DE60114590T2 - Peptide, die cea ("carcinoembryonic antigen") binden - Google Patents

Peptide, die cea ("carcinoembryonic antigen") binden Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft CEA-bindende Polypeptide und Zusammensetzungen für den Nachweis und die Behandlung von Krebs. Insbesondere betrifft die Erfindung Materialien nützlich für und Verfahren zum Nachweisen, Abbilden, Lokalisieren und Zielerfassung von Tumoren, die CEA präsentieren. Die Erfindung stellt bindende Polypeptide bereit, die fähig sind, spezifisch mit CEA zu assoziieren und zwischen CEA und bekannten kreuzreaktiven Antigenen, wie z.B. NCA (unspezifisches kreuzreaktives Antigen (nonspecific crossreacting antigen)), zu unterscheiden. Derartige bindenden Polypeptide sind nützlich für den Nachweis, das Abbilden, die Lokalisation und die Zielerfassung von Geweben oder Lösungen, die CEA enthalten, zum Beispiel mittels Radiographie, Magnetresonanztomographie oder Röntgen, und sind auch nützlich bei der Diagnose und Behandlung von Krebs, der mit CEA verbunden ist.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Carcinoembryionisches Antigen, oder CEA, ist ein komplexes immunoreaktives Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 180000, vorkommend in Adenocarcinomen von Epithelen, die aus dem endodermalen Verdauungssystem stammen, und fötalem Dickdarm. Tumorzellen an vielen Stellen, einschließlich Dickdarm, Brust, Lunge, Cervix, Eierstock, Magen, Blase, Pankreas und Speiseröhre, exprimieren große Mengen carcinoembryionisches Antigen und/oder des nahe verwandten Immunoglobulin Supergen-Familienmitglieds, unspezifisches kreuzreaktives Antigen, oder NCA, auf ihren Oberflächen. Die Expression von diesen Glykoproteinen, besonders von CEA, ist in normalen Zellen bei voll entwickelten Individuen (im Gegensatz zu pränatalen Säuglingen) sehr begrenzt, und dieses Antigen ist als ein Ziel in Immunoassays zur Diagnose und zur seriellen Überwachung von Krebspatienten auf das Wiederauftreten der Krankheit oder Antwort auf Therapie verwendet worden. (siehe Mach et al., Immun. Today, 2: 239, 1981; Berche et al., Br. Med. J., 285: 1447, 1982.) Anti-CEA Antikörper sind auch für die Krebstherapie und für die Verwendung zur Bildung von Immunokonjugaten, welche wiederum bei der Krebstherapie verwendet werden können, vorgeschlagen worden. (Siehe, z.B., Buchegger et al., U.S. 5,047,507 (1991); Osbourne et al. U.S. 5,872,215 (1999).)
  • WO 92/21364 offenbart zwei CEA-bindende Proteine und Fragmente derselben und regt an, dass sie nützlich sein können bei der Diagnose und Behandlung von Krankheiten, die mit CEA zusammenhängen.
  • CEA wurde zuerst von Gold und Freeman beschrieben, J. Exp. Med., 121: 439, 1965, und ist jetzt vollständig sequenziert und charakterisiert worden (siehe Beauchemin et al., Mol. Cell. Biol., 7: 322130, 1987; WO 95/06067). CEA hat eine N-A1-B1-A2-B2-A3-B3-GPI Domänen-Struktur, wobei GPI ein Glykophosphatidylinositol Membran-Anker ist. Ein merklicher Grad von Sequenzhomologie besteht zwischen den Domänen von CEA und anderen Mitgliedern der Immunoglobulin Supergen-Familie, und immunologische Kreuzreaktivität zwischen CEA und bis zu sechzehn anderen homologen Antigenen, wie z.B. NCA und biliärem Glykoprotein-1 (BPG-1), ist berichtet worden.
  • Einer der großen Nachteile der Verwendung von anti-CEA Antikörpern für klinische Zwecke war die Kreuzreaktivität dieser Antikörper mit einigen offensichtlich normalen adulten Geweben. Vorhergehende Untersuchungen haben gezeigt, dass die meisten konventionellen hyperimmunen Antiseren, gezüchtet gegen unterschiedliche immunogene Formen von CEA, kreuzreagieren mit CEA-verwandten Antigenen, vorkommend in normalem Dickdarmschleim, Galle, Leber, Lunge, Schweißdrüsen, polymorphkernigen Leukozyten und Monozyten normaler Individuen sowie vielen unterschiedlichen Carcinomtypen.
  • Entsprechend gibt es einen großen Bedarf für Bindungseinheiten, die an CEA binden, aber nicht mit anderen Antigenen, wie z.B. NCA, kreuzreagieren. Diese und andere Aufgaben werden hierin mit der Offenlegung neuer Peptidbinder von CEA erfüllt.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung befasst sich mit dem Bedürfnis für verbesserte Materialien und Verfahren zum Nachweisen, Lokalisieren, Messen und Behandeln CEA-exprimierender Zellen durch Bereitstellen einer Gruppe von nicht-natürlich auftretenden Polypeptiden, die spezifisch an CEA binden. Geeignetes Markieren von derartigen Polypeptiden stellt nachweisbare Kontrastmittel bereit, die mit hoher Konzentration an einen CEA-exprimierenden Tumor binden, wodurch hervorragende Tumor-spezifische Kontrastmittel bereitgestellt werden. Konjugation oder Fusion von derartigen Polypeptiden mit wirksamen Mitteln, wie z.B. Cytokinen, chemotherapeutischen Mitteln, Radionukliden oder anderen Krebstherapeutika erzeugen Konjugate, die für die Krebstherapie verwendet werden können, d.h., indem bewirkt wird, dass das Konjugat auf die Stelle eines Tumors abzielt, die CER erzeugt. Rekombinante Bakteriophagen, die die CEA- bindenden Polypeptide der Erfindung präsentieren sind identifiziert und isoliert worden, und derartige Phagenprodukte sind auch wertvolle Reagenzien für wirksamen Nachweis und Diagnose von Krebs, der mit der Expression von CEA in Zellen und Geweben verbunden ist. Die CEA-bindenden Einheiten der vorliegenden Erfindung können beim Nachweis, der Diagnose und Therapie von derartigen Störungen, die mit CEA zusammenhängen.
  • Diese Erfindung betrifft CEA-bindende Einheiten. Bindungseinheiten gemäß dieser Erfindung sind nützlich bei jeder Anwendung, bei der das Binden, Nachweisen oder Isolieren von CEA oder dessen Fragmenten vorteilhaft ist. Eine besonders vorteilhafte Verwendung der hierin offenbarten Bindungseinheiten ist ein Verfahren zum Abbilden von Zellen oder Geweben, die CEA in vivo exprimieren. Das Verfahren erfordert die Verwendung von erfindungsgemäßen CEA-spezifischen Bindungseinheiten zum Nachweisen CEA-exprimierender Zellen, wobei die Bindungseinheiten nachweisbar markiert worden sind zur Verwendung als Kontrastmittel, einschließlich Magnetresonanztomographie (MRI) Kontrastmitteln, Röntgenkontrastmitteln, radiopharmazeutischen Kontrastmitteln, Ultraschall Kontrastmitteln und optischen Kontrastmitteln.
  • Bevorzugte erfindungsgemäße CEA-bindende Einheiten sind isolierte, synthetische Polypeptide mit einer hohen Affinität für CEA. Diese Erfindung stellt eine neue Klasse von CEA-bindenden Polypeptiden bereit, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, umfassend:
    X1-X2-X3-Cys-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-Cys-X12-X13-X14 SEQ ID NO: 111), wobei:
    X1 Asp, Asn, Ala oder Ile ist;
    X2 Trp ist;
    X3 Val, Ile, Met, Tyr, Phe, Pro oder Asp ist;
    X4 Asn, Glu, Asp oder Met ist;
    X5 Leu, Phe, Tyr, Trp, Val, Met, Ile oder Asn ist;
    X6 Phe, Leu, Asp, Glu, Ala, Ile, Lys, Asn, Ser, Val, Trp, Tyr, Gly oder Thr ist;
    X7 Lys, Phe, Asp, Gly, Leu, Asn, Trp, Ala, Gln oder Thr ist;
    X8 Asn, Pro, Phe, Gly, Asp, Ala, Ser, Glu, Gln, Trp, His, Arg, Met, Val oder Leu ist;
    X9 Gln, Lys, Leu oder Gly ist;
    X10 Trp, Ala oder Tyr ist;
    X11 Phe, Thr, Met, Ser, Ala, Asn, Val, His, Ile, Pro, Trp, Tyr, Gly, Leu oder Glu ist;
    X12 Asn, Asp, Glu, Pro, Gln, Ser, Phe oder Val ist;
    X13 Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Gln, Ser, Met, Glu, Thr, Lys, Trp oder Arg; und
    X14 Leu, Met, Val, Tyr, Ala, Ile, Trp, His, Pro, Gln, Glu, Phe, Lys, Arg oder Ser ist.
  • Andere bevorzugte CEA-bindende Polypeptide der vorstehenden Formel haben die Aminosäuresequenz:
    X1-X2-X3-Cys-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-Cys-X12-X13-X14 SEQ ID NO: 1),
    wobei:
    X1 Asn, Asp ist oder abwesend ist;
    X2 Trp ist;
    X3 Asp, Phe oder Val ist;
    X4 Asn, Glu oder Met ist;
    X5 Asn, Leu, Met oder Phe ist;
    X6 Asp, Gly, Ile, Lys, Phe oder Thr ist;
    X7 Ala, Gln, Gly, Lys oder Thr ist;
    X8 Arg, Asn, Asp, Glu oder Gly ist;
    X9 Gln, Gly oder Leu ist;
    X10 Ala, Trp oder Tyr ist;
    X11 Ala, Gly, His, Phe, Thr oder Val ist;
    X12 Asn, Gln, Phe, Ser oder Val ist;
    X13 Arg, Leu, Pro oder Ser ist; und
    X14 Leu, Ser, Trp oder Tyr ist;
    und wobei das Polypeptid die Fähigkeit hat, CEA zu binden. Dieses Polypeptid kann zusätzliche Aminosäuren aufweisen, angefügt an irgendeinem Ende. Peptide, die ein Serin am N-Terminus (vor X1) aufweisen, sind bevorzugte Ausführungsformen.
  • Noch andere bevorzugte CEA-bindende Polypeptide der vorstehenden Formel haben die Aminosäuresequenz:
    X1-Trp-Val-Cys-Glu-X5-X6-Lys-X8-Gln-Trp-X11-Cys-Asn-X13-X14 (SEQ ID NO: 2),
    wobei:
    X1 Asn oder Asp ist;
    X5 Asn, Leu, Met oder Phe ist;
    X6 Asp, Gly, Ile, Lys, Phe oder Thr ist;
    X8 Arg, Asn, Asp, Glu, Gly oder Trp ist;
    X11 Ala, Gly, His, Phe, Thr, Tyr oder Val ist;
    X13 Arg, Leu, Pro oder Ser; und
    X14 Leu, Ser, Trp oder Tyr ist.
  • Insbesondere wird eine stabile Bindungsdomäne mit einer hohen Affinität für CEA offenbart, die die Formel hat:
    CyS-X4-X5-X6-X7-Xg-Xg-X10-X11-CyS (SEQ ID NO: 3),
    wobei:
    X4 Asn, Glu oder Met ist;
    X5 Asn, Leu, Met oder Phe ist;
    X6 Asp, Gly, Ile, Lys, Phe oder Thr ist;
    X7 Ala, Gln Gly, Lys oder Thr ist;
    X8 Arg, Asn, Asp, Glu oder Gly ist;
    X9 Gln, Gly oder Leu ist;
    X10 Ala, Trp, oder Tyr;
    X11 Ala, Gly, His, Phe, Thr oder Val ist;
    und wobei es bevorzugt ist, dass
    X4 Glu ist;
    X5 Asn, Leu, Met oder Phe ist;
    X6 Asp, Gly, Ile, Lys, Phe oder Thr ist;
    X7 Lys ist;
    X8 Arg, Asn, Asp, Glu oder Gly ist;
    X9 Gln ist;
    X10 Trp ist; und
    X11 Ala, Gly, His, Phe, Thr oder Val ist.
  • Bevorzugte erfindungsgemäße Polypeptide umfassen eine Aminosäuresequenz:
    Asn-Trp-Val-Cys-Asn-Leu-Phe-Lys-Asn-Gln-Trp-Phe-Cys-Asn-Ser-Tyr (SEQ ID NO: 4)(hierin auch bezeichnet als FX-G08 oder einfach G08, und als Peptid DX207),
    Asp-Trp-Val-Cys-Glu-Asn-Lys-Lys-Asp-Gln-Trp-Thr-Cys-Asn-Leu-Leu (SEQ ID NO: 5) (hierin auch bezeichnet als AB-A07 oder einfach A07, und als Peptid DX208),
    Asn-Trp-Asp-Cys-Met-Phe-Gly-Ala-Glu-Gly-Trp-Ala-Cys-Ser-Pro-Trp (SEQ ID NO: 6) (hierin auch bezeichnet als TN10/9-E01 und DX210),
    Asp-Trp-Val-Cys-Glu-Lys-Thr-Thr-Gly-Gly-Tyr-Val-Cys-Gln-Pro-Leu (SEQ ID NO: 7) (hierin auch bezeichnet als TN10/9-B09),
    Asn-Trp-Phe-Cys-Glu-Met-Ile-Gly-Arg-Gln-Trp-Gly-Cys-Val-Pro-Ser (SEQ ID NO: 8) (hierin auch bezeichnet als TN10/9-F11), und
    Asp-Trp-Val-Cys-Asn-Phe-Asp-Gln-Gly-Leu-Ala-His-Cys-Phe-Pro-Ser (SEQ ID NO: 9) (hierin auch bezeichnet als TN10/9-D04).
  • Die bevorzugtesten erfindungsgemäßen CEA-bindenden Einheiten sind isolierte, synthetische Polypeptide mit einer hohen Affinität für CEA. Diese Erfindung stellt eine neue Klasse CEA-bindender Polypeptide bereit, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, umfassend:
    X1-X2-X3-Cys-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-Cys-X12-X13-X14 SEQ ID NO: 1),
    wobei:
    X1 Asp, Asn, Ala oder Ile ist, mit Asp am stärksten bevorzugt;
    X2 Trp ist;
    X3 Val, Ile, Met, Tyr, Phe, Pro oder Asp ist, mit Val am stärksten bevorzugt;
    X4 Asn, Glu oder Asp ist, mit Asn und Glu am stärksten bevorzugt;
    X5 Leu, Phe, Tyr, Trp, Val, Met, Ile oder Asn ist, mit Leu am stärksten bevorzugt;
    X6 Phe, Leu, Asp, Glu, Ala, Ile, Lys, Asn, Ser, Val, Trp oder Tyr ist, mit Phe am stärksten bevorzugt;
    X7 Lys, Phe, Asp, Gly, Leu, Asn oder Trp ist, mit Lys am stärksten bevorzugt;
    X8 Asn, Pro, Phe, Gly, Asp, Ala, Ser, Glu, Gln oder Trp ist, mit Asn am stärksten bevorzugt;
    X9 Gln oder Lys ist, mit Gln am stärksten bevorzugt;
    X10 Trp ist;
    X11 Phe, Thr, Met, Ser, Ala, Asn, Val, His, Ile, Pro, Trp oder Tyr ist, mit Phe am stärksten bevorzugt;
    X12 Asn, Asp, Glu, Pro, Gln oder Ser ist, mit Asn und Asp am stärksten bevorzugt;
    X13 Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Gln, Ser, Met, Glu, Thr, Lys oder Trp ist, mit Val und Leu am stärksten bevorzugt; und
    X14 Leu, Met, Val, Tyr, Ala, Ile, Trp, His, Pro, Gln, Glu, Phe, Lys oder Arg ist, mit Leu am stärksten bevorzugt.
  • Die in Tabellen 5, 8 und 9 (unten) aufgeführten Polypeptide sind bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Polypeptide 304A-12-H12 (SEQ ID NO: 59), 304A-14-B02 (SEQ ID NO: 74), 304A-14-A12 (SEQ ID NO: 83) und 304A-15-E04 (SEQ ID NO: 92) sind besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Modifikationen der vorerwähnten Polypeptide, um CEA-spezifische Kontrastmittel bereitzustellen, wobei die Bindungseinheiten modifiziert werden durch Radiomarkierung, enzymatische Markierung oder Markierung mit MR-paramagnetischen Chelaten; oder wobei die Bindungseinheiten enthalten sind in Mikropartikeln, Ultraschallblasen, Mikrokugeln, Emulsionen oder Liposomen; oder wobei die Bindungseinheiten mit optischen Farbstoffen konjugiert sind.
