CN117198390B - 通过设计和改造二硫键交联位点的slc膜蛋白复合物的制备方法 - Google Patents
通过设计和改造二硫键交联位点的slc膜蛋白复合物的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供的SLC膜蛋白复合物的制备方法，通过预测选取突变后半胱氨酸空间距离小于的SLC膜蛋白进行氨基酸位点突变，突变后的SLC膜蛋白直接可以形成稳定的二硫键。采用本申请SLC膜蛋白复合物的制备方法得到的SLC膜蛋白复合物能够稳定存在于溶液中且具备生理活性，蛋白产量显著提升，在冷冻电镜下膜蛋白颗粒均一性好，符合作为冷冻电镜样品进行高分辨结构解析的需求。其次，通过本申请的SLC膜蛋白复合物的制备方法制备得到的SLC膜蛋白复合物有助于SLC家族蛋白在冷冻电镜下的高分辨结构解析。可以获取氨基酸底物与SLC膜蛋白结合口袋的结构信息，以及与周围氨基酸残基的相互作用信息。这些信息进一步应用在基于冷冻电镜结构的SLC家族蛋白药物筛选中。
Description
技术领域
本申请属于蛋白质结构领域，具体涉及一种通过设计和改造二硫键交联位点的SLC膜蛋白复合物的制备方法。
背景技术
转运蛋白是人体内最大的膜蛋白家族，包含多种转运方式，其中溶质载体蛋白（SLC）家族最大的类别，共有456个成员，在外源和内源分子的吸收、分布和排泄等生物过程中起着至关重要的作用。目前，转运蛋白是主要的药物靶点，占现阶段已知药物靶点的60%以上，以转运蛋白为靶点的创新药物研发一直是医药领域的研究热点。
而蛋白质结构的解析是药物设计的关键。单颗粒分析（Single ParticleAnalysis,SPA）作为冷冻电镜技术之一，能观察靶点-药物的结合复合物高分辨率结构，以及它们的相互作用。从指导设计苗头化合物到先导化合物，以及助力药物研发其他关键步骤，这种基于结构的药物设计方法（SBDD），能为药物设计和筛选提供必要结构信息；SPA近于原子级别的结构分析可以提高药物的特异性，从而开发出更有效、副作用更小的药物。在现代药物研发过程中，确定蛋白-小分子复合物的高分辨结构，可以加速小分子抑制剂的筛选，减少需要合成和验证的化合物数量，从而实现以更少的迭代次数高效推进候选药物的筛选。
但针对转运蛋白的靶点筛选及药物开发仍面临巨大的挑战。这些膜蛋白及其复合物的复杂性使得它们难以进行有效的表达和纯化。此外，它们通常无法通过传统的质谱法进行直接检测，尤其是那些分子量较小（小于85kDa）且缺乏稳定可溶结构域的转运蛋白。这些问题给结构生物学领域的数据处理带来了重要的技术挑战。
通常情况下，通过筛选与转运蛋白结合的高质量、高特异性抗体，形成抗体-蛋白复合物，可以帮助解析转运蛋白的结构，进一步理解其功能和机制。然而，目前仅有少数SLC家族成员的转运蛋白适用于高质量抗体的筛选。由于SLC家族转运蛋白之间的结构和序列相似性较高，抗体可能出现交叉反应，难以区分不同同源蛋白。其次，转运蛋白主要存在于细胞膜或细胞器膜上，使获得具有在足够亲和力和特异性的抗体变得更具挑战性，因为抗体需要克服细胞膜上的障碍并实现良好的结合。此外，SLC家族转运蛋白的结构复杂性，包括多个跨膜结构与和可变的构象，降低了准确识别特定结构域和抗体结合位点的可行性。截至目前，人类蛋白质图谱仅报道了45种SLC家族成员的抗体，这意味着抗体筛选在转运蛋白中面临着高亲和力和高特异性的挑战性问题，并且更加复杂。
传统技术中共识突变是一种利用多个相关蛋白序列中高度保守的氨基酸残基来改变目标蛋白序列的方法。其基本假设是，这些保守残基在蛋白质结构和功能中发挥重要作用，因此通过引入它们可以增强蛋白质的结构稳定性。然而，共识突变的效果受到多个技术问题的限制。
首先，蛋白质的结构复杂性导致蛋白质的稳定性受到多种相互作用的影响，包括但不限于氢键、疏水相互作用、二硫键和离子相互作用等，不仅仅由保守残基决定。其次，蛋白质结构和折叠动力学也限制了共识突变的效果；最后，蛋白序列的多样性：可用于共识突变的相关蛋白序列可能有限，这限制了选择和效果。因此，仅依靠共识突变来提高整个蛋白质的稳定性是具有一定困难的。
综上所述，本领域亟需要一种增强SLC膜蛋白复合物结构稳定性的制备方法，帮助SLC家族蛋白的冷冻电镜的结构解析，并应用在基于冷冻电镜结构的SLC家族蛋白药物筛选。
