CN109679920B - 一种表达il-17a信号通路阻断剂的间充质干细胞 - Google Patents

一种表达il-17a信号通路阻断剂的间充质干细胞 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种表达IL‑17A信号通路阻断剂的间充质干细胞，利用间充质干细胞对炎症部位的靶向作用及损伤部位的修复能力，将IL‑17A信号通路阻断剂靶向炎症部位，通过基因修饰使间充质干细胞特异表达IL‑17A信号通路阻断剂，特异性阻断IL‑17A与其受体的结合，从而调节人体免疫细胞功能，降低机体炎症反应，修复损伤的组织器官，进而达到治疗IL‑17A介导的自身免疫性疾病的目的。

Description

一种表达IL-17A信号通路阻断剂的间充质干细胞
技术领域
本发明属于干细胞领域，特别涉及表达IL-17A信号通路阻断剂的间充质干细胞及其制备方法。
背景技术
白细胞介素17(IL-17)是T辅助细胞17(Th17)活化产生的一种促炎症细胞因子，可直接或间接诱导多种细胞因子、趋化因子、炎症因子和抗微生物蛋白质，识别介导自身免疫和慢性感染的靶基因，因此在炎症反应、免疫调节、微生物与寄生虫感染方面起重要作用，在人细胞因子免疫调节网络中起关键调节作用。最新研究表明[1-2]，白细胞介素17A(IL-17A)作为促炎症因子IL-17家族的重要成员，与其膜表面受体IL-17RA结合后可激活效应细胞的NF-kB等炎症信号通路，从而引起下游一系列炎症因子(包括TNF-α、IL-1β及IL-6等)释放和炎症发生；IL-17A通过诱导趋化因子的释放来诱导中性粒细胞募集至炎症部位，刺激前列腺素和金属蛋白酶产生，以及抑制蛋白多糖合成，同时IL-17A可进一步促进趋化因子CCL20、CXCL1、3、5、6、8及VEGF等分泌，进而导致免疫细胞异常分化、过度增殖和激活。IL-17A也可以通过降低细胞间黏附因子的表达从而破坏细胞屏障[1,3]。
IL-17A受体包括5个成员：IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD、IL-17RE[4]。IL-17RA是IL-17R家族中研究最多的分子，其编码基因位于22号染色体上，是由27个氨基酸残基的N-末端信号肽、287个氨基酸残基的胞外结构域、21个氨基酸残基的跨膜结构域和525个氨基酸残基的异常长的胞质尾巴构成的单程跨膜蛋白质[5]。IL-17RA广泛表达于多种组织器官，通过与IL-17A结合，诱导促炎细胞分泌趋化因子及炎性因子，参与组织重塑，参与急性期炎症反应。
IL-17A具有强大的促炎作用，其与多种免疫类疾病如类风湿性关节炎、银屑病、慢性阻塞性肺炎等疾病密切相关。而最新开发的治疗自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、银屑病等)的新药中，Secukinumab、Brodalumab及Ixekizumab等单抗药物均针对IL-17A/IL-17RA信号通路而研发，通过阻断IL-17A与其受体的结合从而抑制人体关节或皮肤等组织器官的炎症反应，达到治疗类风湿关节炎或银屑病的目的[1,6-7]。
间充质干细胞(MSCs)来源于发育早期中胚层，因其具有免疫调节及组织损伤修复双重功能，从而在自身免疫性疾病治疗中具有良好的临床应用前景。MSCs对炎症部位有较好的归巢和靶向作用，并通过分泌大量的可溶性细胞因子(如转化生长因子β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)、前列腺素E2(PGE2)等)从而抑制免疫细胞增殖、活化，抑制过激的淋巴细胞增殖和炎症因子释放，改善炎症局部微环境等[8-10]。同时，间充质干细胞对损伤组织具有较强修复能力，其具有定向分化为内皮细胞替换损伤皮肤的能力，同时可通过分泌表皮生长因子(EGF)、角蛋白生长因子(KGF)等因子促进皮肤组织的损伤修复[11-12]。
本发明旨在利用间充质干细胞对炎症部位的靶向作用及损伤部位的修复能力，将IL-17A信号通路阻断剂靶向炎症部位，特异性阻断IL-17A与其受体的结合，从而调节人体免疫细胞功能，降低机体炎症反应，修复损伤的组织器官，进而达到治疗IL-17A介导的自身免疫性疾病的目的。
发明内容
针对上面的目标，发明人创造性地将间充质干细胞对炎症部位的靶向作用及损伤部位的修复能力与IL-17A信号通路阻断剂的抗炎症作用结合起来，通过基因修饰使间充质干细胞特异表达IL-17A信号通路阻断剂。
如前所述，IL-17A是一种促炎症细胞因子，其与受体结合后引起炎症反应，因此可通过阻断IL-17A与其受体的结合来抑制炎症反应。
因此，本发明的第一方面提供了一种表达IL-17A信号通路阻断剂的间充质干细胞，其包含编码IL-17A信号通路阻断剂的外源核酸序列，所述IL-17A信号通路阻断剂特异性阻断IL-17A与其受体的结合。
