CN110128513A - 一种对eb病毒lmp2蛋白c端胞膜外区具有结合亲和力的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽及其应用，首次揭示了一种对EBV LMP2蛋白C端胞外区具有结合亲和力的多肽；本发明还提供了该多肽作为药物或分子靶向试剂的诊断或治疗用途。

Description

一种对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽 及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地，本发明涉及一种对EB病毒LMP 2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽及其应用。

背景技术

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一种全球范围内广泛感染人类的疱疹病毒，是传染性单核细胞增多症的病原，并与鼻咽癌(NPC)、口腔腺体肿瘤、淋巴瘤、何杰金氏病、胃癌以及器官移植后的B细胞淋巴瘤、艾滋病相关的淋巴瘤等密切相关。据统计全世界鼻咽癌病例中约80％发生于我国，尤其我国南方为高发区，但至今尚无有效的疫苗和特异性的防治方法。分子流行病学研究和血清学普查表明，几乎100％未分化和低分化NPC患者感染EB病毒；且运用PCR技术证实，在低分化和高分化的鼻咽癌组织中均能够检测到EBV的基因组及其表达的蛋白。EBV潜伏感染时，主要表达六种核蛋白(EBNA)和潜伏膜蛋白(Latentmembrane protein，LMP)1和2。LMP1为EBV恶性转化基因，可诱导B淋巴细胞转化；而LMP2本身不是致癌基因，但通过调控由B细胞受体引起的蛋白质酪氨酸磷酸化，阻断B细胞受体引起的信号通路转导，从而阻止EB病毒进入增殖期，控制EB病毒的潜伏感染程度，对于B细胞的信号通路和增殖发挥着重要的影响。其主要作用是维持EB病毒的潜伏感染状态。因此，LMP2是EBV相关肿瘤预防和治疗研究的理想靶抗原之一。LMP2是EBV感染的B细胞或某些上皮细胞潜伏感染过程中表达于细胞膜的蛋白，持续并稳定地在EBV相关肿瘤组织中呈高表达，因此是EBV诊断和治疗研究的理想靶抗原之一。

靶向治疗是目前肿瘤治疗中最具希望的方法和策略，主要以表皮生长因子受体(EGFR)和肿瘤血管生成为靶点进行治疗，如EGFR单克隆抗体(HER2单抗)、小分子化合物酪氨酸激酶拮抗剂(赫赛汀和西妥昔单抗等)、贝伐单抗及舒尼替尼等，通过特异性阻断肿瘤细胞的信号传导或是通过封闭受体阻止肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤细胞生长或促使肿瘤细胞凋亡。但基于抗体分子的靶向治疗仍然存在其应用的局限性，如渗透性差、成本昂贵、具有较强的免疫原性和毒副反应严重等有待进一步研究改善。尤其毒副作用产生的毒性效应已经成为发展针对肿瘤治疗性抗体的主要障碍，产生肝、肾及神经系统毒性而使其功能降低。用同位素标记抗体进行放射性免疫治疗也会导致骨髓抑制等。

基于上述说明，本领域仍然亟待研究靶向性治疗EBV感染及其相关肿瘤的新药物或新方法，以改善目前临床现状。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对EB病毒LMP2具有结合亲和力的多肽及其用途。

本发明的第一方面，提供一种对EB病毒LMP2蛋白具有结合亲和力的多肽，该多肽是以如SEQ ID NO:1所示的葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个氨基酸变异后获得的多肽。

在一个优选例中，所述对EB病毒LMP2蛋白具有结合亲和力的多肽在如SEQ ID NO:1所示的葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列的第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35，43位上发生氨基酸突变。

在另一优选例中，相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，所述对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽的：

第9位氨基酸突变为S、V、H或A；

第10位氨基酸突变为A、R或L；

第11位氨基酸突变为A、S、F或R；

第13位氨基酸突变为P、V、L或R；

第14位氨基酸突变为R、V、W或G；

第17位氨基酸突变为S、L、M或A；

第18位氨基酸突变为M、L或W；

第24位氨基酸突变为L、Q、H或E；

第25位氨基酸突变为G、Q或E；

第27位氨基酸突变为Q、L、E或D；

第28位氨基酸突变为A、Q、L或E；

第32位氨基酸突变为R、D或P；

第35位氨基酸突变为A、R、G或H；

第43位氨基酸突变为E。

在另一优选例中，所述对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2-5任一所示。

在另一优选例中，所述对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽与EB病毒LMP2蛋白相互作用的KD值为1.28×10-5M至1.25×10-7M。

在本发明的另一方面，提供一种靶向EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区的靶向性分子，所述靶向性分子包括前面任一所述多肽，以及与该多肽相连接的偶联物，所述偶联物包括但不限于：半胱氨酸残基或多肽标签或抗癌活性的物质或可检测标记物；该可检测标记物包括但不限于：荧光标记、酶、生物素或放射性同位素。

在另一优选例中，所述多肽标签包括但不限于：His标签或Myc标签或GST标签或Flag标签；所述His标签可具体选择6×His。

在另一优选例中，所述酶包括但不限于：碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

在另一优选例中，所述抗癌活性的物质包括但不限于：用本发明多肽引导效应酶：羧肽酶；用于募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白：IL-2、IFNγ、IL-12、TNFα、IP10；促凝血因子，组织因子、von Willebrand因子；毒素；细胞毒性药物：auristatin类似物、阿霉素、放射性同位素。

毒素；较佳地，所述毒素是具有抑制EB病毒LMP2蛋白阳性肿瘤作用的毒素，包括但不限于白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素或所述白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素的功能性片段；所述肿瘤是EB病毒LMP2蛋白阳性的肿瘤。

在另一优选例中，所述抑抗癌活性的物质是绿脓杆菌外毒素A或绿脓杆菌外毒素A的活性片段PE38KDEL。较佳地，该绿脓杆菌外毒素A或绿脓杆菌外毒素A的活性片段PE38KDEL连接于所述对EB病毒LMP2蛋白具有结合亲和力的多肽的羧基末端(C末端)。

在另一优选例中，所述偶联物与所述对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽以柔性肽连接，所述柔性肽包括但不限于：(Gly4Ser)3。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码前面任一所述对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽，其中编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2-5任一所示的对EB病毒LMP2蛋白具有结合亲和力的多肽的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:6-9所示。

在本发明的另一方面，提供一种重组载体，该载体包含所述多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含所述重组载体，或其基因组中整合有所述多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种制备前面任一所述对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽的方法，所述方法包括：(1)培养所述宿主细胞，通过IPTG诱导表达所述对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽；(2)通过镍离子亲和层析分离纯化(1)获得的多肽。

在本发明的另一方面，提供所述对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽或所述靶向EB病毒LMP2蛋白的靶向性分子的用途，

用于制备治疗EB病毒LMP2蛋白表达阳性肿瘤的药物；

或用于制备检测EB病毒LMP2蛋白的检测试剂；

或用于制备诊断EB病毒LMP2蛋白表达阳性肿瘤的诊断试剂。

在一个优选例中，所述靶向EB病毒LMP2蛋白的靶向性分子中，所述偶联物是抗肿瘤药物，所述靶向EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区的靶向性分子用于制备治疗EB病毒LMP2蛋白表达阳性肿瘤的药物。

在另一优选例中，所述靶向EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区的靶向性分子中，所述偶联物是可检测标记物，所述靶向EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区的靶向性分子用于制备诊断EB病毒LMP2蛋白表达阳性肿瘤的诊断试剂。

在另一优选例中，所述EB病毒LMP2蛋白表达阳性肿瘤包括：鼻咽癌、口腔腺体肿瘤、淋巴瘤、何杰金氏病、胃癌以及器官移植后的B细胞淋巴瘤、艾滋病相关的淋巴瘤。

在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包含：所述对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽或所述靶向EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区的靶向性分子；和药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测EB病毒LMP2蛋白表达量的药盒，所述药盒中包括：任一所述的靶向EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区的靶向性分子，所述靶向性分子为多肽标签或者可检测标记物，和检测多肽标签或者可检测标记物的检测试剂。

在本发明的另一方面，提供一种用于诊断EB病毒LMP2蛋白表达阳性肿瘤的药盒，所述药盒中包括：所述对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽或偶联有可检测标记物的所述对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽或偶联有报告酶的所述对对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽，该多肽如SEQ ID NO:2-5。

在本发明的另一方面，提供一种用于治疗EB病毒LMP2蛋白表达阳性肿瘤的药盒，所述药盒中包括：所述的对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽或偶联有抗癌活性的物质的所述对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽，该多肽如SEQ ID NO:2-5，所述抑制EBV的药物包括但不限于：毒素；较佳地，所述毒素是具有抑制EB病毒LMP2蛋白阳性肿瘤作用的毒素，如白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素或所述白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素的功能性片段；所述肿瘤是EB病毒LMP2蛋白阳性的肿瘤。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。

附图说明

图1、各Z_{EBV LMP2}以及Zwt序列的对比。本发明的多肽Z_{EBV LMP2}中被修饰的氨基酸位点在图中己用下划线标出(SEQ ID NO：2-5)。

图2、实施例1中产生的ZEBV LMP2多肽重组质粒构建图和重组蛋白的组成示意图。

(A)Z_{EBV LMP2}多肽重组质粒构建图；(B)Z_WT多肽重组质粒构建图；(C)和(D)分别为Z_{EBV LMP2}和Zwt的原核表达全长重组蛋白的组成示意图，Z_{EBV LMP2}代表具有选自SEQ ID NO：2-5任一氨基酸序列，Zwt代表选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列，6xHis代表六个组氨酸标记，HM代表NdeI(CATATG)翻译的氨基酸，LE代表XhoI(CTCGAG)翻译的氨基酸。

