CN112717136B - 一种治疗胃癌的药物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗胃癌的药物及其制备方法，所述药物含有序列如SEQ ID NO.1所示的多肽以及胃癌化疗药物，所述多肽与胃癌化疗药物通过共价键或非共价键进行结合。本发明治疗胃癌的药物通过由于含有胃癌靶向性多肽，能够与胃癌组织特异性结合且几乎不与正常胃粘膜结合，由此可以降低化疗药物的使用量，避免对正常组织的伤害，具有极高的临床应用价值。

Description

一种治疗胃癌的药物及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种治疗胃癌的药物及其制备方法，特别是涉及一种针对胃癌组织具有靶向性的治疗胃癌的药物及其制备方法。
背景技术
胃癌是起源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，估计全球每年有70万人死于胃癌，占据肿瘤致死率第二位。2005年我国胃癌发病率在男性中达37.1/10万，女性为17.4/10万胃癌发病总人数达到全世界的42％以上。我国每年新发胃癌患者达40万人，死亡人数达30万人。在卫生部组织的全国第二次死因调查中，我国胃癌的死亡率占到所有因癌症死亡人数的23.2％，是严重危害我国人民健康的疾病之一。
胃癌发病隐匿，近半数早期胃癌病人没有临床症状，仅部分有轻度消化不良等症状，如上腹隐痛不适、轻微饱胀、疼痛、恶心、嗳气等。胃癌尽管经过手术、放疗、化疗等积极治疗，各期总体5年生存率仍仅有30％左右。研究证明胃癌的发病受环境和遗传因素的影响，是多种基因和多种因素共同参与的复杂过程。目前胃癌发生和发展的分子机制尚未完全阐明。由于早期胃癌患者没有明显的临床症状，因此胃癌早期诊断率很低，多数胃癌患者被确诊时处于中晚期。由于中晚期胃癌患者手术治疗效果不佳，而且胃癌细胞化疗药物敏感性较低，导致其化疗效果差，胃癌患者5年生存率低于30％。化疗是中晚期胃癌重要的治疗手段，但是，胃癌细胞对化疗药物敏感性低常影响其化疗的效果，这是胃癌高致死率的重要原因之一。
发明内容
基于上述背景技术，本发明所要解决的技术问题在于一种治疗胃癌的药物及其制备方法，特别是对胃癌组织具有靶向性的药物。为了实现本发明的发明目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及一种治疗胃癌的药物，所述药物含有序列如SEQ ID NO.1所示的多肽以及胃癌化疗药物，所述多肽与胃癌化疗药物通过共价键或非共价键进行结合。
在本发明的一个优选实施方式中，所述胃癌化疗药物选自氟尿嘧啶、丝裂霉素、顺铂、奥沙利铂、阿霉素、依托泊苷、紫杉醇、草酸铂、拓扑酶抑制剂、希罗达中的一种或者多种；优选地，所述胃癌化疗药物选自奥沙利铂。
在本发明的一个优选实施方式中，所述奥沙利铂与多肽的重量比例为4-6:1。
在本发明的一个优选实施方式中，所述药物为注射制剂。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述药物含有或者不含有其它活性成分。
在本发明的另一方面，本发明还涉及所述药物的制备方法，所述药物通过将所述多肽与奥沙利铂混合孵育得到。
在本发明的另一方面，还涉及上述药物在制备治疗胃癌的药物中的应用。
在本发明的一个优选实施方式中，所述治疗胃癌的药物为靶向药物。
有益效果
本发明治疗胃癌的药物通过由于含有胃癌靶向性多肽，能够与胃癌组织特异性结合且几乎不与正常胃粘膜结合，由此可以降低化疗药物的使用量，避免对正常组织的伤害，具有极高的临床应用价值。
附图说明
图1为示出阳性噬菌体克隆的多个组织的免疫组化染色结果的图：(A)为胃癌组织、(B)为乳腺癌组织、(C)为结肠癌组织、(D)为正常胃组织。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1：人胃癌组织结合的噬菌体的淘选
具体采用的T7噬菌体随机肽库(购于NOVAGE公司)进行筛选，文库含量约为5.4×108Pfu/mL；噬菌体的宿主细胞采用大肠杆菌ER2738。
所采用的靶细胞为人胃癌细胞SGC7901，将正常培养的贴壁靶细胞用细胞刮刀刮下后用杜氏磷酸缓冲液洗涤，离心收集细胞沉淀。
所采用的噬菌体的淘选步骤为(共进行3轮梯度强度筛选)：
向靶细胞内加入3ml 20％DMEM内含10μL噬菌体肽库(＞1.0×106)，37℃水浴震荡孵育30min后，吸取上清转移至干净试管；将靶细胞加入所制备的上清液，37℃水浴震荡孵育1h，取出水浴产物后弃上清液；PBST洗涤后，用非特异性缓冲液0.2M Glycine-HCl(pH2.2)，1mg/ml BSA温和摇动＞10min以进行洗脱，将洗脱液收集后再用150μl1M Tris-HCl(pH 9.1)中和上述洗脱液，得到噬菌体淘洗液；
