пэннинга, и анализов связывания, и клеточной токсичности использовали несколько коммерческих линий клеток. Клетки LNCaP клона FGC (АТСС кат. № CRL-1740) представляют собой коммерчески доступные линии клеток рака предстательной железы человека. Клетки С4-2В были первоначально созданы в MD Anderson, и получены из LNCaP FGC, выращенных in vivo и метастазирующих в костный мозг (Thalmann et al., 1994, Cancer Research, 54, 2577-81).

2.2. Получение растворимого белка ВКД PSMA.

Рекомбинантный белок внеклеточный домен (ВКД) PSMA шимпанзе (ВКД PSMA шимпанзе, SEQ ID NO: 52) создавали для пэннинга и оценки лидерных антител к PSMA с применением вектора экспрессии собственной разработки с промотором CMV, используя стандартные методики молекулярной биологии. Фрагмент гена ВКД PSMA шимпанзе (аминокислоты 44-750 из SEQ ID NO: 49) с N-концевой сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 594), N-концевую авидиновую метку (SEQ ID NO: 595) и 6-гистидиновыми метками (SEQ ID NO: 596) клонировали с использованием вектора экспрессии собственной разработки с промотором CMV, используя стандартные методы молекулярной биологии и временно экспрессировали в клетки 293Expi (Invitrogen). кДНК получали с использованием методов генного синтеза (патент США № 6670127; патент США № 6,521,427). Супернатанты собирали и очищали путем центрифугирования. Белки очищали с использованием двухэтапного способа очистки: 1) очистка IMAC с помощью колонки HisTrap HP (GE Healthcare) и 2) очистка исключения размера (Superdex 200, Ge Healthcare), где элюирующий буфер представляет собой фосфатно-солевой буфер Дульбекко,

- 65 045935 кальций, магний (Thermofisher, № 14040), содержащий 0,5 мМ ZnCl2 для стабилизации димеризации PSMA. Фракции, содержащие интересующий белок, объединяли и определяли концентрацию белка посредством А280. Этот материал использовали для измерения связывания и аффинности и обозначили как PSMG8.

ВКД PSMA шимпанзе также биотинилировали для пэннинга. Плазмиду BirA, которую котрансфицировали в клетки млекопитающих в биотинилированные белки, содержащие авидиновую метку, получали самостоятельно. Кодирующую область BirA (SEQ ID NO: 597) сливали с сигнальным пептидом из тяжелой цепи мышиного IgG (SEQ ID NO: 598) и сигналом удерживания ЭР (KDEL (SEQ ID NO: 716)) добавляли к С-концу для получения плазмиды BirA (SEQ ID NO: 599). Сконструированный ген клонировали в вектор экспрессии под контролем промотора CMV. Для получения биотинилированного антигена PSMA плазмидную ДНК PSMA добавляли в 4-кратном избытке (мас./мас.) к плазмиде BirA в смесь для трансфекции.

Биотинилирование белка ВКД PSMA шимпанзе проводили с помощью авидиновой метки путем котрансфекции конструкции экспрессии BirA, и полученный секретированный белок очищали с применением двухэтапного процесса очистки: 1) очистка IMAC с помощью колонки HisTrap HP (GE Healthcare) и 2) очистка исключения размера (Superdex 200, Ge Healthcare), где элюирующий буфер представляет собой фосфатно-солевой буфер Дульбекко, кальций, магний (Thermofisher, № 14040), содержащий 0,5 мМ ZnCl₂ для стабилизации димеризации PSMA. Перед использованием в исследованиях методом фагового пэннинга белок был протестирован на эндотоксин.

Рекомбинантный белок внеклеточный домен (ВКД) PSMA (ВКД PSMA яванского макака, SEQ ID NO: 53), соответствующий аминокислотам 44-750 SEQ ID NO: 50 с N-концевым сигналом (SEQ ID NO: 594), N- концевые авидиновые (SEQ ID NO: 595) и 6-гистидиновые (SEQ ID NO: 596) метки клонировали и экспрессировали, как описано ранее для ВКД PSMA шимпанзе. Биотинилирование белка ВКД PSMA яванского макака выполняли с помощью авидиновой метки путем котрансфекции конструкта экспрессии BirA, и полученный секретированный белок очищали двухэтапной очисткой с использованием колонки IMAC HisTrap HP (GE Healthcare) и колонок MonoAvidin. Перед использованием в исследованиях методом фагового пэннинга белок был протестирован на эндотоксин. Этот материал также использовали для измерения связывания и аффинности и обозначили как PSMG1.

Второй рекомбинантный белок ВКД PSMA яванского макака (PSMA яванского макака с Fc, SEQ ID NO: 54) с Fc IgG1 (SEQ ID NO: 593) клонировали и экспрессировали с использованием вектора экспрессии собственной разработки с промотором CMV с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Белок PSMA яванского макака с Fc временно экспрессировался в клетках 293HEK-expi. Продукт временной трансфекции PSMG3 в клетках HEK293.Expi собирали через 5 суток после трансфекции, осветляли центрифугированием (30 мин, 6000 об/мин) и фильтровали (0, 2 мкМ мембрана из полиэфирсульфона, Corning). Относительное количество IgG определяли с помощью прибора Octet (ForteBio) с использованием очищенного известного IgG (того же изотипа), добавленного в отработанную среду для построения стандартной кривой.

Осветленный супернатант с PSMA яванского макака с Fc загружали в уравновешенную (dPBS, pH 7,2) колонку HiTrap MabSelect Sure Protein A (GE Healthcare) при относительной концентрации ~30 мг белка на мл смолы. После загрузки колонку промывали в dPBS при рН 7,2, и белок элюировали с использованием 10 объемов колонки 0,1 М натрий ацетата, рН 3,5. Фракции пика объединяли, нейтрализовали 2 М трис, рН 7, и фильтровали (0,2 мкМ). Нейтрализованный образец белка подвергали диализу против 3 замен dPBS, содержащего Са₂+, Mg₂+ и 0,5 мМ ZnCl₂, рН 7,2, в течение ночи при 4°С. На следующий день образец снимали с диализа, фильтровали (0,2 мкМ) и определяли концентрацию белка по оптической плотности при 280 нМ на спектрофотометре BioTek SynergyHTTM. Качество очищенных белков оценивали методами ДСН-ПААГ-электрофореза и аналитической эксклюзионной ВЭЖХ (система ВЭЖХ Dionex). Уровни эндотоксина измеряли с помощью LAL-теста (Pyrotell-T, Associates of Cape Cod). Очищенные белки хранили при 4°С.

Рекомбинантный белок внеклеточный домен PSMA человека (ВКД) (ВКД PSMA человека, SEQ ID NO: 55), соответствующий аминокислотам 44-750 из SEQ ID NO: 51 с N-концевыми авидиновыми и 6-гистидиновыми метками (SEQ ID NO: 596) клонировали, экспрессировали и очищали так, как описано ранее для белков ВКД PSMA шимпанзе и яванского макака.

2.3. Идентификация Fab к PSMA шимпанзе и человека.

Пэннинг срекомбинантным белком.

Пэннинг в растворе полученных de novo библиотек человеческого Fab-pIX [Shi, L. et al., J. Mol. Biol., 2010, 397(2):p. 385-396. WO 2009/085462], состоящую из библиотек тяжелых цепей VH1-69, 3-23 и 5-51, спаренных с четырьмя библиотеками генов VL человеческой зародышевой линии (А27, В3, L6, 012), выполняли с использованием подхода чередующегося пэннинга с одним циклом захвата фага на стрептавидиновых гранулах (Invitrogen, кат. № 112.05D, партия № 62992920), покрытых биотинилированным ВКД PSMA шимпанзе в соответствии с протоколом производителя, с последующим захватом фага на гранулах ProtG (Invitrogen, кат. № 10003D), покрытых PSMA яванского макака с Fc в соответствии с протоколом производителя с последующим захватом фага на магнитных

- 66 045935 нейтравидиновых гранулах Sera-mag Double Speed (Thermo, кат. № 7815-2104-011150), покрытых биотинилированным ВКД PSMA шимпанзе в соответствии с протоколом производителя. В результате пэннинга получили два отобранных соединения: PSMM18 и PSMM25.

Цельноклеточный пэннинг Fab к PSMA.

Дополнительные эксперименты с пэннингом проводили на целых клетках с использованием выходных данных Раунда № 1 описанных выше экспериментов с пэннингом ВКД шимпанзе или только полученных библиотек фагов de novo в качестве входных данных. Вкратце фаг получали посредством инфекции хелперного фага и концентрировали посредством осаждения с помощью ПЭГ/NaCl в соответствии со стандартными протоколами, известными в данной области техники. Фаговые библиотеки предварительно очищали на нетрансфицированных исходных клетках HEK293F в течение ночи при 4°С с осторожным покачиванием. После осаждения с помощью ПЭГ/NaCl предварительно очищенные библиотеки инкубировали с PSMA-экспрессирующими клетками HEK293 или клетками LNCAP при осторожном покачивании в течение 2 ч при 4°С. Удаление несвязанного фага и выделение связанных с фагом клеток проводили с помощью градиента фиколла, и после нескольких стадий промывки клетки, несущие связанный фаг, инкубировали с 1 мл культуры TG-1 E.coli при 37°С в течение 30 мин без встряхивания. Полученную смесь высевали на чашки с лизогенным бульоном с карбенициллином и 1% глюкозой и выращивали в течение ночи при 37°С. Затем процесс повторяли для последующих раундов пэннинга.

Превращение фага Fab-pIX в Fab-His для получения супернатантов Е.соН.

Полученные отобранные соединения из фагов Fab-pIX превращали в Fab-His с использованием стандартной процедуры. Плазмидную ДНК выделяли из Е.соН, используемой в фаговом пэннинге, (набор Plasmid Plus Maxi Kit, Qiagen, кат. № 12963) и подвергали расщеплению рестриктазами NheI/SpeI. Полученные фрагменты размером 5400 и 100 п.н. разделяли на агарозном геле с концентрацией 0,8% и фрагмент из 5400 п.н. очищали на геле (набор MinElute PCR Purification Kit, Qiagen, кат. № 28006). Очищенную полосу размером 5400 п.н. подвергали самолигированию с использованием лигазы Т4, и полученный продукт (кодирующий гибрид Fab-his) снова трансформировали в штамм E.coli TG-1 и клонировали. Супернатанты Fab-His создавали из клонов путем индукции в течение ночи культур с помощью 1 мМ IPTG. После центрифугирования культивируемой в течение ночи культуры осветленные супернатанты были готовы для использования в последующих анализах. Для определения относительных уровней экспрессии различных супернатантов Fab-his проводили ИФА к каппа (Southern Biotech, кат. № 2061-05) на серийно разведенных супернатантах. Все протестированные клоны продемонстрировали сходную экспрессию Fab-his (данные не показаны).

Клеточное связывание гибридов Fab-his из Е.соН

Для оценки способности связывания отдельных гибридов Fab-his из супернатантов E.coli с клетками, экспрессирующими PSMA, был разработан клеточный анализ связывания. Отдельные клоны Fab выделяли из раунда 3 всех экспериментов с пэннингом после вырезания рГХ. Клоны Fab тестировали на связывание с клетками HEK, экспрессирующими PSMA шимпанзе и яванского макака, а также с PSMA человека на клетках LNCaP. Вкратце клетки, экспрессирующие PSMA, помещали в аликвоты планшета с V-образным дном (CoStar 3357) при плотности 200000 на лунку и инкубировали с (100 мкл) супернатантами, экспрессирующими Fab-фрагменты, в течение 1 ч на льду. Клетки дважды промывали PBS, содержащим 2% FBS, и окрашивали конъюгированным с RPE мышиным антителом к человеческой легкой цепи каппа (Life Technologies, кат. № MH10514) в течение 1 ч на льду. Клетки дважды промывали PBS, содержащим 2% FBS, и ресуспендировали в 100 мкл того же промывочного буфера. Планшеты считывали на проточном цитометре BD FACS. Данные FACS были проанализированы в программном обеспечении FlowJo путем гейтирования нормальной популяции клеток в реальном времени с использованием прямого и бокового рассеяния, а затем анализа клеток внутри этого гейта на окрашивание РЕ. Рассчитывали среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) и экспортировали в Microsoft Excel. Клоны Fab, которые проявляли>3-кратный фон связывания для всех трех видов PSMA (яванского макака, шимпанзе и человека) и не проявляли связывания с линией клеток HEK293, были помечены как предварительно положительные. Fab секвенировали и переносили для клонирования в вектор экспрессии млекопитающих для повторного скрининга. Истинно положительные результаты были выбраны из связывания супернатантов Fab, экспрессируемых клетками млекопитающих, с линиями клеток, экспрессирующими PSMA.

Получение Fab млекопитающих.

Для преобразования Fab E.coli в экспрессируемый млекопитающими Fab использовали In-Fusion HD Cloning (ClonTech, кат. № 638918) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце нуклеотидные последовательности клонов, которые прошли первичный скрининг и должны быть переведены в формат Fab млекопитающих, загружаются в программу InFu Primer Finder v1.2.3 (программное обеспечение, разработанное самостоятельно), которая генерирует перечень изотипспецифических праймеров для ПЦР, используемых для создания ПЦР-фрагментов для клонирования InFusion в векторы экспрессии huKappamuIgGSP и huG1 Fab. Эти векторы представляют собой векторы собственной разработки с промоторами CMV на основе pcDNA3.1. После процесса In-fusion клоны Е.соН

- 67 045935 выделяли, последовательность проверяли и трансфицировали в клетки HEK293, используя стандартные протоколы. Fab к PSMA млекопитающих для подтверждения связывания с линиями клеток, экспрессирующими PSMA, получали путем сбора 20 мл супернатантов через 5 суток после трансфекции.

Повторный скрининг отобранных вариантов из цельноклеточного пэннинга в формате супернатантов клеток млекопитающих

Подтверждение наличия супернатантов Fab, экспрессируемых клетками млекопитающих, выполняли с использованием анализа связывания целых клеток, описанного ранее. Исследовали связывание Fab с клетками PSMA человека (LNCaP), шимпанзе и яванского макака, а также проводили обратный скрининг на отсутствие связывания с исходной клеточной линией HEK . В табл. 14 показан профиль отобранных соединений в отношении связывания супернатанта Fab млекопитающих с PSMAэкспрессирующими клетками. Многие отобранные соединения из супернатантов Е.соИ не подтверждаются белками, экспрессируемыми млекопитающими. PSMM48 продемонстрировало высокое связывание с клетками, экспрессирующими PSMA яванского макака, и некоторое связывание с клетками, экспрессирующими PSMA шимпанзе, но отсутствие связывания с клетками LNCaP, экспрессирующими PSMA человека. PSMM56 продемонстрировал аналогичный профиль, но с некоторым связыванием с клетками LNCaP. PSMM69-80 связывается с клетками LNCaP, но не с клетками, экспрессирующими PSMA шимпанзе или яванского макака. Супернатанты Fab млекопитающих PSMM52, М56 и М57 связывались со всеми тремя клеточными линиями. PSMM50, М51 и М54 демонстрируют большее связывание с клетками шимпанзе или яванского макака. М58 демонстрировало незначительное связывание с клетками шимпанзе и яванского макака.

Таблица 14

Профиль отобранных соединений связывания белка Fab млекопитающих с клетками, экспрессирующими PSMA по данным измерения гео-СИФ (средняя флуоресцентная интенсивность)

ID Fab (ID ДНК Fab)	Яванский макак	Шимпанзе	LNCaP	Исходная НЕК
PSMBIO(PSMMIO)	244	81,6	-	248
PSMB11 (PSMM11)	19	6,6	-	8,14
PSMB12 (PSMM12)	31,6	8,05	-	12,6
PSMB13 (PSMM13)	57,8	18,2	-	50,5
PSMB14 (PSMM14)	32,6	13,1	-	22,2
PSMB15 (PSMM15)	40,4	18,5	-	38
PSMB16(PSMM16)	175	220	-	6,39
PSMB17 (PSMM17)	34,9	22,4	-	40,1
PSMB18 (PSMM18)	696	439	-	8,71
PSMB19 (PSMM19)	53,7	-	5,15	4,47
PSMB20 (PSMM20)	5,75	-	5,85	41,3
PSMB21 (PSMM21)	94,4	-	20,7	372
PSMB22 (PSMM22)	9,07	-	7,92	54,9
PSMB23 (PSMM23)	16,4	-	6,66	164
PSMB24 (PSMM24)	14,6	9,6	4,09	3,96
PSMB25 (PSMM25)	15,2	11,3	16,9	4,09
PSMB26 (PSMM26)	9,48	-	7,26	114
PSMB27 (PSMM27)	20	-	7,56	136
PSMB28 (PSMM28)	29,7	-	8,88	302
PSMB29 (PSMM29)	6,87	-	5,7	72,8
PSMB30 (PSMM30)	5,16	-	4,58	45
PSMB31 (PSMM31)	5,99	-	-	25,5
PSMB32 (PSMM32)	4,81	-	-	27,1
PSMB33 (PSMM33)	5,14	-	-	40,1
PSMB34 (PSMM34)	17,9	-	-	107
PSMB35 (PSMM35)	58,5	-	-	231
PSMB36 (PSMM36)	5,05	-	-	6,96
PSMB37 (PSMM37)	23,4	-	-	178

- 68 045935

PSMB38 (PSMM38)	4,05	-	-	7,7
PSMB39 (PSMM39)	10,2	-	-	166
PSMB40 (PSMM40)	66,9	-	-	348
PSMB41 (PSMM41)	5,39	-	-	12
PSMB42 (PSMM42)	7,35	-	-	25,8
PSMB43 (PSMM43)	8,73	-	-	7,18
PSMB44 (PSMM44)	12,6	-	-	48,9
PSMB45 (PSMM45)	22,4	-	-	43,1
PSMB46 (PSMM46)	3,88	-	-	5,29
PSMB47 (PSMM48)	101	25,5	3,46	2,85
PSMB48 (PSMM49)	2,72	3,18	2,68	2,72
PSMB49 (PSMM50)	51,6	22	3,22	3,48
PSMB51 (PSMM52)	285	231	41,5	2,68
PSMB52 (PSMM53)	39,2	6,89	2,67	2,56
PSMB53 (PSMM54)	27,6	17,8	4	2,6
PSMB54 (PSMM55)	2,7	2,75	2,65	2,79
PSMB55 (PSMM56)	226	180	17,2	2,58
PSMB56 (PSMM57)	95,6	34,7	24,5	2,52
PSMB57 (PSMM58)	19,8	11	3,26	2,68
PSMB58 (PSMM59)	121	192	25,3	2,67
PSMB59 (PSMM60)	4,96	9,69	6,04	3
PSMB60 (PSMM61)	2,28	3,07	87,3	4,64
PSMB61 (PSMM62)	2,1	3,16	135	2,98
PSMB62 (PSMM63)	7,17	4,43	54,9	9,09
PSMB63 (PSMM64)	2,07	2,95	27	2,82
PSMB64 (PSMM65)	2,39	3,26	70,5	3,05
PSMB65 (PSMM66)	2,3	3,13	32,4	4,25
PSMB66 (PSMM67)	2,14	3	24,6	2,83
PSMB67 (PSMM68)	2,23	2,95	21	2,95
PSMB68 (PSMM69)	5,44	-	134	35,3
PSMB69 (PSMM70)	2,29	3,38	25,5	3,35
PSMB70 (PSMM71)	2,22	3,49	15,5	3,26
PSMB71 (PSMM72)	2,54	4,4	18,5	3,07
PSMB72 (PSMM73)	2,13	3,53	227	3,02
PSMB73 (PSMM74)	2,97	4,13	125	ИД
PSMB74 (PSMM75)	120	-	178	132
PSMB75 (PSMM76)	2,99	3,04	173	7,89
PSMB76 (PSMM77)	3,75	3,99	138	3,95
PSMB77 (PSMM78)	4,68	3,96	144	4,71
PSMB78 (PSMM79)	25,2	-	378	24,4
PSMB79 (PSMM80)	38,4	-	512	157
PSMB80 (PSMM81)	19,6	18,6	20,9	6,61
PSMB81 (PSMM82)	2,63	2,06	4,07	2,69
PSMB82 (PSMM83)	2,79	2,23	4,11	2,76
PSMB83 (PSMM84)	2,59	2,28	4,09	2,74

- 69 045935

PSMB84 (PSMM85)	750	729	192	3,15
PSMB85 (PSMM86)	2,84	2,59	2,33	3,24
PSMB86 (PSMM87)	224	176	31,7	2,82
PSMB87 (PSMM88)	2,63	2,27	4,23	2,91
PSMB88 (PSMM89)	37,7	29,7	30,3	7,6
PSMB89 (PSMM90)	27,1	27,3	53,2	39,5
PSMB90 (PSMM91)	26,7	24,7	47,1	36,4
PSMB91 (PSMM92)	8,97	6,16	13	6,63
PSMB92 (PSMM93)	20	16,5	57,1	50
PSMB93 (PSMM94)	5,13	9,62	2,5	3,66
PSMB94 (PSMM95)	5,12	2,67	2,22	3,57
PSMB95 (PSMM96)	8,9	8,82	13,4	11,4
PSMB96 (PSMM97)	2,4	3,25	2,53	4,03
PSMB97 (PSMM98)	2,57	4,73	2,52	3,7
PSMB99 (PSMM100)	9,95	2,4	2,39	4,03
PSMB100 (PSMM101)	4,03	2,52	2,33	3,37
PSMB100 (PSMM101)	3,5	2,86	2,48	4,57
PSMB1O1 (PSMM102)	5,49	3,18	2,23	3,33
PSMB102 (PSMM103)	2,4	2,42	2,16	3,2
PSMB103 (PSMM104)	3,52	3,26	2,58	4,44
PSMB104 (PSMM105)	2,15	2,5	2,34	3,95
PSMB1O5 (PSMM106)	2,03	2,39	2,18	3,39
PSMB106 (PSMM107)	2	2,4	2,27	3,59
PSMB107 (PSMM108)	2	2,47	2,33	3,49
PSMB1O8 (PSMM109)	2	2,58	2,28	3,46
PSMB109 (PSMM110)	321	326	34,9	6,11
PSMBllO(PSMMlll)	2,3	2,31	2,31	3,4
PSMB111 (PSMM112)	2,32	2,31	-	3,21
PSMB112(PSMM113)	6,28	5,7	2,71	3,28
PSMB113 (PSMM114)	2,82	2,95	2,32	3,29
PSMB114 (PSMM115)	2,78	2,47	4,3	3,14
PSMB115 (PSMM116)	2,66	2,59	2,2	3,14
PSMB46 (PSMM117)	4,54	3,18	2,21	4,79
PSMB67 (PSMM118)	3,95	4,3	3	6,13
PSMB74 (PSMM119)	7,94	13	3,16	12,5

- 70 045935

PSMB78 (PSMM120)	5,08	4,79	22,3	6,82
PSMB81 (PSMM121)	3,66	3,83	3,05	5,11
PSMB82 (PSMM122)	15,1	28,4	10,8	24,3
PSMB83 (PSMM123)	37,5	42,1	3,04	4,88
PSMB85 (PSMM124)	34,6	52,9	20,7	46,8
PSMB87 (PSMM125)	4,23	3,74	2,26	4,73
PSMB89 (PSMM126)	51,8	53,1	11,7	6,27
PSMB90 (PSMM127)	42,8	30,2	7,74	5,99
PSMB91 (PSMM128)	3,9	27,6	2,37	4,32
PSMB92 (PSMM129)	45,7	37,3	12,1	7,4
PSMB93 (PSMM130)	5,13	7,85	4,11	7,82
PSMB94 (PSMM131)	3,67	3,23	2,32	4,72
PSMB95 (PSMM132)	4,05	3,64	2,56	5,57
PSMB96 (PSMM133)	3,91	4,54	2,37	4,65
PSMB97 (PSMM134)	3,22	3,16	4,08	4,22
PSMB98 (PSMM135)	15,6	12,7	2,22	4,21
PSMB99 (PSMM136)	4,08	3,26	2,22	5,04
PSMB100 (PSMM137)	5,24	3,82	2,16	4,83
PSMB101 (PSMM138)	3,84	3,14	2,23	4,52
PSMB102 (PSMM139)	4,51	3,82	2,23	4,59
PSMB103 (PSMM140)	6,81	4,27	2,21	5,41
PSMB104 (PSMM141)	7,52	4,35	2,26	4,39
PSMB105 (PSMM142)	5,03	11,2	4,87	7,28
PSMB106 (PSMM143)	3,87	3,8	2,73	4,9
PSMB107 (PSMM144)	3,3	3,35	2,3	4,64
PSMB108 (PSMM145)	6,78	3,83	2,33	4,98
PSMB110(PSMM146)	4,03	3,23	2,28	5,3
PSMB111 (PSMM147)	3,71	3,26	2,36	5,11
PSMB112 (PSMM148)	4,54	3,26	2,26	4,86
PSMB113 (PSMM149)	84,3	104	51,7	94,2
PSMB114 (PSMM150)	3,31	3,26	2,21	5,14
PSMB115 (PSMM151)	3,55	3,43	2,3	4,21

Кривые доза-ответ для Fab, экспрессируемых млекопитающими После подтверждения положительного связывания клонов Fab, экспрессируемых млекопитающими, в виде чистых супернатантов Fab с линиями клеток, экспрессирующих PSMA, супернатанты нормализовали по концентрации белка с помощью Octet или белкового геля, и строили кривые доза-ответ для подтверждения связывания PSMA с использованием протокола, описанного ранее. На фиг. 22-24 показаны кривые титрования для отобранных соединений, которые продемонстрировали связывание со всеми тремя PSMA-экспрессирующими клетками. На фиг. 22А, 22В, 22С и 22D показаны кривые титрования для отобранных при помощи фагового пэннинга соединений к PSMA и клеток LNCaP. На фиг. 23А, 23В, 23С и 23D показаны кривые титрования для отобранных при помощи фагового пэннинга соединений к PSMA и клеток HEK, экспрессирующих PSMA шимпанзе. На фиг. 24А, 24В, 24С и 24D показаны кривые титрования для отобранных при помощи фагового пэннинга соединений к PSMA и клеток HEK, экспрессирующих PSMA яванского макака. Профили связывания среди отобранных соединений сравнивали между линиями клеток, экспрессирующими различные виды PSMA. В экспериментах в качестве положительного контроля использовали супернатант PSMM52. Некоторые отобранные соединения были лишены приоритета из-за N-связанных сайтов гликозилирования в CDR, связывания с PSMA-отрицательной исходной клеточной линией HEK или отсутствия связывания с PSMA-положительными клеточными линиями. Оставалось одиннадцать отобранных Fab, a 10 последовательностей отобранных соединений клонировали в конструкты тяжелой цепи человеческого IgG4 PAA и использовали для создания биспецифических антител к PSMAxCD3. Эти отобранные соединения продемонстрировали межвидовое связывание в пределах 3 раз относительно друг от друга и

- 71 045935 были перенесены в формат биспецифических антител для тестирования на предмет перенаправления Т-клеток, уничтожающих PSMA-положительные мишени. Антигены для пэннинга для каждого отобранного соединения показаны в табл. 15.

Таблица 15

Антиген для каждого из отобранных при помощи фагового пэннинга соединений

Антиген раунда 1	Антиген раунда 2-3	Отобранные соединения	Идентификация отобранных соединений
ВКД PSMA шимпанзе	ВКД PSMA яванского макака	2	PSMM18, PSMM25
ВКД PSMA шимпанзе	НЕК, экспрессирующие PSMA шимпанзе	9	PSMM50, PSMM52, PSMM57, PSMM59, PSMM110, PSMM56, PSMM85, PSMM84
LNCaP	НЕК, экспрессирующие PSMA шимпанзе	2	PSMM87, PSMM81

Получение мкАт к PSMA.

Всего 12 клонов, которые продемонстрировали связывание со всеми тремя клетками, экспрессирующими PSMA, в конечном итоге были преобразованы в мкАт IgG4, имеющее замены в Fc изотипа S228P, F234A и L235A (РАА), посредством рестрикционного клонирования. Вкратце конструкты, соответствующие клонам Fab, прошедшим первоначальный скрининг, расщепляли HindIII и ApaI. Очищенные в геле фрагменты лигировали в вектор экспрессии с промотором CMV vDR000215, вектором экспрессии, управляемым CMV, содержащим человеческий Fc IgG4-PAA, для экспрессии полноразмерного мкАт. Это позволило быстро получить биспецифические антитела. Ранее описанный вектор экспрессии использовали для экспрессии тяжелой и легкой цепей для каждого мкАт к PSMA, при этом оба вектора временно котрансфицировали в линии клеток 293Expi или СНО для экспрессии мкАт. Последовательности CDR межвидовых положительных Fab к PSMA, полученных в результате фагового пэннинга, показаны ниже в табл. 16. Последовательности VH и VL выбранных Fab приведены ниже в табл. 17. Последовательности тяжелой и легкой цепей мкАт, полученных из Fab, показаны в табл. 18.

Таблица 16

Последовательности CDR (определенные по Kabat) антител после фагового пэннинга (соответствующие SEQ ID NO перечислены в скобках)

IDFAB		CDR (SEQ ID NO:)
		CDR1	CDR2	CDR3
PSMB109	НС	NAWIS (62)	WINPESGRANYAQKF QG (63)	ELYYLVYSTYYYAFDY (64)
LC	RASQSIDRWLN (65)	AASSLQS (60)	QQSPRYPLT (66)
PSMB86	НС	SYDIS (67)	GIIPIEGTANYAQKFQ G (68)	DYPAGYGFDY (69)
LC	RASQSVSSSYLA (70)	GASSRAT (71)	QQYGSSPLT (72)
PSMB84	НС	SDWMS (73)	AISGNGGSTEYADSV KG (74)	DPYYYYDGDSYYGMD V (75)
LC	RASQSISSYLN (76)	AASSLQS (60)	QQSYSTP (61)
PSMB83	НС	SDAMH (78)	EISGSGGYTNYADSV KG (79)	DSYDSSLYVGDYFDY (80)
LC	RASQSVSSYLA (81)	DASNRAT (82)	QQRSNWPLT (83)

- 72 045935

PSMB56	НС	SYAIS (84)	WISPYNGNANYAQKF QG (85)	DSDRSYNLDY (86)
LC	RASQSISGWLN (87)	AASSLQS (60)	QQSYSTPLT (88)
PSMB55	НС	SYWIG (89)	IIYPGDSDTRYSPSFQG (90)	GLPIWYLDY (91)
LC	RASQSVASDLA (92)	FASNRAT (93)	QQSITWPFT (94)
PSMB51	НС	SYAIS (95)	WIIPYNGNANYAQKF QG (96)	VNSAALVWERLDY (97)
LC	RASQSIDRWLN (65)	AASSLQS (60)	QQSPRYPLT (66)
PSMB49	НС	SYAIS (84)	GIIPIFGTANYAQKFQ G (98)	ASRVWHASYGYLDY (99)
LC	RASQSVSKWLA (100)	DASNRAT (82)	QQRFTAPWT (101)
PSMB25	НС	SYWIG (89)	IIYPGDSDTRYSPSFQG (90)	GWAYDRGLDY (102)
LC	KSSQSVLYSSNN KNYLA (ЮЗ)	WASTRES (104)	QQYYSTPLT (105)
PSMB18	НС	SYWIG (89)	IIYPGDSDTRYSPSFQG (90)	AYHYSKGLDY (106)
LC	KSSQSVLYSSNN KNYLA (103)	WASTRES (104)	QQYYSTPLT (105)
PSMB80	НС	DYAIS (107)	RIDPIEGTANYAQKFQ G (108)	DRYYYDGVYWYSDYF DY (109)
LC	RASQSISSYLN (76)	AASSLQS (60)	QQSYSTPLT (88)
PSMB58	НС	SYWIS (56)	IIYPGDSYTRYSPSFQG (57)	DYEWELFDSRLDY (58)
LC	RASQSISSYLN (59)	AASSLQS (60)	QQSYSTP (61)

Таблица 17

Последовательности VH и VL Fab к PSMA

ID FAB	Аминокислотная последовательность VH	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность VL	SEQ ID NO
PSMB10 9	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC KASGGTFSSYAISWVRQAPGQG LEWMGWISPYNGNANYAQKFQ GRVTITADESTSTAYMELSSLRS EDTAVYYCARVNSAALVWERL	110	DIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCRASQSID RWLNWYQQKPGKA PKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTL	111

- 73 045935

	DYWGQGTLVTVSS		TISSLQPEDFATYYC QQSPRYPLTFGQGTK VEIK
PSMB86	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC KASGGTFKSYDISWVRQAPGQG LEWMGGIIPIEGTANYAQKFQGR VTITADESTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARDYPAGYGFDYWGQG TLVTVSS	112	EIVLTQSPGTLSLSPG ERATLSCRASQSVSS SYLAWYQQKPGQAP RLLIYGASS RATGIP DRFSGSGSGTDFTLT ISRLEPEDFAVYYCQ QYGSSPLTFGQGTK VEIK	113
PSMB84	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFDSDWMSWVRQAPGKG LEWVSAISGNGGSTEYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDPYYYYDGDSYY GMD VWGQGTLVT VS S	114	DIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCRASQSISS YLNWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQ SYSTPLTFGQGTKVE IK	115
PSMB83	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFKSDAMHWVRQAPGKG LEWVSEISGSGGYTNYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDSYDSSLYVGDYF DYWGQGTLVTVSS	116	EIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSS YLAWYQQKPGQAP RLLIYDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ QRSNWPLTFGQGTK VEIK	117
PSMB80	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC KASGGTFDDYAISWVRQAPGQG LEWMGRIDPIEGTANYAQKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSE DTAVYYCARDRYYYDGVYWYS DYFDYWGQGTLVTVS	118	DIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCRASQSISS YLNWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQ SYSTPLTFGQGTKVE IK	119
PSMB58	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCK GSGYSFTSYWISWVRQMPGKGL EWMGIIYPGDSYTRYSPSFQGQV TISADKSISTAYLQWSSLKASDT AMYYCARDYEWELFDSRLDYW GQGTLVTVSS	120	DIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCRASQSISS YLNWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQ SYSTPLTFGQGTKVE IK	115
PSMB56	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC KASGGTFSSYAISWVRQAPGQG LEWMGWISPYNGNANYAQKFQ GRVTITADESTSTAYMELSSLRS EDTAVYYCARDSDRSYNLDYW GQGTLVTVSS	121	DIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCRASQSIS GWLNWYQQKPGKA PKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYC QQSYSTPLTFGQGTK VEIK	122
PSMB55	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCK	123	EIVLTQSPATLSLSPG	124

- 74 045935

	GSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGL EWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQV TISADKSISTAYLQWSSLKASDT AMYYCARGLPIWYLDYWGQGT LVTVSSA		ERATLSCRASQSVAS DLAWYQQKPGQAP RLLIYFASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ QSITWPFTFGQGTKV EIK
PSMB51	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC KASGGTFSSYAISWVRQAPGQG LEWMGWIIPYNGNANYAQKFQ GRVTITADESTSTAYMELSSLRS EDTAVYYCARVNSAALVWERL DYWGQGTLVTVSS	125	DIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCRASQSID RWLNWYQQKPGKA PKLLIYAASSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYC QQSPRYPLTFGQGTK VEIK	111
PSMB49	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC KASGGTFSSYAISWVRQAPGQG LEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGR VTITADESTSTAYMELSSLRSEDT AVYYCARASRVWHASYGYLDY WGQGTLVTVSS	126	EIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSK WLAWYQQKPGQAP RLLIYDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ QRFTAPWTFGQGTK VEIK	127
PSMB25	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCK GSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGL EWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQV TISADKSISTAYLQWSSLKASDT AMYYCARGWAYDRGLDYWGQ GTLVTVSS	128	DIVMTQSPDSLAVSL GERATINCKSSQSVL YSSNNKNYLAWYQ QKPGQPPKLLIYWAS TRESGVPDRFSGSGS GTDFTLTISSLQAED VAVYYCQQYYSTPL TFGQGTKVEIK	129
PSMB18	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCK GSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGL EWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQV TISADKSISTAYLQWSSLKASDT AMYYCARAYHYSKGLDYWGQ GTLVTVSS	130	DIVMTQSPDSLAVSL GERATINCKSSQSVL YSSNNKNYLAWYQ QKPGQPPKLLIYWAS TRESGVPDRFSGSGS GTDFTLTISSLQAED VAVYYCQQYYSTPL TFGQGTKVEIK	131

Таблица 18

Последовательности тяжелой и легкой цепей моноклональных антител к PSMA с соответствующими SEQ ID NO

ID мкАт	Аминокислотная последовательность тяжелой цепи	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность легкой цепи	SEQ ID NO
PSMB129 (FAB PSMB109)	QVQLVQSGAEVKKPGSSVK VSCKASGGTFSSYAISWVRQ APGQGLEWMGWISPYNGNA NYAQKFQGRVTITADESTST AYMELSSLRSEDTAVYYCA RVNSAALVWERLDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPC	132	DIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCRASQSIDRWLNWY QQKPGKAPKLLIYAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQSP RYPLTFGQGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGT	133

- 75 045935

PSMB130 (FAB PSMB86)

SRSTSESTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTKTYTCNVDHKPSNTKV DKRVESKYGPPCPPCPAPEA AGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPE VTC V V VD VS QEDPE VQF NWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGK

ASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC

QVQLVQSGAEVKKPGSSVK VSCKASGGTFKSYDISWVRQ APGQGLEWMGGIIPIEGTAN YAQKFQGRVTITADESTSTA YMELSSLRSEDTAVYYCAR DYPAGYGFDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPCSRSTS ESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTKT YTCNVDHKPSNTKVDKRVE SKYGPPCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSQEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSLGK

134

EIVLTQSPGTLSLSPGERA TLSCRASQSVSSSYLAWY QQKPGQAPRLLIYGASSR ATGIPDRFSGSGSGTDFTL TISRLEPEDFAVYYCQQY GSSPLTFGQGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC

135

PSMB128 (FAB PSMB84)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFDSDWMSWVRQ APGKGLEWVSAISGNGGSTE YADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCAR DPYYYYDGDSYYGMDVWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPL	136	DIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCRASQSISSYLNWYQ QKPGKAPKLLIYAASSLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQSYS TPLTFGQGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTA	137
APCSRSTSESTAALGCLVKD		SVVCLLNNFYPREAKVQ
	YFPEPVTVSWNSGALTSGVH		WKVDNALQSGNSQESVT
	TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP		EQDSKDSTYSLSSTLTLSK
	SSSLGTKTYTCNVDHKPSNT		ADYEKHKVYACEVTHQG
	KVDKRVESKYGPPCPPCPAP		LSSPVTKSFNRGEC

- 76 045935

EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEV QFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGK

PSMB127 (FAB PSMB83)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFKSDAMHWVRQ APGKGLEWVSEISGSGGYTN YADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCAR DSYDSSLYVGDYFDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPC SRSTSESTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTKTYTCNVDHKPSNTKV DKRVESKYGPPCPPCPAPEA AGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPE VTC V V VD VS QEDPE VQF NWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGK	138	EIVLTQSPATLSLSPGERA TLSCRASQSVSSYLAWYQ QKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTI SSLEPEDFAVYYCQQRSN WPLTFGQGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC	139
PSMB126 (FAB PSMB80)	QVQLVQSGAEVKKPGSSVK VSCKASGGTFDDYAISWVR QAPGQGLEWMGRIDPIEGTA NYAQKFQGRVTITADESTST AYMELSSLRSEDTAVYYCA RDRYYYDGVYWYSDYFDY WGQGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPS NTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSQED PEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKG	140	DIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCRASQSISSYLNWYQ QKPGKAPKLLIYAASSLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQSYS TPLTFGQGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC	137

- 77 045935

	LPSSIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSQEEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSLG К
PSMB124 (FAB PSMB56)	QVQLVQSGAEVKKPGSSVK VSCKASGGTFSSYAISWVRQ APGQGLEWMGWISPYNGNA NYAQKFQGRVTITADESTST AYMELSSLRSEDTAVYYCA RDSDRSYNLDYWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKR VESKYGPPCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSLGK	141	DIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCRASQSISGWLNWY QQKPGKAPKLLIYAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQSY STPLTFGQGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC	142
PSMB123 (FAB PSMB55)	EVQLVQSGAEVKKPGESLKI SCKGSGYSFTSYWIGWVRQ MPGKGLEWMGIIYPGDSDTR YSPSFQGQVTISADKSISTAY LQWSSLKASDTAMYYCARG LPIWYLDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSES TAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTKTY TCNVDHKPSNTKVDKRVES KYGPPCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEG	143	EIVLTQSPATLSLSPGERA TLSCRASQSVASDLAWYQ QKPGQAPRLLIYFASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTI SSLEPEDFAVYYCQQSIT WPFTFGQGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC	144

- 78 045935

	NVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSLGK
PSMB122 (FAB PSMB51)	QVQLVQSGAEVKKPGSSVK VSCKASGGTFSSYAISWVRQ APGQGLEWMGWIIPYNGNA NYAQKFQGRVTITADESTST AYMELSSLRSEDTAVYYCA RVNSAALVWERLDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPC SRSTSESTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTKTYTCNVDHKPSNTKV DKRVESKYGPPCPPCPAPEA AGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGK	145	DIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCRASQSIDRWLNWY QQKPGKAPKLLIYAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQSP RYPLTFGQGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC	133
PSMB121 (FAB PSMB49)	QVQLVQSGAEVKKPGSSVK VSCKASGGTFSSYAISWVRQ APGQGLEWMGGIIPIFGTAN YAQKFQGRVTITADESTSTA YMELSSLRSEDTAVYYCAR ASRVWHASYGYLDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPC SRSTSESTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTKTYTCNVDHKPSNTKV DKRVESKYGPPCPPCPAPEA AGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPE VTC V V VD VS QEDPE VQF NWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGK	146	EIVLTQSPATLSLSPGERA TLSCRASQSVSKWLAWY QQKPGQAPRLLIYDASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTL TISSLEPEDFAVYYCQQRF TAPWTFGQGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC	147
PSMB120 (FAB	EVQLVQSGAEVKKPGESLKI SCKGSGYSFTSYWIGWVRQ MPGKGLEWMGIIYPGDSDTR	148	DIVMTQSPDSLAVSLGER ATINCKSSQSVLYSSNNK NYLAWYQQKPGQPPKLLI	149

- 79 045935

PSMB25)

YSPSFQGQVTISADKSISTAY LQWSSLKASDTAMYYCARG WAYDRGLDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPCSRSTS ESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTKT YTCNVDHKPSNTKVDKRVE SKYGPPCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVT C VVVD VS QEDPE VQFNW YV DGVEVHNAKTKPREEQFNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSLGK

YWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAV YYCQQYYSTPLTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGE C

PSMB119 (FAB PSMB18)

PSMB87 (FAB PSMB58)

EVQLVQSGAEVKKPGESLKI SCKGSGYSFTSYWIGWVRQ MPGKGLEWMGIIYPGDSDTR YSPSFQGQVTISADKSISTAY LQWSSLKASDTAMYYCARA YHYSKGLDYWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSE STAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTKTY TCNVDHKPSNTKVDKRVES KYGPPCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSLGK

150

DIVMTQSPDSLAVSLGER ATINCKSSQSVLYSSNNK NYLAWYQQKPGQPPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAV YYCQQYYSTPLTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGE C

149

EVQLVQSGAEVKKPGESLKI SCKGSGYSFTSYWISWVRQ MPGKGLEWMGIIYPGDSYTR YSPSFQGQVTISADKSISTAY LQWSSLKASDTAMYYCARD YEWELFDSRLDYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPCSRS TSESTAALGCLVKDYFPEPV

TVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKR VESKYGPPCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSLGK

151

DIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCRASQSISSYLNWYQ QKPGKAPKLLIYAASSLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQSYS TPLTFGQGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQ

WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC

137

Было создано моноспецифическое антитело к CD3 PSMB119, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 130 и VL с SEQ ID NO: 131 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A, и L235A. Было создано моноспецифическое антитело к CD3 PSMB120, содержащее области VH и

- 80 045935

VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 128 и VL с SEQ ID NO: 129 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A и L235A. Было создано моноспецифическое антитело к CD3 PSMB121, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 126 и VL с SEQ ID NO: 127 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A и L235A. Было создано моноспецифическое антитело к CD3 PSMB122, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 125 и VL с SEQ ID NO: 111 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A и L235A. Было создано моноспецифическое антитело к CD3 PSMB123, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 123 и VL с SEQ ID NO: 124 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A и L235A. Было создано моноспецифическое антитело к CD3 PSMB124, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 121 и VL с SEQ ID NO: 122 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A и L235A. Было создано моноспецифическое антитело к CD3 PSMB126, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 118 и VL с SEQ ID NO: 119 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A и L235A. Было создано моноспецифическое антитело к CD3 PSMB127, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 116 и VL с SEQ ID NO: 117 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A и L235A. Было создано моноспецифическое антитело PSMB128 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 114 и VL с SEQ ID NO: 115 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A и L235A. Было создано моноспецифическое антитело PSMB129 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 110 и VL с SEQ ID NO: 111 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A и L235A. Было создано моноспецифическое антитело PSMB130 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 112 и VL с SEQ ID NO: 113 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A и L235A.

2.5. Кристаллическая структура ВКД PSMA человека, связанного с Fab к PSMA.

PSMB83 (также известный как PSMM84).

PSMA представляет собой гомодимерный белок, экспрессируемый на клеточной поверхности. PSMA представляет собой интегральный гликопротеин типа II из 750 остатков на мономер, состоящий из большого домена ВКД (705 остатков) с пептидазной активностью, однопроходного ТМ домена и короткого внутриклеточного домена из 19 остатков. Кристаллическая структура внеклеточной области (ВКД) человеческого PSMA, связанного с Fab-плечом к PSMA из биспецифического антитела PS3B27, была определена с разрешением 3,15 А, чтобы лучше охарактеризовать сайт объединения между PSMA и антителом.

Внеклеточную область человеческого PSMA (остатки 44-750) экспрессировали в клетках насекомых High Five™ с N-концевым сигнальным пептидом gp67 с последующей расщепляемой гексагистидиновой меткой (SEQ ID NO: 596). Секретируемый белок очищали из супернатанта с помощью трехэтапной процедуры, включающей начальный Ni²⁺-NTA аффинный захват, TEVопосредованное расщепление гистидиновой метки с последующей стадией обратной аффинной хроматографии и заключительной стадией эксклюзионной хроматографии. Очищенный PSMA-ВКД замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С в 10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 2 мМ CaCl₂, 0,1 мМ ZnCl₂ Fab PSMB83 (также известного как PSMM84), который является исходным Fab-плечом против PSMA в биспецифическом антителе PS3B27, экспрессировался в клетках HEK293 Expi с гексагистидиновой меткой (SEQ ID NO: 596) и очищали с помощью аффинной (HisTrap, GE Healthcare) и гель-фильтрационной хроматографии (SEC-300, Phenomenex Yarra). Fab хранили при 4°С в 50 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 7,4.

Комплекс ВКД PSMA человека/Fab PSMB83 получали с помощью трехстадийной процедуры. Сначала Fab заменяли на 20 мМ MES, рН 6,0, 150 мМ NaCl. Затем Fab и PSMA смешивали (1,5 молярный избыток Fab по отношению к мономеру PSMA) и инкубировали в течение ночи при 4°С при диализе в 20 мМ MES, рН 6,0. Наконец, комплекс связывали с колонкой monoS 5/50 в 20 мМ MES, рН 6,0, и элюировали градиентом NaCl.

Кристаллы, подходящие для рентгеноструктурного анализа, были получены с использованием метода диффузии паров в сидячей капле при 20°С и робота Mosquito LCP (ТТР Labtech). Кристаллы Fab PSMB83, связанного с ВКД PSMA человека, выращивали из 18% ПЭГ 3 кДа, 0,2 М (NH₄)₂SO₄, 0,1 М Трис, рН 8,5 с микрозатравками и комплексом PSMA/Fab первоначально в концентрации 7,3 мг/мл. Кристаллы несвязанного PSMB83 Fab получали из 25% ПЭГ 3 кДа, 0,2 М LiCl, 0,1 М ацетата рН 4,5, при этом Fab первоначально содержалось в концентрации 8,8 мг/мл.

Структуры были расшифрованы путем молекулярного замещения (MR) с помощью Phaser (программное обеспечение Phaser Crystallographic Software, Кембриджский университет). Поисковой моделью MR для структуры Fab PSMB83 (также называемой PSMM84) был код PDB 4M6O. Структуру комплекса PSMA/Fab определяли с использованием кристаллических структур PSMA (код PDB: 2C6G) и PSMB83 Fab (структура с разрешением 1,93 А; данные не показаны) в качестве поисковых моделей MR. Структуры были уточнены с помощью PHENIX (Adams et al., 2004), а корректировки модели были выполнены с помощью COOT (Emsley and Cowtan, 2004). Все остальные кристаллографические расчеты проводили с помощью пакета программ ССР4 (Collaborative Computational Project Number 4, 1994). Все молекулярные графики были созданы с помощью PyMol (система молекулярной графики

- 81 045935

PyMOL, версия 1.4.1, Schrodinger, LLC), а определяющие комплементарность области (CDR) были определены с использованием определения по Kabat.

Структура PSMA/Fab включает остатки 1-211 легкой цепи Fab, остатки 1-224 тяжелой цепи Fab (за исключением остатков 138-146, которые неупорядочены) и остатки 56-750 PSMA, что соответствует протеазе (остатки 56-116 и 352-590), апикальный (остатки 117-351) и спиральный (остатки 591-750) домены и семь из десяти возможных N-связанных гликанов (в Asn-76, -121, -140, -195, -459, -476 и -638) на субъединицу димера PSMA. Активный участок PSMA яванского макака размещен на поверхности раздела между тремя доменами, и он содержит два атома цинка, скоординированных гистидином (Н377 и Н553) и остатками глутамата/аспартата (D387, каталитический Е424, Е425 и D453), и молекулу воды. Кристаллическое асимметричное звено содержит один димер PSMA, причем каждая субъединица связана аналогично Fab PSMB83. Сайт связывания Fab/PSMA хорошо определяется картой электронной плотности, что позволяет надежно позиционировать связывающие остатки. Молекулы Fab и PSMA последовательно пронумерованы на фиг. 25-30.

Эпитоп, паратоп и взаимодействия PSMB83. PSMB83, который является исходным Fab-плечом к PSMA в биспецифическом антителе PS3B27, распознает конформационный и прерывистый эпитоп в апикальном домене PSMA (фиг. 25). Площадь поверхности PSMA, погруженная Fab, составляет около 700 А². В частности, остатки эпитопа PSMB83 представляют собой 1138, F235, Р237, G238, D244, Y299, Y300, Q303, K304, Е307 и К324-Р326. Спираль а7 (остатки Y299-E307) является преобладающей областью эпитопа и связывается через CDR тяжелой и легкой цепей Fab. На одном конце спирали Y299 и Y300 образуют ароматический кластер с остатками Fab Y57^H, W94L и остатками PSMA F235 и Р237, тогда как Е307 на другом конце спирали образует соляной мостик с R91L и водородными связями Y32L. На фиг. 26 и 27 показаны основные взаимодействия PSMA с легкой и тяжелой цепями PSMB83. Остатки эпитопа PSMB83 являются консервативными для человека и яванского макака (фиг. 28), и было продемонстрировано, что биспецифическое антитело PS3B27 связывается со сходной аффинностью с PSMA человека и яванского макака. Напротив, ожидается, что мутации эпитопа G238A и особенно Y300D от человека к мыши будут снижать аффинность связывания PSMB83 с мышиным PSMA по сравнению с человеческим. Мутация Y300D нарушает контакт водородной связи с N59^H и взаимодействие π-стэкинга с W94L.

Паратоп PSMB83 состоит из остатков всех CDR, кроме CDR-L2 и CDR-H1 (фиг. 29). В частности, остатки паратопа представляют собой S30^L, Y32L, R91L, S92L, W94L легкой цепи и G56^H-N59^H, K65^H, G66^H, Y101^H, V107^H и D109^H тяжелой цепи. На фиг. 30 показаны контакты взаимодействия между PSMA и PSMB83. Удаленное расположение эпитопа способствует связыванию Fab-плеча к PSMB83 в биспецифическом антителе к PS3B27 с мембраносвязанным PSMA, а другое Fab-плечо по-прежнему связано с CD3 в Т-клеточной мембране. Предполагается, что PSMB83 не будет ингибировать ферментативную активность PSMA, поскольку антитело связывается с активным центром и не вызывает каких-либо значительных структурных изменений в PSMA, которые могут повлиять на ферментативную функцию, например, движения петли, которые закрывают активный центр, или смещение каталитических остатков (RMSD 0,3 А для суперпозиции Са молекул PSMA в связанных и несвязанных Fab (Barinka et al, 2007) структурах).

2.6. Созревание аффинности антитела к PSMA.

Созревание аффинности проводили на фаговых клонах Fab к PSMA из двух библиотек созревания аффинности PSMA для идентификации антитела с повышенной аффинностью связывания по сравнению с исходным PSMB127 (ID fab=PSMB83, также известное как PSMM84). Были созданы две библиотеки для созревания аффинности PSMB127). В первой библиотеке CDR1 и CDR2 тяжелой цепи рандомизировали в соответствии с дизайном, приведенным в табл. 19 (PH9H9L1). Фрагмент H-CDR3 амплифицировали с помощью ГЩР из pDR000024032 и расщепляли SacII+XhoI. Этот фрагмент клонировали в библиотеку PH9H9L1/PH9L3. Им трансформировали клетки E.coli MC1061F', и получали фаг, отображающий эту библиотеку Fab. Во второй библиотеке CDR легкой цепи были рандомизированы в соответствии с дизайном в табл. 20 (PH9L3L3). Тяжелую цепь из PSMB83 (PSMH360) амплифицировали с помощью ПЦР и расщепляли NcoI+XhoI. Этот фрагмент был клонирован в ДНК библиотеки PH9L3L3 (ELN: фаговая библиотека De Novo 2010 SRI-021). Его трансформировали в клетки E.coli MC1061F' и получили фаг, отображающий эту библиотеку Fab.

- 82 045935

Таблица 19

Дизайн библиотеки PH9H9L1

Положение	Исходная а.к.	а.к. библиотеки
30	S	D, К, S
31	S	D,N, S,Т
32	д	A,D, S,Y
33	А	A, D, G, S, W, Y
35	S	Η, N, S
50	А	А, Е, L, N, R, Т, W, Y
52	S	A, D, L, N, R, S
54	S	А, Е, N, S, Y
57	S	D, N, R, S, Т, Y
59	д	Е, G, N, Q, R, Y

Таблица 20

Дизайн библиотеки PH9L3L3

Положение	Исходная а.к.	а.к. библиотеки
30	S	D, N, R, S
31	S	N, S, Т
32	д	D, N, R, S, Y
49	д	Е, Н, К, Y
50	D	D, G, S, W, Y
53	N	D, N, S, Т, Y
91	R	A, D, Е, G, Η, N, R, S, W, Y
92	S	A, D, Е, G, Η, N, R, S, W, Y
93	N	A, D, Е, G, Η, N, R, S, W, Y
94	W	A, D, Е, G, Η, N, R, S, W, Y
96	L	F, I, L, N, R, W, Y

Пэннинг в растворе для Fab-pIX-библиотек созревания аффинности к PSMA выполняли по отношению к биотинилированному ВКД PSMA человека в течение трех раундов. Связанный с фагом антиген захватывали нейтравидиновыми гранулами (GE Health Care Life Science, кат. № 78152104011150) в соответствии с протоколом производителя с последующими интенсивными промывками 1х PBST (0,05% Твин-20) и длительной инкубацией с немеченым ВКД PSMA в 500-кратном молярном избытке биотинилированного антигена. В результате пэннинга получили клоны, PSMXP46R3_59H09, PSMXP46R3_59H06, PSMXP46R3_59E03, PSMXP46R3_59C09, PSMXP46R3_59H01, PSMXP46R3_59F11, и PSMXP46R3_59F07.

Для определения уровня экспрессии клонов fab к PSMA 96-луночные планшеты Maxisorb покрывали в течение ночи при 4°С антитело к Fd IgG человека, промывали и блокировали 3% молокомPBS-0,05% Твин в течение 1 ч. Образцы супернатанта фага были серийно разбавляли в 2 раза для 11 разведений в блокирующем буфере с последней лункой для контроля. 100 мкл этих растворов захватывали на покрытых планшетах в течение 1 ч. Планшеты промывали и добавляли 100 мкл конъюгированного с ПХ антитела к F(ab')2 в течение 1 ч. Планшеты промывали и проявляли, используя 100 мкл реагента пероксидазы, а люминесценцию считывали на Envision (фиг. 31).

Для определения связывания клонов Fab к PSMA с рекомбинантным белком человека и яванского макака 96-луночные планшеты Maxisorb покрывали 100 мкл 5 мкг/мл нейтравидина в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали и блокировали 3% водным раствором PBS-0,05% Твина в течение 1 ч. Рекомбинантные биотинилированные белки PSMA человека и яванского макака захватывали в концентрации 2,5 мкг/мл в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали и 100 мкл 2-кратно серийно разведенного супернатанта Fab собирали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшет промывали, а затем инкубировали в течение 2,5 ч с 200 мкл 0,3% молока в PBST, чтобы смыть некоторые из Fab со слабой аффинностью. Затем проводили еще 30 мин инкубации со свежеприготовленными 200 мкл 0,3% молока в PBST в для удаления Fab с более слабой аффинностью. Планшеты промывали и добавляли 100 мкл конъюгированного с ПХ антитела к F(ab')2 в течение 1 ч. Планшеты промывали и проявляли, используя 100 мкл реагента пероксидазы, а люминесценцию считывали на Envision (фиг. 32 и 33).

На фиг. 31 показано, что белковая экспрессия исходного Fab и Fab с созревшей аффинностью была

- 83 045935 сходной. Значения оси Y представляют люминесценцию реагента обнаружения, которая соответствует содержанию белка fab на кривой разведения; чем выше показатель люминесценции, тем больше белка в лунке, которое уменьшается при последовательных двукратных разведениях. В лунках с fab со зрелой аффинностью было больше белка, но увеличение по сравнению с исходным было не более чем в пять раз больше, что демонстрируется значениями ЕС50 (которые представляют собой концентрацию белка, которая дает половину максимального ответа). Эти данные демонстрируют, что различие в профилях связывания с PSMA на фиг. 32 и 33 не связано с различием в концентрации Fab.

На фиг. 32 показано улучшенное связывание Fab с созревшей аффинностью с человеческим рекомбинантным антигеном по сравнению с исходным Fab к PSMA (PSMB83). Опять же, ось Y графика представляет значения люминесценции. В этом случае чем больше значение, тем больше Fab связывается с белком PSMA человека. Оно представляет собой меру связывания, поскольку повышенные концентрации Fab (по оси X) приводят к более высоким значениям люминесценции. В этих условиях наблюдали пренебрежимо малое связывание исходного Fab, что подтверждается отсутствием сигнала даже при высоких концентрациях (незаштрихованные кружки вдоль оси X). Связывание Fab с созревшей аффинностью наблюдали для тестируемых концентраций, что соответствует более сильной способности связывания с человеческим белком PSMA. Учитывая, что связывание исходного Fab с белком PSMA человека было равно нулю, невозможно было получить ЕС50.

На фиг. 33 показано улучшенное связывание Fab с созревшей аффинностью с рекомбинантным антигеном яванского макака по сравнению с исходным Fab к PSMA (PSMB83). Опять же, ось Y графика представляет значения люминесценции. В этом случае чем больше значение, тем больше Fab связывается с белком PSMA яванского макака. Оно представляет собой меру связывания, поскольку повышенные концентрации Fab (по оси X) приводят к более высоким значениям люминесценции. В этих условиях наблюдали пренебрежимо малое связывание исходного Fab, что подтверждается отсутствием сигнала даже при высоких концентрациях (незаштрихованные кружки вдоль оси X). Связывание Fab с созревшей аффинностью наблюдали для тестируемых концентраций, что соответствует более сильной способности связывания с человеческим белком PSMA. Учитывая, что связывание исходного Fab с белком PSMA человека было нулевым, для прямого сравнения нельзя было получить ЕС50.

В целом профили связывания Fab фагов демонстрируют улучшенное связывание с рекомбинантным антигеном человека и яванского макака по сравнению с исходным мкАт к PSMA (PSMB127). Это улучшение не является результатом различий в профилях экспрессии Fab, как показано на фиг. 33 и 34, демонстрирующих связывание Fab с созревшей аффинностью, нормализованное к уровням экспрессии Fab. Пять лучших Fab-кандидатов, идентифицированных с помощью скрининга на основе ИФА, были получены в формате моноклональных антител IgG4 PAA. В табл. 21 перечислены последующие идентификаторы мкАт, а в табл. 22 и 23 показаны последовательности для их вариабельных областей и последовательности для тяжелой и легкой цепей соответственно.

Таблица 21

Пять основных антител со зрелой аффинностью, идентифицированных с помощью ИФА

	НС	LC
Ш ячейки	SEQ ID	SEQ ID	Ш белка мкАт
PSMXP46R3_59C09	PSMH859	PSML160	PSMB346
PSMXP46R3_59E03	PSMH859	PSML159	PSMB345
PSMXP46R3_59F07	PSMH862	PSML158	PSMB349
PSMXP46R3_59H01	PSMH860	PH9L3	PSMB347
PSMXP46R3_59H06	PSMH859	PH9L3	PSMB344

- 84 045935

Таблица 22

Последовательности VH и VL для пяти лучших Fab-кандидатов к PSMA

ID мкАт	Аминокислотная последовательность VH	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность VL	SEQ ID NO
PSMB3 44	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTFKSDAMHWVRQAPGK GLEWVSEISGSGGYTNYADSMK GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCARDSYDSSLYVG DYFDYWGQGTLVTVSS	6	EIVLTQSPATLSLSPGERA TLSCRASQSVSSYLAWY QQKPGQAPRLLIYDASN RATGIPARFSGSGSGTDF TLTISSLEPEDFAVYYCQ QRSNWPLTFGQGTKVEI К	117
PSMB3 45	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTFKSDAMHWVRQAPGK GLEWVSEISGSGGYTNYADSMK GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCARDSYDSSLYVG DYFDYWGQGTLVTVSS	6	EIVLTQSPATLSLSPGERA TLSCRASQSVSNYLAWY QQKPGQAPRLLIHDASN RATGIPARFSGSGSGTDF TLTISSLEPEDFAVYYCQ QRRNWPLTFGQGTKVEI К	9
PSMB3 46	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTFKSDAMHWVRQAPGK GLEWVSEISGSGGYTNYADSMK GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCARDSYDSSLYVG DYFDYWGQGTLVTVSS	6	EIVLTQSPATLSLSPGERA TLSCRASQSVSSYLAWY QQKPGQAPRLLIYDASY RATGIPARFSGSGSGTDF TLTISSLEPEDFAVYYCQ QRRNWPLTFGQGTKVEI К	682
PSMB3 47	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTFKSDAMHWVRQAPGK GLEWVSEISGSGGYTNYADSMK SRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCARDSYDSSLYVG DYFDYWGQGTLVTVSS	7	EIVLTQSPATLSLSPGERA TLSCRASQSVSSYLAWY QQKPGQAPRLLIYDASN RATGIPARFSGSGSGTDF TLTISSLEPEDFAVYYCQ QRSNWPLTFGQGTKVEI К	117
PSMB3 49	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTFKSDAMHWVRQAPGK GLEWVSEISGSGGYTNYADSLK GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCARDSYDSSLYVG DYFDYWGQGTLVTVSS	8	EIVLTQSPATLSLSPGERA TLSCRASQSVSSYLAWY QQKPGQAPRLLIYDASN RATGIPARFSGSGSGTDF TLTISSLEPEDFAVYYCQ QRGNWPLTFGQGTKVEI К	10

- 85 045935

Таблица 23

Последовательности тяжелой и легкой цепей пяти лучших кандидатов к PSMA в формате моноклонального антитела IgG4 PAA

ID мкАт	Аминокислотная последовательность тяжелой цепи	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность легкой цепи	SEQ ID NO
PSMB344	EVQLLESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFKSDAMHWVRQ APGKGLEWVSEISGSGGYTN YADSMKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCAR DSYDSSLYVGDYFDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPC SRSTSESTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTKTYTCNVDHKPSNTKV DKRVESKYGPPCPPCPAPEA AGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGK	11	EIVLTQSPATLSLSPGERAT LSCRASQSVSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTIS SLEPEDFAVYYCQQRSNW PLTFGQGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC	139
PSMB345	EVQLLESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFKSDAMHWVRQ APGKGLEWVSEISGSGGYTN YADSMKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCAR DSYDSSLYVGDYFDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPC SRSTSESTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFP	11	EIVLTQSPATLSLSPGERAT LSCRASQSVSNYLAWYQQ KPGQAPRLLIHDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTIS SLEPEDFAVYYCQQRRNW PLTFGQGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQD	14

- 86 045935

	AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTKTYTCNVDHKPSNTKV DKRVESKYGPPCPPCPAPEA AGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGK		SKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
PSMB346	EVQLLESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFKSDAMHWVRQ APGKGLEWVSEISGSGGYTN YADSMKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCAR DSYDSSLYVGDYFDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPC SRSTSESTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTKTYTCNVDHKPSNTKV DKRVESKYGPPCPPCPAPEA AGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGK	11	EIVLTQSPATLSLSPGERAT LSCRASQSVSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYDASYRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTIS SLEPEDFAVYYCQQRRNW PLTFGQGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC	680
PSMB347	EVQLLESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFKSDAMHWVRQ APGKGLEWVSEISGSGGYTN YADSMKSRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCAR DSYDSSLYVGDYFDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPC SRSTSESTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTKTYTCNVDHKPSNTKV DKRVESKYGPPCPPCPAPEA AGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREE	12	EIVLTQSPATLSLSPGERAT LSCRASQSVSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTIS SLEPEDFAVYYCQQRSNW PLTFGQGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC	139

- 87 045935

	QFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGK
PSMB349	EVQLLESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFKSDAMHWVRQ APGKGLEWVSEISGSGGYTN YADSLKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCAR DSYDSSLYVGDYFDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPC SRSTSESTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTKTYTCNVDHKPSNTKV DKRVESKYGPPCPPCPAPEA AGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGK	13	EIVLTQSPATLSLSPGERAT LSCRASQSVSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTIS SLEPEDFAVYYCQQRGNW PLTFGQGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC	15

Различных НС и 4 различных LC были объединены в матричный формат для увеличения разнообразия отобранных вариантов (табл. 24). Учитывая, что метионин в CDR2 PSMH860 имеет риск посттрансляционный модификации, была создана новая последовательность с M64L и обозначена как PSMH865. PSMH865 соединяли с PSML160 для создания мкАт PSMB365.

Таблица 24

Матричный формат комбинированных 3 тяжелых цепей и 4 легких цепей

	PSMH859	PSMH860	PSMH862
PH9L3	PSMB344	PSMB347	PSMB358
PSML158	—	PSMB361	PSMB349
PSML159	PSMB345	PSMB362	PSMB359
PSML160	PSMB346	PSMB363	PSMB360

В табл. 25 и 26 представлены последовательности вариабельных областей из рекомбинированной матрицы и последовательности тяжелой и легкой цепей соответственно.

- 88 045935

Таблица 25

Последовательности VH и VL отобранных соединений к PSMA из рекомбинрованной матрицы

ID мкАт	Аминокислотная последовательность VH	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность VL	SEQ ID NO
PSMB3 58	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFKSDAMHWVRQAPGKG LEWVSEISGSGGYTNYADSLKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDSYDSSLYVGDYF DYWGQGTLVTVSS	8	EIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSS YLAWYQQKPGQAP RLLIYDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ QRSNWPLTFGQGTK VEIK	117
PSMB3 59	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFKSDAMHWVRQAPGKG LEWVSEISGSGGYTNYADSLKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDSYDSSLYVGDYF DYWGQGTLVTVSS	8	EIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSN YLAWYQQKPGQAP RLLIHDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ QRRNWPLTFGQGTK VEIK	9
PSMB3 60	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFKSDAMHWVRQAPGKG LEWVSEISGSGGYTNYADSLKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDSYDSSLYVGDYF DYWGQGTLVTVSS	8	EIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSS YLAWYQQKPGQAP RLLIYDASYRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ QRRNWPLTFGQGTK VEIK	682
PSMB3 61	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFKSDAMHWVRQAPGKG LEWVSEISGSGGYTNYADSMKS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDSYDSSLYVGDYF DYWGQGTLVTVSS	7	EIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSS YLAWYQQKPGQAP RLLIYDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ QRGNWPLTFGQGTK VEIK	10
PSMB3 62	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFKSDAMHWVRQAPGKG LEWVSEISGSGGYTNYADSMKS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDSYDSSLYVGDYF DYWGQGTLVTVSS	7	EIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSN YLAWYQQKPGQAP RLLIHDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ QRRNWPLTFGQGTK VEIK	9
PSMB3 63	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFKSDAMHWVRQAPGKG LEWVSEISGSGGYTNYADSMKS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDSYDSSLYVGDYF DYWGQGTLVTVSS	7	EIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSS YLAWYQQKPGQAP RLLIYDASYRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ	682
			QRRNWPLTFGQGTK VEIK
PSMB3 65	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFKSDAMHWVRQAPGKG LEWVSEISGSGGYTNYADSLKSR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARDSYDSSLYVGDYFD YWGQGTLVTVSS	681	EIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSS YLAWYQQKPGQAP RLLIYDASYRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ QRRNWPLTFGQGTK VEIK	682

- 89 045935

Таблица 26

Последовательности тяжелой и легкой цепей отобранных соединений к PSMA из рекомбинированной матрицы

ID мкАт	Аминокислотная последовательность тяжелой цепи	SEQ ID NO	Аминокислотная последовательность легкой цепи	SEQ ID NO
PSMB3 58	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFKSDAMHWVRQAPGKG LEWVSEISGSGGYTNYADSLKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDSYDSSLYVGDYF DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVES KYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL GK	13	EIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSS YLAWYQQKPGQAP RLLIYDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ QRSNWPLTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC	139
PSMB3 59	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFKSDAMHWVRQAPGKG LEWVSEISGSGGYTNYADSLKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDSYDSSLYVGDYF DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVES KYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLH	13	EIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSN YLAWYQQKPGQAP RLLIHDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ QRRNWPLTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPV	14

- 90 045935

	QDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL GK		TKSFNRGEC
PSMB3 60	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFKSDAMHWVRQAPGKG LEWVSEISGSGGYTNYADSLKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDSYDSSLYVGDYF DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVES KYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL GK	13	EIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSS YLAWYQQKPGQAP RLLIYDASYRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ QRRNWPLTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC	680
PSMB3 61	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFKSDAMHWVRQAPGKG LEWVSEISGSGGYTNYADSMKS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDSYDSSLYVGDYF DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVES KYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL GK	12	EIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSS YLAWYQQKPGQAP RLLIYDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ QRGNWPLTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC	15
PSMB3 62	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFKSDAMHWVRQAPGKG	12	EIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSN	14

- 91 045935

	LEWVSEISGSGGYTNYADSMKS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDSYDSSLYVGDYF DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVES KYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL GK		YLAWYQQKPGQAP RLLIHDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ QRRNWPLTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC
PSMB3 63	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFKSDAMHWVRQAPGKG LEWVSEISGSGGYTNYADSMKS RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARDSYDSSLYVGDYF DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVES KYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL GK	12	EIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSS YLAWYQQKPGQAP RLLIYDASYRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ QRRNWPLTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC	680
PSMB3 65	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFKSDAMHWVRQAPGKG LEWVSEISGSGGYTNYADSLKSR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARDSYDSSLYVGDYFD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKT YTCNVDHKPSNTKVDKRVESKY GPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK	679	EIVLTQSPATLSLSPG ERATLSCRASQSVSS YLAWYQQKPGQAP RLLIYDASYRATGIP ARFSGSGSGTDFTLT ISSLEPEDFAVYYCQ QRRNWPLTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQES	631
	PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK		VTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC

В табл. 27 показаны последовательности CDR для всех отобранных соединений к PSMA с созревшей аффинностью.

- 92 045935

Таблица 27

Последовательности CDR отобранных соединений к PSMA с созревшей аффинностью

ID мкАт		CDR (SEQ ID NO:)
		CDR1	CDR2	CDR3
PSMB344	НС	SDAMH (78)	EISGSGGYTNYADSMK G(l)	DSYDSSLYVGDYFD (80)
LC	RASQSVSSYLA (81)	DASNRAT (82)	QQRSNWPLT (83)
PSMB345	НС	SDAMH (78)	EISGSGGYTNYADSMK G (1)	DSYDSSLYVGDYFD Y (80)
LC	RASQSVSNYLA (4)	DASNRAT (82)	QQRRNWPLT (686)
PSMB346	НС	SDAMH (78)	EISGSGGYTNYADSMK G(l)	DSYDSSLYVGDYFD (80)
LC	RASQSVSSYLA (81)	DASYRAT (684)	QQRRNWPLT (686)
PSMB347	НС	SDAMH (78)	EISGSGGYTNYADSMK S(2)	DSYDSSLYVGDYFD (80)
LC	RASQSVSSYLA (81)	DASNRAT (82)	QQRSNWPLT (83)
PSMB349	НС	SDAMH (78)	EISGSGGYTNYADSLK G(3)	DSYDSSLYVGDYFD (80)
LC	RASQSVSSYLA (81)	DASNRAT (82)	QQRGNWPLT (5)
PSMB358	НС	SDAMH (78)	EISGSGGYTNYADSLK G (3)	DSYDSSLYVGDYFD Y (80)
LC	RASQSVSSYLA (81)	DASNRAT (82)	QQRSNWPLT (83)
PSMB359	НС	SDAMH (78)	EISGSGGYTNYADSLK G(3)	DSYDSSLYVGDYFD Y (80)
LC	RASQSVSNYLA	DASNRAT	QQRRNWPLT
		(4)	(82)	(686)
PSMB360	НС	SDAMH (78)	EISGSGGYTNYADSLK G(3)	DSYDSSLYVGDYFD Y (80)
LC	RASQSVSSYLA (81)	DASYRAT (684)	QQRRNWPLT (686)
PSMB361	НС	SDAMH (78)	EISGSGGYTNYADSMK S(2)	DSYDSSLYVGDYFD Y (632)
LC	RASQSVSSYLA (81)	DASNRAT (82)	QQRGNWPLT (5)
PSMB362	НС	SDAMH (78)	EISGSGGYTNYADSMK S (2)	DSYDSSLYVGDYFD Y (80)
LC	RASQSVSNYLA (4)	DASNRAT (685)	QQRRNWPLT (686)
PSMB363	НС	SDAMH (78)	EISGSGGYTNYADSMK S (2)	DSYDSSLYVGDYFD Y (80)
LC	RASQSVSSYLA (630)	DASYRAT (684)	QQRRNWPLT (686)
PSMB365	НС	SDAMH (78)	EISGSGGYTNYADSLKS (683)	DSYDSSLYVGDYFD Y (80)
LC	RASQSVSSYLA (81)	DASYRAT (684)	QQRRNWPLT (686)

3. Получение и функциональная оценка биспецифических антител к PSMAxCD3.

3.1. Создание биспецифических антител к PSMAxCD3.

