CN115286693A

CN115286693A - 针对癌胚抗原相关细胞黏附分子ceacam6的肿瘤靶向肽及其应用

Info

Publication number: CN115286693A
Application number: CN202210935017.0A
Authority: CN
Inventors: 顾月清; 许昊然; 高新; 韩智豪
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2022-08-05
Filing date: 2022-08-05
Publication date: 2022-11-04

Abstract

本发明公开了针对癌胚抗原相关细胞黏附分子CEACAM6的肿瘤靶向肽及其应用。本发明提供了一类针对癌胚抗原相关细胞黏附分子(CEACAM6)的肿瘤靶向肽，这类多肽能特异性的靶向肿瘤CEACAM6受体，同时偶联荧光染料后可以用于光学成像，术中为医生精确定位肿瘤边界，指导病灶切除，有助于提高手术彻底性，进而改善预后。此外，该类靶向多肽还可偶联放射性核素进行核素成像，来达到肿瘤早期诊断和治疗的目的。

Description

针对癌胚抗原相关细胞黏附分子CEACAM6的肿瘤靶向肽及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及针对癌胚抗原相关细胞黏附分子CEACAM6的肿瘤靶向肽及其制备方法和应用。

背景技术

中国胰腺癌新辅助治疗指南将胰腺癌分为可切除胰腺癌、临界可切除胰腺癌和局部进展胰腺癌，目前手术切除是胰腺癌根治的唯一方法，但仅20％的患者有手术的机会，因为有80％患者因未能得到及时诊断从而错过了治疗最佳期，即使这部分患者进行了根治性手术治疗，术后复发转移的几率仍然很高，中位生存时间仅有2年。癌抗原 19-9(CA19-9)是目前唯一公认的胰腺癌血清学标志物，但其诊断特异性和灵敏度均不高。当今胰腺癌的诊断多依赖于传统影像学检查，随着影像技术和设备的快速发展，医学影像学，包括多排CT(电子计算机断层扫描)、MRI(磁共振成像)、超声内镜等在胰腺癌诊断方面发挥重要作用，但CT和MRI对小于2cm的胰腺癌诊断敏感度只有50％-77％，而超声内镜的缺陷是有创、高度依赖操作者的经验，并需要仔细应对血管变异导致的出血等意外。因此亟需开发非入侵式、便捷性强、实时动态的影像学方法，用以实现胰腺癌微小病灶的早期诊断，为胰腺癌患者争取治疗时间。

癌胚抗原相关细胞粘附分子6(CEACAM6)是癌胚抗原基因家族和免疫球蛋白(Ig)超家族成员，由12种免疫球蛋白相关的细胞表面糖蛋白组成。这些分子在细胞信号转导、细胞粘附和肿瘤发生中发挥作用。CEACAM6被认为是胰腺癌诊断有效的临床生物标志物，临床研究发现，92％的胰腺癌患者样本显示CEACAM6呈阳性；与原发性和/或转移性胰腺癌相比，正常胰腺和正常其他器官中的CEACAM6水平显著降低。尚在研究中的靶向CEA荧光药物SGM-101、ssSM3E/800CW均表现出对胰腺肿瘤识别的特异性与敏感性，可进一步指导手术切除。此外，针对CEACAM6靶点治疗恶性肿瘤的方法也得到了迅速发展，如：单克隆抗体、抗体偶联药物、免疫毒素治疗、基因敲除等方法。因此，CEACAM6已成为胰腺癌及其他肿瘤诊断和治疗极具吸引力的靶点。

与CEACAM6受体特异性结合的多肽可用作成像探针的靶向基团。以小分子多肽作为靶向基团是一种常用的靶向策略，在肿瘤靶向治疗领域已有较多应用，在肿瘤靶向成像的研究也逐渐增多。与单抗相比，小分子多肽具有免疫原性弱、体内快速分布、穿透性强、易于合成和修饰等优点。

正电子发射计算机断层成像(Positron Emission Computed Tomography，PET)技术临床应用发展迅速，可实现各种疾病的无创显像，对疾病的早期诊断、分期和治疗及预后有重要意义。理论上，PET可以发现形态学尚未明显变化的最早期肿瘤和肿瘤转移灶，通过分析胰腺癌患者的PET-CT诊断检查结果，证明PET-CT灵敏性和准确性高，具有极大的临床价值和意义。但 FDA批准的18F-脱氧葡萄糖(FDG，临床常用PET显像剂)并非肿瘤特异性示踪剂，可被正常及一些良性病变组织摄取，会出现假阳性和假阴性结果；¹⁸F-FDG在胰腺癌的早期检出率仅为68.8％，对转移淋巴结的检出准确性也欠佳。目前处于临床阶段的⁶⁸Ga-FAPI可以与成纤维细胞激活蛋白(FAP)特异性结合，已成功对多种肿瘤进行显像，且对原发和转移病灶的检测灵敏度高于¹⁸F-FDG。因此，开发肿瘤特异性靶向的放射性核素标记探针对于肿瘤早期精准诊断、分级及微小病灶识别，从而保证患者能够得到及时救治具有极大的研究价值和临床意义。

单光子发射计算机断层/计算机断层扫描(Single-Photon emissiontomography/computerized tomography，SPECT/CT)是近20年来发展起来的一种新型的核医学显像技术，因其具有灵敏度高、分辨率高、无创伤性、可微量示踪、成像效果好等优点，所以SPECT/CT已经广泛用于临床诊断。本发明将可特异性结合CEACAM6受体的多肽与放射性核素偶联，制备出一种靶向CEACAM6受体的放射性核素成像探针。该探针能够在体内外靶向识别高表达CEACAM6 受体的肿瘤细胞和瘤灶，在肿瘤早期诊断与治疗中有良好的应用前景。

