CN102753193A - Light靶向分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了LIGHT靶向分子(例如LIGHT融合分子)、抗HER2抗体分子、组合物(例如其药物组合物)。此外，本发明还提供了使用这些分子来治疗、预防和/或诊断过度增殖(例如赘生物、疾病或状况，包括但不限于癌症和转移)的方法。

Description

LIGHT靶向分子及其用途
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119，本申请要求2008年10月31日提交的美国专利申请序列No.61/110,359的优先权，所述的申请在此以引用方式全文并入本文。
序列表
本申请包括通过EFS-Web提交的序列表，该序列表在此以引用方式全文并入本文。所述的ASCII拷贝于2009年10月30日创建，命名为B24770WO.txt，大小为134,255字节。
发明背景
LIGHT，也称为TNFSF14或CD258，为配体TNF超家族(TNFSF)的成员。它的名字衍生自类淋巴毒素，表现为可诱导的表达，并且与HSV糖蛋白D竞争疱疹病毒侵入介质(HVEM)(T淋巴细胞所表达的受体)。LIGHT通过活化以紧密调节的方式在T细胞的表面上表达(Castellano et al.(2002)J.Biol.Chem.27742841-51)。LIGHT通过结合3种TNF超家族受体中的一者来调控其生物学作用，所述的3种TNF超家族受体包括淋巴毒素β受体(LTβR)(Crowe et al.(1994)Science 264707-10，Browning et al.(1997)JImmunol 159：3288-98)、疱疹病毒侵入介质(HVEM)(Montgomery et al.(1996)Cell 87(3)：427-36)以及抗诱捕受体3(DeR3)(Yu et al.(1999)J.Biol.Chem.274 13733-6)。LIGHT在与其受体相互作用时，表现出多种免疫刺激活性，包括调节趋化因子的表达以及细胞粘附分子(Wang，J.et al.(2002)Eur.J.Immunol.32：1969-1979)。例如，LIGHT和LTα1β2在淋巴的器官形成以及淋巴结构的发育中协同作用(Scheu，S.et al.(2002)J.Exp.Med.195：1613-1624；Wang，J.et al.(2002)上文)。LTβR通过LIGHT转基因的信号传递显示出足以诱导对趋化因子和粘附分子的表达的上调节(Wang，J.et al.(2004)J.Clin.Invest.113：826-835)。此外，LIGHT还显示出调控T细胞引发和膨胀的CD28非依赖性共刺激活性，这可以得到对抗肿瘤的增强的T细胞免疫和/或增强的自身免疫(Tamada，K.et al.(2000)Nat.Med.6：283-289；Ware，C.F.(2005)Annu.Rev.Immunol.23：787-819；Wang，J.et al.(2005)J.Immunol.174：8173-8182)。
考虑到与LIGHT有关的广泛的免疫刺激活性，仍需要鉴别用于治理所述的这些LIGHT相关性活性的新型靶向试剂以用于治疗多种过度增殖疾病(例如赘生物疾病，包括癌症和转移)。
发明概述
本发明至少部分基于LIGHT靶向分子(例如LIGHT蛋白质或编码LIGHT蛋白质的核酸)的生成，其中所述的分子被选择性地传递至过度增殖(例如癌症)的细胞或组织，从而引发一种或多种抗肿瘤应答，包括但不限于肿瘤细胞的杀死和/或抗肿瘤的免疫。在一个示例性实施方案中，LIGHT靶向分子包括哺乳动物(例如人)LIGHT蛋白质或其功能变体或片段与抗体分子(其与HER2相结合)的至少一种融合蛋白质(本文称为“LIGHT-抗HER2融合物”)。在其他实施方案中，公开了新型的对抗HER2的抗体分子。因此，本发明至少部分提供了LIGHT靶向分子(例如LIGHT融合分子)、抗HER2抗体分子、组合物(例如其药物组合物)以及使用所述的这些分子来治疗、预防和/或诊断过度增殖(例如赘生物)疾病或状况(包括但不限于癌症和转移)的方法。
因此，在一个方面中，本发明特写了LIGHT靶向分子，该分子包括至少一个LIGHT部分(例如LIGHT蛋白质)或其功能变体或片段(例如LIGHT或其部分的细胞外结构域)、以及与过度增殖细胞(例如在癌症或肿瘤细胞或组织上表达的细胞表面蛋白质)上的靶向蛋白质相互作用(例如结合)的至少一个靶向部分(例如结合剂，例如抗体部分)，由此靶向、传递或将LIGHT部分携带至所述的过度增殖细胞或组织。在多个实施方案中，所述的LIGHT部分与所述的靶向部分连接(例如通过化学偶联、基因或多肽的融合、非共价结合等)。例如，所述的LIGHT分子可以使用或不使用连接基团(例如肽连接基团)，与所述的靶向部分作为基因或多肽融合物而融合。在其他实施方案中，所述的LIGHT分子通过反应基团(具有或不具有连接基团(例如非蛋白质的生物相容性聚合物))而与所述的抗体分子共价连接。所述的LIGHT靶向分子可以为至少一个LIGHT部分和至少一个靶向部分的单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或多聚体。在多个实施方案中，所述的LIGHT靶向分子包括或者基本上由一条、两条、三条、四条、五条、六条、七条或八条连续的或非连续的多肽链构成。在其他实施方案中，所述的LIGHT靶向分子包括或者基本上由一个、两个、三个、四个、五个或六个单体或二聚体亚单元，每个亚单元都包括至少一个LIGHT部分和至少一个靶向部分。例如，所述的LIGHT靶向部分可以包括至少一个、两个、三个、四个、五个或六个LIGHT融合分子，每个融合分子都包括至少一个LIGHT部分和至少一个靶向部分。在一些实施方案中，所述的LIGHT融合分子可以为单链多肽(例如与单链或单个结构域抗体融合的LIGHT部分)，或者形成(例如)二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或者更高络合的非连续多肽(例如与抗体分子(例如双链抗体)的一条链或抗原结合片段(例如图1和图24所示的Fab片段)融合的LIGHT部分)的至少两个、三个、四个、五个、六个或多个非连续多肽。在其他实施方案中，所述的LIGHT靶向分子包括或者基本上由两个或三个LIGHT融合分子构成，其中所述的每一个融合分子包括或者基本上由一个LIGHT部分(例如本文所述的LIGHT部分)和一个靶向部分(例如本文所述的靶向部分，例如Fab抗体片段)构成。在另一个实施方案中，所述的LIGHT靶向分子分别具有三聚体或二聚体构造，如图1或图24所示。
在一些实施方案中，所述的LIGHT靶向分子的LIGHT部分包括或者基本上由至少一个LIGHT蛋白质或其功能变体或片段构成。所述的LIGHT蛋白质可以为哺乳动物(例如人)LIGHT的可溶形式，例如哺乳动物(例如人)LIGHT的细胞外结构域(例如LIGHT或其部分的整个细胞外结构域)的可溶形式。在一个实施方案中，所述的LIGHT蛋白质或其变体或片段具有一种或多种LIGHT相关的活性，包括但不限于：(i)与一种或多种LIGHT受体(例如淋巴毒素β受体(LTβR)、疱疹病毒侵入介质(HVEM)和/或抗诱捕受体3(DcR3))结合；(ii)诱导趋化因子或细胞因子(例如CXCL10(IP-10)，CCL21，CXCL9，IL-5，IL-8和/或TNF)、趋化因子或细胞因子受体(例如IL-10RA)、粘附分子和/或共刺激分子中的一种或多种的表达；(iii)活化T细胞，例如淋巴细胞(例如细胞毒素T淋巴细胞)、表达CD4或CD8的T细胞和/或调节T细胞；(iv)募集T细胞进入到过度增殖(例如肿瘤)的细胞或组织；(v)活化和/或增强肿瘤反应性T细胞的增殖；(vi)例如，在过度增殖(例如肿瘤细胞或组织)下，创建类淋巴微环境；(vii)诱导过度增殖(例如肿瘤)细胞或组织的凋亡；和/或(viii)刺激受试对象中的免疫应答，例如刺激受试对象对抗过度增殖(例如肿瘤或癌症)的细胞或组织的免疫系统。
LIGHT部分的示例性LIGHT蛋白质包括或者基本上由氨基酸序列构成，其中所述的氨基酸序列选自：(i)SEQ ID NO：1的大约氨基酸93至240(相应于人LIGHT同种型1的细胞外结构域部分)；SEQ ID NO：2的大约氨基酸253至400(相应于与抗HER2抗体分子71F10的Fab抗体分子的重链片段通过δ4连接体融合的LIGHT细胞外结构域部分，本文中称为“pBIIB71F10-130”)；SEQ ID NO：3的大约氨基酸258至405(相应于与抗HER2抗体分子71F10的Fab抗体分子的重链片段通过G4S δ4连接体融合的LIGHT细胞外结构域部分，本文中称为“pBIIB71F10-131”)；SEQ ID NO：4的大约氨基酸245至392(相应于与抗HER2抗体分子71F10的Fab抗体分子的重链片段通过(G4S)4连接体融合的LIGHT细胞外结构域部分，本文中称为“pBIIB71F10-132”)；或基本上与其一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％、90％、95％或更高一致的氨基酸)；或者(ii)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述的核苷酸序列选自以下的一种或多种：SEQ ID NO：5的大约核苷酸277至720(与人LIGHT同种型1的细胞外结构域部分相应的核苷酸序列)；SEQ ID NO：6的大约核苷酸757至1200(与71F10Fab抗体分子的重链片段通过δ4连接体融合的LIGHT细胞外结构域部分相应的核苷酸序列(pBIIB71F10-130))；SEQ ID NO：7的大约核苷酸772至1215(与71F10Fab抗体分子的重链片段通过G4S δ4连接体融合的LIGHT细胞外结构域部分相应的核苷酸序列(pBIIB71F10-131))；SEQ ID NO：8的大约核苷酸733至1176(与71F10Fab抗体分子的重链片段通过(G4S)4连接体融合的LIGHT细胞外结构域部分相应的核苷酸序列(pBIIB71F10-132))；或基本上与其一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％、90％、95％或更高一致的序列)。
LIGHT部分可以可任选地包括或基本上由得自LIGHT的细胞外结构域或其突变形式(例如得自SEQ ID NO：1的大约氨基酸61至92，与人LIGHT同种型1相应；SEQ ID NO：2的大约氨基酸225至252，与具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物相应(pBIIB71F10-130)；SEQ ID NO：3的大约氨基酸230至257，与具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物相应(pBIIB71F10-131)；或与其基本一致的氨基酸序列)或者由核苷酸序列(得自SEQ ID NO：5的核苷酸181至276，与编码人LIGHT同种型1的核苷酸序列相应；SEQ ID NO：6的大约核苷酸673至756，与编码具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物的核苷酸序列相应(pBIIB71F10-130)；SEQ IDNO：7的大约核苷酸688至771，与编码具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物的核苷酸序列(pBIIB71F10-131)相应；或者与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％、90％95％或更高一致的序列))编码的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基(例如至少10至35、15至30、或者大约20至26个氨基酸残基)构成。
可以使用被改变从而增加一种或多种LIGHT的性质(例如蛋白质稳定性、免疫增强功能)的LIGHT蛋白质变体或其可溶片段(例如LIGHT细胞外结构域或其部分)。例如，所述的LIGHT蛋白质可以被修饰成具有一个或多个基本失活(例如通过蛋白水解位点的删除、突变和/或失活方法，例如插入氨基酸)的蛋白水解位点。在一个实施方案中，除去包含人LIGHT序列(人LIGHT同种型1，SEQ ID NO：1)位置82至83处的蛋白水解位点的氨基酸EQLI(SEQ ID NO：9)，或者得自小鼠LIGHT序列的位置79-82处的氨基酸EKLI(SEQ ID NO：10)。在其他实施方案中，所述的LIGHT蛋白质得自非人源的，例如可以使用鼠科LIGHT。全长小鼠LIGHT的氨基酸和相应核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：113和114中。
在其他实施方案中，所述的靶向部分传递、指引或携带LIGHT部分至所述的位点，例如过度增殖(例如癌症)的细胞或组织，使得所述的LIGHT部分诱导了对抗所述位点(例如过度增殖(例如癌症)的细胞或组织)的一种或多种LIGHT相关活性(例如本文所述的一种或多种LIGHT相关的活性)。在某些实施方案中，所述的靶向部分可以具有与所述的LIGHT部分基本无关的抗肿瘤或抗癌细胞的作用(例如通过抑制涉及肿瘤生长、增殖和/或存活的细胞表面蛋白质或受体的一种或多种活性，包括但不限于受体磷酸化、受体低聚化和/或预防或延迟肿瘤细胞的生长或转移)。
不受理论所束缚，申请人相信，通过本发明的LIGHT靶向分子靶向传递至LIGHT肿瘤可以通过以下所述的一种或多种活性来抑制、阻断或减慢过度增殖和/或肿瘤生长，所述的活性为：(i)淋巴毒素β受体(LTβR)的活化(例如通过LTβR信号传递和/或将细胞毒素T淋巴细胞募集到肿瘤中来引发一种或多种肿瘤细胞毒性)；(ii)HVEM的活化；(iii)诱导一种或多种趋化因子或细胞因子(例如CXCL10(IP-10)，CCL21，CXCL9，IL-5，IL-8和/或TNF)、趋化因子或细胞因子受体(例如IL-10RA)、粘附分子和/或共刺激分子的表达；(iv)活化T细胞，例如淋巴细胞(例如细胞毒素T淋巴细胞)、表达CD4或CD8的T细胞和/或调节T细胞；和/或(v)例如通过所述的靶向部分(例如Fab抗体分子)或所述的LIGHT部分来指引抗肿瘤活性，由此通过发动对抗过度增殖的细胞或肿瘤(包括原发性肿瘤和转移)的有效的T细胞应答来诱导靶向肿瘤细胞的死亡。在一些实施方案中，所述的LIGHT靶向部分可以减少、抑制或阻断生长因子的信号传递(减少一种或多种信号传递的途径，例如磷酸化、受体的二聚化)。对LIGHT靶向分子起作用的一个推荐机制的示意图在此示于图3中。
可以使用所述的靶向部分来靶向的示例性过度增殖(例如癌症)的细胞或组织包括但不限于乳腺、肺、胃、卵巢、前列腺、胰腺、结肠、结肠直肠、肾、膀胱、肝脏、头、颈部、脑以及软组织恶性(包括淋巴恶性癌症、白血病和骨髓瘤)的癌症或实体肿瘤。所述的靶向部分可以与在本文所述的一种或多种多度增殖的细胞或组织上表达的一种或多种靶向分子，例如可溶性或细胞表面蛋白质。例如，所述的靶向部分可以与生长因子受体(例如HER2/neu，HER3，HER4，表皮生长因子受体(EGFR)，胰岛素生长因子受体(IGFR)，Met，Ron，Cripto)；癌症相关的整合素或整合素受体(例如αvβ6，α6β4，层粘连蛋白受体(LAMR))；和/或CD23，CD20，CD16，EpCAM，Tweak受体(FN14)，癌胚抗原(CEA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，TAG-72和/或VEGF等中的一者或多者结合。本文描述了通过所述的靶向部分识别的靶向分子的其他实例。
在某些实施方案中，所述的靶向部分为抗体分子或受体的配体(例如生长因子或激素)。在其中所述的靶向部分为抗体分子的实施方案中，所述的抗体分子可以为单克隆或单特异性抗体或其抗原结合片段(例如Fab，F(ab′)2，Fv，单链Fv片段，单结构域抗体或它们的变体(例如重链或轻链可变结构域单体或二聚体，例如VH，VHH))；单链Fc片段、双体(dAb)、骆驼抗体；移植到VH或VL结构域、或者其他支架(例如纤维连接蛋白的结构域或支架、T细胞受体、亲和体分子(例如在Lee et al.(2008)Clin Cancer Res14(12)：3840-3849；Ahlgren et al.(2009)J.Nucl.Med.50：781-789中所述的亲和体蛋白质Z支架或其他分子)、脂质运载蛋白、锚蛋白重复序列、LDL受体结构域、RNA适配体、PDZ结构域和微体)的所有部分上的一个、两个或所有三个互补性决定区(CDR)(或者之前所述的一种或多种抗体分子的组合)。所述的抗体分子可以与所需的细胞表面蛋白质(例如本文所述的细胞表面蛋白质)相互作用(例如结合)。例如，所述的抗体分子可以包括单链(例如单链Fc)和Fab或scFv的组合。在其他实施方案中，所述的抗体分子可以为多特异性(例如二价或双特异性)抗体或其片段。在一些实施方案中，所述的抗体分子与细胞表面蛋白质上的单个抗原决定部位结合。在其他实施方案中，所述的抗体分子为多特异性抗体，并且与一种或多种细胞表面蛋白质(例如本文所述的一种或多种细胞表面蛋白质)上的两个或多个抗原决定部位结合。通常，所述的抗体分子为人、人源的、嵌合的、骆驼的、鲨鱼的或体外生成的抗体(或其功能片段，例如本文所述的抗原结合片段)。在某些实施方案中，所述的抗体分子以一定的亲和性与所述的细胞表面蛋白质结合，其中所述的亲和性表征为解离常数(Kd)至少为1x10-7M，1x10-8M，1x10-9M，1x10-10M，1x10-11M，1x10-12M，1x10-13M。
所述的抗体分子可以为全长的(例如可以包括至少一条、通常为两条的完整重链；以及至少一条、通常为两条的完整轻链)或者可以包括抗原结合片段(例如Fab，F(ab’)2，Fv，单链Fv片段或本文所述的其他抗原结合片段)。在另外的实施方案中，所述的抗体分子具有重链恒定区(或其部分，例如CH1区)，选自例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD和IgE的重链恒定区；特别是选自例如人抗体的(例如)IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的重链恒定区。在另一个实施方案中，所述的抗体分子具有轻链恒定区，选自例如κ或λ的(例如人)的轻链恒定区或其部分。所述的恒定区可以改变，例如突变，从而修改所述抗体的性质(例如增强或减弱Fc受体结合、抗体的糖基化、半胱氨酸残基(-S-S-键)的数量、效应器细胞的功能和/或补体功能中的一种或多种)。
示例性的LIGHT靶向分子示于图1-3(图示形式)，6和24(二聚体形式)，或者SEQ ID NO：2-4，6-8，101-104，109-110，162-163，167-168，173-174和178-179(包括核苷酸和氨基酸序列)。这些分子的实例包括但不限于LIGHT部分与Fab片段形成的单体、二聚体或三聚体形式的融合物或缀合物。在一个实施方案中，所述的LIGHT部分(例如本文所述的人LIGHT片段(例如SEQ ID NO：1的大约氨基酸93至240(相应于人LIGHT同种型1的细胞外结构域的部分)))的N末端(例如)作为多肽的融合物通过连接基团与Fab重链可变结构域融合的Fab重链恒定区的C末端区的连接(同时Fab的重链和轻链是彼此结合的)而形成共价连接(图1或图24)。在一个实施方案中，用于所述融合物中的Fab CH1区的部分有助于3个LIGHT-Fab融合物作为三聚体的组装，如图1所示，并且可举例为LIGHT融合物pBIIB71F10-130，pBIIB71F10-131，pBIIB71F10-132，pBIIBCD23-204和pBIIBC06-117(参见本文中的实施例6，7和27)。在其他实施方案中，IgG1的全CH1区(例如SEQ ID NO：172的大约氨基酸225至232)用于所述的融合物中，这有助于2个LIGHT-Fab融合物作为二聚体的组装(其通常形成一个或多个二硫键来稳定，如图24所示(实施例28))。
在某些实施方案中，所述的LIGHT靶向分子可以包括具有以下构造的至少两个非临近的多肽：第一个多肽具有与轻链恒定区(CL)融合的轻链可变结构域(VL)，例如VL-CL；而第二个多肽具有与部分或全部的重链恒定区(CH，尤其是CH1)融合的重链可变结构域(VH)，其中所述的重链恒定区与LIGHT部分(例如本文所述的人LIGHT片段)的N末端融合(具有或不具有连接基团(L))，例如VH-CH-(可任选地)-L-LIGHT部分。所述的LIGHT-Fab融合物可以结合形成二聚体或三聚体络合物(例如大约220kD的三聚体络合物)或者二聚体络合物(例如大约150kD的二聚体络合物)。在其他实施方案中，可以使用LIGHT-全长抗体融合物或缀合物，例如这样的融合物或缀合物，其中LIGHT部分的N末端或C末端区(例如)作为多肽的融合物而与全长抗体的各个重链的C末端共价连接(例如形成了大约200kDa的LIGHT二聚体络合物)(图2)。在另外的实施方案中，与Fab的VH区的C末端融合的单链Fc(例如)作为多肽融合物与LIGHT部分共价连接而形成单体、二聚体或三聚体的形式(图2)。在另外的实施方案中，所述的LIGHT部分(例如)组我诶多肽融合物与单链Fv共价连接而形成单体、二聚体或三聚体形式(图2)。在另一个实施方案中，一个或多个亲和体结构域与所述的LIGHT部分共价连接(图2)。在另一个实施方案中，与免疫球蛋白Fc区融合的LIGHT部分(例如)作为多肽融合物与Fab共价连接而形成单体、二聚体或三聚体形式(图2或图24)。
在某些实施方案中，所述的LIGHT部分与所述的靶向部分是功能性连接的(例如通过化学偶联、基因或多肽融合、非共价结合等)。例如，所述的LIGHT分子可以使用或不使用连接基团(例如肽连接基团)，与所述的靶向分子作为基因或多肽融合物而融合。在其他实施方案中，所述的LIGHT分子通过反应性基团(可任选地通过生物相容性非蛋白质类聚合物)而与抗体分子共价连接。所述的连接基团可以为本领域的技术人员显而易见的任何连接基团。例如，所述的连接基团可以为长度为1至100个原子的生物相容性聚合物。在一个实施方案中，所述的连接基团包括或者由聚甘氨酸、聚丝氨酸、聚赖氨酸、聚谷氨酸酯、聚异亮氨酸或聚精氨酸残基、或者它们的组合构成。例如，聚甘氨酸或聚丝氨酸连接体可以包括至少5个、10个、15个或20个甘氨酸和丝氨酸残基而形成以下构造(Gly)4-Ser(SEQ ID NO：145)，并具有1个、2个、3个、4个、5个或度共轭重复，例如3个或4个重复的(Gly)4-Ser(SEQ ID NO：134)。在其他实施方案中，连接基团可以包括得自LIGHT的细胞外结构域或其突变形式(例如得自人LIGHT同种型1的SEQID NO：1的大约氨基酸61至92；具有δ4连接体(pBIIB71F10-130)的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的SEQ ID NO：2的大约氨基酸225至252；具有G4Sδ4连接体(pBIIB71F10-131)的71F10Fab-h LIGHT融合物重链的SEQ IDNO：3的大约氨基酸230至257；或与其基本一致的氨基酸序列；或者由人LIGHT同种型1的SEQ ID NO：5的大约核苷酸181至276的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；由具有δ4连接体(pBIIB71F10-130)的71F10Fab-hLIGHT融合物重链SEQ ID NO：6的大约核苷酸673至756所编码的氨基酸序列；由具有G4S δ4连接体(pBIIB71F10-131)的71F10 Fab-h LIGHT融合物重链SEQ ID NO：7的大约核苷酸688至771所编码的氨基酸序列；或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％、90％、95或更高一致性的序列)所编码的氨基酸序列)的一个或多个氨基酸残基(例如至少10至35、15至30或者大约20至26个氨基酸残基)。备选地，所述的连接基团可以包括一个或多个(Gly)4-Ser(SEQ ID NO：146)重复与得自LIGHT的细胞外结构域或其突变体(例如得自人LIGHT同种型1的SEQ ID NO：1的大约氨基酸61至92；具有δ4连接体(pBIIB71F10-130)的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的SEQ ID NO：2的大约氨基酸225至252；具有G4S δ4连接体(pBIIB71F10-131)的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的SEQ ID NO：3的大约氨基酸230至257；或与其基本一致的氨基酸序列；或者由人LIGHT同种型1的SEQ ID NO：5的大约核苷酸181至276的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；由具有δ4连接体(pBIIB71F10-130)的71F10Fab-hLIGHT融合物重链SEQ ID NO：6的大约核苷酸673至756所编码的氨基酸序列；有具有G4S δ4连接体(pBIIB71F10-131)的71F10Fab-h LIGHT融合物重链SEQID NO：7的大约核苷酸688至771所编码的氨基酸序列；或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％、90％、95或更高一致性的序列)所编码的氨基酸序列)的一个或多个氨基酸残基(例如至少10至35、15至30、或大约20至26个氨基酸残基)的组合。可以用于LIGHT融合物中的示例性连接体以SEQID NO：132(δ4)，SEQ ID NO：133(G4Sδ4)，SEQ ID NO：134(G4S)或与其基本一致的氨基酸序列形式所示。
在其他实施方案中，所述的LIGHT部分与所述的靶向部分是化学偶联的，例如，通过一个反应性基团(例如包含琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺的基团)与所述的LIGHT或所述的靶向部分的定义氨基酸共价偶联。在其中所述的LIGHT部分与所述的靶向部分是化学偶联的这些实施方案中，所述的反应性基团可以可任选地与生物相容性聚合物偶联，所述的聚合物为具有单体的聚合物，所述的单体选自AEA((2-氨基)乙氧基乙酸)、AEEA([2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸)、OA(式NH2-(CH2)7-COOH所示的8-氨基辛酸，也称为8-氨基羊脂酸)或它们的组合中的一种或多种。所述的连接基团可以包括所述的生物相容性聚合物的任何组合。
在一个示例性实施方案中，所述的LIGHT靶向分子包括或基本上由哺乳动物(例如人)LIGHT蛋白质或其功能变体或片段、以及与HER2结合的抗体分子(本文中也称为“LIGHT-抗HER2融合物”)的至少一个融合分子构成。在某些实施方案中，所述的LIGHT-抗HER2融合物包括至少3个融合分子的大约200至250kDa(通常大约220kDa，如图1和3中所示(例如具有NO：2-4的氨基酸序列，或者与其基本一致的氨基酸序列))的三聚体；或至少2个融合分子的大约100至200kDa(通常大约150kDa，如图2和24所示(具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列，湖综合与其基本一致的氨基酸序列))的二聚体。与本文所述的LIGHT-抗HER2重链结合的轻链可以具有SEQID NO：109中所示的氨基酸序列，或者与其基本一致的氨基酸序列(或者由SEQ ID NO：110所示的核苷酸序列或与其基本一致的核苷酸序列所编码)。
不受理论所束缚，据信，所述的LIGHT-抗HER2融合物会通过诱导由抗HER2抗体分子调控的肿瘤细胞的杀死、以及刺激局部LIGHT调控的抗肿瘤免疫来引发双重抗癌效果。在某些实施方案中，所述的LIGHT-抗HER2融合物可以具有以下活性中的一种或多种：(i)以一定的亲和性与HER2结合，其中所述的亲和性表征为解离常数(Kd)至少为1x10-7M，1x10-8M，1x10-9M，1x10-10M，1x10-11M，1x10-12M，1x10-13M；(ii)例如，基本上选择性地结合HER2，而与其他HER家族成员不具有明显的交叉反应；(iii)与HER2上的线性或构造抗原决定部位结合，其中所述的抗原决定部位选自结构域1的抗原决定部位(D1)(与图4中所示的人HER2的大约氨基酸1至196相应)；结构域2的抗原决定部位(D2)(与图4中所示的人HER2的大约氨基酸197至318相应)；结构域3的抗原决定部位(D3)(与图4中所示的人HER2的大约氨基酸319至508相应)；结构域4的抗原决定部位(D4)(与图4中所示的人HER2的大约氨基酸508至630相应)；或它们的组合，例如抗原决定部位D1-2(与图4中所示的人HER2的大约氨基酸1至318相应)或抗原决定部位D1-3(与图4中所示的人HER2的大约氨基酸1至508相应)；(iv)抑制、阻断或减少HER2的信号传递(例如抑制、阻断或减少HER2、AKT和/或MAP激酶中的一种或多种的磷酸化；或抑制、阻断或减少HER2的同源二聚化，或者HER2与HER3、和/或HER2与EGFR的异源二聚化)；(v)在体外(例如MCF7和SKBR-3细胞)和体内抑制表达HER2的细胞的活性和/或诱导细胞的杀死；(vi)引发体内(例如在动物模型(例如带有乳腺肿瘤细胞的小鼠肿瘤模型、或HER2依赖性的结肠直肠和胃部的异种移植物肿瘤模型)或人受试对象中)的抗肿瘤免疫应答；和/或(vii)例如在持久的单一疗法或结合疗法之后，或者在另一次化学疗法(例如标准的化学疗法或抗HER2抗体的疗法)之后检测到肿瘤复发之后，诱导持久的减缓肿瘤的生长和转移。
在一个实施方案中，所述的LIGHT-抗HER2融合物包括或基本上由至少一种哺乳动物(例如人)LIGHT蛋白质或其变体或片段(例如本文所述的LIGHT蛋白质)、以及抗HER2特异性抗体分子或其片段(例如本文所述的抗体分子)。
如本文所述，本发明还特写了选择性地结合HER2(例如本文所述的抗HER2抗体)的抗体分子(例如经分离或纯化的蛋白质或多肽)。本文所述的抗HER2抗体可以存在于本发明的LIGHT靶向分子中，或者可以以不同于本文所述的靶向分子的单一的或结合的实体的形式存在。
在某些实施方案中，存在于LIGHT靶向分子中或者以单一的或结合的实体的形式存在的所述的抗HER2抗体分子包括以下特征中的一种或多种：
在多个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子为抗体分子或得自抗体的Fab片段，所述的抗体选自：BIIB71F10(包括SEQ ID NO：11和13的各自的VH和VL的氨基酸序列；或与71F10Fab LIGHT的CHO细胞保藏相应的ATCC专利保藏名称(ATCC Patent Deposit Designation)PTA-10355的VH和VL氨基酸；或由SEQ ID NO：12和14的各自的VH和VL的核苷酸序列编码的序列；或者编码71F10Fab LIGHT的VH和VL氨基酸的ATCC专利保藏名称PTA-10355的核苷酸序列；或者由所述的这些序列构成)；BIIB69A09(包括SEQ ID NO：15和17的各自的VH和VL的氨基酸序列；或由SEQ ID NO：16和18的各自的VH和VL的核苷酸序列所编码的序列；或者由所述的这些序列构成)；BIIB67F10(包括SEQ ID NO：19和21的各自的VH和VL的氨基酸序列；或由SEQ ID NO：20和22的各自的VH和VL的核苷酸序列所编码的序列；或者由所述的这些序列构成)；BIIB67F11(包括SEQ ID NO：23和25的各自的VH和VL的氨基酸序列；或与67F11FabLIGHT的CHO细胞保藏相应的ATCC专利保藏名称PTA-10357的VH和VL氨基酸；或由SEQ ID NO：24和26的各自的VH和VL的核苷酸序列编码的序列；或者编码67F11Fab LIGHT的VH和VL氨基酸的ATCC专利保藏名称PTA-10357的核苷酸序列；或者由所述的这些序列构成)；BIIB66A12(包括SEQ ID NO：27和29的各自的VH和VL的氨基酸序列；或由SEQ IDNO：28和30的各自的VH和VL的核苷酸序列所编码的序列；或者由所述的这些序列构成)；BIIB66C01(包括SEQ ID NO：31和33的各自的VH和VL的氨基酸序列；或由SEQ ID NO：32和34的各自的VH和VL的核苷酸序列所编码的序列；或者由所述的这些序列构成)；BIIB65C10(包括SEQ IDNO：35和37的各自的VH和VL的氨基酸序列；或与65C10Fab LIGHT的CHO保藏相应的ATCC专利保藏名称PTA-10358的VH和VL氨基酸；或由SEQ ID NO：36和38的各自的VH和VL的核苷酸序列编码的序列；或者编码65C10Fab LIGHT的VH和VL氨基酸的ATCC专利保藏名称PTA-10358的核苷酸序列；或者由所述的这些序列构成)；BIIB65H09(包括SEQ IDNO：39和41的各自的VH和VL的氨基酸序列；或与65H09Fab LIGHT的CHO细胞保藏相应的ATCC专利保藏名称PTA-10356的VH和VL氨基酸；或由SEQ ID NO：40和42的各自的VH和VL的核苷酸序列编码的序列；或者编码65H09Fab LIGHT的VH和VL氨基酸的ATCC专利保藏名称PTA-10356的核苷酸序列；或者由所述的这些序列构成)；以及BIIB65B03(包括SEQ ID NO：43和45的各自的VH和VL的氨基酸序列；或由SEQ IDNO：44和46的各自的VH和VL的核苷酸序列所编码的序列；或者由所述的这些序列构成)(在本文中还称为“71F10”、“69A09”、“67F10”、“67F11”、“66A12”、“66C01”、“65C10”、“65H09”和“65B03”)；或者与其基本一致的氨基酸或核苷酸序列(例如与其至少为大约85％、90％、95％或更高一致性的序列)。这些Fab的每一条的VH和VL结构域的氨基酸和相应核苷酸序列示于SEQ ID NO：11-46中。为了简便，本文所公开的核苷酸和氨基酸序列在本文中全体被称为它们相应的SEQ ID NO，例如SEQ ID NO：39-42，此时，其是指SEQ ID NO：39和41的各自的VH和VL的氨基酸序列和/或相应的ATCC保藏；或由SEQ ID NO：40和42的各自的VH和VL的核苷酸序列编码的序列和/或相应的ATCC保藏。
在其他实施方案中，所述的抗HER2抗体分子具有与抗体分子或得自抗体的Fab片段相当的功能活性，其中所述的抗体选自：BIIB71F10(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：11-14的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB69A09(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：15-18的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB67F10(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：19-22的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB67F11(包括或基本上由本文所述的SEQ IDNO：23-26的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB66A12(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：27-30的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB66C01(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：31-34的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB65C10(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：35-38的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB65H09(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：39-42的氨基酸或核苷酸序列构成)；以及BIIB65B03(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：43-46的氨基酸或核苷酸序列构成)；或与其基本一致的氨基酸和核苷酸序列(例如与其至少为大约85％、90％、95％或更高一致性的序列)。
在其他实施方案中，所述的抗HER2抗体分子可以与得自一种或多种物种的HER2发生交叉反应，其中所述的物种选自人、小鼠、大鼠和/或犬起源的。所述的抗HER2抗体分子可以以一定的EC50而与HER2结合，其中所述的EC50的范围为大约1至120nM、大约1至100nM、大约1至80nM、大约1至70nM、大约1至60nM、大约1至40nM、大约1至30nM、大约1至20nM、大约1至15nM、大约1至12nM、大约1至5nM、大约1至2nM、或者大约1至1nM。在其他实施方案中，所述的抗HER2抗体分子抑制或减少了一种或多种HER2相关的生物学活性，其IC50为大约50nM至5pM、通常为大约100至250pM或更低(例如更好的抑制的情况下)。例如，所述的抗HER2抗体分子可以具有以下活性中的一种或多种：(i)以IC50为大约50nM至5pM、通常为大约100至250pM或更低(例如更好的抑制的情况下)来抑制、阻断或减少HER2的信号传递(例如抑制、阻断或减少HER2、AKT和/或MAP激酶中的一种或多种的磷酸化；或抑制、阻断或减少HER2的同源二聚化，或者HER2与HER3、和/或HER2与EGFR的异源二聚化)；(ii)以较低的动力学进行内化，估计所述的动力学低于或等于对照抗HER2抗体的内化速率，该速率在SKBR-3细胞中为8e-6s-1而在BT-474细胞中为2.1e-5s-1；和/或(iii)在体外(例如MCF7和SKBR-3细胞)和体内抑制表达HER2的细胞的活性和/或诱导细胞的杀死。在一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子以104至107M-1s-1、通常为105至106M-1s-1的动力学范围与HER2结合。在另一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子以0.1-100nM的kD与人HER2结合。在另一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的解离动力学范围为10-2至10-6s-1、通常为10-2至10-5s-1。在一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子以近似于单克隆抗体的亲和性和/或动力学(例如在因数20、10或5的范围内)而与HER2(例如人HER2)结合，其中所述的单克隆抗体选自：BIIB71F10(包括或基本上由本文所述的SEQ IDNO：11-14或ATCC专利保藏PTA-10355的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB69A09(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：15-18的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB67F10(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：19-22的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB67F11(包括或基本上由本文所述的SEQID NO：23-26或ATCC专利保藏PTA-10357的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB66A12(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：27-30的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB66C01(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：31-34的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB65C10(包括或基本上由本文所述的SEQ IDNO：35-38或ATCC专利保藏PTA-10358的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB65H09(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：39-42或ATCC专利保藏PTA-10356的氨基酸或核苷酸序列构成)；以及BIIB65B03(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：43-46的氨基酸或核苷酸序列构成)。可以使用(例如)生物传感器技术(BIACORETM)来测试所述的抗HER2抗体分子的亲和性和结合动力学。
在另一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子特异性地与(例如)哺乳动物HER2(例如人HER2)的抗原决定部位(例如线性或构造抗原决定部位)结合。在一些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子作为抗体进行竞争性地结合(例如结合相同或相似的(例如)部分重叠的抗原决定部位)，其中所述的抗体选自：BIIB71F10(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：11-14或ATCC专利保藏PTA-10355的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB69A09(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：15-18的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB67F10(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：19-22的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB67F11(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：23-26或ATCC专利保藏PTA-10357的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB66A12(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：27-30的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB66C01(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：31-34的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB65C10(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：35-38或ATCC专利保藏PTA-10358的氨基酸或核苷酸序列构成)；BIIB65H09(包括或基本上由本文所述的SEQ ID NO：39-42或ATCC专利保藏PTA-10356的氨基酸或核苷酸序列构成)；以及BIIB65B03(包括或基本上由本文所述的SEQID NO：43-46的氨基酸或核苷酸序列构成)。在一些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子与HER2上的线性或构造抗原决定部位结合，其中所述的抗原决定部位选自：抗原决定部位D1(与图4中所示的人HER2的大约氨基酸1至196相应)；抗原决定部位D2(与图4中所示的人HER2的大约氨基酸197至318相应)；抗原决定部位D3(与图4中所示的人HER2的大约氨基酸319至508相应)；抗原决定部位D4(与图4中所示的人HER2的大约氨基酸508至630相应)或它们的组合，例如抗原决定部位D1-2(与图4中所示的人HER2的大约氨基酸1至318相应)或抗原决定部位D1-3(与图4中所示的人HER2的大约氨基酸1至508相应)。
在一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子包括1个、2个、3个、4个、5个或所有6个得自抗体的CDR，其中所述的抗体选自：BIIB71F10(SEQID NO：11(VH)，13(VL)或ATCC专利保藏PTA-10355)；BIIB69A09(SEQ IDNO：15，17)；BIIB67F10(SEQ ID NO：19，21)；BIIB67F11(SEQ ID NO：23，25或ATCC专利保藏PTA-10357)；BIIB66A12(SEQ ID NO：27，29)；BIIB66C01(SEQ ID NO：31，33)；BIIB65C10(SEQ ID NO：35，37或ATCC专利保藏PTA-10358)；BIIB65H09(SEQ ID NO：39，41或ATCC专利保藏PTA-10356)；BIIB65B03(SEQ ID NO：43，45)；或密切相关的CDR，例如一致的或者具有至少1个氨基酸改变、但不超过2个、3个或4个改变(例如取代(如保守性取代)、删除或插入)的CDR。可任选地，所述的抗体分子可以包括本文所述的任何CDR。
在一些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链免疫球蛋白可变结构域包括重链CDR1、CDR2和/或CDR3；或者具有不同于单克隆抗体的重链CDR1，CDR2和/或CDR3的少于3、2或1个氨基酸取代(例如保守性取代)的CDR，其中所述的单克隆抗体选自：BIIB71F10(SEQ ID NO：47(CDR1)、SEQ ID NO：48(CDR2)和/或SEQ ID NO：49(CDR3)，或得自ATCC专利保藏PTA-10355的CDR)；BIIB69A09(SEQ ID NO：50(CDR1)、SEQ IDNO：51(CDR2)和/或SEQ ID NO：52(CDR3))；BIIB67F10(SEQ ID NO：53(CDR1)、SEQ ID NO：54(CDR2)和/或SEQ ID NO：55(CDR3))；BIIB67F11(SEQ ID NO：56(CDR1)、SEQ ID NO：57(CDR2)和/或SEQ ID NO：58(CDR3)，或得自ATCC专利保藏PTA-10357的CDR)；BIIB66A12(SEQ IDNO：59(CDR1)、SEQ ID NO：60(CDR2)和/或SEQ ID NO：61(CDR3))；BIIB66C01(SEQ ID NO：62(CDR1)、SEQ ID NO：63(CDR2)和/或SEQ IDNO：64(CDR3))；BIIB65C10(SEQ ID NO：65(CDR1)、SEQ ID NO：66(CDR2)和/或SEQ ID NO：67(CDR3)，或得自ATCC专利保藏PTA-10358的CDR)；BIIB65H09(SEQ ID NO：68(CDR1)、SEQ ID NO：69(CDR2)和/或SEQ IDNO：70(CDR3)，或得自ATCC专利保藏PTA-10356的CDR)；以及BIIB65B03(SEQ ID NO：71(CDR1)、SEQ ID NO：72(CDR2)和/或SEQ ID NO：73(CDR3))。
在其他实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的轻链免疫球蛋白可变结构域包括轻链CDR1、CDR2和/或CDR3；或者具有不同于单克隆抗体的轻链CDR1，CDR2和/或CDR3的少于3、2或1个氨基酸取代(例如保守性取代)的CDR，其中所述的单克隆抗体选自：BIIB71F10(SEQ ID NO：74(CDR1)、SEQ ID NO：75(CDR2)和/或SEQ ID NO：76(CDR3)，或得自ATCC专利保藏PTA-10355的CDR)；BIIB69A09(SEQ ID NO：77(CDR1)、SEQ IDNO：78(CDR2)和/或SEQ ID NO：79(CDR3))；BIIB67F10(SEQ ID NO：80(CDR1)、SEQ ID NO：81(CDR2)和/或SEQ ID NO：82(CDR3))；BIIB67F11(SEQ ID NO：83(CDR1)，SEQ ID NO：84(CDR2)和/或SEQ ID NO：85(CDR3)，或得自ATCC专利保藏PTA-10357的CDR)；BIIB66A12(SEQ IDNO：86(CDR1)、SEQ ID NO：87(CDR2)和/或SEQ ID NO：88(CDR3))；BIIB66C01(SEQ ID NO：89(CDR1)、SEQ ID NO：90(CDR2)和/或SEQ IDNO：91(CDR3))；BIIB65C10(SEQ ID NO：92(CDR1)、SEQ ID NO：93(CDR2)和/或SEQ ID NO：94(CDR3)，或得自ATCC专利保藏PTA-10358的CDR)；BIIB65H09(SEQ ID NO：95(CDR1)、SEQ ID NO：96(CDR2)和/或SEQ IDNO：97(CDR3)，或得自ATCC专利保藏PTA-10356的CDR)以及BIIB65B03(SEQ ID NO：98(CDR1)、SEQ ID NO：99(CDR2)和/或SEQ ID NO：100(CDR3))。
在某些实施方案中，BIIB71F10的重链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：156所示的核苷酸序列所编码。BIIB71F10的轻链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列所编码。在其他实施方案中，BIIB71F10的重链和轻链可变结构域包括ATCC专利保藏PTA-10355的氨基酸序列，或者由ATCC专利保藏PTA-10355的核苷酸序列所编码。在某些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的SYGMV(SEQ IDNO：47)；CDR2中的SISSSGGLTWYADSVKG(SEQ ID NO：48)；和/或CDR3中的PPGIAVARDY(SEQ ID NO：49)。在其他实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的轻链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的RASQGISNYLA(SEQ ID NO：74)；CDR2中的AASTLQS(SEQ ID NO：75)；和/或CDR3中的QKYNSALLT(SEQ ID NO：76)；或者具有得自ATCC专利保藏PTA-10355的重链和/或轻链可变结构域的至少1个、2个或3个CDR。
在某些实施方案中，BIIB65H09的重链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列所编码。BIIB65H09的轻链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列所编码。在其他实施方案中，BIIB65H09的重链和轻链可变结构域包括ATCC专利保藏PTA-10356的氨基酸序列，或者由ATCC专利保藏PTA-10356的核苷酸序列所编码。在某些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的WYSMW(SEQ ID NO：68)；CDR2中的SIVSSGGQTRYADSVKG(SEQ ID NO：69)；和/或CDR3中的VKGYYYYIDV(SEQ ID NO：70)。在其他实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的轻链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的RASQSVDSSYLS(SEQ ID NO：95)；CDR2中的GASTRAT(SEQ ID NO：96)；和/或CDR3中的QQHGYSSRT(SEQ ID NO：97)；或者具有得自ATCC专利保藏PTA-10356的重链和/或轻链可变结构域的至少1个、2个或3个CDR。
