CN103145803A - 一种与乳腺癌脑转移细胞特异性结合的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与乳腺癌脑转移细胞特异性结合的BrBP1多肽，本发明还涉及制备该多肽的方法，包括采用噬菌体展示技术，进行多轮全细胞消减筛选，筛选出与乳腺癌脑转移细胞系结合的噬菌体克隆；随机挑出若干个噬菌体克隆，通过细胞ELISA方法选择强阳性噬菌体克隆；将强阳性噬菌体克隆扩增后进行测序，将测得的BrBP1多肽通过人工方式合成。本发明还涉及该多肽在制备用于治疗乳腺癌脑转移药物、用于乳腺癌脑转移早期诊断的试剂盒上的应用。该多肽可通过人工方法合成，分子量小、活性高、穿透力强、亲和力高、特异性高、毒性低，在体内体外都具有良好的肿瘤靶向性，还可内化进入细胞，适合作为靶向治疗的载体。

Description

一种与乳腺癌脑转移细胞特异性结合的多肽

技术领域

本发明涉及一种用于治疗肿瘤的多肽，特别是一种与乳腺癌脑转移细胞特异性结合的多肽，本发明还涉及制备该多肽的方法，以及该多肽在制备治疗乳腺癌脑转移药物、制备用于乳腺癌脑转移早期诊断试剂盒上的应用。

背景技术

乳腺癌是一种严重危害女性健康的恶性肿瘤。全球乳腺癌患病率和死亡率均居女性恶性肿瘤首位，占所有女性癌症病例数的23%和癌症死亡数的14%。乳腺癌发展到晚期的典型表现是远处扩散转移，主要转移到骨骼和脑等部位。其中，乳腺癌脑转移的发生率占转移病例的10%-16%。近年来，随着患者生存期的延长和影像诊断技术的发展，乳腺癌脑转移的检出率逐年提高。但是，现有的药物不能有效控制和治疗乳腺癌脑转移。

近年来，抗体药物治疗肿瘤受到广泛的关注，在治疗乳腺癌方面，单克隆抗体类药物—赫赛汀，对Her-2阳性的转移性乳腺癌有较好的疗效。对于Her-2阳性的乳腺癌患者，放疗联合赫赛汀治疗是标准治疗方法。但是，在诊断出远处转移灶前使用赫赛汀非但不能有效抑制脑转移发生，还会使脑转移的相对危险度提高1.57倍。据报道，在诊断出乳腺癌脑转移之后，50%的患者对化疗敏感，转移症状稳定，但是有一半患者死于进行性脑转移。赫赛汀在脑部有效性较差可能由于赫赛汀对血脑屏障渗透性较低。在脑脊液中赫赛汀的水平仅是注射剂量的1/420,放疗后浓度增加到1/49-1/76，但仍然不能达到有效治疗水平。

多肽药物分子量小、活性高、穿透力强、亲和力高、特异性高、毒性低，可以克服上述抗体治疗中存在的问题，目前还没有靶向治疗乳腺癌脑转移的多肽类药物。因此，发现能与乳腺癌脑转移细胞特异性结合的多肽，对乳腺癌脑转移的早期诊断和有效治疗具有极其重要的应用价值。专利CN101068935A公开了新的人基因B1194，A2282V1，A2282V2和A2282V3，它们的表达在乳腺癌中显著增加，这些基因及其编码的多肽可用于例如诊断乳腺癌，并作为开发抗乳腺癌药物的靶分子。专利CN101334411A公开了作用于治疗CXCR4受体介导的乳腺癌的多肽药物的筛选、修饰方法、标记及其应用。两篇专利文献虽然都是与治疗乳腺癌有关的多肽，但都未提及能和乳腺癌脑转移细胞特异性结合。

发明内容

发明目的：背景技术中提到虽然有专利文献涉及与治疗乳腺癌有关的多肽，但未提及能和乳腺癌脑转移细胞特异性结合的多肽，本发明的目的在于提供一种能与乳腺癌脑转移细胞特异性结合，还具有良好的肿瘤靶向性、可内化进入细胞的多肽。

