JPH07505050A - オートタキシン：癌診断及び治療に有用な運動能刺激タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 オートタキシン：癌診断及び治療に有用な運動能刺激タン本発明は一般に運動能 刺激ペプチド及び該ペプチドを含有する組成物に係る。特に、本発明は該ペプチ ド、例えばオートタキシン（ａｕｔｏｔａｘｉｎ、ＡＴＸ）の精製形態、オート タキシンをコードするＤＮＡセグメント、該ＤＮＡセグメントを含む組換えＤＮ Ａ分子、該組換えＤＮＡ分子を含む細胞、オートタキシンの製造方法、オートタ キシンに対する抗体、並びに該ペプチド及びＤＮＡセグメントを使用する癌診断 及び治療法に係る。

従来技術 細胞運動能は胚事象、成人組織改変、創傷治癒、血管形成、免疫防御及び腫瘍細 胞の転移に重要な役割を果たす（Ｓｉｎｇｅｒ、Ｓ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｋｕｐｆｅ ｒ、Ａ。

（１９８６）　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

２、３３７−３６５）。正常な生理的プロセスで（よ、運動能は厳密に調節され る。他方、腫瘍細胞運動能１ま異常に調節されるか又は自己調節され得る。腫瘍 細胞（言種々の物質に対して自発運動的に応答し得る。このような物質には、散 乱因子（Ｒｏｓｅｎ、Ｅ、Ｍ、ら、　（１９８９）Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１ｌ 　Ｄｅｖｅｌ、Ｂｉｏｌ。

２５、１６３−１７３）及び成長因子（Ｋａｈａｎ。

Ｂ、Ｗ、ら、　（１９８７）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。

４７、６３２４−６３２８；　５ｔｒａｃｋｅ、Ｍ。

■、ら、　（１９８９）　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１７０゜１６４９−１６６９ ；　Ｗａｎｇ、　Ｊ、　Ｍ、ら　（１９ｅａｕ、　Ｊ、ら　（１９９１）　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８．　２８９３−２８９ ７）のような宿主由来因子、細胞外マトリックスの成分（ＭｅＣａｒｔｈｙ、Ｊ 、Ｂ、ら（１９８４）　Ｊ、　Ｃｅ　］　ＩＢｉｏ１．　９８．　１４７４−１ ４８０）並びに腫瘍分泌又はオートクリン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）因子（Ｌ　ｉ 　。

ｔ　ｔａ、Ｌ、Ａ、　ら　（１９８８）　Ｃａｎｃｅｒ　５ｕ（１９８５）　Ｃ ｌ１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｉｍｍｕｎ。

Ｌｌ±ｈ、　３７．　３８７−３９６；　Ａｔｎ１ｐ、Ｋ。

Ｄｌ、ら（１９８７）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　１．４６．　９９６−１００２：　０ｈｎｉｓｈｉ、Ｔ、 ら（１９９０）　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ、　７３．　８８１−８８８；　５ｉ ｌｌｅｔｔｉ。

Ｓ、ら（１９９１）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、５１゜３５０７−３５１１　；及 びＷａｔａｎａｂｅ、Ｈ，ら（１９９１）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６６ 、１３４４２−１３４４８）がある。

多数の型の宿主由来可溶性因子は細胞運動を刺激するために傍分泌式に作用する 。胚線維芽細胞及び平滑筋細胞により産生される「散乱因子（ｓｃａｔｔｅｒ　 ｆａｃｔ。

ｒｓ）Ｊと呼称される運動部刺激タンパク質が同定されている（Ｓｔｏｋｅｒ、 Ｍ、ら（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ３２７、２３９−２４２）。散乱因子は上皮 細胞、ケラチノサイト、血管内皮細胞及び癌細胞（Ｓｔｏｋｅｙ。

Ｍ、ら（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３２７．　２３９−２４２；　Ｒｏｓｅｎ 、Ｅ、Ｍ、ら（１９９０）　Ｐｒ。

ｃ、ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、　１９５．　３４−４３；及びＷｅｉ ｄｎｅｒ、に、Ｍ、ら（１９９０）Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　１１１．　２０ ９７−２１０８）によりランダム及び管理下の運動能を刺激するが、線維芽細胞 により刺激することはない。更に、神経成長因子（Ｋａｈａｎ、Ｂ、Ｗ、ら（１ ９８７）　ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、　４７．　６３２４−６３２８）、インシュリ ン様成長因子−１（Ｓｔｒａｃｋｅ、Ｍ、Ｌ、　ら（１９８ン−６（Ｔ　ａ　ｍ ｍ、Ｉ　、ら（１９８９）　Ｊ、Ｅｘ　０Ｍｅｄ、　１７０．　１６４９−１６ ６９）、インターロイキン−８（Ｗａｎｇ、　Ｊ、　Ｍ、ら（１９９０）　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　１６９゜１６５−１７０） 及び酸性線維芽細胞成長因子（Ｊｏｕａｎｎｅａｕ、Ｊ、ら（１９９１）　Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８．　２８９３−２８９７）を始めとする多数の 宿主分泌成長因子は、腫瘍細胞における運動能を刺激することが立証された。こ れらの傍分泌因子は腫瘍細胞運動能の「帰還性」又は指向性に影響し得る。

これらの宿主由来因子とは対照的に、多（の型の腫瘍細胞は当該因子を形成する 同一腫瘍細胞により這・動部を刺激する「オートクリン運動部因子」なるタンパ ク質を産生ずることが知見された（Ｌｉｏｔｔａ、Ｌ、Ａ、、　ら（１９８６） 　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３．　３３０２−３３０ ６）、オートクリン運動部因子は所与の型の癌細胞に特異的ではなく、多くの型 の癌細胞に対して広範囲の活性を有しており（Ｋｏｈｎ、Ｅ。

Ｃ０ら（１９９０）　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　４６゜２８７−２９２）、正 常線維芽細胞又は白血球にはほとんど作用しない。

従来同定されているオートクリン運動部因子は細胞表面レセプター（Ｓｔｒａｃ ｋｅ、Ｍ、Ｌ、ら（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｊｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ ｍｍ。

１４７、　３３９−３４５；　Ｎａｂｉ、１．Ｒ，ら（１９９０）　Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｒｅｓ、　５０．　４０９−４１４；　Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｈ，ら（１９９ １）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　２６６、１３４４２−１３４４８）を介して 作用し、偽足突起（Ｇｕｉｒｇｕ！ｓ、Ｒ，ら（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３ ２９．　２６１−２６３）を形成し、ランダム及び管理下の両方の移動をもたら す−３３０６；　Ａｔｎ１ｐ、に、Ｄ、ら（１９８７）　旦ｉｏｃｈｅｍ、Ｂｊ ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　１４６、　９９６−１００２；　０ｈｎｉｓ ｈｉ、Ｔ、ら（１９９０）　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ、　７３．　８８１−８８ ８．）。

ヒトＡ２０５８メラノーマ細胞の従来の研究により、これらの細胞はオートクリ ン運動部因子の特に豊富な供給源であることが立証されている。まず約５ＱｋＤ ａの分子量を有するオートタリン運動部因子がこれらの細胞のならし培地から単 離された（Ｌｉｏｔｔａ、Ｌ、Ａ、ら（１９８６）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８３、３３０２−３３０６）。その後、同一分子量を有す る類似の腫瘍細胞由来又は誘導因子が複数の研究者により報告及び精製された（ Ａｔｎ　ｉｐ、に、Ｄ、ら（１９Ｓ、　Ｌ、ら（１９８８）　Ｊ、　Ｃｅ　Ｉ　 Ｉ　Ｓｃ　ｉ、９０゜３９１−３９９：　０ｈｎｉｓｈｉ、Ｔ、ら（１９９０） １１１、２０９７−２１０８）。このような因子は腫瘍細胞浸潤において主要な 役割を果たすと考えられる。

