CN107308466B - 具有肿瘤血管靶向性的多肽、分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有肿瘤血管靶向性的多肽、分子探针及其制备方法和应用，属于诊断显像剂技术领域。所述多肽具有如序列表Seq ID No.1所示的氨基酸序列。单光子或正电子分子探针具有如X‑N‑G所示的结构；其中X为所述单光子显像核素或正电子显像核素，N为双功能螯合剂，G为所述的多肽。荧光分子探针具有如X‑G所示的结构；其中X为所述荧光核素，G为所述多肽。改性的多肽能够明显降低腹部本底，提高图像对比度，所得分子探针制备简单、价格便宜以及较高靶/非靶比值的优点。

Description

具有肿瘤血管靶向性的多肽、分子探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于诊断显像剂技术领域，具体涉及具有肿瘤血管靶向性的多肽、分子探针及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是严重威胁人类健康的疾病，癌症的早期诊断和治疗可以减轻患者痛苦和精神、经济负担，争取让癌症患者早日康复。目前，大多数用于诊断与治疗的靶向药物为单克隆片段，其肿瘤穿透能力差，不能特异地被单核巨噬细胞系统捕获。而多肽具有量小，免疫原性低，良好的组织穿透能力和肿瘤组织亲合力高，靶向药物的研究一直是肿瘤诊断和治疗的热点。
1971年，Folkman最早提出肿瘤生长是血管依赖性的，肿瘤血管不仅可向肿瘤提供充足的营养，同时也是肿瘤细胞恶性生长和转移的重要条件。膜联蛋白A1(annexin A1，Anxa11)是膜联蛋白超家族中的一员，它参与细胞信号转导、分化及凋亡等多种重要的生命过程。Anxa1是肿瘤新生血管特异的标志物，是EGFR的底物，可以特异性调节MAPK/ERK信号传导通路，同时作为PLA2的抑制剂等参与信号转导、细胞凋亡、钙离子通道的形成等众多生理过程，其在肿瘤组织及癌前病变中表达明显高于在相应的正常组织中的表达，其与肿瘤的发生、发展、诊断及治疗密切相关。
糖模拟肽(carbohydrate mimetic peptide，CMP)，是一短序列肽分子，能模拟生物大分子或细胞表面复杂的糖结构，常用于替代糖分子进行诱导免疫反应制备特异性抗体。CMP分子小，血浆清除快，在药代动力学方面极具优势，备受研究者青睐，现在也多用于筛选受体或抗体的特异性高亲和力配体。如能筛选出一种与肿瘤新生血管特异性结合的CMP，将有较高应用前景。例如，Shingo Hatakeyama等在研究糖模拟肽的过程中，发现了一个名为IFLLWQR的七肽片段，要求所述糖模拟肽不仅能有效靶向肿瘤血管，而且还不能在机体中引起免疫反应，同时还要克服多肽在体内易代谢的缺点，另外为了方便显像还要利于核素标记。而现有技术中还没有公开一种有效针对肿瘤血管的糖模拟肽。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供具有肿瘤血管靶向性的多肽，所述多肽能明显解决在体内不易代谢的问题，同时有利于核素标记，具有明显改善分子探针体内药代性能的特点。
本发明的目的还在于提供具有肿瘤血管靶向性的分子探针，所述分子探针能有效提高体内药代性能，降低腹部本底，提高图像对比度，具有较高靶/非靶比值的优点。
本发明的目的还在于提供具有肿瘤血管靶向性的分子探针的制备方法和应用，制备简单、耗时短、标记率高的特点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了具有肿瘤血管靶向性的多肽，具有如序列表Seq ID No.1所示的氨基酸序列。
本发明提供了一种具有肿瘤血管靶向性的单光子或正电子分子探针，具有如X-N-G所示的结构；其中X为所述单光子显像核素或正电子显像核素，N为双功能螯合剂，G为所述的多肽。
优选的，所述双功能螯合剂为与异硫氰基定位结合和/或与羟基定位结合的双功能螯合剂。
优选的，所述双功能螯合剂包括p-SCN-Bn-NOTA、p-SCN-Bn-NODA、p-SCN-Bn-DOTA、DOTA-NHS和p-SCN-Bn-DTPA中的一种或几种。
本发明还提供了所述单光子或正电子分子探针的制备方法，包括以下步骤：
1)将双功能螯合剂溶液与多肽溶液按照摩尔比为1～10:1混合后进行螯合反应，得到标记前体溶液；
2)将所述步骤1)得到的标记前体溶液与单光子显像核素溶液或正电子显像核素溶液按照摩尔比为(10～1.1):1混合进行螯合反应，得到单光子或正电子分子探针。
优选的，所述步骤1)中双功能螯合剂溶液和多肽溶液的溶剂为乙酸铵、水、乙醇、磷酸盐或二甲亚砜。