光学成像技术具有无创、安全、可视化能力强、空间分辨率高、成本低等优点，可对生物分子、细胞、组织和生物体进行实时、多维的可视化监测，是生物医学领域中的重要研究手段。荧光成像由于其灵敏度高、分辨率高及操作简单等优点，在生物分子检测成像、药物分布代谢跟踪、疾病检测和诊断，特别是影像引导癌症治疗中，具有良好的应用前景，而且荧光成像可以弥补放射性PET探针无法清晰准确描绘肿瘤边界的缺陷，更适合用于指导术中阴性切缘。肿瘤靶向探针凭借其高灵敏度、强特异性以及低背景信号等优势，成为肿瘤诊断与治疗领域的研究热点。近红外荧光染料MPA具有穿透深度更深、背景组织自发荧光更弱的优点，更适合用于活体成像。但是MPA不能特异性结合肿瘤细胞，本发明将可特异结合CEACAM6受体的多肽与近红外荧光染料MPA偶联，制备出一种靶向CEACAM6受体的近红外荧光成像探针。该探针能够在体内外靶向识别高表达CEACAM6受体的肿瘤细胞和瘤灶，在荧光成像和荧光指导手术中有良好的应用前景。

因此，特异性靶向的配体是放射性核素显像及荧光成像的关键。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供针对癌胚抗原相关黏附分子CEACAM6 的肿瘤靶向肽。

本发明的又一目的是提供该肿瘤靶向肽的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

针对癌胚抗原相关细胞黏附分子CEACAM6的肿瘤靶向肽，其特征在于选自以下任意一条多肽YQGR-X,X＝1～5:

YQGR-1，该序列为His-Val-His-Leu-Leu-Gln-Ala-Lys-Asp-Ser-NH₂所示多肽；

YQGR-2，该序列为His-Val-His-Leu-Leu-Gln-Ala-Lys-Asp-Cys-NH₂所示多肽；

YQGR-3，该序列为His-Val(D)-His-Nle-Leu-Gln-Ala-Lys-Asp-Ser-NH₂所示多肽

YQGR-4，该序列为His-Val(D)-Gly-Nle-Leu-Gln-Ala-Asn-Asn-Ser-NH₂所示多肽

YQGR-5，该序列为Ser-Asp-Lys-Ala-Gln-Leu-Leu-His-Val-His-NH₂所示多肽；

D表示D型氨基酸，Nle为正亮氨酸。

本发明所述的肿瘤靶向肽在制备肿瘤诊断、治疗或示踪的试剂中的应用；优选在制备用于肿瘤诊断或示踪的荧光成像试剂或放射性显像试剂中的应用。

所述的肿瘤优选高表达CEACAM6受体的肿瘤，进一步优选胰腺癌、乳腺癌、肺癌或结直肠癌。

本发明所述的多肽化合物通过特异性靶向癌胚抗原相关细胞黏附分子(CEACAM6)至肿瘤部位，并且在肿瘤部位有很好的聚集和滞留，具有较高的靶和非靶比值，适合用作荧光肿瘤显像剂和放射性核素显像剂及治疗剂，并可用于制备肿瘤术中影像导航及肿瘤边界精准定位的光学显像药物。

一种修饰的多肽，具备以下通式：

M-L-YQGR-X，或M-YQGR-X，

其中，M表示光标记或放射性核素标记；

L为连接基团；

YQGR-X为本发明所述的任意一条多肽。

所述的光标记优选自有机发色团、有机荧光团、光吸收化合物、光反射化合物、光散射化合物和生物发光分子；所述的光标记进一步优选近红外荧光染料MPA、IRDye800、Cy7.5、 Cy5.5。

所述的放射性核素优选^99mTc、⁶⁸Ga，⁶⁴Cu，⁶⁷Ga，⁹⁰Y，¹¹¹In或¹⁷⁷Lu、¹²⁵I。

所述的L优选叠氮戊酸、丙炔酸、聚乙二醇、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸、7-[(4- 羟基丙基)亚甲基]-1,4,7-三氮杂化壬烷-1,4-二乙酸、1,4,7,10-四氮杂环四氮杂环十二烷 -1,4,7,10-四乙酸、巯基乙酰三甘氨酸、MAG2、N3S、N2S2类配体、二乙基三胺五乙酸、1,4- 丁二酸、5-氨基戊酸、聚乙烯亚胺、6-肼基吡啶-3-甲酸、溴甲酸苯甲基、N-(2-氨基乙酸)马来酰亚胺或它们的组合。

所述的L进一步优选6-氨基己酸、PEG₄、PEG₆、HYNIC-PEG4或HYNIC中的任意一种或多种。

当M表示光标记时，所述的修饰的多肽为荧光分子影像探针，用于肿瘤边界的精准定位和术中影像导航。优选由多肽YQGR-X(X＝1-5)和近红外荧光染料MPA偶联而成。制备方法如下:

(1)取0.02mmol MPA溶于200μL超干DMSO中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(EDCI/NHS)(摩尔比MPA:EDCI:NHS＝1:1.5:1.5)，避光反应4h，进行羧基活化反应。

