CN111848746A - 一种靶向结合her2的结合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向结合HER2的结合蛋白及其制备方法和用途，包括如下的氨基酸序列(a)：NDEMRX1TYW X2IALF X3 X4L X5N X6X7KR X8 X9IR X10LYDDP X11X12A X13 X14LEX15 X16A X17LEA X18 X19 X20。本发明的结合蛋白能够与HER2结合，与HER2具有良好的亲和力。可进行核素标记制备放射性核素分子影像探针，用以进行分子影像诊断，能将肿瘤影像诊断提高到肿瘤细胞特异性表达的分子水平，在确定治疗方案前或者监测药物治疗进程中，实时监测体内可能的肿瘤病灶的HER2表达情况。

Description

一种靶向结合HER2的结合蛋白及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，且特别涉及一种靶向结合HER2的结合蛋白及其制备方法和用途。
背景技术
肿瘤靶向治疗药物的个体化精准治疗是目前肿瘤诊疗领域值得关注的重要问题。人表皮生长因子受体-2(Human epithelial growth Factor receptor-2，HER2)与细胞的生长、活化和放化疗敏感性密切相关。以曲妥珠(Trastuzumab)以及帕妥珠单抗(Pertuzumab)为代表的HER2单抗治疗，明显改善了HER2阳性乳腺癌患者的预后，是肿瘤分子靶向治疗的一个重要的里程碑。检测HER2的表达情况以及在病程进展中监测HER2对靶向性治疗具有重要的意义，检测原发灶及转移灶HER2的表达情况是判断乳腺癌患者能够进行以HER2为靶点治疗的关键。目前的检测方法包括免疫组织化学检测HER2蛋白表达和原位杂交法检测HER2基因扩增等。
但在肿瘤的治疗过程中，HER2的表达会发生变化，病理检查不能及时进行。而且由于肿瘤原发灶之间以及原发灶与转移灶的不一致性，病理检查不能评估全身可能的肿瘤病灶的HER2表达的真实情况，具有一定的片面性。其次，有些转移病灶体积较小或位置较深，难以获取到肿瘤病灶组织切片。因此，临床上迫切需要一种在活体中对HER2进行实时的、无创的特异性分子影像学监测方法。另外，对HER2进行核素分子影像诊断，可以在确定治疗方案前或者监测药物治疗进程中，同时测定体内可能多个肿瘤病灶的HER2表达变化情况，从而进行治疗方案的建立和调整。
目前已有HER2核素分子影像探针进入临床试验，例如用核素标记的免疫球蛋白全分子以及免疫球蛋白片段等。但是对单克隆抗体进行放射性核素标记，如89Zr-trastuzumab等，虽可与HER2结合，但其在血液中清除慢且组织渗透低，分子质量大、结构复杂等特性，也导致了这类探针出现了热稳定性差、制备过程复杂等问题。
发明内容
基于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种靶向结合HER2的结合蛋白，此靶向结合HER2的结合蛋白具有分子量小、结构稳定、组织穿透性好以及成本低等优点，适宜制备放射性核素分子影像探针。
本发明的另一目的在于提供靶向结合HER2的结合蛋白的制备方法及其用途。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提供了一种靶向结合HER2的结合蛋白，所述结合蛋白包括如下的氨基酸序列(a)：
NDEMRX1TYWX2IALFX3X4LX5NX6X7KRX8X9IRX10LYDDPX11X12AX13X14LEX15X16AX17LEAX18X1 9X20。优选的，X1为E、D、T、S、Q、V、A、H、I、L、M或R；X2为E、D、T、S、Q、V、A、H、I、L、M或R；X3为A、G、T、S、Q、N或V；X4为A、G、T、S、Q、V或P；X5为E、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X6为E、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X7为E、T、S、Q、V、D、K、H、I、L、M或R；X8为A、T、S、Q、V、D、K、H、I、L、M或R；X9为Y或F；X10为E、D、T、S、Q、V、A、H、I、L、M或R；X11为A、G、S或T；X12为E、D、T、S、V、A、K、H、I、L、M或R；X