CN111247249A - Dna、多肽、抗间皮素抗体、肿瘤成像剂和复合体 - Google Patents

Dna、多肽、抗间皮素抗体、肿瘤成像剂和复合体 Download PDF

Info

Publication number
CN111247249A
CN111247249A CN201880068618.8A CN201880068618A CN111247249A CN 111247249 A CN111247249 A CN 111247249A CN 201880068618 A CN201880068618 A CN 201880068618A CN 111247249 A CN111247249 A CN 111247249A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gly
ser
leu
ala
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880068618.8A
Other languages
English (en)
Inventor
松浦荣次
小林和子
竹中文章
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Okayama University NUC
Original Assignee
Okayama University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Okayama University NUC filed Critical Okayama University NUC
Publication of CN111247249A publication Critical patent/CN111247249A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1054—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供一种DNA，其包含以下(a)～(c)中的任一者，(a)包含以下碱基序列中的任一碱基序列的DNA：序列号1的第16位～第831位、序列号3的第16位～第822位、序列号5的第16位～第825位、序列号7的第16位～第819位、序列号9的第16位～第834位、序列号11的第16位～第828位；(b)编码包含以下氨基酸序列中的任一氨基酸序列的多肽的DNA：序列号2的第1位～第272位、序列号4的第1位～第269位、序列号6的第1位～第270位、序列号8的第1位～第268位、序列号10的第1位～第273位、序列号12的第1位～第271位；(c)上述(a)或(b)的DNA的互补链。

