KR20180056805A - ＩｇＧ 콘쥬게이션을 위한 자리의 확인 방법 - Google Patents

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나레쉬 첸남세티
베른하르드 헬크
베젤 카이저
베른하르트 트라우트
블라디미르 보이노브
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노파르티스 아게
메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

본 명세서는 환원된 올리고머화 및 효율적인 표지를 가지는 면역글로불린 및 면역글로불린 콘쥬게이트 및 조성물, 이러한 면역글로불린 및 면역글로불린 콘쥬게이트의 생성 방법, 및 특히 질병의 치료 및 예방에서 이러한 면역글로불린 콘쥬게이트의 생성 방법에 관한 것이다.

Description

ＩｇＧ 콘쥬게이션을 위한 자리의 확인 방법{METHODS FOR IDENTIFICATION OF SITES FOR IgG CONJUGATION}
본 발명은 개선된 면역글로불린 및 면역글로불린 콘쥬게이트에 관한 것이다.
단클론 항체들은 큰 실험실 용도 및 치료적 용도가 있다. 유전자 조작된 자리-특이적 형광 또는 결합 특성들을 가지는 항체 유도체들이 개발되었고 여러 해 동안 사용되었다. 더 최근에, 항체들은 치료제로서 개발되었고, 현재 가장 빠르게 성장하는 제약 분야로 존재한다[1]. 항체는 2개의 경쇄와 2개의 중쇄가 이황화 결합에 의해 함께 보유되는 멀티도메인 단백질이다. 가변영역은 특정 항원에서 결합을 특정하고, 불변 영역의 부분은 면역 세포의 표면 상의 Fc 수용체와 결합을 통해 이펙터(effector) 작용을 초래한다. 다양한 질병의 치료에서 그것의 잠재력 때문에, 항체들은 현재 사람 치료의 가장 빠르게 성장하는 분야를 구성한다(Carter. Nature Reviews Immunology. 2006, 6(5), 343). 2001 이후로, 그것의 시장은 생명공학 약물의 모든 범주 중에서 가장 높은 비율인, 매년 평균 35%의 성장률로 성장하였다(S. Aggarwal. Nature. BioTech. 2007, 25 (10) 1097).
항체 콘쥬게이트의 유전자 조작은 항체 적용의 다양성을 더욱 증가시켰다. 많은 연구 기술에서, 효소 또는 형광 프로브는 항체들에 콘쥬게이트되어 분석 작용, 예를 들어 항체 존재도의 정량화를 수행한다. 표적 치료의 경우, 독성 소 분자들은 질병 세포 상의 생체지표와 특이적으로 결합하는 항체들에 부착된다[2-4]. 항체 콘쥬게이션에 다양한 접근들, 예를 들어 표면 리신[5], Fc 탄수화물[6], 또는 부분적으로 환원된 사슬 간 이황화물[7]에 부착이 추구되었다.
대부분의 항체들이 사슬 내 및 사슬 간 이황화 결합에서 사용된 것 이외의 시스테인을 가지지 않기 때문에, 유전자 조작된 표면 시스테인에서 항체 콘쥬게이션은 매우 매력적인 선택으로 남는다. 소분자는 말레이미드와 같은 티올 반응성 화학을 통해 시스테인 치환의 특이적 자리에 부착될 수 있다[8-14]. CH1과 CH3 도메인에서 유전자 조작은 CH2의 가변영역의 항원 결합과 이펙터 작용을 방해하는 것을 피하기 위해 선호되었다. 유전자 조작된 시스테인을 통해 성공적인 항체 콘쥬게이션을 위한 다른 기준이 생각되었다. 예를 들어, 돌연변이를 수행하기 위한 항체 도메인, 돌연변이된 자리의 노출, 치환되어야하는 아미노산은 고려되는 몇몇 변수이다. 시스테인 유전자 조작 및 콘쥬게이션에 적당한 자리를 확인하기 위한 고속 대량 스크리닝 접근이 개발되었다[15]. 항체 시스테인 변이체와 관련된 2가지의 가장 흔한 문제는 올리고머화 및 불량한 표지이다. 또한, 항체 시스테인 변이체가 안정하고 효율적으로 콘쥬게이트될지 여부를 예측하기 위한 보편적인 도구는 없다. 추가로, 시스테인 변이체는 현재 CL, CH1 및 CH3 도메인에 대해서만 존재한다[8, 9, 11, 12, 15].
따라서, 안정한 면역글로불린 콘쥬게이트의 생성에 사용될 수 있는 추가적인 면역글로불린 시스테인 변이체에 대한 필요가 있다.
본원에서는 이 필요를 충족시키는 환원된 가교-결합을 나타내는 개선된 면역글로불린 및 면역글로불린 콘쥬게이트가 설명된다.
따라서 한 양태는 7(VH), 20(VL), 22(VL), 25(VH), 125(CH1), 248(CH2), 254(CH2), 286(CH2), 298(CH2), 및 326(CH2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에서 적어도 하나의 돌연변이를 가지는 면역글로불린을 포함하는 면역글로불린 콘쥬게이트를 포함하며, 적어도 하나의 돌연변이는 시스테인 잔기, 및 원자 또는 분자로 치환되고, 이때 원자 또는 분자는 시스테인 잔기에 콘쥬게이트된다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 7(VH), 20(VL), 22(VL) 및 125(CH1)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 248(CH2) 및 326(CH2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 25(VH) 및 286(CH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 254(CH2) 및 298(VH)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택된다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 IgG1을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 사람 CH1 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 사람 CH2 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 사람 CH3 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 사람 CL 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 VH 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 사람 VL 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 적어도 2개의 반응 자리를 가지는 링커 분자를 추가로 포함하며, 이때 제1 반응 자리는 면역글로불린의 시스테인 잔기에 결합되고, 제2 반응 자리는 원자 또는 분자에 결합된다. 링커 분자를 가지는 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 링커 분자는 히드라존, 이황화물, 펩티드, 킬레이트제, 및 말레이미드로 구성되는 군으로부터 선택된다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 원자 또는 분자는 방사성핵종, 화학치료제, 미생물독소, 식물독소, 폴리머, 탄수화물, 사이토카인, 형광 표지, 발광 표지, 효소-기질 표지, 효소, 펩티드, 펩티도미메틱, 뉴클레오티드, siRNA, 마이크로RNA, RNA 미메틱, 및 앱타머로 구성되는 군으로부터 선택된다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 원자 또는 분자는 90Y, 131I, 67Cu, 177Lu, 213Bi, 211At, 칼리키아미신, 듀오카르마이신, 마이타니소이드, 아우리스타틴, 안트라사이클린, 슈도모나스 엑소톡신 A, 디프테리아 톡신, 리신, 폴리에틸렌 글리콜, 히드록시에틸 전분, 및 만노실 잔기로 구성되는 군으로부터 선택된다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 원자 또는 분자는 돌연변이되지 않은 면역글로불린의 면역원성을 감소시킨다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 원자 또는 분자는 돌연변이 되지 않은 면역글로불린의 면역원성을 증가시킨다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 항원 결합 활성을 추가로 포함하고 활성은 돌연변이되지 않은 면역글로불린의 항원 결합 활성의 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 또는 적어도 130%이다.
다른 양태는 7(VH), 20(VL), 22(VL), 25(VH), 125(CH1), 248(CH2), 254(CH2), 286(CH2), 및 326(CH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형 또는 분리된 면역글로불린을 포함하며, 적어도 하나의 돌연변이는 시스테인 잔기로 치환된다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 7(VH), 20(VL), 22(VL) 및 125(CH1)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기이다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 248(CH2) 및 326(CH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 25(VH) 및 286(CH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 잔기 254(CH2)에 있다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택된다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 IgG1을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 변형 또는 분리된 면역글로불린은 사람 CH1 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 변형 또는 분리된 면역글로불린은 사람 CH2 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 변형 또는 분리된 면역글로불린은 사람 CH3 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 변형 또는 분리된 면역글로불린은 사람 CL 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 변형 또는 분리된 면역글로불린은 사람 VH 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 변형 또는 분리된 면역글로불린은 사람 VL 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 항원 결합 활성을 포함하고, 활성은 돌연변이되지 않은 면역글로불린의 항원 결합 활성의 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 또는 적어도 130%이다.
다른 양태는 앞의 변형된 면역글로불린 양태의 면역글로불린 및 선행 구체예의 모든 조합을 암호화하는 분리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에 있다. 특정 구체예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 유도성 프로모터는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 다른 양태는 선행 구체예 중 하나의 벡터와 숙주 세포를 포함한다. 특정 구체에서, 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 면역글로불린을 발현할 수 있다.
다른 양태는 앞의 양태의 숙주 세포를 포함하는 배양물 배지를 제공하는 단계 및 면역글로불린이 발현되는 조건하에 배양물 배지를 두는 단계를 포함하는, 면역글로불린을 생성하는 방법을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 방법은 발현된 면역글로불린을 분리하는 추가 단계를 포함한다.
다른 양태는 앞의 변형된 면역글로불린 양태의 면역글로불린 및 선행 구체예의 모든 조합을 제공하는 단계, 하나 이상의 치환된 시스테인 잔기를 환원제로 환원시켜 환원된 시스테인 잔기를 형성하는 단계, 및 면역글로불린을 원자 또는 분자와 함께 인큐베이팅하는 단계를 포함하며, 이때 원자 또는 분자는 환원된 시스테인 잔기와 반응시켜, 면역글로불린 콘쥬게이트를 형성하는, 면역글로불린 콘쥬게이트를 생성하는 방법을 포함한다.
다른 양태는 면역글로불린을 제공하는 단계, 7(VH), 20(VL), 22(VL), 및 125(CH1)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기를 시스테인 잔기로 치환하는 단계, 하나 이상의 치환된 시스테인 잔기를 환원제로 환원하여 환원된 시스테인 잔기를 형성하는 단계, 면역글로불린을 원자 또는 분자와 함께 인큐베이팅하는 단계를 포함하는, 면역글로불린 콘쥬게이트의 크게 농축된 약제학적 조제물에서 면역글로불린의 표면-노출 시스테인 사이의 가교-결합을 환원시키는 방법을 포함하며, 분자는 환원된 시스테인 잔기와 반응하여 면역글로불린 콘쥬게이트를 형성하고, 크게 농축된, 면역글로불린 콘쥬게이트의 액체 조제물을 생성하며, 면역글로불린 콘쥬게이트 농축은 적어도 20 mg/ml, 적어도 30 mg/ml, 적어도 40 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml, 적어도 100 mg/ml, 적어도 125 mg/ml, 또는 적어도 150 mg/ml이다. 특정 구체예에서, 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 면역글로불린은 IgG1을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 CH1 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 CH2 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 CH3 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 CL 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 VH 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 VL 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 항원 결합 활성을 포함하고, 활성은 돌연변이되지 않은 면역글로불린의 항원 결합 활성의 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 또는 적어도 130%이다.
다른 양태는 앞의 면역글로불린 콘쥬게이트 양태 및 매우 농축된 액체 조제물을 포함하는 의약의 제조에서 선행 구체예의 임의의 및 모든 조합을 포함하며, 면역글로불린 콘쥬게이트는 적어도 20 mg/ml, 적어도 30 mg/ml, 적어도 40 mg/ml,적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml, 적어도 100 mg/ml, 적어도 125 mg/ml, 또는 적어도 150 mg/ml이다. 어떤 구체예에서, 의약의 사용은 자가면역 질환, 면역학적 질환, 감염성 질환, 염증성 질환, 신경학적 질환, 및 암을 포함하는 종양학적 및 신생물성 질환의 치료를 위한 것이다. 어떤 구체예에서, 의약의 사용은 울혈성 심부전(CHF), 혈관염, 장미여드름, 여드름, 습진, 심근염 및 다른 심근 이상, 전신 홍반성 루프스, 당뇨병, 척추병증, 활막 섬유아세포, 및 골수 기질; 뼈손실; 파젯병, 파골세포종; 유방암; 비사용 골감소증; 영양실조, 치주질환, 고셔병, 랑게르한스 세포 조직구증, 척수 손상, 급성 패혈성 관절염, 골연화증, 쿠싱 증후군, 단골성 섬유성 이형성증, 다골성 섬유성 이형성증, 치주재건, 및 뼈 골절; 유육종증; 골용해성 골암, 유방암, 폐암, 신장암 및 직장암; 뼈 전이, 골 통증 관리, 및 체액성 악성 고칼슘혈증, 강직성 척추염 및 다른 척추관절염; 이식거부, 바이러스 감염, 조혈성 신생물 및 신생물-유사 상태들, 예를 들어 호지킨 림프종; 비-호지킨 림프종(버킷 림프종, 소 림프구성 림프종/만성 림프구성 백혈병, 균상식육종, 맨틀세포 림프종, 여포형 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 변연부 림프종, 모양 세포 백혈병 및 림프형질세포성 백혈병), 림프구 전구세포의 종양, 예를 들어 B-세포 급성 림프모구성 백혈병/림프종, 및 T-세포 급성 림프모구성 백혈병/림프종, 흉선종, 성숙 T 및 NK 세포의 종양, 예를 들어 말초 T-세포 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/T-세포 림프종 및 거대 과립 림프구성 백혈병, 랑게르한스 세포 조직구증, 골수양 신생물, 예를 들어 급성 골수성 백혈병, 예를 들어 성숙화를 동반한 AML, 분화를 동반하지 않은 AML, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수단구성 백혈병, 및 급성 단구성 백혈병, 골수이형성 증후군, 및 만성 골수증식성 장애, 예를 들어 만성 골수성 백혈병, 중추신경계의 종양, 예를 들어 뇌종양(신경아교종, 신경모세포종, 성상세포종, 수질아세포종, 상의세포종, 및 망막아종), 고상 종양(비인두암, 기저세포암종, 췌장암, 담관암, 카포시 육종, 고환암, 자궁암, 질암 또는 자궁경부암, 난소암, 원발성 간암 또는 자궁내막암, 및 혈관계의 종양(혈관육종 및 혈관외피종), 골다공증, 간염, HIV, AIDS, 척추관절염, 류마티스 관절염, 염증성 장질환(IBD), 패혈증 및 패혈성 쇼크, 크론병, 건선, 쉴레다더마, 이식편대숙주병(GVHD), 동종이계성 섬 이식편 거부, 조혈성 악성물, 예를 들어 다발성 골수종(MM), 골수이형성 증후군(MDS) 및 급성 골수성 백혈병(AML), 종양 관련 염증, 말초신경 손상 또는 탈수초성 질환의 치료를 위한 것이다. 어떤 구체예에서, 의약의 사용은 반상 건선, 궤양성 대장염, 비-호지킨 림프종, 유방암, 결직장암, 소아 특발성 관절염, 황반변성, 호흡기 세포융합 바이러스, 크론병, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 골다공증, 치료-유발 뼈손실, 뼈 전이, 다발성 골수종, 알쯔하이머병, 녹내장, 및 다발성 경화증의 치료를 위한 것이다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 어떤 구체예에서, 의약의 사용은 약제학적으로 허용되는 부형제를 더 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 어떤 구체예에서, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 면역글로불린 콘쥬게이트를 포함하는 조제물은 비-올리고머화 모노머이다. 특정 구체예에서, 모노머의 백분율은 비-환원성 SDS-PAGE 분석에 의해 측정된다.
다른 양태는 비-올리고머화 약제학적 활성 성분으로서 선행의 면역글로불린 콘쥬게이트 양태 및 선행 구체예들의 어떤 조합 및 모든 조합의 사용을 포함한다.
다른 양태는 진단적 도구로서 선행 면역글로불린 콘쥬게이트 양태 및 선행 구체예의 모든 조합의 사용을 포함한다.
다른 양태는 고 분자량 단백질에 대한 표준으로서 선행 면역글로불린 콘쥬게이트 양태 및 선행 구체예의 모든 조합의 사용을 포함한다. 다른 양태는 고분자량 단백질에 대한 표준으로서 면역글로불린 콘쥬게이트의 사용을 포함하며, 면역글로불린 콘쥬게이트는 잔기 440(CH3)에서 적어도 하나의 돌연변이를 가지는 면역글로불린을 포함하고, 적어도 하나의 돌연변이는 시스테인 잔기, 및 원자 또는 분자로 치환되고, 이때 원자 또는 분자는 시스테인 잔기에 콘쥬게이트된다.
다른 양태는 선행 면역글로불린 콘쥬게이트 양태 및 선행 구체예의 어떤 및 모든 조합 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 적어도 10 mg/ml, 적어도 20 mg/ml, 적어도 30 mg/ml, 적어도 40 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml, 적어도 100 mg/ml, 적어도 125 mg/ml, 또는 적어도 150 mg/ml의 농도에 있다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린 콘쥬게이트의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 비-올리고머화된 모노머이다.
다른 양태는 면역글로불린의 표면 상에서 제1 아미노산 잔기의 공간-응집-경향을 계산하는 단계, 제1 잔기의 바로 근접한 곳에서 면역글로불린의 복수의 잔기의 공간-응집-경향들을 계산하는 단계, 및 제1 아미노산 잔기의 공간-응집-경향이 0 내지 -0.11의 값과 동일하거나 그 안에 있다면 및 복수의 잔기가 0 미만의 공간-응집-경향들을 가진다면 시스테인으로 돌연변이를 위해 제1 아미노산 잔기를 선택하는 단계를 포함하는, 시스테인으로 돌연변이를 위해 면역글로불린의 잔기를 선택하는 방법을 포함한다. 특정 구체예에서, 복수의 잔기는 제1 잔기의 15Å 내에 있다. 특정 구체예에서, 복수의 잔기는 제1 잔기의 10Å 내에 있다. 특정 구체예에서, 복수의 잔기는 제1 잔기의 7.5Å 내에 있다. 특정 구체예에서, 복수의 잔기는 제1 잔기의 5Å 내에 있다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 잔기의 공간-응집-경향을 계산하는 단계는 반경이 잔기에 있는 원자의 중심에 있는 구체 영역에 대한 공간-응집-경향을 계산하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 구체 영역의 반경은 적어도 5Å이다.
다른 양태는 표면-노출된 잔기에서 시스테인으로 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 변형 또는 분리된 면역글로불린을 포함하며, 제1 잔기의 바로 근처에서 면역글로불린의 복수의 잔기의 공간-응집-경향은 0 내지 -0.11의 값과 동일하거나 또는 그 안에 있고, 제1 잔기의 바로 근처에서 면역글로불린의 복수의 잔기의 공간-응집 경향들은 0 미만의 공간-응집-경향들을 가진다. 특정 구체예에서, 복수의 잔기는 제1 잔기의 15Å 내이다. 특정 구체예에서, 복수의 잔기는 제1 잔기의 10Å 내이다. 특정 구체예에서, 복수의 잔기는 제1 잔기의 7.5Å 내이다. 특정 구체예에서, 복수의 잔기는 제1 잔기의 5Å 내이다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 공간-응집-경향은 반경이 잔기에 있는 원자의 중심에 있는 구체 영역에 대해 계산된다. 특정 구체예에서, 반경은 적어도 5Å이다.
다른 양태는 면역글로불린의 복수의 아미노산 잔기를 선택하고, 이때 복수의 잔기는 면역글로불린의 표면에 노출되는 단계, 복수의 잔기 중 하나의 잔기를 시스테인 잔기로 돌연변이시키는 단계, 시스테인 잔기를 원자 또는 분자에 콘쥬게이트하여 면역글로불린 콘쥬게이트를 형성하는 단계, 가교-결합 경향을 위한 면역글로불린 콘쥬게이트를 시험하는 단계 및 면역글로불린 콘쥬게이트에 가교-결합 경향 값을 부여하는 단계, 및 가교-결합 경향 값이 I 또는 II라면 시스테인으로 돌연변이를 위한 잔기를 선택하는 단계를 포함하는, 시스테인으로 돌연변이를 위한 면역글로불린의 잔기를 선택하는 방법을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 방법은 5% 미만의 면역글로불린 콘쥬게이트가 다이머를 형성하고, 면역글로불린 콘쥬게이트 중에서 트라이머를 형성하는 것이 없으며, 다이머와 트라이머 형성은 상대적인 비-환원성 및 환원성 SDS-PAGE에 의해 측정된다면, 면역글로불린 콘쥬게이트에 II의 가교-결합 경향 값을 부여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 1% 미만의 면역글로불린 콘쥬게이트가 다이머를 형성하며, 다이머 형성은 상대적인 비-환원성 및 환원성 SDS-PAGE에 의해 측정된다면, 면역글로불린 콘쥬게이트에 I의 가교-결합 경향 값을 부여하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 추가 양태 및 구체예는 본 명세서를 통해 발견될 수 있다.
본 발명은 환원된 가교-결합을 나타내는 개선된 면역글로불린 및 면역글로불린 콘쥬게이트에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 본 명세서의 면역글로불린은 특정 잔기에서 시스테인으로 치환에 의해 변형된다. 본 명세서는 변형된 면역글로불린, 및 면역글로불린 콘쥬게이트, 이러한 면역글로불린 및 면역글로불린 콘쥬게이트의 제조 방법, 이러한 면역글로불린을 포함하는 다가 또는 다중특이적 분자, 및 본 명세서의 면역글로불린, 면역글로불린 콘쥬게이트 또는 이중특이적 분자를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
정의
본원에서 언급된 용어 "항체" 또는 "면역글로불린"은 전체 항체 및 그것의 어떤 항원 결합 단편(즉, "항원-결합 부분") 또는 단쇄를 포함한다. 자연 발생 "항체"는 이황화 결합에 의해서 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄(H)와 적어도 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약기됨)과 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약기됨)과 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, 즉 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분될 수 있으며, 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더 보존성인 영역들이 산재되어 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어지며, 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 다음 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역이, 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제 1 성분(C1q)을 포함하여, 숙주 조직이나 인자들과 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서 언급되는 용어 "항체 콘쥬게이트" 또는 "면역글로불린 콘쥬게이트"는 원자 또는 분자에 화학적으로 또는 생물학적으로 연결된 임의의 면역글로불린, 항체 결합 단편, 또는 그것의 단일 사슬을 포함한다. 원자 또는 분자는, 예를 들어 사이토톡신, 방사성 약제, 항-종양 약물, 또는 치료제를 포함할 수 있다. 항체 콘쥬게이트는 면역글로불린 또는 항체 단편의 면역반응성을 보유하며, 즉, 항체 콘쥬게이트의 면역글로불린 또는 항체 결합 단편은 원자 또는 분자와 콘쥬게이션 전에 면역글로불린의 항원 결합 활성의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 또는 적어도 130%이다.