优选的，所述步骤2)中所述标记前体溶液的溶剂为极性溶剂；所述极性溶剂为乙腈或水；所述标记前体溶液的pH值为4～6。
优选的，所述步骤2)中，若标记前体是与单光子显像核素溶液混合，所述混合前向标记前体溶液中加入SnCl2还原剂；所述标记前体溶液与SnCl2的摩尔比为1:(2～20)。
优选的，所述步骤2)中，若标记前体溶液是与单电子显像核素溶液混合，所述混合前向标记前体中加入AlCl3；所述标记前体与AlCl3的摩尔比为1:(2～5)。
本发明还提供了一种具有肿瘤血管靶向性的荧光分子探针，具有如X-G所示的结构；其中X为所述荧光核素，G为所述多肽。
优选的，所述荧光核素为罗丹明B、Cy5和Cy5.5中的一种或几种。
本发明还提供了所述的具有肿瘤血管靶向性的荧光分子探针的制备方法，荧光核素与多肽溶液按照摩尔比1:1.3混合后进行螯合反应，得到荧光分子探针。
本发明还提供了所述的单光子或正电子分子探针或所述的荧光分子探针作为分子影像显像剂的应用。
本发明提供了具有肿瘤血管靶向性的多肽，具有如序列表Seq ID No.1所示的氨基酸序列。本发明所述多肽是以Anxa1为靶点，对肽分子进行适当修饰，引入甘氨酸(Gly-Gly-Gly)合成简单，易于标记，且减少空间位阻；带正电荷的精氨酸(Arg)和带负电荷的天冬氨酸(Asp)形成离子对，增强亲水性；双功能螯合剂与多肽间加的中性天冬酰胺(Asn)，具亲水性。所述多肽不仅保持肽的生物活性，还克服了肽在体内易代谢的问题，同时还要利于核素标记。
本发明提供了一种具有肿瘤血管靶向性的单光子或正电子分子探针，具有如X-N-G所示的结构；其中X为所述单光子显像核素或正电子显像核素，N为双功能螯合剂，G为所述的多肽。本发明所述单光子或正电子分子探针中双功能螯合剂同时含有与靶向多肽定位反应的基团，也含有能够与金属核素形成稳定配合物的配位原子，因此双功能螯合剂在单光子或正电子显像核素和靶向多肽之间起着必不可少的桥梁作用。以正电子核素和单光子核素进行标记，首次制备了靶向Anxal的正电子和单光子示踪剂。阻断实验证实此类显像剂与Anxal特异性结合，经正电子和单光子断层扫描显像，肿瘤可清晰显影，并进行肿瘤Anxal表达的定量分析，为人类检测及诊治肿瘤病症提供了新的医疗途径。本发明所述分子探针能降低腹部本底，提高图像对比度，具有较高靶/非靶比值的优点。
本发明还提供了所述单光子或正电子分子探针的制备方法，制备工艺简单、操作方便，耗时短、标记率高，便于临床、科研及药物开发的进一步应用。
进一步的，本发明提供的制备方法，通过加入AlCl3溶液，使双功能螯合剂上的配位原子能够与金属Al3+形成稳定配合物，而Al3+与溶液中F-有着很强的络合力。所以通过加入AlCl3溶液达到间接标记18F的目的。另外，加入SnCl2还原剂的步骤。Na99TcmO4溶液为+7锝，很难与配位原子配位，加入还原剂SnCl2能够将高价态+7锝还原成低价态锝，以便与螯合剂配位。所述制备方法能够制备得到结构稳定的分子探针。
本发明还提供了所述的单光子或正电子分子探针或所述的荧光分子探针在作为分子影像的显像剂的应用。试验证明，荷瘤鼠SPECT和microPET显像，肿瘤清晰可见，肿瘤与背景对比度高。尾静脉注射1小时后，肿瘤与正常肌肉组织对所述PET示踪剂的摄取比值高，提示所述PET示踪剂与肿瘤高表达的Anxal特异性结合。阻断实验显示，在未标记Anxal靶向肽阻断下，肿瘤中放射性浓聚显著降低，该结果证实所述PET示踪剂与Anxal特异性结合。说明书本发明所述分子探针能够作为分子影像的显像剂应用。
附图说明
图1为实施例1中所述标记前体p-SCN-Bn-DTPA-GR13的结构式；
图2为实施例1中单光子示踪剂99Tcm-p-SCN-Bn-DTPA-GR13的结构式及合成路线图；
图3为实施例1中所述单光子示踪剂的分析型HPLC图；
图4为实施例1中所述U87肿瘤模型鼠尾静脉注射所述单光子示踪剂的SPECT显像图；
图5为实施例2中所述标记前体p-SCN-Bn-NODA-GR13的结构式；
图6为实施例2中PET示踪剂18F-Al-p-SCN-Bn-NODA-GR13的结构式及合成路线图；
图7为实施例2中所述正电子示踪剂的分析型HPLC图；
图8为实施例2中所述U87肿瘤模型鼠尾静脉注射所述正电子示踪剂的microPET显像图；
图9为通过体外生物分布所得实施例2中所述U87肿瘤模型鼠主要器官对正电子示踪剂的摄取值；
图10为实施例3中荧光分子探针GR13-罗丹明B的合成路线；
图11为实施例3中荧光示踪剂与U87肿瘤细胞体外荧光图片；
图12为实施例3中图11为荧光分子探针GR13-罗丹明B与肿瘤细胞结合后的细胞流式图。
具体实施方式