Description

DNA、多肽、抗间皮素抗体、肿瘤成像剂和复合体
技术领域
本发明涉及DNA、多肽、抗间皮素抗体、肿瘤成像剂和复合体。
背景技术
间皮素(MSLN)是介由GPI锚定蛋白与膜结合的40kDa的糖蛋白。MSLN通常局限表达于胸膜、腹膜、心膜的间皮。但是，已知在癌化的组织中，在间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、大肠癌、乳腺癌等很多癌细胞中高表达(非专利文献1～2)。
MSLN是首先以全长71kDa的前体蛋白质的形式合成后，利用弗林蛋白酶等蛋白质分解酶切断，形成介由被称为巨核细胞增强因子(megakaryocyte potentiating factor，MPF)的31kDa的多肽和GPI锚定蛋白而与细胞膜结合而得到的40kDa的多肽，即成熟型MSLN。进而，报告了GPI锚定蛋白型MSLN的一部分从细胞膜分离、游离(可溶型MSLN)。作为MSLN的功能，有参与细胞的粘附、增殖的报告。
从这些背景出发，MSLN被视为有望作为癌症的诊断、治疗的靶分子，识别MSLN的抗体目前为止大量制作、报告有MORAb-009(amatuximab)、HN1等(非专利文献3～5、专利文献1～2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：JAPAN特开2014-221064
专利文献2：JAPAN特表2011-504372
非专利文献
非专利文献1：Eur.J.Cancer 44，46-53，2008
非专利文献2：Clin.Cancer Res.10，3937-3942，2004
非专利文献3：Lung Cancer，68：455-459，2010
非专利文献4：Int.J.Cancer，128：2020-30，2011
非专利文献5：Scientific Reports 5：09928，2015
发明内容
(发明要解决的课题)
本发明的目的在于提供一种对癌症的诊断、治疗有效的新型多肽、DNA、抗间皮素抗体、复合物、以及肿瘤成像剂。
(用于解决课题的技术方案)
本发明提供以下DNA、多肽、抗间皮素抗体、肿瘤成像剂和复合体。
方案1.一种DNA，其包含以下(a)～(c)中的任一者，
(a)包含以下碱基序列中的任一碱基序列的DNA，
序列号1的第16位～第831位，
序列号3的第16位～第822位，
序列号5的第16位～第825位，
序列号7的第16位～第819位，
序列号9的第16位～第834位，
序列号11的第16位～第828位；
(b)编码包含以下氨基酸序列中的任一氨基酸序列的多肽的DNA，
序列号2的第1位～第272位，
序列号4的第1位～第269位，
序列号6的第1位～第270位，
序列号8的第1位～第268位，
序列号10的第1位～第273位，
序列号12的第1位～第271位；
(c)上述(a)或(b)的DNA的互补链。
方案2.一种多肽，其包含以下氨基酸序列中的任一氨基酸序列，
序列号2的第1位～第272位，
序列号4的第1位～第269位，
序列号6的第1位～第270位，
序列号8的第1位～第268位，
序列号10的第1位～第273位，
序列号12的第1位～第271位。
方案3.一种抗间皮素抗体，其包含以下氨基酸序列中的任一氨基酸序列，
序列号2的第1位～第272位，
序列号4的第1位～第269位，
序列号6的第1位～第270位，
序列号8的第1位～第268位，
序列号10的第1位～第273位，
序列号12的第1位～第271位。
方案4.一种肿瘤成像剂，其包含方案2记载的多肽。
方案5.根据方案4记载的肿瘤成像剂，其中，上述肿瘤成像剂还包含89Zr。
方案6.根据方案4或5记载的肿瘤成像剂，其中，上述肿瘤成像剂用于表达间皮素的肿瘤的成像。
方案7.一种复合体，其是将方案2记载的多肽和抗肿瘤物质连结而得到的。
(发明效果)
与以往的全长抗体相比，本发明的抗MSLN scFv被低分子化，血液清除率快，因此，在基于放射标记scFv的PET中，与以往相比可短时间且特异性地将表达MSLN的肿瘤可视化。
另外，由于抗体被低分子化，因此也可进行用于使高分子胶束型DDS制剂等抗肿瘤剂的靶向化的修饰。
另外，通过使用在衰变时不放出β-射线的PET核素即89Zr，可实现更安全的癌症的成像。
附图说明
图1：抗人MSLN scFv抗体制作的构成图和抗人MSLN scFv-cp3抗体的结构。a人类天然抗体噬菌体文库制作的方案。由人扁桃体淋巴细胞制作文库。b具有cp3序列的scFv抗体的结构。具有在利用连接子结合的重链以及轻链的可变区、轻链恒定区附加有PelB以及cp3序列的结构。PT7表示T7启动子。此外，可变区以黑色的方形表示，恒定区以灰色的方形表示。c具有cp3序列的scFv(cp3-scFv)抗体的浓缩、选择和具有His-tag序列的scFv抗体制作的方案。cp3-scFv抗体通过4～5次的生物淘洗进行浓缩，上述生物淘洗使用利用珠(r-MSLN beads)的柱(r-MSLN column)，上述珠介由His-tag(Dynabeads(注册商标)His-tagIsolation&Pull down：10103D：Invitrogen)或小鼠单克隆抗His-tag抗体(MBL：M136-3)与蛋白G(Dynabeads(注册商标)protein G：100.04D：Invitrogen)结合有人重组MSLN。浓缩后，对各个cp3-scFv抗体进行克隆，通过固相酶免疫测定法酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)评价对MSLN的结合能力。对于通过ELISA活性高的scFv抗体，利用流式细胞仪(FCM)再次确认与癌细胞的结合能力，选择反应性高的5个克隆。基于选择的scFv的序列信息，合成附加有His-tag序列的scFv抗体的DNA并利用中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞表达，通过FCM确认与癌细胞的结合能力。基于FCM的评价高的附加有His-tag序列的scFv抗体通过PET成像进行评价。VH表示重链可变区，VL表示轻链可变区，CL表示轻链恒定区。此外，以黑色表示可变区，以灰色表示恒定区。
图2：cp3-scFv克隆的选择以及基于ELISA的评价。为了评价cp3-scFv对r-MSLN的特异性，使r-MSLN固定于96孔板并用于ELISA。Y轴表示吸光度，X轴表示各个克隆名称(由于空间的关系，每隔一个克隆名称标记一个名字)，黑柱表示固定r-MSLN，白柱表示使EGFR固定于板而作为阴性对照时的cp3-scFv克隆的反应。此外，灰柱表示仅与使r-MSLN未固定于板的PBS的cp3-scFv克隆的反应。图中，上段以及中段的4th、5th表示淘洗的次数，4th表示通过4次淘洗而浓缩后得到的克隆，5th表示通过5次淘洗而浓缩后得到的克隆。此外，4th为通过使抗原r-MSLN与Dynabeads(注册商标)His-tag Isolation&Pulldown：10103D)结合而成的珠(以下称为His-tag珠)进行2次淘洗后，使小鼠单克隆抗His-tag抗体(MBL：M136-3)与Dynabeads(注册商标)protein G：100.04D：invitrogen)结合，然后通过使抗原r-MSLN与其结合而成的珠(以下称为PG珠)进行2次淘洗。5th为在4次淘洗后进一步利用His-tag珠进行淘洗。下段表示在4次淘洗后进一步利用PG珠进行淘洗而得到的克隆。HR1为作为对照使用的对日本原矛头蝮(Protobothrops flavoviridis)特异的pc3-scFv。
图3：利用流式细胞仪(FCM)进行的抗人MSLN cp3-scFv抗体克隆的评价。使用肺癌细胞NCI-H226、胃癌细胞NCI-N87、胰腺癌细胞BxPC-3以及PANC-1，通过FCM分析抗人MSLN cp3-scFv抗体克隆的反应性。图中的黑色表示各抗人MSLN cp3-scFv抗体克隆，灰色表示作为对照使用的HR1 007抗日本原矛头蝮毒素scFv抗体。由黑框包围的克隆是根据基于FCM的反应性的高度而选择的克隆。图中的数值是各抗人MSLNcp3-scFv抗体克隆的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)与作为对照使用的HR1 007抗日本原矛头蝮毒素scFv抗体的MFI之比。
图4：得到的抗人MSLNHis-tag-scFv抗体的构成和基于SDS-PAGE的分析。a抗人MSLNHis-tag-scFv抗体的构成。b抗人MSLNHis-tag-scFv抗体的氨基酸序列。在框内显示出轻链可变区和重链可变区的互补决定区(CDR)。(*)表示在各克隆之间不同的氨基酸残基，红色文字表示在CDR区域内没有变化的氨基酸残基。His-tag由6个残基的组氨酸构成。SS表示信号序列。互补决定区(CDR)是基于V BASE(The MRC Centre for ProteinEngineering，MRC Laboratory of Molecular Biology)的数据而推定的。c His-tag-scFv抗体克隆的还原SDS-PAGE分析。试样的还原使用100mM的二硫苏糖醇(DTT)。泳道1：分子尺寸标记物，泳道2：His-Tag-scFv H1a050(27064.24Da)，泳道3：His-Tag-scFv H2a064(26683.87Da)，泳道4：His-Tag-scFv H2a021(26708.96Da)，泳道5：His-Tag-scFv H2a006(26701.85Da)，泳道6：His-Tag-scFv H2a059(27124.32Da)，泳道7：His-Tag-scFv H2b011(27033.18Da)。分子量均由氨基酸序列计算。
图5：利用各种的癌细胞株进行的抗人MSLNHis-tag scFv抗体克隆的评价。通过流式细胞仪分析抗人MSLN His-tag scFv抗体克隆对胰腺癌3种、肺癌2种、前列腺癌1种、子宫癌1种、宫颈癌2种、卵巣癌2种、胃癌3种的反应性。图中的黑色表示各抗人MSLN His-tag scFv抗体克隆，灰色表示不使用1次抗体即抗人MSLN His-tag scFv抗体克隆而仅使用2次抗体即抗His-tag抗体作为作为对照。下段表示使用全长IgG小鼠抗人MSLN抗体11-25的FCM的图。图中的黑色表示全长IgG小鼠抗人MSLN抗体，灰色表示使用IgG同种型对照的抗KLH抗体作为阴性对照的结果。图中的数值是各抗人MSLN cp3-scFv抗体克隆以及全长IgG小鼠抗人MSLN抗体11-25的平均荧光强度mean fluorescence intensity(MFI)与对照的MFI之比。
图6：使用识别使用模型小鼠的人MSLM的89Zr-DFO-scFv抗体的PET·CT图像。BALB/cnu/nu荷瘤小鼠具有MSLN高表达胃癌细胞株MCI-N87(右肩)(白色箭头)和NSLN低表达胰腺癌细胞株PANC-1(左肩)(蓝色箭头)引起的肿瘤。示出将识别人MSLM的89Zr-DFO-scFv抗体给药后3小时的PET·CT图像。H2a064和H1a050为抗人MSLN His-tagscFv抗体的克隆名称。
图7：89Zr-DFO-scFv的生体内分布。荷瘤小鼠中的89Zr-DFO-scFv静脉内注射后3小时的生体内分布。数据以每1克的注射用量的％(％ID/g组织)的形式计算。图中的黑色柱表示scFv克隆H1a050，白色柱表示scFv克隆H2a064。误差柱表示SD。(*p<0.01)
图8是计算89Zr-DFO-scFv抗体在肿瘤、血液中的经时积累的图表。(a)Y轴表示血液中的抗体的积累。(b)表示来自MSLN高表达的胃癌细胞株(NCI-N87)、MSLN低表达的胰腺癌细胞株(PANC-1)的肿瘤中的抗体的积累(％ID/g组织)。此外，图中的误差柱表示SD值。
图9表示MSLN H1a050LHscFv的DNA序列和氨基酸序列。
图10(a)是使用识别使用模型小鼠的人MSLM的89Zr-DFO-1125-IgG的PET·CT图像，(b)是表示89Zr放射能的经时变化的图表
图11是使用(a)89Zr标记曲妥珠单抗和(b)64Cu标记曲妥珠单抗的PET·CT图像
具体实施方式
本发明人等目前为止使用将间皮素(MSLN)蛋白质对小鼠免疫而得到的对MSLN的亲和性·特异性高的IgG抗体来开发肿瘤细胞的成像技术，但小鼠型的抗体针在对人给药时有免疫原性，会诱导针对给药抗体的抗体产生，因此难以进行多次给药。因此，为了降低抗原性，建立了来自人抗体基因的抗间皮素抗体。
本发明中使用的抗体是利用短的连接子仅将抗体的H链和L链的可变区连接而成的低分子抗体即scFv。
本发明的抗间皮素scFv抗体是包含一下氨基酸序列中的任一者的多肽，序列号2的第1位～第272位、序列号4的第1位～第269位、序列号6的第1位～第270位、序列号8的第1位～第268位、序列号10的第1位～第273位、序列号12的第1位～第271位。为了容易精制，该多肽也可以结合His-tag、GST、MBP等蛋白质标签、HA-tag、myc-tag、FLAG-tag等标签。此外，在N末端、C末端侧结合任意的肽而得到的多肽也包含于本发明的多肽。将本发明的序列号2、4、6、8、10、12的肽示于图4b。
序列号1、2来自scFv克隆H1a050，
序列号3、4来自scFv克隆H2a021，
序列号5、6来自scFv克隆H2a064，
序列号7、8来自scFv克隆H2a006，
序列号9、10来自scFv克隆H2a059，
序列号11、12来自scFv克隆H2b011。
将本发明优选的scFv抗体示于图9。
本发明的DNA是编码本发明的肽的DNA，其包含：
(a)包含序列号1的第16位～第831位、序列号3的第16位～第822位、序列号5的第16位～第825位、序列号7的第16位～第819位、序列号9的第16位～第834位、序列号11的第16位～第828位中的任一碱基序列的DNA；
(b)编码包含序列号2的第1位～第272位、序列号4的第1位～第269位、序列号6的第1位～第270位、序列号8的第1位～第268位、序列号10的第1位～第273位、序列号12的第1位～第271位中的任一氨基酸序列的多肽的DNA；
(c)上述(a)或(b)的DNA的互补链。
序列号1、3、5、7、9、11在5’末端侧附加有HindIII识别序列、Kozak序列，在3’末端侧包含EcoRI识别序列，但也可以取代它们或者除它们以外还附加任意的序列。例如，本发明的DNA包含组装有序列号1的第16位～第831位、序列号3的第16位～第822位、序列号5的第16位～第825位、序列号7的第16位～第819位、序列号9的第16位～第834位、序列号11的第16位～第828位中的任一碱基序列的载体。
本发明的多肽可通过利用含有本发明的DNA的载体对细胞进行转化，培养转化细胞而得到。作为用于制造本发明的多肽的细胞，可举出包含有酵母、昆虫细胞(昆虫细胞/杆状病毒表达系统)及哺乳动物细胞(CHO等)的真核生物类、包含大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的原核生物类以及古细菌，优选为CHO。
本发明的多肽可利用标记物质进行标记。作为标记物质，可举出89Zr、99mTc、111In、113mIn、67Ga、68Ga、201Tl、51Cr、57Co、58Co、60Co、85Sr、197Hg、64Cu、123I、125I、124I、131I、90Y、177Lu、186Re、188Re、211At、225Ac、213Bi、212Pb、166Ho、44Sc、47Sc、227Th等放射性核素、荧光素、罗丹明、花青染料、Alexa Fluor、量子点、磺酰罗丹明101(Texas Red)、吲哚菁绿(ICG)等荧光物质，优选为89Zr。
本发明的复合体包含本发明的多肽和抗肿瘤物质。作为抗肿瘤物质，可举出抗癌剤、高分子胶束型DDS制剂等。作为抗癌剤，可举出阿霉素、柔红霉素、顺铂、奥沙利铂、卡铂、紫杉醇、伊立替康、SN－38、放线菌素D、长春新碱、长春碱、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、氟尿嘧啶、丝裂霉素C、多西他赛、环磷酰胺、卡培他滨、表柔比星、吉西他滨、米托蒽醌、甲酰四氢叶酸(Leucovorin)、长春瑞滨、曲妥珠单抗、依托泊苷、雌莫司汀、泼尼松、干扰素α、白细胞介素－2、博来霉素、异环磷酰胺、美司那、六甲蜜胺、拓扑替康、阿糖胞苷、甲基泼尼松龙、地塞米松、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、氟达拉滨、吉妥珠单抗、伊达比星、米托蒽醌、维甲酸、阿仑单抗、苯丁酸氮芥、克拉屈滨、伊马替尼、表柔比星、达卡巴嗪、甲基苄肼、氮芥、利妥昔单抗、地尼白介素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、别嘌呤醇、卡莫司汀、他莫昔芬、非格司亭、替莫唑胺、美法仑、长春瑞滨、阿扎胞苷、沙利度胺和丝裂霉素等，但不限定于它们。
在本发明中作为成为成像的对象的肿瘤，只要是表达间皮素的肿瘤，就没有特别限定，例如可举出小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌等。
本发明的肿瘤成像剂可用于单独或组合PET、SPECT、CT或MRI的成像(例如PET/CT、SPECT/CT、SPECT/CT/PET等)。
实施例
本发明通过以下实施例进一步例示，它们不应被解释为进一步的限定。