본원에서 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분"(또는 간단히 "항원 부분")은 항원 및 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 적어도 일부분과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 전장 항체 또는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해서 수행될 수 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포함되는 결합 단편의 예들은 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편; 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; 및 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편을 포함한다.
또한, Fv 단편의 2개 도메인인 VL과 VH는 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 이용하여 이들을 VL과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일 사슬 Fv(scFv)로 알려짐; 예를 들어, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; 및 Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883 참조)를 형성하고 있는 단일 단백질 사슬로 만들 수 있는 합성 링커에 의해서 이어질 수 있다. 단일 사슬 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 영역" 내에 포함되도록 의도된다. 이러한 항체 단편들은 당업자에게 알려진 종래의 기술을 사용하여 얻어지며, 단편들은 완전 항체에 대한 것과 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크린된다.
본원에서 사용된 "분리된" 항체 또는 면역글로불린은 이러한 항체 또는 면역글로불린이 자연에서 발견되는 다른 성분을 실질적으로 갖지 않는 항체 또는 면역글로불린을 말한다. 또한, 분리된 항체 또는 면역글로불린은 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 갖지 않을 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자 조성물을 말한다. 단클론 항체 조성물은 전형적으로 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "사람 항체"는 프레임워크와 CDR 영역이 모두 사람 기원의 서열에서 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유할 경우, 불변 영역도 또한 이러한 사람 서열, 예를 들어 사람 점라인 서열, 또는 사람 점라인 서열의 돌연변이 형태 또는 Knappik, et al.(2000, J Mol Biol 296, 57-86)에 설명된 사람 프레임워크 서열로부터 유래된 컨센서스 프레임워크 서열을 함유하는 항체로부터 유래된다.
본 명세서의 사람 항체는 사람 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특정 돌연변이유발에 의해, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해서 도입된 돌연변이). 그러나, 본원에서 사용된 용어 "사람 항체"는 마우스 같은 다른 포유류 종들의 점라인으로부터 유래된 CDR 서열이 사람 프레임워크 서열에 접목된 항체를 포함하지는 않도록 의도된다.
본원에서 사용된 용어 "사람 도메인"은 사람 기원 서열, 예를 들어 사람 점라인 서열, 또는 사람 점라인 서열의 돌연변이된 형태 또는 Knappik, et al.(2000, J Mol Biol 296, 57-86)에 설명된 사람 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 컨센서스 프레임워크 서열을 함유하는 항체로부터 유래된 면역글로불린 불변 영역 도메인을 포함하도록 의도된다.
본원에서 사용된 용어 "재조합 사람 항체"는 재조합 수단에 의해서 제조되거나, 발현되거나, 창조되거나, 또는 분리된 모든 사람 항체, 예를 들어 사람 면역글로불린 유전자 또는 그로부터 제조된 하이브리도마에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스염색체인 동물(예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체, 사람 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 분리된 항체, 재조합, 조합 사람 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 및 사람 면역글로불린 유전자, 서열 내지는 다른 DNA 서열의 전부 또는 일부분의 스플라이싱을 수반하는 어떤 다른 수단에 의해서 제조되거나, 발현되거나, 창조되거나 또는 분리된 항체들을 포함한다. 이러한 재조합 사람 항체는 프레임워크와 CDR 영역이 사람 점라인 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 가진다. 그러나, 어떤 구체예에서, 이러한 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 사람 Ig 서열에 대한 트랜스제닉 동물이 사용될 경우에는 생체내 체세포 돌연변이유발)이 행해질 수 있으며, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 사람 점라인 VH 및 VL 서열로부터 유래된 이들과 관련된 것이기는 하지만, 생체내 사람 항체 점라인 레퍼토리 내에는 자연적으로 존재하지 않을 수도 있는 서열이다.
"키메라 항체"는 (a) 항원 결합 부위(가변 영역)가 상이한 또는 변경된 부류, 이펙터 기능 및/또는 종들, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 전체적으로 상이한 분자, 예를 들어 효소, 독소, 호르몬, 성장인자, 약물 등의 불변 영역에 연결되도록 불변 영역, 또는 그것의 일부가 변경되거나, 치환되거나 또는 교환된, 또는 (b) 가변 영역, 또는 그것의 일부가 상이한 또는 변경된 항원 특이성을 가진 가변 영역으로 변경되거나, 치환되거나 또는 교환된 항체 분자이다. 예를 들어, 마우스 항체는 그것의 불변 영역을 본원에 개시된 변형을 포함하는 사람 면역글로불린의 불변 영역으로 치환함으로써 변형될 수 있다. 사람 불변 영역에 의한 치환으로 인해, 키메라 항체는 원래 마우스 항체 또는 본원에 개시된 변형을 갖지 않는 키메라 항체와 비교하여 사람에서 감소된 항원성과 전체적으로 감소된 응집을 가지면서 그것의 특이성을 보유할 수 있다.
"사람화된" 항체는 사람에서 덜 면역원성이면서 비-사람 항체의 반응성을 보유하는 항체이다. 이것은, 예를 들어 비-사람 CDR 영역은 보유하고, 항체의 나머지 부분은 이들의 사람 대응부(즉, 불변 영역뿐만 아니라 가변 영역의 프레임워크 부분)로 치환함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; 및 Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994를 참조한다. 사람 유전공학 기술의 한 예는, 제한은 아니지만 US 5,766,886에 개시된 Xoma 기술을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "링커", "링커 단위", 또는 "링크"는 약물 모이어티 또는 다른 분자에 항체를 공유적으로 부착하는 원자의 공유 결합 또는 사슬을 포함하는 화학적 모이어티를 말한다. 링커는 알킬디일, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 모이어티, 예컨대 : --(CR2)nO(CR2)n-, 알콕시의 반복단위(예를 들어, 폴리에틸렌옥시, PEG, 폴리메틸렌옥시) 및 알킬아미노의 반복단위(예를 들어, 폴리에틸렌아미노, Jeffamine.TM.); 및 숙시네이트, 숙신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트 및 카프로아미드를 포함하는 2산 에스테르 및 아미드.
본원에서 사용되는 용어 "표지"는 항체에 공유적으로 부착될 수 있고, (i) 검출가능한 신호를 제공하고; (ii) 제2 표지와 상호작용하여 제1 또는 제2 표지, 예를 들어, FRET(형광 공명 에너지 이동)에 의해 제공된 검출가능한 신호를 변형하고; (iii) 상호작용을 안정화하거나 또는 항원 또는 리간드와 결합의 친화성을 증가시키고; (iv) 전하, 소수성, 모양, 또는 다른 물리적 변수에 의해 이동성, 예를 들어, 전기영동 이동성, 또는 세포-투과성에 영향을 미치고, 또는 (v) 캡쳐 모이어티를 제공하여 리간드 친화성, 항체/항원 결합, 또는 이온 복합체형성을 조절하기 위해 작용하는 임의의 모이어티를 말한다.
본원에서 사용된 용어 "휴머니어링"은 비-사람 항체를 유전자 조작된 사람 항체로 전환시키는 방법을 말한다(예를 들어, KaloBios' Humaneering™ 기술 참조).
본원에서 사용된 "이소타입"은 본원에 개시된 응집 경향 모티프를 갖는(그리고 따라서 응집을 감소시키는 본원에 개시된 변형을 적용할 수 있는) 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 어떤 항체 부류(예를 들어, IgM, IgE, IgG, 예를 들어 IgG1 또는 IgG2)를 말한다.
본원에서 사용된 용어 "친화성"은 단일 항원 부위에서 항체와 항원 간의 상호작용 강도를 말한다. 각 항원 부위 내에서, 항체 "팔"의 가변 영역은 여러 부위에서 항원과 약한 비공유 힘을 통해 상호작용하며, 상호작용이 클수록 친화성이 더 강해진다. 본원에 개시된 변형은 바람직하게는 본원에 개시된 면역글로불린 또는 항체의 친화성을 감소시키지 않거나, 또는 친화성은 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만으로 감소된다. 본원에서 사용되었을 때, 본원에 개시된 변형이 친화성을 감소시키는 지의 여부를 결정할 때는, 변형을 가진 면역글로불린 또는 항체와 변형은 없지만 어떤 관련 없는 돌연변이는 포함하는 동일한 면역글로불린이 비교된다.
본원에서 사용된 용어 "피험자"는 어떤 사람 또는 비-사람 동물을 포함한다.
용어 "비-사람 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유류 및 비-포유류, 예를 들어 비-사람 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "화학치료제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물을 말한다. 화학치료제의 예는 엘로티닙(TARCEVA(TM), Genentech/OSI Pharm.), 보르테조밉(VELCADE(TM), Millenium Pharm.), 풀베스트란트(FASLODEX(TM), Astrazeneca), 수텐트(SUl 1248, Pfizer), 레트로졸(FEMARA(TM), Novartis), 이마티닙 메실레이트(GLEEVEC(TM), Novartis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), 옥살리플라틴(Eloxatin(TM), Sanofi), 5-FU (5-플루오로우라실), 류코보린, 라파마이신(Sirolimus, RAPAMUNE(TM), Wyeth), 라파티닙(GSK572016, GlaxoSmithKline), 로나파르닙(SCH 66336), 소라페닙(BAY43-9006, Bayer Labs.), 및 게피티닙(IRESSA(TM), Astrazeneca), AG 1478, AG 1571 (SU 5271; Sugen), 티오테파 및 CYTOXAN(TM) 시클로스포스파미드와 같은 알킬화제; 부술판, 임프로술판 및 피포술판과 같은 알킬 술포네이트; 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄토테신(합성 유기체 토포테칸을 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그것의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유기체를 포함); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스포기스타틴; 질소머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 에네딘 항생제와 같은 항생제(예를 들어, 칼리키아미신, 특히 칼리키아미신 감마1I 및 칼리키아미신 오메가1I(Angew Chem Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 클로드로네이트와 같은 비스포스포네이트; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 에네딘 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 클로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN(TM) 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 C와 같은 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대, 칼우스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄과 같은 항-아드레날; 프롤린산과 같은 폴산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노에불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티니움 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도피필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK(TM) 폴리사카라이드 복합체(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아조산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, TAXOL(TM) 파클리탁셀(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.), ABRAXANETM 무-크레모포르, 파클리탁셀의 알부민-유전자 조작된 나노입자 조제물(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 111.), 및 TAXOTERE(TM) 도세탁셀(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로르안부실; GEMZAR(TM) 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카르보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; NAVELBINE(TM) 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레니노산과 같은 레티노이드; 카페시타빈; 및 어떤 상기의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
또한 "화학치료제"의 이 정의에 (i) 예를 들어, 타목시펜(NOLVADEX(TM) 타목시펜을 포함), 랄록시펜, 드롤로시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 FARESTON 토레미펜을 포함하는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)와 같이 종양 상의 호르몬 활동을 조절 또는 억제하도록 작용하는 항-호르몬제; (ii) 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE(TM) 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN(TM) 엑세메스탄, 포르메스타니에, 파드로졸, RIVISOR(TM) 보로졸, FEMARA(TM) 레트로졸, 및 ARIMIDEX(TM) 아나스트로졸과 같은 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타아제를 억제하는 아로마타아제 억제제; (iii) 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤라이드, 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 트록사시타빈(1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 사이토신 유사체); (iv) 아로마타아제 억제제; (v) 단백질 키나아제 억제제; (vi) 지질 키나아제 억제제; (vii) 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 예를 들어, PKC-알파, Ralf 및 H-Ras와 같은 비정상 세포 증식에 연루된 신호 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것; (viii) VEGF 발현 억제제(예를 들어, ANGIOZYME(TM) 리보자임) 및 HER2 발현 억제제와 같은 리보자임; (ix) 유전자 치료 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN(TM) 백신, LEUVECTIN(TM) 백신, 및 VAXID(TM) 백신과 같은 백신; PROLEUKIN(TM) rIL-2; LURTOTECAN(TM) 토포이소머라아제 1 억제제; ABARELIX(TM) rmRH; (x)베바시주맙 (AVASTIN(TM), Genentech)과 같은 혈관생성억제제; 및 (xi) 어떤 상기의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "사이토킨"은 세포간 중개자로서 다른 세포에 작용하는 한 세포 모집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반적 용어이다. 이러한 사이토킨의 예는 림포카인, 모노카인, 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토킨 중에서 사람 성장 호르몬, N-메티오닐 사람 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 파라티로이드 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 여포자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 및 황체형성호르몬(LH)과 같은 글리코단백질 호르몬; 간 성장인자; 섬유아세포 성장인자; 프롤락틴; 태반성 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮐러관억제 물질; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관내피성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); NGF-β와 같은 신경성장 인자; 혈소판-성장 인자; TGF-α 및 TGF-β와 같은 트랜스포밍 성장 인자 (TGF); 인슐린-유사 성장인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론-α, -β, 및 -γ와 같은 인터페론; 대식세포-CSF (M-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자(CSF); 과립-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립세포-CSF (G-CSF); 인터류킨(ILs), 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12; TNF-α 또는 TNF-β와 같은 종양 괴사 인자; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 사이토킨은 천연 서열 사이토킨의 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양물 및 생물학적으로 활성인 동등물로부터의 단백질을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "최적화된"은 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들어 피치아의 세포, 중국 햄스터 난소세포(CHO) 또는 사람 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 암호화하도록 뉴클레오티드 서열이 변경된 것을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 "모" 서열이라고도 하는 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 암호화되는 아미노산 서열을 완전히 또는 가능한 많이 보유하도록 조작된다. 다른 진핵 세포에서 이들 서열의 최적화된 발현도 본원에서 고려된다. 또한, 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열도 최적화된 것으로 언급된다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 활성"은 면역글로불린 또는 면역글로불린 콘쥬게이트의 그것의 표적 항원에 대한 결합의 특이성을 말한다. 예를 들어, 항원 결합 활성은 세포-기반 생물학적 분석(예를 들어, 리포터 유전자 분석), ELISA, 표면 플라즈몬 공명(Biacore), 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 기술을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "교차-결합 경향" (CLP)은 치환된 시스테인 잔기에서 다른 면역글로불린 사이의 교차-결합을 위해 시스테인으로 치환되는 돌연변이를 함유하는 변형된 면역글로불린 또는 면역글로불린 콘쥬게이트의 경향을 말한다. 예를 들어, CLP는 비-환원성 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피와 함께 정적 또는 동적 레이저 광 산란, 또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 기술에 의해 측정되는 올리고머화의 수준에 의해 결정될 수 있다. 부류 I은 모노머이고 표지 후 안정하게 남아있는 변이체를 포함한다. 부류 II의 변이체는 표지 전 및 후 다이머의 적은 비율을 함유한다. 부류 III 변이체는 일부 트라이머의 형성을 포함하는 올리고머화를 위해 더 천명된 경향을 가진다. 클래스 IV 변이체는 특히 표지 후, 트라이머보다 더 거대한 응집의 존재에 의해 증명되는 바와 같이 올리고머화되는 훨씬 큰 경향을 가진다. 부류 V는 정제된 농축 샘플의 단편화 또는 착색화와 같은 부가적인 구조적 이상을 가지는 클래스 IV의 변이체와 유사하게 높은 올리고머화 경향의 변이체를 포함한다.
용어 "에피토프"는 항체와 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정소를 의미한다. 에피토프는 보통 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적 활성 표면 그룹화로 구성되며, 보통 특정한 3차원 구조와 특정한 하전 특성을 가진다. 입체형태적 에피토프와 비-입체형태적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자와 결합하지만, 후자와 결합은 상실된다는 점에서 구별된다.
용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산과 핵산 서열에 모두 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 말하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 말한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산들이 어떤 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 특정되는 모든 위치에서, 이 코돈은 암호화되는 폴리펩티드의 변경 없이 설명된 상응하는 코돈들 중 어느 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "사일런트 변이"이며, 이것은 보존적으로 변형되는 변이의 한 종류이다. 또한, 폴리펩티드를 암호화하는 본원의 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 사일런트 변이를 설명한다. 당업자는 핵산에 있는 각 코돈(일반적으로 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG와 일반적으로 트립토판의 유일한 코돈인 TGG를 제외한다)이 기능적으로 동일한 분자를 얻기 위해 변형될 수 있다는 것이 인정될 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 각 사일런트 변이는 각 설명된 서열에 함축되어 있다.
폴리펩티드 서열에 대해서, "보존적으로 변형된 변이체"는 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 가져오는 폴리펩티드 서열에 개별 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표가 본 분야에 알려져 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 다형성 변이체, 종간 상동체, 및 본 명세서의 대립형질에 더해지고, 이들을 배제하지 않는다. 다음 8개 그룹이 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산들을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들어, Creighton, Proteins (1984) 참조).
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일성" 퍼센트는 동일한 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 말한다. 두 서열은, 다음 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여, 또는 수동 정렬과 육안 검사에 의해 측정했을 때, 비교창, 또는 지정된 영역에 걸쳐서 최대 상응성으로 비교하여 정렬했을 때, 두 서열이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 특정 퍼센트 보유한다면 "실질적으로 동일하다"(즉, 특정된 영영에 걸쳐, 또는 특정되지 않았을 때는 전체 서열에 걸쳐 60% 동일성, 선택적으로 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성). 선택적으로, 동일성은 적어도 약 50개 뉴클레오티드(또는 10개 아미노산) 길이인 영역에 걸쳐서, 또는 더 바람직하게는 100 내지 500개 또는 1000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드(또는 20, 50, 200 또는 그 이상의 아미노산) 길이인 영역에 걸쳐서 존재한다.
서열 비교를 위해서, 전형적으로 한 서열이 기준 서열로서 작용하고, 이것과 검사 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 검사 서열과 기준 서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요하다면 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 또는 다른 파라미터가 지정될 수 있다. 다음에, 서열 비교 알고리즘이 프로그램 파라미터에 기초하여 기준 서열에 대한 검사 서열의 서열 동일성 퍼센트를 계산한다. 두 서열을 동일성 비교할 때 서열이 반드시 연속적일 필요는 없지만, 어떤 갭은 그것과 함께 전체 동일성 퍼센트를 감소시키는 패널티를 지녀야 한다. Blastn에서 디폴트 파라미터는 갭 오프닝 패널티 = 5 및 갭 익스텐젼 패널티 = 2이다. Blastp에서 디폴트 파라미터는 갭 오프닝 패널티 = 11 및 갭 익스텐젼 패널티 = 1이다.
본원에서 사용된 "비교창"은, 제한은 아니지만 20-600, 일반적으로 약 50 내지 약 200, 더 일반적으로 약 100 내지 약 150의 연속 위치의 수 중 어느 하나의 세그먼트에 대한 기준을 포함하며, 여기서 서열이 동일한 수의 연속 위치의 기준 서열과 두 서열이 최적 정렬된 후 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 본 분야에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 최적 서열 정렬은, 예를 들어 Smith 및 Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c의 국소 상동성 알고리즘, Needleman 및 Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson 및 Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988의 유사성 탐색 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 도구(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, 위스콘신 지네틱스 소프트웨어 패키지, Genetics Computer Group, 위스콘신 메디슨 사이언스 드라이브 575), 또는 수동 정렬과 육안 검사(예를 들어, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003) 참조)에 의해서 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 퍼센트를 결정하는데 적합한 알고리즘의 두 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; 및 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990에 각각 설명된다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 내셔날 센터 오브 바이오테크놀로지 인포메이션을 통해 대중적으로 이용할 수 있다. 이 알고리즘은 데이터베이스 서열에 있는 동일한 길이의 단어와 정렬되었을 때 어떤 양의 값의 역치 점수 T와 일치하거나 그것을 만족하는 길이 W의 짧은 단어들을 쿼리 서열에서 확인함으로써 높은 점수의 서열 쌍(HSP)을 확인하는 단계를 먼저 수반한다. T는 이웃 단어 점수 역치로서 언급된다(Altschul et al., 상동). 이들 초기 이웃 단어 적중들은 이들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 탐색을 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 이 단어 적중들은 각 서열을 따라서 두 방향으로 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 만큼 멀리 확장된다. 누적 점수는, 뉴클레오티드 서열에 대해서는, 파라미터 M(한 쌍의 일치하는 잔기에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N(불일치 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 대해서는 점수부여 매트릭스를 사용하여 누적 점수가 계산된다. 각 방향으로 단어 적중의 확장은, 누적 정렬 점수가 그것의 최대 달성 값으로부터 X 양만큼 벗어날 경우; 하나 이상의 음의 점수를 가진 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 또는 그 이하로 될 경우; 또는 어느 하나의 서열의 단부에 도달될 경우 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬 민감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열에 대해)은 디폴트로서 단어길이 (W) 11, 예상치(E) 10, M = 5, N = -4, 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어길이 3, 예상치(E) 10, 및 BLOSUM62 점수부여 매트릭스(Henikoff 및 Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989 참조) 알고리즘(B) 50, 예상치(E) 10, M = 5, N = -4, 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
또한, BLAST 알고리즘은 두 서열 간의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, Karlin 및 Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993 참조). BLAST 알고리즘에 의해서 제공된 유사성의 한 척도는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간 일치가 변화에 의해 일어날 수 있는 확률을 나타내는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 검사 핵산과 기준 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 0.001 미만일 경우 기준 서열과 유사하다고 간주된다.