本发明的另一个目的在于提供制备与乳腺癌脑转移细胞特异性结合的多肽的方法。

本发明的另一个目的是提供上述多肽在制备用于治疗乳腺癌药物的应用。

本发明的另一个目的是提供上述多肽在制备用于乳腺癌脑转移早期诊断的试剂盒的应用。

技术方案：本发明的目的是通过如下技术方案来实现的。

本发明制备与乳腺癌脑转移细胞特异性结合的多肽，利用噬菌体展示技术，以乳腺癌脑转移细胞系MDA-231BR作为正筛细胞，以乳腺癌亲代细胞系MDA-231P作为负筛细胞，进行多轮全细胞消减筛选，筛选出与乳腺癌脑转移细胞特异性结合的噬菌体克隆。

噬菌体单克隆化后通过细胞ELISA初步鉴定120个噬菌体克隆与细胞结合特性，选取P/N值大于3的强阳性克隆进行测序，成功测序的22个噬菌体克隆共发现3种序列，将其中占有绝对优势的噬菌体克隆的氨基酸序列命名为BrBP1，经测序，其基因序列如SEQ IDNO:1所示，将所测的BrBP1序列经过人工合成方法得到与乳腺癌脑转移细胞特异性结合的BrBP1多肽。

本发明通过ELISA鉴定噬菌体克隆与多种细胞系的结合，证实了噬菌体克隆与乳腺癌脑转移细胞结合的特异性，通过竞争抑制实验进一步鉴定噬菌体克隆与乳腺癌脑转移细胞结合的特异性。

本发明还分别从体外细胞水平和体内水平鉴定了噬菌体克隆与靶细胞结合的特异性。

本发明还进一步证实了所述多肽可内化进入细胞，且呈现孵育时间依赖性。

本发明所述的多肽可内化进入细胞，偶联抗肿瘤药物后可进入肿瘤细胞内杀伤靶细胞，大大增强抗肿瘤效果，可用于制备治疗乳腺癌药物。

本发明所述的多肽通过与乳腺癌脑转移细胞特异性结合，可制备试剂盒用于乳腺癌脑转移早期诊断。

有益效果：与现有技术相比，本发明的有益效果有，

1、本发明筛选得到了一种与乳腺癌脑转移细胞特异性结合的多肽，填补了目前缺乏与乳腺癌脑转移细胞结合的多肽的空白；

2、本发明筛选得到多肽为可通过人工方法合成的小分子多肽，分子量小、活性高、穿透力强、亲和力高、特异性高、毒性低，适合作为靶向治疗的载体；

3、本发明筛选得到的多肽在体外和体外均具有良好的肿瘤靶向性，为该多肽的临床前深入研究奠定了坚实的基础；

4、本发明筛选得到的多肽可内化进入细胞，偶联抗肿瘤药物后可进入肿瘤细胞内杀伤靶细胞，大大增强抗肿瘤效果。

附图说明

图1是细胞ELISA检测的120个噬菌体单克隆的P/N比值图；

图2是ELISA检测Phage89、VCSM13噬菌体克隆与不同肿瘤及正常细胞系亲和力对比柱状图；

图3是BrBP1特异肽、Control对照肽竞争抑制Phage89与MDA-231BR结合的实验结果图；

图4是荧光标记肽BrBP1-K（5-TAMRA）、Control-K（5-TAMRA）与细胞系MDA-231BR、HL-7702结合情况的细胞免疫荧光图（放大倍数400×）；

图5A是不同浓度BrBP1-K（5-TAMRA）与MDA-231BR结合的流式结果图；

图5B是不同浓度Control-K（5-TAMRA）与MDA-231BR结合的流式结果图；

图5C是定量分析图5A和5B不同浓度BrBP1-K（5-TAMRA）、Control-K（5-TAMRA）与MDA-231BR结合的阳性细胞百分含量图；

图6是BrBP1竞争抑制BrBP1-K（5-TAMRA）与MDA-231BR结合的共聚焦显微镜结果图（放大倍数400×）；

图7是体内回输实验中噬菌体克隆Phage89及VCSM13在肿瘤及正常组织器官回收噬菌体滴度比值图；

图8是近红外荧光标记肽BrBP1-K（Cy5.5）、Control-K（Cy5.5）不同时间点的近红外活体成像图；

图9是荧光标记肽BrBP1-K（5-TAMRA）、Control-K（5-TAMRA）与MDA-231BR孵育不同时间的内化情况图（放大倍数400×）。

具体实施方式

本发明实施例中所用实验材料、主要试剂及配方如下：

主要实验材料：

1、细胞株：乳腺癌脑转移细胞系MDA-231BR和乳腺癌亲代细胞系MDA-231P由美国国家癌症研究所惠赠。乳腺癌细胞系MCF-7、卵巢癌细胞系SK-OV-3、胰腺癌细胞系PANC-1、胃癌细胞系BGC-823、结肠癌细胞系HT-29、前列腺癌细胞系PC-3、肝癌细胞系SMMC7721、人胚胎肝细胞系HL-7702、人胃粘膜永生化细胞系GES-1、人胚胎肾细胞系293T均购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；