本发明中，IL-17A受体选自IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和IL-17RE，优选IL-17RA。
本发明中，“IL-17A信号通路阻断剂”是指任何能够特异性阻断IL-17A与其受体结合的物质，只要这种物质能够在间充质干细胞中特异性表达。例如，IL-17A信号通路阻断剂可以是IL-17A的类似物，通过竞争性结合IL-17A受体抑制IL-17A与其受体的结合。同样地，IL-17A信号通路阻断剂也可以是IL-17A受体(例如IL-17RA)的类似物，通过竞争性结合IL-17A抑制IL-17A与其受体的结合。
在一个特定的实施方案中，本发明所述IL-17A信号通路阻断剂是能够与IL-17A或其受体特异性结合的抗体或其抗原结合片段。由于信号转导需要IL-17A与其受体的结合，利用特异性抗体与它们两者其中之一相结合即可阻断该信号转导的进行。各种类型的抗体及抗原结合片段均可用于本发明，只要它们能够特异性结合IL-17A或其受体，从而阻断两者的结合。
在一个优选的实施方案中，所述IL-17A信号通路阻断剂是IL-17A单链抗体与IgG4的重链Fc片段组成的融合蛋白，长度为496个氨基酸残基，分子量约为60kD。其中，所述IL-17A单链抗体包含人IL-2信号肽(SEQ ID NO：1)、IL-17A抗体的轻链可变区(VL，SEQ ID NO：3)、接头(SEQ ID NO：5)和IL-17A抗体的重链可变区(VH，SEQ ID NO：7)四部分；所述IgG4的重链Fc片段包含人免疫球蛋白IgG4的重链恒定区的CH3(SEQ ID NO：9)和CH2(SEQ ID NO：11)以及铰链区(SEQ ID NO：13)三部分。所述IL-17A单链抗体的VL及VH两部分由接头序列链接，VL和VH的前后位置可更换，即：VL-接头-VH或VH-接头-VL。更优选地，所述外源核酸序列中编码人IL-2信号肽、IL-17A抗体轻链可变区(VL)、接头和IL-17A抗体重链可变区(VH)四部分的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2、4、6和8所示，编码人免疫球蛋白IgG4重链恒定区的CH3、CH2以及铰链区三部分的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：10、12和14所示。
现有技术中已知多种载体系统可以将外源核酸序列导入目标细胞，它们普遍为本领域技术人员所知，也均可用于本发明。其中，特别适合本发明的是慢病毒载体系统，其能够将外源核酸序列整合到目标细胞的基因组DNA中，从而实现稳定的表达。在本发明的特定实施方案中，使用了第四代慢病毒载体系统LV-EGFP。
由于不同组织来源的间充质干细胞在免疫调节和组织损伤修复中的作用并没有本质区别，因此，各种组织来源的间充质干细胞均可用于本发明，例如：来源于骨髓组织、脂肪组织、脐带组织、胎盘组织等。在一个特定的实施方案中，本发明使用了人脐带间充质干细胞。
本发明的第二方面提供了制备上述表达IL-17A信号通路阻断剂的间充质干细胞的方法，其包括以下步骤：
(1)构建包含编码IL-17A信号通路阻断剂的外源核酸序列的慢病毒表达载体；
(2)将步骤(1)得到的慢病毒表达载体感染宿主细胞，包装得到成熟慢病毒；
(3)收获步骤(2)得到的成熟慢病毒，感染间充质干细胞，筛选感染成功的细胞。
在一个特定的实施方案中，该制备方法包括以下步骤：
(1)利用LV-EGFP慢病毒载体系统构建αIL17A:Fc融合蛋白的慢病毒表达质粒LV-αIL17A:Fc；其中，αIL17A:Fc是IL-17A单链抗体与IgG4的重链Fc片段组成的融合蛋白，αIL17A:Fc编码基因的3’-末端先后连接IRES序列和EGFP基因，形成αIL17A:Fc-I-EGFP序列，共同处于LV-EGFP慢病毒载体中CMV启动子的下游；其中，所述IL-17A单链抗体包含人IL-2信号肽(SEQ ID NO：1)、IL-17A抗体的轻链可变区(VL，SEQ ID NO：3)、接头(SEQ ID NO：5)和IL-17A抗体的重链可变区(VH，SEQ ID NO：7)四部分；所述IgG4的重链Fc片段包含人免疫球蛋白IgG4的重链恒定区的CH3(SEQ ID NO：9)、CH2(SEQ ID NO：11)以及铰链区(SEQ IDNO：13)三部分；
(2)将LV-αIL17A:Fc质粒与慢病毒框架质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G混合，通过LTX脂质体导入293T细胞，包装得到成熟慢病毒；
(3)收获步骤(2)的成熟慢病毒后感染间充质干细胞，24h后加入嘌呤霉素筛选感染成功的细胞。