实施例1
I材料和方法
(1)试剂
去铁胺-p-SCN(DFO)由Macrocyclics(Dallas，TX)购入。PD-10脱盐柱由GE Healthcare(Uppsala，Sweden)购入。Amicon Ultra 0.5离心过滤单元由Merck Millipore(Billerica，MA)购入。此外，其他试剂使用特级等级的试剂。
(2)抗人MSLN-scFv制作
由扁桃体肥大·炎症患者的上颚扁桃体淋巴细胞提取总RNA，按照常规方法，使用针对各个VH、VL以及VL-CL序列的引物，通过逆转录法得到cDNA。对得到的序列附加表达信号PelB和噬菌体的cp3序列，利用(G4S)3连接子结合VH、VL-CL序列以及VH、VL序列彼此，利用pTZ19R噬菌粒载体(Thermo Fisher scientific，Massachusetts，U.S.A.)导入到大肠杆菌(DH12S)。使M13KO7辅助噬菌体感染大肠杆菌，制作人类天然抗体噬菌体文库(图1a，b)。将由VH、VL序列构成的scFv设为H1，将由V H、VL-CL序列构成的scFv-CL设为H2(图1c)。对于用于scFv的浓缩和酶结合免疫吸附法(ELISA)的重组MSLN(以下称为r-MSLN)的制备，示于岩堀等的文献(Iwahori K.et al.，Lung Cancer.2008；62(1)：45-54)。得到的H1和H2的scFv-cp3通过进行4～5次使用使r-MSLN与珠结合的柱的淘洗而浓缩，通过使用固定有r-MSLN的板的ELISA，确认对MSLN的特异亲和性(图2)。使噬菌体感染大肠杆菌，在平板培养基中形成菌落，从而进行克隆，各克隆的基因序列通过DNA测序仪进行确认。得到的人MSLN-scFv-cp3克隆通过使用固定r-MSLN的ELISA根据对r-MSLN的反应性来选择。通过ELISA选择的scFv-cp3进一步通过使用MSLN高表达的癌细胞株和MSLN低表达的癌细胞株的FCM来确认与癌细胞中表达的MSLN的反应性(图3)。由选择的反应性高的scFv-cp3的DNA序列合成具有His-tag序列的scFv基因，使用哺乳类细胞使scFv表达。将人化抗人MSLN-scFv制作的整体流程示于图1c。本研究是获得冈山大学伦理委员会和医学生物研究所、伦理委员会的批准，按照根据JAPAN政府和赫尔辛基宣言而制定的人类基因组/基因研究的伦理指南而实施的。
(3)利用抗人MSLNscFv-cp3的ELISA进行的选择。
将人r-MSLN以及作为阴性对照的上皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor，EGFR)分别溶解于PBS而分注于96孔MAXIsorp板每孔5μg/mL、50μL，通过在4℃下孵育过夜而固定。添加2.5％BSA200μL，通过在室温孵育2小时而进行封闭。加入各抗人MSLNscFv-cp3克隆50μL，在室温下孵育1小时后，添加抗cp3兔多克隆抗体(5μg/mL)50μL，在室温孵育1小时。添加利用PBS稀释5000倍的3次抗体Anti-IgG(H+L链)(兔)pAb-HRP(MBL458，Nagoya，JAPAN)50μL，在室温孵育1小时后，利用3，3'，5，5'-四甲基联苯胺50μL使其显色，利用酶标仪测定450nm的吸光度。
(4)抗人MSLN-scFv-His tag的制作
将临床应用放入视野中，制作由哺乳类细胞表达的scFv。合成在通过ELISA和FCM选择的抗MSLNscFv-cp3的VH、VL序列中附加有连接子以及His-tag的人工基因，插入到哺乳类细胞表达载体pCx17.4(Lonza，SanFrancisco，CA，U.S.A)，基因导入至CHOK1-GSKO(图4a、b)。抗人MSLN-scFv-His-tag是将培养上清施加于1mL的Ni-NTA琼脂糖(QIAGEN)柱，利用PBS清洗后，进行200mM咪唑洗脱3mL×4次，利用PBS将总量透析过夜，通过超滤(Amicon)进行浓缩，从而进行精制，通过SDS-PAGE进行确认。此外，分子量标记物使用Precision PlusProteinTM预染标准品Dual Color(Bio-rad，California，U.S.A)(图4c)。进而，通过MALDI-TOF-MS(AXIMA(注册商标)Performance，SHIMADZU，Kyoto，JAPAN)进行分子量的测定。
(5)细胞培养
由各种组织建立的癌细胞株由美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection，ATCC)以及JCRB细胞库分开出售。培养皿根据各细胞的数据表，分别以RPMI-1640、EMEM、DMEM、IMDM为基础加入10～20％的胎牛血清(FBS)，根据细胞添加必要量的胰岛素、非必需氨基酸(NEAA)等补充剂，在全部培养基中添加1％的青霉素/链霉素。培养基、补充剂等由(Gibco/Life Technologies、CA、USA)购入。将细胞株的名称、组织的来源、疾病名等示于表1。培养使用在37℃、二氧化碳浓度5％的加湿的培养器进行。
[表1]
利用流式细胞仪进行的各癌细胞类型中的MSLN表达的研究
Figure BDA0002460016080000121
表1表示细胞株、组织、疾病和MSLN表达的水平。包含3个胃癌细胞株、4个肺癌细胞株(包含支气管)、3个胰腺癌细胞株、2个卵巣癌细胞株、2个宫颈癌细胞株、3个子宫癌细胞株、1个前列腺癌细胞株、1个结肠直肠癌细胞、1个皮肤癌细胞株、1个神经母细胞瘤细胞株、1个胶质细胞株、3个白血病细胞株、1个乳腺癌细胞株、1个肝癌细胞株和1个肾癌细胞株。
为了进行FCM分析，使用了总计28种细胞株。“MSLN exp ref”表示以前的研究表示的MSLN表达阳性。“MSLN exp FCM”表示各MSLN阳性癌细胞株中的scFv克隆H1a050的平均荧光强度(MFI)相对于对照的MIF的比，将5以上表示为++，将4.9～1.5表示为+，将1.4以下表示为－。
(6)抗体的FCM分析
利用细胞解离液(Cell dissociation solution)、无酶(enzyme-free)、PBS(Gibco/Life Technologies、CA、USA)对各种的人癌细胞株(表1)进行处理，从而制成并获得单独细胞悬浮液。利用包含2％FBS和1mMEDTA的冷PBS将1×106个细胞清洗1次，使用全长抗人MSLN抗体、各抗人MSLN cp3-scFv克隆或各His-tag scFv克隆作为一次抗体。全长抗人MSLN抗体使用抗KLH抗体(IgG2同种型对照)作为阴性对照，使用标记有Alexa Fluor 488的山羊抗小鼠IgG抗体作为2次抗体。抗人MSLNcp3-scFv使用针对日本原矛头蝮毒素的出血因子HR1-007的抗体作为阴性对照，使用兔抗cp3多克隆抗体(MBL，Nagoya，JAPAN)作为2次抗体。此外，3次抗体使用利用Alexa Fluo r488标记的山羊抗兔多克隆抗体(Invitrogen：A11034、USA)。对于抗人MSLN His-tag scFv，2次抗体使用标记有Alexa Fluor 488的小鼠抗His-tag单克隆抗体(No.D291-A48、MBL，Nagoya，JAPAN)。作为对照在没有His-tag scFv的情况下对细胞进行处理。最后，为了挑选死细胞，将其悬浮于含有5μL的7-氨基-放线菌素D(immunostep，Salamanca，Spain)(7AAD)和1mMEDTA的100μL的PBS后，使用BD FACSAria III流式细胞仪(BDBiosciences、NJ、USA)进行测定。抗体的反应均在冰上进行1小时，此外，在与抗体的反应的各阶段，利用包含2％FBS和1mM EDTA的500μL的PBS清洗2次。此外，不包括死细胞团块的荧光强度的平均值使用BDFACSDiva software取得，使用Microsoft Excel进行计算。
(7)对His-tag scFv的DFO修饰以及放射标记
His-tag scFv的DFO修饰通过以溶解的螯合剂去铁胺(p-SCN-Bn-DFO)：His-tag scFv的比为3：1的方式在pH 9.0的碳酸氢盐缓冲液中在37℃孵育1小时而进行。89Zr通过cyclotron(HM-12cyclotron，Sumitomo Heavy Industries Ltd.，Tokyo，JAPAN)制造而得到89Zr-草酸盐。以89Zr-草酸盐：Na2CO3(2M)：HEPES(0.5M)为2：1：10的方式混和并调节为pH7.0，与溶剂被置换成龙胆酸生理盐水(5mg/mL)的DFO修饰His-tag scFv克隆进行混和，在37℃孵育30分钟而得到89Zr-DFO-scFv。未结合的89Zr通过使用Amicon Ultra 10K离心过滤器的超滤而除去。放射化学纯度通过基于薄层色谱法的放射自显影(TLC-ARG)和HPLC(LC-20，Shimadzu Co.，Kyoto，JAPAN)确定。TLC-ARG是将样品点样在硅胶板(硅胶、60RP-18F254S、Millipore)上，使用50mM EDTA(pH5.0)作为流动相来展开。HPLC是将D-PBS(和光)(pH7.0)作为流动相，在流速为0.75mL/分钟、Superdex 20010/300柱(10mm×30cm，GEHealthcare，Buckinghamshire，England)的条件下实施。也分析了被放射标记的scFv的50％人血浆/PBS中的37℃孵育6小时后的体外稳定性。将89Zr-DFO-scFv或抗KLH scFv(50μL)添加于450μL的小鼠血浆。在刚混和不久和孵育6小时后，将被放射标记的scFv与血浆的混合物的一部分在HPLC中通过GABI star(Raytest，straubenhardt,Germany)测定230nm和放射能。进而，为了评价基于DFO修饰、89Zr标记的结合能力的变化，利用使用胺反应性第二代(AR2G)生物传感器探头的分子间相互作用解析装置BLItz(ForteBio,Inc.，CA，U.S.A)测定相对于作为各个抗原即r-MSLN的平衡解离常数(KD)。
(8)模型动物
全部动物实验根据冈山大学的指南来进行，并得到了大学动物实验委员会(OKU-2013098)的批准。从Charp River(Tokyo，JAPAN)购入5周龄的雄BALB/cnu/nu小鼠，使用前在冈山大学自然生命科学研究支援中心动物资源部门维持在没有特定的病原体的条件下。为了进行PET成像，分别培养MSLN表达阳性培养细胞株NCI-N87、MSLN表达阴性培养细胞株PANC-1，将NCI-N87细胞3×106个移植到裸鼠的右肩，将PANC-1细胞1×107个移植到左肩，制作荷瘤小鼠模型。成像在肿瘤的直径为约8mm的时刻进行。
(9)小动物PET·CT成像
使具有由NCI-N87和PANC-1细胞株引起的肿瘤的各小鼠吸入异氟烷进行麻醉，在麻醉下从小鼠的尾静脉给药89Zr-DFO-scFv(n＝3)，使用中动物用PET/CT系统(Clairvivo PET，Shimadzu，Kyoto，JAPAN)进行拍摄。进行3小时的动态PET扫描，使用3D-DRAMA法重建图像。平均给药量分别为H1a050(6.0MBq/8.3μg)、H2a064(4.1MBq/11.5μg)。此外，在PET扫描前，使用CT扫描仪(Eminence Stargate，Shimadzu)取得CT数据。使用PMOD软件版本3.3(PMODTechnologies Ltd.，Zurich,Switzerland)将转换为DICOM格式的PET和CT图像融合，作为PET/CT图像上的肿瘤和血液池，描绘心脏中三维体积兴趣区域(VOI)，确定每1克组织的注射用量的平均百分率(％ID/g)。在CT扫描后，为了研究生体内分布，使全部小鼠安乐死。采集小鼠的肿瘤和主要器官进行称量，使用伽马计数器(AccuFLEXγ7001，Hitachi AlokaMedical，Tokyo，JAPAN)测定器官的放射能。生体内分布数据以％ID/g表示。
(10)统计解析
数据表示为平均±标准偏差的形式。为了进行两组的比较统计解析使用非配对的学生t检验来进行。将P＜0.05判定为有统计显著性。
II结果
(1)抗人MSLN-scFv的制作以及选择
利用扁桃腺肥大·炎症患者的上颚扁桃体淋巴细胞的cDNA制作抗体噬菌体文库，通过4～5次的生物淘洗得到120种抗MSLN cp3-scFv克隆。通过利用固定r-MSLN的ELISA研究得到的抗MSLN cp3-scFv的反应性，其结果可选出15种与r-MSLN反应性高的scFv。此外，在选择这15种时，确认各scFv克隆的基因序列，不选择具有同样的序列的克隆。此外，使用培养癌细胞株确认这些抗MSLNcp3-scFv克隆的反应性。作为对象使用MSLN强表达的肺癌细胞株NCI-H226、胃癌细胞株NCI-N87、胰腺癌细胞株BxPC-3以及MSLN表达非常弱的胰腺癌细胞株PANC-1进行利用FCM的分析。通过FCM分析，选出6种对MSLN强表达癌细胞的反应性高的scFv、对MSLN表达非常弱的癌细胞反应低的scFv(图3)。
(2)抗人MSLN-scFv-His tag制作以及选择
为了防止scFv自身成为抗原，在哺乳类细胞中产生scFv。具体而言，从上述(1)项中选出的抗MSLNcp3-scFv克隆的DNA序列出发，通过基因的全合成来制作在哺乳类细胞中可产生的抗人MSLN-scFv-His-tag单链抗体后，插入载体并导入至CHO细胞(图4a，b)。制作6种scFv克隆，通过使用各种癌细胞株的FCM进行分析。克隆H1a050和H2a064对MSLN表达细胞株显示高的反应性。特别是克隆H1a050对由各种组织建立的癌细胞株也显示良好的反应性(图5)。此外，H1a050 scFv显示与全长抗MSLN抗体11-25同样的反应性(图5)。示出抗人MSLNHis-tag scFv(图4a)和6个scFv克隆的氨基酸序列的结构(图4b)。由DNA序列推定的分子量和通过计算求出的摩尔吸光系数分别为His-tag scFv H1a050(27063.24Da、ε＝45130)、His-tag scFv H2a064(26683.87Da、ε＝49980)。可确认通过CHO细胞产生的His-tag抗人MSLNscFv克隆通过SDS-PAGE被制成为目标分子量的scFv(图4c)。此外，使用MALDI-TOF-MS的分子量的分析中，可确认虽然分别为His-tag scFv H1a050(26926.58Da)、His-tag scFv H2a064(26547.88Da)，且计算值存在1个氨基酸残基左右的分子量的差异，但大致得到了目标分子量的肽。
(3)对His-tag scFv的DFO修饰以及放射标记
DFO修饰后的His-tag scFv的89Zr标记后的比放射性(specific activity)分别为H1a050：(0.496MBq/μg)、H2a064(0.365MBq/μg)。在被89Zr标记的scFv在50％人血浆中，在37℃孵育6小时后的体外稳定性分别为H1a050：(98.3％)，H2a064(100％)。此外，关于DFO修饰、89Zr标记对scFv的结合能力产生的影响，以下示出未标记、DFO修饰后、89Zr标记后的各scFv的平衡解离常数(KD)。H1a050：(4.68E-09、3.38E-09、4.62E-08)，H2a064(5.96E-08、1.14E-07、7.82E-08)单位均为mol/L。
(4)小动物PET·CT成像I
将给药89Zr标记DFO-His-tag-scFv3小时后的PET·CT成像图像示于图6。抗人MSLN-scFv-His tag克隆显示H1a050、H2a064均为MSLN强表达细胞即NCI-N87向移植肿瘤的特异性聚集，特别是克隆H1a050显示比H2a064高的聚集。将89Z标记抗人MSLN-scFv-His tag克隆的PET·CT成像后的生体内分布示于图7。可确认89Z标记H1a050与来自PANC-1的肿瘤相比在来自NCI-N87的肿瘤中显著高地聚集。然而，也可确认对肾脏、肝脏强的89Zr(DFO-His-tag-scFv)的聚集。
图8是表示从PET图像得到的血液中，NCI-N87肿瘤和PANC-1肿瘤的89Z放射能的经时变化的图表。由这些数据，可以确认从刚给药标记抗体不久抗体被摄入血液以及表达MSLN的肿瘤。这些数据显示与血液中的急速的排泄相对，肿瘤中的89Zr放射能逐渐减少，即使给药后经过3小时也仍然保持在高浓度。
在图8下段，示出表示在MSLN弱表达和MSLN强表达肿瘤中的89Zr标记scFv的积累的经时变化的图表。放射标记后的抗人MSLN-scFv与PANC-1肿瘤相比在NCI-N87肿瘤中蓄积更高。此外，显示NCI-N87肿瘤中的scFv克隆H1a050的放射能与H2a064相比缓缓减少。
(5)小动物PET·CT成像II
(i)方法：从具有由NCI-N87细胞株引起的肿瘤的各小鼠的尾静脉给药89Zr-DFO-1125-IgG 1MBq/15μg(n＝3)，在刚给药不久以及24、48、72、96、144小时后使用PET系统(Clairvivo PET，Shimadzu，Kyoto，JAPAN)进行拍摄。收集的数据使用3D-DRAMA法重建图像。此外，在PET扫描后，使用CT扫描仪(Eminence Stargate，Shimadzu)取得CT数据。使用PMOD软件版本3.3(PMOD Technologies Ltd.，Zurich,Switzerland)将转换成DICOM格式的PET和CT图像融合，作为PET/CT图像上的肿瘤和血液池，描绘心脏中三维体积兴趣区域(VOI)，确定每1克组织的注射用量的平均百分率(％ID/g)。