2、噬菌体展示12肽库Ph.D.-12及宿主菌ER2738：购自New England Biolabs；

3、裸鼠：购自军事医学科学院。

主要试剂及配方：

主要试剂：

1、细胞培养试剂：胎牛血清（GIBCO）、DMEM培养基(GIBCO)、DMS（Sigma）；

2、噬菌体展示肽库筛选主要试剂：X-gal、DMF、NaN₃、Tween-20、BSA、甘氨酸、四环素均购自Amresco；蛋白胨、酵母提取物购自OXOID；

3、特异性鉴定主要试剂：HRP标记鼠抗M13抗体(GE Healthcare)、Alexa Fluor 555标记羊抗鼠抗体（Invitrogen）。

主要试剂配方：

1、LB培养基：每升含10g Bacto-Tryptone，5g yeast extract,5g NaCl。高压灭菌，室温贮存；

2、LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1ml IPTG/Xgal，混匀倒平板。平板4℃避光贮存；

3、顶层琼脂：每升含10g Bacto-Tryptone，5g yeast extract,5g NaCl,1g MgCl₂·6H₂O,7g琼脂粉。高压灭菌，分成50ml等份。固体培养基室温贮存，用时微波炉融化；

4、四环素贮液：以20mg/ml的浓度溶于50%乙醇中，-20℃避光贮存，用前摇匀；

5、LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1ml四环素贮液，混匀倒平板，平板4℃避光贮存；

6、封阻缓冲液：0.1M NaHCO₃(pH 8.6),5mg/ml BSA,0.02% NaN₃，过滤除菌，4℃存；

7、TBS:50mM Tris-HCl(pH 7.5),150mM NaCl，高压灭菌，室温贮存；

8、PBS：每升含NaCl 8.00g，KCl 0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g，KH₂PO₄ 0.24g，PH=7.2，高压灭菌，室温存储；

9、PEG/NaCl:20%(w/v)PEG-8000,2.5M NaCl，高压灭菌，室温贮存；

10、碘化物缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA,4M NaI。室温避光贮存；

11、IPTG/X-gal配方：将1.25g IPTG(isopropyl β–D-thiogalactoside)和1g X-gal溶于25ml二甲基甲酰胺中。溶液-20℃避光贮存；

12、TMB显色液：

A液：每升含18.41g Na₂HPO₄·12H₂O，5.10g柠檬酸，0.60g过氧化氢尿素，PH=5.0；

B液：EDTA·2Na 0.146g，柠檬酸0.15g溶于800ml蒸馏水，逐滴加入TMBC（0.1gTMB+10ml无水乙醇），定容至1L；

工作液：A液和B液1:1混匀，避光操作，现用现配。

实施例1BrBP1多肽的筛选和制备

本发明通过下述方法和步骤筛选和制备BrBP1多肽。

1、与乳腺癌脑转移细胞系结合的噬菌体克隆的初步筛选

采用噬菌体展示技术，进行多轮全细胞消减筛选，初步筛选出与乳腺癌脑转移细胞系MDA-231BR结合的噬菌体克隆，具体步骤如下：

第一轮筛选，仅以乳腺癌脑转移细胞系MDA-231BR进行正筛。乳腺癌脑转移细胞系MDA-231BR细胞用胰酶消化后，调整细胞密度至2.5×10⁵/ml，接种于细胞培养皿（60×15mm³），待细胞生长至80%-90%融合度时，进行筛选。

筛选具体步骤如下：

（1）封闭：用移液器吸出上述MDA-231BR细胞培养皿中培养基，用1×TBS洗涤细胞3次后，加入无血清DMEM继续培养2h。再去除无血清DMEM，加入0.5%[m/v]BSA/TBS的封闭液，37℃封闭1h；

（2）孵育：去除封闭液，加入1×10¹¹pfu噬菌体12肽库，37℃温和摇动1h；

（3）洗涤：去除上清，用TBST（TBS+0.1%[v/v]Tween-20）缓冲液洗涤6次；

（4）洗脱：用非特异性洗脱缓冲液0.2M Glycine-HCl（PH 2.2）,1mg/ml BSA室温下温和摇动10min，洗脱液收集后加入150ul1M Tris-HCl（PH 9.1）中和；