发明内容
基于此，本申请提供一种SLC膜蛋白复合物的制备方法帮助SLC家族蛋白的冷冻电镜的结构解析，并提升整个蛋白质结构的稳定性。
本申请一方面提供一种SLC膜蛋白复合物的制备方法，包括以下步骤：
根据目标蛋白1和目标蛋白2的结构预测信息，参照SLC膜蛋白复合物三维结构进行拟合，生成所述目标蛋白1和所述目标蛋白2的复合物的预测模型。
根据所述复合物的预测模型确定所述目标蛋白1和目标蛋白2之间可能形成二硫键的位点，从位点中选出空间距离小于10Å的位点作为改造位点。
将所述目标蛋白1和所述目标蛋白2中的改造位点的氨基酸突变为半胱氨酸，分别形成目标蛋白1’和目标蛋白2’，目标蛋白1’和目标蛋白2’通过二硫键连接，制备SLC膜蛋白复合物。
在其中一个实施例中，若存在多个空间距离小于10Å的位点，选取空间距离相对较小的位点作为改造位点。
在其中一个实施例中，所述SLC膜蛋白选自SLC3A2、SLC7A5、SLC7A6、SLC7A7、SLC7A8、SLC7A10和SLC7A11中的至少两种。
在其中一个实施例中，采用PyMOL、UCSF Chimera或UCSF ChimeraX测量所述位点之间的空间距离。
在其中一个实施例中，SLC膜蛋白复合物的制备方法还包括构建含有突变后的SLC膜蛋白表达载体，导入细胞表达与纯化后收集SLC膜蛋白复合物。
在其中一个实施例中，利用同源重组系统构建含有突变后的SLC膜蛋白表达载体。
可选地，所述表达载体含有Twin-Strep标签。
在其中一个实施例中，构建含有突变后的SLC膜蛋白表达载体包括将突变后的半胱氨酸的氨基端序列插入至带有Twin-Strep标签的哺乳动物表达载体中。
可选地，所述表达载体选自pCDNA-SLC3A2-K300C-Twin-Strep、pCDNA-SLC7A11-Q219C-Twin-Strep、pCDNA-SLC3A2-K533C-Twin-Strep或pCDNA-SLC7A5-E303C-Twin-Strep。
在其中一个实施例中，收集SLC膜蛋白复合物之前包括去垢剂置换的步骤。
在其中一个实施例中，收集SLC膜蛋白复合物之前还包括凝胶过滤色谱验证。
本申请另一方面还提供所述的方法制得的SLC膜蛋白复合物在基于冷冻电镜结构的SLC家族蛋白药物筛选中的应用。
相对于传统技术，本申请的有益效果包括：
本申请提供的SLC膜蛋白复合物的制备方法，通过预测选取突变后半胱氨酸空间距离小于10Å的SLC膜蛋白进行氨基酸位点突变，突变后的SLC膜蛋白直接可以形成稳定的二硫键。采用本申请SLC膜蛋白复合物的制备方法得到的SLC膜蛋白复合物能够稳定存在于溶液中且具备生理活性，蛋白产量显著提升，在冷冻电镜下膜蛋白颗粒均一性好，无明显取向优势，符合作为冷冻电镜样品进行高分辨结构解析的需求。
其次，通过本申请的SLC膜蛋白复合物的制备方法制备得到的SLC膜蛋白复合物有助于SLC家族蛋白在冷冻电镜下的高分辨结构解析。通过结构解析，可以获取氨基酸底物与SLC膜蛋白复合物结合口袋的结构信息，以及与周围氨基酸残基的相互作用信息。这些结构信息可以进一步应用在基于冷冻电镜结构的SLC家族蛋白药物筛选中。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1中的A：拟合生成的膜蛋白复合物示意图，其中上方为SLC3A2膜蛋白，下方为SLC7A11膜蛋白；图1中的B：PyMOL软件中测量两个半胱氨酸的空间距离示意图；
图2为突变后的氨基酸序列；
图3通过本申请SLC膜蛋白复合物的制备方法制备得到的SLC膜蛋白复合物纯化分子筛示意图及凝胶电泳示意；
图4二硫键设计突变前、突变后以及突变后进行去垢剂优化后，SLC膜蛋白复合物产量对比示意图；
图5冷冻电镜下二硫键设计突变前（图5中的A）与突变后（图5中的B）膜蛋白复合物筛样对比示意图；
图6二硫键设计突变前（图6中的A）与突变后（图6中的B）膜蛋白复合物在结构解析中二维投影拟合后2D分类及三维重构后电子云密度对比示意图；
图7二硫键突变后膜蛋白复合物高分辨结构及底物结合口袋示意图。
具体实施方式
下面结合实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非与本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