在某些实施方案中，BIIB67F11的重链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列所编码。BIIB67F11的轻链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列所编码。在其他实施方案中，BIIB67F11的重链和轻链可变结构域包括ATCC专利保藏PTA-10357的氨基酸序列，或者由ATCC专利保藏PTA-10357的核苷酸序列所编码。在某些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的NYYMM(SEQ ID NO：56)；CDR2中的VIGSSGGMTNYADSVKG(SEQ ID NO：57)；和/或CDR3中的GYPTGYYDSSGWVYSYYGIDV(SEQ ID NO：58)。在其他实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的轻链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的QASQDTDNRLH(SEQ ID NO：83)；CDR2中的DAVNLKR(SEQID NO：84)；和/或CDR3中的QHSDGLSLA(SEQ ID NO：85)；或者具有得自ATCC专利保藏PTA-10357的重链和/或轻链可变结构域的至少1个、2个或3个CDR。
在某些实施方案中，BIIB65C10的重链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列所编码。BIIB65C10的轻链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：38所示的核苷酸序列所编码。在其他实施方案中，BIIB65C10的重链和轻链可变结构域包括ATCC专利保藏PTA-10358的氨基酸序列，或者由ATCC专利保藏PTA-10358的核苷酸序列所编码。在某些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的YYPMM(SEQ ID NO：65)；CDR2中的SIWPSGGFTKYADSVKG(SEQ ID NO：66)；和/或CDR3中的VSSSSWYGYLY(SEQ ID NO：67)。在其他实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的轻链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的SGSSSNIGRNTVN(SEQ ID NO：92)；CDR2中的SNNQRPS(SEQ ID NO：93)；和/或CDR3中的AAWDDSLNAWV(SEQ ID NO：94)；或者具有得自ATCC专利保藏PTA-10358的重链和/或轻链可变结构域的至少1个、2个或3个CDR。
在某些实施方案中，BIIB-65B03的重链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：44所示的核苷酸序列所编码。BIIB65B03的轻链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：46所示的核苷酸序列所编码。在某些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的WYRMN(SEQ ID NO：71)；CDR2中的SIYSSGGPTNYADSVKG(SEQ ID NO：72)；和/或CDR3中的EKPDYYDSSGYLDY(SEQ ID NO：73)。在其他实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的轻链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：98)；CDR2中的GASSRAT(SEQ ID NO：99)；和/或CDR3中的HQYGRPPV(SEQ ID NO：100)。
在某些实施方案中，BIIB66A12的重链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列所编码。BIIB66A12的轻链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列所编码。在某些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的MYSMQ(SEQ ID NO：59)；CDR2中的VIGSSGGQTGYADSVKG(SEQ ID NO：60)；和/或CDR3中的VRDYYGSGSYYLDP(SEQ ID NO：61)。在其他实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的轻链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的RASQSISSYLN(SEQ ID NO：86)；CDR2中的AASSLQS(SEQ ID NO：87)；和/或CDR3中的QQSYSTSWT(SEQ ID NO：88)。
在某些实施方案中，BIIB66C01的重链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：32所示的核苷酸序列所编码。BIIB66C01的轻链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：34所示的核苷酸序列所编码。在某些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的WYSMS(SEQ ID NO：62)；CDR2中的SISSSGGPTHYADSVKG(SEQ ID NO：63)；和/或CDR3中的DSSYSGTS(SEQ ID NO：64)。在其他实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的轻链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的SGSSSNIGSEYVY(SEQID NO：89)；CDR2中的RNDQRPS(SEQ ID NO：90)；和/或CDR3中的TTWDDSLSGPV(SEQ ID NO：91)。
在某些实施方案中，BIIB67F10的重链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列所编码。BIIB67F10的轻链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列所编码。在某些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的PYMMV(SEQ ID NO：53)；CDR2中的WISPSGGYTFYADSVKG(SEQ ID NO：54)；和/或CDR3中的GTYPLTY(SEQID NO：55)。在其他实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的轻链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的SGDKLGDKYVS(SEQ IDNO：80)；CDR2中的QDSKWPS(SEQ ID NO：81)；和/或CDR3中的QVWDISHVV(SEQ ID NO：82)。
在某些实施方案中，BIIB69A09的重链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列所编码。BIIB69A09的轻链可变结构域的氨基酸序列包括SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列所编码。在某些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的RYNMW(SEQ ID NO：50)；CDR2中的VIRSSGGYTGYADSVKG(SEQ ID NO：51)；和/或CDR3中的WNSGYSYWDYYYGMDV(SEQ ID NO：52)。在其他实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的轻链可变结构域包括以下结构域中的一种或多种：CDR1中的RASQSISSYLN(SEQ ID NO：77)；CDR2中的AASSLQS(SEQ IDNO：78)；和/或CDR3中的QQFNTYPIT(SEQ ID NO：79)。
在其他实施方案中，所述融合物的抗体分子包括一个或多个具有氨基酸序列的CDR，其中所述的氨基酸序列选自SEQ ID NO：50-73和77-100中的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子包括得自抗体的重链可变区的至少1个、2个或3个Chothia超变环，其中所述的抗体选自：例如BIIB71F10(SEQ ID NO：11-12，或得自ATCC专利保藏PTA-10355的Chothia超变环)，BIIB69A09(SEQ ID NO：15-16)，BIIB67F10(SEQ ID NO：19-20)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23-24，或得自ATCC专利保藏PTA-10357的Chothia超变环)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27-28)，BIIB66C01(SEQ ID NO：31-32)，BIIB65C10(SEQ ID NO：35-36，或得自ATCC专利保藏PTA-10358的Chothia超变环)，BIIB65H09(SEQ ID NO：39-40，或得自ATCC专利保藏PTA-10356的Chothia超变环)或BIIB65B03(SEQ ID NO：43-44)。在另一个实施方案中，所述的抗体分子包括得自抗体的轻链可变区的至少1个、2个或3个超变环，其中所述的抗体选自：例如BIIB71F10(SEQ ID NO：13-14，或得自ATCC专利保藏PTA-10355的Chothia超变环)，BIIB69A09(SEQ ID NO：17-18)，BIIB67F10(SEQ ID NO：21-22)，BIIB67F11(SEQ ID NO：25-26，或得自ATCC专利保藏PTA-10357的Chothia超变环)，BIIB66A12(SEQ ID NO：29-30)，BIIB66C01(SEQ ID NO：33-34)，BIIB65C10(SEQ ID NO：37-38，或得自ATCC专利保藏PTA-10358的Chothia超变环)，BIIB65H09(SEQ ID NO：41-42，或得自ATCC专利保藏PTA-10356的Chothia超变环)或BIIB65B03(SEQ IDNO：45-46)。在另一个实施方案中，所述的抗体或其片段包括包括得自抗体的重链和轻链可变区的至少1个、2个、3个、4个、5个或6个超变环，其中所述的抗体选自：例如BIIB71F10(SEQ ID NO：11-14，或得自ATCC专利保藏PTA-10355的超变环)，BIIB69A09(SEQ ID NO：15-18)，BIIB67F10(SEQID NO：19-22)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23-26，或得自ATCC专利保藏PTA-10357的超变环)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27-30)，BIIB66C01(SEQ IDNO：31-34)，BIIB65C10(SEQ ID NO：35-38，或得自ATCC专利保藏PTA-10358的超变环)，BIIB65H09(SEQ ID NO：39-42，或得自ATCC专利保藏PTA-10356的超变环)，BIIB65B03(SEQ ID NO：43-46)；或密切相关的超变环(例如与本文所公开的序列一致的，或与本文所公开的序列具有至少1个氨基酸改变、但不超过2个、3个或4个改变的超变环)。可任选地，所述的蛋白质可以包括本文所述的任何超变环。
在另一个实例中，所述的抗HER2抗体分子包括具有与以下抗体的相应超变环相同的典型结构的至少1个、2个或3个超变环，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ ID NO：11-14，或得自ATCC专利保藏PTA-10355的超变环)，BIIB69A09(SEQ ID NO：15-18)，BIIB67F 10(SEQ ID NO：19-22)，BIIB67F 11(SEQ ID NO：23-26，或得自ATCC专利保藏PTA-10357的超变环)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27-30)，BIIB66C01(SEQ ID NO：31-34)，BIIB65C10(SEQ IDNO：35-38，或得自ATCC专利保藏PTA-10358的超变环)，BIIB65H09(SEQ IDNO：39-42，或得自ATCC专利保藏PTA-10356的超变环)或BIIB65B03(SEQID NO：43-46)，例如与以下抗体的重链和/或轻链可变结构域的至少环1和/或环2相同或相似的典型结构，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ IDNO：11-14，或得自ATCC专利保藏PTA-10355的超变环)，BIIB69A09(SEQ IDNO：15-18)，BIIB67F10(SEQ ID NO：19-22)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23-26，或得自ATCC专利保藏PTA-10357的超变环)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27-30)，BIIB66C01(SEQ ID NO：31-34)，BIIB65C10(SEQ ID NO：35-38，或得自ATCC专利保藏PTA-10358的超变环)，BIIB65H09(SEQ ID NO：39-42，或得自ATCC专利保藏PTA-10356的超变环)或BIIB65B03(SEQ ID NO：43-46)。对于超变环典型结构的描述，例如参见Chothia et al.(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；Tomlinson et al.(1992)J.Mol.Biol.227：776-798。这些结构可以通过所述文献中描述的表格中的检验方法来确定。
在一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链构架(例如单独的FR1，FR2，FR3，或者涵盖FR1，FR2和FR3但不包含CDR的序列)包括这样的氨基酸序列，该序列与以下抗体的重链构架具有至少80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高的一致性，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQID NO：11或ATCC专利保藏PTA-10355)；BIIB69A09(SEQ ID NO：15)；BIIB67F10(SEQ ID NO：19)；BIIB67F11(SEQ ID NO：23或ATCC专利保藏PTA-10357)；BIIB66A12(SEQ ID NO：27)；BIIB66C01(SEQ ID NO：31)；BIIB65C10(SEQ ID NO：35或ATCC专利保藏PTA-10358)；BIIB65H09(SEQID NO：39或ATCC专利保藏PTA-10356)或BIIB65B03(SEQ ID NO：43)。在一些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链构架具有与人V节段序列HV3-23(SEQ ID NO：107)基本同源的氨基酸序列(例如参见Chothia et al.(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；Tomlinson et al.(1992)J.Mol.Biol.227：776-798)。
在另一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的轻链构架(例如单独的FR1，FR2，FR3，或者涵盖FR1，FR2和FR3但不包含CDR的序列)包括这样的氨基酸序列，该序列与以下抗体的重链构架具有至少80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高的一致性，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQID NO：13或ATCC专利保藏PTA-10355)；BIIB69A09(SEQ ID NO：17)；BIIB67F10(SEQ ID NO：21)；BIIB67F11(SEQ ID NO：25或ATCC专利保藏PTA-10357)；BIIB66A12(SEQ ID NO：29)；BIIB66C01(SEQ ID NO：33)；BIIB65C10(SEQ ID NO：37或ATCC专利保藏PTA-10358)；BIIB65H09(SEQID NO：41或ATCC专利保藏PTA-10356)或BIIB65B03(SEQ ID NO：45)。在一些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链构架具有与人VLκI子群种系序列(例如VLκ共有序列)基本同源的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链免疫球蛋白可变结构域包括或基本上由氨基酸序列构成，其中所述的氨基酸序列由在高度严谨的条件下与编码以下抗体的重链可变结构域的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列所编码，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ ID NO：12；SEQID NO：156或ATCC专利保藏PTA-10355)，BIIB69A09(SEQ ID NO：16)，BIIB67F10(SEQ ID NO：20)，BIIB67F11(SEQ ID NO：24或ATCC专利保藏PTA-10357)，BIIB66A12(SEQ ID NO：28)，BIIB66C01(SEQ ID NO：32)，BIIB65C10(SEQ ID NO：36或ATCC专利保藏PTA-10358)，BIIB65H09(SEQID NO：40或ATCC专利保藏PTA-10356)，或BIIB65B03(SEQ ID NO：44)；或者包括与以下抗体的重链可变结构域的氨基酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高的一致性的氨基酸序列，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ ID NO：11或ATCC专利保藏PTA-10355)，BIIB69A09(SEQ ID NO：15)，BIIB67F10(SEQ ID NO：19)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23或ATCC专利保藏PTA-10357)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27)，BIIB66C01(SEQID NO：31)，BIIB65C10(SEQ ID NO：35或ATCC专利保藏PTA-10358)，BIIB65H09(SEQ ID NO：39或ATCC专利保藏PTA-10356)或BIIB65B03(SEQID NO：43)。
在某些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的轻链免疫球蛋白可变结构域包括或基本上由氨基酸序列构成，其中所述的氨基酸序列由在高度严谨的条件下与编码以下抗体的轻链可变结构域的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列所编码，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ ID NO：14或ATCC专利保藏PTA-10355)，BIIB69A09(SEQ ID NO：18)，BIIB67F10(SEQID NO：22)，BIIB67F11(SEQ ID NO：26或ATCC专利保藏PTA-10357)，BIIB66A12(SEQ ID NO：30)，BIIB66C01(SEQ ID NO：34)，BIIB65C10(SEQID NO：38或ATCC专利保藏PTA-10358)，BIIB65H09(SEQ ID NO：42或ATCC专利保藏PTA-10356)，或BIIB65B03(SEQ ID NO：46)；或者包括与以下抗体的轻链可变结构域具有至少80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高的一致性的氨基酸序列，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ ID NO：13或ATCC专利保藏PTA-10355)，BIIB69A09(SEQ ID NO：17)，BIIB67F10(SEQID NO：21)，BIIB67F11(SEQ ID NO：25或ATCC专利保藏PTA-10357)，BIIB66A12(SEQ ID NO：29)，BIIB66C01(SEQ ID NO：33)，BIIB65C10(SEQID NO：37或ATCC专利保藏PTA-10358)，BIIB65H09(SEQ ID NO：41或ATCC专利保藏PTA-10356)或BIIB65B03(SEQ ID NO：45)。
在某些实施方案中，所述的LIGHT/HER2融合物包括或基本上由氨基酸序列构成，其中所述的氨基酸序列如具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-130)(SEQ ID NO：2)，具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-131)(SEQ ID NO：3)，具有(G4S)4连接体71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-132)(SEQ ID NO：4)，或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；由具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-130)(SEQ ID NO：6)、具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-131)(SEQ ID NO：7)、具有(G4S)4连接体71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-132)(SEQ ID NO：8)、或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)所编码的氨基酸序列中的任意一者所示。在某些实施方案中，所述的LIGHT/HER2融合物还可以包括或基本上由第二条链(与之前所述的链融合或结合)构成，其中所述的第二条链包括或基本上由以下序列构成，其中所述的序列为：SEQ IDNO：109所示的氨基酸序列或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；由SEQ ID NO：110或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)中的任何一者所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在其他实施方案中，所述的LIGHT/HER2融合物还可以包括或基本上由第二条链(与之前所述的链融合或结合)构成，其中所述的第二条链包括或基本上由以下序列构成，其中所述的序列为：ATCC专利保藏PTA-10355、PTA-10356、PTA-10357或PTA-10358的氨基酸序列，或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；由ATCC专利保藏PTA-10355、PTA-10356、PTA-10357或PTA-10358的核苷酸序列或与其基本一致的核苷酸序列所编码的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。
在另一个示例性实施方案中，所述的LIGHT靶向分子包括哺乳动物(例如人)LIGHT蛋白质或其功能变体或片段、及与CD23结合的抗体分子构成的至少一个融合分子(本文中称为“LIGHT-抗CD23Fab融合物”)。在一个实施方案中，所述的LIGHT-抗CD23融合物包括或基本上由氨基酸序列构成，其中所述的序列如具有(G4S)3或(G4S)4连接体的抗CD23Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB CD23-204)(分别为SEQ ID NO：101或174)、或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；由具有(G4S)3或(G4S)4连接体的抗CD23Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB CD23-204)(分别为SEQ ID NO：102或173)中的任何一者所示的核苷酸序列、或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)所编码的氨基酸序列中的任何一者所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述的LIGHT/CD23融合物还可包括或基本上由第二条链(与之前所述的链融合或结合)构成，其中所述的第二条链包括或基本上由以下序列构成，其中所述的序列为：SEQ ID NO：103所示的氨基酸序列或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；由抗CD23Fab-hLIGHT融合物轻链(SEQ ID NO：104)的任何一者中所示的核苷酸序列或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)所编码的氨基酸序列。
在另一个示例性实施方案中，所述的LIGHT靶向分子包括哺乳动物(例如人)LIGHT蛋白质或其功能变体或片段、及与胰岛素生长因子受体结合的抗体分子构成的至少一个融合分子(本文中称为“LIGHT-抗IGFR Fab融合物”)。在一个实施方案中，所述的LIGHT-抗IGFR Fab融合物包括或基本上由以下序列构成，其中所述的序列如具有(G4S)4连接体的抗IGFRFab-hLIGHT融合物重链(BIIB C06-117)(SEQ ID NO：163)或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；由具有(G4S)4连接体的抗IGFR Fab-hLIGHT融合物重链(BIIB C06-117)(SEQID NO：162)中的任何一者所示的核苷酸序列或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)所编码的氨基酸序列中的任何一者所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述的LIGHT/IGFR融合物还可以包括或基本上由第二条链(与之前所述的链融合或结合)构成，其中所述的第二条链包括或基本上由以下序列构成，其中所述的序列为：SEQ ID NO：168所示的氨基酸序列或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；由抗IGFR Fab-hLIGHT融合物轻链(SEQ ID NO：167)的任何一者中所示的核苷酸序列或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)所编码的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明特写了选择性地与HER2(例如本文所述的抗HER2抗体)结合的抗体分子(例如经分离或纯化的蛋白质或多肽)。所述的抗体分子可以为单克隆或单特异性抗体或其抗原结合片段(例如Fab、F(ab′)2、Fv、单链Fv片段、单结构域抗体或其变体(例如重链或轻链可变结构域单体或二聚体，例如VH，VHH))；单链Fc片段；双体(dAb)；骆驼抗体；或移植到VH或VL结构域或其他支架(例如纤维连接蛋白结构域，T细胞受体，本文所述的亲和体分子(例如亲和体蛋白质Z支架)，纤维连接蛋白支架，脂质运载蛋白，锚蛋白重复序列，LDL受体结构域，RNA适配体，PDZ结构域和微体)的所有部分上的1个、2个或所有3个互补性决定区(CDR)(或之前所述的一种或多种抗体分子的组合)。所述的抗体分子可以与HER2(例如哺乳动物(例如人)HER2)相互作用(例如结合)。例如，所述的抗体分子可以包括单链(例如单链Fc)与Fab或scFv的组合。在其他实施方案中，所述的抗体分子可以为多特异性(例如二价或双特异性)抗体或其片段。在一些实施方案中，所述的抗体分子与HER2上的单个抗原决定部位结合。在其他实施方案中，所述的抗体分子为多特异性抗体，并且与一种或多种细胞表面蛋白质(例如本文所述的HER2和一种或多种细胞表面蛋白质)上的两个或多个抗原决定部位结合。通常，所述的抗体分子为人、人源的、嵌合的、骆驼的或体外生成的抗体(或其功能片段，例如本文所述的抗体片段)。在一些实施方案中，所述的抗HER2的抗体是通过体外选择而在噬菌体中形成的。在某些实施方案中，所述的抗体分子以一定的亲和性与所述的细胞表面蛋白质结合，其中所述的亲和性可表征为解离常数(Kd)至少为1x10-7M，1x10-8M，1x10-9M，1x10-10M，1x10-11M，1x10-12M，1x10-13M。
所述的抗体分子可以为全长的(例如可以包括至少一条、通常为两条的完整重链；以及至少一条、通常为两条的完整轻链)或者可以包括抗原结合片段(例如Fab，F(ab’)2，Fv，单链Fv片段)。在另外的实施方案中，所述的抗体分子具有重链恒定区，选自例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD和IgE的重链恒定区；特别是选自(例如人)IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的重链恒定区。在另一个实施方案中，所述的抗体分子具有轻链恒定区，选自例如κ或λ的(例如人)的轻链恒定区。所述的恒定区可以改变，例如突变，从而修改所述抗体的性质(例如增强或减弱Fc受体结合、抗体的糖基化、半胱氨酸残基(-S-S-键)的数量、效应器细胞的功能和/或补体功能中的一种或多种)。
在某些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子可以具有本文针对抗HER2抗体分子所述的一种或多种活性。
在一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子为选自以下的抗体分子或Fab片段，或者具有与选自以下的抗体分子或Fab片段相当的功能活性，如本文所述，其中所述的抗体分子或Fab片段选自：BIIB71F10，BIIB69A09，BIIB67F10，BIIB67F11，BIIB66A12，BIIB66C01，BIIB65C10，BIIB65H09和BIIB65B03。
在其他实施方案中，所述的抗HER2抗体分子可以与得自一个或多个物种的HER2交叉反应，如本文所述，其中所述的物种选自人、小鼠、大鼠或犬起源，和/或所述的抗HER2抗体分子可以具有一种或多种结合性质，例如亲和性和/或动力学。
在另一个实施方案中，如本文所述，所述的抗HER2抗体分子特异性地与(例如)哺乳动物HER2(例如人HER2)的抗原决定部位(例如线性或构造抗原决定部位)结合。
在一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子包括1个、2个、3个、4个、5个或所有6个得自抗体的CDR，其中所述的抗体选自：BIIB71F10，BIIB69A09，BIIB67F10，BIIB67F11，BIIB66A12，BIIB66C01，BIIB65C10，BIIB65H09和BIIB65B03，如本文所述；或密切相关的CDR，例如一致的或者具有至少1个氨基酸改变、但不超过2个、3个或4个改变(例如取代(如保守性取代)、删除或插入)的CDR。可任选地，所述的抗体分子可以包括本文所述的任何CDR。
BIIB71F10的重链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：156所示的核苷酸序列所编码。BIIB71F10的轻链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列所编码。BIIB71F10的重链和轻链可变结构域包括ATCC专利保藏PTA-10355的氨基酸序列，或者由ATCC专利保藏PTA-10355的核苷酸序列所编码。
BIIB65H09的重链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列所编码。BIIB65H09的轻链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列所编码。BIIB65H09的重链和轻链可变结构域包括ATCC专利保藏PTA-10356的氨基酸序列，或者由ATCC专利保藏PTA-10356的核苷酸序列所编码。
BIIB67F11的重链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列所编码。BIIB67F11的轻链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列所编码。BIIB67F11的重链和轻链可变结构域包括ATCC专利保藏PTA-10357的氨基酸序列，或者由ATCC专利保藏PTA-10357的核苷酸序列所编码。
BIIB65C10的重链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列所编码。BIIB65C10的轻链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：38所示的核苷酸序列所编码。BIIB65C10的重链和轻链可变结构域包括ATCC专利保藏PTA-10358的氨基酸序列，或者由ATCC专利保藏PTA-10358的核苷酸序列所编码。
BIIB65B03的重链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：44所示的核苷酸序列所编码。BIIB65B03的轻链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：46所示的核苷酸序列所编码。
BIIB66A12的重链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列所编码。BIIB66A12的轻链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列所编码。
BIIB66C01的重链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：32所示的核苷酸序列所编码。BIIB66C01的轻链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：34所示的核苷酸序列所编码。
BIIB67F10的重链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列所编码。BIIB67F10的轻链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列所编码。
BIIB69A09的重链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列所编码。BIIB69A09的轻链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列所编码。
在另一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子包括得自抗体的重链可变区的至少1个、2个或3个Chothia超变环，其中所述的抗体如本文所述选自：例如BIIB71F10，BIIB69A09，BIIB67F10，BIIB67F11，BIIB66A12，BIIB66C01，BIIB65C10，BIIB65H09，BIIB65B03，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358。在另一个实施方案中，所述的抗体或其片段包括得自抗体的轻链可变区的至少1个、2个或3个超变环，其中所述的抗体如本文所述选自：例如BIIB71F10，BIIB69A09，BIIB67F10，BIIB67F11，BIIB66A12，BIIB66C01，BIIB65C10，BIIB65H09，BIIB65B03，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358。在另一个实施方案中，所述的抗体或其片段包括得自抗体的重链和轻链可变区的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个超变环，其中所述的抗体如本文所述选自：例如BIIB71F10，BIIB69A09，BIIB67F10，BIIB67F11，BIIB66A12，BIIB66C01，BIIB65C10，BIIB65H09，BIIB65B03，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358。
在另一个实例中，所述的抗HER2抗体分子包括具有与以下抗体的相应超变环相同的典型结构的至少1个、2个或3个超变环，其中所述的抗体如本文所述为：BIIB71F10，BIIB69A09，BIIB67F10，BIIB67F11，BIIB66A12，BIIB66C01，BIIB65C10，BIIB65H09，BIIB65B03，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357，PTA-10358，例如与以下抗体的重链和/或轻链可变结构域的至少环1和/或环2相同或相似的典型结构，其中所述的抗体如本文所述为：BIIB71F10，BIIB69A09，BIIB67F10，BIIB67F11，BIIB66A12，BIIB66C01，BIIB65C10，BIIB65H09，BIIB65B03，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358。
在一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链构架(例如单独的FR1，FR2，FR3，或者涵盖FR1，FR2和FR3但不包含CDR的序列)包括这样的氨基酸序列，该序列与以下抗体的重链构架具有至少80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高的一致性，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQID NO：11)，BIIB69A09(SEQ ID NO：15)，BIIB67F10(SEQ ID NO：19)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27)，BIIB66C01(SEQID NO：31)，BIIB65C10(SEQ ID NO：35)，BIIB65H09(SEQ ID NO：39)，BIIB65B03(SEQ ID NO：43)，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357，PTA-10358或如本文所述的重链。在一些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链构架具有与人V节段序列HV3-23(SEQ ID NO：107)基本同源的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的轻链构架(例如单独的FR1，FR2，FR3，或者涵盖FR1，FR2和FR3但不包含CDR的序列)包括这样的氨基酸序列，该序列与以下抗体的轻链构架具有至少85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高的一致性，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ IDNO：13)，BIIB69A09(SEQ ID NO：17)，BIIB67F10(SEQ ID NO：21)，BIIB67F11(SEQ ID NO：25)，BIIB66A12(SEQ ID NO：29)，BIIB66C01(SEQ ID NO：33)，BIIB65C10(SEQ ID NO：37)，BIIB65H09(SEQ ID NO：41)，BIIB65B03(SEQID NO：45)，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357，PTA-10358或上文所述的轻链构架。在一些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链构架具有与人VLκI子群种系序列(例如VLκ共有序列)基本同源的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链免疫球蛋白可变结构域包括或基本上由氨基酸序列构成，其中所述的氨基酸序列由在高度严谨的条件下与编码以下抗体的重链可变结构域的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列所编码，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ ID NO：12；SEQID NO：156)，BIIB69A09(SEQ ID NO：16)，BIIB67F 10(SEQ ID NO：20)，BIIB67F 11(SEQ ID NO：24)，BIIB66A12(SEQ ID NO：28)，BIIB66C01(SEQID NO：32)，BIIB65C10(SEQ ID NO：36)，BIIB65H09(SEQ ID NO：40)，BIIB65B03(SEQ  ID  NO：44)，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358；或者包括与以下抗体的重链可变结构域的氨基酸序列具有至少85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高的一致性的氨基酸序列，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ ID NO：11)，BIIB69A09(SEQ ID NO：15)，BIIB67F10(SEQ ID NO：19)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27)，BIIB66C01(SEQ ID NO：31)，BIIB65C10(SEQ ID NO：35)，BIIB65H09(SEQID NO：39)，BIIB65B03(SEQ ID NO：43)，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358。
在某些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的轻链免疫球蛋白可变结构域包括或基本上由氨基酸序列构成，其中所述的氨基酸序列由在高度严谨的条件下与编码以下抗体的轻链可变结构域的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列所编码，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ ID NO：14)，BIIB69A09(SEQ ID NO：18)，BIIB67F10(SEQ ID NO：22)，BIIB67F11(SEQ IDNO：26)，BIIB66A12(SEQ ID NO：30)，BIIB66C01(SEQ ID NO：34)，BIIB65C10(SEQ ID NO：38)，BIIB65H09(SEQ ID NO：42)，BIIB65B03(SEQ ID NO：46)，PTA-10355，PTA-10356，PTA-1035或PTA-10358；或者包括与以下抗体的轻链可变结构域具有至少80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高的一致性的氨基酸序列，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ ID NO：13)，BIIB69A09(SEQ ID NO：17)，BIIB67F10(SEQ ID NO：21)，BIIB67F11(SEQ IDNO：25)，BIIB66A12(SEQ ID NO：29)，BIIB66C01(SEQ ID NO：33)，BIIB65C10(SEQ ID NO：37)，BIIB65H09(SEQ ID NO：41)，BIIB65B03(SEQ ID NO：45)，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358。
在一些实施方案中，本文所述的LIGHT靶向分子和/或抗体分子与试剂缀合，其中所述的试剂选自：细胞毒性试剂，治疗试剂，细胞生长抑制剂，生物毒素，药物前体，肽，蛋白质，酶，病毒，脂质，生物反应调节剂，药物试剂，淋巴因子，异源抗体或其片段，可检测标记物，聚乙二醇(PEG)，以及任何所述试剂的两种或多种的组合。在另一个实施方案中，所述的细胞毒性试剂选自：放射性核，生物毒素，酶活性毒素，细胞生长抑制或细胞毒性的治疗试剂，药物前体，免疫活性配体，生物反应调节剂或任何所述的细胞毒性试剂的两种或多种的组合。
在另一个方面中，本发明特写了核酸分子(例如经分离的或纯化的核酸)，该核酸分子包括或基本上由编码本文所述的LIGHT靶向分子和/或所述的抗HER2抗体分子的核苷酸序列构成。在某些实施方案中，核酸包括或者基本上由编码LIGHT部分的核苷酸序列(例如编码LIGHT蛋白质或其功能片段或变体的核苷酸序列)以及编码功能连接的(例如通过基因融合、非共价结合等)靶向部分的核苷酸序列构成。
本发明的示例性核酸分子包括或基本上由编码LIGHT部分的LIGHT蛋白质的核苷酸序列构成，其中所述的蛋白质包括或基本上由氨基酸序列构成，所述的氨基酸序列得自：人LIGHT同种型1的大约氨基酸93至240(与SEQ ID NO：1所示的人LIGHT细胞外结构域的部分相应)；具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约氨基酸253至400(pBIIB71F10-130)(与SEQ ID NO：2所示的与抗HER2抗体分子融合的LIGHT细胞外结构域的部分相应)；具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约氨基酸258至405(pBIIB71F10-131)(与SEQ ID NO：3所示的与抗HER2抗体分子融合的LIGHT细胞外结构域的部分相应)；具有(G4S)4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约氨基酸245至392(pBIIB71F10-132)(与SEQID NO：4所示的与抗HER2抗体分子融合的LIGHT细胞外结构域的部分相应)；与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。在其他实施方案中，所述的核酸包括或基本上由核苷酸序列构成，其中所述的核苷酸序列选自：人LIGHT同种型1的大约核苷酸277至720(与SEQ ID NO：5所示的人LIGHT细胞外结构域的部分相应)；具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约核苷酸757至1200(pBIIB71F10-130)(与SEQ ID NO：6所示的与抗HER2抗体分子融合的LIGHT细胞外结构域的部分相应)；具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约核苷酸772至1215(pBIIB71F10-131)(与SEQ ID NO：7所示的与抗HER2抗体分子融合的LIGHT细胞外结构域的部分相应)；具有(G4S)4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约核苷酸733至1176(pBIIB71F10-132)(与SEQ ID NO：8所示的与抗HER2抗体分子融合的LIGHT细胞外结构域的部分相应)；与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。所述的LIGHT部分可以可任选地包括或基本上由一种或多种氨基酸残基(例如至少10至35、15至30或者大约20至26个氨基酸残基)构成，其中所述的氨基酸残基得自LIGHT的细胞外结构域或其突变形式，例如得自人LIGHT同种型1的大约氨基酸61至92(SEQ ID NO：1)；具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约氨基酸225至252(pBIIB71F10-130)(SEQ ID NO：2)；具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约氨基酸230至257(pBIIB71F10-131)(SEQ ID NO：3)；或与其基本一致的氨基酸序列；或者由核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述的核苷酸序列得自：人LIGHT同种型1的大约核苷酸181至276(SEQ ID NO：5)，具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约核苷酸673至756(pBIIB71F10-130)(SEQ IDNO：6)，具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约核苷酸688至771(pBIIB71F10-131)(SEQ ID NO：7)，或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。可以使用被改变从而使LIGHT的一种或多种性质得以增强的所述的LIGHT蛋白质的变体或其可溶片段。例如，所述的LIGHT蛋白质可以被修饰(例如通过删除、突变或插入蛋白水解位点)，从而具有一种或多种失活的蛋白水解位点。在一个实施方案中，除去包含在人LIGHT序列(人LIGHT同种型1，SEQ IDNO：1)的位置82至83处的蛋白水解位点的氨基酸EQLI(SEQ ID NO：9)，或者得自小鼠LIGHT序列的位置79-82的氨基酸EKLI(SEQ ID NO：10)。在其他实施方案中，所述的LIGHT蛋白质得自非人起源的，例如可以使用鼠科LIGHT。全长小鼠LIGHT的氨基酸和相应的核苷酸序列分别示于SEQ IDNO：113和114中。
例如，所述的LIGHT分子可以使用或不使用连接基团(例如肽连接基团)，与所述的靶向分子作为基因或多肽融合物而融合。