(2)取固相合成的多肽YQGR-X(X＝1-5)0.02mmol与0.1mmol三乙胺和200μL超干DMSO加入到5mL反应瓶中，氮气保护下反应10min；将上述反应(1)中溶液加入(2)的反应液中，室温搅拌反应12h；

(3)反应结束后，通过冻干浓缩反应液，然后加入蒸馏水稀释，上样到色谱填料为10μm 的C18制备柱中，用高效液相进行梯度洗脱，收集目标肽的洗脱液体，检测液体纯度。将洗脱液旋蒸除去乙腈，最后用冻干机冻干，所得绿色固体产物为目标荧光化合物，测定质荷比，确定分子量。

当M表示放射性核素标记时，所述的修饰的多肽为放射性核素探针。

在本发明的一些优选实施方式中，本发明利用放射性碘-125对多肽YQGR-X(X＝1-5)进行标记，标记方法如下：

Iodogen氧化法可对含有酪氨酸、组氨酸、色氨酸残基的多肽进行碘标记，多肽YQGR-X (X＝1-5)的序列中因存在组氨酸残基，故可采用此方法进行碘标记。首先将Iodogen制备成固相，取20μL Iodogen的二氯甲烷溶液，微微加热下用氮气吹干，使其在EP管上形成一层均匀的Iodogen薄膜。进行标记时，向Iodogen EP管内加入含有5μg的YQGR-X(X＝1-5)肽的磷酸缓冲液(PH＝7.4)，然后再加入500μCi的Na¹²⁵I，室温震荡反应2min后，取出管内反应液并加入50μL的磷酸缓冲液(PH＝7.4)稀释。放射性混合液通过C18柱纯化后可得到放射性产物¹²⁵I-YQGR-X(X＝1-5)。放射性标记产物通过配备了放射性检测器的高效液相色谱法(HPLC)确证。

在本发明的另一些优选实施方式中，本发明利用放射性核素^99mTc对多肽YQGR-X(X＝1-5)进行标记得到放射性核素^99mTc标记探针，其制备方法包括以下步骤：

(1)双功能螯合剂HYNIC-NHS的合成

将6-氯烟酸和80％水合肼加入到500mL茄型瓶中，加热回流反应6h，反应完成后，冷却到室温，加入蒸馏水稀释，然后调PH＝5.3左右，析出固体，抽滤烘干得到淡黄色固体，产品经ESI-MS质谱和核磁氢谱确定为6-联肼烟酸。得到的6-联肼烟酸和对氨基苯甲醛加入到二甲基甲酰胺(DMF)中，加热反应2小时，反应完成后，加入蒸馏水有固体析出，抽滤烘干后与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)一起加入到DMF中室温反应，反应完成后，蒸除大部分溶剂，加水后析出固体，粗品通过硅胶柱纯化后经ESI-MS质谱和核磁氢谱确定为目标产物。

(2)HYNIC-YQGR-X(X＝1-5)的合成

将纯化的2摩尔量HYNIC-NHS和1摩尔量多肽YQGR-X(X＝1-5)溶于DMSO中，然后加入3摩尔量的三乙胺，室温反应6小时，用分析型高效液相监测反应进程，反应完成后通过制备液相进行分离纯化，最后通过质谱确证。

(3)放射性探针^99mTc-HYNIC-YQGR-X(X＝1-5)的合成

配制含TPPTS(三苯基磷三间磺酸钠)5.0mg，Tricine(三甲基甘氨酸)6.5mg，琥珀酸二钠(disodium succinate hexahydrate)38.5mg，琥珀酸12.7mg和10μg HYNIC-YQGR-X(X＝1-5)的混合液5mL于10mL的西林瓶中，然后加入10-50mCi Na ^99mTcO4溶液，100℃水浴加热15分钟，待反应结束后冷却至室温，制成多肽放射性药物，产品经Agilent ZORBAX SB-Aq分析柱分析鉴定。

在本发明的另一些优选实施方式中，本发明利用放射性核素⁶⁸Ga对多肽YQGR-X(X＝1-5) 进行标记得到放射性核素⁶⁸Ga标记探针，其制备方法包括以下步骤：

(1)DOTA-YQGR-X(X＝1-5)的合成

称取多肽YQGR-X(X＝1-5)(4mg,3.8μmol)于1.5mL EP管中，用二氯甲烷(400μL)溶解,然后加入DOTA-3tBu(4.4mg，7.6μmol)、HATU(3.6mg，9.5μmol)和DIPEA(1.5 mg，11.4μmol)混匀，反应液置于金属浴中，于40℃搅拌6h。用分析液相监测反应情况，反应结束后，向反应液中加入300μL三氟乙酸，再搅拌反应2h，然后将溶液旋干去除溶剂，残余物加入水和乙腈稀释，使用安捷伦1220半制备液相进行纯化。

(2)放射性探针⁶⁸Ga-DOTA-YQGR-X(X＝1-5)的制备

首先配置0.05M的HCl水溶液和0.25M的醋酸钠溶液，将制备的DOTA-YQGR-X(X＝1-5) 配置成10μg/μL的醋酸钠溶液(0.25M)。然后用4mL的0.05M HCl来淋洗⁶⁸Ge-⁶⁸Ga发生器，选取中间放射活度最高的2mL淋洗液进行反应，将20mCi ⁶⁸Ga淋洗液加入西林瓶中，然后加入0.5mL的0.25M的醋酸钠溶液和4μL的DOTA-YQGR-X(X＝1-5)溶液，将西林瓶置于100℃下加热反应30min，反应结束后冷却至室温，然后使用C18小柱进行纯化(使用4 mL 70％乙醇、4mL生理盐水活化)，测上柱样品的放射性活度。然后用1mL生理盐水冲洗C18柱3遍，除去未标记的⁶⁸Ga。待C18柱放射性活度基本稳定后，用0.2mL 60％乙醇淋洗C18柱，获得产物产品，用活度计测放射活度，计算标记产率。使用分析液相检测放化纯度(RCP)。