従来同定された運動能因子のほとんどは均質にまで精製されておらず、配列決定 もされていない。本明細書中でオートタキシン（ＡＴＸ）と呼称する本発明の新 規腫瘍運動部因子は、２−Ｄゲル電気泳動により精製され、均質サンプルである ことが確認された。本発明のタンパク質は従来同定又は精製された運動能因子の いずれとも異なる。ＡＴＸの分子サイズは約１２５ｋＤａであり、約７．７の等 電点を有する。ＡＴＸはｐＭ濃度でヒトＡ２０５８メラノーマ細胞のランダム及 び管理下の両方の移動を刺激する。この因子（ＡＴＸ）の活性は百日咳毒素によ る阻害に対して完全に感受性である。細胞運動能を刺激することが知られている 従来の因子を含む哺乳動物タンパク質と本発明のタンパク質との間に顕著な相同 は存在しないことが判明した。

患者の個々の腫瘍の侵襲を予測し、治療後の腫瘍の局所再発を予測し、浸潤性腫 瘍の発生の危険が高い患者を識別する臨床的必要性は甚大である。本発明はヒト 癌の浸潤潜在性に機能的に関連する機能的マーカーを提供する。本発明は更に、 体液又は組織に分泌されたこのマーカーのアッセイを提供する。本発明のアッセ イはヒト悪性腫瘍及び他の炎症性、線維症性、感染性又は治癒性疾患の検出、診 断及び治療に使用することができる。

発明の要約 本発明は一般に運動部刺激ペプチド及び該ペプチドをコードするＤＮＡセグメン トに係る。

本発明の特定の目的は、以下の文中でオートタキシンと呼称する運動部刺激ペプ チドを提供することである。

本発明の別の目的は、オートタキシンをコードするＤＮＡセグメント及び該セグ メントを含む組換えＤＮＡ分子を提供することである。本発明の更に別の目的は 、このような組換え分子を含む細胞及び該細胞を使用するオートタキシンの製造 方法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、オートタキシンの精製方法を提供することである。

本発明のその他の目的及び利点は以下の説明に明示される。

図面の簡単な説明 図１゜疎水性相互作用によるＡＴＸの分画。Ａ２０５８ならし培地の２００ｍ１ サンプルをフェニル５ｅｐｈａｒｏｓｅ−４Ｂの２０ＱｍＬカラム上でクロマト グラフィーにかけた。緩衝液Ａは５０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　ＣｐＨ７，５）、５ ％メタノール及び１．２Ｍ硫酸アンモニウムとした。緩衝液Ｂは５０ｍＭ　Ｔｒ 　ｉｓ　（ｐＨ７，５）　、５％メタノール及び５０％エチレングリコールとし た。勾配（−一一一）は減少濃度の硫酸アンモニウム（１，２→Ｏ，ＯＭ）と増 加濃度のエチレングリコール（０→５０％）との二重直線勾配を表す。２８０ｎ ｍの吸光度（）をモニターした処、タンパク質の大部分はカラムに結合しなかっ た。Ｂｏｙｄｅｎ　Ｃｈａｍｂｅｒアッセイを使用して運動能刺激能について１ ０ｍ１フラクシヨンをアッセイした（○）。運動部活性のピークは９００〜１０ ５０分に勾配の〜１２％で出現した。

図２゜レクチンアフィニテイクロマトグラフイーによるＡＴＸの単離。フェニル ５ｅｐｈａｒｏｓｅ活性ピーク２Ｑｍｌずつを４０ｍ１コンカナバリンＡ　Ａｆ ｆｉ−Ｇｅｌカラム上でアフィニティ精製した。０．０５ＭＴｒｉｓ　（ｐＨ７ ，５）　、Ｏ，ＩＭ　ＮａＣｌ、０．０１ＭＣａｃ１ｇ及び２０％エチレングリ コールから構成される緩衝液中のメチルα−Ｄ−マンノピラノシド（０゜ＱｍＭ 。

１０ｍＭ及び５００　ｍＭ）の段階的勾配（−−−−）で結合成分を溶離した。

２８０　ｎｍの吸光度（）をモニターした処、タンパク質成分の大部分はカラム に結合していなかった。１０ｍＬフラクション中の運動能（１，。

０、、、＞をアッセイした処、５００ｍＭ溶離液濃度に１に検出された。７回の クロマトグラフィーのうちの１回を示す。

図３゜弱アニオン交換クロマトグラフィーによるＡＴＸの精製。Ｃｏｎ　Ａアフ ィニティ力ラムから溶出した活性ピークの約３０％をＺＯＲＢＡＸ　ＢｉｏＳｅ ｒｉｅｓ−ＷＡＸカラムに加えた。１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉｓ　（ＤＨ７，５）及び ３０％エチレングリコールから構成される緩衝液中でＮａＣ１勾配Ｃ−−−−） を使用して結合成分を溶離した。

１．０ｍｌフラクション中の運動能（○）をアッセイした。

活性ピークは勾配の浅い部分に別個ではあるが広い領域で溶出した。２３０ｎｍ の吸光度（）をモニターした。カラムに強力に結合した活性に会合しないタンパ ク質成分の大部分は１．０Ｍ　ＮａＣ１で溶出した。２回のクロマトグラフィー のうちの１回を示す。

図４゜分子篩排除クロマトグラフィーによるＡＴＸの精製。弱アニオン交換カラ ムから溶出した活性ピーク全体を一連ｆ）ＴＳＫｈラム（４０００ＳＷ、４００ ０ＳＷ、３０ｏｏｓｗ及び２０００　ＳＷの順）に加えた。０．１ＭＮａＰＯ４ ＣｐＨ７，２）　、１０％メタノール及び１０％エチレングリコールから構成さ れる緩衝液中でタンパク質を溶離した。２３５ｎｍの吸光度（）をモニターする ことにより２つの主要なタンパク質ビークが検出された。

０．４ｍｌサンプル中で運動能（、、、Ｏ，、、）をアッセイした処、主に最初 の小さいほうのタンパク質ピークに検出された。

図５゜強アニオン交換クロマトグラフィーによるＡＴＸの最終精製。分子篩排除 系からの活性ピークの約１５％をＰｒｏ−Ｐａｃ　ＰＡＬカラムに加えた。カラ ムに結合したタンパク質を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，５）、５％メタノー ル及び２０％エチレングリコールから構成される緩衝液中でＮａＣｌ勾配（−− −−）を使用して溶離した。

２１５ｎｍの吸光度（）をモニターした。１１５（、、、Ｏ，、、）又は１／１ ５（、，０，、）の２種の異なる希釈率で１．０ｍｌフラクシ町ン中の運動能活 性をアッセイした。活性は勾配の中心領域で二重タンパク質ビークに対応するこ とが判明した。

図６゜種々の精製段階からの活性ピークに会合するタンパク質成分。各クロマト グラフィー分画からの活性ピークをプールし、濃縮し、ＳＯ３−ポリアクリルア ミドゲル電気泳動により分析した。各パネルのレーンｌは分子量標準を示す。パ ネルＡ）は非還元条件下で実施した最初の３回の精製段階の８−１６％勾配ゲル を示す。レーン２はフェニル５ｅｐｈａｒｏｓｅ分画から溶出した活性ピークの プールのアリコートである。レーン３はＣｏｎ　Ａアフィニティ精製から溶出し た活性ピークのプールからのアリコートである。レーン４及び５は弱アニオン交 換クロマトグラフィー（図３）により分画した活性の「ピーク」及び「肩」を示 す。パネルＢ）は分子篩排除クロマトグラフィーにより分画した活性ピークの７ ％ゲルを示す。レーン２及び３はゲルを非還元条件及び還元条件下で夫々使用し た場合の活性ピークのプールの合計のタンパク質分離パターンを示す。パネルＣ ）は非還元条件下で実施した最終強アニオン交換クロマトグラフィーの８−１６ ％勾配ゲルを示す。レーン２はカラムから溶出した活性ピークのプールの合計の 〜１％を含む。

図７゜ＡＴＸの２次元ゲル電気泳動。精製したＡＴＸ（図６、パネルＣ）を非平 衡等電点電気泳動（５００Ｖ５時間）にかけた後、第２の次元で７．５％５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。同時に泳動したチューブゲルの９ ．５ｃｍサンプルで、生じたｐＨ分離を測定し、上部に示す。第２の次元の分子 量標準を右側に示す。