상기 주지된 서열 동일성 퍼센트 이외에, 두 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는, 하기 설명된 대로, 제 1 핵산에 의해서 암호화된 폴리펩티드가 제 2 핵산에 의해서 암호화된 폴리펩티드에 대해 발생한 항체들과 면역학적으로 교차-반응하는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 전형적으로, 예를 들어 두 펩티드가 보존성 치환에 의해서만 상이할 경우 제 2 서열과 실질적으로 동일하다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는, 하기 설명된 대로, 두 분자 또는 그들의 보체가 긴축 조건하에 서로 혼성화하는 것이다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 서열 증폭에 동일한 프라이머가 사용될 수 있다는 것이다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 둘 이상의 폴리뉴클레오티드(DNA 등) 세그먼트들 간의 기능적 관계를 말한다. 전형적으로, 이것은 전사 조절 서열과 번역된 서열의 기능적 관계를 말한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열은, 그것이 적합한 숙주 세포나 다른 발현 시스템에서 코딩 서열의 전사를 자극하거나 조정할 수 있다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 전사된 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사된 서열과 물리적으로 연속되는데, 즉 이들은 시스-작용성이다. 그러나, 인핸서와 같은 어떤 전사 조절 서열은 그것이 전사를 증진하는 암호화 서열과 물리적으로 연속되거나 근처에 위치될 필요가 없다.
용어 "벡터"는 그것에 연결된 다른 폴리뉴클레오티드를 수송할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 말한다. 벡터의 한 종류로서 "플라스미드"가 있으며, 이것은 원형 이중 가닥 DNA 루프로서, 여기에 추가의 DNA 세그먼트가 리게이션될 수 있다. 또 다른 종류의 벡터로서 바이러스 벡터가 있으며, 여기서는 추가의 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 리게이션될 수 있다. 어떤 벡터는 그것이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기원을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 어떤 벡터는 그것이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")라고 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 주로 플라스미드의 형태이다. 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터의 형태이므로, 본 명세서에서 "플라스미드"와 "벡터"가 상호 교환하여 사용될 수 있다. 그러나, 본 명세서는 동등한 기능을 갖는, 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함하도록 의도된다.
용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입되는 세포를 말한다. 이러한 용어는 특정한 해당 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손들도 의미하는 것으로 의도된다. 계속되는 세대에서는 돌연변이나 환경적인 영향으로 인해 어떤 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수도 있지만, 그래도 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위에 포함된다.
용어 "표적 항원"은 그것에 대해 모 면역글로불린이 발생되거나, 또는 생성된(예를 들어, 파지 디스플레이에 의해) 항원을 말한다.
용어 "돌연변이되지 않은 면역글로불린"은 시스테인 잔기로 치환되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하지 않는 면역글로불린을 말한다. 본원에서 사용된 돌연변이되지 않은 면역글로불린은 돌연변이가 있는 면역글로불린과 돌연변이가 없는 면역글로불린의 올리고머화 경향 또는 콘쥬게이션 효능의 비교의 목적을 위한 가설적인 구성물일 수 있다. 예로서, 사람화 돌연변이뿐만 아니라 시스테인으로 돌연변이를 포함하는 뮤린 항체는 돌연변이되지 않은 면역글로불린이 아니다. 돌연변이되지 않은 면역글로불린은 사람화 돌연변이는 갖지만 시스테인으로 돌연변이는 갖지 않는 항체일 수 있다. 돌연변이가 콘쥬게이션을 위한 자리를 제공하는 것을 포함하는 하나 이상의 목적을 제공하도록 의도될 경우, 돌연변이되지 않은 면역글로불린은 이러한 돌연변이는 포함하지 않는다.
용어 "응집 모티프"는 다음 프로세스에 기초하여 함께 그룹화된 잔기 집단을 말한다. 먼저, 0.15를 초과하는 SAP(5Å 반경)를 갖는 잔기가 확인된다. 다음에, 0.15를 초과하는 SAP(5Å 반경)를 갖는 각 잔기의 5Å 이내에 있는 모든 잔기들이 확인된다. 그러면, 모티프는 0.15를 초과하는 SAP(5Å 반경)를 갖는 잔기와 0.15를 초과하는 SAP(5Å 반경)를 갖는 잔기의 5Å 이내에 있는 0.0을 초과하는 SAP(5Å 반경)를 갖는 모든 잔기들이다. 공통된 적어도 하나의 잔기를 갖는 어떤 이러한 모티프는 공통된 잔기를 갖는 모티프가 남지 않을 때까지 반복적으로 더 큰 모티프에 병합된다. 이들 잔류 모티프 또는 잔기 집단이 응집 모티프를 구성한다.
면역글로불린 잔기가 본원에서 번호에 의해 언급될 경우, 잔기 번호는, 관심 대상의 면역글로불린 서열이 사람 IgG1 면역글로불린과 정렬된 때, IgG1 분자에서 상응하는 잔기의 Kabat 번호를 말한다. 참고로 사람 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 도메인이 정렬된다:
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
VH 및 VL 도메인의 정렬은 Ewert, Honegger, 및 Pluchthun, Methods 34 (2004) 184-199에서 발견될 수 있다.
본 발명의 면역글로불린 콘쥬게이트
본 발명은 여기에서 면역글로불린의 표면 잔기의 적어도 하나의 돌연변이를 가지는 면역글로불린을 포함하는 면역글로불린 콘쥬게이트에 관한 것이며, 이때 돌연변이는 시스테인 잔기로 치환이다. 치환된 시스테인 잔기는, 예로써, 세포독성 약제(예를 들어, 독소루비신 또는 백일해 독소와 같은 독소), 형광단, 예컨대 플로오레세인 또는 로다민과 같은 형광염료, 이미징을 위한 킬레이트제 또는 방사선치료 금속, 펩티딜 또는 비-펩티딜 표지 또는 검출 태그, 또는 폴리에틸렌 글리콜의 다양한 이성질체와 같은 간격-변형제, 제3 성분에 결합하는 펩티드, 다른 탄수화물 또는 친유성 약제일 수 있는 원자 또는 분자에 콘쥬게이트된다. 추가 구체예에서, 분자는 효소, 펩티드, 펩티도미메틱, siRNA, 마이크로RNA, 및 RNA 미메틱, 또는 앱타머를 포함하는 RNA 분자와 같은 뉴클레오티드일 수 있다.
표지된 면역글로불린 콘쥬게이트
특정 구체예에서, 본 발명의 변형된 면역글로불린은 반응성 시스테인 티올기를 통해 면역글로불린에 공유적으로 부착될 수 있는 임의의 표지 모이어티와 콘쥬게이트될 수 있다(Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Lundblad R. L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FIa.). 부착된 표지는, 예를 들어, (i) 검출가능한 신호를 제공하고; (ii) 제2 표지와 상호작용하여 제1 또는 제2 표지, 예를 들어, FRET(형광 공명 에너지 이동)에 의해 제공된 검출가능한 신호를 변형하고; (iii) 상호작용을 안정화하거나 또는 항원 또는 리간드와 결합의 친화도를 증가시키고; (iv) 하전, 소수성, 모양, 또는 다른 물리적 변수에 의해 이동성, 예를 들어, 전기영동 이동성, 또는 세포-투과성에 영향을 미치고, 또는 (v) 캡쳐 모이어티를 제공하여 리간드 친화성, 항체/항원 결합, 또는 이온 복합체형성을 조절하기 위해 작용할 수 있다.
표지된 면역글로불린 콘쥬게이트는 진단 분석, 예를 들어, 특이적 세포, 조직 또는 혈청에서 관심의 항원의 발현을 검출하는데 유용할 수 있다. 진단 용도를 위해, 면역글로불린은 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 많은 표지들이 이용가능하며 하기의 예시적 범주로 일반적으로 그룹화될 수 있다.
(a) 방사성동위원소 (방사성 핵종), 예컨대 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, 또는 213Bi. 방사성동위원소 표지된 면역글로불린은 수용체 표적화된 이미징 실험에서 유용하다. Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, New York, N. Y., Pubs. (1991)에서 설명되는 기술을 사용하여 면역글로불린은 방사성동위원소 금속과 결합하고, 킬레이트화 또는 다른 착물을 형성하는 리간드 시약으로 표지되는데, 시약은 면역글로불린의 유전자 조작된 시스테인 티올에 반응성이다. 금속 이온과 착물을 형성할 수 있는 킬레이트 리간드는 DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA 및 TETA를 포함할 수 있다(Macrocyclics, Dallas, Tex.). 방사성핵종은 본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트와 착물형성을 통해 표적화될 수 있다(Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146).
이미징 실험을 위한 면역글로불린 표지로서 적당한 금속-킬레이트 착물은 미국 특허 Nos. 5,342,606; 5,428,155; 5,316,757; 5,480,990; 5,462,725; 5,428,139; 5,385,893; 5,739,294; 5,750,660; 5,834,456; Hnatowich et al (1983) J. Immunol. Methods 65:147-157; Meares et al (1984) Anal. Biochem. 142:68-78; Mirzadeh et al (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65; Meares et al (1990) J. Cancer 1990, Suppl. 10:21-26; Izard et al (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350; Nikula et al (1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90; Camera et al (1993) Nucl. Med. Biol. 20:955-62; Kukis et al (1998) J. Nucl. Med. 39:2105-2110; Verel et al (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Camera et al (1994) J. Nucl. Med. 21:640-646; Ruegg et al (1990) Cancer Res. 50:4221-4226; Verel et al (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Lee et al (2001) Cancer Res. 61:4474-4482; Mitchell, et al (2003)J. Nucl. Med. 44:1105-1112; Kobayashi et al (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111; Miederer et al (2004) J. Nucl. Med. 45:129-137; DeNardo et al (1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90; Blend et al (2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363; Nikula et al (1999) J. Nucl. Med. 40:166-76; Kobayashi et al (1998) J. Nucl. Med. 39:829-36; Mardirossian et al (1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74; Roselli et al (1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20에서 개시된다.
(b) 형광성 표지, 예컨대, 희토 킬레이트(유로퓸 킬레이트), FITC, 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시 플루오레세인을 포함하는 플로오레세인 종류; TAMRA를 포함하는 로다민 종류; 단실; 리사민; 시아닌; 피코에리트린; Texas Red; 및 그것의 유사체. 형광성 표지는, 예를 들어 Current Protocols in Immunology, supra에서 개시되는 기술을 사용하여 면역글로불린에 콘쥬게이트될 수 있다. 형광성 염료 및 형광성 표지 시약은 Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Oreg.) 및 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, 111.)로부터 상업적으로 이용가능한 것을 포함한다.
c) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하거나 또는 개시된다(U.S. Pat. No. 4,275,149). 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매한다. 예를 들어, 효소는 기질의 색 변화를 촉매할 수 있는데, 이는 분광측광에 의해 측정될 수 있다. 대안으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량하는 기술은 상기 설명되었다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기된 다음 측정될 수 있는 빛을 방출시킬 수 있고(예를 들어, 케밀루미노미터(chemiluminometer)를 사용하여), 형광 어셉터에 에너지를 준다. 효소 표지의 예는 루시퍼라아제(예를 들어, 반딧불이 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제; 미국 특허 No. 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 탈수소효소, 우레아제, 홀스래디쉬 페록시다아제(HRP)와 같은 페록시다아제, 알칼린 포스파타아제(AP), β-갈락토시다아제, 글로코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다아제(예를 들어, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제, 및 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소), 헤테로고리 옥시다아제(예컨대 우리카아제 및 크산틴 옥시다아제), 락토페록시다아제, 마이크로페록시다아제 등을 포함한다. 항체들에 효소의 콘쥬게이팅을 위한 기술은 O'Sullivan et al (1981) "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166에서 설명된다.
효소-기질 조합의 예는, 예를 들어 (i) 홀스래디쉬 페록시다아제(HRP)와 기질로서 수소 페록시다아제, 수소페록시다아제는 염료 전구체(예를 들어, 오르토페닐렌 디아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 히드로클로라이드(TMB))를 산화한다; (ii) 알칼린 포스파타아제(AP)와 크로모제닉 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트; 및 (iii) β-D-갈락토시다아제(β-D-Gal)와 크로모제닉 기질(예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다아제) 또는 형광 기질 4-메틸룸벨리페릴-β-갈락토시다아제를 포함한다. 많은 다른 효소-기질 조합이 당업자에게 이용가능하다. 일반적 검토를 위해, 미국 특허 4,275,149호 및 4,318,980호를 참조.
표지는 본 발명의 변형된 면역글로불린과 간접적으로 콘쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린은 비오틴과 콘쥬게이트될 수 있고, 상기 언급한 표지 중 임의의 3가지의 넓은 범주는 아비딘 또는 스트렙타비딘, 또는 반대로 콘쥬게이트될 수 있다. 비오틴은 스트렙타비딘에 선택적으로 결합하고, 따라서 표지는 이 간접적 방식으로 면역글로불린과 콘쥬게이트될 수 있다. 대안으로 면역글로불린 변이체와 표지의 간접적인 콘쥬게이션을 이루기 위해서, 면역글로불린 변이체는 작은 햅텐(예를 들어, 디곡신)과 콘쥬게이트되고, 상기 언급한 표지들 중 하나의 다른 종류는 합-햅텐 폴리펩티드 변이체(예를 들어, 항-디곡신 항체)와 콘쥬게이트된다. 따라서, 표지와 면역글로불린 변이체의 간접적 콘쥬게이션이 이루어질 수 있다(Hermanson, G. (1996) in Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego).
본 발명의 변형된 면역글로불린과 면역글로불린 콘쥬게이트는 ELISA, 경쟁적 결합분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침강법과 같은 임의의 공지된 분석 방법으로 사용될 수 있다(Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158, CRC Press, Inc.).
검출 표지는 결합 또는 인식 사건을 편재화, 시각화, 및 정량화하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 표지된 면역글로불린 콘쥬게이트는 세포-표면 수용체를 검출할 수 있다. 검출가능하게 표지된 면역글로불린 콘쥬게이트에 대한 다른 사용은 형광 표지된 항체와 비드의 콘쥬게이팅 단계와 리간드의 결합 시 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하는 비드-기반 면역포획 방법이다. 유사한 결합 검출 방법은 항체-항원 상호작용을 측정하고 검출하기 위해 표면 플라즈몬 공명(SPR) 효과를 이용한다.
형광 염료 및 화학발광 염료와 같은 검출 표지(Briggs et al (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc, Perkin-Trans. 1:1051-1058)는 검출가능한 신호를 제공하고, 일반적으로 바람직하게는 하기 특성들을 가지는 면역글로불린을 표지하기 위한 용도이다: (i) 표지된 면역글로불린은 낮은 배경과 함께 매우 높은 신호를 만들어야 하기 때문에 소량의 면역글로불린은 무세포 및 세포-기반 분석 둘 다에서 민감하게 검출될 수 있고; (ii) 표지된 항체는 광 안정성이 있어야 하기 때문에 형광 신호는 상당한 백화현상 없이 관찰되고, 모니터링되고 기록될 수 있다. 막 또는 세포 표면, 특히 살아있는 세포에 표지된 항체의 세포 표면 결합을 수반하는 용도를 위해, 표지는 바람직하게는 (iii) 효과적인 콘쥬게이트 농도 및 검출 민감성을 달성하기 위한 양호한 물 용해도를 가지고 (iv) 세포의 정상적인 대사 과정을 파괴하지 않기 위해서 또는 조기 세포사멸을 야기하지 않기 위해서 살아있는 세포에 비-독성이다.
세포 형광 강도의 직접 정량 및 형광 표지된 사건, 예를 들어, 펩티드-염료 콘쥬게이트의 세포 표면 결합의 열거는 살아있는 세포 또는 비드와 혼합-및-판독, 비-방사성 분석을 자동화하는 시스템(FMAT(TM) 8100 HTS System, Applied Biosystems, Foster City, Calif.)에서 수행될 수 있다(Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204). 표지된 면역글로불린의 사용은 또한 세포 표면 수용체 결합 분석, 면역포획 분석, 형광 결합 면역 흡착 분석(FLISA), 카스파아제-분할(Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23; U.S. Pat. No. 6,372,907), 아포토시스(Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V" (1995) J. Immunol. Methods 184:39-51) 및 세포독성 분석을 포함한다. 형광측정 마이크로부피 분석 기술은 세포 표면에 표적화된 분자에 의한 상승 또는 하강 조절을 확인하기 위해 사용될 수 있다(Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271:143-51).
본 발명의 표지된 면역글로불린 콘쥬게이트는 생물의학 및 분자 이미징의 다양한 방법 및 기술, 예컨대 (i) MRI (자기 공명 이미징); (ii) MicroCT(컴퓨터 단층 촬영); (iii) SPECT (단일광자방출 단층촬영); (iv) PET (양전자 방출 단층촬영) Chen et al (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49; (v) 생물발광; (vi) 형광; 및 (vii) 초음파에 의해 이미징 바이오마커 및 프로브로서 유용하다. 면역 신티그래피는 방사성 기질로 표지된 항체들이 동물 또는 사람 환자에 투여되는 이미징 과정이고, 항체가 편재화하는 신체 내 자리에서 촬영된다(미국 특허 6,528,624). 이미징 바이오마커는 보통의 생물학적 과정, 발병 과정 또는 치료적 개입에 대한 약리학적 반응의 지시자로서 객관적으로 측정되고 평가될 수 있다. 바이오마커는 몇가지 유형이 있을 수 있다: 유형 0은 질병의 박물학 마커이고 알려진 임상적 징후들, 예를 들어 류마티스 관절염에서 활액염의 MRI 평가와 장기적으로 관련되고; 유형 I 마커는 메커니즘이 임상적 발병과 관련되지 않을 수도 있지만 작용의 메커니즘과 관련된 간섭의 효과를 포획하고; 유형 II 마커는 CT에 의해 류마티스 관절염에서 측정된 뼈 침식과 같은 표적 반응을 "입증하기" 위한 임상적 이점을 예측한다. 따라서 이미징 바이오마커는 (i) 표적 단백질의 발현, (ii) 표적 단백질에 치료제의 결합, 즉, 선택성, 및 (iii) 분할과 반감기 약동학 데이터에 관한 약력학(PD) 치료정보를 제공할 수 있다. 실험실-기반 바이오마커에 관한 생체내 이미징 바이오마커의 이점은 비-침습적 치료, 정량적, 전신평가, 반복적 투여 및 평가, 즉, 복수의 시점, 및 임상전(작은 동물)으로부터 임상(사람) 결과에 잠재적으로 이동가능한 효과를 포함한다. 일부 용도를 위해, 바이오이미징은 사전임상 연구에서 동물 실험의 수를 대신하고 최소화한다.
방사성핵종 이미징 표지는 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, 또는 213Bi와 같은 방사성핵종을 포함한다. 방사성핵종 금속 이온은 DOTA와 같은 킬레이트 링커와 착물을 형성할 수 있다. DOTA-말레이미드(4-말레이미도부티르아미도벤질-DOTA)와 같은 링커 시약은 Axworthy et al (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1802-1807)의 과정에 따라서 아미노벤질-DOTA를 이소프로필클로로포르메이트(Aldrich)로 활성화된 4-말레이미도부티르산(Fluka)와 반응시켜 제조될 수 있다. DOTA-말레이미드 시약은 변형된 면역글로불린의 자유 시스테인 아미노산과 반응하고, 항체 상에서 금속 착화 리간드를 제공한다(Lewis et al (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86). DOTA-NHS (1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 모노(N-히드록시숙신이미드 에스테르)와 같은 킬레이트 링커 표지 시약은 상업적으로 이용가능하다(Macrocyclics, Dallas, Tex.). 방사선핵종 표지된 항체들에 의한 수용체 표적 이미징은 종양 조직 내 항체들의 점진적 축적의 검출 및 정량화에 의해 경로 활성화의 마커를 제공할 수 있다(Albert et al (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210). 콘쥬게이트된 방사성-금속은 리소좀 분해 후 세포 내에 남아 있을 수 있다.
펩티드 표지 방법은 잘 알려져 있다. Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, VoIs. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin and New York; and Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, FIa.); De Leon-Rodriguez et al (2004) Chem. Eur. J. 10:1149-1155; Lewis et al (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115; Mier et al (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237 참조.
충분히 근접하여 2가지의 모이어티, 형광 리포터와 퀀차로 표지된 펩티드와 단백질은 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 겪는다. 리포터 그룹은 전형적으로 특정 파장에서 빛에 의해 여기되고, 최대 밝기에서 방출을 위한 적절한 스토크스 시프트(Stokes shift)로 어셉터, 또는 퀀차, 그룹에 에너지를 전달한다. 형광 염료는 플루오레세인 및 로다민 및 그것의 유도체와 같이 연장된 방향족성을 가지는 분자들을 포함한다. 형광 리포터는 무결함 펩티드에서 퀀차 모이어티에 의해 부분적으로 또는 상당히 퀀칭될 수 있다. 펩티다아제 또는 프로테아제에 의한 펩티드의 분해시, 형광의 검출가능한 증가가 측정될 수 있다(Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes", Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18-34).
본 발명의 표지된 항체들은 또한 친화성 정제 약제로서 사용될 수 있다. 이 과정에서, 표지된 항체는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 Sephadex 수지 또는 여과지와 같은 고체상에서 고정된다. 고정된 항체는 정제되어야 하는 항원을 함유하는 샘플과 접촉되고, 그 후에, 지지부를 적당한 용매로 세척하여, 고정된 폴리펩티드 변이체에 결합된 정제되어야 하는 항원을 제외하고 샘플 내 모든 물질을 실질적으로 제거할 것이다. 최종적으로, 지지부는 글리신 완충제와 같은 다른 적당한 용매로 pH 5.0으로 세척하여 폴리펩티드 변이체로부터 항원을 방출할 것이다.
표지 시약은 (i) 표지된 항체를 형성하기 위해 변형된 면역글로불린의 시스테인 티올과 직접, (ii) 표지된 항체를 형성하기 위해 링커 시약과, 또는 (iii) 표지된 항체를 형성하기 위해 링커 시약과 반응할 수 있는 반응성 작용기를 함유한다. 표지 시약의 반응성 작용기는, 다른 작용기가 또한 사용될 수 있지만, 말레이미드, 할로아세틸, 요오도아세트아미드, 숙신이미딜 에스테르(예를 들어, NHS, N-히드록시숙신이미드), 이소티오시아네이트, 술포닐 클로라이드, 2,6-디클로로트리아진일, 펜타플루오로페닐 에스테르, 및 포스포르아미다이트를 포함한다.