本发明提供了具有肿瘤血管靶向性的多肽，具有如序列表Seq ID No.1所示的氨基酸序列。所述多肽的氨基酸序列为GGGRDNIFLLWQR。
本发明提供的具有肿瘤血管靶向性的多肽，不仅保持肽的生物活性，还克服了肽在体内易代谢的问题，同时还要利于核素标记，具有明显改善分子探针体内药代性能的特点。
本申请所述的多肽来源由以下方法设计得到，所述多肽的来源委托上海楚肽生物科技有限公司合成。
本发明将在IFLLWQR的基础上添加修饰基团GGGRDN。目的在于：引入甘氨酸(Gly-Gly-Gly)合成简单，且减少空间位阻；带正电荷的精氨酸(Arg)和带负电荷的天冬氨酸(Asp)形成离子对，增强亲水性；双功能螯合剂与多肽间加的中性天冬酰胺(Asn)，具亲水性。加入该修饰基团可以改善分子探针在体内药代性能，降低腹部本底，提高图像对比度。
本发明中，所述多肽的纯度均在95％以上。
本发明中，所述多肽的纯化的方法包括以下步骤：多肽序列中加入Gly-Gly-Gly，Arg，Asp和Asn采用固相肽合成法，按标准Fmoc法从C端到N端合成。采用Fmoc RinkAmideMBHA树脂，树脂/氨基酸为1/4当量。加少量反应结束后，树脂经TFA酸解，裂解液加乙醚沉淀，离心，弃上清。沉淀物加水溶解(可加少量DMF助溶)，经制备型HPLC纯化，流动相为乙腈(加0.1％三氟乙酸[TFA])和水(加0.1％TFA)，梯度洗脱(5％～30％乙腈，20min)，收集对应的紫外峰，MALDI-TOF-MASS分析。将质谱鉴定正确的组分真空冷冻干燥，即得。
本发明提供了一种具有肿瘤血管靶向性的单光子或正电子分子探针，具有如X-N-G所示的结构；其中X为所述单光子显像核素或正电子显像核素，N为双功能螯合剂，G为所述的多肽。所述多肽化合物对Anxal(膜联蛋白)具有较高的靶向性，以正电子核素和单光子核素进行标记，双功能螯合剂使单光子或正电子显像核素与多肽稳定连接。阻断实验证实所述分子探针与Anxal特异性结合，经正电子和单光子断层扫描显像，肿瘤可清晰显影，并进行肿瘤Anxal表达的定量分析。
本发明中，所述单光子或正电子分子探针包括双功能螯合剂。所述双功能螯合剂优选为与异硫氰基定位结合和/或与羟基定位结合的双功能螯合剂。
所述双功能螯合剂为可与氨基定位结合的螯合剂包括p-SCN-Bn-NOTA、p-SCN-Bn-NODA、p-SCN-Bn-DOTA、DOTA-NHS和p-SCN-Bn-DTPA一种或几种。具体的，p-SCN-Bn-NOTA，中文名称为2-(4-异硫氰苯基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸；
p-SCN-Bn-NODA，中文名称为2-(4-异硫氰苯基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-4，7-二乙酸；
p-SCN-Bn-DOTA，中文名称为2-(4-异硫氰苯基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸；
DOTA-NHS，中文名称为2,2',2”-(10-(2-((2,5-二氧吡咯烷-1-基)氧)-2-氧乙基)-1,4,7,10-三氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸；
p-SCN-Bn-DTPA，中文名称为2-(4-异硫氰苯基)-二乙基三胺五乙酸。
本发明对所述双功能螯合剂的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的双功能螯合剂的来源即可。本发明实施例中，所述双功能螯合剂均可购自法国Chematech公司或美国Macrocyclics公司，各型号产品并无明显区别，对本发明的技术效果不产生影响，本发明中均选用100mg包装。
本发明中，所述单光子或正电子分子探针包括单光子或正电子显像核素。所述单光子显像核素优选为Na99TcmO4。所述正电子显像核素优选为Na18F。所述单光子或正电子显像核素的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的单光子或正电子显像核素即可。本发明实施例中，所述单光子显像核素购自上海欣科医药有限公司。所述正电子显像核素由加速器生产得到。所述正电子显像核素的生产方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的生产方法即可。
本发明还提供了所述单光子或正电子分子探针的制备方法，包括以下步骤：
1)将双功能螯合剂溶液与多肽溶液按照摩尔比为1～10:1混合后进行螯合反应，得到标记前体溶液；