この分析によると、ｐｌ＝７．７±０．２及びＭｒ＝１２ｏ、ｏｏｏを有する単 一成分であることが明らかである。

図８゜ＡＴＸの希釈曲線。精製ＡＴＸ　（図６、パネルＣ）を連続希釈し、運動 能刺激活性を試験した。非刺激バックグラウンド運動能を差し引いた結果、活性 は〜５００ｐＭＡＴＸで最大の５０％である。

図９゜ＡＴＸの百日咳毒素（ＰＴ）感受性。運動能アッセイの開始前にＡ２０５ ８細胞を０．１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ中の０．５回ｇ／ｍ１ＰＴ又は０．１％ＢＳ Ａ−ＤＭＥＭ単独（未処理対照）で１時間前処理した。次に精製ＡＴＸ（図６、 パネルＣ）により刺激した運動部活性を２つの処理群について評価した。非刺激 バックグラウンド運動能を差し引いた結果を細胞／ＨＰＦ±Ｓ、Ｅ、Ｍ、として 表すと、未処理対照（黒塗部分）に比較してＰＴ処理細胞（斜線部分）の強い阻 害が明らかである。ＰＴは細胞生存率に影響しなかった。Ｓ、Ｅ、Ｍ、はく１０ ％であった。

図１０゜ＡＴＸ刺激刺激運動子ェッカーボード分析。図示のように、種々の希釈 率のオートタキシンを細胞と共に上部チャンバー及び／又は下部チャンバーに加 えた。細胞／ＨＰＦ＋Ｓ、Ｅ、Ｍ、として表した運動部応答をチェッカーボード の各点で評価した。

図１１゜ＨＰＬＣ上のＡＴＸペプチドの精製。強アニオン交換クロマトグラフィ ーにより均質まで精製したＡＴＸを臭化シアンにより逐次消化し、還元及びピリ ジルエチル化し、トリプシンにより消化した。得られたペプチドを、０．１％ト リフルオロ酢酸中の（０−７０）％アセトニトリル勾配（−−−−）を使用して Ａｑｕａｐｏｒｅ　ＲＰ３００　Ｃ−８逆相カラム上で精製した。２１５ｎｍの 版端アミノ酸配列分析用にランダムに選択した７つのピークを適当な番号で示す 。

発明の詳細な説明 オートタキシンは無血清ならし培地中で低密度で培養したＡ２０５８ヒトメラノ ーマ細胞により分泌される。ＡＴＸはｃｏｎ　Ａに対する高い親和性とＡＴＸペ プチドのアミノ酸配列分析によりグリコジル化タンパク質であると考えられる。

還元条件下でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定したＡＴＸの分 子サイズは約１２５ｋＤａであり、７．７±０．２の等電点を有する。これらの 特徴は腫瘍細胞運動能に関与する数種の小成長因子及びインターロイキンからＡ ＴＸを区別するものである（Ｓｔｒａ；　Ｖａｎ　５ｎｉｃｋ、Ｊ、　（１９９ ０）　Ａｎｎ。

９２３７）　。

１態様によるとＡ２０５８ヒトメラノーマ細胞に由来する本発明のタンパク質は 、例えば本明細書に開示する精製プロトコルを使用して、通常ではこのようなタ ンパク質に会合するタンパク質を実質的に含まないように製造することができる 。このプロトコルの概要を以下に説明する。

適当な産生細胞（例えば腫瘍細胞）から大量の無血清ならし培地を集め、約５０ ０倍に濃縮する。この濃縮ならし培地をタンパク質の化学的及び物理的特性に依 存する方法により他の汚染性タンパク質から分離する。このような特性としては 、分子量、相対疎水性、正味の電荷、等電点及びタンパク質上のレクチン結合糖 残基の存在が挙げられる。

あるいは化学的又は組換え手段を使用してタンパク質又はその機能的部分を合成 することもできる。

本発明のタンパク質は強い生物活性を有する。精製ＡＴＸはピコモル範囲で活性 であり、活性１単位は本明細書及び他の文献（Ｓｔｒａｃｋｅ、Ｍ、Ｌ、ら（１ ９８９）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４．　２１５４４−４９）に記載され ている細胞運動能アッセイにより評価した場合、約５００ｐＭの濃度に対応する 。

本発明のタンパク質は２次元ゲル電気泳動により決定した場合に、１２０〜１３ ０ｋＤａ、より特定的には約１２５ｋＤａの分子サイズを有する。更に、本発明 のタンパク質は７．５〜７．９の範囲、好ましくは約７．７のｐＨを有し得る。

本発明は更にＡＴＸに対応するアミノ酸配列又はこのような配列のユニーク部分 （ユニーク部分は本発明では少なくとも５．１０．２５又は５０アミノ酸として 定義される）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントに関する。１態 様によると、ＤＮＡセグメントは配列番号１〜１１及び配列番号２６〜３３に示 すアミノ酸配列の任意の１種をコードする。

別の態様によると、本発明は当業者により製造できるような、ベクター（例えば プラスミド又はウィルスベクター）とＡＴＸに対応するポリペプチドをコードす るＤＮＡセグメントを含む組換えＤＮＡ分子に関する。好ましくは、コ−ディン グセグメントはプロモーターに作動的に連結したベクター中に存在する。

別の態様によると、本発明は上記組換えＤＮＡ分子を含む細胞に関する。適切な 宿主細胞としては原核細胞（例えば大腸菌を含む細菌）並びに下等真核細胞（例 えば酵母）及び高等真核細胞（例えば哺乳動物細胞）を挙げることができる。宿 主細胞に組換え分子を導入するには当業者に公知の方法を使用することができる 。

別の態様によると、本発明はＡＴＸに対応するアミノ酸配列を有するペプチドの 製造方法に関する。該方法はＤＮＡセグメントが発現されるような条件下で上記 細胞を培養する段階と、こうして産生されたＡＴＸを単離する段階とを含む。

別の態様によると、本発明はオートタキシン又はそのペプチドフラグメントに対 する親和性を有する抗体に関する。

本発明は更にこのような抗体の結合フラグメントに関する。

好適態様によると、抗体は配列番号１〜１１及び配列番号２６〜３３のうちの１ つに示すアミノ酸配列を有するオートタキシンベブチドに対して特異的である。

抗体は、当業者に公知の方法を使用して天然に存在するか又は組換えにより製造 されたオートタキシン又はそのペプチドフラグメントに対する抗体であり得る。

上記ＡＴＸペプチドフラグメントを他の物質、特にポリペプチドに結合し、融合 又は共役結合ポリペプチドとし、キャリヤータンパク質として使用してもよい。

ＡＴＸ及びそのフラグメントはアオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）　、ウシ血清ア ルブミン、破傷風トキソイド等のような種々のキャリヤータンパク質に融合又は 共役結合することができる。

例えばポリクローナル抗体の製造方法の記載については、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ 　、Ｈｏｅｂｅｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　（Ｈａｒｐｅｒ　ａｎ ｄ　Ｒ。

ｗ、　１９６９）、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ、　５ｐｅｃｉｆｉｃｙ　ｏｆ　Ｓ ｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　（Ｄｏｗｅｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔ ｉｏｎｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９６２）及びＷｉ　１１　ｉ　ａｍｓら。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　ａｎｄＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔ ｙｒｙ、Ｖｏｌ、１（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１ ９６７）を参照されたい。典型的な方法は動物を抗原で高度免疫する方法である 。繰り返し感作してまもなく動物から採血し、γグロブリンを単離する。

場合によっては種々の哺乳動物宿主からモノクローナル抗体を製造することが望 ましい。このようなモノクローナル抗体の製造方法は５ｔｉｔｅｓら編、　Ｂａ ５ｉｃ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　（Ｌａｎｇｅ　 Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ。

Ｌｏｓ　Ａｌｔｏｓ、ＣＡ、第４版）及びその引用文献に記載されており、特に モノクローナル抗体の製造方法はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒ ｅ　２５６　：　４９５−４９７　（１９７５）に開示されてむ）る。

別の態様によると、本発明は配列番号１〜１１及び配列番号２６〜３３のうちの １つに示すセンス又はアンチセンス縮重配列に従って合成されたオリゴヌクレオ チドプローブに関する。