编码所述的LIGHT分子的核苷酸序列可以使用或不使用编码连接基团的核苷酸序列，与编码所述的靶向部分的核苷酸序列作为基因融合物而形成基因融合。在其他实施方案中，编码所述的LIGHT分子和所述的靶向分子的核苷酸序列可以是单独表达的，并通过反应性基团(可任选地通过生物相容性聚合物(例如本文所述))而彼此共价连接。编码所述的连接基团的核酸可以在以下的构造中包括至少5个、10个、15个或20个甘氨酸和丝氨酸残基，其中所述的构造为1个、2个、3个、4个、5个或更多个重复的(Gly)4-Ser(SEQ ID NO：145)，例如4个重复的(Gly)4-Ser(SEQ ID NO：134)。在其他实施方案中，连接基团可以包括一种或多种氨基酸残基(例如至少10至35、15至30或者大约20至26个氨基酸残基)，该残基得自LIGHT的细胞外结构域或其突变形式，例如得自人LIGTH同种型1的大约氨基酸61至92(SEQID NO：1)；具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约氨基酸225至252(pBIIB71F10-130)(SEQ ID NO：2)；具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约氨基酸230至257(pBIIB71F10-131)(SEQ IDNO：3)；或与其基本一致的氨基酸序列；或者由核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述的核苷酸序列得自：人LIGHT同种型1的大约核苷酸181至276(SEQ ID NO：5)，具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约核苷酸673至756(pBIIB71F10-130)(SEQ ID NO：6)，具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约核苷酸688至771(pBIIB71F10-131)(SEQ ID NO：7)，或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。备选地，所述核酸编码的连接基团可以包括一种或多种(Gly)4-Ser(SEQ ID NO：146)重复序列与一种或多种氨基酸残基(例如至少10至35、15至30或者大约20至26个氨基酸残基)的组合，其中所述的氨基酸残基得自LIGHT的细胞外结构域或其突变形式，例如得自：例如得自人LIGTH同种型1的大约氨基酸61至92(SEQ ID NO：1)；具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约氨基酸225至252(pBIIB71F10-130)(SEQ ID NO：2)；具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约氨基酸230至257(pBIIB71F10-131)(SEQ IDNO：3)；或与其基本一致的氨基酸序列；或者由核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述的核苷酸序列得自：人LIGHT同种型1的大约核苷酸181至276(SEQ ID NO：5)，具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约核苷酸673至756(pBIIB71F10-130)(SEQ ID NO：6)，具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约核苷酸688至771(pBIIB71F10-131)(SEQ ID NO：7)，或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。
在一个示例性实施方案中，所述的核酸分子编码了LIGHT靶向分子，该分子包括或基本上由哺乳动物(例如人)LIGHT蛋白质的至少1个融合分子或其功能变体或片段、及与HER2结合的抗体分子构成(本文中称为“LIGHT-抗HER2融合物”)。在一个实施方案中，所述的编码LIGHT-抗HER2融合物的核酸包括或基本上由至少1个哺乳动物(例如人)LIGHT蛋白质或其变体或片段(例如本文所述的LIGHT蛋白质)、及抗HER2特异性抗体分子或其片段构成(例如本文所述的抗体分子)。
在一些实施方案中，编码所述的抗HER2抗体分子的核酸为抗体分子或得自抗体的Fab片段，其中所述的抗体如本文所述选自：BIIB71F10(SEQ IDNO：11-14)，BIIB69A09(SEQ ID NO：15-18)，BIIB67F10(SEQ ID NO：19-22)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23-26)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27-30)，BIIB66C01(SEQ ID NO：31-34)，BIIB65C10(SEQ ID NO：35-38)，BIIB65H09(SEQ IDNO：39-42)，BIIB65B03(SEQ ID NO：43-46)，或者PTA-10355、PTA-10356、PTA-10357或PTA-10358的核酸。在其他实施方案中，编码所述的抗HER2抗体分子的核酸具有与抗体分子或得自抗体的Fab片段相当的功能活性，其中所述的抗体如本文所述选自：BIIB71F10(SEQ ID NO：11-14)，BIIB69A09(SEQ ID NO：15-18)，BIIB67F10(SEQ ID NO：19-22)，BIIB67F11(SEQ IDNO：23-26)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27-30)，BIIB66C01(SEQ ID NO：31-34)，BIIB65C10(SEQ ID NO：35-38)，BIIB65H09(SEQ ID NO：39-42)，BIIB65B03(SEQ ID NO：43-46)，或者PTA-10355、PTA-10356、PTA-10357或PTA-10358的核酸。
在一个实施方案中，编码所述融合物的抗体分子、或所述的抗HER2抗体分子的核酸包括得自抗体的至少1个、2个、3个、4个、5个或所有6个CDR，其中所述的抗体选自：BIIB71F10(SEQ ID NO：11-14)，BIIB69A09(SEQID NO：15-18)，BIIB67F10(SEQ ID NO：19-22)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23-26)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27-30)，BIIB66C01(SEQ ID NO：31-34)，BIIB65C10(SEQ ID NO：35-38)，BIIB65H09(SEQ ID NO：39-42)，BIIB65B03(SEQ IDNO：43-46)，或者PTA-10355、PTA-10356、PTA-10357或PTA-10358的核酸；或者密切相关的CDR，例如一致的或者具有至少1个氨基酸改变、但不超过2个、3个或4个改变(例如取代(如保守性取代)、删除或插入)的CDR。可任选地，所述的核酸编码了可以包括本文所述的任何CDR的抗体分子。在一些实施方案中，核酸编码了重链免疫球蛋白可变结构域，该重链免疫球蛋白可变结构域包括重链CDR1、CDR2和/或CDR3；或者具有不同于单克隆抗体的重链CDR1，CDR2和/或CDR3的少于3个氨基酸取代(例如保守性取代)的CDR，其中所述的单克隆抗体如本文所述选自：BIIB71F10(SEQID NO：47(CDR1)，SEQ ID NO：48(CDR2)和/或SEQ ID NO：49(CDR3))；BIIB69A09(SEQ ID NO：50(CDR1)，SEQ ID NO：51(CDR2)和/或SEQ IDNO：52(CDR3))；BIIB67F10(SEQ ID NO：53(CDR1)，SEQ ID NO：54(CDR2)和/或SEQ ID NO：55(CDR3))；BIIB67F11(SEQ ID NO：56(CDR1)，SEQ IDNO：57(CDR2)和/或SEQ ID NO：58(CDR3))；BIIB66A12(SEQ ID NO：59(CDR1)，SEQ ID NO：60(CDR2)和/或SEQ ID NO：61(CDR3))；BIIB66C01(SEQ ID NO：62(CDR1)，SEQ ID NO：63(CDR2)和/或SEQ ID NO：64(CDR3))；BIIB65C10(SEQ ID NO：65(CDR1)，SEQ ID NO：66(CDR2)和/或SEQ ID NO：67(CDR3))；BIIB65H09(SEQ ID NO：68(CDR1)，SEQ ID NO：69(CDR2)和/或SEQ ID NO：70(CDR3))；BIIB65B03(SEQ ID NO：71(CDR1)，SEQ ID NO：72(CDR2)和/或SEQ ID NO：73(CDR3))；或者PTA-10355、PTA-10356、PTA-10357或PTA-10358的CDR。在其他实施方案中，编码了轻链免疫球蛋白可变结构域的核酸包括轻链CDR1、CDR2和/或CDR3；或者具有不同于单克隆抗体的轻链CDR1，CDR2和/或CDR3的少于3个氨基酸取代(例如保守性取代)的CDR，其中所述的单克隆抗体如本文所述选自：BIIB71F10(SEQ ID NO：74(CDR1)，SEQ ID NO：75(CDR2)和/或SEQ IDNO：76(CDR3))；BIIB69A09(SEQ ID NO：77(CDR1)，SEQ ID NO：78(CDR2)和/或SEQ ID NO：79(CDR3))；BIIB67F10(SEQ ID NO：80(CDR1)，SEQ IDNO：81(CDR2)和/或SEQ ID NO：82(CDR3))；BIIB67F 11(SEQ ID NO：83(CDR1)，SEQ ID NO：84(CDR2)和/或SEQ ID NO：85(CDR3))；BIIB66A12(SEQ ID NO：86(CDR1)，SEQ ID NO：87(CDR2)和/或SEQ ID NO：88(CDR3))；BIIB66C01(SEQ ID NO：89(CDR1)，SEQ ID NO：90(CDR2)和/或SEQ ID NO：91(CDR3))；BIIB65C10(SEQ ID NO：92(CDR1)，SEQ ID NO：93(CDR2)和/或SEQ ID NO：94(CDR3))；BIIB65H09(SEQ ID NO：95(CDR1)，SEQ ID NO：96(CDR2)和/或SEQ ID NO：97(CDR3))；BIIB65B03(SEQ IDNO：98(CDR1)，SEQ ID NO：99(CDR2)和/或SEQ ID NO：100(CDR3))；或者PTA-10355、PTA-10356、PTA-10357或PTA-10358的CDR。编码了BIIB71F10，BIIB69A09，BIIB67F10，BIIB67F11，BIIB66A12，BIIB66C01，BIIB65C10，BIIB65H09或BIIB65B03抗体分子的重链和轻链可变结构域的核苷酸序列如本文所述。
在另一个实施方案中，所述的核酸分子编码了所述融合物的抗体分子、或者所述的抗HER2抗体分子，其中所述的分子包括得自抗体重链可变区的至少1个、2个或3个Chothia超变环，其中所述的抗体如本文所述选自：例如BIIB71F10(SEQ ID NO：11-12)，BIIB69A09(SEQ ID NO：15-16)，BIIB67F10(SEQ ID NO：19-20)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23-24)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27-28)，BIIB66C01(SEQ ID NO：31-32)，BIIB65C10(SEQ IDNO：34-35)，BIIB65H09(SEQ ID NO：39-40)，BIIB65B03(SEQ ID NO：43-44)，或者PTA-10355、PTA-10356、PTA-10357或PTA-10358的核酸。在另一个实施方案中，所述的核酸分子编码了所述融合物的抗体分子、或者所述的抗HER2抗体分子，其中所述的分子包括得自抗体轻链可变区的至少1个、2个或3个超变环，其中所述的抗体如本文所述选自：例如BIIB71F10(SEQ IDNO：13-14)，BIIB69A09(SEQ ID NO：17-18)，BIIB67F10(SEQ ID NO：21-22)，BIIB67F11(SEQ ID NO：25-26)，BIIB66A12(SEQ ID NO：29-30)，BIIB66C01(SEQ ID NO：33-34)，BIIB65C10(SEQ ID NO：37-38)，BIIB65H09(SEQ IDNO：41-42)，BIIB65B03(SEQ ID NO：45-46)，或者PTA-10355、PTA-10356、PTA-10357或PTA-10358的核酸。在另一个实施方案中，所述的核酸分子编码了所述融合物的抗体分子、或者所述的抗HER2抗体分子，其中所述的分子包括得自抗体的重链和轻链可变区的至少1个、2个、3个、4个、5个或6个超变环，其中所述的抗体如本文所述选自：例如BIIB71F10(SEQ IDNO：11-14)，BIIB69A09(SEQ ID NO：15-18)，BIIB67F10(SEQ ID NO：19-22)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23-26)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27-30)，BIIB66C01(SEQ ID NO：31-34)，BIIB65C10(SEQ ID NO：35-38)，BIIB65H09(SEQ IDNO：39-42)，BIIB65B03(SEQ ID NO：43-46)，或者PTA-10355、PTA-10356、PTA-10357或PTA-10358的核酸。
在一个实施方案中，所述的核酸分子编码了所述融合物的抗体分子、或者所述的抗HER2抗体分子，所述的分子包括得自BIIB71F10(SEQ IDNO：11-14)，BIIB69A09(SEQ ID NO：15-18)，BIIB67F10(SEQ ID NO：19-22)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23-26)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27-30)，BIIB66C01(SEQ ID NO：31-34)，BIIB65C10(SEQ ID NO：35-38)，BIIB65H09(SEQ IDNO：39-42)，BIIB65B03(SEQ ID NO：43-46)，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358的所有6个超变环；或者密切相关的超变环，例如与本文所公开的序列一致的，或与本文所公开的序列具有至少1个氨基酸改变、但不超过2个、3个或4个改变的超变环。可任选地，所述的核酸可以编码包括本文所述的任何超变环的蛋白质。
在另一个实例中，所述的核酸分子编码了所述融合物的抗体分子、或者所述的抗HER2抗体分子，所述的分子包括具有与以下抗体的相应超变环相同的典型结构的至少1个、2个或3个超变环，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ ID NO：11-14)，BIIB69A09(SEQ ID NO：15-18)，BIIB67F10(SEQ IDNO：19-22)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23-26)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27-30)，BIIB66C01(SEQ ID NO：31-34)，BIIB65C10(SEQ ID NO：35-38)，BIIB65H09(SEQ ID NO：39-42)，BIIB65B03(SEQ ID NO：43-46)，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358，例如与以下抗体的重链和/或轻链可变结构域的至少环1和/或环2相同或相似的典型结构，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ ID NO：11-14)，BIIB69A09(SEQ ID NO：15-18)，BIIB67F10(SEQ IDNO：19-22)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23-26)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27-30)，BIIB66C01(SEQ ID NO：31-34)，BIIB65C10(SEQ ID NO：35-38)，BIIB65H09(SEQ ID NO：39-42)，BIIB65B03(SEQ ID NO：43-46)，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358。
在一个实施方案中，所述的核酸分子编码了所述融合物的抗体分子、或者所述的抗HER2抗体分子，所述的分子包括具有氨基酸序列的重链构架(例如单独的FR1，FR2，FR3，或者涵盖FR1，FR2和FR3但不包含CDR的序列)，该序列与以下抗体的重链构架具有至少85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高的一致性，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ ID NO：11)，BIIB69A09(SEQ ID NO：15)，BIIB67F10(SEQ ID NO：19)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27)，BIIB66C01(SEQ ID NO：31)，BIIB65C10(SEQID NO：35)，BIIB65H09(SEQ ID NO：39)，BIIB65B03(SEQ ID NO：43)，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358。在一些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链构架具有与人V节段序列HV3-23基本同源的氨基酸序列(SEQ ID NO：107)。
在另一个实施方案中，所述的核酸分子编码了所述抗体分子的轻链构架(例如单独的FR1，FR2，FR3，或者涵盖FR1，FR2和FR3但不包含CDR的序列)，所述分子包括或基本上由与以下抗体的轻链构架具有至少85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高的一致性的氨基酸构成，其中所述的抗体为：BIIB71F 10(SEQ ID NO：13)，BIIB69A09(SEQ ID NO：17)，BIIB67F 10(SEQ IDNO：21)，BIIB67F11(SEQ ID NO：25)，BIIB66A12(SEQ ID NO：29)，BIIB66C01(SEQ ID NO：33)，BIIB65C10(SEQ ID NO：37)，BIIB65H09(SEQ ID NO：41)，BIIB65B03(SEQ ID NO：45)，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358。在一些实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的重链构架具有与人VLκI子群种系序列(例如VLκ共有序列)基本同源的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述的核酸分子编码了所述融合物的抗体分子、或者所述的抗HER2抗体分子，所述的分子包括或基本上由核苷酸序列构成，其中所述的核苷酸序列由在高度严谨的条件下与编码以下抗体的重链可变结构域的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：156)，BIIB69A09(SEQ ID NO：16)，BIIB67F10(SEQ ID NO：20)，BIIB67F11(SEQ ID NO：24)，BIIB66A12(SEQ IDNO：28)，BIIB66C01(SEQ ID NO：32)，BIIB65C10(SEQ ID NO：36)，BIIB65H09(SEQ ID NO：40)，BIIB65B03(SEQ ID NO：44)，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358；或者包括与以下抗体的重链可变结构域的氨基酸序列具有至少85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高的一致性的氨基酸序列，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ ID NO：11)，BIIB69A09(SEQ IDNO：15)，BIIB67F10(SEQ ID NO：19)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27)，BIIB66C01(SEQ ID NO：31)，BIIB65C10(SEQ ID NO：35)，BIIB65H09(SEQ ID NO：39)，BIIB65B03(SEQ ID NO：43)，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358。
在其他实施方案中，所述的核酸分子编码了所述融合物的抗体分子、或者所述的抗HER2抗体分子，所述的分子包括或基本上由核苷酸序列构成，其中所述的核苷酸序列由在高度严谨的条件下与编码以下抗体的轻链可变结构域的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ ID NO：14)，BIIB69A09(SEQ ID NO：18)，BIIB67F10(SEQID NO：22)，BIIB67F11(SEQ ID NO：26)，BIIB66A12(SEQ ID NO：30)，BIIB66C01(SEQ ID NO：34)，BIIB65C10(SEQ ID NO：38)，BIIB65H09(SEQID NO：42)，BIIB65B03(SEQ ID NO：46)，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358；或者包括与以下抗体的轻链可变结构域具有至少80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高的一致性的氨基酸序列，其中所述的抗体为：BIIB71F10(SEQ ID NO：13)，BIIB69A09(SEQ ID NO：17)，BIIB67F10(SEQ ID NO：21)，BIIB67F11(SEQ ID NO：25)，BIIB66A12(SEQ ID NO：29)，BIIB66C01(SEQ ID NO：33)，BIIB65C10(SEQ ID NO：37)，BIIB65H09(SEQID NO：41)，BIIB65B03(SEQ ID NO：45)，PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358。
示例性的核酸分子编码了包括或基本上由氨基酸序列构成的LIGHT/HER2融合物，其中所述的氨基酸序列如以下序列中的任意一者所示：具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-130)(SEQID NO：2)；具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-131)(SEQ ID NO：3)；具有(G4S)4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-132)(SEQ ID NO：4)；或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；由以下核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述的核苷酸序列如以下序列中的任意一者所示：具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-130)(SEQID NO：6)；具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-131)(SEQ ID NO：7)；具有(G4S)4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-132)(SEQ ID NO：8)；或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。在某些实施方案中，编码所述的LIGHT/HER2融合物的还可以包括或基本上由第二条链(与之前所述的链融合或结合)构成，其中所述的第二条链包括或基本上由以下所示的氨基酸序列构成：人LIGHT同种型1(SEQ ID NO：1)，或者与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。在一些实施方案中，所述的核酸分子包括或基本上由以下任何一者所示的的核苷酸序列构成：人LIGHT同种型1(SEQ ID NO：5)；或者与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。
在另一个示例性实施方案中，所述的核酸分子编码了LIGHT靶向分子，该分子包括了哺乳动物(例如人)LIGHT蛋白质或其功能变体或片段、及与CD23结合的抗体分子构成的至少一个融合分子(本文中称为“LIGHT-抗CD23融合物”)。在一个实施方案中，编码所述的LIGHT-抗CD23融合物的核酸分子包括或基本上由以下任何一者所示的氨基酸序列构成：具有(G4S)3或(G4S)4连接体的抗CD23Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB CD23-204)(分别为SEQ ID NO：101或174)，或者与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。在一些实施方案中，所述的核酸分子包括或基本上由以下任何一者所示的核苷酸序列构成：具有(G4S)3或(G4S)4连接体的CD23Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB CD23-204)(分别为SEQ ID NO：102或173)，或者与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。在某些实施方案中，编码所述的LIGHT/CD23融合物的核酸分子还可以包括或基本上由第二条链(与之前所述的链融合或结合)构成，其中所述的第二条链包括或基本上由以下所示的氨基酸序列构成：抗CD23Fab-hLIGHT融合物轻链(SEQ ID NO：103)，或者与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。在一些实施方案中，所述的核酸分子包括或基本上由以下任何一者所示的的核苷酸序列构成：抗CD23Fab-hLIGHT融合物轻链(SEQ IDNO：104)，或者与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。
在另一个实施方案中，所述的核酸分子包括编码LIGHT靶向分子的核苷酸序列，其中所述的靶向分子包括哺乳动物(例如人)LIGHT蛋白质或其功能变体或片段、及与IGFR结合的抗体分子的至少一个融合分子。在一个实施方案中，所述的核酸分子编码了LIGHT-抗IGFR Fab融合物，该融合物包括或基本上由以下任何一者所示的氨基酸序列构成：具有(G4S)4连接体的抗IGFR Fab-hLIGHT融合物重链(BIIB C06-117)(SEQ ID NO：163)，或者与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；所述的核苷酸序列编码了具有(G4S)4连接体的抗IGFRFab-hLIGHT融合物重链(BIIB C06-117)(SEQ ID NO：162)，或者与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。在某些实施方案中，所述的核酸分子还可以包括编码第二条链(与之前所述的链融合或结合)的核苷酸序列，其中所述的第二条链包括或基本上由以下所示的氨基酸序列构成：SEQ ID NO：168，或者与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；编码了抗IGFRFab-hLIGHT融合物轻链的核苷酸序列(包括或由SEQ ID NO：167构成)，或者与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。
在另一个方面中，本发明提供了宿主细胞，该细胞包括编码本文所公开的一种或多种LIGHT靶向分子和/或抗HER2抗体分子的一种或多种核酸分子。
在其他实施方案中，本发明提供了包括本文所述的核酸分子的载体。在另一个实施方案中，所述的核酸分子与启动子是可操作地结合的。在另外的实施方案中，本发明提供了包括所述的载体的宿主细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了其中所述的多核苷酸与启动子可操作地结合的载体。
在另外的实施方案中，本发明提供用于生产本文所公开的LIGHT靶向分子和/或抗HER2抗体分子的方法或工艺。所述的方法包括：培养宿主细胞，该宿主细胞包含具有本文所述的核酸分子的载体；以及回收所述的LIGHT靶向分子和/或所述的抗HER2抗体分子。在另一个实施方案中，本发明提供了通过所述的方法生产的经分离的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供通过本文所述的核酸分子编码的经分离的多肽。
此外，还提供了组合物，例如药物组合物，该组合物包括所述的LIGHT靶向分子或所述的抗HER2抗体分子、以及可药用的载体。应该注意的是，所述的组合物(例如药物组合物)可以另外包括第二种治疗试剂，例如本文所述的第二种治疗试剂(例如抗赘生物试剂)。可以与本发明的分子组合物使用的示例性的抗赘生物试剂(例如细胞毒性试剂或细胞生长抑制剂)包括但不限于紫杉烷(例如紫衫萜，紫衫醇)，亚德里亚霉素，环磷酰胺，吉西他滨和长春瑞滨。
用于治疗过度增殖(例如本文所述的赘生、紊乱或状况)的包括所述的LIGHT靶向分子或所述的抗HER2抗体分子的包装药物组合物也被包含在本发明的范围内。可任选地，所述的包装药物组合物是经标记的和/或包含用于治疗过度增殖(例如本文所述的赘生、紊乱或状况)的一些说明书。
在一些实施方案中，本发明提供了包含经分离的LIGHT靶向分子、或者编码抗体重链可变区的核酸分子和/或编码经分离的轻链可变区的核酸分子的组合物，其中所述的编码重链的多核苷酸和编码轻链的多核苷酸分别包括编码与本文所公开的抗体的氨基酸序列一致的或者基本一致(例如至少85％，90％，95％一致)的氨基酸序列的核酸分子。
在其他实施方案中，所述的LIGHT靶向分子、抗体分子、组合物、编码所述LIGHT靶向分子或所述的抗体分子的一条链的核酸分子(例如重链或轻链可变区)进一步包括这样的核酸，该核酸编码了与编码所述的LIGHT靶向分子或所述的抗体分子的核酸分子融合的信号肽。
在一些实施方案中，所述的LIGHT靶向分子、抗体分子、组合物、编码所述LIGHT靶向分子或所述的抗体分子的一条链的核酸分子(例如重链或轻链可变区)进一步包括与VH或VL多肽融合的重链恒定区CH1结构域、进一步包括与VH多肽融合的重链恒定区CH2结构域、进一步包括与VH多肽融合的重链恒定区CH3结构域、或者进一步包括与VH多肽融合的重链铰链区。在另一个实施方案中，所述的重链恒定区为人IgG。在某些其他的实施方案中，所述的IgG1根据Kabat编号系统诱变。
在一些实施方案中，所述的LIGHT靶向分子、抗体分子、组合物、编码VL的多核苷酸进一步包括与VL多肽融合的轻链恒定区结构域。在另一个实施方案中，所述的轻链恒定区为人VLκ。
在一些实施方案中，所述的LIGHT靶向分子、抗体分子、组合物、VH和VL多肽的构架区为人的，不同之处在于具有5或更少的氨基酸取代。
在一些实施方案中，编码VH的多核苷酸包含在第一载体上，编码VL的多核苷酸包含在第二载体上。在另一个实施方案中，编码VH的多核苷酸与第一启动子可操作地结合，编码VL的多核苷酸与第二启动子可操作地结合。在某些其他的实施方案中，所述的第一和第二启动子为相同启动子的拷贝。在另一个实施方案中，所述的第一和第二启动子并非是一致的。
在上文所述的组合物的多个实施方案中，所述的第一载体与所述的第二载体包含在单一的宿主细胞中，或者包含在分开的宿主细胞中。
在另一个方面中，本发明特写了选择性地传递LIGHT靶向分子(例如本文所述的LIGHT蛋白质、其变体或片段)至过度增殖的细胞或组织(例如本文所述的赘生细胞或组织)、由此杀死、消融或选择性地降低过度增殖的细胞或组织的活性的方法。所述的方法包括使过度增殖的细胞与LIGHT靶向分子(例如本文所述的分子)相接触。该接触步骤可以在一种或多种具有LIGHT受体(例如本文所述的LIGHT受体)的免疫细胞的存在下进行。所述的方法可以在体外(例如在培养细胞中)或者以间接体内疗法(例如在受试对象(例如患有本文所述的过度增殖紊乱或状况的受试对象或者本文所述的动物模型(例如携带乳腺肿瘤细胞的小鼠肿瘤模型、或者HER2依赖性结肠直肠和胃部的异种移植物肿瘤模型)中)中作为治疗或预防方案的一部分)实施。
在另一个方面中，本发明特写了治疗或预防(例如治愈、抑制、缓解、延迟或预防过度增殖的发作或预防过度增殖的复发或再度恶化的发作)过度增殖(例如癌症、状况和/或紊乱)的方法。所述的方法包括向受试对象(例如需要治疗的受试对象)给药本文所述的LIGHT靶向分子或抗HER2抗体分子。
在某些实施方案中，所述的方法预防、减轻或缓解了肿瘤或转移的复发或再度恶化。所述的方法包括向受试对象(例如对于标准的治疗(例如化疗、基于抗体的治疗和/或手术)模式而言是部分或完全难以治愈的患者)给药本文所述的LIGHT靶向分子或抗HER2抗体分子。例如，所述的患者患有表达HER2的癌症(例如乳腺癌、胃部的癌症或肺癌)，并且已经在手术、化疗和/或抗体疗法(例如曲妥单抗疗法)之后证明了疾病的进程。在其他实施方案中，所述的患者为已经在手术、化疗和/或抗体疗法(例如VEGF或EGFR抗体疗法)之后证明了疾病的进程的结肠癌患者。在某些实施方案中，将所述的LIGHT靶向分子或抗HER2抗体分子给予已经使用另一种治疗模式治疗了大约10天、1至6个月、6至1年、1至2年等的患者。在某些实施方案中，所述的受试对象对一线疗法发展出了部分或完全的抗性。
与本文所述的体外或体内方法有关的某些实施方案如下：
在另一个实施方案中，所述的过度增殖紊乱或状况选自癌症、赘生物、肿瘤、恶性病或其转移、或复发的恶性病(例如对一线疗法是部分或完全难以治愈的受试对象)中的一种或多种。
就体内方法而言，可以将所述的LIGHT靶向分子或抗HER2抗体分子单独、或者与另一种试剂(例如本文所述的化疗试剂)组合以足以激发患有多度增殖状况和/或紊乱的受试对象(例如哺乳动物)中至少一种LIGHT相关的生物学活性的量给予该受试对象。
在一些实施方案中，例如可以在给予受试对象之前，通过在体外或间接体内疗法来测定降低或抑制一种或多种本文所述的多度增殖活性、紊乱或状况所需的LIGHT靶向分子或抗HER2抗体分子的量，来确定所给予的LIGHT靶向分子或抗HER2抗体分子的量或剂量。所述的体内方法可以可任选地包括鉴定(例如评估、诊断、筛选和/或选择)处于患有一种或多种与所述的紊乱或状况有关的症状的风险中的或者患有一种或多种与所述的紊乱或状况有关的症状的受试对象。
在多种实施方案中，所述的LIGHT靶向分子或所述的抗体分子的靶向部分特异性地与过度增殖(例如赘生的)细胞或组织的表面上表达的细胞表面蛋白质结合。所述的靶向部分可以与一种或多种靶向分子(例如在本文所述的一种或多种过度增殖细胞或组织上表达的可溶性或细胞表面蛋白质)结合。例如，所述的靶向部分可以与生长因子受体(例如HER-2/neu，HER3，HER4，表皮生长因子受体(EGFR)，胰岛素生长因子受体(IGFR)，Met，Ron，Cripto)、癌症相关的整合素和整合素受体(例如αvβ6，α6β4，层粘连蛋白受体(LAMR)和/或其他抗原，如CD23，CD20，CD16，EpCAM，Tweak受体(FN14)，PSMA和/或VEGF等)中的一种或多种结合。被所述的靶向部分所识别的靶向分子的其他实例如本文所述。
在另一个实施方案中，所述的LIGHT靶向分子或所述的抗体分子与所述的过度增殖(例如赘生的)的细胞或组织的结合可以得到以下结果中的一种或多种：(i)与一种或多种LIGHT受体(例如淋巴毒素β受体(LTβR)，疱疹病毒侵入介质(HVEM)和/或抗诱捕受体3(DcR3))结合；(ii)诱导趋化因子或细胞因子(例如CXCL10(IP-10)，CCL21，CXCL9，IL-5，IL-8或TNF)、趋化因子或细胞因子受体(例如IL-10RA)、粘附分子和/或共刺激分子中的一种或多种的表达；(iii)活化T细胞，例如淋巴细胞(例如细胞毒素T淋巴细胞)、表达CD4或CD8的T细胞和/或调节T细胞；(iv)募集T细胞进入到过度增殖(例如肿瘤)的位点或细胞；(v)活化和/或增强肿瘤反应性T细胞的增殖；(vi)例如，在过度增殖(例如肿瘤细胞或组织)下，创建类淋巴微环境；(vii)诱导过度增殖(例如肿瘤)细胞或组织的凋亡；和/或(viii)刺激受试对象中的免疫应答，例如刺激受试对象对抗过度增殖(例如肿瘤或癌症)的细胞或组织的免疫系统。
在其中所述的LIGHT靶向分子或所述的抗体分子与HER2结合的实施方案中，所述的LIGHT靶向分子或所述的抗体分子与所述的过度增殖(例如赘生的)细胞或组织的结合得到以下结果中的一种或多种：(i)以一定的亲和性与HER2结合，其中所述的大致亲和性可表征为解离常数(Kd)至少为1x10-7M，1x10-8M，1x10-9M，1x10-10M，1x10-11M，1x10-12M，1x10-13M；(ii)基本上选择性地结合HER2，而与其他HER家族成员不具有明显的交叉反应；(iii)与HER2上的线性或构造抗原决定部位结合，其中所述的抗原决定部位选自D1抗原决定部位(与图4中所示的人HER2的大约氨基酸1至196相应)；D2抗原决定部位(与图4中所示的人HER2的大约氨基酸197至318相应)；D3抗原决定部位(与图4中所示的人HER2的大约氨基酸319至508相应)；或D4的抗原决定部位(与图4中所示的人HER2的大约氨基酸508至630相应)；或它们的组合；(iv)抑制、阻断或减少HER2的信号传递(例如抑制、阻断或减少HER2、AKT和/或MAP激酶中的一种或多种的磷酸化；或抑制、阻断或减少HER2的同源二聚化，或者HER2与HER3、和/或HER2与EGFR的异源二聚化)；(v)在体外(例如MCF7和SKBR-3细胞)和体内(例如在动物模型(例如带有乳腺肿瘤细胞的小鼠肿瘤模型、或HER2依赖性的结肠直肠和胃部的异种移植物肿瘤模型))、或人受试对象中抑制表达HER2的细胞的活性和/或诱导细胞的杀死；(vi)引发体内的抗肿瘤免疫应答；和/或(vii)例如在持久的单一疗法或结合疗法之后，或者在另一次化学疗法(例如标准的化疗或抗HER2抗体的疗法)之后检测到肿瘤复发之后，诱导持久的减缓肿瘤的生长和转移。
在上文所述方法的多个实施方案中，所述的LIGHT靶向分子或所述的抗体分子抑制了肿瘤细胞的迁移。在另一个实施方案中，所述的肿瘤细胞的增殖通过预防或延迟肿瘤扩散至邻近的组织来进行抑制。
在多个实施方案中，所述的过度增殖疾病或紊乱为定位于以下器官中的赘生物：前列腺、结肠、腹部、骨、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、肾上腺、副甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺、眼睛、头、颈部、中枢神经系统、外周神经系统、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸部或泌尿生殖道。
可以使用所述的靶向部分来靶向示例性的过度增殖(例如癌症或赘生的)细胞或组织，包括但不限于乳腺、肺、胃部、卵巢、胰腺、结肠、结肠直肠、肾、膀胱、肝脏、头、颈部脑以及软组织恶性(例如淋巴恶性病、白血病和骨髓瘤)的癌症或实体肿瘤。可以治疗的其他紊乱包括但不限于鳞状上皮细胞癌，黑素瘤，脑癌，宫颈癌，肾癌，睾丸癌和甲状腺癌。在一些实施方案中，所述的癌症为表达HER2的肿瘤或转移性癌症(例如乳腺、肺或胃部的表达HER2的癌症)。
在多种实施方案中，所述的受试对象为哺乳动物(例如动物模型或人)。在另一个实施方案中，所述的受试对象为人，例如患有本文所述的一种或多种癌症的患者。在一个实施方案中，所述的受试对象为经历标准模式的疗法(例如经历曲妥单抗的化疗和/或治疗的HER2阳性患者)的患者，并且所述的LIGHT靶向分子和/或抗HER2抗体分子作为二线疗法给予。在其他实施方案中，所述的患者为自然(
Figure BDA0000072591770000471
)患者，例如所述的LIGHT靶向分子和/或抗HER2抗体分子作为一线疗法给予。在其他实施方案中，所述的患者对于标准模式的疗法是部分或完全难以治愈的。例如，所述的患者为已经在化疗和/或曲妥单抗疗法之后证明疾病进程的乳腺癌患者。
在其他实施方案中，所述的LIGHT靶向分子的靶向部分或所述的抗体分子作为一线疗法单独给予或者与第二试剂组合给予自然的受试对象，例如患有表达HER2的乳腺癌的自然患者。在其他实施方案中，所述的LIGHT靶向分子的靶向部分或所述的抗体分子作为作为二线疗法单独给予或者与第二试剂组合给予。在其他实施方案中，所述的LIGHT靶向分子的靶向部分或所述的抗体分子给予对于标准模式的疗法是部分或完全难以治愈的患者。例如，所述的患者为已经在化疗和/或曲妥单抗疗法之后证明疾病进程的乳腺癌患者。
在另一个方面中，本发明特写了使用LIGHT靶向分子和/或抗HER2抗体分子(例如本文所述的结合剂)来检测和/或诊断过度增殖紊乱或状况的方法。所述的方法包括：检测样品(例如纯化样品或在体内)中蛋白质靶物(例如HER2)的存在情况。所述的方法包括(i)将所述的样品与所述的LIGHT靶向分子和/或所述的抗HER2抗体分子接触；以及(ii)检测所述的LIGHT靶向分子和/或所述的抗HER2抗体分子与所述的样品的络合物的形成情况，其中所述样品中所述络合物的形成为所述样品中蛋白质靶物的存在的指示。在某些实施方案中，与参照值(例如对照样品)相比，所述的蛋白质靶物的存在增多或减少。与参照值相比发生的变化(例如增多或降低)为过度增殖紊乱或状况的指示。在其中所述的蛋白质靶物为HER2的实施方案中，样品中相对于参照值的升高为多度增殖紊乱或状况的指示。
此外，所述的LIGHT靶向分子和/或所述的抗HER2抗体分子在本文中还共同称为“结合剂”或“结合分子”。
所有的公开、专利申请、专利和本文提及的其他参考文献均以引用方式全文并入本文。
通过说明书和附图、以及权利要求书，本发明的其他特征、对象以及优势将显而易见。
附图简述
图1描绘了LIGHT-Fab设计的示意图。
图2描绘了LIGHT融合物蛋白质设计备选物的示意图。
图3描绘了抗体定向的肿瘤靶向示意图。
图4描绘了人(SEQ ID NO：105)和恒河猴(SEQ ID NO：106)ErbB2细胞外结构域的、具有半胱氨酸配对的氨基酸序列。
图5描绘了人抗HER2Fab的结构域图谱。
图6描绘了用于表达的71F10Fab-hLIGHT构建体的概况。图6按照出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 147，134和132-134。具有不同连接体序列的71F10Fab-hLIGHT融合物的示意图也示于图6中。
图7描绘了通过定量ELISA测量的71F10Fab-hLIGHT与人HER2-Fc的结合情况。图7按照出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 147，134和134。
图8描绘了通过定量ELISA测量的71F10Fab-hLIGHT与鼠科HER2-Fc的结合情况。
图9描绘了具有预计分子量的71F10Fab-hLIGHT三聚体的证明。71F10Fab-hLIGHT融合蛋白质的SEC/LS分析。
图10描绘了纯化的71F10Fab-hLIGHT与人(A)和鼠科(B)LTβR-Ig的结合情况。
图11描绘了纯化的71F10Fab-hLIGHT与人(A)和鼠科(B)HVEM-Ig的结合情况。
图12描绘了71F10Fab-hLIGHT与SKBR3细胞的结合情况。
图13描绘了LTβR-Ig或HER2-Fc对71F10-LIGHT与CHO/hHER2细胞结合的阻断。
图14描绘了使用LTβR-Ig和HVEM-Ig融合物对功能hLIGHT位点的检测。
图15描绘了通过71F10Fab-hLIGHT增强T细胞的增殖。
图16描绘了通过重组hLIGHT对SKBR-3细胞生长的抑制。
图17描绘了通过71F10Fab-hLIGHT融合物蛋白质所示的“U形”生长抑制曲线(SKBR3细胞)。
图18描绘了通过71F10Fab-hLIGHT融合物蛋白质对SKBR-3细胞产生的LIGHT活性依赖性生长抑制情况。
图19描绘了71F10-hLIGHT对BT-474细胞的生长抑制情况。
图20描绘了71F10Fab-hLIGHT融合物蛋白质对HT29细胞中IP-10和IL-8分泌的刺激。
图21描绘了71F10Fab-hLIGHT融合物蛋白质对HT29肿瘤生长的抑制。图21示出了就71F10Fab-hLIGHT融合物蛋白质的最大活性而言，需要LIGHT靶向。
图22描绘了在N87的异种移植物肿瘤模型中71F10Fab-hLIGHT的有效的抗肿瘤活性。图22示出了71F10Fab-hLIGHT能够克服肿瘤对抗HER2疗法的抵抗。
图23A描绘了通过ELISA测量的抗IGFR C06Fab-hLIGHT融合物蛋白质与IGFR-Ig的结合情况。
图23B描绘了通过ELISA测量的抗IGFR C06Fab-hLIGHT融合物蛋白质与LTβR-Ig的结合情况。
图24描绘了71F10Fab-hLIGHT融合物蛋白质的二聚体形式的示意图。
图25A描绘了通过ELISA测量的71F10Fab-hLIGHT的二聚体形式与HER2-Fc的结合情况。
图25B描绘了通过ELISA所示的71F10Fab-hLIGHT的二聚体形式与hLTβR和HER2的同时结合的情况。
在不同的附图中相同的参照符号表示相同的元件。
表格简述
表1描绘了通过流式细胞计数仪测量的Fab与HER2的结合活性的概况。
表2描绘了LIGHT融合物蛋白质的结合活性的概况。
表3描绘了如定量逆转录酶PCR测量的、同时使用BIIB71F10-130进行处理而影响的HT29细胞中促炎基因的实例。
发明详述
本发明至少部分根据所选择性地传递至过度增殖(例如癌症)的细胞或组织、由此激发抗肿瘤应答(包括肿瘤细胞的杀死和/或抗肿瘤免疫)的LIGHT靶向分子的生成。在某些实施方案中，所述的LIGHT靶向分子包括至少一个LIGHT融合分子，该分子含有LIGHT部分(例如LIGHT蛋白质或其功能变体或片段)、以及与癌症蛋白质(例如在癌细胞或肿瘤上表达的细胞表面蛋白质)相互作用(例如结合)、由此传递LIGHT部分至与过度增殖的细胞或组织密切相邻处的靶向部分(例如结合剂，如抗体分子)。不被理论所束缚并且如图3所描绘的那样，据信本发明的LIGHT靶向分子在与其受体、淋巴毒素β受体(LTβR)和疱疹病毒侵入介质(HVEM)中的一者结合时会赋予以下所示的一种或多种活性，所赋予的以下所示的一种或多种LIGHT相关性活性为：i)诱导趋化因子或细胞因子(例如CXCL10(IP-10)，CCL21，CXCL9，IL-5，IL-8或TNF)、趋化因子或细胞因子受体(例如IL-10RA)、粘附分子和/或共刺激分子中的一种或多种的表达；(ii)活化T细胞，例如淋巴细胞(例如细胞毒素T淋巴细胞)、表达CD4或CD8的T细胞和/或调节T细胞；(iii)募集T细胞进入到过度增殖(例如肿瘤)的位点或细胞；(iv)活化和/或增强肿瘤反应性T细胞的增殖；(v)例如，在过度增殖(例如肿瘤细胞或组织)下，创建类淋巴微环境；(vi)诱导过度增殖(例如肿瘤)细胞或组织的凋亡；和/或(vii)刺激受试对象中的免疫应答，例如刺激受试对象对抗过度增殖(例如肿瘤或癌症)的细胞或组织的免疫系统。
在一个示例性实施方案中，所述的LIGHT靶向分子包括哺乳动物(例如人)LIGHT蛋白质或其功能变体或片段、以及与HER2结合的抗体分子的至少一个融合分子(在本文中称为“LIGHT-抗HER2融合物”)。不被理论所束缚，据信，所述的LIGHT-抗HER2融合物通过诱导由所述的抗HER2抗体分子所调控的肿瘤细胞的杀死以及刺激局部LIGHT调控的抗肿瘤免疫来引发双重抗肿瘤作用。由此，本发明在某种程度上提供了LIGHT靶向分子(例如LIGHT融合分子)、对抗HER2的抗体分子以及用于治疗多种过度增殖(例如赘生性疾病，包括使用相同的方法治疗癌症和转移)的方法。
为了更容易地理解本发明，首先定义一些术语。在整个发明详述中列出其他定义。
如本文所用，冠词“一个”和“一种”是指一个或多于一个(例如至少一个)的冠词的语法对象。
术语“或”在本文中用于指术语“和/或”并且可以交换使用，除非内容中另外作出了清除的说明。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中交换使用。
“大约”和“近似”通常是指考虑到测量方法的性质或精确度，对于所测量的量的可接受的误差程度。示例性的误差程度通常在给定值或值范围的20百分率(％)内、10％内，并且更通常在5％内。
术语“LIGHT蛋白质”及类似的术语(“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中交换使用)是指得自任何物种(通常为哺乳动物，例如鼠科、或者人或非人的灵长动物起源的)的TNF超家族的成员、及其保留有LIGHT结合活性(例如能够与LIGHT受体(通常为哺乳动物，例如鼠科或人LIGHT受体，选自淋巴毒素β受体(LTβR)(Crowe et al.(1994)Science 264707-10，Browning et al.(1997)J Immunol 159：3288-98)、疱疹病毒侵入介质(HVEM)(Montgomery et al.(1996)Cell 87(3)：427-36)和/或抗诱捕受体3(DcR3)(Yuet al.(1999)J.Biol.Chem.27413733-6))相互作用(例如结合))的功能变体(包括突变体、片段和拟肽形式)。此外，还包括LIGHT的可溶形式，例如包含LIGHT的细胞外结构域或其功能变体的可溶形式。通常，LIGHT具有本文所述的生物学活性，并且具有以下特征之一：(i)天然形成的哺乳动物LIGHT多肽或其片段(例如成熟的LIGHT)的氨基酸序列，例如人LIGHT同种型1(SEQ ID NO：1)或人LIGHT同种型2(SEQ ID NO：111)或小鼠LIGHT(SEQID NO：113)或其片段的氨基酸序列，例如人LIGHT同种型1的大约氨基酸93至240(与SEQ ID NO：1所示的人LIGHT细胞外结构域的部分相应)，具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约氨基酸253至400(pBIIB71F10-130)(与SEQID NO：2所示的抗HER2抗体分子的人LIGHT细胞外结构域的部分相应)，具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约氨基酸258至405(pBIIB71F10-131)(与SEQID NO：3所示的抗HER2抗体分子的人LIGHT细胞外结构域的部分相应)，具有(G4S)4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约氨基酸245至392(pBIIB71F10-132)(与SEQID NO：4所示的抗HER2抗体分子的人LIGHT细胞外结构域的部分相应)；(ii)与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；(iii)由核苷酸序列所编码的氨基酸序列，其中所述的核苷酸序列选自：人LIGHT同种型1的大约核苷酸277至720(与SEQ ID NO：5所示的人LIGHT细胞外结构域的部分相应)，具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约核苷酸757至1200(pBIIB71F10-130)(与SEQID NO：6所示的抗HER2抗体分子的LIGHT细胞外结构域的部分相应)，具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约核苷酸772至1215(pBIIB71F10-131)(与SEQ ID NO：7所示的抗HER2抗体分子的LIGHT细胞外结构域的部分相应)，具有(G4S)4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约核苷酸722至1176(pBIIB71F10-132)(与SEQID NO：8所示的抗HER2抗体分子的LIGHT细胞外结构域的部分相应)；(iv)与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)所编码的氨基酸序列；(v)由降解形成天然形成的LIGHT核苷酸序列或其片段的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，例如人LIGHT同种型1(SEQ ID NO：1)或其片段的氨基酸序列；或者(vi)在严谨条件(例如高度严谨的条件)下与之前所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
短语LIGHT的“生物学活性”是指与LIGHT有关的生物学活性的一种或多种，包括但不限于：(i)与一种或多种LIGHT受体(例如淋巴毒素β受体(LTβR)、疱疹病毒侵入介质(HVEM)和/或抗诱捕受体3(DcR3))结合；(ii)诱导趋化因子或细胞因子(例如CXCL10(IP-10)，CCL21，CXCL9，IL-5，IL-8或TNF)、趋化因子或细胞因子受体(例如IL-10RA)、粘附分子和/或共刺激分子中的一种或多种的表达；(iii)活化T细胞，例如淋巴细胞(例如细胞毒素T淋巴细胞)、表达CD4或CD8的T细胞和/或调节T细胞；(iv)募集T细胞进入到过度增殖(例如肿瘤)的位点或细胞；(v)活化和/或增强肿瘤反应性T细胞的增殖；(vi)例如，在过度增殖(例如肿瘤细胞或组织)下，创建类淋巴微环境；(vii)诱导过度增殖(例如肿瘤)细胞或组织的凋亡；和/或(viii)刺激受试对象中的免疫应答，例如刺激受试对象对抗过度增殖(例如肿瘤或癌症)的细胞或组织的免疫系统。