本发明所述的修饰的多肽在制备肿瘤诊断、治疗或示踪的试剂中的应用；优选在制备用于肿瘤诊断或示踪的荧光成像试剂或放射性显像试剂中的应用。

有益效果：

1、本发明提供了一类针对癌胚抗原相关细胞黏附分子(CEACAM6)的肿瘤靶向肽，这类多肽能特异性的靶向肿瘤CEACAM6受体，同时偶联荧光染料后可以用于光学成像，术中为医生精确定位肿瘤边界，指导病灶切除，有助于提高手术彻底性，进而改善预后。此外，该类靶向多肽还可偶联放射性核素进行核素成像，来达到肿瘤早期诊断和治疗的目的。

2、这些多肽均为低分子量多肽，合成成本低廉，并且用非天然氨基酸替换了此系列短肽中的天然氨基酸，从而会提高多肽在活体内的稳定性。

3、本发明肽均为首次报道，获取渠道方便。

4、YQGR-X(X＝1-5)系列多肽可以和肿瘤细胞特异性结合，经活体光学成像和放射性核素显像结果证实对多种肿瘤具有优异的显像效果，包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌及结直肠癌等。

5、本发明利用近红外荧光染料MPA穿透深度更深、背景组织自发荧光更弱的优点，在荧光成像和荧光指导手术中有良好的应用前景。

6、YQGR-X(X＝1-5)多肽放射性药物可用于肿瘤的筛查和早期诊断，还可以实时无损在位监测早期恶性肿瘤以及治疗。

附图说明:

图1为荧光靶向化合物MPA-YQGR-1的结构。

图2为化合物MPA-YQGR-1在胰腺癌PANC-1荷瘤鼠体内的手术导航图。

图3为化合物MPA-YQGR-4在胰腺癌CFPAC-1荷瘤鼠体内的光学成像图。

图4为化合物MPA-YQGR-4在胰腺癌CFPAC-1荷瘤鼠体内的阻断光学成像图

图5为靶向放射性药物¹²⁵I-YQGR-1的结构图。

图6为放射性药物¹²⁵I-YQGR-1在肺癌A549荷瘤鼠体内的SPECT成像图。

图7为放射性药物¹²⁵I-YQGR-5在胰腺癌BxPC-3荷瘤鼠体内的SPECT成像图。

图8为靶向放射性药物^99mTc-HYNIC-PEG4-YQGR-1的结构图。

图9为放射性药物^99mTc-HYNIC-PEG4-YQGR-1在胰腺癌BxPC-3荷瘤鼠体内的SPECT成像图。

图10为放射性药物^99mTc-HYNIC-PEG4-YQGR-1在结直肠癌荷瘤鼠体内的SPECT成像图 (白色箭头为HT29，红色箭头为HCT116)。

图11为放射性药物^99mTc-HYNIC-PEG4-YQGR-2在乳腺癌MCF-7荷瘤鼠体内的SPECT成像图。

图12为放射性药物^99mTc-HYNIC-YQGR-3在肺癌荷瘤鼠体内的SPECT成像图(白色箭头为H460，红色箭头为A549)。

图13为放射性药物^99mTc-HYNIC-YQGR-5在胰腺癌及肝癌(阴性)荷瘤鼠体内的SPECT 成像图(红色箭头为CFPAC-1，白色箭头为BEL-7404)。

图14为放射性药物^99mTc-HYNIC-YQGR-5在胰腺癌SW1990荷瘤鼠上的SPECT成像图。

图15为靶向放射性药物⁶⁸Ga-DOTA-PEG4-YQGR-1的结构图。

图16为放射性药物⁶⁸Ga-DOTA-PEG4-YQGR-1在胰腺癌Panc-1荷瘤鼠体内的PET-CT成像图。

图17为放射性药物⁶⁸Ga-DOTA-PEG4-YQGR-4在胰腺癌CFPAC-1荷瘤鼠体内的PET-CT成像图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例和应用例来进一步说明本发明：其中合成步骤中所使用的化学物质均为现有物质或市售商品。

实施例1制备YQGR-1

(1)树脂溶胀

在反应柱中加入一定量Rink Amide MBHA树脂，然后加入适量的二氯甲烷(DCM)，微微鼓吹氮气10-30分钟，使树脂充分溶胀开来。抽干二氯甲烷溶液，再用二甲基甲酰胺(DMF) 洗涤3遍并抽干。

(2)脱除Fmoc

向反应柱里加入20％六氢吡啶的DMF溶液，去保护5分钟一次，8分钟一次。反应结束后，用DMF、DCM、DMF依次分别洗涤树脂3次。

(3)偶联

准确称取投料树脂摩尔数3倍的Fmoc-Ser-OH与O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU)，完全溶于DMF中，加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)使羧基活化后，将溶液加入反应柱进行反应，反应30分钟后，用DMF、DCM、DMF依次分别洗涤3次，然后抽干溶剂，取少量树脂加入6％茚三酮/乙醇溶液和80％苯酚/乙醇溶液各一滴进行检测。若缩合已经完全，无游离氨基存在，则溶液呈无色或淡黄色；否则树脂或溶液将变为蓝色或者红褐色，说明反应不完全。反应结束后，用DMF、DCM、DMF依次分别洗涤3次。重复上述操作，依次偶联其他氨基酸，直至偶联完最后一个氨基酸Fmoc-His(trt)-OH，用甲醇洗涤所得到的peptidyl resin，真空干燥箱里充分干燥。

