CN109045313A - 一种靶向her2的d型多肽放射性药物及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种靶向HER2的D型多肽放射性药物及制备方法，该药物包括D型氨基酸线性多肽和放射性核素，放射性核素通过螯合剂标记所述D型氨基酸线性多肽，所述D型氨基酸线性多肽的序列为：Arg‑Glu‑Phe‑Val‑Phe‑Phe‑Leu‑Tyr。在体内该药物中的放射性核素通过D型氨基酸线性多肽的靶向作用浓聚到肿瘤部位，利用核医学的单光子断层显像技术，对HER2阳性肿瘤进行显像诊断。

Description

一种靶向HER2的D型多肽放射性药物及制备方法

技术领域

本发明涉及一种新型肿瘤诊断放射性药物，可以特异性的靶向HER2阳性肿瘤，特别涉及用于HER2阳性肿瘤患者的显像诊断，以及对接受抗癌药物Herceptin治疗患者的用药指导和实时疗效监测。

背景技术

在我国，癌症的发病人数及死亡人数都在逐年上升。在女性中，乳腺癌的发病率和死亡率都居高不下，在全球142个国家中，乳腺癌是女性的最高发癌症。有数据统计，肿瘤早期诊断的生存率远远高于晚期诊断，尤其是乳腺癌早期诊断的治愈率极高，所以早发现早治疗是克服癌症的重要手段。但是很多肿瘤早期症状不明显，明确诊断时往往已届中晚期，丧失了最佳治疗机会，而可以观察细胞和分子水平的分子影像学的出现使肿瘤的早期诊断成为了可能。

目前，分子影像模态主要包括：分子核磁共振成像，光学成像，靶向超声，单光子发射计算机断层（SPECT）和正电子发射断层（PET）等。这其中，核医学成像（PET，SPECT）凭借其灵敏度高，组织穿透能力强，可进行在体定量，多种核素可供选择的优点，在临床上起到越来越重要的作用。

在临床上，乳腺癌被分为四个亚型：Luminal A型、Luminal B型、HER2过表达型、基底样型，这其中有大约30%的患者属于HER2阳性肿瘤。这类肿瘤恶性程度高，浸润性强，容易发生转移，对化疗药物不敏感，预后差，无病生存期短，属于高危性肿瘤，是临床治疗上的一个难点。曲妥珠单抗（Herceptin，Trastuzumab）是被FDA批准应用于临床上针对乳腺癌HER2靶点的靶向治疗药物，在早期和晚期（转移性）乳腺癌的治疗中均显示出疗效。但是，仅有一部分患者对Herceptin治疗敏感，并且在经过一段时间的靶向治疗后，大部分患者会出现不同程度的耐药。由于抗HER2靶向治疗周期长，抗体药价格昂贵，易产生耐药性等原因，设计新型靶向乳腺癌HER2位点的分子探针对于HER2阳性肿瘤病人的筛选、在Herceptin治疗过程中的实时疗效检测和设计个体化精准诊疗就显得格外重要。

研究证实YLFFVFER序列多肽（以下简称H6多肽）具有很好的HER2靶向性能，能够有效地分辨出不同肿瘤细胞的HER2表达情况。但是H6多肽仍存在肿瘤摄取较低，体内稳定性差以及有明显的胆囊摄取等问题，影响诊断的效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的靶向HER2阳性肿瘤的多肽放射性药物。该药物通过螯合剂将放射性核素标记到D型氨基酸线性多肽上，在体内标记药物通过D型氨基酸线性多肽的靶向作用浓聚到肿瘤部位，利用核医学的单光子断层显像技术，对HER2阳性肿瘤进行显像诊断。

本发明的目的是通过如下技术方案实现：

一种靶向HER2的D型多肽放射性药物，包括D型氨基酸线性多肽（简称ref多肽）和放射性核素，所述放射性核素通过螯合剂标记所述D型氨基酸线性多肽，所述D型氨基酸线性多肽的序列为： Arg-Glu-Phe-Val-Phe-Phe-Leu-Tyr（精氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-酪氨酸）。所述多肽放射性药物为无色透明液体针剂。