（5）扩增：洗脱液测定度后剩余洗脱液加入处于对数生长前期的20ml ER2738培养物中进行扩增，用于下一轮筛选。

第二轮筛选，先以乳腺癌亲代细胞系MDA-231P进行负筛，再用乳腺癌脑转移细胞系MDA-231BR进行正筛。在孵育环节，先将第一轮筛选的次级库与MDA-231P孵育1h后，洗涤2次后，上清及洗涤液加入MDA-231BR进行孵育1h。同时，在本轮筛选中，负筛洗涤液TBST中Tween-20浓度为0.5%，正筛筛洗涤液TBST中Tween-20浓度为0.3%，正筛洗涤8次。

第三轮筛选，先以乳腺癌亲代细胞系MDA-231P进行负筛，再用乳腺癌脑转移细胞系MDA-231BR进行正筛。在孵育环节，先将第二轮筛选的次级库与MDA-231P孵育1h后，洗涤1次后，上清及洗涤液加入MDA-231BR进行孵育1h。同时，在本轮筛选中，负筛洗涤液TBST中Tween-20浓度为0.3%，正筛筛洗涤液TBST中Tween-20浓度为0.5%，正筛洗涤10次。

第四轮筛选，先以乳腺癌亲代细胞系MDA-231P进行负筛，再用乳腺癌脑转移细胞系MDA-231BR进行正筛。在孵育环节，先将第三轮筛选的次级库与MDA-231P孵育1h后，上清加入MDA-231BR中孵育1h。同时，在本轮筛选中，负筛洗涤液TBST中Tween-20浓度为0.1%，正筛筛洗涤液TBST中Tween-20浓度为0.5%，正筛洗涤10次。

在LB/IPTG/Xgal平板上测定第四轮淘选所得洗脱物滴度。从第四轮筛选所得洗脱物滴度板上用灭菌牙签或吸头挑取120个蓝色噬菌斑到至1ml对数生长前期的ER2738培养管中，扩增单克隆噬菌体。

根据每轮筛选噬菌体洗脱液的滴度，计算得率及富集度。得率=回收噬菌体数/投入噬菌体数。富集度=第n轮筛选得率/第n-1轮筛选得率（n≥2）。

整个筛选过程的选择压及富集情况如表1所示，四轮筛选，每一轮的得率较上一轮都有不同程度提高，四轮筛选后，与乳腺癌脑转移细胞系结合的噬菌体克隆合计富集了43.9倍。

表1与乳腺癌脑转移细胞系结合的多肽筛选的选择压控制及噬菌体克隆的富集情况

2、通过细胞ELISA初步鉴定噬菌体阳性克隆

上述实验随机挑出120个噬菌体克隆，通过细胞ELISA方法初步鉴定120个噬菌体克隆与乳腺癌脑转移细胞系MDA-231BR的结合水平。

将MDA-231BR按1×10⁴/孔密度接种于96孔板，培养24h后，无血清处理1h，用PBS冲洗3次，后用4%多聚甲醛/PBS室温固定细胞20min。加入2%脱脂奶粉/PBS封闭1h，然后加入1×10¹⁰pfu噬菌体单克隆37℃孵育1h。洗涤6次后加入HRP标记的鼠抗M13抗体，37℃孵育1h。洗涤6次后，加入100ul/孔TMB显色10min，加入2M H₂SO₄终止反应，用酶标仪检测OD450nm吸光度。本实验用不携带任何外源插入片段的空噬菌体VCSM13作为阴性对照。实验设置3个复孔，重复3次。

实验结果如图1所示，图中噬菌体单克隆编号为随机挑取的120个噬菌体单克隆的编号，P/N比值=噬菌体单克隆与MDA-231BR结合的OD450nm值/VCSM13与MDA-231BR结合的OD450nm值，图1将P/N比值直观的以灰度深浅表示，灰度越深表示P/N越大。由图1可见，不同噬菌体克隆与MDA-231BR具有不同程度的亲和力。在这120个克隆中，选择P/N≥3的强阳性克隆进行下一步实验。

3、DNA提取及测序

噬菌体克隆扩增后，离心去除细菌，取500ul噬菌体上清加入200ul PEG/NaCl，混匀室温静置10min，4℃14000rpm/min离心10min，沉淀物彻底重悬于100ul碘化物缓冲液，加250ul乙醇，室温温育10min后，离心10min，弃上清，用70%乙醇洗沉淀，短暂真空干燥后沉淀重悬于30ul TE，进行测序。