配列番号１〜１１及び配列番号２６〜３３に示す配列をＧｅｎＢａｎｋ　（６８ ，０）　、ＥＭＢＬ　（２７，０）　、５ＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ　（１８，０）及 びＧｅｎＰｅｐｔ　（６４、釦のタンパク質データベースにおける配列と比較し た処、公知タンパク質との間に顕著な相同は認められなかった。従って、オート タキシンは従来記載されていない独特のタンパク質である。

別の態様によると、本発明は癌転移診断方法及びこのような方法で使用するのに 適したキットに係る。好ましくは、非限定的な例としてＥＬＩＳＡＳＲＩＡ又は イムノプロット構造でＡＴＸに対する抗体を使用し、患者の体液（例えば血清、 尿、胸膜浸出液等）中のＡＴＸの存在を検出することができる。これらの抗体を 患者サンプルの免疫染色で使用し、ＡＴＸの存在を検出することもできる。

更に別の態様によると、本発明はｉｎ　ｖｉｖｏ及びｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断法に 関する。ＡＴＸを当業者に公知の手段により放射性標識し、適切な画像により遠 位転移部位を後で検出するために、同様に当業者に公知の適切な補助物質と共に 癌患者に注射する。組織又は体液中のＡＴＸレベルを使用して同様にＡＴＸイン ヒビターを含み得る疾患の結果及び／又は治療法の選択を予測することができる 。

別の態様によると、本発明は癌の治療に関する。ＡＴＸ抗体を当業者に公知の方 法により毒素（例えばリシンＡ）と架橋し、架橋した複合体を当業者に公知の手 段により適切な補助物質と共に癌患者に投与し、抗体複合体が癌細胞に結合した 。ら、細胞を架橋毒素により死滅させる。

以下、非限定的な実施例により本発明を更に詳細に説明以下のプロトコル及び実 験の詳細は後述する実施例で参照する。

扛料。ポリカーボネートＮｕｃｌｅｐｏｒｅ膜及び４８穴微量走化性チヤンバー はＮｅｕｒｏ　Ｐｒｏｂｅ、　ＩｎＣ１から入手した。百日咳毒素（ＰＴ）、エ チレングリコール（バイオテクノロジーグレード）、メチルα−Ｄ−マンノピラ ノシドは市販品とした。両性電解質ｐＨ３−１０Ｂｉｏ−Ｌｙｔｅ及びｐＨ８− １０Ｂｉｏ−ＬｙｔｅはＢｉｏ−Ｒａｄから入手した。フェニル５ｅｐｈａ　ｒ 。

ｓｅ　ＣＬ−４８；　ａｆｆｉ−ＧｅｌコンカナバリンＡ；　ＺＯＲＢＡＸ　Ｂ ｉｏＳｅｒｉｅｓ−ＷＡＸ（弱アニオン交換）カラム（９，４ｍｍＸ２４ｃｍ） ；　Ｓｐｈｅｒｏｇｅｌ−ＴＳＫ　４０００ＳＷ、３０００ＳＷ及び２ｏ　ｏ　 ｏ　ｓｗカラム（各７．５ｍｍＸ３０ｃｍ）；　Ｐｒ。

−Ｐａｃ　ＰＡＬ　（４ｘ５０ｍｍ）強アニオン交換カラム；　Ａｑｕａｐｏｒ ｅ　ＲＰ３００　Ｃ−８逆相カラム（２２０Ｘ２．１ｍｍ）；並びにＡｍ１ｎｏ ＱｕａｎｔＣ−１８逆相カラム（２００ｘ２．１ｍｍ）は同様に市販品とした。

細胞培養。Ｔｏｄａｒｏ　（Ｔｏｄａｒｏ、Ｇ、Ｊ、　ら（１９８０）　Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７、５２５８−５２６２）によ り最初に単離されたヒトメラノーマ細胞系Ａ２０５８をＬｉｏｔｔａ（ＬａＯ２ ）により従来記載されているように維持した。

オートタキシンの製造。Ａ２０５８細胞をＴ−１５０フラスコ中で増殖させ、ト リプシン処理し、ｌＸｌ０”細胞／培地の細胞密度で２４，０００ｃｍ”細胞培 地に接種した。

５〜６日後、血清含有培地を除去し、細胞をＤＰＢＳで洗った。フェノールレッ ドを含まないＤＭＥＭ中に培地を維持し、４ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ　／　ｍ　１ストレプトマイシン、５μｇ　／　ｍ　ｌ 結晶化ウシ血清アルブミン、１０μｇ　／　ｍ　ｌウシインシュリン及び１μＭ アプロチニンを補充した。培養物上清を３日毎に回収し、−４０℃に凍結し、新 しい無血清培地に交換した。

上清の各サイクルのＡＴＸ産生を以下に詳述する細胞運動能アッセイでを試験し た。一般に、細胞培地はこれらのサイクルの９〜１１で産生能を維持し続けた。

上清約４５〜６０Ｌの蓄積後、培養物上清を融解し、Ａｍ１ｃｏｎ　５１０Ｙ３ ０螺旋膜限外濾過カートリツジを使用して２〜２．５Ｌに濃縮した。Ｄｉａｆｌ ｏ膜を使用してＡｍ１ｃｏｎ高性能限外濾過セルでこの上清を更に濃縮した。な らし培地１００〜２００Ｌから達成された最終容量は一般に２５０〜４００ｍ１ であった。全限外濾過は４℃で実施した。

細胞運動能アッセイ。カラムから収集したフラクションの運動能刺激能を試験す ることにより、オートタキシンの精製をモニターした。これらのフラクションは 緩衝液中では走化性アッセイに不適切であったので、各フラクションを適当な緩 衝液、即ちカルシウム及びマグネシウムを含有するＤＰＢＳ中０．１％（ｗ／ｖ ）ＢＳＡで洗う必要があった。この透析は＞３０，０００ダルトンの分子種を保 持するＣｅｎ　ｔ　ｒ　ｉ　ｃｏｎ−３０限外濾過チユーブに各被験フラクショ ンのアリコートを加えることにより実施した。

運動能を決定するためのアッセイは文献（Ｓｔｒａｃｋｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍ ｍ、　１４６．　３３９−３４５；　５ｔｒａｃｋｅら　（１９８９）　Ｊ、Ｂ ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４．　２１５４４−２１５４９）中に記載されている ように４８穴微量走化性チヤンバーを使用して３回繰り返して実施した。これら の改造Ｂｏｙｄｅｎチャンバーで使用したＮｕｃｌｅｐｏｒｅ膜を固定し、Ｄｉ ｆｆ−Ｑｕｉｋで染色した。　２２０２Ｕ１ｔｒｏｓｃａｎレーザーデンシトメ ーターで染色膜を読み取ることにより又は５つのランダムに選択した高パワー領 域（ＨＰ　Ｆ）を光学顕微鏡（４００Ｘ）で各々２回ずつ計数することにより定 量した。デンシトメータ一単位（波長６３３ｎｍ）はＨＰＦ当たりの細胞数に直 線的に関係することが判明した（Ｔａｒａｂｏｌｅｔｔｉ、Ｇ、　（１９８７） 　去、Ｃｅ１ｆ　Ｂｉｏｌ、　１０５．　２４０９−２４１５；５ｔｒａｃｋｅ 、Ｍ、Ｌ、ら（１９８９）　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６４．　２１５４４−２１５４９）、一般に、非刺激運動能（バ ックグラウンド）は５〜１０細胞／ＨＰＦに対応し、高応答細胞は非刺激バック グラウンド上の７０〜１００細胞／ＨＰＦに対応する（即ち合計７５〜１１０全 細胞／ＨＰＦ）。

ＰＴを使用する実験では、アッセイ前に毒素を細胞と共に１〜２時間室温でブレ インキュベートし、アッセイの間中細胞と共に維持した（Ｓｔｒａｃｋｅ、Ｍ、 Ｌ、　ら（１９８７）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、 　１４６．　３３９−３４５）。処理済み細胞の化学誘引体に対する運動能応答 及び非刺激ランダム運動能を試験した。