更优选的方案为，所述多肽与所述螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子。进一步的，所述药代动力学修饰分子为聚乙二醇，其聚合度为1~24（优选4个或24个）与D型氨基酸多肽连接，在增强体内稳定性、提高肿瘤靶向性的同时改善生物相容性和药代动力学性质，达到更好的诊断效果。

放射性核素为^99mTc， ⁸Ga，⁶⁴Cu，¹¹¹In，⁹⁰Y和¹⁷⁷Lu中任意一种。优选为^99mTc。

螯合剂为HYNIC，NOTA，DOTA，TPA中任意一种。优选为HYNIC。

一种靶向HER2的D型多肽放射性药物的制备方法（不含药代动力学修饰分子），

所述方法包括以下步骤：

a、螯合剂-多肽的制备

将螯合剂-NHS和D型氨基酸线性多肽溶于DMF（N，N-二甲基甲酰胺），加入DIEA（N,N-二异丙基乙胺）调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜，向反应液中加入ACN（乙腈）的水溶液并过滤，滤液经YMC-Pack ODS-A半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物螯合剂-多肽；

b、放射性核素-螯合剂-多肽的制备

配制含三苯基膦三磺酸钠、三羟甲基甘氨酸、琥珀酸二钠、琥珀酸和 螯合剂-多肽的混合液，加入含有放射性核素的溶液，100 °C水浴加热反应，待反应结束后室温冷却，制成所述靶向HER2的D型多肽放射性药物。

进一步优化，上述方法优化为以下具体方案：

a、HYNIC-ref的制备

将HYNIC-NHS和D型氨基酸线性多肽（简称ref多肽）溶于DMF，加入DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜，向反应液中加入体积分数50%ACN的水溶液并过滤，滤液经YMC-PackODS-A半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物HYNIC-ref；

b、^99mTc-HYNIC-ref的制备

配制含三苯基膦三磺酸钠 (TPPTS)、三羟甲基甘氨酸（tricine）、琥珀酸二钠、琥珀酸和 HYNIC-ref的混合液，混合液中上述各物质的质量比为：4~6:6~7:38~39:12~13:0.04，加入Na^99mTcO₄ 溶液，100 °C水浴加热反应20~25分钟，待反应结束后室温冷却，制成所述靶向HER2的D型多肽放射性药物。经HPLC分析备用。

所述HPLC方法为使用Agilent 1260 HPLC系统配备YMC-Pack ODS-A半制备柱（250×10 mml.D. S-5 μm，12 nm）或分析柱（250×4.6 mml.D. S-5 μm，12 nm），梯度淋洗30分钟， 其中流动A相为去离子水（含0.05% TFA），流动B相为乙腈（含0.05% TFA）。步骤a：配备半制备柱，流速4 mL/min，淋洗梯度设定为起始时100% A和0% B，18分钟时 28% A和72% B，30分钟时 100% A和0% B。步骤b：配备分析柱，流速1 mL/min，淋洗梯度为初始时 100% A和0% B，25 分钟时 0% A和100% B，30 分钟时 100 %A和0% B。

一种靶向HER2的D型多肽放射性药物的制备方法（包含药代动力学修饰分子，即PKM），所述方法包括以下步骤：

a、螯合剂-PKM-COOH的制备

将Fmoc保护的PKM-COOH溶于哌啶的DMF溶液，室温反应15~30分钟后，加入乙醚进行沉淀，离心，弃掉上清，沉淀用乙醚洗涤，除去残留的乙醚，获得预期产物NH₂-PKM-COOH；将螯合剂-NHS和NH₂-PKM-COOH溶于DMF，加入DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜，粗产品经YMC-Pack ODS-A半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物螯合剂-PKM-COOH；所述PKM为药代动力学修饰分子；