  • Die Verwendung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer mit CEA verbundenen Krankheit wird bereitgestellt.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden therapeutische Mittel bereitgestellt, umfassend eine Kombination, Konjugation oder Fusion eines anti-Krebs Arzneimittels oder eines anderen therapeutischen Mittels mit einer erfindungsgemäßen CEA-bindenden Einheit. Derartige Zusammensetzungen werden bei der Behandlung von Störungen und Zuständen, die mit CEA verbunden sind, nützlich sein.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden auch rekombinante Bakteriophagen, die CEA-bindende Polypeptide auf ihren Oberflächen präsentieren, bereitgestellt. Derartige Phagen sind nützlich als Screening-Reagenzien und Reagenzien zum Nachweisen von CEA.
  • Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden mit Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung ersichtlich werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt Ergebnisse einen Kompetitions-ELISA mit CEA-bindenden Phagen, anfänglich isoliert aus der Phagendisplay-Bibliothek TN10/9. Es wird gezeigt, dass die Phagen, die CEA-bindende Polypeptide tragen, um dieselbe Bindungsstelle (Domäne A3) konkurrieren wie der chimäre Antikörper α-CEA (A3), cT84.66.
  • 2 zeigt ELISA Wertungen für TN10/9-Isolate A07 und G08 im Vergleich zu 14 unterschiedlichen Lib2-Isolaten. Der erste Balken für jede Probe stellt Vertiefungen dar, die jeweils 100 ng CEA aufweisen. Die nachfolgenden Balken stellen dar: 50 ng, 10 ng, 5 ng, 1 ng und 0 ng CEA pro Vertiefung.
  • 3 zeigt Kompetitions-ELISA Wertungen für TN10/9-Isolate A07 und G08 im Vergleich zu 14 unterschiedlichen Lib2-Isolaten. Die Menge an CEA in jeder Vertiefung betrug konstant 0,1 μg/Vertiefung. Ein lösliches Peptid mit der CEA-Bindersequenz des Isolats G08 (Seq ID NO: 4), DX207, wurde als ein Inhibitor der Bindung an CEA zugefügt. Der erste Balken für jede Probe stellt 20 μM des CEA-Binders G08 dar. Nachfolgende Balken stellen dar: 2 μM, 0 M und kein Ziel.
  • 4 zeigt ELISA Wertungen für 18 unterschiedliche CEA-bindende Phagen, isoliert nach einer 18-stündigen Elution mit hoher Stringenz von Lib2 (bezeichnet W3), gegenüber verschiedenen Konzentrationen von NA3 im Vergleich zu Peptid DX306, das die Aminosäuresequenz von Isolat 304A-12-H12 (SEQ ID NO:59) hat. Der erste Balken jeder Probe stellt Vertiefungen dar, die jeweils 30 ng NA3 aufweisen. Nachfolgende Balken stellen dar: 10 ng, 3 ng und 0 ng NA3 pro Vertiefung.
  • 5 zeigt ELISA Wertungen für 18 unterschiedliche CEA-bindende Phagen, isoliert nach einer Faktor X-Elution mit hoher Stringenz von Lib2 (bezeichnet W4), gegenüber verschiedenen Konzentrationen von NA3 im Vergleich zu Peptid DX306, das die Aminosäuresequenz von Isolat 304A-12-H12 (SEQ ID NO: 59) hat. Der erste Balken jeder Probe stellt Vertiefungen dar, die jeweils 30 ng NA3 aufweisen. Nachfolgende Balken stellen dar: 10 ng, 3 ng und 0 ng NA3 pro Vertiefung.
  • 6(a)&(b) zeigen Kompetitions-ELISA Wertungen für 18 unterschiedliche CEA-bindende Phagen, isoliert nach einer 18-stündigen Elution mit hoher Stringenz von Lib2 (bezeichnet W3), gegenüber Ziel NA3 mit verschiedenen Konzentrationen von löslichem Peptid DX306, das die Aminosäuresequenz von Isolat 304A-12-H12 (SEQ ID NO: 59) hat. Der erste Balken jeder Probe stellt Vertiefungen dar, die jeweils 20 μM des Binders DX306, der die Aminosäuresequenz von Isolat 304A-12-H12 (SEQ ID NO: 59) hat, aufweisen. Nachfolgende Balken stellen dar: 10 μM, 5 μM, 2,5 μM, 1,25 μM, 0,625 μM, 0 μM und kein Ziel.
  • 7 zeigt Kompetitions-ELISA Wertungen für 9 unterschiedliche CEA-bindende Phagen, isoliert nach einer Faktor X-Elution mit hoher Stringenz von Lib2 (bezeichnet W4), gegenüber Ziel NA3 mit verschiedenen Konzentrationen von löslichem Peptid DX306, das die Rminosäuresequenz von Isolat 304A-12-H12 (SEQ ID NO: 59) hat. Der erste Balken jeder Probe stellt Vertiefungen dar, die jeweils kein Ziel aufweisen. Nachfolgende Balken stellen dar: 10 μM, 5 μM, 2,5 μM, 0,5 μM, 0 μM des Binders DX306, der die Aminosäuresequenz von Isolat 304A-12-H12 (SEQ ID NO: 59) hat.
  • Definitionen
  • In den folgenden Abschnitten wird der Ausdruck "rekombinant" verwendet, um nicht-natürlich veränderte oder manipulierte Nucleinsäuren, Wirtszellen, transfiziert mit exogenen (nicht-nativen) Nucleinsäuren, oder Polypeptide, nicht-natürlich exprimiert mittels Manipulation isolierter DNA und Transformation von Wirtszellen, zu beschreiben. Rekombinant ist ein Ausdruck, der insbesondere DNA Moleküle einschließt, die in vitro unter Verwendung von gentechnischen Verfahren konstruiert worden sind, und die Verwendung des Ausdrucks "rekombinant" als ein Adjektiv, um ein Molekül, Konstrukt, Vektor, Zelle, Polypeptid oder Polynucleotid zu beschreiben, schließt insbesondere derartige Moleküle, Konstrukte, Vektoren, Zellen, Polypeptide oder Polynucleotide aus, die natürlich auftreten.
  • Der Ausdruck "Bakteriophage" ist definiert als ein bakterieller Virus, enthaltend einen DNA Kern und eine Schutzhülle, die durch die Zusammenlagerung einer Anzahl unterschiedlicher Proteinmoleküle aufgebaut ist. Die Ausdrücke "Bakteriophage" und "Phage" werden hierin austauschbar verwendet.
  • Der Ausdruck "Bindungseinheit" wie er hierin verwendet wird bezieht sich auf irgendein Molekül, Polypeptid, Peptidmimetikum oder transformierte Zelle ("Transformand"), fähig zur Bildung eines Bindungskomplexes mit einem anderen Molekül, Polypeptid, Peptidmimetikum oder Zelle. "CEA-bindende Einheit" ist eine Bindungseinheit, die einen Komplex mit carcinoembryionischem Antigen (CEA) oder einem Teil desselben bildet, sei es natürlich exprimiert oder synthetisch oder rekombinant, löslich oder Membran gebunden. Enthalten bei den Teilen von CEA, die insbesondere ins Auge gefasst sind: die N-terminale Domäne (N), und intakte Domänen A1, B1, A2, B2, A3 oder B3, oder Kombinationen von zwei oder mehr derartiger Domänen in einem einzelnen Konjugat oder Fusionsprotein. Besonders erwähnt wird das Konstrukt N-A3, das ein Konstrukt ist, welches die N-terminale Domäne von CEA mit der Domäne A3 von CEA fusioniert. Die Domäne A3 zeigt keine Determinanten, die strukturelle Verwandte in Proteinen aufweisen, die bekanntermaßen immunologisch kreuzreaktiv mit CEA sind, und deshalb können Binder an Domäne A3 fähig sein, unterschiedlich an CEA zu binden und nicht wie jene bekannten strukturell verwandten Antigene, wie z.B. insbesondere, NCA. Spezifische Beispiele für CEA-bindende Einheiten sind die vorstehend erwähnten Polypeptide (SEQ ID NOs: 1–9, 24–27 und 36–151), Hybridpolypeptide, enthaltend derartige Polypeptide, und rekombinante Zellen oder Bakteriophagen, die irgendein derartiges Polypeptid präsentieren. Auch umfasst von der Definition für CEA-bindende Einheiten sind Polypeptide, abgeleitet von einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NOs: 110 und 111, vorstehend, die modifiziert worden sind für bestimmte Ergebnisse (zusätzlich zur Bindungsfähigkeit an CEA oder ähnliches Polypeptid). Spezifische Beispiele für ins Auge gefasste Modifikationen sind C- oder N-terminale Aminosäuresubstitutionen oder Elongationen, zum Beispiel zum Zweck die Bindungseinheit mit einem nachweisbaren bildgebenden Marker oder einem anderen Substrat zu verknüpfen. Zusätzlich zu den ferner hierin beschriebenen nachweisbaren Markern, umfassen andere geeignete Substrate anti-Krebs Arzneimittel oder andere chemotherapeutische Mittel, Enzyme, Toxine, Liposomen (z.B. beladen mit einem nachweisbaren Marker oder chemotherapeutischen Mittel), oder eine Festphase, Vertiefung, Platte, Kugel, Röhre, Objektträger, Filter oder Schüssel. Auch besonders ins Auge gefasst sind Substitutionen von einem oder mehr Cysteinresten, die normalerweise Disulfidbrücken bilden, zum Beispiel, Substitution mit nicht-natürlich auftretenden Aminosäureresten mit reaktiven Seitenketten, zum Zweck eine stabilere Bindung als die vorherige Disulfidbindung zwischen diesen Aminosäurepositionen zu bilden. Alle derartig modifizierten CEA-bindenden Einheiten werden auch als CEA-bindende Einheiten betrachtet solange sie die Fähigkeit behalten, CEA oder ein Fragment oder Domäne von CEA zu binden.
  • Der Ausdruck "bindend" bezieht sich auf die Bestimmung durch Standardverfahren, dass eine Bindungseinheit ein gegebenes Ziel erkennt und reversibel daran bindet. Derartige Standardverfahren umfassen Gleichgewichtsdialyse, Gelfiltration und die Beobachtung spektroskopischer Veränderungen, die sich durch das Binden ergeben, z.B. unter Verwendung von Fluoreszenzanisotropie, entweder durch direkte Bindungsmessungen oder Kompetitionsassays mit einem anderen Binder.
  • Der Ausdruck "Spezifität" bezieht sich auf eine Bindungseinheit, die für ein Ziel eine höhere Bindungsaffinität aufweist als für ein anderes. Der Ausdruck "CEA-Spezifität" bezieht sich auf eine CEA-bindende Einheit, die eine höhere Affinität für CEA im Vergleich zu einem anderen Ziel, wie z.B. einem Serumprotein (z.B. Rinderserumalbumin (BSA), humanem Serumalbumin (HSA)) oder Gelatine, aufweist.
  • Der Ausdruck "Polypeptid" bezieht sich auf ein lineares Polymer aus zwei oder mehr Aminosäureresten, verbunden durch Amidbindungen, und der Ausdruck "Peptid" wird hierin verwendet, um relativ kurze Polypeptide zu bezeichnen, z.B. mit weniger als etwa 30 Aminosäuren.
  • In der vorliegenden Anmeldung wird gesagt, dass eine CEA-bindende Einheit auf CEA-exprimierende Zellen "zielt", wenn sich die Bindungseinheit in oder nahe der CEA-exprimierenden Zellen anreichert, oder wenn die Bindungseinheit selektiv von den CEA-exprimierenden Zellen aufgenommen wird oder wenn die Bindungseinheit selektiv aufgenommen wird von und metabolisiert wird von den CEA-exprimierenden Zellen. Substanzen, die nicht CEA-bindende Einheiten sind, können auf CEA-exprimierende Zellen "gezielt werden" durch Konjugation mit CEA-bindenden Einheiten der vorliegenden Erfindung.
  • Der Ausdruck "kreuzreaktiv" wird hierin verwendet, um bindende Vereinigungen zwischen Molekülen, ähnlich der Bindung von Antikörpern an Antigene, zu beschreiben. Es soll gelten, dass es nicht-kovalentes Binden bezeichnet, und nicht die Bildung kovalenter Bindungen.
  • Für den Ausdruck "nachweisbar markiert" gilt, dass er das Verbinden eines Moleküls mit einem Farbstoff (wie z.B. Fluorescein), einem Radionuklid (wie z.B. 131I), einem Enzym (wie z.B. Meerretich-Peroxidase) oder nachweisbarem Metall (wie z.B. einem paramagnetischen Ion) umfasst, wobei Farbstoff, Radionuklid, Enzym oder Metall anschließend durch geeignete Mittel nachgewiesen werden können. Der Ausdruck "nachweisbar markiert" umfasst auch eine Bindungseinheit, die synthetisiert worden ist, um ein Radionuklid (wie z.B. 32P, 35S oder 14C) anstelle eines nicht-radioaktiven Isotops desselben Elements zu enthalten.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung stellt neue Bindungseinheiten für CEA bereit. Derartige Bindungseinheiten ermöglichen den wirksamen Nachweis, Abbilden, Lokalisation und Zielerfassung von CEA oder CEA-verwandten Polypeptiden in Geweben oder in einer Lösung oder System, das CEA oder CEA-verwandte Polypeptide enthält. Insbesondere sind die Bindungseinheiten dieser Erfindung, wenn sie geeignet markiert sind, nützlich zum Nachweisen, Abbilden, Lokalisieren und Zielerfassung CEA-exprimierender Zellen oder für die Diagnose CEA-spezifischer Pathophysiologien. Die hierin offenbarten CEA-bindenden Polypeptide können somit verwendet werden, um eine Vielzahl von diagnostischen und therapeutischen Mitteln für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten, die mit CEA zusammenhängen, wie z.B. Dickdarmkrebs und andere Krebsarten, charakterisiert durch die Überexpression von CEA in Zellen im Vergleich zu Leveln der CEA-Expression in entsprechenden Zellen normaler Individuen, zu bilden. Die bevorzugten Bindungseinheiten der vorliegenden Erfindung binden CEA mit hoher Affinität, d.h. wirken bei niedrigen, physiologisch relevanten Konzentrationen, vergleichbar bekannten anti-CEA Antikörpern und anderen CEA-bindenden Proteinen.
  • Bevorzugte erfindungsgemäße CEA-bindende Polypeptide werden an CEA oder ein Fragment desselben binden, aber werden nicht an andere Proteine, die bekannt sind, immunologisch kreuzreaktiv mit CEA zu sein, wie z.B. NCA, binden.
  • Spezifische CEA-bindende Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung wurden anfänglich isoliert durch Screening von Phagendisplay-Bibliotheken, d.h. Populationen rekombinanter Bakteriophagen, transformiert, um eine exogene Peptidschleife auf ihrer Oberfläche zu exprimieren. Um neue Polypeptid Bindungseinheiten für ein bestimmtes Ziel, wie z.B. CEA, zu isolieren, ist das Screening großer Peptidbibliotheken, z.B. unter Verwendung von Phagendisplay-Verfahren, besonders vorteilhaft, dadurch, dass eine sehr große Zahl (z.B. 5 × 109) potentielle Binder getestet werden kann und erfolgreiche Binder in einer kurzen Zeitspanne isoliert werden können.
  • Um eine Phagenbibliothek mit potentiell bindenden Polypeptiden herzustellen, und um die Biliothek nach Mitgliedern zu durchmustern, die CEA-bindende Peptide sein könnten, wird ein Bindungsdomänen-Kandidat ausgewählt, um als eine strukturelle Matrize (template) für die Peptide zu dienen, die in der Bibliothek präsentiert werden sollen. Die Phagenbibliothek besteht aus Analoga dieser Matrize oder "Elterndomäne" (parental domain). Die Bindungsdomänenmatrize kann ein natürlich auftretendes oder ein synthetisches Protein sein, oder ein Bereich oder Domäne eines Proteins. Die Bindungsdomänenmatrize kann ausgewählt werden, basierend auf der Kenntnis einer bekannten Wechselwirkung zwischen der Bindungsdomänenmatrize und CEA, aber dies ist nicht entscheidend. In der Tat ist es nicht wesentlich, dass die Domäne, ausgewählt, um als eine Matrize für die Bibliothek zu fungieren, überhaupt irgendeine Affinität für das Ziel hat: Ihr Zweck ist, eine Struktur bereitzustellen, von welcher eine Vielzahl (Bibliothek) ähnlich strukturierter Polypeptide (Analoga) erzeugt werden kann, wobei die Vielzahl der Analoga hoffentlich ein oder mehr Analoga enthalten wird, die die gewünschten Bindungseigenschaften (und irgendeine andere Eigenschaft auf die durchmustert wurde) zeigen.
