CN1816563B - 对her2具有结合亲和力的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种多肽，该多肽具有HER2亲和结合力，并与葡萄球菌A蛋白(SPA)的一个结构域相关，即该多肽的序列对应于SPA结构域序列，但具有1到大约20个取代突变。本发明还提供了编码该多肽的核酸，以及表达该多肽的表达载体及宿主细胞。本发明还提供了该多肽作为一种药物和一种靶向试剂引导与其缀合的物质至过表达HER2的细胞的用途。本发明还提供了该多肽的使用方法及用于实施该方法的试剂盒，该方法及试剂盒都基于所述多肽与HER2的结合。

Description

对HER2具有结合亲和力的多肽

技术领域

本发明涉及一种结合人表皮生长受体因子2(以下称为HER2)的新多肽。该多肽与葡萄球菌A蛋白(SPA)的一个结构域相关，其中该多肽的序列对应于SPA结构域的序列，具有至少一个取代突变。本发明也涉及这种HER2结合多肽作为一种药物的应用，更特别地涉及其在制备一种治疗以过表达HER2为特征的癌症的药物中的用途。

背景技术

分子

该分子与Z蛋白有关，来源于葡萄球菌A蛋白(SPA)的B结构域(Nilsson B et al(1987)Protein Engineering 1，107-133)，是通过使用不同的相互作用靶分子从该类分子的随机文库中选择出来的(参见WO95/19374；WO00/63243；Nord K et al(1995)Prot Eng 8：601-608；Nord K et al(1997)Nature Biotechnology 15，772-777)。不同的靶分子被用来选择Z蛋白的衍生物，例如Nord K et al所述(1997，如上)。该论文描述的实验概述了针对给定靶选择Z蛋白衍生物的普通技术原理，而不是为了获得用于特殊的治疗和生物技术用途的具有足够高亲和力的分子这一明确的目的。

HER2及其在癌症疾病中的作用

HER2原癌基因编码一个185kD的细胞表面受体蛋白，被称为HER2蛋白或受体(Hynes NE et al(1994)Biochim Biophys Acta1198：165-184)。该基因有时也被称为neu、HER2/neu或c-erbB-2。neu最早在被乙基亚硝基尿处理过的大鼠中发现，并且表现出该基因的突变类型(Shih C et al(1981)Nature 290：261-264)。这种neu的突变类型能够产生一种具有组成型活性形式的受体，并且形成一种能够在低拷贝数下转化细胞的强力癌基因(Hynes NE et al，如上)。

正常细胞在其质膜上以组织特异形式表达少量的HER2蛋白。目前还没有已知的HER2配体被阐明，但是HER2可以和在与配体形成复合体的HER1(表皮生长因子受体，EGFR)、HER3和HER4形成异源二聚体。这种异源二聚体的形成导致激活的HER2受体将生长信号从胞外传到核，从而控制正常细胞的生长和分裂(Sundaresan S et al(1999)Curr Oncol Rep 1：16-22)。

在肿瘤细胞中，DNA复制系统的错误可导致在一条染色体上的一个基因出现多个拷贝，这种现象也称为基因扩增(geneamplification)。HER2基因的扩增导致这种基因转录的增加。这提高了HER2的mRNA的水平，并伴随着HER2蛋白合成的增加，导致HER2蛋白在这些肿瘤细胞表面过表达。这种过表达可以导致HER2蛋白质水平比临近的正常细胞高10-100倍。这进而导致细胞分裂增加并伴随更高速的细胞生长。HER2基因扩增也暗示正常细胞向癌症表型的转化(Hynes NE et al，如上；Sundaresan S et al如上)。

HER2蛋白的过表达被认为能导致HER2同源二聚体的形成，进而导致形成组成型活性受体(Sliwkowski MX et al(1999)Semin Oncol26(4Suppl 12)：60-70)。在这种情况下，在不存在配体时，生长促进信号不停的传送到细胞中。结果，多种胞间信号传导途径被激活，导致无法控制的细胞生长，并且在某些情况下导致致癌性转化(HynesNE et al，如上)。因此，由生长因子受体介导的信号转导机制对于抑制细胞复制和肿瘤生长而言是重要的靶。

乳腺癌是美国妇女中最普遍的恶性肿瘤，在2001年就有192200个新病例出现(Greenlee R et al(2001)CA Cancer J Clin 51：15-36)。在大约25％的乳腺癌患者中，由于HER2基因扩增导致HER2基因的过表达(Slamon DJ et al(1989)Science 244：707-712)。HER2蛋白的过表达与一些不利预后变数有关，包括雌激素受体阴性状态、高S期比例(S phase fraction)、阳性淋巴结状态(positive nodal status)、突变的p53及高核分级(high nuclear grade)(Sjogren S et al(1998)J Clin Oncol 16(2)：462-469)。根据Slamon et al(如上)的报道，发现HER2基因的扩增与无疾病存活期的缩短和阳性淋巴结患者的总体存活期的缩短有很大的相关性。

基于以上原因，进一步研究HER2在乳腺癌发病机理和治疗中的作用不尽是现在，以后也仍将是一个重要的目标。与HER2相互作用的分子的鉴定也成为上述努力的一部分。

临床前体外研究研究了抑制HER2活性是否会影响肿瘤细胞的生长。与用对照单克隆抗体治疗相比，用一种鼠抗HER2单克隆抗体4D5治疗过表达HER2蛋白的SK-BR-3型乳腺癌细胞确实能抑制肿瘤细胞增殖。将4D5施用给携带过表达HER2的人乳腺癌和卵巢癌的小鼠(异种移植)延长了它们的无肿瘤存活时间。类似的研究也证实了抗HER2单克隆抗体能够抑制小鼠体内人胃癌细胞异种移植物的生长(Pietras RJ et al(1994)Oncogene 9：1829-1838)。

在用抗体抑制大量存在于肿瘤细胞表面的HER2蛋白的方法中，近年来有一种治疗方法开始商业应用。因此，单克隆抗体4D5或trastuzumab为这一目的已经被Hoffman-La Roche和Genentech以的商品名市场化。

尽管用抗体治疗特征在于过表达HER2蛋白的癌症具有明显的优势，但是一些因素也是潜在地能够降低抗体的效能(参见例如ReillyRM et al(1995)Clin Pharmacokinet 28：126-142)。这包括：(1)限制抗体穿透大的实体瘤或者进入致命区域，如脑；(2)降低由于血管透性降低而导致的抗体在靶位点的外渗；(3)抗体的交叉反应和抗体对正常组织的非特异性结合，降低了靶向效果；(4)异质肿瘤的吸收产生未治疗区；(5)注入的抗体代谢提高，降低了治疗效果；及(6)HAMA和人抗人抗体的迅速形成，使治疗性抗体失活。

此外，毒素效应已经成为发展针对癌症的治疗性抗体的主要障碍(Carter P(2001)Nat Rev Cancer 1：118-129；Goldenberg DM(2002)J Nucl Med 43：693-713；Reichert JM(2002)Curr Opin Mol Ther 4：110-118)。与健康组织的交叉反应可导致非缀合(裸露)抗体的实质性副作用，这种副作用在抗体与毒素或放射性同位素缀合时可能会被加强。免疫介导的并发症包括来源于肺部毒素效应的呼吸困难，偶发性中枢和外周神经系统并发症，及肝和肾功能降低。偶然情况下，可以观察到无法预期的毒性并发症，如与HER2靶向抗体trastuzumab

相关的心脏毒素效应(Schneider JW et al(2002)SeminOncol 29(3 suppl 11)：22-28)。用同位素缀合抗体进行放射性免疫治疗也会导致骨髓抑制。

尽管目前应用的抗癌抗体在临床和商业上取得了成功，但有关这种治疗策略的未来的许多重要问题还是存在的。因此，继续致力于研究一种对HER2具有相当的亲和力以及该分子在治疗疾病中的应用在本领域内仍然具有很大的吸引力。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种多肽，其特征在于该多肽与HER2特异性结合。

本发明一个相关目的是一种HER2结合多肽，该多肽具有极少或没有非特异性结合。

本发明的另一个目的是提供一种HER2结合多肽，该多肽能被容易地用作融合多肽的一个部分。

本发明的另一个目的是提供一种HER2结合多肽，该多肽解决了现有抗体试剂中存在的一个或多个已知问题。

本发明的另一个目的是提供一种HER2结合多肽，该多肽可用于治疗用途。

本发明一个相关目的是寻找新的在临床中治疗、抑制和/或靶向特征在于过表达HER2蛋白的癌症的方法。

本发明的另一个目的是提供一种分子，该分子可作为一种试剂用于检测低浓度的HER2。

这些及其它目的被本发明权利要求书所请求保护的本发明的不同方面所满足。因而，第一方面，本发明提供了一种多肽，该多肽具有对HER2的结合亲和力，并与葡萄球菌A蛋白(SPA)的一个结构域相关，即该多肽的序列对应于SPA结构域的序列，但具有1到约20个取代突变。

在本发明的多肽的实施方案中，其对HER2的亲和力即相互作用的K_D值至多为1×10^-6M。在另一个实施方案中，多肽对HER2的亲和力即相互作用的K_D值至多为1×10^-7M。

在另一个实施方案中，本发明的多肽特异性结合HER2蛋白的胞外结构域ECD。

因此，本发明人已发现通过取代诱变SPA的一个结构域可能获得一种高亲和力HER2结合多肽，以及该多肽能与HER2相互作用。本发明的多肽可作为HER2抗体在不同应用中的一种替代物。作为非限制性的实例，其可用于治疗特征为HER2过表达的癌症，通过结合细胞表面HER2用于抑制细胞信号传导，用于癌症的体内和体外诊断，用于将制剂靶向特征为过表达HER2的细胞，用于检测HER2的组织化学方法，用于分离方法以及其它应用。本发明的多肽可以用于依赖于一种试剂与HER2的亲和力的任何方法中。因此，在这些方法中该多肽可用作为一种检测试剂、一种捕获试剂或者分离试剂，而且还可直接用作为一种治疗制剂或者将其它治疗制剂靶向HER2蛋白的手段。体外使用本发明的多肽的方法可以不同方式进行，如微量滴定板、蛋白阵列、生物传感器表面和组织切片等等。为了令本发明多肽适用于特异的用途，在不偏离本发明的范围的情况下，可以对本发明的多肽进行修饰和/或添加。在下面详细描述了这些修饰和添加，其可能包括在同一多肽链中包含的额外的氨基酸，或者标记和/或治疗制剂，其化学缀合或以其它方式结合本发明的多肽。另外，本发明还涵盖了保留了结合HER2能力的该多肽的片段。

“HER2结合亲和力”是指可以例如通过利用表面等离子共振(surface plasmon resonance)技术如

装置进行检测的一种多肽特性。HER2结合亲和力可以通过一个实验进行检测，其中将HER2固定在该装置的感应芯片上，然后将含有待测多肽的样品通过该芯片。或者，也可以将待检测的多肽固定在该装置的感应芯片上，然后将含有HER2的样品通过该芯片。本领域技术人员可以利用所获得的感应图像建立多肽的HER2结合亲和力的至少一种定性测量方法。如果需要定量测量方法，例如为了建立相互作用间的某个K_D值，也可以使用表面等离子共振方法。例如，结合值可以利用2000装置(Biocore AB)进行测定。HER2固定于该装置的感应芯片上，而亲和力待检测的多肽样品通过连续稀释制备并以随机顺序进行注射。然后可从结果中计算K_D值，例如利用该装置制造者提供的软件BIAevaluation 3.2中的1∶1朗缪尔结合模型(Langmuir binding model)。

如上所述，本发明的多肽序列与SPA结构域的序列相关，即所述SPA结构域的1到约20个氨基酸残基被取代为其它氨基酸残基。然而，这些引入的取代突变不应该影响该多肽的基本结构。也就是说，本发明多肽的C_α骨架的所有折叠在本质上与相关的SPA结构域的相同，例如在相同顺序的二级结构具有相同的元件。因此，如果基本结构特性是共有的，例如导致相似的CD光谱的那些特性，则该多肽就落入了具有与SPA结构域相同折叠的定义中。本领域技术人员知道其它相关的参数。在突变时，本质上保持SPA结构域的基本结构的要求限制了该结构域可以进行取代的位置。例如，当从Z蛋白的已知结构开始，优选位于Z蛋白表面的氨基酸残基被取代，而埋在Z蛋白核心“三螺旋束(three-helix bundle)”内部的氨基酸残基则应当保持不变以保护该分子的结构特性。相同的原因适用于其它SPA结构域及其片段。

本发明还涵盖了这样的多肽，其中上述HER2结合多肽作为HER2结合结构域，在任一末端或两端被加入了额外的氨基酸残基。这些额外的氨基酸残基可以在多肽结合HER2时起作用，但是也可同样用于其它目的，涉及例如该多肽的生产、纯化、稳定、偶联或检测的一种或几种。这些额外的氨基酸残基可以包括一或多种为了化学偶联目的而添加的氨基酸残基。一个例子是在多肽链的第一位或最后一位添加，即在N或C末端添加一个半胱氨酸残基。这种额外的氨基酸残基也可以包括用于多肽纯化或检测的一个“标记”，如与特异于标记的抗体相互作用的六组氨酰(His₆)标记，或“myc”标记或“flag”标记。本领域技术人员也知道其它的替代方法。

