KR101839163B1 - 시스테인 조작된 항체 및 접합체 - Google Patents

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제넨테크, 인크.
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Abstract

중쇄 또는 경쇄에 유리 시스테인 아미노산을 포함하는 시스테인 조작된 항체는 시스테인 조작된 항체를 코딩하기 위해 1개 이상의 아미노산 잔기를 시스테인으로 대체함으로써 모 항체의 핵산 서열을 돌연변이유발시키고; 시스테인 조작된 항체를 발현시키고; 시스테인 조작된 항체를 단리하여 제조된다. 특정의 고도로 반응성인 시스테인 조작된 항체가 PHESELECTOR 검정에 의해 확인되었다. 단리된 시스테인 조작된 항체는 포획 표지, 검출 표지, 약물 모이어티 또는 고체 지지체에 공유 부착될 수 있다.

Description

시스테인 조작된 항체 및 접합체 {CYSTEINE ENGINEERED ANTIBODIES AND CONJUGATES}
<관련 출원에 대한 참조>
37 CFR §1.53(b) 하에 출원된 본 정식 출원은 35 USC §119(e) 하에 2010년 6월 8일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/352,728을 우선권 주장하고, 그의 전문은 본원에 참고로 포함된다.
<발명의 분야>
본 발명은 일반적으로 반응성 시스테인 잔기로 조작된 항체에 관한 것이고, 보다 구체적으로 치료 또는 진단 용도를 갖는 항체에 관한 것이다. 시스테인 조작된 항체는 화학요법 약물, 독소, 친화성 리간드, 예컨대 비오틴, 및 검출 표지, 예컨대 형광단과 접합시킬 수 있다. 본 발명은 또한 포유동물 세포, 또는 연관된 병리학적 상태를 시험관내, 계내 또는 생체내에서 진단 또는 치료하기 위해 항체 및 항체-약물 접합체 화합물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
항체 약물 접합체 (ADC)는 항원-발현 종양 세포에 강력한 세포독성 약물을 표적화하여 그의 항-종양 활성을 개선시킴으로써 항체 및 세포독성 약물 둘 다의 이상적인 특성을 조합시키므로 매력적인 표적화된 화학요법 분자이다. 주어진 표적 항원에 대한 성공적인 ADC 개발은 항체 선택, 링커 안정성, 세포독성 약물 효능 및 항체에의 링커-약물의 접합 방식의 최적화에 따라 좌우된다.
약물 모이어티를 항체에 부착시키는, 즉 공유 연결시키는 통상적인 수단은 일반적으로 약물 모이어티가 항체 상의 다수의 부위에 부착되는 분자의 불균질 혼합물을 생성한다. 예를 들어, 세포독성 약물은 전형적으로 종종 항체의 다수의 리신 잔기를 통해 항체에 접합되어, 불균질 항체-약물 접합체 혼합물을 생성한다. 반응 조건에 따라, 불균질 혼합물은 전형적으로 0 내지 약 8개 또는 그 초과의 부착된 약물 모이어티를 갖는 항체의 분포를 포함한다. 또한, 약물 모이어티 대 항체의 특정한 정수 비를 갖는 접합체의 각 하위군 내에 약물 모이어티가 항체 상의 다양한 부위에 부착되는 잠재적으로 불균질 혼합물이 존재한다. 분석 및 제조 방법은 접합 반응으로부터 생성되는 불균질 혼합물 내에서 항체-약물 접합체 종 분자를 분리하고 특성화하기에 부적당할 수 있다. 항체는 종종 다수의 반응성 관능기를 갖는 크고 복잡하고 구조상 다양한 생체분자이다. 그의 링커 시약 및 약물-링커 중간체와의 반응성은 pH, 농도, 염 농도, 및 공용매와 같은 요인에 의존한다. 또한, 다단계 접합 과정은 반응 조건을 제어하고 반응물 및 중간체를 특성화하는 어려움 때문에 재현가능하지 않을 수 있다.
pH 7 부근에서 양성자첨가되고 덜 친핵성인 대부분의 아민과는 달리, 시스테인 티올은 중성 pH에서 반응성이다. 유리 티올 (RSH, 술프히드릴) 기가 비교적 반응성이므로, 시스테인 잔기를 갖는 단백질은 종종 디술피드-연결된 올리고머로서 산화된 형태로 존재하거나, 내부에 가교된 디술피드 기를 갖는다. 항체 시스테인 티올 기는 일반적으로 항체 아민 또는 히드록실 기보다 친전자성 접합 시약에 대해 더 반응성이고, 즉 더 친핵성이다. 시스테인 아미노산에 대한 단백질의 다양한 아미노산 잔기의 돌연변이에 의한 시스테인 티올 기에서의 조작은, 특히 쌍을 이루지 않은 (유리 Cys) 잔기 또는 반응 또는 산화에 비교적 접근가능한 것의 경우에 잠재적으로 문제가 된다. 단백질의 농축 용액에서 (이. 콜라이 (E. coli)의 주변세포질, 배양 상청액, 또는 부분적으로 또는 완전히 정제된 단백질 내에서라도), 단백질의 표면 상의 쌍을 이루지 않은 Cys 잔기는 쌍을 이루고 산화되어 분자간 디술피드를 형성할 수 있고, 이에 따라 단백질 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있다. 디술피드 이량체 형성은 새로운 Cys가 약물, 리간드 또는 다른 표지에의 접합에 대해 비반응성이 되도록 한다. 또한, 단백질이 새롭게 조작된 Cys와 기존의 Cys 잔기 사이에서 산화에 의해 분자내 디술피드 결합을 형성하면, 양쪽 Cys 기는 활성 부위 참여 및 상호작용에 이용가능하지 않다. 또한, 단백질은 미스폴딩 또는 3차 구조의 손실에 의해 불활성이 되거나 비-특이적으로 될 수 있다 (문헌 [Zhang et al. (2002) Anal. Biochem. 311:1-9]).
그러나 조작된 시스테인이 접합에 이용가능한 부위에 시스테인 치환 (티오Mab)을 갖는 항체는 이뮤노글로불린 폴딩 및 어셈블리를 교란시키거나 항원 결합 및 이펙터 기능을 변경시키지 않는다 (문헌 [Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al. (2009) Blood 114(13):2721-2729]; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249). 이러한 티오Mab는 이어서 조작된 시스테인 티올 기를 통해 세포독성 약물에 접합되어 균질한 화학량론 (항체 당 약 2개 약물)을 갖는 티오Mab 약물 접합체 (TDC)를 수득할 수 있다. 상이한 항원에 대한 다중 항체를 사용하는 연구는 TDC가 이종이식 모델에서 통상적인 ADC만큼 효능이 있고, 적절한 전임상 모델에서 보다 높은 용량에서 허용된다는 것을 보여주었다. 티오Mab 약물 접합체는 항체 (경쇄-Fab, 중쇄-Fab 및 중쇄-Fc)의 상이한 부분에서의 약물 부착으로 조작된다. TDC의 시험관내 및 생체내 안정성, 효능 및 PK 특성은 그의 동질성 및 세포독성 약물에의 부위 특이적 접합으로 인해 통상적인 ADC보다 특징적인 이점을 제공한다.
<개요>
본 발명은 중쇄 또는 경쇄에 유리 시스테인 아미노산을 포함하는 단리된 시스테인 조작된 항체를 포함한다.
본 발명의 측면은 시스테인 조작된 항체를 코딩하기 위해 1개 이상의 아미노산 잔기를 시스테인으로 대체함으로써 모 항체의 핵산 서열을 돌연변이유발시키고; 시스테인 조작된 항체를 발현하고; 시스테인 조작된 항체를 단리시킴으로써 단리된 시스테인 조작된 항체를 제조하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 단리된 시스테인 조작된 항체의 접합체이고, 여기서 상기 항체는 포획 표지, 검출 표지, 약물 모이어티 또는 고체 지지체에 공유 부착된다.
도 1a는 X-선 결정 좌표에 의해 유래된 hu4D5Fabv7 항체 단편의 3차원 표현을 보여준다. 중쇄 및 경쇄의 예시적인 조작된 Cys 잔기의 구조 위치가 넘버링된다 (순차적 넘버링 시스템에 따름).
도 1b는 4D5v7fabH에 대한 카바트 넘버링 방식 (하부 열)과 비교한 N-말단에서 시작하는 순차적 넘버링 방식 (상부 열)을 보여준다. 카바트 넘버링 삽입은 a, b, c로 표시된다.
도 2a 및 2b는 hu4D5Fabv8 및 hu4D5Fabv8 Cys 돌연변이체 (티오Fab) 파지 변이체의 450nm에서의 흡광도의 검출을 이용하는 결합 측정을 보여준다: (a) 비-비오티닐화 파지-hu4D5Fabv8 및 (b) 비오티닐화 파지-hu4D5Fabv8 (b) (BSA (백색 막대), HER2 (줄무늬 막대) 또는 스트렙타비딘 (흑색 막대)과의 상호작용에 대한 PHESELECTOR 검정에 의함).
도 3a 및 3b는 hu4D5Fabv8 (좌측) 및 hu4D5Fabv8 Cys 돌연변이체 (티오Fab) 변이체의 450nm에서의 흡광도의 검출을 이용하는 결합 측정을 보여준다: (a) 비-비오티닐화 파지-hu4D5Fabv8 및 (b) 비오티닐화 파지-hu4D5Fabv8 (BSA (백색 막대), HER2 (줄무늬 막대) 및 스트렙타비딘 (흑색 막대)과의 상호작용에 대한 PHESELECTOR 검정에 의함). 경쇄 변이체는 좌측 상에 있고, 중쇄 변이체는 우측 상에 있다. 티올 반응성 = 스트렙타비딘 결합에 대한 OD450 nm ÷ HER2 (항체) 결합에 대한 OD450 nm.
도 4a는 야생형 hu4D5Fabv8에 대한 잔기의 분획별 표면 접근성 값을 보여준다. 경쇄 부위는 좌측 상에 있고, 중쇄 부위는 우측 상에 있다.
도 4b는 HER2 (제2일), 스트렙타비딘 (SA) (제2일), HER2 (제4일) 및 SA (제4일)와의 상호작용에 대한, 비오티닐화 hu4D5Fabv8 (좌측) 및 hu4D5Fabv8 Cys 돌연변이체 (티오Fab) 변이체의 450nm에서의 흡광도의 검출을 이용하는 결합 측정을 보여준다. 파지-hu4D5Fabv8 Cys 변이체는 4℃에서 단리 및 저장된다. 비오틴 접합을 제2일 또는 제4일에 수행한 후에 PHESELECTOR 분석을 수행하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 그의 Her2 및 스트렙타비딘과의 상호작용을 모니터링하고 조작된 티오Fab 변이체 상의 반응성 티올 기의 안정성을 프로빙하였다.
도 5는 스트렙타비딘 및 HER2에의 결합에 대한, 비오틴-말레이미드 접합된-hu4D5Fabv8 (A121C) 및 비-비오티닐화 야생형 hu4D5Fabv8의 450nm에서의 흡광도의 검출을 이용하는 결합 측정을 보여준다. 각각의 Fab를 2 ng 및 20 ng에서 시험하였다.
도 6은 토끼 알부민, 스트렙타비딘 (SA) 및 HER2와의 결합에 대한, 비오티닐화 ABP-hu4D5Fabv8 야생형 (wt) 및 ABP-hu4D5Fabv8 시스테인 돌연변이체 V110C 및 A121C의 450nm에서의 흡광도의 검출을 이용하는 ELISA 분석을 보여준다.
도 7은 토끼 알부민, HER2 및 스트렙타비딘 (SA)와의 결합, 및 Fab-HRP 또는 SA-HRP로의 프로빙에 대한, 비오티닐화 ABP-hu4D5Fabv8 시스테인 돌연변이체 (티오Fab 변이체): (좌측으로부터 우측으로) 단일 Cys 변이체 ABP-V110C, ABP-A121C 및 이중 Cys 변이체 ABP-V110C-A88C 및 ABP-V110C-A121C의 450nm에서의 흡광도의 검출을 이용하는 ELISA 분석을 보여준다.
도 8은 HER2 (상부) 및 스트렙타비딘 (하부)에의 비오티닐화 티오Fab 파지 및 항-파지 HRP 항체의 결합을 보여준다.
도 9a는 흡광도 검출을 위한 HRP 표지된 2차 항체의 결합과, 고정된 HER2에의 비오티닐화 항체 결합의 카툰 도면을 보여준다.
도 9b는 고정된 HER2에의 결합에서 비오틴-말레이미드 접합된 티오-트라스투주맙 변이체 및 비-비오티닐화 야생형 트라스투주맙의 450nm에서의 흡광도의 검출을 이용하는 결합 측정을 보여준다. 좌측으로부터 우측으로: V110C (단일 cys), A121C (단일 cys), V110C/A121C (이중 cys) 및 트라스투주맙. 각각의 티오 IgG 변이체 및 트라스투주맙을 1, 10 및 100 ng에서 시험하였다.
도 10a는 흡광도 검출을 위한 항-IgG-HRP에의 비오틴의 결합과, 고정된 HER2에의 비오티닐화 항체 결합의 카툰 도면을 보여준다.
도 10b는 고정된 스트렙타비딘에의 결합에서 비오틴-말레이미드 접합된-티오 트라스투주맙 변이체 및 비-비오티닐화 야생형 트라스투주맙의 450nm에서의 흡광도의 검출을 이용하는 결합 측정을 보여준다. 좌측으로부터 우측으로: V110C (단일 cys), A121C (단일 cys), V110C/A121C (이중 cys) 및 트라스투주맙. 각각의 티오 IgG 변이체 및 트라스투주맙을 1, 10 및 100 ng에서 시험하였다.
도 11은 접합을 위한 세포 배양으로부터 발현된 시스테인 조작된 항체 (티오Mab)를 제조하기 위한 일반적인 방법을 보여준다.
<예시적 실시양태의 상세한 설명>
이하, 본 발명의 특정 실시양태를 상세하게 언급할 것이고, 그의 예를 첨부하는 구조식 및 화학식으로 예시한다. 본 발명이 열거된 실시양태와 관련하여 기재되지만, 본 발명을 이러한 실시양태로 제한하려는 의도가 아님을 이해할 것이다. 반대로, 본 발명은 특허청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 범주 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형 및 등가물을 포함하는 것으로 의도된다.
당업자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 많은 방법 및 재료를 인식할 것이다. 본 발명은 어떠한 방식으로도 본원에 기재된 방법 및 재료로 제한되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 전문 학술 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖고, 다음과 부합된다: 문헌 [Singleton et al. (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed., J. Wiley & Sons, New York, NY; 및 Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York].
<정의>
달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 하기 용어 및 어구는 하기 의미를 갖는 것으로 의도된다:
본원에서 상표명이 사용되는 경우, 본 출원인은 상표 제품 제제, 일반적인 약물 및 상표 제품의 활성 제약 성분(들)을 독립적으로 포함하고자 한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이량체, 다량체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편이 포함된다 (문헌 [Miller et al. (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861]). 항체는 뮤린, 인간, 인간화, 키메라, 또는 다른 종으로부터 유래된 것일 수 있다. 항체는 특정 항원을 인식하고 이에에 결합할 수 있는, 면역계에 의해 생성되는 단백질이다. (문헌 [Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York]). 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDR에 의해 인식되는, 에피토프라고도 지칭되는 다수의 결합 부위를 갖는다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각 항체는 상이한 구조를 갖는다. 따라서, 하나의 항원은 하나 초과의 상응하는 항체를 가질 수 있다. 항체는 전장 이뮤노글로불린 분자 또는 전장 이뮤노글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 관심 표적 항원 또는 그의 일부 (이러한 표적은 암 세포, 또는 자가면역 질환과 연관된 자가면역 항체를 생산하는 세포를 포함하나 이에 제한되지 않음)에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 본원에 개시된 이뮤노글로불린은 이뮤노글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 것일 수 있다. 이뮤노글로불린은 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 그러나, 한 측면에서, 이뮤노글로불린은 인간, 뮤린 또는 토끼 기원의 것이다.
"항체 단편"은 전장 항체의 부분, 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 미니바디 (문헌 [Olafsen et al. (2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323]), Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 항-이디오타입 (항-Id) 항체, CDR (상보성 결정 영역), 및 암 세포 항원, 바이러스 항원 또는 미생물 항원에 면역특이적으로 결합하는 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편, 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질성인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 이러한 집단을 포함하는 개별 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 지시되며 고도로 특이적이다. 추가로, 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 이러한 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 이들이 다른 항체에 의해 오염되지 않는 상태로 합성될 수 있다는 점에서 유익하다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 특징을 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득하였다는 것으로 표시하고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature 256:495]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어: US 4816567; US 5807715 참조)에 의해 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어 문헌 [Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 "키메라" 항체를 포함하며, 여기서 중쇄 및/또는 경쇄의 부분은 특정한 종으로부터 유래되거나 또는 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성이며, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또는 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 및 이들이 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성이다 (US 4816567; 및 문헌 [Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855]). 본원에서 관심 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구세계 원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다.
본원에서 "무손상 항체"는 VL 및 VH 도메인 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 무손상 항체는 항체의 Fc 불변 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에서 기인하는 생물학적 활성을 지칭하는 하나 이상의 "이펙터 기능"을 가질 수 있다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 및 세포 표면 수용체, 예컨대 B 세포 수용체 및 BCR의 하향 조절을 포함한다.
무손상 항체는 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 "클래스"로 배정될 수 있다. 5가지 주요 클래스의 무손상 이뮤노글로불린 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇 가지는 "서브클래스" (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 클래스의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배위는 널리 공지되어 있다. Ig 형태는 힌지-변형 또는 힌지가 없는 형태를 포함한다 (문헌 [Roux et al. (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256]; US 2005/0048572; US 2004/0229310).
"ErbB 수용체"는 그의 구성원이 세포 성장, 분화 및 생존의 중요한 매개자인 ErbB 수용체 패밀리 속하는 수용체 단백질 티로신 키나제이다. ErbB 수용체 패밀리는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR, ErbB1, HER1), HER2 (ErbB2 또는 p185neu), HER3 (ErbB3) 및 HER4 (ErbB4 또는 tyro2)를 포함하는 4가지 특징적인 구성원을 포함한다. 항-ErbB2 항체의 패널은 인간 유방 종양 세포주 SKBR3을 사용하여 특성화된다 (문헌 [Hudziak et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172]). 최대 억제는 세포 증식을 56% 억제하는 4D5로 지칭되는 항체로 수득하였다. 패널 내의 다른 항체는 본 검정보다 더 낮은 수준으로 세포 증식을 감소시켰다. 항체 4D5는 ErbB2-과다발현 유방 종양 세포주를 TNF-α의 세포독성 효과에 대해 감수성으로 만드는 것으로 추가로 밝혀졌다 (US 5677171). 문헌 [Hudziak et al.]에서 논의된 항-ErbB2 항체는 문헌 [Fendly et al. (1990) Cancer Research 50:1550-1558; Kotts et al. (1990) In Vitro 26(3):59A; Sarup et al. (1991) Growth Regulation 1:72-82; Shepard et al. J. (1991) Clin. Immunol. 11(3):117-127; Kumar et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986; Lewis et al. (1993) Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1829-1838; Vitetta et al. (1994) Cancer Research 54:5301-5309; Sliwkowski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665; Scott et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:14300-5; D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:7202-7206; Lewis et al. (1996) Cancer Research 56:1457-1465; 및 Schaefer et al. (1997) Oncogene 15:1385-1394]에서 추가로 특성화된다.
ErbB 수용체는 일반적으로 ErbB 리간드에 결합할 수 있는 세포외 도메인, 친지성 막횡단 도메인, 보존된 세포내 티로신 키나제 도메인, 및 인산화될 수 있는 여러 개의 티로신 잔기를 보유하는 카르복실-말단 신호전달 도메인을 포함할 것이다. ErbB 수용체는 "천연 서열" ErbB 수용체 또는 그의 "아미노산 서열 변이체"일 수 있다. 바람직하게는, ErbB 수용체는 천연 서열 인간 ErbB 수용체이다. 따라서, "ErbB 수용체 패밀리의 구성원"은 EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3, ErbB4를 포함한다.
용어 "아미노산 서열 변이체"는 천연 서열 폴리펩티드와 어느 정도 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 통상적으로, 아미노산 서열 변이체는 천연 ErbB 리간드의 적어도 하나의 수용체 결합 도메인 또는 천연 ErbB 수용체의 적어도 하나의 리간드 결합 도메인과의 서열 동일성이 적어도 약 70%일 것이고, 바람직하게는 이들은 이러한 수용체 또는 리간드 결합 도메인과의 서열 상동성이 적어도 약 80%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%일 것이다. 아미노산 서열 변이체는 천연 아미노산 서열의 아미노산 서열 내의 특정 위치에서 치환, 결실 및/또는 삽입을 보유한다. 아미노산은 통상적인 명칭, 1-문자 및 3-문자 코드에 의해 지정된다.
"서열 동일성"은 아미노산 서열 변이체에서 최대 퍼센트의 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬시키고 필요하다면 갭을 도입한 후에 동일한 잔기의 백분율로서 정의된다. 이러한 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램의 하나는 "Align 2" (저자: 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.), 1991년 12월 10일 미국 저작권청(DC 20559 워싱턴 특별구)에 사용자 문서와 함께 제출됨)이다.
"천연 항체"는 통상적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 달라진다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고, 그 뒤에 수많은 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고, 그의 다른쪽 말단에 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 인터페이스를 형성한다고 여겨진다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열에서 광범위하게 상이하고 각각의 특정한 항체의 그의 특정한 항원에 대한 결합 및 특이성과 관련하여 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성이 항체 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다 내에 초가변 영역이라고 지칭되는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라고 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 3개의 초가변 영역에 의해 연결되고 주로 β-시트 배위를 채택하는 4개의 FR을 각각 포함하며, 이들 초가변 영역은 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 쇄 내의 초가변 영역은 FR에 의해 함께 매우 근접하여 유지되고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역은 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD] 참조). 불변 도메인은 항체의 항원에의 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여를 나타낸다.
용어 "초가변 영역"이 본원에 사용되는 경우, 이는 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 문헌 [Kabat et al. 상기 문헌]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 문헌 [Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917])를 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
항체를 파파인으로 소화시키면 "Fab" 단편이라고 지칭되는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 나머지 "Fc" 단편이 생산되며, 이 명칭은 그의 쉽게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리를 통해 2개의 항원-결합 부위를 갖는 F(ab')2 단편을 수득하고, 여전히 항원을 가교시킬 수 있다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 긴밀하게 비-공유 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이러한 배위에서 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면 상의 항원-결합 부위를 정의한다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖고 있다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 1개의 유리 티올 기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 Fab' 단편 사이에 힌지 시스테인을 갖는, Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로, 2가지 명백한 특징적인 유형 (카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭됨) 중 하나로 할당될 수 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재하는, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌 [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다. 항-ErbB2 항체 scFv 단편은 WO 93/16185; 미국 특허 번호 5571894; 및 5587458에 기재되어 있다.
비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 인간화는 뮤린 항원 결합 정보를 비-면역원성 인간 항체 수용체에 전달하는 방법이고, 다수의 치료상 유용한 약물을 생성한다. 인간화 방법은 일반적으로 모든 6개의 뮤린 상보성 결정 영역 (CDR)을 인간 항체 프레임워크로 전달하여 시작된다 (문헌 [Jones et al., (1986) Nature 321:522-525]). 이들 CDR-이식된 항체는 일반적으로 항원 결합에 대한 이들의 본래 친화도를 유지하지 않고, 실제로 친화도는 종종 심각하게 손상되기도 한다. CDR 이외에, 선택 비-인간 항체 프레임워크 잔기가 또한 적절한 CDR 입체형태를 유지하기 위해 혼입되어야 한다 (문헌 [Chothia et al. (1989) Nature 342:877]). 이식된 CDR의 구조적 입체형태를 지지하기 위한 핵심적인 마우스 프레임워크 잔기의 인간 수용자로의 전달이 항원 결합 및 친화도를 회복시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Riechmann et al. (1992) J. Mol. Biol. 224, 487-499; Foote and Winter, (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; Presta et al. (1993) J. Immunol. 151, 2623-2632; Werther et al. (1996) J. Immunol. Methods 157:4986-4995; 및 Presta et al. (2001) Thromb. Haemost. 85:379-389]). 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 바람직한 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 개선되게 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세한 내용에 대해, US 6407213; 문헌 [Jones et al. (1986) Nature, 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; 및 Presta, (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596]을 참조한다.
"유리 시스테인 아미노산"은 모 항체 내로 조작되고, 티올 관능기 (-SH)를 갖고, 분자내 또는 분자간 디술피드 가교로서 쌍을 이루지 않는 시스테인 아미노산 잔기를 지칭한다.
용어 "티올 반응성 값"은 유리 시스테인 아미노산의 반응성에 대한 정량적 특성화이다. 티올 반응성 값은 티올-반응성 시약과 반응하는, 시스테인 조작된 항체 내의 유리 시스테인 아미노산의 백분율이고, 최대 1의 값으로 전환된다. 예를 들어, 100％ 수율로 티올-반응성 시약, 예컨대 비오틴-말레이미드 시약과 반응하여 비오틴-표지된 항체를 형성하는, 시스테인 조작된 항체 상의 유리 시스테인 아미노산의 티올 반응성 값은 1.0이다. 80％ 수율로 티올-반응성 시약과 반응하는, 동일한 또는 상이한 모 항체로 조작된 또 다른 시스테인 아미노산의 티올 반응성 값은 약 0.8이다. 티올-반응성 시약과 전혀 반응하지 못하는, 동일한 또는 상이한 모 항체로 조작된 또 다른 시스테인 아미노산의 티올 반응성 값은 0이다. 특정한 시스테인의 티올 반응성 값의 결정은 ELISA 검정, 질량 분광분석법, 액체 크로마토그래피, 오토라디오그래피, 또는 다른 정량적 분석 시험에 의해 수행할 수 있다.
"모 항체"는 그로부터 1개 이상의 아미노산 잔기가 1개 이상의 시스테인 잔기로 대체된 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 모 항체는 천연 또는 야생형 서열을 포함할 수 있다. 모 항체는 다른 천연, 야생형, 또는 변형된 형태의 항체에 비해 이미 존재하는 아미노산 서열 변형 (예컨대, 부가, 결실 및/또는 치환)을 가질 수 있다. 모 항체는 관심 표적 항원, 예를 들어 생물학적으로 중요한 폴리펩티드에 대해 지시될 수 있다. 또한, 비폴리펩티드 항원 (예컨대, 종양-연관 당지질 항원; US 5091178 참조)에 대해 지시된 항체가 고려된다.
예시적인 모 항체는 세포 표면 및 막횡단 수용체에 대한 친화도 및 선택성을 갖는 항체 및 종양-연관 항원 (TAA)을 포함한다.
"단리된" 항체는 자연 환경 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 것이다. 항체의 자연 환경의 오염물 성분은 상기 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 결정시에 항체의 95 중량%를 초과하는 정도, 가장 바람직하게는 99 중량%를 초과하는 정도로, (2) 스피닝 컵 시쿼네이터를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질한 것으로 나타날 정도로 정제될 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하는데, 이는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
관심 분자 표적 또는 항원, 예를 들어 ErbB2 항원에 "결합하는" 항체는 항체가 항원을 발현하는 세포를 표적화하는데 유용하도록 충분한 친화도로 그 항원에 결합할 수 있는 것이다. 항체가 ErbB2에 결합하는 것일 경우, 이는 통상적으로 다른 ErbB 수용체와 대조적으로 ErbB2에 우선적으로 결합할 것이고, 다른 단백질, 예컨대 EGFR, ErbB3 또는 ErbB4와 유의하게 교차반응하지 않는 것일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 항체의 이들 비-ErbB2 단백질에의 결합 (예를 들어, 내인성 수용체에의 세포 표면 결합)의 정도는 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사성면역침전법 (RIA)에 의해 결정된 바와 같이 10% 미만일 것이다. 때때로, 항-ErbB2 항체는 예를 들어 문헌 [Schecter et al. (1984) Nature 312:513 및 Drebin et al. (1984) Nature 312:545-548]에 기재된 바와 같이 래트 neu 단백질과 유의하게 교차반응하지 않을 것이다.
본 발명에 포함되는 항체에 대한 분자 표적은 CD 단백질 및 그의 리간드, 예컨대 (i) CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79α (CD79a) 및 CD79β (CD79b); (ii) ErbB 수용체 패밀리의 구성원, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; (iii) 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 αv/β3 인테그린 (그의 알파 또는 베타 서브유닛 포함) (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); (iv) 성장 인자, 예컨대 VEGF; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C, BR3, c-met, 조직 인자, β7 등; 및 (v) 세포 표면 및 막횡단 종양-연관 항원 (TAA)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
달리 나타내지 않는 한, 용어 "모노클로날 항체 4D5"는 뮤린 4D5 항체 (ATCC CRL 10463)의 항원 결합 잔기 또는 이로부터 유래된 항원 결합 잔기를 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 모노클로날 항체 4D5는 뮤린 모노클로날 항체 4D5 또는 그의 변이체, 예컨대 인간화 4D5일 수 있다. 예시적인 인간화 4D5 항체는 미국 특허 번호 5821337에서와 같은 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 (트라스투주맙, 헤르셉틴(HERCEPTIN)®)을 포함한다.
용어 "치료하다" 및 "치료"는 치유적 치료, 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭하고, 이것의 목적은 바람직하지 않은 생리적 변화 또는 장애, 예컨대 암의 발생 또는 확산을 방지하거나 지연시키는 것 (줄이는 것)이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 바람직한 임상 결과는 검출가능하든 검출불가능하든, 증상의 경감, 질환 정도의 약화, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 감속 또는 지연, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 (부분적이든 전체적이든)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우에 예상되는 생존에 비해 생존을 연장시키는 것을 의미할 수도 있다. 치료를 필요로 하는 대상체는 이미 해당 상태 또는 장애를 갖는 대상체 뿐만 아니라 이러한 상태 또는 장애에 걸리기 쉬운 대상체 또는 이러한 상태 또는 장애를 방지하고자 하는 대상체를 포함한다.
용어 "치료 유효량"은 포유동물에서 질환 또는 장애의 치료에 효과적인 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 치료 유효량의 약물은 암 세포의 수 감소, 종양 크기의 감소, 말초 기관으로의 암 세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도 지연시키고 바람직하게는 정지시킴), 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 지연시키고 바람직하게는 정지시킴), 종양 성장의 어느 정도의 억제, 및/또는 암과 연관된 증상 중 하나 이상의 어느 정도의 경감을 유도할 수 있다. 약물은, 존재하는 암 세포의 성장을 방지하고/거나 존재하는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법의 경우, 효능은 예를 들어 질환 진행까지의 시간 (TTP)을 평가하고/거나 반응률 (RR)을 결정하여 측정될 수 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. "종양"은 하나 이상의 암성 세포를 포함한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성종양을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평세포암 (예를 들어, 상피 편평세포암), 폐암, 예를 들어 소세포 폐암, 비소세포 폐암 ("NSCLC"), 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포성암, 위암, 예를 들어 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 뿐만 아니라 두경부암을 포함한다.
"ErbB-발현 암"은 세포 표면에 존재하는 ErbB 단백질을 갖는 세포를 포함하는 것이다. "ErbB2-발현 암"은 세포 표면에 충분한 수준의 ErbB2를 생산하여 항-ErbB2 항체가 그에 결합할 수 있고 그 암에 대해 치료 효과를 가질 수 있는 것이다.
항원성 수용체를 "과다발현하는" 암은 동일한 조직 유형의 비암성 세포에 비해, 그의 세포 표면에 상당히 높은 수준의 수용체, 예컨대 ErbB2를 갖는 것이다. 이러한 과다발현은 유전자 증폭에 의해 또는 증가된 전사 또는 번역에 의해 초래될 수 있다. 수용체 과다발현은 세포 표면 상에 존재하는 수용체 단백질의 증가된 수준을 평가함으로써 진단 또는 예후 검정 (예를 들어, 면역조직화학 검정; IHC를 통함)에서 결정할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 예를 들어 형광 계내 혼성화 (FISH; WO 98/45479 참조), 서던 블롯팅 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예컨대 실시간 정량적 PCR (RT-PCR)을 통해 세포에서 수용체-코딩 핵산의 수준을 측정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 60C, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예컨대 소분자 독소, 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 예를 들어 그의 합성 유사체 및 유도체를 포함한다.
"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 필라멘트형 파지, 입자의 표면 상의 코트 단백질에 대한 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 한 가지 유용성은 무작위화된 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 표적 분자에 높은 친화도로 결합하는 서열에 대해 빠르고 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 파지 상의 펩티드 및 단백질 라이브러리의 디스플레이는 특이적 결합 특성을 갖는 것에 대해 수백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 다가 파지 디스플레이 방법은 전형적으로 필라멘트형 파지의 pIII 또는 pVIII에의 융합을 통해 소형 무작위 펩티드 및 소형 단백질을 디스플레이하는데 사용된다 (문헌 [Wells and Lowman, (1992) Curr. Opin. Struct. Biol., 3:355-362], 및 여기에 인용된 참고문헌). 1가 파지 디스플레이에서, 단백질 또는 펩티드 라이브러리는 파지 코트 단백질 또는 그의 부분에 융합되고, 야생형 단백질의 존재 하에 낮은 수준에서 발현된다. 결합력 효과는 다가 파지에 비해 감소되어, 분류가 내인성 리간드 친화도를 기반으로 하고, DNA 조작을 간소화시키는 파지미드 벡터가 사용된다. 문헌 [Lowman and Wells, Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3:205-0216 (1991)]. 파지 디스플레이는 항체-유사 분자를 생산하기 위한 기술을 포함한다 (문헌 [Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, p627-628; Lee et al.]).