Были получены два типа биспецифических антител к PSMAxCD3 с созревшей аффинностью: одно, специфическое для нацеливаюшего плеча (например, антитело к PSMA с созревшей

- 93 045935 аффинностью), рекомбинированного с плечом к CD3 высокоаффинного CD3B376 (VH SEQ ID NO: 652, VL SEQ ID NO: 661; НС SEQ ID NO: 640, LC SEQ ID NO: 676) или плечом к CD3 высокоаффинного CD3B450 (VH SEQ ID NO: 657, VL SEQ ID NO: 678, НС SEQ ID NO: 675, LC SEQ ID NO: 677).

Эти исходные мкАт находятся в формате GenMab (Labrijn et al, 2013), в котором нацеливающее исходное мкАт (PSMA) содержит мутацию 409R GenMab (нативную аминокислоту для IgG4), а уничтожающее исходное мкАт (CD3) содержит мутацию F405L GenMab и мутацию R409K. Одно из моноспецифических антител к CD3 экспрессировали в виде IgG4, имеющего в Fc замены S228P, F234A, L235A, F405L и R409K (плечо к CD3) (нумерация согласно индексу EU) в Fc-областях. Нацеливающее исходное мкАт (PSMA) находится в формате человеческого IgG4 с заменами в Fc S228P, F234A, L235A. Моноспецифические антитела экспрессировали в клеточных линиях HEK под контролем промоторов CMV.

Исходные антитела к PSMA и CD3 очищали с применением колонки с белком А с элюирующим буфером, содержащим 100 мМ NaAc, pH 3,5, и нейтрализующим буфером 2,5 М Tris, pH 7,2. Нейтрализованные исходные мкАт использовали для получения биспецифических антител к PSMAxCD3. часть исходных мкАт дополнительно заменяли буфером D-PBS, буфером с рН 7,2 для аналитических измерений и анализов.

После очистки выполняли контролируемый обмен Fab-плечами для получения биспецифических антител. Исходные антитела к PSMA смешивали с желаемым исходным антителом к CD3 в восстанавливающих условиях в 75 мМ -2-МЕА (2-меркаптоэтиламина) и инкубировали при 31°С в течение 4 ч или при комнатной температуре в течение ночи. Реакции рекомбинации были основаны на молярных соотношениях, в которых для сведения к минимуму количества исходного мкАт к CD3, оставшегося после рекомбинации, использовали 6% избыток исходных мкАт к PSMA. Затем продукты рекомбинации подвергали диализу против IxDPBS, рН 7,2, для удаления восстановителя.

Полученные конечные биспецифические антитела вместе с исходными мкАт (т.е. PSMA, CD3 или Null (нуль)), используемыми в реакциях рекомбинации, перечислены в табл. 28.

Отобранные подходящие антитела к PSMA также объединяли с неуничтожающим плечом (Null) для получения отрицательных контролей в целях тестирования. Для контрольных биспецифических антител В2М1 создавали, очищали антитело к RSV в формате IgG4 PAA (VH с SEQ ID NO: 610, VL с SEQ ID NO: 611) и комбинировали или с плечом к CD3 CD3B219-F405L, R409K для получения CD3B288 (CD3xnull), либо с плечами к PSMA, PSMB122, PSMB126, PSMB130 для получения PS3B37, PS3B39 и PS3B40 соответственно (PSMAxnull). Эти мкАт с созревшей аффинностью к PSMA скрещивали (как в способах выше) с CD3B219 и CD3B376 для получения биспецифических антител, приведенных в табл. 27.

Таблица 28

Создание биспецифических антител к PSMAxCD3 с созревшей аффинностью, полученных из отобранных соединений к PSMA с созревшей аффинностью

ID	Плечо 1	НС	LC	Плечо 2	НС	LC
PS3B6O	PSMB344	PSMH859	PH9L3	CD3B219	CD3H141	CD3L66
PS3B61	PSMB345	PSMH859	PSML159	CD3B219	CD3H141	CD3L66
PS3B62	PSMB346	PSMH859	PSML160	CD3B219	CD3H141	CD3L66
PS3B63	PSMB347	PSMH860	PH9L3	CD3B219	CD3H141	CD3L66
PS3B64	PSMB349	PSMH862	PSML158	CD3B219	CD3H141	CD3L66
PS3B70	PSMB358	PSMH862	PH9L3	CD3B219	CD3H141	CD3L66
PS3B71	PSMB359	PSMH862	PSML159	CD3B219	CD3H141	CD3L66
PS3B72	PSMB360	PSMH862	PSML160	CD3B219	CD3H141	CD3L66
PS3B73	PSMB361	PSMH860	PSML158	CD3B219	CD3H141	CD3L66
PS3B74	PSMB362	PSMH860	PSML159	CD3B219	CD3H141	CD3L66
PS3B75	PSMB363	PSMH860	PSML160	CD3B219	CD3H141	CD3L66
PS3B76	PSMB358	PSMH862	PH9L3	CD3B376	CD3H219	CD3L150

- 94 045935

PS3B77	PSMB349	PSMH862	PSML158	CD3B376	CD3H219	CD3L150
PS3B78	PSMB359	PSMH862	PSML159	CD3B376	CD3H219	CD3L150
PS3B79	PSMB360	PSMH862	PSML160	CD3B376	CD3H219	CD3L150
PS3B8O	PSMB347	PSMH860	PH9L3	CD3B376	CD3H219	CD3L150
PS3B81	PSMB361	PSMH860	PSML158	CD3B376	CD3H219	CD3L150
PS3B82	PSMB362	PSMH860	PSML159	CD3B376	CD3H219	CD3L150
PS3B83	PSMB363	PSMH860	PSML160	CD3B376	CD3H219	CD3L150
PS3B84	PSMB344	PSMH859	PH9L3	CD3B376	CD3H219	CD3L150
PS3B85	PSMB345	PSMH859	PSML159	CD3B376	CD3H219	CD3L150
PS3B86	PSMB346	PSMH859	PSML160	CD3B376	CD3H219	CD3L150
PS3B9O	PSMB365	PSMH865	PSML160	CD3B376	CD3H219	CD3L150

3.2. Оценка биспецифических Ат к PSMAxCD3 с созревшей аффинностью в связывании клеток LNCAP.

Биспецифические антитела к PSMAxCD3 тестировали на связывание с линией PSMAположительных клеток, LNCAP, с линией PSMA-отрицательных клеток, РС3. Для оценки возможностей связывания биспецифических антител к PSMA использовали анализ связывания клеток (описанный ранее). Биспецифические антитела нормализовали по концентрации белка, а затем инкубировали с таким же количеством клеток, экспрессирующих PSMA человека или яванского макака. СИФ для каждой концентрации получали с помощью проточной цитометрии и наносили на график в виде функции от концентрации. Данные преобразовывали с помощью log10 и затем наносили на график. Для определения ЕС50 строили кривые связывания методом нелинейной регрессии.

Эти относительные значения использовали для ранжирования связывания PSMA с целевыми клетками. На фиг. 14-16 показано связывание всех полученных биспецифических антител с LNCAP. На фиг. 16 ни один из конструктов не продемонстрировал связывания с линией PSMA-отрицательных клеток. На фиг. 14 и 15 все отобранные соединения с созревшей аффинностью продемонстрировали повышенную аффинность связывания по сдвинутым влево кривым и повышенному сМах по сравнению с исходным мкАт, PS2B27.

Взаимодействие биспецифических антител с созревшей аффинностью с рекомбинантным ВКД PSMA яванского макака и ВКД PSMA человека изучали с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ППР) с использованием системы ProteOn XPR36 (BioRad), как описано ранее для рекомбинантного ВКД PSMA шимпанзе. Все биспецифические антитела связываются с обеими мишенями с по существу одинаковой аффинностью, при этом KD находится в диапазоне от 0,05 нМ до 0,27 нМ для ВКД PSMA человека и от 0,05 до 0,23 нМ для ВКД PSMA яванского макака.

3.3. Оценка биспецифических антител с созревшей аффинностью к CD3 и PSMA в анализе функционального уничтожения клеток.

На основании приведенных выше данных, измерений аффинности и идентичности последовательностей три антитела к PSMA, PSMB347, PSMB360 и PSMB365 в качестве биспецифических антител с CD3B219 или CD3B376, были дополнительно охарактеризованы на способность опосредовать PSMA-специфическую перенаправленную цитотоксичность Т-клеток. Опосредованное Т-клетками уничтожение измеряли с помощью анализа цитотоксичности каспазы, который косвенно измеряет уничтожение клеток посредством расщепления флуоресцентного субстрата активной каспазой 3/7. Расщепление субстрата приводит к образованию флуоресцентного красителя ДНК с флуоресценцией, ограниченной ядром клетки. В каждой лунке на протяжении всего анализа проводят повторные измерения флуоресценции с использованием моторизованного объектива с 10-кратным увеличением, способным точно визуализировать клетку(и) в одних и тех же координатах. Популяции клеток-мишеней идентифицируют на основании определенных ограничений по размеру и/или с применением вторичной метки. Замороженные пан CD3+ Т-клетки (приобретены у Biological Specialty Corporation, Кольмар, штат Пенсильвания) выделяли путем отрицательной селекции относительно нормальных здоровых доноров. Клетки рака предстательной железы, экспрессирующие PSMA, (LNCaP, C42) культивировали в RPMI 1640 с добавлением 10% HI FBS+добавок (приобретены у компании Life Technologies).

Т-клетки и клетки-мишени объединяли в соотношении эффектор-мишень (Е:Т) 3:1 в RPMI без фенолового красного+10% FBS и добавки (Life Technologies) без реагентов для селекции и к каждому мл клеток добавляли 0,6 мкл реагента каспаза NucView (Essen Bioscience) в соответствии с рекомендациями производителя. Общий объем клеток составил 0,1 мл в соответствующие лунки прозрачного 96-луночного плоскодонного планшета (BD Falcon). Биспецифические антитела PS3B27 (CD3xPSMA), CD3B288 (CD3xNull) или PS3B46 (PSMAxNull) получали в 2х конечной концентрации в RPMI без фенолового красного, полученной, как указано выше, и в каждую лунку добавляли по 0,1 мл соединений. После 30 мин инкубации при комнатной температуре для сведения к минимуму агрегации клеток на

- 95 045935 краю лунок планшеты переносили в прибор Zoom Incucyte (Essen Bioscience). Incucyte Instrument находится в увлажненном инкубаторе при 37°С, 5% СО2.

Для каждой тестируемой клеточной линии были разработаны описания обработки клеток в соответствии с инструкциями производителя. Измерения проводили каждые 6 ч, пока не наблюдалось плато сигнала каспазы, с последующим тремя или более последовательными уменьшениями относительно максимального сигнала в лунке(ах), содержащей(их) самую высокую концентрацию тестируемого(ых) соединения(ий). Как показано На фиг. 17, кривые для PS3B80, PS3B79, PS3B89, PS3B90, PS3B63 и PS3B72 смещаются влево, что указывает на повышенную активность относительно PS3B27. Как и ожидалось, контрольные антитела с нулевым плечом не индуцировали гибель клеток.

3.4. Противоопухолевая эффективность в предотвращении опухолеобразования ксенотрансплантатов LnCaP у гуманизированных мышей NSG.

Эффективность PS3B79 и PS3B90 оценивали в развившихся ксенотрансплантатах человеческих клеток рака предстательной железы 3D LnCaP AR.TB у самцов мышей NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rgtm^1wj1/SzJ (NSG), гуманизированных внутрибрюшинно (в/б) Т-клетками человека. PS3B79 и PS3B90 в дозах 2,5 и 5 мг/кг или контрольное антитело NullxCD3B376 вводили каждые 3-4 дня на 36, 39, 43, 47, 50, 53, 56, 60 и 63 дни, всего 8 доз. На 53-й день после имплантатации опухоли, который был последней датой исследования, когда в группе оставалось девять (9) животных, было рассчитано ингибирование роста опухоли (%TGI). Статистически значимое ингибирование роста опухоли наблюдали для PS3B79 в дозе 5 мг/кг с 42% TGI (двухфакторный дисперсионный анализ с поправкой Бонферрони, * р<0,0001; фиг. 20) и для PS3B90 в дозе 2,5 и 5 мг/кг с 53 и 33%, соответственно, по сравнению с контролем NullxCD3 (двухфакторный дисперсионный анализ с тестом Бонферрони, * р<0,001; фиг. 21). Таким образом, CD3B376 способен индуцировать активацию Т-клеток и цитотоксичность in vivo и способен приводить к ингибированию роста опухоли в биспецифическом формате с помощью высокоаффинных PSMAсвязывающих плеч, PSMB360 и PSMB365.

4. Получение и функциональная оценка биспецифических антител к IL1RAPxCD3.

Моноклональные антитела к IL1RAP, используемые и подходящие для применения в биспецифических антителах по настоящему изобретению, описаны в публикации заявки на патент США № 20170121420 А1, описание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки. Пятнадцать моноспецифических антител к IL1RAP (см. табл. 6 в US 20170121420 A1) экспрессировали в виде IgG4, имеющего замены в Fc S228P, L234A и L235A. Исходные мкАт к CD3 были экспрессированы в виде IgG4 с S228P, L234A, L235A, F405L и R409K (нумерация согласно индексу EU). Было также создано моноспецифическое антитело CD3B220 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 92 и VL с SEQ ID NO: 93 и константную область IgG4 с заменами S228P, L234A, L235A, F405L и R409K.

Моноспецифические антитела очищали стандартными методами с использованием колонки с белком А. После элюирования пулы нейтрализовали до рН 7 и диализовали в 1xD-PBS, рН 7,2.

Биспецифические антитела к IL1RAPxCD3 получали путем комбинирования моноспецифическогго мкАт к CD3 (CD3B376: VH с SEQ ID NO: 652 и VL с SEQ ID NO: 661; или CD3B450: VH с SEQ ID NO: 657 и VL с SEQ ID NO: 678) и моноспецифического мкАт к IL1RAP посредством контролируемого обмена Fab-плечами (как описано в WO2011/131746). Вкратце около 1-20 мг/мл при молярном соотношении 1,08: 1 антитела к IL1RAP/CD3 в DPBS, рН 7-7,4 и 75 мМ 2-меркаптоэтаноламина (2-МЕА) смешивали вместе и инкубировали при 25-37°С в течение 2-6 ч с последующим удалением 2-МЕА посредством диализа, диафильтрации, тангенциальной фильтрации потока для удаления восстановителя и обеспечения образования биспецифических антител.

Тяжелые и легкие цепи биспецифических антител к IL1RAPxCD3 показаны ниже в табл. 29.

- 96 045935

Таблица 29

Последовательности CDR 15 мкАт к IL1RAP, выбранных для создания биспецифических антител к IL1RAPxCD3 (SEQ ID NO в скобках)

ID	HC-CDR1	HC-CDR2	HC-CDR3	LC-CDR1	LC-CDR2	LC-CDR3
IAPB47	GYSFTSYW	IYPSDSYT	ARRNSAEN YADLDY	QSISND	YAS	QQSFTAPL T
	(152)	(153)	(154)	(155)	(156)	(157)
IAPB38	GFTFSNYA	INYGGGS К	AKDYGPFA LDY	QSVDDW	TAS	QQYHHWP LT
	(158)	(159)	(160)	(161)	(162)	(163)
IAPB57	GGSISSSTY Y	IYFTGST	AKEDDSSG YYSFDY	QGISSY	AAS	QQVNSYPL T
	(164)	(165)	(166)	(167)	(168)	(169)
IAPB61	GVSISSSTY Y	IYFTGNT	GSLFGDYG YFDY	QFISSN	GAS	QQYNNWP ST
	(170)	(171)	(172)	(173)	(174)	(175)
IAPB62	GYTFNTYA	INTNTGN P	ARRYFDW LLGAFDI	QGISSW	AAS	QQANSFPL T
	(176)	(177)	(178)	(179)	(168)	(180)
IAPB3	GGTFSSYA	ISAIFGTA	ARGNSFHA LWDYAFD	QSVLYSSN NKNY	WAS	QQYYSTPL T
	(181)	(182)	(183)	(184)	(185)	(186)
IAPB17	GGTFSSYA	IIPIFGNA	ARTIIYLDY VHILDY	QSVLYSSN NKNY	WAS	QQYYSTPL T
	(181)	(187)	(188)	(184)	(185)	(186)
IAPB23	GFTFSNYW	IRYDGGS К	AKDAYPPY SFDY	QSVSSY	DAS	QQRSNWPL T
	(189)	(190)	(191)	(192)	(193)	(194)
IAPB25	GFTFSSYA	ISGSGGST	AKGDEYY YPDPLDY	QSISSY	AAS	QQSYSTPL T
	(195)	(196)	(197)	(198)	(168)	(199)
IAPB29	GFTFSNYA	ISGSGGST	AKEWSSYF GLDY	QSISSY	AAS	QQSYSTPL T
	(158)	(196)	(200)	(198)	(168)	(199)
IAPB9	GGTFSSYA	ISPIFGTA	ARRYDNFA RSGDLDY	QSISSY	AAS	QQSYSTPL T
	(181)	(201)	(202)	(198)	(168)	(199)
IAPB55	GVSISSSTY Y	IYFTGNT	GSLFGDYG YFDY	QFISSN	GAS	QQYNNWP FT
	(170)	(171)	(172)	(173)	(174)	(203)
IAPB63	GYTFNTYA	INTNTGN	ARRYFDW	SSDVGDYN	DVS	ASYAGNY
		P	LLGAFDI	Y		NW
	(176)	(177)	(178)	(204)	(205)	(206)
IAPB64	GYTFNTYA	INTNTGN P	ARRYFDW LLGAFDI	SSDVGDYN Y	DVS	SSYAGNYN VV
	(176)	(177)	(178)	(204)	(205)	(207)
IAPB65	GGTFSSYA	ISAIFGTA	ARHLHNAI HLDY	QSVSNF	GAS	QQGKHWP WT
	(181)	(182)	(208)	(209)	(174)	(210)

Последовательности VH и VL для 15 моноклональных антител к IL1RAP показаны ниже в табл. 30.

- 97 045935

Таблица 30

Последовательности VH и VL для мкАт к IL1RAP для создания биспецифических антител к IL1RAPxCD3

ID	Аминокислотная последовательность VH	SEQ ID NO:	Аминокислотная последовательность VL	SEQ ID NO:
IAPB4 7	EVQLVQSGAEVKKPGESLK ISCKGSGYSFTSYWIGWVR QMPGKGLEWMGIIYPSDSY TRYSPSFQGQVTISADKSIST AYLQWSSLKASDTAMYYC ARRNSAENYADLDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAP CSRSTSESTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTKTYTCNVDHKPSN TKVDKRVESKYGPPCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSQE DPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPSSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSQEEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK	211	EIVLTQSPGTLSLSPGERA TLSCRASQSISNDLNWYQ QKPGKAPKLLIYYASSLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLT INSLQPEDFATYYCQQSFT APLTFGQGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC	212
IAPB3 8	EVQLLESGGGLVQPGGSLR LSCAASGFTFSNYAMNWV RQAPGKGLEWVSGINYGG GSKYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAV YYCAKDYGPFALDYWGQG	213	EIVLTQSPATLSLSPGERA TLSCRASQSVDDWLAWY QQKPGQAPRLLIYTASNR ATGIPARFSGSGSGTDFTL TISSLEPEDFAVYYCQQY HHWPLTFGQGTKVEIKRT	214

- 98 045935

TLVTVSSASTKGPSVFPLAP CSRSTSESTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTKTYTCNVDHKPSN TKVDKRVESKYGPPCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSQE DPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPSSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSQEEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKS __LSLSLGK__ IAPB5 QLQLQESGPGLVKPSETLSL 215

TCTVSGGSISSSTYYWGWIR QPPGKGLEWIGSIYFTGSTD YNPSLKSRVSISVDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCAK EDDSSGYYSFDYWGQGNL VTVSSASTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTKTYTCNVDHKPSNTK

VDKRVESKYGPPCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPE

VQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVL

HQDWLNGKEYKCKVSNKG LPSSIEKTISKAKGQPREPQV

YTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLS __LGK__ IAPB6 q_Lq_Lq_EsgPGLVKPSETLSL 217

TCTVSGVSISSSTYYWGWL RQPPGMGLEWTGSIYFTGN TYYNPSLKSRVTISVDTSRN QFSLKLSSVTAADTAVYYC GSLFGDYGYFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPE

VAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC

DIQLTQSPSFLSASVGDRV

TITCRASQGISSYLAWYQ QKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTEFTLT ISSLQPEDFATYYCQQVN SYPLTFGGGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC

EIVMTQSPATLSVPPGERA

TLSCRASQFISSNLAWYQ QKPGQAPRLLIYGASTRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTI SSLQSEDFAVYYCQQYNN WPSTFGPGTKVDIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQ

216

218

- 99 045935

PVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTKTYTCNVDHKPSNTK

VDKRVESKYGPPCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPE

VQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVL

HQDWLNGKEYKCKVSNKG LPSSIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSQEEMTKNQVSLTC

LVKGFYPSDIAVEVVESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFL

YSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLS __LGK__ IAPB6 qvqlvqsgSELKKPGASVK 219

VSCKASGYTFNTYAMNWV RQAPGQGLEWMGWINTNT GNPTYAQGFTGRFVFSLDT SVSTAYLQISSLKAEDTAVY YCARRYFDWLLGAFDIWG QGTMVTVSSASTKGPSVFP LAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSG

VHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTKTYTCNVDHK PSNTKVDKRVESKYGPPCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYT __QKSLSLSLGK__ IAPB3 QVQLVQSGAEVKKPGSSVK 221

VSCKASGGTFSSYAISWVR QAPGQGLEWMGGISAIFGT ANYAQKFQGRVTITADEST STAYMELSSLRSEDTAVYY CARGNSFHALWDYAFDYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSG

VHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTKTYTCNVDHK

WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC

DIQMTQSPSSVSASVGDR 220

VTITCRASQGISSWLAWY QQKPGKAPKLLIYAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFATYYCQQA NSFPLTFGGGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC

DIVMTQSPDSLAVSLGER 222 ATINCKSSQSVLYSSNNK NYLAWYQQKPGQPPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAV YYCQQYYSTPLTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYA

- 100 045935

PSNTKVDKRVESKYGPPCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYT __QKSLSLSLGK__________ IAPB1 qvqlvqsgAEVKKPGSSVK

VSCKASGGTFSSYAISWVR QAPGQGLEWMGGIIPIFGN ANYAQKFQGRVTITADEST STAYMELSSLRSEDTAVYY CARTIIYLDYVHILDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLA PCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPS NTKVDKRVESKYGPPCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSQEEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYT __QKSLSLSLGK__________ IAPB2 evQLLESGGGLVQPGGSLR

LSCAASGFTFSNYWMNWV RQAPGKGLEWVSAIRYDGG SKYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAV YYCAKDAYPPYSFDYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLA PCSRSTSESTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPS NTKVDKRVESKYGPPCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKD

223

224

CEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC

DIVMTQSPDSLAVSLGER 222

ATINCKSSQSVLYSSNNK NYLAWYQQKPGQPPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAV YYCQQYYSTPLTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC

EIVLTQSPATLSLSPGERA 225

TLSCRASQSVSSYLAWYQ QKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTI SSLEPEDFAVYYCQQRSN WPLTFGQGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC

- 101 045935

TLMISRTPEVTCVVVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSQEEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYT __QKSLSLSLGK__________ IAPB2 EVQLLESGGGLVQPGGSLR

LSCAASGFTFSSYAMSWVR QAPGKGLEWVSAISGSGGS TYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVY YCAKGDEYYYPDPLDYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKP SNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVYS VLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYT __QKSLSLSLGK__________ IAPB2 EVQLLESGGGLVQPGGSLR

LSCAASGFTFSNYAMSWVR QAPGKGLEWVSAISGSGGS TYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVY YCAKEWSSYFGLDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAP CSRSTSESTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTKTYTCNVDHKPSN TKVDKRVESKYGPPCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSQE DPEVQFNWYVDGVEVHNA

226

DIQMTQSPSSLSASVGDR 227

VTITCRASQSISSYLNWYQ QKPGKAPKLLIYAASSLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQSYS TPLTFGQGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC

228

DIQMTQSPSSLSASVGDR 227

- 102 045935

	KTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPSSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSQEEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK
IAPB9	QVQLVQSGAEVKKPGSSVK VSCKASGGTFSSYAISWVR QAPGQGLEWMGWISPIFGT ANYAQKFQGRVTITADEST STAYMELSSLRSEDTAVYY CARRYDNFARSGDLDYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPL APCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPYTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKP SNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSQEEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSLGK	229	DIQMTQSPSSLSASVGDR VTITCRASQSISSYLNWYQ QKPGKAPKLLIYAASSLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQSYS TPLTFGQGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC	227
IAPB5 5	QLQLQESGPGLVKPSETLSL TCTVSGVSISSSTYYWGWL RQPPGMGLEWTGSIYFTGN TYYNPSLKSRVTISVDTSRN QFSLKLSSVTAADTAVYYC GSLFGDYGYFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTKTYTCNVDHKPSNTK VDKRVESKYGPPCPPCPAPE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPE VQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKG LPSSIEKTISKAKGQPREPQV	633	EIVMTQSPATLSVSPGERA TLSCRASQFISSNLAWYQ QKPGQAPRLLIYGASTRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTI SSLQSEDFAVYYCQQYNN WPFTFGPGHCVDIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC	230

- 103 045935

YTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLS __LGK________________ IAPB6 qvQLVQSGSELKKPGASVK 3

VSCKASGYTFNTYAMNWV RQAPGQGLEWMGWINTNT GNPTYAQGFTGRFVFSLDT SVSTAYLQISSLKAEDTAVY YCARRYFDWLLGAFDIWG QGTMVTVSSASTKGPSVFP LAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTKTYTCNVDHK PSNTKVDKRVESKYGPPCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYT __QKSLSLSLGK__________ IAPB6 qvqlvqsgSELKKPGASVK

VSCKASGYTFNTYAMNWV RQAPGQGLEWMGWINTNT GNPTYAQGFTGRFVFSLDT SVSTAYLQISSLKAEDTAVY YCARRYFDWLLGAFDIWG QGTMVTVSSASTKGPSVFP LAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTKTYTCNVDHK PSNTKVDKRVESKYGPPCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDV SQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVE

219

QSALTQPRSVSGSPGHSV

TISCTGTSSDVGDYNYVS WYQQRPGKVPKLLIYDVS KRPSGVPDRFSGSKSGNT ASLTISGLQAEDEAIYFCA SYAGNYNVVFGGGTKLT VLGQPKAAPSVTLFPPSSE ELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAG VETTTPSKQSNNKYAASS YLSLTPEQWKSHRSYSCQ VTHEGSTVEKTVAPTECS

QSALTQPRSVSGSPGHSV

TISCTGTSSDVGDYNYVS WYQQRPGKVPKLLIYDVS KRPSGVPDRFSGSKSGNT ASLTISGLQAEDEAIYFCS SYAGNYNVVFGGGTKLT VLGQPKAAPSVTLFPPSSE ELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAG VETTTPSKQSNNKYAASS YLSLTPEQWKSHRSYSCQ VTHEGSTVEKTVAPTECS

231

232

- 104 045935

	WESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSLGK
IAPB6 5	QVQLVQSGAEVKKPGSSVK VSCKASGGTFSSYAISWVR QAPGQGLEWMGGISAIFGT ANYAQKFQGRVTITADEST STAYMELSSLRSEDTAVYY CARHLHNAIHLDYWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPC SRSTSESTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTKTYTCNVDHKPSNT KVDKRVESKYGPPCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSQED PEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDLAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSRLTVDKSRWQEGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGK	233	EIVLTQSPATLSLSPGERA TLSCRASQSVSNFLAWYQ QKPGQAPRLLIYGASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTI SSLEPEDFAVYYCQQGKH WPWTFGQGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC	234

4.1. Оценка биспецифических антител к IL1RAP в анализе цитотоксичности Т-клеток цельной крови.

Способы. Линию опухолевых клеток LAMA-84 промывали DPBS, после чего инкубировали с CFSE (ресуспендировали в 150 мкл DMSO и разводили 1:10000) при концентрации 10х10⁶ клеток/мл CFSE в течение 8 мин при комнатной температуре. Реакцию окрашивания гасили HI FBS и промывали в среде перед ресуспендированием в полной среде при 2х10⁵ клеток/мл. Равные объемы цельной крови и опухолевых клеток, окрашенных CFSE, объединяли в каждой лунке 96-луночного планшета. После добавления антитела (ресуспендированного в 10 мкл DPBS) в соответствующие лунки все планшеты инкубировали при 37°С с 5% СО₂ в течение 48 ч. Неразбавленный CD25-PE добавляли непосредственно в каждую лунку цельной крови и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, защищая от света. Затем клетки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин и лизировали 200 мкл буфера для лизиса эритроцитов разных видов, повторяли еще 4 раза. Клетки однократно промывали DPBS и окрашивали Live/Dead Near-IR (разведенными в DPBS) в течение 15 мин (табл. 31). Каждую лунку промывали и ресуспендировали в буфере для FACS перед проведением BD FACS CANTO II.

Таблица 31

Панель окрашивания цитотоксичности Т-клеток цельной крови

Антиген	Канал	Клон	Разведение	Источник	№ по каталогу
CD25	РЕ	ВС96	1:100	Biolegend	302606
CD4	РегСР	RPA-T4	1:100	Biolegend	300528
CD8	АРС	Н1Т8а	1:100	Biolegend	300912
Live/Dead	АРС-Су7	Н/П*	1:200	Invitrogen	L34976

Н/П=не применимо.

Количество клеток на FACS CANTO II (Becton, Dickinson and Company, Франклин Лейкс, штат Нью-Джерси) ограничивали 1х10⁴ опухолевыми клетками. Гибель опухолевых клеток оценивали путем гейтирования по FSC и SSC для идентификации популяций клеток, затем по CFSE-положительным опухолевым событиям и, наконец Live/Dead Near-IR для оценки цитотоксичности опухоли. Активацию Т-клеток оценивали путем гейтирования по FSC и SSC для идентификации популяций клеток, CFSEотрицательных событий, Near-IR-отрицательных событий для оценки живых клеток, а затем CD25положительных клеток. Процент мертвых опухолевых клеток или CD25-положительных клеток был нанесен на график с помощью GraphPad Prism 6 и проанализирован с использованием нелинейной кривой. Дополнительный статистический анализ был проведен в программе R для определения значений ЕС₅₀ в популяции с использованием нелинейной модели со смешанными эффектами.

Результаты, чтобы имитировать физиологические состояния периферической цельной крови, содержащей sIL1RAP, IC3B19 (IAPB57xCD3B219) и IC3B34 (IAPB57xCD3B376) оценивали в анализе перенаправления Т-клеток ex vivo с использованием цельной крови. Экзогенно добавленную линию

- 105 045935 клеток IL1RAP+ LAMA-84 (2х10⁴ клеток/лунку) добавляли к здоровой контрольной периферической цельной крови человека (n=15 донорских образцов) с IC3B19, IC3B34 и контрольными биспецифическими антителами с нулевым плечом в течение 48 ч. Как показано на фиг. 52, IC3B19 и IC3B34 индуцировали аналогичную опосредованную Т-клетками цитотоксичность линии клеток IL1RAP+ LAMA-84 ex vivo через 48 ч. Значения ЕС₅₀ для цитотоксичности IC3B19 и IC3B34, представленные на фиг. 52, составляли 2,097 и 2,762 соответственно (табл. 32). Аналогично значения ЕС₅₀ для активации Т-клеток (CD25) IC3B19 и IC3B34, представленные на фиг. 53, составляли 4,237 и 7,825 нМ соответственно (табл. 33). Все контрольные биспецифические антитела с нулевым плечом не индуцировали определяемых уровней цитотоксичности или активации Т-клеток, как показано на фиг. 52 и 53. Общий уровень цитотоксичности и активации Т-клеток был одинаковым как для IC3B19, так и для IC3B34.

Таблица 32 Концентрации ЕС50 (нМ) цитотоксичности IC3B19 и IC3B34 в клеточной линии LAMA-84

Эффективная концентрация (нМ)	IC3B19	IC3B34
ЕС50	2,097	2,762

Таблица 33

Концентрации ЕС50 (нМ) активации Т-клеток IC3B19 и IC3B34 в клеточной линии LAMA-84

Эффективная концентрация (нМ)	IC3B19	IC3B34
ЕС50	4,237	7,825

4.2. Оценка высвобождения цитокинов биспецифическими антителами к IL1RAPxCD3 в анализе цитотоксичности Т-клеток цельной крови через 24 и 48 ч.

Способы. Замороженные супернатанты 24- и 48-часовых образцов из примера 4-1 размораживали на жидком льду. Перед использованием планшеты центрифугировали при 500 g в течение 5 мин при 4°С, затем снова помещали на жидкий лед. Последовательные разведения готовили в 96-луночных планшетах с U-образным дном (Falcon) с использованием MSD Diluent 2 с соотношениями разведений 1:2, 1:25 и 1:1000 для ИФА.

Во время центрифугирования супернатантов планшеты для анализа MSD (ProInflammatory Panel I V-Plex, кат. № K15049G-4, номер партии K008572) предварительно промывали в соответствии с протоколом производителя. Стандартную кривую подготавливали путем восстановления полученного калибратора в 1,0 мл MSD Diluent 2. Пятьдесят микролитров каждого образца или стандарта добавляли непосредственно в предварительно промытые планшеты MSD. Последующие инкубации и промывки проводили в соответствии с протоколом производителя. Планшеты для анализа считывали на MSD Sector Imager.

Для сравнения ответа IC3B19 и IC3B34 использовались два способа.

Линейная регрессия со смешанными эффектами.

В этом способе была построена модель линейной регрессии с фиксированными эффектами для соединения, дозы и соединения посредством взаимодействия доз и случайных эффектов, которые учитывают объединенных доноров. Затем были проведены апостериорные сравнения между IC3B19 и IC3B34 для каждой концентрации, и р-значения были соответствующим образом скорректированы для множественных сравнений.

Нелинейная (четырехпараметрическая) регрессия со смешанными эффектами IC3B19 и IC3B34 были смоделированы вместе с использованием модели нелинейной регрессии с фиксированными параметрами эффекта для минимума, максимума, logEC50 и угловой коэффициент для каждого соединения, а также со случайным эффектом, который учитывает эффект объединенных доноров. Точечные оценки и их доверительные интервалы были извлечены и нанесены на график для визуального сравнения из этих отдельных моделей. Тестирование значительных различий для каждого параметра проводили путем построения модели, в которой использовали совместную оценку представляющего интерес параметра, а затем сравнивали эту модель с исходной моделью с использованием критерия логарифмического правдоподобия. Для усовершенствования существует модель с параметрами для минимума IC3B19, максимума IC3B19, IC3B19 logEC50, углового коэффициента IC3B19, минимума IC3B34, максимума IC3B34, IC3B34 logEC50 и IC3B34. чтобы проверить, существенно ли отличаются минимумы, строится вторая модель, которая имеет все те же параметры, за исключением того, что для минимума существует единственный общий параметр. Логарифмическое правдоподобие (общая мера того, насколько хорошо модель соответствует данным) первой модели сравнивается с логарифмическим правдоподобием второй модели. Если они существенно не отличаются друг от друга, то можно сделать вывод, что минимумы существенно не отличаются друг от друга. Точно так же, если логарифмические вероятности значительно отличаются друг от друга, мы можем заключить, что минимальные значения существенно отличаются.

В ряде случаев модели или сравнения параметров были неоценимы по одной из двух причин: 1) данные были слишком сложными для расчета самой четырехпараметрической логистической

- 106 045935 регрессии, или 2) разница между оценками параметров была настолько большой, что это привело к сбою объединенной модели. В первом случае результаты не сообщаются, и в сводной таблице они обозначаются Н/Д. Во втором случае результаты также не сообщаются, но они обозначены в сводной таблице как знач., как сокращение для значимого. Поскольку 95% доверительные интервалы вокруг этих параметров оцениваются отдельно и не перекрываются, мы можем считать их существенно разными, но точное р-значение неизвестно.

Различия считаются статистически значимыми при р-значении, меньшем или равном 0,05. Все анализы выполняли в R версии 3.3.2.

Результаты. IC3B19 и IC3B34 опосредованное вовлечение Т-клеток и линии IL1RAP+ клетокмишеней LAMA-84 (эндогенные и экзогенно добавленные опухолевые клетки) приводило к высвобождению цитокинов Т-клетками. чтобы определить разницу в высвобождении цитокинов между IC3B19 и IC3B34, супернатанты оценивали в анализах на 10 провоспалительных цитокинов из цельной крови (n=15 доноров), цитотоксичность и активацию Т-клеток с добавлением экзогенной линии опухолевых IL1RAP+ клеток LAMA-84, как обсуждается в разделе пример 1. Из 10 проанализированных цитокинов большинство цитокинов приводило к измеримому дозозависимому высвобождению в ответ как на IC3B19, так и на IC3B34, за исключением ИЛ-8 и ИЛ-12р70. Как показано в табл. 34, ИЛ-10, ИЛ-2, ФНО-α и ИФН-γ приводили к наиболее сильному высвобождению ЕС50 (нМ). Кроме того, большинство цитокинов и в обеих временных точках, молекула IC3B34 приводила к менее высокой ЕС50 (нМ), которая была статистически значимой. Исключением были ИЛ-4 (24 ч), ИЛ-6 (24 и 48 ч), ИЛ-8 (24 и 48 ч), ИЛ-12р70 (24 и 48 ч), ИЛ-13 (24 ч), ИФН-γ (24 и 48 ч) и ФНО-а (24 ч), которые не имели статистически значимой разницы в значениях ЕС50 (нМ) между IC3B19 и IC3B34.

Таблица 34

Сводная таблица четырехпараметрической логистической регрессии IC3B19 и IC3B34

№ Фиг.	ЕС50	У гловой коэффициен т	Миниму м	Максиму м
Цитокин	Эксперимен т
НЕК-1-бета	Фиг. 37	24 часа	0,0027	0,3046	0,0268	0,2033
НЕК-1-бета	Фиг. 38	48 часов	0,0010	0,3951	0,2543	0,0528
ИЛ-2	Фиг. 39	24 часа	0,0001	0,0256	0,3103	0,6466
ИЛ-2	Фиг. 40	48 часов	знач.	0,2079	0,0158	0,0008
ИЛ-4	Фиг. 41	24 часа	0,2415	0,4668	0,2942	0,0043
ИЛ-4	Фиг. 42	48 часов	Н/д	Н/д	Н/д	Н/д
ИЛ-6	Фиг. 43	24 часа	знач.	0,0819	0,1151	0,5224
ИЛ-6	Фиг. 44	48 часов	Н/д	Н/д	Н/д	Н/д
ИЛ-8	Фиг. 45	24 часа	Н/д	Н/д	Н/д	Н/д
ИЛ-8	Фиг. 46	48 часов	Н/д	Н/д	Н/д	Н/д
ИЛ-10	Фиг. 47	24 часа	< 0,0001	0,0010	0,3406	0,7036
ИЛ-10	Фиг. 48	48 часов	< 0,0001	0,2702	0,0011	0,0004
ИЛ-12р70	Фиг. 49	24 часа	н/д	Н/д	н/д	Н/д
ИЛ-12р70	Фиг. 50	48 часов	н/д	Н/д	Н/д	Н/д
ИЛ-13	Фиг. 51	24 часа	Н/д	Н/д	Н/д	Н/д
ИЛ-13	Фиг. 52	48 часов	0,0106	0,8268	< 0,0001	< 0,0001
ИФН-гамма	Фиг. 53	24 часа	0,0065	0,6920	0,4644	0,3179
ИФН-гамма	Фиг. 54	48 часов	0,0266	0,1678	0,2695	0,0319
ФИО-альфа	Фиг. 55	24 часа	0,0016	0,0128	0,1443	0,7895
ФИО-альфа	Фиг. 56	48 часов	0,0004	0,5553	0,0043	0,5216

Полужирным шрифтом обозначена статистически значимая разница в значениях ЕС50 (нМ) между IC3B19 и IC3B34. Результаты экспериментов по высвобождению отдельных цитокинов показаны на указанных фигурах.

4.3. Оценка биспецифических антител к IL1RAP в анализе цитотоксичности каспаз.

Опосредованное Т-клетками уничтожение IC3B19 и IC3B34 измеряли с применением анализа клеточной токсичности второго типа. Анализ цитотоксичности каспазы косвенно измеряет гибель клеток через расщепление флуоресцентного субстрата активной каспазой 3/7. Расщепление субстрата приводит к образованию флуоресцентного красителя ДНК с флуоресценцией, ограниченной ядром клетки. В каждой лунке на протяжении всего анализа проводят повторные измерения флуоресценции с использованием моторизованного объектива с 10-кратным увеличением, способным точно

- 107 045935 визуализировать клетку(и) в одних и тех же координатах. Популяции клеток-мишеней идентифицируют на основании определенных ограничений по размеру.

Замороженные пан CD3+ Т-клетки (приобретены у Biological Specialty Corporation, Кольмар, штат Пенсильвания) выделяли путем отрицательной селекции относительно нормальных здоровых доноров. Клетки-мишени (клетки NCI-H1975, линия клеток аденокарциномы легкого человека, экспрессирующая IL1RAP) культивировали в среде RPMI 1640/Glutamax (25 мМ буфер HEPES) с добавлением 10% инактивированного нагреванием FBS, 1 мМ пирувата натрия и 0,1 мМ заменимых аминокислот (Life Technologies).

Клетки-мишени высевали из расчета 20000 клеток/лунку в 50 мкл среды RPMI, не содержащей фенолового красного, содержащей добавки, за 16 ч до начала эксперимента в обработанные культурой ткани прозрачные планшеты с плоским дном (Costar). Клетки инкубировали при комнатной температуре (RT) в течение 20 мин, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток в лунках, а затем клетки инкубировали при 37°С и 5% СО₂ в течение ночи.

В день эксперимента Т-клетки подсчитывали и разводили до 1,0x106 клеток/мл в среде RPMI без фенола красного, содержащей добавки, и объединяли с субстратом каспазы-3/7 Nuc-View TM488 (Essen Biosciences) для получения рабочей концентрации 10 мкМ. В каждую лунку добавляли по 100 мкл объединенных Т-клеток и субстрата каспазы-3/7 с конечной концентрацией 5 мкМ субстрата каспазы-3/7.

Биспецифические антитела IC3B19 (IAPB57xCD3B219), IC3B34 (IAPB57xCD3B376), CD3B288 (NullxCD3B219), и IAPB57xNull (IAPB101) получали в 4-кратной конечной концентрации в среде RPMI без фенолового красного, содержащей добавки и 50 мкл антител были добавлены в каждую лунку. После 20-минутной инкубации при комнатной температуре для равномерного распределения в лунках планшеты переносили в прибор Zoom Incucyte (Essen Bioscience). Incucyte Instrument находится в увлажненном инкубаторе при 37°С, 5% СО₂.

Описание обработки на Incucyte было разработано для клеток NCI-H1975. Это описание обработки четко идентифицирует каспазную активность клеток-мишеней, при этом исключая Т-клетки по размеру. Измерения проводились в ТО и каждые 6 ч в течение периода до 120 ч. Максимальный сигнал был определен через 72 ч после обработки, когда данные были проанализированы.

После завершения анализа каждый планшет анализировали с использованием описания обработки NCI-H1975. Необработанные данные флуоресценции экспортировали с программного обеспечения Incucyte Zoom и вставляли в GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., г. Ла-Холья, штат Калифорния, США). Активность каспазы 3/7 определяли путем вычисления площади под кривой (AUC) для каждой лунки в GraphPad. Значения AUC отображали на графике в виде зависимости Log10 концентраций антител в нМ. ЕС50 для каждой кривой концентрация-ответ в наномоль/л (нМ) регистрировали после нелинейного регрессионного анализа (сигмоидальная кривая доза-ответ с переменным угловым коэффициентом). Каждый анализ включал две технических повторности и четыре измерения в каждой технической повторности.

И IC3B19, и IC3B34, но не биспецифические антитела с нулевыми плечами (IAPB57XB23B49 или B23B39xCD3B219), индуцировали мишень-специфическую цитотоксичность в клетках NCI-H1975 (фиг. 56). В этом анализе цитотоксичность ЕС50 варьируется в пределах трех раз для IC3B19 и IC3B34, при этом значения составляют 0,018 и 0,057 нМ соответственно.

4.4. Эффективность IAPB57xCD3B376 в ксенотрансплантатах человеческих клеток нМРЛ H1975 у гуманизированных Т-клетками мышей NSG.

Эффективность биспецифического антитела к IC3B34 IAPB57xCD3B376 оценивали на развившихся ксенотрансплантатах немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) человека Н1975 у самок мышей NOD.CgPrkdcscid I12rgtmlWjl/SzJ (NSG), гуманизированных человеческими Т-клетками. IAPB57xCD3B376 в дозе 0,1, 0,35 или 1 мг/кг или контрольное антитело NullxCD3 вводили на 14, 18, 21 и 25 дни, всего 4 дозы. На 29-й день после имплантатации опухоли, который был последней датой исследования, когда в группе оставалось десять животных, было рассчитано ингибирование роста опухоли (%TGI). Статистически значимое ингибирование роста опухоли наблюдали с IAPB57xCD3B376 в дозе 0,35 и 1 мг/кг с 63 и 89% TGI, соответственно, по сравнению с контролем NullxCD3 (двусторонний дисперсионный анализ с поправкой Бонферрони, р<0,0001, фиг. 57).

5. Антитела к CD33.

5.1. Создание антигенов.

Белки CD33 человека и яванского макака получали с или без мутированной мономерной формы человеческого сывороточного альбумина (HSA), Uniprot P02768 с мутацией C58S, слитой на С-конце для иммунизаций и анализов. кДНК, кодирующие антигены белка CD33 с шестигистидиновой меткой (SEQ ID NO: 596), синтезировали и клонировали в вектор экспрессии для секреции у млекопитающих под управлением промотора актина с использованием стандартных методов молекулярной биологии.

Внеклеточный домен (ВКД) полноразмерного CD33 человека, полученный из Uniprot P20138 (SEQ ID NO: 235) (ВКД CD33 человека), сливали на N-конце с сигнальной последовательностью и с HSA или без нее, после чего следовала шестигистидиновая метка (SEQ ID NO: 596) на С-конце, (ВКД hCD33 с

- 108 045935

HSA и только ВКД hCD33). Конструкт, экспрессирующий CD33 человека, временно трансфицировали в клетки, полученные из HEK 293, Expi293 (Gibco/Thermo Fisher Scientific; г. Уолтем, штат Массачусетс, США) с использованием Expifectamine в соответствии с протоколом производителя. Перед сбором клетки инкубировали в течение 5 дней при 37°С в атмосфере с 8% СО₂ на орбитальном шейкере. Экспрессирующие клетки удаляли центрифугированием и растворимый CD33 очищали из среды с использованием афинной хроматографии на иммобилизованных ионах металла с использованием смолы Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare; г. Масс-Чалфонт, Великобритания) с последующей препаративной эксклюзионной хроматографией (SEC) Superdex 200 (GE Healthcare) в фосфатно-солевом буфере Дульбекко, рН 7,2 (1х DPBS). Элюированные фракции SEC, за исключением любых дисульфидных агрегатов, объединяли и стерилизовали фильтрованием, чтобы получить конечный белок для иммунизации и анализов CD33. Концентрацию белка определяли путем измерения при длине волны А280, а качество очищенного белка оценивали методом ДСН-ПААГ-электрофореза и аналитической эксклюзионной хроматографии (Phenomenex; г. Торранс, штат Калифорния). Измерения уровней эндотоксина проводили с использованием кассет EndoSafe-PTS, хромогенного LAL-теста (Charles River; г. Уилмингтон, штат Массачусетс).

Человеческие белки субдомена ВКД CD33, V-домен hCD33 с HSA, V-домен hCD33 с His, С2-домен hCD33 с HSA и С2-домен hCD33 с His конструировали, экспрессировали и очищали в виде ВКД полноразмерного человеческого CD33.

Конструкты CD33 яванского макака для анализов иммунизации и перекрестной селективности, ВКД CD33 яванского макака с HSA, CD33 яванского макака с His, также были созданы на основе последовательности Genbank XP005590138.1. Экспрессия и очистка белка CD33 яванского макака были такими же, как и для белков CD33 человека.

Антигены CD33 для скрининга биотинилировали в 50 мМ натрий фосфата при рН 7,2 с использованием набора SureLink Chromagenic Biotin Labeling (SeraCare KPL) в соответствии с условиями производителями. Вкратце к белку CD33 добавляли исходный раствор биотина с концентрацией 25 мМ в молярном соотношении 4:1 биотина к белку и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин при осторожном вращении, а затем переводили его на температуру 4°С и инкубировали в течение еще 2 ч. Невключенный биотин удаляли путем замены буфера на 1xDPBS. Концентрацию белка и включение биотина определяли путем измерения при длине волны А28 и A354 нМ с использованием прибора NanoDrop. Последовательности каждого из антигенов, описанных выше, приведены в табл. 35.

Таблица 35

Последовательности антигена

Название белка	ID белка	SEQ ID NO
ВКД CD33 яванского макака с HSA	C33W1	236
ВКД CD33 человека с HSA	C33W2	237
V-домен CD33 человека с HSA	C33W3	238
С2-домен CD33 человека с HSA	C33W4	239
V-домен CD33 человека с His	C33W8	240
С2-домен CD33 человека с His	C33W9	241
ВКД CD33 человека с His	C33W49	242
ВКД CD33 яванского макака с His	C33W50	243
CD33 человека, полноразмерный		244
CD33 яванского макака, полноразмерный		245

5.2. Создание изогенных линий клеток, экспрессирующих CD33.

Линии клеток, экспрессирующие CD33 человека и яванского макака, получали с использованием лентивируса (Genecopoeia; г. Роквилл, штат Мэриленд, США), содержащего полноразмерный CD33 человека или CD33 яванского макака и пуромицин для селекции CD33-положительных клеток. Клетки HEK293F (АТСС), отрицательные по CD33, трансдуцировали лентивирусными частицами для сверхэкспрессии CD33 человека и CD33 яванского макака. После трансдукции клетки, положительно экспрессирующие CD33 и маркер устойчивости, отбирали путем обработки объединенных клеток, выращенных в DMEM+10% HI FBS (Life Technologies; г. Карлсбад, штат Калифорния) с добавлением различных концентраций пуромицина (Life Technologies).

Кроме полученных с помощью HEK линий клеток, для анализов связывания и клеточной токсичности использовали несколько коммерческих линий клеток. Они включали MOLM13, KG1, SH2, OCIAML3 и MV411 и были получены или из Американской коллекции типовых культур, или из Deutsche Sammlung von Mikrooranismen und Zellkulturen, и культивировали при 37°C, 5% CO2 в полной культуральной среде RPMI с 10% FBS.

- 109 045935

5.3. Кампании иммунизации.

OmniRat.

Линию трансгенных крыс, синтезирующих человеческий иммуноглобулин (OmniRat®; Ligand Pharmaceuticals; г. Сан-Диего, штат Калифорния), использовали для создания клеток гибридомы, экспрессирующих моноклональное антитело к CD33 человека. Крысы OmniRat® содержат химерный человеческий/крысиный локус IgH (содержащий 22 человеческих сегмента VHS, все человеческие сегменты D и JH в естественной конфигурации, связанные с крысиным локусом C_H), а также полностью человеческие локусы IgL (12 Vks, связанных с Jk-Ck, и 16 V,s, связанных с Jλ-Cλ) (см., например, Osborn et al. (2013), J. Immunol., 190(4):1481-1490). Соответственно крысы демонстрируют сниженную экспрессию крысиного иммуноглобулина, и в ответ на иммунизацию внедренные человеческие трансгены тяжелой и легкой цепей переключаются на экспрессию другого класса и подвергаются соматической мутации с образованием высокоаффинных химерных человеческих/крысиных моноклональных антител IgG с полностью человеческими вариабельными областями. Получение и применение OmniRat® и геномные модификации в таких крысах описаны в публикации РСТ WO 2014/093908, составленной Bruggemann et al.

При иммунизации рекомбинантным CD33 человека и яванского макака (ВКД huCD33 с HSA и ВКД CD33 яванского макака с HSA соответственно) эта трансгенная крыса продуцирует химерные крысиные/человеческие антитела IgG к человеческому CD33, некоторые из которых также связываются с CD33 яванского макака.

Восемь крыс OmniRat иммунизировали попеременно ВКД huCD33 с HSA и ВКД CD33 яванского макака с HSA. После 46-дневного режима иммунизации лимфатические узлы всех восьми OmniRat собирали и использовали для создания гибридом. Восемьдесят один 96-луночный планшет с супернатантами гибридом подвергали скринингу посредством ИФА связывания и AlphaLISA с использованием стандартных методик, из которых отбирали супернатанты 128 гибридом на специфическое связывание с ВКД huCD33 с HSA и ВКД CD33 яванского макака с HSA. Большинство из 128 супернатантов также были положительными в отношении связывания с клетками, сверхэкспрессирующими huCD33 или cyCD33.

Шесть дополнительных OmniRat иммунизировали только rhuCD33. После 31-дневного режима иммунизации лимфатические узлы всех шести OmniRat собирали и использовали для создания гибридом. Тридцать 96-луночных планшетов с супернатантами гибридом подвергали скринингу посредством ИФА связывания и AlphaLISA с использованием стандартных методик, из которых отбирали 94 супернатанта гибридом на специфическое связывание с ВКД huCD33 с HSA и ВКД CD33 яванского макака с HSA. Лизаты гибридом получали из положительных клонов и готовили к клонированию V-области, как описано ниже.

OmniMouse.

Линию трансгенных мышей, синтезирующих человеческий иммуноглобулин (OmniMouse®; Ligand Pharmaceuticals), использовали для создания гибридомных клеток, экспрессирующих моноклональное антитело к CD33 человека. OmniMouse® содержит химерные человеческие/крысиные локусы IgH вместе с полностью человеческими локусами IgL. Мыши демонстрируют сниженную экспрессию мышиного иммуноглобулина, и в ответ на иммунизацию внедренные человеческие трансгены тяжелой и легкой цепей переключаются на экспрессию другого класса и подвергаются соматической мутации для создания высокоаффинных химерных человеческих/крысиных моноклональных антител IgG с полностью человеческими вариабельными областями.

При иммунизации рекомбинантным CD33 человека и яванского макака (ВКД huCD33 с HSA и ВКД CD33 яванского макака с HSA соответственно) эта трансгенная мышь продуцирует химерные крысиные/человеческие антитела IgG к человеческому CD33, некоторые из которых также связываются с CD33 яванского макака.

Четыре OmniMouse иммунизировали попеременно ВКД huCD33 с HSA и ВКД CD33 яванского макака с HSA. После 53-дневного режима иммунизации собирали селезенки и лимфатические узлы от всех четырех OmniMouse и использовали их для создания гибридом. Сорок восемь 96-луночных планшетов с супернатантами гибридом подвергали скринингу посредством ИФА связывания и AlphaLISA, из которых отбирали 8 супернатантов гибридом на специфическое связывание с ВКД huCD33 с HSA и ВКД CD33 яванского макака с HSA. Лизаты гибридом получали из положительных клонов и готовили к клонированию V-области, как описано ниже.

Клонирование V-области.

Общую РНК из лизатов клеток гибридомы очищали с помощью набора RNeasy 96 (Qiagen; г. Хилден, Германия) в соответствии с протоколом производителя, и полученную РНК количественно определяли с помощью системы Drop Sense и хранили при -80°С, или кДНК синтезировали с использованием Superscript III First-Strand Synthesis System для ОТ-ПЦР (Invitrogen; г. Карлсбад, штат Калифорния). Синтез первой цепи кДНК проводили с использованием ген-специфических праймеров, отожженных с константными областями тяжелых, каппа-и лямбда-цепей соответственно. Реакционная

- 110 045935 смесь для ОТ-ПЦР содержит до 3 мкг очищенной РНК, ген-специфического праймера, смеси dNTP, реакционного буфера, 25 мМ MgCl₂, DTT, RNaseOUT™ (40 Ед/мкл, Invitrogen) и Superscript™ III RT (200 Ед/мкл, Invitrogen, кат. № 18080-051) и инкубируется при 50°С в течение 50 мин и 85°С в течение 5 мин. Полученную одноцепочечную кДНК хранили при -20°С или одноцепочечную ДНК амплифицировали с помощью ПЦР. Реакцию ПЦР проводили с использованием полимеразы Platinum Pfx (Invitrogen). Фрагменты v-области амплифицировали путем отжига прямого и обратного праймеров с лидерными последовательностями и константными областями тяжелой, каппа-и лямбда-цепей, соответственно, с использованием оптимизированных условий ПЦР. Полученные ПЦР-фрагменты прогоняли в геле и секвенировали с использованием предварительно разработанных праймеров для получения последовательностей v-области. Полученные файлы в формате abi для последовательностей v-областей собирали и анализировали с помощью программы анализа последовательностей v-областей по Сенгер, созданной в Janssen Biologics Discovery. Последовательности аминокислот выделенных vобластей записывали во внутренней базе данных, оптимизировали кодоны и клонировали в вектор экспрессии на основе pUnderm, несущий соответствующую константную область желаемого изотипа человеческого антитела: IgG1 F405L и IgG4 PAA. В общей сложности 76 антител OMNIRat и 8 антител OMNIMouse были успешно клонированы и отправлены для дальнейшей характеризации. В таблицах ниже приведены последовательности из 32 первых последовательностей, идентифицированных в процедурах с OMNIRat (см. табл. 36), и 8 последовательностей, идентифицированных в процедуре OMNEVIouse (см. табл. 37) с несколькими антителами OMNIRat, клонированными в IgG1, а также в IgG4 PAA, а все последовательности из процедур с OMNEVIouse клонировали как в IgG1, так и в IgG4 PAA.

Таблица 36

Последовательности антител, идентифицированные посредством иммунизации CD33 у крыс OMNIRat

мкАт	ID НС	Изотип НС	IDLC
СЗЗВ46	СЗЗН1О8	hulgGlF405L	C33L74
СЗЗВ48	СЗЗН8О	hulgGlF405L	C33L73
СЗЗВ52	СЗЗН42	hulgGlF405L	C33L8
СЗЗВ54	СЗЗН44	hulgGlF405L	C33L10
СЗЗВ55	СЗЗН45	hulgGlF405L	C33L11
СЗЗВ56	СЗЗН46	hulgGlF405L	IAPL24
СЗЗВ61	СЗЗН48	hulgGlF405L	C33L58
СЗЗВ62	СЗЗН49	hulgGlF405L	C33L59
C33B63	СЗЗН51	hulgGlF405L	C33L34
СЗЗВ64	СЗЗН52	hulgGlF405L	N46L109
СЗЗВ66	СЗЗН55	hulgGlF405L	C33L42
СЗЗВ72	СЗЗН65	hulgGlF405L	C33L47
C33B73	СЗЗН66	hulgG!F405L	C33L60

- 111 045935

СЗЗВ75	СЗЗН70	hulgGlF405L	N46L109
СЗЗВ77	СЗЗН72	hulgGlF405L	C33L40
СЗЗВ79	СЗЗН74	hulgGlF405L	C33L38
СЗЗВ8О	СЗЗН76	hulgGlF405L	C33L39
СЗЗВ82	СЗЗН78	hulgGlF405L	C33L57
C33B83	СЗЗН81	hulgGlF405L	C33L53
СЗЗВ87	СЗЗН87	hulgGlF405L	C33L35
СЗЗВ88	СЗЗН88	hulgGlF405L	C33L61
СЗЗВ89	СЗЗН90	hulgGlF405L	C33L51
СЗЗВ94	СЗЗН98	hulgGlF405L	C33L69
СЗЗВ95	СЗЗН98	hulgGlF405L	IAPL24
СЗЗВ96	СЗЗН99	hulgGlF405L	C33L37
СЗЗВ1О1	СЗЗН69	hulgGlF405L	C4LL152
СЗЗВ107	СЗЗН68	hulgGlF405L	C33L17
СЗЗВ120	СЗЗН87	hulgGlF405L	C33L41
СЗЗВ122	СЗЗН92	hulgGlF405L	C33L3O
C33B123	СЗЗН91	hulgGlF405L	C33L44
СЗЗВ124	C33H73	hulgGlF405L	C33L32
СЗЗВ125	СЗЗН84	hulgGlF405L	C33L66
СЗЗВ760	СЗЗН45	huIgG4 PAA	C33L11
СЗЗВ777	СЗЗН65	huIgG4 PAA	C33L47
СЗЗВ778	СЗЗН66	huIgG4 PAA	C33L60
СЗЗВ782	СЗЗН72	huIgG4 PAA	C33L40
СЗЗВ792	СЗЗН87	huIgG4 PAA	C33L35
СЗЗВ799	СЗЗН98	huIgG4 PAA	C33L69
СЗЗВ806	СЗЗН69	huIgG4 PAA	C4LL152
C33B83O	СЗЗН84	huIgG4 PAA	C33L66
C33B836	СЗЗН8О	huIgG4 PAA	C33L73
C33B937	СЗЗН66	huIgG4 PAA	C33L132

НС: тяжелая цепь;

LC: легкая цепь

Таблица 37

Последовательности антител, идентифицированные посредством иммунизации CD33 у OMNIMouse

мкАт	IDHC	ID LC
C33B901	C33H249	C33L115
C33B902	C33H250	C33L116
C33B903	C33H251	C33L117

- 112 045935

СЗЗВ904	СЗЗН252	C33L118
СЗЗВ9О5	C33H253	C33L119
СЗЗВ906	СЗЗН254	C33L120
СЗЗВ907	СЗЗН255	C33L121
СЗЗВ9О8	СЗЗН256	C33L122
СЗЗВ909	СЗЗН249	C33L115
СЗЗВ910	СЗЗН25О	C33L116
СЗЗВ911	СЗЗН251	C33L117
СЗЗВ912	СЗЗН252	C33L118
C33B913	C33H253	C33L119
СЗЗВ914	СЗЗН254	C33L120
СЗЗВ915	СЗЗН255	C33L121
СЗЗВ916	СЗЗН256	C33L122

НС: тяжелая цепь;

LC: легкая цепь.

5.4. Трансфекция Expi293 и очистка в малых масштабах.

Антитела, идентифицированные в кампаниях иммунизации и последующем клонировании V-области (в IgG1 F405L и IgG4 PAA), экспрессировали и очищали в небольшом масштабе 2 мл. Клетки Expi293™ (ThermoFisher Scientific) высевали с плотностью 1,25x105-2,25x105 жизнеспособных клеток/мл в среду для экспрессии Expi293 и культивировали в поликарбонатных, одноразовых, стерильных, вентилируемых, встряхиваемых колбах Эрленмейера без дефлекторов в шейкере-инкубаторе при 37°С, 7% CO₂(INFORS HT Multitron Pro). Для стандартного роста клеток во встряхиваемых колбах объемом 125 мл-2 л, скорость встряхивания устанавливали на 130 об/мин для шейкеров с диаметром встряхивания 19 мм. Клетки пересевали, когда плотность достигала логарифмической фазы роста при 3x10⁶-5x10⁶жизнеспособных клеток/мл с 98-99% жизнеспособности.

В день трансфекции определяли плотность жизнеспособных клеток и процент жизнеспособности. Клетки трансфицировали с плотностью 3x10⁶ жизнеспособных клеток/мл. Для оптимальной трансфекции используют стерильную плазмидную ДНК тяжелой и легкой цепей в концентрации 0,1 мг/мл в буфере ТЕ (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТК, рН 8,0).

Клетки Expi293 трансфицировали в соответствии с протоколом трансфекции производителя (публикация ThermoFisher № MAN0007814). Трансфекцию проводили в 24-луночных планшетах с глубокими лунками (GE Healthcare). Вкратце плазмидную ДНК разводили 0,1 мл среды OptiMEM™ (ThermoFisher Scientific) в следующем соотношении: 0,250 мкг ДНК тяжелой цепи: 0,750 мкг ДНК легкой цепи: 0,5 мкг pAdvantage. 5 мкл реагента для трансфекции ExpiFectamine 293 разбавляли и осторожно перемешивали с 95 мкл среды OptiMEM™ и инкубировали в течение 1 мин. Разбавленный реагент ExpiFectamine™ 293 добавляли к разбавленной ДНК, осторожно перемешивали, а комплексы ExpiFectamine 293/плазмидная ДНК инкубировали при комнатной температуре в течение 40 мин. После инкубации к комплексам, инкубированным в течение ночи в шейкере-инкубаторе при 37°С и при 7% СО₂добавляли 1,8 мл клеток Expi293™.

Через 1 день после трансфекции добавляли 10 мкл реагента ExpiFectamine™ 293 Enhancer 1 и 100 мкл реагента Expifectamine 293™ Enhancer 2 и возвращали планшеты в инкубатор еще на 5 дней. Культуру собирали на 6 день после трансфекции путем центрифугирования при 850xg в течение 15 мин перед очисткой.

1,7 мл Осветленных экспрессионных супернатантов, приготовленных, как описано выше, переносили в новый 96-луночный планшет с глубокими лунками объемом 2 мл. Планшеты для очистки получали путем внесения пипеткой 800 мкл смеси 1: 4 MabSelect SuRe (GE Healthcare) и DPBS-/суспензии в каждую лунку 96-луночного стеклянного фильтровального планшета с 1 мкМ порами Acroprep Advance (Pall). К планшету прикладывали вакуумное давление 200 мбар для удаления избытка PBS и затем промывали 800 мкл свежего PBS. Для удаления промывочного буфера применяли давление вакуума 200 мбар. Затем осветленные супернатанты переносили на смолу, промытую PBS, осторожно перемешивали и инкубировали в течение 15 мин. После инкубации применяли вакуумное давление 200 мбар для удаления супернатанта. MabSelect Sure трижды промывали PBS и один раз 25 мМ натрий ацетата, рН 5 (TEKNOVA; г. Холлистер, штат Калифорния) при давлении вакуума 200 мбар между промывками для удаления избыточного буфера. Связанные со смолой мкАт элюировали 0,1 М натрий ацетатом, рН 3,5, и инкубировали в течение 10 мин для эффективной диссоциации. Планшет с фильтром помещали на 96-луночный планшет и элюированные мкАт собирали в нижнем планшете путем центрифугирования при 1000 g в течение 2 мин, для нейтрализации мкАт добавляли 80 мкл 2,5 М трис

- 113 045935 ацетата, рН 7,2. мкАт диализовали в PBS в течение ночи в 96-луночном планшете DispoDIALYZER (Harvard Apparatus; г. Холлистон, штат Массачусетс), переносили в 96-луночный фильтровальный планшет с 0,2 мкМ порами Supor Acroprep Advance (Pall; г. Порт Вашингтон, штат Нью-Йорк), помещали на 96-луночный планшет с глубокими лунками, и растворы белков фильтровали путем центрифугирования при 1500 g в течение 15 мин в настольной центрифуге. Концентрации белка определяли путем измерения при длине волны А280 на фильтрате с помощью прибора DropSense (Trinean).

Таблица 38

Вариабельные области тяжелой и легкой цепей мкАт к CD33

ID НС	SEQ ID NO	АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
В23Н1	246	QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGK ALEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNM DPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTLVTVSS
CD3H141	247	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQ MNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS

CD3H219	20	QVQLQQSGPRLVRPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAAWSWIRQSPS RGLEWLGRTYYRSKWLYDYAVSVKSRITVNPDTSRNQFTLQL NSVTPEDTALYYCARGYSSSFDYWGQGTLVTVSS
СЗЗН42	248	QLQLQESGPGLVNPSETLSHTCTVSGGSISSSSHYWGWIRQPPG KGLEWIGKIYYSGNTYYNPSLKSRVTISIDTSKNQFSLKMSSVT AADTAVYYCARLADVVVVPAARYFDSWGQGTLVTVSS
СЗЗН44	249	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPS RGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVRSRITINPDTSKNQFSLQLN SVTPEDTAVYHCARETMFRGLMDYWGQGTLVTVSS
СЗЗН45	250	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQSPG KGLEWVAVISYDGSNKYCADSVKGRFTISRDNSKSTLYLQMNS LRAEDTAVYYCAKDFRSLDWLPPDSTSYDGMDVWGQGTTVT VSS
СЗЗН46	251	QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMNWVRQAP GQGLEWMGWINTNTGNPTYAQAFTGRFVFSLDTSVSTAYLQIS SLKAEDTAVYYCARDREVRDYWGQGTLVTVSS
СЗЗН48	252	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRSTNYYWGWIRQPPG KGLEWIGTIYYSGNTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVT AADTAVYYCARLADVVVVPAARYFDYWGQGILVTVSS
СЗЗН49	253	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRSSGFYWGWIRQPPR KGLEWIGTIYYSGNTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVT AADTAVYFCARLADVVVVPAARYFDNWGQGTLVTVSS
СЗЗН51	254	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISTGRYYWGWIRQPPG KGVIWIGNIYYSGNTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVT AADTAVYYCARLGSLVVVPAAMSFDYWGQGTLVTVSS
СЗЗН52	255	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRGSSYYWGWVRQPP GKGLEWIGSIYSSGNTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVT AADTALYYCARLGSLVVVPAAMSFDYWGQGTLVTVSS
СЗЗН55	256	QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPG RGLEWIGEIYHSGNTNNSPSLKSRVTISADKSKNQFSLKLSSVTA ADT A VYFC ARIIA VARYFDS WGQGTLVT VS S
СЗЗН65	257	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPG KGLEWVVVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCAKDFRDFDWLPPDSTSYHGMDVWGQGTTV TVSS
СЗЗН66	258	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPG KGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEGTAVYYCAKDFRSFDWLPPDSASYHGMDVWGQGTTV TVSS
СЗЗН68	259	EVQLLESGGGLVQPGGSLGLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPG KGLNWVSAIDYSGNDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCAKESQLLHGLFEHWGQGILVTVSS
СЗЗН69	26	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPG KGLDWIGSINYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKIQFSLKLRSVTA ADTAVYYCARLDGYESPFDYWGQGTLVTVSS

- 114 045935

C33H70	261	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRGSSYYWGWIRQPPG KGLEWIGSIYSSGNTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTA ADTAVYYCARLGSLVVVPAAMSFDYWGQGTLVTVSS
C33H72	262	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPG KGLEWVANIKQHGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMN SLRAEDTAVYYCARDRDLGYFDYWGQGTLVTVSS
C33H73	263	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFTFSSYAMTWVRQAPGK GLEWVSTINISGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCTKGGYSSGPFDYWGQGTLVSVSS
C33H74	264	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASRFTFSSYGMHWVRQAPG KGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVHYCAKDFRSFDWLPPDSASYHGMDVWGQGTTV TVSS
C33H76	265	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNYAMSWVRQAPGK GLEWVSATSGSGGSTYYADSVKGRFTTSRDTSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCARTYNSGYYDGDFDYWGQGTLVTVSS
C33H78	266	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPG KGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNS LRAEDTAVYYCAKDFRYFDWLPPDSSSYYGMDVWGQGTTVT VSS
C33H80	267	QVQLVQSGSELRKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMNWVRQAP GQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSSAYLQIS SLKAEDTAMYYCATDRDRGTDYWGQGTLVTVSS
C33H81	268	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSAYGMHWVRQAPG KGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEGTAVYYCAKDFRSFDWLPPDSASYHGMDVWGQGTTV TVSS
C33H84	269	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPG KGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCAKDFRSFDWLPPDSTSYYGMDVWGQGTTVT VSS
C33H87	270	EVQLVESGGGFVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPG KGLEWVANIKQHGSEKYYVDSVKGRFTISRDNVKNSLYLQMN SLRTEDTAVYYCARDRDLGYFDYWGQGTLVTVSS
C33H88	271	QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTLTRSAMNWVRQAPG QGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVNTAYLLISS LKTEDTAVYYCASDILPGYHEDYWGQGTLVTVSS
C33H90	272	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPS RGLEWLGRTYYRSKWYNDYALSVQSRITINPDTSKNQFSLQLN SVTPEDTAVYYCAREVAVAASFDYWGQGTLVTVSS
C33H91	273	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSRSHYWGWIRQPPG VGLEWIGSIYYTGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTA ADTAVYYCARLADIVVVPAARYFDYWGQGTLVTVSS
C33H92	274	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRSSSYYWGWIRQPPG KGPEWIGSIYSSGNTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLISMTA ADTAVFYCARLAATIVVPAARYFDCWGQGTLVTVSS

- 115 045935

C33H98	275	EVQLVESGGGFVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPG KGLEWVANIKQHGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMN SLRAEDTAVYYCARDRDLGYFDYWGQGTLVTVSS
C33H99	276	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRPAPG KGLEWVANIKRDGGEKYYVDSVKGRFTISRDNAANSLYLQMN SLRVEDTAVYYCARPFYDHFDYWGQGTLVTVSS
C33H108	277	QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFSTYAMNWVRQAPG QGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISS LKAEDTAVYYCARDRDRGTDYWGQGTLVTVSS
C33H249	278	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVASGFTFDDYAIHWVRQAPGK GLEWVSGLSWNGGNIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LKTEDTAFYYCTKDTPYGDYFDYWGQGTLVTVSS
C33H250	279	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAGSGFTFDDYAIHWVRQAPGK GLEWVSGLSWNGGNIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSL KTEDTAFYYCAKDSPYGDYFDYWGQGTLVTVSS
C33H251	280	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPG KGLEWVSGIGWSGGSIVYADSVKGRFKISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTALYYCAKDSPYGDFFDYWGQGTLVTVSS
C33H252	281	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPG KGLEWVSGIGWSGGSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS LRAEDTALYYCAKDSPYGDFFDYWGQGTLVTVSS
C33H253	282	EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCTASGFTFRSYAMSWVRQAPGK GLEWVSAINGYGDGRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNS LRAEDTAVYSCAKDQGFGELFFDYWGQGTLVTVSS
C33H254	283	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSYYGMHWVRQAPD KGLEWVAVIWFDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCARDRELLFDYWGQGTLVTVSS
C33H255	284	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQVPG EGLEWVSGISWNGGDMVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMN SLRPEDTALYYCVKDMPYFDFLTGSDYYYYGMDVWGQGTTV TVSS
C33H256	285	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCATSGFTFSNYGMHWVRQAPG KGLEWVAVIWYVGSHKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCARDGSLCFDYWGQGTLVTVSS
ID LC	SEQ ID NO	АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
B23L3	286	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVDYNGISYMHWYQQK PGQPPKLLIYAASNPESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA VYYCQQIIEDPWTFGQGTKVEIK
CD3L66	287	QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPG QAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEA EYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
CD3L150	52	QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPDK APKVLLYEVSKRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDQADY HCVSYAGSGTLLFGGGTKLTVL

- 116 045935

C33L8	288	SYELTQPPSVSVSPGQTASIICSGDKLGNKYACWYQQKPGQSPV LVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAVDEADYYCQ AWDSSTYVFGTGTKVTVL
C33L10	289	SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGSNIGSKSVHWYQQKPGQAP VMVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYY CQVWDSSSDVVFGGGTKLTVL
C33L11	290	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGHKLGDKYACWYQQKPGQSP VVVIYKDSKRPSGIPERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYC QAWDSSTVVFGGGTKLTVL
IAPL24	291	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSP VLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYC QAWDSSTVVFGGGTKLTVL
C33L58	292	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSP VLVIYQDYKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYC QAWDSSTYVFGTGTKVTVL
C33L59	293	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSP VLVIYQDYKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQTMDEADYYC QAWDISTYVFGTGTKVTVL
C33L34	294	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQLRPGQSPI LVIYQDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQ AWDSSTWVFGGGTKLTVL
N46L109	295	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSP VLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYC QAWDSSTWVFGGGTKLTVL
C33L42	296	SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGIKSVHWYQQKPGQAP VLVVYDDSDRPPGIPERFSGSNSGNTATLTITRVEAGDEADYYC QVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL
C33L47	297	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSP VVVIYQDRKRPSGIPERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYC QAWDSSTVVFGGGTKLTVL
C33L60	298	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSP VLVIYQDGKRPSGIPERFSGSNFGNKATLTISGTQAMDEADYYC QAWDRNTVVFGGGTKLTVL
C33L17	299	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQ QKAGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFILIISSLQAED VAVYYCQQYYGTPWTFGQGTKVEIK
C4LL152	300	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKA PKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQANSFPFTFGPGTKVDIK
C33L40	301	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGNKLGAKFASWYQQKPGQSPV LVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAVDEADYYCQ AWDSSTVVFGGGTKLTVL
C33L32	302	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVRWYQQKTGQSP VLVMYQDSKRPSGIRERFYGSNSGNTATPTISGTQAVDEAEYY CQAWDSSTGVVFGGGTKLTVL

- 117 045935

C33L38	303	SYELTQPPSVSVPPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSP VLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYC QAWGRNTVVFGGGTKLTVL
C33L39	304	QSALTQPASVSGSPGQSIPISSTGTSSDDGKNNIVSWYQQHPGK APKLMIYKDSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQADDEADY HCCSYAGASNHVVFGGGTKLTVL
C33L57	305	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDELGNKYACWYQQKPGQSP VVVVYQDRKRPSGIPERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYY CQAWDSSTVVFGGGTKLTVL
C33L73	306	QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGDYNYVSWYQQHPGK VPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSMSGNTASLTISGLQAEDEADY YCSSYSSSSALEVFGGGTKLTVL
C33L53	307	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSP VLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYC QAWDSNTVVFGGGTKLTVL
C33L66	308	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVCWYQQKPGQSP VVVIHQDRKRPSGIPERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYC QAWDSSTVVFGGGTKLTVL
C33L35	309	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGNKYASWYQQKPGQSP VLVIYQDTKRPSGIPERVSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYHC QAWDSSTVVFGGGTKLTVL
C33L61	310	QSALTQPASVSGSPGQSmSCTGINSDVGSYDLVSWYQQHPGK APKLLIYDGSERPSGVFGRFSGSKSDNTTSLTISGLQAEDEAAY YCCSYEVTTTYVVFGGGTKLTVL
C33L51	311	SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWSQQKPGQAP VLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYC QVWDSNSDHVVFGGGTKLTVL
C33L44	312	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSP VLVIYQDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISETQAMDEADYYC QAWDSSTYVFGTGTKVTVL
C33L3O	313	SYELTQPPSVSVSPGQTVSISCSGDRLGDKYACWYQQKPGQSP VLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYC QAWDSSSYVFGTGTKVTVL
C33L69	314	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGSKFACWYQQKPGQSPV LVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQ AWDSSTVVFGGGTKLTVL
C33L37	315	SYVLTQPPSVAVAPGQTARITCGGSNIGKISVHWYQQKAGQAP VLVVHDDRARPSGIPERLSGSNSGTTATLTISRVEVGDEADYYC QVWNSSSVHPVFGGGTKLTVL
C33L74	316	QSALTQPASVSGSPGQSmSCTGTSSDVGDDNYVSWYQQHPGK APKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQSEDEADY YCSSYSSSTTLEVFGGGTKLTVL
C33L115	317	DIQMTQSPSSVWASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQQPGKA PNLLIYRSSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ QDNSFPYTFGQGTKLEIK

- 118 045935

C33L116	318	DIQMTQSPSSEWASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKA PKLLIYGASSWQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQDNSFPYTFGQGTKLEIK
C33L117	319	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQTVLYSSNNKNYLAWYQ QKPGQPPKLLISWASTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTVSSLQAE DVAVYYCQHYYSTPYTFGQGTKLEIK
C33L118	320	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQTVFYSSNNKNYLAWYQ QKPGQPPKLLISWASTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTVSSLQAE DVAVYYCQHYYSTPYTFGQGTKLEIK
C33L119	321	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAP KLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYCCQ QYNSYPWTFGQGTKVEIK
C33L120	322	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDELGDMYACWYQQKPGQSP LVVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEAAYYC QTWDTRIAVFGGGTNLTVL
C33L121	323	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNLGNEHVCWYHQKPGQSP VLVIYQNNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLSISGTQATDEADYYC QAWDSTTAVFGGGTKLTVL
C33L122	324	SYELTQPPSVSVSPGQTANISCSGVTLGYNYAYWYQQKPGQSPI LVISQDTQRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEAAYYCQ AWDITTVLFGGGTKLTVL
C33L132	325	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQQKPGQSP VLVIYQDGKRPSGIPERFSGSNFGNKATLTISGTQAMDEADYYC QAWDRNTVVFGGGTKLTVL
C33L41	326	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGNKYASWYQQKPGQSP VLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYC QAWDSSTVVFGGGTKLTVL

Таблица 39

Последовательности CDR1-3 тяжелой цепи мкАт к CD33

ID HC	CDR1	ID	CDR2	ID	CDR3	ID
B23H1	GFSLSTSG MG	327	IYWDDDK	368	ARLYGFTYGFAY	409
CD3H1 41	GFTFNTYA	328	IRSKYNNY AT	369	ARHGNFGNSYVSWFAY	410
CD3H2 19	GDSVFNNN AA	329	TYYRSKW LY	370	ARGYSSSFDY	411
C33H42	GGSISSSSH	330	IYYSGNT	371	ARLADVVVVPAARYFDS	412
C33H44	GDSVSSNS AA	331	TYYRSKW YN	372	ARETMFRGLMDY	413
C33H45	GFTFSSYG	332	ISYDGSNK	373	AKDFRSLDWLPPDSTSYDG MDV	414
C33H46	GYTFTNYA	333	INTNTGNP	374	ARDREVRDY	415
C33H48	GGSIRSTNY	334	IYYSGNT	375	ARLADVVVVPAARYFDY	416

- 119 045935

	Y
C33H49	GGSIRSSGF Υ	335	IYYSGNT	376	ARLADVVVVPAARYFDN	417
C33H51	GGSISTGRY Υ	336	IYYSGNT	377	ARLGSLVVVPAAMSFDY	418
C33H52	GGSIRGSSY Υ	337	IYSSGNT	378	ARLGSLVVVPAAMSFDY	419
C33H55	GGSISSSNW	338	IYHSGNT	379	ARIIAVARYFDS	420
C33H65	GFTFSSYG	339	ISYDGSNK	380	AKDFRDFDWLPPDSTSYHG MDV	421
C33H66	GFTFSSYG	340	ISYDGSNK	381	AKDFRSFDWLPPDSASYHG MDV	422
C33H68	GFTFSGYA	341	IDYSGNDT	382	AKESQLLHGLFEH	423
C33H69	GGSISSSSY Y	342	INYSGST	383	ARLDGYESPFDY	424
C33H70	GGSIRGSSY Y	343	IYSSGNT	384	ARLGSLVVVPAAMSFDY	425
C33H72	GFTFSSYW	344	IKQHGSEK	385	ARDRDLGYFDY	426
C33H73	RFTFSSYA	345	INISGGST	386	TKGGYSSGPFDY	427
C33H74	RFTFSSYG	346	ISYDGSNK	387	AKDFRSFDWLPPDSASYHG MDV	428
C33H76	GFTFNYA	347	ISGSGGST	388	ARTYNSGYYDGDFDY	429
C33H78	GFTFSSYG	348	ISYDGSNK	389	AKDFRYFDWLPPDSSSYYG MDV	430
C33H8O	GYTFTNYA	349	INTNTGNP	390	ATDRDRGTDY	431
C33H81	GFTFSAYG	350	ISYDGSNK	391	AKDFRSFDWLPPDSASYHG MDV	432
C33H84	GFTFSSYG	351	ISYDGSNK	392	AKDFRSFDWLPPDSTSYYG MDV	433
C33H87	GFTFSSYW	352	IKQHGSEK	393	ARDRDLGYFDY	434
C33H88	GYTLTRSA	353	INTNTGNP	394	ASDILPGYHEDY	435
C33H90	GDSVSSNS AA	354	TYYRSKW YN	395	AREVA VAASFDY	436
C33H91	GGSISSRSH	355	IYYTGST	396	ARLADIVVVPAARYFDY	437
C33H92	GGSIRSSSY Y	356	IYSSGNT	397	ARLAATIVVPAARYFDC	438
C33H98	GFTFSSYW	357	IKQHGSEK	398	ARDRDLGYFDY	439
C33H99	GFTFSSYW	358	IKRDGGEK	399	ARPFYDHFDY	440
C33H10	GYTFSTYA	359	INTNTGNP	400	ARDRDRGTDY	441
8
C33H24 9	GFTFDDYA	360	LSWNGGNI	401	TKDTPYGDYFDY	442
C33H25 0	GFTFDDYA	361	LSWNGGNI	402	AKDSPYGDYFDY	443
C33H25 1	GFTFDDYA	362	IGWSGGSI	403	AKDSPYGDFFDY	444
C33H25 2	GFTFDDYA	363	IGWSGGSI	404	AKDSPYGDFFDY	445
C33H25 3	GFTFRSYA	364	INGYGDGR	405	AKDQGFGELFFDY	446
C33H25 4	GFTFSYYG	365	IWFDGNNK	406	ARDRELLFDY	447
C33H25 5	GFTFDDYA	366	ISWNGGD M	407	VKDMPYFDFLTGSDYYYYG MDV	448
C33H25 6	GFTFSNYG	367	IWYVGSHK	408	ARDGSLCFDY	449

- 120 045935

Таблица 40

Последовательности CDR1 -3 легкой цепи мкАт к CD3

ID LC	CDR1	ID	CDR2	ID	CDR3	ID
B23L3	QSVDYNGISY	450	AAS	492	QQIIEDPWT	534
CD3L66	TGAVTTSNY	451	GTN	493	ALWYSNLWV	535
CD3L15 0	SSNIGTYKF	452	EVS	494	VSYAGSGTLL	536
C33L8	KLGNKY	453	QDS	495	QAWDSSTYV	537
C33L1O	NIGSKS	454	DDS	496	QVWDSSSDVV	538
C33L11	KLGDKY	455	KDS	497	QAWDSSTVV	539
IAPL24	KLGDKY	456	QDS	498	QAWDSSTVV	540
C33L58	KLGDKY	457	QDY	499	QAWDSSTYV	541
C33L59	KLGDKY	458	QDY	500	QAWDISTYV	542
C33L34	KLGDKY	459	QDS	501	QAWDSSTWV	543
N46L10 9	KLGDKY	460	QDS	502	QAWDSSTWV	544
C33L42	NIGIKS	461	DDS	503	QVWDSSSDHVV	545
C33L47	KLGDKY	462	QDR	504	QAWDSSTVV	546
C33L60	KLGDKY	463	QDG	505	QAWDRNTVV	547
C33L17	QSVLYSSNNK NY	464	WAS	506	QQYYGTPWT	548
C4LL15 2	QGISSW	465	AAS	507	QQANSFPFT	549

- 121 045935

C33L40	KLGAKF	466	QDN	508	QAWDSSTVV	550
C33L32	KLGDKY	467	QDS	509	QAWDSSTGVV	551
C33L38	KLGDKY	468	QDN	510	QAWGRNTVV	552
C33L39	SSDDGKNNI	469	KDS	511	CSYAGASNHVV	553
C33L57	ELGNKY	470	QDR	512	QAWDSSTVV	554
C33L73	SSDVGDYNY	471	DVS	513	SSYSSSSALEV	555
C33L53	KLGDKY	472	QDN	514	QAWDSNTVV	556
C33L66	KLGDKY	473	QDR	515	QAWDSSTVV	557
C33L35	KLGNKY	474	QDT	516	QAWDSSTVV	558
C33L61	NSDVGSYDL	475	DGS	517	CSYEVTTTYVV	559
C33L51	NIGSKS	476	DDS	518	QVWDSNSDHVV	560
C33L44	KLGDKY	477	QDS	519	QAWDSSTYV	561
C33L30	RLGDKY	478	QDS	520	QAWDSSSYV	562
C33L69	KLGSKF	479	QDS	521	QAWDSSTVV	563
C33L37	NIGKIS	480	DDR	522	QVWNSSSVHPV	564
C33L74	SSDVGDDNY	481	DVS	523	SSYSSSTTLEV	565
C33L11 5	QGISSW	482	RSS	524	QQDNSFPYT	566
C33L11 6	QGISSW	483	GAS	525	QQDNSFPYT	567
C33L11 7	QTVLYSSNNK NY	484	WAS	526	QHYYSTPYT	568
C33L11 8	QTVFYSSNNK NY	485	WAS	527	QHYYSTPYT	569
C33L11 9	QSISSW	486	KAS	528	QQYNSYPWT	570
C33L12 0	ELGDMY	487	QDS	529	QTWDTRIAV	571
C33L12 1	NLGNEH	488	QNN	530	QAWDSTTAV	572
C33L12 2	TLGYNY	489	QDT	531	QAWDTTTVL	573
C33L13 2	KLGDKY	490	QDG	532	QAWDRNTVV	574
C33L41	KLGNKY	491	QDS	533	QAWDSSTVV	634

5.5. Определение характеристик мкАт к CD33.

Антитела OMNIRat, идентифицированные посредством иммунизации, клонированные в v-области, а затем экспрессированные и очищенные, были дополнительно охарактеризованы на связывание с экспрессирующими CD33 клетками и на связывание с рекомбинантными антигенами. Очищенные антитела оценивали на связывание со стабильно трансфецированными клетками HEK293F, экспрессирующими CD33 человека или CD33 яванского макака (получение описано выше), вместе с исходным HEK293F в качестве отрицательного контроля. Клетки собирали из колб для тканевых культур с использованием неферментативного буфера для диссоциации (Thermo Scientific). Колбы дважды промывали PBS и в колбу добавляли буфер для диссоциации и инкубировали колбу в течение 10 мин при 37°С до тех пор, пока клетки не становились неприлипающими. Клетки центрифугировали при 300 g в течение 5 мин и ресуспендировали при 1,0х10⁶ клеток/мл в буфере для окрашивания (Becton Dickinson; г. Франклин-Лейкс, штат Нью-Джерси, США). Клетки каждого типа высевали в количестве 50000 клеток на лунку в 50 мкл окрашивающего буфера на круглодонные планшеты (Becton Dickinson). Добавляли 50 мкл исследуемого мкАт или изотипического контроля в 2х концентрации в 3 разведениях и нуль (120, 12, 1,2 и 0 нМ), и полученный раствор инкубировали в течение 30 мин при 4°С. 100 мкл окрашивающего буфера добавляли во все лунки каждого планшета, планшеты центрифугировали при 300 g в течение 5 мин, буфер удаляли, 200 мкл буфера для окрашивания добавляли во все лунки каждого планшета, планшеты центрифугировали при 300 g в течение 5 мин и удаляли буфер. 50 мкл 2 мкг/мл конъюгированного с AF647 вторичного козьего антитела к человеческому Fc (Jackson Immunoresearch; г. Вест Гроув, штат Пенсильвания, США) и планшеты инкубировали в течение 30 мин при 4°С. Во все лунки планшетов добавляли 100 мкл окрашивающего буфера, планшеты центрифугировали при 300 g в

- 122 045935 течение 5 мин и буфер удаляли. 200 мкл рабочего буфера (рабочий буфер представляет собой буфер для окрашивания, 1 мМ ЭДТК, 0,1% плюрониловой кислоты) добавляли во все лунки планшетов, планшеты вращали при 300 g в течение 5 мин и буфер удаляли. Во все лунки с клетками добавляли 30 мкл рабочего буфера, содержащего краситель Sytox Green Live/Dead (ThermoFisher), и планшеты считывали на проточном цитометре iQue IntelliCyt. Клетки гейтировали по прямому и боковому рассеянию для удаления остатков клеток, затем по синглетам, а затем по живым клеткам, в которых было исключено окрашивание Sytox. Связывание антитела оценивали по средней интенсивности флуоресценции в канале AF647.

Для начала оценки биофизических свойств связывания очищенных мкАт проводили скрининг на скорость диссоциации. 76 мкАт OMNTRat к CD33 тестировали на связывание с рекомбинантными белками ВКД CD33 человека с HSA (C33W2) и ВКД CD33 яванского макака с HSA (C33W1) (продукция Janssen) человека, и скорость диссоциации измеряли с помощью платформы IBIS MX96 SPRi (Carterra; г. Ньютон, штат Пенсильвания). Козьи антитела к человеческому Fc IgG (Jackson Immunoresearch, кат. № 109-005-098) были непосредственно иммобилизованы по амино-группе в концентрации 100 мкг/мл в ацетатном буфере, рН 4,5, с использованием сенсорного чипа CMD50m (Xantec, партия CMD50m0415^) со временем ассоциации 10 мин в приборе IBIS. Был достигнут средний уровень иммобилизации GAHFc~ 9000 Ru. Сенсорный чип переносили в устройство Continuous Flow Microspotter (CFM) для захвата каждого мкАт к CD33 в концентрации 10 мкг/мл в течение 10 мин. Связывание измеряли на IBIS SPRi по кинетике одного цикла без регенерации. Каждую серию концентраций антигена (3 мкМ в серии 3-кратных разведений) последовательно вводили от низких (0,46 нМ) до высоких концентраций (3 мкМ) для связывания с захваченными мкАт со временем ассоциации 5 мин и временем диссоциации 15 мин с использованием PBST (PBS с 0,005% Tween) в качестве рабочего буфера. Необработанные данные о связывании (формат файла.trix) были привязаны и выровнены с помощью программного обеспечения SprintX (Wasatch, версия 1.9.3.2), а затем экспортированы (формат файла.ibmx) в программу Scrubber (вер. 2.0) для кинетического анализа связывания 1:1 (Wasatch, версия 2.0.0.33) с получением k_off.

В табл. 41 ниже приведены 32 лучших клона, оцененных по связыванию с линиями клеток, экспрессирующими CD33 человека и яванского макака, а также с рекомбинантным антигеном (скорость диссоциации по меньшей мере >10е-3 для одного из антигенов). Из этих 32 все, кроме 4, продемонстрировали заметное связывание с экспрессирующими клетками или человека, или яванского макака. Для всех 32 определяли дополнительные характеристики с помощью эпитоп-специфической сортировки и полного кинетического анализа.

Таблица 41

Анализ связывания клеток и скорости диссоциации антител к CD33, полученных из OMNIRat

ID белка по а.к.	%Мо η	60 нМ CD33	6 нМ CD33	0,6 нМ CD33	0 нМ CD33	K_D
СЗЗВ48	91,96	400995,84	428948,75	391157,69	91,12	5.47Е-05
C33B73	100,00	201493,02	33443,28	4034,64	93,98	9.12Е-05
СЗЗВ125	98,48	258779,13	79728,78	9203,75	78,26	1.54Е-04
СЗЗВ55	96,39	188278,42	59155,10	7625,56	105,39	2.15Е-04
СЗЗВ96	98,75	476040,28	475653,41	187925,80	55,23	2.28Е-04
СЗЗВ124	100,00	798,33	126,37	90,26	172,03	2.38Е-04
СЗЗВ72	96,94	328194,72	105474,59	12506,85	93,32	2.84Е-04
СЗЗВ79	100,00	236644,03	41925,89	4988,81	77,78	3.28Е-04
СЗЗВ77	92,11	241787,16	88691,05	11484,97	69,46	3.37Е-04
СЗЗВ82	96,21	188508,56	41264,92	5033,60	73,44	3.41Е-04
СЗЗВ87	100,00	242185,48	79532,87	12547,05	73,65	3.52Е-04
СЗЗВ80	98,33	5799,64	409,97	114,93	88,88	3.84Е-04
СЗЗВ101	96,91	268805,28	204984,16	35513,63	70,07	3.98Е-04
C33B83	98,07	92956,55	7856,70	1020,48	87,37	4.61Е-04
СЗЗВ46	95,81	509865,97	447627,97	418017,22	134,53	4.67Е-04
СЗЗВ94	98,31	200142,00	93852,22	13274,87	89,59	5.38Е-04

- 123 045935

C33B88	98,36	393148,13	481100,91	274293,53	94,81	8.25Е-04
C33B66	98,71	444680,31	313288,41	56628,04	129,73	8.59Е-04
C33B120	97,63	190036,14	60357,11	7054,28	92,94	1.40Е-03
C33B64	98,13	200158,36	54138,77	7556,04	114,85	1.71Е-03
C33B52	96,76	196557,09	46286,13	6751,01	82,46	3.13E-O3
C33B56	95,59	143,73	79,73	111,95	138,04	4.02Е-03
C33B75	98,68	163795,25	29603,57	4517,81	95,94	4.16Е-03
C33B107	96,90	375388,25	339798,53	161369,64	86,54	4.44Е-03
C33B63	98,79	247758,77	62221,71	9671,48	86,34	4.57Е-03
C33B95	97,77	154556,58	44354,07	6402,00	87,38	5.99Е-03
C33B61	98,87	198777,34	38699,10	5308,45	79,84	6.71Е-03
C33B89	100,00	315,38	119,12	65,61	70,94	8.11Е-ОЗ
C33B122	98,49	259183,69	84281,03	14291,17	65,01	8.74Е-03
C33B62	99,05	157786,36	37359,44	6092,03	75,00	1.00Е-02
C33B123	95,08	224078,95	88155,99	8864,39	71,05	1. ОЗЕ-02
C33B54	100,00	147753,30	27461,06	3766,69	61,26	2.48Е-02
ID белка по а.к.	60 нМ CD33 яванского макака	6 нМ CD33 яванского макака	0,6 нМ CD33 яванского макака	0 нМ CD33 яванского макака	K_D связывания CD33 яванского макака
СЗЗВ48	56491,32	47326,85	43351,12	94,01	1.20Е-04
C33B73	14799,14	6987,92	795,57	72,51	4.08Е-04
СЗЗВ125	15603,45	11526,47	3458,27	70,22	3.51Е-04
СЗЗВ55	16020,78	9994,42	2433,94	69,38	1.16Е-04
СЗЗВ96	37273,19	20087,29	11574,59	86,31	8.19Е-04
СЗЗВ124	593,00	132,19	77,26	98,41	4.77Е-04
СЗЗВ72	19422,07	13975,14	3894,84	90,81	7.63Е-04
СЗЗВ79	15538,97	6427,73	1082,85	63,59	6.82Е-03
СЗЗВ77	17516,20	11665,49	3601,76	85,23	4.18Е-04
СЗЗВ82	14269,38	6622,07	1540,09	84,24	6.70Е-04
СЗЗВ87	19597,18	12652,44	3266,36	103,07	2.28Е-04
СЗЗВ80	4612,58	248,60	108,93	82,38	2.66Е-04
СЗЗВ101	48016,75	46115,96	17989,37	79,69	1.06Е-04
C33B83	5304,40	687,44	159,37	87,35	2.17Е-03
СЗЗВ46	49840,14	49816,36	49729,78	92,05	1.48Е-04

- 124 045935

СЗЗВ94	16126,84	10782,54	3183,70	87,82	5.37Е-04
СЗЗВ88	50388,18	43928,95	43940,23	90,13	3.89Е-04
СЗЗВ66	48905,04	49076,39	42160,22	77,96	9.33Е-05
СЗЗВ120	13211,32	7865,37	2726,18	75,77	8.54Е-04
СЗЗВ64	21109,59	9685,04	3102,56	99,82	1.21Е-03
СЗЗВ52	12582,90	8444,39	2063,44	75,24	1.20Е-03
СЗЗВ56	104,27	85,94	78,56	83,31	8.46Е-04
СЗЗВ75	12194,41	5577,80	1709,40	124,32	1.20Е-03
СЗЗВ107	50325,07	47810,05	36786,69	55,11	1.35Е-04
C33B63	18322,71	11642,38	2879,89	87,94	9.47Е-04
СЗЗВ95	14774,34	9594,12	1637,99	80,81	6.98Е-03
СЗЗВ61	13552,71	8211,09	1595,90	106,84	1.83E-O3
СЗЗВ89	47301,14	34193,78	23334,20	112,80	4.65Е-05
СЗЗВ122	19740,29	13907,32	5838,25	82,53	1.45Е-03
СЗЗВ62	12737,71	5620,17	1922,97	934,44	1.32Е-03
C33B123	10665,93	10404,03	3232,18	61,08	2.74Е-03
СЗЗВ54	50466,68	43011,75	38091,89	28785,80	1.35Е-04

Затем панель мкАт была дополнительно охарактеризована в полном анализе аффинности, а также в эпитоп-специфической сортировке. Связывание мкАт к CD33 с рекомбинантным ВКД CD33 человека с HSA (C33W2) и ВКД CD33 яванского макака с HSA (C33W1) измеряли при помощи ППР ProteOn (BioRad). Козьи антитела к человеческому Fc IgG (Jackson Immunoresearch, кат. № 109-005-098) напрямую иммобилизованы по амино-группе в концентрации 30 мкг/мл в ацетатном буфере, рН 5,0, во всех 6 вертикально ориентированных лигандных каналах на чипе GLC Sensor (Bio-Rad, кат. № 176-5011) при скорости потока 30 мкл/мин в PBS, содержащем 0,005% Tween-20. Значения плотности иммобилизации в среднем составляли около 5000 единиц ответа (RU) с менее чем 5% разбросом между разными каналами. Различные мкАт захватывали на поверхности антитела к человеческому Fc IgG в концентрации 0,25 или 0,5 мкг/мл (160~300 RU) в вертикальной ориентации лиганда, с отсутствием 6-го лигандного канала в качестве контроля поверхности лиганда. Белки CD33 человека и яванского макака с HSA при концентрации 0,3 мкМ в серии 3-кратных разведений из 5 концентраций применяли в качестве аналита для связывания с захваченными мкАт в горизонтальной ориентации. Образец буфера также вводили в 6й канал для контроля диссоциации захваченного мкАт и стабильности базовой линии. Фазу диссоциации для всех концентраций CD33-HSA человека и яванского макака контролировали при скорости потока 100 мкл/мин в течение 15 мин на связывание с С33В782, 60 мин на связывание с С33В912 (идентично С33В904 с hIgG4) с последующей регенерацией с использованием 18-секундного импульса 0,85% фосфорной кислоты для удаления антигена и связанного мкАт.

Необработанные данные о связывании сравнивали с двойным контролем после вычитания данных ответа из 1) сигналов между пятнами для коррекции неспецифических взаимодействий между антигеном и пустой поверхностью чипа; 2) канала буфера для коррекции смещения базовой линии из-за диссоциации со временем захваченного мкАт с поверхности. Обработанные данные для всех концентраций антигена для каждого мкАт в целом соответствовали простой модели связывания Ленгмюра 1:1 для получения кинетических констант (k_on, k_off) и константы аффинности (Kd).

Чтобы определить, связывает ли все мкАт панели с 1 отдельным эпитопом или имеется широкий охват эпитопов, был проведен эксперимент по эпитоп-специфической сортировке. Конкурентную эпитоп-специфическую сортировку мкАт к CD33 выполняли на приборе IBIS SPRi (Carterra) с использованием сенсорного чипа с призменным возбуждением CMD-200 М. Каждое антитело к CD33 напрямую иммобилизовали по амино-группе на чипе в концентрации 10 мкг/мл в ацетатном буфере (рН 4,5) с использованием отдельной Continuous Flow Microspotter (CFM). Затем напечатанный сенсорный чип переносили в инструмент IBIS для анализов сортировки с использованием классического формата или сэндвич формата. Сортировку выполняли последовательной инъекцией ВКД CD33 человека с HSA (C33W2) в концентрации 50 нМ с последующей однократной инъекцией мкАт к CD33 в качестве конкурирующего аналита в растворе при 133 нМ для связывания иммобилизованных мкАт к CD33 с поверхностной регенерацией после каждого последовательного цикла введения антигена и антитела.

Для отслеживания активности иммобилизованных мкАт перед регенерацией и после нее в начале и в конце эксперимента выполняли инъекцию буфера без какого-либо конкурирующего мкАт с целью измерения активности связывания только с антигеном. Реакция связывания конкурирующего мкАт относительно связывания буфера (только антиген) является показателем того, блокирует ли антитело в

- 125 045935 растворе связывание антигена с иммобилизованными мкАт или ограничивает его. Необработанные данные о сортировке (формат файла.trix) были привязаны и установлены на нуль с помощью программного обеспечения SprintX (Wasatch, версия 1.9.3.2), а затем экспортированы (формат файла.ibmx) в программу для сортировки HtTools.exe (Wasatch, версия 2.0.0.33) для анализов. Данные обрабатывали путем удаления антител с ответами на антигены ниже 20 RU и антител, которые не блокировали себя. Ответы конкурирующих мкАт нормализовали относительно связывания только с антигеном. Антитела с нормализованными ответами <0,25 обозначали как блокаторы, антитела с нормализованными ответами >0,25 обозначали как неблокаторы/ сэндвичи. Различные группы были спрогнозированы с использованием отсечения по высоте 2,5 на графике комбинированных дендрограмм.

В приведенной ниже таблице обобщены полный кинетический анализ и эпитоп-специфическая сортировка для 32 выбранных мкАт. Всего имеется 8 мкАт к CD33, которые обладают субнаномолярной аффинностью к CD33 как человека, так и к яванского макака, и эти мкАт соответствуют 3 отдельным группам эпитопов, в то время как большая панель имеет диапазон аффинностей и 7 отдельных групп эпитопов.

Таблица 42

Полный кинетический анализ и эпитоп-специфическая сортировка мкАт, полученных из OMNIRat

ВКД CD33 человека с HSA
Ш белка по а. к.	ID Vобласти	к_а (1/М*с)	ка (1/с)	K_D(M)	Эпитопн ая группа
СЗЗВ48	C33F53	1.62Е+06	1.82Е-05	1.12Е-11	1
СЗЗВ46	C33F51	1.45Е+06	1.99Е-03	1.38Е-09	1
СЗЗВ66	C33F71	3.85Е+04	2.03Е-03	5.29Е-08	1
СЗЗВ107	C33F112	связывание/ отсутс твие соответствия	связывание/ отсутс твие соответствия	связывание/ отсутств ие соответствия	1
СЗЗВ88	C33F93	связывание/ отсутс твие соответствия	связывание/ отсутс твие соответствия	связывание/ отсутств ие соответствия	1
СЗЗВ96	C33F1O1	2.26Е+05	4.36Е-04	1.92Е-09	3
СЗЗВ101	C33F106	1.62Е+05	1.О8Е-ОЗ	6.64Е-09	3
C33B73	C33F78	5.59Е+05	5.59Е-05	1.00Е-10	4
СЗЗВ125	C33F13O	9.92Е+05	1.34Е-04	1,40Е + -10	4
СЗЗВ55	C33F60	9.85Е+05	2.53Е-04	2.60Е-10	4
СЗЗВ82	C33F87	4.45Е+05	2.70Е-04	6.10Е-10	4
C33B83	C33F88	2.70Е+05	5.21Е-04	1.93Е-09	4
СЗЗВ75	C33F8O	3.85Е+05	4.41Е-03	1.14Е-08	4
C33B123	C33F128	1.02Е+06	1.52Е-02	1.48Е-08	4
СЗЗВ52	C33F57	2.06Е+05	3.96Е-03	1.92Е-08	4
СЗЗВ61	C33F66	4.89Е+05	1.05Е-02	2.14Е-08	4
СЗЗВ62	C33F67	5.07Е+05	1.26Е-02	2.49Е-08	4
СЗЗВ64	C33F69	4.33Е+05	2.21Е-03	5.10Е-09	4
C33B63	C33F68	5.33Е+05	3.74Е-03	7.01Е-09	4
СЗЗВ122	C33F127	7.47Е+05	7.12Е-03	9.53Е-09	4
СЗЗВ72	C33F77	8.71Е+05	2.00Е-04	2.30Е-10	5
СЗЗВ79	C33F84	5.15Е+05	3.90Е-04	7.60Е-10	5
СЗЗВ77	C33F82	8.28Е+05	2.62Е-04	3.20Е-10	6
СЗЗВ87	C33F92	7.20Е+05	4.32Е-04	6.00Е-10	6
СЗЗВ94	C33F99	9.22Е+05	5.85Е-04	6.30Е-10	6
СЗЗВ95	C33F1OO	4.82Е+05	7.40Е-03	1.54Е-08	6
СЗЗВ120	C33F125	5.75Е+05	1.68Е-03	2.93Е-09	6
СЗЗВ89	C33F94	низкое связывание	низкое связывание	низкое связывание	8

- 126 045935

СЗЗВ54	C33F59	низкое связывание	низкое связывание	низкое связывание	9
СЗЗВ124	C33F129	3.57Е+05	Е24Е-04	3.50Е-10	НС
СЗЗВ80	C33F85	3.23Е+05	4.25Е-04	1.32Е-09	НС
СЗЗВ56	C33F61	низкое связывание	низкое связывание	низкое связывание	НС
ВКД CD33 яванского макака с HSA
ID белка по а.к.	ID Vобласти	к_а (1/М*с)	k_d(l/c)	K_D(M)	Эпитоп ная группа
СЗЗВ48	C33F53	4.31Е+06	Е58Е-04	3.66Е-11	1
СЗЗВ46	C33F51	2.97Е+06	3.75Е-04	Е26Е-10	1
СЗЗВ66	C33F71	1.22Е+06	2.66Е-04	2.17Е-10	1
СЗЗВ107	C33F112	3.31Е+05	7.01Е-05	2.12Е-10	1
СЗЗВ88	C33F93	связывание/ отсутс твие соответствия	связывание/ отсутс твие соответствия	связывание/ отсутств ие соответствия	1
СЗЗВ96	C33F1O1	связывание/ отсутс твие соответствия	связывание/ отсутс твие соответствия	связывание/ отсутств ие соответствия	3
СЗЗВ101	C33F106	2.25Е+05	2.69Е-04	1.20Е-09	3
C33B73	C33F78	6.00Е+05	5.08Е-04	8.46Е-10	4
СЗЗВ125	C33F13O	1.12Е+06	3.39Е-04	3.04Е-10	4
СЗЗВ55	C33F60	1.16Е+06	8.37Е-05	7.23Е-11	4
СЗЗВ82	C33F87	5.45Е+05	7.51Е-04	1.38Е-09	4
C33B83	C33F88	2.47Е+05	2.88Е-03	1.17Е-08	4
СЗЗВ75	C33F8O	6.16Е+05	1.32Е-03	2.15Е-09	4
C33B123	C33F128	1.26Е+06	3.39Е-03	2.69Е-09	4
СЗЗВ52	C33F57	ЗДЗЕ+05	Е48Е-03	4.74Е-09	4
СЗЗВ61	C33F66	7.34Е+05	1,62Е - 03	2.21Е-09	4
СЗЗВ62	C33F67	8.05Е+05	1.49Е-03	1.85Е-09	4
СЗЗВ64	C33F69	5.90Е+05	Е01Е-03	Е71Е-09	4
C33B63	C33F68	7.23Е+05	8.80Е-04	1.22Е-09	4
СЗЗВ122	C33F127	связывание/ отсутс твие соответствия	связывание/ отсутс твие соответствия	связывание/ отсутств ие соответствия	4
СЗЗВ72	C33F77	9.19Е+05	5.40Е-04	5.87Е-10	5
СЗЗВ79	C33F84	5.48Е+05	2.20Е-03	4.01Е-09	5
СЗЗВ77	C33F82	1.08Е+06	2.66Е-04	2.47Е-10	6
СЗЗВ87	C33F92	1.12Е+06	2.64Е-04	2.36Е-10	6
СЗЗВ94	C33F99	1.10Е+06	5.20Е-04	4.73Е-10	6
СЗЗВ95	C33F1OO	8.44Е+05	8.06Е-03	9.56Е-09	6
СЗЗВ120	C33F125	8.76Е+05	9.02Е-04	Е03Е-09	6
СЗЗВ89	C33F94	2.65Е+05	2.01Е-04	7.60Е-10	8
СЗЗВ54	C33F59	1.32Е+06	6.37Е-04	4.84Е-10	9
СЗЗВ124	C33F129	4.67Е+05	4.72Е-04	Е01Е-09	НС
СЗЗВ80	C33F85	4.92Е+05	2.59Е-04	5.27Е-10	НС
СЗЗВ56	C33F61	низкое связывание	низкое связывание	низкое связывание	НС

Панель OmniMouse (всего 8 мкАт) создавали отдельно и дополнительно характеризовали на связывание с клетками. Связывание с клетками проводили, как описано выше, и оно обобщено в таблице ниже. Из 8 протестированных мкАт 6 напрямую связывались с CD33-экспрессирующими клетками, тогда как 2 мкАт не связывались.

- 127 045935

Таблица 43

Клеточное связывание полученных из OMNIMouse мкАт с линиями экспрессирующих клеток человека и яванского макака

	Исходное	CD33 человека
мкАт	60 нМ	6нМ	0,6 нМ	ОнМ	60 нМ	6нМ	0,6 нМ	ОнМ
СЗЗВ9 09	253,50	206,04	169,77	119,51	176,49	170,25	154,00	191,28
СЗЗВ9 10	193,52	176,14	108,46	190,17	213,55	183,33	151,25	155,29
СЗЗВ9 11	1466,02	389,41	186,22	113,30	237954,27	100333,48	13501,02	114,07
СЗЗВ9 12	977,91	273,07	140,62	124,53	237140,86	101295,70	15726,96	149,54
СЗЗВ9 13	174,49	118,08	123,26	129,07	518952,00	409071,06	204694,14	127,82
СЗЗВ9 14	181,37	142,74	139,10	113,48	304350,88	315129,56	153252,58	185,45
СЗЗВ9 15	101,28	147,65	143,51	100,00	390477,25	362902,66	138398,56	112,22
СЗЗВ9 16	416,08	145,16	115,70	91,75	447815,47	404033,19	192941,55	167,07
	CD33 яванского макака
мкАт	60 нМ	6 нМ	0,6 нМ	ОнМ
СЗЗВ909	180,33	135,33	115,73	124,03
СЗЗВ910	202,42	135,18	116,71	175,97
СЗЗВ911	17036,56	7729,14	1935,16	97,94
СЗЗВ912	15070,88	7271,38	1726,03	124,69
C33B913	40661,90	36920,95	35224,10	106,19
СЗЗВ914	44964,85	33368,26	22086,01	86,76
СЗЗВ915	37495,34	35692,21	36165,59	113,92
СЗЗВ916	41004,43	33294,78	22790,61	104,43

мкАт, связывающихся с CD33 на клетках, дополнительно характеризовали биофизическими методами полного кинетического анализа с рекомбинантным антигеном с применением способов, описанных выше и приведенных в таблице ниже. Из 6 протестированных мкАт 1 связывалось с CD33 человека с пикомолярной аффинностью (С33В912) и субмолярной аффинностью с CD33 яванского макака, тогда как 1 обладало очень высокой аффинностью к CD33 человека, но только наномолярной аффинностью к CD33 яванского макака (С33В911). Еще два клона были субнаномолярными в отношении CD33 как человека, так и яванского макака (С33В913 и С33В916), но ни один из них не находился в диапазоне С33В912.

Таблица 44

Полный кинетический анализ полученных из OMNIMouse мкАт

	ВКД CD33 человека с HSA	ВКД CD33 яванского макака с HSA
мкАт	к_а (1/М*с)	k_d (1/с)	K_D(M)	к_а (1/М*с)	k_d (1/с)	K_D(M)
СЗЗВ911	1.10Е+06	4.14Е-05	3.78Е-11	1.15Е+06	1.15Е-03	1.00Е-09
СЗЗВ912	1.42Е+06	4.29Е-05	3.02Е-11	1.50Е+06	6.50Е-04	4.33Е-10
C33B913	6.60Е+05	6.40Е-04	9.69Е-10	2.56Е+06	3.08Е-04	1.20Е-10
СЗЗВ914	4.44Е+05	9.80Е-03	2.21Е-08	5.29Е+05	2.33Е-04	4.40Е-10
СЗЗВ915	2.18Е+05	9.89Е-04	4.53Е-09	3.81Е+06	8.93Е-05	2.34Е-11
СЗЗВ916	6.27Е+05	4.11Е-04	6.55Е-10	4.73Е+05	4.03Е-04	8.52Е-10

Эксперимент по эпитоп-специфической сортировке проводили на 6 связывающихся с клетками мкАт, полученных из OMNIMouse, а также на нескольких контрольных мкАт, ранее идентифицированных в предшествующей кампании OMNIRat. Контрольные мкАт выбирали на основе их субнаномолярной аффинности к человеческому CD33 и количества отдельных групп эпитопов.

- 128 045935

Программное обеспечение HtTools для сортировки назначает номера групп эпитопов в каждом эксперименте, и поэтому наличие нескольких контролей для уже определенных групп эпитопов играло решающую роль в перекрестном сравнении. Оба полученных из OMNIMouse клона с высокой аффинностью к CD33 человека (С33В911 и С33В912) были отсортированы с клонами из вышеуказанной группы 4 (группа 4 в данном эксперименте), а субнаномолярный клон (С33В916) был отсортирован в 2 в данном случае вместе с С33В836 (группа 1 в вышеуказанном эксперименте).

Таблица 45

Группы эпитопов OMNIMouse мкАт к CD33

мкАт	ID V-области	Эпитопная группа
СЗЗВ915	C33F553	1
СЗЗВ916	C33F554	2
C33B836	C33F53	2
СЗЗВ914	C33F552	2
C33B913	C33F551	3
СЗЗВ806	C33F106	3
СЗЗВ911	C33F549	4
СЗЗВ912	C33F550	4
СЗЗВ778	C33F78	4
C33B83O	C33F13O	4
СЗЗВ782	C33F82	5
СЗЗВ792	C33F92	5
СЗЗВ799	C33F99	5
СЗЗВ760	C33F60	6
СЗЗВ777	C33F77	7

CD33 состоит из 2 доменов IgG, дистального по отношению к мембране V-домена и проксимального по отношению к мембране С2-домена. SNP rs12459419 могут вызывать селективный альтернативный сплайсинг транскрипта пре-мРНК CD33 для получения только С2-формы, экспрессируемой на клетках, и поэтому нацеливание на этот домен может обеспечить благоприятный клинический эффект.для подтверждения того, какой из двух доменов мкАт был способен связываться, проводили скрининг скорости диссоциации согласно вышеописанному протоколу для 6 мкАт с самой высокой способностью связывания, которая охватывала 4 различных группы эпитопов, используя в качестве связывающих антигенов ВКД CD33 человека с HSA, V-домен CD33 человека с HSA, и С2-домен CD33 человека с HSA. Как показано в таблице ниже, оба клона были ранее сгруппированы в группу 4, которые связывались с доменом С2 huCD33, но не с V-доменом huCD33, тогда как клоны в группе 2 и 3 связывались с V-доменом, но не с С2-доменом. Два клона, сгруппированных в группу 5, не связывались ни с одним из доменов, и, следовательно, их точное положение связывания может охватывать два домена. В этот эксперимент включали три (3) доступных в продаже мкАт ((WM53 (EMD Millipore; г. Дармштадт, Германия), Р67.7 (Biolegend, г. Сан-Диего, штат Калифорния, США) и клон LSBio 906 (LifeSpan Biosciences, г. Сатт, штат Вашингтон, США))), и все они продемонстрировали связывание с V-доменом, но не с С2-доменом. Из данных о группах эпитопов в табл. 37 и 40 по отношению к данным о связывании С2-домена в табл. 46 всего имеется 15 мкАт, которые могут потенциально связываться с С2-доменом в диапазоне аффинности от ~25 нМ до ~30 пМ на человеческом полноразмерном белке.

Таблица 46

Константы диссоциации для связывания доменов

	ВКД huCD33 с HSA	V-домен huCD33 с HSA	С2-домен huCD33 c HSA	Эпитопная группа
Ш белка	k_d(l/c)	k_d (1/c)	kd (1/c)

- 129 045935

СЗЗВ912	1.29Е-05	Ответ отсутствует/ответ с низким уровнем связывания	6.68Е-05	4
СЗЗВ778	4.72Е-05	Ответ отсутствует/ответ с низким уровнем связывания	2.57Е-03	4
СЗЗВ782	2.58Е-04	Ответ отсутствует/ответ с низким уровнем связывания	Ответ отсутствует/ответ с низким уровнем связывания	5
СЗЗВ792	4.27Е-04	Ответ отсутствует/ответ с низким уровнем связывания	Ответ отсутствует/ответ с низким уровнем связывания	5
C33B836	5.52Е-05	3.71Е-05	Ответ отсутствует/ответ с низким уровнем связывания	2
СЗЗВ8О6	1.36Е-03	3.18E-O3	Ответ отсутствует/ответ с низким уровнем связывания	3
WM53	2.37Е-03	3.78Е-02	Ответ отсутствует/ответ с низким уровнем связывания
Р67.7	1.О5Е-ОЗ	2.43Е-03	Ответ отсутствует/ответ с низким уровнем связывания
Клон LSBio 906	2.45Е-03	4.34Е-02	Ответ отсутствует/ответ с низким уровнем связывания

Для дополнительного подтверждения исследований in vivo и in vitro выбранные клоны (С33В836, С33В782, С33В778, С33В904, С33В806, С33В830, С33В937, С33В792, С33В760 и С33В777) были выбраны для масштабирования и обмена Fab-плечами, чтобы получить биспецифические молекулы с антителами к CD3. Клетки ExpiCHO-S™ (ThermoFisher Scientific) высевали с плотностью 1,25x105-2,25x105 жизнеспособных клеток/мл в среду для экспрессии ExpiCHO™ и культивировали в поликарбонатных, одноразовых, стерильных, вентилируемых, встряхиваемых колбах Эрленмейера без дефлекторов в шейкере-инкубаторе при 37°С, 7% CO₂(INFORS HT Multitron Pro). Для стандартного роста клеток во встряхиваемых колбах объемом 125 мл-2 л, скорость встряхивания устанавливали на 130 об/мин для шейкеров с диаметром встряхивания 19 мм. Клетки пересевали, когда плотность достигала логарифмической фазы роста при 4x106-6x106 жизнеспособных клеток/мл с 98-99% жизнеспособности.

За два дня до трансфекции клетки ExpiCHO-S™ высевали в концентрации 1,5x106 жизнеспособных клеток/мл для получения требуемого объема культуры. В день трансфекции определяли плотность жизнеспособных клеток и процент жизнеспособности. Клетки трансфицировали с плотностью 6x10⁶жизнеспособных клеток/мл. Для оптимальной трансфекции использовали стерильную плазмидную ДНК тяжелой и легкой цепей в концентрации >1 мг/мл в буфере ТЕ (10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТК, рН 8,0).

Клетки ExpiCHO-S™ трансфицировали в соответствии с протоколом производителя Max Titer Transfection (публикация ThermoFisher № MAN0014337). Все количества и объемы, указанные ниже, указаны в миллилитрах конечного объема трансфицированной культуры. Вкратце плазмидную ДНК разводили 0,04 мл холодной среды OptiPRO™ (ThermoFisher Scientific) в следующем соотношении: 0,125 мкг ДНК тяжелой цепи: 0,375 мкг ДНК легкой цепи: 0,5 мкг pAdvantage. 6,4 мкл реагента для трансфекции ExpiFectamine™ CHO разбавляли и осторожно перемешивали с 0,04 мл холодной среды OptiPRO и инкубировали в течение 1 мин. Разбавленный реагент ExpiFectamine™ CHO добавляли к разбавленной ДНК, осторожно перемешивали, а комплексы ExpiFectamine™ СНО/плазмидная ДНК инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. После инкубации комплексы добавляли к клеткам ExpiCHO-S™ в шейкерной колбе и инкубировали в течение ночи в шейкере-инкубаторе при 37°С, 7% СО₂.

- 130 045935

Что касается протокола Max Titer, то в 1 день после трансфекции добавляли 6 мкл реагента ExpiFectamine™ CHO и 160 мкл питательного раствора ExpiCHO™, после чего колбу переносили в шейкер-инкубатор при 32°С в атмосфере 7% СО₂. На 5 день после трансфекции в колбу снова добавляли 160 мкл питательного раствора ExpiCHO™ и возвращали в инкубатор с температурой 32°С при встряхивании. Культуру собирали на 12 день после трансфекции, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 мин и очищали с помощью фильтрующей капсулы с размером пор 0,2 мкМ Acropak 1500 (Pall).

Экспрессированные антитела очищали из осветленных супернатантов с помощью MabSelect SuRe (GE Healthcare). Колонки MabSelect SuRe Protein А уравновешивали 1x D-PBS, pH 7,2, перед загрузкой отдельных супернатантов культуры. Несвязанные белки удаляли интенсивной промывкой 1x D-PBS, рН 7,2. Связанные белки элюировали 0,1 М Na-ацетатом, рН 3,5. Фракции пика нейтрализовали 2,5 М Tris рН 7,2 и объединяли. Пулы нейтрализованных фракций или диализовали в 1x dPBS для анализов и биофизических характеристик, или использовали для сборки биспецифического антитела.

Концентрацию белка в каждом пуле элюирования определяли путем измерения поглощения при 280 нМ и рассчитывали с использованием коэффициента экстинкции на основе аминокислотной последовательности.

6. Получение и функциональная оценка биспецифических антител к CD33xCD3.

6.1. Обмен Fab-плечами с использованием очищенных исходных мкАт.

Для получения биспецифических антител к CD33xCD3 требуются два исходных мкАт, одно специфическое к нацеливающему плечу (например, CD33), а другое - специфическое к эффекторному плечу (например, CD3). мкАт к CD33 рекомбинировали с высокоаффинным (CD3B376: VH с SEQ ID NO: 652, и VL с SeQ ID NO: 661) или низкоаффинным плечами к CD3 (CD3B450: VH с SEQ ID NO: 657, и VL с SEQ ID NO: 678). Эти исходные мкАт (плечи к CD33 и CD3) находятся в формате IgG4 PAA (Labrijn et al., 2013), где нацеливающее исходное мкАт (CD33) содержит мутацию Genmab 409R (нативная аминокислота для IgG4), уничтожающее исходное мкАт (CD3) содержит мутацию F405L и R409K. Одно из моноспецифических антител к CD3 экспрессировали в виде IgG4, имеющего в Fc замены S228P, F234A, L235A, F405L и R409K (плечо к CD3) (нумерация согласно индексу EU) в Fc-областях. Моноспецифические антитела экспрессировали и очищали так, как описано выше. После очистки исходные антитела к CD33 смешивали с желаемым исходным антителом к CD3 в восстанавливающих условиях в 75 мМ 2-МЕА (2-меркаптоэтиламина) и инкубировали при 31°С в течение 5 ч или при комнатной температуре в течение ночи. Реакции рекомбинации были основаны на молярных соотношениях, в которых установленное количество антитела к CD33 (например, 10 мг или ~74,6 наномоль) объединяли с антителом к CD3 (например,~67,8 наномоль), причем антитело к CD33 добавляли при 6% избытке антитела к CD3. Концентрации маточных растворов антител к CD33 варьировались от 0,8 до 6 мг/мл, а объемы реакционный смеси для рекомбинации изменялись для каждого спаривания. Затем реакционные смеси для рекомбинации диализовали в течение ночи против PBS для удаления восстановителя. Реакции с биспецифическим антителом к CD33xCD3 выполняли с избытком антитела к CD33 (соотношение) для сведения к минимуму количества непрореагировавшего исходного антитела к CD3, оставшегося после рекомбинации.

Полученные конечные биспецифические антитела к CD3xCD3 вместе с исходными мкАт (т.е. CD33, CD3 или Null (нуль)), используемыми в реакциях рекомбинации, перечислены в табл. 37.

Отобранные подходящие антитела к CD33 также объединяли с неуничтожающим плечом (Null) для получения отрицательных контролей в целях тестирования. Для контрольных биспецифических антител В2М1 создавали, очищали антитело к RSV в формате IgG4 PAA и в комбинации с плечами к CD3 CD3B219 или CD3B376-F405L, R409K для получения CD3B288 (CD3xNull) и CD3B510 (CD3B376xNull) соответственно; Плечи к CD33 комбинировали с В23В49 для получения CD33xNull, как показано в табл. 47.

Таблица 47

Биспецифические антитела к CD33xCD3

Биспецифическо е антитело	Исходное	Ш пепт. НС	Пепт. VH, SEQ ГО NO	ГО пепт. LC	Пепт. VL, SEQ ID NO
СЗСВ7	C33B836	СЗЗН8О	267	C33L73	306
CD3B219	CD3H141	247	CD3L66	287

- 131 045935

C3CB5	C33B83O	СЗЗН84	269	C33L66	308
CD3B219	CD3H141	247	CD3L66	287
C3CB4	СЗЗВ806	СЗЗН69	260	C4LL152	300
CD3B219	CD3H141	247	CD3L66	287
C3CB16	СЗЗВ799	СЗЗН98	275	C33L69	314
CD3B219	CD3H141	247	CD3L66	287
C3CB14	СЗЗВ792	СЗЗН87	270	C33L35	309
CD3B219	CD3H141	247	CD3L66	287
C3CB12	СЗЗВ782	СЗЗН72	262	C33L40	301
CD3B219	CD3H141	247	CD3L66	287
СЗСВП	СЗЗВ778	СЗЗН66	258	C33L60	298
CD3B219	CD3H141	247	CD3L66	287
СЗСВ10	СЗЗВ777	СЗЗН65	257	C33L47	297
CD3B219	CD3H141	247	CD3L66	287
СЗСВ8	СЗЗВ760	СЗЗН45	250	C33L11	290
CD3B219	CD3H141	247	CD3L66	287
СЗСВ97	C33B836	СЗЗН8О	267	C33L73	306
CD3B376	CD3H219	652	CD3L150	661
СЗСВ98	C33B83O	СЗЗН84	269	C33L66	287
CD3B376	CD3H219	652	CD3L150	661
СЗСВ99	СЗЗВ806	СЗЗН69	260	C4LL152	300
CD3B376	CD3H219	652	CD3L150	661
СЗСВ100	СЗЗВ799	СЗЗН98	275	C33L69	314
CD3B376	CD3H219	652	CD3L150	661
СЗСВ101	СЗЗВ792	СЗЗН87	270	C33L35	309
CD3B376	CD3H219	652	CD3L150	661
СЗСВ102	СЗЗВ782	СЗЗН72	262	C33L40	301
CD3B376	CD3H219	652	CD3L150	661
C3CB103	СЗЗВ778	СЗЗН66	258	C33L60	298
CD3B376	CD3H219	652	CD3L150	661
СЗСВ104	СЗЗВ777	СЗЗН65	257	C33L47	297
CD3B376	CD3H219	652	CD3L150	661
СЗСВ105	СЗЗВ760	СЗЗН45	250	C33L11	290
CD3B376	CD3H219	652	CD3L150	661
СЗЗВ941	C33B836	СЗЗН8О	267	C33L73	306

- 132 045935

	В23В49	В23Н1	246	B23L3	286
СЗЗВ942	C33B83O	СЗЗН84	269	C33L66	308
В23В49	В23Н1	246	B23L3	286
C33B943	СЗЗВ806	СЗЗН69	260	C4LL152	300
В23В49	В23Н1	246	B23L3	286
СЗЗВ944	СЗЗВ799	СЗЗН98	275	C33L69	314
В23В49	В23Н1	246	B23L3	286
СЗЗВ945	СЗЗВ792	СЗЗН87	270	C33L35	309
В23В49	В23Н1	246	B23L3	286
СЗЗВ946	СЗЗВ782	СЗЗН72	262	C33L40	301
В23В49	В23Н1	246	B23L3	286
СЗЗВ947	СЗЗВ778	СЗЗН66	258	C33L60	298
В23В49	В23Н1	246	B23L3	286
СЗЗВ948	СЗЗВ777	СЗЗН65	256	C33L47	297
В23В49	В23Н1	246	B23L3	286
СЗЗВ949	СЗЗВ760	СЗЗН45	250	C33L11	290
В23В49	В23Н1	246	B23L3	286
CD3B288	В23В39	В23Н1	246	B23L3	286
CD3B219	CD3H141	247	CD3L66	287
CD3B510	В23В39	В23Н1	246	B23L3	286
CD3B376	CD3H219	652	CD3L150	661
СЗСВ87	СЗЗВ9ОЗ	СЗЗН251	280	C33L117	319
CD3B219	CD3H141	247	CD3L66	287
СЗСВ88	СЗЗВ904	СЗЗН252	281	C33L118	320
CD3B219	CD3H141	247	CD3L66	287
СЗСВ89	СЗЗВ905	C33H253	282	C33L119	321
CD3B219	CD3H141	247	CD3L66	287
СЗСВ90	СЗЗВ907	СЗЗН255	284	C33L121	323
CD3B219	CD3H141	247	CD3L66	287
СЗСВ91	СЗЗВ908	СЗЗН256	285	C33L122	324
CD3B219	CD3H141	247	CD3L66	287
СЗСВ189	СЗЗВ904	СЗЗН252	281	C33L118	320
CD3B376	CD3H219	652	CD3L150	661

Пепт.: пептид.

Нукл.: нуклеотид.

SEQ ID: SEQ ID NO.

6.2. Опосредованное CD33xCD3 снижение ex vivo бластов ОМЛ и активации Т-клеток в первичном образце ОМЛ.

Для дальнейшей оценки потенциала цитотоксичности биспецифических антител к CD33xCD3 был проведен анализ цитотоксичности ex vivo с использованием цельной крови пациента с ОМЛ с использованием четырех лучших антител (фиг. 61). В этом анализе различные биспецифические антитела (антитела к CD33, объединенные с плечами к CD3 CD3B219 и CD3B376) были добавлены к разведенной цельной крови пациентов с ОМЛ на период в 48 ч без добавления дополнительных Т-клеток, поскольку этот анализ основан на присутствии аутологичных Т-клеток в крови пациента, через 48 ч образцы окрашивали CD3 PerCPCy5.5, CD25 РЕ, Cd33 FITC и CD38 АРС (все антитела были приобретены у Biolegend; г. Сан-Диего, штат Калифорния). Затем образцы промывали по меньшей мере 3 раза в 1х буфере для лизиса эритроцитов Lyse RBC Lysis Buffer (eBioscience). Затем образцы окрашивали буфером для окрашивания мертвых клеток LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain (Life Technologies). Степень противоопухолевой цитотоксичности определяли путем первоначального количественного определения живых CD33+ клеток в доле раковых клеток пациента с ОМЛ (определяемых как CD3^-CD38⁺ клетки) в присутствии биспецифических антител. Цитотоксичность рассчитывали в процентах по отношению к PBS/необработанному контролю с использованием

- 133 045935 следующего уравнения: (% CD33+ в PBS/необработанный контроль-% CD33+ в обработанном образце)/(% CD33+ в PBS/необработанный контроль). Активацию Т-клеток рассчитывали как процентную долю CD25+ событий в CD3+ фракции.

Как показано на фиг. 61, все антитела-лидеры к CD33, объединенные с любым из плеч к CD3 (CD3B376 и CD3B219), способствовали дозозависимому снижению общей цитотоксичности, которое коррелировало с активацией Т-клеток через 48 ч. Контрольные антитела с нулевом плечом (NullxCD3B219 и nullxCD3B376) не продемонстрировали цитотоксичность в отношении опухолевых клеток или активацию Т-клеток. Этот результат также продемонстрировал, что биспецифические антитела CD33xCD3 действуют в аутологичных условиях. Эти результаты отражают данные для 4 других образцов доноров с ОМЛ (данные не показаны). В табл. 48 приводится краткая информация по значениям ЕС₅₀, полученным с помощью мультиспецифических антител к CD33xCD3. Как видно из значений ЕС₅₀, C33B904, объединенное с любым из плечей к CD3 (С3СВ88, С3СВ189), а также С33В836, объединенное с любым из плечей CD3 (С3СВ7, С3СВ97), были наиболее мощными и эффективными антителами. Таким образом, эти 4 антитела были предметом дальнейших исследований.

Таблица 48

Анализы опосредованной CD33xCD3 Т-клетками цитотоксичности ех vivo.

Сводка значений ЕС5₀ для 8 биспецифических антител к CD33xCD3

Ш биспецифического Ат	ЕС50 уничтожения первичных клеток ОМЛ (нМ)
СЗСВП	3,958
СЗСВ12	2,635
СЗСВ7	0,3315
СЗСВ88	0,6722
СЗСВ1ОЗ	4,186
СЗСВ102	4,973
СЗСВ97	0,2316
СЗСВ189	0,5782

6.3. Демонстрация того, что биспецифические антитела к CD33xCD3 связываются с С2-доменами CD33 и индуцируют цитотоксичность в отношении линий клеток, экспрессирующих однонуклеотидный полиморфизм (SNP) CD33.

Анализы опосредованной Т-клетками цитотоксичности in vitro с использованием биспецифических антител к CD33xCD3.

Последние исследования продемонстрировали, что в ~50% популяции с ОМЛ присутствовал однонуклеотидный полиморфизм (SNP) rs12459419, что приводило к пропуску экзона 2 CD33, в результате которого возникала делеция V-домена CD33. Это исследование также продемонстрировало, что Mylotarg, который связывается с V-доменом CD33, не эффективен у пациентов, экспрессирующих SNP, и, следовательно, снижает риск рецидива и улучшает выживаемость примерно у 50% популяции с ОМЛ (Lamba et al., 2017, JCO, CD33 Spliting Polymorphism Determines Gemtuzumab Ozogamicin Response in De Novo Acute Myeloid Leukemia: Report From Randomized Phase III Children's Oncology Group Trial AAML0531). Принимая во внимание данные о Mylotarg в вышеупомянутом исследовании, были проведены анализы опосредованной Т-клетками цитотоксичности in vitro, чтобы оценить, опосредуют ли отобранные антитела к CD33 (V-домен-связывающий С33В836 и С2-домен-связывающий С33В904) с плечами к CD3 (CD3B219 или CD3B376) уничтожение линий клеток, экспрессирующих SNP rs12459419. Вкратце эффекторные клетки (пан Т-клетки, приобретенные у компании Biological Speciality) собирали, подсчитывали, промывали и ресуспендировали в концентрации 1x10⁶ клеток/мл в RPMI (Invitrogen) с добавлением 10% FBS (Invitrogen) для культуральных сред. Клетки-мишени (KG1, SH2 и OCIAML3) метили CFSE (Invitrogen) и ресуспендировали в концентрации 2x105 клеток/мл в RPMI с 10% FBS. KG1, SH2 и OCIAML3 выбирали таким образом, чтобы они представляли собой дикий тип, гетерозиготный и гомозиготный по мутации CD33 SNP rs12459419 соответственно. Эффекторные клетки и меченные CFSE клетки-мишени смешивали в соотношении эффектор: мишень (Е:Т)=5:1 в стерильных 96-луночных круглодонных планшетах. В каждую лунку добавляли 10 мкл Fc Block (Fc-фрагмент РеоПро) вместе с аликвотой биспецифического антитела объемом 5 мкл в различных концентрациях. Культуры инкубировали при 37°С в течение 48 ч в атмосфере с 5% СО₂. через 48 ч к образцам добавляли окрашивающий буфер для окрашивания мертвых клеток LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain (1Life Technologies), культуры инкубировали 20 мин в темноте при комнатной температуре, промывали и ресуспендировали в 100-200 мкл буфера для FACS. Вызванную препаратом цитотоксичность определяли, используя проточный цитометр CANTO II (BD Biosciences), и анализировали, используя программное обеспечение FlowJo или Dive (BD Biosciences). Интерес представляет популяция дважды позитивных клеток CFSE+/живые/мертвые+. Как показано на фиг. 63, в отличие от контролей с нулевым

- 134 045935 плечом (nullxCD3B219 и nullxCD3B376), V-домен-связывающие и С2-домен-связывающие CD33xCD3 мультиспецифические антитела индуцировали клеточную цитотоксичность с перенаправлением Т-клеток для CD33+ ДТ для линии клеток KG1 с мутацией SNP rs12459419 через 48 ч. Напротив, в отличие от V-домен-связывающего С33В836 (С3СВ97, С3СВ7), только С2-домен-связывающие спаренные биспецифические антитела С33В904 (С3СВ189, С3СВ88) опосредовали цитотоксичность в отношении линий клеток SH2 и OCIAML3, которые были гетерозиготными или гомозиготными по мутациям rs12459419 SNP соответственно. По этой причине для дальнейшего анализа и определения характеристик использовали спаренные биспецифические антитела С33В904 (С3СВ189, С3СВ88). В совокупности эти данные демонстрируют, что биспецифические антитела, связывающие С2-домен CD33, такие как спаренные биспецифические антитела С33В904, обладают потенциалом к демонстрации эффективности в более широкой группе пациентов с ОМЛ, чем конкурентные связывающие V-домен антитела к CD33.

6.4. Ex vivo CD33x CD3-опосредованное снижение введенных MOLM-13 и моноцитов в анализе цитотоксичности в отношении MOLM-13 в цельной крови ex vivo.

Для оценки потенциала цитотоксичности биспецифических антител к CD33xCD3 при устранении введенных клеток MOLM-13 и нормальных человеческих моноцитов был использован анализ цитотоксичности ex vivo с использованием нормальной цельной крови здорового человека с экзогенно добавленными MOLM-13 линии CD33+ клеток ОМЛ. Подобно описанному выше эксперименту, различные биспецифические антитела (антитела к CD33, объединенные с плечами к CD3 CD3B219 и CD3B376) были добавлены к разведенной цельной крови от 6 различных здоровых доноров-людей на период 48 ч без добавления дополнительных Т-клеток, поскольку этот анализ основан на присутствии аутологичных Т-клеток в крови донора. Перед разведением определяли содержание Т-клеток в крови каждого донора. Затем кровь разводили меченными CFSE (Invitrogen) клетками MOLM-13 таким образом, чтобы соотношение эффектор: мишень (Е:Т) составляло 1:5, чтобы имитировать соотношение эффектор: мишень в образцах, полученных от пациентов с ОМЛ. через 48 ч образцы окрашивали CD3 PerCPCy5.5, CD25 РЕ, CD33 FITC и CD14 Pacific Blue (все антитела были приобретены у Biolegend). Затем образцы промывали по меньшей мере 3 раза в 1х буфере для лизиса эритроцитов Lyse RBC Lysis Buffer (eBioscience). Затем образцы окрашивали буфером для окрашивания мертвых клеток LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain (Life Technologies). Степень противоопухолевой цитотоксичности определяли путем первого количественного определения живых CD33+ клеток во фракции CD14+ моноцитов в присутствии биспецифических антител. Цитотоксичность в отношении клеток MOLM-13 определяли путем подсчета процентного содержания мертвых CFSE+ клеток. Цитотоксичность моноцитов рассчитывали в процентах по отношению к PBS/необработанному контролю с использованием следующего уравнения: (% CD33+ CD14+ в PBS/необработанный контроль-% CD33+ CD14+ в обработанном образце)/(% CD33+ CD14+ в PBS/необработанный контроль). Данные на фиг. 63 демонстрируют, что оба биспецифических антитела к CD33xCD3 (одно и то же лидерное С33В904 к CD33, спаренное с любым плечом к CD3, CD3B376 и CD3B219) специфически индуцируют цитотоксичность в отношении клеток MOLM-13 и CD33+ моноцитов через 48 ч. В качестве отрицательных контролей биспецифических антител использовали контрольные антитела с нулевым плечом. Контроль с нулевым плечом продемонстрировал незначительную цитотоксическую активность в отношении MOLM-13 и CD33+ моноцитов или ее отсутствие. Эти данные демонстрируют средние значения для 6 разных здоровых доноров. Средние значения ЕС₅₀ для цитотоксичности в отношении MOLM-13 и CD14+ моноцитов приведены в табл. 49.

Таблица 49

Анализы опосредованной CD33xCD3 Т-клетками цитотоксичности ех vivo. Сводка значений ЕС₅₀ для 2 биспецифических антител к CD33xCD3

ID биспецифического антитела	ЕС50 уничтожения MOLM13 (нМ)	ЕС50 уничтожения CD33⁺CD14⁺ (нМ)
СЗСВ189	0,1677	1,156
СЗСВ88	0,671	0,506

6.5. Демонстрация видовой перекрестной реактивности биспецифических антител к CD33xCD3 в отношении яванского макака.

Опосредованное CD33xCD3 снижение ex vivo моноцитов в анализе цитотоксичности ex vivo с использованием цельной крови яванского макака.

Для демонстрации функциональной перекрестной реактивности и оценки цитотоксического потенциала биспецифических антител к CD33xCD3 при уничтожении нормальных моноцитов яванского макака использовали анализ цитотоксичности ex vivo с использованием цельной крови здорового яванского макака. Подобно описанному выше эксперименту, различные биспецифические антитела (антитела к CD33, объединенные с плечами к CD3 CD3B219 и CD3B376) были добавлены к разведенной цельной крови от 6 различных здоровых доноров-яванских макак на период 48 ч без добавления

- 135 045935 дополнительных Т-клеток, поскольку этот анализ основан на присутствии аутологичных Т-клеток в крови донора, через 48 ч образцы окрашивали CD3 PerCPCy5.5, CD25 РЕ, CD33 FITC и CD14 Pacific Blue (все антитела были приобретены у Biolegend, за исключением антитела к CD33, которое было приобретено у Miltenyi; Бергиш-Гладбах, Германия). Затем образцы промывали по меньшей мере 3 раза в 1х буфере для лизиса Lyse RBC Lysis Buffer (eBioscience) перед окрашиванием буфером для окрашивания мертвых клеток LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain (Life Technologies). Степень цитотоксичности в отношении моноцитов определяли путем первого количественного определения живых CD33+ клеток во фракции CD14+ моноцитов в присутствии биспецифических антител. Цитотоксичность рассчитывали в процентах по отношению к PBS/необработанному контролю с использованием следующего уравнения: (% CD33+ CD14+ в PBS/необработанный контроль-% CD33+ CD14+ в обработанном образце)/(% CD33+ CD14+ в PBS/необработанный контроль). Активацию Т-клеток рассчитывали как процентную долю CD25+ событий в CD3+ фракции. Данные на фиг. 64 демонстрируют, что оба биспецифических антитела к CD33xCD3 (одно и то же лидерное С33В904 к CD33, объединенное с плечом к CD3, CD3B376 или CD3B219) специфически индуцируют клеточную цитотоксичность в отношении CD33+ моноцитов, а также активацию Т-клеток через 48 ч. Контрольные антитела с нулевым плечом использовали в качестве отрицательных контрольных биспецифических антител, и они демонстрировали незначительную цитотоксичность или активность Т-клеток или ее отсутствие. В табл. 50 приведены средние значения для 6 различных доноров-яванских макак.

Таблица 50

Ш белка по а. к.	ЕС so уничтожения CD33⁺ CD14⁺(нМ)	ЕС50 активации Т-клеток (нМ)
СЗСВ189	3,60	0,02
СЗСВ88	0,89	0,02

6.6. Эффективность С3СВ189 и С3СВ88 в ксенотрансплантатах человеческих клеток ОМЛ MOLM13 у гуманизированных Т-клетками мышей NSG.

Эффективность С3СВ189 и С3СВ88 оценивали на стандартных ксенотрансплантатах человеческих клеток острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) MOLM-13, трансфицированных люциферазой, у самок мышей NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG), гуманизированных 20 миллионами Т-клеток. Животных рандомизировали в п=10/группу с помощью биолюминесцентной визуализации в реальном времени (BLI) на 5-й день после в/в имплантации опухоли. С3СВ189 и С3СВ88 в концентрации 0,005, 0,05 и 0,5 мг/кг или контрольное антитело к NullxCD3 в концентрации 0,5 мг/кг вводили и/п каждые 3-4 дня в течение 6 недель.

На 13 день после имплантации опухоли, когда в каждой группе оставалось по меньшей мере восемь животных, рассчитывали ингибирование роста опухоли (% TGI), определяемое по результатам биолюминесценции. Статистически значимое ингибирование роста опухоли наблюдали для С3СВ189 (фиг. 65) и С3СВ88 (фиг. 67) во всех концентрациях по сравнению с контролем к NullxCD3. C3CB189 в дозах 0,005, 0,05 и 0,5 мг/кг вызывало ингибирование роста опухоли на 76, 100 и 82% соответственно, а С3СВ88 в дозах 0,005, 0,05 и 0,5 мг/кг вызывало ингибирование роста опухоли на 100, 100 и 91 соответственно по сравнению с контролями, обработанными NullxCD3.

Лечение С3СВ189 и С3СВ88 привело к снижению опухолевой нагрузки и увеличению продолжительности жизни (ILS) по сравнению с 16-дневной медианой выживаемости в контрольной группе NullxCD3. В зависимости от доз медиана выживаемости животных, получавших лечение С3СВ189, составила 19-27,5 дней (фиг. 66), а у животных, получавших лечение С3СВ88, медиана выживаемости составила 26-28,5 (фиг. 68) дней по всем дозам. С3СВ189 в дозах 0,005, 0,05 и 0,5 мг/кг привело к увеличению продолжительности жизни на 19, 72 и 50% соответственно, а С3СВ88 привел к увеличению продолжительности жизни на 63, 78 и 72% соответственно по сравнению с контрольной группой.

7. Антитела к TMEFF2.

7.1. Генерация антигенов.

Человеческий внеклеточный домен (ВКД) TMEFF2 получали по последовательности с UniProt с номером доступа Q9UIK5. Конструкт ВКД была сконструирован с последовательностями 6-гистидиновой метки (SEQ ID NO: 596) и авидиновой метки на С-конце (конструкт TMEW1; SEQ ID NO: 578). Конструкт, содержащий домены FS2 и EGF (аминокислоты 151-320 конструировали в виде слияния человеческого сывороточного альбумина (HSA) с последовательностями 6-гистидиновой метки (SEQ ID NO: 596) и авидиновой метки (конструкт TMEW7; SEQ ID NO: 579). Конструкт, содержащий мембранный проксимальный домен TMEFF2 (остатки 230-320), сконструировали с 6-гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 596) (конструкт TMEW19; SEQ ID NO: 580) или сливали с крысиным Fc IgG1 с гистидиновой меткой (конструкт TMEW20; SEQ ID NO: 581). Остатки 230-320

- 136 045935

TMEFF2 содержат EGF домен, который охватывает остатки 261-301 TMEFF2. Экспрессионные конструкты ВКД человеческого TMEFF2 временно трансфицировали в клетки, полученные из HEK293, Expi293 (Gibco/Thermo Fisher Scientific), с использованием Expifectamine в соответствии с протоколом производителя. Перед сбором клетки инкубировали в течение 5 суток при 37°С в атмосфере с 8% СО₂ на орбитальной качалке. Экспрессирующие клетки удаляли центрифугированием, а растворимые белки TMEFF2 с His-метками очищали от среды с использованием аффинной хроматографии на иммобилизованных металлах с использованием смолы Fast Flow Ni Sepharose 6 (GE Healthcare) с последующей препаративной эксклюзионной хроматографией на Superdex 200 (SEC) (GE Healthcare) в фосфатном буфере Дульбекко с рН 7,2 (1х DPBS). Аминокислотные последовательности генерированных антигенов показаны в табл. 51.