本申请中，涉及到数值区间（也即数值范围），如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点（即最小值及最大值），以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1~10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本申请一方面提供一种SLC膜蛋白复合物的制备方法，包括以下步骤：
根据目标蛋白1和目标蛋白2的结构预测信息，参照SLC膜蛋白复合物三维结构进行拟合，生成所述目标蛋白1和所述目标蛋白2的复合物的预测模型。
根据所述复合物的预测模型确定所述目标蛋白1和目标蛋白2之间可能形成二硫键的位点，从所述位点中选出空间距离小于10Å的位点作为改造位点。
将所述目标蛋白1和所述目标蛋白2中的改造位点的氨基酸突变为半胱氨酸，分别形成目标蛋白1’和目标蛋白2’，目标蛋白1’和目标蛋白2’通过二硫键连接，制备SLC膜蛋白复合物。
可选地，还包括将所述SLC膜蛋白复合物进行冷冻制样，然后利用冷冻电子显微镜成像，最后对图像数据进行分析处理以得到所述SLC膜蛋白复合物的三维结构。
在一个具体的示例中，若存在多个空间距离小于10Å的位点，选取空间距离相对较小的位点作为改造位点。可以理解的是一般来说，两个蛋白形成复合物，会存在相互作用界面。在这个相互作用界面上，通常存在一些关键的氨基酸残基，它们通过疏水、氢键、电荷相互作用等方式来稳定复合物的形成。对于紧密的相互作用界面，蛋白之间的氨基酸残基之间的空间距离一般在2Å~4Å，相对松散一些的相互作用界面则在8Å~10Å左右。如果出现多个位点，会优先选择距离更小的，这样更有利于复合物的稳定。
可选地，所述SLC膜蛋白选自SLC3A2、SLC7A5、SLC7A6、SLC7A7、SLC7A8、SLC7A10和SLC7A11中的至少两种。
在一个具体的示例中，采用PyMOL、UCSF Chimera或UCSF ChimeraX测量所述位点之间的空间距离。可以理解的是，也可以选择其他方式测量位点之间的空间距离。
其中，SLC膜蛋白复合物的制备方法还包括构建含有突变后的SLC膜蛋白表达载体，导入细胞表达与纯化后收集SLC膜蛋白复合物。
可选地，利用同源重组系统构建含有突变后的SLC膜蛋白表达载体。
进一步可选地，所述表达载体含有Twin-Strep标签。
在其中一个实施例中，构建含有突变后的SLC膜蛋白表达载体包括将突变后的半胱氨酸的氨基端序列插入至带有Twin-Strep标签的哺乳动物表达载体中。
可选地，所述表达载体选自pCDNA-SLC3A2-K300C-Twin-Strep、pCDNA-SLC7A11-Q219C-Twin-Strep、pCDNA-SLC3A2-K533C-Twin-Strep或pCDNA-SLC7A5-E303C-Twin-Strep。
在其中一个实施例中，收集SLC膜蛋白复合物之前包括去垢剂置换的步骤。
去垢剂主要成分是表面活性剂(部分场合即特指表面活性剂，可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂在蛋白提取中应用的较多)，根据实际需求有时也会包括研磨剂，pH调节剂，酸，硬水软化剂，氧化剂，酶，发泡剂，增白剂、稀释剂等多种成分。
可选地，收集SLC膜蛋白复合物之前还包括凝胶过滤色谱验证。其中，凝胶过滤色谱对于分离和纯化蛋白质、肽和寡核苷酸等生物分子非常有用。该方法可以通过利用具有特定孔隙率的多孔凝胶珠，根据尺寸、疏水性和分子电荷的变化选择性地保留或排除颗粒，是确定各种生物分子大小的有效方法。
本申请另一方面还提供所述的方法制得的SLC膜蛋白复合物在基于冷冻电镜结构的SLC家族蛋白药物筛选中的应用。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1
针对SLC3A2与SLC7A11形成的异源二聚膜蛋白复合物进行制备
一、将AlphaFold2预测的SLC7A11和SLC3A2三维结构结构模型进行拟合，生成膜蛋白复合物PDB文件。