13为D、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X14为E、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X15为E、D、T、S、Q、V、A、H、I、L、M或R；X16为E、D、T、S、Q、V、K、H、I、L、M或R；X17为E、D、T、S、Q、V、A、H、I、L、M或R；X18为E、D、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X19为E、D、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X20为V、I、L或M。
根据一种优选实施方式，所述结合蛋白的氨基酸序列还包括与氨基酸序列(a)同源性至少70％的氨基酸序列。优选的，结合蛋白的氨基酸序列还包括与氨基酸序列(a)同源性至少80％的氨基酸序列。优选的，结合蛋白的氨基酸序列还包括与氨基酸序列(a)同源性至少90％的氨基酸序列。优选的，结合蛋白的氨基酸序列还包括与氨基酸序列(a)同源性至少95％的氨基酸序列。
根据一种优选实施方式，所述结合蛋白的氨基酸序列还包括在所述氨基酸序列(a)中经取代、缺失或添加1-10个氨基酸的氨基酸序列。优选的，所述结合蛋白的氨基酸序列还包括在所述氨基酸序列(a)中经取代、缺失或添加1-8个氨基酸的氨基酸序列。优选的，所述结合蛋白的氨基酸序列还包括在所述氨基酸序列(a)中经取代、缺失或添加1-5个氨基酸的氨基酸序列。
根据一种优选实施方式，所述的在所述氨基酸序列(a)中经取代、缺失或添加的氨基酸不能发生在所述氨基酸序列(a)中的第4、5、7、8、9、11、12、13、14、17、19、22、23、26、27、30、31、32、33、36、39、40、43或47中的至少1个位点。
本发明还提供了一种蛋白质衍生物，所述蛋白质衍生物是由氨基酸序列(a)经取代、缺失或添加1-10个氨基酸的氨基酸序列所形成的且能靶向结合HER2的蛋白质衍生物。
本发明还提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含所述的结合蛋白所形成的二聚体或多聚体。
本发明还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述的结合蛋白。
本发明还提供了一种衍生物，所述衍生物是所述的结合蛋白进行结合、偶联或标记形成的衍生物。
本发明还提供了一种表达载体，包含所述的多核苷酸。
本发明还提供了一种宿主细胞，包含所述的表达载体。
本发明还提供了一种靶向结合HER2的结合蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
制备编码所述的结合蛋白的DNA分子；
制备上述DNA分子的表达载体；
将所述表达载体导入宿主细胞；以及
表达目标结合蛋白。
本发明还提供了所制备的靶向结合HER2的结合蛋白在制备用于诊断或治疗肿瘤的药物或试剂中的用途，其中，所述药物或试剂为分子影像探针，所述分子影像探针的显像制剂包括放射性核素、放射性核素标记物或分子影像制剂中的任意一种；所述肿瘤包括早期乳腺癌、转移性乳腺癌或转移性胃癌且HER2阳性肿瘤。
基于上述技术方案，本发明提供的一种靶向结合HER2的结合蛋白至少具有如下技术效果：
本发明实施例提供的一种靶向结合HER2的结合蛋白具有分子量小、结构稳定、组织穿透性好以及成本低等优点，适宜制备放射性核素分子影像探针。采用本发明结合蛋白进行核素标记制备分子探针，具有相对分子质量小、结构简单、分子单链结构、热稳定性强的特点，还具有高度的选择性和亲和性，非特异性结合率非常低；并且组织渗透力强，可快速浓聚于靶部位，注射后短时间内即可获得高对比度图像等特点。