Таблица 51

Ш белка по а.к.	Описание	Аминокислотная последовательность
TMEW1 (SEQ ID NO: 578)	TMEFF2-FL-ECD-HisAvi-метка	FPTSLSDCQTPTGWNCSGYDDRENDLFLCDTNT CKFDGECLRIGDTVTCVCQFKCNNDYVPVCGSN GESYQNECYLRQAACKQQSEILVVSEGSCATDA GSGSGDGVHEGSGETSQKETSTCDICQFGAECD EDAEDVWCVCNIDCSQTNFNPLCASDGKSYDN ACQIKEASCQKQEKIEVMSLGRCQDNTTTTTKS EDGHYARTDYAENANKLEESAREHHIPCPEHYN GFCMHGKCEHSINMQEPSCRCDAGYTGQHCEK KDYSVLYVVPGPVRFQYVGGGSHHHHHHLNDI FEAQKIEWHE
TMEW7 (SEQ ID NO:	FS2-EGF-Tev- HSA(C34S)-His-Avi-	SGETSQKETSTCDICQFGAECDEDAEDVWCVCN IDCSQTNFNPLCASDGKSYDNACQIKEASCQKQ EKIEVMSLGRCQDNTTTTTKSEDGHYARTDYAE
579)	метка	NANKLEESAREHHIPCPEHYNGFCMHGKCEHSI NMQEPSCRCDAGYTGQHCEKKDYSVLYVVPGP VRFQYVGSGSGSENLYFQGVRSSSDAHKSEVAH RFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKL VNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLC TVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKD DNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYL YEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAA DKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQ KFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVT DLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQ DSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADL PSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEY ARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPH ECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGK VGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLH EKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETY VPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVE LVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKAD DKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGSHHHHH HLNDIFEAQKIEWHE
TMEW19 (SEQ ID NO: 580)	spTMEFF2(230320)G3S-H6	NTTTTTKSEDGHYARTDYAENANKLEESAREH HIPCPEHYNGFCMHGKCEHSINMQEPSCRCDAG YTGQHCEKKDYSVLYVVPGPVRFQYVGGGSHH HHHH
TMEW20 (SEQ ID NO: 581)	spTMEFF2(230-320)- С38-крысиный IgGlFc	_{NTTTTTKSEDGHYARTDYAENANKLEESAREH}HIPCPEHYNGFCMHGKCEHSINMQEPSCRCDAG YTGQHCEKKDYSVLYVVPGPVRFQYVGGGSPR NCGGDCKPCICTGSEVSSVFIFPPKPKDVLTITLT PKVTCVVVDISQDDPEVHFSWFVDDVEVHTAQ TRPPEEQFNSTFRSVSELPILHQDWLNGRTFRCK VTSAAFPSPIEKTISKPEGRTQVPHVYTMSPTKEE MTQNEVSITCMVKGFYPPDIYVEWQMNGQPQE NYKNTPPTMDTDGSYFLYSKLNVKKEKWQQG NTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKGGGSHH HHHH

7.2. Создание антител к TMEFF2.

Создание антител с использованием трансгенных крыс, экспрессирующих локусы иммуноглобулина человека (OmniRat®) Крысы OmniRat® содержат химерный человеческий/крысиный

- 137 045935 локус IgH (содержащий 22 человеческих сегмента VHs, все человеческие сегменты D и JH в естественной конфигурации, связанные с крысиным локусом CH), а также полностью человеческие локусы IgL (12 VZs, связанных с JZ-CZ, и 16 Ws, связанных с Ιλ-Ολ). (см. например, Osborn et al. (2013), J. Immunol., 190(4):1481-1490). Соответственно крысы демонстрируют сниженную экспрессию крысиного иммуноглобулина, и в ответ на иммунизацию внедренные человеческие трансгены тяжелой и легкой цепей переключаются на экспрессию другого класса и подвергаются соматической мутации с образованием высокоаффинных химерных человеческих/крысиных моноклональных антител IgG с полностью человеческими вариабельными областями. Получение и применение OmniRat® и геномные модификации в таких крысах описаны в WO 14/093908.

OmniRat иммунизировали конструктом TMEFF2 человека FS2-EGF-Tev-HSA(C34S)-His-Avi-метка (TMEW7, SEQ ID NO: 579) и стимулировали конструктом spTMEFF2 (230-320)G3S-FdgG1 крысы (TMEW20, SEQ ID NO: 581). После 89 дневной схемы иммунизации собирали лимфатические узлы крыс и использовали их для создания гибридом, а супернатанты гибридом подвергали скринингу на связывание с белком человеческого TMEFF2-FL-ECD-His-Avi-метка (TMEW1) с помощью ИФА и/или SPARCL (люминесценция в аналитическом реагенте пространственной близости). Несколько супернатантов были отобраны для вторичного ELISA и SPARCL-скрининга связывания с ВКД TMEFF, FS2-EGF или доменом EGF только TMEFF2. На основании результатов скрининга несколько клонов гибридомы секвенировали, экспрессировали и охарактеризовали по функциональности.

Создание антител из библиотек фаговых дисплеев Fab, связывающие TMEFF2, были выбраны стандартными методами из двух наборов библиотек фагового дисплея de novo pIX, как описано в Shi et al., J. Mol. Biol., 397:385-96, 2010; и WO 2009/085462). Вкратце два набора библиотек, называемые V3.0 и V5.0, создавали путем диверсификации человеческих каркасов, в которых гены VH зародышевой линии IGHV1-69*01, IGHV3-23*01 и IGHV5-51*01 рекомбинировали с человеческим минигеном IGHJ-4 посредством петли Н3 (миниген IGHJ-6 также использовался в V5.0), а человеческие гены VL-каппа зародышевой линии 012 (IGKV1-39*01), L6 (IGKV3-11*01), A27 (IGKV3-20*01) и В3 (IGKV4-1*01) рекомбинировали с минигеном IGKJ-1 для сборки полных доменов VH и VL. Для диверсификации были выбраны положения в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей вокруг петель H1, Н2, L1, L2 и L3, которые часто контактируют с белковыми и пептидными антигенами. Диверсификация последовательности в выбранных положениях ограничивалась остатками, встречающимися в каждом положении в семействах генов зародышевой линии IGHV или IGLV для соответствующих генов IGHV или IGLV. Диверсификацию в петле Н3 создавали с использованием синтетических петель коротких или средних размеров длиной 7-14 аминокислот для библиотек V3.0 и длиной 6-19 аминокислот для библиотек V5.0. Распределение аминокислот в Н3 выполняли аналогично наблюдаемой вариации аминокислот в человеческих антителах. Каркасы, использованные для создания библиотек, получали название в соответствии с их происхождением от человеческого гена зародышевой линии VH и VL. В обоих наборах V3.0 и V5.0 каждую из трех библиотек тяжелых цепей объединяли с четырьмя легкими цепями зародышевой линии или библиотеками легких цепей зародышевой линии для создания 12 уникальных комбинаций VH:VL для каждого набора библиотек, используемых в экспериментах по отбору.

Клонирование V-области.

Общую РНК из лизатов клеток гибридомы фага очищали с использованием набора RNeasy 96 (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Полученную РНК количественно определяли с использованием Drop Sense и либо хранили при -80°С, либо использовали для синтеза кДНК с использованием системы синтеза First-Strand методом ОТ-ГЩР (Invitrogen). Синтез первой цепи кДНК проводили с использованием ген-специфических праймеров, отожженных с константными областями тяжелых, каппа-и лямбда-цепей соответственно. Реакционную смесь для ОТ-ПЦР, содержащую до 3 мкг очищенной РНК, ген-специфического праймера, смеси дНТФ, реакционного буфера, 25 мМ MgCl₂, DTT, RNaseOUTTM (40 Ед/мкл, Invitrogen) и SuperScript™ III RT (200 Ед/мкл, Invitrogen, кат. № 18080-051), инкубировали при 50°С в течение 50 мин и при 85°С в течение 5 мин. Полученную одноцепочечную кДНК хранили при - 20°С или использовали непосредственно для ПЦР-амплификации. Реакцию ПЦР проводили с использованием полимеразы Platinum Pfx (Invitrogen). Фрагменты v-области амплифицировали путем отжига прямого и обратного праймеров с лидерными последовательностями и константными областями тяжелой, каппа-и лямбда-цепей, соответственно, с использованием оптимизированных условий ПЦР. Полученные ПЦР-фрагменты секвенировали, аминокислотные последовательности выделенных v-областей оптимизировали по кодонам и клонировали в вектор экспрессии на основе pUnderd, несущий константную область IgG4 с мутациями S228P, F234A и L235A (изотип IgG4PAA).

Трансфекция и очистка Expi293 в малых масштабах.

Выбранные антитела, идентифицированные в ходе операций иммунизации или фагового дисплея, клонировали и экспрессировали как IgG1PAA и очищали в небольшом объеме 2 мл. Клетки Expi293™ (ThermoFisher Scientific) высевали с плотностью 1,25x105-2,25x105 жизнеспособных клеток/мл в среде

- 138 045935 экспрессии Expi293™ и культивировали в встряхиваемых колбах объемом 125 мл-2 л при 37°С, 7% СО₂. Клетки пересевали, когда плотность достигала логарифмической фазы роста при 3х10⁶-5х10⁶жизнеспособных клеток/мл с 98-99% жизнеспособности.

В день трансфекции определяли плотность жизнеспособных клеток и процент жизнеспособности. Клетки трансфицировали с плотностью 3х10⁶ жизнеспособных клеток/мл в соответствии с протоколом трансфекции производителя (ThermoFisher, публикация № MAN0007814). Культуру собирали на 6 сутки после трансфекции путем центрифугирования при 850xG в течение 15 мин перед очисткой. Антитела очищали из осветленных супернатантов с использованием смолы mAb Select Sure (GE Healthcare) и диализовали в PBS. Концентрации белка определяли путем измерения при длине волны А280 на фильтрате с помощью прибора DropSense (Trinean).

7.3. Определение характеристик антител к TMEFF2.

Антитела к TMEFF2 связывают TMEFF2 с высокой аффинностью.

Связывание выбранных антител IgG4PAA к TMEFF2 с ВКД TMEFF2 (TMEW1: TMEFF2-FL ECDHis-Avi-метка) и/или мембранной проксимальной областью (TMEW19: spTMEFF2(230-320)G3S-H6) оценивали с использованием Proteon (TMEB674, ТМЕВ675, ТМЕВ 565 и ТМЕВ570) или Biacore SPR (TMEB762 и ТМЕВ757). Кинетические параметры связывания выбранных антител приведены в табл. 52. Было обнаружено, что антитела к TMEFF2 связываются как с мембранной проксимальной областью ВКД TMEFF2, так и с TMEFF2 с пикомолярной аффинностью.

Таблица 52

Антитело	Антиген	Домен TMEFF2	к_а (1/М*с)	Kd (1/с)	KD (нМ)
ТМЕВ674	TMEW1	вкд	2.01Е+06	1.62Е-04	0,10
ТМЕВ674	TMEW19	МР*	8.37Е+05	1.75Е-04	0,20
ТМЕВ675	TMEW1	вкд	2.65Е+06	1.53Е-04	0,10
ТМЕВ675	TMEW19	МР	9.72Е+05	1.58Е-04	0,20
ТМЕВ565	TMEW1	ВКД	3.84Е+05	9.13Е-06	0,02
ТМЕВ565	TMEW19	МР	7.77Е+05	6.39Е-06	0,01
ТМЕВ570	TMEW1	ВКД	4.64Е+05	5.13Е-05	0,11
ТМЕВ570	TMEW19	МР	7.62Е+05	4.67Е-05	0,06
ТМЕВ762	TMEW1	ВКД	5.41Е+05	1.74Е-04	0,32
ТМЕВ757	TMEW1	ВКД	5.42Е+05	1.67Е-04	0,31
*МР: мембранная проксимальная область

ППР ProteOn.

Связывание мкАт к TMEFF2 с ВКД и мембранной проксимальной областью TMEFF2 человека измеряли методом ППР ProteOn (Bio-Rad). Очищенные мкАт (разведенные до конечной концентрации 1 мкг/мл в PBST) использовали в качестве лигандов в анализе и иммобилизовали посредством захвата Fc к антителам козьего античеловеческого (GAH) Fc IgG. Для аминного связывания GAH Fc IgG смесь 1:1 EDC (40 мМ) и NHS (10 мМ) смешивали непосредственно перед инъекцией для активации поверхности чипа и вводили в вертикальную ориентацию. Затем антитело GAH-Fc (30 мкг/мл) в ацетатном буфере (рН 5,0) пропускали по поверхности в течение 300 с при 30 мкл/мин в вертикальной ориентации. Впоследствии любые оставшиеся реакционноспособные карбоксильные группы на поверхности деактивировали путем инъекции 1 М этаноламина (рН 8,5) в той же ориентации. Антитела использовали в концентрации 1 мкг/мл для иммобилизации. Антитела протекали по поверхности в горизонтальном направлении. ВКД TMEFF2 человека или проксимальную область мембраны в серии 3-кратных разбавлений 5 концентраций (самая высокая концентрация в диапазоне 100-600 нМ) протекали в качестве аналита в вертикальной ориентации для связывания с захваченными молекулами. Буферный образец также вводили в 6-й канал в вертикальном направлении для контроля любого смещения исходного сигнала. Стадии ассоциации и диссоциации для всех концентраций отслеживали в течение 3 и 30 (или 15) мин соответственно, при скорости потока 100 мкл/мин. Связывающую поверхность регенерировали для следующего цикла взаимодействия с использованием 18-секундного импульса 0,8% фосфорной кислоты для удаления связанного антигена.

Необработанные данные обрабатывали путем вычитания двух наборов эталонных данных из данных ответа: 1) сигналы между пятнами для коррекции неспецифических взаимодействий между антигеном и пустой поверхностью чипа; 2) сигналы пустого канала (где через чип пропускали только PBST) для коррекции неспецифического смещения исходного уровня.

ППР Biacore 8K.

Связывание мкАт к TMEFF2 с ВКД TMEFF2 человека измеряли методом ППР Biacore 8 K. Формат анализа заключался в захвате мкАт с помощью поверхности Fc человека высокой плотности с

- 139 045935 последующей инъекцией титрования концентрации TMEFF2 человека с помощью метода кинетики одного цикла. Козьи антитела к Fc IgG человека (Jackson Immunoresearch, № по кат. 109-005-098) напрямую иммобилизовали посредством аминного связывания в концентрации 30 мкг/мл в 10 мМ ацетатном буфере, рН 4,5, на проточных ячейках 1 и 2 на чипе датчика СМ5 (GE) со скоростью потока 30 мкл/мин в буфере HBSP (GE). мкАт захватывали на поверхности антител к Fc IgG человека с концентрацией 0,5 мкг/мл (~200-300 ОЕ) на проточной кювете 2. Затем рабочий буфер заменяли на HBSP+100 мкг/мл BSA. TMEFF2 ВКД с концентрацией 30 нМ в серии разведений в 3 раз вводили от низкой до высокой концентрации с использованием метода кинетики с одним циклом. Скорость диссоциации отслеживали через 30 мин после последнего введения или введения наибольшей концентрации, а затем поверхность регенерировали, используя 0,8% фосфорную кислоту (Bio-Rad). Также проводили холостой анализ буферного раствора, захватывая те же мкАт и используя те же условия анализа образца. Необработанные данные обрабатывали путем вычитания двух наборов эталонных данных из данных ответа: 1) эталонная проточная кювета 1 вычтена из проточной кюветы 2 и 2) с контрольным буфером из экспериментального прогона. Обработанные данные для всех концентраций для каждого мкАт в целом соответствовали простой модели связывания Ленгмюра 1: 1 для получения оценок констант кинетики (kon, koff) и аффинности (KD).

Термостабильность антител к TMEFF2.

ТМЕВ675 продемонстрировало более низкий, чем обычный профиль термостабильности методом ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия) с началом разворачивания Tm=52°G и первым тепловым переходом (Tml) при=60,4°С. Более точное исследование последовательности ТМЕВ675 (см. пример 4) показало наличие соматических гипермутаций (SHM) в каркасной области тяжелой и легкой цепей. Несколько реконструированных вариантов субклонировали, экспрессировали, очищали и профилировали методом ДСК. Полученные мкАт ТМЕВ762 и TMEFB757 продемонстрировали желаемый профиль термостабильности (Tml=69,4°C и Tml=69,7°C соответственно). По сравнению с ТМЕВ675, ТМЕВ762 имело следующие аминокислотные модификации в тяжелой цепи: R14P, P20L и H81Q, тогда как TMEFB757 имело следующие аминокислотные модификации в тяжелой цепи: R14P и P20L. По сравнению с ТМЕВ675, ТМЕВ762 имело следующие аминокислотные модификации в легкой цепи: A1D и А91Р, тогда как TMEFB757 имело модификацию А91Р в легкой цепи. Нумерация остатков соответствует схеме Кабат. Кинетические параметры связывания ТМЕВ675, ТМЕВ762 с ВКД TMEFF2 приведены в табл. 52.

7.4. Определение структурных характеристик антител к TMEFF2.

Последовательности кДНК и трансляции аминокислот антител получали с использованием стандартных методик. После определения последовательности полипептидов некоторые кДНК антител, кодирующие вариабельные области или полноразмерные антитела, были оптимизированы по кодонам с помощью стандартных способов экспрессии в увеличенном количестве.

В табл. 53 приведены аминокислотные последовательности HCDR1 и HCDR2 выбранных антител к TMEFF2.

В табл. 54 приведены последовательности HCDR3 выбранных антител к TMEFF2.

В табл. 55 приведены аминокислотные последовательности LCDR1 и LCDR2 выбранных антител к TMEFF2.

В табл. 56 приведены аминокислотные последовательности LCDR3 выбранных антител к TMEFF2.

В табл. 57 приведены аминокислотные последовательности VH и VL выбранных антител к TMEFF2.

В табл. 58 приведены SEQ ID NO: тяжелой и легкой цепей выбранных антител к TMEFF2.

В табл. 59 приведены аминокислотные последовательности тяжелой цепи выбранных антител к TMEFF2.

В табл. 60 приведены аминокислотные последовательности легких цепей выбранных антител к TMEFF2.

В табл. 61 приведены SEQ ID NO: полинуклеотидов, кодирующих различные цепи антитела к TMEFF2.

- 140 045935

Таблица 53

мкАт	Последовательность HCDR1	HCDR1, SEQ ID NO:	Последовательность HCDR2	HCDR2, SEQ ID NO:
ТМЕВ675	SYSMS	582	VISGSGGFTDYADSV KG	584
ТМЕВ570	SYYIS	583	GIIPIS GRANYAQKFQ G	585
ТМЕВ674	SYSMS	582	VISGGGSFTSYADSVK G	586
ТМЕВ565	SYYIS	583	GIIPIS GRANYAQKFQ G	585
ТМЕВ762	SYSMS	582	VISGSGGFTDYADSV KG	584
ТМЕВ757	SYSMS	582	VISGSGGFTDYADSV KG	584

Таблица 54

мкАт	Последовательность HCDR3	HCDR3, SEQ ID NO:
TMEB675	MPLNSPHDY	587
TMEB570	DGYSSGRSTTYAFDY	16
TMEB674	MPLNSPHDC	17
TMEB565	DGYSSGRSTTYAFDY	16
TMEB762	MPLNSPHDY	587
TMEB757	MPLNSPHDY	587

Таблица 55

мкАт	Аминокислота LCDR1	LCDR1SEQ ID NO:	Аминокислота LCDR2	LCDR2, SEQ ID NO:
TMEB675	RASQGIRNDLG	18	AASSLQS	588
TMEB570	RASQSVSTYYLA	19	GASYRAT	21
TMEB674	RASQGIRNDLG	18	AASSLQS	588
TMEB565	RASQGIRNDLG	18	AASSLQS	588
TMEB762	RASQGIRNDLG	18	AASSLQS	588
TMEB757	RASQGIRNDLG	18	AASSLQS	588

Таблица 56

мкАт	Аминокислота LCDR3	LCDR3, SEQ ID NO:
TMEB675	LQDYNYALT	22
TMEB570	QQYGHSPIT	23
TMEB674	LQDYNYSLT	24
TMEB565	LQDYNYALT	22
TMEB762	LQDYNYPLT	603
TMEB757	LQDYNYPLT	603

Таблица 57

Антител 0	Названи e VH	Аминокислотная последовательно CTbVH	VH c SEQ ID NO:	Названи e VL	Аминокислотная последовательно сть VL	VL c SEQ ID NO:
TMEB6 75	TMEH41 1	EVQLLESGGGL VQRGGSLRPSC AASGFTFSSYS MSWVRQAPGK GLEWVSVISGS GGFTDYADSVK GRFTISRDNSK NTLYLHMNSLR	25	TMEL12 7	AIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITC RASQGIRNDLG WYQQKPGKAP KLLIY AASSLQS GVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQ PEDFATYYCLQ	28

- 141 045935

		AEDTAVYYCA RMPLNSPHDY WGQGTLVTVSS			DYNYALTFGG GTKVEIK
TMEB5 70	TMEH39 6	QVQLVQSGAE VKKPGSSVKVS CKASGGTFSSY YISWVRQAPGQ GLEWMGGIIPIS GRANYAQKFQ GRVTITADESTS TAYMELSSLRS EDTAVYYCAR DGYSSGRSTTY AFDYWGQGTL VTVSS	589	TMEL11 2	EIVLTQSPGTLS LSPGERATLSC RASQSVSTYYL AWYQQKPGQA PRLLIYGASYR ATGIPDRFSGSG SGTDFTLTISRL EPEDFAVYYCQ QYGHSPITFGQ GTKVEIK	29
TMEB6 74	TMEH41 0	EVQLLESGGGL VQPPGGSLRLS CAASGFTFSSYS MSWVRQAPGK GLEWVSVISGG GSFTSYADSVK GRFTISRDNSN NTLYLQMSSLR AEDTAFYYCAR MPLNSPHDCW GQGTLVTVSS	27	TMEL12 6	AIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITC RASQGIRNDLG WYQQKPGKAP KLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQ PEDFATYYCLQ DYNYSLTFGGG TKVEIR	30
TMEB5 65	TMEH39 6	QVQLVQSGAE VKKPGSSVKVS CKASGGTFSSY YISWVRQAPGQ GLEWMGGIIPIS GRANYAQKFQ GRVTITADESTS TAYMELSSLRS EDTAVYYCAR DGYSSGRSTTY AFDYWGQGTL VTVSS	589	TMEL11 1	EIVLTQSPGTLS LSPGERATLSC RASQSVATYYL AWYQQKPGQA PRLLIYGASSRA TGIPDRFSGSGS GTDFTLTISRLE PEDFAVYYCQQ YGYNPITFGQG TKVEIK	31
TMEB7 62	TMEH45 9	EVQLLESGGGL VQPGGSLRLSC AASGFTFSSYS MSWVRQAPGK GLEWVSVISGS GGFTDYADSVK GRFTISRDNSK NTLYLQMNSLR AEDTAVYYCA RMPLNSPHDY WGQGTLVTVSS	604	DL3L12 9	DIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITC RASQGIRNDLG WYQQKPGKAP KLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQ PEDFATYYCLQ DYNYPLTFGGG TKVEIK	607
TMEB7	TMEH46	EVQLLESGGGL	612	B76L85	AIQMTQSPSSLS	613
57	0	VQPGGSLRLSC AASGFTFSSYS MSWVRQAPGK GLEWVSVISGS GGFTDYADSVK GRFTISRDNSK NTLYLHMNSLR AEDTAVYYCA RMPLNSPHDY WGQGTLVTVSS			ASVGDRVTITC RASQGIRNDLG WYQQKPGKAP KLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQ PEDFATYYCLQ DYNYPLTFGGG TKVEIK

- 142 045935

Таблица 58

Антитело	Название VH	Название VL	Белок НС, SEQ ID NO:	Белок LC, SEQ ID NO:
ТМЕВ675	ТМЕН411	TMEL127	32	35
ТМЕВ570	ТМЕН396	TMEL112	33	36
ТМЕВ674	ТМЕН410	TMEL126	34	37
ТМЕВ565	ТМЕН396	TMEL111	33	38
ТМЕВ762	ТМЕН459	DL3L129	614	615
ТМЕВ757	ТМЕН460	B76L85	616	617

Таблица 59

Белок НС, SEQ ГО NO:	Аминокислотная последовательность НС
32 (НС TMEB675)	evqllesggglvqrggslrpscaasgftfssysmswvrqapgkglewvsvisgsggftdyadsvkgrftisr dnskntlylhmnslraedtavyycarmplnsphdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalg clvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrv eskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhn aktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqee mtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsv mhealhnhytqkslslslgk
33 (НС ТМЕВ570, ТМЕВ565)	qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyyiswvrqapgqglewmggiipisgranyaqkfqgrvt itadeststaymelsslrsedtavyycardgyssgrsttyafdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstse staalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntk vdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdg vevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlp psqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnv fscsvmhealhnhytqkslslslgk
34 (НС ТМЕВ674)	evqllesggglvqppggslrlscaasgftfssysmswvrqapgkglewvsvisgggsftsyadsvkgrftis rdnsnntlylqmsslraedtafyycarmplnsphdcwgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalg clvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrv eskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhn aktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqee mtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsv mhealhnhytqkslslslgk
614 (НС ТМЕВ762)	evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssysmswvrqapgkglewvsvisgsggftdyadsvkgrftisr dnskntlylqmnslraedtavyycarmplnsphdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalg clvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrv
	eskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhn aktkpreeqfnstyrv v s vltvlhqdwlngkeykckv snkglp s siektiskakgqprepqv у tlpp sqee mtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsv mhealhnhytqkslslslgk
616 (НС ТМЕВ757)	evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssysmswvrqapgkglewvsvisgsggftdyadsvkgrftisr dnskntlylhmnslraedtavyycarmplnsphdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalg clvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrv eskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhn aktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqee mtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsv mhealhnhytqkslslslgk

- 143 045935

Таблица 60

SEQ ID NO: белка LC	Аминокислотная последовательность LC
35 (LC TMEB675)	aiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgirndlgwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftlti sslqpedfatyyclqdynyaltfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqw kvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
36 (LC TMEB570)	eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvstyylawyqqkpgqaprlliygasyratgipdrfsgsgsgtdftltisr lepedfavyycqqyghspitfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwk vdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
37 (LC TMEB674)	aiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgimdlgwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftlti sslqpedfatyyclqdynysltfgggtkveintvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwk vdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
38 (LC TMEB565)	eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvatyylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisr lepedfavyycqqygynpitfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwk vdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
615 (LC TMEB762)	diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgirndlgwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftlti sslqpedfatyyclqdynypltfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqw kvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
617 (LC TMEB757)	aiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgimdlgwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftlti sslqpedfatyyclqdynypltfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqw kvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

Таблица 61

Антитело	кДНК VH c SEQ ID NO:	кДНК VL c SEQ ID NO:	кДНК НС с SEQ ID NO:	кДНК LC c SEQ ID NO:
TMEB675	39	42	46	49
TMEB570	40	43	47	50
TMEB674	41	44	48	51
TMEB565	40	45	47	590
TMEB762	618	619	620	621
TMEB757	622	623	624	625

SEQ ID NO: 39 (кДНК VH TMEB675)

Gaggtgcagctgctggaaagcggcggaggcctggtgcagagaggaggaagcctgagacccagctgtgccgccagcggctt

- 144 045935 caccttcagcagctacagcatgagctgggtcaggcaggcccctggcaaaggactggagtgggtgagcgtgattagcggcagcggcggc ttcaccgattacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaatagcaagaacaccctgtacctgcacatgaacagcctg agggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggatgcccctgaacagccctcacgactactggggccagggaaccctggtgaccg tgtccagc

SEQ ID NO: 40 (кДНК VH TMEB570, TMEB565)

Caggtgcagctggtgcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcagcagcgtgaaagtgagctgcaaagcgagcggcg gcaccttcagctcctattacattagctgggtgcgccaggcgccgggccagggcctggaatggatgggtggcattatcccaatcagtgggcg tgctaattatgcgcagaaatttcagggccgcgtgaccattaccgctgatgaaagcaccagcaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgc agcgaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgacggctacagtagtggacgtagcacaacatacgcatttgactattggggccagggc accctggtgaccgtgtcgagt

SEQ ID NO: 41 (кДНК VH TMEB674)

Gaagtgcagctgctggagagcggaggaggactggtgcagcctcctggcggaagcctgagactgagctgcgccgctagcgg cttcaccttcagcagctacagcatgagctgggtgagacaggctcctggcaagggcctggagtgggtgagcgtgatcagcggcggaggca gctttaccagctacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaacagcaacaacaccctgtacctgcagatgagcagc ctgagggccgaggacaccgccttctactactgcgccaggatgcccctgaacagcccccatgactgctggggacagggcaccctggtgac cgtgagcagc

SEQ ID NO: 42 (кДНК VL TMEB675)

Gccatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagcca gggcatcagaaacgacctgggctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagag cggagtgcctagcaggttcagcggaagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacct actactgcctgcaggactacaactacgccctgacattcggcggcggcaccaaggtggagatcaag

SEQ ID NO: 43 (кДНК VL TMEB570)

Gaaattgtgctgacccagagcccgggcaccctgagcctgagcccgggcgaacgcgcgaccctgagctgccgcgcgagcca gagcgtttccacatactacctggcgtggtatcagcagaaaccgggccaggcgccgcgcctgctgatttacggtgcctcctatcgcgcgacc ggcattccggatcgctttagcggcagcggttccggcaccgattttaccctgaccattagccgcctggaaccggaagattttgcggtgtattatt gccagcagtacggtcacagcccgattacttttggccagggcaccaaagtggaaatcaaa

SEQ ID NO: 44 (кДНК VL TMEB674)

Gccatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagcca gggcatcaggaacgacctgggctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagag cggagtgcctagcaggttcagcggcagcggaagcggcaccgacttcaccctgaccatctccagcctgcagcccgaggacttcgccacct actactgcctgcaggactacaactacagcctgaccttcggcggcggcaccaaggtggagatcagg

SEQ ID NO: 45 (кДНК VL TMEB565)

Gaaattgtgctgacccagagcccgggcaccctgagcctgagcccgggcgaacgcgcgaccctgagctgccgcgcgagcca gagcgttgccacctattatcttgcgtggtatcagcagaaaccgggccaggcgccgcgcctgctgatttacggtgcatcctcccgtgcgacc ggcattccggatcgctttagcggcagcggttccggcaccgattttaccctgaccattagccgcctggaaccggaagattttgcggtgtattatt gccagcagtacggctataacccaattacctttggccagggcaccaaagtggaaatcaaa

SEQ ID NO: 46 (кДНК НС TMEB675) gaggtgcagctgctggaaagcggcggaggcctggtgcagagaggaggaagcctgagacccagctgtgccgccagcggctt caccttcagcagctacagcatgagctgggtcaggcaggcccctggcaaaggactggagtgggtgagcgtgattagcggcagcggcggc ttcaccgattacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaatagcaagaacaccctgtacctgcacatgaacagcctg

- 145 045935 agggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggatgcccctgaacagccctcacgactactggggccagggaaccctggtgaccg tgtccagcgcttccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcc tggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctac agtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaaaacctacacctgcaacgtagatcacaa gcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgaggccgccggggga ccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagcca ggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaac agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagg cctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggagg agatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcag ccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcagg tggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaa a

SEQ ID NO: 47 (кДНК НС TMEB570, TMEB565) caggtgcagctggtgcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcagcagcgtgaaagtgagctgcaaagcgagcggcg gcaccttcagctcctattacattagctgggtgcgccaggcgccgggccagggcctggaatggatgggtggcattatcccaatcagtgggcg tgctaattatgcgcagaaatttcagggccgcgtgaccattaccgctgatgaaagcaccagcaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgc agcgaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgacggctacagtagtggacgtagcacaacatacgcatttgactattggggccagggc accctggtgaccgtgtcgagtgcttccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcc gccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttc ccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaaaacctacacctgca acgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgag gccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtgg tggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcggga ggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaagg tctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgccc ccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtggga gagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgt ggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctc cctgtctctgggtaaa

SEQ ID NO: 48 (кДНК НС TMEB674) gaagtgcagctgctggagagcggaggaggactggtgcagcctcctggcggaagcctgagactgagctgcgccgctagcgg cttcaccttcagcagctacagcatgagctgggtgagacaggctcctggcaagggcctggagtgggtgagcgtgatcagcggcggaggca gctttaccagctacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaacagcaacaacaccctgtacctgcagatgagcagc ctgagggccgaggacaccgccttctactactgcgccaggatgcccctgaacagcccccatgactgctggggacagggcaccctggtgac cgtgagcagcgcttccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggct gcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcc tacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaaaacctacacctgcaacgtagatca caagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgaggccgccggg ggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtga

- 146 045935 gccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtt caacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaa aggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccagg aggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggg cagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagc aggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctggg taaa

SEQ ID NO: 49 (кДНК LC TMEB675)

Gccatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagcca gggcatcagaaacgacctgggctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagag cggagtgcctagcaggttcagcggaagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacct actactgcctgcaggactacaactacgccctgacattcggcggcggcaccaaggtggagatcaagcgtacggtggctgcaccatctgtctt catcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacag tggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagca gcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcaca aagagcttcaacaggggagagtgt

SEQ ID NO: 50 (кДНК LC TMEB570)

Gaaattgtgctgacccagagcccgggcaccctgagcctgagcccgggcgaacgcgcgaccctgagctgccgcgcgagccagag cgtttccacatactacctggcgtggtatcagcagaaaccgggccaggcgccgcgcctgctgatttacggtgcctcctatcgcgcgaccggcattc cggatcgctttagcggcagcggttccggcaccgattttaccctgaccattagccgcctggaaccggaagattttgcggtgtattattgccagcagta cggtcacagcccgattacttttggccagggcaccaaagtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgag cagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaat cgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagacta cgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

SEQ ID NO: 51 (кДНК LC TMEB674)

Gccatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagcca gggcatcaggaacgacctgggctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagag cggagtgcctagcaggttcagcggcagcggaagcggcaccgacttcaccctgaccatctccagcctgcagcccgaggacttcgccacct actactgcctgcaggactacaactacagcctgaccttcggcggcggcaccaaggtggagatcaggcgtacggtggctgcaccatctgtctt catcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacag tggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagca gcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcaca aagagcttcaacaggggagagtgt

SEQ ID NO: 590 (кДНК LC TMEB565)

Gaaattgtgctgacccagagcccgggcaccctgagcctgagcccgggcgaacgcgcgaccctgagctgccgcgcgagccag agcgttgccacctattatcttgcgtggtatcagcagaaaccgggccaggcgccgcgcctgctgatttacggtgcatcctcccgtgcgaccggc attccggatcgctttagcggcagcggttccggcaccgattttaccctgaccattagccgcctggaaccggaagattttgcggtgtattattgccag cagtacggctataacccaattacctttggccagggcaccaaagtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatc tgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacg ccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagca

- 147 045935 aagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggag agtgt

SEQ ID NO: 618 (кДНК VH TMEB762) gaggtgcagctgctggaaagcggcggaggcctggtgcagcccggaggaagcctgagactcagctgtgccgccagcggcttc accttcagcagctacagcatgagctgggtcaggcaggcccctggcaaaggactggagtgggtgagcgtgattagcggcagcggcggctt caccgattacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaatagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctga gggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggatgcccctgaacagccctcacgactactggggccagggaaccctggtgaccgt gtccagc

SEQ ID NO: 619 (кДНК VL TMEB762) gacatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagccag ggcatcagaaacgacctgggctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagagc ggagtgcctagcaggttcagcggaagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccaccta ctactgcctgcaggactacaactaccccctgacattcggcggcggcaccaaggtggagatcaag

SEQ ID NO: 620 (кДНК НС TMEB762) gaggtgcagctgctggaaagcggcggaggcctggtgcagcccggaggaagcctgagactcagctgtgccgccagcggcttc accttcagcagctacagcatgagctgggtcaggcaggcccctggcaaaggactggagtgggtgagcgtgattagcggcagcggcggctt caccgattacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaatagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctga gggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggatgcccctgaacagccctcacgactactggggccagggaaccctggtgaccgt gtccagcgcttccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcct ggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctaca gtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaaaacctacacttgcaacgtagatcacaag cccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgaggccgccgggggac catcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccag gaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaaca gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggc ctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggagga gatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagc cggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcagat ggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaa

SEQ ID NO: 621 (кДНК LC TMEB762) gacatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagccag ggcatcagaaacgacctgggctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagagc ggagtgcctagcaggttcagcggaagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccaccta ctactgcctgcaggactacaactaccccctgacattcggcggcggcaccaaggtggagatcaagcgtacggtggctgcaccatctgtcttc atcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagt ggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcag caccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaa agagcttcaacaggggagagtgttag

SEQ ID NO: 622 (кДНК VH TMEB757) gaggtgcagctgctggaaagcggcggaggcctggtgcagcccggaggaagcctgagactcagctgtgccgccagcggcttc

- 148 045935 accttcagcagctacagcatgagctgggtcaggcaggcccctggcaaaggactggagtgggtgagcgtgattagcggcagcggcggctt caccgattacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaatagcaagaacaccctgtacctgcacatgaacagcctga gggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggatgcccctgaacagccctcacgactactggggccagggaaccctggtgaccgt gtccagc

SEQ ID NO: 623 (кДНК VL TMEB757) gccatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagccag ggcatcagaaacgacctgggctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagagc ggagtgcctagcaggttcagcggaagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccaccta ctactgcctgcaggactacaactaccccctgacattcggcggcggcaccaaggtggagatcaag

SEQ ID NO: 624 (кДНК НС TMEB757) gaggtgcagctgctggaaagcggcggaggcctggtgcagcccggaggaagcctgagactcagctgtgccgccagcggcttc accttcagcagctacagcatgagctgggtcaggcaggcccctggcaaaggactggagtgggtgagcgtgattagcggcagcggcggctt caccgattacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaatagcaagaacaccctgtacctgcacatgaacagcctga gggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggatgcccctgaacagccctcacgactactggggccagggaaccctggtgaccgt gtccagcgcttccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcct ggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctaca gtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaaaacctacacttgcaacgtagatcacaag cccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgaggccgccgggggac catcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccag gaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaaca gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggc ctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggagga gatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagc cggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcagat ggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaa

SEQ ID NO: 625 (кДНК LC TMEB757) gccatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagccag ggcatcagaaacgacctgggctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagagc ggagtgcctagcaggttcagcggaagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccaccta ctactgcctgcaggactacaactaccccctgacattcggcggcggcaccaaggtggagatcaagcgtacggtggctgcaccatctgtcttc atcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagt ggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcag caccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaa agagcttcaacaggggagagtgttag

Каркасы выбранных антител к TMEFF2 приведены в табл. 62.