优选地，所述αIL17A:Fc编码基因中编码人IL-2信号肽、IL-17A抗体轻链可变区(VL)、接头和IL-17A抗体重链可变区(VH)四部分的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2、4、6和8所示，编码人免疫球蛋白IgG4重链恒定区的CH3、CH2以及铰链区三部分的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：10、12和14所示。
本发明的第三方面提供了上述间充质干细胞在制备治疗IL-17A介导的自身免疫性疾病的药物中的用途。特别地，所述IL-17A介导的自身免疫性疾病为类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、银屑病(parapsoriasis,PS)、慢性阻塞性肺炎(chronicobstructive pneumonia，COPD)、儿童多发性风湿性关节炎(JRA)、克隆氏病(Crohn’sdisease,CD)或系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)。
本发明的优点主要有以下两点：
1.间充质干细胞对炎症部位的靶向作用将IL-17A信号通路阻断剂靶向炎症部位，提高了IL-17A信号通路阻断剂发挥作用的精度，从而提高了其对特定部位炎症反应的抑制效果，并且能够减少药物的施用剂量，减轻全身性副作用发生的范围和程度。
2.间充质干细胞对组织损伤具有修复作用，与IL-17A信号通路阻断剂配合施用，对自身免疫性疾病的治疗能够起到辅助作用。
附图说明
图1.LV-EGFP慢病毒表达质粒结构图。CMV启动子后表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因。
图2.LV-αIL17A:Fc慢病毒表达质粒结构图。目的基因αIL17A:Fc的3’-末端连接有IRES序列，后接EGFP基因，形成αIL17A:Fc-I-EGFP序列，共同处于CMV启动子下游。
图3.免疫荧光检测基因修饰间充质干细胞。A：正常间充质干细胞；B：LV-EGFP慢病毒感染后的间充质干细胞；C：LV-αIL17A:Fc慢病毒感染后的间充质干细胞。LV-EGFP以及LV-αIL17A:Fc慢病毒感染后的间充质干细胞表达EGFP，而正常间充质干细胞则不表达EGFP。
图4.间充质干细胞中IgG4Fc的表达情况。通过IgG4ELISA检测试剂盒检测发现LV-αIL17A:Fc慢病毒感染的间充质干细胞高表达IgG4(80±11.5ng/ml)，而正常间充质干细胞以及对照组LV-EGFP慢病毒感染的间充质干细胞不表达IgG4。
图5.IL-17A结合实验。1×、2×、4×指的是LV-αIL17A:Fc慢病毒感染的间充质干细胞培养上清原液、2倍及4倍稀释液。LV-αIL17A:Fc慢病毒感染的间充质干细胞表达IL-17A抗体，并可以与重组IL-17A蛋白质较好结合，而正常间充质干细胞以及对照组LV-EGFP慢病毒感染的间充质干细胞不表达IL-17A抗体。
图6.IL-17A/IL-17RA阻断实验。1×、2×、4×指的是LV-αIL17A:Fc慢病毒感染的间充质干细胞培养上清原液、2倍及4倍稀释液。LV-αIL17A:Fc慢病毒感染的间充质干细胞表达的IL-17A抗体可以显著阻断IL-17A与其受体的结合，而正常间充质干细胞以及对照组LV-EGFP慢病毒感染的细胞上清液则没有阻断作用。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的方案进行清楚完整的描述，但本发明并不受其限制，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，基于本发明的实施例，本领域技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围；同样地，实施例的附图仅仅是本发明一部分实施例的附图，本领域技术人员根据这些附图所获得的其他附图，也都属于本发明的保护范围。
未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：LV-αIL17A:Fc慢病毒表达质粒的构建
我们利用第四代慢病毒载体系统LV-EGFP(购自OriGene公司)构建αIL17A:Fc融合蛋白的慢病毒表达质粒LV-αIL17A:Fc(质粒结构见图2)，并以LV-EGFP(质粒结构见图1)空质粒作为对照(LV-null)。
αIL17A:Fc是IL-17A单链抗体与IgG4的重链Fc片段组成的融合蛋白，长度为496个氨基酸残基，分子量约为60kD。