本发明的方法和组合物包括LIGHT靶向分子、抗体分子和具有特定序列或与其基本一致或相似的序列的核酸，例如与特定序列至少85％，90％，95％一致或更高的序列。就氨基酸序列而言，术语“基本一致的”在本文中用于指包含足够的或最少量氨基酸残基的第一氨基酸，该氨基酸与第二氨基酸序列的联配的氨基酸残基是i)一致的或ii)保守性取代的，使得第一和第二氨基酸序列可以具有同样的结构域和/或同样的功能活性。例如，包含同样结构域且与参照序列具有至少大约85％，90％.91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的一致性的氨基酸序列。
就核苷酸序列而言，术语“基本一致的”在本文中用于指包含足够的或最少量的核苷酸序列的第一核酸序列，该核酸序列与第二核酸序列中联配的核苷酸一致，使得第一和第二核苷酸序列编码了具有同样的功能活性的多肽，或者编码了同样的结构多肽的结构域或同样的功能多肽的活性。例如，与参照序列具有至少大约85％，90％.91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的一致性的核苷酸序列。
此外，作为本发明的多肽还包括之前所述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，以及它们的任何组合。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”当用于指本发明的LIGHT蛋白质、LIGHT靶向分子、抗体分子时，包括保留有相应的天然抗体或多肽的至少一些功能性质的任何多肽。本发明的多肽的片段除了包括本文其他处所述的特异性抗体片段以外，还包括蛋白水解片段以及删除片段。本发明的多肽的变体包括上文所述的片段，并且还包括具有优于氨基酸取代、删除或插入而形成的改变的氨基酸序列的多肽。变体可以天然形成或者非天然形成。非天然形成的变体可以使用本领域已知的突变技术来生产。变体多肽可以包括保守型或非保守型的氨基酸取代、删除或加入。本发明的片段的衍生物为其中经改变使得其表现出在天然多肽中未发现的其他特征的多肽。实例包括融合物蛋白质。如本文所用，多肽的“衍生物”是指具有一个或多个残基(通过功能侧链基团的反应而以化学方式衍生的)的受试对象的多肽。此外，“衍生物”还包括这样的多肽，其包含20种标准氨基酸的一个或多个天然形成的氨基酸衍生物。
术语“功能变体”是指具有与天然形成的序列基本一致的氨基酸序列、或者由基本一致的核苷酸序列所编码、并且能够具有一种或多种天然形成序列的活性的多肽。
序列之间的同源性或序列一致性(所述的术语在本文中交换使用)的计算按照以下方式进行。将序列联配以达到最佳比较的目的(例如在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一者或二者中可以引入空位以达到最佳联配的目的，并且为了进行比较，可以忽略非同源的序列)。用于比较目的而联配的参照序列的长度可以为所述参照序列的长度的至少30％、优选为至少40％、更优选为至少50％，60％、甚至更优选为至少70％，80％，90％，100％。然后，比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸所占据时，则在该位置处的分子是一致的(如本文所用，氨基酸或核酸“一致性”与氨基酸或核酸“同源性”是相当的)。
考虑到空位的数量以及各空位的长度(需要引入它们以达到两条序列的最佳联配)，两条序列之间的百分一致性是由所述序列所共有的一致的位置的数量的函数。序列的比较以及两条序列之间的百分一致性的确定可以使用数学运算来完成。两条氨基酸序列之间的百分一致性可以使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)运算来确定，其中所述的运算已经被引入到GCG软件包的GAP程序(其使用了Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，并且空位加权为16，14，12，10，8，6或4，而长度加权为1，2，3，4，5或6)中。两条核苷酸序列之间的百分一致性可以使用GCG软件包种的GAP程序(其使用了NWSgapdna.CMP矩阵，并且空位加权为40，50，60，70或80，而长度加权为1，2，3，4，5或6)来确定。特别优选的的一组参数(并且除非另作说明，否则应该使用的一组参数)为Blossum 62得分矩阵(空位罚分为12，空位拓展罚分为4，而移码空位罚分为5)。
两条氨基酸或核苷酸序列之间的百分一致性可以使用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS，4：11-17)运算来确定，其中所述的运算已经被引入到ALIGN程序(2.0版)(其使用了PAM120加权残基表，空位长度罚分为12，而空位罚分为4)中。本文所述的核酸和蛋白质序列可以用作“询问序列”来针对公共数据库进行搜索，以(例如)鉴别其他家族的成员或相关的序列。这种搜索可以使用Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)来进行。可以使用NBLAST程序、得分＝100、字长＝12来进行BLAST核苷酸搜索，以得到与本发明的核酸(SEQ ID NO：1)分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序、得分＝50、字长＝3来进行BLAST蛋白质搜索，以得到与本发明的蛋白质(SEQ ID NO：1)分子同源的氨基酸序列。为获得空位联配(gapped alignment)以进行比较，可以按照Altschulet al.，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402所述来使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。
如本文所用，术语“在低度严谨条件、中等严谨条件、高度严谨条件或极高度严谨条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。用于进行杂交反应的指导可以在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。在所述的文献中描述了水性和非水性的方法，并且可以使用任何一者。本文所述的特定的杂交条件如下：1)低度的严谨条件为：在大约45℃下，6x的氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中；然后在至少50℃(对于低度严谨条件而言，洗涤温度可以升高至55℃)下，在0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤两次；2)中度的严谨条件：在大约45℃下，6x SSC中，然后在65℃下，在0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次；3)高度的严谨条件：在大约45℃下，6x SSC中，然后在65℃下，在0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次；以及优选的4)极高度的严谨条件：在65℃下，0.5M磷酸钠、7％SDS中，然后在65℃下在0.2X SSC，1％SDS中洗涤一次或多次。极高度的严谨条件(4)为优选的条件，并且除非另作说明，否则应该使用该条件。
应该理解的是，本发明的LIGHT靶向分子可以具有其他的保守性或非必需的氨基酸取代，该取代对所述分子的功能不具有实质性的影响。“保守性的氨基酸取代”为其中所述的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中有所定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支的侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
本发明的多个方面在下文中进一步详细描述。
1.LIGHT靶向分子
在一个方面中，本发明特写了LIGHT靶向分子，该分子包括至少一个LIGHT部分(例如本文所述的LIGHT蛋白质或其功能变体或片段)、以及与过度增殖细胞(例如在癌或肿瘤细胞或组织上表达的细胞表面蛋白质)上的表面蛋白质相接触(例如结合)、由此将LIGHT部分传递至过度增殖的细胞或组织的至少一个靶向部分(例如结合剂，如抗体分子)。
在一些实施方案中，所述的LIGHT分子与所述的靶向部分是功能连接的(例如通过化学偶联、基因或多肽融合、非共价结合等)。例如，所述的LIGHT分子可以使用或不使用连接基团，与所述的靶向部分作为基因或多肽的融合物而融合。在其他实施方案中，所述的LIGHT分子通过反应性基团(具有或不具有连接基团(例如生物相容性聚合物))而与所述的抗体分子共价连接。所述的LIGHT靶向分子可以为至少一个LIGHT部分和至少一个靶向部分的单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或更多。例如，所述的LIGHT靶向分子可以包括至少1个、2个、3个、4个或5个LIGHT融合分子，每个分子都包括至少一个LIGHT部分和至少一个靶向部分。在一个实施方案中，所述的LIGHT靶向分子包括或基本上由3个LIGHT融合分子构成，其中每个分子都包括或基本上由一个LIGHT部分(例如本文所述的LIGHT部分)和一个靶向部分(例如本文所述的靶向分子)构成。
如本文所述，“融合物蛋白质”是指包含2个或多个可操作结合(例如连接)的部分(例如蛋白质部分)的蛋白质。通常，所述的部分是共价结合的。所述的部分可以是直接结合的，或者通过间隔体或连接体(例如本文所述的连接基团)连接。
在其他实施方案中，所述的靶向部分使所述的LIGHT靶向部分定向于所需的位点，例如过度增殖(例如癌症)的细胞或组织，使得所述的LIGHT部分诱导出针对所需位点(例如过度增殖(例如癌症)的细胞或组织)的一种或多种LIGHT相关的活性(例如本文所述的一种或多种LIGHT相关的活性)。可以使用所述的靶向部分靶向的示例性过度增殖(例如癌症)的细胞或组织包括但不限于乳腺、肺、胃、卵巢、前列腺、胰腺、结肠、结肠直肠、肾、膀胱、肝脏、头、颈部、脑以及软组织恶性(包括淋巴恶性癌症、白血病和骨髓瘤)的癌症或实体肿瘤。所述的靶向部分可以与本文所述的一种或多种过度增殖的细胞或组织上表达的一种或多种细胞表面蛋白质结合。例如，所述的靶向部分(例如本文所述的抗体分子)可以与生长因子受体(例如HER2/neu，HER3，HER4，表皮生长因子受体(EGFR)，胰岛素生长因子受体(IGFR)，Met，Ron，Cripto)；癌症相关的整合素或整合素受体(例如αvβ6，α6β4，层粘连蛋白受体(LAMR))；和/或CD23，CD20，CD16，EpCAM，Tweak受体(FN14)，癌胚抗原(CEA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，TAG-72和/或VEGF等中的一者或多者结合。所选的靶物中的每一个在下文中有更详细的描述。
表皮生长因子受体：人EGFR基因组DNA和mRNA的核苷酸序列在例如Ullrich A et al.，Nature 309：418-425(1984)(同种型1)；Ilekis J.V.，et al.(1995)Mol.Reprod.Dev.41：149-156(同种型2)；Reiter J.L.and Maihle N.J.NucleicAcids Res.24：4050-4056(1996)(同种型2)；Ilekis J.V.et al.，Gynecol.Oncol.65：36-41(1997)(同种型2)；和Reiter J.L.，et al.，Genomics 71：1-20(2001)(同种型3和4)中有所公开。人EGFR的蛋白质序列及其磷酸化和遍在蛋白质位点在例如Heisermann G.J.and Gill G.N.J.Biol.Chem.263：13152-13158(1988)；Zhang Z.and Henzel W.J.Protein Sci.13：2819-2824(2004)；Russo M.W.et al.，J.Biol.Chem.260：5205-5208(1985)；Huang F.et al，Mol.Cell 21：737-748(2006)；和Abe Y.et al.，J.Biol.Chem.273：11150-11157(1998)中有所公开。小鼠EGFRmRNA的核苷酸序列和蛋白质序列在例如Avivi A.et al.，Oncogene7：1957-1962(1992)；Paria B.C.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：55-59(1993)；Luetteke N.C.et al.，Genes Dev.8：399-413(1994)；和Avivi A.et al.，Oncogene 6：673-676(1991)中有所公开。人EGFR是普遍表达的。此外，同种型2也在卵巢癌中表达。所述基因的突变与肺癌有关。在乳腺癌细胞中，EGFR将MUC1磷酸化，并增加了MUC1与C-SRC和CTNNB1/β-联蛋白的相互作用。
胰岛素样生长因子1：人IGF1R基因组DNA和mRNA的核苷酸序列在例如Ullrich A.et al.，EMBO J.5：2503-2512(1986)；Abbot A.M.et al.，J.Biol.Chem.267：10759-10763(1992)；The MGC Project Team，Genome Res.14：2121-2127(2004)；Cooke D.W.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.177：1113-1120(1991)；和Lee S.-T.，et al.，Oncogene 8：3403-3410(1993)中有所公开。人IGF1R的蛋白质序列在例如Ullrich A.et al.，EMBO J.5：2503-2512(1986)中有所公开。小鼠IGF1R mRNA的核苷酸序列和蛋白质序列在例如Wada J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：10360-10364(1993)；和Wilks A.F.et al.，Gene 85：67-74(1989)中有所公开。人IGF1R在多种组织中表达。在对胰岛素样生长因子1具有抗性(IGF1抗性)的情况下，IGF1R的缺失可能是原因所致。IGF1抗性为可表征为宫内发育迟缓以及伴有血浆IGF1增多的出生后生长较差的生长缺陷紊乱。
HER3：人HER3的核苷酸和蛋白质序列在例如Kraus M.H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：9193-9197(1989)(同种型1)；Plowman G.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：4905-4909(1990)(同种型1)；Katoh M.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.192：1189-1197(1993)(同种型2)；和TheMGC Project Team，Genome Res.14：2121-2127(2004)(同种型1)中有所公开。小鼠HER3的核苷酸和蛋白质序列在例如The MGC Project Team，GenomeRes.14：2121-2127(2004)；和Moscoso L.M.et al.，Dev.Biol.172：158-169(1995)中有所公开。人HER3在上皮组织和脑中表达。其在人乳腺肿瘤的子集中过表达。HER3的缺陷是导致致死性先天性挛缩综合症2型(LCCS2)的原因；其中所述的综合症也称为Israeli Bedouin多发性挛缩综合症A型。LCCS2为新生儿致死性关节挛缩的染色体隐性神经形式(其与脊髓前角的萎缩有关)。
HER4：人HER4的核苷酸和蛋白质序列在例如Plowman G.D.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：1746-1750(1993)(同种型JM-A)；Elenius K.et al.，J.Biol.Chem.272：26761-26768(1997)(同种型JM-A和JM-B)；和The MGCProject Team，Genome Res.14：2121-2127(2004)(同种型JM-A)中有所公开。小鼠HER4的核苷酸和蛋白质序列在例如Carninci P.et al.，Science309：1559-1563(2005)；Elenius K.et al.，J.Biol.Chem.272：26761-26768(1997)；Moscoso L.M.et al.，Dev.Biol.172：158-169(1995)中有所公开。除了在骨骼肌、副甲状腺、小脑、垂体、脾、睾丸和乳腺以外，人HER4在脑、心、肾中表达的水平最高，而在胸腺、肺、唾液腺和胰腺中表达水平较低。这种基因中的突变与癌症有关。
MET：Met原癌基因(肝细胞生长因子受体)(MET)在本领域中还称为HGFR，AUTS9，RCCP2和c-Met。人MET的核苷酸和蛋白质序列在例如ParkM.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：6379-6383(1987)(同种型2)；HillierL.W.et al.，Nature 424：157-164(2003)；Chan A.M.-L.et al.，Oncogene1：229-233(1987).Lee S.-T.et al.，Oncogene 8：3403-3410(1993)；和Dean M.etal.，Nature 318：385-388(1985)中有所公开。小鼠MET的核苷酸和蛋白质序列在例如Chan A.M.-L.et al.，Oncogene 2：593-599(1988)；Wilks A.F.Gene85：67-74(1989)；和Weidner K.M.et al.，J.Cell Biol.121：145-154(1993)中有所公开。MET在与TPR基因重新排列后会活化，从而产生原癌蛋白质。MET的缺陷可能与胃癌有关。MET的缺陷是导致肝细胞癌(HCC)的原因、以及是导致遗传性乳头状肾癌(HPRC)(也称为乳头状肾细胞癌2(RCCP2))的原因。HPRC为遗传性肾癌的形式，其可以表征为易于发展成多发性双侧乳头状肾肿瘤。遗传模式符合外显率降低的染色体显性传播。MET的遗传变化与易于患有孤独症1B型(AUTS1B)有关。
RON：人RON的核苷酸和蛋白质序列在例如Ronsin C.et al.，Oncogene8：1195-1202(1993)；和Collesi C.et al.，Mol.Cell.Biol.16：5518-5526(1996)中有所公开。小鼠RON的核苷酸和蛋白质序列在例如Iwama A.et al.，Blood83：3160-3169(1994)；Waltz S.E.et al.，Oncogene 16：27-42(1998)；和PersonsD.A.et al.，Nat.Genet.23：159-165(1999)中有所公开。RON在角化细胞和肺中表达。其使小鼠容易患有Friend病毒诱导的红白血病。
Cripto：人Cripto的核苷酸和蛋白质序列在例如Ciccodicola A.et al.，EMBO J.8：1987-1991(1989)；Dono R.et al.，Am.J.Hum.Genet.49：555-565(1991)；Zhang Z.and Henzel W.J.Protein Sci.13：2819-2824(2004)；Foley S.F.et al.，Eur.J.Biochem.270：3610-3618(2003)中有所公开。小鼠Cripto的核苷酸和蛋白质序列在例如Dono R.et al.，Development118：1157-1168(1993)；和Liguori G.et al.，Mamm.Genome 7：344-348(1996)中有所公开。与正常的胃和结肠直肠相比，Cripto优先在胃癌和结肠直肠癌中表达。在小鼠中，Cripto在成年动物诸如脾、心、肺和脑之类的特定器官中低水平表达。与Cripto结合的抗体分子的实例在例如美国专利申请公开No.：2008/0166341A1中有所描述。
VEGFR：人VEGFR的核苷酸和蛋白质序列在例如Shibuya M.et al.，Oncogene 5：519-524(1990)(同种型Flt1)；Kendall R.L.和Thomas K.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：10705-10709(1993)(同种型SFLT1)；The MGCProject Team，Genome Res.14：2121-2127(2004)(同种型sFlt1)；Matsushime H.et al.，Jpn.J.Cancer Res.78：655-661(1987)(同种型Flt1)；和Ito N.et al.，J.Biol.Chem.273：23410-23418(1998)中有所公开。小鼠VEGFR的核苷酸和蛋白质序列在例如Finnerty H.et al.，Oncogene 8：2293-2298(1993)；Choi K.et al.，Oncogene 9：1261-1266(1994)；和Kondo K.et al.，Gene 208：297-305(1998)中有所公开。VEGFR主要在正常的肺中表达，而且在胎盘、肝脏、肾、心和脑组织中也表达。其在大部分的血管内皮细胞中特异性的表达，并且在外周血单核细胞中也表达。其在肿瘤细胞系中不表达。同种型sFlt1在胎盘中强烈表达。
整合素αvβ6：整合素为与细胞外基质(ECM)相互作用并调控多种细胞内信号的细胞表面受体。存在有多种类型的整合素，并且很多细胞在其表面上都具有多种类型的整合素。整合素为专性异源二聚体，其包含两条不同的链，称为α(alpha)和β(beta)亚基。在哺乳动物中，已经表征了19α和8β亚基。人整合素αv的核苷酸和蛋白质序列在例如Suzuki S.et al.，J.Biol.Chem.262：14080-14085(1987)；Sims M.A.，Cytogenet.Cell Genet.89：268-271(2000)；Hillier L.W.et al.，Nature 434：724-731(2005)；The MGC Project Team，GenomeRes.14：2121-2127(2004)；Donahue J.P.et al.，Biochim.Biophys.Acta1219：228-232(1994)；Suzuki S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：8614-8618(1986)；Cheresh D.A.et al.，Cell 57：59-69(1989)中有所公开。小鼠整合素αv的核苷酸和蛋白质序列在例如Almeida J.Submitted(APR-2008)(EMBL/GenBank/DDBJ数据库)中有所公开。人整合素β6的核苷酸和蛋白质序列在例如Sheppard D.et al.，J.Biol.Chem.265：11502-11507(1990)；Hillier L.W.，Nature 434：724-731(2005)；The MGCProject Team，Genome Res.14：2121-2127(2004)；Jiang W.-M.et al.，Int.Immunol.4：1031-1040(1992)中有所公开。小鼠整合素β6的核苷酸和蛋白质序列在例如Arend L.J.et al.，J.Am.Soc.Nephrol.11：2297-2305(2000)；Carninci P.et al.，Science 309：1559-1563(2005)；The MGC Project Team，Genome Res.14：2121-2127(2004)中有所公开。
整合素αvβ6主要分布于增殖上皮细胞(例如肺和肝脏)中。整合素αvβ6的功能在例如J.et al.，Biochem Soc Trans.36(Pt 2)：257-262(2008)；Wipff P.J.and Hinz B.Eur J Cell Biol.87：601-615(2008)；Bates R.C.FutureOncol.1：821-8(2005)；Thomas G.J.et al.，J Oral Pathol Med.35：1-10(2006)；Sheppard D.Cancer Metastasis Rev.24：395-402(2005)；Bates R.C.and MercurioA.M.Cancer Biol Ther.4：365-370(2005)；Keski-Oja J.et al.，Trends Cell Biol.14：657-659(2004)；Sheppard D.Curr Opin Cell Biol.16：552-557(2004)；Wada J.et al.，Nephrol Dial Transplant.17：75-77(2002)；Thomas G.J.and Speight P.M.Crit Rev Oral Biol Med.12：479-498(2001)；和Imhof B.A.et al.，Curr TopMicrobiol Immunol.213：195-203(1996)中有所公开。
整合素α6β4：人整合素α6的核苷酸和蛋白质序列在例如Hogervorst F.et al.，Eur.J.Biochem.199：425-433(1991)；Starr L.et al.，BioTechniques13：612-618(1992)；Tamura R.N.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：10183-10187(1991)；Ziober B.L.et al.，J.Biol.Chem.268：26773-26783(1993)；Shaw L.M.et al.，J.Biol.Chem.268：11401-11408(1993)；和Delwel G.O.et al.，Cell Adhes.Commun.3：143-161(1995)中有所公开。小鼠整合素α6的核苷酸和蛋白质序列在例如Carninci P.et al.，Science 309：1559-1563(2005)。人整合素β4的核苷酸和蛋白质序列在例如Suzuki S.and Naitoh Y.EMBO J.9：757-763(1990)；Hogervorst F.et al.，EMBO J.9：765-770(1990)；和Tamura R.N.et al.，J.Cell Biol.111：1593-1604(1990)中有所公开。小鼠整合素β4的核苷酸和蛋白质序列在例如Brown J.Submitted(APR-2008)(EMBL/GenBank/DDBJ数据库)中有所公开。
整合素α6β4主要在上皮组合以及上皮和Schwann细胞中表达。在许多上皮肿瘤中，α6β4的表达增多，并且其活化了癌细胞中的多个重要的信号传递分子，包括活化磷脂酰肌醇3-激酶/Akt途径(Bon G.et al.，Breast Cancer Res.9：203(2007)；Wilhelmsen K，A.et al.，Mol Cell Biol.26：2877-86(2006))。
LAMR：核糖体蛋白质SA(LAMR)。其在本领域中也称为RPSA，LRP，p40，67LR，37LRP，LAMBR和LAMR1。层粘连蛋白(细胞外基质蛋白质的家族)为基底膜上主要的非胶原纤维的构成成分。人LAMR的核苷酸和蛋白质序列在例如Yow H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：6394-6398(1988)；vanden Ouweland A.M.W.et al.，Nucleic Acids Res.17：3829-3843(1989)；Satoh K.et al.，Cancer Lett.62：199-203(1992)；Jackers P.et al.，Oncogene13：495-503(1996)；The MGC Project Team，Genome Res.14：2121-2127(2004)；Siyanova E.Y.et al.，Dokl.Biochem.313：227-231(1990)；Vladimirov S.N.et al.，Eur.J.Biochem.239：144-149(1996)；Selvamurugan N.and Eliceiri G.L.et al.，Genomics 30：400-401(1995)；和Wewer U.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：7137-7141(1986)中有所公开。小鼠LAMR的核苷酸和蛋白质序列在例如Rao C.N.et al.，Biochemistry 28：7476-7486(1989)；Makrides S.et al.，NucleicAcids Res.16：2349-2349(1988)；Coggin J.H.Jr.et al.，Anticancer Res.19：5535-5542(1999)；Carninci P.et al.，Science 309：1559-1563(2005)；和TheMGC Project Team，Genome Res.14：2121-2127(2004)中有所公开。已经观察到，与正常的结肠组织和肺细胞系相比，层粘连蛋白受体转录物的水平在结肠癌组织和肺癌细胞系中较高。此外，在癌细胞中所述多肽的调节与这些多肽的入侵和转移表现型之间有一定关系。
CD23：IgE的Fc片段、低亲和性II、(CD23)的受体。其在本领域中也称为FCER2，FCE2，CD23A，IGEBF和CLEC4J。人白细胞分化抗原CD23(FCE2)为B细胞活化和生长的重要分子。其为IgE的低亲和性受体。截短的分子可以被分泌，然后起到有效的促有丝分裂生长因子的作用。人CD23的核苷酸和蛋白质序列在例如Ikuta K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：819-823(1987)；Kikutani H.et al.，Cell 47：657-665(1986)；Luedin C.et al.，EMBO J.6：109-114(1987)；The MGC Project Team，Genome Res.14：2121-2127(2004)；Rose K.et al.，Biochem.J.286：819-824(1992)；和YokotaA.et al.，Cell 55：611-618(1988)中有所公开。小鼠CD23的核苷酸和蛋白质序列在例如Bettler B.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：7566-7570(1989)；Gollnick S.O.et al.，J.Immunol.144：1974-1982(1990)；和Kondo H.et al.，Int.Arch.Allergy Immunol.105：38-48(1994)中有所公开。可以用作靶向部分的抗CD23抗体在例如美国专利No.7,332,163和7,223,392中所述的那样。
CD20：跨膜4结构域，亚家族A，成员1(CD20)在本领域中也称为MS4A1，B1，S7，Bp35，MS4A2，LEU-16和MGC3969。CD20编码了跨膜4A基因家族的成员。人CD20的核苷酸和蛋白质序列在例如Stamenkovic I.and Seed B.J.Exp.Med.167：1975-1980(1988)；Tedder T.F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：208-212(1988)；Einfeld D.A.et al.，EMBO J.7：711-717(1988)；Tedder T.F.etal.，J.Immunol.142：2560-2568(1989)；Taylor T.D.et al.，Nature440：497-500(2006)；和The MGC Project Team，Genome Res.14：2121-2127(2004)中有所公开。小鼠CD20的核苷酸和蛋白质序列在例如Tedder T.F.et al.，J.Immunol.141：4388-4394(1988)；Carninci P.et al.，Science309：1559-1563(2005)；和The MGC Project Team，Genome Res.14：2121-2127(2004)中有所公开。CD20在B细胞上表达。该基因编码了B淋巴细胞表面分子，该分子在B细胞发育并分化成血浆细胞的过程中起到了一定的作用。
CD16：IgG的Fc片段、低亲和性IIIa或IIIb、受体(CD16)。其在本领域中也称为FCGR3A，FCGR3B，FCG3，CD16A，FCGR3，IGFR3，FCR-10，FCRIII，FCGRIII和FCRIIIA。人CD16a和CD16b的核苷酸和蛋白质序列在例如The MGC Project Team，Genome Res.14：2121-2127(2004)；和Scallon B.J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：5079-5083(1989)中有所公开。人CD16b的核苷酸和蛋白质序列在例如Ravetch J.V.and Perussia B.J.Exp.Med.170：481-497(1989)；Simmons D.and Seed B.Nature 333：568-570(1988)；Simmons D.and Seed B.Nature 340：662-662(1989)；Peltz G.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：1013-1017(1989)；Scallon B.J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：5079-5083(1989)；Bertrand G.et al.，Tissue Antigens64：119-131(2004)；和Gessner J.E.et al.，J.Biol.Chem.270：1350-1361(1995)中有所公开。小鼠CD16的核苷酸和蛋白质序列在例如Bonnerot C.et al.，Mol.Immunol.29：353-361(1992)；和Kulczycki A.Jr.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：2856-2860(1990)中有所公开。由FCGR3A编码的受体作为通过跨膜肽锚定的内在膜糖蛋白在天然杀伤(NK)细胞上表达，而FCGR3B在多形核中性粒细胞(PMN)上表达，其中所述的受体通过磷脂酰肌醇(PI)连接而锚定。该基因的突变与容易复发的病毒感染、容易患有系统性红斑狼疮以及同种免疫新生儿中性粒细胞减少症有关。在某些系统性血管炎中，更有活性的FCGR3B*01等位基因与严重的肾病有关。
EpCAM：肿瘤相关的钙信号传导因子1(EpCAM)。其在本领域中也称为TACSTD1，EGP，KSA，M4S1，MK-1，CD326，EGP40，MIC18，TROP1，Ep-CAM，hEGP-2，CO17-1A和GA733-2。该9个外显子的基因编码了癌症相关的抗原，并且为包括至少2个类型I膜蛋白的家族的成员。人EpCAM的核苷酸和蛋白质序列在例如Strnad J.et al.，Cancer Res.49：314-317(1989)；Simon B.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：2755-2759(1990)；Perez M.S.and Walker L.E.J.Immunol.142：3662-3667(1989)；Szala S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：3542-3546(1990)；The MGC Project Team，Genome Res.14：2121-2127(2004)；Linnenbach A.J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：27-31(1989)；和Chong J.M.and Speicher D.W.J.Biol.Chem.276：5804-5813(2001)中有所公开。小鼠EpCAM的核苷酸和蛋白质序列在例如The MGC Project Team，Genome Res.14：2121-2127(2004)；和Carninci P.etal.，Science 309：1559-1563(2005)中有所公开。该抗原在大部分正常的上皮细胞癌和胃肠道癌上表达，并且起到同型钙非依赖型细胞粘附分子的作用。
FN14：肿瘤坏疽因子受体超家族，成员12A(FN14)。其在本领域也称为TNFRSF12A，CD266和TWEAKR。其为TNFSF12/TWEAK的受体。人FN14的核苷酸和蛋白质序列在例如Feng S.-L.Y.et al.，Am.J.Pathol.156：1253-1261(2000)；和The MGC Project Team，Genome Res.14：2121-2127(2004)中有所公开。小鼠FN14的核苷酸和蛋白质序列在例如Meighan-Mantha R.L.et al.，J.Biol.Chem.274：33166-33176(1999)；Carninci P.，Science 309：1559-1563(2005)；和The MGC Project Team，Genome Res.14：2121-2127(2004)中有所公开。人FN14的未加工前体的长度为大约129个氨基酸，分子量为大约13911Da。小鼠FN14的未加工前体的长度为大约129个氨基酸，分子量为大约13641Da。人FN14在心、胎盘和肾中是高表达的；而在肺、骨骼肌和胰腺中是适度表达的。小鼠FN14在胎儿心脏、肠、肾、肝脏、肺和皮肤中，以及在成人的心和卵巢中是高表达的，而在成人的肾、肺和皮肤中是适度表达的。
所述的靶向部分(例如本文所述的抗体分子)还可以与以下物质中的一种或多种结合：酪氨酸-蛋白质激酶受体(例如TYRO3(酪氨酸-蛋白质激酶受体TYRO3，也称为酪氨酸-蛋白质激酶RSE，SKY，DTK或byk，Mark M.R.et al.，J.Biol.Chem.269：10720-10728(1994)))；AXL(也称为酪氨酸-蛋白质激酶受体UFO，O′Bryan J.P.et al.，Mol.Cell.Biol.11：5016-5031(1991))；DDR1(含有上皮盘状结构域的受体1，也称为酪氨酸激酶DDR，盘状受体酪氨酸激酶，酪氨酸-蛋白质激酶CAK，细胞粘附激酶，TRK E，蛋白质-酪氨酸姐妹RTK 6，HGK2，CD167抗原样家族成员A，乳腺癌激酶10(MCK-10)或CD167a；Perez J.L.et al.，Oncogene 9：211-219(1994))；DDR2(包含盘状结构域的受体2，也称为受体蛋白-酪氨酸激酶TKT，酪氨酸-蛋白质激酶TYRO10，神经酪氨酸激酶，受体相关3，CD167抗原样家族成员B或CD167b；IchikawaO.et al.，EMBO J.26：4168-4176(2007))；ALK(ALK酪氨酸激酶受体，也称为间变型淋巴瘤激酶或CD246；Simonitsch I.el al.，FASEB J.15：1416-1418(2001))；CSF1R(巨噬细胞集落刺激因子1受体，也称为Fms原癌基因，c-fms或CD115；Hampe A.et al.，Oncogene Res.4：9-17(1989))；生长因子受体(例如FGFR1(碱性成纤维细胞生长因子受体1，也称为bFGF-R，Fms样酪氨酸激酶2，c-fgr或CD331；Dionne C.A.et al.，EMBO J.9：2685-2692(1990))；FGFR2(成成纤维细胞生长因子受体2，也称为角化细胞生长因子受体2或CD332；Hattori Y.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：5983-5987(1990))；生长因子(例如PDGF1(也称为血小板衍生的生长因子亚基A，血小板衍生的生长因子A链或血小板衍生的生长因子α多肽；Bonthron D.T.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：1492-1496(1988)))；PDGF2(也称为血小板衍生的生长因子亚基B，血小板衍生的生长因子B链，血小板衍生的生长因子β多肽或c-sis；Josephs S.F.et al.，Science225：636-639(1984))；凋亡蛋白质(例如神经生长因子，如神经生长因子-1(Meyerhardt J.A.et al.，Cell Growth Differ.10：35-42(1999)或神经生长因子-4(也称为β-神经生长因子或肝衍生的神经生长因子样蛋白质；Koch M.et al.，J.Cell Biol.151：221-234(2000)))；酪氨酸激酶(例如MER(原癌基因酪氨酸-蛋白质激酶MER，也称为C-mer或受体酪氨酸激酶MerTK；Graham D.K.etal.，Cell Growth Differ.5：647-657(1994)))；激素受体(例如PRL-R(催乳激素受体；Boutin J.-M.et al.，Mol.Endocrinol.3：1455-1461(1989))；GH受体(生长激素受体，也称为生长素受体，GH-binding蛋白质，GHBP或血清结合蛋白质；Leung D.W.et al.，Nature 330：537-543(1987)))；信号传导蛋白质(例如ephrin，例如ephrin A(例如ephrin A1，ephrin A2，ephrin A3，ephrin A4，ephrinA5；Holzman L.B.et al.，Mol.Cell Biol.10(11)：5830-5838(1990)以及ephrin B(例如ephrin B1，ephrin B2，ephrin B3；Fletcher F.A.et al.Genomics 25(1)：334-335(1995)))；PD-L1(程序性细胞死亡配体1，也称为B7-H1或CD274；Dong H.et al.，Nat.Med.5：1365-1369(1999))；神经菌毛素(例如NRP1(神经菌毛素-1，也称为血管上皮细胞生长因子165受体或CD304；He Z.andTessier-Lavigne M.Cell 90：739-751(1997))；NRP2(神经菌毛素-2，也称为血管上皮细胞生长因子165受体2；Chen H.et al.，Neuron 19：547-559(1997))；信号素(SEMA，例如SEMA3，SEMA4，SEMA5，SEMA6或SEMA7；FlanneryE.and Duman-Scheel M.Curr Drug Targets.10：611-619(2009))；细胞粘附分子(例如间皮素(MSLN，也称为前-促-巨核细胞-增效因子，CAK1抗原或巨核细胞-增效因子(MPF)；Chang K.and Pastan I.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：136-140(1996))；结合素(例如结合素1，结合素2，结合素3，结合素4，结合素样蛋白质1，结合素氧蛋白质2，结合素样蛋白质3或结合素样蛋白质4；Takai Y.et al.，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.9：603-615(2008))；CEA(癌胚抗原相关的细胞粘附分子，例如CEA5；Schrewe H.et al.，Mol.Cell.Biol.10：2738-2748(1990)；CEACAM6(癌胚抗原相关的细胞粘附分子6，也称为正常的交联反应抗原，非特异性交联反应抗原或CD66c；Barnett T.et al.，Genomics 3：59-66(1988)))；趋化因子受体(例如CCR4(C-C趋化因子受体类型4，也称为C-C CKR-4，CC-CKR-4，K5-5或CD194；Power C.A.et al.，J.Biol.Chem.270：19495-19500(1995))；CXCR7(C-X-C趋化因子受体类型7，也称为CXC-R7，G-蛋白质偶联的受体RDC1同系物，RDC-1，趋化因子孤儿受体1或G-蛋白质偶联的受体159；Sreedharan S.P.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：4986-4990(1991))；G-蛋白质偶联的受体(例如GPR49(包含富集亮氨酸的重复序列的G-蛋白质偶联的受体5，也称为孤儿G-蛋白质偶联的受体HG38，G-蛋白质偶联的受体49或G-蛋白质偶联的受体67；McDonald T.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.247：266-270(1998)))；S1P受体(鞘氨醇1-磷酸受体，也称为内皮分化G-蛋白质偶联的受体，例如S1P1，S1P2，S1P3，S1P4，S1P5；Hla T.and Maciag T.J.Biol.Chem.265：9308-9313(1990))；血管再生术因子受体(例如TIE2(促血管新生蛋白因子-1受体，TEK，被膜内内皮细胞激酶，p140TEK或CD202b；Ziegler S.F.etal.，Oncogene 8：663-670(1993)))；膜结合粘液素(例如MUC1(也称为PEM，PEMT，Episialin，EMA，H23AG，PUM或CD227；Lan M.S.et al.，J.Biol.Chem.265：15294-15299(1990))，MUC2(也称为肠粘液素-2；Gum J.R.Jr.et.al.，J.Biol.Chem.269：2440-2446(1994))，MUC3(也称为肠粘液素-3；Hillier L.W.etal.，Nature 424：157-164(2003))，MUC4(也称为胰腺癌粘液素，肠粘液素，ASGP或气管支气管粘液素；Moniaux N.et al.，Eur.J.Biochem.267：4536-4544(2000))，MUC5AC(也称为TBM，大气道糖蛋白，胃粘液素或LeB；Escande F.et al.，Biochem.J.358：763-772(2001))，以及MUC 16(也称为CA-125；O′Brien T.J.et al.，Tumor Biol.23：154-169(2002)))；肿瘤标志物(例如内皮唾液酸蛋白质(也称为肿瘤内皮标志物1或CD248；C型凝集素样蛋白质；St Croix B.et al.，Science 289：1197-1202(2000)))；PSMA(前列腺特异性膜抗原，也称为PSA，激肽释放酶-3，Semenogelase，精囊素或P-30抗原；Lundwall A.and Lilja H.FEBS Lett.214：317-322(1987))；TAG-72(肿瘤相关的糖蛋白72；在许多癌细胞表面上发现的蛋白质/糖络合物，包括乳腺、结肠和胰腺细胞；Alles A.J.et al.，Ann Surg.219(2)：131-134(1994))；KIM-1(肾损伤分子-1，也称为T细胞免疫球蛋白和包含粘液素的分子(Tim-1)或肝炎A病毒细胞受体1(HAVCR1)；Feigelstock D.et al.，J.Virol.72：6621-6628(1998))；黑素瘤上的细胞表面标志物(MART-1(T细胞1所识别的黑素瘤抗原，也称为Melan-A蛋白质，抗原SK29-AA或抗原LB39-AA；Kawakami Y.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：3515-3519(1994)))；gp100(黑素细胞系特异性的抗原GP100，也称为黑素细胞蛋白质Pmel 17，Silver基因座蛋白质同系物，ME20-M，ME20-S或95kDa黑素细胞特异性分泌的糖蛋白；Adema G.J.et al.，J.Biol.Chem.269：20126-20133(1994))；TRP-1(酪氨酸酶相关的蛋白质1，也称为DHICA氧化酶，过氧化氢酶B，糖蛋白75或黑素瘤抗原gp75；Cohen T.et al.，Nucleic Acids Res.18：2807-2807(1990))；TRP-2(酪氨酸酶相关的蛋白质2，也称为DCT，DT或L-多巴色素δ异构酶；Yokoyama K.et al.，Biochim.Biophys.Acta 1217：317-321(1994))；或者热激蛋白(例如GRP78(78kDa葡萄糖调节的蛋白质，也称为热激70kDa蛋白质5，BiP或内质网腔Ca(2+)-结合蛋白质grp78；Corrigall V.M.et al.，J.Immunol.166：1492-1498(2001)))。
所述的融合物蛋白质可以另外包括将所述的第一部分(例如所述的LIGHT部分)与所述的第二部分(例如所述的靶向部分)连接的连接体序列。所述的连接基团可以为对本领域的技术人员而言显而易见的任何连接基团。例如，所述的融合物蛋白质可以包括肽连接体，例如长度为大约5至50个氨基酸、更优选的是10至35个氨基酸、或者15至33个氨基酸的肽连接体；所述的肽连接体的长度为大约20、28或33个氨基酸。所述的肽连接体中的每一个氨基酸选自：Gly，Ser，Asn，Thr和Ala；所述的肽连接体包括Gly-Ser元件。在其他实施方案中，所述的融合物蛋白质包括肽连接体，并且该肽连接体包括具有式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)y的序列，其中y为1，2，3，4，5，6，7或8(SEQ ID NO：149)。在一个实施方案中，所述的连接基团包括或由聚甘氨酸，聚丝氨酸，聚赖氨酸，聚谷氨酰胺，聚异亮氨酸，聚精氨酸残基或它们的组合构成。例如，所述的聚甘氨酸或聚丝氨酸连接体可以包括具有以下构造(Gly)4-Ser(SEQ ID NO：145)的、1个、2个、3个、4个、5个或多个重复(例如4个重复的(Gly)4-Ser(SEQ ID NO：134))的至少5个、10个、15个或20个甘氨酸和丝氨酸残基。在其他实施方案中，连接基团可以包括得自LIGHT细胞外结构域或其突变形式(例如得自人LIGHT同种型1的大约氨基酸61至92(SEQ ID NO：1)，具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约氨基酸225至252(pBIIB71F10-130)(SEQ ID NO：2)，具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约氨基酸230至257(pBIIB71F10-131)(SEQ ID NO：3)，或与其基本一致的氨基酸序列；或者由核苷酸序列所编码的氨基酸序列，其中所述的核苷酸序列得自：人LIGHT同种型1的大约核苷酸181至276(SEQ ID NO：5)，具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约核苷酸673至756(pBIIB71F10-130)(SEQ ID NO：6)，具有G4Sδ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约核苷酸688至771(pBIIB71F10-131)(SEQ ID NO：7)，或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列))的一个或多个氨基酸残基(例如至少10至35个、15至30个或者大约20至26个氨基酸残基)。备选地，所述的连接基团可以包括一个或多个(Gly)4-Ser(SEQ ID NO：146)重复与选自LIGHT的细胞外结构域或其突变形式(例如得自人LIGHT同种型1的大约氨基酸61至92(SEQ ID NO：1)，具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约氨基酸225至252(pBIIB71F10-130)(SEQ ID NO：2)，具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约氨基酸230至257(pBIIB71F10-131)(SEQ ID NO：3)，或与其基本一致的氨基酸序列；或者由核苷酸序列所编码的氨基酸序列，其中所述的核苷酸序列得自：人LIGHT同种型1的大约核苷酸181至276(SEQ ID NO：5)，具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约核苷酸673至756(pBIIB71F10-130)(SEQ IDNO：6)，具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的大约核苷酸688至771(pBIIB71F10-131)(SEQ ID NO：7)，或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列))的一个或多个氨基酸残基(例如至少10至35个、15至30个或者大约20至26个氨基酸残基)的组合。