b、螯合剂-PKM-多肽的制备

将螯合剂-PKM-COOH溶于DMF，加入NHS和EDC·HCl，室温搅拌5~10小时，向反应液中加入ACN的水溶液并过滤，滤液经YMC-Pack ODS-A半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得预期产物螯合剂-PKM-OSu；将D型氨基酸线性多肽和螯合剂-PKM-OSu溶于DMF，加入DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜，向反应液中加入ACN的水溶液并过滤，滤液经YMC-Pack ODS-A半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物螯合剂-PKM-多肽；

c、放射性核素-螯合剂-PKM-多肽的制备

配制含三苯基膦三磺酸钠、三羟甲基甘氨酸、琥珀酸二钠、琥珀酸和 螯合剂-PKM-多肽的混合液，加入放射性核素溶液，100 °C水浴加热反应，待反应结束后室温冷却，制成靶向HER2的D型多肽放射性药物。

进一步优化，上述方法优化为以下具体方案：

a、HYNIC-PKM-COOH的制备

将Fmoc保护的PKM-COOH溶于终浓度体积分数20%哌啶的DMF溶液，室温反应15~30分钟后，加入乙醚使PKM沉淀，离心，弃掉上清，沉淀用乙醚洗涤，除去残留的乙醚，获得预期产物NH₂-_-PKM-COOH；将HYNIC-NHS和NH₂-_-PKM-COOH溶于DMF，加入DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜，粗产品经YMC-Pack ODS-A半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物HYNIC-PKM -COOH；

b、HYNIC-PKM-ref的制备

将HYNIC-PKM -COOH溶于DMF，加入NHS和EDC·HCl，室温搅拌5~10小时，向反应液中加入体积分数50%ACN的水溶液并过滤，滤液经YMC-Pack ODS-A半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得预期产物HYNIC-PKM-OSu；将D型氨基酸线性多肽（简称ref多肽）和HYNIC-PKM-OSu溶于DMF，加入DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜，向反应液中加入体积分数50%ACN的水溶液并过滤，滤液经YMC-Pack ODS-A半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物HYNIC-PKM-ref；

c、^99mTc-HYNIC-PKM-ref的制备

配制含三苯基膦三磺酸钠 (TPPTS)、三羟甲基甘氨酸（tricine）、琥珀酸二钠、琥珀酸和 HYNIC-PKM-ref的混合液，混合液中上述各物质的质量比为：4~6:6~7:38~39:12~13:0.04，加入Na^99mTcO₄ 溶液，100 °C水浴加热反应20~25分钟，待反应结束后室温冷却，制成靶向HER2的D型多肽放射性药物。

所述HPLC方法为使用Agilent 1260 HPLC系统配备YMC-Pack ODS-A半制备柱（250×10 mml.D. S-5 μm，12 nm）或分析柱（250×4.6 mml.D. S-5 μm，12 nm），梯度淋洗20分钟， 其中流动A相为去离子水（含0.05% TFA），流动B相为乙腈（含0.05% TFA）。步骤a：配备半制备柱，流速4 mL/min，淋洗梯度设定为起始时90% A和10% B，20分钟时60% A和40% B；步骤b：配备半制备柱，流速4 mL/min，淋洗梯度设定为起始时90% A和10% B，20分钟时30%A和70% B; 步骤c：配备分析柱，流速1 mL/min，淋洗梯度设定为起始时90% A和10% B，20分钟时40% A和60% B。