(4)裂解

取120mL裂解液(87.5％三氟乙酸+5％苯甲硫醚+2.5％乙二硫醇+2.5％苯酚+2.5％水)加入树脂中，在低温条件下震荡2h，然后用砂芯漏斗将裂解液与树脂分离，保留滤液。将滤液缓慢滴加到冰无水乙醚中，滴加完毕后，自然沉降30min。然后离心得固体，用乙醚洗涤固体三遍，将所得沉淀烘干后，得到干粉粗品。

(5)纯化

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的C18制备柱，流动相系统为 0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，采用梯度洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得目标多肽浓缩液，然后冻干得到目标多肽YQGR-1，序列为His-Val-His-Leu-Leu-Gln-Ala-Lys-Asp-Ser-NH₂，最后测定质荷比，确定分子量为 1146.63。

按照上述方法制备YQGR-2，该序列为His-Val-His-Leu-Leu-Gln-Ala-Lys-Asp-Cys-NH₂，质谱确证分子量为1162.38。YQGR-3，该序列为His-Val(D)-His-Nle-Leu-Gln-Ala-Lys-Asp-Ser-NH₂，质谱确证分子量为1145.62。YQGR-4，该序列为His-Val(D)-Gly-Nle-Leu-Gln-Ala-Asn-Asn-Ser-NH₂，质谱确证分子量1050.56。唾液酸神经节苷脂亲和肽YQGR-5，该序列为 Ser-Asp-Lys-Ala-Gln-Leu-Leu-His-Val-His-NH₂，质谱确证分子量为1145.64。

实施例2制备荧光靶向化合物MPA-YQGR-1

MPA来自我们课题组前期申请的一篇发明专利，授权专利号：CN101440282。

(1)取12mg MPA溶于200μL超干DMSO中，加入3.7mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和2.2mg N-羟基琥珀酰亚胺(EDCI/NHS)(摩尔比MPA:EDCI:NHS＝ 1:1.5:1.5)，避光反应4h，进行羧基活化反应。

(2)称取10mg由固相载体合成的多肽YQGR-1与6.5mg三乙胺和200μL超干DMSO 加入到5mL反应瓶中，氮气保护下反应10min；将上述反应(1)中溶液加入(2)的反应液中，室温搅拌反应12h；

(3)反应结束后，通过冻干浓缩反应液，然后加入蒸馏水稀释，用制备液相进行分离纯化，制备液相条件如下所示：使用了Agilent 1220Infinity II系列HPLC系统配备Agilent ZORBAX SB-C18半制备柱(9.4×250mm，5um)，梯度淋洗60分钟，流速2mL/min，其中流动相A为超纯水(0.01％TFA)，B为乙腈(0.01％TFA)。淋洗梯度设定为：0-5分钟时 95％A和5％B，15分钟时85％A和15％B，30分钟时70％A和30％B，45分钟时50％A和50％B， 60分钟时10％A和90％B。最后制得的绿色产物经分析型HPLC和ESI-MS质谱分析确认为预期产物MPA-YQGR-1(结构如图1所示)。在上述制备过程中，以固相合成的YQGR-X(X＝2-5) 多肽替代步骤中使用的YQGR-1多肽，即得到本发明其他多种具有肿瘤靶向光学成像功能的多肽化合物MPA-YQGR-2、MPA-YQGR-3、MPA-YQGR-4、MPA-YQGR-5。

实施例3制备的化合物MPA-YQGR-1在胰腺癌PANC-1荷瘤鼠体内的手术导航图。

将实施例2制备的化合物MPA-YQGR-1配制成生理盐水溶液(600μg/mL)，通过尾静脉分别给胰腺癌PANC-1荷瘤裸鼠(体重约21克)注射药物MPA-YQGR-1溶液100μL，并于给药后不同时间点进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。24h后肿瘤部分荧光信号显著，身体正常组织基本消失，手术导航结果如图2所示。

实施例4化合物MPA-YQGR-4在胰腺癌CFPAC-1荷瘤鼠体内的光学成像图

将制备的化合物MPA-YQGR-4配制成生理盐水溶液(600μg/mL)，通过尾静脉分别给3 只胰腺癌CFPAC-1荷瘤裸鼠(体重约21克)注射药物MPA-YQGR-4溶液100μL，并于给药后1h、2h、4h、8h、12h和24h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。化合物MPA-YQGR-4在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从2h的成像图中可以看出探针已经在肿瘤中有明显聚集，肿瘤边缘轮廓较清晰，直至24h探针依然在肿瘤中有滞留，显像结果如图3所示。其中，4h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。

实施例5经多肽YQGR-4封闭后MPA-YQGR-4在胰腺癌CFPAC-1荷瘤鼠体内的光学成像图

取未用荧光标记的YQGR-4配制成5mg/mL的生理盐水溶液，分别取100μL溶液注射于 3只胰腺癌CFPAC-1荷瘤裸鼠(体重约21克)中，1h后通过尾静脉再给这3只胰腺癌CFPAC-1 荷瘤裸鼠注射药物MPA-YQGR-4溶液(600μg/mL)100μL，并于给药后1h、2h、4h、8h、 12h和24h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。显像结果如图4所示，荧光探针MPA-YQGR-4在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从各个时间点的光学影像图可明显看出，提前用化合物YQGR-4封闭以后，肿瘤部位未见明显的荧光信号，可说明探针MPA-YQGR-4在体内与肿瘤部位的结合是特异性结合。