具有δ4连接体(pBIIB71F10-130)的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的氨基酸和核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2和6所示。与71F10Fab的重链相应的氨基酸和核苷酸序列显示为由N末端开始；然后为与所述的连接基团(大约氨基酸225至252)相应的氨基酸；然后为与人LIGHT细胞外结构域(氨基酸253至400)相应的氨基酸。71F10Fab-Δ4huLIGHT的物理和化学参数如下：消光系数＝1.62；pI＝8.7；MW＝66kDa(x3＝198kDa)；AA数＝614。
具有G4S(SEQ ID NO：147)δ4连接体(pBIIB71F10-131)的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的氨基酸和核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和7所示。与71F10Fab的重链相应的氨基酸和核苷酸序列显示为由N末端开始；然后为与所述的连接基团(大约氨基酸225至257)相应的氨基酸；然后为与人LIGHT细胞外结构域(氨基酸258至405)相应的氨基酸。71F10Fab-G4S-Δ4huLIGHT的物理和化学参数如下：消光系数＝1.61；pI＝8.7；MW＝66kDa(x3＝198kDa)；AA数＝619。
具有(G4S)4(SEQ ID NO：134)连接体(pBIIB71F10-132)的71F10Fab-hLIGHT融合物重链的氨基酸和核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4和8所示。与71F10Fab的重链相应的氨基酸和核苷酸序列显示为由N末端开始；然后为与所述的连接基团(大约氨基酸225至244)相应的氨基酸；然后为与人LIGHT细胞外结构域(氨基酸245至392)相应的氨基酸。71F10Fab-(G4S)4-Δ4huLIGHT的物理和化学参数如下：消光系数＝1.5；pI＝8.7；MW＝64kDa(x3＝198kDa)；AA数＝606。
在其他实施方案中，其他氨基酸序列可以加入到所述的融合物蛋白质的N或C末端，从而有利于表达、检测和/或分离或纯化。例如，融合物蛋白质可以与一个或多个其他部分(例如GST，His6标记(SEQ ID NO：150)，FLAG标记)连接。例如，所述的融合物蛋白质可以另外与GST融合物蛋白质连接，其中所述的融合物蛋白质序列与GST(即，谷胱甘肽S转移酶)序列的C末端融合。这种融合物蛋白质可以有利于该融合物蛋白质的纯化。
在另一个实施方案中，所述的融合物蛋白质在其N末端包括异源信号序列(即，在由LIGHT核酸所编码的多肽中不存在的多肽序列)。例如，可以除去天然LIGHT信号序列，并用替换为得自另一种蛋白质的信号序列。在某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，融合物蛋白质的表达和/或分泌可以通过使用异源信号序列二增强。可以通过标准的重组DNA技术(例如参见Ausubel et al.(eds.)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，1992)来生产本发明的融合物蛋白质。此外，编码融合物部分的(例如免疫球蛋白重链的Fc区)许多表达载体是市售可得的。可以将核酸克隆岛所述的表达载体中，使得所述的融合物部分与所述的免疫球蛋白蛋白质同框连接。
在一些实施方案中，融合物多肽以低聚物(例如单个临近多肽的二聚体或三聚体、或者两个或多个非临近的多肽)的形式存在。
在其他实施方案中，所述的LIGHT或所述的靶向部分在天然形成的序列(野生型)中以具有突变的变体多肽的形式提供，从而得到一个或多个亲和性更高的结合、增强的稳定性(例如对蛋白水解更具有抗性(相对于非突变的序列))等。
在其他实施方案中，其他的氨基酸序列可以加入到所述的融合物蛋白质的N或C末端，从而有利于表达、空间挠性、检测和/或分离或纯化。所述的第二多肽优选为可溶性的。在一些实施方案中，所述的第二多肽增加了所述连接多肽的半衰期(例如血清半衰期)。在一些实施方案中，所述的第二多肽包括有利于所述的融合物多肽与第二多肽结合的序列。在一些实施方案中，所述的第二多肽包括免疫球蛋白多肽的至少一个区。免疫球蛋白融合物多肽是本领域已知的，并且在例如美国专利No.5,516,964；5,225,538；5,428,130；5,514,582；5,714,147和5,455,165中所有描述。
应该理解的是，本文所述的抗体分子和可溶性LIGHT或融合物蛋白质可以与一种或多种其他的分子实体(例如抗体(例如双特异性或多特异性抗体)、毒素、放射性同位素、细胞毒素或细胞生长抑制剂等)功能性地连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合等)。
示例性的LIGHT靶向分子包括LIGHT/HER2融合物，例如本文所述的LIGHT/HER2融合物。LIGHT/HER2融合物包括或基本上由以下任何一者所示的氨基酸序列构成，其中所述的氨基酸为：具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-130)(SEQ ID NO：2)，具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-131)(SEQ ID NO：3)，具有(G4S)4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-132)(SEQ IDNO：4)，或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；由以下任何一者所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，其中所述的核苷酸序列为：具有δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-130)(SEQ ID NO：6)，具有G4S δ4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-131)(SEQ ID NO：7)，具有(G4S)4连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB71F10-132)(SEQ ID NO：8)，或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。在某些实施方案中，所述的LIGHT/HER2融合物还可以包括或基本上由第二条链(与之前所述的链融合或结合)构成，其中所述的第二条链包括或基本上由以下所示的氨基酸序列构成，其中所述的氨基酸序列为：SEQ ID NO：109，或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；由SEQ ID NO：110或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)的任何一者所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
在另一个示例性实施方案中，所述的LIGHT靶向分子包括哺乳动物(例如人)LIGHT蛋白质或其功能变体或片段、及与CD23结合的抗体分子构成的至少一个融合分子(本文中称为“LIGHT-抗CD23融合物”)。在一个实施方案中，所述的LIGHT-抗CD23融合物包括或基本上由以下的任何一者所示的氨基酸序列构成，其中所述的氨基酸序列为：具有(G3S)3或(G4S)4连接体的抗CD23Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB CD23-204)(SEQ ID NO：101或174)，或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；由以下任何一者所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，其中所述的核苷酸序列为：具有(G3S)3或(G4S)4连接体的抗CD23Fab-hLIGHT融合物重链(pBIIB CD23-204)(SEQ ID NO：102或173)，或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。在某些实施方案中，所述的LIGHT/CD23融合物还可以包括或基本上由第二条链(与之前所述的链融合或结合)构成，其中所述的第二条链包括或基本上由以下所示的氨基酸序列构成，其中所述的氨基酸序列为：抗CD23Fab-hLIGHT融合物轻链(SEQ ID NO：103)，或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；由以下任何一者所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，其中所述的核苷酸序列为：抗CD23Fab-hLIGHT融合物轻链(SEQ ID NO：104)，或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。
在另一个示例性实施方案中，所述的LIGHT靶向分子包括哺乳动物(例如人)LIGHT蛋白质或其功能变体或片段、及与胰岛素生长因子受体结合的抗体分子构成的至少一个融合分子(本文中称为“LIGHT-抗IGFR Fab融合物”)。在一个实施方案中，所述的LIGHT-抗IGFR Fab融合物包括或基本上由以下的任何一者所示的氨基酸序列构成，其中所述的氨基酸序列为：具有(G4S)4连接体的抗IGFR Fab-hLIGHT融合物重链，或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；由以下任何一者所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，其中所述的核苷酸序列为：具有(G4S)4连接体的抗IGFR Fab-hLIGHT融合物重链(BIIB C06-117)(SEQ ID NO：162)，或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。在某些实施方案中，所述的LIGHT/IGFR融合物还可以包括或基本上由第二条链(与之前所述的链融合或结合)构成，其中所述的第二条链包括或基本上由以下所示的氨基酸序列构成，其中所述的氨基酸序列为：SEQ ID NO：168，或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)；由以下任何一者所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，其中所述的核苷酸序列为：抗IGFRFab-hLIGHT融合物轻链(SEQ ID NO：167)，或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)。
抗体分子
在某些实施方案中，所述的靶向部分为对抗所选的过度增殖(例如过度增殖(例如癌症)的细胞或组织)的细胞表面蛋白质的抗体分子，使得所述的LIGHT部分诱导出对抗所需位点(例如过度增殖(例如癌症)的细胞或组织)的一种或多种LIGHT相关的活性(例如本文所述的一种或多种LIGHT相关的活性)。在其他实施方案中，公开了对抗HER2的新型抗体分子。可以使用所述的靶向部分靶向的示例性过度增殖(例如癌症)的细胞或组织包括但不限于乳腺、肺、胃、卵巢、前列腺、胰腺、结肠、结肠直肠、肾、膀胱、肝脏、头、颈部、脑以及软组织恶性(包括淋巴恶性癌症、白血病和骨髓瘤)的癌症或实体肿瘤。所述的靶向部分可以在本文所述的一种或多种过度增殖的细胞或组织上表达的一种或多种细胞表面蛋白质结合。例如，所述的靶向部分(例如本文所述的抗体分子)可以与生长因子受体(例如HER-2/neu，HER3，HER4，表皮生长因子受体(EGFR)，胰岛素生长因子受体(IGFR)，Met，Ron，Cripto)、癌症相关的整合素和整合素受体(例如αvβ6，α6β4，层粘连蛋白受体(LAMR)和/或CD23，CD20，CD16，EpCAM和/或Tweak受体(FN14))中的一种或多种结合。所选的每一种靶物都在本文中有更详细的描述。
在一个实施方案中，所述的抗体分子与HER2多肽(例如与HER2上的线性或构造抗原决定部位，其中所述的抗原决定部位选自：抗原决定部位D1，抗原决定部位D2，抗原决定部位D3，抗原决定部位D4或它们的组合，例如抗原决定部位D1-D2或抗原决定部位D1-D3)结合。在其他特定的实施方案中，所述的抗体分子与CD23或IGFR结合。
在一个实施方案中，所述的抗体分子与HER2结合，并且为抗体分子或得自抗体的Fab片段，其中所述的抗体选自：BIIB71F10(SEQ ID NO：11-14)，BIIB69A09(SEQ ID NO：15-18)，BIIB67F 10(SEQ ID NO：19-22)，BIIB67F 11(SEQ ID NO：23-26)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27-30)，BIIB66C01(SEQ IDNO：31-33)，BIIB65C10(SEQ ID NO：34-38)，BIIB65H09(SEQ ID NO：39-42)，BIIB65B03(SEQ ID NO：43-46)(本文中也称为71F10，69A09，67F10，67F11，67F12，66A12，66C01，65C10，65H09和65B03)，或者由PTA-10355、PTA-10356、PTA-10357或PTA-10358所表达的抗体分子。在其他实施方案中，所述的抗HER2抗体分子具有与抗体分子或得自抗体的Fab片段相当的功能活性，其中所述的抗体选自：BIIB71F10，BIIB69A09，BIIB67F10，BIIB67F11，BIIB66A12，BIIB66C01，BIIB65C10，BIIB65H09，BIIB65B03，或者由PTA-10355、PTA-10356、PTA-10357或PTA-10358所表达的抗体分子。所述的抗HER2抗体分子能够与得自一个或多个物种(选自人、小鼠、大鼠或犬起源)的HER2交联反应。
所述的抗HER2抗体分子能够以一定的EC50与HER2结合，其中所述的EC50的范围为大约1至120nM、大约1至100nM、大约1至80nM、大约1至70nM、大约1至60nM、大约1至40nM、大约1至30nM、大约1至20nM、大约1至15nM、大约1至12nM、大约1至5nM、大约1至2nM、或者大约1至1nM。在其他实施方案中，所述的抗HER2抗体分子抑制或减少了一种或多种HER2相关的生物学活性，其IC50为大约50nM至5pM、通常为大约100至250pM或更低(例如更好的抑制的情况下)。例如，所述的抗HER2抗体分子可以以IC50为大约50nM至5pM、通常为大约100至250pM或更低(例如更好的抑制的情况下)来抑制、阻断或减少HER2的信号传递(例如抑制、阻断或减少HER2、AKT和/或MAP激酶中的一种或多种的磷酸化；或抑制、阻断或减少HER2的同源二聚化，或者HER2与HER3、和/或HER2与EGFR的异源二聚化；以较低的动力学进行内化，估计所述的动力学低于或等于对照抗HER2抗体的内化速率，该速率在SKBR-3细胞中为8e-6s-1而在BT-474细胞中为2.1e-5s-1；在体外(例如MCF7和SKBR-3细胞)和体内抑制表达HER2的细胞的活性和/或诱导细胞的杀死)。在一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子以0.1-100nM的kD与人HER2结合。在另一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子的解离动力学范围为10-2至10-6s-1、通常为10-2至10-5s-1。在一个实施方案中，所述的抗HER2抗体分子以近似于单克隆抗体的亲和性和/或动力学(例如在因数20、10或5的范围内)而与HER2(例如人HER2)结合，其中所述的单克隆抗体选自：BIIB71F10，BIIB69A09，BIIB67F10，BIIB67F11，BIIB66A12，BIIB66C01，BIIB65C10，BIIB65H09，BIIB65B03，或者由PTA-10355、PTA-10356、PTA-10357或PTA-10358所表达的抗体分子。可以使用(例如)生物传感器技术(BIACORETM)来测试所述的抗HER2抗体分子的亲和性和结合动力学。
如本文所用，术语“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质。术语抗体分子包括(例如)全长、成熟的抗体以及抗体的抗原结合片段。例如，抗体分子可以包括重(H)链可变结构域序列(简称为VH)，和轻(L)链可变结构域序列(简称为VL)。在另一个实例中，抗体分子包括两条重(H)链可变结构域序列，和两条轻(L)链可变结构域序列，由此形成两个抗原结合位点，例如Fab，Fab’，F(ab’)2，Fc，Fd，Fd’，Fv，单链抗体(例如scFv)，单个可变结构域抗体，双体(Dab)(二价和双特异性)以及嵌合(例如人源化的)抗体，这些抗体可以通过完整抗体的修饰而产生或者使用重组DNA技术重新合成的那些。这些功能抗体片段保留了选择性地结合它们各自的抗原或受体的能力。抗体或抗体片段可以得自任何种类的抗体，包括但不限于IgG，IgA，IgM，IgD和IgE；并且得自任何亚类的抗体(例如IgG1，IgG2，IgG3和IgG4)。本发明的抗体可以为单克隆的或多克隆的。所述的抗体还可以为人、人源化的、CDR移植的或者是体外生成的抗体。所述的抗体可以具有选自(例如)IgG1，IgG2，IgG3或IgG4中的重链恒定区。所述的抗体还可以具有选自(例如)κ或λ的轻链。
抗原结合片段的实例包括：(i)Fab片段，其为VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，其包括在铰链区通过二硫键连接的两条Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域构成的Fv片段；(v)双体(dAb)片段，其由VH结构域构成；(vi)骆驼或骆驼化的可变结构域；(vii)单链Fv(scFv)，例如参见Bird et al.(1988)Science 242：423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；(viii)单链结构域抗体。这些抗体片段是使用本领域的技术人员已知的常规技术获得的，并且可以按照与完整抗体相同的使用方式来筛选所述的片段。
在一些实施方案中，所述的抗体分子为单克隆或单特异性抗体，或者与过度增殖的细胞表面蛋白质(例如哺乳动物(如人)过度增殖的细胞表面蛋白质(或其功能变体))结合的抗原结合片段(例如Fab，F(ab′)2，Fv，单链Fv片段或骆驼变体)。在一些实施方案中，所述的抗体分子与位于过度增殖的细胞表面蛋白质(例如本文所述的过度增殖的细胞表面蛋白质)的细胞外结构域上的一个或多个抗原决定部位结合。通常，所述的抗体分子为人的、人源化的、嵌合的、骆驼的或体外生成的针对人过度增殖的细胞表面蛋白质的抗体(或其功能片段)。通常，所述的抗体抑制、降低或中和过度增殖的细胞表面蛋白质的一种或多种活性(例如本文所述的HER2的一种或多种生物学活性)。
本发明的抗体还可以为单结构域抗体。单结构域抗体可以包括其互补性决定区为单结构域的多肽的一部分的抗体。除了衍生自抗体的那些以为，所述的单结构域抗体的实例包括但不限于重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、衍生自传统的4链抗体的单结构域抗体、基因工程的抗体以及单结构域支架。单结构域抗体可以为本领域的任何抗体、或者为任何其他的单结构域抗体。单结构域抗体可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、兔子和牛。根据本发明的另一个方面，单结构域抗体为天然形成的单结构域抗体(已知缺乏轻链的重链抗体)。例如，这种单结构域抗体在WO 9404678中有所公开。为了清楚起见，已知本文中所述的衍生自天然缺乏轻链的重链抗体为能够区别于4链免疫球蛋白的传统的VH的VHH或纳米抗体。这种VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和骆马)中产生的抗体。除了骆驼科以外的其他物种可以产生天然缺乏轻链的重链抗体；这种VHH在本发明的范围内。
本发明的抗体还可以为亲和体分子支架，例如在Lee et al.(2008)ClinCancer Res 14(12)：3840-3849；Ahlgren et al.(2009)J.Nucl.Med.50：781-789中所述的那些。
如本文所用，“免疫球蛋白可变结构域序列”是指能够形成免疫球蛋白可变结构域的结构的氨基酸序列。例如，所述的序列可以包括全部的或部分的天然形成的可变结构域的氨基酸序列。例如，所述的序列可以包括或不包括1个、2个或多个N或C末端氨基酸，或者可以包括与所形成的蛋白质结构相容的其他改变。
术语“抗原结合位点”是指抗体分子的一部分，该部分包括形成与抗原(例如HER2或其抗原决定部位)结合的界面的决定区。就蛋白质(或者蛋白质拟物)而言，所述的抗原结合位点通常包括形成与抗原(例如HER2或其抗原决定部位)结合的界面的一个或多个环(至少4个氨基酸或氨基酸拟物)。通常，抗体分子的抗原结合位点包括至少1个或2个CDR，或者更通常的是包括至少3个、4个、5个或6个CDR。
术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体的成分”如本文所用是指单一分子成分的抗体分子的制备物。单克隆抗体成分表现出针对特定抗原决定部位的单一结合特异性和亲和性。单克隆抗体可以通过杂交瘤技术或者通过不使用杂交瘤技术的方法(例如重组方法)制备得到。
如上文所述，所述的可变区使得抗体能够选择性地识别并特异性地结合抗原上的抗原决定部位。即，抗体的VL结构域和VH结构域、或者互补性决定区(CDR)的子集会结合从而形成定义了三维抗原结合位点的可变区。这种四级抗体结构形成了存在于Y型各臂末端的抗原结合位点。更具体而言，所述的抗原结合位点是通过各VH和VL链上的3个CDR定义的。在一些情况(例如衍生自骆驼物种或者根据骆驼的免疫球蛋白经基因工程改造的某些免疫球蛋白分子)下，完整的免疫球蛋白分子可以由不具有轻链、单具有的重链构成。例如参见Hamers-Casterman et al.，Nature 363：446-448(1993)。
在天然形成的抗体中，存在于各抗原结合结构域中的6个“互补性决定区”或“CDR”为氨基酸的短的且非临近的序列，当抗体在水性环境中采取其三维构造时，所述的序列特异性地定位从而形成抗原结合结构域。抗原结合结构域中剩余的氨基酸(称为“构架”区)显示出较低的分子内变化性。构架区主要采用β片构造，并且CDR形成了连接β片结构(在某些情况下形成了β片结构的一部分)的环。因此，构架区起到了形成支架的作用，其中所述的支架提供用于通过链内非共价的相互作用来以正确方向定位CDR。通过定位的CDR而形成的抗原结合结构域定义了与免疫反应性抗原上的抗原决定部位互补的表面。该互补的表面促进了抗体与其同源的抗原决定部位的非共价结合。涵盖特定的CDR的确切残基的数量将随着CDR的序列和尺寸而变化。对于任何给定的重链或轻链可变区而言，本领域的普通技术人员可以容易地识别分别包含CDR和构架区的氨基酸，这是因为这些氨基酸已经被精确地定义(参见″Sequences of Proteins of Immunological Interest，″Kabat，E.，et al.，U.S.Department of Health and Human Services，(1983)；和Chothiaand Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)，该文献以引用方式全文并入本文)。
本发明的抗体或抗原结合片段、或其变体、衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人、人源的、灵长动物源的或嵌合的抗体，单链抗体，抗原决定部位结合片段，例如Fab，Fab’，F(ab’)2，Fd，Fvs，单链抗体Fvs(scFv)，单链抗体，二硫化物连接的Fvs(sdFv)，包含VL或VH结构域的片段，通过Fab表达文库产生的片段，以及抗独特型(抗Id)抗体(包括(例如)针对本文所公开的抗体的抗Id抗体)。scFv分子是本领域已知的，并且在例如美国专利No.5,892,019中有所描述。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以为任何种类(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)、免疫球蛋白分子的类型(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。
抗体片段(包括单链抗体)可以包括单独的可变区，或者与以下所述部分的整体或一部分的组合，其中所述的部分为：铰链区，CH1，CH2和CH3结构域。本发明还包括具有可变区与铰链区，CH1，CH2和CH3结构域的任何组合的抗原结合片段。本发明的抗体或其免疫特异性片段可以得自任何动物起源，包括鸟和哺乳动物。所述的抗体可以为人，鼠科，驴，兔，山羊，天竺鼠，骆驼，美洲驼，马或鸡的抗体。在另一个实施方案中，所述的可变区可以为condricthoid来源(例如得自鲨鱼)。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括由人免疫球蛋白文库或者动物(其针对一种或多种人免疫球蛋白而形成转基因的，并且不会表达内生免疫球蛋白，如下文所述，并且例如Kucherlapati et al.的美国专利No.5,939,598)分离得到的抗体。
如本文所用，术语“重链部分”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包括重链部分的多肽至少包括以下中的一者：CH1结构域、铰链(例如铰链区的上部、中部和/或下部)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体或片段。在本文所公开的某些抗体分子中，多聚体的一条多肽链的重链部分与该多聚体的第二条多肽链上的重链部分一致。备选地，本发明的包含重链部分的单体是不一致的。例如，各个单体可以包括不同的靶物结合位点，例如双特异性抗体。用于本文所公开的诊断和治疗方法中的结合多肽的重链部分可以衍生自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可以包括衍生自IgG1分子的CH1结构域以及衍生自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可以包括部分衍生自IgG1分子、以及部分衍生自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中个，重链部分可以包括部分衍生自IgG1分子、以及部分衍生自IgG4分子的嵌合铰链。
如本文所用，术语“轻链部分”包括衍生自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选的是，所述的轻链部分包括VL或CL结构域中的至少一者。
可以在抗原的抗原决定部位或部分方面来描述或说明本文所公开的抗体分子，其中所述的抗原例如为抗体分子所识别或特异性结合的靶物多肽(例如HER2、CD23)。与抗体的抗原结合结构域特异性地相互作用的靶物多肽的部分为“抗原决定部位”或“抗原决定簇”。根据抗原的尺寸、构造和种类，靶物多肽可以包括单一的抗原决定部位，但是通常包括至少两个抗原决定部位，并且可以包括任何数量的抗原决定部位。此外，应该注意的是，靶物多肽上的“抗原决定部位”可以为或包括非多肽的元件，例如“抗原决定部位”可以包括碳水化合物的侧链。认为，针对抗体的肽或多肽的抗原决定部位的最小尺寸为大约4至5个氨基酸。肽或多肽的抗原决定部位优选的是包括至少7个、更优选的是至少9个并且最优选的是至少15至大约30个氨基酸。由于CDR可以以其三级形式来识别抗原肽或多肽，所以包括抗原决定部位的氨基酸无需是临近的，并且在有些情况下，甚至可以不在同一肽链上。在本发明中，由本发明的抗体所识别的肽或多肽的抗原决定部位包括至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、更优选的是至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、或者大约15至大约30个临近的或非临近的氨基酸的序列。
“特异性结合”通常是指抗体通过其抗原结合结构域而与抗原决定部位结合，并且所述的结合需要抗原结合结构域与抗原决定部位之间具有一定的互补性。根据所述的定义，当抗体通过其抗原结合结构域而与抗原决定部位结合时，认为该抗体与抗原决定部位“特异性地结合”，这种结合要比抗体与随意且无关的抗原决定部位的结合更容易。术语“特异性”在本文中用于定性相对的亲和性，通过该亲和性，偶写抗体与某些抗原决定部位结合。
“优先结合”是指抗体与抗原决定部位特异性地结合要比它与无关的、相似的、同源的或类似的抗原决定部位的结合更容易。因此，与给定抗原决定部位“优先结合”的抗体比相关的抗原决定部位更可能结合所述的抗原决定部位，但是所述的抗体可以与相关的抗原决定部位交叉反应。
例如非限定性的实例，如果抗体以一定的解离常数(KD)与第一抗原决定部位结合，而所述的解离常数低于该抗体针对第二抗原决定部位的KD，则认为该抗体优先与第一抗原决定部位结合。在另一个非限定性实例中，如果抗体以一定的亲和性与第一抗原决定部位结合，而所述的亲和性低于该抗体针对第二抗原决定部位的KD的至少一个数量级，则认为该抗体优先与第一抗原结合。在另一个非限定性的实例中，如果抗体以一定的亲和性与第一抗原决定部位结合，而所述的亲和性低于该抗体针对第二抗原决定部位的KD的至少两个数量级，则认为该抗体优先与第一抗原决定部位结合。
在另一个非限定性实例中，如果抗体分子以一定的解离速率(k(off))与第一抗原决定部位结合，而所述的解离速率低于该抗体针对第二抗原决定部位的k(off)，则认为该抗体分子优先与第一抗原决定部位结合。在另一个非限定性实例中，如果抗体以一定的亲和性与第一抗原决定部位结合，而所述的亲和性低于该抗体针对第二抗原决定部位的k(off)的至少一个数量级，则认为该抗体优先与第一抗原决定部位结合。在另一个非限定性实例中，如果抗体以一定的亲和性与第一抗原决定部位结合，而所述的亲和性低于该抗体针对第二抗原决定部位的k(off)的至少两个数量级，则认为该抗体分子优先与第一抗原决定部位结合。
据信，本文所公开的抗体分子可以以一定的解离速率(k(off))与本文所公开的靶物多肽或其片段或变体结合，其中所述的解离速率低于或等于5×10-2sec-1，10-2sec-1，5×10-3sec-1或10-3sec-1。更优选的是，据信，本文所公开的抗体可以以一定的解离速率(k(off))与本文所公开的靶物多肽或其片段或变体结合，其中所述的解离速率低于或等于5×10-4sec-1，10-4sec-1，5×10-5sec-1，10-5sec-1，5×10-6sec-1，10-6sec1，5×10-7sec-1或10-7sec-1。
据信，本文所公开的抗体分子可以以一定的结合速率(k(on))与本文所公开的靶物多肽或其片段或变体结合，其中所述的解离速率高于或等于103M-1sec-1，5×103M-1sec-1，104M-1sec-1或5×104M-1sec-1。据信，本发明的抗体分子可以以一定的结合速率(k(on))与本文所公开的靶物多肽或其片段或变体结合，其中所述的解离速率高于或等于105M-1sec-1，5×105M-1sec-1，106M-1sec-1，5×106M-1sec-1或107M-1sec-1。
如果抗体分子优先地与给定抗原决定部位结合的程度达到其可以在一定程度上阻断参照抗体与所述抗原决定部位的结合，则认为该抗体分子竞争性地抑制参照抗体与所述抗原决定部位的结合。可以通过本领域已知的任何方法(例如竞争ELISA测试)来测定竞争性抑制。据信，抗体可以竞争性地抑制参照抗体与给定抗原决定部位的结合达到至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或者至少50％。
如本文所用，术语“亲和性”是指单个的抗原决定部位与免疫球蛋白分子的CDR的结合强度的量度。例如参见Harlow et al.，Antibodies：A LaboratoryManual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)页码27-28。如本文所用，术语“亲和力”是指免疫球蛋白群体与抗原之间形成的络合物的整体稳定性，即，免疫球蛋白混合物与抗原的功能结合强度。例如参见Harlow页码29-34。亲和力与所述群体中的个体免疫球蛋白分子与特定的抗原决定部位的亲和性、以及所述的免疫球蛋白与所述的抗原的化合价有关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复的抗原决定部位结构(例如聚合物)的抗原之间的相互作用可以为一种高亲和力。
此外，还可以在抗体分子的交叉反应性方面对本发明的抗体分子进行描述或说明。如本文所用，术语“交叉反应性”是指对一种抗原具有特异性的抗体与第二种抗原的发生反应的能力；其为两种不同抗原物质之间的关系的量度。因此，如果抗体与除了诱导其形成的抗原决定部位以外的抗原决定部位结合，则该抗体是交叉反应的。所述的交叉反应的抗原决定部位通常包含与起诱导作用的抗原决定部位相同的许多互补结构特征，并且在某些情况下，事实上可能比起始的抗原决定部位更适合。例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，这是因为他们结合了相关的但并非一致的抗原决定部位，例如与参照抗原决定部位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、以及至少50％一致性(按照本领域已知的方法计算得到，并且在本文中有所描述)的抗原决定部位。如果抗体不能结合与参照抗原决定部位具有低于95％、低于90％、低于85％、低于80％、低于75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％、以及低于50％一致性(按照本领域已知的方法计算得到，并且在本文中有所描述)的抗原决定部位，则可以认为所述的抗体具有较小的或不具有交叉反应性。如果抗体不能与抗原决定部位的任何其他类似物、同系物或同源物结合，则可以认为所述的抗原对某种抗原决定部位是“高度特异性的”。
此外，在本发明的抗体分子对本发明的多肽的结合亲和性方面对该抗体分子进行描述或说明。典型的结合亲和性包括解离常数或Kd低于5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M或10-15M的那些。
本发明的抗体分子可以是“多特异性的”，例如双特异性、三特异性或更高的多特异性，其是指所述的抗体能够同时识别并结合在一种或多种不同的抗原(例如蛋白质)上存在的两个或多个不同的抗原决定部位。因此，不管抗体分子是“单特异性的”或“多特异性的”，例如“双特异性”是指结合多肽与其发生反应的不同抗原决定部位的数量。多特异性抗体可以对本文所述的靶物多肽的不同的抗原决定部位是特异性的，并且可以对靶物多肽以及异源抗原决定部位(例如异源多肽或固体支撑材料)是特异性的。
如本文所用，术语“化合价”是指在抗体、结合多肽或结合抗体中存在的有效结合结构域(例如抗原结合结构域)的数量。各个结合结构域特异性地结合一个抗原决定部位。当抗体、结合多肽或结合抗体包括多于一个的结合结构域时，各结合结构域可以特异性地结合相同的抗原决定部位(对于具有两个结合结构域的抗体而言，称为“二价单特异性的”)或者特异性地结合不同的抗原决定部位(对于具有两个结合结构域的抗体而言，称为“二价双特异性的”)。对于各特异性而言，抗体还可以是双特异性且二价的(称为“双特异性四价抗体”)。在另一个实施方案中，可以制得四价微型抗体或删除了结构域的抗体。
双特异性二价抗体及其制备方法在例如美国专利No.5,731,168；5,807,706；5,821,333；以及美国申请公开No.2003/020734和2002/0155537中有所描述，其中所述的所有公开文献均以引用方式并入本文。双特异性四价抗体及其制备方法在例如WO 02/096948和WO 00/44788中有所描述，其中所述的文献的公开内容以引用方式并入本文。通常参见PCT公开WO93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt et al.，J.Immunol.147：60-69(1991)；U.S.Pat.Nos.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny et al.，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。
所述的抗体分子可以是多克隆的或单克隆的抗体。在其他实施方案中，所述的抗体可以是以重组方式产生的，例如通过噬菌体展示或通过组合方法产生。用于生成抗体的噬菌体展示和组合方法是本领域已知的(例如在Ladner et al.美国专利No.5,223,409；Kang et al.国际公开No.WO 92/18619；Dower et al.国际公开No.WO 91/17271；Winter et al.国际公开WO 92/20791；Markland et al.国际公开No.WO 92/15679；Breitling et al.国际公开WO93/01288；McCafferty et al.国际公开No.WO 92/01047；Garrard et al.国际公开No.WO 92/09690；Ladner et al.国际公开No.WO 90/02809；Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay et al.(1992)Hum AntibodHybridomas 3：81-85；Huse et al.(1989)Science 246：1275-1281；Griffths et al.(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins et al.(1992)J Mol Biol 226：889-896；Clackson et al.(1991)Nature 352：624-628；Gram et al.(1992)PNAS89：3576-3580；Garrad et al.(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboomet al.(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137；和Barbas et al.(1991)PNAS88：7978-7982中有所描述，其中所述文献的内容均以引用方式并入本文)。
在一个实施方案中，所述的抗体分子为全人抗体(例如在小鼠中制得的抗体，其中所述的小鼠经过基因工程改造从而产生得自人免疫球蛋白序列的抗体)，或非人抗体(例如啮齿动物(小鼠或大鼠)、山羊、灵长动物(例如猴子)、骆驼的抗体)。优选的是，非人抗体为啮齿动物的抗体(小鼠或大鼠的抗体)。生产啮齿动物的抗体的方法是本领域已知的。可以使用携带有人免疫球蛋白基因、而并非携带小鼠系统的转基因小鼠来生产人单克隆抗体。得自所述的这些转基因小鼠(使用所关注的抗原免疫)的脾细胞用于生产杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞分泌对得自人蛋白质的抗原决定部位具有特异的亲和性的人mAb(例如参见Wood et al.国际申请WO 91/00906，Kucherlapati et al.PCT公开WO 91/10741；Lonberg et al.国际申请WO 92/03918；Kay et al.国际申请92/03917；Lonberg，N.et al.1994Nature 368：856-859；Green，L.L.et al.1994Nature Genet.7：13-21；Morrison，S.L.et al.1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855；Bruggeman et al.1993Year Immunol 7：33-40；Tuaillon et al.1993 PNAS 90：3720-3724；Bruggeman et al.1991 Eur J Immunol21：1323-1326)。
抗体分子可以为其中可变区或其部分(例如CDR)是在非人有机体(例如大鼠或小鼠)中产生的抗体。嵌合抗体、CDR移植的抗体以及人源化的抗体都在本发明的范围内。在非人有机体(例如大鼠或小鼠)中产生的、然后经过修饰的(例如在可变构架或恒定区中)从而降低了在人体中的抗原性的抗体在本发明的范围内。嵌合抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术来生产。例如，使用限制性酶消化编码鼠科(或其他物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因，从而除去编码鼠科Fc的区域，并用编码人Fc恒定区的基因的等价部分取代(参见Robinson et al.，国际专利公开PCT/US86/02269；Akira，et al.，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison et al.，欧洲专利申请173,494；Neuberger et al.，国际申请WO86/01533；Cabilly et al.美国专利No.4,816,567；Cabilly et al.，欧洲专利申请125,023；Better et al.(1988 Science 240：1041-1043)；Liu et al.(1987)PNAS84：3439-3443；Liu et al.，1987，J.Immunol.139：3521-3526；Sun et al.(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura et al.，1987，Canc.Res.47：999-1005；Wood et al.(1985)Nature 314：446-449；和Shaw et al.，1988，J.Natl Cancer Inst.80：1553-1559)。
人源化的或CDR移植的抗体具有被供着CDR替代的至少1个、2个但是通常为所有3个受者(免疫球蛋白的重链或轻链)CDR。所述的抗体可以被非人CDR的至少一部分替代，或者仅仅一些CDR可以被非人CDR替代。仅仅需要替代人源化的抗体结合所需数量的CDR。优选的是，供者为啮齿动物的抗体(例如大鼠或小鼠的抗体)，而受者为人构架或人共有构架。通常，提供CDR的免疫球蛋白被称为“供者”，而提供构架的免疫球蛋白被称为“受者”。在一个实施方案中，供者免疫球蛋白为非人的(啮齿动物)。受者构架为天然形成(例如人)的构架或共有构架或与其具有大约85％或更高、优选为90％，95％，99％或更高一致性的序列。
如本文所用，术语“共有序列”是指由在相关序列家族中最频繁发生的氨基酸(或核苷酸)所形成的序列(例如参见Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987)。在蛋白质家族中，共有序列中的各个位置被所述家族中所述位置处最频繁发生的氨基酸所占据。如果两种氨基酸以相等的频率发生，则共有序列中可以包括任何一者。“共有构架”是指在共有免疫球蛋白序列中的构架区。
抗体分子可以通过本领域已知的方法人源化。人源化的抗体可以通过使用得自人Fv可变区的等价序列来替代并非直接涉及抗原结合的Fv可变区的序列而形成。用于形成人源化的抗体的普通方法由Morrison，S.L.，1985，Science 229：1202-1207，by Oi et al.，1986，BioTechniques 4：214，和Queen et al.US 5,585,089，US 5,693,761和US 5,693,762所提供。人源化的或CDR移植抗体可以通过CDR移植或CDR取代来生产，其中免疫球蛋白链的1个、2个或所有CDR可以被替代。例如参见美国专利5,225,539；Jones et al.1986Nature 321：552-525；Verhoeyan et al.1988Science 239：1534；Beidler et al.1988J.Immunol.141：4053-4060；Winter US 5,225,539，所有这些文献的内容均以引用方式明确地并入本文。Winter描述了可以用于制备本发明的人源化抗体的CDR移植方法(1987年3月26日提交的UK专利申请GB 2188638A；WinterUS 5,225,539)，所述文献的内容以引用方式明确地并入本文。
此外，其中取代、删除或加入特定氨基酸的人源化的抗体也在本发明的范围内。优选的人源化的抗体在构架区具有氨基酸的取代，从而改善了抗原的结合。例如，人源化的抗体具有与供者构架残基、或者除了受者构架残基以外的另一种氨基酸一致的构架残基。为了生成所述的这种抗体，可以通过相应的供者氨基酸来替代人源化免疫球蛋白链的所选的少量受者构架残基。优选的取代位置包括与CDR相邻的氨基酸残基，或者能够与CDR相互作用的氨基酸残基(例如参见US 5,585,089)。用于选择得自供者的氨基酸的标准在US 5,585,089(例如US 5,585,089的12-16栏，例如US 5,585,089的12-16栏)中有所描述，其中所述文献的内容以引用方式并入本文。用于人源化抗体的其他技术在1992年12月23日公开的Padlan et al.EP 519596A1中有所描述。
在一个实施方案中，可以使用纯化的靶物细胞抗原或其片段(例如本文所述的片段)，膜结合抗原、组织(例如组织制备物粗品)，全细胞(优选为活细胞)，溶解的细胞或细胞碎片(例如膜碎片)进行免疫来制得抗体。
所述的抗体分子可以为单链抗体。单链抗体(scFv)可以是经过基因工程改造的(例如参见Colcher，D.et al.(1999)Ann N Y Acad Sci 880：263-80；和Reiter，Y.(1996)Clin Cancer Res 2：245-52)。所述的单链抗体可以是二聚化的或多聚化的，从而生成具有针对同一靶物的不同抗原决定部位的特异性的多价抗体。
在另外的实施方案中，所述的抗体分子具有重链恒定区，该重链恒定区选自(例如)：IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD和IgE的重链恒定区；特别是选自(例如)：IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的(例如人)重链恒定区。在另一个实施方案中，所述的抗体分子具有轻链恒定区，该轻链恒定区选自(例如)：κ和λ的(例如人)轻链恒定区。所述的恒定区可以被改变，例如突变，从而更改了抗体的性质(例如增强或减弱以下性质的一种或多种：Fc受体的结合、抗体的糖基化、半胱氨酸残基的数量、效应器细胞的功能和/或补体的功能)。在一个实施方案中，所述的抗体具有：效应器功能，并且可以固定补体。在其他实施方案中，所述的抗体不能：募集效应器细胞，或者固定补体。在另一个实施方案中，所述的抗体具有减弱的或者不具有结合Fc受体的能力。例如，这些抗体为同种型或亚类、片段或其他突变体，它们不能支持与Fc受体的结合，例如它们具有诱变或删除的Fc受体结合区。
抗体分子可以用于通过标准的技术(例如亲和层析或免疫沉淀)来分离靶物蛋白质。此外，抗体分子可以用于检测靶物蛋白质(例如细胞溶解物或细胞上清液中)。抗体分子可以用于在诊断方法方面作为临床测试方法的一部分来监测组织中蛋白质的水平(例如测定给定治疗方案的效力)。通过所述抗体与可检测物质(例如抗体标记)的偶联(例如物理连接)而有利于检测。可检测物质的饿实例包括但不限于多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、化学发光材料以及放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基络合物的实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、荧光素、异硫氰酸酯、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹酰基氯化物或藻红蛋白；发光材料的实例包括发光氨；生物发光材料的实例包括荧光素酶、虫荧光素和发光蛋白质；合适的放射性材料的实例包括125I，131I，35S或3H。
其中抗体分子可以被可检测的标记的一种方式为将所述的抗体分子与酶连接并在酶免疫测试(EIA)中使用所得的连接产物(Voller，A.，″The EnzymeLinked Immunosorbent Assay(ELISA)″Microbiological Associates QuarterlyPublication，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons 2：1-7(1978))；Voller et al.，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73：482-523(1981)；Maggio，E.(ed.)，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，Fla.，(1980)；Ishikawa，E.et al.，(eds.)，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo(1981))。还可以采用多种其他免疫测试来完成检测。例如，通过放射性标记所述的抗体分子，可以通过使用放射性免疫测试(RIA)来检测所述的抗体(例如参见Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，(March，1986))。
用于将多个部分与抗体分子缀合的结合是已知的，例如参见Arnon et al.，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″，inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.(1985)；Hellstrom et al.，″Antibodies For Drug Delivery″，inControlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，Marcel Dekker，Inc.，pp.623-53(1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies′84：Biological And ClinicalApplications，Pinchera et al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin et al.(eds.)，Academic Press pp.303-16(1985)，和Thorpe et al.，″ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
特别是，用于本文所公开的诊断和治疗方法中的结合分子(例如结合多肽(LIGHT靶向分子和/或抗HER2抗体分子))可以与细胞毒素(例如放射性同位素、细胞毒素药品或毒素)治疗试剂，细胞生长抑制剂，生物毒素，药物前体，肽，蛋白质，酶，病毒，脂质，生物反应调节剂，药物试剂，免疫活性配体(例如淋巴因子或其他抗体，其中所得的分子与赘生物细胞和效应器细胞(例如T细胞)结合)或PEG缀合。在另一个实施方案中，用于本文所公开的诊断和治疗方法中的结合分子(例如结合多肽)可以与能够降低肿瘤血管化的分子缀合。在其他实施方案中，所公开的组合物可以包括与药品或药物前体偶联的结合分子，例如结合多肽。本发明的其他实施方案包括与特定的生物毒素或它们的细胞毒素片段(例如蓖麻毒素、白树毒素、假单胞菌外毒素或白喉毒素)缀合的结合分子(例如结合多肽)的用途。对使用的缀合或未缀合结合分子的选择取决于癌症的类型和阶段、辅助治疗的使用(例如化疗或外放射治疗)和患者的状况。应该理解的是本领域的技术人员能够容易地根据本文的教导来进行所述的选择。
应该理解的是，使用同位素标记的抗肿瘤抗体已经成功地用于破坏实体肿瘤的细胞以及动物模型(在一些情况下为人)中的淋巴瘤/白血病。示例性放射性同位素包括：90Y，125I，131I，123I，111In，105Rh，153Sm，67Cu，67Ga，166Ho，177Lu，186Re和188Re。
此外，应该理解的是，根据本文的教导，结合分子可以与不同的放射性标记缀合以用于诊断和治疗目的。最后，之前所述的美国专利No.6,682,134，6,399,061和5,843,439公开了在给药治疗抗体之前用于肿瘤的诊断“成像”的放射性标记的治疗缀合物。