由于结合蛋白是一种能够耐受多个氨基酸插入、缺失或替换而保持其折叠和三级结构不变的蛋白质骨架。结合蛋白具有高稳定性、高可溶性的主体结构基础，通过计算方法设计具有特定亲和性界面的蛋白序列，利用表面展示技术筛选确证。结合蛋白与抗体相比，具有更多优势：如无二硫键，能在胞内环境中维持结构稳定；稳定性高，更易于做各种修饰；分子量小，一般为5-20kDa，组织穿透性好；可溶性好，可以在大肠杆菌生产表达，生产成本低等，非常具有商业价值等。将HER2结合蛋白偶联核素制备成为核素标记的HER2显像探针，可快速浓聚于HER2表达部位，注射后短时间内即可获得高对比度图像等特点，本发明的靶向结合HER2的结合蛋白，能够与人表皮生长因子受体2(HER2)结合，与HER2具有良好的亲和力。该结合蛋白的一个或多个氨基酸位置被取代后，还可针对其他多种靶蛋白。采用本发明的结合蛋白可进行核素标记制备放射性核素分子影像探针，用以进行分子影像诊断，能将肿瘤影像诊断提高到肿瘤细胞特异性表达的分子水平，在确定治疗方案前或者监测药物治疗进程，同时测定体内可能多个肿瘤病灶的HER2表达情况，从而进行治疗方案的建立和调整。能够解决现有单克隆抗体进行放射性核素标记制备分子影像探针时血液和组织渗透性较差，稳定性差，成本高等问题，成为新一代的分子识别工具，在疾病的诊断和治疗等相关生物医学领域应用前景广阔。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1表达纯化后BindHer的SDS-PAGE电泳分析和反相高效液相分析图谱；
图2为实施例2采用SPR技术检测HER2胞外结构域蛋白与BindHer蛋白的相互作用的图谱；
图3为实施例3的流式细胞技术分析BindHer蛋白靶向HER2阳性细胞的结合率；
图4为实施例4的BindHer蛋白热稳定分析图；
图5为实施例5的99mTc标记BindHer蛋白的分子探针在乳腺癌裸鼠移植模型中的SPECT/CT显像图；
图6为实施例6中68Ga-BindHer分子探针在乳腺癌裸鼠移植模型中PET/CT成像显示特异性结合Her2肿瘤显像图；
图7为实施例7中18F-BindHer分子探针在乳腺癌裸鼠移植模型中PET/CT成像显示特异性结合Her2肿瘤显像图；
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明的技术方案进行具体说明。
本发明提出了本发明提供了一种靶向结合HER2的结合蛋白，所述结合蛋白包括如下的氨基酸序列(a)：
NDEMRX1TYWX2IALFX3X4LX5NX6X7KRX8X9IRX10LYDDPX11X12AX13X14LEX15X16AX17LEAX18X1 9X20。优选的，X1为E、D、T、S、Q、V、A、H、I、L、M或R；X2为E、D、T、S、Q、V、A、H、I、L、M或R；X3为A、G、T、S、Q、N或V；X4为A、G、T、S、Q、V或P；X5为E、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X6为E、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X7为E、T、S、Q、V、D、K、H、I、L、M或R；X8为A、T、S、Q、V、D、K、H、I、L、M或R；X9为Y或F；X10为E、D、T、S、Q、V、A、H、I、L、M或R；X11为A、G、S或T；X12为E、D、T、S、V、A、K、H、I、L、M或R；X13为D、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X14为E、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X15为E、D、T、S、Q、V、A、H、I、L、M或R；X16为E、D、T、S、Q、V、K、H、I、L、M或R；X17为E、D、T、S、Q、V、A、H、I、L、M或R；X18为E、D、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X19为E、D、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X20为V、I、L或M。
优选的，结合蛋白的氨基酸序列还包括与氨基酸序列(a)同源性至少70％的氨基酸序列。优选的，结合蛋白的氨基酸序列还包括与氨基酸序列(a)同源性至少80％的氨基酸序列。优选的，结合蛋白的氨基酸序列还包括与氨基酸序列(a)同源性至少90％的氨基酸序列。优选的，结合蛋白的氨基酸序列还包括与氨基酸序列(a)同源性至少95％的氨基酸序列。
优选的，结合蛋白的氨基酸序列还包括在所述氨基酸序列(a)中经取代、缺失或添加1-10个氨基酸的氨基酸序列。优选的，所述结合蛋白的氨基酸序列还包括在所述氨基酸序列(a)中经取代、缺失或添加1-8个氨基酸的氨基酸序列。优选的，所述结合蛋白的氨基酸序列还包括在所述氨基酸序列(a)中经取代、缺失或添加1-5个氨基酸的氨基酸序列。