实施例6制备靶向放射性药物¹²⁵I-YQGR-1

首先将Iodogen配制成0.5mg/mL的二氯甲烷溶液，取20μL Iodogen的二氯甲烷溶液于EP管中，微微加热下用氮气吹干，使其在EP管上形成一层均匀的Iodogen薄膜。然后向Iodogen EP管内加入10μL YQGR-1肽的磷酸缓冲液(PH＝7.4)(1mg/mL)，然后再加入500μCi的Na¹²⁵I 溶液，室温震荡反应2min后，取出管内反应液并加入50μL的磷酸缓冲液(PH＝7.4)稀释。放射性混合液通过Sep-Pak C18柱纯化后可得到放射性产物¹²⁵I-YQGR-1。¹²⁵I-YQGR-1的标记率>90％，经Sep-Pak C18柱纯化后放射化学纯度>99％(结构如图5所示)。以固相合成的 YQGR-X(X＝2-5)多肽替代步骤中使用的YQGR-1多肽，即得到本发明其他多种用于SPECT-CT成像的¹²⁵I标记放射性药物¹²⁵I-YQGR-2、¹²⁵I-YQGR-3、¹²⁵I-YQGR-4、¹²⁵I-YQGR-5。

实施例7制备的¹²⁵I-YQGR-1在肺癌A549荷瘤鼠体内的SPECT成像图。

按照实施例6方法制备好化合物¹²⁵I-YQGR-1并配制成生理盐水溶液(1mCi/mL)，取0.2mL(约200μCi)溶液经尾静脉分别注射给3只肺癌A549荷瘤裸鼠，并于给药后0.5h、1 h、2h、3h、4h进行SPECT信号采集。观察放射性核素探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的聚集。1h显像结果如图6所示，探针在肿瘤部位有明显的摄取，说明放射性探针¹²⁵I-YQGR-1可靶向肺癌A549肿瘤细胞，由图像可知代谢产物主要通过肾脏，少量通过肝肠代谢排出体外。

实施例8制备的¹²⁵I-YQGR-5在胰腺癌BxPC-3荷瘤鼠体内的SPECT-成像图。

参照实施例6方法制备好化合物¹²⁵I-YQGR-5并配制成生理盐水溶液(1mCi/mL)，取0.2mL(约200μCi)溶液经尾静脉分别注射给3只胰腺癌BxPC-3荷瘤裸鼠，并于给药后0.5h、1h、2h、3h、4h进行SPECT信号采集。观察放射性核素探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的聚集。1h显像结果如图7所示，探针在肿瘤部位有明显的摄取，说明放射性探针¹²⁵I-YQGR-5可以靶向到胰腺癌BxPC-3肿瘤细胞，由图像可知代谢产物主要通过肾脏，少量通过肝肠代谢排出体外。

实施例9靶向放射性药物^99mTc-HYNIC-PEG4-YQGR-1

本发明用于^99mTc标记前体化合物HYNIC-PEG4-YQGR-X(X＝1-5)的合成参照专利CN111675750A。配制含TPPTS(三苯基磷三间磺酸钠)5.0mg，Tricine(三甲基甘氨酸)6.5mg，琥珀酸二钠(disodium succinate hexahydrate)38.5mg，琥珀酸12.7mg和20μg HYNIC-PEG4-YQGR-1的混合液5mL于10mL的西林瓶中，然后加入10-50mCi Na ^99mTcO4 溶液，100℃水浴加热15分钟，待反应结束后冷却至室温，制成多肽放射性药物，产品使用配备了放射性在线检测器(Flow-RAM)和Agilent ZORBAX SB-Aq分析柱(4.6×250mm，5um) 的HPLC系统鉴定。梯度淋洗45分钟，流速1mL/min，其中流动相A为超纯水(0.01％TFA)， B为乙腈(0.01％TFA)。淋洗梯度设定为：0-5分钟时95％A和5％B，15分钟时85％A和 15％B，25分钟时65％A和35％B，35分钟时50％A和50％B，45分钟时10％A和90％B。^99mTc-HYNIC-PEG4-YQGR-1的标记率>95％，经Sep-Pak C18柱纯化后放射化学纯度>99％。

(结构式如图8所示)

实施例10制备的^99mTc-HYNIC-PEG4-YQGR-1在胰腺癌BxPC-3荷瘤鼠体内的SPECT成像图。

按实施例9中方法制备的化合物^99mTc-HYNIC-PEG4-YQGR-1配制成生理盐水溶液(1mCi /mL)，通过尾静脉分别给3只胰腺癌BxPC-3荷瘤裸鼠(体重约23克)注射药物溶液300μL，并于给药后0.5、1.5h、2.5h、4h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。显像结果如图9所示，放射性探针^99mTc-HYNIC-PEG4-YQGR-1在肿瘤部位有明显的摄取，说明此探针可靶向胰腺癌BxPC-3肿瘤细胞，代谢产物主要通过肾-膀胱排出体外。