上述“额外的氨基酸残基”也可构成具有预期功能的一个或多个多肽结构域，如与第一个、HER2结合结构域相同的结合功能，或者其它结合功能，或是一种酶促功能，或是一种荧光功能，或是其组合。

因此，本发明涵盖了与HER2具有亲和力的多肽的多聚体。这一点是令人感兴趣的，例如当使用本发明的多肽治疗癌症或用于一种纯化HER2的方法中以获得与本发明多肽相比可能具有更强的HER2结合。此时，在所述多肽多聚体的提供，如二聚体、三聚体或四聚体都能产生所需的效果。所述多聚体可以由适当数量的本发明的多肽组成。在这些多聚体中形成单体的本发明的这些多肽结构域可以都具有相同的氨基酸序列，但同样也可能具有不同的氨基酸序列。本发明的多聚体中相连接的多肽“单位”可能是通过用已知有机化学方法共价偶联相连，或是在重组表达多肽的系统中表达为一或多个融合多肽，或以任意其它形式连接，如直接或通过接头连接，例如通过氨基酸接头连接。

此外，在“异源”融合多肽中，HER2结合多肽构成了第一个结构域或第一个部分，第二和其它部分具有除了结合HER2外的其它功能，这些可预期的结果也在本发明的范围内。该融合多肽的第二和其它部分可能包含对除了HER2外的其它靶分子具有亲和力的结合结构域。这种结合结构域也可能与SPA结构域相关，但在1到大约20个位置具有取代突变。结果是融合多肽有至少一个HER2结合结构域和至少一个与所述其它靶分子具有亲和力的结构域，其中两个结构域都与SPA结构域相关。这也使产生能用在许多生物技术应用中的多特异性试剂成为可能，如作为治疗制剂或作为捕获、检测或分离试剂。对于这种与SPA结构域相关多肽的多特异性多聚体的制备，上述对于多种HER2结合“单位”的多聚体的描述仍然有效，所述多特异性多聚体中至少一个多肽具有对HER2的亲和力。在其它选择中，第二或其它部分可能包含一个不相关的、自然形成或重组的蛋白(或其一个保留了自然形成或重组蛋白的结合能力的片段)，其具有对靶的结合亲和力。这种对人血清白蛋白具有亲和力并可以作为本发明的HER2结合SPA结构域衍生物的融合配偶体的结合蛋白的例子就是链球菌G蛋白(SPG)的白蛋白结合结构域(Nygren P-et al(1988)MolRecogn 1：69-74)。一种HER2结合SPA结构域相关多肽和SPG的白蛋白结合结构域的融合多肽就落入了本发明的范围内。当本发明的多肽作为一种治疗制剂或作为靶向制剂施用人体时，其与结合血清白蛋白的部分的融合将会被证明是有益的，因为与单独的SPA结构域相关的HER2结合部分的半衰期相比，在体内这种融合蛋白的半衰期很可能被证明会延长(其原理已例如在WO91/01743中描述)。

其它产生融合多肽的可能性也被想到。因此，根据本发明的第一方面的与HER2结合SPA结构域相关多肽将会与第二或其它部分共价偶联，其除了靶结合还展示了其它功能或者没有靶结合而有其它功能。一个例子就是一或多个HER2结合多肽和一种作为报道子或效应部分的具有酶促活性的多肽的融合物。可以与HER2结合多肽偶联形成一种融合蛋白的报道酶的例子是本领域技术人员已知的，且包括酶如β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、羧肽酶。本发明的融合多肽的第二和其它部分的其它选择包括荧光多肽，如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶及其变体。

本发明融合多肽第二和其它部分的其它选择包括用于治疗性应用的一或多种部分。在治疗性应用中，其它分子也可以通过其它方法共价或非共价偶联到本发明的多肽上。非限制性例子包括用本发明多肽引导效应酶(例如羧肽酶)而进行“ADEPT”(抗体介导的酶前药治疗，antibody-directed enzyme prodrug therapy)的酶；包括用以募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白质；细胞因子，如IL-2、IL-12、TNFα、IP10；包括促凝血因子，如组织因子、von Willebrand因子；包括毒素，如蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物碱；包括毒性小分子，如auristatin类似物、阿霉素。同时，为了更方便掺入放射性核素用于诊断(如⁶⁸Ga、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹²⁴I、¹²⁵I)或治疗(如⁹⁰Y、¹³¹I、²¹¹At)，可以考虑上述列举的额外的氨基酸(特别是六组胺酸标记和半胱氨酸)，其目的是将放射性同位素的螯合剂偶联到多肽序列。

本发明涵盖了这样的多肽，其中上述HER2结合多肽具有一个标记基团例如用于多肽检测的目的，如至少一个荧光团、生物素或放射性同位素。

在描述整合了本发明的HER2结合多肽的融合蛋白时，需要说明的是第一、第二和其它部分的命名是用于清晰的原因，以区别一方面的HER2结合部分和另一方面具有其它功能的部分。这些命名并不是指融合蛋白的多肽链中不同结构域的实际顺序。因此，例如所述第一部分可能并不局限于出现在融合蛋白的N末端、中间部分或C末端。

用SPA结构域作为起点来产生本发明的多肽的一个例子是蛋白Z，该蛋白来源于葡萄球菌A蛋白的B结构域。如在背景部分所指出的，该蛋白曾被用作脚手架结构以产生命名为

的分子，其能够结合多种靶。未被修饰过的Z蛋白的58个氨基酸序列被称为Zwt，如SEQ ID NO：1所示并显示在图1中。

在本发明多肽的一个实施方案中，其与SPA的结构域相关，因为该多肽的序列相应于SPA结构域的序列，具有4到约20个取代突变。其它实施方案可能具有1到约13个取代突变，或4到约13个取代突变。

在本发明多肽的一个更特异的实施方案中，其序列与相应于SEQID NO：1中所示的序列，有1到约20个取代突变，如4到约20、1到约13或4到约13个取代突变。

本发明的多肽在一些实施方案中相应于SEQ ID NO：1中所示的序列，其序列在13、14、28、32和35位的一或多个位置包括取代突变。另外，本发明的多肽序列还可以在9、10、11、17、18、24、25和27位的一或多个位置包括取代突变。

本发明另一个实施方案的多肽序列相应于SEQ ID NO：1，其包括至少在13位的由苯丙氨酸到酪氨酸的一个取代突变。

本发明另一个实施方案的多肽序列相应于SEQ ID NO：1，其包括至少在14位的由酪氨酸到色氨酸的一个取代突变。

本发明另一个实施方案的多肽序列相应于SEQ ID NO：1，其包括至少在28位的由天冬酰胺到选自精氨酸或组氨酸的氨基酸残基的一个取代突变，优选为到精氨酸。

本发明另一个实施方案的多肽序列相应于SEQ ID NO：1，其包括至少在32位的由谷氨酰胺到精氨酸的一个取代突变。

本发明另一个实施方案的多肽序列相应于SEQ ID NO：1，其包括至少在35位的由赖氨酸到酪氨酸的一个取代突变。

本发明另一个实施方案的多肽序列相应于SEQ ID NO：1，其包括至少在10位的由谷氨酰胺到精氨酸的一个取代突变。

本发明另一个实施方案的多肽序列相应于SEQ ID NO：1，其包括至少在11位的由天冬酰胺到苏氨酸的一个取代突变。

本发明另一个实施方案的多肽序列相应于SEQ ID NO：1，其包括至少在17位的由亮氨酸到缬氨酸的一个取代突变。

本发明另一个实施方案的多肽序列相应于SEQ ID NO：1，其包括至少在27位的由精氨酸到选自赖氨酸或丝氨酸的氨基酸残基的一个取代突变。

本发明一个优选的多肽相应于SEQ ID NO：1，其包括至少以下的突变：F13Y、Y14W、N28R、Q32R和K35Y。

本发明不同实施方案多肽的特异序列的例子中每一个都包括一或多个上述特异性突变，如SEQ ID NO：2-79所示并在图1中阐述。这些多肽的HER2结合特性在本发明概述后的实施例中加以揭示。

作为使用没有修饰的SPA结构域的一种替代，SPA结构域也会被诱变进而增加其在碱性条件下的稳定性。这种稳定性包括用对于碱性条件较不敏感的氨基酸残基定点取代在没有修饰的序列中出现的任何天冬酰胺残基。当使用本发明的多肽作为亲和层析中的亲和配体时，这种对碱具有降低的敏感性的特性是有益的；由于在不同的反应之间亲和层析柱要经受频繁的强碱处理以进行就地清洗(CIP，cleaning in place)，因此耐受这种处理的能力能够延长亲和层析基质的使用寿命。例如，利用蛋白Z作为起点，本发明的多肽不仅有赋予HER2结合的取代突变，还有选自N3、N6、N11、N21、N23、N28、N43和N52的至少一个天冬酰胺残基被对碱处理较不敏感的氨基酸残基所取代的修饰。这种多肽的非限制性例子具有下列突变(参考Z_wt序列)：N3A；N6D；N3A、N6D和N23T；N3A、N6D、N23T和N28A；N23T；N23T和N43E；N28A；N6A；N11S；N11S和N23T；N6A和N23T。因此，这些SPA结构域以及其它为了稳定性的原因而发生天冬酰胺突变的SPA结构域都被进一步进行氨基酸残基的取代突变以获得本发明的HER2结合多肽。或者，本发明的、包含天冬酰胺残基的HER2结合多肽也被进一步突变以取代这些残基。显然，后一种选择只有在保留该分子的HER2结合能力的程度下才是可能的。

本发明也涵盖了通过产生上述多肽的片段而衍生自上述任何多肽的多肽，所述片段保留了HER2亲和力。片段多肽是那些保留了稳定性并保留了结合HER2的特异性的。产生对免疫球蛋白G具有保留的结合特异性的野生型SPA结构域的片段的可能性在Proc NatlAcad Sci USA 93：5688-5692(1996)中由Braisted AC和Wells JA et al示出。通过使用基于结构的设计和噬菌体展示的方法，具有59个残基的三螺旋束的结合结构域降低到具有33个残基的双螺旋衍生物。这通过在不同的区域逐步选择随机突变，使稳定性和结合亲和力被反复(iteratively)改良而达到。根据与本发明第一方面的多肽相同的推理，本领域技术人员可以得到一个与“亲代”HER2多肽具有相同结合特性的“最小化”HER2结合多肽。因此，一个构成了本发明上述方面的多肽的、保留了对HER2的结合亲和力的片段的多肽是本发明的另一个方面。

本发明的另一个方面涉及包含编码本发明多肽的序列的核酸分子。

本发明的另一个方面涉及包含前述方面的核酸分子的表达载体，以及其它能够通过表达所述核酸分子而生产本发明多肽的其它核酸元件。

本发明的另一个方面涉及包含前述方面的表达载体的宿主细胞。

本发明所述的上述后三个方面是生产本发明多肽的工具，基于要表达多肽的信息和目前重组表达蛋白质的技术水平，本领域技术人员可以得到这些工具并且将其应用于实践而不需要过多负担。例如，表达未被修饰的蛋白Z的质粒可以用作起始材料(参见例如Nilsson B etal(1987)，如前)。使用已知技术，所需的取代突变可以被引入这个质粒中以获得本发明的表达载体。

然而，本发明的多肽也可通过其它方式生产，包括化学合成或在不同的原核或真核宿主中表达，所述宿主包括植物和转基因动物。当使用化学多肽合成时，上述多肽中的任何天然产生的氨基酸残基都可以被任何相应的、非天然产生的氨基酸残基或其衍生物所取代，只要多肽的HER2结合能力基本不被损害。所述结合能力应该至少被保留，用相应的、非天然产生的氨基酸残基或其衍生物取代实际上可能改良多肽的HER2结合能力。并且，掺入非天然产生的氨基酸可以为HER2结合多肽提供其它分子偶联的位点。非经典氨基酸或合成的氨基酸类似物，包括但不限于普通氨基酸D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、t-丁基甘氨基、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟氨基酸；设计氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸及通常的氨基酸类似物。并且，所述氨基酸残基可以D或L的形式存在。

本分明也涉及使用上述HER2结合多肽的不同方面，以及不同的治疗、诊断、检测方法，其中由于其结合特性而使用所述多肽。当在以下描述用途和方法中涉及“HER2结合多肽”时，该术语不仅涵盖HER2结合多肽本身，还包括基于上述多肽的所有分子，例如构成多肽片段和/或在融合蛋白中将HER2结合多肽掺入成为一个部分和/或与标记或治疗制剂缀合和/或具有额外的氨基酸残基作为标记或用于其他目的的分子。如上述，这些融合蛋白、衍生物、片段等构成了本发明的一个部分。