オートタキシンの精製。最終濃度１．２Ｍの硫酸アンモニウムを濃縮Ａ２０５８ ならし培地に４℃で１時間加えた。

溶液をＲＣ２−Ｂ　Ｕｌｔｒａｓｐｅｅｄ　５ｏｒｖａｌｌ遠心機で１０．．０ ００Ｘｇで１５分間回転させた。上清のみが運動能を刺激する能力を有していた 。

第１段階では、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，５）、５％（Ｖ／Ｖ）メタノー ル及び１．２Ｍ硫酸アンモニウムに平衡化した２００ｍ１フエニル５ｅｐｈａｒ ｏｓｅ　ＣＬ−４Ｂカラムを使用して疎水性相互作用クロマトグラフィーにより サンプルを分画した。硫酸アンモニウム分画からの上清をこのカラムに加え、５ ０ｍＭ　Ｔｒ　ｉｓ　（ｐＨ７゜５）、５％（ｖ　／　ｖ　）メタノール、減少 濃度（１，２−０゜０Ｍ）硫酸アンモニウム及び増加濃度（０−５０％（Ｖ／Ｖ ））エチレングリコールの直線勾配を流速１ｍｌ／ｍｉｎで使用して溶離した。

活性ピークをプールし、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、Ｏ，ＩＭＮａＣｌ、Ｏ，ＯＩＭ　 ＣａＣ１ｇ、２０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールに対して透析し、４０ｍ１　 Ａｆｆｉ−ＧｅｌコンカナバリンＡカラムを流速１ｍｌ／ｍｉｎで使用してレク チンアフィニティクロマトグラフィーにより第２の分画を行った。サンプルを同 一緩衝液に順次０．１０及び５００ｍＭのメチルα−マンノピラノシドを加えな がら段階的に溶離した。勾配の各段階からのフラクションをプールし、その運動 能刺激能を試験した。

第３の精製段階では、５００ｍＭα−メチルマンノピラノシドで溶出したサンプ ルを１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　（ｐＨ７゜５）＋３０％（Ｖ　／　Ｖ　）エチレ ングリコールで透析し、弱アニオン交換クロマトグラフィーにより分画した。ク ロマトグラフィーはＳｈｉｍａｄｚｕ　ＢｉｏＬｉｑｕｉｄりＯＶトゲラフを使 用してＺＯＲＢＡＸ　ＢｉｏＳｅｒｉｅｓ−ＷＡＸカラム上で実施し、流速３ｍ ｌ／ｍｉｎで（０゜０〜０．４Ｍ）塩化ナトリウムの直線勾配を使用して溶離し た。

活性ピークをプールし、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，２）　、１０％（ ｖ　／　ｖ　）メタノール及び１０％（Ｖ／　Ｖ　）エチレングリコールで透析 し、一連のＳｐｈｅｒｉｇｅｌ　ＴＳＫカラム（順に４０００ＳＷ、４０００Ｓ Ｗ。

３０００ＳＷ、２０００ＳＷ）上で第４回目の分画を行った。この分子篩段階は 、流速０．４ｍｌ／ｍｉｎでＳｈｉｍａｄｚｕ　ＢｉｏＬｉｑｕｉｄクロマトグ ラフを使用して実施した。

活性ピークをプールし、１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　（ｐＨ７゜５）、５％（ｖ／ ｖ）メタノール、２０％（ｖ　／　ｖ　）エチレングリコールで透析し、Ａｌ４ ５０ソフトウエアを有するＤｉｏｎｅｘ　ＢｉｏＬＣを使用して流速１ｍｌ／ｍ ｉｎでＰｒｏ−Ｐａｃ　ＰＡＩカラム上で第５の（強アニオン交換）クロマトグ ラフィ一段階を行った。サンプルを（０，０−０，４Ｍ）ＮａＣ１の直線勾配で 溶離した。

各精製段階後の活性収率を計算するために、１活性単位を導く必要があった。オ ートタキシンの希釈曲線は広いピークと最適以下の濃度の直線範囲を有する２相 型であった。

１単位活性／ウェル（即ち４０単位／　ｍ　Ｉ　）を完全希釈曲線中の最大活性 の５０％として定義した。こうして１単位／ウェルに達するために必要な希釈率 から任意容量中に含まれる活性を計算した。即ち、活性１単位／ウェルを調製す るために１：１０の希釈率が必要な場合には、材料は１０Ｘ４０＝４００単位／ ｍｌを含有していた。

５）の条件を使用して５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により夕どバク 賀サンプルを分析した。要約すると、７又は８％ＳＤＳを含有するポリアクリル アミドゲルを調製するか、又は量産されている（８−１６％）勾配ゲルを購入し た。サンプルを還元条件下（５％β−メルカプトエタノール）又は非還元条件下 で調製した。電気泳動分離後、従来記載されているように（Ｎｅｕｈｏｆｆ、Ｖ 、ら（１９８８）　Ｅｌｅｃｔｒｏ　ｈｏｒｅｓｉｓ　９．　２５５−２６２） Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ　Ｇ−２５０を使用してゲルを染色した。通常は 脱染色段階を必要としないこの染色プロトコルでは、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色は １０ｎｇ程度しかタンパク質を染色できないと思われる。

２次元電気泳動のために、２０％エチレングリコール中のタンパク質を５ｐｅｅ ｄ−ｖａｃで乾燥し、９Ｍ尿素、１％（ｖ／ｖ）ｐＨ３−１０Ｂｉｏ−Ｌｙｔｅ 及び２゜５％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎ　ｉ　ｄｅ　ｔ　Ｐ２Ｏのローディング溶液に再 溶解した。次に、９Ｍ尿素、２％（ｖ／ｖ）ｐＨ３−１０Ｂｉｏ−Ｌｙｔｅ、０ ．２５％（ｖ／ｖ）ｐＨ８−１０Ｂｉｏ−Ｌｙｔｅ及び２．５％（ｖ／ｖ）Ｎｏ ｎｉｄｅｔ−Ｐ２Ｏを収容する１２０Ｘ３ｍｍポリアクリルアミドチューブゲル 中でＢｉｏ−Ｒａｄチューブセルを使用して、このサンプルを等電点電気泳動（ ０’Ｆａｒｒｅ１１、Ｐ、Ｈ，（１９７５）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２５０、４００７−４０２１）にかけた。リザバー溶液は０．０１Ｍリン酸及び ０．ＯＩＭ　ＮａＯＨであった。

まず最初に非平衡等電点電気泳動（０’　Ｆａｒｒｅｌｌ。

Ｐ、　Ｈ，ら（１９７７）　Ｃｅ１ｌ　１２．　１１３３−１１４２）を定電圧 （５００Ｖ）で５時間行った。タンパク質は塩基性であったので、平衡条件（５ ００Ｖ１７時間）下で操作を繰り返した。第２の次元での電気泳動はＬａｅｍｍ ｌ　ｉ　（１９７０）の条件を使用して７．５％ポリアクリルアミドゲル上で実 施した。ゲルを上述のようにＣｏ。

ｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ　Ｇ−２５０で染色した。

オートタキシンの内部配列のペプチドの調製。その後、均質ＡＴＸを臭化シアン で消化し、還元及びピリジルエチル化後、トリプシンで消化した（Ｓｔｏｎｅ、 Ｍ、ら　（１９８９）　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔ。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｆｏｎ　ｆｏｒ 　ＭｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＭａｔｓｕｄａｉｒａ、Ｐ、Ｔ、、編、　３ ３−４７頁。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、）、次に、０．１％（ｖ／ｖ）　ト リフルオロ酢酸及び（０−７０）％アセトニトリルを溶離剤としてＡｑｕａｐｏ ｒｅ　ＲＰ３００　Ｃ−８逆相カラム上で勾配溶離により流速０．２ｍｌ／ｍｉ ｎで８５分間かけて得られたフラグメントを分離した。Ｄｉｏｎｅｘ　Ａｌ４５ ０　ＢｉｏＬＣシステムを使用して２１５ｎｍの吸光度をモニターしながらフラ クションを手作業で集めた。