"파지미드"는 박테리아 복제 기점, 예를 들어 ColE1, 및 박테리오파지의 유전자간 영역의 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 파지미드는 필라멘트형 박테리오파지 및 람다형 박테리오파지를 포함하는 임의의 공지된 박테리오파지에서 사용될 수 있다. 이러한 플라스미드는 또한 일반적으로 항생제 내성에 대한 선택 마커를 함유할 것이다. 이들 벡터 내로 클로닝된 DNA 절편은 플라스미드로서 증식될 수 있다. 이들 벡터를 보유하는 세포에 파지 입자의 생산에 필요한 모든 유전자가 제공되는 경우, 플라스미드의 복제 방식이 롤링 써클 복제로 변화되어 플라스미드 DNA 및 패키지 파지 입자의 1개 가닥 카피를 생성시킨다. 파지미드는 감염성 또는 비-감염성 파지 입자를 형성할 수 있다. 이러한 용어는, 유전자 융합체로서 이종 폴리펩티드 유전자에 연결된 파지 코트 단백질 유전자 또는 그의 단편을 함유하여 상기 이종 폴리펩티드가 파지 입자의 표면 상에 디스플레이되도록 하는 파지미드를 포함한다.
"링커", "링커 단위" 또는 "연결하다"는 항체를 약물 모이어티에 공유 부착시키는 공유 결합 또는 원자의 쇄를 포함하는 화학적 모이어티를 의미한다. 다양한 실시양태에서, 링커는 L로 표시된다. 링커는 2가 라디칼, 예컨대 알킬디일, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 모이어티, 예컨대: -(CR2)nO(CR2)n-, 알킬옥시의 반복 단위 (예를 들어, 폴리에틸렌옥시, PEG, 폴리메틸렌옥시) 및 알킬아미노 (예를 들어, 폴리에틸렌아미노, 제파민(Jeffamine)TM); 및 이산 에스테르 및 아미드, 예를 들어 숙시네이트, 숙신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트 및 카프로아미드를 포함한다.
용어 "표지"는 항체에 공유 부착될 수 있고, 하기 기능을 하는 임의의 모이어티를 의미한다: (i) 검출 가능한 신호를 제공하거나; (ii) 제2 표지와 상호작용하여 제1 또는 제2 표지에 의해 제공되는 검출가능한 신호, 예를 들어 FRET (형광 공명 에너지 전달)를 변형시키거나; (iii) 항원 또는 리간드와의 상호작용을 안정화시키거나 또는 이들과의 결합 친화도를 증가시키거나; (iv) 전하, 소수성, 외형 또는 다른 물리적 파라미터에 의해 이동성, 예를 들어 전기영동 이동성 또는 세포-투과성에 영향을 미치거나; 또는 (v) 포획 모이어티를 제공하여 리간드 친화도, 항체/항원 결합, 또는 이온 착화를 조정함.
본원에 사용된 입체화학 정의 및 규정은 일반적으로 문헌 [S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; 및 Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York]에 따른다. 많은 유기 화합물은 광학 활성 형태로 존재하며, 즉 이들은 평면-편광의 평면을 회전시키는 능력을 갖는다. 광학 활성 화합물을 기재하는데 있어서, 접두어 D 및 L, 또는 R 및 S는 키랄 중심(들)에 대한 분자의 절대 배위를 나타내는데 사용된다. 접두어 d 및 l, 또는 (+) 및 (-)는 화합물에 의한 평면-편광 회전의 표시를 나타내는데 사용되며, (-) 또는 l은 화합물이 좌선성임을 의미한다. (+) 또는 d의 접두어가 사용되는 화합물은 우선성이다. 주어진 화학 구조에 있어서, 이러한 입체이성질체는 이들이 서로의 거울상이라는 점을 제외하고는 동일하다. 특정 입체이성질체가 또한 거울상이성질체라고 지칭될 수 있으며, 이러한 이성질체들의 혼합물은 종종 거울상이성질체 혼합물이라고 지칭된다. 거울상이성질체들의 50:50 혼합물은 라세미 혼합물 또는 라세미체라고 지칭되며, 이것은 화학 반응 또는 방법에서 입체선택성 또는 입체특이성이 없는 경우에 생성될 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세미체"는 광학 활성이 없는, 2개의 거울상이성질체 종의 등몰 혼합물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 어구 "제약상 허용되는 염"은 ADC의 제약상 허용되는 유기 또는 무기 염을 지칭한다. 예시적인 염은 술페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 니트레이트, 비술페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트 및 파모에이트 (즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-히드록시-3-나프토에이트)) 염을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 제약상 허용되는 염은 또 다른 분자, 예컨대 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 다른 반대이온의 내포를 포함할 수 있다. 반대이온은 모 화합물상의 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 또한, 제약상 허용되는 염은 그의 구조 내에 1개 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 여러 개의 하전된 원자가 제약상 허용되는 염의 일부인 경우에는 다수 개의 반대이온을 가질 수 있다. 따라서, 제약상 허용되는 염은 1개 이상의 하전된 원자 및/또는 1개 이상의 반대이온을 가질 수 있다.
"제약상 허용되는 용매화물"은 하나 이상의 용매 분자 및 ADC의 회합체를 지칭한다. 제약상 허용되는 용매화물을 형성하는 용매의 예는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸 아세테이트, 아세트산 및 에탄올아민을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
<시스테인 조작된 항체>
본 발명의 화합물은 야생형 또는 모 항체의 1개 이상의 아미노산이 시스테인 아미노산으로 대체된 시스테인 조작된 항체를 포함한다. 임의의 형태의 항체를 상기와 같이 조작, 즉 돌연변이시킬 수 있다. 예를 들어, 모 Fab 항체 단편을 조작하여 본원에서 "티오Fab"라 지칭되는 시스테인 조작된 Fab를 형성할 수 있다. 유사하게, 모 모노클로날 항체를 조작하여 "티오Mab"를 형성할 수 있다. 티오Fab에서는 단일 부위 돌연변이가 단일 조작된 시스테인 잔기를 생성하는 반면, 티오Mab에서는 단일 부위 돌연변이가 2개의 조작된 시스테인 잔기를 생성하는데, 이는 IgG 항체의 이량체 특성 때문이라는 것을 인지해야 한다. 대체된 ("조작된") 시스테인 (Cys) 잔기를 수반한 돌연변이체를 대상으로 하여, 새롭게 도입되고 조작시킨 시스테인 티올 기의 반응성을 평가한다. 티올 반응성 값은 0 내지 1.0 범위의 상대적인 수치 간격이고, 임의의 시스테인 조작된 항체에 대해 측정할 수 있다. 본 발명의 시스테인 조작된 항체의 티올 반응성 값은 0.6 내지 1.0; 0.7 내지 1.0; 또는 0.8 내지 1.0의 범위 내이다.
본 발명의 설계, 선택 및 제조 방법을 이용하여, 친전자성 관능기와 반응성인 시스테인 조작된 항체로 만들 수 있다. 이러한 방법을 통해, 지정, 설계된 선택적인 부위에 약물 분자를 갖는 항체 접합체 화합물, 예컨대 항체-약물 접합체 (ADC) 화합물을 추가로 수득할 수 있다. 항체 표면 상에서의 반응성 시스테인 잔기는 티올 반응성 기, 예컨대 말레이미드 또는 할로아세틸을 통한 약물 모이어티의 특이적인 접합을 허용한다. Cys 잔기의 티올 관능기의 말레이미드 기에 대한 친핵성 반응도는 단백질 내의 임의의 다른 아미노산 관능기, 예컨대 리신 잔기의 아미노 기 또는 N-말단 아미노 기에 비해 약 1000배 더 크다. 아이오도아세틸 및 말레이미드 시약 내의 티올 특이적 관능기는 아민 기와 반응할 수 있지만, 보다 높은 pH (>9.0) 및 보다 긴 반응 시간이 필요하다 (문헌 [Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London]).
본 발명의 시스테인 조작된 항체는 바람직하게는 그의 야생형 모 항체 대응물의 항원 결합 능력을 유지한다. 따라서, 시스테인 조작된 항체는 바람직하게는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 항원은 예를 들어 종양-연관 항원 (TAA), 세포 표면 수용체 단백질 및 다른 세포 표면 분자, 막횡단 단백질, 신호전달 단백질, 세포 생존 조절 인자, 세포 증식 조절 인자, 조직 발달 또는 분화와 연관된 분자 (예를 들어, 조직 발달 또는 분화에 기능적으로 기여하는 것으로 알려져 있거나 추정되는 분자), 림포카인, 시토카인, 세포 주기 조절에 관련된 분자, 혈관형성에 관련된 분자 및 혈관신생에 연관된 분자 (예를 들어, 혈관신생에 기능적으로 기여하는 것으로 알려져 있거나 추정되는 분자)를 포함한다. 종양-연관 항원은 클러스터 분화 인자 (즉, CD 단백질)일 수 있다. 시스테인 조작된 항체가 결합할 수 있는 항원은 상기 언급된 카테고리 중 하나의 하위세트의 구성원일 수 있고, 여기서 상기 카테고리의 다른 하위세트(들)는 (관심 항원과 관련하여) 특징적인 특성을 갖는 다른 분자/항원을 포함한다.
모 항체는 또한 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 (트라스투주맙, 헤르셉틴®) (명백하게 본원에 참고로 포함된 US 5821337의 표 3에 기재된 바와 같음); 인간화 520C9 (WO 93/21319) 및 본원에 기재된 바와 같은 인간화 2C4 항체로부터 선택된 인간화 항체일 수 있다.
본 발명의 시스테인 조작된 항체는 티올-반응성 시약과 부위-특이적으로 및 효율적으로 커플링될 수 있다. 티올-반응성 시약은 다관능성 링커 시약, 포획, 즉 친화도, 표지 시약 (예를 들어, 비오틴-링커 시약), 검출 표지 (예를 들어, 형광단 시약), 고체 상 고정 시약 (예를 들어, 세파로스(SEPHAROSE)TM, 폴리스티렌, 또는 유리), 또는 약물-링커 중간체일 수 있다. 티올-반응성 시약의 한 가지 예는 N-에틸 말레이미드 (NEM)이다. 예시적 실시양태에서, 티오Fab와 비오틴-링커 시약의 반응은 조작된 시스테인 잔기의 존재 및 반응성이 그에 의해 검출 및 측정될 수 있는 비오티닐화 티오Fab를 제공한다. 티오Fab를 다관능성 링커 시약과 반응시키면 관능화 링커를 수반한 티오Fab가 제공되는데, 이를 약물 부분 시약 또는 다른 표지와 추가로 반응시킬 수 있다. 티오Fab와 약물-링커 중간체의 반응은 티오Fab 약물 접합체를 제공한다.
본원에 기재된 예시적인 방법은 일반적으로 항체의 확인 및 생산에, 및 보다 일반적으로 본원에서 기재된 설계 및 스크리닝 단계의 적용을 통해 다른 단백질에 적용될 수 있다.
이러한 접근법은 반응성 기가, 예를 들어 말레이미드, 아이오도아세트아미드, 피리딜 디술피드, 또는 다른 티올-반응성 접합 파트너인 다른 티올-반응성 작용제의 접합에 적용될 수 있다 (문헌 [Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671). 파트너는 세포독성제 (예를 들어, 독소, 예컨대 독소루비신 또는 백일해 독소), 형광단, 예컨대 플루오레세인 또는 로다민과 같은 형광 염료, 영상화 또는 방사선 요법 금속에 대한 킬레이팅제, 펩티딜 또는 비-펩티딜 표지 또는 검출 태그, 또는 제거-변형제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜의 다양한 이성질체, 제3 성분에 결합하는 펩티드, 또는 또 다른 탄수화물 또는 친지성 작용제일 수 있다.
본원에서 예시적인 항체 단편, hu4D5Fabv8 상에서 확인된 부위는 주로, 모든 종의 항체 전반에 걸쳐 잘 보존되는 항체의 불변 도메인 내에 있다. 이들 부위는 특이적 항체 구조에 관한 구조적 설계 또는 지식을 추가로 필요로 하지 않으면서, 및 항체의 가변 도메인에 대한 고유의 항원 결합 특성을 간섭하지 않으면서도 다른 항체에 광범위하게 적용가능해야 한다.
암을 치료하는 데에 유용할 수 있는 시스테인 조작된 항체는 세포 표면 수용체 및 종양-연관 항원 (TAA)에 대한 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 항체는 네이키드 항체 (약물 또는 표지 모이어티에 접합되지 않음)로서 또는 화학식 I 항체-약물 접합체 (ADC)로서 사용될 수 있다. 종양-연관 항원은 당업계에 공지되어 있고, 당업계에 널리 공지되어 있는 방법 및 정보를 이용하여 항체를 생성시키는 데에 사용하기 위해 제조할 수 있다. 암 진단 및 요법을 위한 효과적인 세포 표적을 발견하기 위한 시도에서, 연구자들은 하나 이상의 정상적인 비-암성 세포(들)에 비해 하나 이상의 특정한 유형(들)의 암 세포의 표면 상에서 특이적으로 발현되는 막횡단 또는 다른 종양-연관 폴리펩티드를 확인하고자 하였다. 종종, 이러한 종양-연관 폴리펩티드는 비-암성 세포의 표면 상에서와 비교하여 암 세포의 표면 상에서 더 풍부하게 발현된다. 이러한 종양-연관 세포 표면 항원 폴리펩티드의 확인을 통해, 항체-기반 요법을 통해 파괴시킬 암 세포를 특이적으로 표적화하는 능력이 생성되었다.
TAA의 예는 하기 열거된 TAA (1)-(36)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 편의상, 이러한 항원에 관한 정보 (모두가 당업계에 공지되어 있음)를 하기에 기재하였고, 이것은 미국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) (NCBI)의 핵산 및 단백질 서열 확인 규정에 따른 명칭, 대안적인 명칭, 진뱅크 등록 번호 및 주요 참고문헌(들)을 포함한다. TAA (1)-(36)에 상응하는 핵산 및 단백질 서열은 공공 데이터베이스, 예컨대 진뱅크에서 이용가능하다. 항체가 표적으로 하는 종양-연관 항원은 인용된 참고문헌에서 확인되는 서열에 비해 적어도 약 70％, 80％, 85％, 90％ 또는 95％의 서열 동일성을 갖거나 인용된 참고문헌에서 발견되는 서열을 갖는 TAA와 실질적으로 동일한 생물학적 특성 또는 특징을 나타내는 모든 아미노산 서열 변이체 및 이소형을 포함한다. 예를 들어, 변이체 서열을 갖는 TAA는 일반적으로 열거된 상응하는 서열을 갖는 TAA에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에서 구체적으로 언급된 참고문헌에서의 서열 및 개시내용은 명백하게 참고로 포함된다.
<종양-연관 항원 (1)-(36)>:
(1) BMPR1B (골 형태발생 단백질 수용체-유형 IB, 진뱅크 등록 번호 NM_001203) ten Dijke,P., et al. Science 264 (5155):101-104 (1994), Oncogene 14 (11):1377-1382 (1997)); WO2004063362 (청구항 2); WO2003042661 (청구항 12); US2003134790-A1 (페이지 38-39); WO2002102235 (청구항 13; 페이지 296); WO2003055443 (페이지 91-92); WO200299122 (실시예 2; 페이지 528-530); WO2003029421 (청구항 6); WO2003024392 (청구항 2; 도 112); WO200298358 (청구항 1; 페이지 183); WO200254940 (페이지 100-101); WO200259377(페이지 349-350); WO200230268 (청구항 27; 페이지 376); WO200148204 (실시예; 도 4); NP_001194 골 형태발생 단백질 수용체, 유형 IB /pid=NP_001194.1. 상호-참조: MIM:603248; NP_001194.1; AY065994
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, 진뱅크 등록 번호 NM_003486) Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267-11273); WO2004048938 (실시예 2); WO2004032842 (실시예 IV); WO2003042661 (청구항 12); WO2003016475 (청구항 1); WO200278524 (실시예 2); WO200299074 (청구항 19; 페이지 127-129); WO200286443 (청구항 27; 페이지 222, 393); WO2003003906 (청구항 10; 페이지 293); WO200264798 (청구항 33; 페이지 93-95); WO200014228 (청구항 5; 페이지 133-136); US2003224454 (도 3); WO2003025138 (청구항 12; 페이지 150); NP_003477 용질 캐리어 패밀리 7 (양이온성 아미노산 수송체, y+시스템), 구성원 5 /pid=NP_003477.3 - 호모 사피엔스; 상호-참조: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923; NM_003486_1
(3) STEAP1 (전립선의 6회 막횡단 상피 항원, 진뱅크 등록 번호 NM_012449); Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25):14523-14528); WO2004065577 (청구항 6); WO2004027049 (도 1L); EP1394274 (실시예 11); WO2004016225 (청구항 2); WO2003042661 (청구항 12); US2003157089 (실시예 5); US2003185830 (실시예 5); US2003064397 (도 2); WO200289747 (실시예 5; 페이지 618-619); WO2003022995 (실시예 9; 도 13A, 실시예 53; 페이지 173, 실시예 2; 도 2A); NP_036581 전립선의 6회 막횡단 상피 항원 상호-참조: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1
(4) 0772P (CA125, MUC16, 진뱅크 등록 번호 AF361486); J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001)); WO2004045553 (청구항 14); WO200292836 (청구항 6; 도 12); WO200283866 (청구항 15; 페이지 116-121); US2003124140 (실시예 16); 상호-참조: GI:34501467; AAK74120.3; AF361486_1
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, 거핵구 증강 인자, 메소텔린, 진뱅크 등록 번호 NM_005823) Yamaguchi, N., et al. Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20):11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1):136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995)); WO2003101283 (청구항 14); (WO2002102235 (청구항 13; 페이지 287-288); WO2002101075 (청구항 4; 페이지 308-309); WO200271928 (페이지 320-321); WO9410312 (페이지 52-57); 상호-참조: MIM:601051; NP_005814.2; NM_005823_1
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 캐리어 패밀리 34 (인산나트륨), 구성원 2, 유형 II 나트륨-의존성 포스페이트 수송체 3b, 진뱅크 등록 번호 NM_006424) J. Biol. Chem. 277 (22):19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582); WO2004022778 (청구항 2); EP1394274 (실시예 11); WO2002102235 (청구항 13; 페이지 326); EP875569 (청구항 1; 페이지 17-19); WO200157188 (청구항 20; 페이지 329); WO2004032842 (실시예 IV); WO200175177 (청구항 24; 페이지 139-140); 상호-참조: MIM:604217; NP_006415.1; NM_006424_1
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, sema 도메인, 7개 트롬보스폰딘 반복부 (유형 1 및 유형 1-유사), 막횡단 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B, 진뱅크 등록 번호 AB040878); Nagase T., et al. (2000) DNA Res. 7 (2):143-150); WO2004000997 (청구항 1); WO2003003984 (청구항 1); WO200206339 (청구항 1; 페이지 50); WO200188133 (청구항 1; 페이지 41-43, 48-58); WO2003054152 (청구항 20); WO2003101400 (청구항 11); 등록: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95969.1. Genew; HGNC:10737
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자, 진뱅크 등록 번호 AY358628); Ross et al. (2002) Cancer Res. 62:2546-2553; US2003129192 (청구항 2); US2004044180 (청구항 12); US2004044179 (청구항 11); US2003096961 (청구항 11); US2003232056 (실시예 5); WO2003105758 (청구항 12); US2003206918 (실시예 5); EP1347046 (청구항 1); WO2003025148 (청구항 20); 상호-참조: GI:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1
(9) ETBR (엔도텔린 유형 B 수용체, 진뱅크 등록 번호 AY275463); Nakamuta M., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai H., et al. Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al. J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991; Elshourbagy N.A., et al. J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993; Haendler B., et al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M., et al. Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C., et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y., et al. Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997; Verheij J.B., et al. Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002; Hofstra R.M.W., et al. Eur. J. Hum. Genet. 5, 180-185, 1997; Puffenberger E.G., et al. Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie T., et al., Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A., et al. Hum. Mol. Genet. 5:351-354, 1996; Amiel J., et al. Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.W., et al. Nat. Genet. 12, 445-447, 1996; Svensson P.J., et al. Hum. Genet. 103, 145-148, 1998; Fuchs S., et al. Mol. Med. 7, 115-124, 2001; Pingault V., et al. (2002) Hum. Genet. 111, 198-206; WO2004045516 (청구항 1); WO2004048938 (실시예 2); WO2004040000 (청구항 151); WO2003087768 (청구항 1); WO2003016475 (청구항 1); WO2003016475 (청구항 1); WO200261087 (도 1); WO2003016494 (도 6); WO2003025138 (청구항 12; 페이지 144); WO200198351 (청구항 1; 페이지 124-125); EP522868 (청구항 8; 도 2); WO200177172 (청구항 1; 페이지 297-299); US2003109676; US6518404 (도 3); US5773223 (청구항 1a; Col 31-34); WO2004001004
(10) MSG783 (RNF124, 가설 단백질 FLJ20315, 진뱅크 등록 번호 NM_017763); WO2003104275 (청구항 1); WO2004046342 (실시예 2); WO2003042661 (청구항 12); WO2003083074 (청구항 14; 페이지 61); WO2003018621 (청구항 1); WO2003024392 (청구항 2; 도 93); WO200166689 (실시예 6); 상호-참조: LocusID:54894; NP_060233.2; NM_017763_1
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 연관 유전자 1, 전립선암 연관 단백질 1, 전립선의 6회 막횡단 상피 항원 2, 6회 막횡단 전립선 단백질, 진뱅크 등록 번호 AF455138); Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002)); WO2003087306; US2003064397 (청구항 1; 도 1); WO200272596 (청구항 13; 페이지 54-55); WO200172962 (청구항 1; 도 4B); WO2003104270 (청구항 11); WO2003104270 (청구항 16); US2004005598 (청구항 22); WO2003042661 (청구항 12); US2003060612 (청구항 12; 도 10); WO200226822 (청구항 23; 도 2); WO200216429 (청구항 12; 도 10); 상호-참조: GI:22655488; AAN04080.1; AF455138_1
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 잠재성 양이온 채널, 서브패밀리 M, 구성원 4, 진뱅크 등록 번호 NM_017636); Xu, X.Z., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19):10692-10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003)); US2003143557 (청구항 4); WO200040614 (청구항 14; 페이지 100-103); WO200210382 (청구항 1; 도 9A); WO2003042661 (청구항 12); WO200230268 (청구항 27; 페이지 391); US2003219806 (청구항 4); WO200162794 (청구항 14; 도 1A-D); 상호-참조: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017636_1
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장 인자, 진뱅크 등록 번호 NP_003203 또는 NM_003212); Ciccodicola, A., et al. EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991)); US2003224411 (청구항 1); WO2003083041 (실시예 1); WO2003034984 (청구항 12); WO200288170 (청구항 2; 페이지 52-53); WO2003024392 (청구항 2; 도 58); WO200216413 (청구항 1; 페이지 94-95, 105); WO200222808 (청구항 2; 도 1); US5854399 (실시예 2; Col 17-18); US5792616 (도 2); 상호-참조: MIM:187395; NP_003203.1; NM_003212_1
(14) CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792 진뱅크 등록 번호 M26004); Fujisaku et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118-2125); Weis J.J., et al. J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al. Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S.K., et al. (1993) J. Immunol. 150, 5311-5320; WO2004045520 (실시예 4); US2004005538 (실시예 1); WO2003062401 (청구항 9); WO2004045520 (실시예 4); WO9102536 (도 9.1-9.9); WO2004020595 (청구항 1); 등록: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1.
(15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (이뮤노글로불린-연관 베타), B29, 진뱅크 등록 번호 NM_000626 또는 11038674); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621-1625); WO2004016225 (청구항 2, 도 140); WO2003087768, US2004101874 (청구항 1, 페이지 102); WO2003062401 (청구항 9); WO200278524 (실시예 2); US2002150573 (청구항 5, 페이지 15); US5644033; WO2003048202 (청구항 1, 페이지 306 및 309); WO 99/558658, US6534482 (청구항 13, 도 17A/B); WO200055351 (청구항 11, 페이지 1145-1146); 상호-참조: MIM:147245; NP_000617.1; NM_000626_1
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (SH2 도메인 함유 포스파타제 앵커 단백질 1a), SPAP1B, SPAP1C, 진뱅크 등록 번호 NM_030764, AY358130); Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M.J., et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775; WO2004016225 (청구항 2); WO2003077836; WO200138490 (청구항 5; 도 18D-1-18D-2); WO2003097803 (청구항 12); WO2003089624 (청구항 25); 상호-참조: MIM:606509; NP_110391.2; NM_030764_1
(17) HER2 (ErbB2, 진뱅크 등록 번호 M11730); Coussens L., et al. Science (1985) 230(4730):1132-1139); Yamamoto T., et al. Nature 319, 230-234, 1986; Semba K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J.M., et al. J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns J.J., et al. J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999; Cho H.-S., et al. Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al. (1993) Genomics 15, 426-429; WO2004048938 (실시예 2); WO2004027049 (도 1I); WO2004009622; WO2003081210; WO2003089904 (청구항 9); WO2003016475 (청구항 1); US2003118592; WO2003008537 (청구항 1); WO2003055439 (청구항 29; 도 1A-B); WO2003025228 (청구항 37; 도 5C); WO200222636 (실시예 13; 페이지 95-107); WO200212341 (청구항 68; 도 7); WO200213847 (페이지 71-74); WO200214503 (페이지 114-117); WO200153463 (청구항 2; 페이지 41-46); WO200141787 (페이지 15); WO200044899 (청구항 52; 도 7); WO200020579 (청구항 3; 도 2); US5869445 (청구항 3; Col 31-38); WO9630514 (청구항 2; 페이지 56-61); EP1439393 (청구항 7); WO2004043361 (청구항 7); WO2004022709; WO200100244 (실시예 3; 도 4); 등록: P04626; EMBL; M11767; AAA35808.1. EMBL; M11761; AAA35808.1
(18) NCA (CEACAM6, 진뱅크 등록 번호 M18728); Barnett T., et al. Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:16899-16903, 2002; WO2004063709; EP1439393 (청구항 7); WO2004044178 (실시예 4); WO2004031238; WO2003042661 (청구항 12); WO200278524 (실시예 2); WO200286443 (청구항 27; 페이지 427); WO200260317 (청구항 2); 등록: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. EMBL; M18728
(19) MDP (DPEP1, 진뱅크 등록 번호 BC017023); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26):16899-16903 (2002)); WO2003016475 (청구항 1); WO200264798 (청구항 33; 페이지 85-87); JP05003790 (도 6-8); WO9946284 (도 9); 상호-참조: MIM:179780; AAH17023.1; BC017023_1
(20) IL20Rα (IL20Ra, ZCYTOR7, 진뱅크 등록 번호 AF184971); Clark H.F., et al. Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al. Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al. Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al. J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al. J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al. (2003) Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F., et al. (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010; EP1394274 (실시예 11); US2004005320 (실시예 5); WO2003029262 (페이지 74-75); WO2003002717 (청구항 2; 페이지 63); WO200222153 (페이지 45-47); US2002042366 (페이지 20-21); WO200146261 (페이지 57-59); WO200146232 (페이지 63-65); WO9837193 (청구항 1; 페이지 55-59); 등록: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320.1.
(21) 브레비칸 (BCAN, BEHAB, 진뱅크 등록 번호 AF229053); Gary S.C., et al. Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al. Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; US2003186372 (청구항 11); US2003186373 (청구항 11); US2003119131 (청구항 1; 도 52); US2003119122 (청구항 1; 도 52); US2003119126 (청구항 1); US2003119121 (청구항 1; 도 52); US2003119129 (청구항 1); US2003119130 (청구항 1); US2003119128 (청구항 1; 도 52); US2003119125 (청구항 1); WO2003016475 (청구항 1); WO200202634 (청구항 1)
(22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, 진뱅크 등록 번호 NM_004442); Chan,J. and Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000)); WO2003042661 (청구항 12); WO200053216 (청구항 1; 페이지 41); WO2004065576 (청구항 1); WO2004020583 (청구항 9); WO2003004529 (페이지 128-132); WO200053216 (청구항 1; 페이지 42); 상호-참조: MIM:600997; NP_004433.2; NM_004442_1
(23) ASLG659 (B7h, 진뱅크 등록 번호 AX092328); US20040101899 (청구항 2); WO2003104399 (청구항 11); WO2004000221 (도 3); US2003165504 (청구항 1); US2003124140 (실시예 2); US2003065143 (도 60); WO2002102235 (청구항 13; 페이지 299); US2003091580 (실시예 2); WO200210187 (청구항 6; 도 10); WO200194641 (청구항 12; 도 7b); WO200202624 (청구항 13; 도 1A-1B); US2002034749 (청구항 54; 페이지 45-46); WO200206317 (실시예 2; 페이지 320-321, 청구항 34; 페이지 321-322); WO200271928 (페이지 468-469); WO200202587 (실시예 1; 도 1); WO200140269 (실시예 3; 페이지 190-192); WO200036107 (실시예 2; 페이지 205-207); WO2004053079 (청구항 12); WO2003004989 (청구항 1); WO200271928 (페이지 233-234, 452-453); WO 0116318
(24) PSCA (전립선 줄기 세포 항원 전구체, 진뱅크 등록 번호 AJ297436); Reiter R.E., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al. Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783-788; WO2004022709; EP1394274 (실시예 11); US2004018553 (청구항 17); WO2003008537 (청구항 1); WO200281646 (청구항 1; 페이지 164); WO2003003906 (청구항 10; 페이지 288); WO200140309 (실시예 1; 도 17); US2001055751 (실시예 1; 도 1b); WO200032752 (청구항 18; 도 1); WO9851805 (청구항 17; 페이지 97); WO9851824 (청구항 10; 페이지 94); WO9840403 (청구항 2; 도 1B); 등록: O43653; EMBL; AF043498; AAC39607.1
(25) GEDA (진뱅크 등록 번호 AY260763); AAP14954 지방종 HMGIC 융합-파트너-유사 단백질 /pid=AAP14954.1 - 호모 사피엔스 (인간); WO2003054152 (청구항 20); WO2003000842 (청구항 1); WO2003023013 (실시예 3, 청구항 20); US2003194704 (청구항 45); 상호-참조: GI:30102449; AAP14954.1; AY260763_1
(26) BAFF-R (B 세포 -활성화 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3, 진뱅크 등록 번호 AF116456); BAFF 수용체 /pid=NP_443177.1 - 호모 사피엔스: Thompson, J.S., et al. Science 293 (5537), 2108-2111 (2001); WO2004058309; WO2004011611; WO2003045422 (실시예; 페이지 32-33); WO2003014294 (청구항 35; 도 6B); WO2003035846 (청구항 70; 페이지 615-616); WO200294852 (Col 136-137); WO200238766 (청구항 3; 페이지 133); WO200224909 (실시예 3; 도 3); 상호-참조: MIM:606269; NP_443177.1; NM_052945_1; AF132600
(27) CD22 (B-세포 수용체 CD22-B 이소형, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, 진뱅크 등록 번호 AK026467); Wilson et al. (1991) J. Exp. Med. 173:137-146; WO2003072036 (청구항 1; 도 1); 상호-참조: MIM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1
(28) CD79a (CD79A, CD79α, 이뮤노글로불린-연관 알파, B 세포-특이적 단백질 (Ig 베타 (CD79B)와 공유 상호작용하고, 표면 상에서 IgM 분자와 복합체를 형성하여, B-세포 분화에 관련된 신호를 변환시킴)), pI: 4.84, MW: 25028 TM: 2 [P] 유전자 염색체: 19q13.2, 진뱅크 등록 번호 NP_001774.10); WO2003088808, US20030228319; WO2003062401 (청구항 9); US2002150573 (청구항 4, 페이지 13-14); WO9958658 (청구항 13, 도 16); WO9207574 (도 1); US5644033; Ha et al. (1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531; Mueller et al. (1992) Eur. J. Biochem. 22:1621-1625; Hashimoto et al. (1994) Immunogenetics 40(4):287-295; Preud homme et al. (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1):141-146; Yu et al. (1992) J. Immunol. 148(2) 633-637; Sakaguchi et al. (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464
(29) CXCR5 (버킷 림프종 수용체 1, G 단백질-커플링된 수용체 (CXCL13 케모카인에 의해 활성화되고, 림프구 이동 및 체액 방어에서 기능하고, HIV-2 감염 및 아마도 AIDS, 림프종, 골수종, 및 백혈병의 발생에서 소정의 역할을 함)); 372 aa, pI: 8.54 MW: 41959 TM: 7 [P] 유전자 염색체: 11q23.3, 진뱅크 등록 번호 NP_001707.1); WO2004040000; WO2004015426; US2003105292 (실시예 2); US6555339 (실시예 2); WO200261087 (도 1); WO200157188 (청구항 20, 페이지 269); WO200172830 (페이지 12-13); WO200022129 (실시예 1, 페이지 152-153, 실시예 2, 페이지 254-256); WO9928468 (청구항 1, 페이지 38); US5440021 (실시예 2, col 49-52); WO9428931 (페이지 56-58); WO9217497 (청구항 7, 도 5); Dobner et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Barella et al. (1995) Biochem. J. 309:773-779
(30) HLA-DOB (MHC 클래스 II 분자 (Ia 항원)의 베타 서브유닛 (펩티드에 결합하고, 이들을 CD4+ T 림프구에 제시함)); 273 aa, pI: 6.56, MW: 30820.TM: 1 [P] 유전자 염색체: 6p21.3, 진뱅크 등록 번호 NP_002111.1); Tonnelle et al. (1985) EMBO J. 4(11):2839-2847; Jonsson et al. (1989) Immunogenetics 29(6):411-413; Beck et al. (1992) J. Mol. Biol. 228:433-441; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903; Servenius et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Beck et al. (1996) J. Mol. Biol. 255:1-13; Naruse et al. (2002) Tissue Antigens 59:512-519; WO9958658 (청구항 13, 도 15); US6153408 (Col 35-38); US5976551 (col 168-170); US6011146 (col 145-146); Kasahara et al. (1989) Immunogenetics 30(1):66-68; Larhammar et al. (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111-14119
(31) P2X5 (퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이팅 이온 채널 5, 세포외 ATP에 의해 게이팅된 이온 채널 (시냅스 전달 및 신경발생에 관련될 수 있고, 결핍은 특발성 배뇨근 불안정의 병리생리에 기여할 수 있음)); 422 aa), pI: 7.63, MW: 47206 TM: 1 [P] 유전자 염색체: 17p13.3, 진뱅크 등록 번호 NP_002552.2); Le et al. (1997) FEBS Lett. 418(1-2):195-199; WO2004047749; WO2003072035 (청구항 10); Touchman et al. (2000) Genome Res. 10:165-173; WO200222660 (청구항 20); WO2003093444 (청구항 1); WO2003087768 (청구항 1); WO2003029277 (페이지 82)
(32) CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2); 359 aa, pI: 8.66, MW: 40225, TM: 1 [P] 유전자 염색체: 9p13.3, 진뱅크 등록 번호 NP_001773.1); WO2004042346 (청구항 65); WO2003026493 (페이지 51-52, 57-58); WO200075655 (페이지 105-106); Von Hoegen et al. (1990) J. Immunol. 144(12):4870-4877; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903.