所述ref多肽放射性药物用于HER2阳性肿瘤患者的显像诊断，以及对接受抗癌药物Herceptin治疗患者的用药指导和实时疗效监测。

本实验合成优化的ref多肽，采用了retro-inverso（反转）肽的设计，通过D型氨基酸取代正常L型氨基酸并反转多肽主骨架方向得到，D型多肽序列不会被体内的蛋白酶识别，能够有效的提高体内代谢稳定性，从而提高肿瘤组织的摄取；retro-inverso肽的支柱是相反的，而所有侧链的原始空间定向并没有发生改变，与原L型肽在结构和侧链位置上最为相近，能最大程度保持多肽原有的空间位置和与HER2位点的结合能力，可在保持多肽原有特异靶向性的同时在肿瘤部位有更高的摄取。此外，在用于放射性核素标记的螯合剂与HER2靶向的多肽之间加入了PKM（优选聚乙二醇分子链），改善了探针的生物相容性，优化了药代动力学性质，以达到更好的诊治效果。值得注意的是，多肽与Herceptin分别结合在HER2的不同位点，因此可用于在Herceptin治疗过程中的疗效检测，而不受Herceptin用药量的影响，对患者精准用药起到关键作用。

本发明的有益效果：

1、在本发明ref多肽放射性药物，采用了retro-inverso肽的设计，通过D型氨基酸取代正常L型氨基酸并反转多肽主骨架方向得到，D型多肽序列不会被体内的蛋白酶识别，能够有效的提高体内代谢稳定性，从而提高肿瘤组织的摄取；retro-inverso肽的支柱是相反的，而所有侧链的原始空间定向并没有发生改变，与原L型肽在结构和侧链位置上最为相近，能最大程度保持多肽原有的空间位置和与HER2位点的结合能力，可在保持多肽原有特异靶向性的同时在肿瘤部位有更高的摄取。

2、本发明在用于放射性核素标记的螯合剂与HER2靶向的ref多肽之间引入了PKM，改善了探针的生物相容性，优化了药代动力学性质，特别是从非肿瘤组织的清除动力学。

3、本发明中使用HYNIC作为双功能螯合剂，同时使用tricine和TPPTS作为协同配体从而使“^99mTc-HYNIC核”具有更加良好的体内外稳定性。

附图说明

图1. (A) ref多肽，HYNIC-PKM-ref及其^99mTc标记物结构示意图。

图2. SPR表面等离子体共振测定多肽的亲和力 (A) H6，K_D = 15.0 nmol/L(B)ref，K_D = 10.3 nmol/L。

图3. 在注射 (A) ^99mTc-H6，(B) ^99mTc-HP₄-ref 0.5和1 h后，NOD SCID鼠SKBR3乳腺癌模型中SPECT/CT显像图（虚线指示为肿瘤部位）。

图4. 注射^99mTc-HP₂₄-ref后，在 (A) SKBR3乳腺癌模型，(B) MCF7乳腺癌模型，(C)SKBR3乳腺癌模型注射过量ref多肽阻断实验中的SPECT/CT显像图（虚线指示为肿瘤部位）。

图5. (A) 注射^99mTc-HP₄-ref 0.5 h、1 h、2 h后在SKBR3乳腺癌模型中的体内分布结果；(B) 注射^99mTc-HP₄-ref 0.5 h后，在SKBR3模型和MCF7模型中的体内分布结果对比。

图6. (A) 注射^99mTc-HP₂₄-ref 0.5 h、1 h、2 h后在SKBR3乳腺癌模型中的体内分布结果；(B) 注射^99mTc-HP₂₄-ref 0.5 h后，在SKBR3模型、MCF7模型和SKBR3模型阻断实验中的体内分布结果对比。

图7. 注射^99mTc-HP₄-ref、^99mTc-HP₂₄-ref和^99mTc-H6 0.5 h后，在SKBR3乳腺癌模型中的体内分布结果对比。

具体实施方式

本发明实施例中所采用的材料：

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC·HCl，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，N-hydroxysuccinimide (NHS，N-羟基琥珀酰亚胺)，succinic acid (琥珀酸)，disodium succinate hexahydrate (琥珀酸二钠)，trisodium triphenylphosphine-3,3',3''-trisulfonate (TPPTS，三苯基膦三磺酸钠)，N,N-Dimethylform amide (DMF，N,N-二甲基甲酰胺)，tricine (三羟甲基甘氨酸)均购自美国Sigma-Aldrich公司。HYNIC-NHS(联肼尼克酰胺)购自美国Noca-biochem公司。所述D型氨基酸线性多肽（序列为： Arg-Glu-Phe-Val-Phe-Phe-Leu-Tyr）单体委托中国吉尔生化公司合成。Na^99mTcO₄洗脱液购自北京原子高科股份有限公司。