优选的，在所述氨基酸序列(a)中经取代、缺失或添加的氨基酸不能发生在氨基酸序列(a)中的第4、5、7、8、9、11、12、13、14、17、19、22、23、26、27、30、31、32、33、36、39、40、43或47中的至少1个位点。
本发明还提供了一种蛋白质衍生物，该蛋白质衍生物是由氨基酸序列(a)经取代、缺失或添加1-10个氨基酸的氨基酸序列所形成的且能靶向结合HER2的蛋白质衍生物。
本发明还提供了一种融合蛋白，该融合蛋白包含所述的结合蛋白所形成的二聚体或多聚体。
本发明还提供了一种多核苷酸，该多核苷酸编码所述的结合蛋白。
本发明还提供了一种衍生物，该衍生物是所述的结合蛋白进行结合、偶联或标记形成的衍生物。
本发明还提供了一种表达载体，包含所述的多核苷酸。
本发明还提供了一种宿主细胞，包含所述的表达载体。
本发明还提供了一种靶向结合HER2的结合蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
制备编码所述的结合蛋白的DNA分子；
制备上述DNA分子的表达载体；
将所述表达载体导入宿主细胞；以及
表达目标结合蛋白。
本发明还提供了所制备的靶向结合HER2的结合蛋白在制备用于诊断或治疗肿瘤的药物或试剂中的用途，其中，所述药物或试剂为分子影像探针，所述分子影像探针的显像制剂包括放射性核素、放射性核素标记物或分子影像制剂中的任意一种；所述肿瘤包括早期乳腺癌、转移性乳腺癌或转移性胃癌且HER2阳性的肿瘤。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例1为靶向结合HER2结合蛋白(BindHer)的制备方法。
1、BindHer分子的基因合成及克隆构建。
用蛋白设计软件设计具有靶向结合HER2的蛋白(BindHer)，根据其氨基酸序列，进行基因合成。在BindHer的羧基端引入半胱氨酸，便于放射性核素标记。为了便于表达，将BindHer质粒亚克隆至pET29a载体中，构建成pET29a-BindHer质粒。质粒酶切验证并用自动测序仪测序，验证载体构建成功后，转化E.coli BL21(DE3)表达菌种中。
2、重组蛋白的表达及纯化。
将包含有pET29a-BindHer表达质粒的E.coliBL21(DE3)大肠杆菌的单克隆菌体，接入含卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下培养，至光密度(OD600nm)为0.6-0.8时，添加0.1μM的IPTG，温度为18℃，诱导过夜，通过离心(4500rpm，20分钟)收集培养物，收集菌体并放置-20℃保存。
按湿菌体/缓冲液(20mM PB，500mM NaCl，pH8.0)为1：10体积比例将菌体重悬，进行超声破碎30分钟。破碎细胞后，在13000rpm转速下，4℃离心30分钟，收集上清。上清液用30ml的亲和层析填料Chelating SepharoseTM Fast Flow(GEHealthcare Life Sciences，Sweden)，进行粗纯，脱盐后用阳离子交换SP Sepharose Fast Flow(GE Healthcare LifeSciences，Sweden)进一步精纯。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析其分子量；用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分析纯度。
结果如图1所示，通过基因克隆构建的表达载体，表达并纯化获得与理论分子量一致和高纯度的BindHer蛋白。如图1a所示，显示经还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析检测BindHer蛋白分子量与理论分子量一致；图1b示出了非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析BindHer蛋白存在单体和二聚体；图1c示出了反相高效液相分析BindHer蛋白的纯度，纯度大于95％。
实施例2
本实施例2检测了BindHer对HER2蛋白的亲和力。
在BiacoreTM T200(GE Healthcare，USA)系统上利用表面等离子共振分析BindHer蛋白与HER2之间的相互作用。