  • Bei der Auswahl der Elternbindungsdomäne oder Matrize, auf der die verschiedenartigen Aminosäuresequenzen der Bibliothek basieren sollen, ist die wichtigste Überlegung, wie die verschiedenartigen Peptiddomänen dem Ziel präsentiert werden, d.h. in welcher Konformation die Peptidanaloga mit dem Ziel in Kontakt kommen werden. Bei Phagendisplay-Verfahren werden die Analoga z.B. erzeugt, indem synthetische DNA, die für die Analoga codiert, in Phagen insertiert wird, wodurch das Analogon auf den Oberflächen der Phagen präsentiert wird. Derartige Phagenbibliotheken, wie z.B. Phage M13, die eine große Vielzahl unterschiedlicher Polypeptide präsentieren, können unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, wie beschrieben in, zum Beispiel, Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual (Academic Press, Inc., San Diego 1996) und U.S. 5,223,409 (Ladner et al.), beide durch Bezugnahme hierin enthalten.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Phagenbibliotheken sind konstruiert in Derivaten des filamentösen Phagen M13. Die präsentierten Peptide sind mittels eines Linkerpeptids, das die Erkennungsstelle für Faktor Xa (die aktivierte Form des Faktors X) enthält, fusioniert mit dem Aminoterminus des Proteins III. Faktor Xa kann das präsentierte Peptid von dem Phagen spalten, ohne den Phagen zu verletzen oder dessen Infektiösität zu vermindern.
  • Zur Bildung der Phagendisplay-Bibliotheken ist es bevorzugt, ein strukturiertes Polypeptid als Bindungsdomänenmatrize zu verwenden im Gegensatz zu einem unstrukturierten linearen Peptid. Mutation von Oberflächenresten in einem Protein wird gewöhnlich geringe Wirkung auf die Gesamtstruktur oder allgemeine Eigenschaften (wie z.B. Größe, Stabilität und Denaturierungstemperatur) des Proteins haben; während gleichzeitig Mutation von Oberflächenresten die Bindungseigenschaften des Proteins stark beeinflussen kann. Je enger ein Polypeptidabschnitt eingeschränkt ist, desto weniger wahrscheinlich wird er an irgendein bestimmtes Ziel binden; falls das Polypeptid jedoch bindet, wird die Bindung wahrscheinlich eine höhere Affinität und größere Spezifität haben. Somit ist es bevorzugt, eine Elterndomäne auszuwählen und, wiederum, eine Struktur für die potentiellen Polypeptidbinder, die in ein Gerüst mit einem gewissen Grad an Steifheit eingezwängt ist. Beim Isolieren der spezifischen Polypeptide gemäß dieser Erfindung wurden vier Phagenbibliotheken durchmustert, wobei jede eine kurze verschiedenartige exogene Peptidschleife aus 11, 12 oder 16 Aminosäuren auf der Oberfläche des Phagen M13, am Aminoterminus des Proteins III, präsentierte. Die Bibliotheken wurden TN6/6 (mit einer potentiellen Aminosäuresequenzdiversität von 3,3 × 1012), TN7/1 (mit einer potentiellen Aminosäuresequenzdiversität von 5,6 × 109), TN8/6 (mit einer potentiellen Aminosäuresequenzdiversität von 6,3 × 109) und TN10/9 (mit einer potentiellen Aminosäuresequenzdiversität von 3 × 1016) bezeichnet.
  • Die Bibliothek TN6/6 wurde konstruiert, um eine einzelne Mikroprotein-Bindungsschleife, enthalten in einer 12-Aminosäurenmatrize, zu präsentieren. Die Bibliothek TN6/6 benutzte die Matrizensequenz Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa (SEQ ID NO: 10). Die Aminosäuren an der ersten und letzten Position in der Matrize (Aminosäurepositionen 1 und 12) wurden variiert, um irgendeine Aminosäure, ausgewählt aus einer Gruppe von 14 Aminosäuren (d.h. Pro, Ala, Phe, Ser, Asp, Arg, Leu, Gly, His, Gln, Asn, Val, Trp oder Tyr), zu gestatten; die Aminosäuren an Aminosäurepositionen 2, 3, 5–8, 10 und 11 in der Matrize wurden variiert, um irgendeine Aminosäure, außer Cystein (Cys), zu gestatten. Die Zahl der potentiell entworfenen Sequenzen beträgt 3,3 × 1012; mindestens etwa 2,0 × 108 unabhängige Transformanden waren in der Bibliothek enthalten.
  • Die Bibliothek TN7/1 wurde konstruiert, um eine einzelne Mikroprotein-Bindungsschleife, enthalten in einer 11-Aminosäurenmatrize, zu präsentieren. Die Bibliothek TN7/1 benutzte die Matrizensequenz Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa (SEQ ID NO: 11). Die Aminosäuren an der ersten und letzten Position in der Matrize (Aminosäurepositionen 1 und 11) wurden variiert, um irgendeine Aminosäure, ausgewählt aus einer Gruppe von sieben Aminosäuren (d.h. Phe, His, Pro, Leu, Ala, Asp oder Arg), zu gestatten; die Aminosäuren an Aminosäurepositionen 2 und 10 in der Matrize wurden variiert, um irgendeine Aminosäure, ausgewählt aus einer Gruppe von neun Aminosäuren (d.h. Leu, Gly, His, Ser, Asp, Arg, Pro, Ala oder Phe), zu gestatten; die Aminosäuren an Aminosäurepositionen 4, 5, 6, 7 und 8 (d.h. zwischen den unveränderbaren Cysteinresten in der Matrize) wurden variiert, um irgendeine Aminosäure, ausgewählt aus einer Gruppe von siebzehn Aminosäuren (d.h. Thr, Ile, Trp, Glu, Tyr, Gln, Asn, Val, Leu, Gly, His, Ser, Asp, Arg, Pro, Ala oder Phe), zu gestatten. Die Zahl der potentiell entworfenen Sequenzen beträgt 5,6 × 109; mindestens etwa 8,0 × 107 unabhängige Transformanden waren in der Bibliothek enthalten.
  • Die Bibliothek TN8/6 wurde konstruiert, um eine einzelne Mikroprotein-Bindungsschleife, enthalten in einer 12-Aminosäurenmatrize, zu präsentieren. Die Bibliothek TN8/6 benutzte die Matrizensequenz Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa (SEQ ID NO: 12). Die Aminosäuren an der ersten und letzten Position in der Matrize (Aminosäurepositionen 1 und 12) wurden variiert, um irgendeine Aminosäure, ausgewählt aus einer Gruppe von vier Aminosäuren (d.h. Ala, Asp, Arg oder His), zu gestatten; die Aminosäuren an Aminosäurepositionen 2 und 11 in der Matrize wurden variiert, um irgendeine Aminosäure, ausgewählt aus einer Gruppe von neun Aminosäuren (d.h. Pro, Ala, Phe, Ser, Asp, Arg, Leu, Gly oder His), zu gestatten; die Aminosäuren an Aminosäurepositionen 4, 5, 6, 7, 8 und 9 (d.h. zwischen den unveränderbaren Cysteinresten in der Matrize) wurden variiert, um irgendeine Aminosäure, ausgewählt aus einer Gruppe von dreizehn Aminosäuren (d.h. Pro, Ala, Phe, Ser, Asp, Arg, Leu, Gly, His, Gln, Asn, Val oder Trp), zu gestatten. Die Zahl der potentiell entworfenen Sequenzen beträgt 6,3 × 109; mindestens etwa 1,3 × 108 unabhängige Transformanden waren in der Bibliothek enthalten.
  • Die Bibliothek TN10/9 wurde konstruiert, um eine einzelne Mikroprotein-Bindungsschleife, enthalten in einer 16-Aminosäurenmatrize, zu präsentieren. Die Bibliothek TN10/9 benutzte die Matrizensequenz Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa (SEQ ID NO: 13). Die Aminosäuren an Aminosäurepositionen 1,2, 15 und 16 der Matrize wurden variiert, um irgendeine Aminosäure, ausgewählt aus einer Gruppe von zehn Aminosäuren (d.h. Tyr, Arg, Ser, Trp, Leu, Asn, Pro, Asp, Phe oder His), zu gestatten; die Aminosäuren an Aminosäurepositionen 3 und 14 in der Matrize wurden variiert, um irgendeine Aminosäure, ausgewählt aus einer Gruppe von vierzehn Aminosäuren (d.h. Trp, Tyr, Arg, Ser, Val, Asn, Pro, Gln, Gly, His, Leu, Ala, Asp oder Phe), zu gestatten; die Aminosäuren an Aminosäurepositionen 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 und 12 (d.h. zwischen den unveränderbaren Cysteinresten in der Matrize) wurden variiert, um irgendeine Aminosäure mit Ausnahme von Cystein zu gestatten. Die Zahl der potentiell entworfenen Sequenzen beträgt 3,3 × 1016; mindestens etwa 2,5 × 108 unabhängige Transformanden waren in der Bibliothek enthalten.
  • Derartige kleine Bindungsschleifenpeptide bieten mehrere Vorteile gegenüber großen Proteinen: erstens, die Masse pro Bindungsstelle ist vermindert, z.B. können derartige hochstabilen Polypeptiddomänen mit niederem Molekulargewicht viel höhere Bindung pro Gramm zeigen als es Antikörper (150 kDa) oder single-chain-Antikörper (30 kDa) tun. Zweitens, die Möglichkeit für unspezifisches Binden ist vermindert, weil weniger Oberfläche verfügbar ist. Drittens, kleine Proteine oder Polypeptide (weil sie chemisch synthetisierbar sind) können konstruiert werden, einzigartige Anbindungsstellen, wie z.B. terminale Polylysinabschnitte, in einer Weise aufzuweisen, die für größere Proteine oder Antikörper unmöglich ist. Viertens, kleine Peptide können zu Homo- oder Heteromultimeren kombiniert werden, um entweder Hybridbindung oder Aviditätseffekte zu ergeben. Fünftens, eine eingeschränkte Polypeptidstruktur wird ihre Funktionalität eher erhalten, wenn sie mit intakter struktureller Domäne von einem Gerüst auf ein anderes transferiert wird, d.h. die Bindungsdomänenstruktur kann wahrscheinlich von dem Gerüst, das für die Präsentation der Bibliothek verwendet wurde (z.B. präsentiert auf einem Phagen), übertragen werden auf ein isoliertes Protein, entfernt aus dem Präsentationsgerüst oder immobilisiert auf einer Chromatographiematrix oder einem anderen Substrat.
  • Jede der Peptidschleifen-Bibliotheken wurde erzeugt, indem eine entworfene Serie von Mutationen oder Variationen innerhalb einer für die Mikroproteinmatrize codierenden Sequenz ausgeführt wurde, wobei jede Mutantensequenz für ein Bindungsschleifen-analoges Peptid codiert, das in der Gesamtstruktur der Matrize entspricht, außer, dass es ein oder mehr Aminosäurevariationen in der Sequenz der Matrize aufweist. Die neue verschiedenartige (mutierte) DNA stellt Sequenzdiversität bereit, und jeder Phagentransformand präsentiert eine Variante der anfänglichen Aminosäuresequenzmatrize, die durch die DNA codiert wird, was zu einer Phagenpopulation (Bibliothek) führt, die eine enorme Zahl unterschiedlicher, aber strukturell verwandter, Aminosäuresequenzen präsentiert. Die Phagendisplay-Bibliotheken, die nach CEA-Bindern durchmustert wurden, enthielten von 100 Millionen bis 1 Milliarde Varianten der jeweiligen Elterndomänenpeptide. Es wird erwartet, dass die Aminosäurevariationen die Bindungseigenschaften der Bindungsschleife oder Domäne ändern, ohne deren Struktur merklich zu ändern, wenigstens für die meisten Substitutionen. Es ist bevorzugt, dass die Aminosäurepositionen, die für Variation (variable Aminosäurepositionen) ausgewählt werden, Oberflächenaminosäurepositionen sein werden, d.h. Positionen in der Aminosäuresequenz der Domäne(n), die, wenn die Domäne in ihrer stabilsten Konformation ist, an der äußeren Oberfläche der Domäne (d.h. die der Lösung ausgesetzte Oberfläche) auftreten. Am stärksten bevorzugt werden die zu variierenden Aminosäurepositionen benachbart oder nahe zusammen sein, um die Wirkung der Substitutionen zu maximieren.
  • Wie vorher angegeben, sind die in Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual (Academic Press, Inc., San Diego 1996) und U.S. 5,223,409 (Ladner et al.) erörterten Verfahren besonders nützlich bei der Herstellung einer Bibliothek von potentiellen Bindern, die der ausgewählten Elternmatrize entsprechen. Die vier vorhergehend beschriebenen Bibliotheken wurden gemäß derartiger Verfahren hergestellt, und sie wurden auf CEA-bindende Polypeptide gegen ein immobilisiertes CEA-relevantes Ziel (d.h. ein synthetisches Fusionspeptidziel, zusammengesetzt aus einem Hexahistidin-Leader, der N-Domäne von CEA und der Domäne A3 von CER, bezeichnet als "H6NA3") durchmustert.
  • In einem typischen Screen wird eine Phagenbibliothek kontaktiert mit und erlaubt an das Ziel zu binden, in diesem Fall, CEA oder bestimmte Untereinheit(en), wie z.B. NA3, die vorzugsweise Strukturen präsentieren, die einzigartig für CEA sind (d.h. Strukturen, nicht kreuzreaktiv mit NCA oder anderen CEA-ähnlichen Antigenen). Das H6NA3 Ziel wurde ausgewählt, weil angenommen wurde, dass die Domäne A3 einzigartig für CEA ist; Antikörper, die A3 binden, kreuzreagieren nicht mit anderen CEA-verwandten Antigenen, wie z.B. NCA.
  • Um die Abtrennung der Binder und nicht-Binder zu vereinfachen, ist es bequem, das Ziel an einer festen Phase zu immobilisieren. Phagen, die eine Ziel-Bindungseinheit tragen, bilden einen Komplex mit dem Ziel an der festen Phase, wenn sie in der Gegenwart des Ziels inkubiert werden, wohingegen nicht-bindende Phagen in Lösung verbleiben und mit Puffer ausgewaschen werden können. Gebundene Phagen können dann durch eine Reihe von Mitteln von dem Ziel freigesetzt werden, wie z.B. Wechsel des Puffers zu einem extremen pH (pH2 oder pH10), Wechsel der Ionenstärke des Puffers, Zugabe von denaturierenden Mitteln, oder andere bekannte Mittel. Im vorliegenden Fall wurden die mit dem immobilisierten Ziel NA3 assoziierten CEA-Binder entweder kompetitiv mit einem bekannten CEA-bindenden Antikörper (cT84.66, ein chimärer Maus/Mensch anti-A3 Antikörper, vertrieben von The City of Hope, Duarte CA) oder durch Spaltung mit Faktor Xa eluiert.
  • Die gewonnenen Phagen können dann mittels Infektion bakterieller Zellen amplifiziert werden und das Screeningverfahren mit dem neuen Pool, der jetzt um nicht-Binder dezimiert und um Binder angereichert ist, wiederholt werden. Die Gewinnung von wenigstens einigen bindenden Phagen ist ausreichend, um das Verfahren abzuschließen. Nach einigen Selektionsrunden werden die Gensequenzen, die für die Bindungseinheiten codieren, die aus ausgewählten Phagenklonen des bindenden Pools stammen, bestimmt durch übliche Verfahren, unten beschrieben, wodurch die Peptidsequenz aufgedeckt wird, die dem Phagen Bindungsaffinität zu dem Ziel verleiht. Wenn das Selektionsverfahren funktioniert, nimmt die Sequenzdiversität der Population mit jeder Selektionsrunde ab bis nur gute Binder übrigbleiben. Die Sequenzen konvergieren zu einer kleinen Zahl verwandter Binder, üblicherweise 10–50 aus den mehr als 100 Millionen ursprünglichen Kandidaten. Eine Zunahme der Zahl der nach jeder Selektionsrunde gewonnenen Phagen, und natürlich die Gewinnung nahe verwandter Sequenzen, sind gute Anzeichen, dass Konvergenz der Bibliothek in einem Screen auftrat. Nachdem ein Satz bindender Polypeptide ermittelt ist, kann die Sequenzinformation verwendet werden, um andere sekundäre Phagenbibliotheken zu entwerfen, abgestimmt auf Mitglieder mit zusätzlichen gewünschten Eigenschaften. Sobald CEA-Binder anfänglich isoliert und charakterisiert worden sind, kann ein weiteres Screening nach zusätzlichen ("verbesserten") CEA-Bindern durchgeführt werden, zum Beispiel, indem eine "abgestimmte" Bibliothek, abgeleitet von einer Aminosäure-Konsensussequenz anfänglicher Isolate, erzeugt wird und/oder die Stringenz des Screens erhöht wird (siehe unten).