αIL17A:Fc编码基因包括编码抗IL-17A单链抗体的序列和编码IgG4重链Fc片段的序列，其中，编码抗IL-17A单链抗体的序列由编码人IL-2信号肽的序列(SEQ ID NO：2)、编码IL-17A抗体轻链可变区的序列(SEQ ID NO：4)、编码接头的序列(SEQ ID NO：6)和编码IL-17A抗体重链可变区的序列(SEQ ID NO：8)四部分顺序连接而成；编码IgG4重链Fc片段的序列由编码人免疫球蛋白IgG4的重链恒定区CH3的序列(SEQ ID NO：10)、编码人免疫球蛋白IgG4的重链恒定区CH2的序列(SEQ ID NO：12)和编码人免疫球蛋白IgG4的重链恒定区铰链区的序列(SEQ ID NO：14)三部分顺序连接而成。
αIL17A:Fc编码基因的3’-末端先后连接IRES序列和EGFP基因，形成αIL17A:Fc-I-EGFP序列，共同处于CMV启动子下游。
按照上述基因结构，利用常规的基因工程手段将该目的基因片段插入LV-EGFP质粒的相应位点，得到慢病毒表达质粒LV-αIL17A:Fc。
实施例2：人脐带间充质干细胞种子库建立
人脐带来源于健康足月妊娠剖宫产孕妇供者，由有资质的国家二甲以上医院提供，由孕妇或其家属签订知情同意书和脐带采集登记表。脐带间充质干细胞提取、培养及细胞库建立等工作均在本公司GMP生产车间完成。细胞经分离培养并传代扩增至第2代(P2)后进行外源微生物、病毒、内毒素等检测；同时检测细胞免疫表型、分化能力及细胞生物学效力等。检测合格的细胞作为种子库细胞，置于-196℃液氮罐中保存。
实施例3.LV-αIL17A:Fc基因修饰人脐带间充质干细胞的制备
将上述LV-αIL17A:Fc质粒以及LV-EGFP对照质粒分别与慢病毒框架质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G混合，通过LTX脂质体导入293T细胞，包装得到成熟慢病毒，收获病毒后感染人脐带间充质干细胞，24h后加入嘌呤霉素筛选感染成功的细胞。
实施例4：免疫荧光检测基因修饰干细胞表达绿色荧光蛋白
通过荧光显微镜检测病毒感染后细胞发出的绿色荧光(结果见图3)，发现LV-EGFP及LV-αIL17A:Fc慢病毒感染后的间充质干细胞均发出绿色荧光，而正常间充质干细胞不发出绿色荧光，表明LV-EGFP及LV-αIL17A:Fc慢病毒均可成功感染间充质干细胞，感染率达到90％以上。
实施例5：ELISA检测基因修饰的间充质干细胞表达IgG4
采用IgG4ELISA检测试剂盒(购于Invitrogen公司)检测细胞上清中IgG4的含量，具体方法参照说明书。检测结果见图4，LV-αIL17A:Fc慢病毒感染后的间充质干细胞高表达IgG4(80±11.5ng/ml)，而正常间充质干细胞以及对照组LV-EGFP感染的间充质干细胞不表达IgG4。
实施例6：检测基因修饰的间充质干细胞表达IL-17A抗体及其功能
采用IL-17A蛋白结合实验检测IL-17A抗体表达情况，方法为：采用2μg/ml重组人IL-17A蛋白(购于R&D systems)包被酶标板，样品孔加入间充质干细胞培养上清(原液、2倍及4倍稀释)孵育2h，然后用HRP结合的抗人IgG4抗体(购于Invitrogen公司)作为酶标抗体孵育1h，最后加入底物进行显色。实验结果见图5，通过IL-17A结合实验，确定LV-αIL17A:Fc慢病毒感染后的间充质干细胞表达IL-17A抗体，可以与重组IL-17A蛋白较好地结合，而正常间充质干细胞以及对照组LV-EGFP感染的间充质干细胞均不表达IL-17A抗体。
采用IL-17A/IL-17RA结合阻断实验检测IL-17A抗体阻断IL-17A及其受体结合的情况，采用2μg/ml重组人IL-17A蛋白(购于R&D systems)包被酶标板，样品孔加入间充质干细胞培养上清(原液、2倍及4倍稀释)孵育2h，然后用生物素结合的IL-17RA(终浓度为1μg/ml，购于BPS Bioscience公司)孵育1h，加入HRP结合的链霉亲和素(购于Invitrogen公司)孵育30min，最后加入底物进行显色。实验结果见图6，通过IL-17A/IL-17RA阻断实验，确定LV-αIL17A:Fc慢病毒感染后的间充质干细胞培养上清可以显著阻断IL-17A与其受体IL-17RA的结合，而正常间充质干细胞以及对照组LV-EGFP感染的间充质干细胞上清液则没有阻断作用。
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序列表
<110> 北京贝来生物科技有限公司
<120> 一种表达IL-17A信号通路阻断剂的间充质干细胞
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ile Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 4
<211> 336
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