1)重组HER2胞外结构域(HER2-ECD)固定于CM5芯片表面(胺偶联法)。CM5(BR-1000-12，GEHealthcare，USA)传感芯片表面上羧化葡聚糖层的胺将HER2-ECD蛋白(10004-HCCH，Sino BiologicalInc.，Beijing China)偶联。
a)右旋糖酐表面激活：0.4M的N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)和0.1MN-羟基(N-hydroxysuccinimide)按1:1(vol/vol)比例混合，流速10μL/min运行10分钟。
b)结合HER2-ECD：取HER2-ECD50μg/mL溶解在10mM乙酸，pH为4.5的缓冲液中，流速10μL/min运行5分钟。
c)除去未结合的HER2-ECD：1M乙醇胺，pH8.5，流速10μL/min运行10分钟，去除未结合的HER2-ECD。结合在CM5表面上的HER2的信号大约为2000response units。
2)亲和力的检测。
a)将待检测的蛋白用缓冲液10mM HEPES和150mM NaCl，pH7.4稀释成不同浓度，每个浓度进样10μL/min，3分钟。然后平衡系统，10μL/min，10分钟。
b)表面再生：10mM HCl，pH2.0，10μL/min运行2分钟。
3)数据处理。
供试品到检测通道后得到的图谱减去参比通道所得到的图谱，进行参比校正，所得的曲线采用1:1Lamgmuir模型描述拟合动力学模型，Bia-evaluation分析软件进行数据处理，计算供试品的亲和动力学。
结果如图2所示，蛋白通过1:1结合模型的分子间相互作用进行拟合，获取BindHer蛋白与Her2之间结合的动力学常数(解离速率常数(kd)和结合速率常数(ka))及平衡常数KD及感应图谱见图2，结果显示BindHer的亲和力(KD)为4.24±0.51×10-9M。
实施例3
本实施例3将BindHer蛋白靶向结合HER2阳性细胞。
1、BindHer蛋白的荧光标记。
1)荧光素配制：精密称取荧光素-5-马来酰亚胺(62245，Thermo FisherScientific)4.273mg，加入0.8ml的DMSO，完全溶解后定容至1ml，即成为10mM浓度，避光保存。
2)蛋白质预处理：将1MTECP溶液与BindHer蛋白溶液混合均匀后室温放置1小时，TECP的最终浓度为10mM，用20mM磷酸钠，150mMNaCl，pH7.0缓冲液预平衡的NAP-5(17085302，GE Healthcare)，脱盐去除TECP，最后进行浓度测定。
3)按荧光素-5-马来酰亚胺相对于待偶联的巯基的摩尔量为25:1，分别加入反应体系BindHer蛋白中和荧光素-5-马来酰亚胺混合均匀后，避光放置在室温下2小时或在4℃过夜。
4)用20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH7.0缓冲液预平衡的NAP-5，进行脱盐去除游离荧光素。
5)分别于280nm和495nm波长下的检测吸光值，计算荧光标记率及蛋白浓度。
2、流式细胞技术分析靶向结合。
常规培养HER2阳性细胞株SK-BR3、BT474，阴性细胞株MDA-MB-231。胰酶消化收集对数生长期的细胞，PBS洗三次，用PBS调节细胞悬液密度2×106/ml，每个细胞100μl分别加入对应的流式管中。加入100μl的100nM荧光标记BindHer蛋白，室温孵育30min，阻断组是在加荧光标记BindHer蛋白之前加入100倍的未标记BindHer蛋白，37℃，1小时孵育。加入3mlPBS，1500rpm，5min，洗3次。最后加入300μlPBS。上机收集10000个细胞，在激发488nm的波长下检测。
结果见图3。图3显示选用三种人乳腺癌细胞BT-474(HER2+)、SK-BR-3(HER2+)及MDA-MB-231(HER2-)对BindHer蛋白分子荧光探针进行流式细胞技术分析，依据荧光偏移情况考察其对细胞的特异性结合情况。
在Her2阳性细胞株BT-474、SK-BR-3细胞，BindHer相对于空白对照组和阻断组平均荧光强度增强，而在Her2阴性细胞株MDA-MB-231中平均荧光强度没有增强。说明了该探针对HER2的阳性细胞株具有的结合作用依赖于BindHer分子的结合特异性。