(ii)结果：将给药89Zr标记DFO-1125-IgG后的PET·CT图像示于图10a。示出MSLN强表达细胞即NCI-N87向移植肿瘤的特异性聚集。图10b是表示从PET图像得到的血液中以及NCI-N87肿瘤中的89Zr放射能的经时变化的图表。从这些数据，可确认在给药标记抗体后，伴随时间经过而从血液被清除，另一方面，抗体被摄入表达MSLN的肿瘤，其聚集持续。
(6)小动物PET成像
(i)方法：从具有由高表达HER2的SKOV3细胞株引起的肿瘤的各小鼠的尾静脉给药89Zr-DFO-曲妥珠单抗7.2MBq/100μg，刚给药不久以及24、48、72、120小时后或给药64Cu标记NOTA-曲妥珠单抗，刚给药不久以及24、48小时后使用PET系统(Clairvivo PET，Shimadzu，Kyoto，JAPAN)进行拍摄。收集的数据使用3D-DRAMA法重建图像。
(ii)结果：示出给药89Zr标记DFO-曲妥珠单抗和64Cu标记NOTA-曲妥珠单抗后的PET图像(图11)。均在给药24小时后，开始显示HER2强表达细胞即SKOV3向移植肿瘤的高聚集，伴随时间经过，该聚集增大。另一方面，对于64Cu，观察到也向肝脏部分显著聚集，89Zr中未观察到向肝脏的聚集。
序列表
<110> 国立大学法人　冈山大学
<120> DNA、多肽、抗间皮素抗体、肿瘤成像剂和复合体
<130> P18-036WO
<150> JP 2017-210508
<151> 2017-10-31
<160> 12
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> MSLNH1a050LHscFv
<220>
<221> CDS
<222> (16)..(855)
<400> 1
aagcttgccg ccacc atg gcc agc ttc cct ctc ctc ctc acc ctc ctc act 51
Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr
1 5 10
cac tgt gca gga tcc tgg gcc tcc tat gag ctg act cag cca ccc tcg 99
His Cys Ala Gly Ser Trp Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser
15 20 25
gtg tca gtg tcc cca gga cag acg gcc agg atc acc tgc tct gga aat 147
Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asn
30 35 40
gca ttg cca aag caa tat gct tat tgg tac cag cag aag cca ggc cag 195
Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
45 50 55 60
gcc cct gtg ttg atg ata tat aaa gac agt gag agg ccc tca ggg atc 243
Ala Pro Val Leu Met Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile
65 70 75
cct gag cga ttc tct ggc tcc agc tca ggg aca aca gtc acg ttg acc 291
Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr
80 85 90
atc agt gga gtc cag gca gaa gac gag gct gac tat tac tgt caa tca 339
Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
95 100 105
gca gac agc agt cat act tat aag gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg 387
Ala Asp Ser Ser His Thr Tyr Lys Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
110 115 120
acc gtc cta ggc ggt ggc gga tca ggt ggc ggt gga agt ggc ggt ggt 435
Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
125 130 135 140
ggg tct gga ggt ggg ggc agt gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga 483
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly
145 150 155
ggc ttg gta cag cct gac agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct 531
Gly Leu Val Gln Pro Asp Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
160 165 170
gga ttc acc ttt gat gat tat gcc atg cac tgg gtc cgg caa gct cca 579
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
175 180 185
ggg aag ggc ctg gag tgg gtc tca ggt att agt tgg aat agt ggt agc 627
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser
190 195 200
ata ggc tat gcg gac tct gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac 675
Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
205 210 215 220
aac gcc aag aac tcc ctg tat ctg caa atg aac agt ctg aga gct gag 723
Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
225 230 235
gac acg gcc ttg tat tac tgt gca aaa gat ctg ggg tcc tac tat ggt 771
Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Leu Gly Ser Tyr Tyr Gly
240 245 250
tcg ggg agt ggt atg gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc 819
Ser Gly Ser Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
255 260 265
tcg agc ggg ggt cat cat cac cac cac cac tag tga gaattc 861
Ser Ser Gly Gly His His His His His His
270 275
<210> 2
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> MSLNH1a050LHscFv
<400> 2
Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser
20 25 30
Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asn Ala Leu Pro Lys
35 40 45
Gln Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
50 55 60
Met Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
85 90 95
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser
100 105 110
His Thr Tyr Lys Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
145 150 155 160
Pro Asp Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
165 170 175
Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala
195 200 205
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
210 215 220
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Leu Gly Ser Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Gly
245 250 255
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
260 265 270
His His His His His His
275
<210> 3
<211> 852
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> MSLNH2a021LHscFv
<220>
<221> CDS
<222> (16)..(846)
<400> 3
aagcttgccg ccacc atg gcc agc ttc cct ctc ctc ctc acc ctc ctc act 51
Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr
1 5 10
cac tgt gca gga tcc tgg gcc tct tct gag ctg act cag gac cct gct 99
His Cys Ala Gly Ser Trp Ala Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala
15 20 25
gtg tct gtg gcc ttg gga cag aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac 147
Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp
30 35 40
agc ctc aga agc tat tat gca agc tgg tac cag cag aag cca gga cag 195
Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
45 50 55 60
gcc cct gta ctt gtc atc tat ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc 243
Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile
65 70 75
cca gac cga ttc tct ggc tcc agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc 291
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
80 85 90
atc act ggg gct cag gcg gaa gat gag gct gac tat tac tgt cag gcg 339
Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala
95 100 105
tgg gac agc agt act gca gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc 387
Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
110 115 120
gtc cta ggc ggt ggc gga tca ggt ggc ggt gga agt ggc ggt ggt ggg 435
Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
125 130 135 140
tct gga ggt ggg ggc agt cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc 483
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
145 150 155
ttg gta cag cct ggc agg tcc ctg aga ctc tca tgt gca gct tct gga 531
Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
160 165 170
ttc acc ttt gat gat tat gcc atg cac tgg gtc cgg caa gct cca ggg 579
Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
175 180 185
aag ggc ctg gag tgg gtc tca ggt att agt tgg aat agt ggt atc ata 627
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ile Ile
190 195 200
ggc tat gcg gac tct gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac 675
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
205 210 215 220
gcc aag aac tcc ctg tat ctg caa atg aac agt ctg aga gct gag gac 723
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
225 230 235
acg gcc ttg tat tac tgt gca aaa gat ctg agc agc agc tgg tac ggt 771
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Leu Ser Ser Ser Trp Tyr Gly
240 245 250
gct ttt gat atc tgg ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc tcg agc ggg 819
Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly
255 260 265
ggt cat cat cac cac cac cac tag tga gaattc 852
Gly His His His His His His
270 275
<210> 4
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> MSLNH2a021LHscFv
<400> 4
Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala
20 25 30
Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
50 55 60
Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala
85 90 95
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser
100 105 110
Thr Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
145 150 155 160
Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp
165 170 175
Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ile Ile Gly Tyr Ala Asp
195 200 205
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
210 215 220
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys Asp Leu Ser Ser Ser Trp Tyr Gly Ala Phe Asp Ile
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly His His His
260 265 270
His His His
275
<210> 5
<211> 855
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> MSLNH2a064LHscFv
<220>
<221> CDS
<222> (16)..(849)
<400> 5
aagcttgccg ccacc atg gcc agc ttc cct ctc ctc ctc acc ctc ctc act 51
Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr
1 5 10
cac tgt gca gga tcc tgg gcc tcc tat gag ctg act cag cca ccc tcg 99
His Cys Ala Gly Ser Trp Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser
15 20 25
gtg tca gtg tcc cca gga cag acg gcc agg atc acc tgc tct gga gat 147
Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp
30 35 40
gca ttg cca aag cac tat gct tct tgg tac cag cag aag cca ggc cag 195
Ala Leu Pro Lys His Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
45 50 55 60
gcc cct gtc ctg ctg ata tat aaa gac act gag agg ccc tca ggg atc 243
Ala Pro Val Leu Leu Ile Tyr Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile
65 70 75
cct gag cga ttc tct ggc tcc agc tca ggg aca aca gtc acg ttg acc 291
Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr
80 85 90
atc agt gga gtc cag gca gaa gac gag gct gac tat tac tgt caa tca 339
Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
95 100 105
gcc gac agc agt gtt act gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc 387
Ala Asp Ser Ser Val Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
110 115 120
gtc cta ggc ggt ggc gga tca ggt ggc ggt gga agt ggc ggt ggt ggg 435
Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
125 130 135 140
tct gga ggt ggg ggc agt cag gtg cag ctg gtg caa tct ggg gga ggc 483
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
145 150 155
ttg gta cag cct ggc agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga 531
Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
160 165 170
ttc acc ttt gat gat tat gcc atg cac tgg gtc cgg caa gct cca ggg 579
Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
175 180 185
aag ggc ctg gag tgg gtc tca ggt att agt tgg aat agt ggt agc ata 627
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile
190 195 200
ggc tat gcg gac tct gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac 675
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
205 210 215 220
gcc aag aac tcc ctg tat ctg caa atg aac agt ctg aga gct gag gac 723
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
225 230 235
acg gcc ttg tat tac tgt gca aaa gat atc ggt agc agt ggc tgg tac 771
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Gly Ser Ser Gly Trp Tyr
240 245 250
ggg gct ttt gat atc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcg agc 819
Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
255 260 265
ggg ggt cat cat cac cac cac cac tag tga gaattc 855
Gly Gly His His His His His His
270 275
<210> 6
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> MSLNH2a064LHscFv
<400> 6
Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser
20 25 30
Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys
35 40 45
His Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
50 55 60
Leu Ile Tyr Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
85 90 95
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser
100 105 110
Val Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
145 150 155 160
Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp
165 170 175
Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp
195 200 205
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
210 215 220
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Gly Ser Ser Gly Trp Tyr Gly Ala Phe Asp
245 250 255
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly His His
260 265 270
His His His His
275
<210> 7
<211> 849
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> MSLNH2a006LHscFv
<220>
<221> CDS
<222> (16)..(843)
<400> 7
aagcttgccg ccacc atg gcc agc ttc cct ctc ctc ctc acc ctc ctc act 51
Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr
1 5 10
cac tgt gca gga tcc tgg gcc tcc tat gag ctg aca cag cca ccc tcg 99
His Cys Ala Gly Ser Trp Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser
15 20 25
gtg tca gtg tcc cca gga cag acg gcc agg atc acc tgc tct gga gat 147
Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp
30 35 40
gca ttg cca aag caa tat gct tat tgg tac cag cag aag cca ggc cag 195
Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
45 50 55 60
gcc cct gtg ctg gtg ata tat aaa gac agt gag agg ccc tca ggg atc 243
Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile
65 70 75
cct gag cga ttc tct ggc tcc agc tca ggg aca aca gtc acg ttg acc 291
Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr
80 85 90
atc agt gga gtc cag gca gaa gac gag gct gac tat tac tgt caa tca 339
Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
95 100 105
gca gac agc agt ggt act gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc 387
Ala Asp Ser Ser Gly Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
110 115 120
gtc ctg ggc ggt ggc gga tca ggt ggc ggt gga agt ggc ggt ggt ggg 435
Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
125 130 135 140
tct gga ggt ggg ggc agt gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc 483
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
145 150 155
ttg gta cag cct ggc agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga 531
Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
160 165 170
ttc acc ttt gat gat tat gcc atg cac tgg gtc cgg caa gct cca ggg 579
Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
175 180 185
aag ggc ctg gag tgg gtc tca ggt att agt tgg aat agt ggt agc ata 627
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile
190 195 200
gtc tat gcg gac tct gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac 675
Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
205 210 215 220
gcc aag aac tcc ctg tat ctg caa atg aac agt ctg aga gct gag gac 723
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
225 230 235
acg gcc ttg tat tac tgt gca aaa gac cgc agc agc tgg tac ggg ggg 771
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Arg Ser Ser Trp Tyr Gly Gly
240 245 250
ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcg agc ggg ggt 819
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
255 260 265
cat cat cac cac cac cac tag tga gaattc 849
His His His His His His
270
<210> 8
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> MSLNH2a006LHscFv
<400> 8
Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser
20 25 30
Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys
35 40 45
Gln Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
50 55 60
Val Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
85 90 95
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser
100 105 110
Gly Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
145 150 155 160
Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp
165 170 175
Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Val Tyr Ala Asp
195 200 205
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
210 215 220
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys Asp Arg Ser Ser Trp Tyr Gly Gly Phe Asp Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly His His His His
260 265 270
His His
<210> 9
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> MSLNH2a059LHscFv