(33) LY64 (림프구 항원 64 (RP105), 류신 풍부 반복부 (LRR) 패밀리의 유형 I 막 단백질 (B-세포 활성화 및 아폽토시스를 조절하고, 기능의 손실은 전신 홍반성 루푸스를 갖는 환자에서 증가된 질환 활성과 관련됨)); 661 aa, pI: 6.20, MW: 74147 TM: 1 [P] 유전자 염색체: 5q12, 진뱅크 등록 번호 NP_005573.1); US2002193567; WO9707198 (청구항 11, 페이지 39-42); Miura et al. (1996) Genomics 38(3):299-304; Miura et al. (1998) Blood 92:2815-2822; WO2003083047; WO9744452 (청구항 8, 페이지 57-61); WO200012130 (페이지 24-26)
(34) FcRH1 (Fc 수용체-유사 단백질 1, C2 유형 Ig-유사 및 ITAM 도메인을 함유하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인에 대한 추정 수용체 (B-림프구 분화에서 소정의 역할을 할 수 있음)); 429 aa, pI: 5.28, MW: 46925 TM: 1 [P] 유전자 염색체: 1q21-1q22, 진뱅크 등록 번호 NP_443170.1); WO2003077836; WO200138490 (청구항 6, 도 18E-1-18-E-2); Davis et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777; WO2003089624 (청구항 8); EP1347046 (청구항 1); WO2003089624 (청구항 7)
(35) IRTA2 (이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 수용체 전위 연관 2, B 세포 발생 및 림프종발생에서 가능한 역할을 갖는 추정 면역수용체; 전위에 의한 유전자의 탈조절이 일부 B 세포 악성종양에서 일어남); 977 aa, pI: 6.88, MW: 106468, TM: 1 [P] 유전자 염색체: 1q21, 진뱅크 등록 번호 Human:AF343662, AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085; Mouse:AK089756, AY158090, AY506558; NP_112571.1; WO2003024392 (청구항 2, 도 97); Nakayama et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124-127; WO2003077836; WO200138490 (청구항 3, 도 18B-1-18B-2)
(36) TENB2 (TMEFF2, 토모레귤린, TPEF, HPP1, TR, 추정 막횡단 프로테오글리칸 (성장 인자의 EGF/헤레귤린 패밀리 및 폴리스타틴과 관련됨)); 374 aa, NCBI 등록: AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI RefSeq: NP_057276; NCBI 유전자: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; 진뱅크 등록 번호 AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436; WO2004074320; JP2004113151; WO2003042661; WO2003009814; EP1295944 (페이지 69-70); WO200230268 (페이지 329); WO200190304; US2004249130; US2004022727; WO2004063355; US2004197325; US2003232350; US2004005563; US2003124579; Horie et al. (2000) Genomics 67:146-152; Uchida et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602; Liang et al. (2000) Cancer Res. 60:4907-12; Glynne-Jones et al. (2001) Int J Cancer. Oct 15; 94(2):178-84.
모 항체는 또한 알부민-결합 펩티드 (ABP) 서열을 포함하는 융합 단백질일 수 있다 (문헌 [Dennis et al. (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277:35035-35043]; WO 01/45746). 본 발명의 항체는 (i) 문헌 [Dennis et al. (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043]의 표 III 및 표 IV, 35038 페이지, (ii) US 20040001827의 [0076], 및 (iii) WO 01/45746의 12 내지 13 페이지에 교시된 ABP 서열을 갖는 융합 단백질을 포함하며, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 포함된다.
<돌연변이유발>
출발 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 DNA는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법은 폴리펩티드를 코딩하기 이전에 제조된 DNA의 부위-지정 (또는 올리고뉴클레오티드-매개) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 재조합 항체의 변이체는 또한 제한 단편 조작에 의해 또는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용한 중복 연장 PCR에 의해 제조할 수 있다. 돌연변이유발 프라이머는 시스테인 코돈 대체물(들)을 코딩한다. 표준 돌연변이유발 기술은 이러한 돌연변이체 시스테인 조작된 항체를 코딩하는 DNA를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일반적인 안내는 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; 및 Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1993]에서 찾아볼 수 있다.
부위-지정 돌연변이유발은 치환 변이체, 즉 돌연변이 단백질을 제조하기 위한 한 가지 방법이다. 이 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Carter (1985) et al. Nucleic Acids Res. 13:4431-4443; Ho et al. (1989) Gene (Amst.) 77:51-59; 및 Kunkel et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488] 참조). 간략하게, DNA의 부위-지정 돌연변이유발을 수행하는데 있어서, 출발 DNA는 먼저 원하는 돌연변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 이러한 출발 DNA의 단일 가닥에 혼성화시킴으로써 변경된다. 혼성화 후에, 혼성화된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하고 출발 DNA의 단일 가닥을 주형으로서 사용하면서 DNA 폴리머라제를 사용하여 전체 제2 가닥을 합성한다. 따라서, 바람직한 돌연변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드는 생성된 이중-가닥 DNA 내에 도입된다. 부위-지정 돌연변이유발은 발현 플라스미드에서 돌연변이유발될 단백질을 발현하는 유전자 내에서 수행될 수 있고, 생성된 플라스미드는 바람직한 시스테인 대체 돌연변이의 도입을 확인하기 위해 서열분석될 수 있다 (문헌 [Liu et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:20252-20260]). 상업적으로 입수가능한, 예를 들어 퀵체인지(QuikChange)® 다중 부위-지정 돌연변이유발 키트 (스트라타진(Stratagene), 캘리포니아주 라 졸라)를 포함한 부위-지정 돌연변이유발 프로토콜 및 포맷이 존재한다.
PCR 돌연변이유발은 또한 출발 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체를 만드는데 적합하다. 문헌 [Higuchi, (1990) in PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press; Ito et al. (1991) Gene 102:67-70; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; 및 Vallette et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17:723-733]을 참조한다. 간략하게, 소량의 주형 DNA를 PCR에서 출발 물질로 사용하였을 때, 주형 DNA에서 상응하는 영역으로부터의 서열이 약간 상이한 프라이머를 사용하여, 프라이머가 주형과 상이한 위치에서만 주형 서열과 상이한 특정 DNA 단편을 비교적 대량으로 생성할 수 있다.
변이체를 제조하기 위한 또 다른 방법인 카세트 돌연변이유발은 문헌 [Wells et al. (1985) Gene 34:315-323]에 기재된 기술을 기반으로 한다. 출발 물질은 돌연변이시킬 출발 폴리펩티드 DNA를 포함하는 플라스미드 (또는 다른 벡터)이다. 돌연변이시킬 출발 DNA 내의 코돈(들)이 확인된다. 확인된 돌연변이 부위(들)의 각각의 측면 상에 특징적인 제한 엔도뉴클레아제 부위가 존재해야 한다. 이러한 제한 부위가 존재하지 않으면, 이들은 이들을 출발 폴리펩티드 DNA 내의 적절한 위치에 도입하기 위해 상기 기재된 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이유발 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 플라스미드 DNA는 선형화를 위해 상기 부위에서 절단된다. 제한 부위 사이의 DNA의 서열을 코딩하지만 바람직한 돌연변이(들)를 함유하는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 표준 절차를 이용하여 합성되고, 여기서 올리고뉴클레오티드의 2개의 가닥은 개별적으로 합성된 후, 표준 기술을 이용하여 함께 혼성화된다. 올리고뉴클레오티드는 포스포르아미다이트 합성 방법에 의해 제조된다 (US 4415732; US 4458066; 문헌 [Beaucage, S. and Iyer, R. (1992) "Advances in the synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach", Tetrahedron 48:2223-2311]). 이 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 카세트로서 지칭된다. 이 카세트는 플라스미드에 직접 라이게이션될 수 있도록 선형화된 플라스미드의 말단과 혼화성인 5' 및 3' 말단을 갖도록 설계된다. 이 플라스미드는 이제 돌연변이된 DNA 서열을 함유한다. 코딩된 시스테인 대체를 포함하는 돌연변이체 DNA는 DNA 서열분석에 의해 확인될 수 있다.
단일 돌연변이는 또한 PCR 기반 돌연변이유발에 의해 주형으로서 이중 가닥 플라스미드 DNA를 사용하는 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이유발에 의해 생성된다 (문헌 [Sambrook and Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; Zoller et al. (1983) Methods Enzymol. 100:468-500; Zoller, M.J. and Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500]).
본 발명에서, M13 파지 상에 디스플레이된 hu4D5Fabv8 (문헌 [Gerstner et al. (2002) "Sequence Plasticity In The Antigen-Binding Site Of A Therapeutic Anti-HER2 Antibody", J Mol Biol. 321:851-62])을 실험에서 모델 시스템으로 사용하였다. 시스테인 돌연변이는 hu4D5Fabv8-파지, hu4D5Fabv8, 및 ABP-hu4D5Fabv8 구축물에 도입된다. hu4D5-티오Fab-파지 프렙을 이전에 기재된 바와 같은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 침전 방법을 이용하여 수행하였다 (문헌 [Lowman, Henry B. (1998) Methods in Molecular Biology (Totowa, New Jersey) 87 (Combinatorial Peptide Library Protocols) 249-264]).
<PHESELECTOR 검정>
PHESELECTOR (반응성 티올의 선택을 위한 파지 ELISA) 검정은 ELISA 파지 포맷으로 항체 내의 반응성 시스테인 기의 검출을 허용한다. 관심 단백질 (예를 들어, 항체)을 웰 표면 상에 코팅하고, 이어서 파지 입자와 인큐베이션한 후에 흡광도를 검출하면서 HRP 표지된 2차 항체와 인큐베이션하는 방법이 실시예 2에 상세하게 기재되어 있다. 파지 상에 디스플레이된 돌연변이체 단백질은 신속하고 강력한 고효율 방식으로 스크리닝될 수 있다. 시스테인 조작된 항체의 라이브러리를 제조하여, 항체 또는 다른 단백질의 무작위 단백질-파지 라이브러리로부터 유리 Cys 혼입을 위한 적절하게 반응성인 부위를 확인하기 위한 것과 동일한 방법을 사용하여 결합에 대해 선택할 수 있다. 이 기술은 파지 상에 디스플레이된 시스테인 돌연변이체 단백질을 또한 티올-반응성인 친화성 시약 또는 리포터 기와 반응시키는 것을 포함한다. 도 8은 Fab 또는 티오Fab의 HER2에의 결합 (상부) 및 비오티닐화 티오Fab의 스트렙타비딘에의 결합 (하부)을 도시하는 개략적 표현에 의해 PHESELECTOR 검정을 설명한다.
<단백질 발현 및 정제>
시스테인 조작된 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리하여 서열분석할 수 있다. 하이브리도마 세포가 이러한 DNA의 공급원으로 기능한다. DNA가 일단 단리되면, 이것을 발현 벡터에 위치시킬 수 있고, 이어서 이를 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 항체 단백질을 달리 생산하지는 않는 다른 포유동물 숙주 세포, 예컨대 골수종 세포 (US 5807715; US 2005/0048572; US 2004/0229310)에 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성물을 수득할 수 있다. hu4D5Fabv8 시스테인 조작된 항체의 수율은 야생형 hu4D5Fabv8과 유사하였다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 종설 논문은 문헌 [Skerra et al. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 및 Plueckthun (1992) Immunol. Revs. 130:151-188]을 포함한다.
설계 및 선택 후에, 고도로 반응성인 쌍을 이루지 않은 Cys 잔기를 갖는 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 티오Fab는 (i) 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이, 시스템 또는 포유동물 세포 배양 시스템 (WO 01/00245), 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)에서의 발현; 및 (ii) 통상적인 단백질 정제 기술을 이용한 정제 (문헌 [Lowman et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(17):10982-10988])에 의해 생산될 수 있다.
34B8, 비-저해제 이. 콜라이 균주에서 유도시에 티오Fab가 발현되었다 (문헌 [Baca et al. (1997) Journal Biological Chemistry 272(16):10678-84]). 실시예 3a를 참조한다. 수확된 세포 펠릿을 PBS (포스페이트 완충 염수)에 재현탁시키고, 전체 세포 용해를 마이크로플루이다이저를 통해 통과시켜 수행하고, 티오Fab를 단백질 G 세파로스TM (아머샴(Amersham))를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 티오Fab를 상기 기재된 바와 같이 비오틴-PEO-말레이미드와 접합시키고, 비오티닐화-티오Fab를 유리 비오틴-PEO-말레이미드 및 티오Fab의 올리고머 분획을 제거하는 슈퍼덱스-200TM (아머샴) 겔 여과 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다.
<질량 분광법 분석>
액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 질량 분광측정 (LC-ESI-MS) 분석은 비오틴 접합된 Fab의 정확한 분자량 결정을 위해 사용하였다 (문헌 [Cole, R.B. Electro Spray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation And Applications. (1997) Wiley, New York]). 비오티닐화 hu4D5Fabv8 (A121C) 펩티드의 아미노산 서열은 트립신 소화에 이어 LC-ESI-탠덤 MS 분석에 의해 결정하였다 (표 4, 실시예 3b).
항체 Fab 단편 hu4D5Fabv8은 10개의 Cys 잔기 (5개는 경쇄 상에 있고, 5개는 중쇄 상에 있음)를 포함하는 약 445개 아미노산 잔기를 함유한다. 인간화 4D5 가변 단편 (Fv4D5)의 고해상도 구조가 확립되었다 (문헌 [Eigenbrot et al. "X-Ray Structures Of The Antigen-Binding Domains From Three Variants Of Humanized Anti-P185her2 Antibody 4D5 And Comparison With Molecular Modeling" (1993) J Mol Biol. 229:969-995] 참조). 모든 Cys 잔기는 디술피드 결합의 형태로 존재하고, 이에 따라 이들 잔기는 (환원제로 처리되지 않는 한) 약물-말레이미드와의 접합체에 대한 임의의 반응성 티올 기를 갖지 않는다. 따라서, 새롭게 조작된 Cys 잔기는 쌍을 이루지 않은 채로 유지되어 친전자성 링커 시약 또는 약물-링커 중간체, 예를 들어 약물-말레이미드와 반응, 즉 접합할 수 있다. 도 1a는 X-선 결정 좌표에 의해 유래된 hu4D5Fabv8 항체 단편의 3차원 표현을 보여준다. 중쇄 및 경쇄의 조작된 Cys 잔기의 구조 위치는 순차적 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 이 순차적 넘버링 시스템은 도 1b에 따른 트라스투주맙의 4d5v7fabH 변이체에 대한 카바트 넘버링 시스템 (문헌 [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD])과 상관관계가 있으며, a, b, c로 표시된 삽입에 의한 카바트 넘버링 방식 (하부 열)과 상이한 N-말단에서 출발하는 순차적 넘버링 방식 (상부 열)을 보여준다. 카바트 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 이에 대한 삽입에 상응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 시스테인 조작된 중쇄 변이체 부위는 하기 차트에서 순차적 넘버링 및 카바트 넘버링 방식에 의해 확인된다:
Figure 112012101685569-pct00001
M13 파지미드-Cys 돌연변이체 Fab (도 3a 및 3b)는 Fab 단백질에 비해 빠르게 스크리닝될 수 있다. 파지미드-티오Fab의 항원 및 스트렙타비딘에의 결합은 실시예 2에 기재되고 도 8에 도시된 바와 같이 각각 HER2 및 스트렙타비딘을 ELISA 플레이트 상에 코팅한 후에 항-Fab-HRP (양고추냉이 퍼옥시다제)로 프로빙하여 시험할 수 있다. 이 방법은 조작된 Cys 잔기/접합된 비오틴 분자에 의한 티올 기의 반응성 및 항원 결합에 대한 효과의 동시 모니터링을 허용한다. 또한, 이 방법은 M13 파지 상에 디스플레이된 임의의 단백질에 대해 반응성 티올 기를 스크리닝하는데 적용할 수 있다. 접합된 또는 접합되지 않은 파지미드-티오Fab는 간단한 PEG 침전에 의해 정제된다.
인간화 4D5의 항원-결합 단편 (hu4D5Fab)은 이. 콜라이에서 잘 발현되고, 박테리오파지 상에 디스플레이된다 (문헌 [Garrard et al. (1993) Gene 128:103-109]). 항체 Fab 단편 hu4D5Fabv8은 티올 반응성을 프로빙하기 위한 ELISA 기반 검정에서 모델 시스템으로서 M13 파지 상에 디스플레이된다. 도 8은 비오티닐화 티오Fab 파지 및 항-파지 HRP 항체의 HER2 (상부) 및 스트렙타비딘 (하부)에의 결합을 묘사하는, PHESELECTOR 검정의 그래프 표현이다. 5개 아미노산 잔기 (L-Ala43, H-Ala40, H-Ser119, H-Ala121 및 H-Ser122)를 처음에 항원 결합 표면으로부터 멀리 떨어진 것으로 결정 구조 정보로부터 선택하였다 (문헌 [Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229:969-995]). 단백질 데이터베이스 X-선 결정 구조를 1FVC로 지칭하였다. Cys 잔기를 부위 지정 돌여변이유발에 의해 이들 위치에서 조작하였다. 티오Fab-파지 제제를 단리하고, 비오티닐화 시약과 반응시켰다.
비오틴 접합된 및 접합되지 않은 변이체를 HRP (양고추냉이 퍼옥시다제)-접합된 항-파지 항체를 사용하는 ELISA 기반 PHESELECTOR 검정 (도 8, 실시예 2)을 이용하여 HER2 및 스트렙타비딘 결합에 대해 시험하였다. 비-비오티닐화 파지-hu4D5Fabv8 (도 2a) 및 비오티닐화 파지-hu4D5Fabv8 (도 2b)의 BSA (백색 박스), HER2 (회색 박스) 또는 스트렙타비딘 (흑색 박스)과의 상호작용을 항-M13-양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 항체를 통해 표준 HRP 반응의 발생 및 450 nm에서의 흡광도 측정에 의해 모니터링하였다. 비색계 기질의 턴오버에 의해 생성된 흡광도를 450 nm에서 측정하였다. 티오Fab의 HER2와의 반응성은 항원 결합을 측정한다. 티오Fab의 스트렙타비딘과의 반응성은 비오티닐화 정도를 측정한다. 티오Fab의 BSA와의 반응성은 비특이적 상호작용에 대한 음성 대조군이다. 도 2a에서 나타난 바와 같이, 모든 티오Fab-파지 변이체는 야생형 hu4D5Fabv8-파지에 비해 HER2에 대해 유사한 결합을 나타낸다. 또한, 비오틴과의 접합은 HER2에의 티오Fab 결합을 방해하지 않는다 (도 2b).
놀랍고도 예상치 못하게, 티오Fab-파지 샘플은 다양한 수준의 스트렙타비딘 결합 활성을 나타내었다. 모든 시험된 파지-티오Fab로부터, A121C 시스테인 조작된 항체는 최대 티올 반응성을 나타내었다. 야생형 hu4D5Fabv8-파지를 동일한 양의 비오틴-말레이미드와 인큐베이션하더라도, 이러한 파지는 거의 스트렙타비딘 결합을 나타내지 않으며, 이는 hu4D5Fabv8 및 M13 파지 코트 단백질로부터의 기존의 시스테인 잔기 (디술피드 결합 형성에 관여함)가 비오틴-말레이미드의 부위-특이적 접합을 방해하지 않는다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 파지 ELISA 검정이 Fab 표면 상의 반응성 티올 기를 성공적으로 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
PHESELECTOR 검정은 항체 내의 반응성 티올 기의 스크리닝을 허용한다. 이 방법에 의한 A121C 변이체의 확인은 예시적인 것이다. 전체 Fab 분자는 반응성 티올 기를 갖는 보다 많은 티오Fab 변이체를 확인하기 위해 효과적으로 조사될 수 있다. 분획별 표면 접근성 파라미터를 이용하여 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기에 대한 용매의 접근성을 확인 및 정량화한다. 표면 접근성은 용매 분자, 예를 들어 물이 접촉할 수 있는 표면적 (Å2)으로 표현할 수 있다. 물의 점유 공간은 1.4Å 반경 구체와 비슷하다. 소프트웨어는 공지의 x-선 결정학 유래된 좌표를 사용하여 단백질의 각각의 아미노산의 표면 접근성을 계산하기 위한 알고리즘을 이용하는 결정학 프로그램의 CCP4 스위트(Suite) (문헌 ["The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography" (1994) Acta. Cryst. D50:760-763])로서 무료로 이용가능하거나 허가를 받아 사용할 수 있다 (CCP4에 대한 대용, 데어스베리 래보러토리(Daresbury Laboratory), 영국, WA4 4AD, 워링톤, Fax: (+44) 1925 603825, 또는 internet: www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html). 표면 접근성 계산을 수행하는 2개의 예시적인 소프트웨어 모듈은 문헌 [B.Lee and F.M.Richards (1971) J.Mol.Biol. 55:379-400]의 알고리즘을 기반으로 한 "아레아이몰(AREAIMOL)" 및 "서페이스(SURFACE)"이다. 아레아이몰은 단백질의 용매 접근가능한 표면을 프로브 구체 (용매 분자를 나타냄) 중심의 궤적으로서 정의하는데, 이것이 단백질의 반 데르 발스 (Van der Waals) 표면을 굴러다니기 때문이다. 아레아이몰은 (원자 반경과 프로브 반경의 합과 동일한, 원자 중심에서의 거리에서) 각 원자 주위의 확장된 구체 상에 표면 지점을 생성하고 이웃하는 원자들과 관련된 동등한 구체 내에 있는 것들을 제거하여 용매 접근가능한 표면적을 계산한다. 아레아이몰은 PDB 좌표 파일에서 원자의 용매 접근가능한 면적을 찾아내고, 상기 접근가능한 면적을 잔기, 쇄에 의해 전체 분자에 대해 총괄한다. 개별 원자에 대하여 접근가능한 면적 (또는 면적 차이)은 슈도-PDB 출력 파일에 기록될 수 있다. 아레아이몰은 각 원소에 대한 단일 반경을 의심하고, 오직 제한된 수의 상이한 원소만을 인식한다. 알려지지 않은 원자 유형 (즉, 아레아이몰의 내부 데이터베이스에 없음)은 1.8 Å의 디폴트 반경을 할당받을 것이다. 인식된 원자의 목록은 다음과 같다:
Figure 112012101685569-pct00002
아레아이몰 및 서페이스는 절대적 접근성, 즉 평방 옹스트롬(Å)의 수를 보고한다. 분획별 표면 접근성은 폴리펩티드 내의 아미노산과 관련된 표준 상태를 참조하여 계산된다. 참조 상태는 트리펩티드 Gly-X-Gly이고, 여기서 X는 관심 아미노산이고, 참조 상태는 '확장된' 입체형태, 즉 베타-가닥으로 존재하는 것과 같아야 한다. 확장된 입체형태는 X의 접근가능성을 최대화한다. 접근가능한 면적의 계산치를 Gly-X-Gly 트리펩티드 참조 상태 내의 접근가능한 면적으로 나누고 그 몫을 보고하는데, 이것이 분획별 접근성이다. 접근성 퍼센트는 분획별 접근용이성 x 100의 값이다.
표면 접근성을 계산하기 위한 또 다른 예시적인 알고리즘은 폴리펩티드의 X-선 좌표를 기반으로 물 구체에 대한 아미노산 잔기의 분획별 접근성을 계산하는 프로그램 xsae (브로거, 씨.(Broger, C.), 에프. 호프만-라로슈(F. Hoffman-LaRoche), 바젤)의 SOLV 모듈을 기반으로 한다.
hu4D5Fabv7 내의 모든 아미노산에 대한 분획별 표면 접근성은 결정 구조 정보 (문헌 [Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229:969-995]; US 7521541)를 이용하여 계산되었다. 하기 2가지 기준은 Cys 잔기로 대체되도록 조작될 수 있는 hu4D5Fabv8의 잔기를 확인하기 위해 적용하였다:
1. 완전히 매립된 아미노산 잔기, 즉 10% 미만의 분획별 표면 접근성 잔기를 제거하였다. 10% 초과 접근가능한 (분획별 표면 접근성) hu4D5Fabv8의 134개 (경쇄) 및 151개 (중쇄) 잔기가 존재한다. 상위 10개의 가장 접근가능한 Ser, Ala 및 Val 잔기는 다른 아미노산에 비해 Cys에 대한 이들의 밀접한 구조적 유사성으로 인해, 새롭게 조작된 Cys에 의해 항체에 최소의 구조적 구속을 도입하기 때문에 선택되었다. 다른 시스테인 대체 부위는 또한 스크리닝될 수 있고, 접합에 유용할 수 있다.
2. 잔기는 Fab의 기능적 및 구조적 상호작용에서의 이들의 역할을 기반으로 분류된다. 항원 상호작용에 관여하지 않고, 기존 디술피드 결합로부터 멀리 떨어져 있는 잔기를 추가로 선택하였다. 새롭게 조작된 Cys 잔기는 특징적인 형태이어야 하고, 항원 결합을 방해하지 않고 또한 디술피드 결합 형성에 관여하는 시스테인과의 미스페어를 방해하지 않는다.
티올 반응성은 아미노산의 반응성 시스테인 아미노산으로의 치환이 L-10 내지 L-20; L-38 내지 L-48; L-105 내지 L-115; L-139 내지 L-149; L-163 내지 L-173으로부터 선택된 경쇄의 범위 내에서; 및 H-35 내지 H-45; H-83 내지 H-93; H-114 내지 H-127; 및 H-170 내지 H-184로부터 선택된 중쇄의 범위 내에서, 및 H-268 내지 H-291; H-319 내지 H-344; H-370 내지 H-380; 및 H-395 내지 H-405로부터 선택된 범위 내의 Fc 영역에서 일어날 수 있는 임의의 항체에 대해 일반화될 수 있다.
또한, 티올 반응성은 항체의 특정 도메인, 예컨대 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 일반화될 수도 있다. 약 0.8 이상의 티올 반응성 값을 나타내는 시스테인 대체는 무손상 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM (IgG 서브클래스: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2 포함) 각각의 중쇄 불변 도메인 α, δ, ε, γ 및 μ에서 만들어질 수 있다.
결정 구조 데이터로부터 선택된 10개 Cys 돌연변이체가 항원-조합 부위, 예컨대 이 경우에는 HER2와의 인터페이스로부터 멀리 떨어져 있다는 것이 입증되었다. 이들 돌연변이체는 기능적 상호작용에 대한 간접적인 영향에 대해 실험적으로 시험될 수 있다. 모든 Cys Fab 변이체의 티올 반응성을 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 측정하고, 계산하여, 표 1에 제시하였다. 잔기 L-V15C, L-V110C, H-A88C 및 H-A121C는 반응성 및 안정한 티올 기를 갖는다 (도 3a 및 3b). 돌연변이체 V15C, V110C, A144C, S168C는 경쇄 Cys 변이체이다. 돌연변이체 A88C, A121C, A175C, S179C는 중쇄 Cys 변이체이다. 높은 분획별 표면 접근성을 갖는 부위가 PHESELECTOR 검정에 의해 계산시 최고 티올 반응성을 갖지 않는다는 것은 놀랍고 예상치 못한 것이었다 (표 1). 다르게는, 분획별 표면 접근성 (도 1a)은 티올 반응성과 상관관계가 없었다 (표 1). 실제로, 20% 내지 80%의 중간 표면 접근성을 갖는 부위 (도 4a), 또는 부분적으로 노출된 부위에서 조작된 Cys 잔기, 예컨대 Ala 또는 Val 잔기는 Ser 잔기에서 도입된 Cys보다 우수한 티올 반응성, 즉 >0.6을 나타내었으며 (도 3b, 표 1), 이에 따라 결정 구조 정보만으로는 티올 반응성 부위를 선택하기에 충분하지 않기 때문에 티올 반응성 부위의 스크리닝에 PHESELECTOR 검정을 사용하는 것이 필요하게 되었다 (도 3b 및 4a).
티올 반응성 데이터는 4D5 티오Fab Cys 돌연변이체: (3a) 비-비오티닐화 (대조군) 및 (3b) 비오티닐화 파지-티오Fab의 아미노산 잔기에 대해 도 3a 및 3b에 나타내었다. 항체/Fab 표면 상의 반응성 티올 기를 비-비오티닐화 파지-hu4D5Fabv8 (3a) 및 비오티닐화 파지-hu4D5Fabv8 (3b)의 BSA (백색 박스), HER2 (회색 박스) 또는 스트렙타비딘 (흑색 박스)과의 상호작용에 대한 PHESELECTOR 검정 분석에 의해 확인하였다. 검정은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 경쇄 변이체는 좌측 상에 있고, 중쇄 변이체는 우측 상에 있다. 비-비오티닐화 4D5 티오Fab Cys 돌연변이체의 결합은 예상된 바와 같이 낮았으나, HER2에의 강한 결합이 유지되었다. 비오티닐화 4D5 티오Fab Cys 돌연변이체의 스트렙타비딘 및 HER2에의 결합의 비는 표 1에서 티올 반응성 값을 제공한다. 450 nm에서의 백그라운드 흡광도 또는 비오티닐화 4D5 티오Fab Cys 돌연변이체의 BSA에의 소량의 비-특이적 단백질 결합이 또한 도 3b에서 입증되었다. Cys 잔기로 대체된 선택된 아미노산 잔기의 분획별 표면 접근성을 도 4a에 나타내었다. 분획별 표면 접근성을 이용가능한 hu4D5Fabv7 구조로부터 계산하였다 (문헌 [Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229:969-995]). hu4D5Fabv7 및 hu4D5Fabv8 구조의 입체형태 파라미터는 매우 일관적이고, hu4D5Fabv7의 분획별 표면 접근성 계산과 hu4D5Fabv8 시스테인 돌연변이체의 티올 반응성 사이의 임의의 상관관계의 결정을 허용한다. 부분적으로 노출된 잔기 (Ala 또는 Val)에서 도입된 파지 티오Fab Cys 잔기의 측정된 티올 반응성은 Ser 잔기에서 도입된 것에 비해 보다 우수한 티올 반응성을 나타내었다 (표 1). 표 1의 티오Fab Cys 돌연변이체로부터 티오 반응성 값과 분획별 표면 접근성 사이에 거의 또는 전혀 상관관계가 없다는 것을 알 수 있었다.
항체의 위치 L-15, L-43, L-110, L-144, L-168, H-40, H-88, H-119, H-121, H-122, H-175 및 H-179에서의 아미노산은 일반적으로 유리 시스테인 아미노산으로 돌연변이 (대체)될 수 있다. 이들 위치의 각각의 측면 상에서 약 5개 아미노산 잔기 내의 범위, 즉 L-10 내지 L-20; L-38 내지 L-48; L-105 내지 L-115; L-139 내지 L-149; L-163 내지 L-173; H-35 내지 H-45; H-83 내지 H-93; H-114 내지 H-127; 및 H-170 내지 H-184 뿐만 아니라 H-268 내지 H-291; H-319 내지 H-344; H-370 내지 H-380; 및 H-395 내지 H-405로부터 선택된 Fc 영역의 범위는 또한 유리 시스테인 산으로 대체되어, 본 발명의 시스테인 조작된 항체를 생성할 수 있다.