用于与抗体分子缀合的其他优选试剂为细胞毒素药品，特别是用于癌症治疗的那些。如本文所用，“细胞毒素或细胞毒性试剂”是指不利于细胞的生长和增殖、并且可以起到降低、抑制或破坏细胞或恶性病的任何试剂。示例性的细胞毒素包括但不限于放射性核，生物毒素，酶活性毒素，细胞生长抑制的或细胞毒性治疗试剂，药物前体，免疫活性配体以及生物反应调节剂(例如细胞因子)。起到延迟或减慢免疫反应性细胞或恶性细胞的生长的任何细胞毒素在本发明的范围内。示例性的细胞毒素通常包括细胞生长抑制剂，烷化剂，抗代谢物，抗增殖试剂，微管蛋白结合剂，激素和激素拮抗剂等。其中种类的细胞毒性试剂包括(例如)美登碱系列的药品、蒽环类抗生素系列的药品、长春蔓药品、丝裂霉素、博来霉素、细胞毒性核苷、蝶啶系列的药品、diynene以及足叶草毒素。
在某些实施方案中，增强抗体分子的稳定性和效力的部分可以是缀合的。例如，在一个实施方案中，PEG可以与本发明的结合分子缀合，从而正常它们的体内半衰期。Leong，S.R.，et al.，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in DrugDeliv.Rev.54：531(2002)；或Weir et al.，Biochem.Soc.Transactions 30：512(2002)。
编码LIGHT靶物和抗体分子的核酸
此外，本发明还提供了编码本发明的LIGHT靶物和抗体分子的核酸分子。
在一个实施方案中，本发明提供了经分离的多核苷酸，该多核苷酸包括、基本上由或者由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸构成，其中所述的重链可变区的至少一个CDR或者所述重链可变区的至少两个VH-CDR与得自本文所公开的单克隆HER2抗体的参照重链VH-CDR1，VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列具有至少80％，85％，90％或95％的一致性。备选地，所述VH的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3区与得自本文所公开的单克隆HER2抗体的参照重链VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列具有至少80％，85％，90％或95％的一致性。因此，根据这种实施方案，本发明的重链可变区具有与SEQ ID NO：47-70所示的多肽序列相关的VH-CDR1，VH-CDR2，或VH-CDR3多肽序列。
在某些实施方案中，所述的核酸分子编码了所述融合物的抗体分子、或者所述的抗HER2抗体分子，所述的核酸分子包括或基本上由在高度严谨的条件下与编码以下重链可变结构域的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，其中所述的重链可变结构域为：BIIB71F10(SEQ ID NO：12；SEQ IDNO：156)，BIIB69A09(SEQ ID NO：16)，BIIB67F10(SEQ ID NO：20)，BIIB67F11(SEQ ID NO：24)，BIIB66A12(SEQ ID NO：28)，BIIB66C01(SEQID NO：32)，BIIB65C10(SEQ ID NO：36)，BIIB65H09(SEQ ID NO：40)或BIIB65B03(SEQ ID NO：44)的重链可变结构域，或由PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358表达的抗体分子的重链可变结构域；或者包括与BIIB71F10(SEQ ID NO：11)，BIIB69A09(SEQ ID NO：15)，BIIB67F10(SEQ IDNO：19)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27)，BIIB66C01(SEQ ID NO：31)，BIIB65C10(SEQ ID NO：35)，BIIB65H09(SEQ ID NO：39)或BIIB65B03(SEQ ID NO：43)的重链可变结构域、或由PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358表达的抗体分子的重链可变结构域的氨基酸序列具有至少85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高一致性的氨基酸序列。
在其他实施方案中，所述的核酸分子编码了所述融合物的抗体分子、或者所述的抗HER2抗体分子，所述的核酸分子包括或基本上由在高度严谨的条件下与编码以下轻链可变结构域的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，其中所述的轻链可变结构域为：BIIB71F10(SEQ ID NO：14)，BIIB69A09(SEQ ID NO：18)，BIIB67F10(SEQ ID NO：22)，BIIB67F11(SEQ IDNO：26)，BIIB66A12(SEQ ID NO：30)，BIIB66C01(SEQ ID NO：34)，BIIB65C10(SEQ ID NO：38)，BIIB65H09(SEQ ID NO：42)或BIIB65B03(SEQ ID NO：46)的轻链可变结构域，或由PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358表达的抗体分子的轻链可变结构域；或者包括与BIIB71F10(SEQ ID NO：13)，BIIB69A09(SEQ ID NO：17)，BIIB67F10(SEQ ID NO：21)，BIIB67F11(SEQ IDNO：25)，BIIB66A12(SEQ ID NO：29)，BIIB66C01(SEQ ID NO：33)，BIIB65C10(SEQ ID NO：37)，BIIB65H09(SEQ ID NO：41)或BIIB65B03(SEQ ID NO：45)的轻链可变结构域、或由PTA-10355，PTA-10356，PTA-10357或PTA-10358表达的抗体分子的轻链可变结构域具有至少80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高一致性的氨基酸序列。
示例性的核酸分子编码了LIGHT/HER2融合物，该融合物包括或基本上由以下氨基酸序列构成，其中所述的氨基酸序列为：SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：4或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)中的任何一者所示的氨基酸序列；由SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)中的任何一者所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在某些实施方案中，编码了所述的LIGHT/HER2融合物的核酸分子还可以包括或基本上由第二条链(与之前所述的链融合或结合)构成，其中所述的第二条链包括或基本上由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)构成。在一些实施方案中，所述的核酸分子包括或基本上由SEQ ID NO：5或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)中的任何一者所示的核苷酸序列构成。
在另一个示例性实施方案中，所述的核酸分子编码了LIGHT靶向分子，该靶向分子包括哺乳动物(例如人)LIGHT蛋白质或其功能变体或片段、及与CD23或IGFR结合的抗体分子构成的至少一个融合分子。在一个实施方案中，编码了所述的LIGHT-抗CD23或LIGHT-抗IGFR融合物的核酸分子包括或基本上由SEQ ID NO：101，174，163或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)中的任何一者所示的氨基酸序列构成。在一些实施方案中，所述的核酸分子包括或基本上由SEQ IDNO：102，173，162或与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)中的任何一者所示的核苷酸序列构成。在某些实施方案中，编码了所述的LIGHT/CD23融合物的核酸分子还可以包括或基本上由第二条链(与之前所述的链融合或结合)构成，其中所述的第二条链包括或基本上由SEQ ID NO：103或168所示的氨基酸序列或与其基本一致的氨基酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)构成。在一些实施方案中，所述的核酸分子包括或基本上由SEQ ID NO：104或167中的任何一者所示的核苷酸序列或者与其基本一致的核苷酸序列(例如与其至少大约85％，90％，95％或更高一致性的序列)的核苷酸序列构成。
重组表达载体、宿主细胞以及基因工程改造的细胞
本发明还包括编码了本文所述的靶向分子和/或抗体分子的核酸。此外，本发明还包括包含所述核酸的载体、以及使用所述的核酸转化的细胞，特别是用于生产抗体的细胞，例如哺乳动物的细胞，如CHO或淋巴细胞。本发明还包括制得本文所述的抗体分子的细胞系(例如重组宿主细胞、杂交瘤细胞)以及使用所述细胞来制得抗体分子的方法。
在另一个方面中，本发明包括含有编码本文所述的多肽的核酸的载体，优选的是表达载体。如本文所述，术语“载体”是指能够能够运送已经与其连接的另一种核酸的核酸分子，并且可以包括质粒、粘粒或病毒载体。所述的载体能够自我复制，或者能够整合到宿主DNA中。病毒载体包括(例如)复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒以及腺相关病毒。
载体可以包括适用于在宿主细胞中表达核酸的形式的核酸。优选的是，所述的重组表达载体包括与待表达的核酸序列可操作地连接的一种或多种调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子以及其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。调节序列包括指导核苷酸序列的构成性表达以及组织特异性调节和/或诱导序列的那些。表达载体的设计可以根据诸如待转化的宿主细胞的选取、所需的蛋白质的表达水平等之列的因素来进行。本发明的表达载体可以被引入到宿主细胞中，由此生产由本文所述的核酸所编码的蛋白质或多肽，包括融合物蛋白质或多肽。
可以针对原核生物或真核生物中蛋白质的表达来设计本发明的重组表达载体。例如，本发明的多肽可以在E.coli、昆虫细胞(例如使用杆状病毒表达载体)、酵母菌细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel，(1990)Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，CA中进一步讨论。备选地，重组表达载体可以使用(例如)T7启动子调节序列和T7聚合酶来在体外进行转录和翻译。
蛋白质在原核生物中的表达最通常是在具有载体的E.coli中实施的，其中所述的载体包含指导融合物或非融合物蛋白质表达的构成性或可诱导的启动子。融合物载体将大量的氨基酸加入到其中编码的蛋白质中，通常加入到重组蛋白质的氨基末端。所述的融合物载体通常起到三种所用：1)增加重组蛋白质的表达；2)增加重组蛋白质的溶解性；以及3)通过在亲和纯化中作为配体而有助于重组蛋白质的纯化。通常，将蛋白水解裂解位点引入到融合物部分与重组蛋白质的连接处，从而能够由所述的融合物部分中分离出重组蛋白质，随后纯化所述的融合物蛋白质。所述的酶及其同源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合物表达载体包括pGEX(PharmaciaBiotech Inc；Smith，D.B.and Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，所述的载体分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白质或蛋白质A与所述的靶物重组蛋白质融合。
经纯化的重组蛋白质可以是活性测试(例如下文详述的直接测试或竞争性测试)或者是生成对蛋白质具有特异性的抗体。在优选的实施方案中，在本发明的逆转录病毒表达载体中表达的融合物蛋白质可以用于感染骨髓细胞，该细胞随后被移植到经X射线辐射的受者中。然后，在经过足够的时间(例如6个周)后，检测受试对象受者的病理学。
为了在E.coli中使重组蛋白质的表达最多，应该在以蛋白水解方式裂解所述的重组蛋白质的能力被破坏的宿主细菌中表达所述的蛋白质(Gottesman，S.，(1990)Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，California 119-128)。另一个策略是改变待插入到表达载体中的核酸的核酸序列，使得用于各氨基酸的单个的密码子为在E.coli中优选使用的那些(Wada et al.，(1992)Nucleic Acids Res.20：2111-2118)。本发明的核酸序列的这种改变可以通过标准的DNA合成技术来实施。
所述的表达载体可以为酵母菌表达载体、用于在昆虫细胞中表达的载体，例如杆状病毒表达载体或适用于在哺乳动物细胞中表达的载体。当在哺乳动物细胞中使用表达载体时，该表达载体的控制功能可以通过病毒的调节元件来提供。例如，通常使用的启动子衍生自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。
在另一个实施方案中，所述的启动子为可诱导的启动子，例如受到类固醇激素、多肽激素(例如通过信号传导途径的方式)或者通过异源多肽(例如西环素诱导系统，“Tet-On”和“Tet-Off”，例如参见Clontech Inc.，CA，Gossenand Bujard(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547，和Paillard(1989)Human Gene Therapy 9：983)调节的启动子。在另一个实施方案中，所述的重组哺乳动物表达载体能够在特定的细胞类型中优选地指导核酸的表达(例如使用组织特异性调节元件来表达所述的核酸)。合适的组织特异性启动子的非限定性实例包括清蛋白启动子(肝脏特异性的；Pinkert et al.(1987)GenesDev.1：268-277)、淋巴特异性启动子(Calame and Eaton(1988)Adv.Immunol.43：235-275)、特别是T细胞受体(Winoto and Baltimore(1989)EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白(Banerji et al.(1983)Cell 33：729-740；Queen andBaltimore(1983)Cell 33：741-748)的启动子、神经元特异性启动子(例如神经丝启动子；Byrne and Ruddle (1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5473-5477)、胰腺特异性启动子(Edlund et al.(1985)Science230：912-916)、以及乳腺特异性启动子(例如乳清启动子；美国专利No.4,873,316和欧洲申请公开No.264,166)。发育调节的启动子也被包含在内，例如鼠科同源框蛋白启动子(Kessel and Gruss(1990)Science 249：374-379)和α-甲胎蛋白启动子(Campes and Tilghman(1989)Genes Dev.3：537-546)。
本发明还提供了重组表达载体，该表达载体包含以反义取向克隆到表达载体中的本发明的DNA分子。可以选择与以反义取向克隆的核酸可操作地连接的调节序列(例如病毒启动子和/或增强子)，这些调节序列指导了反义RNA在多种细胞类型中的构成性、组织特异性或细胞类型特异性的表达。所述的反义表达载体可以为重组质粒、噬菌粒和减毒病毒。
本发明的另一个方面提供了包含本文所述的核酸分子的宿主细胞，其中所述的核酸分子例如为处于重组表达载体中的核酸分子或者包含使其同源重组到宿主细胞基因组的特定位点中的序列的核酸分子。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中交换使用。该术语不仅指特定的受试对象细胞，而且指这种细胞的后代或可能后代。由于突变或环境影响而在后代中发生了某些修饰，这些后代事实上可能与亲代细胞不一致，但是仍包含在本发明的范围内。宿主细胞可以为任何原核细胞或真核细胞。例如，蛋白质可以在细菌细胞(例如E.coli)、昆虫细胞、酵母菌细胞或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵细胞(CHO)、COS细胞(例如COS-7细胞)或CV-1起源SV40；Gluzman(1981)Cell 23：175-182)中表达。其他合适的宿主细胞是本领域的技术人员已知的。
本发明的宿主细胞可以用于生产(即，表达)蛋白质。因此，本发明进一步提供了使用本发明的宿主细胞来生产蛋白质的方法。在一个实施方案中，所述的方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(该细胞中已经引入了编码蛋白质的重组表达载体)，由此蛋白质得以产生。在另一个实施方案中，所述的方法进一步包括由培养基或宿主细胞中分离蛋白质。
过度增殖活性的抑制
本发明提供了治疗或预防(例如治愈、抑制、减轻、延迟或预防过度增殖的发作，或者预防过度增殖的复发或再度恶化)受试对象中过度增殖(例如赘生性状况和/或紊乱)的方法。所述的方法包括向所述的受试对象给予足以抑制或降低过度增殖(例如赘生性细胞或组织)中的一种或多种生物学活性的量、由此治疗或预防紊乱或状况的本文所述的LIGHT靶向分子或抗HER2抗体分子。
在某些实施方案中，所述的方法预防、减轻或减缓了肿瘤或转移的复发或再度恶化。所述的方法包括向受试对象(例如对于标准的治疗(例如化疗、基于抗体的治疗和/或手术)模式而言是部分或完全难以治愈的患者)给药本文所述的LIGHT靶向分子或抗HER2抗体分子。例如，所述的患者患有表达HER2的癌症(例如乳腺癌、胃癌或肺癌)，并且已经在手术、化疗和/或抗体疗法(例如曲妥单抗疗法)之后证明了疾病的进程。就这一点而言，患有转移性乳腺癌的大部分患者(其对曲妥单抗具有初始应答)在开始治疗的1年内显示出了疾病的进程(Nahta，R.et al.(2006)Nature Clinical Practice Vol.3(5)：269-280)。本发明的LIGHT-抗HER2分子可以用于治疗曲妥单抗难以治愈的患者群体。本发明的LIGHT-抗HER2分子已经显示出发挥了对抗肿瘤活性的延长的抑制作用(超出使用抗HER2抗体检测的抑制作用)(图22)，由此扩展了所述分子的治疗和预防用途。
在其他实施方案中，所述的患者为在手术、化疗和/或抗体疗法(例如VEGF或EGFR抗体疗法)后已经证明疾病进程的结肠癌患者。在某些实施方案中，将所述的LIGHT靶向分子或抗HER2抗体分子给予已经采用另一个治疗模式(例如标准的治疗模式)治疗大约10天、1至6个月、6个月至1年、1至2年等的患者。在某些实施方案中，所述的受试对象已经发展成对一线疗法具有部分或完全的抗性。
在一些实施方案中，例如在给予受试对象之前，通过体外或在体测试降低或抑制本文所述的一种或多种过度增殖活性、紊乱或状况所需的LIGHT靶向分子或抗HER2抗体分子量，来确定所给予的LIGHT靶向分子或抗HER2抗体分子的量或剂量。所述的体内方法可以可任选地包括鉴定(例如评估、诊断、筛选和/或选择)受试对象处于患有一种或多种与所述的紊乱或状况有关的症状的风险的步骤。
在上文所述方法的多个实施方案中，所述的抗体或其片段抑制的肿瘤细胞的迁移。在另一个实施方案中，所述的肿瘤细胞的增殖通过预防或延迟肿瘤扩散至邻近的组织来进行抑制。
在另一个实施方案中，所述的过度增殖紊乱或状况选自癌症、赘生物、肿瘤、恶性病或其转移、或复发的恶性病(例如对一线疗法是部分或完全难以治愈的受试对象)中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述的LIGHT靶向分子的靶向部分或所述的抗体分子作为一线疗法单独给予或者与第二试剂组合给予自然的受试对象，例如患有表达HER2的乳腺癌的自然患者。在其他实施方案中，所述的LIGHT靶向分子的靶向部分或所述的抗体分子作为作为二线疗法单独给予或者与第二试剂组合给予。在其他实施方案中，所述的LIGHT靶向分子的靶向部分或所述的抗体分子给予对于标准模式的疗法是部分或完全难以治愈的患者。例如，所述的患者为已经在化疗和/或曲妥单抗疗法之后证明疾病进程的乳腺癌患者。
如本文所用，术语动词性的“治疗”或名词性的“治疗”是指治疗性治疗和预防性或预防措施，其中客观对象将要预防或减慢(减轻)所不希望的生理学变化或紊乱，例如癌症的发展或扩散。不管是可检测的或是不可检测的，有利的或所需的临床结果包括但不限于减轻症状，减弱疾病的程度，稳定(即，不恶化)疾病的状态，延迟或减慢疾病的进程，改善或缓解疾病的状态，以及进行缓解(部分或全部)。此外，名词性的“治疗”可以指与如果未接受治疗的预期存活相比，得到延长的存活。需要治疗的那些对象包括已经患有所述状况或紊乱的那些，以及倾向于患有所述状况或紊乱的那些，或者其中所述的状况或紊乱有待预防的那些。
“受试对象”、“个体”、“动物”、“患者”或“哺乳动物”是指需要对其进行诊断、预测或治疗的任何受试对象，特别是哺乳动物受试对象。哺乳动物受试对象包括人，家畜，农场动物，以及动物园动物、运动动物或宠物(例如狗、猫、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、母牛等)。
如本文所用，诸如“受益于给药结合分子的受试对象”和“需要治疗的动物”之类的短语包括受益于给药结合分子(例如其用于检测结合分子所识别的抗体(例如诊断过程))和/或受益于使用结合分子(其特异性地结合给定的靶物蛋白质)的治疗(即，减轻或预防诸如癌症之类的疾病)的受试对象，例如哺乳动物受试对象。如本文中更详细地说明的那样，所述的结合分子可以以非缀合的形式使用，或者可以与(例如)药品、药物前体或同位素缀合。
在多个实施方案中，所述的受试对象为哺乳动物(例如动物模型或人)。在另一个实施方案中，所述的受试对象为人，例如患有本文所述的癌症或赘生物状况中一种或多种的患者。在一个实施方案中，所述的受试对象为经历标准模式的治疗的患者，例如经历化疗和/或曲妥单抗的治疗的HER2阳性患者，并且所述的LIGHT靶向分子和/或抗HER2抗体分子作为二线疗法给药。在其他实施方案中，所述的患者为自然患者，例如所述的LIGHT靶向分子和/或抗HER2抗体分子作为一线疗法给予。在其他实施方案中，所述的患者对于标准模式的疗法是部分或完全难以治愈的。例如，所述的患者为已经在化疗和/或曲妥单抗疗法之后证明疾病进程的乳腺癌患者。
“过度增殖的疾病或紊乱”是指所有赘生性的细胞生长或增殖，而不论它们的恶性的或是良性的，包括所有转化的细胞和组织、以及所有癌细胞和组织。过度增殖的疾病或紊乱包括但不限于癌前期损害、异常的细胞生长、良性肿瘤、恶性肿瘤和“癌症”。在本发明的某些实施方案中，过度增殖的疾病或紊乱(例如癌前期损害、异常的细胞生长、良性肿瘤、恶性肿瘤或“癌症”)包括表达、过表达或异常表达靶物细胞抗原的细胞。
过度增殖的疾病、紊乱和/或状况的其他实例包括但不限于位于以下器官中的赘生物，而不论它们是良性的还是恶性的，其中所述的器官为：前列腺、结肠、腹部、骨、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、副甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头和颈部、神经(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸部和泌尿生殖道。在某些实施方案中，所述的赘生物表达、过表达或异常表达靶物细胞的抗原。
其他过度增殖紊乱包括但不限于：高丙球蛋白血症、淋巴组织增生紊乱、病变蛋白血症、紫癜、肉状瘤病、SezarV综合症、Waldenstron巨球蛋白血症、Gaucher疾病、组织细胞增多病以及位于上文所列器官系统的任何其他过度增殖疾病(除了赘生物以外)。在本发明的某些实施方案中，所述的疾病包括表达、过表达或异常表达靶物细胞抗原的细胞。
如本文所用，术语“肿瘤”或“肿瘤组织”是指由于过度细胞分裂所导致的异常大量的组织，在某些情况下为包含表达、过表达或异常表达过度增殖的细胞蛋白质的细胞的组织。肿瘤或肿瘤组织包括“肿瘤细胞”，其为具有异常生长性质及无用的肌体功能的赘生物细胞。肿瘤、肿瘤组织和肿瘤细胞可以为良性的或恶性的。
如本文所用，术语“恶性病”是指非良性的肿瘤或癌症。如本文所用，术语“癌症”是指一种过度增殖疾病，其包括可表征为失调的或不受控的细胞生长的恶性病。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病或淋巴恶性病。所述癌症的更具体的实例如下所述，并包括：鳞状细胞癌(例如鳞状上皮细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌)、腹膜的癌症、肝细胞癌、胃或胃部的癌症(胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头和颈部的癌症。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如除了原始的恶性病或肿瘤位点之外，其细胞尚未迁移至受试对象肌体中的位点的那些)以及继发性恶性细胞或肿瘤(例如由于转移(恶性细胞或肿瘤细胞迁移至不同于初始肿瘤位点处的继发位点处)所引起的那些)。需要实施本发明的治疗方法的癌症包括表达、过表达或异常表达靶物细胞抗原的细胞。
本发明的方法可以用于治疗恶化前的状况以及预防进展到赘生物或恶性状态，包括但不限于上文所述的那些紊乱。在已知或疑似之前已经进展成赘生物或癌症(特别是在已经发生了非赘生物细胞生长(由增生、组织变形或最特别的是发育异常构成)的情况下)的状况中指明所述的应用(对于这种异常生长状况的综述，参见Robbins andAngell，Basic Pathology，2d Ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.68-79(1976))。其中细胞开始表达、过表达或异常表达靶物细胞抗原的所述状况可以特别通过本发明所述的方法来治疗。
可以通过本发明的方法治疗的其他癌前病变紊乱包括但不限于良性增殖紊乱(例如良性肿瘤、纤维囊性状况、组织肥大、肠息肉、结肠息肉和食道发育异常)、粘膜白斑病、角化病、Bowen疾病、慢性光化性皮炎、日光性唇炎以及日光性角化病。
在优选的实施方案中，本发明的方法用于抑制癌症(特别是本文所列的那些)的生长、进行和/或转移。
其他过度增殖疾病、紊乱和/或状况包括但不限于恶性病和相关紊乱的进行和/或转移，其中所述的恶性病和相关紊乱例如：白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(包括粒细胞白血病、早幼粒白血病、粒单核细胞白血病和红白血病))以及慢性白血病(例如慢性髓细胞(粒细胞)白血病)和慢性淋巴细胞白血病)，真性红细胞增多症，淋巴瘤(例如Hodgkin疾病和非Hodgkin疾病)，多发性骨髓瘤，Waldenstrom巨球蛋白血症，重链疾病以及实体肿瘤(包括但不限于肉瘤和癌，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、恶性血管皮内细胞瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、Wilm肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、menangioma、黑素瘤、成神经细胞瘤以及眼癌)。
对于评估本文所述的LIGHT靶向试剂以及抗HER2抗体分子的作用而言，多种测试系统、细胞系和动物模型是本领域已知的。例如，可以使用表达不同水平的HER2，LTbR和HVEM中的一种或多种的细胞系。表达高水平HER2的示例性人细胞系包括但不限于BT474，SKBR3，N87和SKOV3。表达中等水平的HER2的示例性细胞系包括大鼠Tubo和人HT29。表达低水平或不可检测水平的HER2的示例性细胞系包括人MCF7，MDA-MB-231，MDA-MB-468，以及小鼠TSA和4T1。表达LIGHT受体的示例性细胞系包括HT29，N87和WiDr(其表达高水平的LTβR)；BT474，SKBR3，MCF7，MDA-MB-231，MDA-MB-468，SKOV3和Tubo(它们均表达中等水平的LTβR)；以及小鼠TSA和4T1(其表达低水平的LTβR)。表达中等水平的HVEM的细胞系包括MCF7，MDA-MB-231和HT29。用于测试本发明的分子的异种移植物动物模型在以下实施例中有所描述。
药物组合物、剂量、给药方式
本发明的分子(本文中也称为“活性化合物”)可以并入到药物组合物中。这种组合物通常包括核酸分子、蛋白质或抗体，以及可药用的载体。如本文所用，表达语“可药用的载体”包括与药物的给予方式相容的溶剂、分散介质、涂料、抗细菌和抗真菌试剂、等渗及吸附延迟剂等。补充的活性化合物也可以并入到所述的组合物中。
药物组合物被配制成与其预计的给药途径相容。给药途径的实例包括(例如)静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、经皮(局部)、经粘膜以及直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下施加的溶液或悬浮液可以包括以下成分：无菌稀释液(例如用于注射的水)、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌试剂，例如苯甲基醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节肌肉弹性的试剂，例如氯化钠或右旋葡萄糖。可以使用酸或碱(例如烟酸或氢氧化钠)调节pH。
当通过静脉内、皮肤或皮下注射给药治疗有效量的本发明的分子时，结合剂为无热原、肠胃外可接受的水性溶液。考虑了pH、等渗性、稳定性等的所述肠胃外可接受的蛋白质融合的制备在本领域的范围内。用于静脉内、皮肤或皮下注射的优选的药物组合物除了包含结合剂以外，还应该包含等渗载体，例如氯化钠针剂、Ringer针剂、右旋葡萄糖针剂、右旋葡萄糖与氯化钠针剂、乳酸Ringer针剂或本领域已知的其他载体。本发明的药物组合物还可以包含稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂以及本领域的技术人员已知的其他添加剂。
对于吸入给药而言，本发明的分子以喷雾剂的形式传递，其中所述的气雾剂得自包含合适的推进剂(例如诸如二氧化碳之类的气体)或雾化剂的加压容器或分配器。
此外，系统性的给药还可以通过经粘膜或经皮方式。对于经粘膜或经皮给药而言，使用穿透屏障的渗透剂可以用于所述的配制物中。这种渗透剂是本领域公知的，并且对于经粘膜给药而言包括(例如)洗涤剂、胆盐以及夫两地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于经皮给药而言，所述的活性化合物可以配制成本领域公知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。
得自细胞培养测试和动物研究的数据可以用于配制在人中使用的一定范围的剂量。所述化合物的剂量优选处于包含ED50且具有较少或不具有毒性的循环浓度范围内。所述剂量根据使用的剂型以及采用的给药途径而在上述范围内变化。对于在本发明的方法中使用的任何化合物而言，可以由细胞培养测试来初始估计治疗有效的单次剂量。可以在动物模型中配制单次剂量，从而得到在细胞培养中确定的包含IC50(即，在取得对症状的最大抑制程度的一半时，所述的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度。这种信息可以用于更精确地确定人中的使用单次剂量。例如，可以通过高效液相色谱来测量血浆中的水平。
如本文所定义的那样，蛋白质或多肽的治疗有效量(即，有效剂量)为大约0.001至30mg/kg体重、优选为大约0.01至25mg/kg体重、更优选为大约0.1至20mg/kg体重，并且甚至更优选为大约1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4至7mg/kg或者5至6mg/kg体重。在大约1至10周、优选为2至8周、更优选为大约3至7周、甚至更优选为大约4、5或6周期间，每周一次给药所述的蛋白质或多肽。对于在7天或更长的时间内的重复给药而言，根据所述的状况，进行重复治疗，直到疾病的症状达到所需的抑制程度为止。但是，其他剂量方案可以使用。这种治疗的过程可以容易地通过常规的技术和测试(例如包括X光线照相术的肿瘤成像)来进行监测。最后，主治医生会决定使用本发明的药物组合物的静脉内治疗的合适的持续时间。
技术人员会理解某些因素可能影响有效治疗受试对象所需的剂量和时机，包括但不限于疾病或紊乱的严重程度，早期的治疗情况，受试对象的整体健康情况和或年龄，以及其他存在的疾病。此外，使用治疗有效量的蛋白质、多肽或抗体治疗受试对象可以包括单一的治疗，或者优选的是包括一系列的治疗。
可以将本发明的核酸分子插入到载体中，并用作基因治疗载体。基因治疗载体可以通过(例如)静脉内注射、局部给药(参见美国专利5,328,470)或通过立体定位注射(例如参见Chen et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：3054-3057)而传递给受试对象。所述的基因治疗载体的药物制备物可以包括处于可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包括其中嵌入有基因传递载体的缓释基质。备选地，在完整的基因传递载体(例如逆转录病毒载体)可以由重组细胞整体生产的情况下，所述的药物制备物可以包括能够产生基因传递系统的一种或多种细胞。
所述的药物组合物可以与给药说明书一起装在容器、包装或分配器中。
给药剂量和频率可以根据所述的治疗是预防性的或治疗性的而改变。在预防性的应用中，将包含抗体或其混合物的组合物给予处于尚未患有疾病状态或处于疾病前状态的患者，以增强患者的抗性。所述的量定义为“预防有效单次剂量”。在这种应用中，精确的量再次取决于患者的健康状态以及整体免疫力，而且通常为0.1至25mg/单次剂量，特别是0.5至2.5mg/单次剂量。在长期时间内，以相对少的间隔给药相对低的剂量。有些患者在其余下的生命中持续接受治疗。
在治疗应用中，有时在相对短的间隔内需要相对高的剂量(例如大约1至400mg/kg结合分子(例如每单次剂量的抗体)，并且对于放射性免疫缀合物而言更通常使用5至25mg的剂量，而对于细胞毒素药品缀合的分子而言使用更高的单次剂量)，直到疾病的进程被降低或终止，并且优选的是，直到患者显示出疾病症状的部分或完全减轻。因此，患者可施用预防性方案。
在一个实施方案中，可以使用编码LIGHT靶向分子或抗体分子(在本文中全部称为“结合分子”或“分子”)的核酸分子(例如处于载体中)来治疗受试对象。用于编码多肽的核酸的单次剂量为每位患者大约10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg或者30-300μg DNA。用于感染的病毒载体的单次剂量为10-100或者更高的病毒粒子/单次剂量。
治疗试剂可以通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌肉内的方式给予以用于预防性和/或治疗性的治疗。在一些方法中，可以将试剂直接注射到其中已经累积有表达癌症的细胞的特定组织中，例如颅内注射。对于抗体给药而言，肌肉内注射或静脉内注射是优选的。在一些方法中，将特定的治疗抗体直接注射到头盖骨中。在一些方法中，将抗体作为缓释组合物或装置(例如装置)来给药。
本发明的分子可以可任选地与可以有效治疗需要治疗的(例如预防性的或治疗性的)所述的紊乱或状况的其他试剂组合给药。单独或者与另一种试剂(例如本文所述的化疗治疗试剂)组合的LIGHT靶向分子或抗HER2抗体分子可以以足以激发受试对象(患有过度增殖状况和/或紊乱)中的至少一种LIGHT相关生物学活性的量来给药所述的受试对象，例如哺乳动物。
尽管大量的临床试验已经获得了131I和90Y，其他放射性标记是本领域已知的，并且已经用于相似的目的。仍有其他的放射性同位素用于成像。例如，与本发明的范围相容的其他放射性同位素包括但不限于123I，125I，32P，57Co，64Cu，67Cu，77Br，81Rb，81Kr，87Sr，113In，127Cs，129Cs，132I，197Hg，203Pb，206Bi，177Lu，186Re，212Pb，212Bi，47Sc，105Rh，109Pd，153Sm，188Re，199Au，225Ac，211At和213Bi。在这一方面中，α、γ和β都与本发明的相容。此外，就本发明公开而言，应该提出，本领域的技术人员能够在不会不当地试验的条件下容易地确定哪种放射性核是与所选的治疗过程相容的。到目前为止，已经用于临床诊断的其他放射性核包括125I，123I，99Tc，43K，52Fe，67Ga，68Ga以及111In。此外，抗体已经标记有多种放射性核，以用于靶向免疫疗法中的潜在用途中(Peirersz et al.Immunol.Cell Biol.65：111-125(1987))。这些放射性核包括188Re和186Re，以及在次要程度上包括199Au和67Cu。关于这种放射性核，美国专利No.5,460,785提供了其他数据，并且以参考方式并入本文。
尽管本发明的分子可以按照紧邻的上文中所述的方式进行给药，但是必须强调，在其他的实施方案中，缀合的和非缀合的结合分子可以作为一线治疗试剂以不同的方式给药健康患者。
然而，本发明所选的实施方案包括向患者给药本发明的分子，或者与一种或多种辅助疗法(例如放疗或化疗)组合或结合(即，结合治疗方案)。如本文所用，与辅助疗法结合或组合给药本发明的结合分子是指依次、同时、同延、并行、伴随或同时期给药或施加所述的疗法以及所公开的结合分子。本领域的技术人员应该理解，给药或施加结合治疗方案的各种成分可以是定时的，从而增强所述治疗的整体有效性。例如，可以以标准的治疗过程给予化疗试剂，然后在几周内给予本文所述的放射性免疫缀合物。相反地，细胞毒素缀合的结合分子可以静脉内给药，然后施加定位于肿瘤的外部光束辐射。在另外的实施方案中，结合分子可以与一种或多种所选的化疗试剂在单次医生就诊时同时给药。本领域的技术人员(例如有经验的肿瘤医生)能够在不会不当地试验的条件下，根据所选的辅助疗法以及本说明书的教导容易地分辨有效的结合治疗方案。
就这一点而言，应该理解的是，结合分子(具有或不具有细胞毒素)与化疗试剂的组合可以以任何顺序以及任何期限内(可对患者提供治疗益处)给药。换言之，所述的化疗试剂和结合分子可以以任何顺序或同时给药。在所选的实施方案中，本发明的结合分子给予之前已经经历化疗的患者。在另外的实施方案中，本发明的结合分子与化疗治疗基本同时或同时给药。例如，可以给予患者所述的结合分子，同时经历化疗过程。在优选的实施方案中，在任何化疗试剂或治疗的1年内给予所述的结合分子。在其他优选的实施方案中，在任何化疗试剂或治疗的10，8，6，4或2个月内给予所述的多肽。在其他优选的实施方案中，在任何化疗试剂或治疗的4，3，2或1周内给予所述的结合分子。在其他实施方案中，在所述的化疗试剂或治疗的5，4，3，2或1天内给予所述的结合分子。应该进一步理解的是，可以在大约几小时或几分钟内(即，基本同时)给予患者两种试剂或治疗。
就本发明的这些方面而言，与本发明相容的示例性化疗试剂包括烷化剂、长春蔓生物碱(例如长春新碱和长春碱)、甲苄肼、甲氨蝶呤和泼尼松。4种药品的组合MOPP(二氯甲基二乙胺(氮芥)、长春新碱(Oncovin)、甲苄肼和泼尼松)在治疗多种类型的淋巴瘤中是非常有效的，并构成了本发明的优选实施方案。在抗MOPP的患者中，可以使用的组合ABVD(例如阿霉素，博来霉素，长春碱氮烯唑胺)，ChlVPP(苯丁酸氮芥，长春碱，甲苄肼和泼尼松)，CABS(环己亚硝脲，亚德里亚霉素，博来霉素和链脲霉素)，MOPP+ABVD，MOPP+ABV(亚德里亚霉素，博来霉素和长春碱)或BCVPP(亚硝尿氮芥，环磷酰胺，长春碱，甲苄肼和泼尼松)。Arnold S.Freedman andLee M.Nadler，Malignant Lymphomas，in Harrison′s Principles of InternalMedicine 1774-1788(Kurt J.Isselbacher et al.，eds.，13th ed.1994)和V.T.DeVita et al.，(1997)，并且对于标准的定量给药和时间表引用了其中的参考文献。这些疗法可以不经变化而使用，或者按照特定患者的需要，与本发明的一种或多种抗体或其免疫特异性片段组合，经改变后使用。
对于中等级别的及高级的恶性病患者(其无法取得减缓或发生再度恶化)而言，可以使用挽救疗法。挽救疗法使用了单独给予或组合给予的药品，例如胞核嘧啶、阿拉伯糖苷、顺铂、卡波铂、依托泊苷和异环磷酰胺。在再度恶化或入侵形式的某些赘生性紊乱中，通常使用以下方案：IMVP-16(异环磷酰胺，甲氨蝶呤和依托泊苷)，MIME(丙酮双脒腙，异环磷酰胺，甲氨蝶呤和依托泊苷)，DHAP(地塞米松，单次剂量较高的阿糖胞苷和顺铂)，ESHAP(依托泊苷，甲泼尼龙，HD阿糖胞苷，顺铂)，CEPP(B)(环磷酰胺，依托泊苷，甲苄肼，泼尼松和博来霉素)以及CAMP(环己亚硝脲，米托蒽醌，阿糖胞苷和泼尼松)，其中的每种药品都具有公知的定量给药比例和时间表。
与本发明的结合分子组合使用的化疗试剂的量可以根据受试对象而改变，或者根据本领域所知的情况给药。例如参见Bruce A Chabner et al.，Antineoplastic Agents，in Goodman&Gilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics 1233-1287(Joel G.Hardman et al.，eds.，9th ed.(1996))。
在另一个实施方案中，本发明的结合分子可以与生物学制品结合给药。用于治疗癌症的生物学制品是本领域已知的，并且本发明的结合分子可以与(例如)所述的这些已知的生物学制品结合给药。例如，FDA已经批准了以下生物学制品来用于乳腺癌的治疗：
Figure BDA0000072591770001031
(曲妥单抗，Genentech Inc.，South San Francisco，Calif.；在HER2阳性的乳腺癌中具有抗肿瘤活性的人源化的单克隆抗体)；
Figure BDA0000072591770001032
(氟维司群，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP，Wilmington，Del.；用于治疗乳腺癌的雌激素受体拮抗剂)；
Figure BDA0000072591770001033
(阿纳托，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP；阻断芳香酶(制得雌激素所需的酶)的非甾类芳香酶抑制剂)；
Figure BDA0000072591770001034
(依西美坦，Pfizer Inc.，New York，N.Y.；用于治疗乳腺癌的不可逆甾类芳香酶钝化剂)；
Figure BDA0000072591770001035
(来曲唑，NovartisPharmaceuticals，East Hanover，N.J.；由FDA批准的用于治疗乳腺癌的非甾类芳香酶抑制剂)；以及
Figure BDA0000072591770001036
(三苯氧胺，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP；由FDA批准的用于治疗乳腺癌的非甾类的抗雌激素)。可以与本发明的结合分子结合的其他生物学制品包括：
Figure BDA0000072591770001037
(贝伐单抗，Genentech Inc.；被设计用于抑制血管再生术的FDA批准的一线疗法)；以及
Figure BDA0000072591770001038
(替伊莫单抗，Biogen Idec，Cambridge，Mass.；当前批准的用于治疗B细胞淋巴瘤的放射性标记的单克隆抗体)。
此外，FDA已经批准了以下生物学制品来用于结肠直肠癌的治疗：
Figure BDA0000072591770001041
(西妥昔单抗，ImClone Systems Inc.，New York，N.Y.，andBristol-Myers Squibb，New York，N.Y.；其为定向对抗表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体)；
Figure BDA0000072591770001042
(伊马替尼；其为蛋白质姐妹抑制剂)；以及
Figure BDA0000072591770001043
(盐酸左旋咪唑，Janssen Pharmaceutica Products，LP，Titusville，N.J.；由FDA在1990年批准的、在患有Dukes C期结肠癌的患者经过手术切除后与5-氟尿嘧啶组合的作为辅助治疗的免疫调节剂)。
用于治疗非Hodgkin淋巴瘤的当前批准的疗法包括：
Figure BDA0000072591770001044
(托西莫单抗和碘I-131托西莫单抗，GlaxoSmithKline，Research Triangle Park，N.C.；涉及小鼠单克隆抗体(托西莫单抗)的多步治疗，其中所述的抗体与放射性分子连接(碘I-131))；
Figure BDA0000072591770001045
A(干扰素α-2b，Schering Corporation，Kenilworth，N.J.；其为被批准用于治疗滤泡性非Hodgkin淋巴瘤的与包含蒽环类抗生素组合化疗(例如环磷酰胺，亚德里亚霉素，长春新碱和泼尼松[CHOP])的一种干扰素)；
Figure BDA0000072591770001046
(利妥昔单抗，Genentech Inc.，South San Francisco，Calif.，andBiogen Idec，Cambridge，Mass.；批准用于治疗非Hodgkin淋巴瘤的单克隆抗体)；
Figure BDA0000072591770001047
(地尼白介素，Ligand Pharmaceuticals Inc.，San Diego，Calif.；由白喉毒素片段构成的融合物蛋白质，其中所述的片段与白细胞介素-2基因融合)；以及
Figure BDA0000072591770001048
(替伊莫单抗，Biogen Idec；由FDA批准的用于治疗B细胞非Hodgkin淋巴瘤的放射性标记的单克隆抗体)。
对于白血病的治疗而言，可以与本发明的结合分子组合使用的示例性生物学制品包括：-1H(阿仑单抗，Berlex Laboratories，Richmond，Calif.；用于治疗慢性淋巴细胞白血病的一种单克隆抗体)。此外，可以使用Genasense(oblimersen，Genta Corporation，Berkley Heights，N.J.；在发展治疗白血病中的BCL-2反义疗法)(例如单独或联合一种或多种化疗药物，例如氟达拉滨和环磷酰胺)可以和要求保护的结合分子一起施用。
对于肺癌的治疗而言，示例性的生物学制品包括
Figure BDA00000725917700010410
(埃罗替尼HCL，OSI Pharmaceuticals Inc.，Melville，N.Y.；设计用于靶向所述的人表皮生长因子受体1(HER1)途径的小分子)。
对于多发性骨髓瘤的治疗而言，示例性的生物学制品包括
Figure BDA00000725917700010411
Velcade(硼替佐米，Millennium Pharmaceuticals，Cambridge Mass.；一种蛋白酶体抑制剂)。其他的生物学制品包括(镇静剂，ClegeneCorporation，Warren，N.J.；一种免疫调节剂，并表现出具有多种作用，包括抑制骨髓瘤细胞和抗血管再生术的生长和存活的能力)。
其他的生物学制品包括由ImClone Systems，Inc.，New York，N.Y研发的MOAB IMC-C225。
使用结合分子和核酸扩增测试的诊断和预兆方法
结合分子可以用于诊断目的，以检测、诊断或监测与靶物细胞抗原(例如HER2或CD23)的异常表达和/或活性有关的疾病、紊乱和/或状况。这些靶物的表达可以在肿瘤组织中，以及其他赘生性状况中。结合分子可以用于诊断、治疗、预防和/或预后哺乳动物(优选为人)的过度增殖紊乱。示例性的紊乱在本文中有所公开。因此，本发明提供了在诊断癌症和其他过度增殖紊乱期间使用的诊断方法，该方法涉及测量靶物蛋白质或转录物在得自个体的组织、其他细胞或体液中的表达水平，并比较测量的表达水平与正常组织或体液中的标准的靶物表达水平，由此与标准水平相比升高的表达水平为紊乱的指示。
一个实施方案提供了检测流体或组织样品中异常过度增殖细胞(例如癌症前期或癌细胞)的存在情况，包括：测试个体的组织或体液样品中所述靶物的表达情况，以及比较所述样品中靶物表达的存在或水平情况与标准的组织或体液样品面板中靶物表达的存在或水平情况，其中靶物表达的检测情况或者靶物表达超出标准水平的增多情况为异常过度增殖细胞生长的指示。
更具体而言，本发明提供了检测体液或组织样品中异常过度增殖细胞存在情况的方法，该方法包括：(a)使用本发明的靶物特异性抗体分子针对个体的组织或体液样品中靶物的表达情况进行测试；以及(b)比较所述样品中靶物表达的存在或水平情况与标准组织或体液样品的面板中靶物表达的存在或水平情况，其中靶物表达的检测情况或者靶物表达超出标准水平的增多情况为异常过度增殖细胞生长的指示。
关于癌症，得自个体的活体组织中存在有相对大量的靶物蛋白质可以表明肿瘤或其他恶性生长的存在，可以表明有发展成所述的恶性病或肿瘤的倾向，或者可以在表现出实际临床症状之前提供检测所述疾病的手段。这种更确定的诊断可以使健康专业人士较早地使用预防性的测量或入侵性的治疗，由此防止癌症的发展或进一步进行。
本发明的靶物特异性抗体分子可以用于使用本领域的技术人员已知的传统的免疫组织化学方法来测试生物学样品中的蛋白质水平(例如参见Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen，et al.，J.Cell Biol.105：3087-3096(1987))。用于检测蛋白质表达情况的其他基于抗体的方法包括免疫测试，例如酶连免疫吸附测试(ELISA)以及放射性免疫测试(RIA)。合适的抗体测试标记物是本领域已知的，并包括酶标记物，例如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，例如碘(125I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(112In)以及锝(99Tc)；发光标记物，例如发光氨；以及荧光标记物，例如荧光素和若丹明、以及生物素。合适的测试在本文的其他处进行了更详细的描述。
本发明的一个方面为体内检测或诊断受试对象(优选为哺乳动物，更优选为人)中与所述靶物的异常表达有关的过度增殖疾病或紊乱的方法。在一个实施方案中，诊断包括：a)给药(例如肠胃外、皮下或腹膜内)受试对象有效量的本发明的标记抗体或其片段，其中所述的抗体或其片段特异性地与靶物结合；b)在所述的给药之后，等候一段时间间隔，以使得标记的结合分子在所述的受试对象中在表达靶物的位点优选地聚集(并使未结合的标记的分子被清除，直至背景水平)；c)测定背景水平；以及d)检测所述的受试对象中的标记的分子，这样检测到高于背景水平的标记的分子表明所述的受试对象具有与靶物的异常表达有关的特定疾病或紊乱。可以通过多种方法来测定背景水平，其中所述的方法包括比较所检测的标记分子的量与之前针对特定系统测定的标准值。
本领域中应该理解的是，受试对象的尺寸以及所用的成像系统决定了生成诊断图像所需的成像部分的量。对于人受试对象而言，在放射性同位素部分的情况下，所注入的放射性的量通常为大约5至20居礼的(例如)99Tc。之后，优选的是，标记的结合分子(例如抗体或抗体片段)会在包含特异性蛋白质的细胞的位置处累积。体内肿瘤成像在S.W.Burchiel et al.，″Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments.″(Chapter 13in Tumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel and B.A.Rhodes，eds.，Masson Publishing Inc.(1982)中有所描述。
根据多个变量(包括所用的标记物的类型以及给药的模式)，在给药后使得标记的分子在受试对象中的位点处优选地聚集并且使未结合的标记分子被清除至背景水平的时间间隔为6至48小时，或者6至24小时，或者6至12小时。在另一个实施方案中，在给药后的时间间隔为5至20天或者7至10天。
使用本领域已知的方法来进行体内扫描，可以检测患者中标记分子的存在情况。这些方法取决于所用标记物的类型。技术人员能够确定合适的方法来检测特定的标记物。可以在本发明的诊断方法中使用的方法和装置包括但不限于计算断层照相法(CT)、全身扫描(例如正电子发射断层扫描(PET))、核磁共振成像(MRI)和超声波扫描术。用于体内成像靶物的表达的抗体标记物或标志物包括可以通过X射线照相术、核磁共振成像(NMR)、MRI、CAT扫描或电子自旋共振成像(ESR)检测的那些。在上文所述的那些相关的实施方案中，通过重复用于诊断疾病或紊乱的任何一种方法(例如在初次诊断后的一个月，在初次诊断后的6个月，在初次诊断后的1年等)来监测已经诊断的疾病或紊乱。
在根据传统方法已经诊断出紊乱(包括诊断出肿瘤)的情况下，本文所公开的检测方法可以用作预兆指示剂，由此持续表现出增强的靶物表达的患者，相对于表达水平降低接近标准水平的患者，经历了更坏的临床结果。