BindHer蛋白分子荧光探针与MDA-MB-231细胞结合的荧光信号都很弱，表明荧光标记BindHer不能与HER2阴性的MDA-MB-231细胞形成特异性结合。
综上所述，BindHer蛋白荧光探针能对HER2高表达的BT474和SK-BR-3细胞形成特异性结合，而不与HER2阴性对照的MDA-MB-231细胞形成特异性结合。
实施例4
本实施例4对热稳定性进行了分析。
将样品在100度下加热1小时后，在圆二色谱仪(Aviv Model 400，AvivBiomedical Inc.，USA)完成检测，将各样品和PBS对照依次检测，设置参数：温度为25℃下，扫描波长195nm-260nm，光径为2mm。
结果见图4。BindHer蛋白在常温下的二级结构特征是在195nm处有一强正峰，在222nm和208nm处表现出两个负的特征肩峰谱带，在216nm处有一弱的正峰，峰形完好见图4。该结果表明，BindHer蛋白具有处于a-螺旋和无规卷曲之间的二级结构。在热稳定实验结果显示，BindHer在100℃加热1小时与未加热的相比摩尔椭圆率未发生明显的改变，表明热稳定性良好。
实施例5
本实施例为99mTc-BindHer分子探针的制备及在HER2阳性细胞异植瘤裸鼠中SPECT/CT成像显示特异性结合Her2肿瘤效果。
1、99mTc-BindHer分子探针制备。
标记管中依次加入各10μl的葡萄糖酸钠(1.28mol/L)、EDTA(0.25mol/L，pH8.0)、氯化亚锡(5.6mg/ml，用5％的稀盐酸配置)，70μl的BindHer蛋白(100μg)，加入100μl99mTcO4-溶液(～50MBq)混合均匀，室温孵育20分钟。
2、标记率检测。
采用瞬时薄层色谱层析硅胶板(Instant thin-layer chromatography-silicagel，iTLC-SG，SG10001)，以PBS展开剂，99mTcO4-的Rf为1，99mTc胶体和锝标记蛋白的Rf为0；以吡啶：冰醋酸：水＝10:6:3为展开剂，99mTcO4-和锝标记蛋白的Rf为1，99mTc胶体的Rf为0。取1μl样品点在薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边1.0～1.5cm，样点直径一般不大于2mm。将点好样品的薄层板放入小烧杯中有展开剂中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，用锡箔纸密封烧杯，待展开至规定距离(一般为8～15cm)，取出薄层板。用γ扫描仪扫描，检测放化纯度，99mTc–BindHer分子探针的放化纯度为98.4±0.38％。
3、SPECT/CT成像
裸鼠为4～6周，雌性，订购于北京华阜康生物技术公司，于本实验室动物中心SPF裸鼠房饲养。常规培养HER2阳性细胞株SK-BR-3、HER2阴性细胞株MDA-MB-231，取对数生长期的SK-BR-3细胞，胰酶消化收集对数生长期的细胞，PBS洗三次，用PBS调节细胞悬液密度，以1×107个细胞/0.2ml每只，接种于裸鼠右侧腋窝，每天观察荷瘤裸鼠的饮食情况和精神状态，隔三天测量一次肿瘤大小(体积V＝π/6×肿瘤长×肿瘤宽2)及裸鼠体重。当肿瘤体积达到80～100mm3时可用于实验。
将99mTc–BindHer分子探针(1MBq，1nM)经尾静脉分别注入荷SK-BR-3、MDA-MB-231瘤鼠(n＝4)体内，注射显像剂后1、2、4、8h使用配置针孔准直器的单光子发射计算机断层(SPECT/CT)成像设备进行动物显像。所有荷瘤鼠显像前均使用进行乙氟烷麻醉，俯卧位置于检查床上。釆集参数：放大倍数3.2，采集矩阵256×256，釆集时间20min。
阻断实验将99mTc–BindHer与80μg过量未标记99mTc的BindHer经尾静脉共同注射于荷SK-BR-3瘤鼠(n＝4)体内，然后再行显像，显像方法同前。
以In Vivo-Scope Brower软件进行图像分析，图像分析时根据CT定位确定肿瘤、心脏、大脑、肺、肝脏、肾、肌肉、骨骼、膀胱位置，手动划取脏器横断面，获得单位体积内的放射性计数.计算T/NT。
4、统计学处理。
采用Graph Pad Prism8.0统计软件，符合正态分布的计量数据以
Figure BDA0002624227130000131
表示，应用单因素方差分析比较阻断前、阻断后及HER2阴性的T/NT，以P<0.05为差异有统计学意义。
