RU2420537C2 - Слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин - Google Patents
Слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин Download PDFInfo
- Publication number
- RU2420537C2 RU2420537C2 RU2003125266/10A RU2003125266A RU2420537C2 RU 2420537 C2 RU2420537 C2 RU 2420537C2 RU 2003125266/10 A RU2003125266/10 A RU 2003125266/10A RU 2003125266 A RU2003125266 A RU 2003125266A RU 2420537 C2 RU2420537 C2 RU 2420537C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- immunoglobulin
- cell
- fusion protein
- polypeptide
- cells
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 214
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims description 170
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims description 170
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 121
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 62
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 219
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 207
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 205
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 70
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 claims abstract description 33
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 19
- 208000037914 B-cell disorder Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 7
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims abstract description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims abstract description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 193
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 134
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 132
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 claims description 63
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 claims description 63
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 46
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 42
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 41
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 41
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 41
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 31
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims description 27
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 25
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 25
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 18
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 18
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 15
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 13
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 13
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 11
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 claims description 10
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 8
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 8
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 claims description 7
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 claims description 7
- -1 Gp-100 Proteins 0.000 claims description 6
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 claims description 6
- 208000010928 autoimmune thyroid disease Diseases 0.000 claims description 6
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 claims description 5
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 claims description 5
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 5
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 claims description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 5
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 4
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 4
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 4
- 101000777628 Homo sapiens Leukocyte antigen CD37 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000880770 Homo sapiens Protein SSX2 Proteins 0.000 claims description 4
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 4
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 4
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 claims description 4
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100031586 Leukocyte antigen CD37 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 claims description 4
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims description 3
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 108010060374 FSH Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 208000003807 Graves Disease Diseases 0.000 claims description 3
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 3
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004554 Interleukin-17 Receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010017525 Interleukin-17 Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 3
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 claims description 3
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 3
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 101100067974 Arabidopsis thaliana POP2 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100025218 B-cell differentiation antigen CD72 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102100036008 CD48 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022002 CD59 glycoprotein Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 claims description 2
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100038595 Estrogen receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 101000934359 Homo sapiens B-cell differentiation antigen CD72 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000716130 Homo sapiens CD48 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000897400 Homo sapiens CD59 glycoprotein Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101100118549 Homo sapiens EGFR gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 claims description 2
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934341 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000622304 Homo sapiens Vascular cell adhesion protein 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 2
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 claims description 2
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 claims description 2
- 102100033486 Lymphocyte antigen 75 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710157884 Lymphocyte antigen 75 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025803 Progesterone receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 102100037686 Protein SSX2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100029981 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710100963 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Proteins 0.000 claims description 2
- 101100123851 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HER1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 claims description 2
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims description 2
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 claims description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 claims description 2
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 claims description 2
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 claims description 2
- 108090000468 progesterone receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000064 retinoic acid receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003702 retinoic acid receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 230000036473 myasthenia Effects 0.000 claims 2
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 claims 1
- 102000018343 Follicle stimulating hormone receptors Human genes 0.000 claims 1
- 208000001204 Hashimoto Disease Diseases 0.000 claims 1
- 101000874316 Homo sapiens B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 claims 1
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 claims 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 claims 1
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 claims 1
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 claims 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 claims 1
- 229940124676 vascular endothelial growth factor receptor Drugs 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 29
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 64
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 61
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 59
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 57
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 56
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 50
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 49
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 49
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 32
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 30
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 30
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 29
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 29
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 24
- 230000006870 function Effects 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 23
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 22
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 21
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 20
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 19
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 18
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 17
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 15
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 14
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 14
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 14
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 13
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 12
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 11
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 11
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 11
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 11
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 10
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 9
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 9
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 9
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 8
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 7
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 7
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 6
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 208000028622 Immune thrombocytopenia Diseases 0.000 description 6
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 6
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 6
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 6
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 6
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 6
- 208000031981 Thrombocytopenic Idiopathic Purpura Diseases 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 238000002333 serotherapy Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 239000002585 base Substances 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 5
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 5
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 3
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 3
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 3
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000009177 immunoglobulin therapy Methods 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 3
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000585703 Adelphia <angiosperm> Species 0.000 description 2
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 2
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 2
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010009685 Cholinergic Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100032768 Complement receptor type 2 Human genes 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 2
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 2
- 102100020743 Dipeptidase 1 Human genes 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100027627 Follicle-stimulating hormone receptor Human genes 0.000 description 2
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 2
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000941929 Homo sapiens Complement receptor type 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000998953 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-2 Proteins 0.000 description 2
- 101001008255 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1D-8 Proteins 0.000 description 2
- 101001047628 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2-29 Proteins 0.000 description 2
- 101001008321 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2D-26 Proteins 0.000 description 2
- 101001047619 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3-20 Proteins 0.000 description 2
- 101001008263 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3D-15 Proteins 0.000 description 2
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 2
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 2
- 102100036887 Immunoglobulin heavy variable 1-2 Human genes 0.000 description 2
- 102100022964 Immunoglobulin kappa variable 3-20 Human genes 0.000 description 2
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 239000004166 Lanolin Substances 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108700023219 Phosphoglycerate kinases Proteins 0.000 description 2
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 102000034337 acetylcholine receptors Human genes 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000003200 antithyroid agent Substances 0.000 description 2
- 229940043671 antithyroid preparations Drugs 0.000 description 2
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 201000003872 goiter Diseases 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 2
- 235000019388 lanolin Nutrition 0.000 description 2
- 229940039717 lanolin Drugs 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- VHOGYURTWQBHIL-UHFFFAOYSA-N leflunomide Chemical compound O1N=CC(C(=O)NC=2C=CC(=CC=2)C(F)(F)F)=C1C VHOGYURTWQBHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000681 leflunomide Drugs 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 2
- 238000002616 plasmapheresis Methods 0.000 description 2
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 2
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 235000008979 vitamin B4 Nutrition 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- CJDRUOGAGYHKKD-XMTJACRCSA-N (+)-Ajmaline Natural products O[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H]2[C@@H]3[C@H](O)[C@@]45[C@@H](N(C)c6c4cccc6)[C@@H](N1[C@H]3C5)C2 CJDRUOGAGYHKKD-XMTJACRCSA-N 0.000 description 1
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZGKAASZIMOAMU-UHFFFAOYSA-N 124177-85-1 Chemical compound NP(=O)=O UZGKAASZIMOAMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005274 4-hydroxybenzoic acid group Chemical class 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 1
- 230000024704 B cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010006542 Bulbar palsy Diseases 0.000 description 1
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017987 CD30 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 108010084313 CD58 Antigens Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010007733 Catabolic state Diseases 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 1
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 1
- 244000205754 Colocasia esculenta Species 0.000 description 1
- 235000006481 Colocasia esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101800001467 Envelope glycoprotein E2 Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 101710086299 Fructose-2,6-bisphosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 1
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 1
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 1
- 101001063392 Homo sapiens Lymphocyte function-associated antigen 3 Proteins 0.000 description 1
- 101100495232 Homo sapiens MS4A1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000702617 Human parvovirus B19 Species 0.000 description 1
- 206010020850 Hyperthyroidism Diseases 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102100025947 Insulin-like growth factor II Human genes 0.000 description 1
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010023203 Joint destruction Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 1
- 101710177649 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III Proteins 0.000 description 1
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 102100030984 Lymphocyte function-associated antigen 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 101000969137 Mus musculus Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000014415 Muscarinic acetylcholine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050003473 Muscarinic acetylcholine receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000713883 Myeloproliferative sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N N-ethyl-succinimide Natural products CCN1C(=O)CCC1=O GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091007494 Nucleic acid- binding domains Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108010035004 Prephenate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 108010010974 Proteolipids Proteins 0.000 description 1
- 102000016202 Proteolipids Human genes 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 229940122277 RNA polymerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 1
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000019194 Sorbus aucuparia Species 0.000 description 1
- 241000713896 Spleen necrosis virus Species 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 241000713675 Spumavirus Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 1
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000003911 Thyrotropin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000253 Thyrotropin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100029337 Thyrotropin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102100032100 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 8 Human genes 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 108010013985 adhesion receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000019997 adhesion receptor Human genes 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004727 amygdala Anatomy 0.000 description 1
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003460 anti-nuclear Effects 0.000 description 1
- 230000003356 anti-rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 235000013871 bee wax Nutrition 0.000 description 1
- 239000012166 beeswax Substances 0.000 description 1
- 229940092738 beeswax Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940112129 campath Drugs 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000018631 connective tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000011443 conventional therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012866 crystallographic experiment Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000003532 hypothyroidism Diseases 0.000 description 1
- 230000002989 hypothyroidism Effects 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000006749 inflammatory damage Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007915 intraurethral administration Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 229940042472 mineral oil Drugs 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 231100000324 minimal toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 description 1
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001293 nucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 101150110245 ompC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150073640 ompF gene Proteins 0.000 description 1
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000006201 parenteral dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 108010089520 pol Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229940068917 polyethylene glycols Drugs 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 210000001948 pro-b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 201000002241 progressive bulbar palsy Diseases 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000009712 regulation of translation Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000003307 reticuloendothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000006414 serbal de cazadores Nutrition 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- 229960003885 sodium benzoate Drugs 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 108040006218 thyroid-stimulating hormone receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 150000003710 vitamin D derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Abstract
Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложен слитый белок, содержащий от аминоконца к карбоксильному концу: полипептид связывающего домена, который связывается с биологической молекулой-мишенью; пептид шарнирной области IgG1 человека с одним цистеином; полипептид константной области СН2 тяжелой цепи иммуноглобулина и полипептид константной области СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина. Слитый белок представляет собой смесь мономеров и димеров, имеет ADCC, CDC или оба вида цитотоксичности. Описаны также фармкомпозиция и способ лечения В-клеточного расстройства с использованием слитого белка. Использование изобретения может найти дальнейшее применение в медицине при лечении В-клеточных расстройств. 3 н. и 23 з.п. ф-лы, 27 ил.
Description
ПРЕДПОСЫЛКА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение, в общем, относится к иммунологически активным рекомбинантным связывающим белкам и, в частности, к сконструированным молекулам слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин, включая слитые белки одноцепочечный Fv-иммуноглобулин. Данное изобретение также относится к композициям и способам лечения злокачественных состояний и В-клеточных нарушений, включая заболевания, для которых характерна продукция аутоантител.
Молекула иммуноглобулина состоит из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, которые связаны в макромолекулярный комплекс межцепочечными дисульфидными связями. Внутрицепочечные дисульфидные связи связывают различные области одной и той же полипептидной цепи, и это приводит к образованию петель, которые вместе с расположенными рядом аминокислотами образуют домены иммуноглобулина. Каждая легкая цепь и каждая тяжелая цепь имеет одну вариабельную область, которая проявляет значительную изменчивость аминокислотного состава от антитела к антителу. Вариабельная область легкой цепи, VL, связана с вариабельной областью тяжелой цепи, VH, образуя антигенсвязывающий сайт иммуноглобулина, Fv. Легкие цепи имеют один домен константной области, а тяжелые цепи имеют несколько доменов константной области. Классы IgG, IgA и IgE имеют три домена константной области, которые обозначены CH1, CH2 и CH3, а классы IgM и IgE имеют четыре домена константной области.
Тяжелые цепи иммуноглобулинов можно разделить на три функциональные области: Fd, шарнир и Fc. Область Fd содержит домены VH и CH1 и вместе с легкой цепью образует Fab. Обычно считают, что фрагмент Fc отвечает за эффекторные функции иммуноглобулина, такие как фиксация комплемента и связывание с Fc-рецепторами. Шарнирная область, выявленная в классах IgG, IgA и IgD, действует как гибкий спейсер, позволяя Fab-части свободно перемещаться в пространстве. В отличие от константных областей шарнирные домены разнообразны по структуре, и варьируют как по последовательности, так и по длине среди классов и подклассов иммуноглобулинов. Например, три подкласса IgG человека, IgG1, IgG2 и IgG4, имеют шарнирные области из 12-15 аминокислот, тогда как IgG3 содержит примерно 62 аминокислоты, включая 21 остаток пролина и 11 остатков цистеина. Согласно кристаллографическим исследованиям шарнир, кроме того, можно функционально подразделить на три области: верхний шарнир, центральная часть и нижний шарнир (Shin et al., Immunological Reviews 130: 87 (1992)). Верхний шарнир включает в себя аминокислоты от карбоксильного конца CH1 до первого остатка в шарнире, который ограничивает движение, как правило, до первого остатка цистеина, который образует межцепочечную дисульфидную связь между двумя тяжелыми цепями. Длина верхней шарнирной области коррелирует с гибкостью участков антитела. Центральная шарнирная область содержит дисульфидные мостики внутри тяжелых цепей, и нижняя шарнирная область связана с аминоконцом домена CH2 и включает в себя остатки в CH2 (там же). Центральная шарнирная область IgG1 человека содержит последовательность Cys-Pro-Pro-Cys, которая при образовании дисульфидных связей дает циклический октапептид, предположительно действующий как точка поворота, придавая таким образом гибкость. Шарнирная область также может содержать сайты присоединения углеводов. Например, IgA1 содержит пять сайтов для углеводов в пределах участка шарнирной области из 17 аминокислот, придавая шарниру исключительную устойчивость к протеазам кишечника, что считается свойством, дающим преимущество секретируемому иммуноглобулину.
Конформационные изменения, допускаемые структурой и гибкостью шарнирной области, могут влиять на эффекторные функции Fc-части антитела. Три основных категории эффекторных функций, связанных с Fc-областью, включают (1) активацию классического каскада комплемента, (2) взаимодействие с эффекторными клетками и (3) компартментализацию иммуноглобулинов. Различные подклассы IgG человека варьируют по своей относительной эффективности в активации и усилении стадий каскада комплемента. В общем, IgG1 и IgG3 наиболее эффективно фиксируют комплемент, IgG2 менее эффективен и IgG4 не активирует комплемент. Активация комплемента инициируется связыванием C1q, субъединицы первого компонента C1 в каскаде, с комплексом антиген-антитело. Хотя сайт связывания C1q локализован в CH2-домене антитела, шарнирная область влияет на способность антитела активировать каскад. Например, рекомбинантные иммуноглобулины, в которых отсутствует шарнирная область, не способны активировать комплемент (там же). В отсутствии гибкости, придаваемой шарнирной областью, Fab-часть антитела, связанная с антигеном, не способна принимать конформацию, необходимую для того, чтобы дать возможность C1q связаться с CH2 (смотри там же). Исследования показали, что длина шарнира и гибкость участков коррелирует с активацией комплемента; однако корреляция не является абсолютной. Молекулы IgG3 человека с измененными шарнирными областями, которые являются такими же негибкими, как IgG4, все еще эффективно активируют каскад.
Отсутствие шарнирной области также влияет на способность IgG-иммуноглобулинов человека связываться с рецепторами Fc на иммунных эффекторных клетках. Связывание иммуноглобулина с рецептором Fc способствует зависимой от антител клеточной цитотоксичности (ADCC), которая предположительно является важным способом элиминации опухолевых клеток. Семейство рецепторов Fc IgG человека делится на три группы, FcγRI (CD64), который способен с высокой аффинностью связывать IgG, FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16), которые оба являются низкоаффинными рецепторами. Молекулярное взаимодействие между каждым из трех рецепторов и иммуноглобулином точно не установлено, но эксперименты свидетельствуют о том, что остатки в проксимальной по отношению к шарниру области домена CH2 имеют важное значение для специфичности взаимодействия между антителом и рецептором Fc. Кроме того, белки IgG1 миеломы и рекомбинантные химерные IgG3-антитела, в которых отсутствует шарнирная область, не способны связывать FcγRI, вероятно, вследствие того, что снижена доступность к CH2 (Shin et al., Intern. Rev. Immunol. 10: 177, 178-79 (1993)).
Технология моноклональных антител и генно-инженерные способы привели к быстрой разработке молекул иммуноглобулинов для диагностики и лечения заболеваний человека. Конструирование белков применяли для повышения аффинности антитела по отношению к узнаваемому им антигену, чтобы уменьшить проблемы, связанные с иммуногенностью, и чтобы изменить эффекторные функции антитела. Доменная структура иммуноглобулинов поддается конструированию, при котором можно произвести обмен антигенсвязывающими доменами и доменами, придающими эффекторные функции, между классами и подклассами иммуноглобулинов.
Кроме того, сконструированы меньшие по размеру молекулы иммуноглобулинов, чтобы преодолеть проблемы, связанные с терапией на основе целых иммуноглобулинов. Одноцепочечные Fv (scFv) содержат вариабельный домен тяжелой цепи, связанный посредством короткого линкерного пептида с вариабельным доменом легкой цепи (Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-83, 1988). Вследствие небольшого размера молекул scFv наблюдается очень быстрый клиренс их из плазмы и тканей и более эффективное проникновение в ткани, чем целого иммуноглобулина. Антиопухолевые scFv показали более быстрое проникновение в опухоль и более равномерное распределение в массе опухоли, чем соответствующее химерное антитело (Yokota et al., Cancer Res. 52, 3402-08 (1992)). Слияние scFv с другой молекулой, такой как токсин, обладает преимуществом специфичной антигенсвязывающей активности и небольшого размера scFv для доставки токсина в ткань-мишень (Chaudary et al., Nature 339: 394 (1989); Batra et al., Mol. Cell. Biol. 11: 2200 (1991)).
Несмотря на преимущества, которые приносят молекулы scFv для серотерапии, существует несколько недостатков данного терапевтического подхода. Хотя быстрый клиренс scFv может снижать токсические эффекты в нормальных клетках, такой быстрый клиренс может препятствовать доставке минимальной эффективной дозы в ткань-мишень. Производство адекватных количеств scFv для введения пациентам явилось сложной задачей вследствие трудностей, связанных с экспрессией и выделением scFv, которые неблагоприятно влияют на выход. Во время экспрессии молекулы scFv нестабильны и часто агрегируют в результате спаривания вариабельных областей из разных молекул. Кроме того, уровни продукции молекул scFv в экспрессирующих системах млекопитающих низкие, что ограничивает возможность эффективного производства молекул scFv для терапии (Davis et al., J. Biol. Chem. 265: 10410-18 (1990); Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-59 (1991)). Выявлены методики повышения продукции, включающие добавление сайтов гликозилирования к вариабельным областям (Jost, C. R. Патент США №5888773, Jost et al., J. Biol. Chem. 269: 26267-73 (1994)).
Конъюгирование или слияние токсинов с scFv дает очень эффективную молекулу, но дозирование ограничено токсичностью, обусловленной молекулой токсина. Токсические воздействия включают повышение уровней ферментов печени и синдром заменения проницаемости сосудов. Кроме того, иммунотоксины являются высоко иммуногенными и антитела хозяина, вырабатываемые против токсина, ограничивают возможность повторного лечения.
Дополнительным недостатком использования scFv для терапии является отсутствие эффекторной функции. scFv при отсутствии цитолитических функций, ADCC и зависимой от комплемента цитотоксичности (CDC), связанных с константной областью иммуноглобулина, могут быть неэффективными при лечении заболевания. Хотя разработка методики scFv начата 12 лет назад, в настоящее время нет scFv-продуктов, одобренных для терапии.
Преимущество эффекторных функций, связанных с константной областью антитела, для лечения заболевания побудило к разработке слитых белков, в которых неиммуноглобулиновые последовательности заменяют вариабельной областью антитела. Например, CD4, поверхностный белок T-клеток, распознаваемый HIV, рекомбинантным способом сливали с эффекторным доменом Fc иммуноглобулина (Смотри Sensel et al., Chem. Immunol. 65: 129-158 (1997)). Биологическая активность такой молекулы отчасти будет зависеть от класса и подкласса выбранной константной области. Слитый белок IL-2-IgG1 влиял на опосредованный комплементом лизис клеток, несущих рецептор IL-2 (Смотри там же). Применение константных областей иммуноглобулинов для конструирования указанных и других слитых белков также может придавать улучшенные фармакокинетические свойства.
Заболевания и расстройства, которые, как считают, поддаются некоторым типам иммуноглобулиновой терапии, включают рак и расстройства иммунной системы. Рак включает широкий круг заболеваний, поражающих примерно одного из четырех людей во всем мире. Быстрая и неконтролируемая пролиферация злокачественных клеток является признаком многих типов злокачественных опухолей, включая гематологические злокачественные образования. Наибольшую пользу достижения в области терапии злокачественных опухолей в последние два десятилетия принесли пациентам с гематологическим злокачественным состоянием (Multani et al., J. Clin. Oncology 16: 3691-3710, 1998). Хотя возросла доля ремиссий, у большинства пациентов еще возникают рецидивы и они умирают из-за болезни. Препятствия для лечения цитотоксическими лекарственными средствами включают резистентность опухолевых клеток и высокую токсичность химиотерапии, которые мешают оптимальному дозированию для многих пациентов. Новые способы лечения, основанные на том, чтобы направлять к мишени молекулы, которые специфично связываются со злокачественной клеткой, включая моноклональные антитела (мАт), которые повышают эффективность, не увеличивая токсичность.
С тех пор как в 1975 году впервые были описаны мАт (Kohler et al., Nature 256: 495-97 (1975)), многие пациенты подверглись лечению мАт к антигенам, экспрессируемым на опухолевых клетках. Указанные исследования принесли важный опыт, касающийся выбора антигенных мишеней, подходящих для терапии. Во-первых, и наиболее важно, антигенная мишень не должна экспрессироваться важными нормальными тканями. К счастью злокачественные клетки крови экспрессируют много антигенов, которые не экспрессируются стволовыми клетками или другими жизненно важными клетками. Лечение гематологического злокачественного состояния, которое истощает популяции как нормальных, так и злокачественных клеток гематологического происхождения, приемлемо, так как после окончания терапии происходит регенерация нормальных клеток из предшественников. Во-вторых, антигенная мишень должна экспрессироваться на всех клоногенных популяциях опухолевых клеток, и экспрессия должна продолжаться, несмотря на избирательное давление иммуноглобулиновой терапии. Таким образом, выбор поверхностного идиотипа для терапии В-клеточной злокачественности ограничен ростом вариантов опухолевых клеток с измененной экспрессией поверхностных идиотипов, даже если антиген проявляет высокую степень избирательности по отношению к опухоли (Meeker et al., N. Engl. J. Med. 312: 1658-65 (1985)). В-третьих, выбранный антиген должен правильным образом перемещаться после связывания с ним иммуноглобулина. Сброс или интернализация антигенной мишени после того, как иммуноглобулин связывается с антигеном, может давать опухолевым клеткам возможность избежать разрушения, ограничивая таким образом эффективность серотерапии. В-четвертых, результатом связывания иммуноглобулина с антигенными мишенями, которые передают сигналы активации, могут быть усиленные функциональные ответы в опухолевых клетках, которые приводят к остановке роста и апоптозу. Хотя важны все указанные свойства, запуск апоптоза после связывания иммуноглобулина с антигеном может быть критическим фактором достижения успешной серотерапии.
Антигены, которые были тестированы в качестве мишеней для серотерапии B- и T-клеточных злокачественных опухолей, включают идиотип Ig (Brown et al., Blood 73: 651-61 (1989)), CD19 (Hekman et al., Cancer Immunol. Immunother. 32: 364-72 (1991); Vlasveld et al., Cancer Immunol. Immunother. 40: 37-47 (1995)), CD20 (Press et al., Blood 69: 584-91 (1987); Maloney et al., J. Clin. Oncol. 15: 3266-74, (1997)), CD21 (Scheinberg et. al., J. Clin. Oncol. 8: 792-803, (1990)), CD5 (Dillman et al., J. Biol. Respn. Mod. 5: 394-410 (1986)) и CD52 (CAMPATH) (Pawson et al., J. Clin. Oncol. 15: 2667-72, (1997)). Из них наибольшего успеха достигли с использованием CD20 в качестве мишени для терапии B-клеточных лимфом. Каждая из других мишеней была ограничена биологическими свойствами антигена. Например, поверхностный идиотип может быть изменен соматической мутацией, обеспечивающей спасение опухолевой клетки. CD5, CD21 и CD19 быстро интернализуются после связывания мАт, позволяя опухолевым клеткам избежать разрушения, если мАт не конъюгированы с токсичными молекулами. CD22 экспрессируется только на подгруппе В-клеточных лимфом, тогда как CD52 экспрессируется как на T-клетках, так и на B-клетках и вызывает иммуносупрессию из-за истощения популяции Т-клеток.
CD20 удовлетворяет описанным выше критериям для выбора подходящей антигенной мишени для терапии B-клеточного злокачественного состояния. Лечение пациентов с В-клеточной лимфомой низкой степени злокачественности или фолликулярной В-клеточной лимфомой с использованием химерного CD20-мАт индуцирует частичные или полные реакции у многих пациентов (McLaughlin et al., Blood 88: 90a (abstract, suppl. 1) (1996); Maloney et al., Blood 90: 2188-95 (1997)). Однако обычно происходит рецидив опухоли в течение периода времени от шести месяцев до одного года. Таким образом, необходимы дальнейшие усовершенствования серотерапии, чтобы индуцировать более продолжительные реакции при B-клеточной лимфоме низкой степени злокачественности и обеспечить возможность эффективного лечения лимфомы высокой степени злокачественности и других В-клеточных заболеваний.
Одним из подходов к улучшению серотерапии CD20 была целенаправленная доставка радиоизотопов к B-клеточным лимфомам с использованием мАт, специфичных по отношению к CD20. Хотя увеличивается эффективность терапии, также увеличивается связанная с этим токсичность из-за длительного периода полужизни радиоактивного антитела in vivo, иногда требующая того, чтобы подвергнуть пациента процедуре спасения стволовых клеток (Press et al., N. Eng. J. Med. 329: 1219-1224, 1993; Kaminski et al., N. Eng. J. Med. 329: 459-65 (1993)). мАт к CD20 расщепляли протеазами, получая фрагменты F(ab')2 или Fab до связывания с радиоизотопом. Это повышало проникновение радиоизотопного конъюгата в опухоль и укорачивало время полужизни in vivo, уменьшая таким образом токсичность по отношению к нормальным тканям. Однако теряются преимущества эффекторных функций, включая фиксацию комплемента и ADCC, которые обеспечивает Fc-область CD20-мАт.Таким образом, для улучшенной доставки радиоизотопов необходима методика получения производного CD20-мАт, которое сохраняет Fc-зависимые эффекторные функции, но меньше по размеру, тем самым усиливая проникновение в опухоль и укорачивая время полужизни мАт.
CD20 была первой поверхностной молекулой человека, специфичной для B-клеточной линии, идентифицированной с помощью моноклонального антитела, но функция CD20 в биологии B-клеток еще не полностью выяснена. CD20 является негликозилированным гидрофобным фосфопротеином с М.м. 35 кД, амино- и карбоксильный концы которого расположены в цитоплазме (Einfeld et al., EMBO J. 7: 711-17 (1988)). Природные лиганды CD20 идентифицированы не были. CD20 экспрессируется всеми нормальными зрелыми B-клетками, но не экспрессируется предшественниками B-клеток.
CD20-мАт доставляют сигналы к нормальным B-клеткам, которые влияют на жизнеспособность и рост (Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494-98 (1986)). Недавние данные показали, что обширное сшивание CD20 могут индуцировать апоптоз линий клеток В-клеточной лимфомы (Shan et al., Blood 91: 1644-52 (1998)). Сшивание CD20 на поверхности клеток увеличивает значение и кинетику сигнальной трансдукции, которые регистрировали измерением фосфорилирования клеточных субстратов по остаткам тирозина (Deans et al., J. Immunol. 146: 846-53 (1993)). Важно, что апоптоз B-клеток лимфомы Рамоса так же индуцировался сшиванием CD20-мАт при добавлении клеток, позитивных в отношении Fc-рецептора (Shan et al., Blood 91: 1644-52 (1998)). Таким образом, кроме истощения популяции клеток посредством механизмов на основе комплемента и ADCC связывание Fc-рецептора CD20-мАт in vivo может стимулировать апоптоз злокачественных B-клеток посредством сшивания CD20. Данная теория согласуется с экспериментами, показывающими, что эффективность терапии с помощью CD20 человеческой лимфомы в модели на мышах SCID зависела от связывания Fc-рецептора мАт к CD20 (Funakoshi et al., J. Immunotherapy 19: 93-101 (1996)).