实施例11放射性药物^99mTc-HYNIC-PEG4-YQGR-1在结直肠癌荷瘤鼠体内的SPECT成像图。

按实施例9制备的化合物^99mTc-HYNIC-PEG4-YQGR-1配制成生理盐水溶液(1mCi/mL)，通过尾静脉分别给3只结直肠癌双侧瘤荷瘤裸鼠(体重约22克)注射药物溶液300μL，并于给药后0.5、1h、2h、4h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的聚集。1h显像结果如图10所示(白色箭头为HT29，红色箭头为HCT116)，放射性探针^99mTc-HYNIC-PEG4-YQGR-1在肿瘤部位有明显的摄取，说明此探针可靶向结直肠癌HT29和 HCT116肿瘤细胞，代谢产物主要通过肾-膀胱排出体外。

实施例12放射性药物^99mTc-HYNIC-PEG4-YQGR-2在乳腺癌MCF-7荷瘤鼠体内的SPECT成像图。

按实施例9相同方法制备的化合物^99mTc-HYNIC-PEG4-YQGR-2配制成生理盐水溶液(1 mCi/mL)，通过尾静脉分别给3只乳腺癌MCF-7荷瘤裸鼠(体重约22克)注射药物溶液300μL，并于给药后0.5、1h、2h、4h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的聚集。2h显像结果如图11所示，放射性探针^99mTc-HYNIC-PEG4-YQGR-2在肿瘤部位有明显摄取，说明此探针可靶向乳腺癌MCF-7肿瘤细胞，代谢产物主要通过肾-膀胱排出体外。

实施例13放射性药物^99mTc-HYNIC-YQGR-3在肺癌荷瘤鼠体内的SPECT成像图。

按实施例9相同方法制备的化合物^99mTc-HYNIC-YQGR-3配制成生理盐水溶液(1mCi/mL)，通过尾静脉分别给3只肺癌双侧瘤荷瘤裸鼠(体重约22克)注射药物溶液300μL，并于给药后0.5、1h、2h、4h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的聚集。2h显像结果如图12所示(白色箭头为H460，红色箭头为A549)，放射性探针^99mTc-HYNIC-YQGR-3在肿瘤部位有明显摄取，说明此探针可靶向肺癌肿瘤细胞H460和 A549，代谢产物主要通过肾-膀胱排出体外。

实施例14放射性药物^99mTc-HYNIC-YQGR-5在胰腺癌及肝癌(阴性)荷瘤鼠体内的SPECT成像图。

按实施例9相同方法制备的化合物^99mTc-HYNIC-YQGR-5配制成生理盐水溶液(1mCi/mL)，通过尾静脉分别给3只胰腺癌及肝癌(阴性)荷瘤裸鼠(体重约22克)注射药物溶液300μL，并于给药后0.5、1h、2h、4h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的聚集。2h显像结果如图13所示(红色箭头为CFPAC-1，白色箭头为BEL-7404)，放射性探针^99mTc-HYNIC-YQGR-5在肿瘤部位有明显摄取，说明此探针可靶向胰腺癌CFPAC-1 肿瘤细胞，代谢产物主要通过肾-膀胱排出体外；同时对CEACAM6阴性肿瘤肝癌BEL-7404 没有靶向性，证明探针具有特异性。

实施例15放射性药物^99mTc-HYNIC-YQGR-5在胰腺癌SW1990荷瘤鼠上的SPECT成像图。

按实施例9相同方法制备的化合物^99mTc-HYNIC-YQGR-5配制成生理盐水溶液(1mCi/mL)，通过尾静脉分别给3只胰腺癌SW1990荷瘤裸鼠(体重约22克)注射药物溶液300μL，并于给药后0.5、1h、2h、4h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的聚集。2h显像结果如图14所示，放射性探针^99mTc-HYNIC-YQGR-5在肿瘤部位有明显摄取，说明此探针可靶向胰腺癌SW1990肿瘤细胞，代谢产物主要通过肾-膀胱排出体外。

实施例16放射性药物⁶⁸Ga-DOTA-YQGR-1的制备

首先配置0.05M的HCl水溶液和0.25M的醋酸钠溶液，将制备的DOTA-YQGR-1配置成10μg/μL的醋酸钠溶液(0.25M)。然后用4mL的0.05M HCl来淋洗⁶⁸Ge-⁶⁸Ga发生器，选取中间放射活度最高的2mL淋洗液进行反应，将20mCi ⁶⁸Ga淋洗液加入西林瓶中，然后加入0.5mL的0.25M的醋酸钠溶液和4μL的DOTA-YQGR-1溶液，将西林瓶置于100℃下加热反应30min，反应结束后冷却至室温，然后使用C18小柱进行纯化(使用4mL 70％乙醇、 4mL生理盐水活化)，测上柱样品的放射性活度。然后用1mL生理盐水冲洗C18柱3遍，除去未标记的⁶⁸Ga。待C18柱放射性活度基本稳定后，用0.2mL 60％乙醇淋洗C18柱，获得产物产品，用活度计测放射活度，计算标记产率。使用分析液相检测放化纯度(RCP)。(结构式如图15所示)

实施例17放射性药物⁶⁸Ga-DOTA-PEG4-YQGR-1在胰腺癌Panc-1荷瘤鼠体内的PET-CT 成像图。

按实施例16制备的化合物⁶⁸Ga-DOTA-PEG4-YQGR-1配制成生理盐水溶液(1mCi/mL)，通过尾静脉分别给3只胰腺癌Panc-1荷瘤裸鼠(体重约22克)注射药物溶液150μL，并于给药后0.5、1h、2h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的聚集。1h 显像结果如图16所示，放射性探针⁶⁸Ga-DOTA-PEG4-YQGR-1在肿瘤部位有明显摄取，说明此探针可靶向胰腺癌Panc-1肿瘤细胞，代谢产物主要通过肾-膀胱排出体外。