本实验测序均由华大基因完成。测序引物为5’-^HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’。

利用SeqMan软件分析噬菌体克隆测序结果，并根据遗传密码表将碱基序列翻译为氨基酸序列。统计发现测序成功的22个噬菌体克隆共有3种序列，其中有16个噬菌体克隆携带外源插入序列如SEQ ID NO:1所示，占72.7%，命名为BrBP1。

4、BrBP1多肽的合成

所述BrBP1多肽由吉尔生化（上海）有限公司按照上述氨基酸序列用化学方式人工合成，合成产物通过高效液相色谱（HPLC）纯化，经质谱(MS)鉴定，所述合成多肽的纯度均在98%以上。

实施例2BrBP1多肽的生物信息学分析

本实施例利用ExPASy网站提供的ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）分析上述BrBP1多肽理化性质。如表2所示，该多肽分子量为1487.6，理论等电点为4.00,是由199个原子构成，消光系数为5.700，在哺乳动物网织红细胞半衰期约为30h，该多肽不稳定，亲脂性指数为32.50，总平均疏水性为-0.858。

表2BrBP1理化特征分析

实施例3BrBP1多肽与乳腺癌脑转移细胞系结合的特异性

1、通过ELISA鉴定噬菌体克隆与多种细胞系的结合情况

本实验选取携带BrBP1片段的89号噬菌体克隆（命名为Phage89），通过ELISA鉴定Phage89与不同细胞系的结合能力。将乳腺癌脑转移细胞MDA-231BR、乳腺癌亲代细胞系MDA-231P、乳腺癌细胞系MCF-7、卵巢癌SK-OV-3、胰腺癌PANC-1、胃癌BGC-823、结肠癌HT-29、前列腺癌PC-3、肝癌SMMC7721细胞、人胚胎肝细胞系HL-7702、人胃粘膜永生化细胞系GES-1、人胚胎肾细胞系293T胰酶消化后按1×10⁴/孔密度接种于96孔板，培养24h后，无血清处理1h，用PBS冲洗3次，后用4%多聚甲醛/PBS室温固定细胞20min。加入2%脱脂奶粉/PBS封闭1h，然后加入1×10¹⁰pfu噬菌体单克隆37℃孵育1h。洗涤6次后加入HRP标记的鼠抗M13抗体，37℃孵育1h。洗涤6次后，加入100ul/孔TMB显色10min，加入2M H₂SO₄终止反应，用酶标仪检测OD450nm吸光度。本实验用空噬菌体VCSM13作为阴性对照。实验设置3个复孔，重复3次。

实验结果如图2所示，Phage89与乳腺癌脑转移细胞系MDA-231BR结合水平高，而与乳腺癌亲代细胞系MDA-231P结合水平较低，与自发转移能力较低的细胞系MCF-7不结合，与卵巢癌细胞系SK-OV-3、胰腺癌细胞系PANC-1、胃癌细胞系BGC-823、结肠癌细胞系HT-29、前列腺癌细胞系PC-3、肝癌细胞系SMMC7721细胞不结合，与人胚胎肝细胞系HL-7702、人胃粘膜永生化细胞系GES-1、人胚胎肾细胞系293T不结合。这一结果说明所筛选得到的噬菌体克隆是靶向乳腺癌细胞系，尤其与脑转移细胞系有更高的结合水平。

2、竞争抑制实验进一步鉴定噬菌体克隆与乳腺癌脑转移细胞结合的特异性

化学合成BrBP1多肽及其对照肽Control（GGGAGGGAGGGA），用于多肽-噬菌体克隆竞争抑制实验。

将乳腺癌脑转移细胞MDA-231BR胰酶消化后按1×10⁴/孔密度接种于96孔板，培养24h后，无血清处理1h，用PBS冲洗3次，后用4%多聚甲醛/PBS室温固定细胞20min。加入2%脱脂奶粉/PBS封闭1h。将BrBP1及Control肽自1×10^-4mol/L起2倍梯度稀释14个梯度后分别加入已封闭96孔板与MDA-231BR细胞37℃孵育1h，然后加入1×10¹⁰pfu噬菌体单克隆Phage89及空噬菌体VCSM13置37℃孵育1h。洗涤6次后加入HRP标记的鼠抗M13抗体，37℃孵育1h。洗涤6次后，加入100ul/孔TMB显色10min，加入2M H₂SO4终止反应，用酶标仪检测OD450nm吸光度。实验设置3个复孔，重复3次。