实施例1：

本实施例以^99mTc-HYNIC-PEG₄-ref多肽放射性药物及其制备方法为例。

^99mTc-HYNIC-PEG₄-ref中，ref多肽为D型氨基酸线性多肽（序列为： Arg-Glu-Phe-Val-Phe-Phe-Leu-Tyr），放射性核素^99mTc通过一个双功能螯合剂HYNIC标记所述ref多肽，ref多肽与双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子聚合度为4的聚乙二醇分子（PEG₄），所述ref多肽放射性药物为^99mTc-HYNIC-PEG₄-ref（简称^99mTc-HP₄-ref），所述ref多肽放射性药物为无色透明液体针剂。结构示意图如图1。

^99mTc-HYNIC-PEG₄-ref制备方法如下：

HYNIC-PEG₄-COOH的制备：将Fmoc保护的PEG₄-COOH溶于DMF，加入哌啶使终浓度为20%（体积分数），室温反应20分钟后，加入10 ml 4 ℃乙醚使PEG₄-COOH沉淀，4000 rpm 4 ℃离心5分钟，弃掉上清，沉淀用4 ℃乙醚洗涤3次，旋蒸除去残留的乙醚，获得产物为NH₂-PEG₄-COOH；将HYNIC-NHS和NH₂-PEG₄-COOH溶于DMF，加入DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜，粗产品经YMC-Pack ODS-A半制备柱HPLC分离纯化。HPLC方法为使用Agilent 1260 HPLC系统配备YMC-Pack ODS-A半制备柱（250×10 mml.D. S-5 μm，12 nm），梯度淋洗20分钟，流速4 mL/min, 其中流动A相为去离子水（含0.05% TFA），流动B相为乙腈（含0.05% TFA）。淋洗梯度设定为起始时90% A和10% B，20分钟时60% A和40% B。收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物经MALDI-TOF-MS质谱分析m/z=568.60 ([M+H]⁺)，确认为预期产物HYNIC-PEG₄-COOH。

HYNIC-PEG₄-ref的制备：将HYNIC-PEG₄-COOH溶于DMF，加入NHS和EDC·HCl，室温搅拌7小时，向反应液中加入体积分数50%ACN的水溶液并过滤，滤液经YMC-Pack ODS-A半制备柱HPLC分离纯化。HPLC方法为使用Agilent 1260 HPLC系统配备YMC-Pack ODS-A半制备柱（250×10 mml.D. S-5 μm，12 nm），梯度淋洗20分钟，流速4 mL/min, 其中流动A相为去离子水（含0.05% TFA），流动B相为乙腈（含0.05% TFA）。淋洗梯度设定为起始时90% A和10%B，20分钟时30% A和70% B。收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物经MALDI-TOF-MS质谱分析m/z = 665.67 ([M+H]⁺)，确认为预期产物HYNIC-PEG₄-OSu；将ref多肽和HYNIC-PEG₄-OSu溶于DMF，加入DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜，向反应液中加入体积分数50%ACN的水溶液并过滤，滤液经YMC-Pack ODS-A半制备柱HPLC分离纯化。HPLC方法为使用Agilent 1260 HPLC系统配备YMC-Pack ODS-A半制备柱，梯度淋洗20分钟，流速4 mL/min,其中流动A相为去离子水（含0.05% TFA），流动B相为乙腈（含0.05% TFA）。淋洗梯度设定为起始时90% A和10% B，20分钟时30% A和70% B。收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物经MALDI-TOF-MS质谱分析m/z=1670.90 ([M+H]⁺)，确认为预期产物HYNIC-PEG₄-ref。