ペプチドの配列分析。Ｐｏｒｔｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　２０２０オフラ インシークエネーターで標準プログラム＃１を使用し、配列番号１〜７及び配列 番号２６〜３２に夫々対応するＡＴＸペプチド＃１−７及び１２−１８の消化及 び精製により得られたペプチドのアミノ酸配列を決定した。修正酢酸ナトリウム 勾配プログラム及びＨｅｗＩｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　Ｃ−１８カラムを使用し てＢｅｃｋｍａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｇｏｌｄ　ＨＰＬＣでシークエネーターのフ ェニルチオヒダントインアミノ酸分析を行った。ＡＴＸ−１００（配列番号８） 　、ＡＴＸ−１０１（配列番号９）、ＡＴＸ−１０２（配列番号１０）、ＡＴＸ −１０３（配列番号１１）及びＡＴＸ−１０４（配列番号３３）をゲル精製ＡＴ Ｘから配列決定した。

ＧｅｎＢａｎｋ　（６８，０）　、ＥＭＢＬ　（２７，０）、ＳＷＩ　５Ｓ−Ｐ ＲＯＴ　（１８，０）及びＧｅｎＰｅｐｔ（６４，３）を含むタンパク質データ ベース（Ｐｅａｒｓ“　８）を使用してＡＴＸペプチドとの間のアミノ酸配列の 相同を調べた。

実施例ｌ Ａ２０５８細胞は、運動能をオートクリン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）式に刺激する タンパク質因子を産生ずることが既に示されし培地を使用して新規の運動能刺激 因子を同定及び精製し、それをここではオートタキシン（ａｕｔｏｔａｘｉｎ） と命名した。

生物学的アッセイを用いて精製をモニターするため、運動能刺激活性はずっと維 持する必要があった。該活性は、凍結、酸性緩衝液、プロテアーゼ（但しＤＮａ ｓｅまたはＲＮａｓｅ以外のもの）、還元、強力カオトロピック剤（例えば〉４ Ｍ尿素）及び種々の有機溶剤（イソプロパツール、エタノール、アセトニトリル ）に対して不安定であることが確認された。貯蔵及びクロマトグラフィー分離の ために、バイオ活性を低下させない有機溶剤エチレングリコールを添加した。

アミノ酸配列分析に十分なオートタキシンを生成するには、１００〜２００Ｌの 血清非含有ならし培地を要した。

培地は、低濃度のＢＳＡ　（５μｇ／ｍり（これは担体りンパク質として必要で あった）とインシュリン（１０μｇ／ｍ１）（これは低タンパク質培地において 細胞増殖を支援するのに必要でありだ）とを含んでいた。この大容量を濃縮する ため、Ｍ、＞３０．０００の分子種を保持する低タンパク質結合ＹＭ３Ｑ膜を用 いて限外濾過を実施した。表１に示したように、このように調製したならし培地 ２０ＯＬは１０×１０ｓ単位の活性をもたらした。しかしながら、分画前の当初 ならし培地は、活性、特にインシュリンを刺激することが既知の別の物質を含ん でおり、これは、限外濾過ステップで完全には洗浄除去されず、運動部刺激活性 リンが除去された後続ステップにおいて収量を決定する上で考慮する必要があっ た。

表１．オートタキシンの精製 精製ステップ　タンパク質活性１　比活性　回収率（ｍｇ）　（全単位）　（単 位／易ｇ）　（％）１２００ＬナラＬ培地３３．０００　１０．０００．０００ ”　３００フエニルセフア０−ス　１．２３５　４６０，０００　３７０　１０ ０Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ　Ａ　５８　６６０．０００　１１．４００　１０ ０弱イオン交換　４．５　４９０．０００　１１０．０００　１００ＴＳＫモレ キユラーシーブ　〜０．４’　２２０．０００　５５０．０００　４８強アニオ ン交換　〜０．０４’　２４．０００°　６００．０００　５．２°ボイデンチ ヤンバーアツセイから計算した活性。最高活性の５０％（一般に約２０レーザー 密度単位または〜４０細胞／ＵＰＦ）をもたらした希釈液を１活性率位／ウェル （４０単位／ｍｌに等価）を有するとして選択した。

１最初の精製カラム（即ちフェニルセファロース）以降、活性から回収率を推定 した。

′分画前のならし培地における当初活性は、インシュリンが低タンパク質条件下 で培地において必須増殖因子として使用されたことを反映している。

６推定タンパク質は、アミノ酸分析による定量化に基づく。

°精製タンパク質の比活性は（ボイデンチャンバーウェルにおける）〜１０ｆ■ ｏｌ　ＡＴＸ／運動能運動部位に対応している。

精製の第１ステツプは、フェニルセファロースＣＬ−４Ｂカラムを使用する疎水 的相互作用クロマトグラフィーによる分画を含んだ。この結果を図１に示す。イ ンシュリンを含むほとんどのタンパク質が最初のほうの画分またはボイドに溶出 した。しかしながら、活性のピークは比較的遅く溶出した。精製された活性は４ ６０，０００単位±２０％（表１）と推定された。フェニルセファロース分画か らプールした活性ピークは、有意なインシュリン夾雑物を含まない最初の試料で あると考えられるので、このあとの収量はこの全活性に対して測定した。プール した活性ピークの一部をゲル電気泳動すると（図６、カラム２）、最初のならし 培地からＢＳＡを主として含む多数のタンパク質バンドが明らかとなった。

精製の第２ステツプにおいては、活性ピークをレクチンアフィニティーカラムＡ ｆｆｉ−Ｇｅｌ　ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡに添加した。図２に示したように 、（２８０ｎｍにおいて全吸収の９０％と推定される）はとんどのタンパク質は カラムに全く結合しなかった。非結合フラクションは、運動部刺激活性を実質的 に含まなかった（図２の破線を参照）。メチルα−ローマンノピラノシドの直線 濃度勾配をカラムに適用した場合、走化活性は、温度約２０ｍＭ糖から始まる延 長ゾーンに溶出した。従って、段階的濃度勾配を使用して溶出した。純粋なりＳ ＡはｃｏｎＡに結合しなかった。

活性は主に５００ｍＭ段階のメチルα−ローマンノピラノシドに認められた。表 １からは著しい活性の損失はないように見られるが、比活性（活性／ｍｇ全タン パク質）は３０倍に増加した。プールし濃縮したピークのゲル電気泳動（図６Ａ 、カラム３）から、ＢＳＡ過負荷はもはや見られず、バンド数ははるかに少なく なりでいることが判る。

結合しなかったタンパク質を濃縮しゲルに添加すると、大きなりＳＡ／＜ンドを 含み、フェニルセファロース４Ｂからの活性ピークと同一と見られた。

第３精製ステツプは、図３に示したような弱アニオン交換クロマトグラフィーに より前の活性ピークを分画することを含んだ。実験条件下で、活性は、ＮａＣ１ 濃度勾配の浅い部分（０，０〜０．４Ｍ）の中央に幅広のピークショルダ一また は二重ピークに溶出した。運動能刺激能を欠（最も多くの割合のタンパク質がカ ラムに強力に結合し、高塩濃度（ＩＭ　ＮａＣ１）に溶出した。活性に有意な損 失はないように見えるが、比活性は２０倍に増加した（表１）。ピーク（図３の ２８〜３４分）及びショルダー（図３の３５〜４５分）の両方のゲル電気泳動に よる分析を図６Ａ（それぞれカラム４及び５）に示す。約２５〜３５ｋＤａの幅 広のダブレットと約１１０〜１３０ｋＤａの第２のダブ１ノツトとの２つの主タ ンパク質バンドが得られた。

第４精製ステツプにおいては、活性ピークを一連のモレキュラーンーブに適用し た。溶出液を分光光度計でモニターすると、２つの大きなタンパク質ピークが明 らかとなった（図４）。活性は第１のより高分子量のピークに対応した。活性の 回収率は〜４８％であり、比活性は５倍に増加した。図６Ｂ（それぞれカラム２ 及び３）に示したように非還元及び還元条件下でゲル電気泳動による分析を実施 した。この分画ステップによって、分子量＜５５ｋＤａの全ての夾雑タンパク質 が実質的に除去された。残っている主バンドは、非還元下で分子量１２０ｋＤａ 及び還元下で１２５ｋＤａを有した。更に、分子量８５ｋＤａ及び６０ｋＤａを 有する２つの小さなバンドが存在した。１２０ｋＤａのタンパク質が還元後の電 気泳動移動度においてわずかしか変化しないという事実は、少量のジスルフィド 結合しかないことを示すものである。しかしながら、存在するジスルフィド結合 は、運動能刺激活性は還元に対して不安定であることから、機能的重要性を有す る。