<220>
<221> CDS
<222> (16)..(858)
<400> 9
aagcttgccg ccacc atg gcc agc ttc cct ctc ctc ctc acc ctc ctc act 51
Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr
1 5 10
cac tgt gca gga tcc tgg gcc tcc tat gag ctg atg cag cca ccc tcg 99
His Cys Ala Gly Ser Trp Ala Ser Tyr Glu Leu Met Gln Pro Pro Ser
15 20 25
gtg tca gtg tcc cca gga cag acg gcc agg atc acc tgc tct gga gat 147
Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp
30 35 40
gca ttg cca aag caa tat gct tat tgg tac cag cag aag cca ggc cag 195
Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
45 50 55 60
gcc cct gtg ctg gtg ata tat aaa gac agt gag agg ccc tca ggg atc 243
Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile
65 70 75
cct gag cga ttc tct ggc tcc agc tca ggg aca aca gtc acg ttg acc 291
Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr
80 85 90
atc agt gga gtc cag gca gaa gac gag gct gac tat tac tgt caa tca 339
Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
95 100 105
gca gac agc agt ggt act tat aga gat gtg gta ttc ggc gga ggg acc 387
Ala Asp Ser Ser Gly Thr Tyr Arg Asp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr
110 115 120
aag ctg acc gtc cta ggc ggt ggc gga tca ggt ggc ggt gga agt ggc 435
Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
125 130 135 140
ggt ggt ggg tct gga ggt ggg ggc agt gag gtg cag ctg gtg cag tct 483
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser
145 150 155
ggg gga ggc ttg gta cag cct ggc agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca 531
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
160 165 170
gcc tct gga ttc acc ttt gat gat tat gcc atg cac tgg gtc cgg caa 579
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln
175 180 185
gct cca ggg aag ggc ctg gag tgg gtc tca ggt att agt tgg aat agt 627
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser
190 195 200
ggt agc ata ggc tat gcg gac tct gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc 675
Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
205 210 215 220
aga gac aac gcc aag aac tcc ctg tat ctg caa atg aac agt ctg aga 723
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
225 230 235
gct gag gac acg gcc ttg tat tac tgt gca aaa ggt ctg ggt agt agt 771
Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Leu Gly Ser Ser
240 245 250
ggt tat tac gac gct ttt gat atc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc 819
Gly Tyr Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
255 260 265
gtc tcg agc ggg ggt cat cat cac cac cac cac tag tga gaattc 864
Val Ser Ser Gly Gly His His His His His His
270 275
<210> 10
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> MSLNH2a059LHscFv
<400> 10
Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Ser Tyr Glu Leu Met Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser
20 25 30
Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys
35 40 45
Gln Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
50 55 60
Val Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
85 90 95
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser
100 105 110
Gly Thr Tyr Arg Asp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
115 120 125
Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu
145 150 155 160
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
165 170 175
Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
180 185 190
Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly
195 200 205
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
210 215 220
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Leu Gly Ser Ser Gly Tyr Tyr Asp
245 250 255
Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
260 265 270
Gly His His His His His His
275
<210> 11
<211> 858
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> MSLNH2b011LHscFv
<220>
<221> CDS
<222> (16)..(852)
<400> 11
aagcttgccg ccacc atg gcc agc ttc cct ctc ctc ctc acc ctc ctc act 51
Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr
1 5 10
cac tgt gca gga tcc tgg gcc cag gca ggg ctg act cag cca ccc tcg 99
His Cys Ala Gly Ser Trp Ala Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser
15 20 25
gtg tca gtg tcc cca gga cag acg gcc agg atc acc tgc tct gga gat 147
Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp
30 35 40
gca ttg cca aag caa ttt act tat tgg tac cag cag aag cca ggc cag 195
Ala Leu Pro Lys Gln Phe Thr Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
45 50 55 60
gcc cct gtg ttg gtg ata tat caa gac cgt gag agg ccc tca ggg atc 243
Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Arg Glu Arg Pro Ser Gly Ile
65 70 75
cct gag cga ttc tct ggc tcc agc tca ggg aca aaa gtc acg ttg acc 291
Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Lys Val Thr Leu Thr
80 85 90
atc agt gga gtc cag gca gaa gac gag gct gac tat tat tgt caa tca 339
Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
95 100 105
gca gac agc agt ggt act tat cgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg 387
Ala Asp Ser Ser Gly Thr Tyr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
110 115 120
acc gtc cta ggc ggt ggc gga tca ggt ggc ggt gga agt ggc ggt ggt 435
Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
125 130 135 140
ggg tct gga ggt ggg ggc agt gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga 483
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
145 150 155
ggc ttg gta cag cct ggc agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct 531
Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
160 165 170
gga ttc acc ttt gat gat tat gcc atg cac tgg gtc cgg caa gct cca 579
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
175 180 185
ggg aag ggc ctg gag tgg gtc tca ggt att agt tgg aat agt ggt agc 627
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser
190 195 200
ata ggc tat gcg gac tct gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac 675
Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
205 210 215 220
aac gcc aag aac tcc ctg tat ctg caa atg aac agt ctg aga gct gag 723
Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
225 230 235
gac acg gcc ttg tat tac tgt gca aaa gat gcg ggt agt agt ggt tat 771
Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ala Gly Ser Ser Gly Tyr
240 245 250
tgg agc tac ttt gac tac tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcg 819
Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
255 260 265
agc ggg ggt cat cat cac cac cac cac tag tga gaattc 858
Ser Gly Gly His His His His His His
270 275
<210> 12
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> MSLNH2b011LHscFv
<400> 12
Met Ala Ser Phe Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr His Cys Ala Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser
20 25 30
Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys
35 40 45
Gln Phe Thr Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
50 55 60
Val Ile Tyr Gln Asp Arg Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Lys Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
85 90 95
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser
100 105 110
Gly Thr Tyr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
145 150 155 160
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
165 170 175
Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala
195 200 205
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
210 215 220
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ala Gly Ser Ser Gly Tyr Trp Ser Tyr Phe
245 250 255
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly His
260 265 270
His His His His His
275