  • Nach Analyse der Sequenzen, isoliert aus dem Bibliotheksscreening, wurde eine Familie bestimmter CEA-Binder definiert. Außerdem wurden wichtige Konsensusmotive beobachtet. Es wurde gefunden, dass die folgenden Sequenzen, die mit der TN10/9 Matrize übereinstimmen, ein CEA Ziel binden:
    Asn-Trp-Val-Cys-Asn-Leu-Phe-Lys-Asn-Gln-Trp-Phe-Cys-Asn-Ser-Tyr (SEQ ID NO: 4)(FX-G08);
    Asp-Trp-Val-Cys-Glu-Asn-Lys-Lys-Asp-Gln-Trp-Thr-Cys-Asn-Leu-Leu (SEQ ID NO: 5) (AB-A07);
    Asn-Trp-Asp-Cys-Met-Phe-Gly-Ala-Glu-Gly-Trp-Ala-Cys-Ser-Pro-Trp (SEQ ID NO: 6) (TN10/9-E01);
    Asp-Trp-Val-Cys-Glu-Lys-Thr-Thr-Gly-Gly-Tyr-Val-Cys-Gln-Pro-Leu (SEQ ID NO: 7) (TN10/9-B09);
    Asn-Trp-Phe-Cys-Glu-Met-Ile-Gly-Arg-Gln-Trp-Gly-Cys-Val-Pro-Ser (SEQ ID NO: 8) (TN10/9-F11); und
    Asp-Trp-Val-Cys-Asn-Phe-Asp-Gln-Gly-Leu-Ala-His-Cys-Phe-Pro-Ser (SEQ ID NO: 9) (TN10/9-G01).
  • Es wird erwartet, dass diese Peptide eine Disulfidbindung zwischen den Cys-Resten bilden, wenn sie auf dem Phagen präsentiert werden.
  • Diese Reihe von CEA-Bindern definiert eine Familie von Polypeptiden, umfassend die Aminosäuresequenz:
    X1-X2-X3-Cys-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-Cys-X12-X13-X14 (SEQ ID NO: 111), wobei:
    X1 Asn, Asp, Ala, Ile oder abwesend ist;
    X2 Trp ist;
    X3 Val, Ile, Met, Tyr, Phe, Pro oder Asp ist;
    X4 Asn, Glu, Asp oder Met ist;
    X5 Leu, Phe, Tyr, Trp, Val, Met, Ile oder Asn ist;
    X6 Phe, Leu, Asp, Glu, Ala, Ile, Lys, Asn, Ser, Val, Trp, Tyr, Gly oder Thr ist;
    X7 Lys, Phe, Asp, Gly, Leu, Asn, Trp, Ala, Gln oder Thr ist;
    X8 Asn, Pro, Phe, Gly, Asp, Ala, Ser, Glu, Gln, Trp, His, Arg, Met, Val oder Leu ist;
    X9 Gln, Lys, Leu oder Gly ist;
    X10 Ala, Trp oder Tyr ist;
    X11 Phe, Thr, Met, Ser, Ala, Asn, Val, His, Ile, Pro, Trp, Tyr, Gly, Leu oder Glu ist;
    X12 Asn, Asp, Glu, Pro, Gln, Ser, Phe oder Val ist;
    X13 Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Gln, Ser, Met, Glu, Thr, Lys, Trp oder Arg; und
    X14 Leu, Met, Val, Tyr, Ala, Ile, Trp, His, Pro, Gln, Glu, Phe, Lys, Arg oder Ser ist;
    und wobei dieses Polypeptid die Fähigkeit hat, CEA zu binden.
  • Es wird angenommen, dass die Cysteinreste des Mikroproteins eine Disulfidbindung bilden, die bewirkt, dass das Mikroprotein eine stabile Schleifenstruktur unter nicht-reduzierenden Bedingungen bildet. Somit betrifft die Erfindung die Offenlegung einer CEA-bindenden Schleife, umfassend ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz: Cys-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-Cys (SEQ ID NO: 110, nur zur Erläuterung),
    wobei:
    X4 Asn, Glu, Asp oder Met ist;
    X5 Leu, Phe, Tyr, Trp, Val, Met, Ile oder Asn ist;
    X6 Phe, Leu, Asp, Glu, Ala, Ile, Lys, Asn, Ser, Val, Trp, Tyr, Gly oder Thr ist;
    X7 Lys, Phe, Asp, Gly, Leu, Asn, Trp, Ala, Gln oder Thr ist;
    X8 Asn, Pro, Phe, Gly, Asp, Ala, Ser, Glu, Gln, Trp, His, Arg, Met, Val oder Leu ist;
    X9 Gln, Lys, Leu oder Gly ist;
    X10 Ala, Trp, oder Tyr ist;
    X11 Phe, Thr, Met, Ser, Als, Asn, Val, His, Ile, Pro, Trp, Tyr, Gly, Leu oder Glu ist;
    Wiederkehrende Sequenzen unter den in Screens gewonnenen Isolaten und Wiederkehr gewisser Aminosäuren an denselben Positionen innerhalb der isolierten Peptide lässt eine bevorzugte Familie von CEA-bindenden Peptiden vermuten und eine Sequenz, die nützlich zum Entwerfen einer sekundären gesteuerten Bibliothek sein kann, um CEA-Binder mit noch höherer Affinität zu erhalten. Die bevorzugte Familie von Peptiden hat Aminosäuresequenzen der Formel:
    X1-Trp-Val-Cys-Glu-X5-X6-Lys-X8-Gln-Trp-X11-Cys-Asn-X13-X14 (SEQ ID NO: 2),
    wobei:
    X1 Asn oder Rsp ist;
    X5 Asn, Leu, Met oder Phe ist;
    X6 Asp, Gly, Ile, Lys, Phe oder Thr ist;
    X8 Arg, Asn, Asp, Glu oder Gly ist;
    X11 Ala, Gly, His, Phe, Thr oder Val ist;
    X13 Arg, Leu, Pro oder Ser; und
    X14 Leu, Ser, Trp oder Tyr ist.
  • Die Erfindung schließt auch eine Phagenbibliothek ein, die auf verbesserte Binder an CEA gerichtet ist. Diese Bibliothek wurde aus sieben Teilbibliotheken (sublibraries) konstruiert, wobei jede Teilbibliothek die Variation von fünf Aminosäurepositionen erlaubte, während neun Aminosäurepositionen, die in der anfänglichen Bibliothek (TN10/9) variiert wurden, konstant gehalten wurden. Die Matrizenstruktur der sieben Teilbibliotheken erlaubte Verschiedenartigkeit in den Formen:
    Var1: X1-X2-X3-Cys-X4-X5-Lys-Lys-Asp-Gln-Trp-Thr-Cys-Asn-Leu-Leu (SEQ ID NO: 14)
    Var2: Asp-Trp-Val-Cys-X4-X5-X6-X7-Xg-Gln-Trp-Thr-Cys-Asn-Leu-Leu (5EQ ID NO: 15)
    Var3: Asp-Trp-Val-Cys-Glu-Asn-Lys-X7-Xg-Xg-X10-X1 1-Cys-Asn-Leu-Leu (SEQ ID NO: 16)
    Var4: Asp-Trp-Val-Cys-glu-Asn-Lys-Lys-Asp-Gln-X10-X11-Cys-X12-X13-X14 (SEQ ID NO: 17)
    Var5: Asp-Trp-Val-Cys-Glu-Xs-X6-Lys-Xg-Gln-Trp-X11-Cys-Asn-X13-Leu (SEQ ID NO: 18)
    Var6: Asn-Trp-Val-Cys-X4-Xs-X6-Lys-Xg-Gln-Trp-X1 l-Cys-Asn-Ser-Tyr (SEQ ID NO: 19)
    Var7: X1-Trp-X3-Cys-Asn-Leu-Phe-Lys-Asn-Gln-Trp-Phe-Cys-X12-X13-X14 (SEQ ID NO: 20), wobei
    jeder Rest, mit annähernd gleicher Wahrscheinlichkeit, jede der genetisch codierbaren Aminosäuren sein konnte, außer Cystein. Die unveränderbaren Teile der Sequenzen Var1 bis Var5 basierten auf der am häufigsten beobachteten CEA-bindenden Sequenz im anfänglichen Screening von TN10/9 (siehe SEQ ID NO: 5, Isolat AB-A07). Die unveränderbaren Teile der Sequenzen Var6 bis Var7 basierten auf dem Bindungspeptid, dass die beste Dissoziationskonstante besaß (siehe, SEQ ID NO: 4, Isolat FX-G08).
  • Zusätzlich wurden bevorzugte CEA-bindende Peptide aus dieser gerichteten Bibliothek mit den in Tabellen 5, 8 und 9 (unten) gezeigten Sequenzen isoliert.
  • Direkte Synthese der hierin offenbarten Peptide der Erfindung kann erreicht werden unter Verwendung von üblichen Verfahren, umfassend, vorzugsweise, Festphasen-Peptidsynthese, obwohl Flüssigphasen-Synthese auch verwendet werden kann. Bei der Festphasen-Synthese wird die Synthese zum Beispiel am Carboxyterminalen Ende des Peptids unter Verwendung einer α-Amino geschützten Aminosäure begonnen. t-Butyloxycarbonyl (Boc) Schutzgruppen können für alle Aminogruppen verwendet werden, auch wenn andere Schutzgruppen geeignet sind. Siehe, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1989), W. H. Freeman Co., San Francisco; und Merrifield, J. Am.Chem. Soc., 85: 2149–2154 (1963).
  • Erfindungsgemäße Polypeptide können auch kommerziell von Firmen hergestellt werden, die Peptidsynthese als Dienstleistung anbieten (z.B., BACHEM Bioscience, Inc., King of Prussia, PA; Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, MA).
  • Automatisierte Peptidsynthesemaschinen, wie z.B. hergestellt von Perkin-Elmer Applied Biosystems, sind auch erhältlich.
  • Die Polypeptidverbindung wird vorzugsweise gereinigt nachdem sie isoliert oder entweder mittels chemischer oder rekombinanter Verfahren synthetisiert worden ist. Für Reinigungszwecke gibt es viele Standardverfahren, die eingestzt werden können, einschließlich Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie (RP-HPLC) unter Verwendung einer alkylierten Kieselgelsäule, wie z.B. C4-, C8- oder C18-Kieselgel. Eine mobile Phase mit Gradient mit zunehmendem organischen Gehalt wird allgemein verwendet, um Reinigung zu erreichen, zum Beispiel, Acetonitril in einem wässrigen Puffer, gewöhnlich enthaltend eine kleine Menge an Trifluoressigsäure. Ionenaustausch-Chromatographie kann auch verwendet werden, um Peptide basierend auf ihrer Ladung zu trennen. Der Grad der Reinheit des Polypeptids kann mit verschiedenen Verfahren bestimmt werden, einschließlich Ermittlung eines großen Hauptpeaks bei HPLC. Ein Polypeptid, das einen einzelnen Peak erzeugt, der mindestens 95% des Ausgangsmaterials auf einer HPLC-Säule beträgt, ist bevorzugt. Stärker bevorzugt ist ein Polypeptid, das einen einzelnen Peak erzeugt, der mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99% oder sogar 99,5% des Ausgangsmaterials auf einer HPLC-Säule beträgt.
  • Um zu gewährleisten, dass das Peptid, erhalten unter Verwendung irgendeiner der vorstehend beschriebenen Verfahren, das gewünschte Peptid zur Verwendung in Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist, kann eine Analyse der Peptidzusammensetzung durchgeführt werden. Eine derartige Zusammensetzungsanalyse kann ausgeführt werden unter Verwendung hochauflösender Massenspektrometrie, um das Molekulargewicht des Peptids zu bestimmen. Alternativ kann der Aminosäuregehalt des Peptids bestätigt werden durch Hydrolyse des Peptids in wässriger Säure, und Trennen, Ermitteln und Quantifizieren der Bestandteile der Mischung unter Verwendung von HPLC oder eines Aminosäureanalysators. Protein-Sequenatoren, die das Peptid sequentiell abbauen und die Aminosäuren der Reihe nach ermitteln, können auch verwendet werden, um die Sequenz des Peptids eindeutig zu bestimmen.
  • Die neue Klasse von CEA-bindenden Polypeptiden ist entworfen, konformationell eingeschränkt zu sein durch Disulfidbrücken zwischen den beiden Cysteinresten in ihrer Sequenz. Diese konformationelle Einschränkung gewährleistet, dass die Peptide eine stabile Bindungsstruktur aufweisen, die zu der Affinität der Peptide zu CEA und ihrer Spezifität für CEA gegenüber nicht-CEA-Proteinen beträgt.
  • CEA-bindende Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung können auch erzeugt werden unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren, benutzend Nucleinsäuren (Polynucleotide), die für die Polypeptide gemäß dieser Erfindung codieren, indem diese dann rekombinant exprimiert werden, d.h. mittels Manipulation von Wirtszellen durch Einführung exogener Nucleinsäuremoleküle auf bekannte Weise, um derartige Wirtszellen zu veranlassen, die gewünschten CEA-bindenden Polypeptide zu erzeugen. Rekombinante Erzeugung kurzer Peptide (z.B. 16-meren), wie z.B. die hierin beschriebenen, kann im Vergleich zur direkten Synthese nicht vorteilhaft sein, jedoch können rekombinante Mittel zur Erzeugung sehr vorteilhaft sein, wenn es gewünscht wird, dass ein CEA-Bindungsmotiv dieser Erfindung in einem Hybridpolypeptid oder Fusionsprotein enthalten sein soll.
  • Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können in der Form von RNA oder in der Form von DNA sein, wobei DNA cDNA und synthetische DNA umfasst. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, und falls sie einzelsträngig ist, kann es der codierende oder der nicht-codierende (anti-sense) Strang sein. Die codierenden Sequenzen für CEA-bindende Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung können auf bekannte Weise manipuliert oder variiert werden, um alternative codierende Sequenzen zu ergeben, die, als eine Folge der Redundanz oder Degeneration des genetischen Codes, für dasselbe Polypeptid codieren.
  • Die Polypeptide und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in isolierter Form bereitgestellt, und sind vorzugsweise zur Homogenität gereinigt.
  • Wenn rekombinante Erzeugung von CEA-bindenden Polypeptiden gewünscht ist, fasst die vorliegende Erfindung auch Vektoren ins Auge, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung, Wirtszellen, die mit Vektoren der Erfindung gentechnisch hergestellt sind, und rekombinante Polypeptide, erzeugt durch Kultivierung derartiger gentechnisch hergestellter Wirtszellen, umfassen. Wirtszellen werden gentechnisch hergestellt (transduziert oder transformiert oder transfiziert) mit den Vektoren dieser Erfindung, die, zum Beispiel, ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein können. Der Vektor kann z.B. in der Form eines Plasmids, eines Viruspartikels, einer Phage usw. sein. Die gentechnischen Wirtszellen können in üblichen Nährmedien, angepasst zum geeigneten Aktivieren eines Promotors, Auswählen von Transformanden oder Amplifizieren der Polynucleotide, die für die CEA-Binder codieren. Die Kultivierungsbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen, sind geeignet zur Verwendung der Wirtszellen, die für die Expression ausgewählt wurden, und sind dem auf diesem Gebiet tätigen Fachmann geläufig. Das Polynucleotid kann in irgendeinem von einer Vielzahl von Expressionsvektoren für die Expression eines Polypeptids enthalten sein. Derartige Vektoren umfassen chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA Sequenzen, z.B. Derivative von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Baculovirus; Hefeplasmide; Vektoren, stammend aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA, viraler DNA, wie z.B. Vaccinia, Adenovirus, Hühnerpockenvirus und Pseudorabies. Jedoch kann auch irgendein anderer Vektor verwendet werden solange er in dem Wirt replizierbar und lebensfähig ist. Die geeignete DNA Sequenz kann in den Vektor mittels einer Vielzahl von Verfahren insertiert werden. Allgemein wird die DNA in eine geeignete Restriktionsendonucleasenstelle(n) mittels in dem Fachgebiet bekannter Verfahren insertiert. Derartige Verfahren und andere werden von Fachleuten des Gebiets beherrscht.