第５精製ステツプは、強アニオン交換クロマトグラフィー・による活性ピークの 分画を含んだ。図５に示したように、活性は濃度勾配の中央にある２つの幅広の 光吸収ピークに対応しており、夾雑タンパク質は最初のほうに溶出した。

これら２つのピークはアミノ酸分析及びポリアクリルアミドゲル電気泳動分離に よると同一であった。それらは、同じ親タンパク質の異なるグリコジル化状態を 表わすものと推定される。図５には、活性が２つの異なる試料希釈度で示されて いる。ＡＴＸ希釈曲線の形状は飽和及び高濃度においてはダウンレギュレーショ ンにより先鋭ではないので、活性の真の“ピーク”を解明するためには、分画試 料の幾つかの希釈液が必要なことが多い。このクロマトグラフィーステップから の回収率は、少量のタンパク質をカラムに添加したときに期待されるであろうよ りも低かった（フェニルセファロースと比較して５％）が、比活性はここでも増 加した（表１）。ゲル電気泳動による分析から、非還元下で分子量１２０ｋＤａ の単一のタンパク質バンドが明らかとなった（図６．カラム２）。

精製タンパク質を２次元ゲル電気泳動すると（図７）、単−主バンドが明らかと なった。バンドは、グルコシル化タンパク質に特徴的な様相でゲルの塩基性側に 向かって僅かに下向きに傾斜している。等電点電気泳動を非平衡条件下で実施し た場合（５時間）または平衡させた場合（１７時間）で、塩基性ｐ＋　７．７± ０．２は実質的に同じであった。

精製タンパク質の希釈曲線を図８に示す。タンパク質はこの９Ｍ範囲内で活性で あり、１単位の活性は濃度４００〜６００ｐｍｏｌ　（または約Ｉ　Ｑ　ｆｍｏ 　Ｉのオートタキシン／ボイデンチャンバーウエル）に対応すると見られる。

希釈をより高濃度のＡＴＸから開始すると、得られた曲線には幅広いプラトーが 見られる上に、最高濃度にダウンレギュレーションがあった。精製オートタキシ ンに対する運動能応答は、百日咳毒素に対して高度に感受性であり（表２及び図 ９）　、０．５μｇ／ｍ１ＰＴで活性の約９５％を阻害する。

表２．オートタキシン刺激運動能における百日咳毒素（ＰＴ）の作用 ＾２０５８運動能応答 （密度単位１） 対照細胞２百日咳毒素処理細胞３ ならし培地’　６０．３　０．４ 精製オートタキシン　３８．５　０．０ｉ運動能アツセイによって定量化した走 化性（Ｓｔｒａｃｋｅ、　Ｍル、　、　ｅｔ　ａｌ、　（１９７８）Ｂｉｏｃｈ ｅ動したＡ２０５８細胞。

ベートした後に培地を回収し、Ｙトコ０膜を備えたＡｍ１ｃｏｎ限外濾過装置を 使用して２５〜３０倍に濃縮することにより調製したもの。

オートタキシンに対する運動能応答のランダムな（化学運動性）対指向的（走化 性）を評価するためにチェッカー盤（ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ）分析を実施し た。弱アニオン交換分画ステップによって精製したＡＴＸを使用し、フィルター の上と下とに種々の濃度のＡＴＸを置いてチャンバーを組み立てた。対角線の下 方の正方形は正の勾配に対する応答を表わし、上方の正方形は負の勾配に対する 応答を表わし、対角線上の正方形は勾配不在のランダムな運動能を表わす。

ＡＴＸは走化性及び化学運動性応答の両方を刺激したが（図１０）、走化性応答 はバックグラウンドの１５倍高く、化学運動性はバックグラウンドの８倍高かっ た。

酸加水分解完了後にアミノ酸を分析し、精製タンパク質を定量化した。この加水 分解は、ポリアクリルアミドゲルから切り出し、純粋であると見なされるタンパ ク質において実施した。分析から、モレキュラーシーブにおいて分画すると２． ７ｎｍｌのタンパク質が存在することが判った。

強アニオン交換クロマトグラフィーによる分画では、約３００ｐｍｏｌが残存し た。分析の結果を表３に示す。

実施例３ ＡＴＸ分解及びアミノ酸配列の決定 精製ＡＴＸからＮ末端配列情報を得ようという試みは何回も徒労に終わった。従 っ−て、精製タンパク質を順次消化し、得られたペプチドを逆相クロマトグラフ ィーによって分画した。この結果を図１１に示す。濃度勾配の親水性端部及び疎 水性端部の両方にクラスターを含む複数の鋭いピークが認められる。

これらのペプチドピークの幾つかを、エドマン分解及びＮ末端アミノ酸配列分析 のためにランダムに選択した。選択した（図１１に見られる）８つのピークのう ち７つは表４に示した明らかな単一配列情報を与えた。個々の消化及び精製から 得た材料を使用し、残りの４つの配列も得た。

それぞれセンス及びアンスセンスオリゴヌクレオチドプローブを、当業者には公 知の方法によって表４のフラグメント配列に従って合成した。代表的なプローブ を表５に示す。

中【　小−Ｌカ土Ｓｌ・ｉ（五ＴＹ）のペプ千ｐＰη１から合線され表４．オー トタキシンのペプチド配列 ｈオリゴヌクレオチド。オリゴヌクレオチドの番号は表４のＡＴＸペプチドの番 号に対応している。接尾文字は、該オリゴヌクレオチドがセンス配列（Ｓ）であ るかアンチセンス配列（Ａ）であるかを示す。

実施例４ オートタキシンｃＤＮＡの分子クローニングＡＴＸを合成することが知られてい る同じＡ２０５８腫瘍細胞由来のファージ（λ２．．）においてｃＤＮＡライブ ラリーを作製した。このライブラリーを、ＡＴＸ配列の存在について以下の方法 によってスクリーニングした。まず、鋳型として同じλｚ、、ライブラリー、ブ ライミング配列として誘導オリゴヌクレオチドＡ−４８８（配列番号２１）及び Ａ−１００Ａ　（配列番号２２）を用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を 使用し、２００塩基対（ｂ　ｐ）のＤＮＡ配列を作製した。この２００ｂｐ配列 のＡＴＸｍＲＮＡを使用して全ライブラリーの初回スクリーニングを実施した。

また、誘導オリゴヌクレオチドの混合物を使用して全ｃＤＮＡライブラリーをス クリーニングした。両スクリーニング法によって陽性ｃＤＮＡクローンが得られ た。

ウシ血清アルブミンに架橋させたＡＴＸ−１０１（配列番号１０）をウサギに注 射した。かかるウサギ由来の抗血清に塩析（ｓａｌｔ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉ ｏｎ）を実施し、更に、ペプチドＡＴＸ−１０１（配列番号１０）を共有結合さ せたＡｆｆｉ−ＧｅｌｌＯビーズを用いたアフィニティークロマトグラフィーを 使用して精製した。このアフィニティー精製した抗体はイムノプロットにおいて 部分精製タンパク質と反応した。この同じ抗体を使用し、ヒト組織において免疫 組織化学染色を実施した。

上述した全ての文献は参照により本明細書の一部を構成するものとする。

以上、明確化及び理解のために本発明の詳細な説明したが、本明細書を講読すれ ば、本発明の範囲及び請求の範囲を離れずとも形態及び詳細の種々の変更が行な い得ることが当業者には理解されよう。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人：　５ＴＡＣＫＥ、　ＭＡＲＹＬＩＯＴＴ＾、　ＬＡＮＣＥ ＳＣＨＩＦＦＭＡＮＮ、　ＥＬＬＩＯＴＴＫＲＵＴＺＳＣ）Ｉ、　ＩＩＥＮＲＹ （ｉｉ）発明の名称： 癌診断及び治療に有効な運動部刺激タンパク質（ｉｉｉ）配列の数：３３ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛名：　ＣＵＳＨＭＡＮ　ＤＡＲＢＹ　ＡＮＤ　ＣＵＳ）ＩＭＡＮ（Ｂ） 番地：　１６１５　Ｌ　５ＴＲＥＥＴ、Ｎ、Ｗ。