gatattgtta tgactcagac ccccctcttg agcgtaacgc ccggacagcc tgcgtcaatc 60
tcttgccggt ccagccgaag tctggtccat tcaaggggaa acacgtatct ccattggtac 120
ctccaaaaac cgggtcagtc cccgcagttg ttgatatata aagtcagcaa cagatttatt 180
ggagtacctg atagattttc tggatctggg agtggtacag actttacttt gaaaatcagt 240
cgcgtagagg cagaggatgt tggggtgtat tattgcagcc agagcacaca cctgccgttc 300
acttttgggc aaggtacgaa actcgagata aaattc 336
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
aaagggggtg gggggtctgg tggtggtggc agtggtggag gtggctctgg gggcggaggg 60
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Met Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 357
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
aggtacaact ggttcagtct ggtgccgagg tcaaaaagcc cggctcttct gttaaagtct 60
catgcaaagc tagtgggtat tctttcaccg attaccatat tcactgggta cgccaagccc 120
caggtcaagg cttggagtgg atgggcgtga tcaacccaat gtacggcaca actgactaca 180
atcaacgctt caaaggcaga gtaacgatta ctgcggatga gagtacgtca actgcatata 240
tggaattgtc cagtctgagg tccgaggata cagccgtcta ttattgtgct cggtatgact 300
acttcacggg gacaggagta tactgggggc aggggacgtt ggttacggtc tcctccc 357
<210> 9
<211> 207
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
1 5 10 15
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
20 25 30
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
35 40 45
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
50 55 60
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
65 70 75 80
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
85 90 95
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
100 105 110
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
115 120 125
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
130 135 140
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
145 150 155 160
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
165 170 175
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
180 185 190
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
195 200 205
<210> 10
<211> 612
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
tcctgttccc cccaaaaccc aaggacactc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacgt 60