Figure 112012101685569-pct00003
경쇄로부터의 2개의 Cys 변이체 (L-V15C 및 L-V110C) 및 중쇄로부터의 2개의 Cys 변이체 (H-A88C 및 H-A121C)가 최고 티올 반응성을 나타내므로 이들 변이체를 추가의 분석을 위해 선택하였다 (표 1).
파지 정제와 달리, Fab 제조는 생산 규모에 따라 2-3일이 필요할 수 있다. 이 시간 동안, 티올 기는 산화에 의해 반응성이 손실될 수 있다. hu4D5Fabv8-파지 상의 티올 기의 안정성을 프로빙하기 위해, 파지-티오Fab의 티올 반응성의 안정성을 측정하였다 (도 4b). 티오Fab-파지 정제 후, 제1일, 제2일 및 제4일에, 모든 샘플을 비오틴-PEO-말레이미드와 접합시키고, 파지 ELISA 검정 (PHESELECTOR)으로 프로빙하여 HER2 및 스트렙타비딘 결합을 시험하였다. L-V15C, L-V110C, H-A88C 및 H-A121C는 다른 티오Fab 변이체에 비해 유의한 양의 티올 반응성을 유지하였다 (도 4b).
<표지된 시스테인 조작된 항체>
본 발명의 시스테인 조작된 항체는 반응성 시스테인 티올 기를 통해 항체에 공유 부착될 수 있는 임의의 표지 모이어티에 접합될 수 있다 (문헌 [Singh et al. (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL]). 부착된 표지는 (i) 검출가능한 신호를 제공하거나; (ii) 제2 표지와 상호작용하여 제1 또는 제2 표지에 의해 제공되는 검출가능한 신호를 변형시켜, 예를 들어 FRET (형광 공명 에너지 전달)를 생성하거나; (iii) 항원 또는 리간드와의 상호작용을 안정화시키거나 또는 이들과의 결합 친화도를 증가시키거나; (iv) 전하, 소수성, 외형 또는 다른 물리적 파라미터에 의해 이동성, 예를 들어 전기영동 이동성 또는 세포-투과성에 영향을 미치거나; 또는 (v) 포획 모이어티를 제공하여 리간드 친화도, 항체/항원 결합, 또는 이온 착화를 조절하는 기능을 할 수 있다.
표지된 시스테인 조작된 항체는 예를 들어 특이적 세포, 조직 또는 혈청에서 관심 항원의 발현을 검출하기 위한 진단 분석에서 유용할 수 있다. 진단 용도를 위해, 항체는 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 수많은 표지가 이용가능하고, 이들은 일반적으로 하기 카테고리로 분류될 수 있다.
(a) 방사성동위원소 (방사성핵종), 예컨대 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 89Zr, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At 또는 213Bi. 방사성동위원소 표지된 항체는 수용체 표적화된 영상화 실험에 유용하다. 항체는 문헌 [Current Protocols in Immunology, (1991) Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, NY, Pubs.]에 기재된 기술을 이용하여, 방사성 동위원소 금속에 결합하거나 킬레이팅되거나 또는 다른 방식으로 착화되며 항체의 조작된 시스테인 티올과 반응성인 리간드 시약으로 표지될 수 있다. 금속 이온과 착화될 수 있는 킬레이팅 리간드는 DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA 및 TETA (마크로시클릭스 (Macrocyclics), 텍사스주 달라스)를 포함한다. 방사성핵종은 본 발명의 항체-약물 접합체와의 착화를 통해 표적화될 수 있다 (문헌 [Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146]). DOTA-말레이미드 시약은 시스테인 조작된 항체의 유리 시스테인 아미노산과 반응하여 항체 상에 금속 착화 리간드를 제공한다 (문헌 [Lewis et al. (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86]). 킬레이팅 링커 표지 시약, 예컨대 DOTA-NHS (1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 모노 (N-히드록시숙신이미드 에스테르)는 상업적으로 입수가능하다 (마크로시클릭스, 텍사스주 달라스). 방사성핵종 표지된 항체를 사용한 수용체 표적 영상화는 종양 조직 중 항체의 점진적인 축적을 검출 및 정량화하는 경로로 활성화의 마커를 제공할 수 있다 (문헌 [Albert et al. (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210]).
영상화 실험을 위한 항체 표지로서 적합한 금속-킬레이트 착체가 하기 문헌에 개시되어 있다: (US 2010/0111856; US 5342606; US 5428155; US 5316757; US 5480990; US 5462725; US 5428139; US 5385893; US 5739294; US 5750660; US 5834456; 문헌 [Hnatowich et al. (1983) J. Immunol. Methods 65:147-157; Meares et al. (1984) Anal. Biochem. 142:68-78; Mirzadeh et al. (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65; Meares et al. (1990) J. Cancer1990, Suppl. 10:21-26; Izard et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350; Nikula et al. (1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90; Camera et al. (1993) Nucl. Med. Biol. 20:955-62; Kukis et al. (1998) J. Nucl. Med. 39:2105-2110; Verel et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Camera et al. (1994) J. Nucl. Med. 21:640-646; Ruegg et al. (1990) Cancer Res. 50:4221-4226; Verel et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Lee et al. (2001) Cancer Res. 61:4474-4482; Mitchell, et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1105-1112; Kobayashi et al. (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111; Miederer et al. (2004) J. Nucl. Med. 45:129-137; DeNardo et al. (1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90; Blend et al. (2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363; Nikula et al. (1999) J. Nucl. Med. 40:166-76; Kobayashi et al. (1998) J. Nucl. Med. 39:829-36; Mardirossian et al. (1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74; Roselli et al. (1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20]).
(b) 형광 표지, 예컨대 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), FITC, 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인을 포함하는 플루오레세인 유형; TAMRA를 포함하는 로다민 유형; 단실; 리사민 (Lissamine); 시아닌; 피코에리트린; 텍사스 레드 (Texas Red) 및 그의 유사체. 형광 표지는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌]에 개시된 기술을 이용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광 염료 및 형광 표지 시약은 인비트로젠(Invitrogen)/몰레큘라 프로브스(Molecular Probes, 오레곤주 유진) 및 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc., 일리노이주 록포드)에서 상업적으로 입수가능한 것을 포함한다.
검출 표지, 예컨대 형광 염료 및 화학발광 염료 (문헌 [Briggs et al. (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1:1051-1058])는 검출가능한 신호를 제공하고, 일반적으로 바람직하게는 하기 특성을 갖는 항체 표지에 적용가능하다: (i) 표지된 항체는 낮은 백그라운드로 매우 높은 신호를 생산하여 소량의 항체가 세포-무함유 검정 및 세포-기반 검정 둘 다에서 민감하게 검출될 수 있도록 해야 하고, (ii) 표지된 항체는 광안정성이어서 형광 신호가 유의한 광표백 없이 관찰되고 모니터링되며 기록될 수 있어야 한다. 표지된 항체를 특히 살아있는 세포의 막 또는 세포 표면에 세포 표면 결합시키는 것을 포함하는 적용을 위해, 표지가 (iii) 효과적인 접합체 농도 및 검출 감수성 달성을 위해 양호한 수용성을 갖고, (iv) 세포의 정상적인 대사 과정을 파괴하거나 조기 세포 사멸을 초래하지 않도록 살아있는 세포에 비-독성인 것이 바람직하다.
(c) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하거나 문헌에 개시되어 있다 (US 4275149). 효소는 일반적으로 다양한 기술을 이용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매한다. 예를 들어, 효소는 기질에서의 색 변화를 촉매할 수 있고, 이는 분광학적으로 측정할 수 있다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량화하는 기술은 상기 기재되어 있다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기된 후에 측정 (예를 들어, 화학발광측정기 사용)할 수 있는 광을 방출하거나 에너지를 형광 수용자에게 제공할 수 있다. 효소 표지의 예는 루시페라제 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제, US 4737456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP), β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예컨대, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키는 기술은 문헌 [O'Sullivan et al. (1981) "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예 (US 4275149; US 4318980)는 예를 들어 하기를 포함한다:
(i) 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 기질로서의 수소 퍼옥시다제 (여기서, 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킴);
(ii) 알칼리성 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트; 및
(iii) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제.
표지는 시스테인 조작된 항체와 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 항체를 비오틴과 접합시키고, 상기 언급한 표지의 3가지 광범위한 카테고리 중 임의의 표지를 아비딘 또는 스트렙타비딘과 접합시킬 수도 있고, 또는 그 반대로 접합시킬 수도 있다. 비오틴은 스트렙타비딘에 선택적으로 결합하기 때문에, 표지가 이러한 간접적인 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드 변이체와 표지의 간접 접합을 달성하기 위해, 폴리펩티드 변이체는 소형 합텐 (예를 들어, 디곡신)과 접합시키고 상기 언급한 상이한 유형의 표지 중 하나를 항-합텐 폴리펩티드 변이체 (예를 들어, 항-디곡신 항체)와 접합시킨다. 이에 따라, 폴리펩티드 변이체와 표지의 간접 접합을 달성할 수 있다 (문헌 [Hermanson, G. (1996) in Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego]).
본 발명의 폴리펩티드 변이체는 임의의 공지된 검정 방법, 예컨대 ELISA, 경쟁적 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정 및 면역침전 검정에 사용될 수 있다 (문헌 [Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158, CRC Press, Inc.]).
검출 표지는 결합 또는 인식 사건을 국재화하고 시각화하며 정량화하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 표지된 항체는 세포-표면 수용체를 검출할 수 있다. 검출가능하게 표지된 항체의 또 다른 용도는 비드를 형광 표지된 항체와 접합시키고, 리간드의 결합시에 형광 신호를 검출하는 것을 포함하는, 비드-기반 면역포획 방법이다. 유사한 결합 검출 방법은 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 효과를 이용하여 항체-항원 상호작용을 측정하고 검출한다.
본 발명의 표지된 시스테인 조작된 항체는 생체의학 및 분자 영상화의 다양한 방법 및 기술, 예컨대 (i) MRI (자기 공명 영상화); (ii) 마이크로CT (컴퓨터 단층촬영); (iii) SPECT (단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영); (iv) PET (양전자 방출 단층촬영) (문헌 [Tinianow, J. et al. (2010) Nuclear Medicine and Biology, 37(3):289-297; Chen et al. (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49]; US 2010/0111856); (v) 생체발광; (vi) 형광; 및 (vii) 초음파에 의한 영상화 바이오마커 및 프로브로서 유용하다. 면역섬광조영술은 방사성 물질로 표지된 항체를 동물 또는 인간 환자에게 투여하고 항체가 위치하는 신체 부위의 사진을 찍는 영상화 절차이다 (US 6528624). 영상화 바이오마커는 객관적으로 측정되어 정상적인 생물학적 과정, 발병 과정 또는 치료 개입에 대한 약리학적 반응의 지시자로서 평가될 수 있다. 생물마커는 여러 유형일 수 있다: 유형 0은 질환의 본래 병력 마커이며, 공지된 임상 지표, 예를 들어 류마티스 관절염에서 활액 염증의 MRI 평가와 장기적으로 상관관계가 있고; 유형 I 마커는 작용 메카니즘이 임상 결과와 연관되지 않을 수 있는 경우에도 이 작용 메카니즘에 따른 개입 효과를 포착하며; 유형 II 마커는 대리 종말점으로서 기능하여, 바이오마커의 변화 또는 바이오마커로부터의 신호가 표적화된 반응의 "유효성", 예컨대 류마티스 관절염에서 CT에 의한 골 침식 측정치에 대한 임상적 이점을 예측한다. 따라서, 영상화 바이오마커는 (i) 표적 단백질의 발현, (ii) 표적 단백질에 대한 치료제의 결합, 즉 선택성, 및 (iii) 제거율 및 반감기 약력학 데이터에 대한 약동학 (PD) 치료 정보를 제공할 수 있다. 실험을 기반으로 한 바이오마커에 비한 생체내 영상화 바이오마커의 이점은 비-침습성 치료, 정량화가능한 전신 평가, 반복적 투여 및 평가, 즉 여러 시점에서의 투여 및 평가, 및 전임상 결과 (소형 동물)로부터 임상 (인간) 결과로의 잠재적으로 전이가능한 효과를 포함한다. 일부 적용의 경우, 생체영상화는 전임상 연구에서의 동물 실험을 대체하거나 그 횟수를 최소화한다.
펩티드 표지 방법은 널리 공지되어 있다. 문헌 [Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al. (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin and New York; 및 Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); De Leon-Rodriguez et al. (2004) Chem.Eur. J. 10:1149-1155; Lewis et al. (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115; Mier et al. (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237]을 참조한다.
충분히 근접한 2가지 모이어티, 즉 형광 리포터 및 켄처로 표지된 펩티드 및 단백질에서는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)이 일어난다. 리포터 기는 전형적으로 특정 파장의 광에 의해 여기되고 최대 밝기에서의 방출을 위한 적절한 스톡스(Stokes) 이동으로 에너지를 수용자 또는 켄처 기에게 전달하는 형광 염료이다. 형광 염료는 확장된 방향족성을 갖는 분자, 예컨대 플루오레세인 및 로다민, 및 그의 유도체를 포함한다. 형광 리포터는 무손상 펩티드 중의 켄처 모이어티에 의해 부분적으로 또는 유의하게 켄칭될 수 있다. 펩티드를 펩티다제 또는 프로테아제에 의해 절단시키면, 검출가능한 형광의 증가가 측정될 수 있다 (문헌 [Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes", Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18-34]).
본 발명의 표지된 항체는 친화도 정제 작용제로서 사용될 수도 있다. 이 과정에서, 표지된 항체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 세파덱스(Sephadex) 수지 또는 여과지와 같은 고체 상에 고정된다. 고정된 항체를 정제될 항원을 함유하는 샘플과 접촉시킨 후, 지지체를 정제될 항원을 제외하고는 샘플에 존재하는 실질적으로 모든 물질을 제거할 적합한 용매로 세척하는데, 상기 항원은 고정된 폴리펩티드 변이체에 결합한다. 최종적으로, 상기 지지체를 폴리펩티드 변이체로부터 항원을 방출시킬 또 다른 적합한 용매, 예컨대 글리신 완충제 (pH 5.0)로 세척한다.
표지 시약은 전형적으로 (i) 시스테인 조작된 항체의 시스테인 티올과 직접 반응하여 표지된 항체를 형성할 수 있거나, (ii) 링커 시약과 반응하여 링커-표지 중간체를 형성할 수 있거나, 또는 (iii) 링커 항체와 반응하여 표지된 항체를 형성할 수 있는 반응성 관능기를 보유한다. 표지 시약의 반응성 관능기는 말레이미드, 할로아세틸, 아이오도아세트아미드 숙신이미딜 에스테르 (예를 들어, NHS, N-히드록시숙신이미드), 이소티오시아네이트, 술포닐 클로라이드, 2,6-디클로로트리아지닐, 펜타플루오로페닐 에스테르 및 포스포르아미다이트를 포함하나, 다른 관능기도 사용될 수 있다.
<비오틴-말레이미드의 티오Fab에의 접합>
상기 기재된 티오Fab 특성은 Fab의 파지 코트 단백질에의 융합이 잠재적으로 Cys 티올 접근성 또는 반응성을 변경시킬 수 있기 때문에 파지의 존재 하에 확립하였다. 따라서, 티오Fab 구축물을 알칼리성 포스파타제 프로모터 하에 발현 벡터로 클로닝하고 (문헌 [Chang et al. (1987) Gene 55:189-196]), 티오Fab 발현을 포스페이트-무함유 배지에서 이. 콜라이 세포를 성장시켜 유도하였다. 티오Fab를 단백질 G 세파로스TM 칼럼 상에서 정제하고, 환원 및 비-환원 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다. 이들 분석은 티오Fab가 그의 반응성 티올 기를 유지하는지 또는 분자내 또는 분자간 디술피드 결합 형성에 의해 불활성이 되는지 여부를 평가하는 것을 허용한다. 티오Fab L-V15C, L-V110C, H-A88C 및 H-A121C를 발현시키고, 단백질-G 세파로스TM 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (상세한 내용은 방법 섹션 참조). 정제된 단백질을 환원 (DTT 존재) 및 비-환원 (DTT 부재) 조건에서 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다. 다른 환원제, 예컨대 BME (베타-메르캅토에탄올)을 겔에서 사용하여 쇄간 디술피드 기를 제거할 수 있다. SDS-PAGE 겔 분석으로부터 티오Fab의 주요 (약 90%) 분획이 단량체 형태로 있는 한편, 야생형 hu4D5Fabv8은 본질적으로 단량체 형태 (47 kDa)라는 것을 입증하였다.
티오Fab (A121C) 및 야생형 hu4D5Fabv8을 100배 과량의 비오틴-말레이미드와 3시간 동안 실온에서 인큐베이션하고, 비오티닐화 Fab를 슈퍼덱스-200TM 겔 여과 칼럼 상에 로딩하였다. 이 정제 단계는 단량체 Fab를 올리고머 Fab 및 또한 잉여량의 유리 비오틴-말레이미드 (또는 유리 세포독성 약물)으로부터 분리하는데 유용하였다.
도 5는 파지 내용물의 부재 하에 티오Fab 변이체의 특성의 검증을 보여준다. 파지 융합이 없는 단백질, hu4D5Fabv8 및 hu4D5Fabv8-A121C (티오Fab-A121C)를 발현시키고, 단백질-G 아가로스 비드를 사용하여 정제한 후에 100배 몰 과량의 비오틴-말레이미드와 인큐베이션하였다. 비오티닐화 cys 조작된 티오Fab 및 비-비오티닐화 야생형 Fab의 스트렙타비딘 및 HER2 결합을 비교하였다. 비오틴 접합 (스트렙타비딘과의 상호작용)의 정도 및 이들의 HER2에의 결합 능력을 ELISA 분석에 의해 모니터링하였다. 각각의 Fab를 2 ng 및 20 ng에서 시험하였다.
비오티닐화 A121C 티오Fab는 야생형 hu4D5Fabv8와 대등한 HER2 결합을 유지하였다 (도 5). 야생형 Fab 및 A121C-티오Fab를 겔 여과 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 2개의 샘플을 염소 항-Fab-HRP를 2차 항체로 사용하는 ELISA에 의해 HER2 및 스트렙타비딘 결합에 대해 시험하였다. 야생형 (백색 박스) 및 티오Fab (점선 박스)는 둘 다 HER2에 대해 유사한 결합을 나타내었으나, 오직 티오Fab가 스트렙타비딘 결합을 유지하였다. 오직 백그라운드 수준의 스트렙타비딘과의 상호작용이 비-비오티닐화 야생형 hu4D5Fabv8에서 관찰되었다 (도 5). 비오티닐화-티오Fab (A121C)의 질량 스펙트럼 (LC-ESI-MS) 분석은 야생형 hu4D5Fabv8 (47737 달톤)에 비해 48294.5 달톤에서 주요 피크가 생성되었다. 2개의 분자 사이의 537.5 달톤 차이는 정확하게 티오Fab에 접합된 단일 비오틴-말레이미드에 상응한다. 질량 스펙트럼 단백질 서열분석 (LC-ESI-탠덤 질량 스펙트럼 분석) 결과는 접합된 비오틴 분자가 새롭게 조작된 Cys 잔기에 있다는 것을 추가로 확인하였다 (표 8, 실시예 3b).
<비오틴-말레이미드의 알부민 결합 펩티드 (ABP)-티오Fab에의 부위 특이적 접합>
혈장-단백질 결합은 단기 생존 분자의 약동학적 특성을 개선시키는 효과적인 수단일 수 있다. 알부민은 혈장에서 가장 풍부한 단백질이다. 혈장 알부민 결합 펩티드 (ABP)는 조직 흡수, 침투 및 확산의 변경을 포함하여, 융합된 활성 도메인 단백질의 약력학을 변경시킬 수 있다. 이들 약력학 파라미터는 적절한 혈청 알부민 결합 펩티드 서열의 특이적 선택에 의해 조정될 수 있다 (US 20040001827). 일련의 알부민 결합 펩티드가 파지 디스플레이 스크리닝에 의해 확인되었다 (문헌 [Dennis et al. (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277:35035-35043]; WO 01/45746). 본 발명의 화합물은 (i) 문헌 [Dennis et al. (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043]의 표 III 및 표 IV, 페이지 35038, (ii) US 20040001827의 [0076], 및 (iii) WO 01/45746의 페이지 12-13에 교시된 ABP 서열을 포함하며, 상기 문헌은 모두 본원에 참고로 포함된다.
알부민 결합 펩티드를 Fab 중쇄의 C-말단에 1:1의 화학량론적 비 (1 ABP / 1 Fab)로 융합시켜 알부민 결합 (ABP)-Fab를 조작한다. 이들 ABP-Fab와 알부민의 회합은 토끼 및 마우스에서 이들의 반감기를 25배 초과로 증가시키는 것으로 나타났다. 따라서, 상기 기재된 반응성 Cys 잔기는 이들 ABP-Fab에 도입되어 세포독성 약물과의 부위-특이적 접합 및 이후의 생체내 동물 연구에 사용될 수 있다.
예시적인 알부민 결합 펩티드 서열은 서열 1-5에 열거된 아미노산 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
Figure 112012101685569-pct00004
알부민 결합 펩티드 (ABP) 서열은 다수의 종 (마우스, 래트, 토끼, 소, 레서스, 개코원숭이 및 인간)으로부터의 알부민에 Kd (토끼) = 0.3 μM으로 결합한다. 알부민 결합 펩티드는 알부민에 결합하는 것으로 공지된 리간드와 경쟁하지 않고, 토끼에서 2.3시간의 반감기 (T½)를 갖는다. ABP-티오Fab 단백질을 BSA-세파로스TM 상에서 정제한 후에 이전 섹션에 기재된 바와 같이 비오틴-말레이미드 접합 및 슈퍼덱스-S200 칼럼 크로마토그래피 상에서의 정제를 수행하였다. 정제된 비오티닐화 단백질은 균질하였고, 어떠한 올리고머 형태도 없었다 (실시예 4).
도 6은 알부민 결합 펩티드 (ABP)-티오Fab 변이체의 특성을 보여준다. ELISA 분석을 수행하여 ABP-hu4D5Fabv8-wt, ABP-hu4D5Fabv8-V110C 및 ABP-hu4D5Fabv8-A121C의 토끼 알부민, 스트렙타비딘 및 HER2와의 결합 능력을 시험하였다. 비오티닐화 ABP-티오Fab는 ELISA (도 6) 및 비아코어 결합 동역학 분석 (표 2)에 의해 확인된 바와 같이 알부민 및 HER2에 야생형 ABP-hu4D5Fabv8과 유사한 친화도로 결합할 수 있다. ELISA 플레이트를 기재된 바와 같이 알부민, HER2 및 SA로 코팅하였다. 비오티닐화 ABP-티오Fab의 알부민, HER2 및 SA에의 결합을 항-Fab HRP로 프로빙하였다. 비오티닐화 ABP-티오Fab는 비 비오티닐화 대조군 ABP-hu4D5Fabv8-wt에 비해 스트렙타비딘에 결합할 수 있었으며, 이는 동일한 Cys 돌연변이체가 변이체 둘 다에 대해 사용되므로 ABP-티오Fab가 비오틴 말레이미드 유사 티오Fab와 부위 특이적 방식으로 접합된다는 것을 나타낸다 (도 6).
Figure 112012101685569-pct00005
대안적으로, 알부민-결합 펩티드는 링커 모이어티를 통해 공유 부착에 의해 항체에 연결될 수 있다.
<Fab 당 2개의 유리 티올 기를 갖는 ABP-티오Fab의 조작>
상기 결과는 모든 4개의 (L-V15C, L-V110C, H-A88C 및 H-A121C) 티오Fab (시스테인 조작된 Fab 항체) 변이체가 표지 시약, 링커 시약, 또는 약물-링커 중간체와의 부위 특이적 접합에 사용될 수 있는 반응성 티올 기를 갖는다는 것을 나타낸다. L-V15C는 발현될 수 있고, 정제될 수 있으나 비교적 낮을 수율을 갖는다. 그러나, L-V110C, H-A88C 및 H-A121C 변이체의 발현 및 정제 수율은 hu4D5Fabv8과 유사하였다. 따라서, 이러한 돌연변이체는 추가의 분석에 사용될 수 있고, Fab 당 1개 초과의 티올 기를 수득하기 위해 재조합될 수 있다. 이 목적을 위해, 경쇄 상에 1개의 티올 기 및 중쇄 상에 1개의 티올 기를 구축하여 Fab 분자당 2개의 티올 기를 수득하였다 (L-V110C/H-A88C 및 L-V110C/H-A121C). 이들 2가지 이중 Cys 변이체를 이. 콜라이 발현 시스템에서 발현시키고, 정제하였다. 정제된 비오티닐화 ABP-티오Fab의 균질성은 단일 Cys 변이체와 유사한 것으로 밝혀졌다.
Fab 당 2개의 반응성 Cys 잔기의 조작 효과를 조사하였다 (도 7). 제2 비오틴의 존재를 스트렙타비딘-HRP를 사용하여 비오티닐화 ABP-티오Fab의 SA에의 결합을 프로빙함으로써 시험하였다 (도 7). HER2/Fab 분석을 위해, ELISA 플레이트를 HER2로 코팅하고, 항-Fab HRP로 프로빙하였다. SA/Fab 분석을 위해, ELISA 플레이트를 SA로 코팅하고, 항-Fab HRP로 프로빙하였다. SA/SA 분석을 위해, ELISA 플레이트를 SA로 코팅하고, SA-HRP로 프로빙하였다. 도 7. 비오티닐화 ABP-hu4D5Fabv8 cys 변이체의 HER2, 스트렙타비딘 (SA)과의 상호작용에 대한 ELISA 분석. HER2/Fab, SA/Fab 및 SA/SA는 이들의 상호작용이 각각 항-Fab-HRP, SA-HRP에 의해 모니터링되었다는 것을 나타낸다. SA/Fab는 Fab 당 단일 비오틴의 존재를 모니터링하고, Fab 당 1개 초과의 비오틴이 SA/SA 분석에 의해 모니터링되었다. HER2의 이중 cys 돌연변이체와의 결합은 단일 Cys 변이체와 유사하였다 (도 7). 그러나, 이중 Cys 돌연변이체에 대한 비오티닐화의 정도는 Fab 분자 당 1개 초과의 유리 티올 기로 인해 단일 Cys 변이체에 비해 더 높았다 (도 7).
<트라스투주맙의 티오 IgG 변이체의 조작>
시스테인을 특정 잔기에서 전장 모노클로날 항체, 트라스투주맙 (헤르셉틴®, 제넨테크 인크.)에 도입하였다. 트라스투주맙의 단일 cys 돌연변이체 H-A88C, H-A121C 및 L-V110C, 및 트라스투주맙의 이중 cys 돌연변이체 V110C-A121C 및 V110C-A121C를 CHO (차이니즈 햄스터 난소) 세포에서 1 mM 시스테인을 함유하는 배지에서의 일시적 발효에 의해 발현시켰다. A88C 돌연변이체 중쇄 서열 (450 aa)은 서열 6이다. A121C 돌연변이체 중쇄 서열 (450 aa)은 서열 7이다. V110C 돌연변이체 경쇄 서열 (214 aa)은 서열 8이다.
Figure 112012101685569-pct00006
한 실시양태에 따라, 시스테인 조작된 티오-트라스투주맙 항체는 유리 시스테인 아미노산을 갖는 하기 가변 영역 중쇄 서열 (서열 9-16) 중 하나 이상을 포함한다.
Figure 112012101685569-pct00007
또 다른 실시양태에 따라, 시스테인 조작된 티오-트라스투주맙 항체는 유리 시스테인 아미노산을 갖는 하기 가변 영역 경쇄 서열 (서열 17-27) 중 하나 이상을 포함한다.
Figure 112012101685569-pct00008
생성된 전장, 티오-트라스투주맙 IgG 변이체를 티올 반응성 및 HER2 결합 활성에 대해 검정하였다. 도 10a는 흡광도 검출을 위한 고정된 HER2 및 HRP 표지된 2차 항체에의 비오티닐화 항체 결합의 카툰 도면을 보여준다. 도 10b는 (좌측으로부터 우측으로): 비-비오티닐화 야생형 트라스투주맙 (Wt), 비오틴-말레이미드 접합된 티오-트라스투주맙 변이체 V110C (단일 cys), A121C (단일 cys) 및 V110C-A121C (이중 cys)의 450 nm에서의 흡광도의 검출을 이용하는 고정된 HER2에의 결합 측정을 보여준다. 각각의 티오 IgG 변이체 및 트라스투주맙을 1, 10, 및 100 ng에서 시험하였다. 측정은 비오티닐화 항-HER2 티오Mab이 HER2 결합 활성을 유지한다는 것을 보여준다.
도 11a는 흡광도 검출을 위한 항-IgG-HRP에의 비오틴 결합과, 고정된 HER2에의 비오티닐화 항체 결합의 카툰 도면을 보여준다. 도 14b는 스트렙타비딘에의 결합에서 비오틴-말레이미드 접합된 티오-트라스투주맙 변이체 및 비-비오티닐화 야생형 트라스투주맙의 450 nm에서의 흡광도의 검출을 이용하는 결합 측정을 보여준다. 좌측으로부터 우측으로: V110C (단일 cys), A121C (단일 cys), V110C/A121C (이중 cys) 및 트라스투주맙. 각각의 티오 IgG 트라스투주맙 변이체 및 모 트라스투주맙을 1, 10 및 100 ng에서 시험하였다. 측정은 HER2 티오Mab이 높은 티올 반응성을 갖는다는 것을 보여준다.
시스테인을 특정 잔기에서 전장 2H9 항-EphB2R 항체에 도입하였다. 2H9의 단일 cys 돌연변이체 H-A121C를 CHO (차이니즈 햄스터 난소) 세포에서 1 mM 시스테인을 함유하는 배지에서의 일시적 발효에 의해 발현시켰다. A121C 2H9 돌연변이체 중쇄 서열 (450 aa)은 서열 28이다.
Figure 112012101685569-pct00009
시스테인 조작된 티오-2H9 항체는 유리 시스테인 아미노산을 갖는 하기 Fc 불변 영역 중쇄 서열 (서열 29-38)을 포함한다.
Figure 112012101685569-pct00010
시스테인을 특정 잔기에서 전장 3A5 항-MUC16 항체에 도입하였다. 3A5의 단일 cys 돌연변이체 H-A121C를 CHO (차이니즈 햄스터 난소) 세포에서 1 mM 시스테인을 함유하는 배지에서의 일시적 발효에 의해 발현시켰다. A121C 3A5 돌연변이체 중쇄 서열 (446 aa)은 서열 39를 포함한다.
Figure 112012101685569-pct00011
시스테인 조작된 티오-3A5 항-MUC16 항체는 유리 시스테인 아미노산을 갖는 하기 가변 영역 중쇄 서열 (서열 40-44)을 포함한다.
Figure 112012101685569-pct00012
시스테인 조작된 티오-3A5 항-MUC16 항체는 유리 시스테인 아미노산을 갖는 하기 가변 영역 경쇄 서열 (서열 45-49)을 포함한다.
Figure 112012101685569-pct00013
4D5 항-HER2 티오Fab의 조작 및 티올 반응성
시스테인은 항-HER2 hu4D5Fabv8 Fab 단편 항체의 중쇄 및 경쇄의 각각의 위치에 도입하였다. 모든 440개의 중쇄 돌연변이체 및 경쇄 돌연변이체는 본원에 기재된 방법에 따라 제조되었다. 티올 반응성은 PHESELECTOR 검정에 따라 측정되었다. 중쇄 서열은 순차적 넘버링 시스템에 의해 넘버링된다. 경쇄 서열은 카바트 넘버링 시스템을 따른다. 경쇄에서, 카바트 및 순차적 넘버링은 둘 다 동일한 번호를 표시한다.
중쇄 hu4D5Fabv8 돌연변이체는 HER2 수용체 단백질에의 효율적인 결합 (도 2 및 3) 및 비오티닐화 시약, 비오틴-PEO-말레이미드와의 티올 반응성 (실시예 1 및 2)에 대해 선택되었다. 특정 중쇄 돌연변이체는 항체-Fab의 가변 영역에서 CDR에 위치한 항원 결합 (HER2)을 위한 중요한 잔기이기 때문에 HER2 ECD에의 결합을 제한하거나 절충한다. 또한 Fab의 불변 도메인에 위치한 잔기의 일부는 이러한 잔기가 Fab의 구조 및 폴딩에 기여할 수 있기 때문에 양호하지 못한 HER2 결합을 초래하여, M13-파지 상에 양호하지 못한 4D5-Fab 디스플레이를 초래하였다 (문헌 [Junutula, J.R. et al. (2008) J. Immunol Methods, 332:41-52]). 양호하지 못한 HER2 ECD 결합을 갖는 중쇄 hu4D5Fabv8 돌연변이체는 위치 1, 21, 31, 33-36, 38, 48-50, 59, 87, 95, 101, 104, 129, 131, 132, 136, 153, 155, 159, 166, 169, 170, 172, 197, 198, 202, 215, 219에 시스테인 돌연변이를 포함하였다. 야생형 시스테인 변이체 22, 96, 147, 203, 223이 측정되었다. 다른 중쇄 돌연변이체는 비오티닐화 시약과의 티올 반응성을 제한하였다. 유리 시스테인 아미노산 잔기는 표 3의 중앙 칼럼의 서열의 플랭킹 잔기를 갖는 중심에 있다. 중쇄의 치환된 아미노산 및 위치는 좌측 칼럼에서 지정된다. 표 3의 중쇄 hu4D5Fabv8 돌연변이체 서열 50-98은 야생형 시스테인 변이체를 제외하고, HER2 결합 및 약 0.8 이상의 티올 반응성 값을 유지하였다. 서열 50-98 (표 3)을 갖는 항체는 티올 반응성을 입증하였고, 포획 표지, 검출 표지, 약물 모이어티 또는 고체 지지체와의 공유 부착 형성에 유용할 수 있다. 표 3의 중쇄 돌연변이체는 티오Fab 또는 티오Mab로서, 예를 들어 항체-약물 접합체로서 접합될 수 있다.