多肽-噬菌体克隆竞争抑制实验结果如图3所示，BrBP1及Control肽自1×10^-4mol/L起2倍梯度稀释14个梯度，随着BrBP1多肽浓度的递减，与MDA-231BR结合的噬菌体克隆逐渐增多，OD450nm值逐渐增高。计算BrBP1半数抑制率IC50为6.83×10^-6mol/L。当多肽浓度降至1.95×10^-7mol/L（2^-9稀释级）以下时，对Phage89与MDA-231BR结合的抑制作用已经非常微弱，近乎为0。而随着Control肽浓度的变化，Phage89与MDA-231BR的结合水平不变，说明Control肽对Phage89与MDA-231BR结合没有影响。

实施例4BrBP1多肽在体外与乳腺癌脑转移细胞系结合的特异性

本实施例将BrBP1多肽化学合成并标记5-TAMRA荧光后，在体外鉴定多肽与MDA-231BR结合的亲和力及特异性。

1、多肽荧光标记

化学合成BrBP1多肽及其对照肽Control（GGGAGGGAGGGA），BrBP1及Control肽C端增加一个赖氨酸K，通过其侧链羟基与5-TAMRA荧光染料连接。标记荧光BrBP1及Control肽分别表示为BrBP1-K（5-TAMRA）和Control-K（5-TAMRA）。上述多肽的化学合成由吉尔生化（上海）有限公司完成，通过高效液相色谱（HPLC）纯化，经质谱(MS)鉴定，所有5-TAMRA荧光标记肽的纯度均在98%以上。

2、BrBP1多肽与不同细胞系结合能力

将乳腺癌脑转移细胞MDA-231BR、人胚胎肝细胞系HL-7702胰酶消化后按5×10⁴/孔密度接种于24孔板，培养24h后，用PBS冲洗3次，然后分别加入1×10^-6mol/L的BrBP1-K（5-TAMRA）和Control-K（5-TAMRA）37℃孵育20min。洗涤3次后用4%多聚甲醛/PBS室温固定细胞20min。洗涤3次，加入DAPI于37℃染细胞核15min，洗涤3次后于倒置荧光显微镜观察。实验设置3个复孔，重复3次。其中，荧光染料5-TAMRA的Abs/Em=555/565nm，DAPI Abs/Em=350/457nm。

图4为BrBP1-K（5-TAMRA）、Control-K（5-TAMRA）与MDA-231BR、HL-7702结合荧光图。其中A为荧光标记肽BrBP1-K（5-TAMRA）与细胞系MDA-231BR结合荧光图，B为荧光标记肽Control-K（5-TAMRA）与细胞系MDA-231BR结合荧光图，C为荧光标记肽BrBP1-K（5-TAMRA）与细胞系HL-7702结合荧光图，D为荧光标记肽Control-K（5-TAMRA）与细胞系HL-7702结合荧光图，可见BrBP1-K（5-TAMRA）能与MDA-231BR结合但不与HL-7702结合，说明其结合具有特异性。

3、流式细胞术证明BrBP1多肽在体外与乳腺癌脑转移细胞系结合的特异性

将乳腺癌脑转移细胞MDA-231BR胰酶消化后调整细胞浓度1×10⁵/ml，用PBS冲洗3次，然后分别加入0.25×10^-6mol/L、1×10^-6mol/L、4×10^-6mol/L、16×10^-6mol/L的BrBP1-K（5-TAMRA）和Control-K（5-TAMRA）37℃孵育1h。洗涤3次后，上机检测。实验重复3次。

本实验结果如图5A、5B、5C所示，其中图5A、图5B分别为不同浓度BrBP1-K（5-TAMRA）和Control-K（5-TAMRA）与MDA-231BR结合的流式结果图。由图5A可见，随着BrBP1-K（5-TAMRA）浓度增高，阳性细胞百分数在增加，图5B显示Control-K（5-TAMRA）浓度增加，但仍然没有阳性结合细胞。图5C为阳性细胞百分含量随荧光肽浓度变化图，可见随BrBP1-K（5-TAMRA）浓度升高，BrBP1-K（5-TAMRA）结合阳性的MDA-231BR细胞的百分比上升，当浓度为16×10^-6mol/L时，阳性细胞百分比为64.21%。计算BrBP1-K（5-TAMRA）与MDA-231BR细胞结合的解离常数为Kd=0.9344×10^{- 6}mol/L。而Control-K（5-TAMRA）不与MDA-231BR结合。