2)将所述步骤1)得到的标记前体溶液与单光子显像核素溶液或正电子显像核素溶液按照摩尔比为(10～1.1):1混合进行螯合反应，得到单光子或正电子分子探针。
本发明将双功能螯合剂溶液与多肽溶液按照摩尔比为1～10:1混合后进行螯合反应，得到标记前体溶液。
本发明中，双功能螯合剂溶液和多肽溶液的溶剂的缓冲液为乙酸铵、水、乙醇、磷酸盐或二甲亚砜溶液。所述双功能螯合剂溶液的缓冲液的质量浓度优选为(20～100)μg/100μL。所述双功能螯合剂溶液的pH值优选为4～6，更优选为5。
本发明中，所述螯合反应的时间优选为10～30min，更优选为15～20min。所述螯合反应的温度优选为90～110℃或者24～27℃。
本发明中，所述螯合反应后优选进行纯化。所述纯化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的纯化方法即可。本发明实施例中，所述纯化采用经C18小柱进行纯化。
本发明中，纯化后的标记前体优选采用极性溶剂复溶。所述极性溶剂优选为乙腈或水；所述标记前体溶液的pH值优选为4～6，更优选为5。
得到纯化后的标记前体，本发明将所述标记前体溶液与单光子显像核素溶液或正电子显像核素溶液按照摩尔比为(1.3～3):1混合进行螯合反应，得到单光子或正电子分子探针。
所述单光子显像核素溶液的反应浓度为3～5mCi/100μL，更优选为4mCi/μ100L。所述正电子显像核素溶液的反应浓度为10～30mCi/100μL。
本发明中，若标记前体是与单光子显像核素溶液混合，所述混合前优选向标记前体中加入SnCl2还原剂；所述标记前体与SnCl2的摩尔比优选为1:(2～20)，更优选为1:8。Na99TcmO4溶液为+7锝，很难与配位原子配位，加入还原剂SnCl2能够将高价态+7锝还原成能够与螯合剂配位的低价态锝。
本发明中，若标记前体是与正电子显像核素溶液混合，所述混合前向标记前体中加入AlCl3；所述标记前体与AlCl3的摩尔比优选为1:2～1:5，更优选为1:3。双功能螯合剂上的配位原子能够与金属Al3+形成稳定配合物，而Al3+与溶液中F-有着很强的络合力。所以通过加入AlCl3溶液达到间接稳定标记18F的目的。
本发明中，所述螯合反应的时间为10min。所述螯合反应的温度优选为100℃。
本发明中，所述螯合反应后优选进行纯化。所述纯化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的纯化方法即可。本发明实施例中，所述纯化采用经C18小柱进行纯化。
本发明还提供了一种具有肿瘤血管靶向性的荧光分子探针，具有如X-G所示的结构；其中X为所述荧光核素，G为所述多肽。
本发明中，所述荧光核素优选为罗丹明B、Cy5和Cy5.5中的一种或几种。
本发明还提供了所述的具有肿瘤血管靶向性的荧光分子探针的制备方法，荧光核素与多肽溶液按照摩尔比1:1.0～2.0混合后进行螯合反应，得到荧光分子探针。
本发明中，所述荧光核素与多肽溶液的摩尔比为1:1.3。
本发明还提供了所述的单光子或正电子分子探针或所述的荧光分子探针在作为分子影像的显像剂的应用。
下面结合实施例对本发明提供的具有肿瘤血管靶向性的多肽、分子探针及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例所述的单光子示踪剂是以双功能螯合剂p-SCN-Bn-DTPA为连接基对具有氨基酸序列GGGRDNIFLLWQR(GR13)的多肽化合物进行单光子核素99Tcm标记，具体步骤包括：
1)标记前体p-SCN-Bn-DTPA-GR13的制备：
将3.00mg GR13与1.02mg p-SCN-Bn-DTPA(摩尔比1:1.2)溶于1mL DMF，氮气封闭后37℃水浴搅拌过夜。
将反应后的混合液经制备型HPLC梯度洗脱，条件如下：
制备型反相C18柱(Xbridge，19×150mm，Waters)；
Waters 2998二级管阵列紫外检测器；
BioScan放射性检测器；
Waters2545二元高压梯度泵；
流动相为：A、含0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液；B、含0.1％TFA的水溶液；
梯度洗脱：0-2分钟的5％A和95％B增加到21分钟的65％A和35％B；
流速为20ml/min，检测波长为218nm。
收集出峰时间为17.2min时的流份，获得标记前体。
通过分析型HPLC检测产品纯度，所述分析型HPLC检测条件为：
反相C18柱(Luna，4.6×250mm，phenomenex)；
Waters1525二元HPLC液相泵；