“测试肿瘤相关的靶物多肽的表达水平”是指直接(例如通过测定或估计蛋白质的绝对水平)或间接地(例如通过与第二生物学样品中的爱着相关多肽的水平比较)、定性地或定量地测量或估计第一生物学样品中的靶物多肽的水平。优选的是，测量或估计第一生物学样品中靶物多肽的表达水平，并与标准的靶物多肽的水平比较，其中所述的标准品取自第二生物学样品，该样品得自未患有所述的紊乱的个体、并通过对未患有所述紊乱的个体的群体水平取平均值而测定的。如本领域所理解的那样，一旦“标准的”靶物多肽的水平是已知的，则可以重复地用作标准来进行比较。
“生物学样品”是指得自潜在地表达靶物的个体、细胞系、组织培养或其他细胞来源的任何生物学样品。如所表明的那样，生物学样品包括体液(例如血清、血浆、尿、滑液和脊液)，以及包含潜在地表达靶物的细胞的其他组织来源。用于获得得自哺乳动物的组织活体和体液的方法是本领域公知的。
在另外的实施方案中，定向于靶物的构造抗原决定部位的抗体或抗体的免疫特异性片段可以用于定量或定性地检测靶物的基因产物、保守的变体或其肽片段的存在情况。这可以通过(例如)免疫荧光技术(其使用了与光学显微镜、流式细胞计数仪或荧光检测偶联的荧光标记的抗体)来完成。
可以使用上述方法诊断和/或预测的癌症包括但不限于胃癌、肾癌、脑癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌。
免疫测试
可以通过本领域已知的任何方法，针对免疫特异性的结合来测试本文所公开的靶物特异性抗体或其免疫特异性片段。可以使用的免疫测试包括但不限于使用多种技术(例如western印迹，放射性免疫测试，ELISA(酶连免疫吸附测试)，″夹心″免疫测试，免疫沉淀测试，沉淀素反应，凝胶扩散沉淀反应，免疫扩散测试，凝集测试，补体结合测试，免疫放射测试，荧光免疫测试，蛋白质A免疫测试，仅列举一小部分)的竞争性和非竞争性测试系统。这些测试是常规的，并且是本领域公知的(例如参见Ausubel et al.，eds，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.，New York，Vol.1(1994)，这些文献以引用方式全文并入本文)。示例性的免疫测试在下文中简单地描述(但并非是进行了限定)。
抗体与抗原的结合亲和性、以及抗体-抗原相互作用的解离速率可以通过竞争性结合测试来测定。竞争性结合测试的一个实例为放射性免疫测试，其包括将标记的抗原(例如3H或125I)与所关注的抗体在未标记的抗原的量增多的情况下进行温育；并检测与标记的抗原结合的抗体。所关注的抗体与特定抗原的亲和性以及结合的解离速率可以通过Scatchard绘图分析由所得的数据来测定。此外，还可以使用放射性免疫测试来测定与第二抗体的竞争情况。在这种情况下，将抗原与所关注的抗体(与标记的化合物(例如3H或125I)缀合)在未标记的第二抗体的量增多的情况下进行温育。
此外，在免疫荧光、免疫电子显微镜或非免疫学测试中，可以使用组织学上的靶物特异性的抗体来用于原位检测癌症抗原基因产物或保守变体或其肽片段。原位检测可以通过除去患者中的组织学样本，并将其施加到标记的靶物特异性抗体或其片段上(优选的是通过将标记的抗体(或片段)覆盖在生物学样品上的方法来施加)来完成。
在BIAcore上实施表面等离子共振(SPR)提供了超过传统方法测量抗体-抗原相互作用的亲和性的大量益处：(i)无需标记抗体或抗原；(ii)抗体无需事先纯化，细胞培养上清液可以直接使用；(iii)能够实时测量并足以用于多种评估目的，其中实施测量可以快速地半定量的比较不同单克隆抗体的相互作用；(iv)生物特异性表面可以再生，使得可以在一致的条件下容易地比较一系列不同的单克隆空提；(v)分析方法完全是自动化的，并且可以实施一系列大规模的测量而无需用过干涉。BIAapplications Handbook，versionAB(1998年重新印刷)，BIACORE code No.BR-1001-86；BIAtechnologyHandbook，versionAB(1998年重新印刷)，BIACORE code No.BR-1001-84。
抗原决定部位的特异性是单克隆抗体的重要特征。与采用放射性免疫测试、ELISA或其他表面吸附方法相比，使用BIAcore绘制抗原决定部位的图谱无需标记或纯化的抗体，并且可以使用一连串多个单克隆抗体进行多位点特异性的测试。此外，大量的分析可以自动地进行。
肽抑制为用于绘制抗原决定部位图谱的另一种技术。该方法可以补充成对抗体结合的研究，并且可以在抗原的一级序列为已知时将功能抗原决定部位与结构特征相关联。针对抑制不同MAb与固定化抗原的结合来测试肽或抗原片段。干扰给定MAb的结合的肽被设想为在结构上与MAb所定义的抗原决定部位有关。
列出以下实施例来帮助裂解本发明，但无意于并且不应该被解释为以任何方式限定了本发明的范围。
实施例
实施例1：得自噬菌体文库的hHER2/ErbB2特异性Fab的选择
重组人HER2胞外结构域用于筛选包含3.5x1010个克隆的人自然噬菌体Fab文库(Nat Biotechnol.2005Mar；23(3)：344-8)。在涂敷链霉亲和素的磁珠上捕获生物素化的hHer2-Fc蛋白质，然后与所述的噬菌体文库温育。按照之前所述选择具有删除了Fc特异性结合剂以及EGFR交联反应结合剂的缺陷的hEGFR-Fc(Nat Biotechnol.2005Mar；23(3)：344-8)。在3轮淘选之后，通过MluI消化除去479bp的基因III残段，并将所述的载体再连接以用于可溶性Fab在TG1细胞中表达。对920个克隆的ELISA分析产生了包含79个独特序列的224个阳性克隆。对独特的克隆进行纯化，并通过ELISA以及FACS，在使用全长人HER2稳定转染的CHO细胞上在单一的浓度下重新确认与重组人hHER2胞外结构域的结合情况(参见下文中的细胞系的构建)。根据结合数据，选择24个独特的克隆(65A03，65B03，65C10，65H09，66A12，66C01，67A02，67C12，67F10，67F11，68B11，68D03，69A09，69E02，69F02，70C01，70C08，70D11，71A03，71A06，71F08，71F10，71H02和72H10)以用于进一步的分析。
实施例2：通过流式细胞计数仪测量Fab与hHER2/Erb B2的结合活性
使用hHER2/ErbB2稳定转染的CHO细胞系，通过流式细胞计数仪测定Fab与野生型hHER2/ErbB2结合的能力。
CHO细胞(中国仓鼠卵细胞)稳定地转染有hHER2表达载体，并在包含G418的培养基中选择。将抗G418的克隆合并，并分裂24小时，然后建立所述的测试从而得到70％汇合的单层细胞。通常，CHO细胞系保持在20代内。使用细胞裂解液(Gibco编号#13151-014)释放细胞，计数，洗涤并调节至1x106细胞/ml，然后将1ml的细胞加入到各管(12×75mm管Falcon编号#352054)中。细胞成团，并通过在1200rpm下离心5min除去上清液，然后将100μl稀释的抗体加入到各细胞团中。在FACS缓冲剂中以1∶3的比例稀释的210或60μg/ml的起始浓度(降至0.001μg/ml)下，测试纯化的Fab。在整个测试中使用FACS缓冲剂为包含1％BSA(Sigma编号#A-7906)和0.1％叠氮化钠(Sigma编号#S2002)的PBS(不含Ca++/Mg++)。将样品在冰上温育1小时，然后用2ml FACS缓冲剂洗涤15分钟，并在4℃下在1200rpm下离心5分钟。对上清液进行吸气，并将100μl二级检测抗体加入到各相应管的FACS缓冲剂中。然后，在黑暗中，将样品在冰上温育30分钟。按照上文所述洗涤细胞，然后再次悬浮于250μl FACS缓冲剂/管/样品。
使用FITC缀合的通过亲和纯化的F(ab′)2片段特异性山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch Lab编号#109-096-006；以5μg/ml使用)检测细胞结合的Fab，同时使用F(ab′)2FITC缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)(JacksonImmunoResearch，编号#115-096-062；以5μg/ml使用)检测阳性鼠科对照抗体。使用碘化丙碇染色溶液(PI用于排除死细胞；BD Pharmingen编号#51-66211E或556463；在FACS缓冲剂中以1∶500的最终比例使用)对细胞进行染色以用于活细胞的测定。在FACSCalibur仪器(Becton Dickinson)上运行样品，并且每个样品收集10,000活细胞。使用GraphPad Prism4.0版软件进行数据分析(www.graphpad.com)(GraphPad Software，Inc.，11452E1CaminoReal，#215，San Diego，Calif.92130USA)。
一旦样品已经运行并确定了几何平均值，便使用Graphpad Prism(PrismGraph)绘图程序将抗体浓度(X轴)与几何平均值(Y轴)绘制成Log10。然后，将数据设定转化为X＝Log(X)(X值数据设定＝抗体浓度)，并使用非线性回归曲线拟合(Sigmoidal剂量-应答)绘图。使用Prism Graph软件生成EC50值和R2值。
通过FACS，在多个浓度下，在人HER2-CHO细胞和未转染的CHO细胞上测试由实施例1的筛选所鉴定的24种Fab，从而证实特异性(数据未显示在表1)。
12种Fab(65B03，65C10，65H09，66A12，66C01，67A02，67C12，67F10，67F11，69A09，71A06和71F10)显示出对在CHO细胞上表达的野生型HER2/ErbB具有良好的结合活性。在MDA-MB-468肿瘤细胞系(EGFR+，HER2-)上测试Fab；检测未结合的情况，表明这些Fab对HER2具有特异性。为了计算EC50的近似值，在MCF7和SKBR3肿瘤细胞系、以及人Her2-CHO和鼠科Her2-CHO细胞系上进行全滴定(数据未示出，参见表1中的概况)。此外，在使用全长鼠科HER2和犬HER2稳定转染的CHO细胞上测试12种Fab；发现1种Fab(71F10)与鼠科HER2结合，而发现9种与犬HER2结合(表1)。
实施例3：通过ELISA测量的Fab与人和小鼠的HER2/ErbB2的结合活性
通过酶连免疫吸附测试(ELISA)来测定Fab与野生型hHER2/ErbB2和mHER2/ErbB2的结合能力。
使用处于Na2CO3/NaHCO3缓冲剂(pH 9.5)中的2ug/ml未标记的Gt抗hu IgG或未标记的Gt抗huκ(SouthernBiotech，Cat#2040-01；2060-01)，以100ul/孔涂敷96孔微孔免疫II板(Fisher，Cat#14245-61)，并在4℃下过夜，而且废弃板外的涂料缓冲剂。在下一步骤中，将100ul稀释缓冲剂(处于PBS中的0.5％脱脂牛奶+0.01％硫汞撒)以及处于稀释缓冲剂的100ul单个的上清液或纯化蛋白质加入到孔中，并做两个平行试验，然后在37℃下温育1h。在使用自来水洗涤后，将100ul在Gt抗hu κ-HRP(SouthernBiotech，Cat#2060-05)的稀释缓冲剂中的1/10,000稀释液加入到各孔中，并在37℃下温育1h。洗涤后，加入100ul/孔的HRPO底物结合的TMB过氧化物酶底物/过氧化物酶溶液B(Kirdgaard and Perry Labs，Cat.50-76-00)。在5至10分钟之后，使用100ul的2M H2SO4终止反应。使用Molecular Devices平板读取器在450nm和540nm下测量OD，并生成结合曲线。
24种Fab中的22种Fab显示出对野生型hHER2/ErbB2具有中等/强的结合活性(数据未显示在表1)。仅仅Fab 71F10显示出对野生型mHER2/ErbB2具有中等/强的结合活性(数据未显示在表1)。
实施例4：抗体的交叉反应
通过RT-PCR，由Cynomologous猴肾(BioChain Institute，Inc，Hayward，CA)的肾mRNA扩增Cynomologous猴HER2cDNA。PCR引物为：对于犬HER2细胞外结构域而言，正向引物为：
GAGCCATGGGGCCGGAGCCGCAGTGAGCACCATG(SEQ ID NO：159)；反向引物为：TCGGGGCTTCTGCGGACTTGGCCTTCTGGTTCAC(SEQ IDNO：160)；对于细胞内结构域而言，正向引物为：
GCCCAACCAGGCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAG(SEQ ID NO：161)；反向引物为：CCAGATCCAAGCACCTTCACCTTCCTCAGCTCCG(SEQ IDNO：162)。将扩增的PCR产物克隆到TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen)中，并测序。将全长犬HER2cDNA组装在细胞外结构域和细胞内结构域序列的BsmBI位点处。所得的质粒称为pCR2.1犬HER2。
为了在细胞系中表达犬HER2，使用NotI和HindIII由pCR2.1犬HER2消化得到HER2cDNA，并将其克隆到处于hCMV启动子控制下的慢病毒载体质粒中。生产慢病毒载体，并将培养物上清液用于转导HEK 293细胞。
为了建立表达小鼠HER2的CHO细胞系，由包含小鼠HER2cDNA的质粒PCR扩增编码小鼠HER2的序列(MGC：62447IMAGE：570)。PCR引物：
正向引物：CATGGCGGCCGCCCGGAGCCGCAGTGATCATC(SEQ IDNO：163)；以及反向引物：
CGATGCGGCCGCGGATGTCTGCACATGTGACC(SEQ ID NO：164)。将PCR产物插入到哺乳动物表达载体pV90中。所得的质粒称为pKJS462.21。将pKJS462.21DNA转染到DG44-1CHO细胞中，并通过在具有10％透析型FBS的α-MEM(Hyclone#SH30079.03)中培养来选择稳定的整合物。将大量稳定的群体亚克隆，并选择表达高水平的HER2的单一克隆(称为3G11B)以用于使用了FACS的Fab与mHer2的交叉反应分析。该细胞系通常被称为CHO/mHer2。
使用Tubo癌细胞(衍生自大鼠HER2转基因小鼠)，通过FACS分析来分析与大鼠HER2的交叉反应。
慢病毒载体质粒的构建
得自Invitrogen试剂盒(V480-20)的pLenti6/TR通过用多克隆位点替代Tet抑制基因从而将BamH1位点与EcoR1桥接而修饰得到。将正义寡聚体
GATCCCCGGGTACCGGTCGGCGCGCCTCGAGATATCTTAATTAAG(SEQID NO：115)与反义链
AATTCTTAATTAAGATATCTCGAGGCGCGCCGACCGGTACCCGGG(SEQID NO：116)退火，并连接到经BamH1/EcoR1消化的主链中。该质粒(CK072)包含多个位于CMV启动子下游的多克隆位点，并具有驱动杀稻瘟菌素抗性标志物的SV40启动子。Cynomolgus猴HER2基因PCR得到两段，以用于测序，其中对于细胞外的部分，使用寡聚体
GAGCCATGGGGCCGGAGCCGCAGTGAGCACCATG(SEQ ID NO：117)和反义链CCAGATCCAAGC-ACCTTCACCTTCCTCAGCTCCG  (SEQ IDNO：118)；而对于细胞内的部分，使用
GCCCAACCAGGCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAG(SEQ ID NO：119)和反义链TCGGGGCTTCTGCGGACTTGGCCTTCTGGTTCAC  (SEQ IDNO：120)。PCR产物为TA-TOPO，其被克隆到pCR2.1(Invitrogen K4500-01)中，并测序。最后，将得自细胞外和细胞内质粒的共有的犬Her2序列组装(在BsmB1位点处连接)，用Spe1/Xba1消化切割，并连接到上文所述的CK072的下游Xba1位点。所得的慢病毒载体质粒(CK090.18)用于生成在靶物细胞系中过表达犬HER2的载体。
载体的生产及转导
根据制造商提供的Lipofectamine 2000(Invitrogen#11668-019)的说明书，使用Invitrogen Virapower包装混合物(K4975-00)和上文所述的慢病毒载体质粒CK90.18共转染293FT细胞(Invitrogen#R700-07)。在48小时候，收获培养物上清液，在1250g下将细胞碎片离心成团10分钟，并以0.45u过滤澄清的上清液。将上清液施加给HEK293细胞，以分辨所述的载体传递犬Her2转基因的能力。稳定转导的HEK293细胞显示出在阳性和隐性细胞的混合群体部分转基因的高水平表达。
交叉反应测试
对转导的和未转导的HEK293细胞的合并的群体处理成多种Fab，并使用FITC缀合的二级抗体染色，以用于按照以下方式进行观察。简言之，将表达犬Her2的HEK293细胞平板接种于涂敷CC2的8孔腔室玻片(Nunc#154941)上，并在温育箱中使其过夜结合(5％CO2，37℃)。用50至75ul的Dyax Fab(10mg/m1)替代生长培养基，并使它们在4℃下结合90分钟。用稀释缓冲剂(含有10％FBS的PBS)漂洗细胞，然后使用处于PBS中的4％甲醛在室温下固定20分钟。漂洗固定的细胞，并在45℃下与二级缀合的抗体温育45分钟。所述的二级抗体溶液为FITC缀合的山羊抗人κ链与山羊抗人IgGF(ab’)2特异性片段(分别为Sigma#F3761和Jackson Immun.#109-096-097)的50∶50混合物。用稀释缓冲剂漂洗各孔，从而除去未结合的抗体，然后在Zeiss Axiovert荧光显微镜下进行观察。
结果：选择用于测试的12种Fab中的9种显示出与犬HER2发生交叉反应(表1)。本测试证明，1种Fab(71-F10)显示出与mHER2/ErbB2发生中等的结合交叉反应(表1)。此外，71F10还显示出与大鼠HER2发生交叉反应(数据未示出)。
实施例5：HER2/ErbB2Fab抗原决定部位的图谱
人ErbB2ECD(SEQ ID NO：105)与恒河猴ErbB2ECD(SEQ ID NO：106)的氨基酸序列示于图4中，其具有半胱氨酸配对。人与恒河猴的残基差异为突出的部分。潜在的N糖基化位点具有下划线。
由pLXSN-HER2通过PCR得到编码人ErbB2的DNA片段。通过将各ErbB2DNA片段(人HER2/ErbB2ECD的残基Thr1-Thr196(结构域1)、Thr1-Arg318(结构域1-2)、Thr1-Asn508(结构域1-3)或Thr1-Asn630(Domains1-4))与huIgG1-Fc同框克隆到PV90载体中而生成在CHO细胞中表达的ErbB2-Fc载体。所述的蛋白质构建体称为MR066(结构域1)、MR067(结构域1-2)、MR068(结构域1-3)和MR069(全长ECD)。
蛋白质在293E哺乳动物细胞中瞬间表达。在37℃下培养4天后，收获细胞上清液，过滤，并在蛋白质A琼脂糖上纯化。使用25mM H3PO4/NaOH，0.1M NaCl，pH 2.8由柱上洗脱蛋白质，并立即用1/20体积的0.5M磷酸钠pH 8.6中和。针对纯度、通过SDS-PAGE的聚集程度以及分析SEC来评估蛋白质。使用用于各种蛋白质的在280nm下的序列预测消光系数，通过UV吸附来测定蛋白质的浓度。
通过ELISA测定65B03，66C01，67F10，67F11，71F10，69A09，66A12，65C10，65H09和67A02Fab、及对照抗HER2结合MR066，MR067，MR068和MR069的能力。使用处于PBS中的5ug/ml兔pAbs抗人Fcγ涂敷NuncMaxisorp ELISA平板，并在4℃下过夜。将平板用PBST(PBS，0.05％吐温20)洗涤1次，并在室温下用处于PBS中的1％BSA封闭1小时。将平板用PBST洗涤1次，并与1ug/ml HER2-Fc融合物蛋白质温育1小时。将平板用PBST洗涤3次，并整体加入稀释的Fab(进行4次的5倍系列稀释，起始浓度为1ug/ml)，并温育90分钟。将平板用PBST洗涤3次，并在室温下与1∶2,000的HRP标记的山羊抗人κ(Southern Biotech cat#2060-05)及HRP标记的山羊抗人γ(Southern Biotech cat#2070-05)整体温育1小时。将平板用PBST洗涤3次，与TMB溶液显色5分钟，然后使用等体积的1N H2SO4终止。在450nm下读取吸光值。结果示于图5中。
实施例6：具有δ4、G4Sδ4(SEQ ID NO：147)以及(G4S)4(SEQ ID NO：134)连接体的71F10Fab-hLIGHT融合物的构建
71F10成熟重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的蛋白质序列分别示于SEQ ID NO：11和13中。71F10重链和轻链的CDR(互补性决定区，根据Kabat命名)分别示于SEQ ID NO：47-49和74-76中。71F10VH(SEQID NO：11的残基1-97)与HV3-23VH(SEQ ID NO：107的残基1-97)之间的部分氨基酸序列的联配显示93％(91/97)一致性和95％(93/97)阳性(参数：长度＝98，得分＝186比特(471)，以及期望值＝3e-050)。HV3-23是指Genbank收录号为M99660的人种系HV3-23序列。71F10VH和VL的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：156和14中。71F10VH(SEQ ID NO：156)的核苷酸序列对于哺乳动物细胞的表达而言是密码子优化的。HV3-23VH的氨基酸和核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：107和108中。
71F10Fab-hLIGHT的构建方案如下所述。
使用在110-F1(SEQ ID NO：121)，C06-5’(SEQ ID NO：122)和039-VLR(SEQ ID NO：123)中所述的寡核苷酸引物，通过PCR扩增合成71F10VL区。5′VL PCR引物由正向引物110-F1(SEQ ID NO：121)构成，其中所述的引物包含Not I限制性内切酶位点(GCGGCCGC(SEQ ID NO：180))，引物后为编码部分轻链信号肽的序列和编码部分轻链信号肽的内部正向引物C06-5’(SEQID NO：122)，然后为与71F10VL氨基末端互补的序列。3′VL PCR引物039-VLR(SEQ ID NO：123)包括BsiW I限制性内切酶问点(CGTACG(SEQ IDNO：181))以及编码71F10VL羧基末端的序列。使用得自包含71F10VL的质粒DNA CPG169的3个PCR引物，通过编码所述的轻链信号肽的共同重叠的序列，在两个相继的PCR反应中扩增71F10VL区。将71F10VL基因片段克隆到经Not I/Bsiw I消化的、经修饰的pV100载体中，所述的载体在人κ结构域的氨基末端包含BsiW I位点。通过DNA序列分析证实正确的序列。
通过在不改变多肽序列的情况下用得自人免疫球蛋白VH数据库的共有密码子来替代、并通过同义密码子交换消除假定存在的隐蔽剪切供体和受者位点来重新编码71F10VH区。使用在VH-FR1-F(SEQ ID NO：124)，VH-FR2-R(SEQ ID NO：125)，VH-FR3-F(SEQ ID NO：126)，71F10VH-CDR1-F(SEQ ID NO：127)，71F10VH-CDR2-F(SEQ ID NO：128)，71F10VH-CDR3+FR4-R(SEQ ID NO：129)，VH-pV90-F(SEQ ID NO：130)和VH-pV90-R(SEQ ID NO：131)中所述的寡核苷酸引物，通过组装PCR扩增来合成重新编码的71F10VH区。在第一个PCR步骤中，将3个寡脱氧核苷酸构成的两组脱氧核苷酸退火并延伸，从而产生半长的产物。使用正向5′引物VH-FR1-F(SEQ ID NO：124)、正向5′引物71F10VH-CDR1-F(SEQ ID NO：125)以及反向3′引物VH-FR2-R(SEQ ID NO：126)通过PCR生成5′半段的重新编码的71F10VH，其中所述的正向5′引物VH-FR1-F由编码71F10VH构架1区的核苷酸序列构成，所述的正向5′引物71F10VH-CDR1-F(SEQ ID NO：125)由编码71F10VH CDR1区的核苷酸序列构成，所述的反向3′引物VH-FR2-R(SEQ ID NO：126)由编码71F10VH构架2区的核苷酸序列构成。使用正向5′引物71F10VH-CDR2-F(SEQ ID NO：127)、正向5′引物DyaxVH-FR3-F(SEQID NO：128)以及反向3′引物71F10VH-CDR3+FR4-R(SEQ ID NO：129)通过PCR生成3′半段的重新编码的71F10VH，其中所述的正向5′引物71F10VH-CDR2-F(SEQ ID NO：127)由编码71F10VH CDR2区的核苷酸序列构成，所述的正向5′引物DyaxVH-FR3-F(SEQ ID NO：128)由编码71F10VH构架3区的核苷酸序列构成，所述的反向3′引物71F10VH-CDR3+FR4-R(SEQ ID NO：129)由编码71F10VH CDR3和构架4区的核苷酸序列构成。在第二个PCR步骤中，使用对于所需的全长产物具有特异性的引物，由第一个PCR步骤中的两种混合物选择性地扩增全长的重新编码的71F10VH基因序列。5′正向引物VH-pV90-F(SEQ ID NO：130)，其包含独特的Mlu I限制性核酸内切酶位点(ACGCGT(SEQ ID NO：160))，其后为编码所述重链信号肽的至少3个氨基酸的序列，其后为与重新编码的71F10VH的氨基末端互补的序列，以及3′反向引物VH-pV90-R(SEQ ID NO：131)(其包含Nhe I位点(GCTAGC(SEQ ID NO：182))以及编码与重新编码的71F10VH的羧基末端互补的序列)。重新编码的71F10VH基因片段被克隆到经Mlu I/NheI消化的、经修饰的pV90载体(其包含合成重链的前导序列和Mlu I位点，其后为在IgG1CH1结构域氨基末端的BamH I位点)中。通过DNA序列分析证实正确的序列。
3种不同的连接体(SEQ ID NO：132-134)用于将71F10Fab重链与huLIGHT的氨基末端连接，并且这些连接体的氨基酸序列示于δ4(SEQ IDNO：132)，G4S δ4(SEQ ID NO：133)以及(G4S)4(SEQ ID NO：134)中。按以下所述确定优选连接体的长度：
1.使用Modeller 9，根据人IgG(pdb：1HZH)的晶体结构，通过同源建模来建立Fab的初始3D结构。5对半胱氨酸被约束而形成二硫键。3D的LIGHT/LTbR结构是根据TNFbeta/TNF-R p55(pdb：1TNR)的晶体结构而构建的。
2.使用内部程序构建具有C3对称性的三聚体Fab结构。
3.在以C3轴对准的三聚体Fab与LIGHT/LTbR之间距离的变化来进行能量分析。d为LIGHT/LTbR的一个点(Fab轴与C3轴的交叉点)与邻近点(表面与C3轴的交叉点)之间的距离。使用各种结合计算vdW的相互酌能。25A为最小距离；此外，在三聚体Fab与LIGHT之间具有明显的排斥；相互酌能为零超越(zero beyond)40A。在我们的连接体优化模型中，选择40A作为起始几何学。
构建4种不同的连接体，并使用Modeller进行评估：(G4S)2(SEQ ID NO：151)、(G4S)4(SEQ ID NO：134)、δ4(天然LIGHT连接体)和G4S+δ(SEQ IDNO：147)。结果表明(G4S)2(SEQ ID NO：151)太短，而其他的3种为合适的连接体。
在PCR反应中，使用5′正向+3′反向PCR引物、以及编码3种不同连接体的内部重叠PCR引物组，由包含huIgG1的质粒DNAN5KG1以及包含huLIGHT的pABF046来构建71F10Fab-hLIGHT融合物重链。寡核苷酸的引物描述为MB-04F(SEQ ID NO：135)，130-R1(SEQ ID NO：136)，130-F2(SEQ ID NO：137)，130-R2(SEQ ID NO：138)，131-R2(SEQ ID NO：139)，132-F2(SEQ ID NO：140)和132-R2(SEQ ID NO：141)。简言之，5′正向引物MB-04F(SEQ ID NO：135)，其包含Age I位点(ACCGGT(SEQ ID NO：161))，其后为与IgG1CH1区互补的序列。3′反向引物130-R1(SEQ ID NO：136)，其包含BamH I位点(GGATCC(SEQ ID NO：177))以及编码与huLIGHT的羧基末端互补的序列。内部重叠的PCR引物组的5′正向引物130-F2(SEQ IDNO：137)和132-F2(SEQ ID NO：138)包括3种部分连接体，其后为与氨基末端huLIGHT互补的序列。内部重叠的PCR引物组的3′反向引物130-R2(SEQ IDNO：139)、131-R2(SEQ ID NO：140)和132-R2(SEQ ID NO：141)包含编码部分IgG1铰链的序列，其后为3种部分连接体。然后使用编码重叠的3种连接体的序列，用Age I和BamH I限制性核酸内切酶消化，再连接到Age I/BamHI消化的71F10IgG1重链载体中，最终组装成PCR片段。该操作得到71F10Fab重链与huLIGHT的氨基末端形成的融合产物。通过DNA序列分析证实正确的序列。
71F10轻链载体(pBIIB71F10-129)通常用于71F10Fab-hLIGHT融合物中，并且本文公开DNA(SEQ ID NO：110)和氨基酸(SEQ ID NO：109)。71F10Fab-hLIGHT  融合物(pBIIB71F10-130、pBIIB71F10-131和pBIIB71F10-132)的重链DNA和氨基酸序列在本文中分别描述为SEQ IDNO：2-4和6-8，并且本文还描述物理及化学参数。
使用QuikChange Multi定点突变试剂盒(Stratagene Cat#200513)，使用71F10IgG重链(pBIIB71F10-134)作为模板来构建71F10agly IgG重链(pBIIB71F10-137)。通过包含所需突变的引物137-F，在CH2结构域中的位置299(Kabat编号)处，苏氨酸变为丙氨酸。71F10IgG重链(pBIIB71F10-134)的DNA和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：157和158中。71F10agly IgG重链(pBIIB71F10-137)的DNA和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：153和154中。71F10轻链载体(pBIIB71F10-129)共同用于71F10IgG和71F10agly IgG抗体中。
用于71F10agly IgG重链的定点突变的寡核苷酸(正向5’PCR引物137-F)为
5’-GAGGAGCAGTACAACAGCGCCTACCGTGTGGTCAGCGTC-3’(SEQID NO：155)，其包含所需的点突变密码子(带有下划线)。
实施例7：抗CD23Fab-hLIGHT融合物BIIB CD23-204的构建
使用在204-F(SEQ ID NO：142)和DyaxVH-pV90-R(SEQ ID NO：143)中描述的寡核苷酸引物，通过PCR扩增合成抗CD23VH区。5′正向引物204-F(SEQ ID NO：142)，其包含独特的Mlu I限制性核酸内切酶位点(ACGCGT(SEQ ID NO：160)，其后为编码重链信号肽的至少3个氨基酸的序列，其后为与抗CD23VH的氨基末端互补的序列。3′反向引物DyaxVH-pV90-R(SEQ ID NO：143)，其包含Nhe I位点GCTAGC(SEQ IDNO：182)以及编码与抗CD23VH的羧基末端互补的序列。由包含抗CD23VH基因的质粒DNA pBIIB CD23-121，在PCR反应中扩增抗CD23VH区。将抗CD23VH基因片段克隆到经Mlu I/Nhe I消化的pBIIB71F10-132中。通过DNA序列分析证实正确的序列。所得的载体称为pBIIBCD23-204。抗CD23轻链载体(pBIIBCD23-178)用于抗CD23Fab-hLIGHT融合物中。抗CD23Fab-hLIGHT融合物的轻链的DNA和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：104和103中。抗CD23Fab-hLIGHT融合物(pBIIBCD23-204)的重链的DNA和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：173和174中。与71F10Fab的重链相应的氨基酸和核苷酸序列示为：由N末端开始，其后为与所述的连接基团(氨基酸224至243)相应的氨基酸，其后为与人LIGHT细胞外结构域相应的氨基酸(氨基酸244至391)。
此外，使用(G4S)3(SEQ ID NO：148)连接体制得第二抗CD23Fab-hLIGHT融合物，以用于评估(数据未示出)。具有(G4S)3连接体的抗CD23Fab-hLIGHT融合物的轻链的DNA和氨基酸序列分别示于SEQID NO：104和103中。具有(G4S)3连接体的抗CD23FAb-hLIGHT融合物的重链的DNA和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：102和101中。与71F10Fab的重链相应的氨基酸和核苷酸序列示为：由N末端开始，其后为与所述的连接基团(氨基酸222至236)相应的氨基酸，其后为与人LIGHT细胞外结构域相应的氨基酸(氨基酸237至384)。
实施例8：CHO细胞中71F10Fab-hLIGHT融合物的表达
用于表达的71F10构建体的概况示于图6中。
71F10Fab-hLIGHT在CHO细胞中的瞬间表达
将宿主DG44悬浮细胞保持在CD-CHO(25％)和DMEM/F12(75％)中，并实施两种相同的转染。对于各个转染而言，将细胞以7.5x105细胞/孔的量接种于6孔平板中，并培养24小时；然后使用FuGENE转染试剂(Roche)，根据制造商的方案，用1μg pBIIB71F10-129(轻链在pV100中)以及1μgpBIIB71F10-130，pBIIB71F10-131，pBIIB71F10-132，pBIIB71F10-134或pBIIB71F10-137(重链在pV90中)转染所述的细胞。RR399载体(其包含具有初始VH序列的71F10IgG1agly重链)用作在CHO细胞表达中的对照。48小时后，收获上清液，并通过Octet(ForteBio)根据制造商方案的定量方法，使用代用标准品来测定效价。得自瞬间转染的71F10Fab/Hlight融合物的效价为0.06ug/ml(pBIIB71F10-137)，1.6ug/ml(pBIIB71F10-134)，0.9ug/ml(pBIIB71F10-130)，0.2ug/ml(pBIIB71F10-131)和1.0ug/ml(pBIIB71F10-132)。
71F10Fab-hLIGHT在CHO细胞中的稳定表达
将宿主DG44悬浮细胞保持在CHO-SSFMII(Invitrogen)中，并实施两种相同的转染。对于各个转染而言，将细胞以7.5x105细胞/孔的量接种于6孔平板中，并培养24小时；然后使用FuGENE转染试剂(Roche)，根据制造商的方案，用1μg pBIIB71F10-129(轻链在pV100中)以及1μg pBIIB71F10-130，pBIIB71F10-131，pBIIB71F10-132，pBIIB71F10-134或pBIIB71F10-137(重链在pV90中)转染所述的细胞。48小时后，将得自两种转染的细胞合并，并分入3个T-75烧瓶中，其中每个烧瓶包含15ml CHO-SSFMII，并且补充有400μg/ml艮他霉素(genticin)(Invitrogen)。在两周或三周选择后，将储存或作为未储存的集合的细胞在CHO-SSFMII中使用400μg/ml艮他霉素、然后在BCM16中使用400μg/ml艮他霉素来按比例增加以进行制备运行。在运行结束时，收获上清液，并通过Octet(ForteBio)，使用代用标准品来测定效价。
Octet.测试
通过生物膜层干涉仪(Octet QK System，FortéBio，Inc.Menlo Park，CA)来分析Fab-LIGHT融合物。将抗人Fc特异性生物传感器(Fortebio SKU 18-0001)在OB(1X PBS，补充有1mg/ml BSA，0.05％NaN3和0.02％TWEEN 20)水化至少5分钟，然后进行测试。对于各测试而言，将各个受体-Fc融合物在OB中稀释至10μg/ml，并使其与生物传感器结合5分钟。然后，将所述的传感器在指定的培养物上清液中再温育5分钟，然后转移至新鲜孔中。作为对照，在本测试中还检测了71F10Fab(10μg/ml在OB中)的性能。使用制造商提供的软件计算解离常数(kd)，并将解离速率与71F10Fab的kd比较。
实施例9：71F10Fab-hLIGHT融合物蛋白质的纯化
通过以下所述的方法纯化并表征在CHO细胞中生产的融合物蛋白质。
蛋白质A的捕获：使用3倍柱体积的1×PBS(平衡缓冲剂)以100-150cm/hr的速度预平衡蛋白质A柱。以每毫升残余物包含10mg 71F10Fab-hLIGHT的最大量以150cm/hr的速度加载上清液。加载后，用5倍柱体积的平衡缓冲剂洗涤柱。然后，用100mM甘氨酸pH 3.0以上流方向洗脱柱。收集所需的级分，并用2M Tris碱滴定至中性pH。针对1xPBS透析所收集的级分，并浓缩材料以便为体积排阻步骤作准备。
SUPERDEX(r)200(体积排阻)聚集物除去步骤涉及使用1.5倍体积的1xPBS以36cm/hr的流速平衡SUPERDEX(r)200，然后加载蛋白质并收集所需的级分。
按照以下方式进行性质测试
1)通过质谱进行完整质量分析，其中在电喷雾质谱仪(ESI-MSD)上进行分子质量的测量。在分析之前，还原样品从而除去二硫键。去卷积质谱代表重链和轻链的质量。
2)使用装配有在线PTH分析仪的ABI蛋白质测序仪，通过Edman降解来进行N末端序列分析。鉴定轻链和重链的初始氨基酸的序列。
3)使用质朴分析来绘制肽图谱：通过由各肽所生成的LC/MS数据的分析，绘制色氨酸或/和EndoLysC肽图谱，从而得到完整范围的序列。此外，检测所确定的位点以及氧化和脱酰胺的量。
通过以下步骤进行纯度测试：1)SDS-Page或CE-SDS：还原和非还原的样品，该技术用于测量抗体片段、聚集物和杂志；2)具有LS和RI技术的SEC-HPLC用于测量聚集物和片段，并且LIGHT散射测定了样品部分的摩尔质量；3)SDS凝胶或毛细管IEF方法用于测定得自C和N末端异质性和/或脱酰胺的电荷同种型的等电聚焦图案以及pI分布。
最后，通过鲎阿米巴样细胞裂解物(LAL)动力学比浊度分析方法来测量内毒素的浓度。
实施例10：71F10Fab-hLIGHT融合物蛋白质的结合活性
使用纯化的71F10Fab作为标准品，通过ELISA定量由293E细胞瞬间表达的71F10Fab-Light融合物蛋白质和71F10mAb的浓度。通过与对抗人κ链(80ul/孔，5ug/ml处于PBS中的溶液)的山羊抗体在4-8℃下温育过夜来涂敷96孔平板的孔。倒空各孔，并完全填满具有1％BSA的PBS溶液(封闭缓冲剂)，并在室温下温育1小时。倒空各孔，用包含0.05％吐温20(PBST)的PBS洗涤2次，并填满在另一个96孔平板中制备的样品(80ul/孔的3x系列稀释的处于封闭缓冲剂中的标准品和上清液)。在室温下温育2小时后，倒空各孔，用PBST洗涤3次，并用HRP缀合的山羊pAbs抗人κ链溶液(80ul/孔的2000倍稀释液，处于封闭缓冲剂中)填满。在温育1小时后，倒空各孔，并填满新鲜制备的HRP底物溶液。留下该溶液进行3分钟的显色，并通过加入等体积的1N H2SO4终止。使用板读取器(SpectraMax，Molecular Devices)在450nm下测量吸光值。对数据进行处理并使用SoftMax Pro软件绘图。
相似的ELISA样式用于比较对照抗HER2抗体、对照抗HER2抗体Fab、71F10Fab、71F10mAb和71F10Fab-Light融合物蛋白质与人(图7)或鼠科(图8)HER2-Fc的结合情况。对照抗HER2抗体得自Pharmaceuticals BuyersInternational，Inc。对照抗HER2抗体的Fab是使用标准的技术通过有限木瓜蛋白酶消化而制备得到的。人和鼠科HER2-Fc(其为由HER2的细胞外结构域与人IgG1的Fc片段构成的同源二聚体融合物蛋白质)得自R&D Systems。使用相同的方案进行ELISA，然后不同之处在于所述的孔使用鼠科或人HER2-Fc涂敷，而并非使用山羊抗人κ抗体。
实施例11：71F10Fab-hLIGHT三聚体的表征
Fab、mAb和Fab-Light融合物蛋白质通过在蛋白质A琼脂糖以及体积排阻上的色谱来纯化，从而分离基本缺乏聚集物的材料。使用序列预测消光系数，通过在280nm下的吸光值来定量经纯化的蛋白质。通过SDS-PAGE和体积排阻HPLC来评估纯度。使用具有Waters Alliance HPLC仪器的PBS中的BioSep 3000柱(Phenomenex)，通过SEC/静态光散射来测量分子质量，其中所述的仪器与折射率检测器(Waters)和光散射检测器(PD2000，PrecisionDetectors)偶联。使用Precision Detector软件测定平均分子质量(图9)。
实施例12：71F10Fab-hLIGHT/shuLTBR络合物的SEC/LS分析
通过人LTBR-Ig的有限蛋白水解消化制备可溶性人LTBR(shuLTBR)，并通过蛋白质A琼脂糖和Fractogel TMAE上的色谱来纯化。在4-8℃下，71F10Fab-(G4S)4-LIGHT(SEQ ID NO：134)与5倍摩尔过量的shuLTBR过夜温育。此外，具有各蛋白质的对照也包含在内。使用具有Waters Alliance HPLC仪器的PBS中的BioSep 3000柱(Phenomenex)来分析样品。结果显示形成了较高分子量的络合物，证明Fab-Light能够结合受体(数据未示出)。光散射分析数据的精确性不能进行确切的化学计量学(对于1个Fab-Light三聚体为2或3shuLTBR)的计算。
实施例13：通过ELISA测量的经纯化的LIGHT融合物蛋白质BIIB71F10-132与受体的结合情况
通过ELISA测试71F10Fab或BIIB71F10-132LIGHT融合物蛋白质(系列稀释)与人或鼠科HER2-Fc的结合情况。人和鼠科ErbB2-Fc得自R&DSystems。使用2ug/ml或0.2ug/ml的人或鼠科HER2-Fc，通过在4-8℃下与所述的6种蛋白质(80ul/孔，0.2或2ug/ml处于PBS中的溶液)的任意一者温育过夜，来涂敷96孔平板的孔。倒空各孔，完全填满具有1％BSA的PBS溶液(封闭缓冲剂)并在室温下温育1小时。倒空各孔，用包含0.05％吐温20的PBS(PBST)洗涤2次，并用在另一个96孔平板中制备的样品填满(80ul/孔的3x系列稀释的处于封闭缓冲剂中的标准品和上清液)。在室温下温育2小时后，倒空各孔，用PBST洗涤3次，并填满HRP缀合的山羊pAbs抗人κ链(80ul/孔的2000倍稀释液，处于封闭缓冲剂中)的溶液。在温育1小时后，倒空各孔，并填满新鲜制备的HRP底物溶液。留下该溶液进行3分钟的显色，并通过加入等体积的1N H2SO4终止。使用板读取器(SpectraMax，Molecular Devices)在450nm下测量吸光值。对数据进行处理并使用SoftMaxPro软件绘图。结果表明LIGHT融合物的HER2结合活性是HER2受体密度依赖性的，即，当HER2抗原大量地存在于经涂敷的平板上时(2ug/ml)，亲和性较高。结果示于图7和8中。
使用上文所述的方案，通过ELISA(图10A和10B，以及表2)测试Flag-huLIGHT(对照)或BIIB71F10-132LIGHT融合物(系列稀释)与人或鼠科LTBR-Ig的结合情况，不同之处在于所述的平板使用2ug/ml或0.2ug/ml的人或鼠科LTBR-Ig涂敷；并且使用HRP缀合的抗Flag mAb或山羊抗人κpAb。人和鼠科LTBR-Ig在内部表达和纯化。在受体密度高的情况下，71F10Fab-hLIGHT显示出对hLTbR和mLTbR具有高的亲和性。在受体密度低的情况下，71F10Fab-hLIGHT显示出对hLTbR具有高的亲和性，对mLTbR具有中等的亲和性。
使用上文所述的方案，通过ELISA(图11A和11B，以及表2)测试Flag-huLIGHT(对照)或BIIB71F10-132(系列稀释)与人或鼠科HVEM-Ig(疱疹病毒侵入介质-Ig)的结合情况，不同之处在于所述的平板使用2ug/ml或0.2ug/ml的人或鼠科LTBR-Ig涂敷；并且使用HRP缀合的抗Flag mAb或山羊抗人κpAb。人和鼠科HVEM-Ig在内部表达和纯化。
71F10-hLIGHT融合物蛋白质的结合活性概括于表2中。
实施例14：LIGHT融合物蛋白质与高表达Her2的SKBR3细胞的结合
方法：SK-BR-3细胞系得自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection(Rockville，MD))。在补充有10％热钝化胎牛血清(FBS)和1.5mM L-谷氨酰胺的McCoy’s 5a培养基中。PE缀合的山羊抗小鼠F(ab’)2特异性抗体购自Jackson ImmunoResearch(West Grove，PA)。将SK-BR-3细胞暴露于各种浓度的71F10-LIGHT融合物蛋白质(BIIB71F10-130，BIIB71F10-131和BIIB71F10-132)中。对照抗HER2Fab，71F10Fab和71F10IgG(BIIB71F10-134)用作对照。在FACS缓冲剂(包含5％FBS和0.02％叠氮化钠的PBS)中洗涤样品，并使用PE缀合的山羊抗小鼠F(ab’)2特异性抗体复染色。最后洗涤细胞，并将其再次悬浮于含有1％聚甲醛的FACS缓冲剂中。将固定的样品在FACScan流式细胞计数仪(Becton Dickinson，Sunnyvale，CA)上分析。
结果：与71F10Fab相比，三聚体71F10Fab-hLIGHT显示出对SKBR3细胞具有明显较高的结合活性，推测是由于亲和力增大(图12)。
实施例15：hLIGHT融合物蛋白质与CHO/hHER2细胞的结合可以通过LTbR-Ig或HER2-Fc来阻断
方法：初始CHO细胞系得自美国典型培养物保藏中心，并按照实施例4所述进行修饰从而使其表达hHER2。选择表达高水平的HER2的克隆KS19用于试验。在6孔培养平板中，在补充有10％热钝化的FBS的DMEM中培养KS19细胞。将KS19细胞在浓度为0.2nM的BIIB71F10-130，BIIB71F10-131，BIIB71F10-132和BIIB71F10-MAB下暴露1h。在分开的组中，将融合物蛋白质和BIIB71F10-MAB与hLTbR-Ig(20mg/ml)或HER2-Fc(20mg/ml)预温育。小鼠抗LTbR mAb(AC H16)，hLIGHT和71F10Fab用作对照(数据未示出)。在FACS缓冲剂中洗涤样品，并使用PE缀合的山羊抗小鼠F(ab’)2特异性抗体复染色。最后洗涤细胞，并将其在FACScan流式细胞计数仪上分析。
结果：71F10-hLIGHT融合物蛋白质与CHO/hHER2细胞的结合可以被LTbR-Ig或HER2-Fc阻断(图13)。这些结果表明LIGHT和HER2特异性的Fab能够与其CHO细胞表面上的受体结合。这种结合是特异性的，并被其受体融合物蛋白质(即，LTbR-Ig或HER2-Fc蛋白质)所竞争。阻断效果的水平取决于细胞表面上的受体数量。其显示，在KS10细胞上，hHER2受体比LTbR要更多。
实施例16：LIGHT融合物蛋白质能够同时占据细胞表面上的HER2和hLIGHT受体LTbR和HVEM
方法：在4℃下，将KS19细胞在浓度为0.2nM的BIIB71F10-130，BIIB71F10-131，BIIB71F10-132和BIIB71F10-134，IgG中暴露1h。在使用FACS缓冲剂洗涤后，将各组细胞与单独的FACS缓冲剂、hLTbR-Ig(20ug/ml)或HVEM-Fc(20ug/ml)温育30分钟，然后再次洗涤。对于与FACS缓冲剂温育的一组而言，将细胞用PE缀合的山羊抗小鼠F(ab’)2特异性抗体复染色；对于与hLTbR-Ig或HER2-Fc接触的几组而言，将细胞用PE缀合的山羊抗人Fc特异性抗体(Jackson ImmunoResearch)染色30分钟。最后，洗涤细胞，并在含有1％聚甲醛的FACS缓冲剂中固定。将样品在FACScan流式细胞计数仪上分析(图14)。
结果：3种融合物蛋白质的两个末端(71F10Fab和LIGHT)同时为功能性的，具有识别HER2的71F10Fab位点以及与LTβR-Ig或HVEM-Ig结合的LIGHT末端。
实施例17：71F10Fab-hLIGHT融合物蛋白质在体外使T细胞增殖增强
方法：在4℃下，将平底96孔平板与未达到最佳浓度的抗CD3mAb(0.25mg/孔)过夜预涂敷。随后，在37℃下，在各种浓度的hLIGHT，BIIB71F10-134IgG和71F10-LIGHT融合物蛋白质(BIIB71F10-130，BIIB71F10-131以及BIIB71F10-132)存在下，将得自天然Balb/c小鼠的尼龙毛柱纯化的T细胞培养72h。抗CD28mAb用作对照。在最近的18h内，加入[3H]TdR(1uCi/孔)。使用Tomtec Harvester Mach III M细胞收集器(Hamden，CN)收获平板，并使用MicroBeta液体闪烁及发光计数器(Wallac，Turku，Finland)测量放射性。通过绘制引入的[3H]TdR的百分率(与使用单独的抗CD3mAb进行处理的细胞相比，其中所述的细胞作为100％)，确定T细胞增殖的增加情况。
结果：在未达到最佳的抗CD3抗体的存在下，hLIGHT融合物蛋白质增强了原代小鼠T细胞的增值(图15)。这些结果表明所述的融合物蛋白质仍保持为T细胞增殖的活性共刺激分子。在抗CD3不存在的条件下，LIGHT融合物蛋白质显示出对T细胞增殖不具有活性。
实施例18：71F10Fab-hLIGHT融合物蛋白质对肿瘤细胞生长的抑制
重组hLIGHT蛋白质对SKBR3肿瘤细胞生长的抑制
方法：将人乳腺癌细胞系SKBR-3细胞以1.0x104细胞/孔的量接种于平底96孔平板的McCoy’s 5a中，并使其粘附过夜。然后，将细胞用各种浓度的hLIGHT处理。作为对照组，将hLIGHT与hLTβR-Ig(20ug/ml)预温育，从而阻断LIGHT与肿瘤细胞表面上的LTbR的结合活性。将激动性抗LTβRmAb(CBE11)和对照抗HER2抗体用作对照。将平板温育72h，然后用[3H]TdR(1μCi/孔)脉冲6h。收获平板，然后测量[3H]TdR的引入情况。
结果：使用重组hLIGHT蛋白质的治疗导致SKBR-3细胞的生长受到抑制。hLIGHT的抑制作用可以通过加入LTbR-Fc而特异性地阻断，表明这种抑制活性取决于hLIGHT/LTbR的相互作用。相反，激动性的抗体CBE11未显示出任何抑制作用，并且任意的测试浓度以及对照抗HER2抗体证明在较高的抗体浓度(＞2nM)下生长受到抑制(图16)。
hLIGHT融合物蛋白质对SKBR-3细胞生长的抑制
根据在以上部分描述的方法，在SKBR-3细胞上测试3种LIGHT融合物蛋白质的生长抑制活性。简言之，将SKBR-3细胞接种于平底96孔平板上(1.0x104/孔)，并过夜。然后，用浓度增加的BIIB71F10-130、-131、-132和-134(BIIB71F10mAb对照)处理所述的细胞。再次使用对照抗HER2抗体。将平板在37℃、5％CO2温育箱中温育72h，然后用[3H]TdR脉冲6h。收获平板，并用MicroBeta液体闪烁及发光计数器测量。
结果表明所有3种hLIGHT融合物蛋白质显示出有效的抑制SKBR-3细胞生长的活性。但是，与在hLIGHT中(其中抑制与hLIGHT的浓度相关(见上文))所看见的不同，所有3种LIGHT融合物蛋白质仅在较低的浓度下抑制细胞的生长，而在较高的浓度下失去它们的抑制活性。这种生长抑制的样式可描述为“U”型细胞生长抑制(图17)。推测，这是LIGHT诱导的抑制作用与三聚体Fab靶向的抗性或这些细胞生长promoton的之间的平衡的结果。此外，还表明对照抗体或BIIB71F10-134mAb(IgG)未显示出生长促进或抑制作用。
LIGHT融合物蛋白质在SKBR-3细胞中作用研究的机制
按照上文所述的方法建立SKBR-3细胞生长的抑制试验。所述的治疗仅使用一种融合物蛋白质BIIB71F10-132。除了BIIB71F10-132LIGHT融合物蛋白质处理之外，还在RT下将BIIB71F10-132分别与LTbR-Ig(20ug/ml)或Her2-Fc(20ug/ml)预温育30分钟，然后用于治疗。此外，将对照抗HER2抗体和重组hLIGHT用作其他的对照。结果示于图18中。此外，单独的BIIB71F10-132处理显示出“U”型抑制曲线(图17)。相反，通过与Her2-Fc预温育来阻断Her2与LIGHT融合物蛋白质的结合活性会去除“U”型曲线的尾巴，即，抑制三聚体Fab的生长促进信号，并显示出在hLIGHT中所看见的相似的生长抑制情况。而LTβR-Fc对LIGHT功能的阻断会完全阻断LIGHT融合物蛋白质的抑制活性，表明所述的抑制作用是LIGHT/LTβR相互作用依赖性的。
hLIGHT融合物蛋白质对BT474细胞的生长抑制作用