二、将步骤1中的PDB文件导入Disulfide by Design2网站中，输出二硫键形成的方案，并在PyMOL中测量每对半胱氨酸之间的空间距离。
三、设计引物，将步骤4中满足条件的新二硫键进行氨基酸点突变。其中，对于复合物中的SLC3A2膜蛋白，将第300位的赖氨酸突变为半胱氨酸，其正向突变引物为：CTCCAGAGCGCTAAGTGCAAGAGCATCAGGGTG（SEQ ID NO.1）TGCTCTTGCACTTAGCGCTCTGGAG（SEQ ID NO.2）；而对于复合物中的SLC7A11膜蛋白，将第219位谷氨酰胺突变为半胱氨酸，其正向突变引物为：ATCAAGGGCCAGACCTGCAACTTCAAGGACGCC（SEQ ID NO.3）；反向突变引物为：GGCGTCCTTGAAGTTGCAGGTCTGGCCCTTGAT（SEQ ID NO.4）。
四、将通过同源重组的方法将含有新设计的二硫键的氨基端序列插入至带有Twin-Strep标签的pCDNA3.1+哺乳动物表达载体中。其中，对于复合物中的SLC3A2膜蛋白，其正向引物为：
TATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGCCACCATGGAAGCTGCAGCCTCCTGA（SEQ ID NO.5）
反向引物为：GTACAGGTTCTCGCTGCCGAATTCGGCGGCGTAGGGGAATCTCA
（SEQ ID NO.6）
对于复合物中的SLC7A11膜蛋白，其正向引物为：
CTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGCCACCATGGTGCGCAAGC（SEQ ID NO.7）
反向引物为：GGAAGTACAGGTTCTCGCTGCCGAATTCCAGCTTATCTTCTTCCGGC（SEQ IDNO.8）
五、将步骤四中获得的pCDNA-SLC3A2-K300C-twinstrep载体和pCDNA-SLC7A11-Q219C-twinstrep载体共转染到30mL哺乳动物Expi293细胞中进行中量表达，48h后通过1400rpm/min离心收集细胞，用1mL细胞裂解液（25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0，含有蛋白酶抑制剂混合物）在冰上裂解细胞30min，随后在四度离心机中14800rpm离心1h,收集膜碎片，再加入500μl含1%LMNG的细胞裂解液提取膜组分，4度孵育2-3h后4度14800rpm离心1h，收集上清。
上清与strep beads 4度孵育过夜，随后吸除液体，用含有25mM Tris-HCl，150mMNaCl，pH 8.0，0.01% LMNG的wash buffer 至少洗10个柱体积，随后用含有5mM脱硫生物素的洗涤缓冲液将目的膜蛋白复合物洗脱下来。通过SDS-PAGE跑胶验证新设计的二硫键的形成随后将洗脱的样品收集并进行SDS-PAGE跑胶验证新设计的二硫键的形成。
在凝胶电泳中，蛋白质样品经过非还原处理后，二硫键仍能保持跨链的连接状态。这有助于维持蛋白的结构完整性，并在电泳过程中显示出相应的迁移行为。因此，非还原条件下的凝胶电泳可以用于研究蛋白质中二硫键的存在。
六、将步骤五中验证成功的表达载体转染至1L哺乳动物Expi293细胞中进行大量表达。48h后通过1400rpm/min离心收集细胞，用5倍细胞体积的裂解液（5mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0，含有蛋白酶抑制剂混合物）重悬细胞，并用匀桨器充分裂解细胞，随后用超速离心机100000g离心1h，收集膜碎片。
再加入5倍膜碎片体积的含有1% LMNG的细胞裂解液，4度孵育2h后，使用超速离心机100000g离心1h，收集上清。并以0.5ml/min的流速将上清装载到5ml Strep柱子上；随后用含有25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0，0.03% Digitonin的wash buffer洗20个柱体积，并用含有5mM脱硫生物的洗涤缓冲液将目的膜蛋白复合物洗脱下来。