^99mTc-HYNIC-PEG₄-ref的制备：配制含三苯基膦三磺酸钠 (TPPTS) 5.0 mg，三羟甲基甘氨酸（tricine）6.5 mg，琥珀酸二钠38.5 mg，琥珀酸12.7 mg和20 μg 的HYNIC-PEG₄-ref的混合液500 μL于10 mL西林瓶中，加入1.0-1.5 mL的Na^99mTcO₄ 溶液（10~35mCi），100 °C水浴加热西林瓶反应20~25分钟，待反应结束后室温冷却10分钟，制成ref多肽放射性药物^99mTc-HYNIC-PEG₄-ref。

对ref多肽放射性药物取样进行放射性HPLC分析。HPLC方法为使用Agilent 1260HPLC系统配备YMC-Pack ODS-A分析柱（250×4.6 mml.D. S-5 μm，12 nm），梯度淋洗20分钟，流速1 mL/min, 其中流动A相为去离子水（含0.05% TFA），流动B相为乙腈（含0.05%TFA）。淋洗梯度设定为起始时90% A和10% B，20分钟时40% A和60% B。^99mTc-HYNIC-PEG₄-ref的标记率>95%，经Sep-Pak C18柱纯化后放射化学纯度>98%。

本发明ref多肽放射性药物中，当药代动力学修饰分子PKM为PEG₂₄时，本发明药物为^99mTc-HYNIC-PEG₂₄-ref（^99mTc-HP₂₄-ref），其制备方法同上。

多肽与HER2蛋白亲和力测定（图2）：通过表面等离子体共振成像来检测多肽与HER2 蛋白的亲和解离常数。通过在连续流动过程中实时拟合多肽与 HER2 蛋白的结合和分解速率，我们可以得到动力学常数从而计算得到解离常数。H6多肽的解离常数值为15.0nM，ref多肽的解离常数值为10.3 nM，说明这两条多肽与HER2蛋白能够特异性结合，且体外亲和力相当。

^99mTc-HP₂₄-ref和^99mTc-HP₄-ref在荷瘤鼠中SPECT/CT显像（图3、4）：将NOD SCID鼠荷SKBR3乳腺癌(HER2⁺)肿瘤以及MCF7乳腺癌(HER2^-)肿瘤。在SKBR3乳腺癌肿瘤模型中，^99mTc-HP₄-ref (^99mTc-HYNIC-PEG₄-ref)和^99mTc-HP₂₄-ref (^99mTc-HYNIC-PEG₂₄-ref)的肿瘤摄取清晰可见，明显高于^99mTc-H6 (^99mTc-HYNIC-H6)，且无胆囊摄取，多肽在肿瘤部位滞留时间更长，更有利于肿瘤的诊断。在MCF7乳腺癌肿瘤模型组和阻断实验组中，肿瘤摄取明显降低，说明多肽与HER2位点的特异性结合。

^99mTc-HP₂₄-ref和^99mTc-HPEG₄-ref在荷瘤鼠中生物分布（图5、6、7）：将NOD SCID鼠荷SKBR3乳腺癌肿瘤以及荷MCF7乳腺癌肿瘤模型小鼠随机分成若干组，每组4只。各组小鼠分别经尾静脉注射不同的^99mTc标记多肽，与注射后30分钟、60分钟和120分钟处死，取血及主要脏器，称重并测量放射性计数，经衰变校正后计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g)。在SKBR3乳腺癌肿瘤模型中，^99mTc-HP₄-ref和^99mTc-HP₂₄-ref的肿瘤摄取高于^99mTc-H6 的两倍以上。从肿瘤的摄取以及靶组织与非靶组织的放射性比值来讲^99mTc-HP₄-ref和^99mTc-HP₂₄-ref明显优于^99mTc-H6。HER2阳性肿瘤摄取与阴性肿瘤和阻断实验组有明显统计学差异。