Figure 112012101685569-pct00014
Figure 112012101685569-pct00015
경쇄 hu4D5Fabv8 돌연변이체는 HER2 수용체 단백질에의 효율적인 결합 (도 2 및 3) 및 비오티닐화 시약, 비오틴-PEO-말레이미드와의 티올 반응성 (실시예 1 및 2)에 대해 선택되었다. 특정 경쇄 돌연변이체는 항체-Fab의 가변 영역에서 CDR에 위치한 항원 결합 (HER2)을 위한 중요한 잔기이기 때문에 HER2에의 결합을 제한하거나 절충한다. 또한 Fab의 불변 도메인에 위치한 잔기의 일부는 이러한 잔기가 Fab의 구조 및 폴딩에 기여할 수 있기 때문에 양호하지 못한 HER2 결합을 초래하여, M13-파지 상에 양호하지 못한 4D5-Fab 디스플레이를 초래하였다 (문헌 [Junutula, J.R. et al. (2008) J. Immunol Methods, 332:41-52]). 양호하지 못한 HER2에의 결합을 갖는 경쇄 hu4D5Fabv8 돌연변이체는 위치 4, 29-32, 35, 36, 50, 82, 86, 89-91, 113, 115, 117, 120, 126, 128, 139, 141, 146, 148, 179, 186, 192, 202에 시스테인 돌연변이체를 포함하였다. 야생형 시스테인 변이체 23, 134, 194, 214가 측정되었다. 다른 경쇄 돌연변이체는 비오티닐화 시약과의 티올 반응성을 제한하였다. 유리 시스테인 아미노산 잔기는 표 4의 중앙 칼럼의 서열의 플랭킹 잔기를 갖는 중심에 있다. 경쇄의 치환된 아미노산 및 위치는 좌측 칼럼에서 지정된다. 표 4의 경쇄 hu4D5Fabv8 돌연변이체 서열 99-147은 야생형 시스테인 변이체를 제외하고, HER2 결합 및 약 0.8 이상의 티올 반응성 값을 유지하였다. 서열 99-147 (표 4)을 갖는 항체는 티올 반응성을 입증하였고, 포획 표지, 검출 표지, 약물 모이어티 또는 고체 지지체와의 공유 부착 형성에 유용할 수 있다. 표 4의 경쇄 돌연변이체는 티오Fab 또는 티오Mab로서, 예를 들어 항체-약물 접합체로서 접합될 수 있다.
Figure 112012101685569-pct00016
Figure 112012101685569-pct00017
<티오Mab의 티올 반응성>
전장, IgG 시스테인 조작된 항체 (티오Mab)의 티올 반응성을 비오티닐화 및 스트렙타비딘 결합에 의해 측정하였다 (US 7521541). 비오틴-말레이미드와 특이적으로 접합된 티오Mab를 스크리닝하기 위해 웨스턴 블롯 검정을 설정하였다. 이 검정에서, 항체를 환원 SDS-PAGE 상에서 분석하고, 비오틴의 존재를 스트렙타비딘-HRP와의 인큐베이션에 의해 특이적으로 프로빙하였다. 도 18에 나타난 바와 같이, 스트렙타비딘-HRP 상호작용은 어느 조작된 cys 변이체가 사용되는지에 따라 중쇄 또는 경쇄에서 관찰되고, 야생형에서는 상호작용이 나타나지 않으며, 이는 티오Mab 변이체가 조작된 Cys 잔기에서 비오틴을 특이적으로 접합시킨다는 것을 나타낸다. 도 18은 고정된 항-IgG-HRP (상부 겔) 및 스트렙타비딘-HRP (하부 겔) 상에서의 포획 후에 환원된, 비오티닐화 티오-IgG 변이체의 변성 겔 분석을 보여준다. 레인 1: 3A5 H-A121C. 레인 2: 3A5 L-V110C. 레인 3: 2H9 H-A121C. 레인 4: 2H9 L-V110C. 레인 5: 항-EphB2R 2H9 모, 야생형. 각각의 돌연변이체 (레인 1-4)를 HRP 검출과 함께 항-IgG에 의해 포획하였고 (상부), 이는 선택성 및 친화도가 유지되었다는 것을 나타낸다. HRP 검출과 함께 고정된 스트렙타비딘에 의한 포획 (하부)은 중쇄 및 경쇄 상의 비오틴의 위치를 확인하였다. 레인 1 및 3에서 시스테인 조작된 항체 상의 시스테인 돌연변이의 위치는 중쇄이다. 레인 2 및 4에서 시스테인 조작된 항체 상의 시스테인 돌연변이의 위치는 경쇄이다. 시스테인 돌연변이 부위는 비오틴-말레이미드 시약과 접합된다.
도 18의 티오Mab 시스테인 조작된 항체 및 2H9 V15C 변이체의 LC/MS에 의한 분석은 티올 반응성의 정량적 표시를 제공한다 (표 5).
Figure 112012101685569-pct00018
시스테인 조작은 IgG 항체의 불변 도메인, 즉 Fc 영역에서 수행하였다. 다양한 아미노산 부위를 시스테인 부위로 전환시키고, 발현된 돌연변이체, 즉 시스테인 조작된 항체를 이들의 티올 반응성에 대해 평가하였다. 비오티닐화 2H9 티오Mab Fc 변이체를 ELISA 검정에서 고정된 스트렙타비딘 상에서의 포획에 의한 HRP 정량화에 의해 티올 반응성에 대해 평가하였다 (도 19). 반응성 티올 기를 사용하여 Cys 잔기를 빠르게 스크리닝하기 위한 ELISA 검정을 확립하였다. 도 19 개략적 다이어그램에 도시된 바와 같이, 스트렙타비딘-비오틴 상호작용을 항-IgG-HRP로 프로빙한 후에 450 nm에서의 흡광도를 측정하여 모니터링하였다. 이러한 결과는 2H9-티오Fc 변이체 V282C, A287C, A339C, S375C 및 S400C가 중간 내지 최고의 티올 반응성을 갖는다는 것을 확인하였다. 2H9 티오Mab Fc 변이체의 비오틴 접합의 정도를 표 6에 보고된 바와 같이 LS/MS 분석에 의해 정량화하였다. LS/MS 분석은 A282C, S375C 및 S400C 변이체가 100% 비오틴 접합을 갖고, V284C 및 A339C가 50% 접합을 갖는다는 것을 확인하였으며, 이는 반응성 시스테인 티올 기의 존재를 나타낸다. 다른 티오Fc 변이체, 및 모, 야생형 2H9는 매우 적은 비오티닐화를 갖거나 전혀 갖지 않는다.
Figure 112012101685569-pct00019
<티오-4D5 Fab 경쇄 변이체의 티올 반응성>
항-ErbB2 항체 4D5의 다양한 시스테인 조작된 경쇄 변이체 Fab의 스크리닝은 도 8의 PHESELECTOR 검정에 의해 측정된 바와 같이 0.6 이상의 티올 반응성 값을 갖는 다수의 변이체를 제공하였다 (표 7). 표 7의 티올 반응성 값을 HC-A121C 변이체의 완전한 비오티닐화로 추정되는 100%로 설정된 중쇄 4D5 티오Fab 변이체 (HC-A121C)에 대해 정규화하고, 퍼센트 값으로 표시하였다.
Figure 112012101685569-pct00020
<항체-약물 접합체>
본 발명의 시스테인 조작된 항체는 임의의 치료제, 즉 약물 모이어티에 접합될 수 있고, 이는 반응성 시스테인 티올 기를 통해 항체에 공유 부착될 수 있다.
항체-약물 접합체 (ADC) 화합물의 예시적 실시양태는 시스테인 조작된 항체 (Ab) 및 약물 모이어티 (D)를 포함하고, 여기서 항체는 1개 이상의 유리 시스테인 아미노산을 갖고, 항체는 D에 링커 모이어티 (L)에 의해 1개 이상의 유리 시스테인 아미노산을 통해 부착되고; 조성물은 하기 화학식 I을 갖는다:
<화학식 I>
Figure 112012101685569-pct00021
여기서, p는 1, 2, 3 또는 4이다. 항체 분자에 티올 반응성 링커 모이어티를 통해 접합될 수 있는 약물 모이어티의 수는 본원에 기재된 방법에 의해 도입된 시스테인 잔기의 수에 의해 제한된다. 따라서 화학식 I의 예시적인 ADC는 1, 2, 3 또는 4개의 조작된 시스테인 아미노산을 갖는 항체를 포함한다.
항체-약물 접합체 화합물 (ADC)의 또 다른 예시적 실시양태는 시스테인 조작된 항체 (Ab), 알부민-결합 펩티드 (ABP) 및 약물 모이어티 (D)를 포함하고, 여기서 항체는 링커 모이어티 (L)에 의해 약물 모이어티에 부착되고, 항체는 아미드 결합 또는 제2 링커 모이어티에 의해 알부민-결합 펩티드에 부착되고; 조성물은 하기 화학식 Ia를 갖는다:
<화학식 Ia>
Figure 112012101685569-pct00022
여기서, p는 1, 2, 3 또는 4이다.
본 발명의 ADC 화합물은 항암 활성에 대한 유용성이 있는 것을 포함한다. 특히, 화합물은 약물 모이어티, 즉 독소에 링커에 의해 접합된, 즉 공유 부착된 시스테인-조작된 항체를 포함한다. 약물이 항체에 접합되지 않은 경우, 약물은 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 갖는다. 따라서, 약물 모이어티의 생물학적 활성은 항체에의 접합에 의해 조정된다. 본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)는 유효 용량의 세포독성제를 종양 조직으로 선택적으로 전달할 수 있으며, 이에 의해 더 높은 선택도, 즉 더 낮은 효능 용량이 달성될 수 있다.
<약물 모이어티>
항체-약물 접합체 (ADC)의 약물 모이어티 (D)는 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 갖는 임의의 화합물, 모이어티 또는 기를 포함한다. 약물 모이어티는 하기를 포함한다: (i) 미세소관 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라제 억제제 또는 DNA 삽입제로 기능할 수 있는 화학요법제; (ii) 효소적으로 기능할 수 있는 단백질 독소; 및 (iii) 방사성동위원소.
예시적인 약물 모이어티는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065, 칼리케아미신 및 상이한 에네디인 항생제, 탁산, 안트라시클린, 및 그의 입체이성질체, 동배체, 유사체 또는 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
메이탄시노이드 약물 모이어티로서 사용하기 적합한 메이탄신 화합물은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 공지된 방법에 따라 천연 공급원으로부터 단리되거나 유전 공학 기술을 이용하여 생산할 수 있거나 (문헌 [Yu et al. (2002) PROC. NAT. ACAD. SCI. (USA) 99:7968-7973] 참조), 또는 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체는 공지된 방법에 따라 합성 방식으로 제조될 수 있다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 하기와 같은 변형된 방향족 고리를 갖는 것: C-19-데클로로 (US 4256746) (안사마이토신 P2의 수소화알루미늄리튬 환원에 의해 제조); C-20-히드록시 (또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로 (미국 특허 번호 4361650 및 4307016) (스트렙토미세스 (Streptomyces) 또는 악티노미세스 (Actinomyces)를 사용한 탈메틸화 또는 LAH를 사용한 탈염소화에 의해 제조); 및 C-20-데메톡시, C-20-아실옥시 (-OCOR), +/-데클로로 (미국 특허 번호 4,294,757) (아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해 제조), 및 다른 위치에 변형을 갖는 것을 포함한다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 또한 하기와 같은 변형을 갖는 것을 포함한다: C-9-SH (US 4424219) (메이탄시놀과 H2S 또는 P2S5의 반응에 의해 제조됨); C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR) (US 4331598); C-14-히드록시메틸 또는 아실옥시메틸 (CH2OH 또는 CH2OAc) (US 4450254) (노카르디아 (Nocardia)로부터 제조됨); C-15-히드록시/아실옥시 (US 4364866) (스트렙토미세스에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해 제조된); C-15-메톡시 (미국 특허 번호 4313946 및 4315929) (트레위아 누들플로라 (Trewia nudlflora)로부터 단리됨); C-18-N-데메틸 (미국 특허 번호 4362663 및 4322348) (스트렙토미세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및 4,5-데옥시 (US 4371533) (메이탄시놀의 티타늄 트리클로라이드/LAH 환원에 의해 제조됨). 메이탄신 화합물 상의 다수의 위치가 연결 유형에 따라 연결 위치로서 유용한 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 에스테르 연결을 형성하기 위해, 히드록실 기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실 기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실 기를 갖는 C-20 위치가 모두 적합하다.
화학식 I의 항체-약물 접합체 (ADC)의 약물 모이어티 (D)는 하기 구조를 갖는 메이탄시노이드를 포함한다:
Figure 112012101685569-pct00023
여기서, 파상선은 항체-약물 접합체 (ADC)의 링커 (L)에 D의 황 원자의 공유 부착을 나타낸다. R은 독립적으로 H, 또는 메틸, 에틸, 1-프로필, 2-프로필, 1-부틸, 2-메틸-1-프로필, 2-부틸, 2-메틸-2-프로필, 1-펜틸, 2-펜틸, 3-펜틸, 2-메틸-2-부틸, 3-메틸-2-부틸, 3-메틸-1-부틸, 2-메틸-1-부틸, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, 2-메틸-2-펜틸, 3-메틸-2-펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 3-메틸-3-펜틸, 2-메틸-3-펜틸, 2,3-디메틸-2-부틸 및 3,3-디메틸-2-부틸로부터 선택된 C1-C6 알킬일 수 있다. 황 원자에 아미드 기를 부착시키는 알킬렌 쇄는 메타닐, 에타닐 또는 프로필일 수 있고, 즉 m은 1, 2 또는 3이다.
메이탄신 화합물은 미세소관 단백질, 튜불린의 중합의 억제를 통해 유사분열 동안 미세소관의 형성을 억제함으로써 세포 증식을 억제한다 (문헌 [Remillard et al. (1975) Science 189:1002-1005]). 메이탄신 및 메이탄시노이드는 고도로 세포독성이지만, 암 요법에 있어서의 그의 임상적 용도는 상당히 제한되는데, 이는 주로 종양에 대한 선택성 부족으로 인한 중증의 전신 부작용 때문이다. 메이탄신을 이용한 임상 시험은 중추 신경계 및 위장계에 대한 심각한 부작용으로 인해 중단되었다 (문헌 [Issel et al. (1978) Can. Treatment. Rev. 5:199-207]).
메이탄시노이드 약물 모이어티는, 이들이 (i) 발효 또는 화학적 변형, 발효 생성물의 유도체화에 의한 제조에 비교적 이용가능하고, (ii) 비-디술피드 링커를 통해 항체에 접합되기에 적합한 관능기로 유도체화될 수 있고, (iii) 혈장에서 안정하며, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에, 항체-약물 접합체에서 매력적인 약물 모이어티이다 (US 2005/0169933; WO 2005/037992; US 5208020).
다른 약물 모이어티와 같이, 메이탄시노이드 약물 모이어티의 모든 입체이성체, 즉 D의 키랄 탄소에서 R 배위와 S 배위의 임의의 조합물이 본 발명의 화합물에 대해 고려된다. 한 실시양태에서, 메이탄시노이드 약물 모이어티 (D)는 하기 입체화학을 가질 것이다:
Figure 112012101685569-pct00024
메이탄시노이드 약물 모이어티의 예시적 실시양태는 하기 구조를 갖는 DM1, (CR2)m = CH2CH2; DM3, (CR2)m = CH2CH2CH(CH3); 및 DM4, (CR2)m = CH2CH2C(CH3)2를 포함한다:
Figure 112012101685569-pct00025
링커는 연결 유형에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 통상적인 커플링 기술을 이용하여 히드록실 기와의 반응으로 형성될 수 있다. 반응은 히드록실 기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실 기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실 기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
화학식 I의 항체-약물 접합체 (ADC)의 약물 모이어티 (D)는 또한 돌라스타틴 및 그의 펩티드성 유사체 및 유도체, 아우리스타틴 (미국 특허 번호 5635483; 5780588)을 포함한다. 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세소관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 방해하며 (문헌 [Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584]), 항암 (US 5663149) 및 항진균 활성 (문헌 [Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965])을 갖는 것으로 나타났다. 다양한 형태의 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩티드성 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 공유 부착될 수 있다 (WO 02/088172; 문헌 [Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; Francisco et al. (2003) Blood 102(4):1458-1465]).
약물 모이어티는 돌라스타틴, 아우리스타틴 (US 5635483; US 5780588; US 5767237; US 6124431) 및 그의 유사체 및 유도체를 포함한다. 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세소관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 방해하며 (문헌 [Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584]), 항암 (US 5663149) 및 항진균 활성 (문헌 [Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965])을 갖는 것으로 나타났다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩티드성 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172).
예시적인 아우리스타틴 실시양태는 US 7498298 및 US 7659241 (각각의 개시문은 그의 전문이 명백하게 본원에 참고로 포함됨)에 개시된 N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함한다.
화학식 I의 항체-약물 접합체 (ADC)의 약물 모이어티 (D)는 항체에 N-말단을 통해 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 MMAE 및 MMAF를 포함하고, 하기 구조를 갖는다:
Figure 112012101685569-pct00026
전형적으로, 펩티드-기재의 약물 모이어티는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이의 펩티드 결합 형성으로 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어 펩티드 화학 분야에 널리 공지된 액체 상 합성 방법 (문헌 [E. Schroeder and K. Luebke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조될 수 있다.
약물 모이어티는 칼리케아미신 및 그의 유사체 및 유도체를 포함한다. 칼리케아미신 패밀리의 항생제는 피코몰 미만의 농도에서 이중-가닥 DNA 절단부를 생산할 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 접합체의 제조에 대해, US 5712374; US 5714586; US 5739116; US 5767285; US 5770701, US 5770710; US 5773001; US 5877296을 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1을 포함하나 이에 제한되지 않는다 (문헌 [Hinman et al. Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al. Cancer Research 58:2925-2928 (1998]).
단백질 독소는 하기를 포함한다: 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄 (문헌 [Vitetta et al. (1987) Science, 238:1098]), 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센 (WO 93/21232).
치료 방사성동위원소는 하기를 포함한다: 32P, 33P, 90Y, 125I, 131I, 131In, 153Sm, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi, 212Pb, 및 Lu의 방사성 동위원소.
방사성동위원소 또는 다른 표지는 공지된 방법으로 접합체에서 혼입시킬 수 있다 (문헌 [Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57; "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" Chatal, CRC Press 1989]). 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성핵종의 항체에의 접합을 위한 예시적인 킬레이팅제이다 (WO 94/11026).
<링커>
"링커" (L)는 하나 이상의 약물 모이어티 (D) 및 항체 단위 (Ab)를 연결하여 화학식 I의 항체-약물 접합체 (ADC)를 형성할 수 있는 이관능성 또는 다관능성 모이어티이다. 항체-약물 접합체 (ADC)는 약물 및 항체에 결합하기 위한 반응성 관능기를 갖는 링커를 사용하여 편리하게 제조할 수 있다. 시스테인 조작된 항체 (Ab)의 시스테인 티올은 링커 시약, 약물 모이어티 또는 약물-링커 중간체의 관능기와 결합을 형성할 수 있다.
한 측면에서, 링커는 항체 상에 존재하는 친핵성 시스테인에 반응성인 친전자성 기를 갖는 반응성 부위를 갖는다. 항체의 시스테인 티올은 링커 상의 친전자성 기와 반응성이고, 링커에의 공유 결합을 형성한다. 유용한 친전자성 기는 말레이미드 및 할로아세트아미드 기를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
시스테인 조작된 항체는 문헌 [Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773]의 페이지 766의 접합 방법, 및 실시예 4의 프로토콜에 따라 링커 시약 또는 약물-링커 중간체, 친전자성 관능기, 예컨대 말레이미드 또는 α-할로 카르보닐과 반응한다.
또 다른 실시양태에서, 링커 시약 또는 약물-링커 중간체의 반응성 기는 항체의 유리 시스테인 티올과 결합을 형성할 수 있는 티올-반응성 관능기를 함유한다. 티올-반응 관능기의 예는 말레이미드, α-할로아세틸, 활성화된 에스테르, 예컨대 숙신이미드 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 무수물, 산 클로라이드, 술포닐 클로라이드, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 링커는 1개 초과의 약물 모이어티를 분지화 다관능성 링커 모이어티를 통해 항체에 공유 부착시키기 위한 수지상 유형의 링커일 수 있다 (문헌 [Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990]). 수지상 링커는 ADC의 효능과 관련이 있는 약물 대 항체의 몰비, 즉 로딩을 증가시킬 수 있다. 따라서, 시스테인 조작된 항체가 오직 1개의 반응성 시스테인 티올 기를 보유하고 있는 경우에 다수의 약물 모이어티가 수지상 링커를 통해 부착될 수 있다.
링커는 항체 (Ab)를 본 발명의 시스테인 조작된 항체-약물 접합체 (ADC)의 약물 모이어티 (D)에 연결시키는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 아미노산 잔기는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드, 헵타펩티드, 옥타펩티드, 노나펩티드, 데카펩티드, 운데카펩티드 또는 도데카펩티드 단위를 형성할 수 있다. 아미노산 잔기는 자연적으로 발생하는 것들 뿐만 아니라 소수의 아미노산 및 비-자연 발생 아미노산 유사체, 예컨대 시트룰린을 포함한다.
유용한 아미노산 잔기 단위는 특정한 효소, 예를 들어 활성 약물 모이어티를 유리시키는 종양-연관 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대한 이들의 선택성에서 설계 및 최적화될 수 있다. 한 실시양태에서, 아미노산 잔기 단위, 예컨대 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit)은 그의 절단이 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의해 촉매되는 것이다.
링커 유닛은 ADC가 하기 예시적인 구조를 갖는 p-아미노벤질카르바모일 (PAB) 단위와 같은 자기-희생적 유형일 수 있다:
Figure 112012101685569-pct00027
여기서, Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고; m은 0-4 범위의 정수이고, p는 1 내지 4 범위이다.
자기-희생적 스페이서의 다른 예는 PAB 기에 전기적으로 유사한 방향족 화합물, 예컨대 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체 (US 7375078; 문헌 [Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237]) 및 오르토 또는 파라-아미노벤질아세탈을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 아미드 결합 가수분해시에 결정화를 진행하는 사용될 수 있는 스페이서, 예컨대 치환된 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드 (문헌 [Rodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2:223]), 적절하게 치환된 비시클로[2.2.1] 및 비시클로[2.2.2] 고리계 (문헌 [Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815]) 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드 (문헌 [Amsberry, et al. (1990) J. Org. Chem. 55:5867])를 사용할 수 있다. 글리신에서 치환된 아민-함유 약물의 제거 (문헌 [Kingsbury et al. (1984) J. Med. Chem. 27:1447])가 또한 ADC에서 유용한 자기-희생적 스페이서의 예이다.
또 다른 실시양태에서, 링커 L은 1개 초과의 약물 모이어티를 분지화 다관능성 링커 모이어티를 통해 항체에 공유 부착시키기 위한 수지상 유형 링커일 수 있다 (문헌 [Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768]). 수지상 링커는 ADC의 효능과 관련이 있는 약물 대 항체의 몰비, 즉 로딩을 증가시킬 수 있다. 따라서, 시스테인 조작된 항체가 오직 1개의 반응성 시스테인 티올 기를 보유하는 경우에 다수의 약물 모이어티가 수지상 링커를 통해 부착될 수 있다 (WO 2004/01993; 문헌 [Szalai et al. (2003) J. Amer. Chem. Soc. 125:15688-15689; Shamis et al. (2004) J. Amer. Chem. Soc. 126:1726-1731; Amir et al. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499]).
화학식 Ia 항체-약물 접합체 화합물의 실시양태는 (val-cit), (MC-val-cit) 및 (MC-val-cit-PAB)를 포함한다:
Figure 112012101685569-pct00028
화학식 Ia 항체-약물 접합체 화합물의 다른 예시적 실시양태는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112012101685569-pct00029
여기서, X는
Figure 112012101685569-pct00030
이고;
Y는
Figure 112012101685569-pct00031
이고;
R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고; n은 1 내지 12이다.
또 다른 실시양태에서, 링커는 항체 상에 존재하는 친전자성 기에 반응성인 친핵성 기를 갖는 반응성 관능기를 갖는다. 항체 상의 유용한 친전자성 기는 알데히드 및 케톤 카르보닐 기를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 링커의 친핵성 기의 헤테로원자는 항체 상의 친전자성 기와 반응하여 항체 단위에 공유 결합을 형성할 수 있다. 링커 상의 유용한 친핵성 기는 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트 및 아릴히드라지드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 항체 상의 친전자성 기는 링커와의 부착에 편리한 부위를 제공한다.
전형적으로, 펩티드-유형 링커는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성함으로써 제조할 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어 펩티드 화학 분야에 널리 공지된 액체 상 합성 방법 (문헌 [E. Schroeder and K. Luebke (1965) "The Peptides", volume 1, pp 76-136, Academic Press])에 따라 제조할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 링커는 용해도 또는 반응성을 조정한 기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 하전된 치환기, 예컨대 술포네이트 (-SO3 -) 또는 암모늄은 시약의 수용해도를 증가시키고, 링커 시약과 항체 또는 약물 모이어티와의 커플링 반응을 용이하게 하거나, 또는 ADC 제조에 사용되는 합성 경로에 따라 Ab-L (항체-링커 중간체)과 D, 또는 D-L (약물-링커 중간체)과 Ab와의 커플링 반응을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 화합물은 링커 시약: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 사용하고, 비스-말레이미드 시약: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEO)3 및 BM(PEO)4 (피어스 바이오테크놀로지, 인크., 미국 61105 일리노이주 록포드 피.오. 박스 117, 고객 서비스 부서, 미국 1-800-874-3723, 국제번호 +815-968-0747)을 포함하여 제조된 ADC를 명백하게 고려하나 이에 제한되지 않는다. 문헌 [2003-2004 Applications Handbook and Catalog]의 페이지 467-498을 참조한다. 비스-말레이미드 시약은 시스테인 조작된 항체의 티올 기가 순차적 또는 공동 방식으로, 티올-함유 약물 모이어티, 표지 또는 링커 중간체에 부착되도록 한다. 시스테인 조작된 항체의 티올 기, 약물 모이어티, 표지 또는 링커 중간체와 반응성인, 말레이미드 이외의 다른 관능기는 아이오도아세트아미드, 브로모아세트아미드, 비닐 피리딘, 디술피드, 피리딜 디술피드, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트를 포함한다.
Figure 112012101685569-pct00032
유용한 링커 시약은 또한 다른 상업적 공급원, 예컨대 몰레큘라 바이오사이언시스 인크.(Molecular Biosciences Inc., 콜로라도주 볼더)를 통해 입수할 수 있거나, 또는 문헌 [Toki et al. (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al. (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186]; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; 및 WO 04/032828에 기재된 절차에 따라 합성할 수 있다.
말레이미드 스트레쳐 및 파라-아미노벤질카르바모일 (PAB) 자기-희생적 스페이서를 갖는 예시적인 발린-시트룰린 (val-cit 또는 vc) 디펩티드 링커 시약은 하기 구조를 갖는다:
Figure 112012101685569-pct00033
여기서, Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고; m은 0-4 범위의 정수이다.
말레이미드 스트레쳐 단위 및 p-아미노벤질 자기-희생적 스페이서 단위를 갖는 예시적인 phe-lys(Mtr) 디펩티드 링커 시약은 문헌 [Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60]에 따라 제조할 수 있고, 하기 구조를 갖는다:
Figure 112012101685569-pct00034
여기서, Mtr은 모노-4-메톡시트리틸이고, Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고, m은 0-4 범위의 정수이다.
본 발명의 예시적인 항체-약물 접합체 화합물은 다음을 포함한다:
Figure 112012101685569-pct00035
여기서, Val은 발린이고, Cit는 시트룰린이고, p는 1, 2, 3 또는 4이고, Ab는 시스테인 조작된 항체이다. 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1이 트라스투주맙의 티올 기에 BMPEO 링커를 통해 연결된 다른 예시적인 항체 약물 접합체는 하기 구조를 갖는다:
Figure 112012101685569-pct00036
여기서, Ab는 시스테인 조작된 항체이고; n은 0, 1 또는 2이고; p는 1, 2, 3 또는 4이다.
<항체-약물 접합체의 제조>
화학식 I의 ADC는 다음을 포함한, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 이용하여 여러 경로에 의해 제조할 수 있다: (1) 시스테인 조작된 항체의 시스테인 기를 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통해 항체-링커 중간체 Ab-L을 형성시킨 후, 이를 활성화된 약물 모이어티 D와 반응시키는 것; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵성 기를 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통해 약물-링커 중간체 D-L을 형성시킨 후, 이를 시스테인 조작된 항체의 시스테인 기와 반응시키는 것. 접합 방법 (1) 및 (2)는 다양한 시스테인 조작된 항체, 약물 모이어티 및 링커를 사용하여 화학식 I의 항체-약물 접합체를 제조할 수 있다.
항체 시스테인 티올 기는 친핵성이고, (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기; 및 (iv) 디술피드, 예를 들어 피리딜 디술피드 (술피드 교환을 통한)를 포함하는, 링커 시약 및 약물-링커 중간체 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 약물 모이어티 상의 친핵성 기는 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는, 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트 및 아릴히드라지드 기를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
메이탄신은 예를 들어 May-SSCH3으로 전환될 수 있고, 이는 유리 티올, May-SH로 환원되고, 변형된 항체와 반응하여 (문헌 [Chari et al. (1992) Cancer Research 52:127-131]) 디술피드 링커를 갖는 메이탄시노이드-항체 면역접합체를 생성할 수 있다. 디술피드 링커를 갖는 항체-메이탄시노이드 접합체는 보고되었다 (WO 04/016801; US 6884874; US 2004/039176 A1; WO 03/068144; US 2004/001838 A1; 미국 특허 번호 6441163, 5208020, 5416064; WO 01/024763). 디술피드 링커 SPP는 링커 시약 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트로 구축한다.
특정 조건 하에, 시스테인 조작된 항체를 환원제, 예컨대 DTT (클레란드(Cleland) 시약, 디티오트레이톨) 또는 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드로 처리하여 링커 시약과의 접합에 반응성이 되도록 할 수 있다 (문헌 [Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80]; 솔텍 벤쳐스(Soltec Ventures), 매사추세츠주 비벌리). CHO 세포에서 발현되는 전장, 시스테인 조작된 모노클로날 항체 (티오Mab)는 약 50배 과량의 TCEP로 3시간 동안 37℃에서 환원시켜 새롭게 도입된 시스테인 잔기와 배양 배지에 존재하는 시스테인 사이에 형성될 수 있는 디술피드 결합을 환원시켰다. 환원된 티오Mab를 희석하고, 10 mM 아세트산나트륨 (pH 5) 중에서 HiTrap S 칼럼 상에 로딩하고, 0.3M 염화나트륨을 함유하는 PBS로 용리하였다. 디술피드 결합은 모 Mab에 존재하는 시스테인 잔기와 희석한 (200 nM) 수성 황산구리 (CuSO4) 사이에 실온에서 밤새 재확립될 수 있다. 당업계에 공지된 다른 산화제, 즉 산화 작용제, 및 산화 조건이 사용될 수 있다. 주위 공기 산화가 또한 효과적이다. 이 온화한 부분적 재산화 단계는 효율적으로 쇄내 디술피드를 고충실도로 형성시킨다. 대략 10배 과량의 약물-링커 중간체, 예를 들어 BM(PEO)4-DM1을 첨가하고, 혼합하고, 약 1시간 동안 실온에서 정치하여 접합시키고 티오Mab 항체-약물 접합체를 형성할 수 있다. 접합체 혼합물을 겔 여과하고, 로딩하고, HiTrap S 칼럼을 통해 용리하여 잉여량의 약물-링커 중간체 및 다른 불순물을 제거하였다.
도 11은 접합을 위한 세포 배양으로부터 발현된 시스테인 조작된 항체를 제조하는 일반적인 방법을 보여준다. 시스테인 부가물은 아마도 다양한 쇄간 디술피드 결합과 함께 환원적으로 절단되어 항체의 환원된 형태를 제공한다. 쌍을 이룬 시스테인 잔기 사이의 쇄간 디술피드 결합은 부분적 산화 조건 하에, 예컨대 주위 산소에 노출시켜 재형성된다. 새롭게 도입된, 조작된, 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기는 링커 시약 또는 약물-링커 중간체와의 반응에 이용가능한 상태로 남아있어 본 발명의 항체 접합체를 형성한다. 포유동물 세포주에서 발현된 티오Mab는 -S-S- 결합 형성을 통해 조작된 Cys에 대해 외부적으로 접합된 Cys 부가물을 생성시킨다. 따라서, 정제된 티오Mab는 실시예 11에 기재된 바와 같이 환원 및 산화 절차로 처리되어 반응성 티오Mab를 생성하여야 한다. 이들 티오Mab는 세포독성 약물, 형광단 및 다른 표지를 함유하는 말레이미드와 접합시키는데 사용된다.