  • Die DNA Sequenz in dem Expressionsvektor ist funktional mit einer geeigneten Expressionskontrollsequenz(en) (Promotor) verknüpft, um die mRNA Synthese zu steuern. Als repräsentative Beispiele für derartige Promotoren können LTR oder SV40 Promotor, E. coli lac oder trp, der Phage lambda PL-Promotor und andere Promotoren erwähnt werden, die bekannt sind, die Expression der Gene in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder ihren Viren zu kontrollieren. Der Expressionsvektor enthält auch eine Ribosomenbindungsstelle für den Start der Translation und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann auch geeignete Sequenzen für eine amplifizierende Expression enthalten. Außerdem wird der Expressionsvektor vorzugsweise ein oder mehr selektionierbare Markergene enthalten, um ein phenotypisches Merkmal für die Selektion transformierter Wirtszellen bereitzustellen, wie z.B. Dihydrofolatreductase oder Neomycin-Resistenz für eine eukaryotische Zellkultur, oder wie z.B. Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenz für bakterielle Zellkulturen, wie z.B. E. coli.
  • Der Vektor, der die hier oberhalb beschriebene geeignete DNA Sequenz sowie einen geeigneten Promotor oder Kontrollsequenz enthält, kann eingesetzt werden, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, damit der Wirt das Protein exprimieren kann. Als repräsentative Beispiele für geeignete Wirtszellen können erwähnt werden: bakterielle Zellen, wie z.B. E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Pilzzellen, wie z.B. Hefe; Insektenzellen, wie z.B. Drosophila and Sf9; Tierzellen, wie z.B. CHO, COS oder Bowes Melanom; Pflanzenzellen, usw. Die Auswahl eines geeigneten Wirts für diese Art der Herstellung von CEA-Bindern wird aus den Lehren hierin ebenfalls von Fachleuten auf dem Gebiet beherrscht. Viele geeignete Vektoren und Promotoren, nützlich für die Expression von Proteinen gemäß dieser Erfindung, sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt, und viele sind kommerziell erhältlich. Die folgenden Vektoren werden als Beispiel bereitgestellt. Bakterielle: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS (+ oder –),pD10, pHagescript, psiX174, pBluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryotische: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Irgendein anderes Plasmid oder anderer Vektor kann verwendet werden solange es/er in der ausgewählten Wirtszelle replizierbar und lebensfähig ist.
  • Die Einführung von Vektoren in die Wirtszelle kann bewirkt werden durch irgendein bekanntes Verfahren, einschließlich Calciumphosphat-Transfection, DEAE-Dextran vermittelte Transfection oder Elektroporation (siehe Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986); Sambrook et al., Molecular Cloning, ISBN 0-87969-309-6, (1987)).
  • In der Praxis der vorliegenden Erfindung ist eine Bestimmung der Affinität der CEA-bindenden Einheit für CEA relativ zu anderen Bestandteilen einer Probe ein nützliches Maß, und wird als Spezifität für CEA bezeichnet. Standardassays zur Quantifizierung der Bindung und Bestimmung der Affintät umfassen Gleichgewichtsdialyse, Gleichgewichtsbindung, Gelfiltration, Oberflächen-Plasmonresonanz, Mikrowaagen (Hengerer et al., Biotechniques, 26 (5): 956–60, 962, 964 (1999)) oder die Beobachtung zahlreicher spektroskopischer Änderungen (wie z.B. Fluoreszenz), die sich aus der Interaktion der Bindungseinheit und dessen Ziel ergeben kann. Diese Verfahren messen die Konzentration von gebundenem und freiem Liganden als eine Funktion der Ligand-(oder Protein-)konzentration. Die Konzentration an gebundenem Polypeptid ([Gebunden]) wird in Bezug gebracht zu der Konzentration an freiem Polypeptid ([Frei)) und der Konzentration der Bindungsstellen für das Polypeptid, d.h. an CEA, (N = Gesamt CEA), wie beschrieben in der folgenden Gleichung: [Gebunden] = N × [Frei]/((KD) + [Frei]).
  • Eine Auswertung dieser Gleichung ergibt die Dissoziationskonstante KD, ein quantitatives Maß der Bindungsaffinität. Die Assoziationskonstante Ka ist das Reziproke der Dissoziationskonstante KD. Ein Peptid mit einem 2-fach höheren KD für HSA (oder einem anderen nicht-CEA Ziel, wie z.B. NCA) als für CEA würde als ein schwacher CEA-Binder betrachtet werden. Ein Peptid mit einem 10-fach höheren KD für HSA als für CEA würde als hochspezifisch für CEA bezeichnet werden. Vorzugsweise haben die Peptide und Verbindungen der vorliegenden Erfindung einen KD, der mindestens 2-fach höher für HSA als für CEA, bevorzugter mindestens 10-fach höher, und noch bevorzugter mindestens 100-fach, und am stärksten bevorzugt mindestens 1000-fach höher ist.
  • Für die meisten Anwendungen: Je niedriger die Dissoziationskonstante, desto besser. Bevorzugte erfindungsgemäße CEA-Binder werden einen KD für CEA von weniger als 10 μM haben, bevorzugtere CEA-Binder werden einen KD für CEA von weniger als 1 μM haben, und am stärksten bevorzugte CEA-Binder werden einen KD für CEA von weniger als 0,1 μM oder niedriger haben. Der erste Satz von CEA-Bindern, isoliert aus der Bibliothek TN10/9 hatte einen KD für CEA in dem Bereich von 1 μM bis 7 μM.
  • Verwendungen für CEA-bindende Polypeptide
  • Die CEA-bindenden Einheiten gemäß dieser Erfindung werden nützlich zum Nachweisen des Vorhandenseins von CEA in Blut oder anderen biologischen Flüssigkeiten und/oder zum Lokalisieren oder Abbilden der CEA-Expression in vitro oder in vivo sein, und besonders zum Nachweis und/oder Abbilden von CEA-exprimierenden Zellen und Geweben. Irgendein geeignetes Verfahren zum Untersuchen oder Abbilden von CEA kann eingesetzt werden.
  • Nachweis von CEA
  • Assays für CEA unter Verwendung der erfindungsgemäßen CEA-bindenden Einheiten können direktes Binden, kompetitives Binden oder Sandwich-Assays sein. Die CEA-bindende Einheit kann an eine Oberfläche angeheftet sein und bei Oberflächen-Plasmonresonanz oder Mikrowägen verwendet werden, um die Bindung von CEA direkt nachzuweisen.
  • Alternativ kann ein Bakteriophage, der ein CER-bindendes Peptid präsentiert, mit Zellen, die auf CEA-Expression getestet werden sollen, inkubiert werden. Die Zellen können auf eine Weise abzentrifugiert werden, dass der Phage nicht sedimentiert, und das Vorhandensein von Phage im Zellsediment kann dann mit markierten Antikörpern, die an den Phagen binden, nachgewiesen werden. Eine weiterer nützlicher Nachweisassay benutzt eine nachweisbar markierte CEA-bindende Einheit, die mit Zellen gemischt wird, die auf Oberflächen-Expression von CEA getestet werden sollen. Nach der Inkubation werden die Zellen abzentrifugiert und das Vorhandensein (oder die Abwesenheit) von CEA wird nachgewiesen durch das Vorhandensein (oder die Abwesenheit) der Markierung im Zellsediment.
  • Bei einem weiteren Nachweisverfahren kann die CER-bindende Einheit immobilisiert werden, die zu testende Probe wird mit der immobilisierten CEA-bindenden Einheit kontaktiert, und nach Inkubation wird die Probe entfernt und der Behälter gewaschen. Das Vorhandensein von CEA wird nachgewiesen mit einem nachweisbar markierten Antikörper, der CEA bindet. Dieser Antikörper muss nicht zwischen CEA und anderen kreuzreaktiven Antigenen unterscheiden, wenn bevorzugte Polypeptide gemäß dieser Erfindung verwendet werden, weil nur CEA durch die immobilisierte Bindungseinheit (die, bei bevorzugten Eigenschaften, spezifisch für CEA und nicht für kreuzreaktive Spezies, wie z.B. NCA, ist) eingefangen worden sein wird.
  • Bei einem weiteren Verfahren wird die CEA-bindende Einheit der vorliegenden Erfindung in einer Vertiefung immobilisiert; nachweisbar markiertes CEA wird an die CER-bindende Einheit gebunden; eine Probe wird dann zugegeben, und das Vorhandensein oder die Abwesenheit von CEA wird nachgewiesen durch die Freisetzung des markierten CEA oder den Verbleib des markierten CEA.
  • Für Nachweis oder Reinigung von CEA oder CEA-exprimierenden Zellen in oder aus einer Lösung kann eine Bindungseinheit der Erfindung auf einem festen Träger, wie z.B. einem chromatographischen Träger oder anderem porösen Material, immobilisiert werden, dann kann die immobilisierte Bindungseinheit mit der Lösung unter Bedingungen, geeignet zur Bildung eines Bindungseinheit/CEA-Komplexes, beladen oder kontaktiert werden. Der nicht-bindende Teil der Lösung kann entfernt werden und der Komplex kann nachgewiesen werden, z.B. unter Verwendung eines anti-CEA oder anti-Bindungseinheit Antikörpers, oder das CEA-Ziel kann unter geeigneten Elutionsbedingungen von der Bindungseinheit freigesetzt werden.
  • Tumorabbildung
  • Eine besonders bevorzugte Verwendung für die Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Erzeugen visuell erfassbarer Abbildungen von Tumoren, einschließlich neoplastischer Zellen, die große Mengen an CEA exprimieren, um bei der Diagnose, dem Überwachen und der Behandlung von Krebs oder anderen Störungen, die mit CEA zusammenhängen, zu helfen.
  • Die hierin offenbarten CEA-bindenden Einheiten können in bildgebende Mittel zum Nachweis CEA-exprimierender Tumoren umgewandelt werden, indem die Polypeptide mit einem geeigneten Marker für den diagnostischen Nachweis konjugiert werden. Vorzugsweise wird ein CEA-bindendes Polypeptid, das eine viel größere Spezifität für CEA als für NCA zeigt, verwendet. Ein Polypeptid gemäß dieser Erfindung kann mit einem geeigneten Marker für das Nachweisverfahren, das eingesetzt werden soll, konjugiert oder verbunden werden. Zum Beispiel kann der CEA-Binder mit einem paramagnetischen Chelat, geeignet für Magnetresonanztomographie (MRI), mit einer Radiomarkierung, geeignet für Röntgen, mit einer Ultraschall-Mikrokugel oder einem Liposom, geeignet für Ultraschallnachweis, oder mit einem optischen bildgebenden Farbstoff konjugiert sein.
  • Geeignete Linker für die Konjugation der Polypeptidbinder an einen nachweisbaren Marker können substituierte oder unsubstituierte Alkylketten, Aminosäureketten (z.B. Polyglycin), Polyethylenglykole, Polyamide und andere einfache in dem Fachgebiet bekannte polymere Linker sein. Viele heterobifunktionelle Linker sind auch bekannt und sind kommerziell erhältlich. Nachweisbare Marker können auch direkt an die CEA-bindenden Einheiten gebunden werden, z.B. an eine Lysinseitenkette oder andere reaktive Stelle, die die Interaktion CEA/Bindungseinheit nicht stört.
  • Moleküle, die mehrfache Kopien einer CEA-bindenden Einheit enthalten, weisen wahrscheinlich längere Verweilzeiten sowohl am Tumor als auch im Kreislauf auf. Es ist wünschenswert, dass ein Mittel, dass vorgesehen ist, CEA, entweder zum Abbilden oder für eine Therapie, zu binden, für mindestens ein paar Stunden im Kreislauf verbleibt, so dass es Zeit hat, den Tumor zu erreichen. Sobald das Mittel den Tumor erreicht hat, ist es wünschenswert, dass es dort solange wie möglich verbleibt.
  • Viele Verfahren zur Herstellung multimerer Formen von bindenden Molekülen sind bekannt, und derartige Verfahren können verwendet werden, um CEA-bindende Multimere herzustellen, die eine erhöhte Serum-Halbwertszeit und höhere Avidität für CEA aufweisen. Zum Beispiel kann eines der CEA-bindenden Peptide der vorliegenden Erfindung mit einem C-terminalen Gly-Gly-Lys Anhang synthetisiert werden. Die Seitengruppen der anderen Reste sind auf eine Weise geschützt und die terminale Lys-Seitengruppe und die Carboxylgruppen sind auf eine orthogonale Art geschützt. Die terminale Lys-Amingruppe wird entschützt und eine Chelatorgruppe wird angeheftet. Die Carboxylgruppen werden entschützt und zwei Kopien werden unter Verwendung bifunktioneller Polyethylenglykol-Reagenzien verbunden. Die anderen Schutzgruppen werden entfernt. Kurz vor Verwendung wird ein geeignetes Radionuklid zugefügt. Für Abbildungen ist 99MTc ein bevorzugtes Radionuklid und HYNIC ist ein bevorzugter Chelator. Alternativ könnten an den Lys-Anhang andere Einheiten als Chelatoren gekuppelt werden. Vollständige Antikörper zeigen nachweisbare Aviditätseffekte, wenn sie an CEA binden. Somit werden bei einem dimerisierten Bindungspeptid gemäß der Erfindung vergleichbare Aviditätseffekte erwartet.
  • Vorzugsweise sind die Peptideinheiten eines Multimers (z.B. Homo- und Heterodimere, Trimere und Tetramere) durch einen Linker getrennt, bevorzugter einen hydrophilen Linker. Zum Beispiel können die Peptideinheiten eines Moleküls durch eine Entfernung getrennt sein, ähnlich der Trennung zwischen den Bindungsstellen (combining sites) eines Antikörpers (d.h. in der Größenordnung von 100%). Ein bevorzugter Linker enthält von etwa 1 bis etwa 100 -(CH2-CH2-O)- Einheiten, um Trennung zu ermöglichen und die Serum-Verweilzeit zu erhöhen. Vorzugsweise enthält der Linker von etwa 50 bis etwa 80 -(CH2-CH2-O)- Einheiten.
  • Allgemein basiert das Verfahren der Verwendung einer nachweisbar markierten CEA-bindenden Einheit für die Diagnose in vivo auf der Voraussetzung, dass der Marker ein Signal erzeugt, das außerhalb des Körpers eines Patienten nachweisbar ist. Wenn die nachweisbar markierte CEA-bindende Einheit dem Patienten, der im Verdacht steht, einen CEA-exprimierenden Tumor zu haben, verabreicht wird, bewirkt die hohe Affinität der CEA-bindenden Einheit für CEA an einem Tumor, dass die CEA-bindende Einheit an den Tumor bindet und Marker an der Stelle des Tumors anreichert. Dem markierten Peptid wird ausreichend Zeit gegeben, um sich an der Stelle des Tumors zu fixieren. Das von dem markierten Peptid erzeugte Signal kann dann mittels einer Scanvorrichtung, die entsprechend dem Typ des verwendeten Markers variieren wird, nachgewiesen werden, und das Signal kann dann zu einem Bild des Tumors umgewandelt werden.
  • Therapeutische Anwendungen
  • Die CEA-bindenden Einheiten der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um die Aktivität von anti-Krebs Arzneimitteln oder Tumor-tötenden Mitteln zu verbessern, indem sie ihre Affinität für CEA bereitstellen oder verbessern. In dieser Ausführungsform der Erfindung werden Hybrid-anti-Tumormittel bereitgestellt, indem eine erfindungsgemäße CEA-bindende Einheit mit einem Arzneimittel oder anderem für Tumoren tödlichen Mittel konjugiert wird. Der Bestandteil der CEA-bindenden Einheit des Konjugats bewirkt, dass das anti-Tumormittel auf die Stellen von CEA-exprimierenden Zellen zielt, und die Affinität des Konjugats zu den Zellen verbessert ist, so dass die anti-Tumorwirkung des Konjugats mehr auf die Tumorstellen fixiert und konzentriert ist. Derartige Konjugate werden nützlich sein bei der Behandlung von Krankheiten, die mit CEA zusammenhängen, insbesondere Dickdarmkrebs, bei Menschen und Tieren, wobei das Verfahren umfasst: Verabreichen einer wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen CEA-bindenden Einheit, konjugiert mit einem geeigneten therapeutischen Mittel, an einen Menschen oder ein Tier, die dasselbe benötigen. Die Erfindung stellt auch die Verwendung derartiger Konjugate bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krankheiten, die mit der Überexpression von CEA durch Zellen zusammenhängen, bei Menschen oder Tieren bereit.