Claims (7)

1.一种DNA，其特征在于，包含以下(a)～(c)中的任一者，
(a)包含以下碱基序列中的任一碱基序列的DNA，
序列号1的第16位～第831位，
序列号3的第16位～第822位，
序列号5的第16位～第825位，
序列号7的第16位～第819位，
序列号9的第16位～第834位，
序列号11的第16位～第828位；
(b)编码包含以下氨基酸序列中的任一氨基酸序列的多肽的DNA，
序列号2的第1位～第272位，
序列号4的第1位～第269位，
序列号6的第1位～第270位，
序列号8的第1位～第268位，
序列号10的第1位～第273位，
序列号12的第1位～第271位；
(c)所述(a)或(b)的DNA的互补链。
2.一种多肽，其特征在于，包含以下氨基酸序列中的任一氨基酸序列，
序列号2的第1位～第272位，
序列号4的第1位～第269位，
序列号6的第1位～第270位，
序列号8的第1位～第268位，
序列号10的第1位～第273位，
序列号12的第1位～第271位。
3.一种抗间皮素抗体，其特征在于，包含以下氨基酸序列中的任一氨基酸序列，
序列号2的第1位～第272位，
序列号4的第1位～第269位，
序列号6的第1位～第270位，
序列号8的第1位～第268位，
序列号10的第1位～第273位，
序列号12的第1位～第271位。
4.一种肿瘤成像剂，其特征在于，包含权利要求2所述的多肽。
5.根据权利要求4所述的肿瘤成像剂，其中，所述肿瘤成像剂还包含89Zr。
6.根据权利要求4或5所述的肿瘤成像剂，其中，所述肿瘤成像剂用于表达间皮素的肿瘤的成像。
7.一种复合体，其特征在于，所述复合体是将权利要求2所述的多肽和抗肿瘤物质连结而得到的。
CN201880068618.8A 2017-10-31 2018-03-27 Dna、多肽、抗间皮素抗体、肿瘤成像剂和复合体 Pending CN111247249A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017210508A JP6339283B1 (ja) 2017-10-31 2017-10-31 Ｄｎａ、ポリペプチド、抗メソセリン抗体、腫瘍イメージング剤及び複合体
JP2017-210508 2017-10-31
PCT/JP2018/012391 WO2019087425A1 (ja) 2017-10-31 2018-03-27 Ｄｎａ、ポリペプチド、抗メソセリン抗体、腫瘍イメージング剤及び複合体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111247249A true CN111247249A (zh) 2020-06-05