Полипептид CD20 содержит четыре трансмембранных домена (Einfeld et al., EMBO J. 7: 711-17, (1988); Stamenkovic et al., J. Exp.Med. 167: 1975-80 (1988); Tedder et al., J. Immunol. 141: 4388-4394 (1988)). Множественные домены, проходящие в мембране, предотвращают интернализацию CD20 после связывания с антителом. Указанное качество CD20 признано важным свойством для эффективной терапии В-клеточных злокачественных опухолей, когда мышиные CD20-мАт, 1F5, инъецировали пациентам с B-клеточной лимфомой, что приводило к значительному истощению популяции злокачественных клеток и частичным клиническим ответам (Press et al., Blood 69: 584-91 (1987)).
Поскольку нормальные зрелые B-клетки так же экспрессируют CD20, популяция нормальных B-клеток истощается во время терапии CD20-антителом (Reff M. E. et al., Blood 83: 435-445, 1994). Однако после завершения лечения нормальные B-клетки восстанавливаются из CD20-негативных предшественников B-клеток; таким образом, пациенты, которых лечили с помощью анти-CD20-терапии, не испытывают значительной иммуносупрессии. Истощение популяции нормальных B-клеток может быть полезным при заболеваниях, в которые вовлечена несвойственная продукция аутоантител, или других заболеваниях, в которых могут играть роль B-клетки. Химерное мАт, специфичное по отношению к CD20, состоящее из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей мышиного происхождения, слитых с константными областями тяжелой цепи IgG1 человека и легкой каппа-цепи человека, сохраняют способность связываться с CD20 и опосредовать ADCC и фиксировать комплемент (Liu et al., J. Immunol. 139: 3521-26 (1987); Robinson et al., патент США No. 5500362). Указанная работа привела к разработке химерного CD20-мАт, ритуксимаба (RituximabTM), недавно одобренного Управлением по пищевым продуктам и медикаментам США (FDA) для лечения B-клеточных лимфом. Хотя после лечения ритуксимабом клинические ответы наблюдаются с высокой частотой, у пациентов часто возникают рецидивы примерно через 6-12 месяцев.
Для внутривенной инфузии требуются высокие дозы ритуксимаба, поскольку молекула является крупной, примерно 150 кД, и диффузия в лимфоидные ткани, где находится много опухолевых клеток, ограничена. Считают, что механизм противоопухолевой активности ритуксимаба заключается в комбинировании нескольких активностей, включая ADCC, фиксацию комплемента и запускание сигналов в злокачественных B-клетках, которые стимулируют апоптоз. Большой размер ритуксимаба препятствует оптимальной диффузии молекулы в лимфоидные ткани, которые содержат злокачественные B-клетки, тем самым ограничивая указанные противоопухолевые активности. Как обсуждалось выше, расщепление CD20-мАт протеазами на Fab- или F(ab')2-фрагменты делает их меньшего размера и позволяет лучше проникать в лимфоидные ткани, но эффекторные функции, важные для противоопухолевой активности, теряются. Хотя фрагменты CD20-мАт могут быть более эффективными для доставки радиоизотопов, чем интактное антитело, желательным было бы конструирование производного CD20-мАт, которое сохраняет эффекторные функции Fc-части, но меньше по размеру, способствуя лучшему проникновению в опухоли и характеризуясь более коротким временем полужизни.
CD20 экспрессируется злокачественными клетками B-клеточной природы, включая B-клеточную лимфому и хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL). CD20 не экспрессируется злокачественными опухолями пре-B-клеток, такими как острый лимфобластный лейкоз. Таким образом, CD20 является хорошей мишенью для терапии B-клеточной лимфомы, CLL и других заболеваний, при которых B-клетки вовлечены в активность заболевания. Другие B-клеточные расстройства включают аутоиммунные заболевания, при которых продуцируются аутоантитела во время дифференцировки B-клеток в плазматические клетки. Примеры B-клеточных расстройств включают аутоиммунное заболевание щитовидной железы, включая болезнь Грейвса и тиреоидит Хашимото, ревматоидный артрит, системную красную волчанку (СКВ), синдром Шегрена, иммунную тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), рассеянный склероз (MS), миастению (MG), псориаз, склеродерму и воспалительное заболевание кишечника, включая болезнь Крона и язвенный колит.
Из сказанного выше очевидна явная необходимость усовершенствования композиций и способов лечения злокачественных состояний и B-клеточных расстройств. Композиции и способы согласно данному изобретению преодолевают ограничения предшествующего уровня техники, предоставляя слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, содержащий полипептид связывающего домена, который слит с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, который слит с полипептидом константной области CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина, слитым с полипептидом константной области CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин способен опосредовать ADCC или фиксацию комплемента. Кроме того, композиции и способы обеспечивают другие связанные преимущества.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Аспектом данного изобретения является получение слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин, содержащего (a) полипептид связывающего домена, который слит с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, где указанный полипептид шарнирной области выбран из группы, состоящей из (i) мутантного полипептида шарнирной области, который не содержит остатков цистеина и который получен из полипептида шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, имеющего один или более остатков цистеина, (ii) мутантного полипептида шарнирной области, который содержит один остаток цистеина и который получен из полипептида шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, имеющего два или более остатков цистеина, (iii) полипептида шарнирной области IgA дикого типа человека, (iv) мутантного полипептида шарнирной области IgA человека, который не содержит остатков цистеина и который получен из полипептида области IgA дикого типа человека, и (v) мутантного полипептида шарнирной области IgA человека, который содержит один остаток цистеина и который получен из полипептида области IgA дикого типа человека; (b) полипептид константной области CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина, который слит с полипептидом шарнирной области; и (c) полипептид константной области CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, который слит с полипептидом константной области CH2, где: (1) слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин способен проявлять, по меньшей мере, одну иммунологическую активность, выбранную из группы, состоящей из антителозависимой опосредованной клетками цитотоксичности и фиксации комплемента, и (2) полипептид связывающего домена способен специфично связываться с антигеном. В одном варианте полипептид шарнирной области иммуноглобулина является мутантным полипептидом шарнирной области и проявляет пониженную способность димеризоваться по сравнению с полипептидом шарнирной области человеческого иммуноглобулина G дикого типа. В другом варианте полипептид связывающего домена содержит, по меньшей мере, один полипептид вариабельной области иммуноглобулина, который является полипептидом вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина или полипептидом вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина. В следующем варианте полипептид вариабельной области иммуноглобулина получен из иммуноглобулина человека.
В другом варианте полипептид связывающего домена слитого белка связывающий домен Fv-иммуноглобулин содержит (a) по меньшей мере, один полипептид вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина; (b) по меньшей мере, один полипептид вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина и (c) по меньшей мере, один линкерный пептид, который слит с полипептидом (a) и с полипептидом (b). В следующем варианте полипептиды вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина и вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина получены из иммуноглобулинов человека.
В другом варианте, по меньшей мере, один из полипептидов - полипептид константной области CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина и полипептид константной области CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, получен из тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В другом варианте полипептиды константных областей CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина относятся к изотипу, выбранному из IgG человека и IgA человека. В другом варианте антиген выбран из группы, состоящей из CD19, CD20, CD37, CD40 и L6. В некоторых следующих вариантах описанного выше слитого белка линкерный полипептид содержит, по меньшей мере, один полипептид, имеющий аминокислотную последовательность Gly-Gly-Gly-Gly-Ser [SEQ ID NO: 21], и в некоторых других вариантах линкерный полипептид содержит, по меньшей мере, три повтора полипептида, имеющего аминокислотную последовательность Gly-Gly-Gly-Gly-Ser [SEQ ID NO: 21]. В некоторых вариантах полипептид шарнирной области иммуноглобулина содержит полипептид шарнирной области IgA человека. В некоторых вариантах полипептид связывающего домена содержит внеклеточный домен CD154. В некоторых вариантах полипептид связывающего домена содержит внеклеточный домен CD154 и, по меньшей мере, один полипептид вариабельной области иммуноглобулина.
В других вариантах изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему любой из описанных выше слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин, и в связанных вариантах изобретение относится к рекомбинантной экспрессирующей конструкции, содержащей такой полинуклеотид, и в некоторых следующих вариантах изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной или трансфицированной такой рекомбинантной экспрессирующей конструкцией. В другом варианте изобретение относится к способу получения слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин, включающему стадии (a) культивирования раскрытой здесь клетки-хозяина, в условиях, которые обеспечивают экспрессию слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин; и (b) выделения слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин из культуры клеток-хозяев.
Данное изобретение также относится к некоторым вариантам фармацевтической композиции, содержащей слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, который описан выше, в комбинации с физиологически приемлемым носителем. В другом варианте представлен способ лечения субъекта, у которого имеется или предположительно имеется злокачественное состояние или В-клеточное расстройство, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества описанного выше слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин. В некоторых следующих вариантах злокачественным состоянием или В-клеточным расстройством является В-клеточная лимфома или заболевание, которое характеризуется продукцией аутоантител, и в некоторых других вариантах злокачественным состоянием или В-клеточным расстройством является ревматоидный артрит, миастения, болезнь Грейвса, сахарный диабет типа I, рассеянный склероз или аутоиммунное заболевание.
Указанные и другие аспекты данного изобретения станут более понятными при обращении к следующему подробному описанию и прилагаемым чертежам. Все указанные источники информации включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме, так же как были бы включены по отдельности.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 показана последовательность DNA и расшифрованная аминокислотная последовательность [SEQ ID NO: 15] 2H7scFv-Ig, слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин, способного специфично связывать CD20.
На фигуре 2 показаны уровни продукции 2Н7 scFv-Ig трансфицированными стабильными линиями СНО и получение стандартной кривой с помощью связывания очищенного 2Н7 scFv-Ig с клетками СНО, экспрессирующими CD20.
На фигуре 3 показан анализ в SDS-ПААГ различных препаратов выделенного белка 2H7scFv-Ig.
На фигуре 4 показана фиксация комплемента (фиг.4А) и опосредование антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC, фиг.4В)) посредством 2H7scFv-Ig.
На фигуре 5 показано влияние одновременного лигирования CD20 и CD40 на рост нормальных В-клеток.
На фигуре 6 показано влияние одновременного лигирования CD20 и CD40 на экспрессию CD95 и индукцию апоптоза в лимфобластоидной В-клеточной линии.
На фигуре 7 показана последовательность DNA и расшифрованная аминокислотная последовательность слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин 2H7scFv-CD154 L2 (фиг.7А, SEQ ID NO:21 и 33) и 2H7scFv-CD154 34 (фиг.7 В, SEQ ID NO:22 и 34), способных специфично связывать CD20 и CD40.
На фигуре 8 показано связывание слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин 2H7scFv-CD154 с СНО-клетками CD20+с помощью проточной иммуноцитофлуорометрии.
На фигуре 9 показано связывание аннексина V с линиями В-клеток Ramos, ВJAB и Т51 после связывания с клетками слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин 2H7scFv-CD154.
На фигуре 10 показано влияние на пролиферацию В-клеточной линии Т51 после связывания слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин 2H7scFv-CD154.
На фигуре 11 изображено схематичное представление структур слитых белков, 2H7ScFv-Ig [SEQ ID NO:16, 17 и 18], называемых производными CytoxB или CytoxB: CytoxB-MHWTG1C (2H7-ScFv, мутантный шарнир, Fc-домен человеческого IgG1 дикого типа), CytoxB-MHMG1C (2H7-ScFv, мутантный шарнир, мутантный Fc-домен IgG1 человека) и CytoxB-IgAHWTHG1C (2H7-ScFv, шарнир, полученный из IgA человека, соответственно, Fc-домен IgG1 дикого типа человека). Стрелками указаны номера положений аминокислотных остатков, которые предположительно участвуют в связывании FcR и в активности ADCC (темные стрелки), и в фиксации комплемента (светлые стрелки). Межцепочечные дисульфидные связи не указаны.
На фигуре 12 показан анализ в SDS-ПААГ выделенных слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин CytoxB и 2H7scFv-CD154.
На фигуре 13 показана антителозависимая опосредованная клетками цитотоксическая (ADCC) активность производных CytoxB.
На фигуре 14 показана комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC) производных CytoxB.
На фигуре 15 показаны определения времени полужизни в сыворотке CytoxB-MHWTG1C в образцах крови макак.
На фигуре 16 показано влияние CytoxB-MHWTG1C на уровни циркулирующих В-клеток CD40+в образцах крови макак.
На фигуре 17 показаны уровни продукции HD37 (CD19-специфичного)-ScFv-Ig трансфицированными линиями клеток млекопитающих и получение стандартной кривой с помощью связывания очищенного HD37-ScFv-Ig с клетками, экспрессирующими CD19.
На фигуре 18 показаны уровни L6 (антиген карциномы)-ScFv-Ig трансфицированными стабильными линиями CHO и получение стандартной кривой с помощью связывания очищенного L6-ScFv-Ig с клетками, экспрессирующими антиген L6.
На фигуре 19 показана ADCC-активность слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин 2H7-ScFv-Ig, HD37-ScFv-Ig и G28-1 (CD37-специфичного)-ScFv-Ig.
На фигуре 20 показана ADCC-активность слитых белков L6-ScFv-Ig.
На фигуре 21 показан анализ в SDS-ПААГ слитых белков L6-ScFv-Ig и 2H7-ScFv-Ig.
На фигуре 22 показан анализ в SDS-ПААГ слитых белков G28-1-ScFv-Ig и HD37-ScFv-Ig.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение направлено на слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин и родственные композиции и способы, которые будут использованы в иммунотерапевтических и иммунодиагностических применениях и которые дают определенные преимущества по сравнению с антиген-специфичными полипептидами предшествующего уровня техники. Слитые белки согласно данному изобретению предпочтительно представляют собой одиночные полипептидные цепи, которые содержат в существенной части следующие слитые домены: полипептид связывающего домена, полипептид шарнирной области иммуноглобулина, полипептид константной области CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина и полипептид константной области CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина. В особенно предпочтительных вариантах полипептидные домены, из которых состоит слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, являются или получены из полипептидов, которые представляют собой продукты генных последовательностей человека, но изобретение не следует ограничивать таким образом, и в действительности оно может относиться к слитым белкам связывающий домен-иммуноглобулин, которые представлены в данном описании, которые получены из любого природного или искусственного источника, включая генетически сконструированные и/или мутантные полипептиды.
Данное изобретение частично относится к неожиданному наблюдению того, что приведенные в данном описании слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин способны проявлять иммунологическую активность. Более конкретно указанные белки сохраняют способность принимать участие в хорошо известных иммунологических эффекторных активностях, включая антителозависимую опосредованную клетками цитотоксичность (ADCC, например, происходящее после связывания антигена на поверхности клеток контактирование и индукцию цитотоксических эффекторных клеток, несущих соответствующие Fc-рецепторы, таких как природные клетки-киллеры (NK), несущие FcRγIII, в соответствующих условиях) и/или фиксацию комплемента в случае комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC, например, происходящее после связывания антигена на поверхности клеток, рекрутмент и активация цитолитических белков, которые являются компонентами каскада комплемента крови), несмотря на наличие структур, для которых не ожидали, что они способны стимулировать такие эффекторные активности. Как описано более подробно ниже, ADCC и CDC являются неожиданными функциями для мономерных белков, содержащих области тяжелой цепи иммуноглобулина, которые предпочтительны благодаря структурам, выбранным для рассматриваемых слитых белков, и, в частности, благодаря выбору полипептидов шарнирной области, в которых нарушена способность образовывать межцепочечные, дисульфидные связи гомодимеров.
Другим преимуществом, предоставляемым данным изобретением, является слитый полипептид связывающий домен-иммуноглобулин, который можно получить в значительных количествах, как правило, больших, чем обычно достигаемые количества в случае конструкций одноцепочечного антитела предшествующего уровня техники. В предпочтительных вариантах слитые полипептиды связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению рекомбинантно экспрессируют в экспрессирующих системах млекопитающих, которые дают преимущество, предоставляя полипептиды, которые стабильны in vivo (например, при физиологических условиях). Согласно не ограничивающей теории такую стабильность отчасти можно получить на основе посттрансляционных модификаций, и, в частности, гликозилирования слитых белков. Продукция данных слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин посредством рекомбинантной экспрессии в клетках млекопитающих была достигнута в стационарных культурах клеток на уровне, превышающем 50 мг белка в литре надосадка культуры, и обычно наблюдалась в таких культурах на уровне 10-50 мг/л, так что предпочтительно в условиях стационарной культуры можно получить, по меньшей мере, 10-50 мг/л; также предполагается усиленная продукция слитых белков с использованием общепринятых в данной области методик крупномасштабного производства, таких как способ получения с «периодической подпиткой» (т.е. нестационарный), где получают выходы, составляющие, по меньшей мере, 5-500 мг/л, и в некоторых случаях, по меньшей мере, 0,5-1 г/л в зависимости от конкретного белкового продукта.
Полипептидом связывающего домена согласно данному изобретению может быть любой полипептид, который обладает способностью специфично распознавать и стабильно или временно связываться с узнаваемой биологической молекулой или комплексом нескольких молекул или с группой или агрегатом таких молекул, которые включают белок, полипептид, пептид, аминокислоту или их производное; липид, жирную кислоту и тому подобное; углевод, сахарид или тому подобное или их производное, нуклеиновую кислоту, нуклеотид, нуклеозид, пурин, пиримидин или родственную молекулу, или их производное, или тому подобное; или их любую комбинацию, например, гликопротеин, гликопептид, гликолипид, липопротеин, протеолипид; или любую другую биологическую молекулу, которая может присутствовать в биологическом образце. Биологический образец можно приготовить, получая образец крови, образец биопсии, эксплантат ткани, культуру органов, биологическую жидкость или любой другой препарат ткани или клеток от субъекта или из биологического источника. Субъектом или биологическим источником может быть человек или животное, отличное от человека, первичная культура клеток или линия клеток, адаптированных в культуре, включая, но не ограничивая указанным, генетически сконструированные линии клеток, которые могут содержать интегрированные в хромосому или эписомные рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот, иммортализованные или неиммортализованные линии клеток, клеточные линии гибридов соматических клеток, дифференцированные или недифференцированные клеточные линии, трансформированные линии клеток и тому подобное. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения для субъекта или биологического источника может предположительно существовать риск или он может подвергаться риску наличия злокачественного состояния или B-клеточного расстройства, которое представлено в данном описании и которое в некоторых дополнительных предпочтительных вариантах может представлять собой аутоиммунное заболевание, и в некоторых других предпочтительных вариантах изобретения может быть известно, что субъект или биологический источник не подвергается риску или не имеет такого заболевания.
Таким образом, полипептидом связывающего домена может быть любой имеющий природное происхождение или полученный рекомбинантно партнер связывания соответствующей биологической молекулы, которая представлена в данном описании и которая является представляющей интерес структурой-мишенью, называемой в данном описании «антигеном», но означающей согласно данному описанию структуру, охватывающую любую биологическую молекулу-мишень, с которой требуется специфичное связывание слитого белка согласно данному изобретению. Слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин определяют как «иммуноспецифичные» или способные специфично связываться, если они связываются с требуемой молекулой-мишенью, такой как представленный в данном описании антиген, с Ka, большей или равной примерно 104 M-1, предпочтительно большей или равной примерно 105 M-1, более предпочтительно большей или равной примерно 106 M-1 и еще более предпочтительно большей или равной примерно 107 M-1. Аффинности связывания слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению можно легко определить с использованием обычных способов, например, способов, описанных Scatchard et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660 (1949). Такое определение связывания слитого белка с представляющими интерес антигенными мишенями также можно осуществить, используя любой из ряда известных способов идентификации и получения белков, которые специфично взаимодействуют с другими белками или полипептидами, например, двугибридную дрожжевую систему скрининга, такую как система, описанная в патенте США No. 5283173 и патенте США No. 5468614, или эквивалентную.
Предпочтительные варианты слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению содержат связывающие домены, которые включают, по меньшей мере, один полипептид вариабельной области иммуноглобулина, такой как вся или часть или фрагмент V-области тяжелой цепи или легкой цепи, при условии, что он способен специфично связывать антиген или другую требуемую представляющую интерес структуру-мишень, приведенную в данном описании. В других предпочтительных вариантах связывающий домен содержит одноцепочечный полученный из иммуноглобулина Fv-продукт, который может включать всю или часть, по меньшей мере, одной V-области легкой цепи иммуноглобулина и всю или часть, по меньшей мере, одной V-области тяжелой цепи иммуноглобулина и который дополнительно содержит линкер, слитый с V-областями; получение и тестирование таких конструкций приведено в данном описании более подробно и известно в данной области. Другие полипептиды связывающего домена могут содержать любой белок или его часть, которая сохраняет способность специфично связываться с антигеном, который приведен в данном описании, включая белки, отличные от иммуноглобулинов. Таким образом, изобретение охватывает слитые белки, содержащие полипептиды связывающего домена, которые получены из полипептидных лигандов, таких как гормоны, цитокины, хемокины и тому подобное; рецепторов клеточной поверхности или растворимых рецепторов для таких полипептидных лигандов; лектинов; рецепторов межклеточной адгезии, таких как специфичные лейкоцитарные интегрины, селектинов, представителей суперсемейства генов иммуноглобулинов, молекул межклеточной адгезии (ICAM-1,-2,-3) и тому подобного; антигенов гистосовместимости и т.д.
Примеры рецепторов клеточной поверхности, которые могут представлять полипептид связывающего домена и которые также могут быть выбраны в качестве молекулы-мишени или антигена, с которым желательно связывается слитый белок связывающий домен-Ig согласно данному изобретению, включает следующие или подобные рецепторы: HER1 (например, с депозитарным номером в GenBank No. U48722, SEG_HEGFREXS, K03193), HER2 (Yoshino et al., 1994 J. Immunol. 152: 2393; Disis et al., 1994 Canc. Res. 54: 16; смотри, например, также GenBank депозитарный No. X03363, M17730, SEG_HUMHER20), HER3 (например, GenBank депозитарный No. U29339, M34309), HER4 (Plowman et al., 1993 Nature 366: 473; смотри также, например, GenBank депозитарный No. L07868, T64105), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) (например, GenBank депозитарный No. U48722, SEG_HEGFREXS, KO3193), фактор роста эндотелиальных клеток сосудов (например, GenBank No. M32977), рецептор фактора роста эндотелиальных клеток сосудов (например, GenBank депозитарный No. AF022375, 1680143, U48801, X62568), инсулиноподобный фактор роста I (например, GenBank депозитарный No. X00173, X56774, X56773, X06043, смотри также европейский патент No. GB 2241703), инсулиноподобный фактор роста II (например, GenBank депозитарный No. X03562, X00910, SEG_HUMGFIA, SEG_HUMGFI2, M17863, M17862), рецептор трансферрина (Trowbridge and Omary, 1981 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3039; смотри также, например, GenBank депозитарный No. X01060, M11507), рецептор эстрогена (например, GenBank депозитарный No. M38651, X03635, X99101, U47678, M12674), рецептор прогестерона (например, GenBank депозитарный No. X51730, X69068, M15716), рецептор фолликулостимулирующего гормона (FSH-R) (например, GenBank депозитарный No. Z34260, M65085), рецептор ретиноевой кислоты (например, GenBank депозитарный No. L12060, M60909, X77664, X57280, X07282, X06538), MUC-1 (Barnes et al., 1989 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 7159; смотри также, например, GenBank депозитарный No. SEG_MUSMUCIO, M65132, M64928) NY-ESO-1 (например, GenBank депозитарный No. AJ003149, U87459), NA 17-A (например, в европейском патенте No. WO 96/40039), мелан-A/MART-1 (Kawakami et al., 1994 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3515; смотри также, например, GenBank депозитарный No. U06654, U06452), тирозиназу (Topalian et al., 1994 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 9461; смотри также, например, GenBank депозитарный No. M26729, SEG_HUMTYR0, смотри также Weber et al., J. Clin. Invest. (1998) 102: 1258), Gp-100 (Kawakami et al., 1994 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3515; смотри также, например, GenBank депозитарный No. S73003, смотри также европейский патент No. EP 668350; Adema et al., 1994 J. Biol. Chem. 269: 20126), MAGE (van den Bruggen et al., 1991 Science 254: 1643; смотри также, например, GenBank депозитарный No. U93163, AF064589, U66083, D32077, D32076, D32075, U10694, U10693, U10691, U10690, U10689, U10688, U10687, U10686, U10685, L18877, U10340, U10339, L18920, U03735, M77481), GAGE (например, GenBank депозитарный No. U19180, смотри также патенты США No. 5683886 и 5571711), GAGE (например, GenBank депозитарный No. AF055475, AF055474, AF055473, U19147, U19146, U19145, U19144, U19143, U19142), любой из CTA-класса рецепторов, включая, в частности, антиген HOM-MEL-40, кодируемый геном SSX2 (например, GenBank депозитарный No. X86175, U90842, U90841, X86174), онкофетальный антиген (CEA, Gold and Freedman, 1985 J. Exp.Med 121: 439; смотри также, например, GenBank депозитарный No. SEG_HUMCEA, M59710, M59255, M29540) и PyLT (например, GenBank депозитарный No. J02289, J02038).
Дополнительные рецепторы клеточной поверхности, которые могут быть источниками полипептидов связывающего домена или которые могут быть соответствующими антигенами, включают следующие или подобные примеры: CD2 (например, GenBank депозитарный No. Y00023, SEG_HUMCD2, M16336, M16445, SEG_MUSCD2, M14362), 4-1BB (CDw137, Kwon et al., 1989 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 1963), лиганд 4-1BB (Goodwin et al., 1993 Eur. J. Immunol. 23: 2361; Melero et al., 1998 Eur. J. Immunol. 3: 116), CD5 (например, GenBank депозитарный No. X78985, X89405), CD10 (например, GenBank депозитарный No. M81591, X76732), CD27 (например, GenBank депозитарный No. M63928, L24495, L08096), CD28 (June et al., 1990 Immunol. Today 11: 211; смотри также, например, GenBank депозитарный No. J02988, SEG_HUMCD28, M34563), CTLA-4 (например, GenBank депозитарный No. L15006, X05719, SEG_HUMIGCTL), CD40 (например, GenBank депозитарный No. M83312, SEG_MUSC040A0, Y10507, X67878, X96710, U15637, L07414), интерферон-γ (IFN-γ; смотри, например, Farrar et al. 1993 Ann. Rev. Immunol. 11: 571 и цитированные в данной работе ссылки, Gray et al. 1982 Nature 295: 503, Rinderknecht et al. 1984 J. Biol. Chem. 259: 6790, DeGrado et al. 1982 Nature 300: 379), интерлейкин-4 (IL-4; смотри, например, 53rd Forum in Immunology, 1993 Research in Immunol. 144: 553-643; Banchereau et al., 1994 в The Cytokine Handbook, 2nd ed., A. Thomson, ed., Academic Press, NY, p.99; Keegan et al., 1994 J. Leukocyt. Biol. 55: 272, и цитированные в данных работах ссылки), интерлейкин-17 (IL-17) (например, GenBank депозитарный No. U32659, U43088) и рецептор интерлейкина-17 (IL-17R) (например, GenBank депозитарный No. U31993, U58917). Несмотря на вышесказанное, данное изобретение определенно не охватывает, в частности, слитые иммуноглобулиновые белки, которые заявлены в патенте США 5807734, 5795572 или 5807734.