대표적인 반응성 작용기는 검출가능한 표지, 예를 들어, 비오틴 또는 형광 염료의 카르복실기 치환체의 N-히드록시숙신이미딜 에스테르(NHS)이다. 표지의 NHS 에스테르가 수행되고, 분리되고, 정제될 수 있고, 및/또는 특성화될 수 있고, 또는 인시츄로 형성될 수 있고 항체의 친핵성 기와 반응될 수 있다. 전형적으로, 표지의 카르복실 형태는 카르보디이미드 시약, 예를 들어 디시클로헥실카르보디이미드, 디이소프로필카르보디이미드, 또는 우로늄 시약, 예를 들어, TSTU (0--(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트, HBTU (O-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), 또는 HATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), 활성제, 예컨대 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 및 N-히드록시숙신이미드의 일부 조합과 반응에 의해 활성화되어 표지의 NHS 에스테르를 제공한다. 일부 경우에, 표지 및 항체는 표지의 인시츄 활성과 항체와의 반응에 의해 커플링되어 한 단계로 표지-항체 콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 다른 활성화 및 커플링 시약은 TBTU (2-(1H-벤조트리아조-1-일)-1-1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), TFFH(N,N',N",N'"-테트라메틸우로늄 2-플루오로-헥사플루오로포스페이트), PyBOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트, EEDQ (2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디히드로-퀴놀린), DCC (디시클로헥실카르보디이미드); DIPCDI (디이소프로필카르보디이미드), MSNT (1-(메시틸렌-2-술포닐)-3-니트로-1H-1,2,4-트리아졸, 및 아릴 술포닐 할로겐화물, 예를 들어 트리이소프로필벤젠술포닐 클로라이드를 포함한다.
따라서 본 발명의 목적은 진단 도구로서 단락 [0007]에서 논의한 바와 같은 면역글로불린 콘쥬게이트 및 그것의 구체예의 임의의 및 모든 조합의 사용을 제공하는 것이다.
따라서 본 발명의 목적은 고분자량 단백질에 대한 표준으로서 단락 [0007]에서 논의한 바와 같은 면역글로불린 콘쥬게이트 및 그것의 구체예의 임의의 및 모든 조합의 사용을 제공하는 것이다.
면역글로불린 폴리머 콘쥬게이트
추가 구체예에서, 본 발명은 또한 면역글로불린이 폴리머와 연결되는 면역글로불린 콘쥬게이트를 고려한다. 전형적으로, 폴리머는 면역글로불린 성분이 생리적 환경과 같은 수성 환경에서 침전하기 않기 때문에 수용성이다. 적당한 폴리머의 예는 아실화를 위한 활성 에스테르, 또는 알킬화를 위한 알데히드와 같은 단일 반응기를 가지도록 변형된 것이다. 이 방법으로, 중합도는 조절될 수 있다. 반응성 알데히드의 예는 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 또는 모노-(C1-C10)알콕시, 또는 그것의 아릴옥시 유도체이다(예를 들어, Harris, et al., 미국 특허 5,252,714호). 폴리머는 분지 또는 비분지될 수 있다. 게다가, 폴리머의 혼합물은 항체 성분과 콘쥬게이트를 만들기 위해 사용될 수 있다.
적당한 수용성 폴리머는, 제한 없이, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 모노메톡시-PEG, 모노-(C1-C10)알콕시-PEG, 아릴옥시-PEG, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)PEG, 트레실 모노메톡시 PEG, PEG 프로피온알데히드, 비스-숙신이미딜 카르보네이트 PEG, 프로필렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 코-폴리머, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 덱스트란, 셀룰로오스, 또는 다른 탄수화물-계 폴리머를 포함한다. 적당한 PEG는 약 600 내지 약 60,000, 예를 들어 5,000, 12,000, 20,000 및 25,000의 분자량을 가진다. 콘쥬게이트는 또한 이러한 수용성 폴리머의 혼합물을 포함할 수 있다.
예시로서, 폴리알킬 옥시드 모이어티는 면역글로불린 성분의 N-말단에 부착될 수 있다. PEG는 하나의 적당한 폴리알킬 옥시드이다. 예를 들어, 면역글로불린은 PEG, "페길화"로서 알려진 과정으로 변형될 수 있다. 면역글로불린의 페길화는 당업계에 알려진 임의의 페길화 반응에 의해 수행될 수 있다(예를 들어, EP 0 154 316, Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan and Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994), and Francis et al., Int J Hematol 68:1 (1998)참조). 예를 들어, 페길화는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자와 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 대안의 접근에서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 PEG의 말단 히드록시 또는 아미노기가 활성화된 링커에 의해 치환된 활성화된 PEG를 축합함으로써 형성된다(예를 들어, Karasiewicz et al., 미국특허 5,382,657호 참조).
아실화에 의한 페길화는 전형적으로 PEG의 활성 에스테르 유도체를 면역글로불린과 반응시키는 단계를 필요로 한다. 활성화된 PEG 에스테르의 예는 N-히드록시 숙신이미드로 에스테르화된 PEG이다. 본원에서 사용되는 용어 "아실화"는 하기 종류의 면역글로불린과 수용성 폴리머 사이의 연결을 포함한다: 아미드, 카르바메이트, 우레탄 등. 아실화에 의해 페길화된 항-BCMA-TACI 면역글로불린을 제조하는 방법은 (a) 하나 이상의 PEG 기를 면역글로불린에 부착하는 조건하에서 면역글로불린을 PEG와 반응시키는 단계(예컨대 PEG의 알데히드 유도체의 반응성 에스테르), 및 (b) 반응 생성물(들)을 얻는 단계를 전형적으로 포함할 것이다. 일반적으로, 아실화반응을 위한 최적의 반응 조건은 알려진 변수 및 원하는 결과를 기반으로 결정될 것이다. 예를 들어, PEG:항체 성분의 더 큰 비율, 폴리페길화된 항체 성분 생성물의 더 큰 비율.
아실화에 의한 페길화의 생성물은 전형적으로 폴리페길화된 면역글로불린 생성물이며, 리신 ε-아미노 기는 아실 연결기를 통해 페길화된다. 접속 연결의 예는 아미드이다. 더 높은 페길화의 정도를 가지는 일부 종들이 반응 조건에 의존하여 형성될 수 있지만, 전형적으로, 결과 면역글로불린 성분은 적어도 95% 모노-, 디, 또는 트리-페길화될 것이다. 페길화된 종들은 투석, 초미세여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등과 같은 표준 정제 방법을 사용하여 콘쥬게이트되지 않은 면역글로불린 성분으로부터 분리될 수 있다.
알킬화에 의한 페길화는 일반적으로 환원제의 존재하에서 PEG의 말단의 알데히드 유도체를 면역글로불린 성분과 반응시키는 단계를 수반한다. PEG 기는 -CH2-NH 기를 통해 폴리펩티드에 부착될 수 있다.
모노페길화된 생성물을 생성하기 위한 환원성 알킬화를 통한 유도체화는 유도체화를 위해 이용할 수 있는 다른 종류의 1차 아미노기의 차별적인 반응성을 고려한다. 전형적으로, 반응은 단백질의 리신 잔기의 ε-아미노기와 N-말단 잔기의 α-아미노기 사이의 pKa 차이의 이점을 취하도록 허용하는 pH에서 수행된다. 이러한 선택적 유도체화에 의해, 알데히드와 같은 반응성 기를 함유하는 수용성 폴리머의 단백질에 부착은 조절된다. 폴리머와의 콘쥬게이션은 리신 측쇄 아미노기와 같은 다른 반응성 기의 중요한 변형 없이 단백질의 N-말단에서 우세하게 일어난다.
모노폴리머 항체 성분의 실질적으로 균질한 모집단을 만들기 위한 반응성 알킬화는 (a) 항체 성분의 아미노 말단에서 α-아미노기의 선택적 변형을 허용하기에 적당한 pH에서 환원성 알킬화 조건 하에 항체 성분을 반응성 PEG와 반응시키는 단계, 및 (b) 반응 생성물(들)을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 환원성 알킬화를 위해 사용한 환원제는 수용액에서 안정해야 하고 바람직하게는 환원성 알킬화의 초기 과정에서 형성된 Schiff 염기만을 환원시킬 수 있어야 한다. 바람직한 환원제는 소듐 보로하이드라이드, 소듐 시아노보로하이드라이드, 디메틸아민 보란, 트리메틸아민 보란, 및 피리딘보란을 포함한다.
모노폴리머 면역글로불린 콘쥬게이트의 실질적으로 균일한 모집단에 대해, 환원성 알킬화 반응 조건은 면역글로불린의 N-말단에 수용성 폴리머 모이어티의 선택적인 부착을 허용하는 것이다. 이러한 반응 조건은 일반적으로 N-말단에서 리신 아미노기와 α-아미노기 사이의 pKa 차이를 제공한다. pH는 또한 사용되는 폴리머 대 단백질의 비율에 영향을 미친다. 일반적으로, pH가 낮으면, N-말단의 α기 가 덜 반응성이기 때문에 단백질에서 더 큰 과량의 폴리머가 요망될 것이고, 더 많은 폴리머가 최적의 조건을 이루기 위해 필요로 된다. pH가 더 높다면, 더 큰 반응성 기가 이용가능하기 때문에 폴리머:항체 성분은 더 클 필요가 없다. 전형적으로, pH는 3 내지 9, 또는 3 내지 6의 범위 내에 속할 것이다.
폴리펩티드 및 수용성 폴리머를 포함하는 콘쥬게이트를 생성하는 일반적인 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Karasiewicz et al., 미국 특허 5,382,657호, Greenwald et al., 미국 특허 5,738,846호, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal Biochem. 247:434 (1997)) 참조.
면역글로불린 약물 콘쥬게이트
추가 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린이 약물 또는 세포독성 모이어티에 콘쥬게이트되는 면역글로불린 콘쥬게이트를 포함한다. 면역글로불린 약물 콘쥬게이트의 약물 모이어티는, 예를 들어 세포독성 또는 세포증식 억제 효과를 가지는 임의의 화합물, 모이어티 또는 기를 포함할 수 있다. 약물 모이어티는, 제한 없이: (i) 마이크로튜블린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, 또는 DNA 인터커레이터로서 작용할 수 있는 화학치료제; (ii) 효소적으로 작용할 수 있는 단백질 독소; 및 (iii) 방사성동위원소를 포함한다.
대표적인 약물 모이어티는, 제한되는 것은 아니지만, 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065, 칼리키아미신 및 다른 에네딘 항생제, 탁산, 안트라사이클린, 및 그것의 입체이성질체, 동배체, 유사체 또는 유도체를 포함한다.
메이탄시노이드 약물 모이어티로서 사용에 적당한 메이탄시노이드 화합물은 당업계에 잘 알려져 있고, 알려진 방법에 따라서 천연 공급원으로부터 분리되고, 유전자 유전자 조작 기술을 사용하여 만들어지고(Yu et al (2002) PROC. NAT. ACAD. SCI. (USA) 99:7968-7973 참조), 또는 알려진 방법에 따라서 합성으로 제조되는 메이탄신올 및 메이탄신올 유사체를 사용하여 만들어질 수 있다.
대표적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 변형된 방향족 환, 예컨대 C-19-데클로로(미국특허 4,256,746호) (안사마이토신 P2의 수소화 알루미늄리튬 환원에 의해 제조); C-20-히드록시(또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로(미국특허 4,361,650호 및 4,307,016호) (스트렙토마이세스 또는 악티노마이세스를 사용하여 탈메틸화 또는 LAH를 사용하여 탈염소화에 의해 제조); 및 C-20-데메톡시, C-20-아실옥시 (--OCOR), +/-데클로로(미국 특허 4,294,757호) (아실 클로라이드를 사용하여 아실화에 의해 제조) 및 다른 위치에서 변형을 가지는 것을 포함한다.
대표적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 또한 변형을 가지는 것, 예컨대, C-9-SH (미국 특허 4,424,219호) (메이탄시놀과 H2S 또는 P2S5의 반응에 의해 제조); C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2 OR)(미국 특허 4,331,598호); C-14-히드록시메틸 또는 아실옥시메틸(CH2OH 또는 CH2OAc) (미국 특허 4,450,254호) (Nocardia로부터 제조); C--I5-히드록시/아실옥시(미국 특허 4,364,866호) (스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 변환에 의해 제조); C-15-메톡시(미국 특허 4,313,946호 및 4,315,929호) (Trewia nudlflora로부터 분리됨); C-18-N-데메틸(미국 특허 4,362,663호 및 4,322,348호) (스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조); 및 4,5-데옥시(미국 특허 4,371,533호) (메이탄시놀의 티타늄 트리클로라이드/LAH 환원에 의해 제조)를 포함한다. 메이탄신 화합물의 다수의 위치는 결합의 종류에 따라서, 결합 위치로서 유용하게 되는 것으로 알려져있다. 예를 들어, 에스테르 결합을 형성하기 위해서, 히드록실기를 가지는 C-3 위치, 히드록시메틸기로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치 및 히드록실기를 가지는 C-20 위치는 모두 적당하다.
메이탄신 화합물은 마이크로튜불린 단백질, 튜불린의 중합화의 억제를 통해 유사분열 동안 미세소관의 형성을 억제함으로써 세포 증식을 억제한다(Remillard et al (1975) Science 189:1002-1005). 메이탄신과 메이탄시노이드는 매우 세포독성이지만 암 치료에서 그것의 임상적 사용은 주로 종양에 대한 그것의 불량한 선택성에 기인하는 그것의 심각한 전신 부작용에 의해 크게 제한되었다. 메이탄신으로 임상적 시도는 중추신경계 및 위장관계의 심각한 부작용 때문에 중단되었다. (Issel et al (1978) Can. Treatment. Rev. 5:199-207).
메이탄시노이드 약물 모이어티는 면역글로불린 약물 콘쥬게이트에서 매력적인 약물 모이어티인데, 그것들이 (i) 발효 또는 생성물의 화학적 변형, 유도체화에 의해 상대적으로 제조되기 쉽고, (ii) 항체에 비-디술파이드 링커를 통해 콘쥬게이션에 적당한 작용기로 유도체화를 잘 받아들이고, (ii) 혈장에서 안정하고, (iv) 다양한 종양 셀라인에 대해 효과적이기 때문이다(US 2005/0169933; WO 2005/037992; 미국 특허 5,208,020호).
다른 약물 모이어티와 함께, 메이탄시노이드 약물 모이어티의 모든 입체이성질체는 본 발명의 화합물에 대해 생각된다.
면역글로불린 약물 콘쥬게이트의 약물 모이어티는 또한 돌라스타틴 및 그것의 펩티드 유사체 및 유도체, 아우리스타틴을 포함한다(미국 특허 5,635,483; 5,780,588호). 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세소관 움직임, GTP 가수분해, 및 핵 과 세포의 분열을 방해하는 것으로 나타났고(Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) 항암(미국특허 5,663,149호) 및 항진균 활성(Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)을 가진다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티의 다양한 형태는 펩티드 약물 모이어티의 N(아미노) 말단 또는 C(카르복실) 말단을 통해 항체에 공유적으로 부착될 수 있다(WO 02/088172; Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; Francisco et al (2003) Blood 102(4):1458-1465).
대표적인 아오리스타틴 구체예는 명세서 각각 전체가 참고로써 명확히 포함되는, WO 2005/081711; Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, presented Mar. 28, 2004에서 개시되는 N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함한다.
전형적으로, 펩티드계 약물 모이어티는 2이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에서 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은, 예를 들어 펩티드 화학 분야에서 잘 알려진 액체 상 합성 방법에 따라서 제조될 수 있다(E. Schroder and K. Luibke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press 참조).
약물 모이어티는 칼리키아미신, 및 그것의 유사체 및 유도체를 포함한다. 항생체의 칼리키아미신 패밀리는 서브-피코몰 농도에서 2중 가닥 DNA 파괴를 만들 수 있다. 칼리키아미신 패밀리의 콘쥬게이트의 제조를 위해, 미국 특허 5,712,374; 5,714,586; 5,739,116; 5,767,285; 5,770,701, 5,770,710; 5,773,001; 5,877,296 참조. 사용될 수 있는 칼리키아미신의 구조적 유사체는, 제한되는 것은 아니지만, γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I PSAG 및 θI 1(Hinman et al Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al Cancer Research 58:2925-2928 (1998)을 포함한다.
단백질 독소는, 예를 들어 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 부분, 엑소톡신 A 사슬(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 사슬(Vitetta et al (1987) Science, 238:1098), 아브린 A 사슬, 모덱신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우라이트 포르디이(Aleurites Fordil) 단백질, 디안신 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함한다(WO 93/21232).
치료적 방사성동위원소는, 예를 들어 32P, 33P, 90Y, 125I, 131I, 131In, 153Sm, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi, 212Pb, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다.
방사성동위원소 또는 다른 표지들은 알려진 방법으로 콘쥬게이트에 포함될 수 있다(Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57; "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" Chatal, CRC Press 1989). 탄소-14-표지된 1-이소티오시안네이토벤질-3-메틸디에틸렌트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 방사선핵종의 콘쥬게이션을 위한 대표적인 킬레이트제이다(WO 94/11026).
링커
본 발명의 특정 구체예에서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 적어도 2개의 반응 자리를 가지는 링커 분자를 포함한다. 하나의 반응 자리는 면역글로불린의 치환된 시스테인 잔기에 결합되고, 나머지 반응 자리는 원자 또는 분자에 결합된다. "링커"는 하나 이상의 약물 모이어티 및 면역글로불린 단위에 사용되어 면역글로불린 콘쥬게이트를 형성할 수 있는 이작용성 또는 다작용성 모이어티이다. 면역글로불린 콘쥬게이트는 약물 또는 다른 분자 및 면역글로불린에 결합을 위해 반응성 작용기를 가지는 링커를 사용하여 편리하게 만들어질 수 있다. 변형된 면역글로불린의 시스테인 티올의 시스테인으로 치환은 링커 시약, 약물 모이어티 또는 약물-링커 중간체의 작용기와 결합을 형성할 수 있다.
한 양태에서, 링커는 항체에 존재하는 친핵성 시스테인에 반응성인 친전자성기를 가지는 반응기를 가진다. 항체의 시스테인 티올은 링커의 친전자성 기와 반응성이고 링커와 공유결합을 형성한다. 유용한 친전자성 기는, 제한되는 것은 아니지만, 말레이미드 및 할로아세트아미드 기를 포함한다.
본 발명의 변형된 면역글로불린은 Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773의 766 페이지의 콘쥬게이션 방법에 따라서, 링커 시약 또는 약물-링커 중간체, 말레이미드 또는 α-할로 카르보닐과 같은 친전자성 작용기와 반응한다.
링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 아미노산 단위는 존재할 때, 본 발명의 면역글로불린 약물 콘쥬게이트의 약물 모이어티에 면역글로불린을 연결한다.
아미노산 링커는, 예를 들어 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드, 헵타펩티드, 옥타펩티드, 노나펩티드, 데카펩티드, 운데카펩티드 또는 도데카펩티드 단위일 수 있다. 아미노산 단위를 포함하는 아미노산 잔기는 자연적으로 발생하는 것뿐만 아니라 시트룰린과 같이 비-자연적으로 발생하는 아미노산 유사체를 포함한다.
아미노산 단위는 종양-관련 프로테아제를 포함하는 하나 이상의 효소에 의해 효소적으로 분해되어 약물 모이어티를 방출시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 링커는 분지를 통해 하나 이상의 약물 모이어티, 다작용성 링커 모이어티의 항체에 공유 부착을 위한 수지상 형 링커일 수 있다(Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). 수지상 링커는 약물 대 항체의 몰비, 즉, 면역글로불린 약물 콘주게이트의 효능과 관련된 부하를 증가시킬 수 있다. 따라서, 변형된 면역글로불린이 단지 하나의 반응성 시스테인 티올기를 함유한다면, 다수의 약물 모이어티가 수지상 링커를 통해 부착될 수 있다.
다른 구체예에서, 링커는 용해도 또는 반응성을 조절한 기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 술포네이트(--SO3 -) 또는 암모늄과 같은 하전된 치환체는 시약의 물 용해도를 증가시킬 수 있고, 면역글로불린 콘쥬게이트를 제조하기 위해 사용된 합성 경로에 따라서, 링커 시약과 면역글로불린 또는 약물 모이어티의 커플링 반응을 가능하게 하고, 또는 면역글로불린-링커 중간체와 약물 모이어티의 커플링 반응을 가능하게 한다.
본 발명의 화합물은, 제한되는 것은 아니지만, 링커 시약: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트), 및 비스-말레이미드 시약 TME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEO)3, 및 BM(PEO)4를 포함하여 제조되는 면역글로불린 콘쥬게이트를 명백히 고려하며, 이것들은 Pierce Biotechnology, Inc., Customer Service Department, P.O. Box 117, Rockford, 111. 61105 U.S.A, U.S.A 1-800-874-3723, International +815-968-0747로부터 상업적으로 이용가능하다. 467-498페이지, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog 참조. 비스-말레이미드 시약은 순차적 또는 동시 방식으로 티올-함유 약물 모이어티, 표지, 또는 링커 중간체의 티올기의 부착을 허용한다. 시스테인, 약물 모이어티, 표지, 또는 링커 중간체와 반응성인 말레이미드 이외의 다른 작용기는, 제한없이, 요오도아세트아미드, 브로모아세트아미드, 비닐 피리딘, 디술피드, 피리딜 디술피드, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트를 포함한다.