将含有目的膜蛋白复合物的组分混合在一起。使用100kDa超滤管将蛋白质浓缩至约500μl。接下来，在含有25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0，0.01% Digitonin的缓冲液中用superose6 10/300或superose6 5/150分析用凝胶过滤柱（GE公司）进行凝胶过滤色谱实验。最后，收集目的膜蛋白组分以备后续的结构解析或功能研究。
七、将步骤六中收集的膜蛋白组分进一步浓缩至浓度为10mg/ml，可直接进行冷冻制样或冻存于-80℃待用。
八、膜蛋白冷冻制样：通过15mA60s辉光放电的方法对铜载网进行亲水化处理，在4度、湿度为100%的条件下进行上样操作。随后进行冷冻样品筛选及数据收集，结构解析。
实施例2
针对SLC3A2与SLC7A5形成的异源二聚膜蛋白复合物进行制备
一、将AlphaFold2预测的SLC7A5和SLC3A2三维结构结构模型进行拟合，生成膜蛋白复合物PDB文件。
二、将步骤1中的PDB文件导入Disulfide by Design2网站中，输出二硫键形成的方案，并在PyMOL中测量每对半胱氨酸之间的空间距离。
三、设计引物，将步骤4中满足条件的新二硫键进行氨基酸点突变。其中，对于复合物中的SLC3A2膜蛋白，将第533位的赖氨酸突变为半胱氨酸，其正向突变引物为：AGTGATCAGAGAAGCTGCGAACGAAGCCTGCTC（SEQ ID NO.9）；反向突变引物为：GAGCAGGCTTCGTTCGCAGCTTCTCTGATCACT（SEQ ID NO.10）。
而对于复合物中的SLC7A5膜蛋白，将第303位谷氨酸突变为半胱氨酸，其正向突变引物为：CCCTGTCCACCTGCCAGATGCTGTCG（SEQ ID NO.11）；反向突变引物为：CGACAGCATCTGGCAGGTGGACAGGG（SEQ ID NO.12）。
四、将通过同源重组的方法将含有新设计的二硫键的氨基端序列插入至带有Twin-Strep标签的pCDNA3.1+哺乳动物表达载体中。其中，对于复合物中的SLC3A2膜蛋白，引物序列同实施例1，即（SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6）
而对于复合物中的SLC7A5膜蛋白，其正向引物为：GAGACCCAAGCTGGCTAGCATGGCGGGTGCGGGC（SEQ ID NO.13）
反向引物为：ACAGGTTCTCGCTGCCGAATTCTGTCTCCTGGGGGA（SEQ ID NO.14）
SLC3A2与SLC7A5膜蛋白复合物的表达、纯化、冷冻电镜样品制备、样品筛选、数据收集及结构解析步骤同实施例1。
实施例3 效果验证
由于膜蛋白存在于疏水环境中，其稳定性相对于水溶性蛋白而言更为困难，其次，膜蛋白通常比较难表达和纯化，其产量通常较低，而冷冻电镜制样需要大量的蛋白样品，尤其对于膜蛋白更甚。此外，膜蛋白的结构通常比水溶蛋白更复杂，多了一层去垢剂的包裹，因而需要更高的结构分辨来解析其细节，为了获得高分辨的结构，需要收集大量的冷冻电镜图像，并保证样品的质量和均一性。因此，高产量的膜蛋白样品可以支持高质量的结构解析。
如图4所示，二硫键突变前、突变后以及二硫键突变后去垢剂优化后，膜蛋蛋白复合物产量对比示意图。
在冷冻电镜样品筛样中，当样品的均一性较好时，意味着样品中的蛋白颗粒在结构上非常相似，并且呈现出高度一致的构象，这是实现高分辨结构图像的关键。而如图5中的A所示，在二硫键突变前，样品呈现出聚集、蛋白颗粒大小不均一的情况，如图5中的B所示，膜蛋白颗粒足够均匀地分布，这样，观察到的图像将具有更少的噪声和伪像，从而提高图像的信噪比。
在冷冻电镜单颗粒样品中，通过进行二维分类和三维重构并对比不同类别的图像，能够获得更高的结构分辨率，这意味着可以观察到更加精细的蛋白质结构细节。