结果见图5，注射99mTc-BindHer后1h、2h、4h、8h显像，肿瘤部位具有肿瘤靶向特异性(见放射性浓聚)(箭头示)；BindHer阻断后1h、2h、4h、8h显像，肿瘤部位未见放射性浓聚(箭头示)；注射99mTc-BindHer，Her2阴性乳腺癌异植裸鼠后1h、2h、4h、8h显像，肿瘤部位也未见放射性浓聚(箭头示)。注射99mTc–BindHer至乳腺癌细胞SKBR-3皮下移植瘤裸鼠体内，进行SPECT/CT显像，结果显示荷瘤鼠肿瘤有靶向摄取，具有较高的肿瘤/正常组织比率，在注射4小时后，99mTc–BindHer的肿瘤-肝脏比率为9.1。除了肾脏和膀胱之外，肿瘤中所有时间点的放射性吸收均高于所有其他器官。用过量的未标记BindHer蛋白阻断SKBR-3皮下移植瘤裸鼠后，肿瘤吸收99mTc–BindHer明显降低，但不影响其他器官的吸收。注射99mTc–BindHer至乳腺癌细胞MDA-MB-231皮下移植瘤裸鼠模型的显像表明，肿瘤放射性吸收不明显。
实施例6
本实施例为68Ga-BindHer分子探针的制备及在HER2阳性细胞异植瘤裸鼠中PET/CT成像显示特异性结合Her2肿瘤效果。
1、68Ga-BindHer分子探针制备。
(1)蛋白预处理：将BindHer 3mg/mL，按照1mg蛋白中加入1mM TCEP的比例加入适量TCEP溶液，充分混合均匀后室温放置30min，用NAP-5(17-0853-01，GEHealthcare，USA)脱盐柱进行溶液置换，将蛋白置换到PBS溶液同时去除TCEP。
(2)溶液蛋白与NOTA偶联反应：按照蛋白与螯合剂摩尔比例为1:3加入50mg/mL的MMA-NOTA(B-622，Macrocyclics，USA)充分混匀之后置于常温过夜反应。利用NAP-5柱按照上述上样和收集规则，去除游离MAL-NOTA，将BindHer-NOTA样品置换至0.1M，pH4.0的醋酸钠溶液中。
(3)68Ga标记BindHer-NOTA：前体蛋白BindHer-NOTA 100μL(缓冲液为0.1M，pH4.0的醋酸钠溶液，调整前体蛋白浓度为2mg/mL)，加入100μL预缓冲68Ga溶液(约10MBq)混合均匀，分别于75℃下孵育15分钟。用NAP-5脱盐柱进行溶液置换，将68Ga-BindHer置换到PBS溶液同时去除游离68Ga。TLC检测68Ga-BindHer分子探针的纯度大98.21±0.52％。
2、PET/CT体内成像。
建立动物肿瘤模型同实施例5。将68Ga-BindHer分子探针10μg(约1.5MBq/只，用生理盐水稀释成100μL)分别经尾静脉注入乳腺癌荷瘤鼠体内，注射显像剂后用PET/CT成像仪器进行动物动态显像。
结果见图6。图6a为注射68Ga-BindHer后用PET/CT成像仪器进行动物动态显像过程中10min、30min、60min及90min的显像，相对于阻断、Her2阴性组，肿瘤部位具有靶向摄取(见放射性浓聚)(箭头示)，具有表示差异性极显著(P<0.01)见图6b。
实施例7
本实施例为18F-BindHer分子探针的制备及在HER2阳性细胞异植瘤裸鼠中PET/CT成像显示特异性结合Her2肿瘤效果。
1、18F-BindHer分子探针制备。
取前体蛋白BindHer-NOTA 100μL(前体蛋白浓度为2mg/mL，缓冲液为0.1M，pH4.0的醋酸钠溶液)，加入7.5μL的2mM氯化铝溶液(蛋白与氯化铝摩尔比例＝1:0.6)，充分混合。随后加入20μL的18F(370MBq)，最后加入等体积无水乙醇，混合后在100℃下反应15分钟。用PBS平衡10个柱体积NAP-5柱纯化(最大上样体积为500μL)，再将上述反应混合液过柱，用PBS洗脱，收集洗脱液。Nanodrop测收集样品浓度，iTLC检测其放射纯度93.2±0.62％。
2、PET/CT体内成像。
建立动物肿瘤模型同实施例5。将18F-BindHer分子探针10μg(约1.5MBq/只，用生理盐水稀释成100μL)分别经尾静脉注入乳腺癌荷瘤鼠体内，注射显像剂后用PET/CT成像仪器进行动物动态显像。
结果见图7。乳腺癌荷瘤鼠PET/CT显像可见，18F-BindHer分子探针注射10分钟后就能显示结合Her2阳性肿瘤，0.5小时能获得较清晰的图像，相对于阻断、Her2阴性组，在肿瘤部位有明显的浓聚，肿瘤部位具有靶向摄取(见放射性浓聚)(箭头示)，具有表示差异性极显著(P<0.01)见图7b。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (12)