4、竞争抑制实验进一步证明BrBP1多肽在体外与乳腺癌脑转移细胞系结合的特异性

本实验利用共聚焦显微镜成像，共分为3组，分别为实验组（1×10^-6mol/L的BrBP1-K（5-TAMRA））、对照组(1×10^-6mol/L的Control-K（5-TAMRA）)、竞争组（1×10^-6mol/L的BrBP1-K（5-TAMRA）+1×10^-5mol/LBrBP1）。主要步骤如下：将乳腺癌脑转移细胞MDA-231BR胰酶消化后按5×10⁴/孔密度接种于激光共聚焦培养皿，培养24h后，无血清处理1h，用PBS冲洗3次，然后分别加入实验组、对照组、BrBP1竞争组37℃孵育20min。洗涤3次后用4%多聚甲醛/PBS室温固定细胞20min。洗涤3次，加入DAPI于37℃染细胞核15min，洗涤3次后于激光共聚焦显微镜观察。实验设重复3次。其中，荧光染料5-TAMRA的Abs/Em=555/565nm，DAPI Abs/Em=350/457nm。

本实验结果如图6所示，其中A为实验组多肽（1×10^-6mol/L的BrBP1-K（5-TAMRA））与MDA-231BR的结合情况，B为竞争组多肽（1×10^-6mol/L的BrBP1-K（5-TAMRA）+1×10^-5mol/L BrBP1）与MDA-231BR结合的情况。当BrBP1浓度为BrBP1-K（5-TAMRA）浓度的10倍（1×10^-5mol/L）时，BrBP1已经能完全竞争抑制BrBP1-K（5-TAMRA）与MDA-231BR的结合。以上结果充分说明了BrBP1-K（5-TAMRA）与MDA-231BR结合的特异性。

实施例5BrBP1多肽在体内与乳腺癌脑转移细胞系结合的特异性

1、体内回输实验研究携带BrBP1多肽片段的噬菌体克隆在荷瘤鼠体内的生物学分布

构建荷瘤鼠：本专利中裸鼠购于军事医学科学院，均为4-5周龄雌鼠。裸鼠饲养于东南大学SPF级动物房。将MDA-231BR细胞胰酶消化后，调整细胞浓度5×10⁵/200ul/只，接种至裸鼠背部右侧皮下。每两日观察裸鼠成瘤情况并测定肿瘤体积，2-3周，肿瘤体积达到300-500mm³时用于实验。肿瘤体积=1/2长×宽²。

体内回输实验：尾静脉注射1×10¹¹pfu噬菌体,循环15min后乙醚麻醉，右心室PBS灌流200ml以上，解剖，分离裸鼠肿瘤、心、肝、肺、肾、脑，称重后组织匀浆，释放噬菌体。测定噬菌体滴度。计算并比较单位质量的组织中噬菌体的滴度值。本实验中实验组注射Phage89（携带BrBP1片段的89号噬菌体克隆），对照组注射空噬菌体VCSM13，试验组和对照组均为4只裸鼠。

计算单位质量的肿瘤组织与单位质量的其他组织噬菌体滴度的比值，作图。如图7所示，Phage89在单位质量（g）肿瘤组织的滴度值与单位质量（g）心、肝、肺、肾、脑的滴度值之比分别为12.21、3.48、4.85、3.30、31.43，即肿瘤组织的滴度要高出其他组织器官2.30-30.43倍。而空噬菌体VCSM13在单位质量（g）肿瘤组织的滴度值与单位质量（g）心、肝、肺、肾、脑的滴度值之比分别为0.85、0.87、0.82、0.66、18.46。以上结果可以看出，不论Phage89还是VCSM13进入脑组织的噬菌体数量要远低于肿瘤及其他组织，这可能与血脑屏障限制了噬菌体的进入有关。Phage89在肿瘤组织的滴度要高于其他正常组织，而VCSM13则没有这种现象，这充分说明携带BrBP1插入片段的Phage89具有肿瘤的靶向性，而VCSM13不具有靶向性。

2、近红外活体成像鉴定BrBP1多肽在活体状态下的特异性

本实验中用荧光素Cy5.5标记BrBP1及Control肽，分别表示为BrBP1-K（Cy5.5）和Control-K（Cy5.5）。上述合成肽由生工生物工程（上海）有限公司完成，合成产物通过高效液相色谱（HPLC）纯化，经质谱(MS)鉴定，所有Cy5.5荧光标记肽的纯度均在95%以上。