图3、pET21a(+)/affibody的重组质粒电泳图。

M：DNA marker；1-5分别为pET21a(+)/Z_{EBV LMP2}12、pET21a(+)/Z_{EBV LMP2}132、pET21a(+)/Z_{EBV LMP2}137、pET21a(+)/Z_{EBV LMP2}142及pET21a(+)/Zwt的重组质粒。

图4、Affibody重组蛋白原核表达(A)及纯化(B)的SDS-PAGE电泳分析。

(A)M：蛋白marker；1-2分别为BL21(DE3)菌株和pET21(+)空载体转染的BL21(DE3)菌株，3-7分别为pET21a(+)/Z_{EBV LMP2}12、pET21a(+)/Z_{EBV LMP2}132、pET21a(+)/Z_{EBV LMP2}137、pET21a(+)/Z_{EBV LMP2}142及pET21a(+)/Zwt的重组质粒转染的BL21(DE3)菌株。

(B)M：蛋白marker；1-5分别为纯化的Z_{EBV LMP2}12、Z_{EBV LMP2}132、Z_{EBV LMP2}137、Z_{EBV LMP2}142及Zwt affibody重组蛋白。

图5、EBV LMP2重组蛋白原核表达鉴定及制备兔血清抗体的分析

(A)EBV LMP2串联B表位重组蛋白原核表达的SDS-PAGE电泳分析，M：Marker；1：E.coli.BL21菌株；2：pET32a(+)空载体转染的E.coli BL21菌株；3：pET32a(+)/EBV LMP2-串联B表位重组质粒转染的E.coli BL21菌株诱导后；4：pET32a(+)空载体质粒转染的E.coli BL21菌株诱导后；5-6：分别为EBV LMP2-串联B表位(Trx-EBV-LMP2-3B-his-tag)和载体蛋白(Trx-his-tag)纯化后；

(B)、(C)和(D)分别为EBV LMP2串联B表位重组蛋白Western Blot分析，一抗分别为his-tag单克隆抗体(B)、EBV-LMP2串联B表位重组蛋白免疫鼠血清(C)和鼻咽癌患者的血清(D)。M：Marker；1：E.coli.BL21菌株；2：pET32a(+)空载体转染的E.coli BL21菌株；3：pET32a(+)空载体质粒转染的E.coli BL21菌株诱导后；4：pET32a(+)/EBV LMP2-串联B表位重组质粒转染的E.coli BL21菌株诱导后；(E)EBV LMP2串联B表位重组蛋白免疫后鼠血清抗体的反应；(F)EBV LMP2串联B表位重组蛋白免疫后鼠血清抗体的效价。

图6、Z_{EBV LMP2}结合多肽与EBV LMP2串联B表位重组蛋白亲和力在ProteOn XPR36仪器上的SPR检测。

A-E分别为Z_{EBV LMP2}12、Z_{EBV LMP2}132、Z_{EBV LMP2}137、Z_{EBV LMP2}142及Zwt蛋白与靶蛋白EBV LMP2串联B表位重组蛋白的亲和力分析。

图7、Z_{EBV LMP2}多肽与EBV LMP2天然蛋白亲和力的细胞免疫荧光方法鉴定。

A-E分别为Z _{EBV LMP2}12、Z_{EBV LMP2}132、Z_{EBV LMP2}137、Z_{EBV LMP2}142及Zwt蛋白与天然蛋白结合的间接免疫荧光检测。

图8、Dylight755标记的Z _{EBV LMP2}结合多肽SDS-PAGE电泳及荧光分析

(A)为Z _{EBV LMP2}和Z_wt多肽SDS-PAGE电泳分析；(B)为Dylight755标记的Z_{EBV LMP2}和Z_wt多肽SDS-PAGE电泳的荧光分析。M：预染蛋白marker；1：DyLight755-Z_EBV-LMP2142重组蛋白；2：DyLight755-Z_EBV-LMP2137重组蛋白；3：DyLight755-Z_EBV-LMP2132重组蛋白；4：DyLight755-Z_EBV-LMP212重组蛋白；5.DyLight755-Zwt重组蛋白；6.Zwt重组蛋白。

图9、Dylight755标记的Z _{EBV LMP2}结合多肽在裸鼠体内的生物分布和肿瘤靶向的成像分析。

(A)Dylight755-Z _{EBV LMP2}142多肽在健康裸鼠体内各时间点的荧光成像和肾脏分布；及(B)肾脏与肌肉组织荧光信号强度的比值；(C)Dylight755-Z _{EBV LMP2}142结合多肽在C666-1细胞荷瘤裸鼠中的肿瘤靶向成像；(D)Dylight755-Z _{EBV LMP2}结合多肽在C666-1细胞荷瘤裸鼠中肾脏与肌肉组织荧光信号强度的比值；(E)Dylight755-Z _{EBV LMP2}结合多肽在C666-1细胞荷瘤裸鼠中肿瘤与肌肉组织荧光信号强度的比值。

图10、pET21a(+)/Z_EBV-LMP2affitoxin重组质粒构建图(A)和酶切鉴定图(B)。

(B)M:1Kb Marker；1:pET21a(+)质粒；2:pET21a(+)/Z_{EBV LMP2}affitoxin142质粒；3:pET21a(+)/Z_{EBV LMP2}affitoxin142/NdeⅠ+XhoⅠ；4:pET21a(+)/Z_{EBV LMP2}affitoxin142质粒T7通用引物PCR产物。

图11、Z_EBV-LMP2affitoxin蛋白SDS-PAGE电泳鉴定和WB鉴定。

(A)Z_EBV-LMP2affitoxin142和Zwt affitoxin重组蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析。M：预染蛋白marker；1：E.coli.BL21(DE3)菌株；2：pET21a(+)/E.coli BL21(DE3)菌株；3：诱导后pET21a(+)/Z_EBV-LMP2affitoxin142/BL21(DE3)(45kDa)；4:诱导后pET21a(+)/Zwtaffitoxin/BL21(DE3)(48kDa)。(B)纯化的Z_EBV-LMP2affitoxin142和Zwt affitoxin重组蛋白SDS-PAGE电泳分析。M：预染蛋白marker；1:Z_EBV-LMP2affitoxin142纯化蛋白；2:Zwtaffitoxin纯化蛋白。(C)纯化的Z_EBV-LMP2affitoxin142和Zwt affitoxin重组蛋白WB鉴定，一抗为his-tag单抗；M：预染蛋白marker；1:Z_EBV-LMP2affitoxin142纯化蛋白；2:Zwt affitoxin纯化蛋白。

图12、Z_EBV-LMP2affitoxin142与EBV LMP2天然蛋白亲和力的细胞免疫荧鉴定。A：Z_EBV-LMP2affitoxin142蛋白；B：Zwt affitoxin蛋白。一抗分别为鼠抗His单克隆抗体(ABR公司，美国，1：2000)、兔抗SPA血清(1:500)及PE38KDEL鼠血清抗体(1：500)。

图13、Z_{EBV LMP2}affitoxin142对肿瘤细胞生长的影响及IC50分析。

A、B、C:为Z_{EBV LMP2}affitoxin142分别对B95-8、C666-1和CNE-2Z肿瘤细胞的IC50分析；D、E和F:为Z_{EBV LMP2}affitoxin142及其对照Zwt蛋白分别对B95-8、C666-1和CNE-2Z肿瘤细胞生长抑制作用；G为Z_{EBV LMP2}affitoxin142分别对B95-8、C666-1、CNE-2Z和A375肿瘤细胞细胞生长抑制抑制作用。

图14、Z_EBVLMP2affitoxin142对Balb/c荷瘤裸鼠的抑瘤作用效应。

A:为Balb/c裸鼠在接种鼻咽癌C666-1细胞株后，待肿瘤长至100～200mm³大小时，尾静脉注射4mg/kg浓度的Z_EBVLMP2affitoxin142、Z_{EBV LMP2}affibody142、Zwt affitoxin对照蛋白及PBS，每隔1天注射1次，共15次。观察至42天。B:为Balb/c裸鼠在接种人黑色素瘤A375细胞株后，待肿瘤长至100～200mm³大小时，尾静脉注射4mg/kg浓度的Z_EBVLMP2affitoxin142，每隔1天注射1次，共15次。观察至42天。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

如本文所用，所述“对EBV LMP2具有结合亲和力的多肽”是指以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个氨基酸变异后获得的多肽，且该多肽能够特异性结合EBV LMP2、具有极少或没有非特异性结合。

如本文所用，所述“本发明的多肽”、“对EBV LMP2具有结合亲和力的多肽”、“EBVLMP2结合多肽”、“Z _{EBV LMP2}affibody多肽”、“Z_{EBV LMP2}affibody”、“Z _{EBV LMP2}”、“affibody蛋白”、“affibody重组蛋白”、“Z_{EBV LMP2}重组蛋白”可以互换使用；SPAZ与Zwt可以互换使用。

如本文所用，所述“靶向性分子”是指将本发明的对EBV LMP2具有结合亲和力的多肽与其它功能性偶联物连接后获得的、可以靶向EBV LMP2的分子。所述偶联物可以是半胱氨酸残基，多肽标签，抑制EBV LMP2的药物，酶或可检测标记物等。

如本文所用，所述“融合多肽”是所述“靶向性分子”的下位概念，是指本发明的对EBV LMP2具有结合亲和力的多肽与其它功能性肽(例如毒素蛋白或功能性蛋白片段)连接后获得的、可以靶向EBV LMP2的分子。