Дополнительные рецепторы клеточной поверхности, которые могут быть источниками полипептидов связывающего домена или которые могут быть соответствующими антигенами, включают следующие или подобные примеры: CD59 (например, GenBank депозитарный No. SEG_HUMCD590, M95708, M34671), CD48 (например, GenBank депозитарный No. M59904), CD58/LFA-3 (например, GenBank депозитарный No. A25933, Y00636, E12817; смотри также JP 1997075090-A), CD72 (например, GenBank депозитарный No. AA311036, S40777, L35772), CD70 (например, GenBank депозитарный No. Y13636, S69339), CD80/B7.1 (Freeman et al., 1989 J. Immunol. 43: 2714; Freeman et al., 1991 J. Exp.Med. 174: 625; смотри также, например, GenBank депозитарный No. U33208, I683379), CD86/B7.2 (Freeman et al., 1993 J. Exp.Med. 178: 2185, Boriello et al., 1995 J. Immunol. 155: 5490; смотри также, например, GenBank депозитарный No. AF099105, SEG_MMB72G, U39466, U04343, SEG_HSB725, L25606, L25259), лиганд CD40 (например, GenBank депозитарный No. SEG_HUMCD40L, X67878, X65453, L07414), IL-17 (например, GenBank депозитарный No. U32659, U43088), CD43 (например, GenBank депозитарный No. X52075, J04536) и VLA-4 (α4β7) (например, GenBank депозитарный No. L12002, X16983, L20788, U97031, L24913, M68892, M95632). Следующие рецепторы поверхности клеток обычно связаны с B-клетками: CD19 (например, GenBank депозитарный No. SEG_HUMCD19W0, M84371, SEG_MUSCD19W, M62542), CD20 (например, GenBank депозитарный No. SEG_HUMCD20, M62541), CD22 (например, GenBank депозитарный No. I680629, Y10210, X59350, U62631, X52782, L16928), лиганд CD30 (например, GenBank депозитарный No. L09753, M83554), CD37 (например, GenBank депозитарный No. SEG_MMCD37X, X14046, X53517), CD106 (VCAM-1) (например, GenBank депозитарный No. X53051, X67783, SEG_MMVCAM1C, смотри также патент США No. 5596090), CD54 (ICAM-1) (например, GenBank депозитарный No. X84737, S82847, X06990, J03132, SEG_MUSICAM0), интерлейкин-12 (смотри, например, Reiter et al., 1993 Crit. Rev. Immunol. 13: 1, и цитированные в данной работе ссылки). Дополнительные клеточные агенты также могут включать любой из следующих рецепторов клеточной поверхности, обычно связанных с дендритными клетками: CD83 (например, GenBank депозитарный No. AF001036, AL021918), DEC-205 (например, GenBank депозитарный No. AF011333, U19271).
Полипептид шарнирной области иммуноглобулина, который обсуждается выше, включает любой пептид или полипептид шарнира, который имеет природное происхождение, получен в виде искусственного пептида или в виде результата генетического конструирования и который расположен в полипептиде тяжелой цепи иммуноглобулина между аминокислотными остатками, ответственными за образование внутрицепочечных дисульфидных связей доменов иммуноглобулина в областях CH1 и CH2; полипептиды шарнирной области для применения в данном изобретении также могут включать мутантный полипептид шарнирной области. Таким образом, полипептид шарнирной области иммуноглобулина можно получить из части или фрагмента или он может являться частью или фрагментом (т.е. одна или более аминокислот, связанных пептидной связью, обычно 5-65 аминокислот, предпочтительно 10-50, более предпочтительно 15-35, еще более предпочтительно 18-32, еще более предпочтительно 20-30, еще более предпочтительно 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29 аминокислот) области полипептидной цепи иммуноглобулина, которая согласно классическим представлениям обладает функцией шарнира, которая описана выше, но полипептид шарнирной области для применения в настоящем изобретении не следует ограничивать таким образом, и он может включать аминокислоты, расположенные (в соответствии со структурными критериями для размещения конкретного остатка в конкретном домене, который может варьировать, как известно в данной области) в прилегающем домене иммуноглобулина, таком как домен CH1 или домен CH2, или в случае некоторых искусственно сконструированных конструкций иммуноглобулина домен вариабельной области иммуноглобулина.
Полипептиды шарнирной области иммуноглобулина дикого типа включают любую область шарнира природного происхождения, которая расположена между доменами константной области CH1 и CH2 иммуноглобулина. Полипептид шарнирной области иммуноглобулина дикого типа предпочтительно является полипептидом шарнирной области иммуноглобулина человека, предпочтительно содержащим шарнирную область иммуноглобулина IgG человека, и более предпочтительно полипептид шарнирной области изотипа IgG1 человека. Как известно в данной области, несмотря на огромное общее разнообразие аминокислотных последовательностей иммуноглобулина, в первичной структуре иммуноглобулина наблюдается высокая степень консерватизма последовательностей в конкретных частях полипептидных цепей иммуноглобулинов, особенно по отношению к расположению остатков цистеина, которые благодаря своим сульфгидрильным группам обеспечивают возможность для образования дисульфидных связей с другими имеющимися сульфгидрильными группами. Таким образом, в контексте данного изобретения полипептиды шарнирной области иммуноглобулина дикого типа можно рассматривать как полипептиды, характерной особенностью которых является один или более высоко консервативных (например, преобладающих в популяции статистически значимым образом) остатков цистеина и в некоторых предпочтительных вариантах можно выбрать мутантный полипептид шарнирной области, который не содержит или содержит один остаток цистеина и который получен из такой шарнирной области дикого типа.
Мутантный полипептид шарнирной области иммуноглобулина может содержать область шарнира, которая имеет происхождение из иммуноглобулина вида, изотипа или класса иммуноглобулина или подкласса иммуноглобулина, который отличается от такового для доменов CH2 и CH3. Например, в некоторых вариантах изобретения слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин может содержать полипептид связывающего домена, который слит с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, содержащим полипептид шарнирной области человеческого IgA дикого типа или мутантный полипептид шарнирной области IgA человека, который не содержит или содержит только один остаток цистеина, как указано в данном описании. Такой полипептид шарнирной области может быть слит с полипептидом области CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина из Ig другого изотипа или класса, например подкласса IgG, который в некоторых предпочтительных вариантах будет представлять собой подкласс IgG1.
Например, и как описано более подробно далее, в некоторых вариантах данного изобретения выбран полипептид шарнирной области иммуноглобулина, который получен из шарнирной области IgA дикого типа человека, который в природе содержит три цистеина, при этом выбранный полипептид шарнирной области укорочен по сравнению с полной шарнирной областью так, что остается только один остаток цистеина (например, SEQ ID NO: 35-36). Подобным образом в некоторых других вариантах изобретения слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин содержит полипептид связывающего домена, который слит с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, содержащим мутантный полипептид шарнирной области, в котором количество остатков цистеина уменьшено с помощью аминокислотной замены или делеции. Таким образом, мутантный полипептид шарнирной области можно получить из шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, которая содержит один или более остатков цистеина. В некоторых вариантах мутантный полипептид шарнирной области может не содержать или содержать только один остаток цистеина, при этом мутантный полипептид шарнирной области получают из шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, которая содержит соответственно, один или более или два или более остатков цистеина. В мутантном полипептиде шарнирной области остатки цистеина шарнирной области иммуноглобулина дикого типа предпочтительно заменяют аминокислотами, которые неспособны образовывать дисульфидную связь. В одном варианте изобретения мутантный полипептид шарнирной области получают из полипептида шарнирной области IgG дикого типа человека, который может включать любой из четырех подклассов изотипа IgG человека, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых предпочтительных вариантах мутантный полипептид шарнирной области получают из полипептида шарнирной области IgG1 дикого типа человека. В качестве примера мутантный полипептид шарнирной области, полученный из полипептида шарнирной области IgG1 дикого типа человека, может содержать мутации в двух из трех остатков цистеина в шарнирной области иммуноглобулина дикого типа или мутации во всех трех остатках цистеина.
Остатки цистеина, которые присутствуют в шарнирной области иммуноглобулина дикого типа и которые удаляют в результате мутагенеза согласно особенно предпочтительным вариантам данного изобретения, включают остатки цистеина, которые образуют или которые способны образовывать межцепочечные дисульфидные связи. Не желая связывать с теорией, в данном изобретении предполагают, что мутация таких остатков цистеина шарнирной области, которые предположительно вовлечены в образование межцепочечных дисульфидных мостиков, снижает способность слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению димеризоваться (или образовывать олигомеры более высокого порядка) посредством образования дисульфидных связей, при этом неожиданно не лишая способности слитого белка стимулировать антителозависимую опосредованную клетками цитотоксичность (ADCC) или фиксировать комплемент. В частности, Fc-рецепторы (FcR), которые опосредуют ADCC (например, FcRIII, CD16), проявляют низкую аффинность в отношении Fc-доменов иммуноглобулина, что свидетельствует о том, что функциональное связывание Fc с FcR требует стабилизации авидности комплекса Fc-FcR благодаря димерной структуре тяжелых цепей в обычном антителе, и/или агрегации и сшиванию FcR с помощью обычной Fc-структуры Ат. (Sonderman et al., 2000 Nature 406: 267; Radaev et al., 2001 J. Biol. Chem. 276: 16469; Radaev et al., 2001 J. Biol. Chem. 276: 16478; Koolwijk et al., 1989 J. Immunol. 143: 1656; Kato et al., 2000 Immunol. Today 21: 310). Следовательно, слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению обеспечивают преимущества, связанные с одноцепочечными слитыми белками иммуноглобулина, при этом также неожиданно сохраняя иммунологическую активность. Подобным образом, способность фиксировать комплемент обычно связана с иммуноглобулинами, которые являются димерными по отношению к константным областям тяжелой цепи, такими как области, которые содержат Fc, несмотря на это слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению проявляют неожиданную способность фиксировать комплемент.
Как отмечено выше, предполагают, что в слитых белках связывающий домен-иммуноглобулин согласно не ограничивающей теории нарушена их способность димеризоваться и, кроме того, согласно теории указанное свойство является следствием снижения количества остатков цистеина, которые присутствуют в полипептиде шарнирной области иммуноглобулина, выбранном для включения в конструкцию слитого белка. Определение относительной способности полипептида димеризоваться хорошо известно в соответствующей области, при этом можно использовать любую из ряда разработанных методик для выявления димеризации белка (смотри, например, Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 1987 Springer-Verlag, New York). Например, способы биохимического разделения для разделения белков на основе размера молекул (например, гель-электрофорез, гель-фильтрационная хроматография, аналитическое ультрацентрифугирование и т.д.) и/или сравнение физико-химических свойств белков до и после введения активных по отношению к сульфгидрильным группам (например, йодацетамид, N-этилмалеимид) или снижающих образование дисульфидных связей (например, 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол) агентов или другие эквивалентные методики, все указанные способы можно использовать для определения степени димеризации или олигомеризации полипептидов и для определения возможного вклада дисульфидных связей в такую возможную четвертичную структуру. В некоторых вариантах изобретение относится к слитому белку связывающий домен-иммуноглобулин, который проявляет пониженную (т.е. статистически значимую по сравнению с соответствующим контролем, полученным из IgG) способность димеризоваться по сравнению с полипептидом шарнирной области человеческого иммуноглобулина G дикого типа, как указано в данном описании. Таким образом, специалисты в данной области смогут легко определить, проявляет ли конкретный слитый белок такую пониженную способность к димеризации.
Композиции и способы получения слитых белков иммуноглобулина хорошо известны в данной области, как описано, например, в патенте США No. 5892019, в котором заявлены рекомбинантные антитела, которые являются продуктами одного кодирующего полинуклеотида, но которые не являются слитыми белками связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению.
Для слитого белка иммуноглобулина согласно изобретению, который предназначен для применения на человеке, константные области обычно будут иметь происхождение из последовательностей человека, чтобы минимизировать возможный иммунный ответ против белков человека и обеспечить соответствующие эффекторные функции. Обработка последовательностей, кодирующих константные области антител, описана в заявке на выдачу патента PCT Morrison и Oi, WO 89/07142. В особенно предпочтительных вариантах домен CH1 делетирован, и карбоксильный конец связывающего домена или в случае, когда связывающий домен содержит два полипептида вариабельной области иммуноглобулина, вторая (т.е. более проксимальная по отношению к C-концу) вариабельная область связана с аминоконцом CH2 посредством шарнирной области. Схематичная диаграмма, на которой изображены структуры двух типичных слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин, показана на фиг.11, при этом следует отметить, что в особенно предпочтительных вариантах межцепочечные дисульфидные связи отсутствуют, и в других вариантах может присутствовать ограниченное количество межцепочечных дисульфидных связей относительно количества таких связей, которые могли бы присутствовать, если бы вместо имеющихся были полипептиды шарнирной области дикого типа, и что в других вариантах слитый белок содержит мутантный полипептид шарнирной области, который проявляет пониженную способность димеризоваться по сравнению с полипептидом шарнирной области IgG дикого типа человека. Таким образом, выделенная молекула полинуклеотида кодирует одноцепочечный слитый белок иммуноглобулина, имеющий связывающий домен, который обеспечивает специфичную аффинность связывания выбранного антигена.
Как указано выше, в некоторых вариантах слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин содержит, по меньшей мере, один полипептид вариабельной области иммуноглобулина, который может представлять собой полипептид вариабельной области легкой цепи или тяжелой цепи, и в некоторых вариантах слитый белок содержит, по меньшей мере, одну такую V-область легкой цепи и одну такую V-область тяжелой цепи и, по меньшей мере, один линкерный пептид, который слит с каждой V-областью. Конструирование таких связывающих доменов, например одноцепочечных Fv-доменов, хорошо известно в данной области и более подробно описано в примерах ниже и описано, например, в патенте США No. 5892019 и цитированных в указанном патенте ссылках; отбор и сборка одноцепочечных вариабельных областей и линкерных пептидов, которые могут быть слиты с каждой V-областью, полученной из тяжелой цепи и полученной из легкой цепи (например, чтобы создать связывающий домен, который содержит одноцепочечный Fv-полипептид), также известны в данной области и приведены в данном описании и, например, в патентах США No. 5869620, 4704692 и 4946778. В некоторых вариантах вся или часть последовательности иммуноглобулина, которая получена из источника, отличного от человека, может быть «гуманизирована» согласно известным способам создания гуманизированных антител, т.е. последовательностей иммуноглобулинов, в которые введены последовательности Ig человека, чтобы уменьшить степень, с которой иммунная система человека может воспринимать такие белки, как чужеродные (смотри, например, патенты США No. 5693762; 5585089; 4816567; 5225539; 5530101 и цитированные в данных патентах ссылки).
После конструирования слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин, который приведен в данном описании, можно синтезировать ДНК, кодирующие полипептид, посредством синтеза олигонуклеотидов, как описано, например, в Sinha et al., Nucleic Acids Res., 12, 4539-4557 (1984); собрать с помощью ПЦР, как описано, например, в Innis, Ed., PCR Protocols, Academic Press (1990), а также в Better et al. J. Biol. Chem. 267, 16712-16118 (1992); клонировать и экспрессировать с помощью стандартных способов, как описано, например, в Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1989), а также в Robinson et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 2, 84-93 (1991); и тестировать в отношении специфичной антигенсвязывающей активности, как описано, например, в Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988) и Munson et al., Anal. Biochem., 107, 220-239 (1980).
Получение связывающих молекул Fv-области с одной полипептидной цепью, одноцепочечных Fv-молекул, описано в патенте США No. 4946778, который включен в данное описание в виде ссылки. В данном изобретении синтезируют одноцепочечные Fv-подобные молекулы путем кодирования первой вариабельной области тяжелой или легкой цепи, за которой следует один или более линкеров к вариабельной области соответствующей легкой или тяжелой цепи, соответственно. Выбор соответствующего линкера(ров) между двумя вариабельными областями описан в патенте США No. 4946778. Типичным приведенным в данном описании линкером является (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3. Линкер используют для превращения агрегированных в естественных условиях, но химически разделенных тяжелых и легких цепей в аминоконцевую антигенсвязывающую часть одной полипептидной цепи, при этом указанная антигенсвязывающая часть будет укладываться в структуру, подобную исходной структуре, образуемой двумя полипептидными цепями, и таким образом сохранять способность связываться с представляющим интерес антигеном. Нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей, связанные последовательностью, кодирующей линкер, связаны с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константные области антитела. Константными областями являются области, которые позволяют полученному в результате полипептиду образовывать межцепочечные дисульфидные связи, чтобы образовать димер, и которые обладают требуемыми эффекторными функциями, такими как способность опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). Для подобной иммуноглобулину молекулы согласно изобретению, которая предназначена для применения на человеке, константные области обычно будут в значительной степени человеческими, чтобы минимизировать возможный иммунный ответ против белков человека и обеспечить разрешенные эффекторные функции. Обработка последовательностей, кодирующих константные области антитела, описана в заявке PCT Morrison and Oi, WO 89/07142, которая включена в данное описание в виде ссылки. В предпочтительных вариантах домен CH1 делетирован и карбоксильный конец второй вариабельной области связан с аминоконцом CH2 посредством шарнирной области. Остаток Cys шарнира, который образует дисульфидную связь с соответствующим Cys легкой цепи, удерживая тяжелую и легкую цепи нативной молекулы антитела, может быть делетирован или предпочтительно заменен, например, остатком Pro или тому подобным.
Как описано выше, данное изобретение относится к рекомбинантным экспрессирующим конструкциям, способным управлять экспрессией слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин, которые представлены в данном описании. Аминокислоты, которые встречаются в различных указанных в данном описании аминокислотных последовательностях, идентифицированы в соответствии с хорошо известными трехбуквенными или однобуквенными сокращениями. Нуклеотиды, которые встречаются в различных упоминаемых в данном описании последовательностях ДНК или их фрагментах, указаны стандартными однобуквенными обозначениями, обычно используемыми в данной области. Приведенная аминокислотная последовательность также может охватывать сходные аминокислотные последовательности, имеющие только небольшие изменения, например, с целью иллюстрации и без ограничения, ковалентные химические модификации, вставки, делеции и замены, которые дополнительно могут включать консервативные замены. Аминокислотные последовательности, которые сходны друг с другом, могут иметь значительные области гомологии последовательностей. Подобным образом нуклеотидные последовательности могут охватывать в значительной степени сходные нуклеотидные последовательности, имеющие только небольшие изменения, например, в качестве иллюстрации и без ограничения, ковалентные химические модификации, вставки, делеции и замены, которые, кроме того, могут включать молчащие мутации вследствие вырожденности генетического кода. Нуклеотидные последовательности, которые сходны друг с другом, могут иметь значительные области гомологии последовательностей.
Наличие злокачественного состояния у субъекта относится к наличию диспластических, канцерогенных и/или трансформированных клеток у субъекта, включая, например, неопластические, опухолевые, контактно не ингибированные или онкогенно трансформированные клетки или тому подобное. Например, в предпочтительных вариантах, рассматриваемых в данном изобретении, такими раковыми клетками являются злокачественные гематопоэтические клетки, такие как трансформированные клетки лимфоидной линии и, в частности, B-клеточные лимфомы и тому подобное; раковыми клетками в некоторых предпочтительных вариантах также могут быть эпителиальные клетки, такие как клетки карциномы. В изобретении также рассматриваются B-клеточные нарушения, которые могут включать некоторые злокачественные состояния, которые затрагивают B-клетки (например, B-клеточная лимфома), но которые не следует считать ограниченными таким образом, и подразумевается, что они включают аутоиммунные заболевания и, в частности, заболевания, расстройства и состояния, которые характеризуются продукцией аутоантител.
Аутоантителами являются антитела, которые реагируют с собственными антигенами. Аутоантитела выявлены при нескольких аутоиммунных заболеваниях (т.е. заболевание, расстройство или состояние, при котором иммунная система хозяина вызывает нежелательные иммунные реакции, направленные против самого себя), при этом они вовлечены в активность заболевания. Современными средствами лечения указанных аутоиммунных заболеваний являются иммуносупрессирующие лекарственные средства, которые требуют непрерывного введения, не обладают специфичностью и вызывают значительные побочные эффекты. Новые подходы, которые могут исключить продукцию аутоантител при минимальной токсичности, будут направлены на неудовлетворенные потребности здравоохранения в отношении спектра заболеваний, которые поражают многих людей. Слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению предназначен для лучшего проникновения в лимфоидные ткани. Истощение популяции B-лимфоцитов прерывает цикл продукции аутоантител и позволяет иммунной системе восстановиться, так как новые B-лимфоциты продуцируются из предшественников в костном мозге.
Идентифицирован ряд заболеваний, при которых согласно неограничивающей теории предполагается целебное действие в результате терапии по истощению популяции B-клеток; краткое описание нескольких примеров указанных заболеваний приведено далее.
Аутоиммунное заболевание щитовидной железы включает болезнь Грейвса и тиреоидит Хашимото. Только в Соединенных Штатах проживает примерно 20 миллионов человек, у которых имеется какая-либо форма аутоиммунного заболевания щитовидной железы. Аутоиммунное заболевание щитовидной железы возникает из-за продукции аутоантител, которые либо стимулируют щитовидную железу, вызывая гипертиреоидизм (болезнь Грейвса), либо разрушают щитовидную железу, вызывая гипотиреоидизм (тиреоидит Хашимото). Стимуляцию щитовидной железы вызывают аутоантитела, которые связываются и активируют рецептор тиреотропина (TSH). Разрушение щитовидной железы вызывают аутоантитела, которые реагируют с другими антигенами щитовидной железы.
В настоящее время терапия болезни Грейвса включает хирургию, лечение радиоактивным йодом или противотиреоидными лекарственными средствами. Широко используют радиоактивный йод, так как противотиреоидные лекарственные средства обладают значительными побочными эффектами и высока вероятность рецидива заболевания. Хирургия предназначена для пациентов с крупным зобом или в случае, когда необходима очень быстрая нормализация функции щитовидной железы. Не существует способов терапии, мишенью которых является продукция аутоантител, ответственных за стимуляцию рецептора TSH. Современная терапия тиреоидита Хашимото использует левотероксин натрия, и терапия обычно осуществляется на протяжении жизни, вследствие малой вероятности ремиссии. Показана подавляющая терапия для уменьшения зоба при тиреоидите Хашимото, но не известны способы лечения, которые уменьшают продукцию аутоантител, чтобы целенаправленно поразить механизм заболевания.
Ревматоидный артрит (RA) является хроническим заболеванием, характеризующимся воспалением суставов, приводящим к опухоли, боли и потере функции. RA по оценкам поражает 2,5 миллиона человек в Соединенных Штатах. Причиной RA является комбинация событий, включая начальную инфекцию или повреждение, аномальный иммунный ответ и генетические факторы. Хотя при RA присутствуют аутореактивные T-клетки и B-клетки, для диагностики RA используют высокие уровни антител, которые собираются в суставах, называемых ревматоидным фактором. Современная терапия RA включает многие лекарственные средства для подавления боли и замедления прогрессирования заболевания. Не открыты способы терапии, которые могут излечивать заболевание. Лекарственные средства включают нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID) и модифицирующие заболевание антиревматоидные лекарственные средства (DMARD). NSAID эффективны в начале заболевания, но не могут предотвращать прогрессирование разрушения сустава и болезненность при тяжелом RA. Как NSAID, так и DMARD связаны со значительными побочными эффектами. Только один новый DMARD, лефлюномид, был одобрен в течение 10 лет. Лефлюномид блокирует продукцию аутоантител, снижает воспаление и замедляет прогрессирование RA. Однако такое лекарственное средство также вызывает тяжелые побочные эффекты, включая тошноту, диарею, выпадение волос, сыпь и повреждение печени.
Системная красная волчанка (СКВ) является аутоиммунным заболеванием, вызванным рецидивирующими повреждениями кровеносных сосудов в различных органах, включая почки, кожу и суставы. СКВ поражает более 500000 человек в Соединенных Штатах. У пациентов с СКВ неправильное взаимодействие между T-клетками и B-клетками приводит к продукции аутоантител, которые атакуют клеточное ядро. Антитела включают антитела против двухцепочечной ДНК и анти-Sm-антитела. Примерно у половины пациентов с СКВ также выявляют аутоантитела, которые связывают фосфолипиды и ответственны за повреждение кровеносных сосудов и низкое количество клеток крови. Иммунные комплексы накапливаются в почках, кровеносных сосудах и суставах пациентов с СКВ, где они вызывают воспаление и повреждение ткани. Не обнаружены способы лечения СКВ, которые излечивают заболевание. Для терапии используют NSAID и DMARD в зависимости от тяжести заболевания. Плазмаферез с заменой плазмы для удаления аутоантител может вызвать временное улучшение у пациентов с СКВ. Общепринято, что за СКВ ответственны аутоантитела, таким образом, новые способы терапии, которые истощают B-клеточную линию, позволяя иммунной системе восстановиться, так как новые B-клетки образуются из предшественников, дают надежду на долговременное полезное действие у пациентов с СКВ.
Синдром Шегрена является аутоиммунным заболеванием, которое характеризуется разрушением увлажняющих желез. Синдром Шегрена является одним из наиболее преобладающих аутоиммунных заболеваний, поражающих до 4 миллионов человек в Соединенных Штатах. Примерно половина людей с синдромом Шегрена также имеют заболевание соединительной ткани, такое как ревматоидный артрит, тогда как другая половина имеет первичный синдром Шегрена без другого сопутствующего аутоиммунного заболевания. У пациентов с синдромом Шегрена часто присутствуют аутоантитела, включая антиядерные антитела, ревматоидный фактор, антифодрин и антитела против мускаринового рецептора. Обычная терапия включает кортикостероиды.
Иммунная тромбоцитопеническая пурпура (ITP) вызвана аутоантителами, которые связываются с тромбоцитами и вызывают их разрушение. Некоторые случаи ITP вызваны лекарственными средствами, а другие связаны с инфекцией, беременностью или аутоиммунным заболеванием, таким как СКВ. Примерно половину всех случаев идентифицируют как «идиопатические», что означает, что причина неизвестна. Лечение ITP определяют по тяжести симптомов. В некоторых случаях терапия не требуется. В большинстве случаев используют иммуносупрессирующие лекарственные средства, включая кортикостероиды или внутривенные инфузии иммуноглобулина, чтобы истощить популяцию T-клеток. Другим способом лечения, который обычно приводит к увеличению количества тромбоцитов, является удаление селезенки, органа, который разрушает покрытые антителами тромбоциты. Более эффективные иммуносупрессирующие лекарственные средства, включая циклоспорин, циклофосфамид или азатиоприн, используют для пациентов в тяжелых случаях. Удаление аутоантител с помощью пропускания плазмы пациента через колонку с белком A используют в качестве второй линии лечения пациентов с тяжелой формой заболевания.
Рассеянный склероз (MS) является аутоиммунным заболеванием, которое характеризуется воспалением центральной нервной системы и деструкцией миелина, который изолирует волокна нервных клеток в головном мозге, спинном мозге и в теле. Хотя причина MS неизвестна, широко распространено мнение, что первичный вклад в патогенез заболевания вносят аутоиммунные T-клетки. Однако в спинномозговой жидкости пациентов с MS присутствуют высокие уровни антител, и некоторые теории прогнозируют, что B-клеточный ответ, приводящий к продукции антител, является важным для опосредования заболевания. Не разработаны способы лечения пациентов с MS на основе истощения B-клеток. MS неизлечим. Современная терапия представляет собой кортикостероиды, которые могут уменьшать продолжительность и тяжесть приступов, но не влияют на течение MS во времени. Недавно одобрены новые способы лечения MS биотехнологически полученным интерфероном (IFN).