因此，在某个方面，本发明提供了本文所述的HER2结合多肽作为药物的应用。

在另一个方面，本发明提供了本文所述的HER2结合多肽在制备一种用于治疗至少一种特征在于过表达HER2的癌症的药物中的应用。特征在于过表达HER2的一种特定的癌症是乳腺癌。如在背景部分提到的，所有乳腺癌患者中约25％的患者表现出过表达HER2(Slamon DJ et al，如前)。

并不局限于这个理论，本文所述的多肽可以作为治疗制剂基于至少一种以下机制：(i)加强化疗(细胞毒性)，施用该多肽会与目前和将来的化疗和激素治疗协同作用。阻断细胞表面的HER2蛋白已经被证明能阻止在DNA破坏药物影响后的DNA修复(Pietras RJ et al(1994)Oncogene 9：1829-1838)。(ii)对肿瘤细胞增殖的抑制(抑制细胞)。这个推理基于如下观察，当一个分子(抗体)附着于细胞表面的HER2蛋白上时，导致一些受体被胞吞，限制了进一步的细胞生长信号，从而发生了HER2蛋白的下调(Baselga J et al(1998)Cancer Res58：2825-2831；Sliwkowski MX et al，如前)。

本发明的一个相关方面是提供了一种治疗至少一种特征为过表达HER2的癌症的方法，该方法包括将治疗有效量的组合物施用给需要这种治疗的患者，该组合物包括本文所述的HER2结合多肽作为活性物质。

本发明的多肽的HER2结合特性以及用该多肽生产融合蛋白和/或标记的结合分子的稳定性意味着该多肽也可以用于将其它活性物质靶向肿瘤部位，这些肿瘤包括过表达HER2的细胞。因此，本发明的另一方面是提供了本文所述的HER2结合多肽与一种具有抗癌活性的物质缀合的应用，以将所述物质运送到过表达HER2的细胞。所述缀合的物质也可以具有引起患者内源免疫系统应答的功能。自然杀伤(NK)细胞或者其它免疫系统的效应子会被吸引到细胞表面的HER2和HER2结合多肽的复合物上，这通过一种具有能募集该效应子的功能的融合部分实现。NK细胞或其它效应子，检测细胞出现异常后，附着到HER2结合融合蛋白上。最后，癌细胞被NK细胞消灭。(Sliwkowski MX et al，如前；Pegram MD et al(1997)Proc Am AssocCancer Res 38：602，Abstract 4044)。

这种活性物质可能是通过融合或通过化学键偶联到HER2结合多肽上的蛋白质，如选自用于“ADEPT”(antibody-directed enzymeprodrug therapy)应用的效应酶；用于募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白；细胞因子，如IL-2、IL-12、TNFα、IP10；促凝血因子，如组织因子、von Willebrand因子；毒素，如蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物碱。或者，所述活性物质也可能是细胞毒性药物，如auristatin类似物或阿霉素或放射性同位素(如⁹⁰Y、¹³¹I、²¹¹At)，这种同位素可与HER2结合多肽直接结合，或通过一种螯合剂，如熟知的螯合剂DOTA或DTPA而与HER2结合多肽结合。

在相关方面，本发明还提供了一种在体内将具有抗癌活性的物质导向过表达HER2细胞的方法，包括施用给患者本文所述的所述活性物质与HER2结合多肽的缀合物。这种缀合物在前文已被适当描述。

本发明的另一方面是使用本文所述的HER2结合多肽检测样品中的HER2。例如，这种检测可以用来诊断特征为过表达HER2的疾病情况。检测HER2的存在可以在体内也可以在体外进行。体内诊断的优选选择是使用正电子放射X线断层摄影术，PET。被检测的样品可以例如是生物学液体样品或组织样品。现在的普遍方法是用针对HER2的抗体，这种方法可以适用于本发明的HER2结合多肽，这种方法是组织化学方法检测HER2的存在，用来鉴定新鲜、冷冻或福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品中HER2蛋白的过表达。为了检测HER2，本发明的多肽也能用作融合蛋白的一部分，其中其它结构域是报告酶或荧光酶。或者，其也可以是被一个或多个荧光制剂和/或放射性同位素标记的，任选通过螯合剂标记。合适的放射性同位素包括⁶⁸Ga、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹²⁴I和¹²⁵I。

本发明的另一个方面是本文所述的HER2结合多肽在检测生物学液体样品中HER2的方法中的应用。这个方法包括以下步骤：(i)提供被检测患者的生物学液体样品，(ii)将本文所述的HER2结合多肽在能使所述多肽与样品中存在的任何HER2结合的条件下加入样品中，(iii)除去非结合的多肽，及(iv)检测结合的多肽。被检测到的结合的多肽的量与样品中存在的HER2量相关。在步骤(ii)中，HER2结合多肽可以以任何适宜的形式加入到样品中，包括例如这样的情况，当HER2结合多肽被固定在一种固体支持物上，通过其使样品接触，以及这样的设置，其中HER2结合多肽存在于溶液中。

其它与本发明相关的方面是一种用来检测样品中HER2的方法，包括如下步骤：(i)提供一种怀疑含有HER2的组织样品，例如一个冷冻切片或用福尔马林包埋的组织切片，(ii)在适宜条件下加入本发明的HER2结合多肽到所述样品中，所述条件为益于所述多肽与样品中存在的任何HER2结合，(iii)除去未结合的多肽，及(iv)检测结合的多肽。检测到的结合的多肽的量与样品中存在的HER2的量相关。

本发明还提供了一个诊断组织样品中HER2过表达的试剂盒，包括与报告酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)融合的、本发明的HER2结合多肽、检测酶活性的试剂、和阳性和阴性对照组织切片。

本发明还提供了一个诊断组织样品中HER2过表达的试剂盒，包括通过抗体检测的与标记(如flag标记或myc标记)融合的本发明的HER2结合多肽、一个特异于标记的一抗、特异于一抗并与报告酶缀合的二抗、检测酶活性的试剂，和阳性和阴性对照组织切片。

诊断应用的一个领域就是在体内检测癌细胞或其聚集物。本发明提供了一个进行这种诊断的试剂盒，该试剂盒包括标记有一个螯合物的、本发明的HER2结合多肽、一种诊断用放射性同位素(非限制性的例子是⁶⁸Ga、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹²⁴I和¹²⁵I)，以及用于分析掺入效率的试剂。

如上所述，本发明涵盖了本发明的HER2结合多肽将活性物质靶向过表达HER2的细胞如某些类型的癌症细胞的应用。本发明还提供了一个用于此目的的试剂盒，该试剂盒包括用一个螯合物标记的本发明的HER2结合多肽、一个治疗性放射性同位素(非限制性的例子是(⁹⁰Y、¹³¹I、²¹¹At)，以及用于分析掺入效率的试剂。

附图说明

图1显示序列表的序列的对比。本发明的多肽Z_HER2中被修饰的氨基酸位点在图中已用黑体标出(SEQ ID NO：2-79)。

图2显示实施例1中产生的一个融合多肽的氨基酸序列示意图。Z_HER2代表具有选自SEQ ID NO：2-3的序列的HER2结合结构域，His₆代表六组氨酰标记。

图3显示纯化的融合蛋白的凝胶电泳结果。泳道1：His₆-Z_HER2A(8.7kDa)；泳道2：His₆-Z_HER2 B(8.7kDa)；M：分子量标准(LMW-SDSMarker Kit，Amersham Biosciences#17-0446-01)。

图4显示向感应芯片表面注射10μM的His₆-Z_HER2 A融合蛋白后所获得的Biacore感应图(sensorgram)，所述表面上固定有A：HER2，B：HIV-1gp120和C：BB。

图5显示向感应芯片表面注射10μM的His₆-Z_HER2B融合蛋白后所获得的Biacore感应图(sensorgram)，所述表面上固定有A：HER2，B：HIV-1gp120和C：BB。

图6显示向其上固定有HER2的感应芯片表面注射A：1μM；B：2μM；C：5μM；D：10μM；E：20μM；F：40μM的His₆-Z_HER2A融合蛋白后获得的Biacore感应图。

图7显示向其上固定有HER2的感应芯片表面注射A：1μM；B：2μM；C：5μM；D：10μM；E：20μM；F：40μM的His₆-Z_HER2B融合蛋白后获得的Biacore感应图。

图8A显示HER2-ECD流动池(flow-cell)表面注射选定浓度的His₆-Z_HER2A后获得的Biacore感应图，所述浓度为：312.5nM(实心菱形)，156.3nM(实心圆形)，78.2nM(实心三角形)，39.1nM(空心正方形)，19.6nM(空心菱形)，和9.8nM(空心圆形)。

图8B显示HER2-ECD流动池表面注射选定浓度的His₆-Z_HER2B后获得的Biacore感应图，所述浓度为：625nM(实心方形)，312.5nM(实心菱形)，156.3nM(实心圆形)，78.2nM(实心三角形)，39.1nM(空心正方形)和19.6nM(空心菱形)。

图9显示His₆-Z_HER2A与SKBR-3细胞结合的特异性。在估计理论配体：HER2受体比率为5∶1时，¹²⁵I标记的His₆-Z_HER2A结合SKBR-3细胞。所有数值为三次实验的平均值，误差棒(error bar)表示标准差。

图10显示向有胺偶联HER2-ECD的感应芯片流动池表面注射纯化的His₆-Z_HER2A(空心正方形)和His₆-(Z_HER2A)₂(实心正方形)后获得的Biacore感应图。曲线上的y值已被标准化为0-100共振单位(Resonance Unit)。插入的SDS-PAGE凝胶(16％的Tris-甘氨酸同质凝胶，还原条件)显示表达的和IMAC纯化的His₆-Z_HER2A(泳道1)和His₆-(Z_HER2A)₂(泳道2)。泳道M为分子量为kDa的标记蛋白。

图11显示注射¹²⁵I-苯甲酸酯-(Z_HER2A)₂后1小时携带肿瘤的裸鼠中放射活性生物分布的比较。封闭：用未标记的(Z_HER2A)₂预注射小鼠的数据。非封闭：没有预注射的小鼠的数据。

图12显示注射¹²⁵I-苯甲酸酯-(Z_HER2A)₂(Z4具体)或者¹²⁵I-苯甲酸酯-Z_Taq(Ztaq5∶4)后4小时携带肿瘤的裸鼠中放射活性生物分布的比较。

图13显示注射¹²⁵I-苯甲酸酯-(Z_HER2A)₂后不同时间点放射性碘在携带肿瘤的裸鼠中的生物分布。数据由两次生物分布实验结果组成。注射后4小时的数据是两次实验结果的平均值。

图14显示注射¹²⁵I-苯甲酸酯-(Z_HER2A)₂后8小时携带肿瘤的裸鼠中放射性碘的生物分布。

图15显示血液和肿瘤中放射活性浓度的比较。数据由两次生物分布实验结果组成，A：实验数据，B：通过以两相指数衰减模式(two-phase exponential decay model)进行非线性回归而拟合的曲线。

图16显示放射性浓度的肿瘤和血液比率。数据由两次生物分布实验结果组成。

图17是iv尾注射¹²⁵I-苯甲酸酯-(Z_HER2A)₂缀合物后后6小时(左侧小鼠)和8小时(右侧小鼠)携带肿瘤的小鼠(SKOV-3)的全身γ照相图。

图18显示注射¹²⁵I-苯甲酸酯-Z_HER2A后4小时携带肿瘤的裸鼠中放射性的生物分布。

图19显示注射¹²⁵I-苯甲酸酯-Z_HER2A后24小时携带肿瘤的裸鼠中放射性的生物分布。

图20显示注射¹²⁵I-苯甲酸酯-Z_HER2A后在不同时间点在携带肿瘤的裸鼠的肿瘤和血液中放射性碘的动力学。

图21显示注射¹²⁵I-苯甲酸酯-Z_HER2A后放射性的肿瘤和血液比率。

图22是实施例6中产生的一个融合多肽的氨基酸序列的示意图。Z_HER2A代表具有SEQ ID NO：2所示序列的HER2结合结构域，ABD代表葡萄球菌G蛋白的白蛋白结合结构域。

图23显示注射¹²⁵I-苯甲酸酯-ABD(Z_HER2A)₂后12小时(灰色)和24小时(白色)携带肿瘤的裸鼠中放射性的生物分布。

图24显示注射(A)：¹²⁵I-ABD(Z_HER2A)₂，(B)：¹²⁵I-(Z_HER2A)₂和(C)：¹²⁵I-Z_HER2A后在不同时间点携带肿瘤的裸鼠的肿瘤中放射性碘的动力学。

图25显示¹²⁵I-苯甲酸酯-Z_HER2A，¹²⁵I-苯甲酸酯-(Z_HER2A)₂和^99mTc-(Z_HER2A)₂的输送剂量的比较。

图26显示注射将^99mTc-(Z_HER2A)₂后8小时携带肿瘤的裸鼠中放射性的生物分布。

图27显示注射^99mTc-(Z_HER2A)₂后8小时携带肿瘤的裸鼠的选定器官中放射性的比较。

图28是显示SKBR-3细胞在经²¹¹At-(Z_HER2A)₂照射24小时后的生长图。曲线A的黑色实心圆圈代表没有被照射的细胞，曲线B的空心方形代表中等水平的²¹¹At-(Z_HER2A)₂照射的细胞，曲线D的实心灰色方形代表用高水平的²¹¹At-(Z_HER2A)₂照射的细胞。曲线C的实心灰色三角形代表用组合有500倍超量的非标记His₆-(Z_HER2A)₂的高水平的²¹¹At-(Z_HER2)₂照射的细胞。所有数值都是三次实验的平均值，误差值表示标准差。