本发明人选择EBV LMP2作为靶抗原。本发明人以葡萄球菌A蛋白的Z结构域(Zwt，SEQ ID NO:1)作为支架，将其表面氨基酸残基模拟抗体结合位点进行随机突变，通过噬菌体展示技术构建突变文库，以EBV LMP2作为靶抗原对该文库进行亲和筛选，经过大量的筛选工作，最终获得了对于EBV LMP2具有高度亲和力的多肽。

本发明的多肽是以葡萄球菌A蛋白Z结构域的氨基酸序列作为骨架，进行14-20个(较佳地为14个)氨基酸变异后获得的多肽。作为本发明的优选方式，本发明的多肽相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，在第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35，43位上发生氨基酸突变。更优选地，本发明的多肽具有SEQ ID NO:2-5任一所示的氨基酸序列，如表1所示。

本发明还涵盖了在所述EBV LMP2结合多肽的氨基酸序列任一末端或两端加入额外的氨基酸残基而形成的多肽。这些额外的氨基酸残基可以在多肽结合EBV LMP2时起作用，但是也可同样用于其它目的，如涉及该多肽的生产、纯化、稳定、偶联或检测的一种或几种。这些额外的氨基酸残基可以包括一或多种为了化学偶联目的而添加的氨基酸残基。如在多肽链的第一位或最后一位添加，即在N或C末端添加一个半胱氨酸残基等。这种额外的氨基酸残基也可以包括用于多肽纯化或检测的一个“标记”，如与标记抗体相互作用的六组氨酸肽(His₆)标记，或“myc”标记或“flag”标记。此外，其它本领域技术人员熟知的替代方式也包含在本发明中。

所述“额外的氨基酸残基”也可构成具有预期功能的一个或多个多肽结构域，如与第一个、EBV LMP2结合结构域相同的结合功能，或者其它结合功能，或是一种酶促功能，或是一种荧光功能，或是其组合。

本发明也包含在所述EBV LMP2结合多肽基础上，经修饰进而增加其在碱性条件下的稳定性的多肽。这种稳定性包括用对于碱性条件较不敏感的氨基酸残基定点取代在没有修饰的序列中出现的任何天冬酞胺残基。由于在不同的反应之间亲和层析柱要经受频繁的强碱处理以进行洗脱，这种对碱降低敏感性的特性，有利于使用本发明的多肽作为亲和层析中的亲和配体，能够延长亲和层析基质的使用寿命。

本发明也包含在本发明的EBV LMP2结合多肽基础上，进行其它修饰后获得的多肽。这些修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明的EBV LMP2结合多肽可以与偶联物连接，从而构成功能性的靶向性分子，这种连接可通过化学键(包括肽键)相连或吸附；所述化学键是共价键或非共价键。作为一种优选方式，通过肽键连接，从而形成融合多肽。所述EBV LMP2结合多肽与偶联物之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述连接子例如包括1-30个氨基酸；较佳地为1-20个氨基酸。连接肽的设置基本上不影响融合蛋白中各多肽的活性。较佳地，可以利用柔性肽(Gly4Ser)3进行连接。其它本领域技术人员熟知的连接肽也可应用于本发明。

在“异源”融合多肽中，所述EBV LMP2结合多肽构成了第一个结构域或第一个部分，第二和其它部分具有除了结合EBV LMP2外的其它功能，这些可预期的结果也在本发明的范围内。该融合多肽的第二和其它部分可能包含对除了EBV LMP2外的其它靶分子具有亲和力的结合结构域。这种结合结构域也可能与SPA结构域相关，但在1到大约20个位置具有取代突变。结果是融合多肽有至少一个EBV LMP2结合结构域和至少一个与所述其它靶分子具有亲和力的结构域。这扩展了本发明的多肽的应用，如作为治疗制剂或作为捕获、检测或分离试剂。

本发明融合多肽第二和其它部分的其它选择包括用于治疗性应用的一或多种部分。在治疗性应用中，其它分子也可以通过其它方法共价或非共价偶联到本发明的多肽上。作为本发明的优选实施方式，将改造的铜绿假单胞菌外毒素PE38KDEL通过柔性肽连接于MAGE-A3结合多肽的C-末端，构成融合蛋白。非限制性例子包括用本发明多肽引导效应酶(例如羧肽酶)而进行“ADEPT"(抗体介导的酶前药治疗，antibody-directed enzymeprodrug therapy)的酶；包括用以募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白质；包括细胞因子，如IL-2、IFNγ、IL-12、TNFα、IP10；包括促凝血因子，如组织因子、von Willebrand因子；包括毒素，如蓖麻毒蛋白A、calcheamicin、美登木素生物碱；包括毒性小分子，如auristatin类似物、阿霉素等。同时，为了更方便掺入放射性核素(如⁶⁸Ga、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹²⁴I、¹²⁵I)用于诊断或放射性核素(如⁹⁰Y、¹³¹I、²¹¹At)用于治疗，可以考虑上述列举的额外的氨基酸(特别是六组胺酸标记和半胱氨酸)，其目的是将放射性同位素的鳌合剂偶联到多肽序列。

本发明还涵盖了在所述EBV LMP2结合多肽上连接一个可检测标记物(如荧光标记，生物素或放射性同位素)，从而可基于本发明的多肽的特异性，实现检测表达EBV LMP2阳性肿瘤的目的。

“EBV LMP2结合亲和力”是指可以例如通过利用表面等离子共振(surfaceplasmon resonance)技术如装置进行检测的一种多肽特性。EBV LMP2结合亲和力可以通过一个实验进行检测，其中将EBV LMP2固定在该装置的感应芯片上，然后将含有待测多肽的样品通过该芯片。或者，也可以将待检测的多肽固定在该装置的感应芯片上，然后将含有EBV LMP2的样品通过该芯片。本领域技术人员可以利用所获得的感应图像建立多肽的EBV LMP2结合亲和力的至少一种定性测量方法。如果需要定量测量方法，例如为了建立相互作用间的某个KD值，也可以使用表面等离子共振方法。例如，结合值可以利用2000装置(Biocore AB)进行测定。EBV LMP2固定于该装置的感应芯片上，而亲和力待检测的多肽样品通过连续稀释制备并以随机顺序进行注射。然后可从结果中计算KD值。在本发明的实施例中，所述多肽的KD值达到1.28×10^-5M至1.25×10^-7M。

本发明还提供了编码本发明的EBV LMP2结合多肽或靶向性分子或融合多肽的分离的核酸，也可以是其互补链。所述核酸可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得，本发明涉及到的核酸序列由北京擎科生物技术有限公司委托合成。

本发明还提供了包含编码所述核酸分子的载体。所述载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。如本文所用，“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，如Pouwels等，克隆载体：实验室手册中所描述的。

此外，含有所述核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

通过制备编码本发明的EBV LMP2结合多肽的核酸、载体以及宿主细胞，用于生产发明的EBV LMP2结合多肽。

生产本发明的EBV LMP2结合多肽或靶向性分子或融合多肽的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有相应多肽的编码核酸的重组细胞，获得产物多肽。可将上述制备获得的多肽纯化为基本均一的性质，其纯化方式可以采用鎳柱纯化或者其他通用纯化方式，在此不进行列举，验证结果为在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。

基于要表达多肽的信息和目前重组表达蛋白质的技术水平，结合本发明揭示的内容，本领域技术人员易于制备本发明的多肽。例如，表达未被修饰的Z结构域的质粒可以用作起始材料。使用已知技术，所需的取代突变可以被引入这个质粒中以获得本发明的表达载体。

当使用化学多肽合成方法制备本发明的多肽或靶向性分子或融合蛋白时，上述多肽中的任何天然产生的氨基酸残基都可以被任何相应的、非天然产生的氨基酸残基或其衍生物所取代，只要产物多肽的功能基本不被损害。

本发明还涉及所述EBV LMP2结合多肽或靶向性分子或融合多肽在不同方面的应用，包括应用于治疗、诊断和/或检测。

本发明的EBV LMP2结合多肽可作为EBV LMP2抗体在不同应用中的一种替代物。

作为非限制性的实例，其可用于治疗特征以EBV LMP2表达为特征的疾病，例如肿瘤(如鼻咽癌)等。通过结合胞内EBV LMP2以抑制细胞信号传导，用于相关疾病的体内和体外诊断。本发明的多肽可作为一种检测试剂、一种捕获试剂或者分离试剂，而且还可直接用作为一种治疗制剂或者将其它治疗制剂靶向EBV LMP2蛋白的手段。体外使用本发明的多肽的方法可以不同方式进行，如微量滴定板、蛋白阵列、生物传感器表面和组织切片等等。为了使本发明多肽适用于特异的用途，在不偏离本发明的范围的情况下，可以对本发明的多肽进行修饰和/或添加。

在下面详细描述了这些修饰和添加，其可能包括在同一多肽链中包含的额外的氨基酸，或者标记和/或治疗制剂，其化学修饰或以其它方式结合本发明的多肽。另外，本发明还涵盖了保留了结合EBV LMP2能力的该多肽的片段。

本发明多肽的EBV LMP2结合特性以及用该多肽生产靶向性分子(包括融合蛋白)和/或标记的结合分子的稳定性意味着该多肽也可以用于将其它活性物质靶向肿瘤部位，这些肿瘤包括表达EBV LMP2的细胞。因此，本发明的另一方面是提供了本文所述EBV LMP2结合多肽与一种具有抗癌活性的物质偶联的应用，以将所述物质运送到表达EBV LMP2的细胞，产生靶细胞的损伤或凋亡。