Миастения (MG) является хроническим аутоиммунным нейромышечным заболеванием, которое характеризуется слабостью группы произвольных мышц. MG поражает примерно 40000 человек в Соединенных Штатах. MG вызвана аутоантителами, которые связываются с рецепторами ацетилхолина, экспрессированными на нервно-мышечных соединениях. Аутоантитела уменьшают количество или блокируют ацетилхолиновые рецепторы, предотвращая передачу сигналов из нервов в мышцы. MG неизлечим. Обычные способы лечения включают иммуносупрессию кортикостероидами, циклоспорином, циклофосфамидом или азатиоприном. Хирургическое удаление тимуса часто используют, чтобы притупить аутоиммунный ответ. Плазмаферез, используемый для снижения уровней антител в крови, эффективен при MG, но кратковременно, поскольку продукция аутоантител продолжается. Плазмаферез обычно назначают при тяжелой мышечной слабости перед операцией.
Псориаз поражает примерно пять миллионов человек. Аутоиммунное воспаление в коже. Псориаз связан с артритом в 30% случаев (псориазный артрит). Много способов терапии, включая стероиды, УФ-излучение, ретиноиды, производные витамина D, циклоспорин, метотрексат.
Склеродерма является хроническим аутоиммунным заболеванием соединительной ткани, которое также известно, как системный склероз. Склеродерма характеризуется сверхпродукцией коллагена, приводящей к утолщению кожи. Примерно 300000 человек в Соединенных Штатах имеют склеродерму.
Воспалительные заболевания кишечника, включая болезнь Крона и язвенный колит, являются аутоиммунными заболеваниями пищеварительной системы.
Данное изобретение, кроме того, относится к конструкциям, кодирующим слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин, и, в частности, к способам введения рекомбинантных конструкций, кодирующих такие белки, которые могут быть экспрессированы, например, в виде фрагментов, аналогов и производных таких полипептидов. Термины «фрагмент», «производное» или «аналог» при ссылке на слитые полипептиды или слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин относятся к любому слитому полипептиду или слитому белку связывающий домен-иммуноглобулин, который сохраняет по существу такую же биологическую функцию или активность, как и такой полипептид. Таким образом, аналог включает белок-предшественник, который может быть активирован отщеплением части белка-предшественника с получением активного слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин.
Фрагментом, производным или аналогом слитого полипептида или слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин, включая слитые полипептиды или слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин, кодируемые приведенными в данном описании ДНК, может быть (i) фрагмент, производное или аналог, в котором один или более аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным аминокислотным остатком), и такой замененный аминокислотный остаток может кодироваться или не кодироваться с помощью генетического кода, или (ii) фрагмент, производное или аналог, в котором один или более аминокислотных остатков включают замещающую группу, или (iii) фрагмент, производное или аналог, в котором дополнительные аминокислоты слиты со слитым полипептидом связывающий домен-иммуноглобулин, включая аминокислоты, которые используют для выявления или специфичного функционального изменения последовательности слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин или последовательности пробелка. Считается, что такие фрагменты, производные и аналоги понятны специалистам в данной области, исходя из инструкций, приведенных в данном описании.
Полипептиды согласно данному изобретению включают слитые полипептиды и слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин, имеющие аминокислотные последовательности полипептида связывающего домена, которые идентичны или сходны с последовательностями, известными в данной области, или их фрагментами или частями. Например, в качестве иллюстрации и без ограничения внеклеточный домен молекулы CD154 человека предполагают использовать согласно данному изобретению, также как полипептиды, обладающие, по меньшей мере, 70% сходством (предпочтительно 70% идентичностью) и более предпочтительно 90% сходством (более предпочтительно 90% идентичностью) с указанным полипептидом и еще более предпочтительно 95% сходством (еще более предпочтительно 95% идентичностью) с указанными полипептидами и частями таких полипептидов, при этом такие части слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин обычно содержат, по меньшей мере, 30 аминокислот и более предпочтительно, по меньшей мере, 50 аминокислот.
Как известно в данной области «сходство» между двумя полипептидами определяют сравнением аминокислотной последовательности и консервативных аминокислотных замен в последовательности полипептида с последовательностью второго полипептида. Фрагменты или части нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды согласно данному изобретению, можно использовать для того, чтобы синтезировать полноразмерные нуклеиновые кислоты согласно данному изобретению. В используемом в данном описании смысле «% идентичности» относится к проценту идентичных аминокислот, расположенных в соответствующих положениях остатков аминокислот при сопоставлении двух или более полипептидов или анализом их последовательности с использованием алгоритма BLAST для пробелов (например, Altschul et al., 1997 Nucl. Ac. Res. 25: 3389), который присваивает весовые коэффициенты пробелам в последовательности и ошибочным спариваниям в последовательности в соответствии с коэффициентами взвешивания по умолчанию, предоставляемыми в базе данных National Institutes of Health/NCBI (Bethesda, MD; смотри www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast).
Термин «выделенный» означает, что материал извлечен из своего исходного окружения (например, природного окружения, если оно является веществом природного происхождения). Например, нуклеиновая кислота или полипептид природного происхождения, присутствующий в живом организме, не является выделенным, но та же самая нуклеиновая кислота или полипептид, отделенные от некоторых или всех совместно существующих в природной системе веществ, являются выделенными. Такие нуклеиновые кислоты могут быть частью вектора и/или такие нуклеиновые кислоты или полипептиды могут быть частью композиции и быть выделенными, так как такой вектор или композиция не являются частью его природного окружения.
Термин «ген» означает участок ДНК, участвующий в продуцировании полипептидной цепи; он включает области, предшествующие и следующие за кодирующей областью, «лидер и концевую часть», а также вставочные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими участками (экзонами).
Как обсуждается в данном описании, изобретение относится к слитым белкам связывающий домен-иммуноглобулин, кодируемым нуклеиновыми кислотами, которые имеют последовательность, кодирующую связывающий домен, слитую в рамке с дополнительной последовательностью, кодирующей домен иммуноглобулина, чтобы обеспечить экспрессию полипептидной последовательности связывающего домена, слитой с дополнительной функциональной полипептидной последовательностью, которая делает возможным, например, в качестве иллюстрации и без ограничения регистрацию, функциональное изменение, выделение и/или очистку слитого белка. Такие слитые белки могут обеспечивать возможность функционального изменения связывающего домена благодаря содержанию дополнительных полученных из иммуноглобулина полипептидных последовательностей, которые влияют на поведение слитого продукта, например (и как описано выше) за счет снижения доступности сульфгидрильных групп для участия в образовании дисульфидных связей и за счет придания способности усиливать ADCC и/или CDC.
Модификацию полипептида можно осуществить любым способом, известным специалистам в данной области. Предпочтительные способы согласно данному изобретению основаны на модификации ДНК, кодирующей слитый белок, и экспрессии модифицированной ДНК. ДНК, кодирующую одно из обсуждавшихся выше слияний связывающий домен-иммуноглобулин можно подвергнуть мутагенезу с использованием стандартных методик, включая методики, описанные далее. Например, остатки цистеина, которые в противном случае могут способствовать образованию мультимера или поддерживать особые конформации молекулы, можно делетировать из полипептида или заменить, например, остатки цистеина, которые ответственны за образование агрегатов. При необходимости остатки цистеина, которые вносят вклад в образование агрегатов, можно идентифицировать эмпирически путем делетирования и/или замены остатка цистеина и выяснения того, агрегирует ли полученный в результате белок в растворах, содержащих физиологически приемлемые буферы и соли. Кроме того, можно сконструировать и использовать фрагменты слияний связывающий домен-иммуноглобулин. Как указано выше, описаны контррецептор/связывающие домены лиганда для многих потенциальных слияний связывающий домен-иммуноглобулин, так что специалист в данной области легко может выбрать соответствующие полипептидные домены для включения в кодируемые продукты данных экспрессирующих конструкций.
Консервативные замены аминокислот хорошо известны и могут быть осуществлены, как правило, без изменения биологической активности полученной в результате молекулы слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин. Например, такие замены, как правило, осуществляют посредством взаимной замены в группе полярных остатков, заряженных остатков, гидрофобных остатков, небольших остатков и тому подобных. При необходимости такие замены можно определить эмпирически только путем тестирования полученного в результате модифицированного белка по способности связываться с соответствующими рецепторами клеточной поверхности в биологических анализах in vitro или связываться с соответствующими антигенами или требуемыми молекулами-мишенями.
Данное изобретение, кроме того, относится к нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются с последовательностями полинуклеотидов, кодирующих слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, которые приведены в данном описании, или с комплементарными им последовательностями, что без труда будет понятно специалисту в данной области, если между последовательностями имеется, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, по меньшей мере, 90% и более предпочтительно, по меньшей мере, 95% идентичность. Данное изобретение, в частности, относится к нуклеиновым кислотам, которые в условиях высокой жесткости гибридизуются с приведенными в данном описании нуклеиновыми кислотами, кодирующими слияние связывающий домен-иммуноглобулин. В используемом в данном описании смысле термин «условия высокой жесткости» означает, что гибридизация будет проходить только в том случае, если существует, по меньшей мере, 95% и предпочтительно, по меньшей мере, 97% идентичность между последовательностями. Нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с приведенными в данном описании нуклеиновыми кислотами, кодирующими слияние связывающий домен-иммуноглобулин, в предпочтительных вариантах кодируют полипептиды, которые сохраняют по существу такую же биологическую функцию или активность, что и слитые полипептиды связывающий домен-иммуноглобулин, кодируемые ДНК, указанными в цитированных в данном описании ссылках.
В используемом в данном описании смысле термин «гибридизоваться» в условиях определенной жесткости используют для описания стабильности гибридов, образованных между двумя одноцепочечными молекулами нуклеиновых кислот. Жесткость гибридизации обычно выражают в виде условий ионной силы и температуры, при которых отжигают и промывают гибриды. Обычно «высокая», «умеренная» и «низкая» жесткость охватывает следующие условия или эквивалентные им условия: высокая жесткость: 0,1 x SSPE или SSC, 0,1% SDS, 65°C; умеренная жесткость: 0,2 x SSPE или SSC, 0,1% SDS, 50°C; и низкая жесткость: 1,0 x SSPE или SSC, 0,1% SDS, 50°C. Как известно специалистам в данной области, изменения жесткости условий гибридизации можно достичь путем изменения времени, температуры и/или концентрации растворов, используемых для стадий предварительной гибридизации, гибридизации и промывки, и подходящие условия также могут отчасти зависеть от конкретных нуклеотидных последовательностей используемого зонда и блотированного образца исходной нуклеиновой кислоты. Таким образом, будет понятно, что подходящие условия жесткости легко можно выбрать без чрезмерного экспериментирования в том случае, если указана требуемая избирательность зонда, на основании его способности гибридизоваться с одной или более определенными исходными последовательностями и при этом не гибридизоваться с определенными другими исходными последовательностями.
Нуклеиновые кислоты согласно данному изобретению, также называемые в данном описании полинуклеотидами, могут быть в форме РНК или в форме ДНК, и ДНК включает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной, и в случае одноцепочечной ДНК может быть кодирующей цепью или некодирующей (антисмысловой) цепью. Кодирующая последовательность, которая кодирует слитый полипептид связывающий домен-иммуноглобулин для применения согласно данному изобретению, может быть идентична кодирующей последовательности, известной в данной области, для любого данного слияния связывающий домен-иммуноглобулин или может представлять собой другую кодирующую последовательность, которая в результате избыточности или вырожденности генетического кода кодирует тот же самый слитый полипептид связывающий домен-иммуноглобулин.
Нуклеиновые кислоты, которые кодируют слитые полипептиды связывающий домен-иммуноглобулин для применения согласно изобретению, могут включать, но не ограничены указанным: только кодирующую последовательность слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин; кодирующую последовательность слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин и дополнительную кодирующую последовательность; кодирующую последовательность слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин (и необязательно дополнительную кодирующую последовательность) и некодирующую последовательность, такую как интроны или некодирующие последовательности с 5'- и/или 3'-стороны кодирующей последовательности слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин, которые, например, могут дополнительно включать, но не ограничены указанным, одну или более регуляторных последовательностей нуклеиновых кислот, которые могут представлять собой регулирующий или регулируемый промотор, энхансер, другую последовательность регуляции транскрипции, последовательность, связывающую репрессор, последовательность регуляции трансляции или любую другую регуляторную последовательность нуклеиновой кислоты. Таким образом, термин «нуклеиновая кислота, кодирующая» или «полинуклеотид, кодирующий» слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, охватывает нуклеиновую кислоту, которая включает только кодирующую последовательность слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин, а также нуклеиновую кислоту, которая включает дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность(ти).
Нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды для приведенного в данном описании применения можно синтезировать любым способом, известным специалистам в данной области (смотри, например, WO 93/01286, заявку на выдачу патента США с регистрационным No. 07/723454; патент США No. 5218088; патент США No. 5175269; патент США No. 5109124). Идентификация олигонуклеотидов и последовательностей нуклеиновых кислот для применения в данном изобретении включает способы, хорошо известные в данной области. Например, требуемые свойства, длины и другие характеристики применимых олигонуклеотидов хорошо известны. В некоторых вариантах могут быть сконструированы синтетические олигонуклеотиды и последовательности нуклеиновых кислот, которые устойчивы к деградации эндогенными нуклеолитическими ферментами клетки-хозяина за счет наличия таких связей, как: фосфоротиоатные, метилфосфонатные, сульфоновые, сульфатные, кетильные, фосфородитиоатные, фосфоамидные, сложные фосфорноэфирные и другие такие связи, для которых показано, что они пригодны для применений в качестве антисмысловых (смотри, например, Agrwal et al., Tetrаhedron Lett. 28: 3539-3542 (1987); Miller et al., J. Am. Chem. Soc. 93: 6657-6665 (1971); Stec et al., Tetrаhedron Lett. 26: 2191-2194 (1985); Moody et al., Nucl. Acids Res. 12: 4769-4782 (1989); Uznanski et al., Nucl. Acids Res. (1989); Letsinger et al., Tetrahedron 40: 137-143 (1984); Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 54: 367-402 (1985); Eckstein, Trends Biol. Sci. 14: 97-100 (1989); Stein в: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, Ed, Macmillan Press, London, pp.97-117 (1989); Jager et al., Biochemistry 27: 7237-7246 (1988)).
В одном варианте данное изобретение относится к укороченным компонентам (например, полипептиду связывающего домена, полипептиду шарнирной области, линкеру и т.д.) для применения в слитом белке связывающий домен-иммуноглобулин, и в другом варианте изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, имеющий такие укороченные компоненты. Укороченной молекулой может быть любая молекула, которая содержит версию молекулы, которая меньше, чем полноразмерная. Укороченные молекулы, представленные в данном изобретении, могут включать укороченные биологические полимеры и в предпочтительных вариантах изобретения такими укороченными молекулами могут быть укороченные молекулы нуклеиновых кислот или укороченные полипептиды. Укороченные молекулы нуклеиновых кислот имеют нуклеотидную последовательность, которая короче полноразмерной последовательности известной или описанной молекулы нуклеиновой кислоты, при этом такая известная или описанная молекула нуклеиновой кислоты может быть природного происхождения, синтетической или рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты при условии, что специалист в данной области может расценивать ее как полноразмерную молекулу. Таким образом, например, укороченные молекулы нуклеиновой кислоты, которые соответствуют последовательности гена, содержат меньше полной длины гена, где ген содержит кодирующие и некодирующие последовательности, промоторы, энхансеры и другие регуляторные последовательности, фланкирующие последовательности и тому подобные, и другие функциональные и нефункциональные последовательности, которые считают частью гена. В другом примере укороченные молекулы нуклеиновой кислоты, которые соответствуют последовательности мРНК, содержат меньше полной длины транскрипта мРНК, который может включать различные транслируемые и нетранслируемые области, а также другие функциональные и нефункциональные последовательности.
В других предпочтительных вариантах укороченными молекулами являются полипептиды, которые содержат аминокислотную последовательность более короткую, чем полная последовательность конкретного белка или полипептидного компонента. В используемом в данном описании смысле «делеция» имеет свое общепринятое значение, которое понятно специалисту в данной области и может относиться к молекулам, в которых отсутствует одна или более частей последовательности либо из концевой, либо из неконцевой области по сравнению с соответствующей молекулой полной длины, например, как в случае приведенных в данном описании укороченных молекул. Укороченные молекулы, которые являются линейными биологическими полимерами, такие как молекулы нуклеиновых кислот или полипептиды, могут иметь одну или более делеций либо в концевой области молекулы, либо делеций в неконцевой области молекулы, при этом такие делеции могут быть делециями 1-1500 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидных или аминокислотных остатков, предпочтительно 1-500 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидных или аминокислотных остатков и более предпочтительно 1-300 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидных или аминокислотных остатков. В некоторых особенно предпочтительных вариантах укороченные молекулы нуклеиновой кислоты могут иметь делецию 270-330 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов. В некоторых других особенно предпочтительных вариантах укороченные молекулы полипептидов могут иметь делецию 80-140 непрерывно следующих друг за другом аминокислот.
Данное изобретение, кроме того, относится к вариантам указанных в данном описании нуклеиновых кислот, которые кодируют фрагменты, аналоги и/или производные слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин. Варианты нуклеиновых кислот, кодирующих слияние связывающий домен-иммуноглобулин, могут быть аллельными вариантами нуклеиновых кислот природного происхождения или вариантами неприродного происхождения. Как известно, в данной области аллельный вариант представляет собой альтернативную форму последовательности нуклеиновой кислоты, которая может иметь, по меньшей мере, одну замену, делецию или присоединение одного или более нуклеотидов, любой из которых существенно не изменяет функцию кодируемого слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин.
Вариант и производные слияния связывающий домен-иммуноглобулин можно получить посредством мутаций нуклеотидных последовательностей, кодирующих слитые полипептиды связывающий домен-иммуноглобулин. Изменения нативной аминокислотной последовательности можно осуществить любым из ряда стандартных способов. Мутации можно ввести в конкретные локусы путем синтеза олигонуклеотидов, содержащих мутантную последовательность, фланкированную сайтами рестрикции, обеспечивающими лигирование с фрагментами нативной последовательности. После лигирования полученная в результате реконструированная последовательность кодирует аналог, имеющий требуемую вставку, замену или делецию аминокислоты.
Альтернативно можно использовать сайт-специфичный мутагенез на основе олигонуклеотидов, чтобы получить измененный ген, в котором предварительно определенные кодоны можно изменить путем замены, делеции или вставки. Типичные способы осуществления таких изменений описаны Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering. Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154: 367, 1987) и в патентах США No. 4518584 и 4737462.
В качестве примера модификацию ДНК можно осуществить с помощью сайт-специфичного мутагенеза ДНК, кодирующей белок, наряду с применением способов ДНК-амплификации с использованием праймеров, чтобы ввести и амплифицировать изменения в ДНК-матрице, таких как сплайсинг путем удлинения перекрывающихся участков с помощью ПЦР (SOE). Сайт-специфичный мутагенез обычно осуществляют с использованием фагового вектора, который имеет одно- и двухцепочечные формы, такого как векторы на основе фага M13, которые хорошо известны и коммерчески доступны. Можно использовать другие подходящие векторы, которые содержат начало репликации одноцепочечного фага (смотри, например, Veira et al., Meth. Enzymol. 15: 3, 1987). В общем, сайт-специфичный мутагенез выполняют путем получения одноцепочечного вектора, который кодирует представляющий интерес белок (например, весь или часть компонента данного слитого белка связывающий домен-иммуноглобулин). Олигонуклеотидный праймер, который содержит требуемую мутацию в области гомологии с ДНК в одноцепочечном векторе, отжигают с вектором с последующим добавлением ДНК-полимеразы, такой как ДНК-полимераза I E.coli (фрагмент Кленова), которая использует двухцепочечную область в качестве праймера для получения гетеродуплекса, в котором одна цепь кодирует измененную последовательность, а другая - исходную последовательность. Гетеродуплекс вводят в соответствующие бактериальные клетки и отбирают клоны, которые содержат требуемую мутацию. Полученные в результате измененные молекулы ДНК можно рекомбинантно экспрессировать в соответствующих клетках-хозяевах, чтобы получить модифицированный белок.
Данное изобретение также охватывает эквивалентные ДНК-конструкции, которые кодируют различные добавления или замены аминокислотных остатков или последовательностей, или делеции концевых или внутренних остатков или последовательностей, которые не нужны для биологической активности. Например, и как обсуждалось выше, последовательности, кодирующие остатки Cys, которые не желательны или не являются существенными для биологической активности, можно изменить на основе делеции остатков Cys или замены другими аминокислотами, предотвращая образование неподходящих внутримолекулярных дисульфидных мостиков при ренатурации.
Организмы-хозяева включают такие организмы, в которых может осуществляться рекомбинантная продукция слитых продуктов связывающий домен-иммуноглобулин, кодируемых рекомбинантными конструкциями согласно данному изобретению, такие как бактерии (например, E.coli), дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris), клетки насекомых и млекопитающие, включая экспрессию in vitro и in vivo. Таким образом, организмы-хозяева могут включать организмы для конструирования, размножения, экспрессии или других стадий продукции вакцин, приведенных в данном описании; хозяева также включают субъекты, у которых имеют место иммунные ответы, которые описаны выше. В настоящее время предпочтительными организмами-хозяевами являются бактериальные штаммы E.coli, инбредные линии мышей и линии клеток мышей, и клетки человека, в организме и в виде линий клеток.
Конструкцию ДНК, кодирующую требуемое слияние связывающий домен-иммуноглобулин, вводят в плазмиду для экспрессии в соответствующем хозяине. В предпочтительных вариантах хозяином является бактериальный хозяин. Последовательность, кодирующую лиганд или связывающий домен нуклеиновой кислоты, предпочтительно оптимизируют в отношении кодонов для экспрессии в конкретном хозяине. Таким образом, если, например, слияние связывающий домен-иммуноглобулин человека экспрессируют в бактериях, то кодоны можно оптимизировать для использования бактериями. В случае небольших кодирующих областей ген можно синтезировать в виде отдельного олигонуклеотида. Для более крупных белков можно использовать сплайсинг различных олигонуклеотидов, мутагенез или другие способы, известные специалистам в данной области. Последовательности нуклеотидов в плазмидах, которые являются регуляторными областями, такие как промоторы и операторы, функционально связывают друг с другом для транскрипции. Последовательность нуклеотидов, кодирующая слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, также может включать ДНК, кодирующую сигнал секреции, при этом полученный в результате пептид является белком-предшественником. Полученный в результате процессированный белок можно извлечь из периплазматического пространства или среды для ферментации.
В предпочтительных вариантах плазмиды ДНК также содержат последовательность терминации транскрипции. В используемом в данном описании смысле «область терминации транскрипции» является последовательностью, которая сигнализирует о терминации транскрипции. Полный терминатор транскрипции можно получить из гена, кодирующего белок, который может быть тем же самым или может отличаться от встроенного гена, кодирующего слияние связывающий домен-иммуноглобулин, или от источника промотора. Терминаторы транскрипции являются необязательными компонентами экспрессирующих систем согласно изобретению, но используются в предпочтительных вариантах.
Используемые в данном изобретении плазмиды включают промотор в фунциональной связи с ДНК, кодирующей представляющий интерес белок или полипептид, и предназначены для экспрессии белков в подходящем хозяине, который описан выше (например, бактерии, мыши или человеке), в зависимости от требуемого применения плазмиды (например, введение вакцины, содержащей последовательности, кодирующие слияние связывающий домен-иммуноглобулин). Подходящие промоторы для экспрессии белков и полипептидов согласно изобретению широко доступны и хорошо известны в данной области. Предпочтительны индуцируемые промоторы или конститутивные промоторы, которые связаны с регуляторными областями. Такие промоторы включают, но не ограничены указанным, промотор фага T7 и другие фаговые промоторы, подобные T7, такие как промоторы T3, T5 и SP6, промоторы trp, lpp и lac, такие как lacUV5, из E.coli; P10 или промотор гена полиэдрина экспрессирующей системы бакуловирус/клетка насекомого (смотри, например, патенты США No. 5243041, 5242687, 5266317, 4745051 и 5169784) и индуцируемые промоторы других эукариотических экспрессирующих систем. Для экспрессии белков такие промоторы встраивают в плазмиду в функциональной связи с регуляторной областью, такой как lac-оперон.
Предпочтительные области промоторов представляют собой области, которые являются индуцируемыми и функциональными в E.coli. Примеры подходящих индуцируемых промоторов и промоторных областей включают, но не ограничены указанным: оператор lac E.coli, отвечающий на изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (IPTG; смотри Nakamura et al., Cell 18: 1109-1117, 1979); регулируемые металлами элементы промотора металлотионеина, отвечающие на индукцию тяжелым металлом (например, цинк) (смотри, например, патент США No. 4870009, Evans et al.); промотор фага T7lac, отвечающий на IPTG (смотри, например патент США No. 4952496 и Studier et al., Meth. Enzymol. 185: 60-89, 1990) и промотор TAC.
Плазмиды могут необязательно включать ген или гены селектируемого маркера, которые функциональны в хозяине. Ген селектируемого маркера включает любой ген, который определяет фенотип бактериям, который позволяет идентифицировать и избирательно выращивать трансформированные бактериальные клетки среди подавляющего большинства нетрансформированных клеток. Подходящие гены селектируемого маркера для бактериальных хозяев, например, включают ген резистентности к ампициллину (Ampr), ген резистентности к тетрациклину (Tcr) и ген резистентности к канамицину (Kanr). В настоящее время предпочтительным является ген резистентности к канамицину.
Плазмиды также могут включать ДНК, кодирующую сигнал секреции, функционально связанного белка. Подходящие для применения сигналы секреции широко доступны и хорошо известны в данной области. Можно использовать прокариотические и эукариотические сигналы секреции, функциональные в E.coli. Предпочтительные в настоящее время сигналы секреции включают, но не ограничены указанным, сигналы, кодируемые следующими генами E.coli: ompA, ompT, ompF, ompC, бета-лактамазы и щелочной фосфатазы, и тому подобными (von Heijne, J. Mol. Biol. 184: 99-105, 1985). Кроме того, можно использовать сигнал секреции бактериального гена pelB (Lei et al., J. Bacteriol. 169: 4379, 1987), сигнал секреции phoA и cek2, функциональный в клетке насекомого. Наиболее предпочтительным сигналом секреции является сигнал секреции ompA E.coli. Также можно использовать другие прокариотические и эукариотические сигналы секреции, известные специалистам в данной области (смотри, например, von Heijne, J. Mol. Biol. 184: 99-105, 1985). Используя способы, приведенные в данном описании, специалист в данной области может манипулировать сигналами секреции, которые являются функциональными либо в дрожжевых клетках, клетках насекомых, либо в клетках млекопитающих, чтобы секретировать белки из указанных клеток.
Предпочтительные плазмиды для трансформации клеток E.coli включают экспрессирующие векторы pET (например, pET-11a, pET-12a-c, pET-15b; смотри патент США No. 4952496; доступные из Novagen, Madison, WI). Другие предпочтительные плазмиды включают плазмиды pKK, в частности pKK 223-3, которая содержит промотор tac (Brosius et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6929, 1984; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology; патенты США No. 5122463, 5173403, 5187153, 5204254, 5212058, 5212286, 5215907, 5220013, 5223483 и 5229279). Плазмиду pKK модифицировали заменой гена устойчивости к ампициллину геном устойчивости к канамицину (доступна из Pharmacia; получена из pUC4K, смотри, например, Vieira et al. (Gene 19: 259-268, 1982; и патент США No. 4719179). Бакуловирусные векторы, такие как pBlueBac (также называемый pJVETL и его производные), в частности, pBlueBac III (смотри, например, патенты США No. 5278050, 5244805, 5243041, 5242687, 5266317, 4745051 и 5169784; доступен из Invitrogen, San Diego) также можно использовать для экспрессии полипептидов в клетках насекомых. Другие плазмиды включают плазмиды pIN-IIIompA (смотри патент США No. 4575013; смотри также Duffaud et al., Meth. Enz. 153: 492-507, 1987), такие как pIN-IIIompA2.