（Ｃ）町：　ｆＡｓＨＩＮＧＴＯＮ （Ｄ）州：Ｄ、Ｃ。

（Ｅ）国コＵ、Ｓ、＾。

（Ｆ）郵便番号：　２００３６ （ｖ）コンピュータ読取り形式： （Ａ）媒体：テープ （Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティングシス テム：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：　ＰａｔｅｎｔＩｎ 　リリース＃１．０゜バージョン１１．２５ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願臼： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：　５ＣＯＴＴ、　ＷＡＴＳＯＮ　Ｔ（Ｂ）登録番号：　２６５８１ （ｉｘ）通信情報： （Ａ）電話番号＋　（２０２）　８６１−３０００（Ｂ）ファックス：　（２０ ２）　８２２−０９４４（Ｃ）テレックス：　６７１４６２７Ｃ［ｌ５）Ｉ（２ ）配列番号１の情報： （＋）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ＝６ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列： （２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さニア （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列： （２）配列番号３の情報： （１）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ：５ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列： （２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ　）配列： ｃｌｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ（２）配列番号５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０ ＣＢ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列： Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｘａａ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　 Ｌａｕｌ　５　１０ （２）配列番号６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・９ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （ｘｉ）配列・ Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌａ（ ２）配列番号７の情報・ （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ＝１０ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列・ （２）配列番号８の情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ：１１ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロン−・直鎖状 （ｘｉ）配列： Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　にｉｎ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｔｒｐ　ＸＬａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　 Ｔｈｒ　Ｌｙｓ（２）配列番号９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１６ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列： （２）配列番号１０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１２ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列： Ａｓｐ　工１ｅ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　 Ｐｈａ　Ｐｈｅ　Ａｒｇｌ　５　１０ （２）配列番号１１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２３ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列： （２）配列番号１２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・１８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列。

ＧＴＴＧＧＣＡＧＣＮ　ＡＣＲＴＧＣＣ入　１Ｂ（２）配列番号１３の情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｘｉ）配列・ ＴＧＧＣＡＹＧＴＮＧ　ＣＴＧＣＣＡＡＣ１８（２）配列番号１４の情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列 （２）配列番号１５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列： ＴＡＹＣＣ’！’ＧＣＮＴ　ＴＹＡＡＧ　１５（２）配列番号１６の情報： （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ＝１５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎮 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （ｘｉ）配列： ＧＧＴＮＡＣＹＴＣＹ　ＴＣＡＧＧ　１５（２）配列番号１７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （×１）配列： ＣＣＴ（逓Ｇ縁Ｇ　ＴＮＡＣＣ１５ （２）配列番号１８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型；核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ＮＧＴＮＧＣＲτＣＲＡＡＴＧＧＣＡＣＲＴ　Ｃ２１（２）配列番号１９の情報 ： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列： ＧＡＹＧＴＧＣＣＡＴ　ＴＹＧＡＹＧＣＮＡＣＮ　２１（２）配列番号２０の情 報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列： ＧＴＴＤＡＴＲＴＴＳ　ＴＣＲＡＡＴＧＧＧＧ　Ｇ　”（２）配列番号２１の情 報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列： ＣＣＣＣＣＡＴＴｒＧ　ＡＧＡＡＣＡＴＣＡＡ　Ｃ２１（ｘｉ）配列： （２）配列番号２５の情報； （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列： 入ＴＧＣＪＪＩＡＣ入Ｇ　ＴＣＴＴＹＧＴＧＧＧ　ＣＴＡＹＧＧＣＣＣＣＡＣＣ ＴＴＹ入入Ｒコ９（２）配列番号２６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：９ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー；直鎖状 （ｘｉ）配列： （２）配列番号２７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列： （２）配列番号２８の情報； （ｉ）配列の特徴： （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （２）配列番号２９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列： Ｈｌｓ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｖａｌ　 Ｌａｕ　Ｔｙｒ１５１゜ （２）配列番号３０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）蛸の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （２）配列番号３１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１４ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列： Ｘａａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　Ｐｈ＠Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｌ ａｕ　Ｓａｒ　ｓａｒ　Ｓａｒ　Ｐｒ。

１　５　１゜ （２）配列番号３２の情報： （ｉ）配列の特徴： Ｔｈｒ　Ｐｈ＠　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｉａｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｘａａ　Ａｌａ　 Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　５ａｒ（２）配列番号３３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２２ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本舗 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列： Ｖａｌ＾ｓｎ　Ｖａｌ　Ｉｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｕｙ　Ｐｒｏ　Ｉｌａ　Ｐｈｉ　Ａ ｓｐ　Ｔｙｒ　ｋｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌａｕｌ　５　１０　ｉｓ Ｆ工Ｇ、１ 運動能（密度単位） 濃度勾配　（ｅ／ｅ　ａ）　（−） Ｆ工Ｇ、２ 運動能（密度単位） Ｆ工Ｇ、３ 運動能（密度単位） Ｆ工Ｇ４ ０　ψ　０　ψ　３ Ｆ工Ｇ、５ ＦＩＧ、Ｂ 運動能（密度単位） ＦＩＧ、９ 運動能（密度単位） ＦＩＧ、ｌＯ 時間（分） 補正書の写しく翻訳文）提出口（特許法第１８４条の８）平成６年７月１５曙囚

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．オートタキシンに対応するアミノ酸配列またはその少なくとも５つのアミノ 酸を含むポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント。
2. ２．配列番号１〜配列番号１１及び配列番号２６〜配列番号３３のうちいずれか １つに示されたアミノ酸配列をコードする請求項１に記載のＤＮＡセグメント。
3. ３．自然に会合するタンパク質を含まず、オートタキシンに対応するアミノ酸配 列またはその少なくとも５つのアミノ酸を含むポリペプチド。
4. ４．前記アミノ酸配列が、配列番号１〜配列番号１１及び配列番号２６〜配列番 号３３のうちいずれか１つに示されたアミノ酸配列からなる請求項３に記載のポ リペプチド。
5. ５．固体支持体に結合させた、オートタキシンに対応するアミノ酸配列またはそ の少なくとも５つのアミノ酸を含むポリペプチド。
6. ６．配列番号１〜配列番号１１及び配列番号２６〜配列番号３３のうちいずれか １つに示されたアミノ酸配列を含む請求項５に記載のポリペプチド。
7. ７．ベクター及び請求項１に記載のＤＮＡセグメントを含む組換えＤＮＡ分子。
8. ８．請求項７に記載の組換えＤＮＡ分子を含む細胞。
9. ９．オートタキシンに対する結合親和性を有する抗体またはその結合フラグメン ト。
10. １０．オートタキシンに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを製造する 方法であって、請求項８に記載の細胞を、前記ＤＮＡセグメントが発現され、そ れによって前記ポリペプチドが産生される条件下に培養し、前記ポリペプチドを 単離することからなる方法。
11. １１．請求項３に記載のオートタキシンペプチドを精製する方法であって、 ｉ）Ａ２０５８ヒトメラノーマ細胞培養物由来の上清を回収及び濃縮し、それに よって前記ペプチドの第１調製物を生成するステップ； ｉｉ）前記第１調製物を塩分画し、第２のペプチド調製物を生成するステップ； 及び ｉｉｉ）前記ペプチドが実質的に純粋な形態で得られるように、前記ペプチドを 前記第２調製物から単離するステップ からなる方法。
12. １２．前記単離ステップをカラムクロマトグラフィーによって行う請求項１１に 記載の方法。
13. １３．オートタキシンに対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする ＤＮＡセグメント。
14. １４．配列番号１２〜配列番号２５のいずれか１つからなる請求項１に記載のＤ ＮＡセグメント。
15. １５．配列番号１２〜配列番号２５のいずれか１つからなる請求項１３に記載の ＤＮＡセグメント。
16. １６．自然に会合するタンパク質を含まず、オートタキシンに対応するアミノ酸 配列を含むポリペプチド。
17. １７．固体支持体に結合させた、オートタキシンに対応するアミノ酸配列を含む ポリペプチド。