따라서 본 발명의 목적은 7(VH), 20(VL), 22(VL), 25(VH), 125(CHI), 248(CH2), 254(CH2), 286(CH2), 298(CH2), 및 326(CH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에서 적어도 하나의 돌연변이를 가지는 면역글로불린을 포함하는 면역글로불린 콘쥬게이트를 제공하는 것이며, 적어도 하나의 돌연변이는 시스테인 잔기, 및 원자 또는 분자로 치환되고, 원자 또는 분자는 시스테인 잔기에 콘쥬게이트 된다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 7(VH), 20(VL), 22(VL) 및 125(CH1)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 248(CH2) 및 326(CH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 25(VH) 및 286(CH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 254(CH2) 및 298(VH)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택된다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 IgG1을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 CH1 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 CH2 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 CH3 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 CL 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 VH 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 VL 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 적어도 2개의 반응 자리를 가지는 링커 분자를 추가로 포함하며, 이때 제1 반응 자리는 면역글로불린의 시스테인 잔기에 결합되고, 제2 반응 자리는 원자 또는 분자에 결합된다. 링커 분자를 가지는 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 링커 분자는 히드라존, 이황화물, 펩티드, 킬레이트제 및 말레이미드로 구성되는 군으로부터 선택된다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 원자 또는 분자는 방사성핵종, 화학치료제, 미생물독소, 식물독소, 폴리머, 탄수화물, 사이토카인, 형광 표지, 발광 표지, 효소-기질 표지, 효소, 펩티드, 펩티도미메틱, 뉴클레오티드, siRNA, 마이크로RNA, RNA 미메틱, 및 앱타머로 구성되는 군으로부터 선택된다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 원자 또는 분자는 90Y, 131I, 67Cu, 177Lu, 213Bi, 211At, 칼리키아미신, 듀오카르마이신, 마이타니소이드, 아우리스타틴, 안트라사이클린, 슈도모나스 엑소톡신 A, 디프테리아 톡신, 리신, 폴리에틸렌 글리콜, 히드록시에틸 전분, 및 만노실 잔기로 구성되는 군으로부터 선택된다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 원자 또는 분자는 돌연변이되지 않은 면역글로불린의 면역원성을 감소시킨다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 원자 또는 분자는 돌연변이되지 않은 면역글로불린의 면역원성을 증가시킨다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 항원 결합 활성을 더 포함하고, 활성은 돌연변이되지 않은 면역글로불린의 항원 결합 활성의 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 또는 적어도 130%이다.
따라서 본 발명의 목적은 7(VH), 20(VL), 22(VL), 25(VH), 125(CHI), 248(CH2), 254(CH2), 286(CH2), 및 326(CH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린을 제공하는 것이며, 적어도 하나의 돌연변이는 시스테인 잔기로 치환이다. 특정 구체예에서 적어도 하나의 돌연변이는 7(VH), 20(VL), 22(VL) 및 125(CH1)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 248(CH2) 및 326(CH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 25(VH) 및 286(CH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 잔기 254(CH2)에서이다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택된다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 IgG1을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 변형 또는 분리된 면역글로불린은 사람 CH1 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 변형 또는 분리된 면역글로불린은 사람 CH2 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 변형 또는 분리된 면역글로불린은 사람 CH3 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 변형 또는 분리된 면역글로불린은 사람 CL 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 변형 또는 분리된 면역글로불린은 사람 VH 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 변형 또는 분리된 면역글로불린은 사람 VL 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 항원 결합 활성을 더 포함하고, 활성은 돌연변이되지 않은 면역글로불린의 항원 결합 활성의 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 또는 적어도 130%이다.
면역글로불린 약물 콘쥬게이트의 제조
한 양태에서, 본 발명은 면역글로불린 콘쥬게이트를 생성하는 방법을 포함한다. 면역글로불린 약물 콘쥬게이트는 당업자에게 알려진 유기 화학 반응, 조건, 및 시약을 사용하여 몇몇 경로에 의해 제조될 수 있으며, (1) 변형된 면역글로불린의 시스테인 기와 링커 시약의 반응으로 공유결합을 통해 면역글로불린-링커 중간체를 형성한 다음, 활성화된 약물 모이어티와 반응하는 단계; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵성 기와 링커 시약의 반응으로 공유 결합을 통해 약물-링커 중간체를 형성한 다음, 변형된 면역글로불린의 시스테인기와 반응하는 단계를 포함한다. 콘쥬게이션 방법 (1) 및 (2)는 다양한 변형된 면역글로불린, 약물 모이어티, 및 링커와 함께 사용되어 본 발명의 면역글로불린 약물 콘쥬게이트를 만들 수 있다.
항체 시스테인 티올기는 친핵성이고, (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할로겐화물; (ii) 알킬 및 벤질 할로겐화물, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실, 및 말레이미드 기; 및 (iv) 디술파이트, 예컨대 술파이드 교환을 통한 피리딜 디술파이드를 포함하는, 링커 시약 및 링커 중간체 상의 친핵성 기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있다.
약물 모이어티 상의 친핵성 기는, 링커 모이어티 및 링커 시약 상에서 친핵성 기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는, 제한되는 것은 아니지만, 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드 기를 포함한다.
메이탄신은, 예를 들어 유리 티올, May-SH로 환원될 수 있고, 변형된 항체와 반응할 수 있는 May-SSCH3로 변환되어(Chari et al (1992) Cancer Research 52:127-131) 이황화물 링커를 가지는 메이탄시노이드-항체 면역콘쥬게이트를 만들 수 있다. 이황화물 링커와 항체-메이탄시노이드 콘쥬게이트가 보고되었다(WO 04/016801; 미국특허 6,884,874호; US 2004/039176 A1; WO 03/068144; US 2004/001838 A1; 미국특허 6,441,163호, 5,208,020, 5,416,064; WO 01/024763). 이황화물 링커 SPP는 링커 시약 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트로 구성된다.
특정 조건하에서, 변형된 면역글로불린은 환원제, 예컨대 DTT (Cleland's 시약, 디티오트레이톨) 또는 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드; Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, Mass.) 또는 당업자에게 알려진 다른 환원제로 처리에 의해 링커 시약과 콘쥬게이션을 위해 반응성으로 만들어질 수 있다.
따라서 본 발명의 목적은 [0008] 또는 [0019]에서 논의한 변형된 또는 분리된 면역글로불린 및 그것의 구체예의 임의의 및 모든 조합을 제공하는 단계, 하나이상의 치환된 시스테인 잔기를 환원제로 환원시켜 환원된 시스테인 잔기를 형성하는 단계, 및 면역글로불린을 원자 또는 분자와 함께 인큐베이팅하며, 이때 원자 또는 분자는 환원된 시스테인 잔기와 반응하여 면역글로불린 콘쥬게이트를 형성하는 단계에 의해 면역글로불린 콘쥬게이트를 만드는 방법을 제공하는 것이다.
공간-응집 경향
한 양태에서, 본 발명은 시스테인으로 돌연변이를 위해 단백질 표면에서 잔기들을 선택하고, 변형된 면역글로불린 또는 면역글로불린 콘쥬게이트의 교차-결합을 줄이는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 교차-결합에 대해 감소된 경향을 가지는 면역글로불린 및 면역글로불린 콘쥬게이트를 만들기 위해 사용될 수 있고, 즉, 농축된 용액에서 면역글로불린 또는 면역글로불린 콘쥬게이트는 더 높은 차수로 응집된 멀티머보다는 모노머 형태로 우세하게 남아있다. 본원의 방법은 가교-결합을 위한 단백질의 경향을 평가하기 위한 컴퓨터적 방법의 능력에서 진보를 나타낸다. 특히, 본 방법은 단백질의 표면을 특성화하기 위해 당업계에 알려진 SAA(Solvent Accessible Area)의 계산에 적어도 부분적으로 기초한다. SAA는 용매와 접촉하고 있는 각 아미노산 또는 단백질 구조의 표면적을 제공한다. SAA는 전형적으로 프로브 구체가 단백질 표면, 즉 단백질 구조 모델의 표면 위를 굴러감에 따라서 프로브 구체 중심의 궤적을 컴퓨터로 계산함으로써 계산될 수 있다. 프로브 구체는 물 분자의 반경과 동일한 반경, 즉 R = 1.4Å을 가진다. 하기 설명되는 SAA를 계산하는 다른 방법도 본 분야에 알려져 있으며, 본원에 설명된 방법과 양립가능하다. SAA는 단백질 표면을 특성화하는데 아주 유용하지만, 다음 단점들 때문에 잠재적으로 응집 경향이 있는 단백질 표면의 소수성 패치를 특성화하는 데는 충분하지 않은 것으로 판명되었다,
1. SAA는 소수성 영역과 친수성 영역을 구별하지 못한다.
2. SAA는 잔기의 소수성에 직접 비례하지 않는다(예를 들어, MET는 LEU보다 표면적이 더 크지만 덜 소수성이다).
3. SAA는 몇 개의 소수성 잔기들이 나란히 있는지 나타내지 못하며, 따라서 어떤 영역의 소수성을 증진시킬 수 있다. 이들 잔기는 일차 서열에서 나란히 있을 수 있거나, 또는 일차 서열에서는 멀리 떨어져 있어도 3차 구조에서는 나란히 있을 수 있다. 어느 쪽이든지 이들은 항체 표면에서 어떤 패치의 소수성을 증진시킬 수 있다.
본원에 설명한 한 척도인 유효-SAA는 하기 식에 따라서 노출된 아미노산 분획의 소수성을 계산함으로써 발생된다:
Figure pat00006
유효-SAA의 추가의 구체예는 일차 단백질 서열에서 인접해 있는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 등)의 아미노산 잔기에 걸쳐 유효-SAA를 합계 내는 것을 포함한다. 유효-SAA는 기본 SAA를 능가하는 개선을 나타내지만, 접힌 단백질의 구조와, 단백질 서열에서 인접해 있지 않은 아미노산들이 단백질의 접힌 2차, 3차, 또는 4차 구조에서는 서로 근접해 있을 수 있다는 사실을 충분히 설명할 수 있는 능력이 부족하다. 이러한 단백질 접힘은 일차 구조에서는 나타나지 않거나, 또는 접힌 단백질 구조의 더욱 면밀한 분석에 의해서만 검출될 수 있는 응집 경향 영역을 형성할 수 있다.
본 발명은 단백질 표면의 어떤 패치나 영역의 유효 소수성을 강조하는, 공간-응집-경향이라고 부르는 새로운 더욱 진보된 척도를 제공한다. 공간-응집-경향은 단백질 구조 모델의 원자들 상의 또는 근처의 한정된 공간 영역에 대해 계산된다.
이와 관련하여, "한정된 공간 영역"은 단백질 구조 상의 또는 근처의 물리적 국소 구조 및/또는 화학적 환경을 포착하도록 선택된 3-차원 공간 또는 부피이다. 특히 바람직한 구체예에서, 공간-응집-경향은 반경 R이 단백질에 있는 원자들(예를 들어, 단백질 구조 모델의 원자들)의 중심에 있는 구체 영역에 대해 계산된다. 또한, 공간-응집-경향은 반경 R이 화학적 결합들의 중심에 있거나, 또는 구조 모델 근처의 공간에 위치된 구체 영역에 대해 계산될 수 있다. 따라서, 다른 구체예에서, SAP는 원자 근처에 중심이 있는, 예를 들어 특정 원자 또는 화학 결합의 중심으로부터 1-10Å, 1-5Å, 또는 1-2Å 사이에 있는 공간 내의 지점에 중심이 있는 한정된 공간 영역에 대해 계산될 수 있다.
어떤 구체예에서, 선택된 반경 R은 1Å 내지 50Å이다. 특정 구체예에서, 선택된 반경은 적어도 1Å, 적어도 3Å, 적어도 4Å, 적어도 5Å, 적어도 6Å, 적어도 7Å, 적어도 8Å, 적어도 9Å, 적어도 10Å, 적어도 11Å, 적어도 12Å, 적어도 15Å, 적어도 20Å, 적어도 25Å, 또는 적어도 30Å이다. 어떤 구체예에서, 선택된 반경은 5Å 내지 15Å, 5Å 내지 12Å, 또는 5Å 내지 10Å이다. 특정 구체예에서, 선택된 반경은 5Å 또는 10Å이다.
다른 구체예에서, 공간-응집 경향이 계산되는 영역은 구체가 아니다. 이 영역의 가능한 모양은 큐브, 원통, 원뿔, 회전타원, 피라미드, 반구, 또는 공간의 일부분의 감싸는데 사용될 수 있는 어떤 다른 모양을 더 포함할 수 있다. 이러한 구체예에서, 영역의 크기는 반경 이외의 다른 척도, 예를 들어 그 모양의 중심에서부터 표면 또는 꼭지점까지의 거리를 사용하여 선택될 수 있다.
어떤 구체예에서, SAP는 단백질의 교차결합에 대한 경향을 증가시키지 않고 시스테인으로 치환될 수 있는, 단백질, 특히 항체 또는 면역글로불린 내 잔기를 선택하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 교차-결합에 대한 경향을 증가시키지 않고 시스테인으로 치환될 수 있는 잔기를 확인하는 과정을 간소화하는 것으로 기대된다.
따라서, 일반적인 항목에서, 단백질에서 특정 원자의 공간-응집-경향을 계산하기 위한 방법은 (a) 단백질을 표시하는 구조 모델에서 하나 이상의 원자를 확인하는 단계, 여기서 하나 이상의 원자는 특정 원자 상에 또는 근처에 중심이 있는 한정된 공간 영역 내에 있고; (b) 한정된 공간 영역 내의 하나 이상의 원자 각각에 대해, 이 원자들에서의 용매 접근가능한 면적(SAA) 대 완전히 노출된 동일한 잔기에서의 원자들의 SAA의 비를 계산하는 단계; (c) 각 비에 하나 이상의 원자들의 원자 소수성을 곱하는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 적들을 합계 내는 단계를 포함하며, 이때 합계가 특정 원자의 SAP이다.
관련된 구체예에서, SAP는 (a) 단백질을 표시하는 구조 모델에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 확인하는 단계, 여기서 하나 이상의 아미노산 잔기는 특정 원자 상에 또는 근처에 중심이 있는 한정된 공간 영역 내에 적어도 하나의 원자를 가지고; (b) 확인된 하나 이상의 아미노산 잔기 각각에 대해, 이 아미노산에서의 원자들의 용매 접근가능한 면적(SAA) 대 완전히 노출된 동일한 잔기에서의 원자들의 SAA의 비를 계산하는 단계; (c) 각 비에 아미노산 소수성 등급에 의해 결정된 하나 이상의 아미노산 잔기의 소수성을 곱하는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 적들을 합계 내는 단계를 포함하는 상이한 방법에 따라서 계산될 수 있으며, 이때 합계가 특정 원자의 SAP이다. 바람직한 구체예에서, 구조 모델은 분자 역학 시뮬레이션에서 구조 모델이 용매와 상호작용하도록 허용함으로써 단계 (a) 전에 처리된다. 아미노산이 한정된 공간 영역 내에 적어도 하나의 원자를 갖는 것으로 확인된 경우, 적어도 하나의 원자는 오로지 아미노산 측쇄에 있는 원자이기 위해서 필요할 수 있다. 또는 달리, 그것은 주쇄 원자이기 위해 필요한 원자일 수 있다.
다른 구체예에서, 이 방법은 선택적으로 단계 (a) 전에 분자 역학 시뮬레이션을 수행하는 단계, 및 단계 (a)-(d)를 반복하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 매번 복수 회의 단계에서 추가의 분자 역학 시뮬레이션을 수행하고, 이로써 단계 (d)에서와 마찬가지로 다중 합계가 만들어지는 단계, 및 합계의 평균을 계산하는 단계를 더 포함할 수 있고, 이때 계산된 평균이 특정 원자의 SAP이다.
당업자는 분자 역학 시뮬레이션에서 계산된 값들의 평균을 채용하는 본 발명의 구체예가 컴퓨터 계산상 더욱 집약적일 거라는 점을 인정할 것이다. 이러한 구체예는 또한, 어떤 경우에는 더욱 정확한 또는 높은 해상도의 공간-응집-경향 맵을 제공할 것이다. 그러나, 본원에서 논의된 실험들은 본 방법이 분자 역학 평균화가 채용되지 않은 경우에도 여전히 매우 정확하다는 것을 나타낸다. 한 바람직한 구체예에서, 공간-응집-경향 값은 데이터베이스, 예를 들어 단백질 데이터 뱅크(PDB)의 모든 단백질 구조에 대해 계산될 수 있으며, 이로써 모든 공지된 단백질 구조 상의 소수성 잔기 및 패치를 신속하게 확인할 수 있다. 이 방법은 대규모 단백질 집단의 신속한 스크리닝과 그에 따른 잠재적 응집 경향 영역 및/또는 단백질 상호작용 부위의 확인을 허용한다.
바람직한 적용에서, 공간-응집-경향은 하기 식에 의해 설명되며;
Figure pat00007
여기서,
1) SAA-R은 각 시뮬레이션 스냅샷에서 컴퓨터로 계산된 반경 R 내에 있는 측쇄 원자들의 SAA이다. SAA는 바람직하게 프로브 구체가 단백질 표면 위를 굴러감에 따라 프로브 구체 중심의 궤적을 컴퓨터로 계산함으로써 시뮬레이션 모델에서 계산될 수 있다. 프로브 구체는 물 분자의 반경과 동일한 반경, 즉 R = 1.4Å을 가진다. 당업자는 SAA를 계산하는 다른 방법들고 SAP를 계산하기 위해 본원에 설명된 방법들과 양립될 수 있다는 것을 인정할 것이다. 예를 들어, SAA는 오직 아미노산 측쇄 원자들에 대해서만 계산될 수 있다. 또한, SAA는 오직 아미노산 주쇄 원자들(즉, 펩티드 백본의 원자들과 관련 수소들)에 대해서만 계산될 수 있다. 또는 달리, SAA는 관련된 수소들은 제외한 채로 오직 아미노산 주쇄 원자들에 대해서만 계산될 수 있다;
2) SAA-fe는 완전히 노출된 잔기(아미노산 'X'라고 하자)의 측쇄의 SAA로서, 이것은 바람직한 구체예에서는 트리펩티드 'Ala-X-Ala'의 완전히 펼쳐진 입체형태에서 중앙부 잔기의 측쇄들의 SAA를 계산함으로써 얻어진다; 및
3) 원자-hb는 Black 및 Mould(Black and Mould, Anal. Biochem. 1991, 193, 72-82)의 소수성 등급을 사용하여 상기 설명된 대로 얻어진 원자 소수성이다. 이 등급은 글리신의 소수성이 0이 되도록 정규화된다. 따라서, 소수성 등급에서 글리신보다 더 소수성인 아미노산들은 양의 값이고, 글리신보다 덜 소수성인 아미노산들은 음의 값이다.
"완전히 노출된" 잔기는 트리펩티드 Ala-X-Ala의 완전히 펼쳐진 입체형태에서의 잔기 X이다. 당업자는 이 배열이, 이러한 잔기 X에 대한 SAA의 계산에 의해 이용할 수 있는 최대 용매 접근가능한 면적이 산출되도록 디자인된다는 것을 인정할 것이다. 따라서, 알라닌 이외의 다른 잔기들도 결과의 완전한 혼란이나 변경 없이 계산에 사용될 수 있다는 것이 고려된다.
상기 설명된 대로, 본 발명의 방법은 상기와 동일한 식을 사용하여 X-선 구조를 포함하는 어떤 단백질 구조 모델에도 적용될 수 있다.
유사하게, X-선 구조를 이용할 수 없는 경우, 동일한 공간-응집-경향 파라미터가 상동성 모델링을 통해 생성된 구조에 적용될 수 있으며, SAP 파라미터는 상기와 동일한 식을 사용하여 계산될 수 있다.
어떤 구체예에서, 공간-응집-경향은 단백질 구조 모델에 있는 모든 원자에 대해 계산된다. 어떤 구체예에서, 원자과학적 공간-응집-경향 값은 각 개별 단백질 잔기에 걸쳐서, 또는 소규모 잔기 그룹에 걸쳐서 평균될 수 있다.
SAP 방법의 사용
한 양태에서, 본 발명은 단백질에서 소수성 아미노산 잔기, 영역 또는 패치를 확인하기 위해 상기 설명된 대로 사용될 수 있다. 특정 역치 값에 고정되는 것을 바라지는 않지만, > 0의 공간-응집-경향을 갖는 원자 또는 아미노산 잔기가 소수성인 것으로, 또는 응집 경향 영역에 있는 것으로 간주된다. 단백질 타입, 특정 구조, 및 그것이 존재하고 있는 용매에 따라서, 0 약간 아래의 컷오프를 사용하여, 예를 들어 -0.1, -0.15, -0.2, 등을 초과하는 공간-응집-경향을 갖는 원자 또는 잔기를 선택함으로써, 원자 또는 잔기를 확인하는 것이 바람직할 수 있다. 또는 달리, 더 강한 소수성 원자, 잔기, 또는 패치를 선택하려면, 예를 들어 0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 등의 더 엄격한 컷오프를 채용하는 것이 바람직할 수 있다. 이에 더하여, 알고리즘이 패치의 중심에 있는 잔기에 더 높은 번호를 부여하기 때문에, 컷오프를 만족하는 잔기들의 3Å, 4Å, 5Å, 7.5Å 또는 10Å 내에 있는 잔기들도 응집 감소를 위한 덜 소수성인 잔기로의 돌연변이를 위해 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 공간적으로(즉, 단백질 서열을 따라서), 또는 바람직한 구체예에서는 공간적으로(즉, 3-차원 구조에서) 가까이 위치하는 원자 또는 잔기들보다 더 큰 공간-응집-경향을 갖는 원자 또는 잔기를 선택하는 것이 간단히 유리할 수 있다. 소수성 패치 내의 원자 또는 잔기를 선택하기 위한 한 바람직한 방법은, 예를 들어 이들이 유래하는 단백질 구조 모델 위에, 컬러 코딩 또는 숫자 코딩을 사용하여 계산된 공간-응집-경향 값들을 지도화하는 것이며, 이로써 단백질 표면 전체에서 공간-응집-경향의 차이가 시각화되고, 소수성 패치 또는 잔기의 선택이 용이해진다. 특히 바람직한 구체예에서, 공간-응집-경향의 계산은 더 높은 해상도의 반경, 예를 들어 5Å와 더 낮은 해상도의 반경, 예를 들어 10Å의 반경에 대해 선택된 두 개의 값을 사용하여 별도로 수행된다. 이러한 구체예에서, 더 큰 또는 더 넓은 소수성 패치가 해상도가 더 낮은 맵에 의해 단백질 구조에 보일 수 있다. 일단 관심 대상의 소수성 패치가 낮은 해상도 맵에서 선택되며, 이들 패치는 해상도가 더 높은 맵에서 더 상세히 조망될 수 있으며, 이것은 어떤 구체예에서는 당업자로 하여금 더욱 쉽게 또는 더욱 정확히 돌연변이되거나 변형될 잔기를 선택할 수 있도록 한다. 예를 들어, 해상도가 더 높은 맵에서 소수성 패치를 볼 때는, SAP 점수가 가장 높거나, 또는 가장 소수성(예를 들어, Black and Mould, Anal. Biochem. 1991, 193, 72-82의 등급에 따라 패치에서 가장 소수성인 잔기)인 잔기를 돌연변이를 위해 선택하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 구체예에서, 단백질에서 응집 경향 영역을 확인하기 위한 방법은 (a) 단백질 내의 원자들에 대해 본원에 설명된 방법 중 어느 것에 따라서 계산된 SAP를 구조 모델 위에 지도화하는 단계; 및 (b) > 0의 SAP를 갖는 복수의 원자를 가진 단백질 내의 영역을 확인하는 단계를 포함하며, 여기서 응집 경향 영역은 상기 복수의 원자를 포함하는 아미노산을 포함한다. 이러한 구체예에서, SAP는 단백질에 있는 모든 원자에 대해, 또는 일부 원자에 대해 계산될 수 있다. 오직 관심 대상의 특정 잔기 또는 잔기 그룹에 대한 SAP만을 계산할 수 있다는 것도 고려된다.