  • Eine CEA-bindende Einheit der vorliegenden Erfindung kann vorteilhaft verwendet werden, um ein Toxin, Radioaktivität, cytolytische T-Zellen, Cytokine, chemotherpeutische Mittel oder andere Moleküle zu einem CEA-exprimierenden Tumor zu lenken.
  • Bei dem vorhergehenden Behandlungsverfahren können die Verbindungen auf irgendeinem bequemen Weg, der gebräuchlich für anti-Tumorbehandlungen ist, verabreicht werden, zum Beispiel durch Infusion oder Bolus-Injektion. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Zusammensetzung in Übereinstimmung mit Routineverfahren als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert sein, die für eine intravenöse Verabreichung an menschliche Wesen angepasst ist. Typischerweise sind Zusammensetzungen für eine intravenöse Verabreichung Lösungen in sterilen, isotonischen, wässrigen Puffern. Falls notwendig kann die Zusammensetzung auch ein solubilisierendes Mittel und ein Lokalanästhesiakum, wie z.B. Lignocain, enthalten, um den Schmerz an der Injektionsstelle zu lindern. Allgemein werden die Inhaltsstoffe entweder getrennt oder zusammengemischt in Form von Dosierungseinheiten zugeführt, zum Beispiel als ein trockenes lyophilisiertes Pulver oder wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch abgeschlossenen Behälter, wie z.B. einer Ampulle oder Tütchen, die die Wirkstoffmenge in Wirkeinheiten angeben. Wenn die Zusammensetzung durch Infusion verabreicht werden soll, kann sie mit einer Infusionsflasche, enthaltend steriles "Wasser für Injektion" pharmazeutischen Grads oder Salzlösung, abgegeben werden. Wenn die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht werden soll, kann eine Ampulle mit sterilem Wasser für die Injektion oder Salzlösung bereitgestellt werden, so dass die Inhaltsstoffe vor der Verabreichung gemischt werden können.
  • Die Menge an verabreichtem Material wird von der Schwere des Zustands und der Position und Größe des Tumors abhängen. Die genaue Dosis, die eingesetzt werden soll und die Art der Verabreichung muss zwangsweise im Hinblick auf die Natur der Beschwerde entsprechend den Umständen von dem Arzt, der die Behandlung überwacht, entschieden werden. Allgemein werden sich die Dosierungen des CEA-Binder/anti-Tumormittel-Konjugats nach den Dosierungen richten, die für das anti-Tumormittel allein üblich sind, obwohl die verbesserte Affinität für CEA, beigetragen durch den CEA-Binder-Bestandteil, eine Absenkung der Standarddosierung gestatten kann.
  • Die Isolierung der CEA-bindenden Einheiten in Übereinstimmung mit dieser Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher erläutert. Die spezifischen Parameter, die in den folgenden Beispielen enthalten sind, sind dazu vorgesehen, den Gebrauch der Erfindung zu erläutern, und sie werden nicht präsentiert, um den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.
  • Beispiel 1: Herstellung eines CEA-Ziels für das Bibliotheksscreening
  • Für das Screening von Bibliotheken, um Bindungseinheiten für CEA zu isolieren, wurde ein verkürztes Zielprotein verwendet, d.h. H6NA3, bestehend aus einem Hexahistidin-Leader und den Domänen N und A3 von CEA, basierend auf der Annahme, dass Binder, die gegen Domäne A3 gerichtet sind, nicht kreuzreaktiv sein würden mit anderen Antigenen, wie z.B. NCA, die einen hohen Grad an Homologie zu CEA aufweisen. Das rekombinant erzeugte Protein H6NA3 wurde in PBS dispergiert und zu den Vertiefungen einer 96-Loch Polystyrol-Mikrotiterplatte zugegeben, mit 1 μg/Vertiefung. Die Platte wurde über Nacht bei 4°C stehengelassen, was wirksam war, um das Ziel Antigen H6NA3 an der Platte zu immobilisieren.
  • Beispiel 2: Screening der Phagendisplay-Bibliotheken
  • Vier Phagendisplay-Bibliotheken wurden für das anfängliche Screening nach CEA-bindenden Einheiten verwendet. Die Bibliotheken wurden bezeichnet: TN6/6, TN7/1, TN8/6 und TN10/9.
  • Die Phagendisplay-Bibliothek TN6/6 bestand aus rekombinantem Phagen M13, der verschiedenartige exogene Einzelschleifen-Peptide, basierend auf einer Mikroproteinmatrize mit der Struktur: Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa (SEQ ID NO: 10), präsentierte. 2,0 × 108 Transformanden (bei 6,0 × 109 pfu/ml) wurden durchmustert.
  • Die Phagendisplay-Bibliothek TN7/1 bestand aus rekombinantem Phagen M13, der verschiedenartige exogene Einzelschleifen-Peptide, basierend auf einer Mikroproteinmatrize mit der Struktur: Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa (SEQ ID NO: 11) präsentierte. 8,0 × 107 Transformanden (bei 7,0 × 109 pfu/ml) wurden durchmustert.
  • Die Phagendisplay-Bibliothek TN8/6 bestand aus rekombinantem Phagen M13, der verschiedenartige exogene Einzelschleifen-Peptide, basierend auf einer Mikroproteinmatrize mit der Struktur: Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa (SEQ ID NO: 12) präsentierte. 1,3 × 108 Transformanden (bei 7,5 × 109 pfu/ml) wurden durchmustert.
  • Die Phagendisplay-Bibliothek TN10/9 bestand aus rekombinantem Phagen M13, der verschiedenartige exogene Einzelschleifen-Peptide, basierend auf einer Mikroproteinmatrize mit der Struktur: Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa (SEQ ID NO: 13) präsentierte. 2,5 × 108 Transformanden (bei 7,0 × 109 pfu/ml) wurden durchmustert.
  • Alle Bibliotheken wurden konstruiert, so dass der Phage ein verschiedenartiges Peptid am Aminoterminus des Proteins III exprimierte, und eine konstante Faktor Xa Spaltstelle wurde zwischen dem präsentierten Peptid und dem reifen Protein III bereitgestellt. Jede Bibliothek wurde vor der Zugabe zu den H6NA3-beschichteten Vertiefungen getrennt in 100 μL Bindungspuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 0,05% Tween-20) verdünnt.
  • Jede Bibliothek konnte mit dem Ziel getrennt interagieren. Nach 2-stündiger Inkubation mit dem Ziel, um das Binden zu ermöglichen, wurden die Vertiefungen der Platte extensiv (Minimum 10 Mal) gewaschen, um ungebundenen oder schwach gebundenen Phagen zu entfernen. Gebundener Phage wurde durch Elution unter zwei Bedingungen gewonnen: Erstens, durch kompetitives Binden mit einem zweiten CEA-Liganden, nämlich einem chimären monoklonalen Maus/Mensch anti-A3 Antikörper, cT84.66 (zugegeben zu 333 nM), gefolgt von Faktor Xa Spaltungselution. Phagenfraktionen der kompetitiven Antikörperelution (AbE) und der Faktor X-Elution (FXE) wurden gewonnen und über Nacht getrennt vermehrt.
  • Die amplifizierten Phagen wurden konzentriert (AbE und FXE getrennt), erneut dem Ziel ausgesetzt und mit Antikörper oder Faktor Xa (jeweils) eluiert. Dieses Verfahren wurde weitere zwei Mal wiederholt. Eine stetige Zunahme des Elutionstiters nach jeder der vier Screeningrunden zeigte Selektion von Phagen mit Affinität für das Ziel NA3 an.
  • Beispiel 3: Analyse von individuellen Isolaten
  • Nach vier Selektionsrunden wurden die eluierten Phagen vermehrt und ein Teil plattiert, um Phagenplaques zu isolieren, die aus individuellen Klonen hervorgehen. 94 derartige Klone wurden zufällig ausgewählt, vermehrt und individuell auf Bindung an NA3 in einem ELISA mit getrockneter H6NA3-Platte getestet. Getrocknete H6NA3-Platten wurden wie vorhergehend für das Bibliotheksscreening beschrieben hergestellt. Phagenproben (je ~109 Phagen) wurden inkubiert in den Vertiefungen der H6NA3-Platten in Bindungspuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 0,05 Tween-20), enthaltend 0,1% HSA. Nach 1 Stunde wurden die Platten 5-mal mit Bindungspuffer gewaschen. Polyklonaler anti-M13 Antikörper, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (Pharmacia) wurde in 1/5000 Verdünnung in Bindungspuffer zu den Vertiefungen zugegeben und für 1 Stunde inkubiert. Die Vertiefungen wurden wieder 5-mal mit Bindungspuffer gewaschen und das Vorhandensein des Antikörper/Phage/NA3-Komplexes wurde mit calorimetrischen HRP- Reagenzien (3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) und H2O2) gemessen. Eine hohe Absorption bei 630 nm (aufgrund des oxidierten TMB) war ein Anzeichen einer engen Interaktion Phage/NA3, und Phagenklone, die mit diesen Vertiefungen korrespondierten wurden als Träger von CEA-bindenden Einheiten ermittelt.
  • ELISAs, um die Bindung an immobilisiertes HSA (passiv an die Polystyrolplatte gebunden) zu untersuchen, und eine Ziel-freie Mikrotiterplatte waren Kontrollen, um Phagen auszuschließen, die promiskuitiv oder unspezifisch banden.
  • Die Aminosäuresequenzen der Phagen-präsentierten Polypeptide der positiven Klone aus dem ELISA (diejenigen, positiv für NA3, aber negativ für HSA und die Polystyroplatte) wurden durch DNA-Sequenzierung abgeleitet. Die Aminosäuresequenzdaten von diesen Phagenisolaten wurden sortiert gemäß dem Grad der Ähnlichkeit und Antwort im H6NA3-Platten ELISA. Die Ergebnisse des Screens der Bibliothek TN10/9 sind in Tabelle 1 angegeben.
  • Tabelle 1: Aminosäuresequenzen der CEA-bindenden Polypeptide aus der Bibliothek TN10/9
    Figure 00480001
  • Die Screens der Bibliotheken TN6/6, TN7/1 und TN8/6 führten nicht zur Gewinnung von irgendwelchen hochaffinen CEA-Bindern.
  • Später wurde herausgefunden, dass Peptide G01 (SEQ ID NO: 21) und B10 (SEQ ID NO: 22) nicht mit nützlicher Affinität an CEA binden.
  • Beispiel 4: Sequenzkonservierung unter TN10/9-Isolaten
  • Die Polypeptidsequenzen, die an das Ziel H6NA3 binden, definieren eine Cystein-verbrückte CEA-bindende Schleife aus 10 Aminosäuren (einschließlich der Cysteine), nämlich Cys-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-CyS (SEQ ID NO: 3), wobei
    X4 Asn, Glu oder Met ist;
    X5 Asn, Leu, Met oder Phe ist;
    X6 Asp, Gly, Ile, Lys, Phe oder Thr ist;
    X7 Ala, Gln, Gly, Lys oder Thr ist;
    X8 Arg, Asn, Asp, Glu oder Gly ist;
    X9 Gln, Gly, Leu oder Ser ist;
    X10 Ala, Trp oder Tyr ist; und
    X11 Ala, Gly, His, Phe, Thr oder Val ist,
    das eine stabile Bindungsstelle für CEA bildet.
  • Es wird auch klar aus den ausgewählten Isolaten, dass eine bestimmte Sequenz, die von A07 (SEQ ID NO: 5), mit großer Häufigkeit vorkommt (75/94) und bei beiden Elutionsverfahren, Kompetition mit cT84.66 (AbE) und Faktor Xa-Spaltung (FXE), gewonnen wurde. Weil dieses Polypeptid mit derart großer Häufigkeit unter den Isolaten auftrat, wurde es für einen bevorzugten Binder gehalten, und die anderen Sequenzen wurden mit der Sequenz A07 verglichen, um zu bestimmen, ob irgendeine Aminosäureposition in dem 16-mer konserviert wurde. Eine Position wurde als konserviert angesehen, wenn eines der anderen Isolate dieselbe Aminosäure an derselben Position in Bezug auf die unveränderbaren Cysteinreste zeigte; eine Position wurde als hochkonserviert angesehen, wenn zwei oder mehr der anderen Isolate dieselbe Aminosäure an derselben Position in Bezug auf die unveränderbaren Cysteinreste zeigte. Aus dieser Analyse wurde die folgende konservierte Sequenz (SEQ ID NO: 23) beobachtet:
  • Figure 00500001
  • In dieser konservierten Sequenz (SEQ ID NO: 23) zeigten die mit "X" bezeichneten Position keine Konservierung einer Aminosäure von A07, waren die spezifizierten Aminosäurereste (an Positionen 8, 14 und 16) konserviert, und die unterstrichenen Aminosäurereste waren hochkonserviert. Die konservierte Sequenz wurde verwendet als eine Elternmatrize (parental template) bei dem Entwurf einer zusätzlichen, sekundären Bibliothek (Lib2), die auf zusätzliche hochaffine Binder von CEA durchmustert werden sollte (siehe Beispiel 7).
  • Beispiel 5: Epitop-Mapping der Phagenisolate
  • Mehrere Phagenisolate wurden getestet, um zu bestimmen, ob die Bindung an Domäne A3 von CEA erfolgte, indem ein ELISA mit unterschiedlichen Konzentrationen des chimären anti-A3 Antikörpers, cT84.66, durchgeführt wurde. Isolate G08, A07, E01, B09, F11 und D04 wurden getestet. In jedem Assay waren die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit H6NA3 (100 ng/Vertiefung), blockiert mit 2% fettarmer Trockenmilch (Carnation), beschichtet und Peptid-präsentierender Phage (5 × 1010/Vertiefung) wurde in der Gegenwart oder Abwesenheit von cT84.66 zugegeben. Nach dem Waschen wurde die Bindung an H6NA3 unter Verwendung von anti-M13 Antikörper, markiert mit Meerrrettich-Peroxidase, nachgewiesen. Wenn cT84.66 verwendet wurde, wurde er mit 10 nM oder 100 nM in getrennten Versuchen zugegeben. Zugabe von BSA wurde als Kontrolle durchgeführt; und Assays unter Verwendung der nicht-CEA-bindenden Phagen B10 (SEQ ID NO: 22) und G01 (SEQ ID NO: 21) wurden auch als Negativkontrolle durchgeführt. Die Ergebnisse des Mapping-ELISA sind in 1 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die vorher isolierten CEA-bindenden Phagen in jedem Fall um dieselbe Bindungsstelle mit dem Antikörper cT84.66, der die Domäne A3 von CEA erkennt, konkurrierten.
  • Beispiel 6: Bindungsstudien
  • Die Affinität der Peptide, präsentiert von den vier Phagenisolaten mit der höchsten Affinität (1), wurden in direkten Bindungsstudien weiter getestet. 27-mer Peptide, einschließlich der Bindungsschleifen der Isolate G08, A07, E01 und B09, wurden durch Festphasen-Synthese synthetisiert. Die so hergestellten Peptide sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Tabelle 2: Aminosäuresequenzen von CEA-bindenden Polypeptiden für Bindungsstudien
    Figure 00510001
  • Wie Tabelle 2 entnommen werden kann, hatte jedes der Peptide einen N-terminalen Serinrest zugefügt, replizierend einen Teil der Umgebung der Phagendisplay-Peptide. Jedes Peptid war auch mit einem C-terminalen Linker mit Amidfunktion versehen, der für die Immobilisierung der Peptide an verschiedenen chromatographischen Substraten nützlich ist: -Ala18-Pro19-Gly20-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Ser-Lys-CONH2 (SEQ ID NO: 28). Das Tripeptid -Ala18-Pro19-Gly20- repliziert einen Teil aus der Umgebung der Phagen-präsentierten Peptide, und der restliche C-Terminus ist ein synthetischer Linker für die Immobilisierung. Aliquots von jedem Peptid wurden Fluoreszenzmarkiert unter Verwendung von NHS-Fluorescein, umgesetzt mit der ε-Aminoseitengruppe des C-terminalen Lysins.
