CN103623418A - 一种荧光标记的肿瘤靶向示踪剂及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种荧光标记的肿瘤靶向示踪剂及制备方法和应用，属于荧光标记技术领域。本发明示踪剂由异硫氰酸荧光素FITC与7肽IF7构成，记为FITC-IF7；7肽IF7为异亮氨酸－苯丙氨酸－亮氨酸－亮氨酸－色氨酸－谷氨酰胺－精氨酸。其制备方法为：取FITC加入于IF7碱性溶液中，4℃反应24h，NH4Cl终止反应，制备型HPLC分离纯化得到FITC－IF7。FITC－IF7具有良好的稳定性，对肿瘤细胞亲和力高，能进入不同的肿瘤细胞：人表皮癌细胞（A431）、人肺腺癌细胞（A549）、人肝癌细胞（Bel-7402）、小鼠黑色素瘤细胞（B16）。FITC-IF7利用FITC等荧光材料作为示踪剂，检测方便，各种荧光显微镜、流式细胞仪都可检测，还可用于肿瘤诊断的荧光成像。
Description
技术领域
荧光标记的肿瘤靶向示踪剂及制备方法和应用，属于荧光标记技术领域。本发明示踪剂FITC- IF7可用于检测其进入不同肿瘤细胞的能力，在抗肿瘤药物研制和光学成像等生物应用领域具有重要的作用。
背景技术
在生命科学及现代分子生物学领域里，研究和应用高灵敏度的非同位素检测方法一直是各国学者共同努力的方向。荧光标记技术是指利用一些能发荧光的物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。该技术具有高灵敏度、高稳定性和高选择性等特点。
糖模拟肽（carbohydrate mimetic peptide，CMP），是一短序列肽分子，能模拟生物大分子或细胞表面复杂的糖结构，常用于替代糖分子进行诱导免疫反应制备特异性抗体。CMP分子小，血浆清除快，在药代动力学方面极具优势，备受研究者青睐，现在也多用于筛选受体或抗体的特异性高亲和力配体。如能筛选出一种与肿瘤新生血管特异性结合的CMP，将有较高应用前景。Shingo Hatakeyama等在研究糖模拟肽的过程中，发现了一个名为IF7的七肽片段，能有效靶向肿瘤血管，而且基本不引起免疫反应。Anxa1是钙磷脂结合蛋白Anx家族的成员之一，高表达于肿瘤新生血管，是EGFR的底物，可以特异性调节MAPK/ERK信号传导通路，同时作为PLA2的抑制剂等参与信号转导、细胞凋亡、钙离子通道的形成等众多生理过程，在肿瘤的形成及发展中起重要作用。结合Shingo Hatakeyama等的研究，我们发展了以IF7为基础，以Anxa1为靶点，荧光为标记的肿瘤靶向示踪剂，检测其进入不同肿瘤细胞的能力，这对研究抗肿瘤药物和光学成像等生物应用领域具有重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种荧光标记的肿瘤靶向示踪剂及制备方法和应用。用荧光基团标记IF7制备肿瘤靶向示踪剂，并且检测其进入肿瘤细胞的能力，在抗肿瘤药物研制和光学成像等生物应用领域具有重要的作用。
本发明的技术方案：一种荧光标记的肿瘤靶向示踪剂，该示踪剂由异硫氰酸荧光素FITC与7肽IF7构成，记为FITC- IF7；7肽IF7为异亮氨酸－苯丙氨酸－亮氨酸－亮氨酸－色氨酸－谷氨酰胺－精氨酸。
FITC－IF7的结构式为
肿瘤靶向示踪剂的制备
（1）IF7、FITC分别用DMSO溶解配制成10mg/mL溶液，再用0.5mol/L 的碳酸氢钠缓冲溶液稀释成1mg/mL溶液。
（2）取1mg/mL 的FITC（10μL）缓慢加入于1mg/mL 的IF7（100μL）溶液中，边加边轻轻晃动使其混合均匀，暗处4℃反应24 h。
（3）加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2 h。
肿瘤靶向示踪剂的分离纯化：
（1）制备型高效液相（HPLC）纯化
FITC标记的IF7用制备型高效液相（HPLC）纯化，Waters XBridge，C-18色谱柱(150 mm ×19mm，5μm)，流动相A为纯水（0.1%TFA），B为乙腈（0.1%TFA），流速20mL/min，进样体积为1 mL，检测波长218nm。
（2）梯度洗脱，条件为，收集16.51min的流出液。
表1 HPLC纯化FITC－IF7洗脱条件
| min | A（%） | B(%) |
| 0 | 95 | 5 |
| 1.2 | 95 | 5 |
| 21 | 35 | 65 |
| 24 | 35 | 65 |
| 27 | 5 | 95 |
| 30 | 95 | 5 |
所述的肿瘤靶向示踪剂的应用，其应用于肿瘤细胞的示踪，用荧光显微镜和/或流式细胞仪技术观察示踪剂对肿瘤细胞的亲和力。
本发明的有益效果：
此荧光标记的IF7肿瘤示踪剂稳定，具有荧光标记，可进入细胞用来评价进入肿瘤细胞的能力。示踪剂检测方便，各种荧光显微镜、流式细胞仪都可检测，为开发以IF7为载体的药物提供了研究工具。
FITC－IF7肿瘤靶向示踪剂的制备比较简单，采用制备型HPLC一步法就可得到FITC-IF7，纯度高，稳定性好。
附图说明
图1制备型高效液相（HPLC）纯化。