1.一种靶向结合HER2的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括如下的氨基酸序列(a)：
NDEMRX1TYW X2IALF X3 X4LX5N X6X7KR X8 X9IR X10LYDDPX11X12AX13X14LEX15X16AX17LEAX18 X19 X20；
且其中：X1为E、D、T、S、Q、V、A、H、I、L、M或R；X2为E、D、T、S、Q、V、A、H、I、L、M或R；X3为A、G、T、S、Q、N或V；X4为A、G、T、S、Q、V或P；X5为E、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X6为E、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X7为E、T、S、Q、V、D、K、H、I、L、M或R；X8为A、T、S、Q、V、D、K、H、I、L、M或R；X9为Y或F；X10为E、D、T、S、Q、V、A、H、I、L、M或R；X11为A、G、S或T；X12为E、D、T、S、V、A、K、H、I、L、M或R；X13为D、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X14为E、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X15为E、D、T、S、Q、V、A、H、I、L、M或R；X16为E、D、T、S、Q、V、K、H、I、L、M或R；X17为E、D、T、S、Q、V、A、H、I、L、M或R；X18为E、D、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X19为E、D、T、S、Q、V、A、K、H、I、L、M或R；X20为V、I、L或M。
2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白的氨基酸序列还包括与所述氨基酸序列(a)同源性至少70％的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白的氨基酸序列还包括在所述氨基酸序列(a)中经取代、缺失或添加1-10个氨基酸的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的结合蛋白，其特征在于，所述的在所述氨基酸序列(a)中经取代、缺失或添加的氨基酸不能发生在所述氨基酸序列(a)中的第4、5、7、8、9、11、12、13、14、17、19、22、23、26、27、30、31、32、33、36、39、40、43或47中的至少1个位点。
5.一种蛋白质衍生物，所述蛋白质衍生物是由权利要求1中的氨基酸序列(a)经取代、缺失或添加1-10个氨基酸的氨基酸序列所形成的且能靶向结合HER2的蛋白质衍生物。
6.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含权利要求1-4任一项所述的结合蛋白所形成的二聚体或多聚体。
7.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-4任一项所述的结合蛋白。
8.一种衍生物，所述衍生物是权利要求1-4任一项所述的结合蛋白进行结合、偶联或标记形成的衍生物。
9.一种表达载体，包含权利要求7所述的多核苷酸。
10.一种宿主细胞，包含权利要求9所述的表达载体。
11.一种靶向结合HER2的结合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
制备编码权利要求1至4任一项所述的结合蛋白的DNA分子；
制备上述DNA分子的表达载体；
将所述表达载体导入宿主细胞；以及
表达目标结合蛋白。
12.权利要求11所制备的靶向结合HER2的结合蛋白在制备用于诊断或治疗肿瘤的药物或试剂中的用途，其中，所述药物或试剂为分子影像探针，所述分子影像探针的显像制剂包括放射性核素、放射性核素标记物或分子影像制剂中的任意一种；所述肿瘤包括早期乳腺癌、转移性乳腺癌或转移性胃癌且HER2阳性的肿瘤。
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