  • Dissoziationskonstanten wurden bestimmt unter Verwendung von Fluoreszenzanisotropie, mittels Messungen der direkten Bindung und Kompetitionsexperimenten. Bei direkten Bindungsassays wird die Konzentration des Fluorescein-markierten Peptids konstant gehalten und die Konzentration von H6NA3 wird variiert. Beim Kompetitionsexperiment werden die Konzentration des Fluorescein-markierten Peptids und des Ziels H6NA3 konstant gehalten und die Konzentration eines Kompetitors (cT84.66, unmarkiert) wird variiert. Die Änderung der Anisotropie wird über nichtlineare Regression angepasst an die geeignete Gleichung, um den beobachteten Ka (apparent Kd) zu erhalten. Die Dissoziationskonstanten, die die Bindung der vier synthetischen Peptide an H6NA3 beschreiben, sind in Tabelle 3 angegeben.
  • Tabelle 3: Dissoziationskonstanten (KD) für CEA-bindende Peptide
    Figure 00520001
  • Diese Experimente zeigen, dass die Peptide Domäne A3 von CEA mit Dissoziationskonstanten binden, die von 1 bis 7 μM reichen. Nach diesen Tests scheint das Polypeptid, das die Sequenz G08 enthält, der isolierte Binder mit der höchsten Affinität zu sein.
  • Beispiel 7: Eine Bibliothek gerichtet auf verbesserte CEA Bindung
  • Eine zweite Bibliothek TN10, gerichtet auf Peptide mit verbesserter Bindung für CEA, wurde konstruiert unter Verwendung von Sequenz- und Bindungsinformation, erhalten aus den vorhergehenden Beispielen.
  • Aus der Vorauswahl von Sequenzen, schien das Polypeptid A07 (SEQ ID NO: 5) der beste Binder zu sein. Unter Verwendung dieser Sequenz als sekundäre Elterndomäne oder Matrize, wurden 5 Aminosäurepositionen innerhalb der Sequenz A07 variiert. Fünf Oligonucleotide wurden konstruiert, die A07 als Elternsequenz (parental sequence) verwendeten und erlaubten, fünf Positionen auf einmal zu allen möglichen Sequenzen, die Cysteine ausschließen, zu variieren. Die Oligonucleotidsequenzen codierten somit für Peptide, die die entworfenen Sequenzen Var1 bis Var5, gezeigt in Tabelle 4 unten, aufweisen. Nach der Beobachtung, dass das Peptid G08 den niedrigsten KD hatte, wurden zusätzliche variierte Oligonucleotide, die für Peptide, basierend auf der Elternsequenz von G08, codieren, entworfen und zu der gerichteten Bibliothek zugefügt. Die Oligonucleotidsequenzen, die für Peptide, basierend auf G08 codierten, haben die entworfenen Sequenzen Var6 und Var7, gezeigt in Tabelle 4 unten. Tabelle 4: Entworfene Polypeptide für die Expression in Präsentationsbibliothek "Lib2"
    Figure 00540001
    • X
    = irgendeine Aminosäure außer Cys
  • Die Oligonucleotide, die für die Peptide Var1 bis Var7 codieren, wurden zu gleichen Teilen gemischt und eine sekundäre Bibliothek ("Lib2"), die etwa 1,7 × 107 unterschiedliche Sequenzen erlaubt, wurde konstruiert. Mehr als 5 × 108 Transformanden wurden erhalten, so dass alle erlaubten Sequenzen vorhanden sein sollten.
  • Beispiel 8: Sieben von Lib2 und Isolate aus Lib2
  • Lib2 wurde gesiebt über 3 Runden unter Verwendung von geringeren Mengen an Ziel und unter Anwendung von zwei unterschiedlichen Waschverfahren: Waschverfahren 1 (W1) war identisch zu dem in Beispiel 2 benutzten Screeningverfahren (d.h. 10 Waschungen mit PBS/0,1% TWEEN-20, einem nicht-ionischen Detergens), Waschverfahren 2 (W2) umfasste 5 Waschungen in dem PBS/0,1% TWEEN-Puffer, einstündiges Einweichen in demselben Puffer, gefolgt von 5 weiteren Waschungen. Gebundener Phage wurde eluiert nach Faktor X Spaltungsverfahren und die zwei durchmusterten Proben (W1 und W2) wurden getrennt über Nacht vermehrt (Runde 1).
  • In der zweiten Screeningrunde von Probe W1 wurde die Zielkonzentration auf ein Drittel der in Runde 1 verwendeten Zielkonzentration vermindert; die zweite Screeningrunde von W2 war identisch zu Runde 1. Das Waschverfahren für W1 und W2 war dasselbe, wie durchgeführt für jedes in Runde 1. Gebundener Phage wurde durch Elution unter zwei Bedingungen gewonnen: Erstens, durch kompetitive Bindung mit cT84.66 (zugegeben zu 333 nM), gefolgt von Faktor Xa Spaltungselution (wie in Beispiel 2). Phagenfraktionen der kompetitiven Antikörperelution (W1AbE und W2AbE) und der Faktor X-Elution (W1FXE und W2FXE) wurden gewonnen und getrennt über Nacht vermehrt (Runde 2).
  • Die dritte Selektionsrunde bestand aus Waschverfahren identisch zu Runde 2 für jedes der beiden Waschverfahren (W1 und W2), entweder gefolgt von Antikörperelution (für W1AbE und W2AbE) oder Faktor X-Elution (für W1FXE und W2FXE) und Vermehrung (getrennt) über Nacht (Runde 3).
  • Eine Zunahme des Elutionstiters wurde im Anschluss an Runde 2 beobachtet, aber bei Runde 3 pendelte er sich ein, nahelegend, dass die Selektion von Phagen, die eine Affinität für NA3 aufwiesen, anfänglich erfolgte, aber nicht zunehmen konnte, entweder aufgrund der hohen Konzentration an vielfachen hochaffinen Bindern in der Population der Bibliothek oder (wahrscheinlicher) aufgrund des Gleichgewichts zu der Konzentration von Ziel auf der Platte.
  • Nach der dritten Runde wurden 96 Isolate aus jeder der vier Behandlungsgruppen (W1AbE, W1FXE, W2AbE und W2FXE) mittels ELISA auf Bindung an NA3 getestet. Zweiundsiebzig Isolate waren ELSIR positiv und wurden sequenziert. Es gab 71 unterschiedliche Sequenzen, nahelegend, dass weiteres Screening benötigt werden könnte, um die allerbesten Sequenzen zu ermitteln. Die Sequenzen sind in Tabelle 5 unten gezeigt. Die einundsiebzig CEA-Binder des Lib2-Screens definieren eine bevorzugte Familie von Bindungseinheiten mit der allgemeinen Formel:
    X1-Trp-X2-Cys-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Trp-X9-Cys-X10-X11-X12 (SEQ ID NO: 36), wobei:
    X1 Asp, Asn, Ala, oder Ile ist, mit Asp am stärksten bevorzugt;
    X2 Val, Ile, Met, Tyr, Phe, Pro, oder Asp ist, mit Val am stärksten bevorzugt;
    X3 Asn, Glu, oder Asp ist, mit Asn und Glu am stärksten bevorzugt;
    X4 Leu, Phe, Tyr, Trp, Val, Met, Ile, oder Asn ist, mit Leu am stärksten bevorzugt;
    X5 Phe, Leu, Asp, Glu, Ala, Ile, Lys, Asn, Ser, Val, Trp, oder Tyr ist, mit Phe am stärksten bevorzugt;
    X6 Lys, Phe, Asp, Gly, Leu, Asn, oder Trp ist, mit Lys am stärksten bevorzugt;
    X7 Asn, Pro, Phe, Gly, Asp, Ala, Ser, Glu, Gln, oder Trp ist, mit Asn am stärksten bevorzugt;
    X8 Gln, oder Lys ist, mit Gln am stärksten bevorzugt;
    X9 Phe, Thr, Met, Ser, Ala, Asn, Val, His, Ile, Pro, Trp, oder Tyr ist, mit Phe am stärksten bevorzugt;
    X10 Asn, Asp, Glu, Pro, Gln, oder Ser ist, mit Asn und Asp am stärksten bevorzugt;
    X11 Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Gln, Ser, Met, Glu, Thr, Lys, oder Trp ist, mit Val und Leu am stärksten bevorzugt; und
    X12 Leu, Met, Val, Tyr, Ala, Ile, Trp, His, Pro, Gln, Glu, Phe, Lys, oder Arg ist, mit Leu am stärksten bevorzugt.
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Mehrere Isolate gaben besonders starke ELISA-Signale und diese wurden weiter getestet. 2 zeigt das Bindungsprofil von 14 unterschiedlichen Isolaten von CEA-Bindern (im Vergleich zu den früher isolierten CEA-Bindern A07 und G08) gegenüber verschiedenen Konzentrationen von NA3. Zum Beispiel fällt die Bindung von G08 und A07 sehr schnell ab, sobald die Menge an NA3 unter 50 ng pro Vertiefung fällt. Die Bindung von 304A-12-H12 und 304A-14-A12 fällt nicht so schnell ab. 304A-14-B02 und 304A-15-E04 zeigen eine Bindung, die mindestens so gut ist wie die von G08 und A07.
  • 3 zeigt das Bindungsprofil von 14 unterschiedlichen Isolaten von CEA-Bindern gegenüber NA3 in einem Kompetitionsassay mit verschiedenen Konzentrationen eines löslichen Peptids mit der Sequenz G08 (Inhibitorpeptid, bezeichnet als DX207). Diese Daten legen nahe, dass die Isolate aus dem Lib2-Screen im allgemeinen höhere Affinität zu Domäne A3 von CEA zeigen als es G08 oder A07 tun.
  • Beispiel 9: Lib2-Isolat Bindungsstudien
  • Die Affinität ausgewählter Peptide, präsentiert von Phagenisolaten aus dem Lib2-Screening, wurde weiter getestet in direkten Bindungsstudien (wie in Beispiel 6). Peptide, einschließlich der Bindungsdomäne der Isolate der CEA-Binder wurden synthetisiert mittels Festphasen-Synthese.
  • Außerdem wurde ein Peptid mit einer einzigartigen Sequenz de novo synthetisiert, basierend auf einem "Hybridisierungs"konstrukt der Sequenz der Isolate 304A-12-H12 und 304A-14-A12, die sich voneinander in zwei getrennten Aminosäurepaaren unterschieden. Tabelle 6 erläutert das Konstrukt dieses "Hybrids H12/A12" aus den zwei "Eltern"sequenzen.
  • Tabelle 6: Aminosäuresequenzen von CEA-bindenden Polypeptiden für Bindungsstudien
    Figure 00610001
  • Aliquots von jedem Peptid wurden Fluoreszenz-markiert unter Verwendung von NH5-Fluorescein, umgesetzt mit der ε-Aminoseitengruppe des C-terminalen Lysins.
  • Dissoziationskonstanten wurden bestimmt unter Verwendung von Fluoreszenzanisotropie, mittels Messungen der direkten Bindung (siehe Beispiel 6). Die Dissoziationskonstanten, die die Bindung des synthetischen Peptids an H6NA3 beschreiben sind in Tabelle 7 angegeben.
  • Tabelle 7: Dissoziationskonstanten (KD) für CEA-bindende Peptide
    Figure 00610002
  • Diese Experimente demonstrieren, dass der CEA-Binder 304A-12-H12 (auch als DX306 bezeichnet) eine 8-fache Zunahme der Affinität zeigte, verglichen mit dem Isolat Peptid G08 (aus Tabelle 3). Der CEA-Binder aus Isolat 304A-14-A12 zeigte auch ein mehrfache Zunahme der Affinität. Das synthetische Peptid, Hybrid H12/A12, das CEA-Bindungseigenschaften zeigt, vergleichbar den aus dem anfänglichen Bibliotheksscreen erhaltenen Isolaten, zeigte nicht die dramatisch verbesserten Bindungseigenschaften, die von den aus dem Lib2-Screen erhaltenen Bindern gezeigt werden. Diese Ergebnisse unterstützen die Ansicht, dass zusätzliches Screening einer "vorselektionierten", abgestimmten Bibliothek (z.B. Lib2) "verbesserte" Binder mit höherer Affinität erzeugt als diejenigen, die aus einer "naiven" Bibliothek isoliert werden.
  • Beispiel 10: CEA-Binderscreen mit hoher Stringenz von naiven und vorselektionierten Bibliotheken
  • Weil der Lib2-Screen CEA-Binder mit höherer Affinität erzeugt als diejenigen aus der nicht-abgestimmten Bibliothek, und weil es keine offensichtliche Sequenzkonvergenz der Lib2-Screen Isolate gab, wurde das Sieben der naiven Bibliothek und der vorselektionierten Bibliothek unter Waschbedingungen mit hoher Stringenz durchgeführt, um CEA-Binder mit sogar noch höherer Affinität zu erzeugen.
  • Ein CEA-Binderscreen mit hoher Stringenz wurde mit drei Bibliotheken getrennt durchgeführt. Die amplifizierten Elutionen, erzeugt von der dritten Runde des CEA-Screens der abgestimmten Bibliothek (Beispiel 8), wurden kombiniert, um zwei "vereinigte Bibliotheken" zu bilden: eine vereinigte mit Antikörper eluierte Bibliothek (aus W1AbE und W2AbE), und eine vereinigte mit Faktor X eluierte Bibliothek, "pFX" (aus W1FXE und W2FXE). Die dritte naive Bibliothek war die ursprüngliche Bibliothek TN10/9 aus Beispiel 2 (nachfolgend bezeichnet mit den Buchstaben "CEA").
  • Jede der drei Bibliotheken wurde gemäß demselben Bindungs(0,1 μg Ziel NA3) und Waschverfahren durchmustert. Fünf Waschungen (PBS/0,1% TWEEN-20, ein nicht-ionisches Detergens), unterbrochen von 30-minütigen Einweichintervallen, wurden durchgeführt, gefolgt von zusätzlichen vier Waschungen, wobei Aliquots von jeder von diesen aufbewahrt wurden. Waschung 1 (erzeugend Aliquots W1pAB, W1pFX, und W1CEA) war eine 1-stündige kompetitive Elution unter Verwendung von 10 μM DX306 in PBS/0.1% TWEEN. Waschung 2 (erzeugend Aliquots W2pAB, W2pFX, und W2CEA) war identisch zu Waschung 1. Waschung 3 (erzeugend Aliquots W3pAB, W3pFX, und W3CEA) war eine über Nacht (18 Stunden) Elution in demselben Puffer. Waschung 4 (erzeugend Aliquots W4pAB, W4pFX, und W4CEA) war eine Faktor X-Elution. W3CEA und W4CEA wurden getrennt über Nacht vermehrt und durchliefen eine zweite Screenrunde identisch zu der ersten Runde (erzeugend Isolate W3CEAR2 und W4CEAR2).
  • Wie erwartet wurde eine Zunahme des Elutionstiters in den zwei vorselektionierten vereinigten Bibliotheken im Vergleich zu der naiven Bibliothek beobachtet. Auch die naive Bibliothek zeigte eine Zunahme des Titers bei der zweiten Runde, der 18-stündigen Waschung, aber nicht bei der Faktor X-Elution. Ergebnisse der Elutionstiter von diesen Screens (Daten nicht gezeigt) legen nahe, dass Selektion von Phagen, die eine Affinität für NA3 aufwiesen, in allen Pools auftraten, außer bei der Faktor X-Waschung der naiven Bibliothek; vielleicht aufgrund der verhältnismäßig kleinen Menge hochaffiner Binder in der anfänglichen Bibliothek, die von dem Ziel während der 18-stündigen Waschung heruntergewaschen werden, wohingegen die vorselektionierten Pools mit hohen Titern von festen Bindern, mit einer größeren Wahrscheinlichkeit bei der letzten (Faktor X-Spaltung) Elution noch vorhanden zu sein, starteten.
  • Achtundneunzig (98) Isolate aus jedem der acht Elutionsaliquots ((W3pAb, W3pFX, W4pAb, W4pFX, W3CEAR1, W4CEAR1, W3CEAR2 und W4CEAR2) wurden zufällig ausgewählt und mittels ELISA auf Bindung an NA3 getestet. Tabelle 8 offenbart die Aminosäuresequenz der CEA-Binder, isoliert aus dem Screen der naiven Bibliothek mit hoher Stringenz. Tabelle 9 offenbart die Aminosäuresequenz der CEA-Binder, isoliert aus dem Screen der vorselektionierten Bibliotheken mit hoher Stringenz.