实施例2：

HYNIC-ref：将ref多肽和HYNIC-NHS溶于DMF，加入DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜，向反应液中加入体积分数50%ACN水溶液并过滤，滤液经YMC-Pack ODS-A半制备柱HPLC分离纯化。HPLC方法为使用安捷伦1260 Infinity HPLC设备配制YMC-Pack ODS-A C18半制备柱（250×10 mml.D. S-5 μm，12 nm），梯度淋洗时间为30 min，流速为4 mL/min，流动A相为去离子水（含0.05% TFA），流动B相为乙腈（含0.05% TFA）。淋洗梯度为：起始时100% A和0% B，18 分钟时 28% A和72% B，30 分钟100% A和0% B。收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物经MALDI-TOF-MS质谱分析m/z= 1423.41 ([M+H]⁺)，确认为预期产物HYNIC-ref。

^99mTc-HYNIC-ref的制备：配制含三苯基膦三磺酸钠 (TPPTS) 5.0 mg，三羟甲基甘氨酸（tricine）6.5 mg，琥珀酸二钠38.5 mg，琥珀酸12.7 mg和20 μg 的HYNIC-ref的混合液500μL于10 mL西林瓶中，加入1.0-1.5 mL的Na^99mTcO₄ 溶液（10~35 mCi），100 °C水浴加热西林瓶反应20~25分钟，待反应结束后室温冷却10分钟，制成ref多肽放射性药物。

对ref多肽放射性药物取样进行放射性HPLC分析。HPLC方法为使用安捷伦1260Infinity HPLC设备及Raytest Gabi放射性检测器，配备YMC-Pack ODS-A C18分析柱（250×4.6 mml.D. S-5 μm，12 nm），梯度淋洗时间为30 min，流速为1 mL/min，流动A相为去离子水（含0.05% TFA），流动B相为乙腈（含0.05% TFA）。淋洗梯度为：初始时 100% A和0% B，25 分钟时 0% A和100% B，30 分钟时 100 %A和0% B。^99mTc-HYNIC-ref的标记率>95%，经Sep-Pak C18柱纯化后放射化学纯度>98%。

实施例3：

DOTA-ref：将ref多肽和DOTA-NHS溶于DMF，加入DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜，向反应液中加入体积分数50%ACN水溶液并过滤，滤液经YMC-Pack ODS-A半制备柱HPLC分离纯化。HPLC方法为使用Agilent 1260 HPLC系统配备YMC-Pack ODS-A半制备柱（250×10 mml.D. S-5 μm，12 nm），梯度淋洗20分钟，流速4 mL/min, 其中流动A相为去离子水（含0.05% TFA），流动B相为乙腈（含0.05% TFA）。淋洗梯度设定为起始时90% A和10% B，20分钟时40% A和60% B。收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物经MALDI-TOF-MS质谱分析m/z = 1506.72 ([M+H]⁺)，确认为预期产物DOTA-ref。

⁶⁸Ga-DOTA-ref：用浓度为0.05M的HCl从锗镓发生器中直接淋洗出⁶⁸Ga的原液，通过1.25M醋酸缓冲液调节pH值至3.5-4.0，并与DOTA-ref混合，在100℃条件下反应15-20min，得到标记产物⁶⁸Ga-DOTA-ref，标记物通过HPLC检测标记率和放化纯，放化纯>95%。HPLC方法为使用Agilent 1260 HPLC系统配备YMC-Pack ODS-A分析柱（250×4.6 mml.D. S-5 μm，12 nm），梯度淋洗20分钟，流速1 mL/min, 其中流动A相为去离子水（含0.05% TFA），流动B相为乙腈（含0.05% TFA）。淋洗梯度设定为起始时90% A和10% B，20分钟时40% A和60% B。