Предпочтительно молекула ДНК реплицируется в бактериальных клетках, предпочтительно в E.coli. Предпочтительная молекула ДНК также включает бактериальное начало репликации, чтобы обеспечить сохранение молекулы ДНК в бактериях из поколения в поколение. Таким образом, можно получить большие количества молекулы ДНК путем репликации в бактериях. Предпочтительные бактериальные начала репликации включают, но не ограничены указанным, начала репликации fl-ori и col E1. Предпочтительные хозяева содержат хромосомные копии ДНК, кодирующей РНК-полимеразу T7, функционально связанные с индуцируемым промотором, таким как промотор lacUV (смотри патент США No. 4952496). Такие хозяева включают, но не ограничены указанным, лизогенные штаммы E.coli HMS174(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysS, HMS174(DE3) и BL21(DE3). Предпочтительным является штамм BL21(DE3). Штаммы pLys дают низкие уровни лизоцима T7, природного ингибитора РНК-полимеразы T7.
Представленные молекулы ДНК также могут содержать ген, кодирующий белок-репрессор. Белок-репрессор способен репрессировать транскрипцию с промотора, который содержит последовательности нуклеотидов, с которыми связывается белок-репрессор. Промотор может быть дерепрессирован путем изменения физиологических условий в клетке. Например, изменение можно осуществить путем добавления в среду роста молекулы, которая ингибирует способность взаимодействовать с оператором или с регуляторными белками или другими областями ДНК, или путем изменения температуры ростовых сред. Предпочтительные белки-репрессоры включают, но не ограничены указанным, репрессор lacI E.coli, чувствительный к индукции IPTG, чувствительный к температуре репрессор λ cI857, и тому подобные. Предпочтительным является репрессор lacI E.coli.
В общем, рекомбинантные конструкции согласно данному изобретению также будут содержать элементы, необходимые для транскрипции и трансляции. В частности, такие элементы предпочтительны в тех случаях, когда рекомбинантная экспрессирующая конструкция, содержащая последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин, предназначена для экспрессии в клетке-хозяине или организме. В некоторых вариантах данного изобретения предпочтительную для типа клеток или специфичную для типа клеток экспрессию гена, кодирующего слияние связывающий домен-иммуноглобулин, можно достичь, помещая ген под контроль промотора. Выбор промотора будет зависеть от типа клеток, которые необходимо трансформировать, и степени или типа требуемого контроля. Промоторы могут быть конститутивными или активными и могут, кроме того, быть специфичными для типа клеток, тканеспецифичными, специфичными для отдельных клеток, специфичными для события, временно специфичными или индуцируемыми. Предпочтительными являются промоторы, специфичные для типа клеток, и промоторы, специфичные для определенного события. Примеры конститутивных или неспецифичных промоторов включают ранний промотор SV40 (патент США No. 5118627), поздний промотор SV40 (патент США No. 5118627), промотор раннего гена CMV (патент США No. 5168062) и аденовирусный промотор. Кроме вирусных промоторов в контексте данного изобретения также применимы клеточные промоторы. В частности, применимы клеточные промоторы так называемых генов домашнего хозяйства. Предпочтительны вирусные промоторы, так как, как правило, они являются более сильными промоторами, чем клеточные промоторы. Промоторные области идентифицированы в генах многих эукариот, включая высших эукариот, так что специалисты в данной области легко могут выбрать подходящие промоторы для применения в конкретном хозяине.
Также можно использовать индуцируемые промоторы. Указанные промоторы включают LTR MMTV (PCT WO 91/13160), индуцируемый дексаметазоном; промотор металлотионеина, индуцируемый тяжелыми металлами; и промоторы с элементами ответа на цАМФ, индуцируемые цАМФ. При использовании индуцируемого промотора последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, может быть доставлена в клетку с помощью экспрессирующей конструкции согласно данному изобретению, и она может находиться в покое вплоть до добавления индуктора. Это обеспечивает контроль времени выработки генного продукта.
Специфичные для события промоторы активны или стимулируются только в том случае, когда происходит определенное событие, такое как образование опухоли или вирусная инфекция. LTR HIV является хорошо известным примером промотора, специфичного для события. Промотор неактивен, если не присутствует продукт гена tat, который появляется при вирусной инфекции. Некоторые промоторы, специфичные для определенного события, также являются тканеспецифичными.
Кроме того, можно использовать промоторы, регуляция которых осуществляется согласованно с конкретным клеточным геном. Например, промоторы генов, которые экспрессируются согласованно, можно использовать в том случае, когда необходима экспрессия конкретного гена, кодирующего слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, вместе с экспрессией одного или более дополнительных эндогенных или введенных экзогенно генов. Указанный тип промотора особенно пригоден в том случае, когда известен характер экспрессии гена, относящейся к индукции иммунного ответа в конкретной ткани иммунной системы, с тем чтобы можно было активировать или другим образом привлечь специфичные иммунокомпетентные клетки в такой ткани к участию в иммунном ответе.
Кроме промотора, могут быть встроены репрессирующие последовательности, негативные регуляторы или тканеспецифичные сайленсеры, чтобы уменьшить неспецифичную экспрессию генов, кодирующих слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, в определенных ситуациях, таких как, например, ситуация, когда у хозяина временно ослабляют иммунитет, что является частью методики лечения. В промоторную область можно встроить различные репрессирующие элементы. Репрессия транскрипции не зависит от ориентации репрессирующих элементов или расстояния от промотора. Одним из типов репрессирующей последовательности является последовательность инсулятора. Такие последовательности ингибируют транскрипцию (Dunaway et al., Mol. Cell. Biol. 17: 182-9, 1997; Gdula et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9378-83, 1996, Chan et al., J. Virol. 70: 5312-28, 1996; Scott and Geyer, EMBO J. 14: 6258-67, 1995; Kalos and Fournier, Mol. Cell. Biol. 15: 198-207, 1995; Chung et al., Cell 74: 505-14, 1993) и будут подавлять фоновую транскрипцию.
Репрессирующие элементы также идентифицированы в промоторных областях генов коллагена типа II (хряща), холинацетилтрансферазы, альбумина (Hu et al., J. Cell Growth Differ. 3(9): 577-588, 1992), фосфоглицераткиназы (PGK-2) (Misuno et al., Gene 119 (2): 293-297, 1992) и в гене 6-фосфофрукто-2-киназы/фруктоза-2,6-бифосфатазы (Lemaigre et al., Mol. Cell Biol. 11 (2): 1099-1106). Кроме того, идентифицирован негативный регуляторный элемент Tse-1 в ряде генов, специфичных для печени, и было показано, что он блокирует индукцию активации гена в гепатоцитах, опосредованную элементом ответа на цАМФ (CRE) (Boshart et al., Cell 61 (5): 905-916, 1990).
В предпочтительных вариантах в конструкцию включают элементы, которые увеличивают экспрессию требуемого продукта. Такие элементы включают внутренние сайты связывания рибосомы (IRES; Wang and Siddiqui, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203: 99, 1995; Ehrenfeld and Semler, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203: 65, 1995; Rees et al., Biotechniques 20: 102, 1996; Sugimoto et al., Biotechnology 12: 694, 1994). IRES повышают эффективность трансляции. Другие последовательности также могут усиливать экспрессию. В случае некоторых генов последовательности особенно на 5'-конце ингибируют транскрипцию и/или трансляцию. Указанные последовательности обычно представляют собой палиндромы, которые могут образовать структуры шпилек. Как правило, любые такие последовательности в нуклеиновой кислоте, которую необходимо доставить, делетируют. Чтобы подтвердить или выяснить, какие последовательности влияют на экспрессию, анализируют уровни экспрессии транскрипта или транслированного продукта. Уровни транскрипта можно анализировать любым известным способом, включая Нозерн-блот-гибридизацию, защиту зонда от РНКазы и тому подобное. Уровни белка можно анализировать любым известным способом, включая ELISA, Вестерн-блот, иммуноцитохимию или другие хорошо известные способы.
В конструкции, кодирующие слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, согласно данному изобретению можно включить другие элементы. В предпочтительных вариантах конструкция содержит последовательность терминации транскрипции, включая последовательность полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга и энхансер. Также можно включать другие элементы, пригодные для экспрессии и поддержания конструкции в клетках млекопитающих или других эукариотических клетках (например, начало репликации). Так как конструкции обычно получают в бактериальных клетках, включают элементы, которые являются необходимыми или которые усиливают воспроизведение в бактериях. Такие элементы включают начало репликации, селектируемый маркер и тому подобное.
Как показано в данном описании, можно обеспечить дополнительный уровень регуляции экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин, доставляемых в клетки с помощью конструкций согласно изобретению, путем одновременной доставки двух или более дифференцированно регулируемых конструкций нуклеиновых кислот. Использование такого подхода на основе различных конструкций нуклеиновых кислот может обеспечить возможность координированной регуляции иммунного ответа, такой, например, как пространственно-временная координация, которая зависит от типа клеток и/или присутствия другого экспрессированного кодируемого компонента. Специалистам в данной области будет понятно, что различных уровней регулируемой экспрессии гена можно добиться сходным образом путем выбора подходящих регуляторных последовательностей, включая, но не ограничивая указанным, промоторы, энхансеры и другие хорошо известные регуляторные элементы генов.
Данное изобретение также относится к векторам и конструкциям, полученным на основе известных векторов, которые включают нуклеиновые кислоты согласно данному изобретению, и, в частности, к «рекомбинантным экспрессирующим конструкциям», которые содержат любые нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки и полипептиды связывающий домен-иммуноглобулин согласно изобретению, которые приведены выше; к клеткам-хозяевам, которые генетически сконструированы с векторами и/или конструкциями согласно изобретению, и к способам введения экспрессирующих конструкций, содержащих последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие такие слитые полипептиды и слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин согласно изобретению, или их фрагменты или варианты, методами на основе рекомбинации. Слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин можно экспрессировать практически в любой клетке-хозяине под контролем соответствующих промоторов в зависимости от природы конструкции (например, тип промотора, который описан выше) и от природы требуемой клетки-хозяина (например, является ли она терминально постмитотически дифференцированной или активно делящейся; например, находится ли экспрессирующая конструкция в клетке-хозяине в виде эписомы или интегрирована в геном клетки-хозяина). Соответствующие клонирующие и экспрессирующие векторы для применения в прокариотических и эукариотических хозяевах описаны Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, (1989); как указано выше, в особенно предпочтительных вариантах изобретения рекомбинантную экспрессию проводят в клетках млекопитающих, которые были трансфицированы или трансформированы рекомбинантной экспрессирующей конструкцией согласно данному изобретению.
Обычно конструкции получают из плазмидных векторов. Предпочтительной конструкцией является модифицированный вектор pNASS (Clontech, Palo Alto, CA), который имеет последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие ген резистентности к ампициллину, сигнал полиаденилирования и сайт промотора T7. Другие подходящие экспрессирующие векторы млекопитающих хорошо известны (смотри, например, Ausubel et al., 1995; Sambrook et al., выше; смотри также, например, каталоги Invitrogen, San Diego, CA; Novagen, Madison, WI; Pharmacia, Piscataway, NJ; и другие). Можно получить предпочтительные в настоящее время конструкции, которые содержат последовательность, кодирующую дигидрофолатредуктазу (DHFR) под подходящим регуляторным контролем, для обеспечения повышенных уровней продукции слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин, при этом указанные уровни являются результатом амплификации генов после применения соответствующего агента селекции (например, метотрексата).
Как правило, рекомбинантные экспрессирующие векторы будут содержать начала репликации и селектируемые маркеры, позволяющие трансформировать клетку-хозяина, и промотор, полученный из высоко экспрессируемого гена, чтобы направлять транскрипцию ниже расположенной структурной последовательности, которая описана выше. Осуществляют сборку гетерологичной структурной последовательности в соответствующей фазе с последовательностями инициации и терминации трансляции. Таким образом, например, представленные в данном описании нуклеиновые кислоты, кодирующие слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, можно включить в любой из множества конструкций экспрессирующих векторов в виде рекомбинантной экспрессирующей конструкции для экспрессии слитого полипептида связывающий домен-иммуноглобулин в клетке-хозяине. В некоторых предпочтительных вариантах конструкции включены в композиции, которые вводят in vivo. Такие векторы и конструкции включают хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК, например, производные SV40; бактериальные плазмиды; фаговую ДНК; дрожжевые плазмиды; векторы, полученные на основе комбинации плазмид и фаговой ДНК, ДНК вируса, такого как вирус оспы, аденовирус, поксвирус птиц и вирус бульбарного паралича или дефицитные по репликации ретровирусы, которые описаны ниже. Однако для получения рекомбинантной экспрессирующей конструкции можно использовать любой другой вектор, и в предпочтительных вариантах такой вектор будет способен к репликации и будет жизнеспособным в хозяине.
Соответствующую последовательность(ти) ДНК можно встроить в вектор различными способами. В общем последовательность ДНК встраивают в соответствующий сайт(ты) рестрикции эндонуклеазами способами, известными в данной области. Стандартные способы клонирования, выделения, амплификации и очистки ДНК, ферментативных реакций с участием ДНК-лигазы, ДНК-полимеразы, эндонуклеаз рестрикции и тому подобных, и различные способы разделения являются известными и широко используемыми специалистами в данной области способами. Ряд стандартных способов описан, например, в Ausubel et al. (1993 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. and John Wiley and Sons, Inc., Boston, MA); Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Maniatis et al. (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Glover (Ed.) (1985 DNA Cloning Vol.I and II, IRL Press, Oxford, UK); Hames and Higgins (Eds.), (1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK); и в других источниках.
Последовательность ДНК в экспрессирующем векторе функционально связана, по меньшей мере, с одной подходящей последовательностью регуляции экспрессии (например, конститутивным промотором или регулируемым промотором), чтобы направлять синтез мРНК. Типичные примеры таких последовательностей регуляции экспрессии включают промоторы эукариотических клеток или их вирусов, которые описаны выше. Промоторные области можно выбрать из любого требуемого гена, используя векторы CAT (хлорамфениколтрансфераза) или другие векторы с селектируемыми маркерами. Эукариотические промоторы включают предранний промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV, ранний и поздний промотор SV40, LTR ретровируса и промотор металлотионеина-I мыши. Выбор соответствующего вектора и промотора хорошо известен специалисту в данной области, и получение некоторых особенно предпочтительных рекомбинантных экспрессирующих конструкций, содержащих, по меньшей мере, один промотор или регулируемый промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей слитый полипептид связывающий домен-иммуноглобулин, приведено в данном описании.
Транскрипцию ДНК, кодирующей полипептиды согласно данному изобретению, высшими эукариотами можно увеличить путем встраивания в вектор последовательности энхансера. Энхансеры являются цис-действующими элементами ДНК, обычно длиной примерно от 10 до 300 п.о., которые действуют на промотор, усиливая его транскрипцию. Примеры включают энхансер SV40 у конца начала репликации, п.о. от 100 до 270, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы у конца начала репликации и аденовирусные энхансеры.
Как указано в данном описании в некоторых вариантах, вектор может представлять собой вирусный вектор, такой как ретровирусный вектор (Miller et al., 1989 BioTechniques 7: 980; Coffin and Varmus, 1996 Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY). Например, ретровирусы, из которых могут быть получены ретровирусные плазмидные векторы, включают, но не ограничены указанным, вирус лейкоза мышей Молони, вирус некроза селезенки, ретровирусы, такие как вирус саркомы Рауса, вирус саркомы Харви, вирус лейкоза птиц, вирус лейкоза обезьяны гиббона, вирус иммунодефицита человека, аденовирус, вирус миелопролиферативной саркомы и вирус опухоли молочной железы.
Ретровирусы являются РНК-вирусами, которые могут реплицироваться и интегрировать в геном клетки-хозяина посредством промежуточного продукта ДНК. Указанный промежуточный продукт ДНК или провирус может быть стабильно интегрирован в ДНК клетки-хозяина. Согласно некоторым вариантам данного изобретения вакцина может содержать ретровирус, в который введен чужеродный ген, который кодирует чужеродный белок, вместо нормальной ретровирусной РНК. Когда ретровирусная РНК проникает в клетку-хозяина при инфекции, чужеродный ген также вводится в клетку и затем может интегрироваться в ДНК клетки-хозяина, как будто он является частью ретровирусного генома. Экспрессия указанного чужеродного гена в хозяине приводит к экспрессии чужеродного белка.
Большинство ретровирусных векторных систем, которые были разработаны для генной терапии, основаны на ретровирусах мышей. Такие ретровирусы существуют в двух формах, в виде свободных вирусных частиц, называемых вирионами, или в виде провирусов, интегрированных в ДНК клетки-хозяина. Вирионная форма вируса содержит структурные и ферментные белки ретровируса (включая фермент обратной транскриптазы), две РНК-копии вирусного генома и части плазматической мембраны клетки-источника, содержащие гликопротеины вирусной оболочки. Ретровирусный геном организован в виде четырех основных областей: длинный концевой повтор (LTR), который содержит цис-действующие элементы, необходимые для инициации и терминации транскрипции, и расположен как с 5'-, так и с 3'-стороны кодирующих генов, и три кодирующих гена gag, pol и env. Три указанных гена gag, pol и env кодируют, соответственно, внутренние вирусные структуры, ферментные белки (такие как интеграза) и гликопротеин оболочки (называемый gp70 и p15e), который придает инфекционность и определяет пределы специфичности вируса в отношении хозяина, а также пептид «R» с неопределенной функцией.
Разработаны отдельные линии пакующих клеток и линии клеток, продуцирующих векторы, в связи с безопасностью в отношении применения ретровирусов, включая их применение в вакцинах, как описано в данном изобретении. Коротко, в указанном способе используют два компонента, ретровирусный вектор и линию пакующих клеток (PCL). Ретровирусный вектор содержит длинные концевые повторы (LTR), чужеродную ДНК, которую необходимо перенести, и пакующую последовательность (y). Указанный ретровирусный вектор не будет репродуцироваться сам по себе, поскольку гены, которые кодируют структурные белки и белки оболочки, не включены в векторный геном. PCL содержит гены, кодирующие белки gag, pol и env, но не содержит сигнала упаковки «y». Таким образом, сама PCL может только образовывать пустые вирусные частицы. В указанном общем способе ретровирусный вектор вводят в PCL, создавая, тем самым, линию клеток, продуцирующих вектор (VCL). Указанная VCL производит частицы вирионов, содержащие только геном ретровирусного вектора (чужеродный), и поэтому ранее его считали безопасным ретровирусным вектором для терапевтического применения.
«Конструкция ретровирусного вектора» относится к конструкции, которая в предпочтительных вариантах изобретения способна направлять экспрессию представляющей интерес последовательности(тей) или гена(ов), таких как последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие слияние связывающий домен-иммуноглобулин. Коротко, конструкция ретровирусного вектора должна включать 5'-LTR, сайт связывания тРНК, сигнал упаковки, начало синтеза второй цепи ДНК и 3'-LTR. В векторную конструкцию можно включать широкое множество гетерологичных последовательностей, включая, например, последовательности, которые кодируют белок (например, цитотоксичный белок, связанный с заболеванием антиген, вспомогательную иммунную молекулу или замещенный ген) или которые являются пригодными в виде самой молекулы (например, рибозим или антисмысловая последовательность).
Конструкции ретровирусного вектора согласно данному изобретению легко можно сконструировать из широкого множества ретровирусов, включая, например, ретровирусы типа B, C и D, а также спумавирусы и лентивирусы (смотри, например, RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985). Такие ретровирусы легко можно получить из депозитариев и коллекций, таких как Американская коллекция типовых культур («ATCC»; Rockville, Maryland), или выделить из известных источников с использованием общедоступных способов. Любой из указанных выше ретровирусов можно легко использовать для того, чтобы собрать или сконструировать конструкции ретровирусного вектора, пакующие клетки или клетки-продуценты согласно данному изобретению, на основании представленного описания и стандартных способов рекомбинации (например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Kunkle, PNAS 82: 488, 1985).
Подходящие промоторы для применения в вирусных векторах обычно могут включать, но не ограничены указанным, ретровирусный LTR; промотор SV40 и промотор цитомегаловируса человека (CMV), описанный в Miller, et al., Biotechniques 7: 980-990 (1989), или любой другой промотор (например, клеточные промоторы, такие как эукариотические клеточные промоторы, включая, но не ограничивая указанным, промоторы гистонов, pol III и β-актина). Другие вирусные промоторы, которые можно использовать, включают, но не ограничены указанным, аденовирусные промоторы, промоторы тимидинкиназы (TK) и промоторы парвовируса B19. Выбор подходящего промотора будет очевиден для специалистов в данной области, исходя из инструкций, приведенных в данном описании, и может осуществляться из числа регулируемых промоторов или промоторов, которые описаны выше.
Как описано выше, ретровирусный плазмидный вектор используют для трансдукции линий пакующих клеток, чтобы образовать линии клеток-продуцентов. Примеры пакующих клеток, которые можно трансфицировать, включают, но не ограничены указанным, линии клеток PE501, PA317, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 и DAN, которые описаны в Miller, Human Gene Therapy, 1: 5-14 (1990). Пакующие клетки можно трансдуцировать вектором с помощью любого способа, известного в данной области. Такие способы включают, но не ограничены указанным, электропорацию, применение липосом и преципитацию CaPO4. Альтернативно ретровирусный плазмидный вектор может быть инкапсулирован в липосому или связан с липидом и затем введен в хозяина.
Линия клеток-продуцентов создает инфекционные ретровирусные векторные частицы, которые содержат последовательность(ти) нуклеиновой кислоты, кодирующую слитые полипептиды или слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин. Затем такие ретровирусные векторные частицы можно использовать для того, чтобы трансдуцировать эукариотические клетки, либо in vitro, либо in vivo. Трансдуцированные эукариотические клетки будут экспрессировать последовательность(ти) нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый полипептид или слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин. Эукариотические клетки, которые можно трансдуцировать, включают, но не ограничены указанным, эмбриональные стволовые клетки, а также гематопоэтические стволовые клетки, гепатоциты, фибробласты, циркулирующие периферические мононуклеарные и полиморфноядерные клетки крови, включая миеломоноцитарные клетки, лимфоциты, миобласты, тканевые макрофаги, дендритные клетки, клетки Купфера, лимфоидные и ретикулоэндотелиальные клетки лимфатических узлов и селезенки, кератиноциты, эндотелиальные клетки и бронхиальные эпителиальные клетки.
В качестве другого примера варианта изобретения, в котором используют вирусный вектор, чтобы получить экспрессирующую конструкцию слияния связывающий домен-иммуноглобулин, в одном предпочтительном варианте клетки-хозяева, трансдуцированные рекомбинантной вирусной конструкцией, направляющей экспрессию слитых полипептидов или слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин, могут продуцировать вирусные частицы, содержащие экспрессированные слитые полипептиды или слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин, которые получены из частей мембраны клетки-хозяина, захваченными вирусными частицами во время активной репликации вируса (бадинга).
В другом аспекте данное изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим описанные выше рекомбинантные конструкции, экспрессирующие слияние связывающий домен-иммуноглобулин. Клетки-хозяева генетически конструируют (трансдуцируют, трансформируют или трансфицируют) векторами и/или экспрессирующими конструкциями согласно данному изобретению, которые могут, например, представлять собой клонирующие вектор, челночный вектор или экспрессирующую конструкцию. Вектор или конструкция, например, может быть в форме плазмиды, вирусной частицы, фага и т.д. Сконструированные клетки-хозяева можно культивировать в обычных питательных средах, модифицированных так, чтобы они подходили для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации отдельных генов, таких как гены, кодирующие слитые полипептиды связывающий домен-иммуноглобулин или слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин. Условия культивирования конкретных клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, такие как температура, pH и тому подобное, будут очевидны для специалиста в данной области.
Клеткой-хозяином может быть клетка высшего эукариота, такая как клетка млекопитающего, или клетка низшего эукариота, такая как клетка дрожжей, или клеткой-хозяином может быть прокариотическая клетка, такая как бактериальная клетка. Типичные примеры подходящих клеток-хозяев согласно данному изобретению включают, но не ограничены указанным, бактериальные клетки, такие как E.coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; клетки грибков, таких как дрожжи; клетки насекомых, такие как Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; клетки животных, такие как клетки CHO, COS или 293; аденовирусы; растительные клетки, или любая подходящая клетка, уже адаптированная к размножению in vitro или введенная в культуру de novo. Предполагается, что специалисты в данной области свободно могут выбрать подходящего хозяина, исходя из инструкций, приведенных в данном описании.
Различные системы на основе культур клеток млекопитающих также можно использовать, чтобы экспрессировать рекомбинантный белок. Примеры экспрессирующих систем млекопитающих включают линии фибробластов почки обезьяны COS-7, описанные Gluzman, Cell 23: 175 (1981), и другие линии клеток, способные экспрессировать совместимый вектор, например, линии клеток C127, 3T3, CHO, HeLa и BHK. Экспрессирующие векторы млекопитающих будут содержать начало репликации, подходящий промотор и энхансер, а также любые необходимые сайты связывания рибосомы, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности, например, последовательности, приведенные при описании, касающемся получения конструкций, экспрессирующих слияние связывающий домен-иммуноглобулин. Последовательности ДНК, полученные из сайтов сплайсинга и полиаденилирования SV40, можно использовать для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов. Введение конструкции в клетку-хозяина осуществляют различными способами, с которыми будут знакомы специалисты в данной области, включая, но не ограничивая указанным, например, трансфекцию с помощью фосфата кальция, трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном или электропорацию (Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology).
Слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин согласно данному изобретению можно приготовить в фармацевтических композициях для введения согласно хорошо известным способам. Фармацевтические композиции обычно содержат одну или более рекомбинантных экспрессирующих конструкций и/или продуктов экспрессии таких конструкций в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентом или разбавителем. Такие носители должны быть нетоксичными по отношению к реципиенту при используемых дозах и концентрациях. В случае композиций на основе нуклеиновых кислот или в случае композиций, содержащих продукты экспрессии рекомбинантных конструкций согласно данному изобретению, следует вводить примерно от 0,01 мкг/кг до 100 мг/кг массы тела, обычно интрадермальным, подкожным, внутримышечным или внутривенным путем или другими путями. Предпочтительная доза составляет примерно от 1 мкг/кг до примерно 1 мг/кг, при этом особенно предпочтительная - примерно от 5 мкг/кг до 200 мкг/кг. Специалистам в данной области будет понятно, что количество и частота введения будет зависеть от ответа хозяина. «Фармацевтически приемлемые носители» для терапевтического применения хорошо известны в фармацевтической области и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R.Gennaro edit. 1985). Например, можно использовать стерильный физиологический раствор или фосфатно-солевой буфер при физиологическом pH. Фармацевтические композиции могут содержать консерванты, стабилизаторы, красители и даже корригенты. Например, в качестве консервантов могут быть добавлены бензоат натрия, сорбиновая кислота и сложные эфиры пара-гидроксибензойной кислоты. Там же, 1449. Дополнительно можно использовать антиоксиданты и суспендирующие агенты. Там же.