这种抗癌活性的物质可能是通过融合或通过化学键偶联到EBV LMP2结合多肽上的蛋白质，如选自用于“ADEPT”(antibody-directed enzyme prodrug therapy)应用的效应酶；用于募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白；细胞因子，如IL-2、IFNγ、IL-12、TNFα、IP 10等；促凝血因子，如组织因子、von Willebrand因子等；毒素，如蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物碱等。或者，所述活性物质也可能是细胞毒性药物，如auristatin类似物或阿霉素或放射性同位素(如⁹⁰Y、¹³¹I、²¹¹At等)，这种同位素可与EBV LMP2结合多肽直接结合，或通过一种鳌合剂，如熟知的鳌合剂DOTA或DTPA而与EBVLMP2结合多肽结合。

在相关方面，本发明还提供了一种在体内将具有抗癌活性的物质导向表达EBVLMP2细胞的方法，包括施用给患者本文所述所述活性物质与EBV LMP2结合多肽的偶联物。这种偶联物在前文已被适当描述。

本发明还包括使用所述与EBV LMP2结合的多肽检测样品中的EBV LMP2蛋白。

例如，这种检测可以用来诊断特征为表达EBV LMP2的疾病情况。检测EBV LMP2的存在可以在体内也可以在体外进行。体内诊断的优选选择是使用正电子放射X线断层摄影术，PET。被检测的样品可以例如是生物学液体样品或组织样品。现在的普遍方法是用针对与EBV LMP2的抗体，这种方法可以适用于本发明的与EBV LMP2结合多肽，这种方法是组织化学方法检测与EBV LMP2的存在，用来鉴定新鲜、冷冻或福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品中与EBV LMP2蛋白的表达。为了检测EBV LMP2。

本发明的多肽也能用作融合蛋白的一部分，其中其它结构域是报告酶或荧光酶。或者，其也可以是被一个或多个荧光制剂和/或放射性同位素标记的，任选通过鳌合剂标记。合适的放射性同位素包括⁶⁸Ga、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹²⁴I和¹²⁵I等。

本发明还包括将所述EBV LMP2结合多肽应用于检测生物学液体样品中EBV LMP2。这个方法包括以下步骤：(1)提供被检测患者的生物学液体样品，(2)将本文所述EBV LMP2结合多肽在能使所述多肽与样品中存在的任何EBV LMP2结合的条件下加入样品中，(3)除去非结合的多肽，及(4)检测结合的多肽。被检测到的结合的多肽的量与样品中存在的EBVLMP2量相关。在步骤(2)中，EBV LMP2结合多肽可以以任何适宜的形式加入到样品中，包括例如这样的情况，当EBV LMP2结合多肽被固定在一种固体支持物上，通过其使样品接触，或EBV LMP2结合多肽存在于溶液中。

所述EBV LMP2结合多肽的其它应用还包括：检测样品中EBV LMP2的方法，包括如下步骤：(1)提供一种怀疑含有EBV LMP2的组织样品，例如冷冻切片或用福尔马林包埋的组织切片，(2)在适宜条件下加入本发明的EBV LMP2结合多肽到所述样品中，所述条件为益于所述多肽与样品中存在的任何EBV LMP2结合，(3)除去未结合的多肽，及(4)检测结合的多肽。检测到的结合的多肽的量与样品中存在的EBV LMP2的量相关。

本发明还提供了一个诊断组织样品中EBV LMP2表达的试剂盒，包括与报告酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)融合的、本发明的EBV LMP2结合多肽、或/和检测酶活性的试剂、或/和阳性和阴性对照组织切片。

本发明还提供了一个诊断组织样品中EBV LMP2表达的试剂盒，包括通过抗体检测的与标记(如flag标记或myc标记)融合的本发明的EBV LMP2结合多肽、一个特异于标记的一抗、特异于一抗并与报告酶偶联的二抗、或/和检测酶活性的试剂，或/和阳性和阴性对照组织切片。

诊断应用的一个领域就是在体内检测癌细胞或其聚集物。本发明提供了一个进行这种诊断的试剂盒，该试剂盒包括标记有一个鳌合物的、本发明的EBV LMP2结合多肽、一种诊断用放射性同位素(非限制性的例子是⁶⁸Ga、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹²⁴I和¹²⁵I等)，以及用于分析掺入效率的试剂。

如上所述，本发明涵盖了本发明的EBV LMP2结合多肽将活性物质靶向表达EBVLMP2的细胞如某些类型的癌症细胞的应用。本发明还提供了一个用于此目的的试剂盒，该试剂盒包括用一个鳌合物标记的本发明的EBV LMP2结合多肽、一个治疗性放射性同位素(非限制性的例子是⁹⁰Y、¹³¹I、²¹¹At)，以及用于分析掺入效率的试剂。

本发明还提供一种药物组合物，其包含：有效量的本发明所述对EBV LMP2蛋白具有结合亲和力的多肽或靶向EBV LMP2蛋白的靶向性分子，和药学上可接受的载体。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

可将所述组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。

在使用时，是将安全有效量的本发明所述对EBV LMP2蛋白具有结合亲和力的多肽或靶向性分子施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1、EBV LMP2结合多肽的文库构建及筛选研究

构建噬菌体展示EBV LMP2结合多肽的随机组合文库，即许多不同的SPA结构域相关多肽的文库，从该文库中筛选EBV LMP2结合多肽，并对其亲和性进行了鉴定。

1、EBV LMP2结合多肽的随机组合噬菌体展示文库的构建和鉴定

根据野生型SPA-Z的氨基酸序列及结构(Nilsson B等，Protein Eng.1987；1(2):107-113)，针对其三个螺旋结构区对应的编码序列设计随机引物，利用PCR方法扩增获得可导致随机氨基酸突变的SPA编码序列，命名为SPA-N。按分子克隆常规方法，通过Sfi I和NotI位点将SPA-N编码序列克隆至pCANTAB5E载体构建pCANTAB5E/SPA-N重组质粒，转化至感受态E.coli TG1细胞中，涂布2YT-A平板，37℃培养过夜。即为初级库，标记为affibody初级库备用。随机挑取平板上长出的20个单克隆菌落，将提取质粒用Sfi I和Not I双酶切鉴定为阳性克隆，经测序和分析其随机性。

结果：根据测序结果，送测序的25个克隆中有测序结果的为22个克隆，其中连接成功17个克隆，随机性完全不同，故重组率为17/22＝73％；多样性为17/17＝100％。取上述转化后培养的菌液，用2×YT培养液倍比稀释(1:10，1:10²……)，涂布SOB-AG平板，计算平板上的单菌落数，推算库容。通过增加连接转化次数累计库容，多次连接转化后使克隆数达到2.4×10⁶个Z蛋白变体(affibody分子)，其在第9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35和43位具有随机的氨基酸残基。

2、EBV LMP2结合多肽的筛选和滴度测定

将纯化的EBV LMP2蛋白包被96孔酶标板，经封闭、加噬菌体文库(初级库)孵育、再加入E.coli TG1 37℃，轻摇温育；取100μl，用2*YT培养基做梯度倍比稀释，取稀释液100μl涂布SOB-AG平板，30℃过夜，计数结合噬菌体感染菌落数，计算EBV LMP2结合噬菌体滴度；结果平板可见菌落，滴度是10³；此时完成第一轮淘洗，另部分菌液加10¹⁰辅助噬菌体M13KO7和卡那霉素培养过夜，离心后取上清经0.22μm滤膜过滤，获得EBV LMP2分子亲和筛选后的噬菌体文库，为一级库。重复上述4轮富集筛选，分别获得EBV LMP2分子亲和筛选后的噬菌体文库，为二级，滴度分别为1×10⁶；在二级库的基础上再重复上述4轮富集筛选，为三级文库，滴度为1×10⁸。同时设置不加噬菌体的空白对照作同步筛选。

3、EBV LMP2结合多肽单克隆噬菌体的制备及ELISA鉴定

ELISA用于筛选表达EBV LMP2结合affibody分子的噬菌体。将EBV LMP2蛋白以20μg/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；PBS洗涤，用2％脱脂奶粉封闭2h；洗涤，取四轮筛选后获得的噬菌体与等体积的3％脱脂奶粉混匀，200μl/孔，37℃，2h。洗涤，加入1:10000稀释的HRP/anti-M13酶标二抗(兔抗M13，Abcam#ab6188)，200μl/孔，37℃，1h；洗涤，加入OPD显色液200μl/孔，37℃，15min；2M H₂SO₄ 50μl/孔，终止反应；置酶标仪(ELx800^TM，BIO-TEK，Winooski，USA)读取OD490值。

在四轮淘选循环中选择结合抗原的affibody分子，经过这四轮选择循环，进一步用噬菌体ELISA检测以分析其EBV LMP2结合活性，用高于0.5的OD490的ELISA值为选择标准，鉴定编码EBV LMP2结合多肽的噬菌体，选择高于这个ELISA信号值的282个克隆，并与另外随机挑选12个无ELISA值的克隆进行DNA序列分析。

4、EBV LMP2亲和体分子的序列检测及筛选

共282个单克隆送中国上海生工公司测序，测序引物为CATATGGTTGACAACAAA TTCAACAAAGAA(SEQ ID NO:10)。测序结果用DNA STAR软件分析对标准序列SPA-Z与SPA-N进一步分析其三个螺旋区的随机性和多样性。结果获68个完全正确克隆序列，有部分序列完全重复，兼并重复序列后获得56个序列完全正确的克隆。

根据DNA测序结果进行分析，在上述测序正确的56个克隆中，选择与EBV LMP2蛋白结合活性最强的4个单克隆噬菌体(即呈现EBV LMP2亲和体分子的单克隆噬菌体)的DNA序列(分别为Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2} 137、Z_{EBV LMP2}142)作为靶目标进行研究，氨基酸序列为图1中的SEQ ID NO:2、3、4、5，它们的编码序列如SEQID NO:6、7、8、9。用于下一步用于EBV LMP2结合亲和体的分子克隆和表达及功能检测。