选取1μl进行滴度测定，将剩余的噬菌体淘洗液4℃贮存过夜，并在第二天侵染大肠杆菌ER2738进行扩增，然后进行下一轮的淘选。
经3轮筛选后，每轮筛选结果都由洗脱得到的噬菌体的滴度来评定，具体筛选结果如表1所示：
表1噬菌体淘选选择性富集情况
第一轮 第二轮 第三轮
PBST洗涤次数 5(tween0.5％) 6(tween1.0％) 8(tween2.0％)
噬菌体加入量(PFU) 5.4×10<sup>6</sup> 6.0×10<sup>6</sup> 6.1×10<sup>6</sup>
噬菌体回收量(PFU) 3.5×10<sup>2</sup> 2.9×10<sup>3</sup> 3.2×10<sup>4</sup>
回收率(％) 6.5×10<sup>-3</sup> 4.8×10<sup>-2</sup> 5.2×10<sup>-1</sup>
富集倍数 1 7.4 80
*回收率(％)＝(噬菌体回收量×100)/(噬菌体加入量)
*富集倍数：将第一轮的回收率定为1，后几轮的回收率分别与第一轮回收率的比值。可以看出与第1轮相比，第3轮的筛选，靶细胞回收的噬菌体滴度及回收率均增加非常显著，与人胃癌细胞结合的噬菌体得到了特异性富集。
2、阳性克隆的鉴定
1)ELISA检测鉴定阳性克隆
从经过三轮筛选的、滴度为104的多克隆噬菌体培养皿上挑选20个单克隆，扩增后选取其中10个单克隆用于即全细胞ELISA试验测定其与胃癌细胞BGC823的结合活性(以胃正常细胞作为对照，胃癌细胞和胃正常细胞接种ELISA板的密度为5×105，一抗为兔抗-M13抗体，二抗为羊抗兔抗体)。基于与胃癌细胞BGC823的结合活性的检测结果，第3号噬菌体多肽克隆的能够与胃癌细胞BGC823具有最高的亲和力。
2)免疫组化鉴定
以噬菌体多肽克隆当中与胃癌细胞BGC823具有最高亲和力的第3号噬菌体多肽进行下一步筛选，提取其单链DNA，并进行序列测定及氨基酸分析，获得其氨基酸序列为VLNDMPR(如SEQ.ID.NO.1所示)；合成该多肽，并进行与荧光素的连接，得到荧光连接的多肽，简称Fitc-VLN。
以所合成的多肽进行免疫组化染色检测(石蜡切片)，鉴定其与胃癌及其他癌组织的结合能力，鉴定结果如图1所示：
结果显示Fitc-VLN与胃癌组织(A)有特异性结合，而与乳腺癌组织(B)和结肠癌组织(C)结合较弱，不与正常胃组织(D)结合。上述实验结果证明该多肽对胃癌具有较高的亲和力和特异性。
3)细胞实验
将胃癌细胞SGC7901、乳腺癌细胞MCF7和人宫颈癌细胞Hela正常培养到96孔板中。分别加入不同浓度的奥沙利铂、奥沙利铂+VLNDMPR(重量比例为5:1，超声混合均匀之后孵育15min)，以不添加任何药物的细胞系为空白对照组。37℃、5％CO2培养箱中培养48h后，加入MTT 20μL(5mg/mL)作用4h，吸去培养液，加入DMSO 100μL，15min后用酶标仪在492nm波长下测定每孔的吸光值(A值)，计算药物的细胞抑制率。细胞抑制率＝[1-(实验组A值/空白对照组A值)]×100％。实验结果如下表2所示。
表2：细胞抑制率实验结果(x±s，％)
Figure BDA0002944416160000041
从上述实验结果可以看出，VLNDMPR的加入有助于奥沙利铂对胃癌细胞SGC7901的抑制，相比较而言，对于乳腺癌细胞MCF7和人宫颈癌细胞Hela的抑制提升不明显。由此进一步说明，VLNDMPR对于胃癌细胞具有靶向作用。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
序列表
<110> 黑龙江中医药大学
<120> 一种治疗胃癌的药物及其制备方法
<130> CP2021048
<141> 2021-02-19
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Val Leu Asn Asp Met Pro Arg
1 5

Claims (7)

1.一种治疗胃癌的药物，所述药物含有序列如SEQ ID NO.1所示的多肽以及胃癌化疗药物，所述多肽与胃癌化疗药物通过共价键或非共价键进行结合，所述胃癌化疗药物为奥沙利铂。
2.根据权利要求1所述的药物，所述奥沙利铂与多肽的重量比例为4-6:1。
3.根据权利要求1所述的药物，所述药物为注射制剂。
4.根据权利要求1所述的药物，所述药物含有或者不含有其它活性成分。
5.权利要求1-4任意一项所述药物的制备方法，所述药物通过将所述多肽与奥沙利铂混合孵育得到。
6.权利要求1-4任意一项所述药物在制备治疗胃癌的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述治疗胃癌的药物为靶向药物。
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