«Фармацевтически приемлемая соль» относится к солям соединений согласно данному изобретению, полученным в результате комбинации таких соединений и органической и неорганической кислоты (кислотно-аддитивные соли) или органического или неорганического основания (основно-аддитивная соль). Соединения согласно данному изобретению можно использовать либо в виде свободного основания, либо в форме солей, при этом считается, что обе формы входят в объем данного изобретения.
Фармацевтические композиции, которые содержат одну или более конструкций, кодирующих слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин (или продукты их экспрессии), могут быть в любой форме, которая позволяет вводить композицию пациенту. Например, композиция может быть в форме твердого вещества, жидкости или газа (аэрозоль). Типичные пути введения включают без ограничения пероральный, местный, парентеральный (например, подъязычный или буккальный), подъязычный, ректальный, вагинальный или интраназальный. Термин «парентеральный» в используемом в данном описании смысле включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, внутригрудинные, внутрикавернозные, интратекальные, внутриканальные, интрауретральные инъекции или инфузии. Фармацевтическую композицию готовят так, чтобы она позволяла находящимся в ней активным ингредиентам быть биодоступными при введении композиции пациенту. Композиции, которые будут вводить пациенту, имеют форму одной или более дозированных единиц, при этом, например, таблетка может быть однократной единицей дозирования, а емкость, содержащая одно или более соединений согласно изобретению в аэрозольной форме, может содержать большое количество единиц дозирования.
В случае перорального введения может присутствовать эксципиент и/или связывающее вещество. Примерами являются сахароза, каолин, глицерин, декстрины крахмала, альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза и этилцеллюлоза. Могут присутствовать красящие агенты и/или корригенты. Можно использовать покрывающую оболочку.
Композиция может быть в форме жидкости, например, эликсира, сиропа, раствора, эмульсии или суспензии. В качестве двух примеров жидкость может быть использована для перорального введения или доставки путем инъекции. Предпочтительные композиции, в том случае, если они предназначены для перорального введения, содержат кроме одной или более конструкций или экспрессированных продуктов слияния связывающий домен-иммуноглобулин один или более подсластителей, консервантов, красителей/усилителей цвета и вкуса. В композицию, предназначенную для введения путем инъекции, могут быть включены одно или более поверхностно-активных веществ, консервантов, увлажнителей, диспергирующих агентов, суспендирующих агентов, буферов, стабилизаторов и агентов для изотоничности.
Жидкая фармацевтическая композиция, используемая в данном изобретении, либо в форме раствора, суспензии, либо в другой подобной форме может включать в себя один или более из следующих вспомогательных веществ: стерильные разбавители, такие как вода для инъекции, солевой раствор, предпочтительно физиологический раствор, раствор Рингера, изотоничный раствор хлорида натрия, жирные масла, такие как синтетические моно- и диглицериды, которые могут служить в качестве растворителя или суспедирующей среды, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для доведения тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы с многократными дозами, сделанные из стекла или пластика. Предпочтительным вспомогательным средством является физиологический раствор. Инъекционные фармацевтические композиции предпочтительно являются стерильными.
Также желательным может быть включение в препарат других компонентов, таких как носители для доставки, включая, но не ограничивая указанным, соли алюминия, эмульсии типа «вода в масле», биодеградируемые масляные носители, эмульсии типа «масло в воде», биодеградируемые микрокапсулы и липосомы. Примеры иммуностимулирующих веществ (адъювантов) для применения в таких носителях включают N-ацетилмурамил-L-аланин-D-изоглутамин (MDP), липополисахариды (ЛПС), глюкан, IL-12, GM-CSF, гамма-интерферон и IL-15.
Хотя в фармацевтических композициях согласно данному изобретению можно использовать любой подходящий носитель, известный специалистам в данной области, тип носителя будет зависеть от способа введения и от того, требуется ли длительное высвобождение. Для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, носитель предпочтительно содержит воду, физиологический раствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения можно использовать любой из указанных выше носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. Также в качестве носителей для фармацевтических композиций согласно данному изобретению можно использовать биодеградируемые микросферы (например, полилактид-галактид). Подходящие биодеградируемые микросферы описаны, например, в патентах США No. 4897268 и 5075109. В этом отношении предпочтительно, чтобы микросфера была больше, чем примерно 25 микрон.
Фармацевтические композиции также могут содержать разбавители, такие как буферы, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, полипептиды с низкой молекулярной массой (примерно менее 10 остатков), белки, аминокислоты, углеводы, включая глюкозу, сахарозу или декстрины, хелатирующие агенты, такие как EDTA, глутатион и другие стабилизаторы и эксципиенты. Примером подходящих разбавителей являются нейтральный забуференный раствор соли или физиологический раствор, смешанный с неспецифичным сывороточным альбумином. Предпочтительно продукт готовят в виде лиофилизата с использованием в качестве разбавителей подходящих растворов эксципиентов (например, сахарозы).
Как описано выше, данное изобретение включает композиции, способные доставлять молекулы нуклеиновых кислоты, кодирующие слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин. Такие композиции включают рекомбинантные вирусные векторы (например, ретровирусы (смотри WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 и WO 94/03622), аденовирус (смотри Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988; Li et al., Hum. Gene Ther. 4: 403-409, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5: 130-134, 1993 и Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219, 1994), поксвирус (смотри патент США No. 4769330; патент США No. 5017487 и WO 89/01973)), рекомбинантные экспрессирующие конструкции нуклеиновых кислот в комплексе с поликатионной молекулой (смотри WO 93/03709) и нуклеиновые кислоты, связанные с липосомами (смотри Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7851, 1987). В некоторых вариантах ДНК может быть связана с убитым или инактивированным аденовирусом (смотри Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147-154, 1992; Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6094, 1992). Другие подходящие композиции включают ДНК-лиганд (смотри Wu et al., J. Biol. Chem. 264: 16985-16987, 1989) и комбинации липид-ДНК (смотри Felgner et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 84: 7413-7417, 1989).
Кроме прямых способов in vivo, можно использовать способы ex vivo, при которых клетки извлекают из хозяина, модифицируют и помещают в того же самого или другого животного-хозяина. Очевидно, что можно использовать любую из указанных выше композиций для введения слитых белков связывающий домен-иммуноглобулин или молекул нуклеиновых кислот, кодирующих слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, в клетки ткани в условиях ex vivo. Протоколы вирусных, физических и химических способов захвата хорошо известны в данной области.
Таким образом, данное изобретение применимо для лечения пациентов, имеющих B-клеточное расстройство или злокачественное состояние, или для обработки культур клеток, полученных от такого пациента. В используемом в данном описании смысле термин «пациент» относится к любому теплокровному животному, предпочтительно человеку. Пациент может страдать раком, таким как B-клеточная лимфома, или может быть здоровым (т.е. не имеющим выявляемого заболевания или инфекции). «Культура клеток» представляет собой любой препарат, поддающийся обработке ex vivo, например, препарат, содержащий иммунокомпетентные клетки или выделенные клетки иммунной системы (включая, но не ограничивая указанным, T-клетки, макрофаги, моноциты, B-клетки и дендритные клетки). Такие клетки можно выделять любым из множества способов, хорошо известных специалистам в данной области (например, центрифугирование в градиенте плотности фикол-гипак). Клетки могут быть (но необязательно) выделены от пациента, пораженного B-клеточным расстройством или злокачественной опухолью, и могут быть повторно введены пациенту после обработки.
Жидкая композиция, предназначенная либо для парентерального, либо для перорального введения, должна содержать такое количество конструкции, кодирующей слитый белок связывающий домен-иммуноглобулин, или экспрессированного продукта, чтобы можно было получить подходящую дозу. Обычно такое количество составляет, по меньшей мере, 0,01% мас. конструкции слияния связывающий домен-иммуноглобулин или экспрессированного продукта в композиции. В том случае если композиция предназначена для перорального введения, такое количество может варьировать от 0,1 до примерно 70% от массы композиции. Предпочтительные пероральные композиции содержат примерно от 4% до 50% конструкции слияния связывающий домен-иммуноглобулин или экспрессированного продукта(тов). Предпочтительные композиции и препараты готовят так, чтобы парентеральная дозированная лекарственная форма содержала от 0,01 до 1% активного компонента по массе.
Фармацевтическая композиция может быть предназначена для местного введения, и в этом случае удобный носитель может содержать раствор, эмульсию, мазь или гелевую основу. Основа, например, может содержать один или более из следующих компонентов: петролатум, ланолин, полиэтиленгликоли, пчелиный воск, минеральное масло, разбавители, такие как вода и спирт, и эмульгаторы и стабилизаторы. В фармацевтической композиции для местного введения могут присутствовать загустители. В случае планируемого трансдермального введения композиция может включать трансдермальный пластырь или устройство для ионтофореза. Местные композиции могут содержать концентрацию конструкции слияния связывающий домен-иммуноглобулин или экспрессированного продукта примерно от 0,1 до 10% мас./об. (масса на единицу объема).
Композиция может быть предназначена для ректального введения, например, в форме суппозитория, который будет расплавляться в прямой кишке и высвобождать лекарственное средство. Композиция для ректального введения может содержать масляную основу в качестве подходящего нераздражающего эксципиента. Такие основы включают без ограничения ланолин, масло какао и полиэтиленгликоль.
В способах согласно изобретению конструкции, кодирующие слияние связывающий домен-иммуноглобулин, или экспрессированный продукт(ты) можно вводить с использованием вкладки(док), гранулы(нул), композиции(ций) замедленного высвобождения, пластыря(рей) или композиции(ций) быстрого высвобождения.
Следующие примеры предлагаются с целью иллюстрации, но не с целью ограничения.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
КЛОНИРОВАНИЕ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ОБЛАСТЕЙ 2H7 И КОНСТРУИРОВАНИЕ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ 2H7scFv-Ig
Данный пример иллюстрирует клонирование молекул кДНК, которые кодируют вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи моноклонального антитела 2H7. Данный пример также демонстрирует конструирование, секвенирование и экспрессию 2H7scFv-Ig.
Клетки гибридомы, экспрессирующие моноклональное антитело 2H7, которое специфично связывается с CD20, использовали в качестве исходного материала. Перед сбором клетки гибридомы поддерживали в логарифмической фазе роста в течение нескольких дней в среде RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) с добавлением глутамина, пирувата, не-необходимых аминокислот DMEM и пенициллина-стрептомицина. Клетки осаждали из культуральной среды центрифугированием и использовали 2×107 клеток, чтобы получить РНК. РНК из продуцирующих 2H7 клеток гибридомы выделяли с использованием набора для выделения суммарной РНК Pharmingen (San Diego, CA) (№ в каталоге 45520K) согласно инструкциям производителя, прилагаемым к набору. Один микрограмм (1 мкг) суммарной РНК использовали в качестве матрицы для получения кДНК с помощью обратной транскрипции. Смешивали РНК и 300 нг случайных праймеров и денатурировали при 72°C в течение 10 минут перед добавлением фермента. Обратную транскриптазу Superscript II (Life Technologies) добавляли к РНК плюс смесь праймеров в общем объеме 25 мкл в присутствии 5X буфера для синтеза второй цепи и 0,1 М ДТТ, поставляемых вместе с ферментом. Реакции обратной транскрипции позволяли продолжаться при 42°C в течение одного часа.
2H7-кДНК, созданную в обратно-транскриптазной реакции со случайными праймерами, и праймеры, специфичные для V-области, использовали для того, чтобы с помощью ПЦР амплифицировать вариабельные области легкой и тяжелой цепи антитела 2H7. Праймеры, специфичные для V-области, конструировали, ориентируясь на опубликованную последовательность (GenBank, депозитарные номера M17954 для VL и M17953 для VH). Конструировали две вариабельных цепи с совместимыми концевыми последовательностями, так чтобы можно было собрать scFv лигированием двух V-областей после амплификации и расщепления ферментами рестрикции.
Пептидный линкер (gly4ser)3, который необходимо встроить между двумя V-областями, встраивали путем добавления дополнительных нуклеотидов к антисмысловому праймеру для VL 2H7. Также встраивали сайт рестрикции Sac I в место соединения двух V-областей. Смысловой праймер, используемый для амплификации VL 2H7, который содержал сайт рестрикции HindIII и лидерный пептид легкой цепи, представлял собой 5'-gtc aag ctt gcc gcc atg gat ttt caa gtg cag att ttt cag c-3' (SEQ ID NO: 23). Антисмысловой праймер представлял собой 5'-gtc gtc gag ctc cca cct cct cca gat cca cca ccg ccc gag cca ccg cca cct ttc agc tcc agc ttg gtc cc-3' (SEQ ID NO: 24). Рамка считывания V-области указана в виде приведенного жирным шрифтом, подчеркнутого кодона. Сайты Hind III и SacI показаны подчеркнутыми, изображенными курсивом последовательностями.
Домен VH амплифицировали без лидерного пептида, но с
включенным 5'-сайтом рестрикции SacI для слияния с VL и сайтом рестрикции BclI на 3'-конце для слияния с различными хвостами, включая Fc-домен IgG1 человека и укороченные формы лиганда CD40, CD154. Смысловой праймер представлял собой 5'-gct gct gag ctc tca ggc tta tct аса gca agt ctg g-3' (SEQ ID NO: 25). Сайт SacI указан курсивом и подчеркнутым шрифтом, а рамка считывания кодона для первой аминокислоты домена VH указана жирным, подчеркнутым шрифтом. Антисмысловой праймер представлял собой 5'-gtt gtc tga tca gag acg gtg acc gtg gtc cc-3' (SEQ ID NO: 26). Сайт BclI указан курсивом, подчеркнутым шрифтом, а последний серин последовательности домена VH указан жирным, подчеркнутым шрифтом.
Сборку scFv-Ig осуществляли встраиванием HindIII-BclI - фрагмента 2H7scFv в pUC19, содержащую шарнирную, CH2- и CH3-области IgG1 человека, которую расщепляли ферментами рестрикции HindIII и BclI. После лигирования продуктами лигирования трансформировали бактерии DH5α. Проводили скрининг позитивных клонов в отношении точно встроенных фрагментов с использованием сайта SacI в соединении VL-VH 2H7 в качестве диагностического сайта. кДНК 2H7scFv-Ig подвергали циклу секвенирования в термоциклере PE 9700, используя программу, рассчитанную на 25 циклов при денатурации при 96°C в течение 10 секунд, отжиге при 50°C в течение 30 секунд и удлинении при 72°C в течение 4 минут. Праймерами для секвенирования были прямой и обратный праймеры pUC и внутренний праймер, который отжигается с доменом CH2 человека в части константной области IgG. Реакции секвенирования выполняли, используя готовую смесь для секвенирования с терминаторами, меченными красителем Big Dye (PE Applied Biosystems, Foster City, CA), согласно инструкциям производителя. Затем образцы очищали, используя колонки Centrisep (№ в каталоге CS-901, Princeton Separations, Adelphia, N.J.), элюаты сушили в вакуумной сушилке Savant, денатурировали в реагенте для супрессии матрицы (PE-ABI) и анализировали в генетическом анализаторе ABI 310 (PE-Applied Biosystems). Последовательность редактировали, транслировали и анализировали, используя Vector Nti, версию 6.0 (Informax, North Bethesda, MD). На фигуре 1 показана кДНК и рассчитанная аминокислотная последовательность конструкции 2H7scFv-Ig.
ПРИМЕР 2
ЭКСПРЕССИЯ 2H7-ScFv-Ig В СТАБИЛЬНЫХ ЛИНИЯХ КЛЕТОК CHO
Данный пример иллюстрирует экспрессию 2H7scFv-Ig в эукариотической линии клеток и характеристику экспрессированного 2H7scFv-Ig с помощью SDS-ПААГ и функциональных анализов, включающих ADCC и фиксацию комплемента.
HindIII-XbaI-фрагмент 2H7scFv-Ig (~1,6 т.п.н.) с правильной последовательностью встраивали в экспрессирующий вектор млекопитающих pD18, и ДНК позитивных клонов амплифицировали, используя наборы для получения плазмид QIAGEN (QIAGEN, Valencia, CA). Затем рекомбинантную плазмидную ДНК (100 мкг) линеаризовали в несущественном участке путем расщепления AscI, очищали фенольной экстракцией и ресуспендировали в среде для культуры ткани Excell 302 (№ в каталоге 14312-79P, JRH Biosciences, Lenexa, KS). Клетки для трансфекции, клетки CHO DG44, поддерживали в логарифмической фазе роста и собирали 107 клеток для каждой реакции трансфекции. Линеаризованную ДНК добавляли к клеткам CHO в общем объеме 0,8 мл для электропорации.
Стабильной продукции слитого белка 2H7scFv-Ig (SEQ ID NO: 10) добивались путем электропорации селектируемой, способной к амплификации плазмиды pD18, содержащей кДНК 2H7scFv-Ig под контролем промотора CMV, в клетки яичника китайского хомячка (CHO). Кассету, экспрессирующую 2H7, субклонировали ниже промотора CMV в векторном сайте множественного клонирования в виде HindIII-XbaI-фрагмента длиной ~1,6 т.п.н. Вектор pD18 является модифицированной версией pcDNA3, кодирующей селектируемый маркер DHFR с ослабленным промотором, чтобы увеличить давление отбора для плазмиды. Плазмидную ДНК получали, используя наборы Qiagen maxiprep, и очищенную плазмиду линеаризовали в уникальном сайте AscI перед фенольной экстракцией и осаждением этанолом. ДНК спермы лосося (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) добавляли в качестве ДНК-носителя и по 100 мкг плазмидной ДНК и ДНК носителя использовали для трансфекции 107 клеток CHO DG44 посредством электропорации. Клетки выращивали в логарифмической фазе в среде Excell 302 (JRH Biosciences), содержащей глутамин (4 мМ), пируват, рекомбинантный инсулин, пенициллин-стрептомицин и не-необходимые аминокислоты 2X DMEM (все из Life Technologies, Gaithersburg, Maryland), в дальнейшем называемой «полной средой Excell 302». Среды для нетрансфицированных клеток также содержали HT (разбавленный из 100X раствора гипоксантина и тимидина) (Life Technologies). Среды для трансфекции в условиях селекции содержали различные уровни метотрексата (Sigma-Aldrich) в качестве селектирующего агента в пределах от 50 нМ до 5 мкМ. Электропорацию проводили при 275 вольтах, 950 мкF. Трансфицированным клеткам давали возможность восстановиться в течение ночи в неселективной среде перед высеванием на селективные среды в 96-луночные планшеты с плоским дном (Costar) при различных серийных разведениях в пределах от 125 клеток/лунку до 2000 клеток/лунку. Культуральной средой для клонирования клеток была полная среда Excell 302, содержащая 100 нМ метотрексата. После достаточного разрастания клонов проводили скрининг серийных разведений надосадков культуры из маточных лунок в отношении связывания с трансфицированными клетками CD20-CHO. Клоны с самой высокой продукцией слитого белка размножали во флаконах Т25, а затем Т75, чтобы получить соответствующие количества клеток для замораживания и для крупномасштабного получения 2H7scFv-Ig. Затем увеличивали уровни продуцирования в культурах из трех клонов с помощью прогрессирующей амплификации в культуральной среде, содержащей метотрексат. При каждом последующем пассаже клеток полная среда Excell 302 содержала увеличенную концентрацию метотрексата, так что могли выжить только клетки с амплифицированной DHFR-плазмидой.
Надосадки клеток СНО, экспрессирующих 2H7scFv-Ig, собирали, фильтровали через экспресс-фильтры PES, 0,2 мкм (Nalgene, Rochester, NY) и пропускали через колонку с белком А-агарозой (IPA 300 сшитая агароза) (Repligen, Needham, MA). Колонку промывали PBS и затем связанный белок элюировали, используя 0,1 М цитратный буфер, pH 3,0. Фракции собирали и элюированный белок нейтрализовали, используя 1М Трис, рН 8,0, перед диализом в течение ночи в PBS. Концентрацию очищенного 2H7scFv-Ig (SEQ ID NO: 15) определяли по поглощению при 280 нм. Коэффициент экстинкции 1,77 определяли, используя сервисные программы для анализа белков в пакете компьютерных программ Vector Nti, версия 6.0 (Informax, North Bethesda, MD). Указанная программа использует данные об аминокислотном составе для расчета коэффициентов экстинкции.
Уровни продуцирования 2H7scFv-Ig трансфицированными стабильными клетками СНО анализировали проточной цитометрией. Очищенному 2H7scFv-Ig к клеткам СНО давали возможность связаться с клетками СНО, которые экспрессировали CD20 (CD20-CHO) и анализировали проточной цитометрией, используя конъюгированный с флуоресцеином второй реагент против IgG человека (номера в каталоге Н10101 и Н10501, CalTag, Burlingame, CA). На фигуре 2 (вверху) показана стандартная кривая, полученная путем титрования связывания 2H7scFv-Ig с CD20-CHO. При каждой концентрации 2H7scFv-Ig показана средняя яркость сигнала флуоресцеина в линейных единицах. Затем надосадкам, собранным из Т-флаконов, содержащих стабильные клоны клеток СНО, экспрессирующих 2H7scFv-Ig, давали возможность связаться с CD20-CHO и связывание анализировали проточной цитометрией. Измеряли сигнал флуоресцеина, генерируемый 2H7scFv-Ig, находящимся в надосадках, и концентрацию 2H7scFv-Ig в надосадках рассчитывали на основе стандартной кривой (фигура 2, внизу).
Очищенный 2H7scFv-Ig (SEQ ID NO:15) анализировали с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидных гелях. Образцы 2H7scFv-Ig, очищенные независимыми прогонами через колонку с белок А-агарозой, кипятили в буфере для образцов с SDS без восстановления дисульфидных связей и наносили на 10% Трис-BIS-гели с SDS (№ в каталоге NP0301, Novex, Carlsbad, CA). Двадцать микрограммов каждой очищенной партии наносили на гели. Белки после электрофореза визуализировали окрашиванием Кумасси синим (Pierce Gel Code Blue Stain Reagent, № в каталоге 24590, Pierce, Rockford, IL), и краситель удаляли в дистиллированной воде. В тот же самый гель включали маркеры молекулярной массы (предварительно окрашенные стандарты Kaleidoscope, № в каталоге 161-0324, Bio-Rad, Hercules, CA). Результаты представлены на фигуре 3. Цифрами над дорожками обозначены независимые партии очистки. Молекулярные массы маркеров размера в килодальтонах указаны с левой стороны фигуры. Дальнейшие эксперименты с использованием альтернативных условий приготовления образцов показали, что восстановление дисульфидных связей кипячением в буфере для образцов с SDS, содержащем ДТТ или 2-меркаптоэтанол, вызывает агрегацию 2H7scFv-Ig.
Можно контролировать ряд других иммунологических параметров, используя стандартные анализы, которые хорошо известны в данной области. Анализы включают, например, анализ антителозависимой опосредованной клетками цитотоксичности (ADCC), анализ вторичных гуморальных ответов in vitro, анализ различных субпопуляций клеток периферической крови или мононуклеарных лимфоидных клеток проточной иммуноцитофлуорометрией с использованием хорошо установленных систем маркерных генов, иммуногистохимию или другие подходящие анализы. Указанные и другие анализы можно, например, найти в Rose et al. (Eds.), Manual of Clinical Laboratory Immunology, 5-th Ed., 1997 American Society of Microbiology, Washington, DC.
Способность 2H7scFv-Ig убивать CD20-позитивные клетки в присутствии комплемента тестировали с использованием B-клеточных линий Ramos и Bjab. В анализе использовали комплемент кролика (Pel-Freez, Rogers, AK) при конечном разведении 1/10. Очищенный 2H7scFv-Ig инкубировали с B-клетками и комплементом в течение 45 минут при 37°C с последующим подсчетом живых и мертвых клеток путем исключения при окрашивании трипановым синим. Результаты на фигуре 4A показывают, что в присутствии комплемента кролика 2H7scFv-Ig лизировал B-клетки, экспрессирующие CD20.
Способность 2H7scFv-Ig убивать CD20-позитивные клетки в присутствии мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) тестировали путем измерения высвобождения 51Cr из меченых клеток Bjab в 4-часовом анализе, используя соотношение PBMC к клеткам Bjab 100:1. Результаты, показанные на фигуре 4B, свидетельствуют, что 2H7scFv-Ig может опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), поскольку высвобождение 51Cr было выше в присутствии PBMC и 2H7scFv-Ig вместе, чем в присутствии либо PBMC, либо только 2H7scFv-Ig.
ПРИМЕР 3
ВЛИЯНИЕ ОДНОВРЕМЕННОГО ЛИГИРОВАНИЯ CD20 И CD40 НА РОСТ НОРМАЛЬНЫХ B-КЛЕТОК И НА ЭКСПРЕССИЮ CD95 И ИНДУКЦИЮ АПОПТОЗА
Данный пример иллюстрирует влияние сшивания CD20 и CD40, экспрессированных на клеточной поверхности, на пролиферацию клеток.
Покоящиеся в результате высокой плотности B-клетки выделяли из миндалевидной железы человека в ступенчатом градиенте перкола и T-клетки удаляли с помощью E-розеткообразования. Пролиферацию покоящихся тонзиллярных B-клеток с высокой плотностью измеряли по поглощению 3[H]-тимидина в течение последних 12 часов 4-дневного эксперимента. Пролиферацию измеряли в культурах в четырех повторах, рассчитывая средние значения и стандартные отклонения, как показано. Мышиные мАт против CD20 человека, 1F5 (анти-CD20), использовали отдельно или сшивали с анти-мышиным ĸ мАт, 187.1 (анти-CD20XL). Активацию CD40 осуществляли с использованием растворимого CD154 человека, слитого с мышиным CD8 (CD154) (Hollenbaugh et al., EMBO J. 11: 4212-21 (1992)), и сшивание CD40 осуществляли, используя анти-мышиное CD8 мАт, 53-6 (CD154XL). Указанный способ позволял осуществлять одновременное сшивание CD20 и CD40 на поверхности клеток. Результаты представлены на фигуре 5.
Оценивали влияние сшивания CD20 и CD40 на клетки Ramos, линию B-клеточной лимфомы. Клетки Ramos анализировали в отношении экспрессии CD95 (Fas) и определяли процент апоптоза через восемнадцать часов после обработки (без козьего анти-мышиного IgG (GAM)) и/или сшивания (+GAM) с использованием мышиного мАт, которое специфично связывает CD20 (1F5) и CD40 (G28-5). Контрольные клетки обрабатывали контрольным антителом несвязывающего изотипа (64.1), специфичным по отношению к CD3.
Обработанные клетки Ramos собирали, инкубировали с ФИТЦ-анти-CD95 и анализировали проточной цитометрией, чтобы определить относительный уровень экспрессии Fas на поверхности клеток после сшивания CD20 или CD40. Данные указаны на графике в виде средней флуоресценции клеток после обработки указанными стимулами (фигура 6A).
Обработанные клетки Ramos из того же эксперимента собирали и измеряли связывание аннексина V, чтобы показать процент апоптоза в обработанных культурах. Апоптоз измеряли по связыванию аннексина V через 18 часов после сшивания CD20 и CD40 с использованием 1F5 и G28-5 с последующим сшиванием GAM.
Связывание аннексина V измеряли, используя набор ФИТЦ-аннексин V (№ в каталоге PN-IM2376, Immunotech, Marseille, France). Известно, что связывание аннексина V является ранним событием в продвижении клеток к апоптозу. Апоптоз или запрограммированная гибель клеток является процессом, характеризующимся каскадом катаболических реакций, приводящих к гибели клеток в результате суицида. В ранней фазе апоптоза перед тем, как клетки изменяют морфологию и происходит гидролиз ДНК, целостность клеточных мембран сохраняется, но клетки теряют асимметричность фосфолипидов своих мембран, выводя на поверхность клеток отрицательно заряженные фосфолипиды, такие как фосфатидилсерин. Аннексин V, белок, связывающий кальций и фосфолипиды, предпочтительно и с высокой аффинностью связывается с фосфатидилсерином. Результаты, демонстрирующие влияние сшивания обоих CD20 и CD40 на экспрессию рецептора (CD95), представлены на фигуре 6А. Влияние сшивания обоих CD20 and CD40 на связывание аннексина V с клетками показано на фигуре 6B.