实施例2、EBV LMP2结合多肽重组质粒构建和原核蛋白表达及纯化

如前选择了具有较高ELISA读数的4个克隆(图1中的Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2} 137、Z_{EBV LMP2}142)，及Zwt作为EBV LMP2结合多肽的阴性对照。为了对筛选的affibody分子进行功能检测，对其进行重组质粒构建、原核蛋白的表达及其鉴定，并制备纯化蛋白。

1.pET21a(+)/affibody的重组质粒构建和鉴定

参照affibody基因序列(GenBank：GY324633.1)设计PCR引物，上游引物5’GGGAATTCCATATGGTTGACAACAAATTCAACAAAGAA 3’(SEQ ID NO:11，斜体和下划线表示Ned I酶切位点)，下游引物5’CCGGAATTCCGTTTCGGAGCCTGAGCGT 3’(SEQ ID NO:12，斜体和下划线表示XhoⅠ酶切位点)；以筛选的测序正确三级库单克隆affibody Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2} 137、Z_{EBV LMP2}142为模板，通过PCR扩增affibody目的基因，如SEQ ID NO:NO:6、7、8、9所示，同时将affibody Zwt经原核密码子优化后全序列合成作为阴性对照，如SEQ ID NO:13所示。将PCR扩增的目的基因经NdeⅠ和XhoⅠ克隆至pET21a(+)载体，构建pET21a(+)/Z_{EBV LMP2}的重组质粒，并经测序鉴定，如图2-3所示。

2.Z_{EBV LMP2}原核蛋白制备

将重组质粒转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中，37℃，培养16h；加0.8mM异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(默克公司，德国)IPTG诱导培养6h表达带有His标签的Z_{EBV LMP2}affibody及Zwt affibody蛋白。经诱导后表达的重组蛋白，用镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTA Agarose)(QIAGEN公司，美国)亲和层析法纯化并经SDS-PAGE分析鉴定。结果，利用分子生物学技术成功构建了pET21a(+)/Z_{EBV LMP2}重组质粒，并采用原核表达系统制备了纯化的Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2} 137、Z_{EBV LMP2}142及Zwt affibody重组融合蛋白，经SDS-PAGE电泳分析证实，如图4所示，出现考马斯亮蓝浓染的条带分子质量约7.8kDa，与预期Z_{EBV LMP2} affibody多肽的分子质量大小一致。本发明选择pET21a(+)载体，在设计上利用其多克隆位点的起始酶位点为NdeI(CATATG)，其密码子ATG即为目的蛋白翻译的氨基酸(M)起始密码子，这样利用原核表达系统表达的蛋白即为全长的目的蛋白Z_{EBV LMP2}而不带载体蛋白片段，避免了载体蛋白对实验结果的干扰。

实施例3、Z_{EBV LMP2} affibody多肽与EBV LMP2重组蛋白的结合

为鉴定Z_{EBV LMP2} affibody多肽与EBV LMP2蛋白结合的特异性，利用表面等离子共振技术(SPR)分析筛选的Z_{EBV LMP2}12、Z_{EBV LMP2}132、Z_{EBV LMP2}137、Z_{EBV LMP2}142及其对照Zwtaffibody与靶蛋白EBV LMP2的特异性结合。

1.EBV LMP2蛋白的制备和鉴定

将实验室构建并保存的pET32a/EBV LMP2串联B表位(EBV LMP2的胞膜外区)重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后表达重组蛋白，用Ni-NTA亲和层析法纯化制备蛋白，并常规免疫BALB/c小鼠制备血清抗体。结果如图5A所示，SDS-PAGE电泳显示一明显蛋白条带出现在相对分子质量(Mr)约22kDa的位置，与预期蛋白Mr大小相符；经用亲和层析柱析纯化后，经SDS-PAGE分析在Mr 22kDa的位置处出现一条较为单一的的蛋白条带。分别以小鼠抗6×His mAb、EBV-LMP2串联B表位免疫鼠血清及NPC患者血清为一抗进行Westernblot分析，均可见在Mr 22kDa处出现单一的信号反应带，如图5B、C、D所示，表明EBV LMP2串联B表位重组蛋白均能被相应的His标签抗体、制备的鼠多克隆抗体及NPC患者血清抗体所特异性识别和结合。经ELISA检测，鼠EBV LMP2串联B表位重组蛋白免疫后出现了高效价的抗体反应，表明成功制备高效价的EBV LMP2特异性鼠血清抗体，如图5E、F所示。

2.Z_{EBV LMP2}多肽的传感器分析

在ProteOn XPR36系统仪器(Bio-Rad公司)进行EBV LMP2串联B表位蛋白和Z_{EBV LMP2}多肽之间相互作用的亲和力分析，即利用表面等离子共振技术(SPR)分析上述带有His标签的Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2} 137、Z_{EBV LMP2}142及Zwt affibody分子(作为对照)与EBVLMP2之间的相互作用。根据操作手册，在不同的流动池上通过偶联于GLH芯片将EBV LMP2串联B表位蛋白重组蛋白固定，进行与筛选多肽之间的亲和力测定。第6个流动池表面被激活和失活以作为注射时的空白对照。affibody分子分别进行5个不同梯度浓度稀释与EBVLMP2串联B表位重组蛋白结合，即即Z_{EBV LMP2：12}浓度为51.2nM、25.6nM、12.8nM、6.4nM、3.2nM、1.6nM，Z_{EBV LMP2}137浓度为25.6nM、12.8nM、6.4nM、3.2nM、1.6nM、0.8nM，Z_{EBV LMP2} 137浓度为74.4nM、37.2nM、18.6nM、9.3nM、4.6nM、0.8nM，Z_{EBV LMP2}142浓度为51.2nM、25.6nM、12.8nM、6.4nM、3.2nM、1.6nM，及Z_WT affibody分子浓度为27.0nM、13.5nM、6.3nM、3.2nM、1.6nM、0.8nM，所有的分析在25℃进行，流速为30μl/min，注射标本的容量为200μl，并以流速30μl/min随机顺序注射，随后用HCl(BIO-RAD货号：#176-2250 100mM HCl)洗涤6min，利用ProteOn Manager^TM软件(BIO-RAD)的1：1朗缪尔结合模型分析结合曲线。所有的分析在25℃进行，流速为30_μl/min，注射标本的容量为200μl，并以流速30μl/min随机顺序注射，随后用100mM HCl(BIO-RAD)洗涤6min，利用ProteOn ManagerTM软件(BIO-RAD)的1：1朗缪尔结合模型分析结合曲线。

如图6所示，结果范围随着Z_{EBV LMP2}亲和体分子浓度升高，其与靶蛋白EBV LMP2串联B表位蛋白相互作用的能力增强，亲和力平衡解离常数KD均值，Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2} 137、Z_{EBV LMP2}142及Zwt亲和体分子分别的为1.25×10^-7mol/L、3.74×10^-6mol/L、3.90×10^-6mol/L、1.14×10^-6mol/L及1.62×10^-1mol/L。Z_{EBV LMP2}分子较Zwt affibody分子解离常数KD值相差100000至1000000倍。经筛选获得的Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2} 137、Z_{EBV LMP2}142均能与EBV LMP2串联B表位(EBV LMP2胞膜外区)重组蛋白结合，亲和力均已经达到nmol/L级水平，与此同时野生型的Zwt affibody分子和EBV LMP2串联B表位重组蛋白几乎没有结合力。表明筛选出的Z_{EBV LMP2}affibody分子与EBV LMP2串联B表位重组蛋白具有较高的特异亲和力，同时也表明原核诱导表达的Z_{EBV LMP2}affibody分子与EBV LMP2串联B表位重组蛋白均具有生物活性。

因此，本发明的Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2} 137、Z_{EBV LMP2}142蛋白分子与EBVLMP2靶蛋白分子具有相互结合和识别能力。从蛋白水平验证了Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2} 137、Z_{EBV LMP2}142分子与EBV LMP2靶蛋白之间的亲和力。

实施例4、Z_{EBV LMP2}affibody多肽与表达EBV LMP2蛋白细胞的结合

为进一步验证筛选的Z_{EBV LMP2} affibody多肽与EBV LMP2靶蛋白的亲和力，利用表达EBV LMP2的肿瘤细胞作为研究对象，即B95-8细胞株(EB病毒转化的绒猴淋巴细胞，作为阳性对照)、EBV阳性的鼻咽癌细胞株C666-1、CNE-2Z和EBV阴性的黑色素瘤细胞株A-375(作为阴性对照)，进一步验证Z_{EBV LMP2}蛋白分子与EBV LMP2蛋白分子之间的结合。

细胞培养：B95-8、C666-1和CNE-2Z细胞培养于RPMI 1640培养基，RPMI 1640培养基的组分包括10％胎牛血清，2.05mM L-谷氨酞胺和100IU/ml青霉素及100μg/ml链霉素。黑色素瘤细胞系A375细胞培养于DMEM培养基，DMEM培养基的组分包括10％胎牛血清，2.05mML-谷氨酞胺和100IU/ml青霉素及100μg/ml链霉素。细胞在37℃含有5％CO₂的培养箱中培养至24h，细胞状态良好时进行免疫荧光检测。