다양한 티오Fab 및 티오Mab 항체-약물 접합체가 제조되었다 (실시예 4-8). 시스테인 돌연변이체 hu4D5Fabv8 (V110C)은 비스-말레이미도 링커 시약 BMPEO를 갖는 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1과 접합되어 hu4D5Fabv8 (V110C)-BMPEO-DM1을 형성하였다 (실시예 8).
<시험관내 세포 증식 검정>
일반적으로, 항체-약물 접합체 (ADC)의 세포독성 또는 세포증식억제 활성은 수용체 단백질, 예를 들어 HER2를 갖는 포유동물 세포를 세포 배양 배지 중에서 ADC의 항체에 노출시키고, 상기 세포를 약 6시간 내지 약 5일의 기간 동안 배양하고, 세포 생존율을 측정함으로써 측정된다. 세포-기반 시험관내 검정을 사용하여 본 발명의 ADC의 생존율 (증식), 세포독성, 및 아폽토시스 유도 (카스파제 활성화)를 측정하였다.
항체-약물 접합체의 시험관내 효능은 세포 증식 검정에 의해 측정되었다 (도 10 및 11, 실시예 9). 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 발광 세포 생존율 검정은 상업적으로 입수가능하며 (프로메가 코포레이션(Promega Corp.), 위스콘신주 매디슨), 콜레오프테라(Coleoptera) 루시페라제의 재조합 발현을 기반으로 하는 균일한 검정 방법이다 (미국 특허 번호 5583024; 5674713 및 5700670). 이러한 세포 증식 검정은 대사적으로 활성인 세포의 지표인 ATP 존재량의 정량화를 기반으로 배양물 중 생존 세포의 수를 결정한다 (문헌 [Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88]; US 6602677). 셀타이터-글로® 검정은 96웰 포맷으로 수행하여, 자동화 고처리량 스크리닝 (HTS)에 적용될 수 있게 한다 (문헌 [Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404]). 균일한 검정 절차는 단일 시약 (셀타이터-글로® 시약)을 혈청이 보충된 배지 중에서 배양된 세포에 직접 첨가하는 것을 포함한다. 세포 세척, 배지 제거, 및 다중 피펫팅 단계는 필요하지 않다. 상기 시스템은 시약을 첨가하고 혼합한 후에 10분 내에 384웰 포맷에서 겨우 15개 세포/웰에 불과한 것도 검출한다. 세포는 ADC로 계속적으로 처리될 수 있거나 또는 이들은 ADC로부터 처리 및 분리될 수 있다. 일반적으로, 간략하게, 즉 3시간 처리된 세포는 계속적으로 처리된 세포와 동일한 효력 효과를 나타내었다.
균일한 "첨가-혼합-측정" 포맷은 세포를 용해하고 그에 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 신호를 생성시킨다. ATP의 양은 배양물에 존재하는 세포의 수에 직접적으로 비례한다. 셀타이터-글로® 검정은 루시페라제 반응에 의해 생산되는 "백열광-유형"의 발광 신호를 생생하며, 그의 반감기는 일반적으로 사용된 세포형 및 배지에 따라 5시간이 넘는다. 생존 세포는 상대적 발광 단위 (RLU)에 반영된다. 기질인 딱정벌레 루시페린은 ATP를 AMP로 전환시킴과 동시에 광자를 생성하는 재조합 반딧불이 루시페라제에 의해 산화적으로 탈카르복실화된다.
<생체내 효능>
본 발명의 2개의 알부민 결합 펩티드-DM1 (메이탄시노이드)-항체-약물 접합체 (ADC)의 생체내 효능은 높은 발현 HER2 트랜스제닉 체외이식편 마우스 모델에 의해 측정된다 (도 12, 실시예 10). 동종이식편은 헤르셉틴® 요법에 반응하지 않거나 그에 대한 반응이 양호하지 않은 Fo5 mmtv 트랜스제닉 마우스로부터 증식된다. 대상체를 ABP-rhuFab4D5-cys(경쇄)-DM1; ABP-rhuFab4D5-cys(중쇄)-DM1; 및 위약 PBS 완충제 대조군 (비히클)으로 1회 처리하고, 3주에 걸쳐 모니터링하여 종양이 2배가 되는 시간, 로그 세포 사멸 및 종양 수축을 측정하였다.
<항체-약물 접합체의 투여>
본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)는 치료할 상태에 적절한 임의의 경로로 투여될 수 있다. ADC는 전형적으로 비경구로, 즉 주입, 피하, 근육내, 정맥내, 피내, 경막내 및 경막외로 투여될 것이다.
<제약 제제>
본 발명의 치료 항체-약물 접합체 (ADC)의 제약 제제는 전형적으로, 제약상 허용되는 비경구 비히클과 함께 단위 투여량의 주사가능한 형태로, 비경구 투여용, 즉 볼루스, 정맥내, 종양내 주사용으로 제조한다. 바람직한 정도의 순도를 갖는 항체-약물 접합체 (ADC)를 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 제약상 허용되는 희석제, 담체, 부형제 또는 안정화제와 임의로 혼합한다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition, Osol, A. Ed.]).
<항체-약물 접합체 치료>
본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)를 사용하여 예를 들어 종양 항원의 과다발현을 특징으로 하는 다양한 질환 또는 장애를 치료할 수 있음이 고려된다. 예시적인 상태 또는 과다증식성 장애는 양성 또는 악성 종양; 백혈병 및 림프성 악성종양을 포함한다. 기타는 뉴런, 신경교, 성상세포, 시상하부, 선상, 대식세포, 상피, 기질, 포배강, 염증성, 혈관신생 및 면역 장애 (자가면역 장애 포함)를 포함한다.
일반적으로, 치료할 질환 또는 장애는 과다증식성 장애, 예컨대 암이다. 본원에서 치료할 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성 종양을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평세포암 (예를 들어, 상피 편평세포암), 폐암, 예를 들어 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포성암, 위암, 예를 들어 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 뿐만 아니라 두경부암을 포함한다.
ADC 화합물이 치료에 사용될 수 있는 자가면역 질환은 류마티스 장애 (예컨대, 예를 들어 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 경피증, 루푸스, 예컨대 SLE 및 루푸스 신염, 다발근염/피부근염, 한랭글로불린혈증, 항-인지질 항체 증후군, 및 건선성 관절염), 골관절염, 자가면역 위장 및 간 장애 (예컨대, 예를 들어 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 결장염 및 크론병), 자가면역 위염 및 악성 빈혈, 자가면역 간염, 원발성 담즙성 간경변증, 원발성 경화성 담관염, 및 복강 질환), 혈관염 (예컨대, 예를 들어 ANCA-연관 혈관염, 예를 들어 처크-스트라우스 혈관염, 베게너 육아종증 및 다발동맥염), 자가면역 신경계 장애 (예컨대, 예를 들어 다발성 경화증, 안진전 간대성 근경련 증후군, 중증 근무력증, 시신경척수염, 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 자가면역 다발신경병증), 신장 장애 (예컨대, 예를 들어 사구체신염, 굿패스쳐 증후군 및 베르게르병), 자가면역 피부 장애 (예컨대, 예를 들어 건선, 두드러기, 담마진, 심상성 천포창, 수포성 유천포창 및 피부 홍반성 루프스), 혈액 장애 (예컨대, 예를 들어 혈소판감소성 자반증, 혈전성 혈소판감소성 자반증, 수혈후 자반증, 및 자가면역 용혈성 빈혈), 아테롬성동맥경화증, 포도막염, 자가면역 청각 질환 (예컨대, 예를 들어 내이 질환 및 청력 상실), 베체트병, 레이노 증후군, 기관 이식 및 자가면역 내분비 장애 (예컨대, 예를 들어 당뇨병성-관련 자가면역 질환, 예컨대 인슐린-의존성 당뇨병 (IDDM), 애디슨병, 및 자가면역 갑상선 질환 (예를 들어, 그레이브스병 및 갑상선염))을 포함한다. 보다 바람직한 이러한 질환은 예를 들어 류마티스 관절염, 궤양성 결장염, ANCA-연관 혈관염, 루푸스, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 그레이브스병, IDDM, 악성 빈혈, 갑상선염 및 사구체신염을 포함한다.
질환을 예방 또는 치료하는데 적절한 ADC 투여량은 상기 정의된 바와 같은 치료할 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 분자가 예방 목적으로 투여되는지 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 분자는 환자에게 1회 투여하거나 일련의 치료에 걸쳐 투여하는 것이 적합하다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해서든 연속 주입에 의해서든지 간에, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1-20 mg/kg)의 분자가 환자에게 투여할 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인에 따라 약 1μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 환자에게 투여될 ADC의 예시적인 투여량은 환자 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 약 10 mg의 범위이다.
수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 상태에 따라 바람직한 질환 증상의 저해가 일어날 때까지 치료를 지속한다. 예시적인 투여 요법은 약 4 mg/kg의 초기 부하 용량의 항-ErbB2 항체를 투여한 후, 약 2 mg/kg의 매주 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
<표지된 항체 영상화 방법>
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 시스테인 조작된 항체는 방사성핵종, 형광 염료, 생물발광-촉발 기질 모이어티, 화학발광-촉발 기질 모이어티, 효소, 및 진단, 약력학 및 치료 용도를 이용하는 영상화 실험에서 다른 검출 표지를 사용하여 시스테인 티올을 통해 표지될 수 있다. 일반적으로, 표지된 시스테인 조작된 항체, 즉 "바이오마커" 또는 "프로브"는 살아있는 유기체, 예를 들어 인간, 설치류, 또는 다른 소형 동물, 관류된 기관, 또는 조직 샘플에 주사, 관류 또는 경구 섭취에 의해 투여된다. 프로브의 분포를 시간 경로에 걸쳐 검출하고, 영상으로 나타낸다.
<제조품>
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조품 또는 "키트"가 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, 블리스터 팩 등을 포함한다. 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 용기가 형성될 수 있다. 용기는 상태의 치료에 효과적인 항체-약물 접합체 (ADC) 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥주사액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 ADC이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 해당 조성물이 선택된 상태, 예컨대 암의 치료에 사용된다는 것을 표시한다. 대안적으로 또는 추가로, 제조품은 제약상-허용되는 완충제, 예컨대 정균 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.
<실시예>
실시예 1 - 비오티닐화 티오Fab 파지의 제조
티오Fab-파지 (5 x 1012개 파지 입자)를 150배 과량의 비오틴-PEO-말레이미드 ((+)-비오티닐-3-말레이미도프로피온아미딜-3,6-디옥사옥타인디아민, 문헌 [Oda et al. (2001) Nature Biotechnology 19:379-382], 피어스 바이오테크놀로지, 인크.)와 3시간 동안 실온에서 반응시켰다. 과량의 비오틴-PEO-말레이미드를 반복된 PEG 침전 (3-4회)에 의해 비오틴-접합된 파지로부터 제거하였다. 비오틴-BMCC, PEO-아이오도아세틸 비오틴, 아이오도아세틸-LC-비오틴 및 비오틴-HPDP (피어스 바이오테크놀로지, 인크.) 및 Nα-(3-말레이미딜프로피오닐)비오시틴 (MPB, 몰레큘라 프로브스, 오레곤주 유진)을 포함하는, 시스테인 티올 기와 반응성인 친전자성 기를 갖는 다른 상업적으로 입수가능한 비오티닐화 시약을 사용할 수 있다. 비오티닐화, 이관능성 및 다관능성 링커 시약에 대한 다른 상업적 공급원은 몰레큘라 프로브스(오레곤주 유진) 및 시그마(Sigma) (미주리주 세인트 루이스)를 포함한다.
Figure 112012101685569-pct00037
실시예 2 - PHESELECTOR 검정
소 혈청 알부민 (BSA), erbB2 세포외 도메인 (HER2) 및 스트렙타비딘 (2 μg/ml의 100 μl)을 맥시소르프(Maxisorp) 96 웰 플레이트 상에 개별적으로 코팅하였다. 0.5% 트윈-20 (PBS 중)으로 차단한 후에, 비오티닐화 및 비-비오티닐화 hu4D5Fabv8-티오Fab-파지 (2x1010개 파지 입자)를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 표지된 2차 항체 (항-M13 파지 코트 단백질, pVIII 단백질 항체)와 인큐베이션하였다. 도 8은 Fab 또는 티오Fab의 HER2에의 결합 (상부) 및 비오티닐화 티오Fab의 스트렙타비딘에의 결합 (하부)을 도시하는 개략적 표현에 의해 PHESELECTOR 검정을 설명한다.
표준 HRP 반응을 수행하고, 흡광도를 450 nm에서 측정하였다. 티올 반응성을 스트렙타비딘에 대한 OD450/HER2에 대한 OD450 사이의 비를 계산하여 측정하였다. 1의 티올 반응성 값은 시스테인 티올의 완전한 비오티닐화를 나타낸다. Fab 단백질 결합 측정의 경우에, hu4D5Fabv8 (2-20 ng)을 사용한 후에 HRP 표지된 염소 폴리클로날 항-Fab 항체와 인큐베이션하였다.
실시예 3a - 티오Fab의 발현 및 정제
34B8, 비-저해제 이. 콜라이 균주에서 유도시에 티오Fab가 발현되었다 (문헌 [Baca et al. (1997) Journal Biological Chemistry 272(16):10678-84]). 수확된 세포 펠릿을 PBS (포스페이트 완충 염수)에 재현탁시키고, 전체 세포 용해는 마이크로플루이다이저를 통해 통과시켜 수행하고, 티오Fab를 단백질 G 세파로스TM (아머샴)를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
티오Fab L-V15C, L-V110C, H-A88C 및 H-A121C를 발현시키고, 단백질-G 세파로스TM 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 올리고머-Fab는 분획 26 내지 30에 존재하고, 대부분의 단량체 형태는 분획 31-34에 존재하였다. 단량체 형태로 이루어진 분획을 모으고, 야생형 hu4D5Fabv8과 함께 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 환원 (DTT 또는 BME 존재) 및 비-환원 (DTT 또는 BME 부재) 조건에서 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다. A121C-티오Fab의 겔 여과 분획을 비-환원 SDS-PAGE 상에서 분석하였다.
티오Fab를 상기 기재된 바와 같이 비오틴-PEO-말레이미드와 접합시키고, 비오티닐화-티오Fab를 유리 비오틴-PEO-말레이미드 및 티오Fab의 올리고머 분획을 제거하는 슈퍼덱스-200TM (아머샴) 겔 여과 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 야생형 hu4D5Fabv8 및 hu4D5Fabv8 A121C-티오Fab (정량적으로 0.5 mg)를 각각 및 개별적으로 100배 몰 과량의 비오틴-PEO-말레이미드와 3시간 동안 실온에서 인큐베이션하고, 슈퍼덱스-200 겔 여과 칼럼 상에 로딩하여 유리 비오틴 뿐만 아니라 단량체 형태로부터의 올리고머 Fab를 분리하였다.
실시예 3b - 티오Fab의 분석
비오티닐화 hu4D5Fabv8 (A121C) 티오Fab 및 야생형 hu4D5Fabv8의 효소적 소화 단편을 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 질량 분광분석법 (LS-ESI-MS)에 의해 분석하였다. 비오티닐화 hu4D5Fabv8 (A121C)의 48294.5 일차 질량과 야생형 hu4D5Fabv8의 47737.0 일차 질량 사이의 차이는 557.5 질량 단위이다. 이 단편은 단일 비오틴-PEO-말레이미드 모이어티 (C23H36N5O7S2)의 존재를 나타낸다. 표 8은 서열을 확인하는 단편화 값의 할당을 보여준다.
Figure 112012101685569-pct00038
슈퍼덱스-200 겔 여과 이전 또는 이후에, DTT 또는 BME에 의한 환원의 존재 및 부재 하에, 비오티닐화 ABP-hu4D5Fabv8-A121C, 비오티닐화 ABP-hu4D5Fabv8-V110C, 비오티닐화 이중 Cys ABP-hu4D5Fabv8-(V110C-A88C) 및 비오티닐화 이중 Cys ABP-hu4D5Fabv8-(V110C-A121C)의 SDS-PAGE 겔 분석을 수행하였다.
hu4D5Fabv8-(V110C)-BMPEO-DM1 (슈퍼덱스-200 겔 여과 정제 후)의 질량 분광법 분석 (MS/MS): Fab+1 51607.5, Fab 50515.5. 이 데이터는 91.2% 접합을 보여준다. hu4D5Fabv8-(V110C)-BMPEO-DM1 (환원됨)의 MS/MS 분석: LC 23447.2, LC+1 24537.3, HC (Fab) 27072.5. 이 데이터는 모든 DM1 접합이 Fab의 경쇄 상에 있다는 것을 보여준다.
실시예 4 - ABP-hu4D5Fabv8-(V110C) 및 MC-MMAE의 접합에 의한 ABP-hu4D5Fabv8-(V110C)-MC-MMAE의 제조
DMSO에 용해된 약물 링커 시약, 말레이미도카프로일-모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 즉 MC-MMAE를 공지의 농도에서 아세토니트릴 및 물에 희석하고, 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 냉각된 ABP-hu4D5Fabv8-(V110C) 티오Fab에 첨가하였다 (US 7521541, US 7659241 및 US 7498298에 따름). 약 1시간 후에, 과량의 말레이미드를 첨가하여 반응을 켄칭시키고, 임의의 미반응 항체 티올 기를 캡핑하였다. 반응 혼합물을 원심분리 한외여과에 의해 농축하고, ABP-hu4D5Fabv8-(V110C)-MC-MMAE를 정제하고, PBS 중 G25 수지를 통한 용리에 의해 탈염시키고, 멸균 조건 하에 0.2 μm 필터를 통해 여과하고, 동결시켜 저장하였다.
실시예 5 - ABP-hu4D5Fabv8-(LC V110C) 및 MC-MMAF의 접합에 의한 ABP-hu4D5Fabv8-(LC V110C)-MC-MMAF의 제조
ABP-hu4D5Fabv8-(LC V110C)-MC-MMAF는 실시예 4의 절차에 따라 ABP-hu4D5Fabv8-(LC V110C) 티오Fab 및 MC-MMAF의 접합에 의해 제조하였다.
실시예 6 - ABP-HC A121C-티오Fab 및 MC-val-cit-PAB-MMAE의 접합에 의한 ABP-HC A121C-티오Fab-MC-val-cit-PAB-MMAE의 제조
ABP-hu4D5Fabv8-(HC A121C)-MC-val-cit-PAB-MMAE는 실시예 4의 절차에 따라 ABP-hu4D5Fabv8-(HC A121C) 및 MC-val-cit-PAB-MMAE의 접합에 의해 제조하였다.
실시예 7 - ABP-HC A121C-티오Fab 및 MC-val-cit-PAB-MMAF의 접합에 의한 ABP-HC A121C-티오Fab-MC-val-cit-PAB-MMAF의 제조
ABP-hu4D5Fabv8-(HC A121C)-MC-val-cit-PAB-MMAF는 실시예 4의 절차에 따라 ABP-hu4D5Fabv8-(HC A121C) 및 MC-val-cit-PAB-MMAF의 접합에 의해 제조하였다.
Figure 112012101685569-pct00039
실시예 8 - hu4D5Fabv8-(LC V110C) 티오Fab-BMPEO-DM1의 제조
hu4D5Fabv8-(V110C) 티오Fab 상의 유리 시스테인을 비스-말레이미도 시약 BM(PEO)3 (피어스 케미칼 (Pierce Chemical))에 의해 변형시켰으며, 항체의 표면 상에 미반응 말레이미도 기가 남았다. 이는 BM(PEO)4를 50％ 에탄올/물 혼합물에 10 mM의 농도로 용해시키고, 10배 몰 과량의 BM(PEO)3을 포스페이트 완충 염수 중 hu4D5Fabv8-(V110C) 티오Fab를 함유하는 용액에 대략 1.6 mg/ml (10 마이크로몰)의 농도로 첨가하고, 1시간 동안 반응시킴으로써 달성하였다. 과량의 BM(PEO)3은 150 mM NaCl 완충제를 사용하는 30 mM 시트레이트 (pH 6) 중의 겔 여과 (HiTrap 칼럼, 파마시아(Pharmacia))에 의해 제거하였다. 디메틸 아세트아미드 (DMA)에 용해된 대략 10배 몰 과량의 DM1을 hu4D5Fabv8-(LC V110C) 티오Fab-BMPEO 중간체에 첨가하였다. 디메틸포름아미드 (DMF)를 또한 사용하여 약물 모이어티 시약을 용해시킬 수 있다. 반응 혼합물을 밤새 반응시킨 후에 PBS 내로 겔 여과 또는 투석하여 미반응 약물을 제거하였다. PBS 중 S200 칼럼 상의 겔 여과를 이용하여 고분자량 응집물을 제거하고, 정제된 hu4D5Fabv8-(LC V110C) 티오Fab-BMPEO-DM1을 제공하였다.
동일한 프로토콜에 의해, hu4D5Fabv8 (HC A121C) 티오Fab-BMPEO-DM1을 제조하였다.
실시예 9 - 시험관내 세포 증식 검정
ADC의 효능은 하기 프로토콜을 사용하는 세포 증식 검정에 의해 측정하였다 (셀타이터 글로 발광 세포 생존율 검정, 프로메가 코포레이션 테크니칼 불레틴 TB288; 문헌 [Mendoza et al. (2002) Cancer Res. 62:5485-5488]):
1. 배지 중에 약 104개 세포 (SKBR-3, BT474, MCF7 또는 MDA-MB-468)를 함유하는 세포 배양물 100 μl의 분취액을 96-웰 불투명-벽 플레이트의 각각의 웰에 침착시켰다.
2. 배지를 함유하고 세포는 함유하지 않는 대조군 웰을 제조하였다.
3. ADC를 실험 웰에 첨가하고, 3-5일 동안 인큐베이션하였다.
4. 플레이트를 대략 30분 동안 실온으로 평형화시켰다.
5. 각각의 웰에 존재하는 세포 배양 배지의 부피와 동일한 부피의 셀타이터-글로 시약을 첨가하였다.
6. 내용물을 오비탈 진탕기 상에서 2분 동안 혼합하여 세포 용해를 유도하였다.
7. 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 발광 신호를 안정화시켰다.
8. 발광을 기록하고, RLU = 상대적 발광 단위로 그래프에 기록하였다.
특정 세포를 96-웰 플레이트, 50 uL/웰 중에 1000-2000개/웰 (PC3 세포주) 또는 2000-3000개/웰 (OVCAR-3)로 시딩한다. 1일 (PC3) 또는 2일 (OVCAR-3) 후에, ADC를 50 μL 부피에서 9000, 3000, 1000, 333, 111, 37, 12.4, 4.1 또는 1.4 ng/mL의 최종 농도로 첨가한다 ("ADC 없음" 대조군 웰에 배지만을 첨가함). 조건은 2회 또는 3회 반복한다. 3일 (PC3) 또는 4-5일 (OVCAR-3) 후에, 100 μL/웰 셀 타이터글로 II를 첨가하고 (루시페라제-기반 검정; ATP 수준에 의해 측정되는 증식), 세포 카운트는 발광측정기를 이용하여 결정한다. 데이터는 각각의 반복 세트의 발광의 평균으로 플롯팅한다 (표준 편차 오차 막대 표시함). 프로토콜은 셀타이터 글로 발광 세포 생존율 검정 (프로메가)의 변형이다:
1. 배지의 PC3/Muc16, PC3/neo의 1000개 세포/웰 (50 μL/웰 중)을 플레이팅한다. Ovcar3 세포는 그의 배지의 2000개 세포/웰 (50 μL 중)로 플레이팅되어야 한다. (하기 방안) 세포를 밤새 부착시킨다.
2. ADC를 작업 농도 18 μg/ml에서 시작하여 배지 중에서 1:3으로 연속적으로 희석한다 (이는 9 μg/ml의 최종 농도를 생성함). 50 μL의 희석된 ADC는 이미 웰에서 50 μL의 세포 및 배지에 첨가된다.
3. 72-96시간 인큐베이션한다 (표준은 72시간이지만, 0 ug/mL 농도를 주시하여 세포가 85-95% 전면성장률일 때 검정을 중지함).
4. 100 μL/웰의 프로메가 셀 타이터 글로 시약을 첨가하고, 3분 진탕시키고, 발광측정기에서 판독한다
배지: PC3/neo 및 PC3/MUC16은 50/50/10%FBS/글루타민에서 성장시키고/250 μg/mL G-418 OVCAR-3은 RPMI/20%FBS/글루타민에서 성장시킨다.
실시예 10 - 높은 발현 HER2 트랜스제닉 체외이식편 마우스에서의 생체내 종양 성장 억제 효능
트랜스제닉 실험에 적합한 동물은 표준 상업적 공급원, 예컨대 타코닉(Taconic) (뉴욕주 저먼타운)으로부터 수득할 수 있다. 다수의 종이 적합하지만, FVB 암컷 마우스가 그의 보다 높은 종양 형성 가능성 때문에 바람직하다. 수컷 FVB를 교배에 사용하였고, 정관절제된 CD.1 종을 이용하여 위임신을 자극하였다. 정관절제된 마우스를 임의의 상업적 공급업체로부터 수득할 수 있다. 파운더는 FVB 마우스 또는 129/BL6 x FVB p53 이종접합 마우스와 번식시켰다. p53 대립유전자에 이형접합성을 갖는 마우스를 이용하여 종양 형성을 잠재적으로 증가시켰다. 그러나, 이것은 불필요한 것으로 판명되었다. 따라서, 일부 F1 종양은 혼합된 종의 것이다. 파운더 종양은 오직 FVB이다. 한배 자손을 갖지 않고 일부 종양이 발생한 6 파운더를 수득하였다.
종양 (Fo5 mmtv 트랜스제닉 마우스로부터 증식된 동종이식편)을 갖는 동물을 ADC의 IV 주사에 의해 단일 또는 다중 용량으로 처리하였다. 종양 부피를 주사 후에 다양한 시점에서 평가하였다.
종양은 HER2의 래트 상동체인 neu의 돌연변이에 의해 활성화된 형태를 발현하는 트랜스제닉 마우스에서 쉽게 발생하지만, 인간 유방암에서 과다발현되는 HER2는 돌연변이되지 않고, 종양 형성은 비돌연변이된 HER2를 과다발현하는 트랜스제닉 마우스에서 훨씬 덜 강력하다 (문헌 [Webster et al. (1994) Semin. Cancer Biol. 5:69-76]).
비돌연변이된 HER2를 갖는 종양 형성을 개선시키기 위해, 상류 ATG 코돈에서의 번역의 개시를 방지하기 위해 이러한 상류 ATG를 결실시킨 HER2 cDNA 플라스미드 (이는 달리 HER2의 하류의 정확한 개시 코돈으로부터의 번역 개시의 빈도를 감소시킴)를 이용하여 트랜스제닉 마우스를 생산하였다 (예를 들어, 문헌 [Child et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 24335-24341] 참조). 추가로, 키메라 인트론을 5' 말단에 부가하였으며, 이는 또한 이전에 보고된 바와 같이 발현 수준을 증진시켜야 한다 (문헌 [Neuberger and Williams (1988) Nucleic Acids Res. 16:6713; Buchman and Berg (1988) Mol. Cell. Biol. 8:4395; Brinster et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836]). 키메라 인트론은 프로메가 벡터, Pci-neo 포유동물 발현 벡터 (bp 890-1022)로부터 유래되었다. cDNA 3'-말단은 인간 성장 호르몬 엑손 4 및 5, 및 폴리아데닐화 서열에 의해 말단절단된다. 또한, FVB 마우스를 사용하였으며, 이는 이러한 종이 종양 발생 가능성이 더 크기 때문이다. MMTV-LTR로부터의 프로모터를 사용하여 유선에서 조직-특이적 HER2 발현을 확실하게 하였다. 동물은 종양 형성 가능성을 증가시키기 위해 AIN 76A 식이를 공급하였다 (문헌 [Rao et al. (1997) Breast Cancer Res. and Treatment 45:149-158]).
실시예 11 - 접합을 위한 티오Mab의 환원/산화
CHO 세포에서 발현된 전장, 시스테인 조작된 모노클로날 항체 (티오Mab)를 약 50배 과량의 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드; 문헌 [Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80]; 솔텍 벤쳐스, 매사추세츠주 비벌리)로 3시간 동안 37℃에서 환원시켰다. 환원된 티오Mab (도 11)를 희석하고, 10 mM 아세트산나트륨 (pH 5) 중 HiTrap S 칼럼 상에 로딩하고, 0.3M 염화나트륨을 함유하는 PBS로 용리하였다. 용리된 환원된 티오Mab를 200 nM 수성 황산구리 (CuSO4)로 실온에서 밤새 처리하였다. 데히드로아스코르브산 (DHAA) 및 주변 공기 산화가 또한 효과적인 산화제이다.
실시예 12 - 티오Mab의 접합
티오-트라스투주맙 (HC A121C), 티오-2H9 (A121C) 및 티오-3A5 (A121C)를 포함하는, 실시예 11로부터의 재산화된 티오Mab를 10배 과량의 약물-링커 중간체, BM(PEO)3-DM1과 조합하고, 혼합하고, 약 1시간 동안 실온에서 정치시켜 접합을 수행하고 티오Mab 항체-약물 접합체 (티오-트라스투주맙 (HC A121C)-BMPEO-DM1, 티오-2H9 (HC A121C)-BMPEO-DM1 및 티오-3A5 (HC A121C)-BMPEO-DM1 포함)를 형성하였다. 접합 혼합물은 겔 여과 또는 로딩하고, HiTrap S 칼럼을 통해 용리하여 잉여량의 약물-링커 중간체 및 다른 불순물을 제거하였다.
본 발명은 본 발명의 몇몇 측면의 설명으로 의도되는 실시예에 개시된 구체적 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않을 것이며, 기능상으로 동등한 임의의 실시양태가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 사실상, 본원에 제시되고 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 당업자에게 명백하게 될 것이며, 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 참고문헌은 그의 전문이 모든 목적을 위해 명백하게 참고로 포함된다.
Sequence Listing <110> Bhakta, Sunil Junutula, Jagath Reddy <120> CYSTEINE ENGINEERED ANTIBODIES AND CONJUGATES <130> P4444R1 <141> 2011-06-07 <150> US 61/352,728 <151> 2010-06-08 <160> 147 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 1 Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Ser Gln Arg Leu Met Glu 1 5 10 15 Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp Phe 20 25 30 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 2 Gln Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu 1 5 10 15 Trp Glu Asp Asp Phe 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 3 Gln Arg Leu Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu 1 5 10 15 Trp Glu Asp Asp Phe 20 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 4 Arg Leu Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Glu Asp Asp <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 5 Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 <210> 6 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> artificial protein <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30 Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Cys Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr 95 100 105 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 125 130 135 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 140 145 150 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 155 160 165 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 170 175 180 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 185 190 195 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 200 205 210 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 215 220 225 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 320 325 330 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 335 340 345 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 350 355 360 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 365 370 375 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 380 385 390 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 395 400 405 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 410 415 420 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 425 430 435 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 440 445 450 <210> 7 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30 Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr 95 100 105 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 Cys Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 125 130 135 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 140 145 150 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 155 160 165 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 170 175 180 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 185 190 195 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 200 205 210 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 215 220 225 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 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11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 107 Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Pro Glu Asp 1 5 10 <210> 108 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 108 Thr Ile Ser Ser Leu Cys Pro Glu Asp Phe Ala 1 5 10 <210> 109 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 109 Ile Ser Ser Leu Gln Cys Glu Asp Phe Ala Thr 1 5 10 <210> 110 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 110 Tyr Cys Gln Gln His Cys Thr Thr Pro Pro Thr 1 5 10 <210> 111 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 111 Gln His Tyr Thr Thr Cys Pro Thr Phe Gly Gln 1 5 10 <210> 112 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 112 Thr Pro Pro Thr Phe Cys Gln Gly Thr Lys Val 1 5 10 <210> 113 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 113 Pro 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<220> <223> sequence is synthesized <400> 133 Ala Lys Val Gln Trp Cys Val Asp Asn Ala Leu 1 5 10 <210> 134 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 134 Val Gln Trp Lys Val Cys Asn Ala Leu Gln Ser 1 5 10 <210> 135 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 135 Val Asp Asn Ala Leu Cys Ser Gly Asn Ser Gln 1 5 10 <210> 136 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 136 Gln Ser Gly Asn Ser Cys Glu Ser Val Thr Glu 1 5 10 <210> 137 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 137 Leu Thr Leu Ser Lys Cys Asp Tyr Glu Lys His 1 5 10 <210> 138 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 138 Thr Leu Ser Lys Ala Cys Tyr Glu Lys His Lys 1 5 10 <210> 139 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 139 Lys Ala Asp Tyr Glu Cys His Lys Val Tyr 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is synthesized <400> 146 Leu Ser Ser Pro Val Cys Lys Ser Phe Asn Arg 1 5 10 <210> 147 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 147 Ser Ser Pro Val Thr Cys Ser Phe Asn Arg Gly 1 5 10

Claims (30)

  1. 하기 화학식 I을 갖는 항체-약물 접합체(ADC):
    <화학식 I>
    Figure 112017099668044-pct00065

    상기 식에서, L은 링커이고, D는 약물 모이어티이며, p는 1, 2, 3 또는 4이고, Ab는 유리 시스테인 아미노산, 및 하기 서열로부터 선택되는 중쇄 서열
    Figure 112017099668044-pct00066

    또는 하기 서열로부터 선택되는 경쇄 서열
    Figure 112017099668044-pct00067

    을 포함하는 시스테인 조작된 항체이며, 여기서 서열 내의 시스테인은 유리 시스테인 아미노산이고, 상기 항체는 유리 시스테인 아미노산을 통해 링커 모이어티(L)에 의해 D에 결합되며, 상기 시스테인 조작된 항체는 단리되었을 때 0.8 이상의 티올 반응성 값을 갖는다.