图29A和B显示用于测定从第四和第五轮亲和力成熟选择中挑选出的克隆的结合活性的ABAS ELISA的结果。

图30是实施例9和10中产生的融合多肽的氨基酸序列的示意图。Z_HER2代表本发明第一方面的HER2结合多肽，His₆代表六组氨酰标记。

图31为当以约50nM的浓度注射于HER2包被的表面时，从本发明的10个亲和力成熟的HER2结合多肽获得的感应图的总体图。A：Z_HER2:205，B：Z_HER2:149；C：Z_HER2:202；D：Z_HER2A；E：Z_HER2:222；F：Z_HER2:225；G：Z_HER2:209；H：Z_HER2:229；I：Z_HER2:207；J：Z_HER2:107；K：Z_HER2:101。注意，本研究中添加了Z_HER2A，其是从第一代文库中选择分离的。

图32显示了具有特异性HER2结合活性的Z_HER2变体的结合分析结果。如图所示的是向含有HER2或HIV-1 gp120的感应芯片表面注射(A)Z_HER2:3053(B)Z_HER2:0434(C)Z_HER2:0024*所获得的总体感应图。

下面通过非限制性实施例的描述对本发明进行进一步阐述。

实施例1

HER2结合多肽的选择与研究

在本实验中，本发明的多个HER2结合多肽是从一个含有许多不同的SPA结构域相关多肽的文库中选择的，并在随后进行了定性。

文库淘选(panning)和克隆选择

一个组合噬菌体展示文库已由Nord K et al(1995，如前)基本制备。本研究所用的该文库池(pool)中包含有8.7×10⁸个Z蛋白变体(分子)，其在第9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32和35位具有随机的氨基酸残基。用生物素酰化的人HER2胞外结构域(HER2-ECD)作为靶(重组人HER2胞外结构域，氨基酸238-2109，由Fox Chase Cancer Center，Philadelphia，USA提供)在四轮淘选循环中选择结合抗原的

分子。经过这四轮选择循环，共挑出91个克隆用于噬菌体ELISA以分析其HER2结合活性。

用于HER2结合分析的噬菌体ELISA

将经四轮选择获得的克隆的噬菌体置于96孔板上生产，酶联免疫吸附分析(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)用于筛选表达HER2结合分子的噬菌体。单菌落用于接种在深孔96孔板中的补充有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的250μl TSB培养基(30.0克胰胨豆胨肉汤(Tryptic Soy Broth)(Merck)，加水至1升，高压灭菌)，37℃在摇床上过夜生长。取5μl的过夜培养物加入到新平板中补充了0.1％的葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的500μl的TSB+YE培养基(30.0克胰胨豆胨肉汤(Merck)，5.0g酵母提取物，加水至1升，高压灭菌)中。在37℃生长3小时后，向每个孔中加入0.5μl的5×10¹²pfu/ml(2.5×10⁹pfu)辅助噬菌体M13K07(NewEngland Biolabs，#NO315S)和100μl的TSB+YE培养基，然后将平板于37℃不摇动温育30分钟。向每个孔中加入补充了IPTG、卡那霉素和氨苄青霉素的300μl的TSB+YE至终浓度为1mM的IPTG，25μg/ml的卡那霉素和100μg/ml的氨苄青霉素，平板在30℃在摇床上温育过夜。将细胞以2500g离心15分钟沉淀，含有表达分子的噬菌体的上清用于ELISA。将100μl的含4μg/ml的HER2的PBS(2.68mM KCl，137mM NaCl，1.47mM KH₂PO₄，8.1mM Na₂HPO₄，pH7.4)加到微量滴定板(Nunc#446612)，并于4℃温育1个月。在室温下用含2％脱脂奶粉的PBS(封闭缓冲液)对封闭孔1小时后，加入200μl含噬菌体的上清和50μl的10％封闭缓冲液。平板在室温温育2小时。将多克隆抗体(兔抗M13，Abcam#ab6188)用2％封闭缓冲液1∶1000稀释，向每个孔中加入150μl。平板在室温温育1小时。缀合了碱性磷酸酶的山羊抗兔IgG抗体(Sigma#A-3687)用2％封闭缓冲液1∶10000稀释，之后向每个孔中加入150μl并在室温温育1小时。用含有1M二乙醇胺，5mM MgCl2，pH9.8及水的1∶1混合物溶解Sigma-104底物(Sigma#104-105)配制显影液(1片/5ml的1∶1混合物)。然后，向每个孔中加入180μl的显影液。每次加入新的试剂之前，用PBS-T(PBS+0.1％Tween-20)洗孔两次并用PBS洗一次。加入底物25分钟后，在ELISA分光光度计(Basic Sunrise，Tecan)上读取A₄₀₅的值。

用高于0.5的A₄₀₅的ELISA值为阈值标准，鉴定编码HER2结合物(binder)的噬菌体。48个克隆的ELISA信号高于这个值，并与另外随机挑选的5个无ELISA值的克隆进行DNA序列分析。

DNA序列分析

利用

BigDye^TM Terminator v2.0 Ready ReactionCycle测序试剂盒(Applied Biosystems)根据厂商的指导从上述方法中所分离的克隆的DNA进行测序。制备质粒以及用寡核苷酸RIT-27(5′-GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG-3’)和生物素酰化的NOKA-2(5′-生物素-CGGAACCAGAGCCACCACCGG-3′)对编码分子的DNA进行测序。在3700 Genetic Analyser(AppliedBiosystems)上分析序列。在上述挑选的53个克隆中，发现有一些克隆编码相同的氨基酸序列。考虑到简并，在ELISA结合分析中选择的克隆表达的4种

分子的序列如图1所示(Z_HER2A-D)，并在序列表中鉴定为SEQ ID NO：2-5。

克隆和蛋白生产

使用如图2示意图所示的编码构建体的表达载体，在大肠杆菌(E.coli)中表达Z_HER2多肽。所述多肽从而生产为与N末端六组氨酰标记的融合体。在固定的金属离子亲和层析(IMAC)柱上纯化融合多肽His₆-Z_HER2A和His₆-Z_HER2B并在SDS-PAGE上进行分析。

SDS-PAGE实验的结果如图3所示。

融合多肽的生物传感器分析

在

2000系统(Biacore AB，Uppsala，Sweden)上利用表面等离子共振分析上述部分生产的His标记的Z_HER2变体与HER2之间的相互作用。根据操作手册，在不同的流动池上通过偶联于CM-5芯片表面上羧化葡聚糖层的胺将人HER2，HIV-1 gp120(ProteinSciences Corporation，#2003-MN)和BB(源自链球菌G蛋白的白蛋白结合蛋白)固定，后两者作为对照。人HER2、HIV-1gp120和BB的固化分别产生了1900、6290和1000的共振单位(RU)。第四个流动池表面被激活和失活以作为注射时的空白对照。用HBS(5mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％表面活性剂P-20，pH7.4)将His₆-Z_HER2A和His₆-Z_HER2B蛋白稀释到终浓度为10μM，并以固定流速30μl/分钟和随机顺序注射，均一式两份。纯化的蛋白His₆-Z_HER2A和His₆-Z_HER2B与HER2相互作用的能力已被证实，分别在图4和5中的感应图加以说明。

此外，也对His₆-Z_HER2A和His₆-Z_HER2B进行了动力学研究。使用了人HER2固化其上的、具有1900RU的CM-5芯片。在HBS中分别制备了His₆-Z_HER2A和His₆-Z_HER2B的一系列六个不同浓度(1μM-40μM)，并以流速30μl/分钟和随机顺序注射，均一式两份。总注射时间为50秒(缔合)，随后洗涤6分钟(解离)。用20mM HCl处理10秒使表面再生。具有固定的HER2的池的测量应答应减去参照池(激活/失活表面)的测量应答。利用BIAevaluation 3.0.2软件(BiacoreAB)的1∶1朗缪尔结合模型分析结合曲线(感应图)。如图6(His₆-Z_HER2A)和图7(His₆-Z_HER2B)所示结合曲线清楚示出，His₆-Z_HER2A和His₆-Z_HER2B同样清楚地结合于HER2，该结果被缔合和解离曲线所证实，该曲线显示His₆-Z_HER2A的指示K_D为10-100nM，而His₆-Z_HER2B的为200-400nM。此外，结合是选择性的，因为所研究的HER2结合多肽不与BB和gp120对照抗原结合(图4和图5)。

在第二个动力学实验中，His₆-Z_HER2A和His₆-Z_HER2B变体以不同浓度(0-5μM，His₆-Z_HER2A最低浓度为0.0098μM，His₆-Z_HER2B最低浓度为0.0196μM，HBS稀释)和30μl/分钟的流速被注射到HER2表面。在动力学分析之前，蛋白浓度通过氨基酸分析确定。解离平衡常数(K_D)，缔合速率常数(K_a)以及解离速率常数(K_d)用BIAevaluation3.0.2软件(Biacore)在假设一对一结合的条件下进行计算。对于首先的两个Biacore分析，样品在25℃以随机顺序一式两份，而且每次注射之后，通过注射10mM HCl使流动池再生。在评估结合曲线(图8A-8B)时，可确定His₆-Z_HER2A的解离平衡常数(K_D)约为50nM，而His₆-Z_HER2B的约为140nM。导致K_D差异的原因极有可能是解离速率的显著差异，可以通过比较图4的图表A和图5的图表A看出。对His₆-Z_HER2A，缔合速率常数(K_a)约为1.8×10⁵M^-1s^-1，解离速率常数(K_d)约为9.9×10^-3s^-1，而对His₆-Z_HER2B，由于快速的缔合和解离动力学，很难估计其K_a和K_d。因此，选择表现出较强靶结合的His₆-Z_HER2Aaffibody变体进行进一步的定性。

实施例2

Z_HER2A与表达HER2细胞的结合

细胞培养

人乳腺癌细胞系SKBR-3购买于ATCC(ATCC#HTB-30)，已知该细胞系每个细胞表达约2×10⁶个HER2分子。细胞培养于RPMI 1640培养基，其添加了10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺和PEST(100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素)，皆购自Biochrom KG(柏林，德国)。细胞在37℃在含有5％CO2的潮湿空气中培养，实验开始前三天在3cm有盖培养皿中接种。

放射性标记

标记前体，N-琥珀酰亚胺基p-(三甲基-甲锡烷基)苯甲酸酯(N-succinimidyl p-(trimethyl-stannyl)benzoate，SPMB)根据Orlova etal，Nucl Med Biol 27：827-835(2000)的方法进行制备，将5μg的SPMB加到含有5MBq ¹²⁵I的5％乙酸溶液中。加入40μg氯胺-T(Sigma，St.Louis，MO)的水溶液以启动反应。将反应混合物振荡5分钟，加入焦亚硫酸钠(Aldrich，Steinheim，德国)水溶液以终止反应。将放射标记前体加到含有40μg的His₆-Z_HER2A或His₆-Z_HER2B的0.07M，pH9.2的硼酸盐缓冲液中。在室温下连续振荡45分钟进行偶联反应。利用经PBS平衡的NAP^TM-5大小排阻柱(Amersham Biosciences)将标记的Z_HER2变体与低分子量产物分离。然后利用Biacore技术分析标记的Z_HER2变体以证实标记过程不影响对HER2-ECD的结合亲和力。两种Z_HER2变体都保持了亲和力(数据未显示)。

细胞检测

每个培养皿约有100000个SKBR-3细胞，加入含有14ng标记过的His₆-Z_HER2A或His₆-Z_HER2B的1ml补充的培养基。这个量相应于配体∶受体的理论比率为5∶1。为了确定非特异性结合不是来自细胞，对三个无细胞的培养皿也采用相同方式处理。处理细胞所获得的数值应减去非细胞对照的数值。为了分析细胞结合特异性，三个培养皿不仅用标记过的Z_HER2变体处理，而且也用500倍过量的非标记的Z_HER2变体处理。在37℃温育3小时后，去除放射性培养基并用冰冻的无血清培养基迅速洗涤培养皿三次。用0.5ml胰蛋白酶/EDTA溶液(0.25％/0.02％的PBS；Biochrom KG，柏林，德国)在37℃对细胞进行胰蛋白酶消化15分钟。然后用1ml补充的培养基重悬细胞，0.5ml细胞悬液用于细胞计数，另外1ml则用自动γ计数器测量放射性。

如图9所示，His₆-Z_HER2A表现出与SKBR-3细胞的特异性结合，已知每个细胞表达2×10⁶个HER2受体(“非封闭”条)。通过加入过量非标记的His₆-Z_HER2A(“封闭”条)可将放射标记的His₆-Z_HER2A的结合完全封闭。然而，His₆-Z_HER2B与SKBR-3细胞的结合低于检测限度(数据未显示)，可能是因为该Z_HER2变体较快的解离速率(如前所述)。