细胞免疫荧光检测：将灭菌的盖玻片放入六孔板中，将培养至24h的B95-8、C666-1、CNE-2Z和A375细胞调整数目为1×10⁵/孔，5％CO₂、37℃培养24h至单层细胞。分别加入终浓度为50μg/ml的Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2} 137、Z_{EBV LMP2}142Z affibody及Zwt多肽于上述含10％FBS培养基中，5％CO₂、37℃培养6h，吸出培养液，用预冷PBS洗涤；采用2％多聚甲醛固定单层细胞10min，PBST洗涤3次，加入0.3％Triton X-100打孔10min，洗涤后加入10％FBS+1640培养基37℃封闭1h，洗涤；加入鼠抗His单克隆抗体(ABR公司，美国，1：2000)，置37℃1h，洗涤后加FITC-羊抗鼠IgG二抗(上海联科生物技术公司，中国)和PI(索莱宝公司，北京)2μl/孔1h，避光，洗涤后加盖玻片并用缓冲甘油封片，共聚焦荧光显微镜(LeicaTCS SP2 microscope德国)在400×下观察并拍片。

如图7A-D所示，结果显示，Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2} 137、Z_{EBV LMP2}142affibody蛋白孵育的B95-8、C666-1和CNE-2Z细胞株的细胞膜可见多个强绿色的点状或团块状荧光蛋白，而A375细胞株均未见明显的荧光团块；如图7E所示，同时Zwt对照肽孵育的B95-8、C666-1 CNE-2Z和A375细胞株的细胞膜均未见明显的荧光团块。表明，Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2} 137、Z_{EBV LMP2}142 affibody重组蛋白能特异性识别细胞株天然表达的EBV LMP2蛋白，本发明制备的Z_{EBV LMP2} affibody重组蛋白和活细胞表达的EBV LMP2蛋白有很强的特异结合能力。

上述结果进一步从细胞水平验证了Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2} 137、Z_{EBV LMP2}142 affibody重组蛋白与EBV LMP2蛋白具有很强的亲和力和结合的特异性。

实施例5、Z_{EBV LMP2} affibody多肽在荷瘤裸鼠中的生物分布和肿瘤靶向特性

在本实施例的实验中，用近红外荧光染料DyLight755 NHS Ester(Thermo Fisher公司，美国，货号62278)分别标记Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2} 137、Z_{EBV LMP2}142affibody分子，并将其注射到携带C666-1细胞移植肿瘤的小鼠体内，进行Z_{EBV LMP2} affibody多肽生物分布研和成像定位，以研究标记多肽的生物分布和肿瘤靶向特性。

1.动物肿瘤模型的制备

选择6-7周龄BALB/c-nu小鼠(购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证SCXK(沪)2012-0002)，体重为15-18g。将培养至对数生长期，生长状态良好的C666-1细胞用EDTA(胰酶)消化后，用含10％血清细胞培养液进行吹打、收集，常温1000rpm离心3min，将离心细胞用不含血清的培养液重悬并计数，配制成1×10⁶/ml，取0.2ml于背部近右前臂皮下注射接种裸鼠。每隔3天观察小鼠的精神状态、活动力、反应、饮食、体重及皮下接种区域外观及触感，并以电子游标卡尺测量瘤体大小直径。

结果显示，裸鼠皮下接种上述细胞均可见明显的肿瘤生长，40只裸鼠全部成瘤。2周后，肿瘤最大直径达到约300-500mm³时开始实验。

2.近红外荧光染料Dylight755标记及鉴定

按照说明书步骤对Z_{EBV LMP2} affibody及对照蛋白Zwt affibody进行Dylight755的标记并鉴定。即取91μg DyLight 755 NHS-Ester染料溶解入273μl DMF有机溶剂后，分别加入透析后的Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2} 137、Z_{EBV LMP2}142 affibody分子及Zwt(300μg/ml，共1ml)溶液中，避光，4℃条件下反应1h，将反应后的溶液避光透析，每隔半小时更换透析液(磷酸盐缓冲液，pH7.2-7.4)，2h后分别收集Dy755标记荧光蛋白，取样测蛋白浓度为100μg/ml，采用SDS-PAGE电泳进行鉴定。分别将上述Dy755标记荧光蛋白加入10μl蛋白loading buffer中，于冰上避光条件下电泳，并将凝胶放于活体成像仪(CRi Maesro 2.10)中，激发光滤片为671-705nm，发射光滤片为750longpass，采用8bit和2×2模式，用780-920nm波长间隔10nm每次曝光5000ms收集图像信息，用Maesro 25软件进行图像处理及分析。将经鉴定的上述Dy755标记荧光蛋白分别分装于棕色离心管，-20℃保存备用。

如图8A-B所示，结果显示，Dy755标记荧光蛋白经SDS-PAGE电泳分析，在相对分子质量为7.8kDa处均出现单一的染色条带；Dy755标记荧光蛋白经小动物活体成像仪扫描，在相对相对分子质量为7.8kDa处均出现单一的荧光条带，而未标记Dy755荧光的Zwt则未见荧光条带。表明，近红外荧光Dy755标记Z_{EBV LMP2}及Zwt affibody成功。

3.Z_{EBV LMP2} affibody多肽在荷瘤裸鼠中的生物分布和肿瘤靶向特性

(1)Dy755-Z_{EBV LMP2} affibody 142在健康裸鼠体内的生物分布

为分析Dy755-Z_{EBV LMP2} affibody 142在正常裸鼠体内的代谢，用10％水合氯醛腹腔注射诱导麻醉，待其进入深度麻醉状态后经尾静脉注射50μg Dy755-Z_{EBV LMP2} affibody142蛋白，置于小动物活体成像仪(CRi Maesro 2.10)中成像，并用0.8-1.0μl/g水合氯醛维持麻醉状态，以保证小鼠在成像过程中处于深度麻醉，在注射前及注射后5min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、24h、48h、72h和96h连续成像观察。成像的激发光滤片为671-705nm，发射光滤片为750longpass，采用8bit和2×2模式，780-920nm波长间隔10nm每次曝光5000ms收集图像信息，并用Maesro软件进行图像处理及分析，分别显示背景自发荧光和目标荧光信号，然后测量其荧光值，将背景自发荧光设置为黑色，目标荧光信号设置为红色，最后将两种色彩相叠加。所得数据用GraphPAD软件进行处理。

结果可见双侧肾脏出现了最大的荧光信号，将其与腿部肌肉处的荧光信号比值进行分析，即肾脏/正常组织率{K/N ratio＝[肾脏ROI的背景信号/正常ROI的组织(肌肉)背景信号]}。结果表明，Dy755-Z_{EBV LMP2} affibody 142主要分布于肾脏，在注射后肾脏的荧光信号逐渐增强，于8小时达到高峰，此后逐渐减弱，并于96小时荧光信号消失。表明，Dy755-Z_{EBV LMP2} affibody 142蛋白主要分布于正常裸鼠的肾脏，即经肾脏排泄，并于96小时内完全排泄，如图9A、B所示。

(2)Dy755-Z_{EBV LMP2} affibody 142多肽在荷瘤裸鼠中的生物分布和肿瘤靶向特性

待裸鼠的肿瘤长至300-500mm3时将裸鼠带出SPF屏障系统，用10％水合氯醛腹腔注射诱导麻醉，待其进入深度麻醉状态后经尾静脉注射50μg Dy755-Z_{EBV LMP2}及Zwt荧光蛋白，置于小动物活体成像仪(CRi Maesro 2.10)中成像，并用0.8-1.0μl/g水合氯醛维持麻醉状态，以保证小鼠在成像过程中处于深度麻醉，在注射前及注射后30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h和72h连续成像观察。成像的激发光滤片为671-705nm，发射光滤片为750longpass，采用8bit和2×2模式，780-920nm波长间隔10nm每次曝光5000ms收集图像信息，并用Maesro软件进行图像处理及分析，分别显示背景自发荧光和目标荧光信号，然后测量其荧光值，将背景自发荧光设置为黑色，目标荧光信号设置为红色，最后将两种色彩相叠加。所得数据用GraphPad软件进行处理。

结果，荷瘤裸鼠在尾静脉注射50μg Dy755-Z_{EBV LMP2} affibody荧光蛋白30min后，肿瘤部位即出现明显的荧光信号，1h～8h荧光信号最完整，之后逐渐降低，分别至4h和6h左右信号强度最为明显，与肿瘤大小对应，8h时后肿瘤的荧光成像明显变小，至24h～72h，如图9C逐渐消失，但Zwt蛋白注射后，肿瘤区域未出现荧光聚集现象；将肿瘤区荧光信号其与腿部肌肉处的荧光信号比值进行分析，即肿瘤/正常组织率{K/N ratio＝[肿瘤ROI的背景信号/正常ROI的组织(肌肉)背景信号]}，各时间段的Dy755-Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2}137、Z_{EBV LMP2}142平均荧光强度比值，在6h左右信号强度达到高峰，8h时后肿瘤的荧光强度减弱，直至至24h～72h逐渐消失，如图9D所示，Dy755-Zwt蛋白在肿瘤区域的信号强度则在各时间段未见有明显的增强现象。除肿瘤区域外，双侧肾脏出现了很强的荧光信号，将其与腿部肌肉处的荧光信号比值进行分析，即肾脏/正常组织率{K/N ratio＝[肾脏ROI的背景信号/正常ROI的组织(肌肉)背景信号]}，表明Dy755-Z_{EBV LMP2} affibody主要分布于肾脏，在注射后肾脏的荧光信号逐渐增强，并于6h-8h小时达到高峰，此后逐渐减弱，并于72小时荧光信号基本消失。表明，Z_{EBV LMP2} 12、Z_{EBV LMP2} 132、Z_{EBV LMP2} 137、Z_{EBV LMP2}142及Zwt蛋白主要经裸鼠的肾脏排泄，并于72小时内基本排泄完全，如图9E所示。