实施例18放射性药物⁶⁸Ga-DOTA-PEG4-YQGR-4在胰腺癌CFPAC-1荷瘤鼠体内的PET-CT成像图。

按实施例16相同方法制备的化合物⁶⁸Ga-DOTA-PEG4-YQGR-4配制成生理盐水溶液(1 mCi/mL)，通过尾静脉分别给3只胰腺癌CFPAC-1荷瘤裸鼠(体重约22克)注射药物溶液150μL，并于给药后0.5、1h、2h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的聚集。显像结果如图17所示，放射性探针⁶⁸Ga-DOTA-PEG4-YQGR-4在肿瘤部位有明显摄取，说明此探针可靶向胰腺癌CFPAC-1肿瘤细胞，代谢产物主要通过肾-膀胱排出体外。

本发明基于YQGR-X(X＝1-5)多肽与CEACAM6受体特异性结合的原理，利用CEACAM6受体在胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等恶性肿瘤中高表达，以及近红外荧光染料MPA穿透深度更深、背景组织自发荧光更弱的优点，能够靶向识别高表达CEACAM6受体的肿瘤细胞和瘤灶，在荧光成像和荧光指导手术中有良好的应用前景。同时，此系列多肽还可以偶联放射性核素，在体内核素标记后的药物通过YQGR-X(X＝1-5)多肽的靶向作用浓聚到肿瘤部位，利用核医学的单光子(SPECT)和正电子(PET)断层显像技术，对多种肿瘤进行显像诊断。本发明涉及与肿瘤诊断相关的药物领域，具体涉及多条多肽、以及这些多肽为有效成分的药物组合物以及它们在制备诊断药物中的应用。

Claims

1.针对癌胚抗原相关黏附分子CEACAM6的肿瘤靶向肽，其特征在于选自以下任意一条多肽:

YQGR-1，序列为His-Val-His-Leu-Leu-Gln-Ala-Lys-Asp-Ser-NH₂所示多肽；

YQGR-2，序列为His-Val-His-Leu-Leu-Gln-Ala-Lys-Asp-Cys-NH₂所示多肽；

YQGR-3，序列为His-Val(D)-His-Nle-Leu-Gln-Ala-Lys-Asp-Ser-NH₂所示多肽

YQGR-4，序列为His-Val(D)-Gly-Nle-Leu-Gln-Ala-Asn-Asn-Ser-NH₂所示多肽

YQGR-5，序列为Ser-Asp-Lys-Ala-Gln-Leu-Leu-His-Val-His-NH₂所示多肽；

其中，D表示D型氨基酸，Nle为正亮氨酸。

2.权利要求1所述的肿瘤靶向肽在制备肿瘤诊断、治疗或示踪的试剂中的应用；优选在制备用于肿瘤诊断或示踪的的荧光成像试剂或放射性显像试剂中的应用；所述的肿瘤优选高表达CEACAM6受体的肿瘤，进一步优选胰腺癌、乳腺癌、肺癌或结直肠癌。

3.一种修饰的多肽，其特征在于具备以下通式：

M-L-YQGR-X，或M-YQGR-X，

其中，M表示光标记或放射性核素标记；

L为连接基团；

YQGR-X为权利要求1所述的任意一条多肽。

4.根据权利要求3所述的修饰的多肽，其特征在于所述的光标记选自有机发色团、荧光染料、光吸收化合物、光反射化合物、光散射化合物和生物发光分子。

5.根据权利要求4所述的修饰的多肽，其特征在于所述的光标记选自荧光染料，优选近红外荧光染料，进一步优选MPA、IRDye800、Cy7.5、Cy5.5。

6.根据权利要求3所述的修饰的多肽，其特征在于所述的放射性核素选自^99mTc、⁶⁸Ga，⁶⁴Cu，⁶⁷Ga，⁹⁰Y，¹¹¹In、¹⁷⁷Lu或¹²⁵I。

7.根据权利要求3所述的修饰的多肽，其特征在于所述的L选自叠氮戊酸、丙炔酸、聚乙二醇、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸、7-[(4-羟基丙基)亚甲基]-1,4,7-三氮杂化壬烷-1,4-二乙酸、1,4,7,10-四氮杂环四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸、巯基乙酰三甘氨酸、MAG2、N3S、N2S2类配体、二乙基三胺五乙酸、1,4-丁二酸、5-氨基戊酸、聚乙烯亚胺、6-肼基吡啶-3-甲酸、溴甲酸苯甲基、N-(2-氨基乙酸)马来酰亚胺、6-氨基己酸、HYNIC-PEG4或HYNIC或它们的组合。

8.根据权利要求7所述的修饰的多肽，其特征在于所述的L选自6-氨基己酸、PEG₄、PEG₆、HYNIC-PEG4或HYNIC中的任意一种或多种。

9.权利要求3～8中任一项所述的修饰的多肽在制备肿瘤诊断、治疗或示踪的试剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于权利要求3～8中任一项所述的修饰的多肽在制备用于肿瘤诊断或示踪的荧光成像试剂或放射性显像试剂中的应用；所述的肿瘤优选高表达CEACAM6受体的肿瘤，进一步优选胰腺癌、乳腺癌、肺癌或结直肠癌。