实施例3

HER2结合多肽二聚体的表达及特性分析

DNA载体构建和蛋白生产

如上述选择一种新的affibody配体，即His₆-Z_HER2A，其具有对HER2受体的亲和力。通过将编码Z_HER2A多肽的基因片段亚克隆到His₆-Z_HER2A的表达载体中来构建二聚体Z_HER2变体。在DNA测序仪

3700 Analyzer(Applied Biosystems，Foster City，CA)上通过DNA测序确证导入的Z_HER2A片段。克隆过程中采用大肠杆菌(Escherichia coli)菌株RR1ΔM15(Nucleic Acids Res 10：5765-5772(1982))作为细菌宿主。所得载体在T7启动子的控制下(Studier et al，Methods Enzymol 185：60-89(1990))编码一个二聚体Z_HER2变体，(Z_HER2A)₂，与N末端六组氨酰(His₆)标记融合，其允许通过固化金属离子亲和层析(IMAC)进行纯化。

二聚体Z_HER2变体在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达为His₆标记融合蛋白，在变性条件下，在Talon金属亲和树脂(8901-2，BDBiosciences，CA)柱上通过IMAC纯化回收，如实施例1中对多肽单体所述。根据产品说明书(Applied Biosystems)，使用以PBS(10mM磷酸盐，154mM NaCl，pH7.1)平衡的PD-10柱对纯化的His₆-(Z_HER2A)₂融合蛋白进行复性。利用适当的消光系数(30440M^-1cm^-1)，用280nm处测量的吸光值计算蛋白浓度，同时也通过氨基酸分析(Aminosyraanalyscentralen，Uppsala，Sweden)证实。利用Novex系统(Novex，CA，USA)在16％的Tris-甘氨酸同质凝胶中通过SDS-PAGE对纯化的蛋白进一步分析。蛋白条带用考马氏亮蓝染色观察。通过SDS-PAGE分析，可以看出该蛋白的预期分子量的特异条带(15.6kD)(图10，插入的泳道2)。用280nm测量的吸光值可估计出细胞培养物的表达水平约为200mg/l。

生物传感器分析

利用2000系统(Biacore AB)进行实时生物特异相互作用分析(BIA)。根据产品说明书，将重组的HER2的胞外结构域(HER2-BCD)稀释于10mM NaAc，pH4.5中，然后通过胺偶联固定于与CM5感应芯片(研究级)(BR-1000-14，Biacore AB)上的一个流动池表面的羧化葡聚糖层上。另一个流动池表面被激活和失活，以作为参照表面。根据产品说明书(Amersham Biosciences)，用NAP^TM-10柱通过凝胶过滤将缓冲液改变为HBS(5mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％表面活性剂P-20，pH7.4)，之后将样品过滤(0.45μm；Millipore，Billerica，MA)。结合分析在25℃进行，HBS为工作液。所有Biacore分析，样品都以随机顺序运行，一式两份，每次注射后用10mM HCl注射再生流动池。

在第一次实验中，以流速5μl/分钟将5μM的每种蛋白注射到HER2-ECD表面，以检测Z_HER2蛋白的单体和二聚体(实施例1中的His₆-Z_HER2A及His₆-(Z_HER2A)₂)间与HER2-BCD结合的差异。从图10可看出，His₆-(Z_HER2A)₂具有较低的脱离速率(off-rate)，表明其相对His₆-Z_HER2A而言His₆-(Z_HER2A)₂和HER2-BCD具有更强的结合。

在第二次实验中，将His₆-(Z_HER2A)₂进行动力学分析，其中以不同浓度(0-5μM，最低浓度为0.0049μM，HBS稀释)和30μl/分钟的流速被注射到HER2-ECD表面。在动力学分析之前，通过氨基酸分析测定了蛋白浓度。解离平衡常数(K_D)，缔合速率常数(K_a)以及解离速率常数(K_d)用BIAevaluation 3.2软件(Biacore AB)在假设1∶1结合的条件下进行计算。对结合曲线进行评估，可确定解离平衡常数(K_D)约为3nM，缔合速率常数(K_a)约为2.5×10⁵M^-1s^-1，及解离速率常数(K_d)约为7.6×10^-4s^-1。通过比较这些值与实施例1中所获得的His₆-Z_HER2A单体动力学常数，证实二聚体His₆-(Z_HER2A)₂具有更强的结合。这种改良的表观较高的亲和力是因为这些二聚体结构的亲和力作用，证实了更早的其它分子(Gunneriusson E et al，Protein Eng 12：873-878(1999))。

实施例4

(Z_HER2A)₂在携带SKOV-3异种移植物的裸鼠中的

生物分布和肿瘤靶向

在本实施例的实验中，用¹²⁵I标记实施例3的His₆-标记的二聚体(Z_HER2A)₂多肽，并将其注射到携带特征为HER2过表达的移植肿瘤的小鼠体内。进行了多肽生物分布的研究，并对小鼠成像以研究标记多肽的定位。一个对Taq DNA聚合酶有结合亲和力的标记的Z结构域衍生物被用作对照，其对HER2没有特异性(Z_Taq；Gunneriusson E etal，如前所述，并被称为Z_TaqS1-1)。

材料与方法

间接放射性碘化(Z_HER2A)₂

在一个硅化微量离心管里加入2.3μl ¹²⁵I(相应于10MBq)(Na[¹²⁵I]，Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)。再加入10μl乙酸(0.1％溶于水)、5μl N-琥珀酰亚胺基p-三甲基-甲锡烷基-苯甲酸酯(1mg/ml，溶于5％乙酸的甲醇)(参考Koziorowski J et al，Appl RadiatIsot 49：955-959(1998))和10μl氯胺-T(溶于水，4mg/ml)(CH₃C₆H₄SO₂N(Cl)Na·3H₂O，Sigma，St Louis，MO，USA)。以相同的混合使反应进行5分钟。反应以10μl焦亚硫酸钠中止(8mg/ml，溶于水)(Na₂S₂O₅，Sigma，St Louis，MO，USA)。40μl(Z_HER2A)₂二聚体(0.25mg/ml，溶于0.07M硼酸盐缓冲液中，pH9.2(硼酸钠，Na₂B₄H₇·10H₂O，Sigma，St Louis，MO，USA，及氢氯酸，HCl，Merck，Darmstadt，Germany))加入到反应试管中。每个试管中加入40μl硼酸缓冲液以使pH增加到9。持续振荡至反应时间到45分钟后，在根据生产厂家的说明用PBS平衡的NAP-5大小排阻柱(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)上分离反应组分。反应试管，空级分，高MW级分，低MW级分和柱子分别在60cm(¹²⁵I)用手持γ探测器(Mini-instruments Ltd，Essex，UK)测量以计算标记产量。高分子量级分于-20℃储存于硅化微量离心管中至第二天使用。得到的产量为25-30％。

间接放射性碘化Z_Taq

[¹²⁵I]-NaI储存液与10μl的0.1％乙酸水溶液、5μl N-琥珀酰亚胺基p-三甲基-甲锡烷基-苯甲酸酯溶液(1mg/ml，溶于5％乙酸的甲醇)及10μl的氯胺-T水溶液(4mg/ml)混合。反应混合物剧烈涡旋，室温下振荡温育5分钟。10μl焦亚硫酸钠水溶液(8mg/ml)中止反应。21μl溶解于PBS的Z_Taq溶液(2.4mg/ml)加入到粗反应混合物中。用硼酸缓冲液(0.1M，pH9.15)调节反应混合物的pH值到约9。反应混合物在室温下振荡温育30分钟并在用于PBS中的5％白蛋白(牛，级分V，Sigma，St.Louis，MO，USA)预平衡的NAP-5柱中分离高分子量级分(标记的Z_Taq)和低分子量级分，PBS作为洗脱液。得到的放射化学产量在75％和80％之间。特异的放射性是100kBq/μg。

动物的制备

在C181/1条例许可下使用来源于M&B的雌性杂交繁殖的nu/nubalb小鼠(到达时10-12周龄)。在异种移植之前的一周里，利用标准饲料、垫料和环境使小鼠适应瑞典Uppsala的Rudbeck实验室的动物设施。小鼠自由采食和饮水。

第一次实验前两月，将5×10⁶个SKOV-3人卵巢癌细胞(ATCC#HTB-77)皮下注射入33只小鼠的右后腿。这组命名为“A组(setA)”。

第二次实验前三周，将10⁷个SKOV-3细胞皮下注射入32只小鼠的两只后腿。这组命名为“B组”。

对于成像研究，具有大肿瘤的两只小鼠(见下文)取自A组，所有其它的取自B组。

实验时，肿瘤已经在所有小鼠中建立，但是相当小并在大小和状态上有差异(被包被的和侵润性的，血管形成阶段)。使用时，所有小鼠体重在22-27克。

生物分布实验I

A组的20只小鼠被随机分为5组(I-V)，4只一组。A组中具有较大肿瘤的2只小鼠不作成像研究。分组、注射和处死时间见方案1。

小鼠在尾部iv注射了于50μl的PBS中的0.5μg的(Z_HER2A)₂，其间接标记了¹²⁵I(每只小鼠100kBq)。在注射标记的(Z_HER2A)₂45分钟前，组II的小鼠(“封闭”组)sc预注射了于200μl的PBS中的0.05mg未标记的(Z_HER2A)₂。通过没有任何明显的问题来判断，所有注射都被很好的耐受。

方案1

组	小鼠ID	额外处理	注射后处死时间(h)
				IIIIIIIVV	1-45-89-1213-1617-20	未标记的(ZHER2A)2	114824

在处死前5分钟，小鼠都被ip注射致死剂量的Ketalar/Rompun溶液(20μl/g体重，Ketalar 10mg/ml(Pfizer，New York，USA)，Rompun1mg/ml(Bayer，Leverkusen，Germany))。使用1ml用稀释过的肝素(5000IE/ml，Leo Pharma，Copenhagen，Denmark)冲洗过的注射器在处死时通过心脏穿刺采血。血液、尿样、肌肉、骨骼、大肠和小肠、心脏、膀胱、肺、肝、脾、胰、肾、胃、唾液腺和甲状腺、脑、肿瘤和尾的样品都被切碎并收集到20ml的塑料瓶中。在B组的某些小鼠的含有多个肿瘤的情况中，每个肿瘤都收集在不同的瓶中。称量器官和组织样品的重量，用γ计数器测量它们的放射活性(含有3-inch NaI(Tl)检测装置的自动γ计数器，1480 Wallac WIZARD，Wallac OY，Turku，Finland)。

生物分布实验II

B组的24只小鼠被随机分为6组，4只一组。B组的8只有较大肿瘤的小鼠用于成像分析。分组、注射和处死时间见方案2。

I组和IV-VI组的小鼠在尾部iv注射于50μl的PBS中的0.5μg的(Z_HER2A)₂，其间接标记了¹²⁵I(每只小鼠100kBq)。组II的小鼠被注射同样量的放射性碘化的(Z_HER2A)₂，但是在尾部皮下注射。组III的小鼠(“阴性对照组”)在尾部iv注射于50μl的PBS中1.07μg的、间接标记了¹²⁵I的Z_Taq(每只小鼠100kBq)。通过没有任何明显的问题来判断，所有注射都被很好的耐受。

方案2

组	小鼠ID	额外处理	注射后处死时间(h)
				IIIIIIIVVVI	1-45-89-1213-1617-2021-24	标记的ZTaq	44461015

如上述生物分布实验I进行处死和采样。在第二次实验中，畜体同样被收集，其放射性含量也被测量。称量器官和组织样品的重量，用γ计数器测量它们的放射活性。

放射活性测定

采用测量¹²⁵I的标准方法。计算相对于背景水平的每分钟计数进行评估。组织吸收值用％ID/g表示，每克组织注射剂量的百分数按下式计算：

其中iv注射时：

注射的放射活性＝对照注射器中的平均放射活性-使用的注射器中的放射活性-尾部的放射活性

sc注射时：

注射的放射活性＝对照注射器中的平均放射活性-使用的注射器中的放射活性

成像研究

为了成像，小鼠被分为2组，每组5只，每组中需包括一只来自A组的具有一个大肿瘤的小鼠。B组的小鼠被随机化。在成像前6h或8h之前，两组小鼠都分别注射于90μl的PBS中的2.3μg(Z_HER2A)₂，其间接标记了¹²⁵I(每只小鼠2.9MBq)。通过没有任何明显的问题来判断，所有注射都被很好的耐受。

小鼠整个身体成像是在注射(pi)放射缀合物后6和8小时后进行。小鼠被迫排尿，ip注射致死的Ketalar/Rompun麻醉并通过颈部错位(cervical dislocation)处死。小鼠(每组5个)被置于一个e.CAMγ-相机内(Siemens，Germany)，每个时间点取10分钟的图像。具有较大肿瘤的2只小鼠(每组一只)被选作用同样相机进行特殊图像研究，曝光20分钟。在具有99％窗口大小的35keV能量窗口下用低能量、高分辨率瞄准仪在256×256-bit矩阵中获得图像。使用NuclearDiagnostics(Kent，UK)的Hermes软件来帮助分析图像。