Radiomatic 610TR放射性检测器(Perkin-Elmer)；
Waters 2998双波长紫外检测器；
流动相为：A、含0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液；B、含0.1％TFA的水溶液；
梯度洗脱：0～2分钟的5％A和95％B增加到32分钟的65％A和35％B；
流速为1ml/min，检测波长为218nm；
产品纯度>95％。LC-MS:[MH]+＝2072.94(m/z),这与标记前体即p-SCN-Bn-DTPA-GR13(C91H134N26O28S:2071.96)的计算值相吻合。
所述标记前体p-SCN-Bn-DTPA-GR13的结构式如图1所示。
2)单光子示踪剂99Tcm-p-SCN-Bn-DTPA-GR13的制备：取100μg p-SCN-Bn-DTPA-GR13，溶于10μLDMSO，充氮气保护。称取氯化亚锡适量，溶于0.15mol/L盐酸，得浓度为1mg/mL的溶液。20μL氯化亚锡加入至p-SCN-Bn-DTPA-GR13溶液中，加入3mciNa99TcmO4置于37℃水浴反应30min。反应结束后，以15mL的注射用水稀释溶液上C18柱(已经过10mL无水乙醇、10mL去离子水活化)，测上柱药物的放射剂量。分别以10mLPBS冲洗C18柱1遍，去离子水15mL冲洗C18柱3遍，除去杂质。待C18柱的放射性活度变动小于100μCi，以0.3mL盐酸乙醇淋洗C18柱，获得产品，测产品的放射剂量为2.85mCi，计算其标记率(未校正)为95％。
采用步骤2中所述的分析型HPLC条件对示踪剂进行检测，产品保留时间：15.5分钟(HPLC图谱见图3所示)，放射化学纯度>95％。
单光子示踪剂99Tcm-p-SCN-Bn-DTPA-GR13的结构式及合成路线图2。
SPECT显像
取荷人移植瘤(U87)模型鼠置于SPECT床板上，异氟烷麻醉模型鼠，经胶带固定。模型鼠经尾静脉注射上述单光子示踪剂的生理盐水溶液(100μci,0.2mL)。注射后2小时、4小时、6小时，分别进行SPECT显像，结果如图4所示。图中箭头所示为肿瘤。
如图4所示，注射上述单光子示踪剂后2小时到6小时，各移植瘤均清晰可见，从图中可以看到，肿瘤与对侧相比具有良好的对比度。
如图4所示，注射后2h，肿瘤对所述单光子示踪剂摄取值约3.56±0.44％ID/g，随着时间的变化，摄取值逐渐降低。
99Tcm-p-SCN-Bn-DTPA-GR13在小鼠的体内的生物分布
按照本实施例制备好标记率大于95％的99Tcm-p-SCN-Bn-DTPA-GR13溶液。将30只正常ICR小鼠随机分成5组，雌雄各半，每组6只。经小鼠从尾静脉注射0.2ml(0.74MBq)标记化合物，分别于30min、60min、120min、240min和360min处死小鼠，收集肿瘤、血、脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、胰、肌肉、脂肪、性腺、肾上腺、甲状腺、骨，称重后用γ计数器测放射性计数，并计算各脏器和组织的摄取量(％ID/g)，实验结果以x(SD)表示。结果显示，99Tcm-p-SCN-Bn-DTPA-GR13注射后30min，肝肾有明显的放射性浓聚，360min后大部分消除。
表1荷瘤鼠注射99Tcm-p-SCN-Bn-DTPA-GR13后肿瘤及各脏器的放射性摄取(％ID/g)。
Figure BDA0001328308060000101
Figure BDA0001328308060000111
生物分布实验中，数据显示脑，心脏和肌肉摄取99Tcm-p-SCN-DTPA-GGGRDN-IF7低，肿瘤在30，60，120，240和360分钟摄取值分别为4.32±0.34％ID/g 4.11±0.31％ID/g，3.54±0.33％ID/g，2.78±0.36％ID/g和2.02±0.24％ID/g。注射99Tcm-p-SCN-DTPA-GGGRDN-IF760min后肝肾的摄取值较高，240分钟后明显降低，说明99Tcm-p-SCN-DTPA-GGGRDN-IF7主要经肝肾系统进行排泄。注射药物99Tcm-p-SCN-DTPA-GGGRDN-IF730min，60min，120min，240min和360min后肿瘤与肌肉、肿瘤与血液的摄取比值分别为9.60±1.88，7.61±1.55，9.07±2.54，8.69±3.27，9.18±3.01和2.80±1.02，3.34±1.25，3.73±1.45，3.43±1.34，4.68±1.78。
实施例2