유사한 구체예에서, 원자들의 SAP 점수(또는 아미노산 잔기들에 걸쳐 평균된 SAP 점수)를 플롯으로 나타내는 것이 유익할 수 있다. 단백질 내의 원자 또는 잔기에 따른 SAP 점수를 나타내는 이러한 플롯은 대체 후보들을 나타낼 수 있는 피크의 용이한 확인을 허용한다. 특히 바람직한 구체예에서, 단백질 내의 원자 또는 잔기에 따른 SAP 점수는 그래프로 그려지고, 곡선하 면적(AUC)가 그래프의 피크에 대해 계산된다. 이러한 구체예에서, 더 큰 AUC를 가진 피크는 더 큰 또는 더 많은 소수성 응집 경향 영역을 표시한다. 특정 구체예에서, 피크, 또는 더 바람직하게는 더 큰 AUC를 가진 피크에 존재한다고 확인된 하나 이상의 잔기를 대체를 위해 선택하는 것이 바람직할 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 시스테인으로 돌연변이를 위해 면역글로불린의 잔기를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는, 면역글로불린의 표면에서 제1 아미노산 잔기의 SAP 값이 계산된다. SAP 값이 0 내지 -0.11값과 동일하거나 그 사이에 있다면, 제1 잔기는 시스테인으로 돌연변이를 위해 선택된다. 추가 구체예에서, 제1 잔기에 바로 근접한 면역글로불린의 복수의 잔기의 SAP 값이 계산된다. 복수의 잔기들이 0미만의 SAP 값을 가진다면, 제1 잔기는 시스테인으로 돌연변이를 위해 선택된다.
면역글로불린 변이체는 자리-지정 돌연변이유발 및 다른 재조합 DNA 기술을 포함하는 본 분야에 알려진 어떤 방법에 의해서 제조될 수 있으며, 예를 들어 US Pat. Nos. 5284760; 5556747; 5789166; 6878531, 5932419; 및 6391548를 참조한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 본원에 설명된 방법 중 어느 것에 의해서 확인된 면역글로불린의 표면에 노출된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 면역글로불린을 원자 또는 분자에 콘쥬게이팅하기 위해 사용될 수 있는 천연 아미노산 잔기, 변형된 아미노산 잔기, 희귀한 아미노산 잔기, 비천연 아미노산 잔기, 또는 아미노산 잔기 유사체 또는 유도체로 치환함으로써 원자 또는 분자에 콘쥬게이팅될 수 있는 면역글로불린 변이체를 제조하는데 사용될 수 있다.
비천연 아미노산의 합성은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 U.S. 특허공개 No. 2003-0082575에 더 설명된다. 일반적으로, 비천연, 변형, 또는 희귀한 아미노산을 단백질에서 합성하거나 통합할 수 있는 본 분야에 알려진 어떤 방법도 사용될 수 있으며, 제한은 아니지만 Liao J. Biotechnol Prog . 2007 Jan-Feb; 23 (1): 28-31; Rajesh and Iqbal. Curr Pharm Biotechnol . 2006 Aug; 7(4): 247-59; Cardillo et al. Mini Rev Med Chem. 2006 Mar; 6(3): 293-304; Wang et al. Annu Rev Biophys Biomol Struct . 2006; 35: 225-49; Chakraborty et al, Glycoconj J. 2005 Mar; 22(3): 83-93에 설명되거나 참조된 방법들이 있다. 추가의 예로서, 본원에 설명된 방법에서 지시된 비천연 아미노산, 또는 희귀한 아미노산을 단백질에서 발생시키고 통합하기 위해서 Ambrx ReCODE™ 기술이 채용될 수 있다.
본 발명에 따르는 면역글로불린 변이체 및 면역글로불린 콘쥬게이트는, 예를 들어, 비-환원성 SDS-PAGE에 의해 결정되는 향상된 또는 개선된 안정성을 나타낼 수 있다.
따라서 본 발명의 목적은 단락 [0008] 및 [0019]에서 논의되는 변형된 면역글로불린을 암호화하는 분리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 그것의 구체예의 임의 및 모든 조합을 제공하는 것이다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 벡터에 있다. 특정 구체예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 유도성 프로모터는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 다른 양태는 선행 구체예 중 하나의 벡터를 가지는 숙주 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 면역글로불린을 발현시킬 수 있다.
따라서 본 발명의 목적은 선행 단락의 숙주 세포를 포함하는 배양물 배지를 제공하는 단계 및 면역글로불린이 발현되는 조건 하에서 배양물 배지를 두는 단계를 포함하는 교차-결합에 대해 감소된 경향을 가지는 면역글로불린을 만드는 방법을 제공하는 것이다. 특정 구체예에서, 본 방법은 발현된 면역글로불린을 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
따라서 본 발명은 면역글로불린의 표면 상에서 제1 아미노산 잔기의 공간-응집-경향을 계산하는 단계, 제1 잔기에 바로 근접한 면역글로불린의 복수의 잔기의 공간-응집-경향들을 계산하는 단계, 및 제1 아미노산 잔기의 공간-응집-경향이 0 내지 -0.11의 값과 동일하거나 그 사이에 있고, 복수의 잔기들이 0 미만의 공간-응집-경향들을 가진다면, 시스테인으로 돌연변이를 위한 제1 아미노산 잔기를 선택하는 단계를 포함하는 시스테인으로 돌연변이를 위한 면역글로불린의 잔기를 선택하는 방법을 제공하는 것이다. 특정 구체예에서, 복수의 잔기는 제1 잔기의 15Å 내에 있다. 특정 구체예에서, 복수의 잔기는 제1 잔기의 10Å 내에 있다. 특정 구체예에서, 복수의 잔기는 제1 잔기의 7.5Å 내에 있다. 특정 구체예에서, 복수의 잔기는 제1 잔기의 5Å 내에 있다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 잔기의 공간-응집-경향을 계산하는 단계는 반경이 잔기에 있는 원자의 중심에 있는 구체 영역에 대해 공간-응집 경향을 계산하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 구체 영역의 반경은 적어도 5Å이다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라서 SAP를 결정하기 위한 컴퓨터 코드에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 수행하도록 전용화된 컴퓨터, 수퍼컴퓨터, 또는 컴퓨터 클러스터에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 단백질 상의 응집 경향 영역을 결정하기 위한 웹-기반, 서버-기반, 또는 인터넷-기반 서비스를 제공하며, 이 서비스는 사용자(예를 들어, 인터넷 상의)로부터 단백질에 대한 데이터(예를 들어, 단백질 구조 모델)를 어셉트하거나, 또는 데이터베이스로부터 이러한 데이터를 검색함으로써, 서비스 사용자가 선택적으로 단백질의 분자 역학 모델링을 포함해서 단백질의 정적 구조를 생성하거나, 검색하거나, 또는 접근할 수 있어서 단백질의 역학적 구조를 제공할 수 있는 단계, 및 이렇게 생성된 정적 또는 역학적 구조에 기초하여 단백질의 원자 또는 잔기에 대한 SAP를 결정하는 단계, 및 SAP 데이터를, 예를 들어 서비스 제공자가 사용자에게 상기 SAP 데이터를 사용하여 지도화된 구조적 모델로서 되돌려 보내는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 사용자는 사람이다. 다른 구체예에서, 사용자는 컴퓨터 시스템 또는 자동화된 컴퓨터 알고리즘이다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 인터넷을 통해 사용자 단말기에 SAP를 계산하기 위한 웹 서비스를 제공하기 위한 웹 서버; 계산 방법, 아미노산 소수성 등에 대한 일반적인 정보를 저장하기 위한 데이터베이스; 및 데이터베이스의 정보 및 사용자가 인터넷을 통해 제공하거나 전송한 정보에 기초하여 SAP 계산을 수행하기 위한 계산 서버를 포함하는 SAP 계산 시스템을 제공한다.
어떤 구체예에서, 웹 서버와 계산 서버는 동일한 컴퓨터 시스템이다. 어떤 구체예에서, 컴퓨터 시스템은 수퍼컴퓨터, 클러스터 컴퓨터, 또는 단일 워크스테이션 또는 서버이다. 관련된 구체예에서, SAP 계산 시스템의 웹 서버는 전체 작업을 제어하기 위한 컨트롤러, 인터넷에 접속하기 위한 네트워크 접속 유닛, 및 인터넷을 통해 접속된 사용자 단말기에 SAP를 계산하기 위한 웹 서비스를 제공하기 위한 웹 서비스 유닛을 더 포함한다.
이에 더하여, 본 발명의 구체예는 또한 다양한 컴퓨터-도구화된 작업을 수행하기 위한, 예를 들어 구조적 모델의 SAP를 계산하고, SAA를 계산하고, 유효-SAA를 계산하고, 구조적 모델을 조작하고, 분자 역학 시뮬레이션을 실행하고, 관련 데이터를 구조화하여 저장하고, 또는 본원에 설명된 다른 작업을 수행하기 위한 프로그램 코드를 함유하는 컴퓨터 판독가능한 매체를 가진 컴퓨터 저장 제품에 관한 것이다. 컴퓨터-판독가능한 매체는 데이터를 저장할 수 있고, 그 후 컴퓨터 시스템에 의해 판독될 수 있는 어떤 데이터 저장 장치이다. 컴퓨터-판독가능한 매체의 예들은, 제한은 아니지만 하드디스크, 플로피디스크, 플래시 드라이브, 광 디스크(예를 들어, CD, DVD, HD-DVD, 블루레이 디스크 등), 및 특별히 구성된 하드웨어 장치, 예를 들어 어플리케이션 특정 집적회로(ASIC) 또는 프로그램가능한 로직 장치(PLD)를 포함한다. 또한, 컴퓨터-판독가능한 매체는 짝을 이룬 컴퓨터 시스템의 네트워크 상의 캐리어 웨이브에 매립된 데이터 신호로서 분포될 수 있으며, 이로써 컴퓨터-판독가능한 코드가 분포된 방식으로 저장되고 실행된다. 상기 설명된 하드웨어 및 소프트웨어 요소는 표준 디자인 및 구조를 가진다는 것이 당업자에게 인정될 것이다. 상기 설명된 컴퓨터, 인터넷, 서버 및 서비스 관련 구체예들은 또한 SAA 및 유효-SAA뿐만 아니라 SAP에도 적용할 수 있다.
면역글로불린 및 면역글로불린 콘쥬게이트를 함유하는 약제학적 조성물
다른 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 조제된, 본 발명의 방법에 의해서 생산된 하나 이상의 면역글로불린 콘쥬게이트를 함유하는 조성물, 예를 들어 약제학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 조합 치료법으로, 즉 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 치료법은 적어도 하나의 다른 항암제와 조합된 본 발명의 면역글로불린을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체"는 어떤 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장 및 흡수지연제를 포함하며, 이들은 생리학적으로 적합해야 한다. 바람직하게, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여에 적합하다(예를 들어, 주사 또는 주입에 의한). 투여 경로에 따라서, 활성 화합물, 즉 본 발명의 면역글로불린 또는 그것의 변이체가 화합물을 비활성화할 수 있는 산이나 다른 천연 조건들의 작용으로부터 이 화합물을 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용되는 염"은 모 화합물의 바람직한 생물학적 활성은 보유하면서 어떤 바람직하지 않은 독성 효과는 부여하지 않는 염을 말한다(예를 들어, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm . Sci . 66:1-19 참조). 이러한 염의 예들은 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 비독성 무기산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 유래된 것들뿐만 아니라, 비독성 유기산, 예를 들어 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 것들을 포함한다. 염기 부가 염은 알칼리 토금속, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래된 것들뿐만 아니라, 비독성 유기아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것들을 포함한다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 항산화제의 예들은 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 염산염, 나트륨 바이술페이트, 나트륨 메타바이술파이트, 나트륨 술파이트 등; (2) 지용성 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔(BHA), 부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 채용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예들은 물, 에탄올, 폴리올류(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들어 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산물의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 애쥬번트를 함유할 수 있다. 멸균 과정과 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르빈산 등을 포함시키는 것에 의해서 미생물 존재의 확실한 방지가 가능하다. 또한, 당류, 염화나트륨 등과 같은 등장제를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 이에 더하여, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 포함시킴으로써 주사가능한 제약 형태의 연장된 흡수가 가능해질 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산물, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제들의 사용은 본 분야에 알려져 있다. 어떤 종래의 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우만 제외하고, 본 발명의 약제학적 조성물에서 이들의 사용이 고려된다. 또한, 보충적 활성 화합물도 조성물에 혼입될 수 있다.
전형적인 제제는 본 발명의 적어도 하나의 면역글로불린 콘쥬게이트를 포함하고, 본원에 개시된 방법에 더하여, 면역글로불린의 교차-결합을 방지하거나 줄일 수 있는 안정제를 더 낮은 농도로 포함할 수 있다. 따라서, 교차-결합을 방지하기 위해 사용된 종래의 방법이 본 발명의 방법에 의해 생산된 면역글로불린 콘쥬게이트를 함유하는 약제학적 조성물의 개발에서 채용될 수 있다. 예를 들어, 여러 안정화 또는 응집방지 화합물이 의도된 용도 및 생물학적 독성에 따라서 본 발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 안정화 화합물은, 예를 들어 시클로덱스트린 및 그 유도체들(U.S. Pat. No. 5730969), 알킬글리코시드 조성물(U.S. Pat. Appl. No. 11/474,049), 샤프롱 분자의 사용(예를 들어, LEA(Goyal et al, Biochem J. 2005, 388(Pt l):151-7; U.S. Pat. No. 5688651의 방법), 베타인 화합물(Xiao, Burn, Tolbert, Bioconjug Chem . 2008 May 23), 계면활성제(예를 들어, Pluronic F127, Pluronic F68, Tween 20(Wei et al. International Journal of Pharmaceutics, 2007, 338(1-2):125-132)), 및 U.S. Pat. Nos. 5696090, 5688651, 및 6420122에 설명된 방법을 포함한다.
이에 더하여, 단백질, 특히 항체는 상이한 부류의 부형제들의 조합을 사용하여 조제물 중에서 안정화되며, 예들 들어 (1) 이당류(예를 들어, 사카로오스, 트레할로스) 또는 폴리올류(예를 들어, 소르비톨, 만니톨)는 우선적 배제에 의해 안정제로서 작용하며, 또한 동결건조 동안 세포보호제로서 작용할 수 있고, (2) 계면활성제(예를 들어, Polysorbat 80, Polysorbat 20)는 액체/얼음, 액체/물질-표면 및/또는 액체/공기 계면과 같은 계면에서 단백질의 상호작용을 최소화함으로써 작용하고, (3) 버퍼(예를 들어, 포스페이트 버퍼, 시트레이트 버퍼, 히스티딘)은 제제의 pH를 조절하고 유지하는데 도움을 준다. 따라서, 이러한 이당류, 폴리올, 계면활성제 및 버퍼는 본 발명의 방법에 더하여 면역글로불린을 더 안정화하고 이들의 응집을 방지하기 위하여 사용될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 멸균되어야 하고, 제조 및 저장 조건에서 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도를 위해 적합한 다른 정돈된 구조로서 조제될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산물의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 예를 들어 당류, 폴리알코올류, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨과 같은 등장제를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 포함시킴으로써 주사가능한 조성물의 연장된 흡수가 가능해질 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 필요에 따라 상기 나열된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적합한 용매에 필요한 양으로 활성 화합물을 혼합한 후, 멸균 미세여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산물은 염기성 분산 매질 및 상기 나열된 것들로부터 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼합함으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액 제조용의 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 냉동 건조(동결건조)이며, 이로써 이미 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 어떤 추가의 바람직한 성분의 분말이 얻어진다.
단일 투약 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 피험자, 및 특정 투여 방식에 따라서 변할 것이다. 단일 투약 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 야기하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중, 이 양은 약제학적으로 허용되는 담체와 조합된 약 0.01% 내지 약 99%의 활성 성분, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30%의 활성 성분의 범위일 것이다.
따라서 본 발명의 목적은 면역글로불린을 제공하는 단계, 7(VH), 20(VL), 22(VL), 및 125(CH1)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기를 시스테인 잔기로 치환하는 단계, 하나 이상의 치환된 시스테인을 환원제로 환원하여 환원된 시스테인 잔기를 형성하는 단계, 면역글로불린을 원자 또는 분자와 함께 인큐베이팅하여(분자는 환원된 시스테인 잔기와 반응한다) 면역글로불린 콘쥬게이트를 형성하는 단계, 및 매우 농축된, 면역글로불린 콘쥬게이트의 액체 조제물을 생성하는 단계(면역글로불린 콘쥬게이트 농축은 적어도 20 mg/ml, 적어도 30 mg/ml, 적어도 40 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml, 적어도 100 mg/ml, 적어도 125 mg/ml, 또는 적어도 150 mg/ml이다)를 포함하는 면역글로불린 콘쥬게이트의 매우 농축된 약제학적 조제물에서 면역글로불린의 표면-노출된 시스테인 사이의 교차-결합을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다. 특정 구체예에서, 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 면역글로불린은 IgG1을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 CH1 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 CH2 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 CH3 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 CL 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린은 사람 VH 도메인을 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 항원 결합 활성을 포함하고, 활성은 돌연변이되지 않은 면역글로불린의 항원 결합 활성의 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%이다.
따라서 본 발명의 목적은 적어도 10 mg/ml, 적어도 20 mg/ml, 적어도 30 mg/ml, 적어도 40 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml, 적어도 100 mg/ml, 적어도 125 mg/ml, 또는 적어도 150 mg/ml의 농도에서 단락 [0007]에서 논의되는 면역글로불린 콘쥬게이트로 만들어질 수 있는 변형된 면역글로불린 조제물 및 그것의 구체예의 임의의 및 모든 조합을 제공하는 것이다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 콘쥬게이트가 동일 조건 하에 농축된, 액체 용액에서 올리고머화 형태 올리고머에 대한 높은 경향을 가지는 것으로 알려진 농도보다 더 큰 농도에 면역글로불린 콘쥬게이트가 있다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 비-올리고머화된 모노머이다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 조제물은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 임의의 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린 조제물은 비-올리고머화된 모노머인 면역글로불린 콘쥬게이트의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함한다.
본 발명의 목적은 단락 [0007]에서 논의한 바와 같은 면역글로불린 콘쥬게이트 및 비-올리고머화 약제학적 활성 성분으로서 그것의 구체예의 임의의 및 모든 조합을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 단락 [0007]에서 논의한 바와 같은 면역글로불린 콘쥬게이트 및 그것의 구체예의 임의의 및 모든 조합 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. 특정 구체예에서, 면역글로불린은 적어도 10 mg/ml, 적어도 20 mg/ml, 적어도 30 mg/ml, 적어도 40 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml, 적어도 100 mg/ml, 적어도 125 mg/ml, 또는 적어도 150 mg/ml의 농도에 있다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 콘쥬게이트가 동일 조건하에 농축된, 액체 용액에서 올리고머화 형태 올리고머에 대한 높은 경향을 가지는 것으로 알려져 있는 농도보다 더 큰 농도에 면역글로불린 콘쥬게이트가 있다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린 콘쥬게이트의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 비-올리고머화 모노머이다. 임의의 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 면역글로불린 조제물은 비-올리고머화된 모노머인 면역글로불린 콘쥬게이트의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함한다. 선행 구체예와 조합될 수 있는 특정 구체예에서, 올리고머화는 비-환원성 SDS-PAGE에 의해 측정된다.
최적의 바람직한 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 용량 섭생이 조정된다. 예를 들어, 1회의 일시주사가 투여될 수 있거나, 몇 번으로 나눠진 분량이 시간을 두고 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 위급도에 따라서 분량이 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 투여 용이성 및 용량 균일성을 위해서 단위 제형으로 비경구 조성물을 조제하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 단위 제형은 치료될 피험자를 위한 단일 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하며, 각 단위는 필요한 제약 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 야기하도록 계산된 정해진 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 제형에 대한 명세는 (a) 활성 화합물 특유의 특성 및 달성되어야 할 특정 치료 효과, 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위한 이러한 활성 화합물을 화합하는 기술에 있어서의 고유한 제한에 직접적으로 의존하여 지시된다.