结果

封闭实验

进行生物分布实验I的封闭实验是为了证明肿瘤吸收(Z_HER2A)₂是否是特异的和是否受受体调控。在放射性碘化的二聚体被主要iv注射前，0.05mg未标记的(Z_HER2A)₂被sc注射入方案1中组II的小鼠中。比较了组I和组II中注射后一小时的放射活性的吸收。两组小鼠中肿瘤与血液的比率是0.72(组I，平均)和0.25(组II，平均)(图11)。然而，吸收的差异并不显著(p＝0.16)。在除肿瘤外的所有器官中，在封闭与非封闭动物中放射活性的吸收是相同的。

非封闭小鼠中出现相当低的肿瘤与血液比率可以通过该实验所选的早期时间点(1h pi)来解释。

吸收特异性

在生物分布实验II中，组III的小鼠被注射的Z_Taq的量相当于其它组中小鼠被注射的(Z_HER2A)₂的量。Z_Taq使用和(Z_HER2A)₂相同的间接方法标记了放射性碘。Z_Taq对于HER2受体是非特异的。比较了组I和组II注射后4小时的放射活性的吸收。这个实验的结果表明(图12)，非特异的Z_Taq分子比特异(Z_HER2A)₂分子具有较低的肿瘤吸收。本实验中肿瘤与血液的比率是1.34(组I，特异的(Z_HER2A)₂)和0.15(组III，非特异的Z_Taq)。统计学分析表明这个差异是显著的(p＝0.009)。在所有其它器官中，对两种Z分子，放射活性的吸收水平是相同的。

与封闭实验相比，本实验观测到了更高的(Z_HER2A)₂的肿瘤与血液比率。这很可能是由于实验时间点较晚(4h pi)造成的。

生物分布

生物分布实验I和II中iv注射了标记的(Z_HER2A)₂的小鼠组的结果与携带肿瘤小鼠的器官和组织中放射性碘生物分布分析相结合。结果示于图13-16。

参考图13和14，肿瘤中¹²⁵I的浓度比大多数正常器官高，表明(Z_HER2A)₂多肽能够靶向具有HER2的肿瘤细胞。正常器官和组织中放射活性浓度低于肿瘤中的，除了肾(所有时间点)、甲状腺(所有时间点)和肝(早期时间点)。本实验展示了放射性碘从血液和正常器官中快速清除。正常器官的清除大体上紧随血液中的清除，甲状腺除外，发现其中聚集放射性碘。甲状腺对游离碘吸收的增加，即使在间接标记的方法中也会出现，这是众所周知的并在一定程度上通过“冷冻”或非放射性碘来避免(Larsen RH et al，Nucl Med Biol 25：351-357(1998))。高浓度的放射性碘也在小鼠肾脏中发现，因为肾脏是这种小蛋白和代谢物的主要排泄途径。

图15A和B示出放射性碘浓度在血液和肿瘤中随时间变化的进程。从pi4小时开始，肿瘤的放射活性高于血液放射活性。用图15A所提供的实验数据可以通过来自于GraphPad Software(San Diego，USA)的

v3.0计算血液和肿瘤中放射性碘的半衰期。使用含有两相指数衰减的非线形回归作为模型，所得图示于图15B。肿瘤中T_1/2α(0.36小时)比血液中的短(0.76小时)，但T_1/2β却长(肿瘤中87.5小时，血液中4.3小时)，这与取得的结果有很好的一致性。为了比较，血液中标记的二聚体的T_1/2α用取自正常的、不携带肿瘤的小鼠所得的生物分布数据计算，该值为0.3小时(数据未示出)。

肿瘤与血液的放射性浓度比率在pi至少12小时期间随时间增加(图16)。该比率是图像对比的很好估计因子，因为放射性成像的主要背景来自血液中的放射活性。当考虑到肿瘤与血液的比率和肿瘤的放射性浓度，可以得出这样的结论，pi6和8小时可能是最佳的图像时间点。为获得好对比度的图像，肿瘤与非肿瘤的放射活性浓度比应该不小于2。

γ图像

γ图像的拍摄来自两组中的5只小鼠(分别在注射后6和8小时)，每一只都被成像。在两个时间点在所有小鼠中都可以鉴定出具有清晰结构的肾脏。注射后6小时，在小鼠的图像中肾脏以上可见一些额外的结构(可能是肝脏)，也可看到来自于总体血池(generalized bloodpool)的一个提高的背景。一些动物在膀胱中有尿液，这也可直接看到。在小鼠注射后8小时的图像上，可以鉴别在颈部有额外的结构，在所有的可能性中都是甲状腺。

在每一个图像部分的5个动物中，可以看到一个大的入侵性肿瘤(来自第一批的SKOV-3注射)。明显没有其它肿瘤定位。被研究的两只动物被选出，进行额外的成像，结果示于图17中。

总结

通过苯甲酸酯基团间接标记有放射性碘(¹²⁵I)的二聚体多肽(Z_HER2A)₂在携带SKOV-3(卵巢癌细胞系)肿瘤的小鼠中的生物分布示出与正常小鼠中缀合物的正常生物分布具有很好的一致性。实现了¹²⁵I-苯甲酸酯-(Z_HER2A)₂形式注射入的放射性碘的肿瘤吸收。肿瘤吸收是受体介导的，并具有特异性，可以通过使用一种高浓度非标记的(Z_HER2A)₂分子的预注射封闭实验，和通过注射一种非特异的、标记的Z变异体Z_Taq来示出。对所得数据的分析表明在注射后4小时后肿瘤中的放射活性浓度高于血液中放射活性浓度，并且比注射后6小时后大多数正常器官和组织还高，除了肾脏和甲状腺。携带SKOV-3异种移植肿瘤的小鼠的γ图像在注射后6小时和8小时得到。得到了很好的分辨率。在两个时间点，大的入侵性肿瘤能够被清楚地鉴别。

实施例5

His₆-Z_HER2A单聚体在携带SKOV-3异种移植物的裸鼠中的生物分布和肿瘤靶向

在本实施例的实验中，实施例1和2的单体Z_HER2A多肽是¹²⁵I放射标记的，并注射到携带特征为HER2过表达的移植肿瘤的小鼠中。该多肽生物分布的研究是用以研究其定位。

材料和方法

间接放射性碘化Z_HER2A

为了用¹²⁵I标记，40μl的单体His₆-Z_HER2A经过与实施例4中的二聚体多肽构建体相同的处理。

动物制备

在C66/4条例许可下使用来源于M&B的杂交繁殖的nu/nu balb小鼠(到达时10-12周龄)。在异种移植建立之前的一周里，利用标准饲料、垫料和环境使小鼠适应瑞典Uppsala的Rudbeck实验室的动物设施。小鼠自由采食和饮水。实验前三周，将5×10⁷个SKOV-3人卵巢癌细胞(ATCC#HTB-77)皮下注射入16只小鼠的右后腿。实验时，肿瘤已经在所有小鼠中建立，所有小鼠体重在22-27克。

放射活性测定

按照实施例4所述测量¹²⁵I及计算％ID/g。

生物分布实验

16只小鼠随机分成4组(I-IV)，每组4只小鼠。分组、注射及处亡时间参见方案3。小鼠在尾部iv注射于50μl的PBS中的0.5μg、间接用¹²⁵I标记的Z_HER2A。所有注射都忍受良好，没有任何肉眼可观察到的缺陷。

方案3

组	小鼠ID	注射后处死时间(h)
			I	1-4	1
II	5-8	4
			III	9-12	8
IV	13-16	24

如实施例4第一个生物分布研究所述处死小鼠和取样。称量器官和组织样品的重量，用γ计数器测量它们的放射活性(具有3-inch NaI(Tl)检测装置的自动γ计数器，1480 Wallac WIZARD，Wallac OY，Turku，Finland)。

结果

分析了sc注射标记的Z_HER2A的几组小鼠的结果以建立小鼠器官和组织中放射性碘的生物分布。结果示于图18-20。参考图18和19，肿瘤中¹²⁵I的浓度比大多数正常器官在4和24小时高，表明Z_HER2A多肽能够靶向携带HER2的肿瘤细胞。发现在正常器官和组织中放射活性浓度低于肿瘤中的，除了肾脏(所有时间点)和甲状腺(所有时间点)。本实验还示出从血液和正常器官中放射性碘的快速清除。从正常器官中的清除主要在血液清除之后，但甲状腺除外，在其中发现放射性碘聚集。在小鼠肾脏中也发现了高浓度的放射性碘。图20示出血液中和肿瘤中放射性碘浓度随时间的变化。从注射后4小时开始，肿瘤放射活性比血液放射活性高6倍。肿瘤与血液中放射活性浓度的比率(图21)在注射后至少8小时内随时间增长，注射后8小时的比率是10比1。

总结

通过苯甲酸酯基团间接标记有放射性碘(¹²⁵I)的单体多肽Z_HER2A在携带SKOV-3(卵巢癌细胞系)肿瘤的小鼠中的生物分布与正常小鼠中缀合物的正常生物分布有很好的一致性。实现了肿瘤对以¹²⁵I-苯甲酸酯-Z_HER2A形式注射的放射性碘的吸收。对所得数据的分析表明在注射后4小时，肿瘤中的放射活性浓度高于血液中的放射活性浓度，与二聚体形式的(Z_HER2A)₂相比，其也比注射后4小时的大多数正常器官和组织高，但肾脏和甲状腺除外。

实施例6

ABD(Z_HER2A)₂在携带SKOV-3异种移植物的裸鼠中的生物分布及肿瘤靶向

在本实施例的实验中，通过遗传工程将实施例3的二聚体(Z_HER2A)₂多肽在其N末端与链球菌G蛋白的“白蛋白结合结构域”(ABD)融合，以形成命名为ABD(Z_HER2A)₂的多肽(图22)。ABD以高亲和力结合人和小鼠血清白蛋白(M Johansson et al，J Biol Chem277：8114-8120(2002))。白蛋白是血液中一种血浆清除缓慢、含量丰富的蛋白质。高亲和性结合白蛋白意味着应使结合物具有与白蛋白本身相似的缓慢动力学。理论上，在动物体内延长一个肿瘤靶向配体的循环时间，就会增加运输到肿瘤的剂量。为检测这个观点，用¹²⁵I放射标记ABD(Z_HER2A)₂多肽并将其注射到携带特征为HER2过表达的移植肿瘤的裸鼠体内。通过研究该多肽的生物分布以研究其定位。

材料与方法

DNA构建与蛋白生产

如实施例1和2所述，选择一个名为His₆-Z_HER2A新的affibody配体，且其具有对HER2受体的亲和力。一个通过将编码Z_HER2A多肽的基因片段亚克隆到His₆-Z_HER2A的表达载体上而构建的二聚体Z_HER2A变体如实施例3所述。这个二聚体Z_HER2A变体的ABD融合蛋白则通过将编码ABD多肽的基因片段亚克隆到His₆-Z_HER2A的表达载体上，用ABD多肽取代六组氨酸标记而构建。另外，通过延伸PCR将一个C末端半胱氨酸残基加入该融合蛋白。导入的ABD片段在DNA测序仪ABI3700 Analyser(Applied Biosystems，FosterCity，CA)通过DNA测序加以证实。克隆过程中采用大肠杆菌菌株RR1ΔM15(Nucleic Acids Res 10：5765-5772(1982))作为细菌宿主。所得载体在T7启动子控制下(Studier et al，Meth Enzymol185：60-89(1990))编码ABD融合二聚体Z_HER2变体ABD(Z_HER2A)₂，其融合了C末端半胱氨酸残基，该残基可允许位点特异性化学修饰(图22)。二聚体Z_HER2A变体在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达为与ABD的融合体，并在根据产品说明制备的白蛋白琼脂糖亲和柱上通过亲和层析纯化而回收(Amersham Biosciences)。使用适当消光系数，用280nm的吸光值计算蛋白浓度。利用Novex系统(Novex，CA，USA)在16％的Tris-甘氨酸同质凝胶中通过SDS-PAGE进一步分析纯化的蛋白质。蛋白条带用考马氏亮蓝染色观察。通过SDS-PAGE分析，可以看出该蛋白的预期分子量的特异条带。

间接放射性碘化ABD(Z_HER2A)₂

为了用¹²⁵I标记，40μl的ABD(Z_HER2A)₂经过与实施例4中的二聚体多肽构建体相同的处理。

动物制备

在C66/4条例许可下使用来源于M&B的雌性杂交繁殖的nu/nubalb小鼠(到达时10-12周龄)。在异种移植建立之前的一周里，利用标准饲料、垫料和环境使小鼠适应瑞典Uppsala的Rudbeck实验室的动物设施。小鼠自由采食和饮水。实验前三周，将5×10⁷个SKOV-3人卵巢癌细胞(ATCC#HTB-77)皮下注射入16只小鼠的右后腿。