本实施例所述的PET示踪剂是以双功能螯合剂p-SCN-Bn-NODA为连接基对具有氨基酸序列GGGRDNIFLLWQR(GR13)的多肽化合物进行正电子核素18F标记，具体步骤包括：
1)标记前体p-SCN-Bn-NODA-GR13的制备：将4mg GR13与0.6mg p-SCN-Bn-NODA(摩尔比1:1.2)溶于1mL DMF，氮气封闭后37℃水浴搅拌过夜。反应结束后，使用制备型HPLC纯化，条件如下：
制备型反相C18柱(Xbridge，19×150mm，Waters)；
Waters 2998二级管阵列紫外检测器；
BioScan放射性检测器；
Waters2545二元高压梯度泵；
流动相为：A、含0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液；B、含0.1％TFA的水溶液；
梯度洗脱：0-2分钟的5％A和95％B增加到21分钟的65％A和35％B；
流速为20ml/min，检测波长为218nm。
收集出峰时间为22.8min时的流份，获得标记前体。
通过分析型HPLC检测产品纯度，所述分析型HPLC检测条件为：
反相C18柱(Luna，4.6×250mm，phenomenex)；
Waters1525二元HPLC液相泵；
Radiomatic 610TR放射性检测器(Perkin-Elmer)；
Waters 2998双波长紫外检测器；
流动相为：A、含0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液；B、含0.1％TFA的水溶液；
梯度洗脱：0-2分钟的5％A和95％B增加到32分钟的65％A和35％B；
流速为1ml/min，检测波长为218nm；
产品纯度>95％。LC-MS:[MH]+＝1983.23(m/z)，这与标记前体即p-SCN-Bn-NODA-GR13(C89H133N26O24S:1982.97)的计算值相吻合。
所述标记前体p-SCN-Bn-NODA-GR13的结构式如下图5所示。
2)18F溶液的制备：医用加速器中采用质子速轰击H2 18O得到18F溶液。采用CRC-15R活度计(CAPINTEC)测定其放射剂量为20mCi。
3)PET示踪剂18F-Al-p-SCN-Bn-NODA-GR13的制备：将40μg前述标记前体用200μl乙醇溶解，加入6μl的2mM的AlCl3溶液和10μl的5％醋酸，充分混匀后加入100μl 20mCi前述新鲜制得的18F-溶液，100℃反应10min。冷却，并加15ml水稀释后注入C18分离小柱，(VarianBOND ELUT C18，100mg1ml)，5ml的磷酸盐缓冲液和8ml水冲洗柱子后用300μl乙醇洗脱标记产品，生理盐水稀释后无菌过滤即得所述PET示踪剂，合成时间约20min，采用CRC-15R活度计(CAPINTEC)测定其放射剂量为11.6mCi，因此，计算其标记率(未校正)为58％。
采用步骤2中所述的分析型HPLC条件对示踪剂进行检测，产品保留时间：19.9分钟(HPLC图谱见图7所示)，放射化学纯度>95％。
PET示踪剂18F-Al-p-SCN-Bn-NODA-GR13的结构式及合成路线图6所示。
MicroPET显像
取荷人移植瘤(U87)模型鼠置于小动物PET床板上，异氟烷麻醉模型鼠，经胶带固定。模型鼠经尾静脉注射上述PET示踪剂的生理盐水溶液(1.85MBq,0.2mL)。注射后20分钟、30分钟、1小时、2小时，分别进行microPET显像，结果分别如图8所示。图中箭头所示为肿瘤。图中颜色由明到暗表示所述PET示踪剂摄取值由高到低。
采用二维有序子集期望最大化算法进行图像重建。在肿瘤、肌肉、肝等器官用感兴趣区(ROI)法计算放射性活度(MBq/mL)，所得值除以注射剂量获得各组织对PET示踪剂摄取值(％ID/g)(假定组织密度为1g/ml)。计算结果分别如图9所示。
如图9所示，注射上述PET示踪剂后20min到60min，各移植瘤均清晰可见，从图中可以看到，肿瘤与对侧相比具有良好的对比度。
所述PET示踪剂在模型鼠的肾中具有显著的浓聚，这表明其主要通过肾代谢。随着时间的延长，所述PET示踪剂在模型鼠体内的浓聚逐渐降低，显示所述PET示踪剂逐渐代谢排出体外，这表明所述PET示踪剂是安全的，不会持久的存于鼠体内，且半衰期较短，不会对模型鼠造成伤害。
如图9所示，注射后30min，肿瘤对所述PET示踪剂摄取值达最高约5.74±1.13％ID/g，随着时间的变化，摄取值逐渐降低。肾对所述PET示踪剂摄取值显著，证实所述PET示踪剂主要通过肾代谢。此外，如图9所示，肿瘤较正常组织如肌肉对所述PET示踪剂摄取显著，便于肿瘤的诊断和治疗。120min后骨中的摄取低，说明标记物在体内稳定，无脱18F的现象，此标记物可能成为一种良好的肿瘤显像剂。