构建荷乳腺癌脑转移细胞裸鼠模型，待肿瘤体积长至300-500mm³时用于实验。本实验共分为两组：实验组（尾静脉注射1nmol的BrBP1-K（Cy5.5））和对照组（尾静脉注射1nmol的Control-K（Cy5.5））。实验步骤如下：尾静脉注射实验组和对照组荧光标记多肽，异氟烷气麻后，将小鼠固定于CRi Maestro多光谱活体成像系统(CRi,Woburn,MA,USA)，分别检测30min和60min成像。其中，荧光染料Cy5.5的Abs/Em=673/707nm。

本实验结果如图8所示，在30min和60min，BrBP1-K（Cy5.5）在肿瘤部位的荧光信号明显高于对照组Control-K（Cy5.5）在肿瘤部位的荧光信号。实验组在30min时，肝脏也存在较强的荧光信号，但是随着时间延长，60min肿瘤部位的荧光信号要远远高于其他组织器官。由此说明，BrBP1-K（Cy5.5）在活体状态下，在体内也有良好的肿瘤靶向性。

实施例6BrBP1多肽孵育时间依赖性及细胞内化性研究

本实施例将多肽与MDA-231BR孵育时间进一步延长至1h，分析孵育不同时间多肽内化进入细胞的水平。具体实施步骤如下：

将乳腺癌脑转移细胞MDA-231BR胰酶消化后按5×10⁴/孔密度接种于24孔板，培养24h后，用PBS冲洗3次，然后分别加入1×10^-6mol/L的BrBP1-K（5-TAMRA）和Control-K（5-TAMRA）37℃孵育30min、45min、60min，洗涤3次后用4%多聚甲醛/PBS室温固定细胞20min。洗涤3次，加入DAPI于37℃染细胞核15min，洗涤3次后于倒置荧光显微镜观察。实验设置3个复孔，重复3次。其中，荧光染料5-TAMRA的Abs/Em=555/565nm，DAPI Abs/Em=350/457nm。

本实验结果如图9所示，其中A-C分别为BrBP1-K（5-TAMRA）与MDA-231BR孵育30min、45min、60min的内化情况荧光图，随着孵育时间延长，BrBP1-K（5-TAMRA）逐渐内化进入细胞。孵育30min，主要是细胞膜染色，而45min时细胞浆已经出现明显染色，60min时细胞核也出现明显染色。D-F为Control-K（5-TAMRA）与MDA-231BR孵育30min、45min、60min的染色情况，可见Control-K（5-TAMRA）不与MDA-231BR结合。因此，BrBP1-K（5-TAMRA）多肽可以内化进入细胞，且呈现孵育时间依赖性。

序列表

<110>东南大学

 

<120>一种与乳腺癌脑转移细胞特异性结合的多肽

 

<130>

 

<160>1

 

<170>PatentIn version 3.5

 

<210>1

 

<211>12

 

<212>PRT

 

<213>人(human)

 

<400>1

 

Met Tyr Pro Trp Thr Glu Pro Ser Tyr Leu Ser Asn

1                          5                                 10

 

Claims (4)

1.一种与乳腺癌脑转移细胞特异性结合的多肽，命名为BrBP1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种制备权利要求1所述的与乳腺癌脑转移细胞特异性结合的多肽的方法，其特征在于按以下步骤进行：

（1）采用噬菌体展示技术，进行多轮全细胞消减筛选，初步筛选出与乳腺癌脑转移细胞系结合的噬菌体克隆；

（2）随机挑出若干个噬菌体克隆，通过细胞ELISA方法初步鉴定挑选出的噬菌体克隆与乳腺癌脑转移细胞系的结合水平，并选择强阳性噬菌体克隆进行下一步实验；

（3）将上述强阳性噬菌体克隆扩增处理后进行测序，其中一种噬菌体克隆的氨基酸序列为权利要求1所述的BrBP1多肽；

（4）将上述BrBP1多肽通过人工方式合成。

3.权利要求1所述的与乳腺癌脑转移细胞特异性结合的多肽在制备用于治疗乳腺癌脑转移药物的应用。

4.权利要求1所述的与乳腺癌脑转移细胞特异性结合的多肽在制备用于乳腺癌脑转移早期诊断的试剂盒的应用。

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