gcgtggtggt ggacgtgagc caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggatg 120
gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac agcacgtacc 180
gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt 240
gcaaggtctc caacaaagcc tcccgtcctc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg 300
gcagccccga gagccacagg tgtacaccct gcccccatcc caggaggaga tgaccaagaa 360
ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg 420
ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga 480
cggctccttc ttcctctaca gcaggctaac cgtggacaag agcaggtggc aggaggggaa 540
tgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct 600
ctccctgtct cg 612
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 30
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
cccccatgcc catcatgccc a 21

Claims (6)

1. 一种表达IL-17A信号通路阻断剂的间充质干细胞，其特征在于所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞，包含编码IL-17A信号通路阻断剂的外源核酸序列，其中所述IL-17A信号通路阻断剂是IL-17A单链抗体与IgG4的重链Fc片段组成的融合蛋白；所述IL-17A单链抗体包含序列为SEQ ID NO：1的人IL-2信号肽、序列为SEQ ID NO：3的IL-17A抗体轻链可变区（VL）、序列为SEQ ID NO：5的接头和序列为SEQ ID NO：7的IL-17A抗体重链可变区（VH）四部分；所述IgG4的重链Fc片段包含序列分别为SEQ ID NO：9、11、13的人免疫球蛋白IgG4重链恒定区的CH3、CH2以及铰链区三部分。
2. 权利要求1所述的间充质干细胞，其中所述外源核酸序列中编码人IL-2信号肽、IL-17A抗体轻链可变区（VL）、接头和IL-17A抗体重链可变区（VH）四部分的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2、4、6和8所示；所述外源核酸序列中编码人免疫球蛋白IgG4重链恒定区的CH3、CH2以及铰链区三部分的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：10、12和14所示。
3.权利要求1所述的间充质干细胞，其中所述外源核酸序列通过慢病毒载体导入所述间充质干细胞。
4.权利要求3所述的间充质干细胞，其中所述慢病毒载体是LV-EGFP慢病毒载体系统。
5.权利要求1-4任一项的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
（1）构建包含编码IL-17A信号通路阻断剂的外源核酸序列的慢病毒表达载体；
（2）将步骤（1）得到的慢病毒表达载体感染宿主细胞，包装得到成熟慢病毒；
（3）收获步骤（2）得到的成熟慢病毒，感染间充质干细胞，筛选感染成功的细胞。
6.权利要求5的制备方法，包括以下步骤：
（1）利用LV-EGFP慢病毒载体系统构建αIL17A:Fc融合蛋白的慢病毒表达质粒LV-αIL17A:Fc；其中，αIL17A:Fc是IL-17A单链抗体与IgG4的重链Fc片段组成的融合蛋白，αIL17A:Fc编码基因的3’-末端先后连接IRES序列和EGFP基因，形成αIL17A:Fc-I-EGFP序列，共同处于LV-EGFP慢病毒载体中CMV启动子的下游；
（2）将LV-αIL17A:Fc质粒与慢病毒框架质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G混合，通过LTX脂质体导入293T细胞，包装得到成熟慢病毒；
（3）收获步骤（2）的成熟慢病毒后感染间充质干细胞，24h后加入嘌呤霉素筛选感染成功的细胞。
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