  • Die Offenlegung von diesen CEA-Bindern mit hoher Stringenz definiert eine Familie von Bindungseinheiten mit der allgemeinen Formel:
    X2-X2-X3-Cys-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-Cys-X12-X13-X14 (SEQ ID NO: 111), wobei:
    X1 Asp, Asn, Ala oder Ile ist;
    X2 Trp ist;
    X3 Val, Ile, Met, Tyr, Phe, Pro oder Asp ist;
    X4 Asn, Glu, Asp oder Met ist;
    X5 Leu, Phe, Tyr, Trp, Val, Met, Ile oder Asn ist;
    X6 Phe, Leu, Asp, Glu, Ala, Ile, Lys, Asn, Ser, Val, Trp, Tyr, Gly oder Thr ist;
    X7 Lys, Phe, Asp, Gly, Leu, Asn, Trp, Ala, Gln oder Thr ist;
    X8 Asn, Pro, Phe, Gly, Asp, Ala, Ser, Glu, Gln, Trp, His, Arg, Met, Val oder Leu ist;
    X9 Gln, Lys, Leu oder Gly ist;
    X10 Trp, Ala oder Tyr ist;
    X11 Phe, Thr, Met, Ser, Ala, Asn, Val, His, Ile, Pro, Trp, Tyr, Gly, Leu oder Glu ist;
    X12 Asn, Asp, Glu, Pro, Gln, Ser, Phe oder Val ist;
    X13 Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Gln, Ser, Met, Glu, Thr, Lys, Trp oder Arg ist; und
    X14 Leu, Met, Val, Tyr, Ala, Ile, Trp, His, Pro, Gln, Glu, Phe, Lys, Arg oder Ser ist.
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Mehrere Isolate gaben besonders starke ELISA-Signale und diese wurden weiter getestet. 4 zeigt Bindungsprofile von 18 unterschiedlichen CEA-Bindern, isoliert aus der 18-stündigen Elution (W3) bei variierenden Konzentrationen von NA3. 5 zeigt das Bindungsprofil von neun (9) unterschiedlichen CEA-Bindern, isoliert aus der Faktor X-Elution (W4) bei variierenden Konznetrationen von NA3. Isolat 304A-12-H12 (bezeichnet als DX306) wurde parallel dazu als eine Vergleichsbasis untersucht.
  • 6(a) & 6(b) zeigen das Bindungsprofil derselben 18 CEA-Binder, isoliert aus der 18-stündigen Elution (W3), an NA3 in einem Kompetitionsassay mit variierenden Konzentrationen eines löslichen Peptids mit der Sequenz 304A-12-H12 (DX306). 7 zeigt das Bindungsprofil der neun (9) CEA-Binder, isoliert aus der Faktor X-Elution (W4), an NA3 in einem Kompetitionsassay mit variierenden Konzentrationen eines löslichen Peptids mit der Sequenz 304A-12-H12 (DX306).
  • Beispiel 11: Bindungsstudien der Isolate mit hoher Stringenz
  • Die Affinität der ausgewählten Peptide, präsentiert von Phagenisolaten aus dem Lib2-Screen mit hoher Stringenz, wurde weiter getestet in direkten und Kompetitions-Bindungsstudien (wie in Beispielen 6 & 9). Peptide, einschließlich der Bindungsdomäne der Isolate der CEA-Binder wurden synthetisiert mittels Festphasen-Synthese. Jedes Peptid war auch mit einem C-terminalen Linker mit Amidfunktion versehen, der für die Immobilisierung der Peptide an verschiedenen chromatographischen Substraten nützlich ist: -Ala18-Pro19-Gly20-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Ser-Lys-CONH2 (SEQ ID NO: 28). Das Tripeptid -Ala18-Pro19-Gly20- repliziert einen Teil der Umgebung der Phagen-präsentierten Polypeptide, und der restliche C- Terminus ist ein synthetischer Linker für die Immobilisierung. Aliquots von jedem Peptid wurden Fluoreszenz-markiert unter Verwendung von NHS-Fluorescein, umgesetzt mit der ε-Aminoseitengruppe des C-terminalen Lysins.
  • Dissoziationskonstanten wurden bestimmt unter Verwendung von Fluoreszenzanisotropie, mittels Messungen der direkten Bindung, entweder an NA3 oder CEA, in PBS mit 0,01 TWEEN-20. Bei direkten Bindungsassays wird die Konzentration des Fluorescein-markierten Peptids konstant gehalten und die Konzentration von NA3 wird variiert. Beim Kompetitionsexperiment werden die Konzentration des Fluorescein-markierten Peptids und des Ziels NA3 konstant gehalten und die Konzentration des Kompetitor-Peptids (aus Isolat 12-H12) wird variiert. Die Änderung der Anisotropie wird über nichtlineare Regression angepasst an die geeignete Gleichung, um den beobachteten Kd zu erhalten. Isolat 304A-12-H12, vorher isoliert aus Lib2 und auf Bindung untersucht, wurde als Kontrolle parallel dazu analysiert. Analysen für bestimmte Binder wurden repliziert und werden berichtet, um die Sorgfalt und Genauigkeit der Messungen zu bestätigen. KD-Standardfehlerwerte sindnich aus der nichtlinearen Regression berechnet (SIGMAPLOT, SPSS Science, Chicago, IL). Die Dissoziationskonstanten, die die Bindung des synthetischen Peptids an jedes von diesen Zielen beschreiben, sind in Tabelle 10 angegeben.
  • Tabelle 10: Dissoziationskonstanten(KD) für CEA-bindende Peptide
    Figure 00690001
  • Es wurde vorher gemessen, dass das Peptid DX306 an NA3 mit einem KD von 0,24 ± 0,03 μM bindet; innerhalb des Standardfehlers der vorliegenden Messung. Die Daten legen nahe, dass diese CEA-Binder mit hoher Stringenz NA-3 mit etwa derselben Affinität wie DX306 (das Kontrollpeptid) binden.
  • 304A-12-H12, 315A-17-G08 und 315A-18-E02 banden CEA auch wirksam, aber nicht so stark wie sie an NA3 banden. 315A-17-B12 schien CEA nicht zu binden. Verringerte Affinität für das Binden von CEA kann auf einen strukturellen Unterschied in den Proteinen zurückzuführen sein, der die Peptidbindung beeinträchtigt, oder auf das Vorhandensein einer merklichen Konzentration an nichtfunktionalem (inaktivem) CEA in der kommerziellen Präparation.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00700001
  • Figure 00710001
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  • Figure 01230001
  • Figure 01240001
  • Figure 01250001
  • Figure 01260001

Claims (17)

  1. Polypeptid mit der Fähigkeit CEA zu binden, umfassend die Aminosäuresequenz: X1-X2-X3-Cys-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-CYS-X12-X13-X14 (SEQ ID NO: 111), wobei: X1 Asp, Asn, Ala oder Ile ist; X2 Trp ist; X3 Val, Ile, Met, Tyr, Phe, Pro oder Asp ist; X4 Asn, Glu, Asp oder Met ist; X5 Leu, Phe, Tyr, Trp, Val, Met, Ile oder Asn ist; X6 Phe, Leu, Asp, Glu, Ala, Ile, Lys, Asn, Ser, Val, Trp, Tyr, Gly oder Thr ist; X7 Lys, Phe, Asp, Gly, Leu, Asn, Trp, Ala, Gln oder Thr ist; X8 Asn, Pro, Phe, Gly, Asp, Ala, Ser, Glu, Gln, Trp, His, Arg, Met, Val oder Leu ist; X9 Gln, Lys, Leu oder Gly ist; X10 Trp, Ala oder Tyr ist; X11 Phe, Thr, Met, Ser, Ala, Asn, Val, His, Ile, Pro, Trp, Tyr, Gly, Leu oder Glu ist; X12 Asn, Asp, Glu, Pro, Gln, Ser, Phe oder Val ist; X13 Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Gln, Ser, Met, Glu, Thr, Lys, Trp oder Arg; und X14 Leu, Met, Val, Tyr, Ala, Ile, Trp, His, Pro, Gln, Glu, Phe, Lys, Arg oder Ser ist.
  2. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei: X4 Asn, Glu oder Met ist; X5 Asn, Leu, Met oder Phe ist; X6 Asp, Gly, Ile, Lys, Phe oder Thr ist; X7 Ala, Gln Gly, Lys oder Thr ist; X8 Arg, Asn, Asp, Glu oder Gly ist; X9 Gln, Gly oder Leu ist; X10 Ala, Trp, oder Tyr; und X11 Ala, Gly, His, Phe, Thr oder Val ist.
  3. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei: X1 Asn oder Asp ist; X2 Trp ist; X3 Asp, Phe oder Val ist; X4 Asn, Glu oder Met ist; X5 Asn, Leu, Met oder Phe ist; X6 Asp, Gly, Ile, Lys, Phe oder Thr ist; X7 Ala, Gln, Gly, Lys oder Thr ist; X8 Arg, Asn, Asp, Glu oder Gly ist; X9 Gln, Gly oder Leu ist; X10 Ala, Trp oder Tyr ist; X11 Ala, Gly, His, Phe, Thr oder Val ist; X12 Asn, Gln, Phe, Ser oder Val ist; X13 Arg, Leu, Pro oder Ser; und X14 Leu, Ser, Trp oder Tyr ist.
  4. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei: X1 Asp, Asn, Ala oder Ile ist; X2 Trp ist; X3 Val, Ile, Met, Tyr, Phe, Pro oder Asp ist; X4 Asn, Glu oder Asp ist; X5 Leu, Phe, Tyr, Trp, Val, Met, Ile oder Asn ist; X6 Phe, Leu, Asp, Glu, Ala, Ile, Lys, Asn, Ser, Val, Trp oder Tyr ist; X7 Lys, Phe, Asp, Gly, Leu, Asn oder Trp ist; X8 Asn, Pro, Phe, Gly, Asp, Ala, Ser, Glu, Gln oder Trp ist; X9 Gln, oder Lys ist; X10 Trp ist; X11 Phe, Thr, Met, Ser, Ala, Asn, Val, His, Ile, Pro, Trp oder Tyr ist; X12 Asn, Asp, Glu, Pro, Gln oder Ser ist; X13 Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Gln, Ser, Met, Glu, Thr, Lys oder Trp ist; und X14 Leu, Met, Val, Tyr, Ala, Ile, Trp, His, Pro, Gln, Glu, Phe, Lys oder Arg ist.
  5. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei: X4 Asn oder Glu ist; X5 Leu, Phe, Tyr, Trp oder Ile ist; X6 Phe, Leu, Asp, Glu, Ile, Ser, Val oder Gly ist; X7 Lys ist; X8 Asn, Pro, Gly, Asp, Ala, Ser, His, Met, Val oder Leu ist; X9 Gln ist; X10 Trp ist; und X11 Phe, Thr, Ser, Ala, Asn, Val, His, Ile, Trp, Tyr, Leu oder Glu ist.
  6. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Polypeptid an CEA bindet, aber nicht an NCA bindet.
  7. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polypeptid einen Kd für CEA hat, der weniger als 7 μM ist.
  8. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das mit einem nachweisbaren Marker markiert ist.
  9. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das mit einem therapeutischen Mittel konjugiert ist.
  10. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 für die Verwendung als ein Medikament.
  11. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer mit CEA verbundenen Krankheit.
  12. Rekombinante Bakteriophage, die exogen DNA exprimiert, die kodiert für ein CEA bindendes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, umfassend: X1-X2-X3-Cys-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-CYS-X12-X13-X14 (SEQ ID NO: 111), wobei: X1 Asp, Asn, Ala oder Ile ist; X2 Trp ist; X3 Val, Ile, Met, Tyr, Phe, Pro oder Asp ist; X4 Asn, Glu, Asp oder Met ist; X5 Leu, Phe, Tyr, Trp, Val, Met, Ile oder Asn ist; X6 Phe, Leu, Asp, Glu, Ala, Ile, Lys, Asn, Ser, Val, Trp, Tyr, Gly oder Thr ist; X7 Lys, Phe, Asp, Gly, Leu, Asn, Trp, Ala, Gln oder Thr ist; X8 Asn, Pro, Phe, Gly, Asp, Ala, Ser, Glu, Gln, Trp, His, Arg, Met, Val oder Leu ist; X9 Gln, Lys, Leu oder Gly ist; X10 Trp, Ala oder Tyr ist; X11 Phe, Thr, Met, Ser, Ala, Asn, Val, His, Ile, Pro, Trp, Tyr, Gly, Leu oder Glu ist; X12 Asn, Asp, Glu, Pro, Gln, Ser, Phe oder Val ist; X13 Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Gln, Ser, Met, Glu, Thr, Lys, Trp oder Arg; und X14 Leu, Met, Val, Tyr, Ala, Ile, Trp, His, Pro, Gln, Glu, Phe, Lys, Arg oder Ser ist, und wobei das bindende Polypeptid auf der Oberfläche des Bakteriophagen gezeigt wird.
  13. Rekombinante Bakteriophage nach Anspruch 12, wobei: X1 Asp, Asn, Ala oder Ile ist; X2 Trp ist; X3 Val, Ile, Met, Tyr, Phe, Pro oder Asp ist; X4 Asn, Glu oder Asp ist; X5 Leu, Phe, Tyr, Trp, Val, Met, Ile oder Asn ist; X6 Phe, Leu, Asp, Glu, Ala, Ile, Lys, Asn, Ser, Val, Trp oder Tyr ist; X7 Lys, Phe, Asp, Gly, Leu, Asn oder Trp ist; X8 Asn, Pro, Phe, Gly, Asp, Ala, Ser, Glu, Gln oder Trp ist; X9 Gln oder Lys ist; X10 Trp ist; X11 Phe, Thr, Met, Ser, Ala, Asn, Val, His, Ile, Pro, Trp oder Tyr ist; X12 Asn, Asp, Glu, Pro, Gln oder Ser ist; X13 Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Gln, Ser, Met, Glu, Thr, Lys oder Trp; und X14 Leu, Met, Val, Tyr, Ala, Ile, Trp, His, Pro, Gln, Glu, Phe, Lys oder Arg ist.
  14. Rekombinante Bakteriophage nach Anspruch 12, wobei: X4 Asn oder Glu ist; X5 Leu, Phe, Tyr, Trp oder Ile ist; X6 Phe, Leu, Asp, Glu, Ile, Ser, Val oder Gly ist; X7 Lys ist; X8 Asn, Pro, Gly, Asp, Ala, Ser, His, Met, Val oder Leu ist; X9 Gln ist; X10 Trp ist; und X11 Phe, Thr, Ser, Ala, Asn, Val, His, Ile, Trp, Tyr, Leu oder Glu ist.
  15. Rekombinante Bakteriophage nach Anspruch 12, wobei: X1 Asp oder Asn ist; X2 Trp ist; X3 Val, Ile oder Met ist; X4 Asn oder Glu ist; X5 Leu, Phe, Tyr, Trp oder Ile ist; X6 Phe, Leu, Asp, Glu, Ile, Ser, Val oder Gly ist; X7 Lys ist; X8 Asn, Pro, Gly, Asp, Ala, Ser, His, Met, Val oder Leu ist; X9 Gln ist; X10 Trp ist; X11 Phe, Thr, Ser, Ala, Asn, Val, His, Ile, Trp, Tyr, Leu oder Glu ist; X12 Asn oder Asp ist; X13 Val, Leu, Ile, Pro, Ala, Gln, Ser oder Met ist; und X14 Leu, Met, Val, Tyr, Trp, His, Gln, Arg oder Ser ist.
  16. Rekombinante Bakteriophage nach Anspruch 12, die exogen DNA exprimiert, die kodiert für eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Asn-Trp-Val-Cys-Asn-Leu-Phe-Lys-Asn-Gln-Trp-Phe-Cys-Asn-Ser-Tyr (SEQ ID NO: 4); Asp-Trp-Val-Cys-Glu-Asn-Lys-Lys-Asp-Gln-Trp-Thr-Cys-Asn-Leu-Leu (SEQ ID NO: 5); Asn-Trp-Asp-Cys-Met-Phe-Gly-Ala-Glu-Gly-Trp-Ala-Cys-Ser-Pro-Trp (SEQ ID NO: 6); Asp-Trp-Val-Cys-Glu-Lys-Thr-Thr-Gly-Gly-Tyr-Val-Cys-Gln-Pro-Leu (SEQ ID NO: 7); Asn-Trp-Phe-Cys-Glu-Met-Ile-Gly-Arg-Gln-Trp-Gly-Cys-Val-Pro-Ser (SEQ ID NO: 8); und Asp-Trp-Val-Cys-Asn-Phe-Asp-Gln-Gly-Leu-Ala-His-Cys-Phe-Pro-Ser (SEQ ID NO: 9).
  17. Rekombinante Bakteriophage nach Anspruch 13, die exogen DNA exprimiert, die kodiert für eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOs: 37–109 und 113–151.
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