如图6中的A所示，突变前的二维分类图和三维电子云密度图中的膜蛋白复合物只能显示轮廓，而二硫键突变后，在图6中的B所示，不仅有复合物的形状，而且能观察到蛋白的结构细节，如白色更深的为Helix结构。而结构分辨率的提高对解决许多生物学问题具有重要意义。它使我们能够更准确地理解蛋白质的三维结构，揭示其活性位点和功能区域，为药物设计和疾病治疗提供了更精确的目标。如图7所示，突变后获得的SLC膜蛋白的整体分辨率为3.13Å，其中跨膜区域为2.99Å，揭示了氨基酸底物与膜蛋白复合物结合口袋的结构信息，以及与周围氨基酸残基的相互作用信息。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书和附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (11)
1.SLC膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
根据目标蛋白1和目标蛋白2的结构预测信息，参照SLC膜蛋白复合物三维结构进行拟合，生成所述目标蛋白1和所述目标蛋白2的复合物的预测模型；
根据所述复合物的预测模型确定所述目标蛋白1和目标蛋白2之间可能形成二硫键的位点，从位点中选出空间距离小于的位点作为改造位点；
将所述目标蛋白1和所述目标蛋白2中的改造位点的氨基酸突变为半胱氨酸，分别形成目标蛋白1’和目标蛋白2’，目标蛋白1’和目标蛋白2’通过二硫键连接，制备SLC膜蛋白复合物；
所述目标蛋白1与所述目标蛋白2各自独立地包括SLC3A2、SLC7A5、SLC7A6、SLC7A7、SLC7A8、SLC7A10和SLC7A11中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的SLC膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，若存在多个空间距离小于的位点，选取空间距离相对较小的位点作为改造位点。
3.根据权利要求1～2任一项所述的SLC膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，采用PyMOL、UCSF Chimera或UCSF ChimeraX测量所述位点之间的空间距离。
4.根据权利要求1～2任一项所述的SLC膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，还包括构建含有突变后的SLC膜蛋白表达载体，导入细胞表达与纯化后收集SLC膜蛋白复合物。
5.根据权利要求4所述的SLC膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，利用同源重组系统构建含有突变后的SLC膜蛋白表达载体。
6.根据权利要求4所述的SLC膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，所述表达载体含有Twin-Strep标签。
7.根据权利要求1～2或5中任一项所述的SLC膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，构建含有突变后的SLC膜蛋白表达载体包括将突变后的半胱氨酸的氨基端序列插入至带有Twin-Strep标签的哺乳动物表达载体中。
8.根据权利要求7所述的SLC膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，所述表达载体选自pCDNA-SLC3A2-K300C-Twin-Strep、pCDNA-SLC7A11-Q219C-Twin-Strep、pCDNA-SLC3A2-K533C-Twin-Strep或pCDNA-SLC7A5-E303C-Twin-Strep。
9.根据权利要求1～2或5中任一项所述的SLC膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，收集SLC膜蛋白复合物之前包括去垢剂置换的步骤。
10.根据权利要求1～2或5中任一项所述的SLC膜蛋白复合物的制备方法，其特征在于，收集SLC膜蛋白复合物之前还包括凝胶过滤色谱验证。
11.权利要求1～10任一项所述的方法制得的SLC膜蛋白复合物在基于冷冻电镜结构的SLC家族蛋白药物筛选中的应用。
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