图2荧光显微镜观察肿瘤靶向示踪剂进入细胞的能力。A：A431细胞；B：A549细胞；C：Bel-7402细胞；D：B16细胞。图中细胞的荧光强度越强说明FITC－IF7进入肿瘤细胞的能力越强。加FITC－IF7后，四个肿瘤细胞都有不同强度的荧光摄取，说明FITC－IF7能进入不同的肿瘤细胞，对肿瘤细胞具有较好的靶向性。
图3流式细胞仪观察肿瘤靶向示踪剂进入细胞的能力；
A、C、E、G为A431细胞、A549细胞、Bel-7402细胞、B16细胞的自发荧光图；
B、D、F、H为A431细胞、A549细胞、Bel-7402细胞、B16细胞加FITC－IF7后细胞的荧光图；
结果显示，加FITC－IF7后，四种细胞的荧光强度明显增加，说明示踪剂FITC－IF7对肿瘤细胞具有较好的靶向摄取作用。
具体实施方式
实施例1：FITC－IF7肿瘤靶向示踪剂的制备
（1）IF7、FITC分别用DMSO溶解到10mg/mL，再用0.5mol/L 的碳酸氢钠缓冲溶液稀释成1mg/mL。
（2）取FITC（10μL）缓慢加入于IF7（100μL）溶液中，边加边轻轻晃动使其混合均匀，暗处4℃反应24 h。
（3）加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2 h。
实施例2：FITC－IF7肿瘤靶向示踪剂的分离纯化
（1）制备型高效液相（HPLC）纯化
FITC标记的IF7用制备型高效液相（HPLC）纯化，Waters XBridge，C-18色谱柱(150 mm ×19mm，5μm)；流动相A为纯水（0.1%TFA），B为乙腈（0.1%TFA），流速20mL/min，进样体积为1 mL，检测波长218nm。
（2）梯度洗脱，0 -1.2min：95%A和5% B；1.2-21 min：95%A和5% B-35%A和65% B；21-24 min：35%A和65% B；24-27 min：35%A和65% B-5%A和95% B；27-30min：5%A和95% B-95%A和5% B；收集16.51min的流出液。
| min | A（%） | B(%) |
| 0 | 95 | 5 |
| 1.2 | 95 | 5 |
| 21 | 35 | 65 |
| 24 | 35 | 65 |
| 27 | 5 | 95 |
| 30 | 95 | 5 |
实施例3：荧光显微镜观察FITC－IF7肿瘤靶向示踪剂进入细胞的能力
收集不同类型的肿瘤细胞，人表皮癌细胞（A431）、人肺腺癌细胞（A549）、人肝癌细胞（Bel-7402）、小鼠黑色素瘤细胞（B16），浓度为105/mL，铺到96孔板中，每孔100μL，37℃，5%CO2培养箱过夜。加FITC－IF7，终浓度为100μg/mL，37℃孵育1h后用0.05mol/L PBS，pH 7.2洗涤五次，荧光显微镜观察FITC－IF7示踪剂进入细胞的能力，如图2所示。
实施例4：流式细胞仪观察FITC－IF7肿瘤靶向示踪剂进入细胞的能力
收集不同类型的肿瘤细胞，人表皮癌细胞（A431）、人肺腺癌细胞（A549），人肝癌细胞（Bel-7402）、小鼠黑色素瘤细胞（B16），浓度为5×105/mL，铺到6孔板中，每孔2mL，37℃，5%CO2培养箱过夜。加FITC－IF7，终浓度为100μg/mL，37℃孵育1h后用pH 7.2、0.05mol/L PBS洗涤五次，流式细胞仪检测2×105个肿瘤细胞的荧光强度，评价FITC－IF7示踪剂进入肿瘤细胞的能力。
Claims (4)
1.一种荧光标记的肿瘤靶向示踪剂，其特征在于该示踪剂由异硫氰酸荧光素FITC与7肽IF7构成，记为FITC- IF7；7肽IF7为异亮氨酸－苯丙氨酸－亮氨酸－亮氨酸－色氨酸－谷氨酰胺－精氨酸。
2.权利要求1所述荧光标记的肿瘤靶向示踪剂的制备方法，其特征在于：
（1）IF7、FITC分别用DMSO溶解配制成10mg/mL溶液，再用0.5mol/L 的碳酸氢钠缓冲溶液稀释成1mg/mL溶液；
（2）取1mg/mL 的FITC溶液10μL缓慢加入于1mg/mL 的IF7 100μL溶液中，边加边轻轻晃动使其混合均匀，暗处4℃反应24 h；
（3）加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2 h。
3.权利要求1所述的肿瘤靶向示踪剂的分离纯化方法，其特征在于：
（1）制备型高效液相HPLC纯化
FITC标记的IF7用制备型高效液相HPLC纯化，Waters XBridge，C-18色谱柱150 mm ×19mm，5μm，流动相A为含0.1%TFA的纯水，B为含0.1%TFA的乙腈，流速20mL/min，进样体积为1 mL，检测波长218nm；
（2）梯度洗脱，0 -1.2min：95%A和5% B；1.2-21 min：95%A和5% B-35%A和65% B；21-24 min：35%A和65% B；24-27 min：35%A和65% B-5%A和95% B；27-30min：5%A和95% B-95%A和5% B；收集16.51min的流出液。
4.权利要求1所述的肿瘤靶向示踪剂的应用，其特征在于应用于肿瘤细胞的示踪，用荧光显微镜和/或流式细胞仪技术观察示踪剂对肿瘤细胞的亲和力。
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