ПРИМЕР 4
КОНСТРУИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА СЛИТЫХ БЕЛКОВ 2H7ScFv-CD154
Чтобы сконструировать молекулу, способную связывать CD20 и CD40, кДНК, кодирующую 2H7scFv сливали с кДНК, кодирующей CD154, лиганд CD40. кДНК 2H7scFv, кодируемую HindIII-BclI-фрагментом, извлекали из конструкции 2H7scFv-Ig и встраивали в вектор pD18 вместе с BamHI-XbaI-фрагментом кДНК, кодирующим внеклеточный домен CD154 человека. Внеклеточный домен кодируется карбоксильным концом CD154, подобно другим мембранным белкам типа II.
Внеклеточный домен CD154 человека амплифицировали в ПЦР, используя кДНК, полученную с помощью случайных праймеров и РНК из T-лимфоцитов человека, активированных ФГА (фитогемагглютинин). Наборы праймеров включали два разных 5'- или смысловых праймера, которые создавали соединения слияния в двух разных положениях во внеклеточном домене CD154. Конструировали два разных соединения слияния, результатом которых была короткая или укороченная форма (форма S4), включающая аминокислоты 108 (Glu)-261 (Leu)+(Glu), и длинная или полная форма (форма L2), включающая аминокислоты 48 (Arg)-261 (Leu)+(Glu) внеклеточного домена CD154, которые конструировали в виде BamHI-XbaI-фрагментов. Смысловой праймер, который сливает два разных укороченных внеклеточных домена с 2H7scFv, содержит BamHI-сайт для клонирования. Смысловой праймер для формы S4 кДНК CD154 обозначен SEQ ID NO: 11 или CD154BAM108 и кодирует 34-мер следующей последовательности: 5'-gtt gtc gga tcc aga aaa cag ctt tga aat gca a-3', в то время как антисмысловой праймер обозначен SEQ ID NO: 12 или CD154XBA и кодирует 44-мер следующей последовательности: 5'-gtt gtt tct aga tta tca ctc gag ttt gag taa gcc aaa gga cg-3'.
Олигонуклеотидные праймеры, используемые при амплификации длинной формы (L2) внеклеточного домена CD154, кодирующей аминокислоты 48 (Arg)-261 (Leu)+(Glu), представляли собой следующие праймеры: Смысловой праймер, обозначенный CD154 BAM48 (SEQ ID NO: 13), кодировал 35-мер со следующей последовательностью: 5'-gtt gtc gga tcc aag aag gtt gga caa gat aga ag-3'. Антисмысловой праймер, обозначенный CD154XBA (SEQ ID NO:__), кодировал 44-мер: 5'-gtt gtt tct aga tta tca ctc gag ttt gag taa gcc aaa gga cg-3'. Другие условия реакции ПЦР были идентичны условиям, используемым для амплификации 2H7scFv (смотри пример 1). ПЦР-фрагменты очищали с помощью наборов для быстрой ПЦР (QIAGEN, San Diego, CA), элюировали 30 мкл ddH2O и расщепляли эндонуклеазами рестрикции BamHI и XbaI (Roche) в реакционном объеме 40 мкл при 37°С в течение 3 часов. Фрагменты очищали в геле, очищали с использованием наборов QIAEX согласно инструкциям производителя (QIAGEN) и лигировали вместе с HindIII-BclI-фрагментом 2Н7 в экспрессирующий вектор pD18, расщепленный HindIII+XbaI. Реакционными смесями для лигирования трансформировали химически компетентные бактерии DН5-альфа и бактерии высевали на LB-чашки, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Трансформанты выращивали в течение ночи при 37°С и выделенные колонии использовали для инокуляции 3 мл жидкой среды в бульон Луриа, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Проводили скрининг клонов после получения миниплазмид (QIAGEN) для встраивания 2H7scFv и фрагмента внеклеточного домена CD154.
Конструкции кДНК 2H7scFv-CD154 подвергали циклическому секвенированию в термоциклере РЕ 9700, используя программу, рассчитанную на 25 циклов, которая включает денатурацию при 96°С, 10 секунд, отжиг при 50°С в течение 5 секунд и изменено при 60°С в течение 4 минут. Используемыми для секвенирования праймерами были прямой праймер pD18 (SEQ ID NO: 30: 5'-gtctatataagcagagctctggc-3') и обратный праймер pD18 (SEQ ID NO: 31: 5'-cgaggctgatcagcgagctctagca-3'). Кроме того, использовали внутренний праймер, который обладал гомологией с последовательностью CD154 человека (SEQ ID NO: 32: 5'-ccgcaatttgaggattctgatcacc-3'). Реакционные смеси содержали 3,2 пмоль праймеров, примерно 200 нг матрицы ДНК и 8 мкл смеси для секвенирования. Реакции секвенирования выполняли, используя готовую смесь для секвенирования с терминаторами, меченными красителем Big Dye (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) согласно инструкциям производителя. Затем образцы очищали с использованием колонок Centrisep (Princeton Separations, Adelphia, NJ). Элюаты сушили в скоростной вакуумной сушилке Savant, денатурировали в 20 мкл реагента для супрессии матрицы (ABI) при 95°С в течение 2 минут и анализировали в генетическом анализаторе ABI 310 (PE-Applied Biosystems). Последовательность редактировали, транслировали и анализировали, используя Vector Nti, версия 6.0 (Informax, North Bethesda, MD). Последовательность кДНК и рассчитанная аминокислотная последовательность 2H7scFv-CD154 L2 представлены на фигуре 7А, а последовательность кДНК и рассчитанная аминокислотная последовательность 2H7scFv-CD154 S4 представлены на фигуре 7В.
Связывающая активность слитых белков 2H7scFv-CD154 (SEQ ID N0:33 и 34) одновременно с CD20 и CD40 определяли проточной цитометрией. В анализе использовали клеточные мишени СНО, которые экспрессируют CD20. После 45-минутной инкубации клеток CD20-CHO с надосадками из клеток, трансфицированных плазмидой, экспрессирующей 2H7scFv-CD154, клетки CD20-CHO дважды промывали и инкубировали с конъюгированным с биотином слитым белком CD40-Ig в PBS/2% FBS. Через 45 мин клетки дважды промывали и инкубировали с меченым фикоэритрином (РЕ) стрептавидином в разведении 1:100 в PBS/2% FBS (Molecular Probes, Eugene OR). После дополнительной 30-минутной инкубации клетки промывали 2Х и анализировали проточной цитометрией. Результаты показывают, что молекула 2H7scFv-CDl54 способна связываться с CD20 на поверхности клеток и захватывать из раствора CD40, конъюгированный с биотином (фигура 8).
Чтобы определить влияние 2H7scFv-CDl54 на рост и жизнеспособность В-лимфоидных и лимфобластоидных линий клеток, клетки инкубировали с 2H7scFv-CDl54 L2 (SEQ ID NO:33) в течение 12 часов и затем оценивали связывание аннексина V. Связывание аннексина V измеряли, используя набор ФИТЦ-аннексина V (Immunotech, Marseille, France, № в каталоге PN-IM2376). Линии В-клеток инкубировали в культурах объемом 1 мл с разведениями концентрированных диализованных надосадков клеток, экспрессирующих секретируемые формы слитых белков 2H7scFv-CDl54. Результаты представлены на фигуре 9.
Скорость роста линии В-лимфоидных клеток Ramos в присутствии 2H7scFv-CDl54 оценивали по поглощению 3H-тимидина в течение последних 6 часов 24-часового культивирования. Влияние 2H7scFv-CDl54 на пролиферацию клеток показано на фигуре 10.
Пример 5
Конструирование и характеристика производных антител CytoxB
Антитела CytoxB получали из полипептида 2H7scFv-IgG. 2H7scFv (смотри пример 1) связывали с Fc-доменом IgG1 человека посредством измененного шарнирного домена (смотри фигуру 11). Остатки цистеина в шарнирной области заменяли остатками серина сайт-специфичным мутагенезом и другими способами, известными в данной области. Мутантный шарнир сливали либо с Fc-доменом дикого типа, чтобы создать одну конструкцию, обозначенную CytoB-MHWTG1C, либо сливали с мутантным Fc-доменом (CytoxBMHMG1C), который имел дополнительные мутации, введенные в домен CH2. Аминокислотные остатки в CH2, которые вовлечены в эффекторную функцию, показаны на фигуре 11. Мутации в одном или более из указанных остатков могут снизить связывание с FcR и опосредование эффекторных функций. В данном примере остаток лейцина 234, который, как известно в данной области, важен для связывания рецептора Fc, подвергали мутированию в слитом белке 2H7scFv, CytoxB[MG1H/MG1C]. В другой конструкции шарнирную область IgG1 человека заменяли частью шарнира IgA человека, который сливали с человеческим Fc-доменом дикого типа (CytoxB-IgAHWTHG1C) (смотри фигуру 11). Указанная мутантная шарнирная область позволяла экспрессировать смесь мономерных и димерных молекул, которые сохраняют функциональные свойства CH2- и CH3-доменов IgG1 человека. Конструировали синтетические рекомбинантные экспрессирующие кассеты кДНК указанных молекул и экспрессировали полипептиды в клетках CHODG44 согласно способам, описанным в примере 2.
Очищенные производные молекул слитого белка CytoxB-scFvIg анализировали в SDS-ПААГ согласно способам, описанным в примере 2. Полиакриламидные гели разгоняли в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях. На каждый гель наносили различные наборы маркеров молекулярной массы, предварительно окрашенные маркеры BioRad (BioRad, Hercules, CA) и маркеры молекулярной массы Novex Multimark. Картины миграции различных конструкций и ритуксимаба представлены на фигуре 12.
Способность различных производных молекул CytoxB-scFvIg опосредовать ADCC измеряли, используя в качестве мишени клетки B-лимфомы Bjab и свежеприготовленные PBMC человека в качестве эффекторных клеток (смотри пример 2). Отношения эффектор к мишени варьировали следующим образом: 70:1, 35:1 и 18:1, при этом количество клеток Bjab на лунку оставалось постоянным, а количество PBMC варьировали. Клетки Bjab метили в течение 2 часов 51Cr и разносили аликвотами при плотности клеток 5×104 клеток/лунку в каждую лунку 96-луночных планшетов с плоским дном. Добавляли очищенные слитые белки или ритуксимаб при концентрации 10 мг/мл к различным разведениям PBMC. Спонтанное высвобождение измеряли без добавления PBMC или слитого белка и максимальное высвобождение измеряли при добавлении детергента (1% NP-40) в соответствующие лунки. Реакционные смеси инкубировали в течение 4 часов и собирали 100 мкл надосадка культуры в Lumaplate (Packard Instruments) и давали возможность высохнуть в течение ночи перед подсчетом высвобождения в имп/мин. Результаты представлены на фигуре 13.
Также измеряли зависимую от комплемента цитотоксическую (CDC) активность производных CytoxB. Реакции осуществляли, как описано в примере 2. Результаты представлены на фигуре 14 в виде процента погибших клеток к общему количеству клеток для каждой концентрации слитого белка.
ПРИМЕР 6
ИССЛЕДОВАНИЯ IN VIVO НА МАКАКАХ
Исходные исследования in vivo производных CytoxB выполняли на приматах, отличных от человека. На фигуре 15 показаны данные, характеризующие время полужизни CytoxB в сыворотке обезьян. Измерения проводили в образцах сыворотки, полученных от двух разных макак (J99231 и K99334) после того, как каждой макаке вводили дозы 6 мг/кг в дни, указанные стрелками. Для каждого образца имеющийся уровень 2H7scFvIg оценивали путем сравнения со стандартной кривой, полученной при связывании очищенного слитого белка CytoxB-(MHWTG1C)-Ig с клетками CD20-CHO (смотри пример 2). Данные приведены в виде таблицы на нижней панели фигуры 15.
Исследовали влияние слитого белка CytoxB-(MHWTG1C)Ig на уровни циркулирующих клеток CD40+у макак. Полный анализ крови выполняли в каждый из дней, указанных на фигуре 16. Кроме того, выполняли анализ FACS (флуоресцентно активируемый сортировщик клеток) на лимфоцитах периферической крови, используя специфичное по отношению к CD40 антитело, конъюгированное с флуоресцеином, чтобы выявить B-клетки в популяции клеток. Затем использовали процент позитивных клеток, чтобы рассчитать количество B-клеток в исходных образцах. Данные изображены графически в тысячах B-клеток на микролитр крови при измерении в указанные дни после инъекции (фигура 16).
ПРИМЕР 7
КОНСТРУИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ СЛИТОГО БЕЛКА АНТИ-CD19-scFv-Ig
Слитый белок анти-CD19-scFv-Ig конструировали, трансфицировали в эукариотические клетки и экспрессировали согласно способам, приведенным в примерах 1, 2 и 5 и стандартных в данной области. Вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи клонировали из РНК, выделенной из клеток гибридомы, продуцирующих антитело HD37, которое специфично связывается с CD19. Измеряли уровни экспрессии HD37scFv-IgAHWTG1C и HD37scFv-IgMHWTG1C и сравнивали со стандартной кривой, полученной с использованием очищенного HD37scFvIg. Результаты представлены на фигуре 17.
ПРИМЕР 8
КОНСТРУИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ СЛИТОГО БЕЛКА АНТИ-L6-scFv-Ig
Слитый белок scFv-Ig конструировали с использованием вариабельных областей, полученных из мАт против карциномы, L6. Слитый белок конструировали, трансфицировали в эукариотические клетки и экспрессировали согласно способам, представленным в примерах 1, 2 и 5 и стандартных в данной области. Измеряли уровни экспрессии L6scFv-IgAHWTG1C и L6scFv-IgMHWTG1C и сравнивали со стандартной кривой, полученной с использованием очищенного HD37scFvIg. Результаты представлены на фигуре 18.
ПРИМЕР 9
ХАРАКТЕРИСТИКА РАЗЛИЧНЫХ СЛИТЫХ БЕЛКОВ scFv-Ig
Кроме уже описанного слитого белка scFv-Ig получали слитые белки G28-1 (анти-CD37)scFv-Ig, по существу, как описано в примерах 1 и 5. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей клонировали согласно способам, известным в данной области. ADCC-активность 2H7-MHWTG1C, 2H7-IgAHWTG1C, G28-1-MHWTG1C, G28-1-IgAHWTG1C, HD37-MHWTG1C и HD37-IgAHWTG1C определяли согласно способам, описанным выше (смотри пример 2). Результаты представлены на фигуре 19. ADCC-активность L6scFv-IgAHWTG1C и L6scFv-IgMHWTG1C измеряли, используя линию клеток карциномы легкого человека 2981. Результаты представлены на фигуре 20. Известно, что мышиное моноклональное антитело L6 не проявляет ADCC-активности.
Очищенные белки анализировали с помощью SDS-ПААГ при восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Подготовку образцов и разгонку в гелях осуществляли, по существу, как описано в примерах 2 и 5. Результаты для слитых белков L6- и 2H7-scFv-Ig представлены на фигуре 21, а результаты для слитых белков G28-1 и HD37-scFv-Ig представлены на фигуре 22.
Из сказанного выше будет понятно, что хотя в данном описании в целях иллюстрации приведены конкретные варианты изобретения, могут быть осуществлены различные модификации, не отходя от сути и не превышая объем изобретения. Таким образом, данное изобретение не ограничено ничем, кроме прилагаемой формулы изобретения.
Claims (26)
1. Слитый белок, содержащий, от амино-конца к карбоксильному концу:
(a) полипептид связывающего домена, который связывается с биологической молекулой-мишенью;
(b) пептид шарнирной области IgG1 человека, имеющий один цистеин;
(c) полипептид константной области СН2 тяжелой цепи иммуноглобулина;
и
(d) полипептид константной области СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина, причем слитый белок, представляющий собой смесь мономеров и димеров, имеет антителозависимую опосредованную клетками цитотоксичность, комплемент-зависимую цитотоксичность или оба вида цитотоксичности.
(a) полипептид связывающего домена, который связывается с биологической молекулой-мишенью;
(b) пептид шарнирной области IgG1 человека, имеющий один цистеин;
(c) полипептид константной области СН2 тяжелой цепи иммуноглобулина;
и
(d) полипептид константной области СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина, причем слитый белок, представляющий собой смесь мономеров и димеров, имеет антителозависимую опосредованную клетками цитотоксичность, комплемент-зависимую цитотоксичность или оба вида цитотоксичности.
2. Слитый белок по п.1, в котором полипептид связывающего домена представляет собой одноцепочечный полипептид Fv.
3. Слитый белок по п.2, в котором вариабельные области тяжелой и легкой цепи одноцепочечного Fv присоединены полипептидным линкером, который включает по меньшей мере один полипептид, имеющий аминокислотную последовательность Gly-Gly-Gly-Gly-Ser [SEQ ID NO:21].
4. Слитый белок по одному из пп.1-3, где биологическая молекула-мишень находится на поверхности клетки-мишени.
5. Слитый белок по одному из пп.1-3, где слитый белок способен связываться с В-клеточными мишенями.
6. Слитый белок по п.5, где В-клеточная мишень представляет собой CD37.
7. Слитый белок по п.5, в котором полипептид связывающего домена иммуноглобулина включает одноцепочечный полипептид Fv G28-1.
8. Слитый белок по п.5, где В-клеточная мишень представляет собой CD20.
9. Слитый белок по одному из пп.1-3, где биологическая молекула-мишень представляет собой CD19, CD22, лиганд CD30, CD54, CD106 или интерлейкин-12.
10. Слитый белок по одному из пп.1-3, где биологическая молекула-мишень представляет собой CD2, CD5, CD10, CD27, CD28, CD40, CTLA-4, 4-1BB, лиганд 4-1BB, интерферон-γ, интерлейкин-4 или интерлейкин-17.
11. Слитый белок по одному из пп.1-3, где биологическая молекула-мишень представляет собой CD59, CD48, CD72, CD70, CD86/B7.2, лиганд CD40, CD43 или VLA-4 (α4β7).
12. Слитый белок по одному из пп.1-3, где биологическая молекула-мишень представляет собой CD83 или DEC-205.
13. Слитый белок по одному из пп.1-3, где биологическая молекула-мишень представляет собой HER1, HER2, HER3, HER4, фактор роста эндотелиальных клеток сосудов, инсулиноподобный фактор роста I, инсулиноподобный фактор роста II, MUC-1, NY-ESO-1, NA 17-А, мелан-A/MART-1, тирозиназу, Gp-100, MAGE, BAGE, GAGE, антиген HOM-MEL-40, кодируемый геном SSX2, онкофетальный антиген или PyLT.
14. Слитый белок по одному из пп.1-3, где биологическая молекула-мишень представляет собой рецептор интерлейкина-17, рецептор эпидермального фактора роста, рецептор фактора роста эндотелиальных клеток сосудов, рецептор трансферрина, рецептор эстрогена, рецептор прогестерона, рецептор фолликулостимулирующего гормона, рецептор ретиноевой кислоты или рецептор СТА-класса.
15. Слитый белок по одному из пп.1-14, в котором иммуноглобулин-связывающий домен гуманизирован.
16. Слитый белок по одному из пп.1-15, в котором полипептиды константных областей СH2 и СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина являются полипептидами константных областей СН2 и СН3 IgG1.
17. Фармацевтическая композиция для лечения В-клеточного расстройства, содержащая терапевтически эффективное количество слитого белка по одному из пп.1-16 и физиологически приемлемый носитель.
18. Фармацевтическая композиция по п.17, где В-клеточное расстройство представляет собой злокачественное состояние или аутоиммунное заболевание.
19. Фармацевтическая композиция по п.18, где злокачественное состояние представляет собой В-клеточную лимфому.
20. Фармацевтическая композиция по п.18, где злокачественное состояние представляет собой хронический лимфоцитарный лейкоз.
21. Фармацевтическая композиция по п.18, где аутоиммунное заболевание представляет собой ревматоидный артрит, псориаз, системную красную волчанку, миастению, болезнь Грейвса, сахарный диабет типа I, рассеянный склероз, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, тиреоидит Хашимото, синдром Шегрена, иммунную тромбоцитопеническую пурпуру, склеродерму, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона или язвенный колит.
22. Способ лечения В-клеточного расстройства, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества слитого белка по одному из пп.1-16.
23. Способ по п.22, где В-клеточное расстройство представляет собой злокачественное состояние или аутоиммунное заболевание.
24. Способ по п.23, где злокачественное состояние представляет собой В- клеточную лимфому.
25. Способ по п.23, где злокачественное состояние представляет собой хронический лимфоцитарный лейкоз.