因此，本发明的Z_{EBV LMP2} affibody多肽具有靶向结合EBV LMP2表达阳性肿瘤的特性。

实施例6、Z_{EBV LMP2} affitoxin蛋白对EBV LMP2阳性细胞生长的抑制作用

在本实施例中，利用Z_{EBV LMP2}142的靶向作用，携带经改造具有细胞毒作用的绿脓杆菌外毒素A(pseudomonas exotoxinA，PEA)的活性片段PE38KDEL作为细胞毒分子。构建Z_EBVLMP2142/PE38KDEL原核表达载体，并利用原核表达系统制备并纯化了Z_EBVLMP2142/PE38KDEL蛋白，即affitoxin 142，对affitoxin 142与靶蛋白EBV LMP2的特异性结合，及对EBV LMP2表达阳性的细胞株和肿瘤细胞的体内外生长抑制作用进行验证。

1.Z_EBVLMP2 affitoxin 142蛋白的制备和鉴定

选择Z_EBVLMP2142 affibody作为EBV LMP2的靶向分子，利用柔性肽(Gly4Ser)3在其C末端连接PE38(KDEL)，将柔性肽C端连接经原核密码子优化的PE38(KDEL)的全序列，如SEQID NO:14所示，构成Z_EBVLMP2 affitoxin 142分子。即将PE38(KDEL)的全序列DNA合成并经EcoRI和XhoI位点克隆至pET21a(+)载体，构建pET21a(+)/PE38(KDEL)载体，如图10A，B所示，通过分子克隆方法将Z_EBVLMP2142 affibody经NedI和EcoRI克隆至pET21a(+)/PE38(KDEL)载体重组质粒并测序鉴定，进一步将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后表达重组蛋白，用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定。同时构建并原核表达Zwt affitoxin作为对照蛋白。

如图11A，B所示，结果，成功构建了pET21a(+)/Z_EBVLMP2 affitoxin 142及pET21a(+)/Zwt affitoxin重组质粒；该重组质粒在原核表达系统表达并获得纯化的Z_EBVLMP2affitoxin 142及Zwt affitoxin重组蛋白，SDS-PAGE电泳提示在相对分子质量(Mr)约48kDa的位置出现一明显条带，与预期理论值大小相符；由于重组pET21a(+)/Z_EBVLMP2 142/PE38KDEL蛋白(即Z_EBVLMP2 affitoxin 142)的C端含有His标签，所以用亲和层析柱析纯化后，进一步通过Western Blot分析鉴定，结果如图11C所示，His-tag鼠单抗作为一抗，在分子质量约为48kDa均处出现单一条带，提示Z_EBVLMP2 affitoxin 142及Zwt affitoxin重组蛋白能被His-tag单抗特异性识别和结合。表明，Z_EBVLMP2 affitoxin 142及Zwt affitoxin重组纯化蛋白制备成功。

2.Z_EBVLMP2 affitoxin 142蛋白与细胞表达靶蛋白的靶向结合特性

为验证Z_EBVLMP2 affitoxin 142蛋白与EBV LMP2靶向结合的特性，采用细胞免疫荧光方法进一步验证。选择EBV LMP2表达阳性的B95-8、C666-1和CNE-2Z肿瘤细胞株作为靶细胞，及EBV LMP2表达阴性的A375作为阴性对照细胞株。方法同实施例4。简述为将细胞调整数目培养至单层细胞，分别加入终浓度为50μg/ml Z_EBVLMP2 affitoxin 142及Zwtaffitoxin重组纯化蛋白共孵育2h，用预冷PBS洗涤后固定，打孔，封闭1h，洗涤；分别加入鼠抗His单克隆抗体(ABR公司，美国，1：2000)、兔抗SPA血清(1:500)及PE38KDEL鼠血清抗体(1：500)，置37℃1h，洗涤后分别加FITC-羊抗鼠IgG二抗、FITC-羊抗兔IgG二抗(上海联科生物技术公司，中国)，37℃孵育1h,PBST洗涤。加入PI(索莱宝公司，北京)2μl/孔1h染核5分钟，避光，洗涤后加盖玻片并用缓冲甘油封片，共聚焦荧光显微镜(Leica TCSSP2microscope德国)400×下观察并拍片。

如图12A所示，结果在荧光荧显微镜下观察到，经Z_EBVLMP2 affitoxin 142蛋白孵育的B95-8、C666-1和CNE-2Z细胞，在细胞膜可见多个绿色的点状或团块状强荧光信号，而与人黑色素瘤细胞株A375孵育则未见明显的荧光信号；如图12B所示，而对照蛋白Zwtaffitoxin与B95-8、C666-1和CNE-2Z细胞孵育，未见明显的荧光信号。表明，Z_EBVLMP2affitoxin 142重组蛋白能特异性识别细胞株中天然表达EBV LMP2蛋白。

表明，Z_EBVLMP2 affitoxin 142蛋白能特异性识别细胞中天然表达的EBV LMP2蛋白，从细胞水平验证了其对靶细胞表达的EBV LMP2具有特异性结合的亲和力。

3.Z_EBVLMP2 affitoxin 142蛋白对细胞生长的体外抑制作用

为研究Z_EBVLMP2 affitoxin 142体外细胞生长抑制作用，选择Z_EBVLMP2 affitoxin142蛋白作为研究对象。选择选择EBV LMP2表达阳性的B95-8、C666-1和CNE-2Z肿瘤细胞株作为靶细胞，及EBV LMP2表达阴性的A375作为阴性对照细胞株。方法同实施例4。即制备细胞悬液并计数接种于96孔细胞培养板，培养24h后，加入Z_EBVLMP2 affitoxin 142蛋白，分别设置2.2μmol/L、1.11μmol/L、0.56μmol/L、0.28μmol/L、0.14μmol/L、0.07μmol/L、0.035μmol/L浓度组，并以Zwt affibody为对照组，采用CCK-8试剂盒检测细胞的生存率。同时在加样后1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h，检测细胞的生存率。每组均设置3个复孔，并进行3次重复实验。计算细胞生长存活的IC50值及细胞在各时间段的生存率。

结果如图13A、B、C所示，经GraphPad primer 5.0软件来计算B95-8、C666-1和CNE-2Z细胞生长存活的IC50值，分别为0.313±0.054μM、0.412±0.063μM和0.453±0.139μM。图如图13D、E、F、G所示，Z_EBVLMP2 affitoxin 142对EBV LMP2表达阳性的B95-8、C666-1和CNE-2Z生长具有较强的抑制作用，与对照蛋白Zwt和PE38KDEL比较均具有显著性差异(p<0.05)；而对EBV LMP2表达阴性的A375细胞生长则无明显的抑制作用。

以上结果表明，Z_EBVLMP2 affitoxin 142具有抑制B95-8、C666-1和CNE-2Z细胞生长的特性，进一步验证了Z_EBVLMP2 affitoxin 142具有体外EBV LMP2靶向结合特异性。

4.Z_EBVLMP2 affitoxin 142蛋白的半数致死量LD50分析

为研究Z_EBVLMP2 affitoxin 142蛋白急性毒性作用，选择BALB/c雌鼠作为实验对象，并计算其半数致死量。选择4w龄BALB/c雌鼠，18～20g，分为8个剂量组，每组4～7只，见表3。每只小鼠尾静脉仅一次给药，尾静脉注射Z_{EBV LMP2} affitoxin142重组蛋白200μL剂量分别为30mg/kg、25mg/kg、20mg/kg、15mg/kg、10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg和200μL 1×PBS(pH7.4)。注射后高剂量组别小鼠于用药当日出现死亡，低剂量组别小鼠在第14天仍存活，与PBS对照组别结果相似。将小鼠死亡结果用GraphPad primer 5.0software计算，Z_{EBV LMP2}affitoxin142重组蛋白对小鼠的半数致死量(LD₅₀₎为17.147±6.356mg/kg。

表1.Z_EBVLMP2 affitoxin 142蛋白急性毒性作用

剂量(mg/kg)

30

25

20

15

10

5

2.5

0

死亡率(1)

4/4

4/4

7/7

7/7

2/7

2/7

2/7

0/7

死亡率(2)

5/5

5/5

6/7

4/7

2/7

1/7

0/7

0/7

死亡率(3)

5/5

5/5

4/5

3/5

2/5

1/5

0/5

0/5

实施例7、Z_{EBV LMP2} affitoxin蛋白对EBV LMP2荷瘤裸鼠的保护作用

为检测Z_EBVLMP2 affitoxin 142蛋白对肿瘤细胞致瘤作用的保护作用，本实施例采用EBV LMP2表达阳性的鼻咽癌细胞株C666-1细胞制备BALB/c裸鼠的荷瘤模型，具体方法同实施例5，即选择4～5周龄BALB/c-nu小鼠，体重为12-15g，饲养于温州医科大学实验动物中心屏障系统(SPF级)内，荷瘤裸鼠分别分成5组，即Z_EBVLMP2 affitoxin142、Z_EBVLMP2 affibody142、PE38KDEL、Zwt affitoxin及PBS对照组。每组10～12只。将培养48h至对数生长期的C666-1细胞，分别配制成所需的细胞数即1x10⁶/ml，取0.1ml于裸小鼠的背部近左前臂皮下注射，同时将各组蛋白(均为4mg/kg)稀释于0.1ml的PBS中，在裸小鼠肿瘤细胞后，待肿瘤体积长至50～100mm³左右，按组别经尾静脉注射0.1ml对应蛋白，PBS组仅注射0.1ml的PBS。同时，以EBV阴性的人黑色素瘤细胞株A-375(作为阴性对照)荷瘤裸鼠注射Z_EBVLMP2 affitoxin142作为阴性对照。每隔1天注射1次，共15次。每3天观察裸小鼠生活和精神状态等，测量肿瘤大小并拍照记录，观察至42天。