  2. (i) 시스테인 조작된 항체를 코딩하기 위해 1개 이상의 아미노산 잔기를 시스테인으로 대체함으로써 모 항체의 핵산 서열을 돌연변이유발시키는 것;
    (ii) 시스테인 조작된 항체를 발현시키는 것; 및
    (iii) 시스테인 조작된 항체를 단리하는 것
    을 포함하는 방법에 의해 시스테인 조작된 항체를 형성시키는 것을 포함하는, 제1항의 ADC의 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, 돌연변이유발이 부위-지정 돌연변이유발을 포함하는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 시스테인 조작된 항체를 파지 또는 파지미드 입자로부터 선택된 바이러스 입자 상에서 발현시키는 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    (i) 시스테인 조작된 항체를 티올-반응성 친화성 시약과 반응시켜 친화도 표지된, 시스테인 조작된 항체를 생성하는 것; 및
    (ii) 친화도 표지된, 시스테인 조작된 항체의 포획 매질에의 결합을 측정하는 것
    을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 티올-반응성 친화성 시약이 비오틴 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 티올-반응성 시약이 말레이미드 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 포획 매질이 스트렙타비딘을 포함하는 것인 방법.
  9. 제2항에 있어서,
    a) 시스테인 조작된 항체의 시스테인 기를 링커 L과 반응시켜 공유 결합을 통해 항체-링커 중간체 Ab-L을 형성시킨 후, 이를 활성화된 약물 모이어티 D와 반응시키는 것; 또는
    b) 약물 모이어티 D의 친핵성 기를 링커 시약과 반응시켜 공유 결합을 통해 약물-링커 중간체 D-L을 형성시킨 후, 이를 시스테인 조작된 항체의 시스테인 기와 반응시키는 것
    을 추가로 포함하는 방법.
  10. a) 시스테인 조작된 항체의 시스테인 기를 링커 L과 반응시켜 공유 결합을 통해 항체-링커 중간체 Ab-L을 형성시킨 후, 이를 활성화된 약물 모이어티 D와 반응시키는 것; 또는
    b) 약물 모이어티 D의 친핵성 기를 링커 시약과 반응시켜 공유 결합을 통해 약물-링커 중간체 D-L을 형성시킨 후, 이를 시스테인 조작된 항체의 시스테인 기와 반응시키는 것
    을 포함하는, 제1항의 ADC의 제조 방법.
  11. 제1항에 있어서, 시스테인 조작된 항체가 알부민-결합 펩티드(ABP)를 포함하는 융합 단백질인 ADC.
  12. 제11항에 있어서, ABP가 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4 및 서열 5로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 ADC.
  13. 제1항에 있어서, 시스테인 조작된 항체가 모노클로날 항체, 항체 단편, 이중특이적 항체, 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체로부터 선택되는 것인 ADC.
  14. 제13항에 있어서, 항체 단편이 Fab 단편인 ADC.
  15. 제13항에 있어서, 시스테인 조작된 항체가 항-HER2 항체인 ADC.
  16. 제1항에 있어서, 시스테인 조작된 항체가 하기 수용체 (1)-(36) 중 하나 이상에 결합하는 것인 ADC:
    (1) BMPR1B (골 형태발생 단백질 수용체-유형 IB);
    (2) E16 (LAT1, SLC7A5);
    (3) STEAP1 (전립선의 6회 막횡단 상피 항원);
    (4) 0772P (CA125, MUC16);
    (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, 거핵구 증강 인자, 메소텔린);
    (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 캐리어 패밀리 34 (인산나트륨), 구성원 2, 유형 II 나트륨-의존성 포스페이트 수송체 3b);
    (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, sema 도메인, 7개 트롬보스폰딘 반복부 (유형 1 및 유형 1-유사), 막횡단 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B);
    (8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자);
    (9) ETBR (엔도텔린 유형 B 수용체);
    (10) MSG783 (RNF124, 가설 단백질 FLJ20315);
    (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 연관 유전자 1, 전립선암 연관 단백질 1, 전립선의 6회 막횡단 상피 항원 2, 6회 막횡단 전립선 단백질);
    (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 잠재성 양이온 채널, 서브패밀리 M, 구성원 4);
    (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장 인자);
    (14) CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792);
    (15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (이뮤노글로불린-연관 베타), B29);
    (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (SH2 도메인 함유 포스파타제 앵커 단백질 1a), SPAP1B, SPAP1C);
    (17) HER2;
    (18) NCA;
    (19) MDP;
    (20) IL20Rα;
    (21) 브레비칸;
    (22) EphB2R;
    (23) ASLG659;
    (24) PSCA;
    (25) GEDA;
    (26) BAFF-R (B 세포-활성화 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3);
    (27) CD22 (B-세포 수용체 CD22-B 이소형);
    (28) CD79a (CD79A, CD79α, 이뮤노글로불린-연관 알파, B 세포-특이적 단백질);
    (29) CXCR5 (버킷 림프종 수용체 1, G 단백질-커플링된 수용체);
    (30) HLA-DOB (MHC 클래스 II 분자의 베타 서브유닛 (Ia 항원));
    (31) P2X5 (퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이팅 이온 채널 5);
    (32) CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2);
    (33) LY64 (림프구 항원 64 (RP105), 류신 풍부 반복부 (LRR) 패밀리의 유형 I 막 단백질);
    (34) FcRH1 (Fc 수용체-유사 단백질 1);
    (35) IRTA2 (이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 수용체 전위 연관 2); 및
    (36) TENB2 (추정 막횡단 프로테오글리칸).
  17. 제1항에 있어서, 시스테인 조작된 항체가 포획 표지, 검출 표지, 약물 모이어티 또는 고체 지지체에 공유 부착된 것인 ADC.
  18. 제17항에 있어서, 항체가 비오틴 포획 표지에 공유 부착된 것인 ADC.
  19. 제17항에 있어서, 항체가 형광 염료 검출 표지에 공유 부착된 것인 ADC.
  20. 제19항에 있어서, 형광 염료가 플루오레세인 유형, 로다민 유형, 단실, 리사민(Lissamine), 시아닌, 피코에리트린, 텍사스 레드(Texas Red) 및 그의 유사체로부터 선택되는 것인 ADC.
  21. 제17항에 있어서, 항체가 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 89Zr, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At 및 213Bi로부터 선택된 방사성핵종 검출 표지에 공유 부착된 것인 ADC.
  22. 제17항에 있어서, 항체가 킬레이팅 리간드에 의해 검출 표지에 공유 부착된 것인 ADC.
  23. 제22항에 있어서, 킬레이팅 리간드가 DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA 및 TETA로부터 선택되는 것인 ADC.
  24. 제1항 및 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 모이어티가 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트리코테센, CC1065, 칼리케아미신, 에네디인 항생제, 탁산 및 안트라시클린으로부터 선택된 것인 ADC.
  25. 제24항에 있어서, 하기 구조를 갖는 것인 ADC.
    Figure 112017099668044-pct00068
  26. 제24항에 있어서, D가 하기 구조를 갖는 메이탄시노이드인 ADC:
    Figure 112017099668044-pct00069

    여기서, 파상선은 D의 황 원자의 링커에의 공유 부착을 나타내고;
    R은 독립적으로 H, 메틸, 에틸, 1-프로필, 2-프로필, 1-부틸, 2-메틸-1-프로필, 2-부틸, 2-메틸-2-프로필, 1-펜틸, 2-펜틸, 3-펜틸, 2-메틸-2-부틸, 3-메틸-2-부틸, 3-메틸-1-부틸, 2-메틸-1-부틸, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, 2-메틸-2-펜틸, 3-메틸-2-펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 3-메틸-3-펜틸, 2-메틸-3-펜틸, 2,3-디메틸-2-부틸 및 3,3-디메틸-2-부틸로부터 선택되고;
    m은 1, 2 또는 3이다.
  27. 제26항에 있어서, D가 하기 구조로부터 선택되는 것인 ADC:
    Figure 112017099668044-pct00070
    ;
    Figure 112017099668044-pct00071
    .
  28. 제27항에 있어서, 하기 구조를 갖는 것인 ADC:
    Figure 112017099668044-pct00072

    여기서, n은 0, 1 또는 2이다.
  29. 제24항에 있어서, D가 하기 구조를 갖는 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 MMAE 또는 MMAF인 ADC.
    Figure 112017099668044-pct00073
  30. 제29항에 있어서, 항체-약물 접합체가 하기 구조로부터 선택되는 것인 ADC:
    Figure 112017099668044-pct00074

    여기서, Val은 발린이고; Cit는 시트룰린이고; p는 1, 2, 3 또는 4이다.
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Families Citing this family (167)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR080243A1 (es) 2010-02-23 2012-03-21 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores
WO2011118739A1 (ja) 2010-03-26 2011-09-29 協和発酵キリン株式会社 新規修飾部位導入抗体および抗体フラグメント
KR101839163B1 (ko) 2010-06-08 2018-03-15 제넨테크, 인크. 시스테인 조작된 항체 및 접합체
MX345519B (es) 2010-12-20 2017-02-01 Genentech Inc Anticuerpos anti-mesotelina e inmunoconjugados.
WO2013063516A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Neotope Biosciences Limited Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein
US11147852B2 (en) 2011-12-23 2021-10-19 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
IN2014DN07149A (ko) * 2012-01-27 2015-04-24 Neotope Biosciences Ltd
MX353608B (es) * 2012-02-24 2018-01-19 Alteogen Inc Anticuerpo modificado en el que el tema que comprende residuos de cisteina esta ligado, conjugado de farmaco de anticuerpo modificado que comprende el anticuerpo modificado y metodo de produccion para el mismo.
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
AR090903A1 (es) 2012-05-01 2014-12-17 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados anti-pmel17
CN104662000B (zh) * 2012-05-15 2018-08-17 索伦托医疗有限公司 药物偶联物及其偶联方法和用途
CN104540519B (zh) * 2012-05-21 2018-06-01 基因泰克公司 抗Ly6E抗体和免疫缀合物及使用方法
KR102090849B1 (ko) * 2012-07-04 2020-03-19 에프. 호프만-라 로슈 아게 공유 결합된 항원-항체 접합체
RU2015106946A (ru) 2012-08-02 2016-09-27 Дженентек, Инк. Антитела к рецептору эндотелина типа в (etbr) и их иммуноконъюгаты
EP2879708A4 (en) 2012-08-02 2016-03-16 Genentech Inc ANTIBODY AND ANTI-ETBR IMMUNOCONJUGATES
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
US9393327B2 (en) 2012-12-19 2016-07-19 Genentech, Inc. Methods and compositions for radiohalogen protein labeling
CN103333246B (zh) * 2012-12-21 2015-09-16 百奥泰生物科技(广州)有限公司 一种抗egfr受体的肿瘤生长抑制剂及其制备方法和用途
SG11201504887TA (en) 2012-12-21 2015-07-30 Bioalliance Cv Hydrophilic self-immolative linkers and conjugates thereof
CN104688740A (zh) * 2012-12-21 2015-06-10 百奥泰生物科技(广州)有限公司 类美登素衍生物及其制备方法和用途
CN103933575B (zh) 2013-01-23 2017-09-29 上海新理念生物医药科技有限公司 一种三齿型连接子及其应用
AU2014214751B2 (en) 2013-02-08 2017-06-01 Novartis Ag Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
EP2961435B1 (en) * 2013-02-28 2019-05-01 ImmunoGen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
US9803002B2 (en) 2013-05-31 2017-10-31 Genentench, Inc. Anti-wall teichoic antibodies and conjugates
CA2913011A1 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Genentech, Inc. Anti-wall teichoic antibodies and conjugates
SG11201509839TA (en) 2013-05-31 2016-01-28 Genentech Inc Anti-wall teichoic antibodies and conjugates
US10457741B2 (en) 2013-07-03 2019-10-29 Seoul National University R&Db Foundation Chicken antibody transformed into cysteine and site-specific conjugation using same
ES2871418T3 (es) * 2013-08-28 2021-10-28 Abbvie Stemcentrx Llc Composiciones y métodos de conjugación de anticuerpos específicos de sitio
EP3338793A1 (en) 2013-08-28 2018-06-27 AbbVie Stemcentrx LLC Novel sez6 modulators and methods of use
JP2016537399A (ja) 2013-09-17 2016-12-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｌｇｒ５抗体を使用する方法
CN106132431A (zh) 2013-10-15 2016-11-16 索伦托治疗有限公司 具有靶向分子和两种不同药物的药物偶联物
US9290578B2 (en) 2013-10-21 2016-03-22 Genentech, Inc. Anti-Ly6E antibodies and methods of use
KR20160070191A (ko) 2013-11-06 2016-06-17 스템센트알엑스 인코포레이티드 신규한 항-클라우딘 항체 및 사용 방법
AU2014361856A1 (en) 2013-12-12 2016-06-30 Abbvie Stemcentrx Llc Novel anti-DPEP3 antibodies and methods of use
TW201533060A (zh) 2013-12-13 2015-09-01 Genentech Inc 抗ｃｄ３３抗體及免疫結合物
EA033456B1 (ru) 2013-12-16 2019-10-31 Genentech Inc Конъюгаты антитело-лекарственное средство, содержащие пептидомиметические линкеры
CN105828840B (zh) 2013-12-16 2020-08-04 基因泰克公司 1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚二聚体抗体-药物缀合物化合物及使用和治疗方法
CN107106700B (zh) 2013-12-16 2020-10-30 基因泰克公司 肽模拟化合物及其抗体-药物缀合物
WO2015101586A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-hapten/anti-blood brain barrier receptor antibodies, complexes thereof and their use as blood brain barrier shuttles
EP3089759B1 (en) 2014-01-03 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Covalently linked polypeptide toxin-antibody conjugates
AU2015218633A1 (en) 2014-02-21 2016-09-01 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-DLL3 antibodies and drug conjugates for use in melanoma
CN104788566A (zh) * 2014-03-11 2015-07-22 南京任诺药业有限公司 用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-V280C
CN104650233A (zh) * 2014-03-11 2015-05-27 南京任诺药业有限公司 用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-K330C
CN104672330A (zh) * 2014-03-11 2015-06-03 南京任诺药业有限公司 用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-N267C
CN106414499A (zh) 2014-05-22 2017-02-15 基因泰克公司 抗gpc3抗体和免疫偶联物
CN107073121A (zh) 2014-06-13 2017-08-18 基因泰克公司 治疗及预防癌症药物抗性的方法
SG11201610624WA (en) * 2014-06-20 2017-01-27 Bioalliance Cv Anti-cd22 antibody-drug conjugates and methods of using thereof
CA2952876A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Bioalliance C.V. Anti-folate receptor alpha (fra) antibody-drug conjugates and methods of using thereof
MX2016015280A (es) 2014-06-26 2017-03-03 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-bromodesoxiuridina(brdu) y metodos de uso.
AU2015282627B2 (en) 2014-06-30 2020-04-02 Glykos Finland Oy Saccharide derivative of a toxic payload and antibody conjugates thereof
TW201617368A (zh) 2014-09-05 2016-05-16 史坦森特瑞斯公司 新穎抗ｍｆｉ２抗體及使用方法
EP3191521A2 (en) * 2014-09-12 2017-07-19 F. Hoffmann-La Roche AG Cysteine engineered antibodies and conjugates
TW201625690A (zh) 2014-09-12 2016-07-16 建南德克公司 抗－ｃｌｌ－１抗體及免疫結合物
ES2830385T3 (es) 2014-09-12 2021-06-03 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados anti-HER2
BR112017004953A2 (pt) 2014-09-17 2017-12-05 Genentech Inc imunoconjugado, formulação farmacêutica, método de tratamento e método de inibição da proliferação de uma célula
EP3235820A1 (en) 2014-09-17 2017-10-25 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof
EP3204005A1 (en) * 2014-10-10 2017-08-16 Pfizer Inc Synergistic auristatin combinations
WO2016090038A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Anti-staphylococcus aureus antibody rifamycin conjugates and uses thereof
US10590165B2 (en) 2015-01-28 2020-03-17 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody drug conjugates
WO2016205176A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates
US10501545B2 (en) 2015-06-16 2019-12-10 Genentech, Inc. Anti-CLL-1 antibodies and methods of use
PL3310816T3 (pl) * 2015-06-19 2020-12-14 Eisai R&D Management Co., Ltd. Immunoglobuliny sprzężone na cys80
CN114671951A (zh) 2015-06-29 2022-06-28 伊缪诺金公司 抗cd123抗体以及其缀合物和衍生物
CA2938333A1 (en) * 2015-08-12 2017-02-12 Pfizer Inc. Capped and uncapped antibody cysteines, and their use in antibody-drug conjugation
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
MA44334A (fr) 2015-10-29 2018-09-05 Novartis Ag Conjugués d'anticorps comprenant un agoniste du récepteur de type toll
TWI726942B (zh) 2015-11-30 2021-05-11 美商輝瑞股份有限公司 位點專一性ｈｅｒ２抗體藥物共軛體
WO2017107817A1 (zh) * 2015-12-21 2017-06-29 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种抗体药物偶联物的制备方法
CN108713026B (zh) 2016-01-08 2023-01-06 美国全心医药生技股份有限公司 四价抗psgl-1抗体及其用途
JP6705904B2 (ja) 2016-03-04 2020-06-03 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗体−リファマイシン複合体の製造プロセス
AU2017238172A1 (en) 2016-03-21 2018-09-13 Marengo Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
CN113801296A (zh) 2016-04-15 2021-12-17 拜克门寇尔特公司 光敏大分子及其用途
EP3465221B1 (en) 2016-05-27 2020-07-22 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates
JP7043425B2 (ja) 2016-06-06 2022-03-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド シルベストロール抗体－薬物コンジュゲート及び使用方法
KR20230149857A (ko) 2016-07-07 2023-10-27 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 항체-애쥬번트 접합체
CN109690315A (zh) 2016-07-08 2019-04-26 豪夫迈·罗氏有限公司 人附睾蛋白4(he4)用于评估muc16阳性癌症治疗的响应性的用途
JP2019530434A (ja) 2016-08-05 2019-10-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド アゴニスト活性を有する多価及び多重エピトープ抗体ならびに使用方法
KR102221364B1 (ko) 2016-11-21 2021-03-04 쿠레아브 게엠베하 항-gp73　항체　및　면역접합체
CA3046790A1 (en) 2016-12-13 2018-06-21 Bolt Biotherapeutics, Inc. Antibody adjuvant conjugates
JP7244987B2 (ja) 2016-12-14 2023-03-23 シージェン インコーポレイテッド 多剤抗体薬物コンジュゲート
US10864279B2 (en) 2016-12-16 2020-12-15 Industrial Technology Research Institute Linker-drug and antibody-drug conjugate (ADC) employing the same
WO2018151820A1 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
AR111249A1 (es) 2017-03-22 2019-06-19 Genentech Inc Composiciones de anticuerpo optimizadas para el tratamiento de trastornos oculares
SG11201909218RA (en) 2017-04-03 2019-11-28 Hoffmann La Roche Antibodies binding to steap-1
PL3609540T3 (pl) 2017-04-14 2023-03-27 Bolt Biotherapeutics, Inc. Sposób syntezy immunokoniugatu
EP3630836A1 (en) 2017-05-31 2020-04-08 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
WO2019032827A1 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Massachusetts Institute Of Technology PEPTIDE ALBUMIN BINDING CONJUGATES AND METHODS THEREOF
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
US11364303B2 (en) 2017-09-29 2022-06-21 Pfizer Inc. Cysteine engineered antibody drug conjugates
EP3728317A2 (en) 2017-12-21 2020-10-28 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to hla-a2/wt1
JP7436365B2 (ja) 2017-12-29 2024-02-21 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 抗ｖｅｇｆ抗体及び使用の方法
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
HUE063489T2 (hu) 2018-03-13 2024-01-28 Zymeworks Bc Inc Anti-HER2 biparatopikus antitest-gyógyszer konjugátumok és alkalmazási módszereik
EP3765516A2 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
US20210238280A1 (en) 2018-03-14 2021-08-05 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
KR20230042407A (ko) 2018-03-29 2023-03-28 제넨테크, 인크. 포유류 세포들에서 젖분비자극 활성의 조절
CN108743966B (zh) * 2018-04-24 2021-10-19 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物
CN110386986B (zh) * 2018-06-22 2024-01-26 深圳琅技生命科技有限公司 人工改造蛋白质及其构建方法与应用
TW202019473A (zh) 2018-07-02 2020-06-01 美商安進公司 抗steap1抗原結合蛋白
DE202019005887U1 (de) 2018-07-03 2023-06-14 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR-Antikörpermoleküle und Verwendungen davon
JP2020080784A (ja) * 2018-11-29 2020-06-04 シスメックス株式会社 融合ポリペプチド、融合ポリペプチドの製造方法、及び融合ポリペプチドをコードするｄｎａ
BR102019025989A2 (pt) 2018-12-14 2020-06-23 Beckman Coulter, Inc. Modificação de corantes poliméricos e aplicações
AR117453A1 (es) 2018-12-20 2021-08-04 Genentech Inc Fc de anticuerpos modificados y métodos para utilizarlas
MX2021007421A (es) 2018-12-21 2021-08-05 Hoffmann La Roche Anticuerpo que se une a factor de crecimiento endotelial vascular (vegf) y a interleucina 1 beta (il-1beta) y metodos de uso.
MX2021007307A (es) 2018-12-21 2021-07-07 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3.
EP3897841A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rifamycin analogs and antibody-drug conjugates thereof
CA3124796A1 (en) 2018-12-24 2020-07-02 Sanofi Multispecific binding proteins with mutant fab domains
AU2020208396A1 (en) * 2019-01-16 2021-05-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying free thiols in proteins
CN114126714A (zh) 2019-02-21 2022-03-01 马伦戈治疗公司 抗tcr抗体分子及其用途
CA3130628A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
JP2022521750A (ja) 2019-02-21 2022-04-12 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用
CN114026122A (zh) 2019-02-21 2022-02-08 马伦戈治疗公司 结合t细胞相关癌细胞的多功能分子及其用途
JP2022521937A (ja) 2019-02-21 2022-04-13 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド ＮＫｐ３０に結合する抗体分子およびその使用
WO2020181846A1 (zh) * 2019-03-11 2020-09-17 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
EP4003526A2 (en) 2019-07-31 2022-06-01 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies binding to gprc5d
CN114174338A (zh) 2019-07-31 2022-03-11 豪夫迈·罗氏有限公司 与gprc5d结合的抗体
WO2021022678A1 (zh) * 2019-08-07 2021-02-11 烟台迈百瑞国际生物医药股份有限公司 一种抗体药物偶联物及其应用
MX2022003212A (es) 2019-09-18 2022-04-25 Genentech Inc Anticuerpos anti-klk7, anticuerpos anti-klk5, anticuerpos multiespecificos anti-klk5/klk7 y metodos de uso.
US20210230278A1 (en) 2019-12-18 2021-07-29 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies binding to HLA-A2/MAGE-A4
EP4084821A4 (en) 2020-01-03 2024-04-24 Marengo Therapeutics Inc CD33-BINDING MULTIFUNCTIONAL MOLECULES AND THEIR USES
CN115315512A (zh) 2020-03-26 2022-11-08 基因泰克公司 具有降低的宿主细胞蛋白质的经修饰的哺乳动物细胞
CN115397850A (zh) 2020-03-30 2022-11-25 豪夫迈·罗氏有限公司 与vegf和pdgf-b结合的抗体及其使用方法
BR112022020332A2 (pt) 2020-04-10 2022-12-13 Seagen Inc Composto conjugado anticorpo-droga, composição, método de tratamento de câncer e de um distúrbio autoimune
EP4139363A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
AU2021288916A1 (en) 2020-06-08 2022-11-24 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-HBV antibodies and methods of use
BR112022025574A2 (pt) 2020-06-19 2023-01-03 Hoffmann La Roche Anticorpos que se ligam a cd3, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo que se liga a cd3 e para tratar uma doença em um indivíduo, composição farmacêutica, anticorpo para uso e invenção
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
US11780920B2 (en) 2020-06-19 2023-10-10 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies binding to CD3 and CD19
AR122656A1 (es) 2020-06-19 2022-09-28 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 / folr1
WO2021262783A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Genentech, Inc. Apoptosis resistant cell lines
AU2021308653A1 (en) 2020-07-17 2023-02-16 Genentech, Inc. Anti-Notch2 antibodies and methods of use
AU2021331075A1 (en) 2020-08-26 2023-04-06 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
EP4204458A1 (en) 2020-08-26 2023-07-05 Marengo Therapeutics, Inc. Methods of detecting trbc1 or trbc2
KR20230074144A (ko) 2020-08-26 2023-05-26 마렝고 테라퓨틱스, 인크. NKp30에 결합하는 항체 분자 및 이의 용도
JP2023539201A (ja) 2020-08-28 2023-09-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド 宿主細胞タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９マルチプレックスノックアウト
PE20230986A1 (es) 2020-09-04 2023-06-21 Hoffmann La Roche Anticuerpo que se une a vegf-a y ang2, y metodos de uso
KR20230060509A (ko) 2020-09-04 2023-05-04 노바록 바이오테라퓨틱스 리미티드 넥틴-4 항체 및 이의 용도
TW202233671A (zh) 2020-10-20 2022-09-01 美商建南德克公司 Ｐｅｇ結合抗ｍｅｒｔｋ抗體及其使用方法
BR112023014128A2 (pt) 2021-01-15 2023-10-31 Seagen Inc Conjugados de anticorpo-fármaco imunomodulatórios
CA3206244A1 (en) 2021-02-03 2022-08-11 Kung-Pern WANG Immunostimulatory compounds and conjugates
JP2024509695A (ja) 2021-02-03 2024-03-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性結合タンパク質分解プラットフォームおよび使用方法
WO2022192647A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Genentech, Inc. Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use
JP2024511088A (ja) 2021-03-26 2024-03-12 ボルト バイオセラピューティクス、インコーポレーテッド ２－アミノ－４－カルボキサミド－ベンゾアゼピン免疫複合体、及びその使用
JP2024512056A (ja) 2021-03-26 2024-03-18 ボルト バイオセラピューティクス、インコーポレーテッド ２－アミノ－４－カルボキサミド－ベンゾアゼピン免疫複合体、及びその使用
WO2022216993A2 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Marengo Therapeutics, Inc. Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof
EP4319820A1 (en) 2021-04-10 2024-02-14 Profoundbio Us Co. Folr1 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
CA3215965A1 (en) 2021-04-19 2022-10-27 Amy Shen Modified mammalian cells
CA3216459A1 (en) 2021-04-23 2022-10-27 Profoundbio Us Co. Anti-cd70 antibodies, conjugates thereof and methods of using the same
TW202309085A (zh) 2021-04-26 2023-03-01 大陸商軒竹生物科技股份有限公司 雙特異性抗體結合物
EP4341385A1 (en) 2021-05-21 2024-03-27 Genentech, Inc. Modified cells for the production of a recombinant product of interest
KR20240015670A (ko) 2021-05-28 2024-02-05 씨젠 인크. 안트라사이클린 항체 접합체
US20230048743A1 (en) 2021-07-12 2023-02-16 Genentech Inc. Structures for Reducing Antibody-Lipase Binding
AU2022310847A1 (en) 2021-07-14 2024-01-25 Genentech, Inc. Anti-c-c motif chemokine receptor 8 (ccr8) antibodies and methods of use
AU2022315528A1 (en) 2021-07-22 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Heterodimeric fc domain antibodies
WO2023012147A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies and methods of use
CA3234604A1 (en) * 2021-10-29 2023-05-04 Shelley Erin ACKERMAN Tlr agonist immunoconjugates with cysteine-mutant antibodies, and uses thereof
WO2023092099A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Ardeagen Corporation Gpc3 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
WO2023141445A1 (en) 2022-01-19 2023-07-27 Genentech, Inc. Anti-notch2 antibodies and conjugates and methods of use
WO2023215740A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Seagen Inc. Immunomodulatory antibody-drug conjugates
TW202402810A (zh) 2022-05-11 2024-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與ｖｅｇｆ—ａ及ｉｌ６結合之抗體及其使用方法
WO2024030577A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Seagen Inc. Immunostimulatory anti-pd-l1-drug conjugates
WO2024074762A1 (en) * 2022-10-03 2024-04-11 Turun Yliopisto Ultrastable antibody fragments with a novel disuldide bridge
WO2024077239A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 Genentech, Inc. Methods of treating cancer with anti-c-c motif chemokine receptor 8 (ccr8) antibodies
CN117198390B (zh) * 2023-09-08 2024-03-12 中国科学院广州生物医药与健康研究院 通过设计和改造二硫键交联位点的slc膜蛋白复合物的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100111856A1 (en) * 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates

Family Cites Families (348)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6098584A (ja) 1983-11-02 1985-06-01 Canon Inc カメラ―体形ｖｔｒ
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5316757A (en) 1984-10-18 1994-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Synthesis of polyazamacrocycles with more than one type of side-chain chelating groups
US5342606A (en) 1984-10-18 1994-08-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Polyazamacrocyclic compounds for complexation of metal ions
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5583024A (en) 1985-12-02 1996-12-10 The Regents Of The University Of California Recombinant expression of Coleoptera luciferase
US5091178A (en) 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
GB8720833D0 (en) 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
CA2023779A1 (en) 1989-08-23 1991-02-24 Margaret D. Moore Compositions and methods for detection and treatment of epstein-barr virus infection and immune disorders
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
AU9016591A (en) 1990-10-25 1992-05-26 Tanox Biosystems, Inc. Glycoproteins associated with membrane-bound immunoglobulins as antibody targets on B cells
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JP4156662B2 (ja) 1991-03-29 2008-09-24 ジェネンテック・インコーポレーテッド ヒトｐｆ４ａ受容体とその使用
US5440021A (en) 1991-03-29 1995-08-08 Chuntharapai; Anan Antibodies to human IL-8 type B receptor
US5543503A (en) 1991-03-29 1996-08-06 Genentech Inc. Antibodies to human IL-8 type A receptor
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
JP3050424B2 (ja) 1991-07-12 2000-06-12 塩野義製薬株式会社 ヒトエンドセリンリセプター
US5264557A (en) 1991-08-23 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Polypeptide of a human cripto-related gene, CR-3
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
US6011146A (en) 1991-11-15 2000-01-04 Institut Pasteur Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and methods of using the determinant
US6153408A (en) 1991-11-15 2000-11-28 Institut Pasteur And Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and methods of using the determinant
US5480990A (en) 1991-12-10 1996-01-02 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclocarboxylic acid complexes for use as contrast agents
US5428139A (en) 1991-12-10 1995-06-27 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as radiopharmaceuticals
US5739294A (en) 1991-12-10 1998-04-14 The Dow Chemical Company Bicyclopol yazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as contrast agents
ATE295420T1 (de) 1992-02-06 2005-05-15 Chiron Corp Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
AU4025193A (en) 1992-04-08 1993-11-18 Cetus Oncology Corporation Humanized C-erbB-2 specific antibodies
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
WO1994006474A1 (en) 1992-09-16 1994-03-31 Galagen Inc. ANTIBODY TREATMENT OF $i(HELICOBACTER PYLORI)
IL107366A (en) 1992-10-23 2003-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Genes coding for megakaryocyte potentiator
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5644033A (en) 1992-12-22 1997-07-01 Health Research, Inc. Monoclonal antibodies that define a unique antigen of human B cell antigen receptor complex and methods of using same for diagnosis and treatment
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5869445A (en) 1993-03-17 1999-02-09 University Of Washington Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
US5801005A (en) 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
US5385893A (en) 1993-05-06 1995-01-31 The Dow Chemical Company Tricyclopolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US5462725A (en) 1993-05-06 1995-10-31 The Dow Chemical Company 2-pyridylmethylenepolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5773223A (en) 1993-09-02 1998-06-30 Chiron Corporation Endothelin B1, (ETB1) receptor polypeptide and its encoding nucleic acid methods, and uses thereof
DE69434136T2 (de) 1993-10-01 2005-12-01 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Dolastatin-derivate
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5750370A (en) 1995-06-06 1998-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acid encoding human endothlein-bombesin receptor and method of producing the receptor
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
JPH08336393A (ja) 1995-04-13 1996-12-24 Mitsubishi Chem Corp 光学活性なγ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5707829A (en) 1995-08-11 1998-01-13 Genetics Institute, Inc. DNA sequences and secreted proteins encoded thereby
US20020193567A1 (en) 1995-08-11 2002-12-19 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
AU7075496A (en) 1995-09-18 1997-04-09 Intracel Corporation Neutralizing monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus
US5834456A (en) 1996-02-23 1998-11-10 The Dow Chemical Company Polyazamacrocyclofluoromonoalkylphosphonic acids, and their complexes, for use as contrast agents
JP3646191B2 (ja) 1996-03-19 2005-05-11 大塚製薬株式会社 ヒト遺伝子
BR9710968A (pt) 1996-05-17 2001-09-04 Schering Corp Antìgenos de célula b humana; reagentes correlatos
US5945511A (en) 1997-02-20 1999-08-31 Zymogenetics, Inc. Class II cytokine receptor
US20030185830A1 (en) 1997-02-25 2003-10-02 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
US7033827B2 (en) 1997-02-25 2006-04-25 Corixa Corporation Prostate-specific polynucleotide compositions
US6541212B2 (en) 1997-03-10 2003-04-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting prostate stem cell antigen protein
EP1514876B1 (en) 1997-03-10 2013-05-08 The Regents of The University of California Antibody against prostate stem cell antigen (PSCA)
US6261791B1 (en) 1997-03-10 2001-07-17 The Regents Of The University Of California Method for diagnosing cancer using specific PSCA antibodies
US5994071A (en) 1997-04-04 1999-11-30 Albany Medical College Assessment of prostate cancer
US6555339B1 (en) 1997-04-14 2003-04-29 Arena Pharmaceuticals, Inc. Non-endogenous, constitutively activated human protein-coupled receptors
US6319688B1 (en) 1997-04-28 2001-11-20 Smithkline Beecham Corporation Polynucleotide encoding human sodium dependent phosphate transporter (IPT-1)
WO1998051824A1 (en) 1997-05-15 1998-11-19 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting disease of the urinary tract
US6890749B2 (en) 1997-05-15 2005-05-10 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
US6753165B1 (en) 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
US6248564B1 (en) 1997-08-29 2001-06-19 Harvard University Mutant MHC class I molecules
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
US20030060612A1 (en) 1997-10-28 2003-03-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20020034749A1 (en) 1997-11-18 2002-03-21 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US6110695A (en) 1997-12-02 2000-08-29 The Regents Of The University Of California Modulating the interaction of the chemokine, B Lymphocyte Hemoattractant, and its Receptor, BLR1
US7005504B2 (en) 1998-01-22 2006-02-28 Genentech, Inc. Antibody fragment-peg conjugates
WO2004031238A2 (en) 2002-10-03 2004-04-15 Mcgill Univeristy Antibodies and cyclic peptides which bind cea (carcinoembryonic antigen) and their use as cancer therapeutics
WO1999046284A2 (en) 1998-03-13 1999-09-16 The Burnham Institute Molecules that home to various selected organs or tissues
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
JP2002520000A (ja) 1998-05-13 2002-07-09 エピミューン， インコーポレイテッド 免疫応答を刺激するための発現ベクターおよびそのベクターの使用方法
US20030064397A1 (en) 1998-05-22 2003-04-03 Incyte Genomics, Inc. Transmembrane protein differentially expressed in prostate and lung tumors
US20020187472A1 (en) 2001-03-09 2002-12-12 Preeti Lal Steap-related protein
WO2002016429A2 (en) 2000-08-24 2002-02-28 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2000012130A1 (en) 1998-08-27 2000-03-09 Smithkline Beecham Corporation Rp105 agonists and antagonists
JP4689781B2 (ja) 1998-09-03 2011-05-25 独立行政法人科学技術振興機構 アミノ酸輸送蛋白及びその遺伝子
AU5963699A (en) 1998-10-02 2000-04-26 Mcmaster University Spliced form of (erb)b-2/neu oncogene
US20020119158A1 (en) 1998-12-17 2002-08-29 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6858710B2 (en) 1998-12-17 2005-02-22 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030091580A1 (en) 2001-06-18 2003-05-15 Mitcham Jennifer L. Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6962980B2 (en) 1999-09-24 2005-11-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6468546B1 (en) 1998-12-17 2002-10-22 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of ovarian cancer
AU776672B2 (en) 1998-12-30 2004-09-16 Beth Israel Deaconess Medical Center Characterization of a calcium channel family
US20030190669A1 (en) 1998-12-30 2003-10-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
BR0007840A (pt) 1999-01-29 2002-01-22 Corixa Corp Proteìnas de fusão her-2/neu
GB9905124D0 (en) 1999-03-05 1999-04-28 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
AU3395900A (en) 1999-03-12 2000-10-04 Human Genome Sciences, Inc. Human lung cancer associated gene sequences and polypeptides
US7312303B2 (en) 1999-05-11 2007-12-25 Genentech, Inc. Anti-PRO4980 antibodies
WO2000075655A1 (fr) 1999-06-03 2000-12-14 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de criblage avec cd100
DK2283866T3 (en) 1999-06-25 2015-05-18 Genentech Inc METHODS OF TREATMENT USING ANTI-ERBB ANTIBODY-MAYTANSINOID CONJUGATES
CN100340575C (zh) 1999-06-25 2007-10-03 杰南技术公司 人源化抗ErbB2抗体及其在制备药物中的应用
US20030119113A1 (en) 1999-07-20 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7297770B2 (en) 1999-08-10 2007-11-20 Genentech, Inc. PRO6496 polypeptides
US7294696B2 (en) 1999-08-17 2007-11-13 Genentech Inc. PRO7168 polypeptides
JP3951035B2 (ja) 1999-09-01 2007-08-01 ジェネンテック・インコーポレーテッド 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードしている核酸
US20030206918A1 (en) 1999-09-10 2003-11-06 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030232056A1 (en) 1999-09-10 2003-12-18 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030129192A1 (en) 1999-09-10 2003-07-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
CA2385528C (en) 1999-10-01 2013-12-10 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US6750054B2 (en) 2000-05-18 2004-06-15 Lexicon Genetics Incorporated Human semaphorin homologs and polynucleotides encoding the same
IL149116A0 (en) 1999-10-29 2002-11-10 Genentech Inc Anti-prostate stem cell antigen (psca) antibody compositions and methods of use
ES2568625T3 (es) 1999-11-29 2016-05-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Aislamiento de cinco genes novedosos que codifican nuevos melanomas de tipo receptor de Fc implicados en la patogénesis del linfoma/melanoma
AU1807401A (en) 1999-11-30 2001-06-12 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of breast cancer
CA2393738A1 (en) 1999-12-10 2001-06-14 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions
US6610286B2 (en) 1999-12-23 2003-08-26 Zymogenetics, Inc. Method for treating inflammation using soluble receptors to interleukin-20
WO2001046261A1 (en) 1999-12-23 2001-06-28 Zymogenetics, Inc. Method for treating inflammation
EP1857466B1 (en) 1999-12-23 2010-10-20 ZymoGenetics, Inc. Soluble interleukin-20 receptor
NZ502058A (en) 1999-12-23 2003-11-28 Ovita Ltd Isolated mutated nucleic acid molecule for regulation of ovulation rate
US20040001827A1 (en) 2002-06-28 2004-01-01 Dennis Mark S. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
CA2390691C (en) 1999-12-24 2016-05-10 Genentech, Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
US7294695B2 (en) 2000-01-20 2007-11-13 Genentech, Inc. PRO10268 polypeptides
US20030224379A1 (en) 2000-01-21 2003-12-04 Tang Y. Tom Novel nucleic acids and polypeptides
WO2001053463A2 (en) 2000-01-21 2001-07-26 Corixa Corporation COMPOUNDS AND METHODS FOR PREVENTION AND TREATMENT OF HER-2/neu ASSOCIATED MALIGNANCIES
AU2001243142A1 (en) 2000-02-03 2001-08-14 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US20030104562A1 (en) 2000-02-11 2003-06-05 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030219806A1 (en) 2000-02-22 2003-11-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 18607, 15603, 69318, 12303, 48000, 52920, 5433, 38554, 57301, 58324, 55063, 52991, 59914, 59921 and 33751 molecules and uses therefor
US20020142377A1 (en) 2000-02-22 2002-10-03 Glucksmann Maria Alexandra 18607, a novel human calcium channel
US20040005561A1 (en) 2000-03-01 2004-01-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
EP1261743A2 (en) 2000-03-07 2002-12-04 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
JP2004521602A (ja) 2000-03-24 2004-07-22 ファハリ サッチオグリュ 前立腺特異的または精巣特異的な新規の核酸分子、ポリペプチド、ならびに診断法および治療法
US20030186889A1 (en) 2000-03-31 2003-10-02 Wolf-Georg Forssmann Diagnostic and medicament for analysing the cell surface proteome of tumour and inflammatory cells and for treating tumorous and inflammatory diseases, preferably using a specific chemokine receptor analysis and the chemokine receptor-ligand interaction
WO2001075177A2 (en) 2000-04-03 2001-10-11 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Tumor markers in ovarian cancer
AU2001249885A1 (en) 2000-04-07 2001-10-23 Arena Pharmaceuticals, Inc. Non-endogenous, constitutively activated known g protein-coupled receptors
AU2001274888A1 (en) 2000-05-19 2001-12-03 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US20020051990A1 (en) 2000-06-09 2002-05-02 Eric Ople Novel gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of ovarian carcinomas
AU2001268471A1 (en) 2000-06-16 2002-01-02 Incyte Genomics, Inc. G-protein coupled receptors
MXPA02012749A (es) 2000-06-30 2003-10-06 Amgen Inc Moleculas semejantes a b7 y sus usos.