特异性实验：
U87神经胶质瘤模型鼠预先注射未标记的靶向Anxal多肽化合物即GR13(10mg/kg体重)30min后，然后注入所述PET示踪剂，20分钟、30分钟、60分钟和120分钟后进行microPET显像。
由图8中可见，注射后60min，阻断组模型鼠移植瘤对PET示踪剂的摄取值较未阻断组显著下降约80％。这是由于未标记的靶向Anxal的多肽化合物，有效抑制肿瘤高表达的Anxa1与所述PET示踪剂的结合，导致肿瘤对所述PET示踪剂的摄取值相应降低。实验证实，所述PET示踪剂与Anxa1特异性结合。
18F-Al-p-SCN-Bn-NODA-GR13在小鼠的体内的生物分布
按照本实施例制备好标记率大于95％的18F-Al-p-SCN-Bn-NODA-GR13溶液。将24只正常ICR小鼠随机分成4组，雌雄各半，每组6只。经小鼠从尾静脉注射0.2ml(0.74MBq)标记化合物，分别于30min、60min、120min以及60min阻断后处死小鼠，收集肿瘤、血、脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、胰、肌肉、脂肪、性腺、肾上腺、甲状腺、骨，称重后用γ计数器测放射性计数，并计算各脏器和组织的摄取量(％ID/g)，实验结果以
Figure BDA0001328308060000142
(SD)表示。结果显示，18F-Al-p-SCN-Bn-NODA-GR13注射后30min，肝肾有明显的放射性浓聚，120min后大部分消除。
表2 18F-Al-p-SCN-Bn-NODA-GR13后肿瘤及各脏器的放射性摄取取(％ID/g)。
Figure BDA0001328308060000141
Figure BDA0001328308060000151
动物分布实验的结果与microPET显像结果一致。除了肝肾以外的其他器官对药物的摄取值均低于肿瘤对药物的摄取值。18F-Al-p-SCN-NODA-GGGRDN-IF7在血液及主要脏器(心脏、肝脏、肌肉、骨骼)中可迅速清除。相较于脏器，药物在肿瘤中的清除较慢，30min、60min和120min的摄取值分别为6.34±1.78％ID/g、4.01±1.23％ID/g和1.34±0.45％ID/g。肝肾对药物有大量摄取。60min时肿瘤/肌肉和肿瘤/血液的T/NT分别为36.45±8.87和8.53±3.28。经过量GGGRDN-IF7阻断后60min肿瘤的摄取降低至0.98±0.32％ID/g。
实施例3
本实施例所述的荧光示踪剂是将具有氨基酸序列GGGRDNIFLLWQR(GR13)的多肽化合物与荧光核素罗丹明B直接相连，进行体外与肿瘤细胞结合，进行荧光拍照，具体步骤包括：
1)荧光分子探针GR13-罗丹明B的制备：
将10mg GR13与8mg罗丹明B溶于10mL DMF，氮气封闭后37℃水浴搅拌过夜。反应结束后，使用制备型HPLC纯化，收集对应的紫外峰，MALDI-TOF-MASS分析。将质谱鉴定正确的组分真空冷冻干燥，即得。HPLC纯化条件：
制备型反相C18柱(Xbridge，19×150mm，Waters)；
Waters 2998二级管阵列紫外检测器；
BioScan放射性检测器；
Waters2545二元高压梯度泵；
流动相为：A、含0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液；B、含0.1％TFA的水溶液；
梯度洗脱：0-2分钟的5％A和95％B增加到21分钟的65％A和35％B；
流速为20ml/min，检测波长为218nm。
收集出峰时间为22.8min时的流份，获得标记前体。
通过分析型HPLC检测产品纯度，所述分析型HPLC检测条件为：
反相C18柱(Luna，4.6×250mm，phenomenex)；
Waters1525二元HPLC液相泵；
Radiomatic 610TR放射性检测器(Perkin-Elmer)；
Waters 2998双波长紫外检测器；
流动相为：A、含0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液；B、含0.1％TFA的水溶液；
梯度洗脱：0-2分钟的5％A和95％B增加到32分钟的65％A和35％B；
流速为1ml/min，检测波长为218nm；
产品纯度>95％。LC-MS:[MH]+＝2001.56(m/z)，这与荧光分子探针即GR13-罗丹明B(C98H135N24O22:2001.31)的计算值相吻合。