Таблица 62

Антитело	Каркас VH	Каркас VH, SEQ ID NO:	Каркас VL	Каркас VL, SEQ ID NO:
ТМЕВ675	VH3_3-23	53	VKI_L11	55
ТМЕВ570	VHl_l-69	54	VKIII_A27	591
ТМЕВ674	VH3_3-23	53	VKI_L11	55
ТМЕВ565	VHl_l-69	54	VKI_L11	55
ТМЕВ762	VH3_3-23	53	VKI_L11	55
ТМЕВ757	VH3_3-23	53	VKI_L11	55

- 149 045935

SEQ ID NO: 53 (каркас VH3_3-23)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGS GGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 54 (каркас VHl_l-69)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS SYAIS WVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGTANYAQKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR

SEQ ID NO: 55 (каркас VKI_L11) aiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgirndlgwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsg tdftltisslqpedfatyyc Iqdynyp

SEQ ID NO: 591 (каркас VKIII_A27)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP

7.5. Картирование эпитопов антител к TMEFF2.

Картирование эпитопов ТМЕВ570 и ТМЕВ675 проводили с H/D обменом. TMEW1 (SEQ ID NO: 578) в этих анализах использовали в качестве источника TMEFF2.

мкг TMEW1 в 130 мкл контрольного буфера (50 мМ фосфата, 100 мМ натрий хлорида при рН 7,4) денатурировали путем добавления 130 мкл 4 М гуанидин гидрохлорида, 0,85 М буфера ТСЕР (конечный рН составлял 2,5) и инкубации смеси в течение 3 мин при 10°С. Затем смесь подвергали расщеплению пепсином/протеазой XIII на колонке, используя колонку пепсин/протеаза XIII собственной упаковки (мас./мас., 1:1) (2,1x30 мм). Полученные пептиды анализировали с помощью системы СВЭЖХМС, состоящей из СВЭЖХ Waters Acquity, соединенной с масс-спектрометром Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap (Thermo). Пептиды разделяли на колонке С8 размером 50x1 мм с градиентом 16,5 мин от 2-34% растворителя В (0,2% муравьиной кислоты в ацетонитриле). Растворитель А представлял собой 0,2% муравьиную кислоту в воде. Клапан инжектора и колонка пепсина/протеазы XIII и их соответствующие соединительные трубки располагаются внутри охлаждаемого корпуса, где поддерживается температура 10°С. Второй переключающий клапан, колонка С8, и их соответствующие соединительные трубки из нержавеющей стали находятся внутри другого охлаждаемого корпуса с циркуляцией, где поддерживается температура -6°С. Идентификацию пептида осуществляют путем поиска данных МС/МС в сравнении с последовательностью TMEW1 с использованием программы Mascot. Допуск по массе для ионов предшественника и продукта составлял 7 ч./млн и 0,02 Да соответственно.

мкл TMEW1 (5 мкг) или 10 мкл TMEW1 и ТМЕВ570, или смеси ТМЕВ675 (5:15 мкг) инкубировали с 120 мкл буферного раствора для мечения оксидом дейтерия (50 мМ натрий фосфата, 100 мМ натрий хлорида при рН 7,4) в течение 0, 30, 360, 3600 или 14400 с при 10°С. Водород-дейтериевый обмен (H/D) в каждый момент времени проводили в двух повторностях. Водород-дейтериевый обмен останавливали добавлением 130 мкл 4 М гуанидингидрохлорида, 0,85 М буфера ТСЕР (конечный рН составлял 2,5). Затем образцы после остановки обмена наносили на колонку расщепления с пепсином/протеазой XIII и анализировали с помощью ЖХ-МС, как описано выше. Масс-спектры регистрировали только в режиме МС.

Исходные данные МС обрабатывают с помощью программного обеспечения HDX WorkBench, предназначенного для анализа данных МС H/D обмена (Pascal et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2012, 23 (9), 1512-1521). Уровни дейтерия вычисляют с помощью средней разности масс между дейтерированным пептидом и его нативной формой (t0). Около 97-99% белка можно было картировать относительно конкретных пептидов. Кривые накопления дейтерия показали значительную разницу в наклоне за время обмена для пептидов.

Эпитоп ТМЕВ570: TMEW1 продемонстрировал умеренное снижение поглощения дейтерия по остаткам 235-249 (нумерация остатков соответствует SEQ ID NO: 575), например, остатки HGKCEHSINMQEPSC (SEQ ID NO: 592) в мембранной проксимальной области была защищены от H/D обмена при связывании с ТМЕВ570.

Эпитоп ТМЕВ675: TMEW1 продемонстрировал умеренное снижение поглощения дейтерия по остаткам 252-268 (нумерация остатков соответствует SEQ ID NO: 575), например, остатки DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 600) в мембранной проксимальной области были защищены от H/D обмена при связывании с ТМЕВ675.

Таким образом, эпитопные остатки ТМЕВ570 TMEFF2 охвачены HGKCEHSINMQEPSC (SEQ ID NO: 592), а эпитопные остатки ТМЕВ675 охвачены DAGYTGQHCEKKDYSVL (SEQ ID NO: 600). Оба антитела связывались с TMEFF2 в мембранной проксимальной области.

7.6. Создание биспецифических антител к TMEFF2xCD3.

Выбранные моноспецифические антитела к TMEFF2 и CD3 (см. примеры 1-7) экспрессировали как IgG4/K. Замены F405L и R409K (нумерация ЕС) были внесены в антитела к CD3, в то время как антитела к TMEFF2 имели IgG4 дикого типа. В дополнение к заменам в положениях 405 и 409 были

- 150 045935 сконструированы мкАт IgG4 с заменой S228P, F234A и L235A.

Моноспецифические антитела экспрессировали и очищали с помощью стандартных способов, применяя колонку Protein А (колонку HiTrap MabSelect SuRe). После элюирования пулы диализировали в D-PBS, рН 7,2.

Биспецифические антитела TMEFF2xCD3 создавали, комбинируя моноспецифическое мкАт к TMEFF2 и моноспецифическое мкАт к CD3 при обмене Fab-плечами in vitro, как описано в международной патентной публикации № WO2011/131746. Вкратце около 1-20 мг/мл каждого антитела в молярном соотношении 1:1 в PBS, рН 7-7,4, и 75 мМ 2-меркаптоэтаноламина (2-МЕА) смешивали вместе и инкубировали при 25-37°С в течение 2-6 ч, после чего удаляли 2-МЕА посредством диализа, диафильтрации, тангенциальной поточной фильтрации и/или фильтрации в вихревой ячейке с применением стандартных способов.

Биспецифические антитела после обмена Fab-плечами in vitro дополнительно очищали стандартными способами, применяя гидрофобную хроматографию, чтобы свести к минимуму остаточное содержание исходных антител к TMEFF2 и CD3.

В табл. 63 и 64 показаны полученные биспецифические антитела.

Таблица 63

Биспециф ическое антитело	Исходное (плечо к ТМЕРР2/плеч о к CD3)	HCD R1	HCDR2	HCDR3	LCDR1	LCDR2	LCDR3
ТМСВ132	ТМЕВ675	582	584	587	18	588	22
CD3B376	662	663	664	671	673	690
ТМСВ131	ТМЕВ570	583	585	16	19	21	23
CD3B376	662	663	664	671	673	690
ТМСВ150	ТМЕВ762	582	584	587	18	588	603
CD3B376	662	663	664	671	673	690

Таблица 64

Биспецифичес кое антитело	Исходное (плечо к ТМЕРР2/плечо к CD3)	VH	VL	НС	LC
ТМСВ132	ТМЕВ675	25	28	32	35
CD3B376	652	661	640	676
ТМСВ131	ТМЕВ570	589	29	33	36
CD3B376	652	661	640	676
ТМСВ150	ТМЕВ762	604	607	614	615
CD3B376	652	661	640	676

7.7. Определение характеристик биспецифических антител к TMEFF2xCD3 Анализ чистоты методом аналитического ультрацентрифугирования (AUC).

Аналитическое ультрацентрифугирование (AUC) позволяет определить размер, форму, состояние агрегации и обратимое взаимодействие макромолекул в растворе. Скорость осаждения (SV) представляет собой методику AUC, позволяющую перевести градиент концентрации макромолекулы к внешнему радиусу держателя образца (клетки) при вращении центрифуги. Это позволяет определять коэффициент осаждения, который является фактором размера и формы молекулы, а также является уникальным для каждой молекулы. Для этой цели использовали прибор Beckman Optima AUC. Образцы загружали в ячейки центрифуги, оснащенные сердцевинами Beckman 1,2 см (с номинальным интервалом 50 тыс. об/мин) и кварцевыми окошками. Клетки собирали и вращали до 130 фунтов. Клетки центрифуги помещали в ротор An-50 (отверстие 8) или An-60 (отверстие 4) и помещали в камеру AUC. Перед началом пробега температуру AUC уравновешивали до 20,5°С в течение по меньшей мере 1 ч с помощью ротора в камере. Анализ проводили при 40 тыс. об/мин для образца мкАт со счетчиком сканирований (250 сканирований), частотой сбора данных (90 с), разрешением данных (10 мкМ), длиной волны 280 нМ. Данные анализировали с помощью программного обеспечения для прямого подбора границ SEDANAL. Измеряли чистоту биспецифического антитела ТМСВ150 и его исходных мкАт. ТМСВ150 продемонстрировало наличие 97,1% мономера, 2,8% димерного мономера и отсутствие агрегации, что установлено по AUC, удовлетворяющей приемлемым критериям для временно экспрессируемого исследуемого материала для дополнительной биофизической характеристики. ТМЕВ762 продемонстрировало содержание мономера 95,5%, димера 4,5% и отсутствие агрегации, тогда как CD3B376 продемонстрировало содержание мономера 97,7% и димера 2,2% без агрегации. Уровни агрегатов, составляющие >5% минимальной двухстадийной очищенной молекулы, могут оказывать значительное влияние на биологическую активность, растворимость, стабильность и срок хранения.

- 151 045935

Конформационная стабильность биспецифических антител к TMEFF2/CD3 по результатам ДСК.

Тепловое разворачивание ТМСВ150 определяли с помощью ДСК (дифференциальной сканирующей калориметрии), показывающей начало разворачивания Тш=52,6°С, первый тепловой переход (Tm1) при 61,8°С, второй тепловой переход (Tm2) при 67,6°С и третий тепловой переход (Tm3) при 75,5°С. На основании профиля теплового перехода в исходное антитело (антитело к TMEFF2, ТМЕВ762 и антитело к CD3, CD3B376), который оценивается с помощью ДСК до, Tm1 в ТМСВ150 соответствует разворачиванию FAB CD3B376, а Tm3 в ТМСВ150 соответствует переходам разворачивания Fab TMEB762.

Стабильность в сыворотке.

Разрабатывается анализ стабильности в сыворотке для оценки свойств лидерных кандидатов на неспецифическое или нецелевое связывание с компонентами сыворотки человека. Это может спрогнозировать плохие фармакокинетические свойства и свойства биораспределения. Связывание и стабильность ТМСВ150 оценивают как в буфере, так и в человеческой сыворотке с использованием способа флуоресцентной хроматографии. Биспецифическое антитело метили конъюгатом Alexa Fluor 488 (Invitrogen kit в соответствии с инструкциями производителя), инкубировали в буфере Hepes и человеческой сыворотке (Sigma, кат. № Н4522) при 4 и 37°С в течение 2 дней, а затем анализировали посредством эксклюзионной ВЭЖХ с использованием системы для ВЭЖХ Agilent, оснащенной флуоресцентным детектором. Процент агрегатов рассчитывают по суммарной площади под кривой каждого пика. ТМСВ150 продемонстрировало агрегацию 2,4% в буфере Hepes в нулевой момент времени и агрегацию 2,0 и 1,3% через двое суток при 4 и 37°С соответственно. В человеческой сыворотке ТМСВ150 продемонстрировало агрегацию 1,7% в нулевой момент времени и агрегацию 1,1% через двое суток при 4 и 37°С.

Неспецифическое связывание.

Неспецифическое связывание лидерной молекулы с неродственными поверхностями определяется с помощью биосенсорной технологии (Biacore 8 K). Антитело пропускают через поверхности ППР, покрытые неродственными белками. Если антитело проявляет существенное связывание с данными нерелевантными поверхностями, предполагается, что оно будет иметь слабые свойства in vivo и вызывать проблемы при производстве. Лидерная молекула тестируется в конечной концентрации 1 мкМ. К нерелевантным поверхностям относятся отрицательно заряженный белок (ингибитор соевого трипсина), положительно заряженный белок (лизоцим и β-дефензин), гидрофобный (Rh-интегрин а4b7), человеческий IgG, липкий белок (Rh-CD19). В данном эксперименте использовали надлежащие контроли. Лидерная молекула течет по двум поверхностям: одна является немодифицированной, а другая имеет непосредственно иммобилизованную молекулу. Уровень единицы ответа (RU) определяют путем вычитания RU немодифицированной поверхности из RU исследуемой поверхности. RU ТМСВ150 и исходных мкАт приведены ниже в таблице. Единица ответа>100 прогнозирует высокий риск неспецифического связывания с заряженными/гидрофобными поверхностями/поверхностями IgG, которые могут создавать проблемы при производстве и преобразовывать в плохие ФК свойства. Ни одно из антител не демонстрирует неспецифического связывания с нерелевантными поверхностями, прогнозирующими низкий риск производства и in vivo.

Таблица 65

	STI	вдефензин3	IgG человека	Лизоци м	rh-интегрин а4Ь7	rh-CD19
ТМСВ1 50	1,6	6,4	7,5	4,2	0	3,4
ТМЕВ7 62	0	4,1	8,4	4,6	0	3,3
CD3B37 6	19,5	3,1	0,4	0,2	0	0

Стабильность при высокой концентрации.

Многие моноклональные антитела готовят в высокой концентрации (>100 мг/мл) для уменьшения объема инъекции для облегчения подкожного введения. Кроме того, во время процесса очистки все моноклональные антитела подвергают воздействию временно высоких концентраций (>50 мг/мл). Следовательно, стабильность при высокой концентрации является критическим свойством качества этих молекул. Концентрирование проводят с использованием центрифужных ультрафильтрационных аппаратах с мембранами MWCO 30 кДа. От 5,1 до 5,3 мг каждого белка сначала разводили до той же исходной концентрации и центрифугировали при 4000xg с 15-минутными интервалами. В конце каждой стадии центрифугирования в течение 15 мин концентраторы извлекают из центрифуги и регистрируют визуальную оценку оставшегося объема образца.

Концентрацию измеряют с помощью прибора SoloVPE. Концентрированные образцы инкубировали при 4 и 40°С в течение 2 недель, отбирали аликвоты с временными интервалами для проверки

- 152 045935 целостности с помощью аналитической SEC. TMCB150 и исходные мкАт (CD3B376 и ТМЕВ762) концентрировались нормально. Конечная концентрация ТМСВ150 составляла 99,4 мг/мл, а конечная концентрация исходных мкАт составляла 52,2 мг/мл (ТМЕВ762) и 52,6 мг/мл (CD3B376). Концентрация оставалась одинаковой в течение 2 недель при 4 и 40°С, что указывает на то, что молекулы обладают хорошими собственными свойствами без возможности агрегации или адсорбции в пробирках Eppendorf. % видов (А: Агрегат; М: Мономер; F: Фрагмент), измеренный по сумме пиков SEC, представлен ниже в таблице. При высокой концентрации молекулы интактны и содержат 4-5% агрегатов и <0,3% фрагментов после хранения в течение 2 недель при 40°С, что прогнозирует хороший срок хранения.

Таблица 66

	Начальный момент	2 недели, 4 °C	2 недели, 40 °C
А	м	F	А	М	F	А	м	F
ТМСВ150	0,8	99,2	0	1,4	98,6	0	3,6	96,1	0,3
ТМЕВ762	2,5	97,5	0	2,7	97,3	0	3,1	96,9	0
CD3B376	1,1	98,9	0	2,5	97,5	0	5,1	94,7	0,2

Определение аффинности биспецифического антитела к TMEFF2/CD3 с помощью кинетического эксклюзионного анализа (KinExA).

Для измерения в растворе равновесной аффинности K_D биспецифического мкАт ТМСВ150 и его двухвалентного исходного мкАт TMEFF2 ТМЕВ762 к внеклеточному домену (ВКД) использовали прибор KinExA 3200 (Sapidyne Instruments, Inc.). Готовили последовательные разведения человеческого внеклеточного домена (ВКД) TMEFF2 с постоянной концентрацией мкАт к TMEFF2 в 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCL, 0,05% поверхностно-активного вещества Р20, рН 7,4, 0,1% BSA и 0,02% NaN3. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре до достижения равновесия на основе связывающих взаимодействий. Продолжительность инкубации определяли с помощью моделирования программного обеспечения KinExA. Гранулы получали путем прямой ковалентной иммобилизации ТМН1Т2-ВКД путем аминного связывания на предварительно активированных гранулах, состоящих из сополимера бис-акриламид/азолактон (Pierce Biotechnology, Inc.). После инкубации образцы анализировали на приборе KinExA для оценки свободного антитела в смеси путем пропускания смеси через модифицированные TMEFF2 гранулы и обнаружения захваченного антитела с использованием вторичного антитела с флуоресцентной меткой. Данные аппроксимировали с моделью связывания 1:1 с использованием программного обеспечения KinExA Pro.

Таблица 67

образец мкАт	K_D, пМ	95% ДИ, K_D, пМ
ТМСВ150	63,6	55,8-71,9
ТМЕВ762	46,1	38,0-55,1

Измерение аффинности связывания биспецифического антитела к TMEFF2/CD3 с N-концевым пептидом CD3s.

Константы кинетической скорости измеряли методом ППР, выполненные на биосенсорных поверхностях Biacore 8 K (GE Healthcare) и антител к человеческому Fc. Антитела к человеческому иммуноглобулину ковалентно связывали с поверхностью сенсорного чипа СМ4 (GE Healthcare). Представляющие интерес антитела захватывали сенсорным чипом иммуноглобулина человека с последующей инъекцией N-концевого пептида CD3s в различных концентрациях в буферный раствор HEPES, содержащий 0,05% поверхностно-активного вещества Р20 (Tween™ 20) и 100 мкг/мл BSA. Поверхность регенерировали, вводя 2 инъекции 30 мкл 0,8% фосфорной кислоты со скоростью 100 мкл/мин. Приведенные данные представляют собой разность сигнала SPR между проточной ячейкой, содержащей захваченное антитело и эталонной ячейкой, не содержащей захваченного антитела. Дополнительно погрешность, вносимую прибором в сигнал, устраняли, вычитая данные пустой инъекции из сигнала с вычтенным эталонным сигналом. Данные анализировали, аппроксимируя фазы ассоциации и диссоциации при всех концентрациях (глобальная аппроксимация) моделью связывания 1:1, используя программное обеспечение Biaevaluation (Biacore, Inc.). Данные представлены в виде среднего значения+95% ДИ (доверительный интервал), которое вычисляют по значению t для 95% ДИ* ст. откл./квадрат числа повторов.

Таблица 68

образец мкАт	Средн. Значение k_on(1/М*с)	Средн. Значение k_Off (1/с)	Средн. Значение Kd, нМ	95% ДИ, Kd, пМ
ТМСВ150	3.57Е+04	1.ОЗЕ-ОЗ	28,7	24,4,-34,3
CD3B376	4.33Е+04	1.17Е-03	26,9	21,1,-34,4

- 153 045935

7.8. Биспецифические антитела к TMEFF2xCD3 эффективны для опосредованного Т-клетками уничтожения клеток рака предстательной железы.

Опосредованное Т -клетками уничтожение клеток рака предстательной железы.

Выбранные биспецифические антитела к TMEFF2xCD3 оценивали на их способность опосредовать опосредованное Т-клетками уничтожение раковых клеток предстательной железы.

Опосредованное Т-клетками уничтожение биспецифических антител к TMEFF2xCD3 измеряли с помощью анализа цитотоксичности каспазы, который косвенно измеряет уничтожение клеток посредством расщепления флуоресцентного субстрата активной каспазой 3/7. Расщепление субстрата приводит к образованию флуоресцентного красителя ДНК с флуоресценцией, ограниченной ядром клетки. В каждой лунке на протяжении всего анализа проводят повторные измерения флуоресценции с использованием моторизованного объектива с 10-кратным увеличением, способным точно визуализировать клетку(и) в одних и тех же координатах. Популяции клеток-мишеней идентифицируют на основании определенных ограничений по размеру и/или с применением вторичной метки.

Замороженные пан CD3+ Т-клетки (Biological Specialty Corporation, Кольмар, штат Пенсильвания) выделяли путем отрицательной селекции относительно нормальных здоровых доноров. Клетки рака предстательной железы, экспрессирующие TMEFF2 (LNCaP-AR), культивировали в RPMI 1640 с добавлением 10% HI FBS+добавки (Life Technologies). Т-клетки и клетки-мишени объединяли в соотношении эффектор-мишень (Е:Т) 3:1 в RPMI без фенолового красного+10% FBS и добавки (Life Technologies) без реагентов для селекции и к каждому мл клеток добавляли 0,6 мкл реагента каспаза NucView (Essen Bioscience) в соответствии с рекомендациями производителя. Общий объем клеток составил 0,1 мл в соответствующие лунки прозрачного 96-луночного плоскодонного планшета (BD Falcon). Биспецифические антитела TMEFF2xCD3 получали в 2x конечной концентрации в RPMI без фенолового красного, полученной, как указано выше, и в каждую лунку добавляли по 0,1 мл соединений. После 30 мин инкубации при комнатной температуре для сведения к минимуму агрегации клеток на краю лунок планшеты переносили в прибор Zoom Incucyte (Essen Bioscience), в котором поддерживали температуру 37°С, 5% СО₂.

Для каждой тестируемой клеточной линии были разработаны описания обработки клеток в соответствии с инструкциями производителя. Измерения проводили каждые 6 ч, пока не наблюдалось плато сигнала каспазы, с последующим тремя или более последовательными уменьшениями относительно максимального сигнала в лунке(ах), содержащей (их) самую высокую концентрацию тестируемого(-ых) соединения(ий).

После завершения анализа каждый планшет анализировали с использованием описания соответствующей обработки. Необработанные данные флуоресценции экспортировали с программного обеспечения Incucyte Zoom и вставляли в GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., г. Ла-Холья, штат Калифорния, США). Активность каспазы 3/7 определяли путем вычисления площади под кривой (AUC) для каждой лунки в GraphPad. Значения AUC отображали на графике в виде зависимости от Log10 нМ соединения. ЕС50 для каждой кривой дозы, в наномолях (нМ), регистрировали после нелинейного регрессионного анализа (аппроксимация параметров 4, наименьшие обычные квадраты). Каждый анализ содержал минимум три биологических повторности, и каждую клеточную линию тестировали с использованием Т-клеток от пяти здоровых доноров. Данные дополнительно анализировали с помощью доклинической статистики с использованием нелинейной регрессионной модели.

Биспецифические антитела к TMEFF2xCD3 эффективны в моделях опухолей предстательной железы in vivo.

Выбранные биспецифические антитела исследовали в модели рака предстательной железы LnCaP ex vivo у самцов мышей NSG. Для исследования клетки 10 LnCaP в 50% Cultrex в количестве 0,2 мл/животное вводили путем подкожной инъекции в правый бок на 0 сутки. Животных рандомизировали, когда опухоли достигали объема приблизительно ~100-150 мм³, и на 15 сутки вводили внутрибрюшинно 20⁶ Т-клеток/мышь. В каждой группе было по десять животных. Обработка антителами начиналась через 1-3 суток после инъекции Т-клеток. Антитела вводили внутрибрюшинно дважды в неделю. Перед введением дозы все животные получали IVIG+Fc Block. Объем опухоли и массу тела оценивали дважды в неделю до достижения опухолями ~1200 мм³. Группы лечения приведены в табл. 69. В этих анализах в качестве отрицательного контроля использовали CD3-связывающее плечо и нулевое плечо, которое связывается с gp120 ВИЧ.

- 154 045935

Таблица 69

Группа	Обработка	Доза
1	CD3xNull	5 мг/кг
6	ТМСВ131 (ТМЕВ570 х CD3B376)	5 мг/кг
7	ТМСВ131 (ТМЕВ570 х CD3B376)	0,5 мг/кг
8	ТМСВ132 (ТМЕВ675 х CD3B376)	5 мг/кг
9	ТМСВ132 (ТМЕВ675 х CD3B376)	0,5 мг/кг

В табл. 70 приведен процент ингибирования роста опухоли на 38 сутки в каждой группе после имплантации опухоли.

На фиг. 71 показано уменьшение среднего объема опухоли с течением времени после имплантации опухоли. На фиг. 72 показано уменьшение среднего объема опухоли у каждой мыши, получавшей 0,05, 0,1 или 0,5 мг/кг TMEB762xCD3B376.

Таблица 70

Обработка	% TGI на 38 сутки
CNT07008 (Null х CD3)
ТМСВ132 (ТМЕВ675 х CD3B376), 5 мг/кг	48
ТМСВ132 (ТМЕВ675 х CD3B376), 0,5 мг/кг	47,7
ТМСВ131 (ТМЕВ570 х CD3B376), 5 мг/кг	23,3
ТМСВ131 (ТМЕВ570 х CD3B376), 0,5 мг/кг	35

Эффективность TMEB762xCD3B376 (TMCB150) также оценивали в развившихся ксенотрансплантатах LNCaP у самцов мышей NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1wjl/SzJ (NSG), гуманизированных Т-клетками 20е6. Животных рандомизировали в группы по 10 животных, каждая по среднему объему опухоли на 13 сутки после имплантации опухоли. TMEB762xCD3B376 в дозах 0,5, 0,1 и 0,05 мг/кг или контрольное антитело nullxCD3B376 в дозе 0,5 мг/кг вводили в/б два раза в неделю в течение 5 недель. На 35 сутки после имплантации опухоли, когда по меньшей мере восемь животных оставались в каждой группе, рассчитывали ингибирование роста опухоли (% TGI) по объему опухоли. Статистически значимое ингибирование роста опухоли наблюдали для TMEB762xCD3B376 в дозах 0,5 и 0,1 мг/кг, но не в дозах 0,05 мг/кг по сравнению с контролем nullxCD3 (фиг. 72, р<0,0001). TMEB762xCDB376 при 0,5, 0,1 и 0,05 мг/кг вызывало ингибирование роста опухоли на 110, 88 и 25% соответственно по сравнению с контрольными образцами, получавшими лечение NullxCD3. Лечение TMEB762xCDB376 приводила к семи и трем полным ответам в дозах 0,5 и 0,1 мг/кг соответственно. Подкожные опухоли LNCaP измеряли штангенциркулем два раза в неделю, а результаты представляли в виде среднего объема опухоли (мм³)±СОС (оставались >8 мышей на группу).

Активация Т-клеток в ответ на введение ТМСВ132.

Активацию Т-клеток в клетках рака предстательной железы LnCaP измеряли посредством проточной цитометрии, в частности, путем оценки положительности CD25 Т-клеток CD3+/CD8+ у 6 отдельных нормальных здоровых доноров (9642, 9672, 9762, 9772, 9832, 9852) через 72 ч после лечения ТМСВ132 (фиг. 74). Активацию CD3+ пан-Т-клеток, добавленных в соотношении эффектор: мишень 3:1, наблюдали в ответ на введение ТМСВ132 на клетки рака предстательной железы LnCaP.

Опосредованная Т-клетками цитотоксичность ТМСВ132 in vitro.

Анализ опосредованной Т-клетками цитотоксичности использовали для оценки цитотоксического потенциала ТМСВ132 in vitro с использованием долговременной визуализации на платформе Incucyte. TMCB132 исследовали в TMEFF2-положительной клеточной линии LnCaP в присутствии выделенных пан-человеческих CD3+ Т-клеток от здоровых доноров при соотношении эффектор: мишень (Эффектор: Мишень) (соотношение Е: Т) 3:1. Уничтожение клеток путем апоптоза контролировали путем измерения сигнала флуоресценции для активной каспазы 3/7 в течение 96 ч. ТМСВ132 способствовал дозозависимому снижению жизнеспособных клеток LnCaP с увеличением времени. Дозозависимое увеличение активности каспазы 3/7 или сигнала флуоресценции указывает на гибель клеток LnCaP в присутствии Т-клеток (фиг. 74). Данные демонстрируют, что ТМСВ132 эффективен для индукции опосредованной Т-клетками гибели опухолевых клеток LnCaP.

Эффективность ТМСВ132 в развившемся п/к ксенотрансплантате человеческих клеток предстательной железы у гуманизированных Т-клетками мышей.

Противоопухолевую эффективность ТМСВ132 оценивали в развившихся подкожных (п/к) ксенотрансплантатах человеческих клеток LNCaP у самцов мышей NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1wjl/SzJ (NSG, The Jackson Laboratory, Бар Харбор, штат Мериленд), гуманизированных 20е⁶ Т-клетками. Животных рандомизировали в группы по 10 животных, каждая по среднему объему опухоли на 13 сутки после имплантации опухоли. ТМСВ132 в дозах 0,5, 0,1 и 0,05 мг/кг или контрольное антитело nullxCD3B219 в

- 155 -

Claims

дозе 0,5 мг/кг вводили в/б два раза в неделю в течение 4 недель. На 45 сутки после имплантации опухоли, когда по меньшей мере семь животных оставались в каждой группе, рассчитывали ингибирование роста опухоли (% TGI) по объему опухоли. Статистически значимое ингибирование роста опухоли наблюдали для ТМСВ132 в дозах

0,5 и 0,1 и 0,05 мг/кг по сравнению с контролем nullxCD3 (фиг. 75, р<0,0001). ТМСВ132 в дозах 0,5, 0,1 и 0,05 мг/кг вызывал ингибирование роста опухоли на 102, 109 и 47% соответственно, по сравнению с контрольными образцами, получавшими NullxCD3. Лечение ТМСВ132 привело к получению трех, двух и одного полного ответа при дозах 0,5, 0,1 и 0,05 мг/кг соответственно.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Выделенное рекомбинантное антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее

a) тяжелую цепь, содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR), содержащую SEQ ID NO: 662; HCDR2, содержащую SEQ ID NO: 663; и HCDR3, содержащую SEQ ID NO: 664, и легкую цепь, содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR), содержащую SEQ ID NO: 671; lCdR2, содержащую SEQ ID NO: 673; и LCDR3, содержащую SEQ ID NO: 690;

b) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 652, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 661;

c) тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 640, и легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 676;

d) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 657, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 678; или

e) тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 675, и легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 677.
2. Выделенное рекомбинантное антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, причем выделенное рекомбинантное антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывает CD3d, или CD3e, или CD3e и CD3d Macaca fascicularis или человека с аффинностью связывания около 300 нМ или менее.
3. Выделенное рекомбинантное антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, в котором аффинность связывания составляет около 100 нМ или менее.
4. Выделенное рекомбинантное антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2 или 3, в котором аффинность связывания измеряют с помощью проточной цитометрии или анализа методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием системы ProteOn XPR36 при +25°С.
5. Выделенное рекомбинантное антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому одному из предшествующих пунктов, в котором антитело или антигенсвязывающий фрагмент имеет одно, два, три или четыре из следующих свойств:

а) связывает CD3+ Т-лимфоциты человека и Macaca fascicularis с расчетной ЕС50 300 нМ или менее и связывает клетки HEK, экспрессирующие CD3 Macaca fascicularis, с расчетной ЕС50 300 нМ или менее, причем разница в расчетных ЕС50 между связыванием CD3+ Т-лимфоцитов и связыванием клеток HEK, экспрессирующих CD3 Macaca fascicularis, составляет менее 5 раз, при этом расчетную ЕС50 измеряют в анализе связывания с цельными клетками при 0°С с использованием проточной цитометрии;

b) связывает рекомбинантный CD3d от человека (SEQ ID NO: 691), или связывает рекомбинантный CD3e от человека (SEQ ID NO: 636), или связывает рекомбинантный CD3d от Масаса fascicularis (SEQ ID NO: 692), или связывает рекомбинантный CD3e от Масаса fascicularis (SEQ ID NO: 693) с равновесной константой диссоциации (K_D) 300 нМ или менее, в котором K_D измеряют с помощью анализа методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием системы ProteOn XPR36 при +25°С; или

c) связывает остатки 1-6 CD3e (SEQ ID NO: 636) при определении с помощью рентгеновской кристаллографии.
6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому одному из предшествующих пунктов, содержащее по меньшей мере одну замену в константном домене антитела, причем по меньшей мере одна замена включает

a) замены в тяжелой цепи K409R, F405L или F405L и R409K;

b) замены в тяжелой цепи S228P, F234A и L235A;

c) замены в тяжелой цепи L234A, G237A, P238S, Н268А, А330 и P331S, при этом антитело относится к изотипу IgG1; или

d) замену в тяжелой цепи S228P, при этом антитело относится к изотипу IgG4, в котором нумерация остатков соответствует индексу EU.
7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно.
8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов,

- 156 045935 содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL) с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно.
9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов, содержащее последовательность тяжелой цепи (НС) и последовательность легкой цепи (LC) с SEQ ID NO: 640 и 676 соответственно.
10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, содержащее VH и VL с SEQ ID NO: 657 и 678 соответственно.
11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, содержащее НС и LC с SEQ ID NO: 675 и 677 соответственно.
12. Антитело анти-CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно.
13. Антитело анти-CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее VH и VL с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно.
14. Антитело анти-CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее НС и LC с SEQ ID NO: 640 и 676 соответственно.
15. Антитело анти-CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее VH и VL с SEQ ID NO: 657 и 678 соответственно.
16. Антитело αнти-CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее НС и LC с SEQ ID NO: 675 и 677 соответственно.
17. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из предшествующих пунктов, в котором антитело является человеческим или гуманизированным.
18. Антитело по п. 17, в котором антитело относится к изотипу IgG4 или IgG1.
19. Антитело по п.18, содержащее одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять замен в Fc антитела.
20. Антитело hhtu-CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее НС с SEQ ID NO: 640 и LC с SEQ ID NO: 646, содержащие по меньшей мере одну замену, включающую

a) замены в легкой цепи D43G, L49M, L50I, S62N, Q85E;

b) замены в легкой цепи D43G, V48L, L49M, L50I, S62N, Q85E, H89Y;

c) замены в тяжелой цепи R10G, R13K, V73I, R70K, T83S, L96V;

d) любую одну из замен в легкой цепи D43G, V48L, L49M, L50I, S62N, Q85E или H89Y; или

e) любую одну из замен в тяжелой цепи R10G, R13K, V73I, R79K, T83S или L96V, в котором нумерация остатков соответствует индексу EU.
21. Антитело по любому из предшествующих пунктов, в котором антитело является биспецифическим или мультиспецифическим.
22. Биспецифическое антитело анти-CD3, содержащее первый домен, который специфически связывает CD3, и второй домен, который специфически связывает второй антиген, причем первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 662, 663, 664, 671, 673 и 690 соответственно.
23. Биспецифическое антитело по п.22, в котором первый домен и второй домен относятся к изотипу IgG4, при этом первый или второй домен содержит замены в тяжелой цепи S228P, F234A, L235A, F405L и R409K, а другой домен из первого или второго домена содержит замену в тяжелой цепи S228P, F234A и L235A, причем нумерация остатков соответствует индексу EU.
24. Биспецифическое антитело по п.22, в котором первый и/или второй домен содержит по меньшей мере одну замену в константном домене СН3, содержащем замену F405L или F405L и R409K, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
25. Биспецифическое антитело по п.22, в котором один из первого или второго доменов содержит замену в тяжелой цепи F405L, а другой из первого или второго доменов содержит замену в тяжелой цепи K409R, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
26. Биспецифическое антитело по п.22, в котором первый домен и второй домен относятся к изотипу IgG4, при этом один из первого или второго доменов содержит замену в тяжелой цепи S228P, а другой из первого или второго доменов содержит замены в тяжелой цепи S228P, F405L и R409K, при этом нумерация остатков соответствует индексу EU.
27. Биспецифическое антитело по п.22, в котором первый домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 652 и 661 соответственно.
28. Биспецифическое антитело по п.22, в котором первый домен содержит НС и LC с SEQ ID NO: 640 и 676 соответственно.
29. Биспецифическое антитело по п.22, в котором первый домен содержит VH и VL с SEQ ID NO: 657 и 678 соответственно.
30. Биспецифическое антитело по п.22, в котором первый домен содержит НС и LC с SEQ ID NO: 675 и 677 соответственно.
31. Биспецифическое антитело по п.22, в котором второй антиген представляет собой антиген клеточной поверхности, который экспрессируется на клетке-мишени, отличной от иммунной

- 157 -