Claims (10)

1.一种靶向HER2的D型多肽放射性药物，其特征在于：包括D型氨基酸线性多肽和放射性核素，所述放射性核素通过螯合剂标记所述D型氨基酸线性多肽，所述D型氨基酸线性多肽的序列为：Arg-Glu-Phe-Val-Phe-Phe-Leu-Tyr。

2.根据权利要求1所述的靶向HER2的D型多肽放射性药物，其特征在于：所述D型氨基酸线性多肽与所述螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子。

3.根据权利要求2所述的靶向HER2的D型多肽放射性药物，其特征在于：所述药代动力学修饰分子为聚乙二醇，其聚合度为1~24。

4.根据权利要求3所述的靶向HER2的D型多肽放射性药物，其特征在于：所述聚乙二醇的聚合度为4或24。

5.根据权利要求1所述的靶向HER2的D型多肽放射性药物，其特征在于：所述放射性核素为^99mTc， ⁸Ga，⁶⁴Cu，¹¹¹In，⁹⁰Y和¹⁷⁷Lu中任意一种。

6.根据权利要求1所述的靶向HER2的D型多肽放射性药物，其特征在于：螯合剂为HYNIC，OTA，DOTA，TPA中任意一种。

7.根据权利要求3所述的靶向HER2的D型多肽放射性药物，其特征在于：所述放射性核素为^99mTc，所述螯合剂为HYNIC。

8.根据权利要求1所述的靶向HER2的D型多肽放射性药物，其特征在于：所述D型多肽放射性药物为无色透明液体针剂。

9.权利要求1所述靶向HER2的D型多肽放射性药物的制备方法，其特征在于：

所述方法包括以下步骤：

a、螯合剂-多肽的制备

将螯合剂-NHS和D型氨基酸线性多肽溶于DMF，加入DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜，向反应液中加入ACN的水溶液并过滤，滤液经YMC-Pack ODS-A半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物螯合剂-多肽；

b、放射性核素-螯合剂-多肽的制备

配制含三苯基膦三磺酸钠、三羟甲基甘氨酸、琥珀酸二钠、琥珀酸和 螯合剂-多肽的混合液，加入含有放射性核素的溶液，100 °C水浴加热反应，待反应结束后室温冷却，制成所述靶向HER2的D型多肽放射性药物。

10.权利要求2所述靶向HER2的D型多肽放射性药物的制备方法，其特征在于：

所述方法包括以下步骤：

a、螯合剂-PKM-COOH的制备

将Fmoc保护的PKM-COOH溶于哌啶的DMF溶液，室温反应15~30分钟后，加入乙醚进行沉淀，离心，弃掉上清，沉淀用乙醚洗涤，除去残留的乙醚，获得预期产物NH₂-PKM-COOH；将螯合剂-NHS和NH₂-PKM-COOH溶于DMF，加入DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜，粗产品经YMC-Pack ODS-A半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物螯合剂-PKM-COOH；所述PKM为药代动力学修饰分子；

b、螯合剂-PKM-多肽的制备

将螯合剂-PKM-COOH溶于DMF，加入NHS和EDC·HCl，室温搅拌5~10小时，向反应液中加入ACN的水溶液并过滤，滤液经YMC-Pack ODS-A半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得预期产物螯合剂-PKM-OSu；将D型氨基酸线性多肽和螯合剂-PKM-OSu溶于DMF，加入DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜，向反应液中加入ACN的水溶液并过滤，滤液经YMC-Pack ODS-A半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物螯合剂-PKM-多肽；

c、放射性核素-螯合剂-PKM-多肽的制备

配制含三苯基膦三磺酸钠、三羟甲基甘氨酸、琥珀酸二钠、琥珀酸和 螯合剂-PKM-多肽的混合液，加入放射性核素溶液，100 °C水浴加热反应，待反应结束后室温冷却，制成靶向HER2的D型多肽放射性药物。