所述荧光分子探针GR13-罗丹明B的合成路线如下图10所示。
2)体外实验:
先将100μg GR13-罗丹明B溶于3μLDMSO中，再用PBS稀释成10μg/mL的溶液，取5μLGR13-罗丹明B溶液加入到A431或U87细胞抚育10min、30min和60min。抚育结束后，取出液体，用PBS洗涤2-3次，进行荧光拍照。
所述荧光分子探针GR13-罗丹明B与A431或U87细胞结合后荧光照片如下图10所示。A、B、C图分别为荧光分子探针GR13-罗丹明B与细胞A431结合10min、30min和60min。D、E、F图分别为荧光分子探针GR13-罗丹明B与细胞U87结合10min、30min和60min。从图11清晰可见，荧光分子探针GR13-罗丹明B与肿瘤细胞A431或U87有着很强的结合力。图12为荧光分子探针GR13-罗丹明B与肿瘤细胞A431(图12中的A图)或U87(图12中的B图)的结合后的细胞流式图。从细胞流式图清晰可见，荧光分子探针与肿瘤细胞能够大部分结合，表明有着很强的特异性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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<120> 具有肿瘤血管靶向性的多肽、分子探针及其制备方法和应用
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<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Gly Gly Arg Asp Asn Ile Phe Leu Leu Trp Gln Arg
1 5 10

Claims (9)

1.一种具有肿瘤血管靶向性的单光子分子探针，其特征在于，具有如X-N-G所示的结构；其中X为所述单光子显像核素，N为双功能螯合剂，G为具有肿瘤血管靶向性的多肽；
所述多肽具有如序列表Seq ID No.1所示的氨基酸序列；
所述双功能螯合剂为与异硫氰基定位结合和/或与羟基定位结合的双功能螯合剂；
所述双功能螯合剂包括p-SCN-Bn-NODA、p-SCN-Bn-DOTA、DOTA-NHS和p-SCN-Bn-DTPA中的一种或几种；
所述单光子显像核素为Na99TcmO4。
2.权利要求1所述单光子分子探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将双功能螯合剂溶液与多肽溶液按照摩尔比为1～10:1混合后进行螯合反应，得到标记前体溶液；
2)将所述步骤1)得到的标记前体溶液与单光子显像核素溶液按照摩尔比为(10～1.1):1混合进行螯合反应，得到单光子分子探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中双功能螯合剂溶液和多肽溶液的溶剂为乙酸铵、水、乙醇、磷酸盐或二甲亚砜。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中所述标记前体溶液的溶剂为极性溶剂；所述极性溶剂为乙腈或水；所述标记前体溶液的pH值为4～6。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，若标记前体溶液与单光子显像核素溶液混合，混合前向标记前体溶液中加入SnCl2还原剂；所述标记前体与SnCl2的摩尔比为1:(2～20)。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，若标记前体溶液与单电子显像核素溶液混合，所述混合前向标记前体中加入AlCl3；所述标记前体与AlCl3的摩尔比为1:2～5。
7.一种具有肿瘤血管靶向性的荧光分子探针，其特征在于，具有如X-G所示的结构；其中X为所述荧光核素，G为具有肿瘤血管靶向性的多肽；所述多肽具有如序列表Seq ID No.1所示的氨基酸序列；
所述荧光核素为罗丹明B、Cy5和Cy5.5中的一种或几种。
8.权利要求7所述的具有肿瘤血管靶向性的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，荧光核素与多肽溶液按照摩尔比1:1.3混合后进行螯合反应，得到荧光分子探针。
9.权利要求2所述的单光子分子探针或权利要求2～6任意一项所述方法制备的单光子分子探针或权利要求7所述的荧光分子探针或权利要求8所述方法制备的荧光分子探针在制备分子影像显像剂中的应用。
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