면역글로불린의 투여에 대해서, 용량은 숙주 체중을 기준으로 약 0.0001 내지 100mg/kg, 더 일반적으로는 0.01 내지 5mg/kg의 범위이다. 예를 들어, 용량은 0.3mg/kg 체중, 1mg/kg 체중, 3mg/kg 체중, 5mg/kg 체중 또는 10mg/kg 체중이거나, 또는 1-10mg/kg 범위 내이다. 전형적인 치료 섭생은 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월에 1회, 3개월마다 1회, 또는 3-6개월마다 1회 투여를 수반한다. 본 발명의 면역글로불린의 바람직한 용량 섭생은 정맥내 투여에 의한 1mg/kg 체중 또는 3mg/kg 체중을 포함하며, 이때 항체는 다음 투약 일정 중 하나를 사용하여 제공된다: (i) 6회 용량을 4주마다, 이후 3개월마다; (ii) 3주마다; (iii) 3mg/kg 체중 1회, 이후 3주마다 1mg/kg 체중.
또는 달리, 본 발명의 면역글로불린은 지속 방출 제제로서 투여될 수 있으며, 이 경우 더 적은 빈도의 투여가 필요하다. 용량 및 빈도는 환자에게 투여된 물질의 반감기에 따라서 변한다. 일반적으로, 사람 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 이어서 사람화된 항체, 키메라 항체, 및 비-사람 항체 순이다. 용량 및 투여 빈도는 치료가 예방적 치료인지 또는 치료적 치료인지에 따라 변할 수 있다. 예방적 적용에서는 비교적 낮은 용량이 장기간에 걸쳐서 비교적 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 남은 일생 동안 계속 치료받을 수 있다. 치료적 적용에서는 질환의 진행이 감소되거나 멈출 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 완화를 나타낼 때까지 비교적 높은 용량이 비교적 짧은 간격으로 때로는 필요하다. 이후, 환자에게 예방적 섭생이 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 활성 성분의 실제 용량 수준은 환자에게 독성이 아니면서 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 따라 바람직한 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분 양을 얻을 수 있도록 변화될 수 있다. 선택된 용량 수준은 채용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 그것의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시기, 채용된 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 채용된 특정 조성물과 조합하여 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료될 환자의 나이, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 병력, 및 의료 분야에 잘 알려진 유사한 요인들을 포함하는 여러 약동학적 요인들에 따를 것이다.
본 발명의 면역글로불린의 "치료적 유효 용량"은 바람직하게는 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 증상이 없는 시기의 빈도 및 기간의 증가, 또는 질환으로 인한 장애나 무능력의 방지를 가져온다. 예를 들어, 종양의 치료에서, "치료적 유효 용량"은 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 미치료 피험자에 비하여 적어도 약 20%까지, 더 바람직하게는 적어도 약 40%까지, 더욱 바람직하게는 적어도 약 60%까지, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 80%까지 억제한다. 종양 성장을 억제하는 화합물의 능력은 사람 종양에서의 효능이 예측되는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 또는 달리, 조성물의 이런 특성은 당업자에게 알려진 분석법에 의해서 시험관내에서 이러한 억제를 나타내는 화합물의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 치료 화합물의 치료적 유효량은 종양 크기를 감소시킬 수 있거나, 또는 피험자에서 증상을 완화할 수 있다. 당업자는 피험자의 크기, 피험자의 증상의 중증도, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 요인들에 기초하여 이러한 양을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 조성물은 본 분야에 알려진 여러 방법 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 인정되는 대로, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 원하는 결과에 따라서 변할 것이다. 본 발명의 결합 부분에 대한 바람직한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입을 포함한다. 본원에서 사용된 문구 "비경구 투여"는 장 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식을 의미하며, 일반적으로 주사에 의한 투여를 말하고, 제한은 아니지만 정맥내, 근육내, 동맥내, 수막내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복막내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 낭하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
또는 달리, 본 발명의 면역글로불린은 비-비경구 경로, 예를 들어 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소 경로로 투여될 수 있다.
활성 화합물은, 삽입물, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화 송달 시스템을 포함하는 제어 방출 제제와 같이, 빠른 방출로부터 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머가 사용될 수 있다. 이러한 제제를 제조하기 위한 많은 방법들이 특허를 취득하였고, 본 분야에 일반적으로 알려져 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참조한다.
치료 조성물은 본 분야에 알려진 의료 장치에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물은, U.S. 특허 Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 장치와 같은, 무바늘 피하주사 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 본 발명에서 유용한 잘 알려진 삽입물 및 모듈의 예들은, 제어된 속도로 의약을 분배하기 위한 삽입형 마이크로-주입 펌프를 개시하는 U.S. 특허 No. 4,487,603; 피부를 통해 의약을 투여하기 위한 치료 장치를 개시하는 U.S. 특허 No. 4,486,194; 정확한 주입 속도로 의약을 송달하기 위한 의약 주입 펌프를 개시하는 U.S.특허 No. 4,447,233; 연속적 약물 송달을 위한 가변 유속 삽입형 주입 장치를 개시하는 U.S. 특허 No. 4,447,224; 멀티-챔버 구획들을 가진 삼투 약물 송달 시스템을 개시하는 U.S. 특허 No. 4,439,196; 및 삼투 약물 송달 시스템을 개시하는 U.S. 특허 No. 4,475,196을 포함한다.
따라서 본 발명의 목적은 매우 농축된 액체 조제물을 포함하는 의약의 제조에서 단락 [0007]에서 논의되는 바와 같은 면역글로불린 콘쥬게이트 및 그것의 구체예의 임의의 및 모든 조합의 사용을 제공하는 것이며, 이때 면역글로불린 콘쥬게이트 농도는 적어도 20 mg/ml, 적어도 30 mg/ml, 적어도 40 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml, 적어도 100 mg/ml, 적어도 125 mg/ml, 또는 적어도 150 mg/ml이다. 어떤 구체예에서, 의약의 사용은 자가면역 질환, 면역학적 질환, 감염성 질환, 염증성 질환, 신경학적 질환, 및 암을 포함하는 종양학적 및 신생물성 질환의 치료를 위한 것이다. 어떤 구체예에서, 의약의 사용은 울혈성 심부전(CHF), 혈관염, 장미여드름, 여드름, 습진, 심근염 및 다른 심근 이상, 전신 홍반성 루프스, 당뇨병, 척추병증, 활막 섬유아세포, 및 골수 기질; 뼈손실; 파젯병, 파골세포종; 유방암; 비사용 골감소증; 영양실조, 치주질환, 고셔병, 랑게르한스 세포 조직구증, 척수 손상, 급성 패혈성 관절염, 골연화증, 쿠싱 증후군, 단골성 섬유성 이형성증, 다골성 섬유성 이형성증, 치주재건, 및 뼈 골절; 유육종증; 골용해성 골암, 유방암, 폐암, 신장암 및 직장암; 뼈 전이, 골 통증 관리, 및 체액성 악성 고칼슘혈증, 강직성 척추염 및 다른 척추관절염; 이식거부, 바이러스 감염, 조혈성 신생물 및 신생물-유사 상태들, 예를 들어 호지킨 림프종; 비-호지킨 림프종(버킷 림프종, 소 림프구성 림프종/만성 림프구성 백혈병, 균상식육종, 맨틀세포 림프종, 여포형 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 변연부 림프종, 모양 세포 백혈병 및 림프형질세포성 백혈병), 림프구 전구세포의 종양, 예를 들어 B-세포 급성 림프모구성 백혈병/림프종, 및 T-세포 급성 림프모구성 백혈병/림프종, 흉선종, 성숙 T 및 NK 세포의 종양, 예를 들어 말초 T-세포 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/T-세포 림프종 및 거대 과립 림프구성 백혈병, 랑게르한스 세포 조직구증, 골수양 신생물, 예를 들어 급성 골수성 백혈병, 예를 들어 성숙화를 동반한 AML, 분화를 동반하지 않은 AML, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수단구성 백혈병, 및 급성 단구성 백혈병, 골수이형성 증후군, 및 만성 골수증식성 장애, 예를 들어 만성 골수성 백혈병, 중추신경계의 종양, 예를 들어 뇌종양(신경아교종, 신경모세포종, 성상세포종, 수질아세포종, 상의세포종, 및 망막아종), 고상 종양(비인두암, 기저세포암종, 췌장암, 담관암, 카포시 육종, 고환암, 자궁암, 질암 또는 자궁경부암, 난소암, 원발성 간암 또는 자궁내막암, 및 혈관계의 종양(혈관육종 및 혈관외피종), 골다공증, 간염, HIV, AIDS, 척추관절염, 류마티스 관절염, 염증성 장질환(IBD), 패혈증 및 패혈성 쇼크, 크론병, 건선, 쉴레다더마, 이식편대숙주병(GVHD), 동종이계성 섬 이식편 거부, 조혈성 악성물, 예를 들어 다발성 골수종(MM), 골수이형성 증후군(MDS) 및 급성 골수성 백혈병(AML), 종양 관련 염증, 말초신경 손상 또는 탈수초성 질환의 치료를 위한 것이다. 어떤 구체예에서, 의약의 사용은 반상 건선, 궤양성 대장염, 비-호지킨 림프종, 유방암, 결직장암, 소아 특발성 관절염, 황반변성, 호흡기 세포융합 바이러스, 크론병, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 골다공증, 치료-유발 뼈손실, 뼈 전이, 다발성 골수종, 알쯔하이머병, 녹내장, 및 다발성 경화증의 치료를 위한 것이다. 선행 구체예 중 어느 것과 조합될 수 있는 어떤 구체예에서, 의약의 사용은 약제학적으로 허용되는 부형제를 더 포함한다. 선행 구체예 중 어느 것과 조합될 수 있는 어떤 구체예에서, 의약 중의 면역글로불린 콘쥬게이트는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 비-올리고머화된 모노머를 나타낸다. 어떤 구체예에서, 올리고머화는 비-환원성 SDS-PAGE에 의해 측정된다.
실시예
본원에서 설명하는 실시예는, 특히 본 발명의 비-제한적 구체예와 관련된다.
실시예 1: 항체 시스테인 변이체의 설계, 발현 및 콘쥬게이션
IgG1 시스테인 변이체의 세트는 각 면역글로불린 폴드 도메인이 나타나도록 설계한다(표 1). 변이체 1-13을 항체-1의 X-레이 구조로부터 설계하였다. 항체-1에 대해서 상동 모델링에 의해 만든 다른 IgG1, 항체-2의 구조로부터 변이체 14를 선택하였다. 모든 자리들을 항체 표면에 노출시켰다. 세린 및 트레오닌 및 아르기닌과 같은 극성 잔기들, 또는 리신과 같은 하전된 잔기를 시스테인으로 치환하였다. 경쇄 및 중쇄 유전자들을 벡터 gWIZ (Genlantis)에서 서브클로닝하였고, 포유동물 세포의 일시적인 트랜스펙션에 의한 단백질 발현을 위해 유전자 조작하였다. 항체 변이체들을 드 노보(de novo) 합성(GeneArt)하거나 또는 자리-지정 돌연변이 PCR에 의해 생성하고 시퀀싱에 의해 확인하였다. 항체 야생형 및 변이체를 트랜스펙션 시약으로서 폴리에틸렌이민(Polysciences)으로 Freestyle HEK 293 세포 (Invitrogen)의 일시적인 트랜스펙션에 의해 10-100 mg 수준에서 발현시켰다. 세포 배양물 상청액을 트랜스펙션 후 7-10일에 수집하였다. 항체를 단백질 A 컬럼(GE Healthcare)에서 정제하였고, 50 mM 시트레이트 버퍼로 용리하였고, pH는 3.5였고, 버퍼를 형광표지를 위한 100 mM Tris pH 7.0에서 교환하였다.
항체 변이체의 발현 및 정제 다음에, 유전자 조작한 표면 시스테인을 거의 산화시켰다. 예를 들어 유전자 조작된 표면 시스테인과 함께 항체에 대해 기대된 2.0과는 반대로, 변이체 4와 6은 항체 분자당 0.3미만의 유리 티올을 가졌다. 본 발명자들은 분류 I의 변이체 및 분류 IV의 변이체에서 약한 환원제, TCEP (트리스[2-카르복시에틸]포스핀 히드로클로라이드) 및 더 강한 환원제, DTT (디티오트레이톨)의 효과를 비교하였고, 비-올리고머화 변이체 4는 항체 당 0.13 유리 티올을 나타내었고, 크게 올리고머화하는 변이체 6은 항체 당 0.25 자유 티올을 가졌다. 야생형의 알리쿼트, 변이체 4, 및 변이체 6은 항체 당 0.25 자유 티올을 가졌다. 야생형의 알리쿼트, 변이체 4, 및 변이체 6을 5가지의 다른 조건으로 처리하였다: 1) 환원제 없음, 2) TCEP, 10x, 1시간, 3) TCEP, 2Ox, 1시간, 4) DTT, 5x, 15분, 및 5) DTT, 10x, 15분. 환원제의 제거 후, 샘플을 비-환원 PAGE에서 용해하였고 자유 티올로 정량하였다. 야생형과 변이체의 결과 비교는 TCEP 처리가 WT에서 효과가 거의 없이 비-올리고머화된 형태(변이체 4)에서 시스테인을 감소시키기에 충분하다는 것을 나타내었다. 그러나, 올리고머로부터의 시스테인(변이체 6)은 거친 처리 후에만 감소하였다. 낮은 수준에서조차 DTT로 처리는 WT와 두 변이체에 대해 항체 단편화를 유발한다. 표면 시스테인을 도입한 자리는 콘쥬게이션을 위해 유전자 조작한 시스테인을 디캡핑하는 능력에서 엄청난 효과를 가졌다.
다른 방법은 표지 전 유전자 조작된 표면 티올의 구체적 환원을 위한 시도를 하였다. TCEP 및 DTT는 사용한 시약 중 2가지였고, 유리 티올의 수준을 Ellman's 시약(Invitrogen)을 사용하여 정량하였다. 본 발명자들은 L-시스테인이 본 자리-특이적 표지 실험에서 가장 우수하게 작용한다는 것을 발견하였고, 따라서 하기 2-단계 프로토콜을 사용하였다. 첫번째로, 변이체들을 4시간 동안 37℃에서 100-200배 과량의 L-시스테인으로 인큐베이팅한 다음, 50 mM Tris/EDTA로 버퍼 교환하였다. 두번째로, 샘플을 1시간 동안 실온에서 5-10배 과량의 Alexa488 말레이미드 염료(Invitrogen)로, 또는 12시간 동안 실온에서 10배 과량의 Pyrene 말레이미드 염료(Invitrogen)로 인큐베이팅하였다. 유리 염료의 제거 및 50 mM 포스페이트 버퍼 pH 7.0으로 버퍼 교환 후, 단백질 표지의 효능을 제조업자의 프로토콜에 따라서 단백질의 몰 당 염료의 몰로서 계산하였다(Invitrogen).
실시예 2: 유전자 조작된 항체 시스테인 변이체의 특성화
표지되지 않은 및 표지된 항체 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 7.5%, 10%, 및 12%의 겔을 비-환원 분석을 위해 사용하였다. 12%의 겔을 DTT와 함께 가열한 샘플의 환원 분석을 위해 사용하였다. 보통, 5-10 μg의 샘플을 레인마다 부하하였다.
형광 이미지를 쿠마씨 블루로 염색 전에 UV 광 하에서 취하였다. 항체 분해를 GluC (12-24시간 동안 25℃에서 1:20 wt 효소/wt 항체) 및 프로나아제(37℃에서 1시간 동안 1:20 wt 효소/wt 항체)에 의해 수행하였다.
비-환원성 겔은 모노머 뿐만 아니라 다이머, 트라이머의 존재, 일부 경우에 더 고차의 올리고머 조차 나타낸다. 환원성 겔은 표면 시스테인이 유전자 조작된 것에 따라서 경쇄 또는 중쇄의 배타적인 표지를 나타낸다. 표지 및 미표지된 변이체 1-6을 또한 항원 결합 특이성에 대해 분석하였다. 변이체는 표지시 활성의 일부 손실을 가지는 야생형의 80% 및 130% 내 활성을 보유한다. 미표지된 변이체 1은 대략 110%의 야생형 활성을 보유한 반면, 표지된 변이체 1은 대략 80%를 보유하였다. 미표지된 변이체 2는 대략 105% 활성의 야생형을 보유한 반면, 표지된 변이체 2는 100% 약간 미만의 활성을 보유하였다. 미표지 및 표지된 변이체 3은 둘다 대략 110%의 야생형 활성을 보유하였다. 미표지된 변이체 4는 대략 125%의 야생형 활성을 보유한 반면, 표지된 변이체 4는 대략 95%의 활성을 보유하였다. 미표지된 변이체 5는 대략 125%의 야생형 활성을 보유한 반면, 표지된 변이체 6은 대략 100%의 활성을 보유하였다. 최종적으로, 미표지된 변이체 6은 대략 115%의 야생형 활성을 보유한 반면, 표지된 변이체 6은 대략 90%의 활성을 보유하였다. 그것의 미표지된 한쪽과 유사하게, 표지된 변이체 6은 높은 올리고머화 경향을 나타내었다.
대부분의 변이체를 2.0몰 염료/몰 항체의 최적의 효능에 가깝게 표지하였다(2개의 동일한 시스테인/항체 분자). 2.0보다 높은 표지 효율은 바람직하지 않은데, 그것이 부분적 붕괴와 이황화물 사이 사슬의 표지를 시사하기 때문이다. 변이체 6, 변이체 11 및 변이체 5와 같은 높은 올리고머화 경향을 가지는 변이체들은 효율적으로 표지하지 않는다. 다른 변이체 중에서조차, 반응 시간 및 염료 대 단백질 비율과 같은 표지 조건들은 개개의 기초에서 최적화되어야 하는데, 모든 유전자 조작된 시스테인은 콘쥬게이션을 동일하게 잘 받아들일 수 있기 때문이다. 변이체 1-14를 유전자 조작된 시스테인을 옮기는 사슬에서 특이적으로 표지하였다. 프로나아제로 변이체의 단백질 분해 처리로 대부분의 변이체에 대해 다른 형광 패턴을 얻었지만, 변이체 3 및 12와 같은 이웃하는 치환을 가지는 변이체들에 대해 유사한 패턴을 얻었다. 따라서, 대부분의 변이체를 효율적으로 그리고 특이적으로 표지하였다.
교차-결합 경향의 5가지 분류를 시스테인 변이체의 이 설정에 대해 구별하였다(표 1). 분류 I은 모노머인 변이체를 포함하고 표지 후 안정하게 남아있다. 분류 II의 변이체들은 표지 전 및 후 다이머의 적은 비율을 함유하였다. 분류 III 변이체들은 일부 트라이머의 형성을 포함하는 올리고머화하는 더 큰 경향을 가졌다. 분류 IV 변이체는, 특히 표지 후 트라이머보다 더 큰 응집의 존재에 의해 증명되는 바와 같이 올리고머화를 위한 훨씬 더 큰 경향을 가진다. 분류 V는 정제된 농축 샘플의 단편화 또는 착색과 같은 추가적인 구조적 이상을 가지는 분류 IV의 변이체와 유사하게 높은 올리고머화 경향의 변이체들을 포함하였다.
실시예 3: 유전자 조작된 항체 시스테인 변이체의 적용
낮은 교차-결합 경향을 가지는 시스테인 변이체(변이체 1-4, 7, 10, 12-14)를 높은 특이성과 효율성을 가지고 올리고머화가 거의 없도록 표지하였다. 말레이미드 염료로 표지는 이들 항체 변이체에서 자리-특이적 콘쥬게이션의 단지 한 예이다. 결합 특이성 또는 독성과 같은 다수의 다른 작용을 가지는 분자들은 동일하게 부착될 수 있다. 따라서, 이 세트의 변이체들은 항체 변이체의 목록을 더 설명하여 표적 치료에서 탑재된 비히클에 대해 또는 시험관내 및 생체내 형광 분석에 도움이 된다.
변이체 중 하나의 형광 적용을 설명하기 위해, 본 발명자들은 형광 피렌과 콘쥬게이트된 변이체들의 방출 형태를 분석하였다. 2개의 피렌 분자들이 함께 밀접할 때, 여기 형광으로서 알려진 465nm에서 방출의 특징적 증가가 있다. 본 발명자들은 피렌 말레이미드를 가지는 변이체 4 및 7을 표지하였다. 변이체 4가 465nm에서 기본적 수준의 방출을 나타내지만, 변이체 7은 강한 여기 형광을 나타내었다. Fab 도메인의 내부측에서 변이체 7에 대해 CH1에서 유전자 조작된 시스테인의 위치를 고려하여, 관찰 결과는 Fc에 대해 Fab의 알려진 시저링 효과와 관련한다. 따라서, 이 변이체는 항체 도메인 역학의 분석에 사용될 수 있다.
변이체 6의 높은 올리고머화 경향은 훨씬 상세하게 탐구된 항체 시스테인 변이체의 다른 이용성을 제안하였다. 표지된 변이체 6을 올리고머로부터 모노머를 분리하기 위해 겔 여과 크로마토그래피를 받게하였고, 단백질-함유 부분을 7.5% 비-환원 SDS-PAGE 겔에 용해하였고 쿠마씨 블루로 염색 전 및 후 분석하였다. 변이체 6에서 겔 여과 분석은 표지와 가교결합 사이의 경쟁을 나타내었다: 종들의 더 높은 MW, 더 낮은 표지 효율성(형광의 수준에 의해 나타냄). 가장 높은 MW 종은 0.5의 표지 효율을 가지는 한편, 모노머 종들은 1.0의 표지 효율을, 원래 표지된 샘플은 표지 효율 0.8을 가졌다. 다양한 올리고머를 가지는 항체 변이체, 변이체 6은 자리-특이적으로 표지될 수 있는 추가 작용기와 함께, 항체 올리고머화 및 고분자량 단백질에 대해 적당한 표준을 위한 뛰어난 대조군으로 존재한다.
실시예 4: 시스테인 변이체의 교차-결합 경향( CLP ) 및 공간-응집 경향(SAP) 사이의 상관관계
교차-결합 경향(CLP) 및 공간 응집 경향(SAP)을 특이적 아미노산이 시스테인으로 치환되는 시스테인 변이체에 대해 비교하였다. 각 변이체에 비-환원성 SDS-PAGE 분석을 기반으로 한 CLP를 부여하였다. 돌연변이된 잔기에 대한 SAP 값은 5Å의 반경을 가지는 컴퓨터적 결과로부터 나온다. 본 발명자들은 SAP-암호화된 항체-1 구조에 유전자 조작된 시스테인 변이체를 더하였다.