结果如图13所示，Z_EBVLMP2 affitoxin 142蛋白对C666-1肿瘤细胞的致瘤作用具有较强的抑制作用，与各对照组Z_EBVLMP2 affibody 142、PE38KDEL、Zwt affitoxin及PBS对照组蛋白比较，分别在第18天开始出现有显著性差异(p<0.01)；Z_EBVLMP2 affibody 142，与PE38KDEL、Zwt affitoxin及PBS对照组比较，在第24天开始出现有显著性差异(p<0.01)；随着时间的延长，肿瘤体积大小在各组别之间，差异明显变大，直至42天(图13A)。而ZEBVLMP2affitoxin 142蛋白对EBV LMP2阴性的A375肿瘤细胞,则无明显的抑制作用(图13B)。

上述结果表明，ZEBVLMP2 affitoxin 142蛋白具有显著抑制肿瘤细胞的生长作用，即ZEBVLMP2 affitoxin 142蛋白对EBV LMP2具有显著的靶向抑瘤作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> 一种对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽及其应用

<130> 16

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> staphylococcus aureus

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(58)

<400> 1

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 2

<211> 58

<212> PRT

<213> staphylococcus aureus

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(58)

<400> 2

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Ser Ala Ala Ala Pro Arg Glu Ile

1 5 10 15

Ser Met Leu Pro Asn Leu Asn Leu Gly Gln Gln Ala Ala Phe Ile Arg

20 25 30

Ser Leu Ala Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 3

<211> 58

<212> PRT

<213> staphylococcus aureus

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(58)

<400> 3

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Val Arg Ser Ala Val Val Glu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Leu Pro Asn Leu Asn Gln Gly Gln Leu Gln Ala Phe Ile Asp

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 4

<211> 58

<212> PRT

<213> staphylococcus aureus

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(58)

<400> 4

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu His Leu Phe Ala Leu Trp Glu Ile

1 5 10 15

Met Leu Leu Pro Asn Leu Asn His Gln Gln Glu Leu Ala Phe Ile Arg

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 5

<211> 58

<212> PRT

<213> staphylococcus aureus

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(58)

<400> 5

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Ala Leu Arg Ala Arg Gly Glu Ile

1 5 10 15

Ala Trp Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Asp Glu Ala Phe Ile Pro

20 25 30

Ser Leu His Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 6

<211> 174

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(174)

<400> 6

gttgacaaca aattcaacaa agaatccgcc gccgctccgc gggaaatctc gatgctgccg 60

aacctgaacc taggccagca ggctgctttc atccgctctc tggctgacga cccgtctcag 120

tctgctgagc tcctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174

<210> 7

<211> 174

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(174)

<400> 7

gttgacaaca aattcaacaa agaagtgcgg tccgctgtcg tggaaatcct cctgctgccg 60

aacctgaacc aaggacagct acaagctttc atcgattctc tgcgagacga cccgtctcag 120

tctgctgagc tcctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174

<210> 8

<211> 174

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(174)

<400> 8

gttgacaaca aattcaacaa agaacacctg ttcgctttgt gggaaatcat gttgctgccg 60

aacctgaacc atcaacagga actggctttc atccggtctc tgggagacga cccgtctcag 120

tctgctgagc tcctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174

<210> 9

<211> 174

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(174)

<400> 9

gttgacaaca aattcaacaa agaagccctc cgcgctcggg gcgaaatcgc gtggctgccg 60

aacctgaacg aggagcagga cgaggctttc atcccatctc tgcacgacga cccgtctcag 120

tctgctgagc tcctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<400> 10

catatggttg acaacaaatt caacaaagaa 30

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(38)

<400> 11

gggaattcca tatggttgac aacaaattca acaaagaa 38

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(28)

<400> 12

ccggaattcc gtttcggagc ctgagcgt 28

<210> 13

<211> 174

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(174)

<400> 13

gttgacaaca aattcaacaa agaacagcag aacgctttct acgaaatcct gcacctgccg 60

aacctgaacg aagaacagcg taacgctttc atccagtctc tgaaagacga cccgtctcag 120

tctgctaacc tgctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174

<210> 14

<211> 1029

<212> DNA

<213> 多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1029)

<400> 14

ggtggttctc tggctgctct gaccgctcac caggcttgcc acctgccgct ggaaaccttc 60

acccgtcacc gtcagccgcg tggttgggaa cagctggaac agtgcggtta cccggttcag 120

cgtctggttg ctctgtacct ggctgctcgt ctgtcttgga accaggttga ccaggttatc 180

cgtaacgctc tggcttctcc gggttctggt ggtgacctgg gtgaagctat ccgtgaacag 240

ccggaacagg ctcgtctggc tctgaccctg gctgctgctg aatctgaacg tttcgttcgt 300

cagggtaccg gtaacgacga agctggtgct gctggtccgg ctgactctgg tgacgctctg 360

ctggaacgta actacccgac cggtgctgaa tttctgggta acggtggtga cgtttctttc 420

tctacccgtg gtacccagaa ctggaccgtt gaacgtctgc tgcaggctca ccgtcagctg 480

gaagaacgtg gttacgtttt cgttggttac cacggtacct tcctggaagc tgctcagtct 540

atcgttttcg gtggtgttcg tgctcgttct caggacctgg acgctatctg gaggggcttc 600

tacatcgctg gcgacccgga actggcttac ggttacgctc aggaccagga accggacgcg 660

cgtggtaggt tctgcaacgg tgcgctcctg cgtgtctacg tcccgcgttg gaacctgccg 720

ggtttctacc gtaccggtct gaccctggct gctccggaag ctgctggtga agttgaacgt 780

ctgatcggtc acccgctgcc gctgcgtctg gacgctatca ccggtccgga agaagaaggt 840

ggtcgtctgg aaaccatcct gggttggccg ctggctgaac gtaccgttgt tatcccgtct 900

gctatcccga ccgacccgcg taacgttggt ggtgacctgg acccgtcttc tatcccggac 960

aaagaacagg ctatctctgc tctgccggac tacgcttctc agccgggtaa accgccgaaa 1020

gacgaactg 1029

Claims (12)

1.一种对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽，其特征在于，相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，所述对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽的：

第9位氨基酸突变为S、V、H或A；

第10位氨基酸突变为A、R或L；

第11位氨基酸突变为A、S、F或R；

第13位氨基酸突变为P、V、L或R；

第14位氨基酸突变为R、V、W或G；

第17位氨基酸突变为S、L、M或A；

第18位氨基酸突变为M、L或W；

第24位氨基酸突变为L、Q、H或E；

第25位氨基酸突变为G、Q或E；

第27位氨基酸突变为Q、L、E或D；

第28位氨基酸突变为A、Q、L或E；

第32位氨基酸突变为R、D或P；

第35位氨基酸突变为A、R、G或H；

第43位氨基酸突变为E。

2.根据权利要求1所述的一种对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽，其特征在于，所述的对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2-5任一所示。

3.根据权利要求2所述的一种对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽，其特征在于，所述的对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽与LMP2蛋白C端胞膜外区相互作用的KD值为1.28×10^-5M至1.25×10^-7M。

4.一种靶向EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区的靶向性分子，其特征在于，所述靶向性分子包括权利要求1-3中任意一种对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽，以及与该多肽相连接的偶联物，所述偶联物包括但不限于：半胱氨酸残基或多肽标签或抗癌活性的物质或可检测标记物；该可检测标记物包括但不限于：荧光标记、酶、生物素或放射性同位素；

其中所述多肽标签包括但不限于：His标签或Myc标签或GST标签或Flag标签；

其中所述酶包括但不限于：碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶；

其中所述抗癌活性的物质包括但不限于：用于权利要求1-3中任意一种多肽引导效应酶：羧肽酶；或/和用于募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白：IL-2、IFNγ、IL-12、TNFαa、IP10、促凝血因子、组织因子、von Willebrand因子；或/和毒素；或/和细胞毒性药物：auristatin类似物、阿霉素、放射性同位素；

其中所述毒素是具有抑制EB病毒LMP2蛋白阳性肿瘤作用的毒素，包括但不限于白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素或所述白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素的功能性片段。

5.权利要求4所述的一种靶向EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区的靶向性分子，其特征在于，所述偶联物与所述对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽以柔性肽连接，所述柔性肽包括但不限于：(Gly4Ser)3。

6.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求2所述对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽，该多核苷酸如序列SEQ ID NO:6-9所示。

7.一种重组载体，其特征在于，该载体包含权利要求6所述的多核苷酸。

8.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞包含权利要求7所述重组载体，或其基因组中整合有权利要求6所述多核苷酸。

9.一种药物组合物，其特征在于，其包含：权利要求1-3任一所述的对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽或权利要求4中任意一项所述靶向EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区的靶向性分子；和药学上可接受的载体。

10.一种用于诊断EB病毒LMP2蛋白表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括：权利要求4任一所述的靶向EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区的靶向性分子，所述靶向性分子为多肽标签或者可检测标记物，和检测多肽标签或者可检测标记物的检测试剂。

11.一种用于治疗EB病毒感染疾病或EB病毒LMP2蛋白表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括：权利要求1-3任一所述的对EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区具有结合亲和力的多肽或权利要求4中任一靶向EB病毒LMP2蛋白C端胞膜外区的靶向性分子，或权利要求9所述的药物组合物。

12.根据权利要求11所述的一种用于治疗EB病毒感染疾病或EB病毒LMP2蛋白表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，EB病毒LMP2蛋白表达阳性肿瘤包括：鼻咽癌、口腔腺体肿瘤、淋巴瘤、何杰金氏病、胃癌以及器官移植后的B细胞淋巴瘤、艾滋病相关的淋巴瘤。