26. Способ по п.23, где аутоиммунное заболевание представляет собой ревматоидный артрит, псориаз, системную красную волчанку, миастению, болезнь Грейвса, сахарный диабет типа I, рассеянный склероз, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, тиреоидит Хашимото, синдром Шегрена, иммунную тромбоцитопеническую пурпуру, склеродерму, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона или язвенный колит.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US76520801A | 2001-01-17 | 2001-01-17 | |
US09/765,208 | 2001-01-17 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2003125266A RU2003125266A (ru) | 2005-01-20 |
RU2420537C2 true RU2420537C2 (ru) | 2011-06-10 |
Family
ID=25072937
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2003125266/10A RU2420537C2 (ru) | 2001-01-17 | 2002-01-17 | Слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
EP (3) | EP2706116A1 (ru) |
JP (4) | JP2004525620A (ru) |
KR (1) | KR100927261B1 (ru) |
CN (3) | CN101684158A (ru) |
AU (1) | AU2002241922B2 (ru) |
CA (1) | CA2433877C (ru) |
IL (2) | IL156955A0 (ru) |
MX (1) | MXPA03006358A (ru) |
NZ (1) | NZ527591A (ru) |
PL (1) | PL364623A1 (ru) |
RU (1) | RU2420537C2 (ru) |
WO (1) | WO2002056910A1 (ru) |
ZA (1) | ZA200305098B (ru) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2636355C2 (ru) * | 2012-10-02 | 2017-11-22 | Женёро Са | Соединения для лечения блокады ремиелинизации при заболеваниях, связанных с экспрессией белка оболочки herv-w |
RU2648157C2 (ru) * | 2012-07-18 | 2018-03-22 | Аподжиникс Аг | КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ СМЕСЬ ИЗОФОРМ CD95-Fc |
RU2707535C2 (ru) * | 2017-12-28 | 2019-11-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Генетическая конструкция, кодирующая структуру т-клеточного химерного рецептора на основе одноцепочечных vhh-антител, специфичных опухолевому рецептору cd47, для нацеленной иммунотерапии злокачественных новообразований |
RU2737882C2 (ru) * | 2013-11-27 | 2020-12-04 | Займворкс Инк. | Биспецифические антигенсвязывающие конструкции против her2 |
Families Citing this family (121)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1176195B1 (en) | 1999-04-09 | 2013-05-22 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Method for controlling the activity of immunologically functional molecule |
US6946292B2 (en) | 2000-10-06 | 2005-09-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity |
US20030133939A1 (en) | 2001-01-17 | 2003-07-17 | Genecraft, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
US7754208B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
US7829084B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-11-09 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding constructs and methods for use thereof |
US8287864B2 (en) | 2002-02-14 | 2012-10-16 | Immunomedics, Inc. | Structural variants of antibodies for improved therapeutic characteristics |
AU2003208415B2 (en) * | 2002-02-14 | 2009-05-28 | Immunomedics, Inc. | Anti-CD20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use |
EP1578447A4 (en) | 2002-10-31 | 2009-06-03 | Genentech Inc | METHODS AND COMPOSITIONS THAT CAN INCREASE ANTIBODY PRODUCTION |
US7575893B2 (en) | 2003-01-23 | 2009-08-18 | Genentech, Inc. | Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture |
US7754209B2 (en) | 2003-07-26 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals | Binding constructs and methods for use thereof |
BRPI0510915A (pt) | 2004-06-04 | 2007-11-13 | Genentech Inc | método para o tratamento da esclerose múltipla e artigo manufaturado |
JP2008509666A (ja) * | 2004-08-11 | 2008-04-03 | トルビオン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 結合ドメイン融合タンパク質 |
WO2006134494A2 (en) | 2005-02-03 | 2006-12-21 | Coda Therapeutics Limited | Anti-connexin compounds and therapeutic uses thereof |
US20060263357A1 (en) | 2005-05-05 | 2006-11-23 | Tedder Thomas F | Anti-CD19 antibody therapy for autoimmune disease |
KR101289537B1 (ko) | 2005-02-15 | 2013-07-31 | 듀크 유니버시티 | 항-cd19 항체 및 종양학에서 이의 용도 |
US8349332B2 (en) | 2005-04-06 | 2013-01-08 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Multiple signaling pathways induced by hexavalent, monospecific and bispecific antibodies for enhanced toxicity to B-cell lymphomas and other diseases |
US8475794B2 (en) | 2005-04-06 | 2013-07-02 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Combination therapy with anti-CD74 antibodies provides enhanced toxicity to malignancies, Autoimmune disease and other diseases |
CN100475965C (zh) * | 2005-07-22 | 2009-04-08 | 上海高科联合生物技术研发有限公司 | 一种大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法 |
US7923538B2 (en) | 2005-07-22 | 2011-04-12 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd | Recombinant antibody composition |
WO2007011041A1 (ja) * | 2005-07-22 | 2007-01-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | 遺伝子組換え抗体組成物 |
AU2006272597A1 (en) | 2005-07-25 | 2007-02-01 | Emergent Product Development Seattle Llc | Single dose use of CD20-specific binding molecules |
PL1912675T3 (pl) | 2005-07-25 | 2014-10-31 | Emergent Product Dev Seattle | Zmniejszanie liczby komórek B za pomocą cząsteczek wiążących swoistych dla antygenów CD37 i CD20 |
TW200732350A (en) * | 2005-10-21 | 2007-09-01 | Amgen Inc | Methods for generating monovalent IgG |
MY149159A (en) | 2005-11-15 | 2013-07-31 | Hoffmann La Roche | Method for treating joint damage |
CA2631184A1 (en) * | 2005-11-28 | 2007-05-31 | Genmab A/S | Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof |
JP5175214B2 (ja) | 2005-12-30 | 2013-04-03 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 改良された安定性を有するインターロイキン−12p40変種 |
BRPI0620795A2 (pt) | 2005-12-30 | 2011-11-22 | Merck Patent Ges Mit Beschronkter Haftung | anticorpos anti-cd19 imunogenicidade reduzida |
EP1806365A1 (en) | 2006-01-05 | 2007-07-11 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them |
US7625564B2 (en) | 2006-01-27 | 2009-12-01 | Novagen Holding Corporation | Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo |
EP2540741A1 (en) | 2006-03-06 | 2013-01-02 | Aeres Biomedical Limited | Humanized anti-CD22 antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease |
MX363905B (es) | 2006-06-12 | 2019-04-08 | Aptevo Res & Development Llc | Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora. |
RU2542471C2 (ru) | 2006-11-15 | 2015-02-20 | Коуда Терапьютикс, Инк. | Улучшенные способы и композиции для заживления ран |
US20100062004A1 (en) | 2006-12-19 | 2010-03-11 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against gpcrs and polypeptides comprising the same for the treatment of gpcr-related diseases and disorders |
EP2514767A1 (en) | 2006-12-19 | 2012-10-24 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against a metalloproteinase from the ADAM family and polypeptides comprising the same for the treatment of ADAM-related diseases and disorders |
EP2703011A3 (en) | 2007-05-07 | 2014-03-26 | MedImmune, LLC | Anti-icos antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease |
MX2009013004A (es) | 2007-06-01 | 2010-01-20 | Univ Maryland | Agentes de union al receptor de la region constante fc de inmunoglobulina. |
PE20090368A1 (es) | 2007-06-19 | 2009-04-28 | Boehringer Ingelheim Int | Anticuerpos anti-igf |
BRPI0814465B1 (pt) | 2007-07-26 | 2021-11-23 | Novagen Holding Corporation | Proteína de fusão, dímero, método para produzir uma proteína de fusão, linhagem de célula, usos de uma proteína de fusão e de uma composição farmacêutica e composição farmacêutica |
KR20100097716A (ko) | 2007-11-27 | 2010-09-03 | 아블린쓰 엔.브이. | 이종이량체 사이토킨 및/또는 이의 수용체에 대한 아미노산 서열과 이를 포함하는 폴리펩티드 |
AU2009235467A1 (en) | 2008-04-07 | 2009-10-15 | Ablynx Nv | Single variable domains against the Notch pathways |
WO2009126944A1 (en) | 2008-04-11 | 2009-10-15 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof |
KR20110033233A (ko) | 2008-07-21 | 2011-03-30 | 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 | 개선된 치료 특성을 갖는 항체의 구조 변이체 |
AR073295A1 (es) | 2008-09-16 | 2010-10-28 | Genentech Inc | Metodos para tratar la esclerosis multiple progresiva. articulo de fabricacion. |
KR20190064664A (ko) * | 2008-10-02 | 2019-06-10 | 압테보 리서치 앤드 디벨롭먼트 엘엘씨 | Cd86 길항제 다중-표적 결합 단백질 |
CN110317272A (zh) * | 2008-10-14 | 2019-10-11 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 免疫球蛋白变体及其用途 |
CN102203618B (zh) | 2008-10-30 | 2014-10-15 | 郭培宣 | 用于dna测序和其他用途的膜集成病毒dna包装马达蛋白连接器生物传感器 |
US20110293605A1 (en) | 2008-11-12 | 2011-12-01 | Hasige Sathish | Antibody formulation |
DK2376116T3 (en) | 2008-12-12 | 2016-02-29 | Boehringer Ingelheim Int | The anti-IGF antibodies. |
WO2010075249A2 (en) | 2008-12-22 | 2010-07-01 | Genentech, Inc. | A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists |
AU2010260476A1 (en) | 2009-03-11 | 2011-10-13 | Wyeth Llc | Methods of purifying small modular immunopharmaceutical proteins |
SG174862A1 (en) | 2009-04-10 | 2011-11-28 | Ablynx Nv | Improved amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of il-6r related diseases and disorder |
WO2010123119A1 (ja) * | 2009-04-23 | 2010-10-28 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | 炎症性腸疾患治療剤およびそのスクリーニング方法 |
KR20180056805A (ko) * | 2009-06-04 | 2018-05-29 | 노파르티스 아게 | IgG 콘쥬게이션을 위한 자리의 확인 방법 |
KR101852204B1 (ko) | 2009-06-05 | 2018-04-26 | 아블린쓰 엔.브이. | 기도 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 일가, 이가 및 삼가 항 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (hrsv) 나노바디 구조물 |
US20110172398A1 (en) | 2009-10-02 | 2011-07-14 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Bispecific binding molecules for anti-angiogenesis therapy |
UY32917A (es) | 2009-10-02 | 2011-04-29 | Boehringer Ingelheim Int | Moléculas de unión a dll-4 |
KR101119995B1 (ko) * | 2009-11-10 | 2012-03-16 | 한국기초과학지원연구원 | 단백질 상호작용 억제제 선별방법 |
EP2507262A1 (en) | 2009-11-30 | 2012-10-10 | Ablynx N.V. | Improved amino acid sequences directed against human respiratory syncytial virus (hrsv) and polypeptides comprising the same for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections |
EP3309176A1 (en) | 2009-12-14 | 2018-04-18 | Ablynx N.V. | Immunoglobulin single variable domain antibodies against ox40l, constructs and therapeutic use |
EP2516467A2 (en) | 2009-12-23 | 2012-10-31 | Emergent Product Development Seattle, LLC | Compositions comprising tnf-alpha and il-6 antagonists and methods of use thereof |
CN105693861A (zh) | 2009-12-29 | 2016-06-22 | 新兴产品开发西雅图有限公司 | 异二聚体结合蛋白及其应用 |
WO2011083141A2 (en) | 2010-01-08 | 2011-07-14 | Ablynx Nv | Method for generation of immunoglobulin sequences by using lipoprotein particles |
TWI513466B (zh) | 2010-01-20 | 2015-12-21 | Boehringer Ingelheim Int | 抗凝血劑解毒劑 |
RU2573994C2 (ru) | 2010-02-10 | 2016-01-27 | Иммьюноджен, Инк | Антитела против cd20 и их применение |
EP2571901B1 (en) | 2010-05-20 | 2019-01-02 | Ablynx N.V. | Biological materials related to her3 |
BR112013002074B1 (pt) | 2010-07-28 | 2021-09-14 | Gliknik Inc | Composto homodimérico, dímero ou multímero de ordem superior do composto homodimérico, composição, composto, multímero e usos dos mesmos |
US9428546B2 (en) | 2010-07-30 | 2016-08-30 | Pfizer Inc. | Tandem purification of proteins |
WO2012022734A2 (en) | 2010-08-16 | 2012-02-23 | Medimmune Limited | Anti-icam-1 antibodies and methods of use |
GB201014033D0 (en) * | 2010-08-20 | 2010-10-06 | Ucb Pharma Sa | Biological products |
US20120225081A1 (en) | 2010-09-03 | 2012-09-06 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Vegf-binding molecules |
EP2638068B1 (en) | 2010-11-08 | 2018-12-26 | Novartis AG | Cxcr2 binding polypeptides |
EP3974453A3 (en) | 2010-11-16 | 2022-08-03 | Amgen Inc. | Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression |
TWI743461B (zh) * | 2011-03-28 | 2021-10-21 | 法商賽諾菲公司 | 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白 |
EP2691156A1 (en) | 2011-03-30 | 2014-02-05 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Anticoagulant antidotes |
US20130078247A1 (en) | 2011-04-01 | 2013-03-28 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Bispecific binding molecules binding to dii4 and ang2 |
US9527925B2 (en) | 2011-04-01 | 2016-12-27 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2 |
JP4857396B1 (ja) * | 2011-04-13 | 2012-01-18 | 日本製薬株式会社 | 融合蛋白質 |
UA117218C2 (uk) | 2011-05-05 | 2018-07-10 | Мерк Патент Гмбх | Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f |
CA2837169C (en) | 2011-05-24 | 2021-11-09 | Zyngenia, Inc. | Multispecific complexes comprising angiopoietin-2-binding peptide and their uses |
US8952134B2 (en) * | 2011-09-26 | 2015-02-10 | Jn Biosciences Llc | Hybrid constant regions |
US20130122005A1 (en) | 2011-10-27 | 2013-05-16 | Paul Adam | Anticancer combination therapy |
ES2729165T3 (es) | 2012-03-30 | 2019-10-30 | Boehringer Ingelheim Int | Moléculas de unión a ANG2 |
SG10201608307WA (en) | 2012-04-20 | 2016-11-29 | Emergent Product Dev Seattle | Cd3 binding polypeptides |
US9328174B2 (en) | 2012-05-09 | 2016-05-03 | Novartis Ag | Chemokine receptor binding polypeptides |
JP6273205B2 (ja) | 2012-10-05 | 2018-01-31 | 協和発酵キリン株式会社 | ヘテロダイマータンパク質組成物 |
KR102168562B1 (ko) * | 2012-11-19 | 2020-10-22 | 발리오팜 아게 | Cd20 및 cd95에 결합하는 재조합 이중특이성 항체 |
US20140255413A1 (en) | 2013-03-07 | 2014-09-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Combination therapy for neoplasia treatment |
BR112015023752B1 (pt) | 2013-03-15 | 2023-11-14 | Zyngenia, Inc. | Domínio de reconhecimento modular (mrd), complexo compreendendo mrd e cetuximabe, usos do complexo para inibir a angiogênese e tratar câncer e composição farmacêutica compreendendo o dito complexo |
US9914770B2 (en) | 2013-04-30 | 2018-03-13 | Intas Pharmaceuticals Ltd | Cloning, expression and purification method for the preparation of ranibizumab |
WO2015050959A1 (en) | 2013-10-01 | 2015-04-09 | Yale University | Anti-kit antibodies and methods of use thereof |
NL2013661B1 (en) | 2014-10-21 | 2016-10-05 | Ablynx Nv | KV1.3 Binding immunoglobulins. |
CN114010788A (zh) | 2014-08-22 | 2022-02-08 | 奥克兰联合服务有限公司 | 通道调节剂 |
CN104922670A (zh) * | 2015-05-06 | 2015-09-23 | 武汉奥斯梅得生物医药有限公司 | 融合免疫蛋白在制备治疗多发性硬化症药物中的应用 |
BR112017026713A2 (pt) * | 2015-06-12 | 2018-08-28 | Ubi Pharma Inc | proteínas de fusão de imunoglobulina e usos das mesmas |
JP7002446B2 (ja) | 2015-09-21 | 2022-03-04 | アプティーボ リサーチ アンド デベロップメント エルエルシー | Cd3結合ポリペプチド |
CN109311966B (zh) | 2015-10-25 | 2023-03-10 | 赛诺菲 | 用于预防或治疗hiv感染的三特异性和/或三价结合蛋白 |
KR20180134378A (ko) * | 2016-04-13 | 2018-12-18 | 사노피 | 3특이성 및/또는 3가 결합 단백질 |
RS64771B1 (sr) | 2016-04-13 | 2023-11-30 | Sanofi Sa | Trispecifični i/ili trovalentni vezujući proteini |
CN109312304A (zh) * | 2016-04-20 | 2019-02-05 | 弗雷德哈钦森癌症研究中心 | 免疫调节性il2r融合蛋白及其用途 |
PL3458478T3 (pl) | 2016-05-18 | 2021-06-28 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Przeciwciała anty pd-1 i anty-lag3 do leczenia nowotworu |
WO2017214321A1 (en) | 2016-06-07 | 2017-12-14 | Gliknik Inc. | Cysteine-optimized stradomers |
JP7222888B2 (ja) | 2016-11-16 | 2023-02-15 | アブリンクス エン.ヴェー. | Cd123及びtcrアルファ/ベータに結合することが可能なt細胞動員ポリペプチド |
CN110248962A (zh) * | 2016-12-06 | 2019-09-17 | 希望之城 | 半胱氨酸肽使能抗体 |
JP2020500856A (ja) | 2016-12-09 | 2020-01-16 | グリックニック インコーポレイテッド | 多価fc化合物を用いる炎症性疾患の治療方法 |
PE20191354A1 (es) | 2016-12-09 | 2019-10-01 | Gliknik Inc | Optimizacion de fabricacion de gl-2045, un stradomer multimerizante |
EP3360898A1 (en) | 2017-02-14 | 2018-08-15 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Bispecific anti-tnf-related apoptosis-inducing ligand receptor 2 and anti-cadherin 17 binding molecules for the treatment of cancer |
US20180230218A1 (en) | 2017-01-04 | 2018-08-16 | Immunogen, Inc. | Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof |
MX2019014199A (es) | 2017-06-02 | 2020-01-23 | Boehringer Ingelheim Int | Tratamiento de combinacion antineoplasico. |
EP3569618A1 (en) | 2018-05-19 | 2019-11-20 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Antagonizing cd73 antibody |
WO2020014306A1 (en) | 2018-07-10 | 2020-01-16 | Immunogen, Inc. | Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof |
GB201818477D0 (en) | 2018-11-13 | 2018-12-26 | Emstopa Ltd | Tissue plasminogen activator antibodies and method of use thereof |
CN109679920B (zh) * | 2018-12-26 | 2019-11-22 | 北京贝来生物科技有限公司 | 一种表达il-17a信号通路阻断剂的间充质干细胞 |
US11613576B2 (en) | 2019-04-09 | 2023-03-28 | Sanofi | Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof |
CN110305874A (zh) * | 2019-06-19 | 2019-10-08 | 浙江省肿瘤医院 | 长爪沙鼠免疫球蛋白IgG1、IgG2重组蛋白、基因及其应用 |
TW202128756A (zh) | 2019-10-02 | 2021-08-01 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 用於癌症治療之多重專一性結合蛋白 |
EP4153316A1 (en) | 2020-05-19 | 2023-03-29 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Binding molecules for the treatment of cancer |
EP4232476A2 (en) | 2020-10-21 | 2023-08-30 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Agonistic trkb binding molecules for the treatment of eye diseases |
WO2022178255A2 (en) | 2021-02-19 | 2022-08-25 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Single domain antibodies that neutralize sars-cov-2 |
EP4342908A1 (en) * | 2021-06-17 | 2024-03-27 | Fapon Biotech Inc. | Chimeric immunoglobulin |
EP4355778A1 (en) | 2021-06-17 | 2024-04-24 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Novel tri-specific binding molecules |
US20240052065A1 (en) | 2022-07-15 | 2024-02-15 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Binding molecules for the treatment of cancer |
Family Cites Families (71)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US783039A (en) | 1904-04-20 | 1905-02-21 | Fred Hirsh | Clasp. |
US4769330A (en) | 1981-12-24 | 1988-09-06 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus and methods for making and using the same |
NZ201418A (en) | 1982-07-28 | 1986-08-08 | Barmac Ass Ltd | Mineral breaker with centrifugal breaking action |
US4737462A (en) | 1982-10-19 | 1988-04-12 | Cetus Corporation | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β |
US4870009A (en) | 1982-11-22 | 1989-09-26 | The Salk Institute For Biological Studies | Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4518584A (en) | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
US4745051A (en) | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
US5175269A (en) | 1984-01-30 | 1992-12-29 | Enzo Diagnostics, Inc. | Compound and detectable molecules having an oligo- or polynucleotide with modifiable reactive group |
US5118627A (en) | 1984-02-27 | 1992-06-02 | Amgen | Papova virus construction |
US4952496A (en) | 1984-03-30 | 1990-08-28 | Associated Universities, Inc. | Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase |
US5212286A (en) | 1984-04-19 | 1993-05-18 | Scios Nova Inc. | Atrial natriuretic/vasodilator peptide compounds |
US4719179A (en) | 1984-11-30 | 1988-01-12 | Pharmacia P-L Biochemicals, Inc. | Six base oligonucleotide linkers and methods for their use |
US5168062A (en) | 1985-01-30 | 1992-12-01 | University Of Iowa Research Foundation | Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence |
GB8508845D0 (en) | 1985-04-04 | 1985-05-09 | Hoffmann La Roche | Vaccinia dna |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
US4704692A (en) | 1986-09-02 | 1987-11-03 | Ladner Robert C | Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US5869620A (en) | 1986-09-02 | 1999-02-09 | Enzon, Inc. | Multivalent antigen-binding proteins |
US5075109A (en) | 1986-10-24 | 1991-12-24 | Southern Research Institute | Method of potentiating an immune response |
US5220013A (en) | 1986-11-17 | 1993-06-15 | Scios Nova Inc. | DNA sequence useful for the detection of Alzheimer's disease |
US5187153A (en) | 1986-11-17 | 1993-02-16 | Scios Nova Inc. | Methods of treatment using Alzheimer's amyloid polypeptide derivatives |
IL85035A0 (en) | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
US5229279A (en) | 1987-06-29 | 1993-07-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for producing novel polyester biopolymers |
US5892019A (en) | 1987-07-15 | 1999-04-06 | The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services | Production of a single-gene-encoded immunoglobulin |
US4897268A (en) | 1987-08-03 | 1990-01-30 | Southern Research Institute | Drug delivery system and method of making the same |
WO1989001973A2 (en) | 1987-09-02 | 1989-03-09 | Applied Biotechnology, Inc. | Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens |
US5223483A (en) | 1987-10-22 | 1993-06-29 | Merck & Co., Inc. | Cysteine-modified acidic fibroblast growth factor |
JP3095168B2 (ja) | 1988-02-05 | 2000-10-03 | エル. モリソン,シェリー | ドメイン‐変性不変部を有する抗体 |
US5109124A (en) | 1988-06-01 | 1992-04-28 | Biogen, Inc. | Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
EP0454781B1 (en) | 1989-01-23 | 1998-12-16 | Chiron Corporation | Recombinant cells for therapies of infection and hyperproliferative disorders and preparation thereof |
US5215907A (en) | 1989-02-24 | 1993-06-01 | Oklahoma Medical Research Foundation | Thermostable acid protease from sulfolobus acidocaldarius |
US5173403A (en) | 1989-02-24 | 1992-12-22 | Oklahoma Medical Research Foundation | Thermostable acid protease from sulfolobus acidocaldarius and gene |
US5242687A (en) | 1989-03-15 | 1993-09-07 | Tkb Associates Limited Partnership | Method of reducing cellular immune response involving T-cells using CD8-bearing antigen presenting cells |
US5244805A (en) | 1989-05-17 | 1993-09-14 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Baculovirus expression vectors |
US5155037A (en) | 1989-08-04 | 1992-10-13 | The Texas A&M University System | Insect signal sequences useful to improve the efficiency of processing and secretion of foreign genes in insect systems |
EP1001032A3 (en) | 1989-08-18 | 2005-02-23 | Chiron Corporation | Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells |
US5218088A (en) | 1989-11-02 | 1993-06-08 | Purdue Research Foundation | Process for preparing dithiophosphate oligonucleotide analogs via nucleoside thiophosphoramidite intermediates |
US5283173A (en) | 1990-01-24 | 1994-02-01 | The Research Foundation Of State University Of New York | System to detect protein-protein interactions |
JPH05503015A (ja) | 1990-02-28 | 1993-05-27 | シェリング・コーポレーション | 哺乳類発現ベクター |
KR920003787B1 (ko) | 1990-03-05 | 1992-05-14 | 한국과학기술 연구원 | 신규 플라스미드 제조 및 그를 함유한 균주를 배양하여 아이 지 에프-1(igf-1)을 생산하는 방법 |
US5212058A (en) | 1990-05-09 | 1993-05-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Nucleic acid encoding ubiquitin-specific proteases |
US5122463A (en) | 1990-05-17 | 1992-06-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for trans-destabilization of specific proteins in vivo and dna molecules useful therefor |
DE4017595A1 (de) | 1990-05-31 | 1991-12-05 | Consortium Elektrochem Ind | Maltopentaose produzierende amylasen |
US5169784A (en) | 1990-09-17 | 1992-12-08 | The Texas A & M University System | Baculovirus dual promoter expression vector |
US5266317A (en) | 1990-10-04 | 1993-11-30 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Insect-specific paralytic neurotoxin genes for use in biological insect control: methods and compositions |
JPH06508133A (ja) * | 1991-05-31 | 1994-09-14 | ジェネンテク,インコーポレイテッド | Hivに関連した免疫性の血小板減少性紫斑病の治療 |
AU659482B2 (en) | 1991-06-28 | 1995-05-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Localized oligonucleotide therapy |
AU2143992A (en) | 1991-08-16 | 1993-03-16 | Vical, Inc. | Composition and method for treating cystic fibrosis |
US5243041A (en) | 1991-08-22 | 1993-09-07 | Fernandez Pol Jose A | DNA vector with isolated CDNA gene encoding metallopanstimulin |
WO1993025234A1 (en) | 1992-06-08 | 1993-12-23 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for targeting specific tissue |
EP0644946A4 (en) | 1992-06-10 | 1997-03-12 | Us Health | VECTOR PARTICLES RESISTANT TO HUMAN SERUM INACTIVATION. |
US5596090A (en) | 1992-07-24 | 1997-01-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Antisense oligonucleotides directed against human VCAM-1 RNA |
GB2269175A (en) | 1992-07-31 | 1994-02-02 | Imperial College | Retroviral vectors |
ES2144440T3 (es) * | 1992-08-18 | 2000-06-16 | Centro Inmunologia Molecular | Anticuerpos monoclonales que reconocen el receptor del factor de crecimiento epidermico, celulas y metodos para su produccion y compuestos que los contienen. |
ZA936260B (en) * | 1992-09-09 | 1994-03-18 | Smithkline Beecham Corp | Novel antibodies for conferring passive immunity against infection by a pathogen in man |
WO1994011026A2 (en) * | 1992-11-13 | 1994-05-26 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma |
US5736137A (en) * | 1992-11-13 | 1998-04-07 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma |
US5795572A (en) | 1993-05-25 | 1998-08-18 | Bristol-Myers Squibb Company | Monoclonal antibodies and FV specific for CD2 antigen |
US5571711A (en) | 1993-06-17 | 1996-11-05 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules coding for BAGE tumor rejection antigen precursors |
WO1995009917A1 (en) * | 1993-10-07 | 1995-04-13 | The Regents Of The University Of California | Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies |
DK0668350T4 (da) | 1994-02-16 | 2009-02-23 | Us Gov Health & Human Serv | Melanomassocieret antigen, epitoper deraf samt vacciner mod melanom |
HU221001B1 (hu) * | 1994-03-17 | 2002-07-29 | Merck Patent Gmbh. | Egyláncú anti-EGFR Fv-k és anti-EGFR ellenanyagok |
US5888773A (en) | 1994-08-17 | 1999-03-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of producing single-chain Fv molecules |
US5876950A (en) * | 1995-01-26 | 1999-03-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy |
US5821122A (en) | 1995-06-07 | 1998-10-13 | Inserm (Institute Nat'l De La Sante Et De La Recherche . .) | Isolated nucleic acid molecules, peptides which form complexes with MHC molecule HLA-A2 and uses thereof |
JPH0975090A (ja) | 1995-09-13 | 1997-03-25 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 細胞付着部材 |
GB9809280D0 (en) * | 1998-04-30 | 1998-07-01 | Rpms Technology Ltd | Immunosupression |
WO2000027885A1 (fr) * | 1998-11-05 | 2000-05-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouveau popypeptide chimerique |
EP1151002A4 (en) * | 1999-01-29 | 2002-05-02 | Imclone Systems Inc | KDR-SPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOF |
-
2002
- 2002-01-17 NZ NZ527591A patent/NZ527591A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-01-17 EP EP13178315.1A patent/EP2706116A1/en not_active Withdrawn
- 2002-01-17 EP EP20020707519 patent/EP1361892A4/en not_active Withdrawn
- 2002-01-17 WO PCT/US2002/001487 patent/WO2002056910A1/en active Application Filing
- 2002-01-17 EP EP10182383A patent/EP2316951A1/en not_active Withdrawn
- 2002-01-17 IL IL15695502A patent/IL156955A0/xx unknown
- 2002-01-17 CN CN200910165059A patent/CN101684158A/zh active Pending
- 2002-01-17 RU RU2003125266/10A patent/RU2420537C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-01-17 MX MXPA03006358A patent/MXPA03006358A/es active IP Right Grant
- 2002-01-17 JP JP2002557417A patent/JP2004525620A/ja not_active Withdrawn
- 2002-01-17 CN CNB028038207A patent/CN1268394C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-17 CN CN2006100936924A patent/CN1911965B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-17 KR KR1020037009474A patent/KR100927261B1/ko active IP Right Grant
- 2002-01-17 CA CA2433877A patent/CA2433877C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-17 AU AU2002241922A patent/AU2002241922B2/en not_active Ceased
- 2002-01-17 PL PL02364623A patent/PL364623A1/xx not_active Application Discontinuation
-
2003
- 2003-06-30 ZA ZA200305098A patent/ZA200305098B/en unknown
-
2008
- 2008-06-18 JP JP2008159145A patent/JP2008260781A/ja not_active Withdrawn
-
2009
- 2009-11-22 IL IL202255A patent/IL202255A0/en unknown
-
2010
- 2010-06-02 JP JP2010126883A patent/JP2010209112A/ja active Pending
-
2012
- 2012-11-26 JP JP2012257362A patent/JP2013049707A/ja not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MICHAELSEN et al., "One disulfide bond in front of the * |
WANG et al. "Human single-chain Fv immunoconjugates targeted to a melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan mediate specific lysis of human melanoma cells by natural killer cells and complement", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, Vol.96, стр.1627-1632. * |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2648157C2 (ru) * | 2012-07-18 | 2018-03-22 | Аподжиникс Аг | КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ СМЕСЬ ИЗОФОРМ CD95-Fc |
RU2648146C2 (ru) * | 2012-07-18 | 2018-03-22 | Аподжиникс Аг | Укороченные варианты cd95-f-c |
RU2636355C2 (ru) * | 2012-10-02 | 2017-11-22 | Женёро Са | Соединения для лечения блокады ремиелинизации при заболеваниях, связанных с экспрессией белка оболочки herv-w |
US9840550B2 (en) | 2012-10-02 | 2017-12-12 | Geneuro S.A. | Compounds for treating the remyelination blockade in diseases associated with the expression of HERV-W envelope protein |
US10752675B2 (en) | 2012-10-02 | 2020-08-25 | Geneuro S.A. | Compounds for treating the remyelination blockade in diseases associated with the expression of HERV-W envelope protein |
RU2737882C2 (ru) * | 2013-11-27 | 2020-12-04 | Займворкс Инк. | Биспецифические антигенсвязывающие конструкции против her2 |
US10947319B2 (en) | 2013-11-27 | 2021-03-16 | Zymeworks Inc. | Bispecific antigen-binding constructs targeting HER2 |
US11325981B2 (en) | 2013-11-27 | 2022-05-10 | Zymeworks Inc. | Bispecific antigen-binding constructs targeting Her2 |
US11965036B2 (en) | 2013-11-27 | 2024-04-23 | Zymeworks Bc Inc. | Bispecific antigen-binding constructs targeting HER2 |
RU2707535C2 (ru) * | 2017-12-28 | 2019-11-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Генетическая конструкция, кодирующая структуру т-клеточного химерного рецептора на основе одноцепочечных vhh-антител, специфичных опухолевому рецептору cd47, для нацеленной иммунотерапии злокачественных новообразований |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2433877A1 (en) | 2002-07-25 |
KR20030066821A (ko) | 2003-08-09 |
JP2010209112A (ja) | 2010-09-24 |
ZA200305098B (en) | 2004-09-30 |
RU2003125266A (ru) | 2005-01-20 |
IL202255A0 (en) | 2010-06-16 |
CN1911965A (zh) | 2007-02-14 |
EP2706116A1 (en) | 2014-03-12 |
KR100927261B1 (ko) | 2009-11-18 |
CN101684158A (zh) | 2010-03-31 |
AU2002241922B2 (en) | 2007-10-25 |
IL156955A0 (en) | 2004-02-08 |
CN1486192A (zh) | 2004-03-31 |
EP1361892A4 (en) | 2004-10-13 |
CN1911965B (zh) | 2013-05-29 |
AU2002241922A2 (en) | 2002-07-30 |
PL364623A1 (en) | 2004-12-13 |
NZ527591A (en) | 2006-04-28 |
MXPA03006358A (es) | 2004-12-02 |
EP2316951A1 (en) | 2011-05-04 |
JP2013049707A (ja) | 2013-03-14 |
WO2002056910A1 (en) | 2002-07-25 |
CA2433877C (en) | 2014-11-18 |
JP2008260781A (ja) | 2008-10-30 |
EP1361892A1 (en) | 2003-11-19 |
CN1268394C (zh) | 2006-08-09 |
JP2004525620A (ja) | 2004-08-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2420537C2 (ru) | Слитые белки связывающий домен-иммуноглобулин | |
US9005612B2 (en) | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins | |
US8853366B2 (en) | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins | |
AU2002241922A1 (en) | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins | |
US7829084B2 (en) | Binding constructs and methods for use thereof | |
AU2008200400B2 (en) | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins | |
AU2012227176A1 (en) | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20111128 |
|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190118 |