实验时，肿瘤已经在所有小鼠中建立，所有小鼠体重在22-27克。

放射活性测定

按照实施例4所述测量¹²⁵I及计算％ID/g。

生物分布实验

16只小鼠随机分成4组(I-V)，每组4只小鼠。分组、注射及处死时间参见方案4。小鼠在尾部iv注射于50μl PBS中的0.5μg用¹²⁵I间接标记的ABD(Z_HER2A)₂。所有注射都忍受良好，没有任何肉眼可观察到的缺陷。

方案4

组	小鼠ID	注射后处死时间(h)
			I	1一4	12
II	5-8	24
			III	9-12	48
IV	13-16	72

如实施例4的第一次生物分布研究所述处死小鼠和取样。将器官和组织样品称重，并用γ计数器(具有一个3-inch的NaI(Tl)检测器的自动γ计数器，1480 Wallac WIZARD，Wallac OY，Turku，Finland)测量它们的放射活性。

结果

结果如图23-24所示。如图23所示，在12小时(肿瘤2.4％ID/g)和24小时(肿瘤2.2％ID/g)时，¹²⁵I在肿瘤中的浓度高于大多数正常器官的，表明ABD(Z_HER2A)₂多肽能靶向携带HER2的肿瘤细胞。发现在正常器官和组织中的放射活性浓度低于肿瘤中的，除了肾脏(所有时间点，在24小时为3.5％ID/g)、甲状腺(所有时间点，在24小时为5.2％ID/g)和血液(所有时间点，在24小时为3.9％ID/g)。肺脏数值或多或少与肿瘤数值相等，这是因为肺脏的血液含量高。本实验显示血液中的放射性碘的清除非常缓慢。这点正如预期，因为ABD(Z_HER2A)₂的ABD部分高亲和性地与血清白蛋白结合，而该蛋白在血液中非常丰富而且具有缓慢的动力学。从正常器官中清除要比从血液中清除快，除了甲状腺，发现在此放射性碘聚集。高浓度的放射性碘也在小鼠肾脏中发现。图24显示了与实施例4和5的Z_HER2A单体和二聚体结果比较，肿瘤中与ABD(Z_HER2A)₂相关的放射性碘浓度随时间的变化情况。在注射后24小时，使用ABD(Z_HER2A)₂的肿瘤放射活性比单体或二聚体高出13倍，表明靶向部分在体内存留时间的延长的确可以用于增加其在肿瘤中的剂量。这些数据也支持(Z_HER2A)₂部分能与白蛋白结合结构域进行功能性偶联。

总结

通过苯甲酸酯基团间接标记有放射性碘(¹²⁵I)的融合多肽ABD(Z_HER2A)₂在携带SKOV-3(卵巢癌细胞系)肿瘤的小鼠中的生物分布与所期望的白蛋白结合多肽的特性有很好的一致性。实现了肿瘤对以¹²⁵I-ABD(Z_HER2A)₂形式注射的放射性碘的吸收，而且在肿瘤上的剂量比Z_HER2A多肽的二聚体或单聚体形式要高。对所得数据的分析表明，在注射后12小时，肿瘤中的放射活性浓度高于大多数其它器官中的放射活性浓度，尽管在肺、肾、甲状腺和血液中的放射活性仍然维持高浓度。

实施例7

锝标记的二聚体^99mTc-(Z_HER2A)₂的生物分布

在本实施例的实验中，用诊断性成像核素99m-锝标记实施例3的二聚体His₆-(Z_HER2A)₂多肽，并将其注射到正常小鼠和携带有特征为HER2过表达的移植肿瘤的小鼠中。^99m锝(^99mTc)是一种具有较适于体内诊断的理想特性的放射性核素。另外，由于其廉价易得，也使其成为临床上医学成像的一个好选择。研究该多肽的生物分布以研究其定位。

材料与方法

锝标记His₆-(Z_HER2A)₂

将His₆-(Z_HER2A)₂多肽按照产品说明书利用商业化的IsoLink^TM试剂盒(Mallinckrodt，Netherlands)进行标记，该试剂盒能将^99mTc核素导向His₆-(Z_HER2A)₂蛋白上的六组氨酸标记。IsoLink^TM试剂盒的试剂产生锝阳离子，[^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺，然后其可稳定地与六组氨酸标记配位，提供了特异性标记His₆-(Z_HER2A)₂多肽的His₆标记的手段。

简而言之，从Uppsala University Hospital的发生器(generator)洗脱的0.5-0.6ml的^99mTc储存液与IsoLink^TM羰基标记试剂在100℃水浴中温育20分钟。这样获得的锝阳离子即[^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺的40μl溶液与40μl的His₆-(Z_HER2A)₂的PBS(1.2mg/ml)混合并在50℃温育1小时。以5kD为截断值在NAP-5大小排阻柱(Pharmacia，Uppsala)上分离纯化产物。根据直接薄层层析(instant thin layerchromatography)，产物纯化度为97％。

动物制备

在C66/4条例许可下使用来源于M&B的雌性杂交繁殖的nu/nubalb小鼠(到达时为10-12周龄)。在异种移植建立之前的一周里，利用标准饲料、垫料和环境使小鼠适应瑞典Uppsala的Rudbeck实验室的动物设施。小鼠自由采食和饮水。实验前三周，将5×10⁷个SKOV-3人卵巢癌细胞(ATCC#HTB-77)皮下注射入4只小鼠的右后腿。实验时，肿瘤已经在所有小鼠中建立，所有小鼠体重在22-27克。

放射活性测定

如实施例4对¹²⁵I所述进行^99mTc测量和％ID/g的计算。

生物分布实验

4只小鼠作为一组进行实验。注射及处死时间如表5所示。小鼠在尾部iv注射于50μl PBS中的0.5μg、用^99mTc标记的His₆-(Z_HER2A)₂(每只小鼠100kBq)。所有注射都忍受良好，没有任何肉眼可观察到的缺陷。

方案5

组	小鼠ID	注射后处死时间(h)
			I	1-4	8

如实施例4的第一次生物分布研究所述处死小鼠和采样。将器官和组织样品称重，并用γ计数器(具有一个3-inch的NaI(Tl)检测器的自动γ计数器，1480 Wallac WIZARD，Wallac OY，Turku，Finland)测量它们的放射活性。

结果

缀合物^99mTc-His₆-(Z_HER2A)₂在体外具有高稳定性(用PBS、血浆、半胱氨酸和过量的游离组氨酸攻击)。^99mTc-His₆-(Z_HER2A)₂的体内生物分布实验结果如图25-27。如图25，使用^99mTc-His₆-(Z_HER2A)₂的总肿瘤剂量(3.3％ID/g，注射后8小时)比¹²⁵I标记的单体构建体¹²⁵I-苯甲酸酯-Z_HER2A(1.1％ID/g，注射后8小时)或二聚体构建体¹²⁵I-苯甲酸酯-(Z_HER2A)₂(1.06％ID/g，注射后8小时)高三倍。已知^99mTc与¹²⁵I相比是一种更好的残留试剂，暗示其运输的剂量被保留了，而碘剂量被代谢并从肿瘤细胞中释放。根据图26，肿瘤中注射后8小时的^99mTc浓度要高于大多数正常器官的(肿瘤，3.3％ID/g)，显示^99mTc-His₆-(Z_HER2A)₂多肽能够靶向携带HER2的肿瘤细胞。发现在正常器官和组织中的放射活性浓度低于肿瘤中的，除了肾脏(8小时时27％ID/g，肿瘤剂量的36倍)和肝脏(8小时时11.4％ID/g，肿瘤剂量的3倍)(图27)。由于^99mTc-His₆-(Z_HER2A)₂经过肾脏清楚，高肾脏值是预料到的。在肾脏中的高水平示踪剂并没有引起毒性问题，因为作为诊断目的的总注射剂量非常低。甲状腺中的放射活性值如预计(8小时时1％ID/g)根本不采用¹²⁵I的值(实施例4)一样高。从正常器官的清除主要在血液清除之后，除了肾脏，在此1小时时可以观察到^99mTc聚集产生的一个峰。然后水平开始减少，一个小时间(直至注射后2小时)会有一个快速清除期(rapid elimination phase)，接着是一个慢的清除期，而24小时后肾脏内仍然存在70％ID/g的显著剂量。

注射后8小时时锝缀合物的肿瘤与血液比率为4，而总肿瘤剂量为3.3％ID/g。这说明^99m锝可用于体内诊断用途。作为比较，在相同时间点，¹²⁵I-苯甲酸酯-(Z_HER2A)₂和¹²⁵I-苯甲酸酯-Z_HER2A的肿瘤剂量约为1％，而肿瘤与血液比率则约为11。

总结

^99mTc标记多肽即^99mTc-His₆-(Z_HER2A)₂在携带SKOV-3(卵巢癌细胞系)肿瘤的小鼠中的生物分布示出用于医学成像目的的相对好的分布特性。实现了肿瘤对以^99mTc-His₆-(Z_HER2A)₂注射的锝的吸收，其在肿瘤中的剂量高于¹²⁵I标记的Z_HER2A多肽的二聚体或单体。分析所获数据表明注射后8小时在肿瘤中的放射活性浓度高于大多数其它器官和血液中的放射活性浓度，尽管肝脏和肾脏比肿瘤的吸收实质上要高。

实施例8

利用²¹¹At进行体外标记及定性分析

在本实施例的实验中，使用与前述用¹²⁵I标记相同的化学方法，用治疗性放射性核素²¹¹砹(²¹¹At)标记实施例3的二聚体His₆-(Z_HER2A)₂多肽。放射性核素肿瘤靶向的一个目的是放射治疗。这要求核素发射高能粒子，如α粒子和高能β粒子，其能根除靶细胞。放射性卤素²¹¹At的α放射范围正好为几个细胞的直径，意味着细胞根除可以高度精确地进行。本实验进行了²¹¹At标记多肽的体外细胞杀伤能力的研究。

材料与方法

提前两天，将100000个特征为HER2过表达的SKBR-3细胞接种于3cm培养皿中。利用Copenhagen University Hospital的Scanditronix MC32回旋加速器产生的²¹¹At标记60μg的His₆-(Z_HER2A)₂多肽，并在瑞典Uppsala University的Carlsson实验室加以纯化。将约1∶1和5∶1摩尔比的²¹¹At-(Z_HER2A)₂分子/细胞受体加入到三个培养皿中。另外三个培养皿加入5∶1浓度的²¹¹At-(Z_HER2A)₂以及500倍过量的非标记His₆-(Z_HER2A)₂以封闭结合位点，并估计非特异性放射效应。细胞与²¹¹At-(Z_HER2A)₂在37℃温育24小时。温育24小时后，所有细胞都经过洗涤并补充新鲜的培养基。在约两个月内每周一次进行一次细胞生长监控。

平行地，向一组用与上述细胞杀伤分析方法相同的方式制备的培养皿加入相同的²¹¹At-(Z_HER2A)₂溶液。在不同时间点收集这些细胞，并进行细胞计数和放射活性测定，以建立所有培养皿组的吸收曲线。该曲线用于计算细胞杀伤实验中超过24小时时每个细胞的衰减(decay)值。

结果

将来源于人类乳腺癌细胞系SKBR-3、过表达HER2的细胞用两种不同剂量的²¹¹At-(Z_HER2A)₂照射24小时。在第一种剂量中，加入的²¹¹At-(Z_HER2A)₂分子与细胞上HER2靶受体的数量相等。在第二种剂量中，加入5倍过量的²¹¹At-标记分子。温育24小时后，在两个月内每周一次监控细胞和计数，并确定存活部分。如图28所示，应答与提供的剂量相关。与加入没有靶制剂的放射活性的对照相比，用等摩尔量²¹¹At-(Z_HER2A)₂处理的细胞并没有表现出任何特异的生长延迟。由于非特异性的放射损伤导致一个短期的生长延迟，但是细胞并没有停止生长。相反，当加入5倍过量的²¹¹At-(Z_HER2A)₂时，对细胞生长的抑制是非常明显的。到实验末期，接受高剂量的组也没有恢复，而低剂量组和对照组则提高了10⁶。假设照射后存活细胞仍然保持与以前相同的生长速度，在5∶1组的所有细胞都被清除了。吸收曲线揭示了5∶1封闭组也受到了实质性的细胞相关照射，可能是因为封闭不足造成的。每个细胞的衰亡数量(DPC)由积分吸收曲线加以估计。从生长曲线上，倍增时间计算为指数生长曲线的斜率，而存活分数则通过从照射时间推断延迟生长来计算。结果如表1所示。

表1

	倍增时间(天)	DPC	存活
				对照	2.5	-	100％
封闭	2.6	12	7.0％
				1∶1	2.5	37	3.4％
5∶1	-	98	-

总结

在体外²¹¹At-(Z_HER2)₂表现出与HER2过表达的SKBR-3细胞的特异性结合。诱导的细胞死亡与剂量积累十分相关。每个细胞少于100个衰减就足够引起单个细胞的死亡并达到整个细胞的消亡。