将处于具有10％FBS的RPMI1640中浓度为0.1x106细胞/ml的BT474细胞平板接种(100μl/孔)于平底96孔平板中，并使其粘附过夜。然后，将细胞用200μl不同浓度的单独的BIIB71F10-132、单独的71F10mAb、单独的hLIGHT、与hLIGHT(200nM)混合的不同浓度的71F10mAb、或者与不同浓度的hLIGHT(200，20，2，0.2和0.02nM)组合的71F10mAb(2.5nM)进行处理。使用对照抗HER2抗体。将所述的平板温育72h，然后用[3H]TdR脉冲6h。用MicroBeta液体闪烁及发光计数器测量放射性。
结果：71F10Fab-hLIGHT融合物蛋白质、hLIGHT以及BIIB71F10-134(71F10mAb)在乳腺癌细胞系BT474细胞中均显示出有效的生长抑制作用(图19)。当靶向mAb时，将71F10mab与hLIGHT一起加入，在这些细胞中未观察到有明显的协同作用。与SKBR-3细胞的结果相比，未观察到“U”型生长抑制曲线。这些结果表明不同的细胞系对LIGHT融合物蛋白质的处理极为不同。
实施例19：71F10-hLIGHT融合物蛋白质的内化作用
内化作用的测试(Fab)
将SKBR3细胞平板接种于CC2涂敷的8孔腔室玻片(Nunc#154941)上，并在温育箱中使其过夜结合(5％CO2，37℃)。用50至75ul的Dyax Fab(10mg/ml)替代生长培养基，并使它们在4℃下结合15分钟。Santa Cruz抗人Neu单克隆抗体(9G6)Sc-08用作阳性对照，因为其可以通过与二级抗体交连而快速内化。将一组玻片移至37℃下并保持1小时。将经SC08处理的孔改变为包含Alexa Fluor488缀合的山羊抗小鼠IgG抗体的溶液(InvitrogenA-11029)，并且在37℃下的温育再持续1小时。用稀释缓冲剂(含有10％FBS的PBS)洗涤各孔。将细胞用处于PBS中的4％甲醛在室温下固定10分钟。用稀释缓冲剂洗涤玻片。在室温下，用处于PBS中的0.2％Triton X使细胞渗透15分钟。洗涤玻片，然后在4℃下与FITC缀合的山羊抗人κ链与山羊抗人IgG F(ab’)2特异性片段(分别为Sigma#F3761和Jackson Immun.#109-096-097)的50∶50混合物温育45分钟。用稀释缓冲剂洗涤玻片，除去腔室，并加入含DAPI(Vector Laboratories#H-1200)的Vectashield，然后放上盖玻片。使用Leica Confocal显微镜捕获图像堆，并选择集中于中心平坦区域的一堆图像用于附图。
结合测试
将SKBR3细胞平板接种于CC2涂敷的8孔腔室玻片(Nunc#154941)上，并在温育箱中使其过夜结合(5％CO2，37℃)。将一个孔用传递鼠科LIGHT基因的腺病毒载体进行处理以用于阳性对照。第二天，用100ml测试抗体(10mg/ml)替代生长培养基，并在4℃下使它们结合1小时。用稀释缓冲剂(含有10％FBS的PBS)洗涤细胞，并加入100ml LTβR-人Fc融合物，并在4℃下使其结合1小时。洗涤细胞，然后在4℃下将玻片与FITC缀合的山羊抗人Fc(γ)片段特异性抗体(Jackson Immun.#109-096-098)温育1小时。用稀释缓冲剂洗涤玻片，除去腔室，并加入含DAPI(Vector Laboratories#H-1200)的Vectashield，然后放上盖玻片。使用Leica Confocal显微镜捕获图像堆，并选择集中于中心平坦区域的一堆图像用于附图。
结果：71F10-hLIGHT融合物蛋白质对肿瘤细胞表面展示出功能hLIGHT(数据未示出)。
内化作用的测试(Fab-LIGHT融合物蛋白质)
方法：与上文所述的结合测试方法相似，将SKBR3和BT474细胞平板接种于CC2涂敷的8孔腔室玻片(Nunc#154941)上，并在温育箱中使其过夜结合(5％CO2，37℃)。用0.1ml的处理抗体(1ug/ml SC08和100nM融合物以及对照抗HER2抗体)替代生长培养基，并使它们在4℃下结合15分钟。Santa Cruz抗人Neu单克隆抗体(9G6)Sc-08用作阳性对照，因为其可以通过与二级抗体交连而快速内化。将一组玻片移至37℃下并保持90分钟。将经SC08处理的孔改变为包含Alexa Fluor 488缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(Invitrogen A-11029)的溶液，并且在37℃下的温育再持续30多分钟。用稀释缓冲剂(含有10％FBS的PBS)洗涤各孔。将细胞用处于PBS中的4％甲醛在室温下固定10分钟。用稀释缓冲剂洗涤玻片。在室温下，用处于PBS中的0.2％Triton X使细胞渗透15分钟。洗涤玻片，然后在4℃下与FITC缀合的山羊抗人κ链与山羊抗人IgG F(ab’)2特异性片段(分别为Sigma#F3761和Jackson Immun.#109-096-097)的50∶50混合物温育45分钟。用稀释缓冲剂洗涤玻片，除去腔室，并加入含DAPI(Vector Laboratories#H-1200)的Vectashield，然后放上盖玻片。使用Leica Confocal显微镜捕获图像堆，并选择集中于中心平坦区域的一堆图像。
结果：在试验条件下，71F10Fab-hLIGHT融合物蛋白质(BIIB71F10-130，BIIB71F10-131，BIIB71F10-132)未显示出内化作用(对SKBR3进行共焦显微方法)。
实施例20：hLIGHT融合物蛋白质对促炎基因的诱导
对由LIGHT融合物蛋白质诱导的促炎基因的定量PCR分析
方法：将HT29细胞接种于6孔平板中，当达到大约80％汇合时进行处理。24小时之后，将它们再次补充新鲜的培养基，或者含有4nMBIIB71F10-130的新鲜培养基，并将其温育24小时以上。在收获时，估计细胞为1E6/孔。使用Qiagen RNeasy小型提取试剂盒(#74104)，根据制造商提供的说明书(包括脱氧核糖核酸酶的处理以除去任何染色体的污染)来分离RNA。使用得自SuperArray Bioscience Corporation(#C-03)的试剂盒进行第一条链cDNA的合成。使用SuperArray“人炎症细胞因子和受体”96孔阵列平板(#PAHS-011)、RT Sybr Green PCR Master Mix(SuperArray#PA-012)并根据制造商的建议在ABI 7300实时PCR循环仪来进行QPCR。将得自热循环仪的数据输入“RT2PCR阵列数据分析软件”(SuperArray提供有阵列)。简言之，在将数据归一化以用于控制样品制备(逆转录和PCR)的多个步骤以及5种看家基因的面板之后，将它们以经处理的数据除以未经处理的数据的形式(其在基因表达中显示为“倍数变化”)来表示。
结果：使用LIGHT融合物#130对HT29细胞进行处理使得促炎趋化因子和细胞因子的表达会显著变化。当我们比较经处理的转录物和未处理的转录物时，84种基因中的大多数是上调节的，少数是下调解的。这表明，当融合分子的LIGHT的末端占据LTbR时，它引发了基因的表达转变为促炎状态。显示出高倍数变化的基因取样示于表3中。
LIGHT融合物蛋白质对IP-10和IL-8分泌的刺激作用
方法：将HT29细胞以3x104/孔的量平板接种于96孔平板中，并使其粘附过夜。将细胞再次补充处于包含100u/ml IFNg的培养基(总体积为100ul/孔)中的稀释试剂。24小时后，收集上清液，并离心形成团状细胞碎片。经澄清的上清液在冰上存放过夜。根据制造商提供的说明说使用用于人CXCL8/IL-8(#D8000C)和人IP-10(#DIP100)的R+D Systems QuantikineELISA试剂盒。对于IL-8ELISA，以1∶90的总量稀释样品；对于IP-10ELISA，以1∶30的量稀释样品。上述数据以ng/ml的IP-10或IL-8来绘图(相对于摩尔处理浓度)。
结果：71F10Fab-hLIGHT融合物蛋白质刺激了HT29细胞中IP-10和IL-8的分泌。
实施例21：抗HER2Fab，mAb以及LIGHT融合物蛋白质的HER2信号传递分析
HER2，Akt和MAPK的磷酸化的作用
方法：将5x105MCF7，SKBR3，BT474或N87细胞/孔平板接种于6孔平板中，体积为1mL。在24h后，将1mL 200nM的指定试剂溶液(Fab，mAb，对照抗HER2抗体或LIGHT融合物蛋白质)加入到各孔中，从而得到2mL100nM的溶液。在经历需要的温育时间(1，6，24或72小时)之后，除去培养基，并用PBS将细胞洗涤1x。使用包含蛋白酶和磷酸酶(分别为Mini-complete和PhosStop；分别为Roche Applied Bioscience cat#11836153001和04906837001)抑制剂的500uL RIPA缓冲剂(20mM MOPS pH 7.0，150mM氯化钠，1％NP40，1％脱氧胆酸盐，0.1％SDS)裂解细胞。将裂解物收集在微型离心管中，并存放在4℃下。使用Micro BCA Protein Assay试剂盒(Piercecat#23235)测定全蛋白质的浓度。以每孔10ug全蛋白质的量在处于200V的
Figure BDA0000072591770001301
Novex 4-12％Bis-Tris Gel(Invitrogen cat#.Gels，使用
Figure BDA0000072591770001302
MOPS SDS Running Buffer运行)(Invitrogen cat#NP0001)上加载1h。使用转移缓冲剂(12.5mM Tris，96mM甘氨酸，20％甲醇)，将印在PCDF膜(Invitrogencat#LC2002)上的凝胶在30V下运行1h。将膜在TBS-T(使用0.1％Tween20缓冲的1X Tris)中漂洗，并在R/T下在StartingBlock T20(TBS)封闭缓冲剂(Pierece cat#37543)中封闭1h，同时进行温和地摇动。将初级抗体(Her2(#2242)，磷酸Her2(#2249)，Akt(#4691)，磷酸Akt(#4060)，MAPK(#4695)，磷酸MAPK(#4370)，均得自Cell Sigaling Technology，Beverly，MA)加入到封闭缓冲剂中。将印记与抗体在4℃下过夜并温和地摇动。将印记在TBS-T中彻底洗涤。将HRP缀合的驴抗兔IgG(H+L)(JacksonImmunocat#711-035-152)二级抗体以1∶10000的浓度加入到封闭缓冲剂中。将印记在R/T下温育1小时，并温和地搅拌。在温育后，将印记用TBS-T彻底洗涤，并按照说明书加入ECL Plus试剂(GE Healthcare Life Science cat#RPN2132)。将印记暴露于X射线薄膜(Kodak BioMax XAR cat#165-1454)，并显色。备选地，将印记与检测抗体在4℃下温育过夜，并进行温和地搅拌。将印记在TBS-T中彻底地洗涤，将缀合DyLight 680(Pierce cat#35518)的山羊抗小鼠IgG(H+L)以及缀合DyLight 800(Pierce cat#35571)的山羊抗兔IgG(H+L)二级抗体以1∶10000的浓度加入到一个容器中的封闭缓冲剂中，并在R/T下温育1小时，并进行温和地搅拌。然后，用TBS-T彻底地洗涤印记。在Licor Odyssey红外线扫描仪上观察印记。
结果：
与对照抗HER2抗体在6或72小时时所观察到的相比，没有抗HER2Fab显示出诱导HER2，MAP激酶和AKT的磷酸化(数据未示出)。
在转变为全长抗体之后，BIIB71F10-134在MCF7细胞中缺乏Heregulin的情况下显示出微弱的活化MAP激酶的激动活性(mAb浓度为1-100nM)。在经BIIB71F10-134处理后，在全部或磷酸化的Her2和Akt中未观察到明显的作用。此外，LIGHT融合物蛋白质BIIB71F10-132的处理在MCF7细胞中缺乏Heregulin的情况下会诱导MAP激酶的磷酸化。2.5pM至200nM的BIIB71F10-132融合物蛋白质的处理可以检测到诱导MAP激酶的磷酸化(数据未示出)。此外，在SKBR3细胞中检测到相似的MAP激酶的活化，但是在非常低的水平(数据未示出)。
此外，MCF7中BIIB71F10-132融合物蛋白质对MAP激酶的活化推测是通过在LIGHT融合物进行处理时发生了HER2的三聚作用。这种MAP激酶的活化并非为LIGHT途径活化的结果，这是因为LIGHT的功能被所述的融合物蛋白质的LTbR-Ig的阻断产生了与在使用单独的LIGHT融合物进行处理中所观察到的一致的结果。这些结果表明，三聚化的71F10现实出是激动性的，并且能在当前的试验条件下活化HER2的信号传导。
HER2与HER3的异源二聚化的作用
方法：将5x105MCF7，SKBR3或N87细胞平板接种于6孔平板中。在24h后，加入50nM的测试试剂(Fab，全长抗体或LIGHT融合物蛋白质)，并将细胞与这些试剂温育1或72h。在温育抗体之后，将Heregulinβ(100ng/mL)加入到培养基中，并将细胞再温育30分钟。用PBS将细胞洗涤1x，并用使用含蛋白酶和磷酸酶(分别为Mini-complete和PhosStop；分别为RocheApplied Bioscience cat#11836153001和04906837001)抑制剂的250uL RIPA缓冲剂(20mM MOPS pH 7.0，150mM氯化钠，1％NP40，1％脱氧胆酸盐，0.1％SDS)裂解细胞。将裂解物收集在微型离心管中，并存放在4℃下。将100uL裂解物加入到900uL不含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲剂中。将1ug兔抗HER3(Santa Cruz Biotechnology cat#sc-285)加入到各样品中，并加入25uL蛋白质A琼脂糖(GE Healthcare cat#17-5280-01)。将混合物在4℃下震动过夜。在过夜温育后，通过在3000rpm下离心1分钟使琼脂糖珠成团。通过抽吸除去上清液，并用500uL PBS洗涤团粒。将该过程重复两次以上。在除去最后的上清液之后，将30uL 5X SDS样品还原缓冲剂(11.5％SDS，50％甘油，0.3M Tris，0.025％苯酚红，25％β-巯基乙醇)加入到团粒中，破坏团粒，并加热至95℃并持续5分钟。然后，将样品在14000rpm下离心3分钟，并将上清液加载到
Figure BDA0000072591770001321
Novex 4-12％Bis-Tris Gel(Invitrogen)上。使用
Figure BDA0000072591770001322
MOPS SDS Running Buffer(Invitrogen cat#NP0001)在200V下将凝胶运行1h。使用转移缓冲剂(12.5mM Tris，96mM甘氨酸，20％甲醇)，将印在PVDF膜(Invitrogen cat#LC2002)上的凝胶在30V下运行1h。将膜在TBS-T(使用0.1％Tween20缓冲的1X Tris)中漂洗，并在R/T下在StartingBlock T20(TBS)封闭缓冲剂(Pierece cat#37543)中封闭1h，同时进行温和地摇动。将兔抗人HER2抗体(Cell Signal Technologies cat#2242)加入到封闭缓冲剂中。将印记与抗体在4℃下温育过夜，并进行温和地摇动。将印记在TBS-T中彻底洗涤。将HRP缀合的驴抗兔IgG(H+L)(JacksonImmunocat#711-035-152)二级抗体以1∶20000的浓度加入到封闭缓冲剂中。将印记在R/T下温育1小时，并温和地搅拌。在温育后，将印记用TBS-T彻底洗涤，并按照说明书加入ECL Plus试剂(GE Healthcare Life Science cat#RPN2132)。将印记暴露于X射线薄膜(Kodak BioMax XAR cat#165-1454)，并显色。
结果：
Fab 65H09显示出在缺乏Heregulin的情况下会增加与HER3的异源二聚化的作用，但是该作用会被Heregulin的处理所终止。这可以通过在Her2上65H09的结合位点与Heregulin与HER2的相互作用位点重叠来解释。由于Heregulin具有比65H09更高的亲和性，所以消除了65H09与HER2/HER3的异源二聚化的促进作用。所有其他的Fab对HER2/HER3的异源二聚化未显示出作用(数据未示出)。
显示，在N87细胞中，在HER3配体Heregulin存在下，在1小时时Fab71F10会降低HER2/HER3的异源二聚化作用。但是，这种作用在SKBR3细胞中不能重复(数据未示出)。LIGHT融合物蛋白质对Her2/Her3异源二聚化的作用得以保持，从而使用上文相同的方法进行测试。
Fab对HER2与EGFR的异源二聚化的作用
方法：将5x105MCF7，SKBR3或B87细胞平板接种于6孔平板中。在24h后，加入50nM的抗体，并将细胞与这些抗体温育1或72h。在温育抗体之后，加入人表皮生长因子(100ng/mL)，并将细胞再温育30分钟。用PBS将细胞洗涤1x，并用使用含蛋白酶和磷酸酶(分别为Mini-complete和PhosStop；分别为Roche Applied Bioscience cat#11836153001和04906837001)抑制剂的250uL RIPA缓冲剂(20mM MOPS pH 7.0，150mM氯化钠，1％NP40，1％脱氧胆酸盐，0.1％SDS)裂解细胞。将裂解物收集在微型离心管中，并存放在4℃下。将100uL裂解物加入到900uL不含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲剂中。将1ug小鼠抗人EGFR(BD Bioscinces Pharmingencat#610016)加入到各样品中，并加入25uL蛋白质A琼脂糖(GE Healthcarecat#17-5280-01)。将混合物在4℃下震动过夜。在过夜温育后，通过在3000rpm下离心1分钟使琼脂糖珠成团。通过抽吸除去上清液，并用500uL PBS洗涤团粒。将该过程重复两次以上。将30uL 5X SDS样品还原缓冲剂(11.5％SDS，50％甘油，0.3M Tris，0.025％苯酚红，25％β-巯基乙醇)加入到团粒中，破坏团粒，并加热至95℃并持续5分钟。然后，将样品在14000rpm下离心3分钟，并将上清液加载到
Figure BDA0000072591770001331
Novex 4-12％Bis-Tris Gel(Invitrogen)上。使用
Figure BDA0000072591770001332
MOPS SDS Running Buffer(Invitrogen cat#NP0001)在200V下将凝胶运行1h。使用转移缓冲剂(12.5mM Tris，96mM甘氨酸，20％甲醇)，将印在PVDF膜(Invitrogen cat#LC2002)上的凝胶在30V下运行1h。将膜在TBS-T(使用0.1％Tween20缓冲的1X Tris)中漂洗，并在R/T下在StartingBlock T20(TBS)封闭缓冲剂(Pierece cat#37543)中封闭1h，同时进行温和地摇动。将兔抗人HER2抗体(Cell Signal Technologies cat#2242)加入到封闭缓冲剂中。将印记与抗体在4℃下温育过夜，并进行温和地摇动。将印记在TBS-T中彻底洗涤。将HRP缀合的驴抗兔IgG(H+L)(JacksonImmunocat#711-035-152)二级抗体以1∶20000的浓度加入到封闭缓冲剂中。将印记在R/T下温育1小时，并温和地搅拌。在温育后，将印记用TBS-T彻底洗涤，并按照说明书加入ECL Plus试剂(GE Healthcare Life Science cat#RPN2132)。将印记暴露于X射线薄膜(Kodak BioMax XAR cat#165-1454)，并显色。
结果：
结果表明，Fab 66A12促进了SKBR3细胞中EGFR/HER2的异源二聚化，而其他所有的Fab未显示出活性。相似地，如同在66A12中观察到的那样，对照抗HER2抗体Fab也能够促进EGFR/HER2的异源二聚化(数据未示出)。LIGHT融合物蛋白质对EGFR/Her3异源二聚化的作用得以保持，从而使用上文相同的方法进行评估。
实施例22：用于评估LIGHT融合物对抗原发性肿瘤和转移的活性的肿瘤模型
LIGHT融合物蛋白质通过HER2途径的封阻以及LTβR途径的活化相组合来有效地显示其抗肿瘤活性。因此，需要LTβR和HER2双阳性肿瘤模型来测试LIGHT融合物蛋白质。这些肿瘤模型包括人肿瘤细胞系，例如BT474，SKBR-3，MCF7，MDA-MB-231，MDA-MB-468，N87，SKOV3，HT29，WiDr；以及小鼠乳腺肿瘤细胞系Tubo，TSA和4T1细胞。
在37℃、湿度气氛5％CO2下，将BT474，MCF7，MDA-MB-231，MDA-MB-468人乳腺肿瘤细胞系，N87人胃癌细胞系，以及SKOV3人卵巢癌细胞系与具有10％胎牛血清的RPMI 1640中培养。将SKBR3人乳腺肿瘤细胞系，HT29，Widr人结肠腺癌在包含1.5mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清的McCoy’s 5a培养基中培养。将小鼠乳房腺肿瘤细胞系Tubo，TSA和4T1在补充有10％胎牛血清饿DMEM中培养。培养基每3天更换一次。通过使用PBS洗涤1次来除去培养烧瓶中的细胞以用于传代，然后与0.5mM EDTA和0.05％胰岛素(PH 7.4)进行5分钟的温育。通过显微镜检测使用0.1％台盼蓝颜色的细胞来测定细胞的发育能力。将能自行发育的细胞在0.1ml的PBS中接种给小鼠。
为了建立LTβR和HER2的双阳性肿瘤异种移植物模型，使用2x106可自行发育的经培养的人肿瘤细胞在0.1ml PBS中以皮下方式接种给雌性无胸腺裸鼠(nu/nu)BALB/c小鼠(6-8周龄)的右侧腹部皮肤中。通过使用游标卡尺每周两次测量垂直二维的肿瘤来评估已经建立s.c肿瘤的小鼠。对小鼠实施安乐死，并且当s.c肿瘤的直径超过14mm时，由致死性肿瘤的进程，将小鼠评为死亡。使用公式V＝xy2/2来计算肿瘤的体积，其中x和y为两条垂直的直径(长度和宽度)。由于MCF7肿瘤在无雌二醇的条件下不能生长，所以在接种MCF7肿瘤的所有小鼠都在接种肿瘤之前的7天接受s.c 17β-雌二醇丸粒(Innovative Research of America，Sarasota，FL)移植物。
为了建立同源模型，使用0.5x106可自行发育的经培养的小鼠肿瘤细胞(Tubo，TSA或4T1)在0.1ml PBS中以皮下方式接种给雌性Balb/c(H-2Kd)小鼠的右侧腹部皮肤中。按照上述方式计算肿瘤的体积。
此外，可以在基因工程改造的过表达人或小鼠Her2(例如MCF7/hHer2，4T1/mHer2和TSA/mHer2)的肿瘤细胞系中测试LIGHT融合物蛋白质。这些细胞中Her2的过表达试图模拟人乳腺癌中Her2的过表达，并使其更容易测试抗HER2LIGHT融合物蛋白质的肿瘤靶向能力。这些经修饰的细胞系在它们的亲代细胞系的相同培养基中生长，但包括选择药品，例如G418和Blasticydin。
实施例23：使用结合疗法在体内抑制肿瘤的生长
方法：可以在异种移植物模型(例如BT474或MCF模型)或者原发性肿瘤节段的模型中测试与化疗试剂(例如紫衫萜，紫衫醇，阿霉素(Doxcirubicin)，环磷酰胺，氟尿嘧啶(5FU)，2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷和长春瑞滨)结合的LIGHT融合物蛋白质在抑制肿瘤生长中的效力。可以评估与根据当前的护理标准给药(即，每3天80mg/kg，持续4周)的2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷结合给药(腹膜内方式(i.p.)，每周两次30mg/kg，持续7周；每周一次60mg/kg，持续5周)的LIGHT-Fab融合物蛋白质的效力。单独的2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷、单独的LIGHT-Fab融合物蛋白质以及单独的假手术注射传递载体可以作为阴性对照给药。在治疗开始时肿瘤的体积为大约200mm3。可以评估原发性肿瘤的退缩、肿瘤中hLIGHT融合物的累积、渗透淋巴细胞、CD4、CD8、Tregs以及肿瘤的再攻击。
实施例24：在异种移植物肿瘤模型中Fab-LIGHT融合物蛋白质的抗肿瘤活性
据信，LIGHT融合物蛋白质至少部分地通过肿瘤细胞靶物(例如HER2)的抑制以及肿瘤细胞表面上LIGHT受体(即，LTβR和HVEM)的活化相组合来显示器抗肿瘤活性。因此，HER2和LIGHT受体的双阳性肿瘤模型可以用于测试LIGHT融合物蛋白质。例如，可以选择HT29和N87异种移植物肿瘤模型来在体内测试LIGHT融合物蛋白质的抗肿瘤活性。
HT29(衍生自人结肠直肠腺癌的肿瘤细胞系)购自ATCC(cat#HTB-38)，并随后进行传代。如通过Western印记和免疫组织化学染色所测定的那样(数据未示出)，所述的细胞表达中等水平的HER2(IHC得分2+)。此外，HT29细胞还表达LIGHT的LTβR和HVEM受体。HT29细胞的生长并非是HER2依赖性的，但是这些细胞确实表达HER2。例如，在抗HER2抗体处理之后，所述的细胞并未表现出生长停止(数据未示出)。因此，如体外增殖测试所示，71-F10-hLIGHT融合物蛋白质的抗肿瘤活性主要依赖于针对肿瘤细胞的LIGHT定向杀死活性(数据未示出)。相反，N87为衍生自人胃癌的肿瘤细胞系(ATCC，#CRL5822)，并在SCID小鼠中形成了皮下肿瘤。N87细胞过表达HER2至高水平(IHC得分3+)，并对抗HER2抗体的处理发生应答，其导致生长停止以及细胞死亡(数据未示出)。因此，由LIGHT所引发的HER2的阻断以及细胞生长的停止/细胞死亡能够有助于71F10-hLIGHT的抗肿瘤活性。
nu/nu无胸腺雌性小鼠和SCID雌性小鼠得自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)，为6-8周龄。2x106(HT-29)和5x106(N87)肿瘤细胞分别皮下接种于nu/nu和SCID小鼠的右侧腹部。选择已经建立肿瘤(50-200mm3)的小鼠来进行研究(每个处理组N＝7-10)。使用卡尺测量肿瘤的维度，并使用椭圆球体的等式(LxW2)/2＝mm3来计算肿瘤的体积，其中L和W是指在各次测量中收集到的较大和较小的维度。配制测试融合物蛋白质或抗体，并通过静脉内(IV)或腹腔(IP)以6mL/kg的单次剂量进行给药。将单独的载体给药对照组。对动物每周3次定量给药(TIW-周一，周三，周五)，并连续6-8周。对于单克隆抗体而言，所述的处理为每周两次(BIW-周一和周四)。对动物称重，并每周两次测量肿瘤。跟踪小鼠，直到对照组中肿瘤的体积达到大约1000mm3，并通过CO2安乐死来处死。计算各组的平均肿瘤体积。经处理的肿瘤的平均体积的变化除以对照肿瘤的平均体积的变化，在乘以100，再由100％中减去上述所得的值，从而得到各组中肿瘤生长的抑制情况。使用标准的T-检验并使用GraphPad 软件来进行统计学分析。
实施例25：抗HER2-LIGHT融合物蛋白质在HT29异种移植物模型中显示出有效的抗肿瘤活性
71F10-hLIGHT活性在HT29肿瘤模型中的结果概况于21中。在mg/kg71F10-hLIGHT融合物蛋白质处理组中显示出71F10-hLIGHT的明显的抗肿瘤活性(p＜0.05)。T/C(处理组与对照组)值低于42％(数据未示出)。虽然未达到统计学意义，但是与对照组相比，1mg/kg和5mg/kg的组显示出剂量依赖性的方式的清楚的抗肿瘤活性。对于抗肿瘤效力而言，1mg/kg和5mg/kg的IP与IV传递之间未观察到差异(数据未示出)。相反，单独的抗HER2单克隆抗体BIIB71-F10的处理未显示出任何抗肿瘤作用。如实施例24中所讨论的那样，HT29细胞的生长并非是HER2依赖性的，但是这些细胞确实表达HER2，其可能促进了BIIB-71F10Mab处理中效力的缺乏。此外，这些结果显示HT29肿瘤的抗肿瘤效力得自71F10-LIGHT融合分子中的LIGHT一侧，这是因为未观察到71F10Mab处理的活性。在对照融合分子、抗CD23-hLIGHT处理组中，进一步证明了LIGHT的直接杀死活性。HT29细胞上不表达CD23，因此该处理不能预期“靶向作用”。在5和10mg/kg抗CD23-hLIGHT组中仅检测到温和的抗肿瘤活性，但是对于效力而言并非是剂量依赖性的(即，5和10mg/kg数据是重叠的)。这些结果表明循环从不含LIGHT融合分子可能注意诱导肿瘤生长的停止。
与非靶向的抗CD23-hLIGHT对照分子相比，靶向HER2的71F10-hLIGHT显示出有效得多的抗肿瘤活性。抗CD23-hLIGHT的较弱的抗肿瘤活性并非是由于试剂在质量上的差异或药代动力学差异，这是因为71F10-hLIGHT和抗CD23-hLIGHT如在使用HT29细胞的体外杀死测试中所示的那样具有相等的效力，以及相似的PK值(数据未示出)。因此，对于71F10-hLIGHT的最大抗肿瘤活性而言，71F10-hLIGHT的更有效的活性可能得自需要使LIGHT靶向肿瘤细胞。这些结果提供了另外的证据来支持LIGHT/LTβR/HVEM受体在细胞表面上寡聚化在获得TNF家族成员的最大信号传递强度中的作用。
实施例26：抗HER2-LIGHT融合物蛋白质在HER2依赖性的N87异种移植物肿瘤模型中显示出有效的抗肿瘤活性
为了测试抗HER2疗法与LIGHT定向的杀死活性之间的协同作用，在本试验中使用N87肿瘤模型。如上所述，N87细胞过表达HER2至高水平(IHC得分3+)，并对抗HER2抗体(例如对照抗HER2抗体)的处理发生应答，其导致生长停止以及细胞死亡(数据未示出)。N87肿瘤在SCID小鼠的侧腹生长，并在肿瘤尺寸达到50-200mm3时进行处理。所述的处理与在实施例25中所述的那些相似，但是包括曲妥单抗或对照抗HER2抗体(Roch/Genentech)。结果概括于图22中。71F10-hLIGHT显示出显著的抗肿瘤活性(p＜0.001)，并以剂量依赖性的方式抑制肿瘤的生长(T/C＜40％)。与实施例25中的观察情况相似，与相同剂量(5mg/kg)的71F10-hLIGHT相比，抗CD23-hLIGHT的有效性较低，并且在N87模型中显示出显著的效力(p＜0.02)。单独的靶向抗体BIIB71-F10(不具有LIGHT部分)在降低肿瘤生长中不能达到统计学意义(注意BIIB71-F10抗体与对照抗HER2抗体不能交叉阻断)。对照抗HER2抗体的处理在处理过程期间显示出显著的生长延迟(p＜0.02)。但是，使用对照抗HER2抗体处理N87肿瘤在第50天时会再度复发和重新开始生长。相反，使用71F10-hLIGHT处理的肿瘤显示出对生长持续的抑制，甚至肿瘤退缩的趋势。这些观察结果强调了抗HER2抗体与抗HER2-LIGHT融合分子之间在它们各自的抗肿瘤活性中的某些分子及细胞的差异。例如，除了与HER2受体的阻断、以及LIGHT所引发的细胞生长的停止和死亡有关的机制以外，LIGHT可以刺激天然细胞(例如NK细胞和巨噬细胞)从而有助于肿瘤细胞的杀死。这种机制符合已知的LIGHT的生物学功能以及其中肿瘤中对71F10-hLIGHT融合物蛋白质的处理稍微延迟的观察结果。可以通过肿瘤部分的免疫组织化学染色以及细胞清除试验进一步研究天然免疫细胞在抗肿瘤活性中的参与情况。不管71F10-hLIGHT融合物蛋白质的作用机制如何，所述的蛋白质与抗HER2抗体相比，在处理HER2依赖性的肿瘤中显示出差异，并且提供了克服对抗HER2抗体疗法的抵抗的备选疗法。
实施例27：LIGHT融合物的处理会刺激宿主抗肿瘤免疫应答
LIGHT为T细胞活性的有效的共刺激分子，因此，通过Fab-LIGHT将LIGHT靶向肿瘤组织会引发宿主的抗肿瘤应答，并减少或消除肿瘤的转移。可以在免疫竞争性动物中测试免疫应答。可以使用同源小鼠肿瘤模型，例如小鼠乳腺肿瘤细胞TSA，4T1和Tubo(Her2+)细胞。简言之，肿瘤细胞可以制备成单一细胞的悬浮液。可以将1-5x105肿瘤细胞接种于Balb/c小鼠的右侧腹部。当s.c肿瘤区域建成并达到50-100mm3时，可以使用各种剂量的71F10-hLIGHT融合物蛋白质和对照来处理动物，时间为两周。在处理结束以及处理后的两个周，可以收获肿瘤组织和引流淋巴结，从而分析免疫细胞渗透，即，停留有CD4，CD8，NK细胞和巨噬细胞的肿瘤。对于组织学分析而言，可以检测肿瘤组织中的类淋巴结构，并可以针对淋巴细胞的运输来测定SLC(CCL21)的瘤内水平。可以在处理之后一个月时手机引流淋巴结和肺组织，以用于转移分析。所述的融合物蛋白质处理组可以增加肿瘤渗透淋巴细胞的数量，上调节细胞因子/粘附分子，并使得肿瘤转移减少。
此外，还可以测定LIGHT融合物蛋白质诱导的免疫在保护动物免于受到肿瘤的再次攻击中的作用。可以监测再次攻击的肿瘤的原发性生长以及转移。
实施例28：抗IGFR Fab-LIGHT融合物蛋白质C06-hLIGHT的构建
使用如DyaxVH-pV90-F(SEQ ID NO：157)，256-R(SEQ ID NO：158)和165-R2(SEQ ID NO：159)所述的寡核苷酸引物，通过PCR扩增来合成单克隆抗体C06VH区。5′正向引物DyaxVH-pV90-F，其包含独特的Mlu I限制性内切酶位点(ACGCGT(SEQ ID NO：160))，其后为编码重链信号肽的至少3个氨基酸的序列，其后为与重新编码的C06VH的氨基末端互补的序列。3′反向引物由编码C06VH的羧基末端的内部反向引物256-R、以及编码部分人IgG1CH1结构域和Age I位点(ACCGGT(SEQ ID NO：161))的第二反向引物165-R2构成。在两个相继的PCR反应中，使用得自质粒DNApBIIBC06-030(其包含重新编码的Dyax抗IGF1R C06VH基因)的3个PCR引物，通过编码人IgG1CH1结构域的共同重叠序列来扩增重新编码的C06VH区。将C06VH基因片段克隆到经Mlu I/Age I消化的pBIIB71F10-132中。通过DNA测序证实正确的序列。C06Fab-hLIGHT融合物(pBIIBC06-256)的重链DNA和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：162和163所示。与C06Fab的重链相应的氨基酸和核苷酸序列显示为由N末端开始；然后为与所述的连接基团(大约氨基酸226至245)相应的氨基酸；然后为与人LIGHT细胞外结构域(氨基酸246至393)相应的氨基酸。C06VH CDR1-3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：164-166中。
C06轻链载体(pBIIBC06-117)用于C06Fab-hLIGHT融合物中，并且DNA和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：167和168所示。C06VL CDR1-3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：169-171中。
按照实施例8中所述，通过瞬间转染CHO细胞来生产C06-hLIGHT融合物蛋白质。通过Octet(ForteBio)测定培养基中蛋白质的效价，并用于ELISA测试中以估测与IGFR和LIGHT受体LTβR的结合活性。抗HER271F10-hLIGHT用作对照。结果概括于图23A和23B中。C06-hLIGHT显示出对IGFR(图23A)和LTβR(图23B)特异性地结合，并且显示出其双功能活性。
实施例29：Fab-LIGHT融合物蛋白质的二聚体形式的构建
通过包含IgG1的全长CH1铰链区来生成Fab-LIGHT融合物蛋白质的二聚体形式。通过形成两对二硫键来稳定二聚体。将包含两个半胱氨酸残基以用于链间二硫键的形成的人IgG1铰链序列插入到71F10-hLIGHT融合物重链的(G4S)4连接体区的前面(图24)。在PCR反应中，使用5′正向及3′反向PCR引物、以及编码人IgG1铰链序列(得自包含人IgG1和hLIGHT的质粒DNA)的内部重叠PCR引物组来构建71F10Fab-hLIGHT二聚体融合物重链。引物序列如MB-04F(SEQ ID NO：135)，130-R1(SEQ ID NO：136)，255-mF(SEQ ID NO：175)和255-mR(SEQ ID NO：176)所示。简言之，5′正向引物MB-04F，其具有AgeI位点(ACCGGT(SEQ ID NO161))，其后为与IgG1CH1区互补的序列。3′反向引物130-R1，其包含BamH I位点(GGATCC(SEQID NO：177))以及编码与hLIGHT的羧基末端互补的序列。内部重叠PCR引物组的5′正向引物255-mF和3′反向引物255-mR包括编码人IgG1铰链区的序列(其后为部分(G4S)4连接体)。在第二个PCR反应中，使用编码huIgG1铰链区与(G4S)4连接体的重叠序列的序列将PCR片段组装在一起。使用Age I和BamH I消化最终的PCR产物，并与经Age I/BamH I消化的pBIIB71F10-134载体(其包含BIIB71-F10IgG1重链序列)连接。通过DNA测序证明所述构建体的DNA序列。71F10Fab-hLIGHT二聚体融合物(pBIIB71F10-255)的重链DNA和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：178和179所示。与71F10Fab的重链相应的氨基酸和核苷酸序列显示为由N末端开始；然后为与IgG1的CH1铰链区(SEQ ID NO：172的氨基酸225至232)相应的氨基酸；然后为与所述的连接基团(SEQ ID NO：172的氨基酸233至252)相应的氨基酸；然后为与人LIGHT细胞外结构域(SEQ ID NO：172的氨基酸253至400)相应的氨基酸。
71F10轻链载体(pBIIB71F10-129)用于71F10Fab-hLIGHT二聚体融合物中，并且DNA和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：110和109中所示。
按照实施例8中所述，通过使用pBIIB71F10-255载体瞬间转染CHO细胞来生产71F10Fab-hLIGHT融合物蛋白质。通过Octet(ForteBio)测定培养基中蛋白质的效价，并用于ELISA测试中以估测与HER2靶物和LIGHT受体LTβR的结合活性。抗HER271F10-hLIGHT用作对照。结果概括于图25A和25B中。在图25A中，将2倍系列稀释的培养基加入到使用2ug/mlrhErbB2-Fc涂敷的平板中，并通过山羊抗人κHRP(1∶10000)检测结合情况。在图25B中，将2倍系列稀释的培养基加入到使用2ug/ml hHER2-Fc涂敷的平板中，并在与1ug/ml的生物素-hLTβR-Fc温育后通过链霉亲和素-HRP(1∶4000)检测结合情况。C06-hLIGHT显示出对IGFR(图25A)和LTβR(图25B)特异性地结合，并且显示出其双功能活性。
保藏
根据Budapest条约，2009年9月24日，美国典型培养物保藏中心
Figure BDA0000072591770001411
代表Biogen IDEC Inc.，14Cambridge Center，Cambridge，MA 02142保藏表达以下Fab-LIGHT融合物的CHO： 专利保藏名称
CHO细胞：71F10fab轻链#1                 PTA-10355
CHO细胞：65H09fab轻链5F6                PTA-10356
CHO细胞：67F11fab轻链#4                 PTA-10357
CHO细胞：65C10fab轻链分类池             PTA-10358
等价物
本文所列举的所有文献均以引用方式全文并入本文，并且对于所有目的而言都如同每份单独的公开、专利或专利申请都明确且单独地指明以引用方式全文并入本文以用于所有目的程度。
本文所述的具体的实施方案不能限定本发明的范围。事实上，除了本文所述的那些以外，由上述说明书和附图本发明的多种修改方式对于本领域的技术人员而言是显而易见的。这些修改方式将落入所附的权利要求书的范围内。
表1
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表3
如定量逆转录酶PCR测量的，使用BIIB71F10-130进行处理而影响的HT29细胞中促炎基因的实例
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Claims (52)

1.一种LIGHT靶向分子，其包含人LIGHT蛋白质或其片段的至少一个细胞外结构域，以及与癌细胞或组织上的表面蛋白质结合的靶向抗体分子，所述的LIGHT靶向分子包括至少2个非连续的多肽。
2.权利要求1所述的LIGHT靶向分子，其包含至少2个具有以下构造非连续的多肽：具有与轻链恒定区(CL)连接的轻链可变结构域(VL)的第一多肽；以及具有与重链恒定区(CH)连接的重链可变结构域(VH)的第二多肽，所述多肽通过或不通过连接基团(L)与所述的LIGHT蛋白质或其片段的N末端连接。
3.权利要求1或2所述的LIGHT靶向分子，其中所述的抗体分子为Fab片段。
4.权利要求1-3的任意一项中所述的LIGHT靶向分子，其为所述的LIGHT蛋白质或其片段与Fab片段形成的二聚体或三聚体形式的融合物。
5.权利要求1-4的任意一项中所述的LIGHT靶向分子，其中所述的LIGHT蛋白质的细胞外结构域具有一种或多种LIGHT相关的活性，该活性选自：(i)与一种或多种LIGHT受体结合；(ii)诱导趋化因子或细胞因子、趋化因子或细胞因子受体、粘附分子和/或共刺激分子中的一种或多种的表达；(iii)活化T细胞；(iv)募集T细胞进入到肿瘤细胞或组织中；(v)活化和/或增强肿瘤反应性T细胞的增殖；(vi)在肿瘤细胞或组织中，创建类淋巴微环境；(vii)诱导肿瘤细胞或组织的凋亡；或(viii)刺激受试对象中的免疫应答。
6.权利要求1-5的任意一项中所述的LIGHT靶向分子，其中所述的LIGHT蛋白质的细胞外结构域包含SEQ ID NO：1(人LIGHT同种型1)的氨基酸93至240，或者与其具有至少90％一致性的氨基刷序列。
7.权利要求1-6的任意一项中所述的LIGHT靶向分子，其中所述的抗体分子与癌细胞蛋白质结合，其中所述的癌细胞蛋白质选自：HER2/neu，HER3，HER4，表皮生长因子受体(EGFR)，胰岛素生长因子受体(IGFR)，Met，Ron，Cripto，αvβ6，α6β4，层粘连蛋白受体(LAMR)，CD23，CD20，CD16，EpCAM和Tweak受体(FN14)。
8.权利要求1-7的任意一项中所述的LIGHT靶向分子，其中所述的抗体分子与人HER2，CD23或IGFR结合。
9.权利要求1-8的任意一项中所述的LIGHT靶向分子，其具有选自以下的一种或多种活性：
(i)以一定的亲和性与HER2结合，其中所述的亲和性表征为解离常数(Kd)至少为1x10-7M；
(ii)与HER2结合，而与其他HER家族成员不具有明显的交叉反应；
(iii)与HER2上的线性或构造抗原决定部位结合，其中所述的抗原决定部位选自：结构域1(D1)的抗原决定部位，其与SEQ ID NO：105(人HER2)的大约氨基酸1至196相应；结构域2(D2)的抗原决定部位，其与SEQ IDNO：105的大约氨基酸197至318相应；结构域3(D3)的抗原决定部位，其与SEQID NO：105的大约氨基酸319至508相应；结构域4(D4)的抗原决定部位，其与SEQ ID NO：105的大约氨基酸508至630相应；或它们的组合。
(iv)减少HER2、AKT或MAP激酶中的一种或多种的磷酸化；或减少HER2的同源二聚化，或者HER2与HER3、和/或HER2与EGFR的异源二聚化；
(v)在体外和体内抑制表达HER2的细胞的活性或诱导细胞的杀死；
(vi)在带有HER2依赖性的乳腺肿瘤细胞、结肠直肠和胃部的异种移植物肿瘤模型中引发抗肿瘤免疫应答；和/或
(vii)在单一疗法或肿瘤复发之后，诱导持久的减缓肿瘤的生长和转移。
10.权利要求9所述的LIGHT靶向分子，其中所述的抗体分子为包含重链和轻链的可变(VH和VL)氨基酸序列的Fab片段，其中所述的重链和轻链的可变氨基酸序列选自：SEQ ID NO：11和13(BIIB71F10VH和VL)，SEQ ID NO：15和17(BIIB69A09VH和VL)，SEQ ID NO：19和21(BIIB67F 10VH和VL)，SEQID NO：23和25(BIIB67F11VH和VL)，SEQ ID NO：27和29(BIIB66A12VH和VL)，SEQ ID NO：31和33(BIIB66C01VH和VL)，SEQ ID NO：35和37(BIIB65C10VH和VL)，SEQ ID NO：39和41(BIIB65H09VH和VL)，SEQ IDNO：43和45(BIIB65B03VH和VL)，或者与其具有至少90％一致性的氨基酸序列。
11.权利要求1-10的任意一项中所述的LIGHT靶向分子，其包含具有1个、2个、3个、4个或5个(G4S)4重复的连接体。
12.权利要求1-11的任意一项中所述的LIGHT靶向分子，其包含具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或与其具有至少90％一致性的氨基酸序列的重链、以及具有SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列或与其具有至少90％一致性的氨基酸序列的轻链。
13.权利要求8所述的LIGHT靶向分子，其包含具有SEQ ID NO：101或174所示的氨基酸序列或与其具有至少90％一致性的氨基酸序列的重链、以及具有SEQ ID NO：103所示的氨基酸序列或与其具有至少90％一致性的氨基酸序列的轻链。
14.权利要求8所述的LIGHT靶向分子，其包含具有SEQ ID NO：163所示的氨基酸序列或与其具有至少90％一致性的氨基酸序列的重链、以及具有SEQ ID NO：168所示的氨基酸序列或与其具有至少90％一致性的氨基酸序列的轻链。
15.一种与HER2结合的经纯化的抗体分子，该抗体分子包含得自抗体的所有6个CDR，该CDR选自：BIIB71F10(SEQ ID NO：11，13)，BIIB69A09(SEQID NO：15，17)，BIIB67F10(SEQ ID NO：19，21)，BIIB67F11(SEQ ID NO：23，25)，BIIB66A12(SEQ ID NO：27，29)，BIIB66C01(SEQ ID NO：31，33)，BIIB65C10(SEQ ID NO：35，37)，BIIB65H09(SEQ ID NO：39，41)，BIIB65B03(SEQ ID NO：43，45)，或者与所述的CDR一致的或与所述的CDR具有不超过2个改变的CDR。
16.权利要求15所述的抗体分子，其为选自Fab，F(ab′)2，Fv，单链Fv片段以及单结构域抗体中的抗体片段。
17.一种经分离的核酸，该核酸包含编码权利要求1-12的任意一项中所述的LIGHT靶向分子的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性的核苷酸序列。
18.一种经分离的核酸，该核酸包含编码权利要求13所述的LIGHT靶向分子的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性的核苷酸序列。
19.一种经分离的核酸，该核酸包含编码权利要求14所述的LIGHT靶向分子的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性的核苷酸序列。
20.一种经分离的核酸，该核酸包含编码权利要求15或16所述的抗体分子的核苷酸序列。
21.一种宿主细胞，其包含编码权利要求1-12的任意一项中所述的LIGHT靶向分子的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性的核苷酸序列。
22.一种宿主细胞，其包含编码权利要求13所述的LIGHT靶向分子的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性的核苷酸序列。
23.一种宿主细胞，其包含编码权利要求14所述的LIGHT靶向分子的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性的核苷酸序列。
24.一种宿主细胞，其包含编码权利要求15或16所述的抗体分子的核苷酸序列。
25.一种载体，其包含编码权利要求1-12的任意一项中所述的LIGHT靶向分子的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性的核苷酸序列。
26.一种载体，其包含编码权利要求13所述的LIGHT靶向分子的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性的核苷酸序列。
27.一种载体，其包含编码权利要求14所述的LIGHT靶向分子的核苷酸序列或与其具有至少90％一致性的核苷酸序列。
28.一种宿主细胞，其包含编码权利要求15或16所述的抗体分子的核苷酸序列。
29.一种提供重组LIGHT靶向分子的方法，该方法包括：提供包含编码权利要求1-12的任意一项中所述的LIGHT靶向分子的核酸的宿主细胞；以及将所述的宿主细胞保持在其中所述的重组LIGHT靶向分子被表达的条件下。
30.权利要求29所述的方法，该方法进一步包括由所述的宿主细胞或其中保持有所述的宿主细胞的培养基中分离所述的LIGHT靶向分子。
31.权利要求30所述的方法，该方法进一步包括制备所述的LIGHT靶向分子的配制物作为药物组合物。
32.一种提供重组LIGHT靶向分子的方法，该方法包括：提供包含编码权利要求13所述的LIGHT靶向分子的核酸的宿主细胞；以及将所述的宿主细胞保持在其中所述的重组LIGHT靶向分子被表达的条件下。
33.权利要求32所述的方法，该方法进一步包括由所述的宿主细胞或其中保持有所述的宿主细胞的培养基中分离所述的LIGHT靶向分子。
34.权利要求33所述的方法，该方法进一步包括制备所述的LIGHT靶向分子的配制物作为药物组合物。
35.一种提供重组LIGHT靶向分子的方法，该方法包括：提供包含编码权利要求14所述的LIGHT靶向分子的核酸的宿主细胞；以及将所述的宿主细胞保持在其中所述的重组LIGHT靶向分子被表达的条件下。
36.权利要求35所述的方法，该方法进一步包括由所述的宿主细胞或其中保持有所述的宿主细胞的培养基中分离所述的LIGHT靶向分子。
37.权利要求36所述的方法，该方法进一步包括制备所述的LIGHT靶向分子的配制物作为药物组合物。
38.一种提供与HER2结合的抗体分子的方法，该方法包括：提供包含编码权利要求15或16所述的抗体分子的核酸的宿主细胞；以及将所述的宿主细胞保持在其中所述的重组LIGHT靶向分子被表达的条件下。
39.权利要求38所述的方法，该方法进一步包括由所述的宿主细胞或其中保持有所述的宿主细胞的培养基中分离所述的LIGHT靶向分子。
40.权利要求38或39所述的方法，该方法进一步包括制备所述的LIGHT靶向分子的配制物作为药物组合物。
41.一种药物组合物，该组合物包含权利要求1-12的任意一项中所述的LIGHT靶向分子以及可药用的载体。
42.一种药物组合物，该组合物包含权利要求13所述的LIGHT靶向分子以及可药用的载体。
43.一种药物组合物，该组合物包含权利要求14所述的LIGHT靶向分子以及可药用的载体。
44.一种药物组合物，该组合物包含权利要求15或16所述的抗体分子以及可药用的载体。
45.一种治疗过度增殖状况或紊乱的方法，该方法包括：向患有所述状况或紊乱、或者处于患有所述状况或紊乱的风险中的受试对象给药有效量的权利要求1-14的任意一项中所述的LIGHT靶向分子，由此治疗所述的多度增殖状况或紊乱。
46.一种选择性地传递LIGHT靶向分子至赘生性细胞或组织的方法，该方法包括将权利要求1-14的任意一项中所述的LIGHT靶向分子以使得所述的赘生性细胞或组织被杀死或脱落的量与所述的赘生性细胞或组织相接触，其中所述的接触步骤在受试对象的体外、离体或体内发生。
47.权利要求45所述的方法，其中所述的受试对象为患有过度增殖的状况或紊乱的患者，其中所述的状况或紊乱选自：乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌或肝癌。
48.权利要求45所述的方法，其中所述的受试对象为患有表达HER2的乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌或前列腺癌的患者。
49.权利要求48所述的方法，其中所述的患者为对于化疗、基于抗体或手术治疗是部分或完全难以治愈的。
50.一种治疗过度增殖的状况或紊乱的方法，该方法包括：向患有所述状况或紊乱、或者处于患有所述状况或紊乱的风险中的受试对象给药有效量的权利要求15或16所述的抗HER2抗体分子，由此治疗所述的多度增殖状况或紊乱。
51.一种检测样品中HER2蛋白质的存在情况的方法，该方法包括：(i)将所述的样品与权利要求15或16所述的抗HER2抗体分子相接触；以及(ii)检测所述的抗HER2抗体分子与所述的样品之间络合物的形成情况，其中所述的样品中所述络合物的形成为所述样品中存在HER2的指示。
52.一种诊断赘生性状况或紊乱的方法，该方法包括：(i)获得得自受试对象的样品；(ii)将所述的样品与权利要求15或16所述的抗HER2抗体分子相接触；以及(iii)检测所述的抗HER2抗体分子与所述的样品之间络合物的形成情况，其中所述的样品中所述络合物的形成为所述样品中存在HER2的指示，并且其中所述样品中HER2蛋白质相对于参照值的升高的表达水平为所述的赘生性状况或紊乱的指示。
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