WO2002002587A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. B7-like polynucleotides, polypeptides, and antibodies
JP2004528003A (ja) 2000-06-30 2004-09-16 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド 細胞外マトリクスおよび細胞接着分子
WO2002006339A2 (en) 2000-07-03 2002-01-24 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
US20040044179A1 (en) 2000-07-25 2004-03-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6891030B2 (en) 2000-07-27 2005-05-10 Mayo Foundation For Medical Education And Research T-cell immunoregulatory molecule
CA2417671A1 (en) 2000-07-28 2002-02-07 Ulrich Wissenbach Trp8, trp9 and trp10, novel markers for cancer
US7229623B1 (en) 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
HUP0600780A2 (en) 2000-08-14 2007-01-29 Corixa Corp Compositions and methods for the therapy and diagnosis of her-2/neu-associated malignancies
WO2002013847A2 (en) 2000-08-14 2002-02-21 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
GB0020953D0 (en) 2000-08-24 2000-10-11 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CA2421949A1 (en) 2000-09-11 2002-03-21 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
AR030612A1 (es) 2000-09-12 2003-08-27 Smithkline Beecham Corp Procedimiento e intermedios
ATE460429T1 (de) 2000-09-15 2010-03-15 Zymogenetics Inc Polypeptide enthaltend extrazellulären domäne von il-20ra und/oderr il-20rb
US7491797B2 (en) 2000-09-15 2009-02-17 Genentech, Inc. PRO6308 polypeptide
US6613567B1 (en) 2000-09-15 2003-09-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of Her-2 expression
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
AU2001292724B2 (en) 2000-09-18 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. CRIPTO mutant and uses thereof
CA2425569A1 (en) 2000-10-13 2002-04-18 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of prostate cancer, compositions and methods of screening for modulators of prostate cancer
CA2428242A1 (en) 2000-11-07 2002-05-16 Zymogenetics, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
US20020150573A1 (en) 2000-11-10 2002-10-17 The Rockefeller University Anti-Igalpha-Igbeta antibody for lymphoma therapy
WO2002061087A2 (en) 2000-12-19 2002-08-08 Lifespan Biosciences, Inc. Antigenic peptides, such as for g protein-coupled receptors (gpcrs), antibodies thereto, and systems for identifying such antigenic peptides
AU2002243495A1 (en) 2001-01-12 2002-07-24 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Bone morphogenetic protein-2 in the treatment and diagnosis of cancer
US20030119126A1 (en) 2001-01-16 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030119125A1 (en) 2001-01-16 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
MXPA03006617A (es) 2001-01-24 2004-12-02 Protein Design Labs Inc Metodos de diagnostico de cancer de pecho, composiciones y metodos de rastreo de moduladores de cancer de pecho.
US20030073144A1 (en) 2001-01-30 2003-04-17 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of pancreatic cancer
US20040170994A1 (en) 2001-02-12 2004-09-02 Callen David Frederick DNA sequences for human tumour suppressor genes
WO2002071928A2 (en) 2001-03-14 2002-09-19 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
AU2002311787A1 (en) 2001-03-28 2002-10-15 Zycos Inc. Translational profiling
WO2003008537A2 (en) 2001-04-06 2003-01-30 Mannkind Corporation Epitope sequences
US6820011B2 (en) 2001-04-11 2004-11-16 The Regents Of The University Of Colorado Three-dimensional structure of complement receptor type 2 and uses thereof
MXPA03009510A (es) 2001-04-17 2005-04-29 Univ Arkansas Secuencias de repeticion del gen ca125 y su uso para intervenciones de diagnosticos y terapeuticas.
CA2444691A1 (en) 2001-04-18 2002-10-31 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer
AU2002334799B2 (en) 2001-04-26 2009-05-07 Biogen Ma Inc. Cripto-specific antibodies
DE60230868D1 (de) 2001-04-26 2009-03-05 Biogen Inc Criptoblockierende antikörper und deren verwendung
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
WO2002089747A2 (en) 2001-05-09 2002-11-14 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
AU2002344326A1 (en) 2001-05-11 2002-11-25 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acid sequence encoding ovarian antigen, ca125, and uses thereof
IL158920A0 (en) 2001-05-24 2004-05-12 Zymogenetics Inc Taci-immunoglobulin fusion proteins
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US7157558B2 (en) 2001-06-01 2007-01-02 Genentech, Inc. Polypeptide encoded by a polynucleotide overexpresses in tumors
WO2002098358A2 (en) 2001-06-04 2002-12-12 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis and treatment of androgen-dependent prostate cancer, prostate cancer undergoing androgen-withdrawal, and androgen-independent prostate cancer
WO2003000842A2 (en) 2001-06-04 2003-01-03 Curagen Corporation Novel proteins and nucleic acids encoding same
US20050112568A1 (en) 2001-06-05 2005-05-26 Lori Friedman Dgks as modifiers of the p53 pathwha and methods of use
ATE483976T1 (de) 2001-06-05 2010-10-15 Exelixis Inc Gfats als modifikatoren des p53-wegs und verwendungsverfahren
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US7125663B2 (en) 2001-06-13 2006-10-24 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Genes, compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer
US7189507B2 (en) 2001-06-18 2007-03-13 Pdl Biopharma, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
MXPA03011979A (es) 2001-06-18 2005-04-08 Eos Biotechnology Inc Metodos de diagnostico de cancer de ovario composiciones y metodos para rastrear moduladores de cancer de ovario.
US7705120B2 (en) 2001-06-21 2010-04-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
WO2003002717A2 (en) 2001-06-28 2003-01-09 Schering Corporation Biological activity of ak155
WO2003004529A2 (en) 2001-07-02 2003-01-16 Licentia Ltd. Ephrin-tie receptor materials and methods
US20040076955A1 (en) 2001-07-03 2004-04-22 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of bladder cancer, compositions and methods of screening for modulators of bladder cancer
WO2003003984A2 (en) 2001-07-05 2003-01-16 Curagen Corporation Novel proteins and nucleic acids encoding same
US7446185B2 (en) 2001-07-18 2008-11-04 The Regents Of The University Of California Her2/neu target antigen and use of same to stimulate an immune response
US20030108963A1 (en) 2001-07-25 2003-06-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kit, and methods for identification, assessment, prevention and therapy of prostate cancer
MXPA04001050A (es) 2001-08-03 2004-07-08 Genentech Inc Polipeptidos tacis y br3 y usos de los mismos.
AU2002324700A1 (en) 2001-08-14 2003-03-03 Bayer Ag Nucleic acid and amino acid sequences involved in pain
US20030092013A1 (en) 2001-08-16 2003-05-15 Vitivity, Inc. Diagnosis and treatment of vascular disease
WO2003018621A2 (en) 2001-08-23 2003-03-06 Oxford Biomedica (Uk) Limited Genes
AU2002357643A1 (en) 2001-08-29 2003-04-14 Vanderbilt University The human mob-5 (il-24) receptors and uses thereof
US20030124579A1 (en) 2001-09-05 2003-07-03 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
US20040235068A1 (en) 2001-09-05 2004-11-25 Levinson Arthur D. Methods for the identification of polypeptide antigens associated with disorders involving aberrant cell proliferation and compositions useful for the treatment of such disorders
ES2537074T3 (es) 2001-09-06 2015-06-02 Agensys, Inc. Ácido nucleico y proteína correspondiente denominados STEAP-1 útiles en el tratamiento y la detección de cáncer
AU2002330039A1 (en) 2001-09-17 2003-04-01 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of cancer compositions and methods of screening for modulators of cancer
DE60238143D1 (de) 2001-09-18 2010-12-09 Genentech Inc Zusammensetzungen und verfahren für die diagnose von tumoren
US20050004017A1 (en) 2001-09-18 2005-01-06 Yuval Reiss Methods and compositions for treating hcap associated diseases
WO2003025148A2 (en) 2001-09-19 2003-03-27 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
US20030077644A1 (en) 2001-09-28 2003-04-24 Bing Yang Diagnosis and treatment of diseases caused by mutations in CD72
WO2003029421A2 (en) 2001-10-03 2003-04-10 Origene Technologies, Inc. Regulated breast cancer genes
US20050130117A1 (en) 2001-10-03 2005-06-16 Davis Cong L. Modulators of lymphocyte activation and migration
US20050089957A1 (en) 2001-10-19 2005-04-28 Audrey Goddard Compositions and methods for the diagnosis and treatment of inflammatory bowel disorders
US20050123925A1 (en) 2002-11-15 2005-06-09 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2003035846A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 National Jewish Medical And Research Center Structure of tall-1 and its cognate receptor
US7405192B2 (en) 2001-10-31 2008-07-29 Alcon, Inc. Bone morphogenic proteins (BMP), BMP receptors and BMP binding proteins and their use in the diagnosis and treatment of glaucoma
WO2003042661A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
US20030232350A1 (en) 2001-11-13 2003-12-18 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
JP2005511627A (ja) 2001-11-20 2005-04-28 シアトル ジェネティクス，インコーポレーテッド 抗ｃｄ３０抗体を使用する免疫学的疾患の治療
US7344843B2 (en) 2001-11-29 2008-03-18 Serono Genetics Institute S.A. Agonists and antagonists of prolixin for the treatment of metabolic disorders
AU2002349784A1 (en) 2001-12-03 2003-06-17 Asahi Kasei Pharma Corporation Nf-kappab activating genes
EP1504099A4 (en) 2001-12-10 2006-05-10 Nuvelo Inc NEW NUCLEIC ACIDS AND POLYPEPTIDES
WO2003049704A2 (en) 2001-12-11 2003-06-19 University Of Massachusetts Antibodies to treat cancer
WO2003060080A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Idexx Laboratories, Inc. Canine immunoglobulin variable domains, caninized antibodies, and methods for making and using them
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
US20030134790A1 (en) 2002-01-11 2003-07-17 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Bone Morphogenetic Protein-2 And Bone Morphogenetic Protein-4 In The Treatment And Diagnosis Of Cancer
US7452675B2 (en) 2002-01-25 2008-11-18 The Queen's Medical Center Methods of screening for TRPM4b modulators
JP2005526501A (ja) 2002-02-21 2005-09-08 デューク・ユニヴァーシティ 自己免疫疾患用の試薬および治療方法
JP2005535290A (ja) 2002-02-22 2005-11-24 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫関連疾患の治療のための組成物と方法
WO2003074662A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Exelixis, Inc. SCDs AS MODIFIERS OF THE p53 PATHWAY AND METHODS OF USE
WO2003104399A2 (en) 2002-06-07 2003-12-18 Avalon Pharmaceuticals, Inc Cancer-linked gene as target for chemotherapy
WO2003101400A2 (en) 2002-06-04 2003-12-11 Avalon Pharmaceuticals, Inc. Cancer-linked gene as target for chemotherapy
EP2258712A3 (en) 2002-03-15 2011-05-04 Multicell Immunotherapeutics, Inc. Compositions and Methods to Initiate or Enhance Antibody and Major-histocompatibility Class I or Class II-restricted T Cell Responses by Using Immunomodulatory, Non-coding RNA Motifs
WO2004000997A2 (en) 2002-03-19 2003-12-31 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
WO2003081210A2 (en) 2002-03-21 2003-10-02 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Identification of kinase inhibitors
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
US7317087B2 (en) 2002-03-25 2008-01-08 The Uab Research Foundation Members of the FC receptor homolog gene family (FCRH1-3, 6), related reagents, and uses thereof
WO2003083074A2 (en) 2002-03-28 2003-10-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Novel gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of colon carcinomas
US20030194704A1 (en) 2002-04-03 2003-10-16 Penn Sharron Gaynor Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for gene expression analysis two
JP2005534287A (ja) 2002-04-05 2005-11-17 アジェンシス， インコーポレイテッド 癌の処置および検出において有用な９８ｐ４ｂ６との名称の核酸および対応するタンパク質
US20040101874A1 (en) 2002-04-12 2004-05-27 Mitokor Inc. Targets for therapeutic intervention identified in the mitochondrial proteome
EP2011886A3 (en) 2002-04-16 2009-02-11 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
AU2003239158A1 (en) 2002-04-17 2003-11-03 Baylor College Of Medicine Aib1 as a prognostic marker and predictor of resistance to encocrine therapy
WO2003093444A2 (en) 2002-05-03 2003-11-13 Incyte Corporation Transporters and ion channels
EP1572925A4 (en) 2002-05-15 2007-08-15 Avalon Pharmaceuticals CANCER-RELATED GENE AS A TARGET FOR CHEMOTHERAPY
AU2003232453A1 (en) 2002-05-30 2003-12-19 David K. Bol Human solute carrier family 7 member 11 (hslc7a11)
AU2003240495A1 (en) 2002-06-04 2003-12-19 Incyte Corporation Diagnostics markers for lung cancer
JP4594085B2 (ja) 2002-06-06 2010-12-08 オンコセラピー・サイエンス株式会社 ヒト結腸癌に関連する遺伝子およびポリペプチド
AU2003242633A1 (en) 2002-06-06 2003-12-22 Molecular Engines Laboratories Dudulin genes, non-human animal model: uses in human hematological disease
AU2003245441A1 (en) 2002-06-12 2003-12-31 Avalon Pharmaceuticals, Inc. Cancer-linked gene as target for chemotherapy
AU2003247576A1 (en) 2002-06-18 2003-12-31 Archemix Corp. Aptamer-toxin molecules and methods for using same
US20040249130A1 (en) 2002-06-18 2004-12-09 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
CN100495938C (zh) 2002-06-20 2009-06-03 施耐普特拉克股份有限公司 减少组合gps接收机和通信系统中的交叉干扰
EP1539218A4 (en) 2002-06-20 2007-08-22 Univ California COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING LYMPHOCYTE ACTIVITY
EP2365004B1 (en) 2002-06-21 2016-01-06 Johns Hopkins University School of Medicine Membrane associated tumor endothelium markers
US7776814B2 (en) 2002-07-09 2010-08-17 R&D-Biopharmaceuticals Gmbh Tubulysin conjugates
AU2003281515A1 (en) 2002-07-19 2004-02-09 Cellzome Ag Protein complexes of cellular networks underlying the development of cancer and other diseases
CA2492447A1 (en) 2002-07-25 2004-02-05 Genentech, Inc. Taci antibodies and uses thereof
US20050180972A1 (en) 2002-07-31 2005-08-18 Wahl Alan F. Anti-CD20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
ES2544527T3 (es) 2002-07-31 2015-09-01 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de fármacos y su uso para tratar el cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa
AU2003251471A1 (en) 2002-08-06 2004-02-25 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with human cxc chemokine receptor 5(cxcr5)
JP2004121218A (ja) 2002-08-06 2004-04-22 Jenokkusu Soyaku Kenkyusho:Kk 気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法
ES2361739T3 (es) 2002-08-16 2011-06-21 Immunogen, Inc. Reticulantes con elevada reactividad y solubilidad y su uso en la preparación de conjugados para el suministro dirigido de fármacos de molécula pequeña.
EP1578371A4 (en) 2002-08-19 2009-05-20 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING AND TREATING TUMORS
WO2004020583A2 (en) 2002-08-27 2004-03-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide predictor set for identifying protein tyrosine kinase modulators
WO2004020595A2 (en) 2002-08-29 2004-03-11 Five Prime Therapeutics, Inc. Novel human polypeptides encoded by polynucleotides
AU2002951346A0 (en) 2002-09-05 2002-09-26 Garvan Institute Of Medical Research Diagnosis of ovarian cancer
CN1691964A (zh) 2002-09-06 2005-11-02 曼康公司 表位序列
US20060134109A1 (en) 2002-09-09 2006-06-22 Nura Inc. G protein coupled receptors and uses thereof
JP2004113151A (ja) 2002-09-27 2004-04-15 Sankyo Co Ltd 癌遺伝子及びその用途
CA2501131A1 (en) 2002-10-04 2004-04-22 Van Andel Research Institute Molecular sub-classification of kidney tumors and the discovery of new diagnostic markers
EP1578447A4 (en) 2002-10-31 2009-06-03 Genentech Inc METHODS AND COMPOSITIONS THAT CAN INCREASE ANTIBODY PRODUCTION
AU2003295401B2 (en) 2002-11-08 2010-04-29 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of natural killer cell related diseases
WO2004044178A2 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Genentech, Inc. Methods and compositions for diagnosing dysplasia
AU2003298650B2 (en) 2002-11-15 2010-03-11 Musc Foundation For Research Development Complement receptor 2 targeted complement modulators
WO2004045553A2 (en) 2002-11-15 2004-06-03 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Ca125 gene and its use for diagnostic and therapeutic interventions
US20080213166A1 (en) 2002-11-20 2008-09-04 Biogen Idec Inc. Novel Gene Targets and Ligands that Bind Thereto for Treatment and Diagnosis of Colon Carcinomas
WO2004047749A2 (en) 2002-11-21 2004-06-10 University Of Utah Research Foundation Purinergic modulation of smell
US20040253606A1 (en) 2002-11-26 2004-12-16 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators
CA2508519A1 (en) 2002-12-02 2004-06-17 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Se Cretary Of The Department Of Health And Human Services Recombinant immunotoxin and use in treating tumors
EP1581641A4 (en) 2002-12-06 2006-11-15 Diadexus Inc COMPOSITIONS, SPREADING VARIATIONS AND METHODS RELATED TO OVARAL SPECIFIC GENES AND PROTEINS
US20040157278A1 (en) 2002-12-13 2004-08-12 Bayer Corporation Detection methods using TIMP 1
US7276372B2 (en) 2002-12-20 2007-10-02 Pdl Biopharma, Inc. Antibodies against GPR64 and uses thereof
AU2003299819A1 (en) 2002-12-23 2004-07-22 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha conjugate, neutrokine-alpha complex, and uses thereof
EP1597558A2 (en) 2003-01-08 2005-11-23 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to epidermal growth factor receptor modulators
US20050227301A1 (en) 2003-01-10 2005-10-13 Polgen Cell cycle progression proteins
US20050181375A1 (en) 2003-01-10 2005-08-18 Natasha Aziz Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of metastatic cancer
EP1583820A4 (en) 2003-01-14 2007-07-18 Bristol Myers Squibb Co ASSOCIATED POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES ASSOCIATED WITH THE NF-KB WAY
JP2007520996A (ja) 2003-01-15 2007-08-02 ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ４４３９０、５４１８１、２１１、５６８７、８８４、１４０５、６３６、４４２１、５４１０、３０９０５、２０４５、１６４０５、１８５６０、２０４７、３３７５１、５２８７２、１４０６３、２０７３９、３２５４４、４３２３９、４４３７３、５１１６４、５３０１０、１６８５２、１５８７、２２０７、２２２４５、２３８７、５２９０８、６９１１２、１４９９０、１８５４７、１１５、５７９、１５９８５、１５６２５、７６０、１８６０３、２３９５、２５５４、８６７５、３２７２０、４８０９、１４３０３、１６８１６、１７８２７、３２６２０、５７７、６１９、１４２３、２１５８、８２６３、１５４０２、１６２０９、１６３８６、２１１６５、３０９１１、４１８９７、１６４３、２５４３、９６２６、１３２３１、３２４０９、８４２６０、２８８２、８２０３、３２６７８または５５０５３を用いて泌尿器科障害を処置するための方法および組成物
AU2004205684A1 (en) 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
JP2009520459A (ja) 2003-02-14 2009-05-28 サイグレス ディスカバリー， インコーポレイテッド 癌における治療標的
US20030224411A1 (en) 2003-03-13 2003-12-04 Stanton Lawrence W. Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
SG149815A1 (en) 2003-11-06 2009-02-27 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
EP1711527A4 (en) * 2003-12-15 2008-09-03 Dendreon Corp HLA-DR SPECIFIC ANTIBODIES, COMPOSITIONS AND METHODS
EP1718667B1 (en) 2004-02-23 2013-01-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
WO2005092925A2 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
MXPA06014065A (es) * 2004-06-01 2007-01-31 Genentech Inc Conjugados de droga-anticuerpo y metodos.
CN101065151B (zh) * 2004-09-23 2014-12-10 健泰科生物技术公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
DK1797127T3 (en) 2004-09-24 2017-10-02 Amgen Inc Modified Fc molecules
JP2008521828A (ja) 2004-11-29 2008-06-26 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 操作された抗体およびイムノコンジュゲート
WO2008020827A2 (en) 2005-08-01 2008-02-21 Biogen Idec Ma Inc. Altered polypeptides, immunoconjugates thereof, and methods related thereto
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
CN101037475B (zh) * 2006-03-15 2012-08-15 上海中信国健药业股份有限公司 一种嵌合受体及其制备方法和用途
WO2007140371A2 (en) 2006-05-30 2007-12-06 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
EP1894941A1 (en) * 2006-09-01 2008-03-05 Institut Pasteur Treatment of cervical carcinoma with a recombinant adenylate cyclase carrying HPV antigens
GB0619291D0 (en) * 2006-09-29 2006-11-08 Ucb Sa Altered antibodies
PT2099823E (pt) 2006-12-01 2014-12-22 Seattle Genetics Inc Agentes de ligação ao alvo variantes e suas utilizações
US7834154B2 (en) 2007-02-09 2010-11-16 Genentech, Inc. Anti-ROBO4 antibodies and uses therefor
EP2144628B1 (en) 2007-05-08 2012-10-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates
EP2641618A3 (en) 2007-07-16 2013-10-23 Genentech, Inc. Humanized anti-CD79B antibodies and immunoconjugates and methods of use
SG183023A1 (en) 2007-07-16 2012-08-30 Genentech Inc Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
RU2505544C2 (ru) 2007-10-19 2014-01-27 Дженентек, Инк. Антитела против tenb2, сконструированные с цистеином, и конъюгаты антитело - лекарственное средство
WO2009092011A1 (en) 2008-01-18 2009-07-23 Medimmune, Llc Cysteine engineered antibodies for site-specific conjugation
DK2700651T3 (da) * 2008-07-18 2019-07-22 Bristol Myers Squibb Co Monovalente sammensætninger til cd28-binding og fremgangsmåder til anvendelse heraf
BRPI1013588A2 (pt) 2009-03-27 2016-04-19 Glaxo Group Ltd composição
PL2437785T3 (pl) 2009-06-04 2015-08-31 Novartis Ag Sposoby identyfikacji miejsc sprzęgania IgG
US20120213705A1 (en) 2009-06-22 2012-08-23 Medimmune, Llc ENGINEERED Fc REGIONS FOR SITE-SPECIFIC CONJUGATION
US8394922B2 (en) 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
GB0920127D0 (en) * 2009-11-17 2009-12-30 Ucb Pharma Sa Antibodies
KR101839163B1 (ko) 2010-06-08 2018-03-15 제넨테크, 인크. 시스테인 조작된 항체 및 접합체
US8979373B2 (en) 2010-07-15 2015-03-17 Thomson Industries, Inc. Linear motion bearing with interlock structure
WO2012074757A1 (en) 2010-11-17 2012-06-07 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
US11147852B2 (en) 2011-12-23 2021-10-19 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
TW201406785A (zh) 2012-07-09 2014-02-16 Genentech Inc 抗ｃｄ２２抗體及免疫結合物
EP2879708A4 (en) 2012-08-02 2016-03-16 Genentech Inc ANTIBODY AND ANTI-ETBR IMMUNOCONJUGATES
TWI636792B (zh) 2013-08-12 2018-10-01 建南德克公司 １－（氯甲基）－２，３－二氫－１ｈ－苯并［ｅ］吲哚二聚體抗體－藥物結合物化合物及使用與治療方法
WO2015110935A1 (en) 2014-01-27 2015-07-30 Pfizer Inc. Bifunctional cytotoxic agents
CN114732916B (zh) 2014-09-11 2023-12-19 西雅图基因公司 含叔胺药物物质的靶向递送
ES2830385T3 (es) * 2014-09-12 2021-06-03 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados anti-HER2
WO2016205176A1 (en) * 2015-06-15 2016-12-22 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates
MA43345A (fr) * 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100111856A1 (en) * 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates

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