实施例9

其它HER2结合多肽的鉴定及定性分析

为了提高从实施例1所述的选择中所获得的HER2结合Z变体的亲和力，在构建第二个文库时采用了亲和力成熟策略(Gunneriusson etal，Protein Eng 12：873-878(1999)；Nord et al，Eur J Biochem 268：4269-77(2001))，然后针对HER2进行再次选择。第一代多肽变体Z_{HER2A，B，C和D}的比对示出Z_HER2A和Z_HER2B之间除了第13、14、28、32和35位相同外，在第10位存在R和K的趋同，在11位存在Q和T的趋同。因此，第二代文库含有5个固定位置13、14、28、32和35位，以及两个部分固定的位置，第10位(cgc/aaa作为简并密码子)和第11位(caa/acc作为简并密码子)，而余下的位置9、17、18、24、25和27使用NNG/T简并密码子随机化。转化后，获得一个含3×10⁸个克隆的文库。以逐渐降低浓度的生物素酰化的人HER2胞外结构域(HER2-ECD)为靶(重组人HER2胞外结构域，氨基酸238-2109，由Fox Chase Cancer Center，Philadelphia，USA提供)，将抗原结合分子进行五轮选择。

在第4和第5轮选择中，分别获得80和260个菌落克隆，将这些克隆挑出以分析其HER2结合活性。

HER2结合的ABAS ELISA分析

从第4和第5轮选择中随机选择的克隆在96孔板(Nunc)上生产。一个称为ABAS ELISA的ELISA筛选步骤用于鉴定高亲和力的HER2结合Z变体。将单菌落接种于于深孔96孔板中的、补加了1mMIPTG和100μg/ml氨苄青霉素的1ml TSB-YE培养基(30.0g胰胨豆胨肉汤(Merck)和5.0g酵母提取物(Merck)，加水至终体积1升)中，并在37℃在摇床上过夜生长。在3000g离心10分钟沉淀细胞。用300μlPBS-T重悬沉淀并于-80℃冷冻至少30分钟。平板在温水中解冻，然后在3500g离心20分钟。取100μl上清加到微量滴定孔中(#9018)，该孔已经用具有6μg/ml人血清白蛋白(HSA)的15mMNa₂CO₃和35mM NaHCO₃(pH9.6)于4℃过夜温育，然后在室温用2％脱脂奶粉的PBS-T封闭1小时。在向每孔加入100μl的1μg/ml的生物素酰化的HER2之前将板洗涤四次并温育1.5小时。洗涤孔四次之后，向每孔加入100μl链霉抗生物素蛋白-HRP(1∶5000)(#P0397Dako)并温育1小时。将孔洗涤四次，在最后一次洗涤后向每孔加入100μl显影液(ImmunoPure)TMB(#34021 Pierce)。20-30分钟后，向每孔加入100μl终止液(2M H₂SO₄)。在ELISA读数器(Tecan)上读取450nm的吸光值。ABAS ELISA结果如图29所示。图29A和29B中X轴对应于待测96孔板的孔号-因此，图29A表示第一个96孔板的ELISA结果，而图29B表示第二个板的结果。

DNA序列分析

根据厂商指导，使用生物素酰化的寡核苷酸AFFI-72(5′-生物素-CGGAACCAGAGCCACCACCGG)，利用dGTP，BigDye^TM Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems))对ABAS-ELISA所分析的编码Z_HER2变体的DNA进行测序。在3100 Genetic Analyser(AppliedBiosystems)上分析序列。序列分析获得130个独特序列。通过吸光值至少比阴性对照的吸光值高两倍而证实的、来自在ABAS ELISA实验中表现结合能力的Z_HER2变体的序列示于图1，并在序列表中鉴别为SEQ ID NO：6-76。这些HER2结合Z变体的命名方式如下。从ELISA实验中的第一个平板分离的变体(图29A)命名为Z_HER2:1NN，这里的NN对应于在其中分析特定多肽变体的第一个平板的孔号。从ELISA实验中的第二个平板分离的变体(图29B)命名为Z_HER2:2NN，这里的NN对应于在其中分析特定多肽变体的第而个平板的孔号。

克隆和蛋白生产

使用编码如图30所示的构建体的表达载体，在大肠杆菌细胞中表达选择的HER2结合多肽。这些多肽生产为与N末端六组氨酰标记的融合体。His₆标记多肽Z_HER2:101、Z_HER2:107、Z_HER2:149、Z_HER2:202、Z_HER2:205、Z_HER2207、Z_HER2:209、Z_HER2:222、Z_HER2:225和Z_HER2:229以及Z_HER2A用BioRobot 3000(Qiagen)和NI-NTA Superflow 96 BioRobot方法在变性条件下进行纯化。纯化的、His₆标记蛋白在PBS(2.68mM KCl，137mM NaCl，1.47mM KH₂PO₄，8.1mM Na₂HPO₄，pH7.4)中透析。样品的蛋白浓度利用280nm处测量的吸光值和各种蛋白的理论消光系数进行计算。

His₆标记Z_HER2变体的生物传感器分析

在2000系统(Biacore AB，Uppsala，Sweden)上利用表面等离子共振分析上述生产的His标记的Z_HER2变体与HER2之间的相互作用。根据厂商指导，将人HER2和IgG(免疫球蛋白G)通过偶联于CM-5芯片表面上的羧化葡聚糖层上的胺而固定于不同的流动池上。人HER2和IgG的固化分别产生4600和5100共振单位(RU)。对第三个流动池表面进行激活和失活以作为注射时的空白对照。用1×HBS-EP(5mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％表面活性剂P-20，pH7.4)将融合多肽Z_HER2:101、Z_HER2:107、Z_HER2:149、Z_HER2:202、Z_HER2:205、Z_HER2:207、Z_HER2:209、Z_HER2:222、Z_HER2:225及Z_HER2:229稀释到终浓度为50μM，以固定的流速10μl/分钟注射。总注射时间为2分钟(缔合)，随后洗涤3分钟(解离)。用25mM HCl注射两次(30秒/注射)使表面再生。具有固定的HER2的池的测量反应应减去参照池(激活/失活表面)的测量反应。这些纯化蛋白与HER2相互作用的能力已被确定，并如图31的感应图所述。

实施例10

其它HER2结合多肽的鉴定及特性分析

对实施例1所述的第三和第四轮选择后所获得的克隆进行全面的序列分析。根据厂商指导，使用

dGTP，BigDye^TMTerminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit(AppliedBiosystems)和3100 Genetic Analyzer(AppliedBiosystems)对DNA进行测序。生物素酰化的寡核苷酸AFFI-72(5′-生物素-CGGAACCAGAGCCACCACCGG)用作引物。序列分析发现有11个新的多肽序列，即在实施例1中所述研究中未发现的克隆。

使用编码如图30所示的构建体的表达载体，在大肠杆菌细胞中表达这些Z变体。这些多肽从而生产为与N末端六组氨酰标记的融合体。这些多肽使用BioRobot 3000(Qiagen)和NI-NTA Superflow 96BioRobot方法在变性条件下通过固化金属离子亲和层析(IMAC)进行纯化。洗脱的蛋白用SDS-PAGE分析。根据产品说明书，用PD-10柱(Amersham Bioscience)将His₆标记蛋白的缓冲液交换成5mMNH₄Ac。然后，将蛋白冻干并溶解于HBS-EP(5mM HEPES，150mMNaCl，3.4mM EDTA，0.005％表面活性剂P-20，pH7.4)。样品的蛋白浓度利用280nm处测量的吸光值和各种蛋白的理论消光系数进行计算。

His₆标记Z_HER2变体的生物传感器分析

利用

2000(Biacore AB，Uppsala，Sweden)分析His₆标记Z_HER2变体与HER2之间的结合活性。根据厂商指导，将人HER2和HIV-1 gp120(Protein Sciences Corporation，#2003-MN)通过偶联于CM-5芯片表面上的羧化葡聚糖层上的胺而固定于不同的流动池上。人HER2和HIV-1 gp120的固化分别产生了2631和3138共振单位(RU)。对第三个流动池表面进行激活和失活以作为注射时的空白对照。用1×HBS-EP(5mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％表面活性剂P-20，pH7.4)将Z_HER2变体稀释到终浓度为1μM，以固定的流速10μl/分钟注射。总注射时间为1分钟(缔合)，随后洗涤3分钟(解离)。用10mM HCl注射30秒使表面再生。具有固定的HER2的池的测量反应应减去参照池(激活/失活表面)的测量反应。三种纯化的蛋白Z_HER2:3053、Z_HER2:0434和Z_HER2:0024*与HER2特异性结合，如图32的感应图所示。这些Z_HER2变体的序列见图1，并在序列表中鉴别为SEQ ID NO：77-79。

Claims (33)

1.一种多肽，其对HER2具有结合亲和力，其中所述多肽的序列是在SEQ ID NO：1所示的序列中经过5至20个取代突变而直接得到，所述突变包括至少F13Y、Y14W、N28R、Q32R和K35Y。

2.权利要求1的多肽，其对HER2具有结合亲和力，其中相互作用的K_D值至多为1×10^-6M。

3.权利要求2的多肽，其对HER2具有结合亲和力，其中相互作用的K_D值至多为1×10^-7M。

4.权利要求1的多肽，其还包含在第9、10、11、17、18、24、25和27位中的一个或多个位置的取代突变。

5.权利要求4的多肽，其包含在第10位的从谷氨酰胺至精氨酸的取代突变。

6.权利要求4的多肽，其包含在第11位的从天冬酰胺至苏氨酸的取代突变。

7.权利要求4的多肽，其包含在第17位的从亮氨酸至缬氨酸的取代突变。

8.权利要求4的多肽，其包含在第27位的从精氨酸至选自赖氨酸和丝氨酸的氨基酸残基的取代突变。

9.权利要求1的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2-3和6-76中的任一序列所示。

10.权利要求9的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2-3中的任一序列所示。

11.权利要求1的多肽，该多肽包含在选自N3、N6、N11、N21、N23、N28、N43和N52中的至少一个位置的取代突变。

12.权利要求11的多肽，其包含以下突变中的至少一个：N3A、N6A、N6D、N11S、N23T、N28A和N43E。

13.权利要求1的多肽，其在任一末端或两端进一步包括六组氨酰标记。

14.权利要求1的多肽，其在任一末端或两端进一步包括至少一个功能性多肽结构域，所以该多肽是由一个第一部分和至少一个第二部分以及任选地其它一个或多个部分组成的融合蛋白，所述第一部分由权利要求1-12中任一项的多肽组成，所述第二部分以及任选地其它一个或多个部分由一个或多个如权利要求1-12中任一项所述的多肽组成，使得该多肽成为如权利要求1-12中任一项所述的HER2结合多肽的多聚体，这些HER2结合多肽的序列可以相同或不同。

15.权利要求1的多肽，其在任一末端或两端进一步包括至少一个功能性多肽结构域，所以该多肽是由一个第一部分和至少一个第二部分以及任选地其它一个或多个部分组成的融合蛋白，所述第一部分由权利要求1-12中任一项的多肽组成，所述第二部分以及任选地其它一个或多个部分由链球菌G蛋白的白蛋白结合结构域组成。

16.权利要求1的多肽，其包含一标记基团。

17.权利要求16的多肽，其中所述标记基团选自荧光标记、生物素和放射性标记。

18.权利要求1的多肽，其被偶联到具有抗过表达HER2的细胞的活性的物质上。

19.权利要求18的多肽，其中所述具有抗过表达HER2的细胞的活性的物质选自细胞毒性制剂、放射性制剂、用于ADEPT应用的酶、细胞因子和促凝血因子。

20.一种核酸分子，其由编码权利要求1-15中任一项的多肽的序列组成。

21.包含权利要求20的核酸分子的表达载体。

22.包含权利要求21的表达载体的宿主细胞。

23.权利要求1-19中任一项的多肽在制备用于治疗至少一种特征为HER2过表达的癌症的药物中的用途。

24.权利要求23的用途，其中所述多肽与一具有抗癌活性的物质缀合。

25.权利要求1-19中任一项的多肽在制备用于检测样品中HER2的诊断剂中的用途。

26.权利要求25的用途，其中所述样品是一种生物学液体样品。

27.权利要求26的用途，其中所述样品是人血浆样品。

28.权利要求25的用途，其中所述样品是组织样品。

29.权利要求28的用途，其中所述样品是人组织样品。

30.权利要求29的用途，其中所述样品是一种来自患有癌症的人的活检样品。

31.用于诊断组织样品中HER2过表达的试剂盒，该试剂盒包含与一种报道酶融合的权利要求1-19中任一项的多肽、用于检测所述报道酶的活性的试剂、和阳性与阴性对照组织玻片。

32.用于HER2过表达的体内诊断的试剂盒，该试剂盒包含以螯合剂标记的权利要求1-19中任一项的多肽、诊断用放射性同位素、和用于对掺入效率进行分析的试剂。

33.用于实施在体内将具有抗癌活性的物质指向过表达HER2的细胞的方法的试剂盒，所述方法包括给对象施用所述物质和权利要求1-19任一项的多肽的缀合物，该试剂盒包含以螯合剂标记的权利要求1-36中任一项的多肽、治疗性放射性同位素、和用于对掺入效率进行分析的试剂。

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