하기 상관관계를 관찰하였다. 시스테인으로 치환된 모든 아미노산은 -0.27 내지 0.00의 범위에서 음의 SAP-값을 가진다. 이는 치환에 대해 극성 또는 하전된 아미노산의 선택과 일치한다. CLP 분류 I의 모든 변이체는 0.00 내지 -0.11의 SAP를 가지고(변이체 3, 4, 7, 10, 12), CLP 분류 II의 모든 변이체는 -0.12 내지 -0.23의 SAP를 가진다(변이체 1, 2, 13). 그러나, 높은 CLP를 가지는 범위에서 SAP를 가지는 변이체가 있다(예를 들어 변이체 8, 9 및 11). 크게 교차-결합하는 변이체인 변이체 8 및 11은 높은-SAP 자리에 이웃한다. CLP III을 가지는 변이체 5는 CH2에서 높은-SAP에 인접하는 한편, CLP II의 변이체 2는 그렇지 않다. 그러나, CH3의 변이체 6과 변이체 10 사이, 및 VH의 변이체 9와 14 사이에 이러한 상관 관계가 없다.
추가 관찰을 변이체 14로 하였다. 변이체 14는 가까이에 높은 SAP의 영역이 있다면 발현하지 않는 반면, 이 높은 SAP 영역은 낮은 SAP의 영역에 의해 치환된다. 안정화된 항체-2(35.6 mg/L 배양물)에서 100배 더 높은 수율의 변이체 14를 천연 항체-2 배경(0.34 mg/L)에서 변이체 14의 수율과 비교하여 관찰하였다. 다른 배경에서 변이체 14의 상대적인 수율은 시스테인이 높은 SAP 값의 영역 근처에서 단백질의 표면에 도입될 때 구조적 문제를 나타내었다. 유전자 조작된 시스테인에 인접하는 소수성 패치에서 2개의 소수성 아미노산이 리신으로 치환되었을 때, 이 문제는 해결되었다.
요약해서, 시스테인 변이체와 SAP의 안정성 사이에 상관관계가 존재한다: 1) 낮은 교차-결합 경향을 가지는 시스테인 변이체는 약간 음의 SAP(0.00 내지 -0.11)를 가지고, 2) 더 음의 SAP(-0.12 내지 -0.23)를 가지는 시스테인 변이체는 교차-결합이 더 쉽고, 3) 높은-SAP의 패치에 바로 근접한 시스테인 변이체는 교차-결합의 가능성이 더 있거나 또는 구조적 이상을 가진다. 결론 1 및 2는 완전히 노출된 잔기가 더 교차-결합되기 쉬울 수 있다는 앞서 정의한 생각과 일치한다[9].
실시예 5 - 결론
본 발명자들은 면역글로불린 폴드 도메인마다 적어도 하나의 변이체를 가지는 항체 분자에 광범위하게 분포하는 사람 IgG1 시스테인 변이체의 세트를 설계하였다. 이들 변이체의 대부분은 안정하고, 항원 결합 활성의 상당한 손실 없이 효율적이고 특이적으로 콘쥬게이트될 수 있다. 따라서, 안정한 항체 변이체가 하중된 분자의 자리-특이적 콘쥬게이션을 위한 변이체의 목록에 첨가된다. 형광단이 유전자 조작된 시스테인에 부착된다면, 특정 도메인의 동력학을 분석할 수 있다. 크게 올리고머화된 변이체는 마찬가지로 유리한데, 수많은 멀티머들이 항체 응집에 대해 그리고 고분자량 단백질에 대해 일반적으로 편리한 표준을 제공하기 때문이다.
항체 시스테인 변이체의 교차-결합 경향 사이의 상관관계는 본원에서 설명하였고, SAP 방법은 SAP 방법론이 환원된 교차-결합을 가지는 콘쥬게이션 자리에 대한 스크리닝에 사용될 수 있다는 것을 증명한다. SAP 기법은 컴퓨터-기반이며, 따라서 변이체 설계에서 시간과 실험적 작업을 감소시킨다. CLP/SAP 비교는 부분적이고 완전하지 않은 노출된 아미노산의 치환으로 대부분의 안정한 변이체를 얻는다는 것을 나타내었다. 게다가, 비교는 이웃하는 소수성 패치가 회피되어야 한다는 것을 나타내었다.
본원에서 설명한 유전자 조작된 사람 IgG1 표면 시스테인 변이체는 치료적 항체들의 자리-특이적 콘쥬게이션을 위한 새로운 자리 및 추가 변이체를 확인하기 위한 방법을 제공한다. 교차결합 경향이 거의 없는 변이체들은 표적화된 치료를 위한 항체들을 발생시키는 것에 가장 큰 이용성을 가진다. 본원에 개시된 시스테인 변이체들은 앞서 나타낸 도메인(CL, CH1, CH3) 뿐만 아니라 앞서 나타내지 않은 도메인(VL, VH, CH2)에서 새로운 자리를 포함한다.
게다가, 표지된 변이체들은 시험관내 및 생체내 실험실 연구를 위해 자리-특이적 형광 항체 마커의 세트로서 사용될 수 있다. 형광으로 표지된 제품을 생명공학 회사들(예컨대, Thermo Scientific Pierce, GE Healthcare, 및 Invitrogen)로부터 상업화할 수 있고, 항체 및 다른 단백질 시약을 연구 커뮤니티에 제공한다.
매우 교차-결합인 변이체 6은 유용한 단백질-겔 또는 다른 크로마토그래피 기법 표준이다. 이는 단백질 시약을 공급하는 회사들(예를 들어, Invitrogen, Bio-Rad, 및 Pierce)에 의해 시판될 수 있다.
CLP와 SAP 사이의 상관관계는 본 발명자들의 앞서 설명한 SAP 기법의 상업적 적용을 추가로 제안하였다. SAP의 고려는 자리-특이적 콘쥬게이션을 위한 안정한 항체 시스테인 변이체의 설계를 개선시킬 수 있다.
[표 1]
Figure pat00008
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Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 35 40 45 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 50 55 60 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 65 70 75 80 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 85 90 95 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 <210> 15 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 1 5 10 15 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 20 25 30 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 35 40 45 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 50 55 60 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 65 70 75 80 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 85 90 95 Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 <210> 16 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 1 5 10 15 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 20 25 30 Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 35 40 45 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 50 55 60 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys 65 70 75 80 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Phe Thr Gln Lys Ser Leu 85 90 95 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 <210> 17 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 1 5 10 15 Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 20 25 30 Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 35 40 45 Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 50 55 60 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg 65 70 75 80 Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 85 90 95 Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 <210> 18 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 1 5 10 15 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 20 25 30 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 35 40 45 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 50 55 60 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 65 70 75 80 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 85 90 95 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (82)

  1. 7(VH), 20(VL), 22(VL), 25(VH), 125(CH1), 248(CH2), 254(CH2), 286(CH2), 298(CH2), 및 326(CH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에서 적어도 하나의 돌연변이를 가지는 면역글로불린을 포함하는 면역글로불린 콘쥬게이트로서, 적어도 하나의 돌연변이는 시스테인 잔기, 및 원자 또는 분자로 치환되고, 원자 또는 분자는 시스테인 잔기에 콘쥬게이트된 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이는 7(VH), 20(VL), 22(VL) 및 125(CH1)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  3. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이는 248(CH2) 및 326(CH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  4. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이는 25(VH) 및 286(CH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  5. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이는 254(CH2) 및 298(VH)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택되는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린은 IgG1을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CH1 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CH2 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CH3 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CL 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 VH 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 VL 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 반응 자리를 가지는 링커 분자를 포함하며, 제1 반응자리는 면역글로불린의 시스테인 잔기에 결합되고, 제2 반응자리는 원자 또는 분자에 결합되는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  15. 제14항에 있어서, 링커 분자는 히드라존, 이황화물, 펩티드, 킬레이트제, 및 말레이미드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 원자 또는 분자는 방사성 핵종, 화학치료제, 미생물독소, 식물독소, 폴리머, 탄수화물, 사이토카인, 형광 표지, 발광 표지, 효소-기질 표지, 효소, 펩티드, 펩티도미메틱, 뉴클레오티드, siRNA, 마이크로RNA, RNA 미메틱, 및 앱타머로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 원자 또는 분자는 90Y, 131I, 67Cu, 177Lu, 213Bi, 211At, 칼리키아미신, 듀오카르마이신, 마이타니소이드, 아우리스타틴, 안트라사이클린, 슈도모나스 엑소톡신 A, 디프테리아 톡신, 리신, 폴리에틸렌 글리콜, 히드록시에틸 전분, 및 만노실 잔기로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 원자 또는 분자는 돌연변이되지 않은 면역글로불린의 면역원성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 원자 또는 분자는 돌연변이되지 않은 면역글로불린의 면역원성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 콘쥬게이트.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 항원 결합 활성을 더 포함하고, 활성은 돌연변이되지 않은 면역글로불린의 항원 결합 활성의 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 또는 적어도 130%인 면역글로불린 콘쥬게이트.
  21. 7(VH), 20(VL), 22(VL), 25(VH), 125(CH1), 248(CH2), 254(CH2), 286(CH2), 및 326(CH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린으로서, 적어도 하나의 돌연변이는 시스테인 잔기로 치환인 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  22. 제21항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이는 7(VH), 20(VL), 22(VL) 및 125(CH1)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  23. 제21항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이는 248(CH2) 및 326(CH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  24. 제21항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이는 25(VH) 및 286(CH2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기에 있는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  25. 제21항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이는 잔기 254(CH2)에 있는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  27. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린은 IgG1을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CH1 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CH2 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  30. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CH3 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  31. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 CL 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  32. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 VH 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  33. 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 VL 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  34. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린은 항원 결합 활성을 더 포함하고, 활성은 돌연변이되지 않은 면역글로불린의 항원 결합 활성의 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 또는 적어도 130%인 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  35. 제21항 내지 제34항 중 어느 한 항의 면역글로불린을 암호화하는 분리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  36. 제35항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  37. 제36항에 있어서, 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  38. 제36항 또는 제37항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  39. (a) 제38항의 숙주 세포를 포함하는 배양물 배지를 제공하는 단계; 및
    (b) 면역글로불린이 발현되는 조건하에 배양물 배지를 두는 단계
    를 포함하는 면역글로불린의 생성 방법.
  40. 제39항에 있어서, (c) 면역글로불린을 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. (a) 제21항 내지 제34항 중 어느 한 항의 면역글로불린을 제공하는 단계;
    (b) 하나 이상의 치환된 시스테인 잔기를 환원제로 환원시켜 환원된 시스테인 잔기를 형성하는 단계; 및
    (c) 면역글로불린을 원자 또는 분자와 함께 인큐베이팅하며, 원자 또는 분자는 환원된 시스테인 잔기와 반응하여 면역글로불린 콘쥬게이트를 형성하는 단계를 포함하는,
    면역글로불린 콘쥬게이트의 생성 방법.
  42. 면역글로불린 콘쥬게이트의 크게 농축된 약제학적 조제물에서 면역글로불린의 표면 노출된 시스테인 사이의 교차 결합을 환원시키는 방법으로서,
    (a) 면역글로불린을 제공하는 단계;
    (b) 7(VH), 20(VL), 22(VL), 및 125(CH1)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기를 시스테인 잔기로 치환하는 단계,
    (c) 하나 이상의 치환된 시스테인 잔기를 환원제로 환원시켜 환원된 시스테인 잔기를 형성하는 단계;
    (d) 면역글로불린을 원자 또는 분자와 함께 인큐베이팅하며, 분자는 환원된 시스테인 잔기와 반응하여, 면역글로불린 콘쥬게이트를 형성하는 단계; 및
    (e) 면역글로불린 콘쥬게이트의 매우 농축된, 액체 조제물을 만들고, 면역글로불린 콘쥬게이트 농도는 적어도 20 mg/ml, 적어도 30 mg/ml, 적어도 40 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml, 적어도 100 mg/ml, 적어도 125 mg/ml, 또는 적어도 150 mg/ml인 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제42항에 있어서, 면역글로불린은 IgG1을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제42항 내지 제44항에 있어서, 면역글로불린은 사람 CH1 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제42항 내지 제45항에 있어서, 면역글로불린은 사람 CH2 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제42항 내지 제46항에 있어서, 면역글로불린은 사람 CH3 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제42항 내지 제47항에 있어서, 면역글로불린은 사람 CL 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제42항 내지 제48항에 있어서, 면역글로불린은 사람 VH 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제42항 내지 제49항에 있어서, 면역글로불린은 사람 VL 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제42항 내지 제50항에 있어서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 항원 결합 활성을 포함하고, 활성은 돌연변이되지 않은 면역글로불린의 항원 결합 활성의 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 또는 적어도 130%인 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 크게 농축된 액체 조제물을 포함하는 의약의 제조에서 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 면역글로불린 콘쥬게이트의 사용으로서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 적어도 20 mg/ml, 적어도 30 mg/ml, 적어도 40 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml, 적어도 100 mg/ml, 적어도 125 mg/ml, 또는 적어도 150 mg/ml인 것을 특징으로 하는 사용.
  53. 제52항에 있어서, 의약은 자가면역 질환, 면역학적 질환, 감염성 질환, 염증성 질환, 신경학적 질환, 및 암을 포함하는 종양학적 및 신생물성 질환의 치료를 위한 것을 특징으로 하는 사용.
  54. 제52항에 있어서, 의약은 울혈성 심부전(CHF), 혈관염, 장미여드름, 여드름, 습진, 심근염 및 다른 심근 이상, 전신 홍반성 루프스, 당뇨병, 척추병증, 활막 섬유아세포, 및 골수 기질; 뼈손실; 파젯병, 파골세포종; 유방암; 비사용 골감소증; 영양실조, 치주질환, 고셔병, 랑게르한스 세포 조직구증, 척수 손상, 급성 패혈성 관절염, 골연화증, 쿠싱 증후군, 단골성 섬유성 이형성증, 다골성 섬유성 이형성증, 치주재건, 및 뼈 골절; 유육종증; 골용해성 골암, 유방암, 폐암, 신장암 및 직장암; 뼈 전이, 골 통증 관리, 및 체액성 악성 고칼슘혈증, 강직성 척추염 및 다른 척추관절염; 이식거부, 바이러스 감염, 조혈성 신생물 및 신생물-유사 상태들, 예를 들어 호지킨 림프종; 비-호지킨 림프종(버킷 림프종, 소 림프구성 림프종/만성 림프구성 백혈병, 균상식육종, 맨틀세포 림프종, 여포형 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 변연부 림프종, 모양 세포 백혈병 및 림프형질세포성 백혈병), 림프구 전구세포의 종양, 예를 들어 B-세포 급성 림프모구성 백혈병/림프종, 및 T-세포 급성 림프모구성 백혈병/림프종, 흉선종, 성숙 T 및 NK 세포의 종양, 예를 들어 말초 T-세포 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/T-세포 림프종 및 거대 과립 림프구성 백혈병, 랑게르한스 세포 조직구증, 골수양 신생물, 예를 들어 급성 골수성 백혈병, 예를 들어 성숙화를 동반한 AML, 분화를 동반하지 않은 AML, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수단구성 백혈병, 및 급성 단구성 백혈병, 골수이형성 증후군, 및 만성 골수증식성 장애, 예를 들어 만성 골수성 백혈병, 중추신경계의 종양, 예를 들어 뇌종양(신경아교종, 신경모세포종, 성상세포종, 수질아세포종, 상의세포종, 및 망막아종), 고상 종양(비인두암, 기저세포암종, 췌장암, 담관암, 카포시 육종, 고환암, 자궁암, 질암 또는 자궁경부암, 난소암, 원발성 간암 또는 자궁내막암, 및 혈관계의 종양(혈관육종 및 혈관외피종), 골다공증, 간염, HIV, AIDS, 척추관절염, 류마티스 관절염, 염증성 장질환(IBD), 패혈증 및 패혈성 쇼크, 크론병, 건선, 쉴레다더마, 이식편대숙주병(GVHD), 동종이계성 섬 이식편 거부, 조혈성 악성물, 예를 들어 다발성 골수종(MM), 골수이형성 증후군(MDS) 및 급성 골수성 백혈병(AML), 종양 관련 염증, 말초신경 손상 또는 탈수초성 질환의 치료를 위한 것을 특징으로 하는 사용.
  55. 제52항에 있어서, 의약은 반상 건선, 궤양성 대장염, 비-호지킨 림프종, 유방암, 결직장암, 소아 특발성 관절염, 황반변성, 호흡기 세포융합 바이러스, 크론병, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 골다공증, 치료-유발 뼈손실, 뼈 전이, 다발성 골수종, 알쯔하이머병, 녹내장, 및 다발성 경화증의 치료를 위한 것을 특징으로 하는 사용.
  56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 의약은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
  57. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 콘쥬게이트의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 비-올리고머화된 모노머인 것을 특징으로 하는 사용.
  58. 제57항에 있어서, 모노머의 백분율은 비-환원성 SDS-PAGE 분석에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 사용.
  59. 비-올리고머화 약제학적 활성 성분으로서 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 면역글로불린 콘쥬게이트의 사용.
  60. 진단 도구로서 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 면역글로불린 콘쥬게이트의 사용.
  61. 고분자량 단백질에 대한 표준으로서 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항의 면역글로불린 콘쥬게이트의 사용.
  62. 고분자량 단백질에 대한 표준으로서 면역글로불린 콘쥬게이트의 사용에 있어서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 잔기 440(CH3)에서 적어도 하나의 돌연변이를 가지는 면역글로불린 콘쥬게이트를 포함하며, 적어도 하나의 돌연변이는 시스테인 잔기, 및 원자 또는 분자로 치환이고, 원자 또는 분자는 시스테인 잔기에 콘쥬게이트되는 것을 특징으로 하는 사용.
  63. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 면역글로불린 콘쥬게이트 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 면역글로불린 콘쥬게이트는 적어도 10 mg/ml, 적어도 20 mg/ml, 적어도 30 mg/ml, 적어도 40 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml, 적어도 100 mg/ml, 적어도 125 mg/ml, 또는 적어도 150 mg/ml의 농도에 있는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 면역글로불린 콘쥬게이트의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 비-올리고머화된 모노머인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  66. 시스테인으로 돌연변이를 위한 면역글로불린의 잔기를 선택하는 방법에 있어서,
    (a) 면역글로불린의 표면에서 제1 아미노산 잔기의 공간-응집-경향을 계산하는 단계;
    (b) 제1 잔기의 바로 근처에서 면역글로불린의 복수의 잔기의 공간-응집-경향들을 계산하는 단계; 및
    (c) 제1 아미노산 잔기의 공간-응집-경향이 0 내지 -0.11의 값과 동일하거나 그 안에 있다면, 및 복수의 잔기가 0미만의 공간-응집-경향들을 가진다면, 시스테인으로 돌연변이를 위해 제1 아미노산 잔기를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 복수의 잔기들은 제1 잔기의 15Å 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제66항에 있어서, 복수의 잔기들은 제1 잔기의 10Å 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제66항에 있어서, 복수의 잔기들은 제1 잔기의 7.5Å 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제66항에 있어서, 복수의 잔기들은 제1 잔기의 5Å 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 잔기의 공간-응집-경향을 계산하는 단계는 잔기에서 반경이 잔기에 있는 원자의 중심에 있는 구체 영역에 대한 공간-응집-경향을 계산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 구체 영역의 반경은 적어도 5Å인 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 표면-노출된 잔기의 시스테인으로 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린으로서,
    잔기의 공간-응집 경향은 0 내지 -0.11의 값과 동일하거나 그 안에 있고, 제1 잔기에 바로 근접한 면역글로불린의 복수의 잔기의 공간-응집-경향들은 0 미만의 공간-응집-경향을 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  74. 제73항에 있어서, 복수의 잔기는 제1 잔기의 15Å 내에 있는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  75. 제73항에 있어서, 복수의 잔기는 제1 잔기의 10Å 내에 있는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  76. 제73항에 있어서, 복수의 잔기는 제1 잔기의 7.5Å 내에 있는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  77. 제73항에 있어서, 복수의 잔기는 제1 잔기의 5Å 내에 있는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  78. 제73항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 공간-응집-경향은 반경이 잔기에 있는 원자의 중심에 있는 구체 영역에 대해 계산되는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  79. 제78항에 있어서, 반경은 적어도 5Å인 것을 특징으로 하는 변형된 또는 분리된 면역글로불린.
  80. 시스테인으로 돌연변이를 위한 면역글로불린의 잔기를 선택하는 방법으로서,
    (a) 복수의 잔기들이 면역글로불린의 표면에 노출되어 있는, 면역글로불린의 복수의 아미노산 잔기를 선택하는 단계
    (b) 복수의 잔기들 중 하나의 잔기를 시스테인 잔기로 돌연변이시키는 단계;
    (c) 시스테인 잔기를 원자 또는 분자에 콘쥬게이트하여 면역글로불린 콘쥬게이트를 형성하는 단계;
    (d) 교차-결합 경향을 위한 면역글로불린 콘쥬게이트를 시험하고, 면역글로불린 콘쥬게이트에 교차-결합 경향 값을 부여하는 단계; 및
    (e) 교차-결합 경향 값이 I 또는 II라면 시스테인으로 돌연변이를 위해 잔기를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 면역글로불린 콘쥬게이트의 5% 미만이 다이머를 형성하고, 면역글로불린 콘쥬게이트 중에서 트라이머를 형성하는 것이 없으며, 다이머 및 트라이머 형성은 상대적인 비-환원성 및 환원성 SDS-PAGE에 의해 측정된다면, 면역글로불린 콘쥬게이트에 II의 교차-결합 경향 값을 부여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 면역글로불린 콘쥬게이트의 1% 미만이 다이머를 형성하며, 다이머 형성은 상대적인 비-환원성 및 환원성 SDS-PAGE에 의해 측정된다면, 면역글로불린 콘쥬게이트에 I의 교차-결합 경향 값을 부여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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