Family

ID=62487265

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880068618.8A Pending CN111247249A (zh) 2017-10-31 2018-03-27 Dna、多肽、抗间皮素抗体、肿瘤成像剂和复合体

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11975080B2 (zh)
JP (1) JP6339283B1 (zh)
CN (1) CN111247249A (zh)
WO (1) WO2019087425A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109678960A (zh) * 2019-01-15 2019-04-26 天津医科大学 一种msln特异性荧光探针及其应用
TW202321296A (zh) 2021-10-06 2023-06-01 美商鏈接免疫療法公司 抗間皮素抗原結合分子及其用途

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999028471A2 (en) * 1997-12-01 1999-06-10 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services ANTIBODIES, INCLUDING Fv MOLECULES, AND IMMUNOCONJUGATES HAVING HIGH BINDING AFFINITY FOR MESOTHELIN AND METHODS FOR THEIR USE
US7081518B1 (en) * 1999-05-27 2006-07-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Anti-mesothelin antibodies having high binding affinity
CN101012280A (zh) * 2007-02-07 2007-08-08 吴小华 抗人可溶性间皮素相关蛋白单克隆抗体的制备方法
WO2011074621A1 (ja) * 2009-12-18 2011-06-23 株式会社医学生物学研究所 メソセリン（msln）に対する抗体及びその用途
US20120107933A1 (en) * 2009-03-24 2012-05-03 The Government of the United States, as represented by The Secretary of the Dept. of Healt Anti-mesothelin antibodies
AU2012254877A1 (en) * 2005-03-10 2012-12-06 Eisai, Inc. Anti-mesothelin antibodies
US20160311917A1 (en) * 2013-12-19 2016-10-27 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
CN106467573A (zh) * 2015-08-21 2017-03-01 科济生物医药（上海）有限公司 抗间皮素全人抗体以及靶向间皮素的免疫效应细胞

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001262750A1 (en) * 2000-06-14 2001-12-24 Medical And Biological Laboratories Co., Ltd. Method of constructing scfv antibody fused with fluorescent protein
KR101559599B1 (ko) 2007-11-26 2015-10-12 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 항-메소텔린 항체 및 이의 용도

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999028471A2 (en) * 1997-12-01 1999-06-10 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services ANTIBODIES, INCLUDING Fv MOLECULES, AND IMMUNOCONJUGATES HAVING HIGH BINDING AFFINITY FOR MESOTHELIN AND METHODS FOR THEIR USE
US7081518B1 (en) * 1999-05-27 2006-07-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Anti-mesothelin antibodies having high binding affinity
AU2012254877A1 (en) * 2005-03-10 2012-12-06 Eisai, Inc. Anti-mesothelin antibodies
CN101012280A (zh) * 2007-02-07 2007-08-08 吴小华 抗人可溶性间皮素相关蛋白单克隆抗体的制备方法
US20120107933A1 (en) * 2009-03-24 2012-05-03 The Government of the United States, as represented by The Secretary of the Dept. of Healt Anti-mesothelin antibodies
WO2011074621A1 (ja) * 2009-12-18 2011-06-23 株式会社医学生物学研究所 メソセリン（msln）に対する抗体及びその用途
US20160311917A1 (en) * 2013-12-19 2016-10-27 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
CN106467573A (zh) * 2015-08-21 2017-03-01 科济生物医药（上海）有限公司 抗间皮素全人抗体以及靶向间皮素的免疫效应细胞

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HO ET AL.: "A novel high affinity human monoclonal antibody to mesothelin", 《INT J CANCER》 *
HO ET AL.: "A novel high affinity human monoclonal antibody to mesothelin", 《INT J CANCER》, 1 May 2011 (2011-05-01), pages 2020, XP002715757, DOI: 10.1002/ijc.25557 *
KAZUKO KOBAYASHI ET AL.: "A Novel PET Imaging Using 64Cu-Labeled Monoclonal Antibody against Mesothelin Commonly Expressed on Cancer Cells", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGY RESEARCH》 *
KAZUKO KOBAYASHI ET AL.: "A Novel PET Imaging Using 64Cu-Labeled Monoclonal Antibody against Mesothelin Commonly Expressed on Cancer Cells", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGY RESEARCH》, 31 December 2015 (2015-12-31), pages 1 - 15 *
陈书成等: "抗人可溶性间皮素相关蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定", 《细胞与分子免疫学杂志》 *
陈书成等: "抗人可溶性间皮素相关蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定", 《细胞与分子免疫学杂志》, 31 December 2007 (2007-12-31), pages 246 - 248 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019087425A1 (ja) 2019-05-09
US20200324001A1 (en) 2020-10-15
JP6339283B1 (ja) 2018-06-06
JP2019080531A (ja) 2019-05-30
US11975080B2 (en) 2024-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107216389B (zh) 抗pd-l1纳米抗体及其编码序列和用途
CN109096396B (zh) 一种抗pd-l1人源化纳米抗体及其应用
CN110144009B (zh) Cd47单域抗体及其用途
CN109096395B (zh) 阻断型cd47纳米抗体及其用途
US12083193B2 (en) Anti-Her2 nanobody and coding sequence and use thereof
Pruszynski et al. Targeting breast carcinoma with radioiodinated anti-HER2 Nanobody
CN110835371A (zh) 抗ccr8单克隆抗体及其应用
EP3786184A1 (en) Blocking type pd-l1 single-domain camel antibody and application thereof
US20180155449A1 (en) Covalent disulfide-linked diabodies and uses thereof
CN111518212B (zh) 抗Trop2纳米抗体及其应用
CN109485726B (zh) 放射性标记抗纳米抗体在癌症的预后、诊断中的应用
CN111247249A (zh) Dna、多肽、抗间皮素抗体、肿瘤成像剂和复合体
CN117327182A (zh) Cldn18.2单域抗体探针的制备方法及应用
CN115124621B (zh) 靶向pd-l1的纳米抗体及其制备方法和应用
CN114380907B (zh) 靶向cmtm6的纳米抗体及其制备方法和应用
WO2023031644A1 (en) Anti-fibroblast activation protein (fap) single domain antibodies and uses thereof
AU2022303437A1 (en) Anti-trop2 single-domain antibody and use thereof
CN116023497B (zh) 抗ddr1抗体及其用途
CN115873113B (zh) 靶向CaSR的纳米抗体及其制备方法和应用
CN117659194B (zh) 靶向egfr的纳米抗体、药物偶联物及其用途
US20240360248A1 (en) Anti-ptk7 single-domain antibody and application thereof
EP4389769A1 (en) Anti-ptk7 single-domain antibody and application thereof
Csizmar Engineered Proteins for Studying and Controlling Cellular Recognition
CN118754989A (zh) 一种抗her2纳米抗体及其制备方法和应用
CN117327183A (zh) 核素标记Trop2特异性单域抗体探针制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination